KR20010020259A - 말단이 잘린 ｖｅｇｆ-관련 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명의 방법은 시험관내 및 생체내에서 혈관 형성을 촉진하는데 유용한 혈관 내피 증식인자 관련 단백질 (VRP)의 말단이 잘린 신규 형태를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 말단이 잘린 신규 VRP를 코딩하는 핵산 및 말단이 잘린 VRP의 제조 방법도 제공한다. 말단이 잘린 VRP를 함유하는 제약 조성물 및 말단이 잘린 VRP를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 치료법은 심장병 치료 및 창상 치료에 유용할 수 있다.

Description

말단이 잘린 ＶＥＧＦ-관련 단백질 {Truncated VEGF-Related Proteins}

혈관 투과성 인자 (VPF)로도 불리는 혈관 내피 증식인자 (VEGF)는 여러 기관내에서 여러 다른 종류의 세포에 의해 생성되는 하나의 단백질족으로서, 거의 오로지 내피세포만을 자극하는, 매우 선택적인 방식으로 작용한다 (Ferrara et al., Endocr. Rev. 13: 18-32 (1992), Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146: 1029-39, 1995, Thomas, J. Biol. Chem. 271: 603-06, 1996). 이 문헌들과 본원에 인용된 여타의 모든 문헌들은 본 명세서에 온전히 참고로 도입된다.

VEGF를 세포 배양하여 시험하면, VEGF는 강력한 유사분열 촉진성 (Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7311-15, 1989) 및 화학주성(化學主性)을 보인다 (Favard et al., Biol. Cell 73:1-6, 1991). 또한 VEGF는 플라스미노겐 활성인자, 플라스미노겐 활성인자 억제인자 및 플라스미노겐 활성인자 수용체를 유도하며 (Mandriota et al., J. Biol. Chem. 270:9709-16, 1995, Pepper et al., 181: 902-06, 1991), 또한 콜라겐 분해효소 (Unemori et al., J. Cell Physiol. 153: 557-62, 1992), 모세혈관이 증식하여 조직내로 침윤하는 것을 조절하는 효소계를 유도한다. VEGF는 또한 시험관내 혈관 형성의 일례인 내피세포에 의한 튜브형 구조물의 형성을 촉진한다 (Nicosia et al., Am. J. Pathol., 145: 1023-29, 1994).

생체내에서 VEGF는 혈관 형성을 유도하고 (Leung et al., Science 246: 1306-09, 1989), 혈관 투과성을 증가시킨다 (Senger et al., Science 219: 983-85, 1983). VEGF는 현재 모세혈관 형성의 중요한 생리 조절인자로 알려져 있다. 이들은 태아 성장을 비롯한 조직 성장시에 새로운 모세혈관의 정상적 형성에 관여하며 (Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8915-19, 1993), 조직 복구 (Brown et al., J. Exp. Med. 176: 1375-79, 1992), 월경 주기 및 임신 (Jackson et al., Placenta 15: 341-53, 1994, Cullinan ＆ Koos, Endocrinology 133: 829-37, 1993, Kamat et al., Am. J. Pathol. 146: 157-65, 1995)에 관여한다. 태아 발생 동안에는 VEGF가 혈도(血島)로부터 혈관이 새롭게 (de novo) 형성되는데 중요한 역할을 하는 것으로 보이며 (Risau ＆ Flamme, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 73-92, 1995), 이러한 사실은 VEGF 대립유전자 하나가 없는 배(胚)에서 관찰된 비정상적인 혈관 발생 및 치사에 의해 입증되었다 (Carmeliet et al., Nature 380: 435-38, 1996). 게다가 VEGF는 충실(solid) 종양을 비롯한 여러 질병에 특징적인 병적 혈관 증식 (Potgens et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376:57-70, 1995), 망막증 (Miller et al., Am. J. Pathol. 145: 574-84, 1994, Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331: 1480-87, 1994, Adamis et al., Am. J. Ophthalmol. 118:445-50, 1994), 건선 (Detmar et al., J. Exp. Med. 180: 1141-46, 1994) 및 류마티스성 관절염 (Fava et al., J. Exp. Med. 180: 341-46, 1994)에 깊이 연루되어 있다.

VEGF 발현은 호르몬 (Schweiki et al., J. Clin. Invest. 91: 2235-43, 1993), 증식인자 (Thomas, J. Biol. Chem. 271: 603-06, 1996) 및 산소압저하 (Schweiki et al., Nature 359: 843-45, 1992, Levy et al., J. Biol. Chem. 271: 2746-53, 1996)에 의해 조절된다. 산소압저하 상태에 의한 VEGF의 상향조절(upregulation)은 추가적인 모세혈관의 형성을 유도하고 이 결과 얻어지는 혈류의 증가를 통해 각 조직의 산소 획득량을 증가시키는 보상 기작으로서 특히 중요하다. 이 기작은 종양 및 망막증에서 병적인 혈관 형성의 원인인 것으로 생각된다. 그러나 산소압저하 이후에 VEGF 발현의 상향조절은 조직 복구, 예를 들면 진피 창상 치유 (Frank et al., J. Biol. Chem. 270: 12607-613, 1995) 및 관 허혈 (Banai et al., Cardiovasc. Res. 28: 1176-79, 1994, Hashimoto et al., Am. J. Physiol. 267: H1948-H1954, 1994)에서도 필수적이다.

혈관 허혈의 동물 모델에서 혈관 형성을 약학적으로 유도하는 VEGF의 능력이 토끼 만성 사지 허혈 모델에서 밝혀졌는데, VEGF를 근육내 반복 주사하거나 또는 하나의 농축괴로 동맥내 투여하면 측지(側枝) 혈관 형성이 증가될 수 있음이 허혈성 뒷다리에서 혈류 측정을 통해 입증되었다 (Pu, et al., Circulation 88: 208-15, 1993, Bauters et al., Am. J. Physiol. 267: H1263-71, 1994, Takeshita et al., Circulation 90 [part 2] II-228-34, 1994, Bauters et al., J. Vasc. Surg. 21: 314-25, 1995, Bauters et al., Circulation 91: 2802-09, 1995, Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93: 662-70, 1994). 이 동물 모델에서는 또한 VEGF가 염기성 FGF와 상승작용하여 허혈을 완화시킨다는 것도 밝혀졌다 (Asahara et al., Circulation 92: [suppl 2], II-365-71, 1995). 또한 VEGF는 풍선형확대에 의해 손상된 (balloon-injured) 쥐의 경동맥 내피의 복구를 가속화시켜 그 밑에 있는 평활근층이 병적으로 두꺼워지는 것을 막아 결과적으로 관강(菅腔) 직경 및 혈류를 유지한다고 보고되었다 (Asahara et al., Circulation 91: 2793-2801, 1995). 뿐만 아니라 VEGF는 개의 관상 동맥에서 EDRF (내피 유래 이완 인자 (산화질소))-의존적 이완을 유도하여, 혈관 형성과 무관한 제2의 기작을 통해서 허열 부위로의 혈류 증가에 잠재적으로 기여한다고 밝혀져 있다 (Ku et al., Am. J. Physiol. 265:H586-H592, 1993). 이런 데이타를 종합해 보면 창상 치유, 허혈 질병 및 재발협착증에서 VEGF의 잠재적 치료 기능에 대한 확실한 증거를 얻게 된다.

VEGF 단백질족은 적어도 4개의 구성원 즉, VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 및 VEGF-206으로 이루어져 있다. 처음에 특징이 규명된 VEGF는 아미노산 잔기가 165개인 동일한 서브유닛 2개로 구성된 34-45 kDa 당단백질이다 (Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1198-1206, 1989). VEGF-165 cDNA는 잔기 191개의 아미노산 서열을 코딩하며, 이 아미노산 서열은 잔기 26개의 분비 신호 펩티드 (세포로부터 단백질이 분비될 때 쪼개짐)와 잔기 165개의 성숙 단백질 서브유닛으로 구성된다. VEGF-165는 헤파린에 강하게 결합하는데, 이때 잔기 115-159 사이의 강한 염기성 서열이 헤파린에의 결합에 관여하는 것으로 생각된다 (도 1) (Thomas, J. Biol. Chem., 271: 603-06 (1996)). VEGF 단백질족에 속하는 다른 것들은 그 보다 더 짧거나 더 긴 서브유닛, 즉 121, 189, 206개 잔기의 서브유닛을 갖는 호모다이머 단백질들 (각각 VEGF-121, VEGF-189, VEGF-206)이다 (Tischer et al., J. Biol. Chem. 266: 11947-54, 1991, Park et al., Mol. Biol. Cell 4:1317-26 (1993)). 이들 4가지 VEGF 형태는 VEGF 유전자에서 최대 8개의 엑손이 선택적 스플라이싱되어 발생된다 (VEGF-121은 엑손 1-5, 8, VEGF-165는 엑손 1-5, 7, 8, VEGF-189는 엑손 1-5, 6a, 7, 8, VEGF-206은 엑손 1-5, 6b, 7, 8 (엑손 6a 및 6b는 동일한 엑손의 선택적 스플라이싱 형태 2가지를 일컬음)) (Houck et al., Mol. Endocr., 5: 1806-14 (1991)). VEGF 서열에는 보존된 디술피드-형성 코어 시스테인 잔기가 8개 있다. 모든 VEGF 유전자는 VEGF 단백질을 분비 경로로 보내는 신호 펩티드를 코딩한다. 그러나 VEGF-121 및 VEGF-165만이 배양 세포로부터 쉽게 분비되며, VEGF-189 및 VEGF-206은 세포외 매트릭스에 결합된 상태로 남아있다. 이런 형태의 VEGF는 VEGF-189 및 VEGF-206의 잔기 115-139에 해당하는, 매우 염기성이 강한 서열 (매트릭스 타켓팅 서열)을 추가로 갖고 있어서, 세포외 매트릭스의 산성 성분에 대한 높은 친화도를 갖는다 (Thomas, J. Biol. Chem. 271: 603-06 (1996)).

각종 VEGF 동종형(isoform)의 유사분열 촉진 활성은 각 동종형마다 다르다. 예를 들어 VEGF-121과 VEGF-165는 내피세포에 대한 유사분열 촉진 활성이 매우 유사하다. 반면에 VEGF-189 및 VEGF-206은 약한 유사분열 촉진 활성만을 띈다 (Ferrara et al., Endocr. Rev. 13: 18-32, 1992). 이 동종형들의 저조한 활성은 이들이 세포 및 매트릭스와 강력하게 결합되어 있기 때문이며, 이는 VEGF-189 및 VEGF-206에 공통적으로 존재하는 24개 잔기의 "매트릭스 타겟팅" 서열 (도 1의 잔기 115-139)을 제거한 VEGF-206 돌연변이체의 경우 유사분열 촉진 활성이 정상적이라는 것에 의해 입증된다 (Ferrara et al., Endocr. Rev. 13: 18-32, 1992).

플라스민에 의해 생성된 VEGF-165 N-말단 단편 (VEGF (1-110))은 KDR 수용체에 VEGF-165 및 VEGF-121과 동일한 친화도로 결합한다. 그러나 C-말단 VEGF 단편 (111-165)은 결합 활성이 전혀 없다 (Keyt et al., J. Biol. Chem. 271: 7788-95, 1996). 이 연구에서 흥미로운 것은 VEGF-121 및 VEGF-110의 유사분열 촉진 활성이 VEGF-165에 비해서 대략 110 배 정도 감소했다는 점이다. 이런 사실은 VEGF 동종형의 생물학적 효능에 있어서 VEGF-165의 C-말단 도메인이 일정한 역할을 하고 있음을 암시한다. 이 발견은 VEGF-121 및 VEGF-165의 내피세포 증식에 대한 효능이 동일하다는 것을 입증한 이전의 결과들을 고려하면 그 중요성이 다소 불분명하다. 게다가 KDR 수용체와 VEGF의 기능적 상호작용이 세포 표면 헤파린 황산염 프로테오글리칸(들)에 따라 적어도 부분적으로 달라지는 것으로 여겨지기 때문에 (Cohen et al., J. Biol. Chem., 270: 11322-26, 1995, Tessler et al., J. Biol. Chem. 269: 12456-61, 1994), 결과상의 차이가 여러 실험계 간의 차이로부터 유발되는 것으로 생각할 수 있다. 이런 맥락에서 보면 세포 표면 헤파린 황산염이 VEGF-121 (헤파린 결합 도메인 결여) 및 VEGF-165 (헤파린 결합 도메인 보유)의 기능적 상호작용을 어느 정도 조절하는지가 불분명하다 (Tessler et al., J. Biol. Chem. 269: 12456-61, 1994, Cohen et al., J. Biol. Chem. 270: 11322-26, 1995, Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 271: 5519-23 (1996)).

VEGF는 혈소판 유래 증식인자 (PDGF)와 근친관계에 있다 (Andersson et al., Growth Factors 12: 159-64, 1995). 또한 VEGF는 태반 증식인자 (PlFG) 유전자인 PlGF-129 및 PlGF-150에서 유도된 단백질족과도 근친관계에 있다 (Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9267-71, 1991, Oncogene 8: 925-31, 1993). 더 최근에는 여러 VEGF-관련 유전자가 추가로 동정되었는데, 이를 테면 VEGF-B (VEGF-관련 인자 VRF-1로도 불림) (Grimmond et al., Genome Res. 6: 122-29, 1996, Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2567-81, 1996) VRF-2 (Grimmond et al., Genome Res. 6: 122-29, 1996) 및 VEGF-C (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988-92, 1996) 및 VEGF-3 (PCT 출원 제PCT/US95/07283, 1996년 12월 12일 공개, 공개 번호 WO96/39421)이 있다. 마지막으로 두 개의 바이러스 코딩 VEGF-관련 서열이 밝혀졌는데, 천연두바이러스 ORF-1 및 ORF-2가 그것이다 (Lyttle et al., J. Virol. 68: 84-1994). PDGF를 제외하면 이들 단백질들은 VEGF-관련 단백질 (VRP)로 불린다. VRP에 속하는 서열의 예들을 도 1에 나타냈다.

VRP 및 지금까지 알려진 PDGF는 자신들의 서열 내에 상대적 위치가 보존된 시스테인 8개를 갖고 있다. 따라서 이 보존된 시스테인에 걸쳐있는 단백질 서열을 본 명세서에서는 코어 서열이라 부르며, 이 서열의 N-말단쪽의 첫번째 보존 시스테인을 "코어 서열의 제1 시스테인" 또는 "제1 코어 시스테인"이라 명명한다.

흥미롭게도 VEGF 족의 구성원들은 헤테로다이머, 예를 들면 VEGF 및 PlGF 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머를 형성할 수 있다 (DiSalvo et al., J. Biol. Chem. 270: 7717-23, 1995, Cao et al., J. Biol. Chem. 271: 3154-62, 1996). VEGF가 혈관 형성 및 내피세포 증식을 자극하는 효능이 매우 큰 반면, VEGF/PlGF 헤테로다이머는 유사분열촉진인자로서의 효능이 떨어지며, PlGF 호모다이머는 유사분열 촉진 활성이 거의 없거나 전혀 없다 (DiSalvo et al., J. Biol. Chem. 270: 7717-23, 1995, Cao et al., J. Biol. Chem. 271: 3154-62, 1996). 다른 실험에서는 VEGF-165/VEGF-B 헤테로다이머가 두 유전자 모두로 세포를 형질감염시킨 후에 형성되는 것이 발견되었다 (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2567-81, 1996).

VEGF는 내피세포 상에 존재하는 두 수용체인 KDR/flk-1 (Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-86, 1992) 및 flt-1 (De Vries et al., Science 255: 989-91, 1992)와 상호작용한다. 전하를 띤 잔기의 알라닌 스캐닝을 통한 VEGF-165의 체계적 위치지정 돌연변이 유발 결과는 잔기 D63, E64 및 E67이 VEGF가 flt-1에 결합하는데 관여하고, 염기성 잔기인 R82, KI84 및 H86이 KDR에의 결합에 크게 기여한다는 것을 보여주었다 (Keyt et al., J. Biol. Chem. 271: 5638-46, 1996).

VRP는 3개의 상이한 내피세포 수용체 중 하나 이상에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이들 수용체는 각각 하나의 막횡단(transmembrane) 단백질로서 면역글로불린형 도메인 7개로 이루어진 거대한 세포외 부분 및 티로신 키나아제로 작용하는 세포질 부분이 있다. 이들 수용체는 KDR/flk-1 (Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-86, 1992), flt-1 (De Vries et al., Science 255: 989-91, 1992) 및 flt-4 (Pajusola et al., Cancer Res. 52: 5738-43, 1992)이다. 이들 수용체와 여러 VEGF 리간드 사이의 선택성은 차이가 있으나 아직까지 완전히 밝혀지지는 않았다. 그러나 VEGF가 KDR 및 flt1에 결합하나 (Terman et al., Growth Factors 11: 187-95, 1994) flt4에는 결합하지 않으며 (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996), PlGF가 flt1에는 결합하지만 KDR (Terman et al., Growth Factors 11: 187-95, 1994) 및 flt4 (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996)에는 결합하지 않으며, VEGF-C가 flt-4에 결합한다는 것(Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996)은 알려져 있으나, VEGF-C가 KDR에도 결합하는지 여부는 논란의 여지가 있다 (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988-92, 1996). VEGF-B/VRF-1, VRF-2 및 바이러스 코딩 VRP에 대한 수용체 특이성은 현재는 밝혀지지 않았다. 그러나 VEGF-B가 내피세포 증식을 자극하는 데다 (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2567-81, 1996) KDR이 내피세포의 VEGF-형 증식인자에 대한 혈관 형성 반응에 우선적인 원인으로 여겨지고 있기 때문에 VEGF-B는 KDR에 결합할 수 있다는 추측이 가능하다 (Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 271: 5519-23 (1996)).

내피세포를 "혈관 형성능력이 있는" 것으로 만든다고 여겨지는 KDR 수용체가 VRP 대부분에 의해 활성화된다고 밝혀진 바 있다. 그러한 활성에 대한 증거는 내피세포 증식을 촉진하는 VEGF-B (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2567-81, 1996), 내피세포 이동 및 증식을 촉진하는 VEGF-C (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988-92, 1996) 및 맥관형성성인 것으로 보고된 공지된 바이러스 코딩 VRP 둘 모두에 대해 제시된 바 있다 (Lyttle et al., J. Virol. 68: 84-92, 1994). 주목할만한 예외는 PlGF 동종형 호모다이머로서, 이는 내피세포에 대한 유사분열 촉진 활성이 무시할 수 있는 정도에 불과하다. 그러나 PlGF/VEGF 헤테로다이머는 여전히 상당한 유사분열 촉진 활성을 보유하고 있다 (DiSalvo et al., J. Biol. Chem. 270: 7717-23, 1995, Cao et al., J. Biol. Chem. 271: 3154-62, 1996).

VEGF는 여러 다른 조직에서 발현된다. 이와 마찬가지로 VRP 유전자 또한 다수의 조직에서 발현되지만, 특히 흥미로운 것은 VEGF-B와 이보다는 덜한 정도로 VRF-2가 사람 심장 및 골격근에서 강력하게 발현된다는 점이다 (Grimmond et al., Genome Res. 6: 122-29, 1996, Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2567-81, 1996). 사실상 VEGF-B는 생쥐의 심장에서 VEGF보다 훨씬 더 강력하게 발현된다 (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2567-81, 1996). VEGF-C도 각종 인체 조직에서 강력하게 발현되며, 그 중에서도 심장 및 골격근에서 가장 두드러지게 발현된다 (Joukov et al., EMBO J. 15: 290-98, 1996). 이런 발현 패턴 및 내피세포에 대한 VRP의 섬세한 특이성은 이들 인자들이 이들 조직에서 혈관 형성에 생리적 역할을 담당하고 있음을 의미한다. 이는 심장 근육내에 적절한 모세혈관을 공급해 주기 위해 측지 혈관 형성이 요구되는 관 허혈 등의 병태에 관련된 것으로 생각된다. 관상 동맥 결찰 또는 산소압저하에 의해 유도된 일시적 허혈은 생체내 쥐 또는 돼지 심장에서 VEGF mRNA를 상향조절하며, 산소압저하는 시험관내 심근세포 및 평활근세포에서 VEGF mRNA를 유도하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Hashimoto et al., Am. J. Physiol. 267, H1948-H1954, 1994, Banai et al., Cardiovac. Res. 28: 1176-79, 1994, Circulation 90, 649-52, 1994). 심장에서 VEGF 및 VRP의 강력한 발현은 새로운 혈관 형성이 필요한 때에 혈관 형성을 유도할 수 있는, 풍부하고 능력있는 조절 시스템을 확보하는데 도움이 될 수 있다. 측지 혈관 형성은 말초 (하지(下肢)) 혈관 허혈 및 뇌 허혈 (졸중)에도 필요하다. 마지막으로 새 혈관 형성은 창상을 당한 후에 조직 복구 과정에서 필요하다. 이런 맥락에서 VEGF가 피부 창상 치유시 상피 각질세포에서 상향조절된다는 것은 주목할만한 가치가 있다 (Brown et al., J. Exp. Med. 176: 1375-79, 1992). 따라서 심근 경색, 만성 관 허혈, 만성 하지 허혈, 창상 치유 및 졸중 등의 각종 허혈성 질환을 VRP로 치료하는 것은 잠재적으로 임상적 유용성을 가질 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 VEGF-관련 단백질 (VRP), 더욱 바람직하게는 사람 VRP의 말단이 잘린 신규 형태에 관한 것이다. 본 발명의 말단이 잘린 VRP 및 핵산 분자 조성물의 바람직한 용도는 심장병, 창상 또는 다른 허혈성 질환 환자의 치료를 돕기 위해 그러한 조성물을 사용하여 상기 환자들에게서 혈관 형성을 촉진하는 것이다. VRP의 아미노산 서열은 VRP 및 VEGF 단백질 간에 보존된 디술피드 형성 시스테인 잔기 8개 (코어 시스테인)를 포함한다. VRP에는 VEGF-B, VEGF-C, VRF-2, ORF-1, ORF-2, PlGF 등이 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제1 측면은 상기 서브유닛 중의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽의 아미노산 잔기가 1개 이상 결실된, 말단이 잘린 VRP를 제공한다. 그 조성은 다른 단백질을 실질적으로 배제할 것이다. 바람직하게는 말단의 절단 범위가 최소한으로는 성숙 단백질 서브유닛 (신호 서열을 포함하지 않음)의 N-말단 잔기만이며, 최대로는 성숙 단백질의 (N-말단 잔기에서부터 제1 코어 시스테인 잔기 (앞)까지 이르는) N-말단 아미노산 전부이다. 더 바람직한 측면에서는 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단에 있는 아미노산 잔기가, 상기 제1 시스테인의 바로 N-말단쪽에 있는 1 내지 5개의 아미노산 서열을 제외하고는 전부 결실된다.

아미노산 결실이 N-말단 서열에서 인접하지 않은 아미노산 잔기들의 결실로 이루어질 수도 있지만 바람직한 것은 연속된 아미노산 잔기들의 결실이다. 따라서 바람직한 한 측면에서 본 발명은 결실되는 아미노산 잔기 서열의 길이가 N-말단쪽 서열의 N-말단으로부터 최대로는 VRP 서브유닛 서열 중의 코어 서열의 제1 시스테인에 이르기까지 변하는 것인 사람 VRP를 포괄한다.

바람직한 측면에서 본 발명은 VRP 즉 VEGF-B, VRF-2, VEGF-C, VEGF-3, PlGF, 천연두바이러스 ORF-1 및 천연두바이러스 ORF-2의 말단이 잘린 형태를 제공한다. 이들 말단이 잘린 VRP 내의 각 서브유닛은 서로 독립적으로 그 서브유닛 중의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽 아미노산 잔기가 적어도 하나 이상 결실된 것일 수 있거나, 또는 그 서브유닛 중 하나만이 그렇게 결실된 것일 수 있다.

특정한 실시태양에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 코어 서열의 제1 시스테인의 N-말단쪽에서 결실된 아미노산 잔기의 개수가 다양한 VRP 서브유닛을 포함한다. 한 측면에서는, 남아있는 N-말단 잔기는 N-말단 서열로부터 유래된 연속 아미노산 잔기로 구성된다. 이들 연속적인 N-말단 잔기들은 N-말단쪽 서열의 어느 위치에서나 유래될 수 있지만, N-말단쪽 서열의 N-말단으로부터 출발하는 연속 서열이 바람직하며, VRP 서브유닛 중의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 바로 N-말단쪽에 있는 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 서열이 가장 바람직하다. 그러한 가장 바람직한 실시태양의 예는 도 2에 나타냈다.

다른 실시태양에서 본 발명의 말단이 잘린 VRP의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽에 있는 아미노산 잔기들은 무작위로 선택된 아미노산 잔기이며, 이와 또른 실시태양에서는 이들 아미노산 잔기들이 전장(全長) VRP 서열의 N-말단 서열로부터 유래된 것이기는 하나 전장 VRP 서열로부터 반드시 연속적인 아미노산은 아니다.

따라서 가장 바람직한 한 측면에서 본 발명은 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 코어 서열에서 제1 시스테인의 N-말단 아미노산 잔기가 결실된 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 제공한다.

다른 측면에서는 코어 서열의 N-말단의 아미노산 서열이 11 내지 20, 더욱 바람직하게는 11 내지 15, 더욱 바람직하게는 6 내지 10, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어진, 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 제공한다.

바람직하게는 코어 서열의 N-말단의 아미노산 서열이 상기 VRP 서브유닛의 코어 서열에서 제1 시스테인의 바로 N-말단쪽에 있는 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 것이다. 따라서 이들 바람직한 실시태양에서 말단이 잘린 VRP는 코어 서열, 코어 서열에 대해 C-말단쪽의 필요 서열을 포함하며, 추가로 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단 부위에, 전장 VRP 서열의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 바로 N-말단쪽에 있는 아미노산 서열의 연속적 아미노산 잔기 11 내지 20, 더욱 바람직하게는 11 내지 15, 더욱더 바람직하게는 6 내지 10, 가장 바람직하게는 2 내지 5 개를 포함한다.

당업자라면, 말단이 잘린 VRP 서브유닛이 예를 들어 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽에 아미노산 (X개)을 포함하는 경우에 그러한 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 상응하는 전장 VRP 서브유닛이 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽에 아미노산 (X + 1개)을 포함하는 것임을 이해할 것이다.

본 발명의 말단이 잘린 VRP는 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 두 개로 이루어진 말단이 잘린 VRP 호모다이머 (여기서 말단이 잘린 VRP 서브유닛 두 개는 아미노산 서열이 동일함)를 포함하며, 또한 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 두 개로 이루어진 말단이 잘린 VRP 헤테로다이머 (여기서 두 서브유닛은 아미노산 서열이 서로 다름)도 포함한다.

본 발명의 목적상 "제1 N-NN" 아미노산 (여기서 N 및 NN은 각기 아미노산의 개수를 나타냄, 예를 들면 제1의 10-15개 아미노산)은 해당 VRP의 신호 펩티드 서열 다음의 제1 N-NN 아미노산 (예를 들면 제1의 10-15개 아미노산)을 나타낸다. 용어 N-NN은 신호 서열 뒤의 첫번째 아미노산 N 내지 NN의 임의의 위치의 결실을 포괄한다. 따라서 더욱 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 10-15개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 15-20개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 20-25개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 23-24개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 hVEGFB 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 10-15개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 15-20개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 20-25개 아미노산이 결실, 가장 바람직하게는 제1의 23-24개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 hVRF2 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 95-100개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 100-105개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 105-110개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 108-109개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 hVEGFC 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 16-21개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 21-26개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 26-31개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 29-30개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 hPlGF 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 10-15개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 15-20개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 20-25개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 23-24개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 hVEGF3 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 20-25개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 25-30개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 30-35개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 33-34개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 pvORF1 단백질 서브유닛으로 이루어진다.

다른 더 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛은 제1의 30-35개 아미노산이 결실된, 더 바람직하게는 제1의 35-40개 아미노산이 결실된, 더욱 바람직하게는 제1의 40-45개 아미노산이 결실된, 가장 바람직하게는 제1의 43-44개 아미노산이 결실된, 말단이 잘린 pvORF2 단백질 서브유닛으로 이루어진다. 몇몇 바람직한 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 예들의 서열을 도 2에 기재했다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 예를 들면 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명은 또한 말단이 잘린 VRP 코딩 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 벡터 및 그러한 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주 세포 (이 때 벡터는 본원에 기재된 것과 같은 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 합성을 유도함)도 제공한다.

본 발명은 또한 적절한 숙주계에서 발현을 촉진할 목적으로 N-말단이 잘린 VRP 서브유닛의 생합성 전구체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 그런 핵산 분자는 말단이 잘린 서브유닛의 N-말단 앞에 있는 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함한다. VEGF 또는 VRP의 신호 서열은 적절한 신호 펩티드를 포함하는 말단이 잘린 VRP 형태를 제작하는데 사용될 것이다. 사람 VEGF 신호 펩티드는 mnfllswvhwslalllylhhakwsqa (서열 40)이다. 또한 도 1에 보인 신호 펩티드를 사용할 수도 있다. 바람직하게는 말단이 잘린 VRP에 대해 특이적인 신호 펩티드를 제작에 사용한다.

말단이 잘린 VRP 형태에 신호 서열을 융합시킨 후 포유동물 세포에서 신호 펩티드 절단을 용이하게 하기 위해, hVEGFB의 경우에는 성숙 VRP 펩티드 서열의 제1 잔기 또는 제1 잔기 2개, 예를 들면 프롤린(P) 또는 프롤린-발린 (PV)을 포함할 필요가 있을 수 있다. 따라서 적합한 핵산 분자는 VEGF-B의 신호 서열 코딩 DNA, 임의로는 그 뒤에 프롤린 (성숙 VEGF-B의 제1 잔기)의 코돈, 임의로는 그 뒤에 발린 (성숙 VEGF-B의 제2 잔기)의 코돈 및 그 뒤에 N-말단이 절단된 VEGF-B 코딩 DNA로 이루어질 것이다. 본 발명은 또한 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 비포유동물 숙주에게 가장 적합한, 다른 적절한 신호 펩티드 융합 제작물도 제공한다. 당업자라면 신호 펩티드가 경우에 따라서는 본 발명의 말단이 잘린 각종 VRP 서브유닛을 위한, 포유동물 세포 내에서 신호 펩티드 절단을 용이하게 하는데 필요한 잔기를 포함해야 한다는 것을 이해할 것이다.

따라서 본 발명은 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자의 5' 말단이 신호 펩티드 코딩 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 발현 벡터를 제공한다. 이 신호 펩티드는 사람 VRP 신호 펩티드일 수 있다. 또한 이 신호 펩티드 코딩 DNA 서열은 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있을 수 있으며, 이 때 상기 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA의 3' 말단은 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛 코딩 핵산 분자에 작동가능하게 연결되어 있다. 다른 측면에서 상기 신호 펩티드 코딩 DNA 서열은 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기 2개를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있으며, 이때 상기 2개의 잔기를 코딩하는 3' 말단은 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛 코딩핵산 분자에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서 바람직한 측면에서 본 발명은 상기한 바와 같고 또한 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 N-말단에 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기 1 또는 2개를 더 포함하는 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 제공한다. 당업자라면 본 발명의 그러한 말단이 잘린 VRP 서브유닛이 코어 서열의 제1 시스테인의 N-말단 아미노산의 최종 개수가 (신호 펩티드 절단을 용이하게 할 수 있는 1 또는 2개의 추가 아미노산을 포함) 상응하는 전장 VRP의 코어 서열의 제1 시스테인의 N-말단 아미노산의 개수 보다 하나 이상 작다는 것을 인식할 것이다.

다른 바람직한 측면에서 본 발명은 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기 1 또는 2개를 N-말단에 포함하는 말단이 잘린 VRP 서브유닛 2개로 이루어진 말단이 잘린 VRP 호모다이머 또는 헤테로다이머를 제공한다.

바람직한 측면에서 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 재조합 핵산 분자는 벡터로 형질전환될 숙주 세포에서 작동가능한 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 벡터를 포함하는 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 말단이 잘린 VRP 코딩 핵산 분자를 포함하는 운반 벡터를 포함한다. 그러한 운반 벡터는 예를 들면 바이러스 벡터일 수 있다. 그러한 바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 결합 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서는 본 발명의 말단이 잘린 VRP 코딩 핵산 분자의 5' 말단이 신호 펩티드 코딩 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 바람직하게는 신호 펩티드가 VEGF 신호 펩티드, VEGF-B 신호 펩티드, VRF-2 신호 펩티드, VEGF-C 신호 펩티드, PlGF 신호 펩티드, VEGF-3 신호 펩티드, 천연두바이러스 ORF-1 신호 펩티드 및 천연두 바이러스 ORF-2 신호 펩티드로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는 상기 신호 펩티드는 VEGF-B 신호 펩티드이다. 바람직한 측면에서는 신호 펩티드 코딩 DNA 서열이 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 제1 아미노산 잔기 코딩 DNA의 3' 말단은 상기 말단이 잘린 VRP를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 가장 바람직한 측면에서, 아데노바이러스 벡터는 도 2의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 또다른 바람직한 측면에서는,

(A)(1) 야생형 바이러스를 포함하지 않으며,

(2) E1A/ElB 유전자가 결실된, 부분적인 아데노바이러스 서열 및 이 부분적인 아데노바이러스 서열이 측면에 연결된 프로모터에 의해 작동되는, 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 도입유전자(transgene)를 포함하는

재조합 아데노바이러스 벡터 및

(B) 제약상 허용가능한 담체를 함유하는 여과 주입가능한 아데노바이러스 벡터 제제가 제공된다.

바람직한 측면에서 상기 제제는 30 마이크론 필터를 통해 여과된 것이다. 다른 바람직한 측면에서 말단이 잘린 VEGF 서브유닛은 도 2의 말단이 잘린 VEGF 서브유닛이다. 또다른 바람직한 측면에서 주입가능한 아데노바이러스 벡터 제제는 CMV 프로모터, 심실 심근세포 특이적 프로모터 및 미오신 중쇄 프로모터로 구성된 군에서 선택된 프로모터를 포함한다.

다른 측면에서 본 발명은, 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 적절한 조건하에서 증식시켜서 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 숙주 세포로부터 상기 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 적절한 조건이란 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드가 말단이 잘린 VRP 서브유닛으로 폴딩되도록 주어진다. 포유동물 세포에서 그러한 조건은 세포에 의해 자연적으로 제공되어야 한다. 비포유동물 세포의 경우에는 적절한 pH, 등장성 및 환원 상태가 예를 들어 실시예 2에 기재된 것과 같이 제공되어야 한다. 가장 바람직하게는 본 발명은 말단이 잘린 VRP 서브유닛이 VRP 서브유닛 및 말단이 잘린 VRP 서브유닛으로 구성된 군에서 선택된 제2의 VRP 서브유닛과 다이머를 형성하는 적절한 조건에서 말단이 잘린 VRP을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 측면에서는 동일한 아미노산 서열을 갖는 두 개의 말단이 잘린 VRP 서브유닛으로 이루어진, 말단이 잘린 VRP 호모다이머의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서는 두 개의 VRP 서브유닛의 아미노산 서열이 상이한 말단이 잘린 VRP 헤테로다이머의 제조 방법을 제공한다. 그러한 헤테로다이머는 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나와 말단이 잘리지 않은 VRP 서브유닛 하나, 또는 둘다 말단이 잘린 VRP 서브유닛으로 구성될 수 있다. 이 두 서브유닛은 상이한 VRP로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들면 헤테로다이머는 VEGF-B 서브유닛 하나와 말단이 잘린 VEGF-C 서브유닛 하나로 구성되거나 또는 둘 서브유닛 모두 말단이 절단될 것일 수 있다.

다른 바람직한 측면에서 본 발명은 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 그러한 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈관 형성의 자극 방법을 포함한다.

내피세포를 말단이 잘린 VRP로 처리하는 것을 포함하는, 시험관내에서 내피세포 증식 또는 내피세포 이동을 자극하는데 본 발명의 화합물을 사용하는 방법이 제공된다.

본 발명은 또한 말단이 잘린 VRP 서브유닛 1종 이상을 코딩하며 환자의 체내에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 핵산 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장병 환자의 치료 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서는 본 발명의 말단이 잘린 VRP를 함유하는 제약 조성물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는 환자의 혈관 형성의 자극 방법이 제공된다.

바람직하게는 상기 제약 조성물은 치료적으로 적절한 투여 체계로 투여된다. 다른 바람직한 측면에서는 상기 말단이 잘린 VRP의 혈관 형성 효과를 강화하는 강화제가 투여된다. 그러한 강화제로는 예를 들면 염기성 섬유아세포 증식인자 (bFGF) (FGF-2), 산성 FGF (FGF-1), FGF-4, FGF-5, FGF-6 또는 내피세포를 자극하는 임의의 FGF 또는 다른 맥관형성성 인자 등이 있다. 따라서 본 발명의 한 측면에서는 말단이 잘린 VRP 및 1종 이상의 강화제를 함유하는 제약 조성물이 제공된다. 이 제약 조성물은 또한 심근 경색, 만성 관 허혈, 만성 하지 허혈, 졸중 및 말초 혈관 질병 등의 허혈성 질환 환자의 치료에도 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 제약 조성물을 써서 진피 또는 장 창상 등의 창상을 치료하는 방법도 제공된다.

바람직한 실시태양에서는 말단이 잘린 VRP 서브유닛 1종 이상을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며 또한 심근 내에서 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 운반 벡터를 관상 동맥 하나 또는 양자 모두에 직접 관내 주입하여 환자의 심근에 투여하는 것을 포함하는 환자의 혈관 형성의 자극 방법을 제공한다.

다른 바람직한 실시태양에서는 관상 측지 혈관 발생을 자극하기 위해 상기 방법을 사용할 수 있다.

더 바람직한 실시태양에서는 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 도입유전자를 포함하며 말초 혈관계에서 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 운반 벡터를 대퇴부 동맥 하나 또는 양자 모두에 직접 대퇴부 동맥내 주입에 의해 환자의 말초 혈관계로 투여하는 것을 포함하는 말초 혈관 질병 환자에게서 혈관 발생의 자극 방법이 제공된다.

바람직하게는 본 발명에서 사용된 운반 벡터는 바이러스 운반 벡터이다. 한 바람직한 측면에서 이 운반 벡터는 복제능력이 상실된 아데노바이러스 벡터이다. 또다른 바람직한 측면에서 이 운반 벡터는 아데노바이러스 결합 바이러스 벡터이다.

본 발명은 말단이 잘린 신규 형태의 혈관 내피 증식인자 (VEGF) 관련 단백질에 관한 것이다. 더 구체적으로는 다른 단백질이 실질적으로 없는 N-말단이 잘린 VEGF-관련 단백질에 관한 것이다. 이러한 말단이 잘린 VEGF-관련 단백질은 생체내 및 시험관내에서 혈관 형성(angiogenesis)을 촉진하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 이러한 신규 말단이 잘린 VEGF-관련 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 세포, 조직 및 동물, 이러한 핵산을 이용한 치료 방법 및 지금까지 언급한 모든 것에 관련된 방법에 관한 것이다.

도 1은 VEGF-B (서열 1), VRF-2 (서열 2), VEGF-C (서열 3), PlGF (사람 PlGF-2) (서열 4), VEGF-3 (서열 5), 폭스바이러스 ORF-1 (서열 6) 및 폭스바이러스 ORF-2 (서열 7)의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 소문자는 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드를 의미한다. 코어 서열의 8개의 시스테인은 밑줄을 그어 표시하였다. 서열은 다음 문헌에서 기술된다: 사람 VEGF-B: Grimmond et al., Genome Res. 6:122-29 (1996), Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:2567-81 (1996), 생쥐 VEGF-B: Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:2567-81 (1996), 사람 VRF-2: Grimmond et al., Genome Res. 6:122-29 (1996), 사람 VEGF-C: Joukov et al., EMBO J. 15:290-98 (1996); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1988-92 (1996), PlGF: Maglione et al., Oncogene 8:925-31 (1993); Hauser ＆ Weich, Growth Factors 9:259-68 (1993), 사람 VEGF3: PCT 출원 번호 제PCT/US95/07283 (1996년 12월 12일 WO96/39421호로 공개됨), 천연두바이러스 ORF-1 및 ORF-2: Lyttle et al., J. Virol. 68:84-92 (1994).

도 2a-2f는 전장 (F/L) VRP 서열 밑에 말단이 잘린 VRP 아미노산 서열의 예를 도시한 것이다. 각 잘린 부분의 아미노산 서열은 다음과 같다.

2a(F/L) (서열 34): (1) (서열 8); 2a(2) (서열 9); 2a(3) (서열 10); 2a(4) (서열 11); 2a(5) (서열 12); 2a(6) (서열 13); 2b(F/L) (서열 35); (1) (서열 14); 2b(2) (서열 15); 2b(3) (서열 16); 2b(4) (서열 17); 2c(F/L) (서열 36); (1) (서열 18); 2c(2) (서열 19); 2c(3) (서열 20); 2c(4) (서열 21); 2d(F/L) (서열 37); (1) (서열 22); 2d(2) (서열 23); 2d(3) (서열 24); 2d(4) (서열 25); 2e(F/L) (서열 38); (1) (서열 26); 2e(2) (서열 27); 2e(3) (서열 28); 2e(4) (서열 29); 2f(F/L) (서열 39); (1) (서열 30); 2f(2) (서열 31); 2f(3) (서열 32); 및 2f(4) (서열 33).

신규 말단이 잘린 VRP 서열의 제조

본 발명은 제1 측면에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛 1개 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 특징으로 한다. "말단이 잘린 VRP 서브유닛"은 성숙 서브유닛의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽에 있는 하나 이상의 N-말단 아미노산 잔기가 결실된 하나의 VRP (예를 들어 도 1에 도시한 서열 중의 하나), 또는 그의 유사체 또는 유도체 (이에 제한되지 않음)에 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VRP 서브유닛을 의미한다. VRP에 "실질적으로 유사한" 서열은 VEGF-B의 8개의 시스테인 코어 서열에 25% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 코어 서열의 필수적인 보존 시스테인 잔기를 모두 포함하고 VRP 활성을 보유한다. "말단이 잘린 VRP 서브유닛"은 또한 VEGF 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽에 있는 하나 이상의 N-말단 아미노산 잔기가 결실되고 코어 서열의 하나 이상의 비필수 시스테인이 결실된 VRP 서브유닛을 의미한다. 비필수 시스테인은 VRP 활성의 보유에 필요하지 않은 잔기이다. 이러한 비필수 시스테인은 PDGF와 관련하여 문헌에 기재되어 있다 (Potgens, et al., J. Biol. Chem. 269:32879-85 (1994)).

"동일성"은 서열의 유사성 또는 관계의 척도가 되는 서열의 특성을 의미한다. 동일성은 동일한 잔기의 수를 잔기의 총수로 나눈 후 100을 곱함으로써 계산된다. 따라서, 정확히 동일한 서열의 2 카피는 100% 동일성을 갖지만, 보존성이 높지 않고 결실, 부가 또는 치환을 갖는 서열은 동일성의 정도가 더 낮을 수 있다. 서열 동일성을 계산할 때, 2개의 서열은 N-말단 결실부의 카르복시 말단에서 출발하여 비교된다. 당업계의 숙련가는 서열 동일성 측정에 유용한 여러 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있음을 알 것이다.

말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛의 유사체는 관련 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛의 하나 이상의 활성을 일정 정도로 보유하고 아미노산 서열이 유사한 기능적 등가물이다. "기능적 등가물"은 말단이 잘린 특정 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛의 활성을 한 가지 이상 대신할 수 있는 활성을 갖는 유사체를 의미한다. 바람직한 기능적 등가물은 말단이 잘린 특정 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛의 모든 활성을 보유하지만, 기능적 등가물은 정량적으로 측정시에 예를 들어 본원에서 개시되는 바와 같은 VRP 기능 분석에서 측정한 바와 같이 더 강하거나 약한 활성을 가질 수 있다. 대부분의 경우, 상기 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛은 기능 활성을 측정하기 위해서 말단이 잘린 VRP 다이머 내에 도입되어야 한다. 바람직한 기능적 등가물은 관련 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛 활성의 1 내지 10,000%, 보다 바람직하게는 10 내지 1000%, 보다 더 바람직하게는 50 내지 200%의 활성을 갖는다.

일부 활성을 보유하는 유도체의 능력은 본원에 개시된 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 유도체는 번역 동안 또는 번역 후에 발생하는 변형, 예를 들어 인산화, 글리코실화, 가교결합, 아실화, 단백질 분해, 항체 분자, 멤브레인 분자 또는 다른 리간드에 대한 결합을 포함한다 (Ferguson et al., 1988, Annu. Rev. Biochem. 57:285-320).

유도체 또는 유사체의 특정 종류는 결실, 치환, 부가 및 아미노산 변형과 같은 아미노산 변이를 포함한다. "결실"은 관련 폴리펩티드 내에 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부재를 의미한다. "부가"는 관련 폴리펩티드 내에 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 존재를 의미한다. 폴리펩티드에 대한 부가 및 결실은 아미노 말단, 카르복시 말단 및(또는) 내부에서 발생할 수 있다. 아미노산 "변형 (modification)"은 천연 아미노산이 변이되어 비천연 아미노산을 생성시킴을 의미한다. "치환"은 폴리펩티드 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)이 다른 아미노산 잔기(들)에 의해 대체됨을 의미한다. 유도체는 1 개 이상의 변이 및 다른 종류의 변이를 포함하는 변이의 상이한 조합을 포함할 수 있다.

VRP 활성에 대한 아미노산 변화의 영향은 인산화, 글리코실화, 내부 사슬 연결, 3차 구조 및 활성 부위 또는 있을 수 있는 알로스테릭 부위에서 아미노산의 역할 등의 요인에 따라 달라지지만, 치환된 아미노산은 대체되는 아미노산과 동일한 군으로부터 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다. 다음과 같은 군은 어느 정도 상호 교환가능한 아미노산을 함유한다: 염기성 아미노산 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 산성 아미노산 아스파르트산 및 글루탐산; 중성 극성 아미노산 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴 및 보다 약한 정도로 메티오닌; 비극성 지방족 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신 (그러나, 크기 때문에 글리신 및 알라닌이 보다 밀접하게 관련되고, 발린, 이소류신 및 류신이 보다 밀접하게 관련된다); 방향족 아미노산 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 또한, 상이한 범주로 분류되더라도, 알라닌, 글리신 및 세린은 어느 정도까지는 상호 교환가능한 것으로 보이며, 시스테인은 상기 군에 추가로 포함되거나 또는 극성 중성 아미노산으로 분류될 수 있다.

바람직한 유도체는 관련 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛의 활성에 큰 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산 변이(들)을 갖는다. 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛에서 VRP 활성에 필요하지 않은 영역의 아미노산은 활성에 거의 영향을 주지 않으면서 결실, 부가 또는 치환될 수 있다. VRP 활성에 필요한 영역에서, 아미노산 변이는 VRP 활성에 영향을 줄 위험이 더 크기 때문에 바람직하지 않다. 이러한 변이는 보존적 변이이어야 한다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

보존 영역은 비보존 영역보다 단백질 활성에 있어서 더 중요한 것이 일반적이다. 시험관내 돌연변이 유발법 또는 결실 분석법을 사용하고 본원에서 개시되는 바와 같이 VRP 활성을 측정하여 VRP 활성에 중요한 보존 및 비보존 영역을 정하기 위해 표준 방법을 사용할 수 있다.

유도체는 표준 화학 기술 및 재조합 핵산 분자 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 특이적인 폴리펩티드에 대한 변형은 위치지정 돌연변이법 및 고상 합성 동안의 아미노산 치환을 통하여 실시되는 바와 같이 인위적일 수 있거나, 또는 폴리펩티드를 생산하는 숙주의 돌연변이를 통하는 것과 같은 우연에 의한 것일 수 있다. 유도체를 포함하는 폴리펩티드는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌의 15장에는 클로닝된 DNA의 위치지정 돌연변이법의 과정이 기술되어 있다.

"말단이 잘린 VRP 폴리펩티드"는 본 발명의 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 아미노산 서열 또는 본원에서 설명되는 바와 같은 그의 기능적 유사체 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "말단이 잘린 VRP 폴리펩티드"는 또한 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 포함하고, 용어 서브유닛은 일반적으로 3차원 활성 구조로 폴딩되는 폴리펩티드를 의미한다.

"말단이 잘린 VRP"는 2개의 VRP 서브유닛의 다이머를 의미한다. 2개의 서브유닛은 말단이 잘린 VRP 서브유닛인 2개의 상이한 VRP로부터 유도될 수 있다. 서브유닛 중의 하나 또는 둘 모두가 말단이 잘린 것일 수 있고, 2개의 서브유닛은 또한 상이한 N-말단 결실을 가질 수 있다.

말단이 잘린 VRP, 말단이 잘린 VRP 서브유닛 또는 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드는 농축되거나 정제되는 것이 유리하다. 상기 표현에서 용어 "농축"은 특정 아미노산 서열이, 정상 또는 병든 세포에서 또는 서열이 채취되는 세포에서보다 목적 세포 또는 용액에 존재하는 전체 아미노산 서열의 상당히 높은 분획 (2 내지 5배)을 구성한다는 것을 의미한다. 이것은 존재하는 다른 아미노산의 양의 우선적인 저하, 목적하는 특정 아미노산 서열의 양의 우선적인 증가, 또는 2 방법의 조합에 의해 실시될 수 있다. 그러나, 농축이, 존재하는 다른 아미노산 서열이 전혀 존재하지 않는다는 것이 아니라 목적하는 서열의 상대적인 양이 상당히 증가한다는 것을 의미함을 알아야 한다. 여기서 사용된 용어 "상당히"는 증가 수준이 그 증가를 만든 사람에게 유용하다는 것을 나타내기 위해 사용된 것으로, 일반적으로 다른 아미노산 서열에 대해 약 2배, 보다 바람직하게는 약 5배 내지 10배 이상 증가함을 의미한다. 또한, 상기 용어는 다른 공급원으로부터의 아미노산 서열이 전혀 존재하지 않는다는 것을 의미하지 않는다. 다른 공급원의 아미노산 서열은 예를 들어 효모 또는 세균 게놈, 또는 pUC19와 같은 클로닝 벡터에 의해 코딩되는 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 목적하는 아미노산 서열의 비율을 증가시키기 위해 사람이 조작한 상황을 단지 언급하고자 한 것이다.

또한, 정제된 형태의 아미노산 서열도 특정 목적에 유리하다. 폴리펩티드에 대한 용어 "정제된"은 절대적인 순도 (예를 들어 균일 제제)를 필요로 하지 않고, 대신에 서열이 천연 환경에서보다 상대적으로 순도가 높다는 것을 나타낸다 (천연 수준에 비해 mg/ml의 측면에서 10배 이상 더 높아야 한다). 10의 1제곱 이상, 바람직하게는 10의 2 또는 3제곱 이상, 보다 바람직하게는 10의 4 또는 5제곱 이상의 정제가 분명하게 생각된다. 폴리펩티드는 상당한 수준, 예를 들어 90%, 95% 또는 99%의 순도를 갖도록 오염되지 않는 것이 바람직하다.

제2 특징으로서, 본 발명은 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

일부 상황에서, 상기 핵산 분자는 농축되거나 정제되는 것이 바람직하다. 핵산 분자에 대해 사용되는 용어 "농축된"은 특정 DNA 또는 RNA 서열이, 정상 또는 병든 세포에서 또는 서열이 채취되는 세포에서보다 목적 세포 또는 용액에 존재하는 전체 DNA 또는 RNA 서열의 상당히 높은 분획 (2 내지 5배)을 구성한다는 것을 의미한다. 이것은 존재하는 다른 DNA 또는 RNA 양의 우선적인 저하, 목적하는 특정 아미노산 서열의 양의 우선적인 증가, 또는 2 방법의 조합에 의해 실시될 수 있다. 그러나, 농축이, 존재하는 다른 DNA 또는 RNA 서열이 전혀 존재하지 않는다는 것이 아니라 목적하는 서열의 상대적인 양이 상당히 증가한다는 것을 의미함을 알아야 한다. 여기서 사용된 용어 "상당히"는 증가 수준이 그 증가를 만든 사람에게 유용하다는 것을 나타내기 위해 사용된 것으로, 일반적으로 다른 핵산에 대해 약 2배, 보다 바람직하게는 약 5배 내지 10배 이상 증가함을 의미한다. 또한, 상기 용어는 다른 공급원으로부터의 DNA 또는 RNA가 전혀 존재하지 않는다는 것을 의미하지 않는다. 다른 공급원의 DNA는 예를 들어 효모 또는 세균 게놈, 또는 pUC19와 같은 클로닝 벡터로부터의 DNA를 포함할 수 있다. 상기 용어는 한 mRNA가 다른 종류의 mRNA에 비해 자연적으로 증가될 수 있는 자연 발생 사건, 예를 들어 바이러스 감염 또는 종양형 성장과 구별된다. 즉, 상기 용어는 목적하는 핵산 서열의 비율을 증가시키기 위해 사람이 조작한 상황을 단지 언급하고자 한 것이다.

또한, 정제된 형태의 뉴클레오티드 서열도 특정 목적에 유리하다. 핵산 분자에 대한 용어 "정제된"은 절대적인 순도 (예를 들어 균일 제제)를 필요로 하지 않고, 대신에 서열이 천연 환경에서보다 상대적으로 순도가 높다는 것을 나타낸다 (천연 수준에 비해 mg/ml의 측면에서 2 내지 5배 이상 더 높아야 한다).

핵산 분자는 예를 들어 올리고뉴클레오티드 위치지정 돌연변이를 사용한 변형 또는 제한 효소를 사용한 서열의 결실 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 존재하는 VRP 뉴클레오티드 서열로부터 제조할 수 있다. 돌연변이 유발을 위한 표준 재조합 기술, 예를 들어 시험관내 위치지정 돌연변이유발법 (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551, (1978), Sambrook et al., Chapter 15, 상기 문헌), TAB (등록상표) 링커 (Pharmacia)의 사용 및 PCR 의존적 돌연변이 유발을 사용하여 상기 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 핵산 분자는 또한 트리에스테르법 또는 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 또는 유기체 내의 재조합 DNA 벡터 및 재조합 발현 벡터를 특징으로 한다. 재조합 DNA 벡터는 숙주 세포에서 전사를 개시시키기에 효과적인 프로모터를 함유하는 벡터에 말단이 잘린 VRP 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 재조합 DNA 벡터는 세포에서 기능하는 전사 개시 영역 및 세포에서 기능하는 전사 종결 영역을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자 또는 재조합 DNA 벡터를 함유하여 말단이 잘린 VRP 펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 유기체에 관한 것이다. 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 세포로부터 정제될 수 있다. 세포는 유전자 조작을 통하여 정상적으로는 발현하지 않거나 매우 낮은 수준으로만 생산하는 단백질을 생산하도록 처리된 세포를 "목적하는 폴리펩티드를 발현하도록 변형된" 것으로 지칭된다. 당업계의 숙련가는 게놈, cDNA 또는 합성 서열을 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하여 발현시키는 방법을 용이하게 적용할 수 있다.

핵산 분자, 예를 들어 DNA는 전사 및 번역 조절 서열을 함유하고 이러한 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"될 경우 폴리펩티드를 "발현할 수 있는" 것으로 지칭된다. 유전자 서열 발현에 필요한 조절 영역의 정확산 특성은 유기체 각각에 따라 상이할 수 있지만, 일반적으로는 원핵세포에서 프로모터 (RNA 전사의 개시를 지시함) 및 RNA로 전사시에 합성 개시 신호를 발생시키는 DNA 서열을 함유하는 프로모터 영역을 포함한다. 이러한 영역은 일반적으로 전사 및 번역의 개시에 관련되는 5' 비코딩 서열, 예를 들어 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함할 것이다.

예를 들어, 말단이 잘린 VRP 서브유닛 또는 그의 단편의 전체 코딩 서열은 발현을 허용하는 적합한 발현 벡터에서 (1) 외인성 프로모터 서열, (2) 리보좀 결합 부위, (3) 폴리아데닐화 신호 및 (4) 분비 신호 중의 하나 이상과 조합될 수 있다. 변형은 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현을 개선시키기 위해 5' 비번역 서열 및 3' 비번역 서열에서 생성될 수 있거나, 또는 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하면서도 선택되는 발현계에 바람직한 코돈일 수 있도록 코돈을 변형시킬 수 있다. 상기 바람직한 코돈의 사용은 본원에 참고로 포함된 문헌 [예를 들어 Grantham et al., Nuc. Acids Res., 9:43-74 (1981), 및 Lathe, J. Mol. Biol., 183:1-12 (1985)]에 기재되어 있다.

필요한 경우, 게놈 VRP 서열의 3' 비번역 영역은 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이 영역은 그의 전사 종결 조절 서열, 예를 들어 종결 및 폴리아데닐화를 위해 재조합 DNA 벡터에 사용될 수 있다. 따라서, VRP 유전자를 코딩하는 DNA 서열에 천연적으로 인접하는 3' 영역을 보유시킴으로써 전사 종결 신호가 제공될 수 있다. 별법으로, 숙주 세포에서 기능성인 3' 영역은 치환될 수 있다.

작동가능한 연결은, DNA 조절 서열과 발현시키고자 하는 DNA 서열이 유전자 서열 발현을 허용하는 방식으로 연결된 결합을 의미한다. 2개의 DNA 서열 (예를 들어 프로모터 영역 서열 및 말단이 잘린 VRP 서열)은, 2개의 DNA 서열 사이의 연결의 특성이 (1) 코딩 서열 내의 프레임 시프트 돌연변이를 생성시키지 않커나, (2) 말단이 잘린 VRP 유전자 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역 서열의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 프로모터 영역 서열에 의해 전사되는 말단이 잘린 VRP 유전자 서열의 능력을 방해하지 않는다면 작동가능하게 연결된 것으로 지칭된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 DNA 서열의 전사를 달성할 수 있다면 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 따라서, 적합한 숙주에 의해서 인지되는 말단이 잘린 VRP 유전자, 전사 및 번역 신호를 발현시키는 것이 필요하다.

신규 말단이 잘린 VRP 서열의 발현 및 정제

실시예 2 및 3은 바큘로바이러스 시스템에서 발현되는 본 발명의 신규 말단이 잘린 VRP 서열의 발현 및 정제를 설명한다. 당업계의 숙련가는 본 발명의 말단이 잘린 VRP가 본 발명의 범위에 포함되는 원핵세포 및 진핵세포의 다른 세포 시스템에서 발현될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실시예 4 내지 6은 신규 말단이 잘린 VRP의 기능 활성의 적합한 분석에 대한 예를 제공한다.

본 발명의 말단이 잘린 VRP는 일반적으로 재조합 단백질의 생산에 매우 효과적이고 편리한 원핵세포에서 발현될 수 있지만, 상기 세포에서 생산되는 말단이 잘린 VRP는 글리코실화되지 않고, 따라서 체내에서 더 짧은 반감기를 가질 수 있다. 가장 자주 사용되는 원핵생물은 다양한 균주의 이. 콜라이(E. coli)이다. 그러나, 다른 세균 균주를 포함하여 다른 미생물 균주도 사용될 수 있다. 인정되는 원핵세포 숙주는 세균, 이. 콜라이, 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia) 등을 포함한다. 원핵세포 숙주는 발현 플라스미드 내의 레플리콘 및 조절 서열과 상용성이어야 한다.

원핵생물 시스템에서, 숙주와 상용성인 종으로부터 유래한 복제 부위 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 플라스미드 벡터의 예는 pBR322, pUC118, pUC119 등을 포함할 수 있고, 적합한 파지 또는 박테리오파지 벡터는 γgt10, γgt11 등을 포함할 수 있고, 적합한 바이러스 벡터는 pMAM-neo, pKRC 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 선택되는 벡터는 선택되는 숙주 세포에서 복제 능력을 갖는다.

원핵세포에서 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛 (또는 그의 기능적 유도체)를 발현하기 위해서, 말단이 잘린 VRP 서열을 기능성 원핵세포 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것이 필요하다. 적합한 프로모터는 구성적 (constitutive)이거나 또는 보다 바람직하게는 조절가능 (즉, 유도가능 또는 탈억제가능)할 수 있다. 구성적 프로모터의 예는 박테리오파지 λ의 int 프로모터, pBR322의 β-락타마제 유전자 서열의 bla 프로모터 및 pBR325의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터 등을 포함한다. 유도가능 원핵세포 프로모터의 예는 박테리오파지 λ의 주요 우측 프로모터 및 좌측 프로모터 (P_L및 P_R), 이. 콜라이의 trp, recA, λacZ, λacI 및 gal 프로모터, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)의 α-아밀라제 (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162:176-182(1995)) 및 σ-28-특이적 프로모터 (Gilman e tla., Gene sequence 32:11-20(1984)), 바실러스의 박테리오파지의 프로모터 (Cryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) 및 스트렙토마이세스 프로모터 (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478(1986))을 포함한다. 원핵세포 프로모터는 문헌 [Glick, J. Ind. Microbiot. 1:277-282(1987); Cenatiempo, Biochimie 68:505-516(1986) 및 Gottesman, Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)]에 개시되어 있다.

원핵세포에서의 적절한 발현은 또한 유전자 서열 코딩 서열의 상류에 존재하는 리보좀 결합 부위의 존재를 필요로 한다. 이러한 리보좀 결합 부위는 예를 들어 문헌 [Gold et al., Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404(1981)]에 개시되어 있다. 번역 개시에 필요한 리보좀 결합 부위 및 다른 서열은 예를 들어 상기 조절 서열을 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드의 인 프레임 라이게이션에 의해 말단이 잘린 VRP를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다. 원핵세포에서의 발현을 위해서는 어떠한 신호 펩티드 서열도 요구되지 않는다. 조절 서열, 발현 벡터, 형질전환 방법 등의 선택은 유전자 발현에 사용되는 숙주 세포의 종류에 따라 결정된다.

본원에서 사용되는 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환가능한 의미로 사용되고, 모든 상기 명명은 그 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 이로부터 유도된 배양물을 그 이전 횟수에 관계없이 포함한다. 원핵세포에서 발현되는 말단이 잘린 VRP 펩티드는 적절하게 말단이 잘린 VRP 펩티드와 발현 벡터의 서열로부터 예상되는 N-말단 서열의 혼합물, 및 세균 발현 동안 개시 메티오닌의 비효율적인 절단으로부터 발생하는 N-말단 메티오닌을 갖는 말단이 잘린 VRP 펩티드를 포함할 것으로 예상된다. 말단이 잘린 VRP 펩티드는 2종류 모두 N-말단 메티오닌의 존재가 생물학적 활성에 영향을 주지 않을 것으로 예상되기 때문에 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다. 또한, 인위적이거나 우연한 돌연변이에 의해 모든 자손의 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 상기 정의한 바와 같이, 돌연변이 자손은 본래 형질전환된 세포와 동일한 기능을 갖는다.

바람직한 원핵세포 벡터는 플라스미드, 예를 들어 이. 콜라이에서 복제가능한 플라스미드 (예를 들어 pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, πVX)를 포함한다. 상기 플라스미드는 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition, Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)]에 개시되어 있어 있다. 바실러스 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함한다. 상기 플라스미드는 문헌 [Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), PP. 307-329]에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스 플라스미드는 p1J101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)) 및 스트렙토마이세스 박테리오파지, 예를 들어 ψC31 (Chater et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54)를 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 문헌 [John et al., Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986) 및 Izaki, Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978))에 개시되어 있다.

본 발명의 발현 시스템에 사용될 수 있는 진핵 숙주 세포에 대해서는 이들이 말단이 잘린 VRP 펩티드의 발현에 사용하기 적합한 것이라면 특별한 제한은 없다. 바람직한 진핵 숙주는 예를 들어 효모, 진균류, 곤충 세포, 체내 또는 조직 배양물 상태의 포유동물 세포를 포함한다. 숙주로서 유용할 수 있는 포유동물 세포는 HeLa 세포, 섬유아세포 기원의 세포, 예를 들어 VERO 또는 CHO-K1, 또는 임파구 기원의 세포 및 이들의 유도체를 포함한다.

본 발명의 말단이 잘린 VRP는 문헌 [예를 들어 Olofsson, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2576-2581 (1996)]에 기재된 바와 같이 Epstein-Barr 바이러스 핵 항원 1을 발현하는 사람 배(胚) 신장 293EBNA 세포와 같은 사람 세포에서도 발현될 수 있다. 세포는 인산칼슘 침전법을 사용하여 실시예 2의 발현벡터로 형질감염시킨 후, 48시간 이상 동안 인큐베이션한다. 이어서, 말단이 잘린 VRP 펩티드는 실시예 3에서 설명하는 바와 같이 상등액으로부터 정제될 수 있다.

또한, 식물 세포도 숙주로서 사용가능하고, 식물 세포와 상용성인 조절 서열, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 및 19S 및 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열을 사용할 수 있다. 다른 바람직한 숙주는 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 라르배(Drosophila larvae)이다. 숙주로서 곤충 세포를 사용하는 경우, 드로소필라 알콜 탈수소효소 프로모터를 사용할 수 있다 (Rubin, Science 240:1453-1459 (1988)).

효모를 글루코스 풍부 배지에서 성장시킬 때 다량 생산되는 해당 (glycolytic) 효소를 코딩하는, 활발하게 발현되는 유전자 서열로부터 유래한 프로모터 및 종결 성분을 도입한 일련의 효모 유전자 서열 발현 시스템을 이용할 수 있다. 공지의 해당 유전자 서열은 또한 매우 효과적인 전사 조절 신호를 제공할 수도 있다. 효모는 또한 번역후 펩티드 변형도 수행할 수 있기 때문에 상당한 잇점을 제공한다. 목적 단백질을 효모에서 생산하기 위해 사용될 수 있는 강한 프로모터 서열 및 고카피수의 플라스미드를 이용하는 많은 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 서열 생성물 상의 리더 서열을 인식하여 리더 서열을 보유하는 펩티드(즉, 전구-펩티드)를 분비한다. 말단이 잘린 VRP 펩티드의 발현을 위해 포유동물 숙주에 대한 수개의 가능한 벡터 시스템을 사용할 수 있다.

숙주의 특성에 따라 매우 다양한 전사 및 번역 조절 서열을 사용할 수 있다. 전사 및 번역 조절 신호는, 높은 수준으로 발현되는 특정 유전자 서열과 조절 신호가 관련되는 바이러스 공급원, 예를 들어 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 원숭이 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다. 별법으로, 포유동물 발현 생성물, 예를 들어 액틴, 콜라겐, 미오신 등의 프로모터를 사용할 수 있다. 유전자 서열의 발현을 조절할 수 있도록 억제 또는 활성화를 허용하는 전사 개시 조절 신호를 선택할 수 있다. 온도 감수성이어서 온도를 변경시킴으로써 발현을 억제 또는 개시시킬 수 있거나 또는 화학물질 (예를 들어 대사산물) 조절을 받는 조절 신호도 사용할 수 있다.

진핵세포 숙주에서 말단이 잘린 VRP의 발현은 진핵세포 조절 영역의 사용을 필요로 한다. 이러한 영역은 일반적으로 RNA 합성의 개시를 지시하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 바람직한 진핵세포 프로모터는 예를 들어 생쥐 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터 (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288(1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (McKnight, Cell 31:355-356 (1982)); SV40 초기 프로모터 (Benoist et al., Nature (London) 290:304-310(1981)); 효모 gal4 유전자 서열 프로모터 (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975(1982)); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984))를 포함한다.

진핵세포 mRNA의 번역은 처음 메티오닌을 코딩하는 코돈에서 개시된다. 이러한 이유때문에, 말단이 잘린 VRP (또는 그의 기능적 유도체)를 코딩하는 DNA 서열과 진핵세포 프로모터 사이의 연결이, 그 중간에 위치하는 메티오닌을 코딩할 수 있는 코돈 (즉, AUG)를 함유하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 상기 코돈의 존재는 융합 단백질 (AUG 코돈이 말단이 잘린 VRP 코딩 서열과 동일한 리딩 프레임으로 존재하는 경우) 또는 프레임 시프트 돌연변이 (AUG 코돈이 말단이 잘린 VRP 코딩 서열과 동일한 리딩 프레임으로 존재하지 않는 경우)를 형성시킨다.

말단이 잘린 VRP 핵산 분자 및 작동가능하게 연결된 프로모터는 선형 분자 또는 보다 바람직하게는 공유결합된 폐환(closed covalent circular) 분자일 수 있는 비복제성 DNA (또는 RNA)로서 원핵 또는 진핵 수용체 세포에 도입될 수 있다. 이러한 분자는 자율적 복제능이 없기 때문에, 유전자의 발현은 도입된 서열의 일시 발현을 통하여 발생할 수 있다. 별법으로, 임시 발현은 도입된 DNA 서열의 숙주 염색체 내로의 통합을 통하여 발생할 수 있다.

목적 유전자 서열을 숙주 세포 염색체 내에 통합시킬 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 도입된 DNA를 염색체 내에 안정적으로 통합시키는 세포는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선발을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선발될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양성, 살생물제, 예를 들어 항생물질 또는 중금속, 예를 들어 구리 등에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택가능 마커 유전자 서열은 발현되는 DNA 유전자 서열에 직접 연결되거나 동일한 세포에 동시형질감염에 의해 도입될 수 있다. 또한, 단일쇄 결합 단백질 mRNA의 최적 합성을 위해 추가의 성분이 필요할 수 있다. 이들 성분은 스플라이싱 신호, 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 상기 성분을 포함하는 cDNA 발현 벡터는 문헌 [Okayama, Molec. Cell. Biol. 3:280 (1983)]에 기재된 것을 포함한다.

도입된 핵산 분자를 수여체 숙주내에서 자율적으로 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 통합시킬 수 있다. 이러한 목적으로 매우 다양한 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어서 중요한 인자는 벡터를 포함하는 수여체 세포를 인지하여 벡터를 포함하지 않은 수여체 세포로부터 구별할 수 있는데 있어서의 용이성; 특정 숙주에서 요구되는 벡터의 카피수; 및 상이한 종의 숙주 세포들간에 벡터를 "셔틀(shuttle)"시킬 수 있는 것을 원하는지 아닌지 등을 포함한다.

바람직한 진핵세포 플라스미드는 예를 들면, BPV, 백시니아, SV40, 2-미크론 서클 등 또는 이들의 유도체를 포함한다. 이러한 플라스미드들은 당업계에 잘 알려져 있다 [봇스테인(Botstein) 등, Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); 브로취(Broach), In: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p.445-470 (1981); 브로취, Cell 28:203-204 (1982); 볼론(Bollon) 등, J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); 마니아티스(Maniatis), In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol.3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp.563-608 (1980)].

일단 구조물(들)을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 발현시키기 위해 제조하면, DNA 구조물(들)을 형질전환법, 형질감염법, 접합법, 프로토플라스트 융합법, 전기천공법, 미립자총(particle gun) 기법, 지질감염(lipofection)법, 인산칼슘 침전법, 직접적인 현미주사법, DEAE-덱스트란 형질감염법 등과 같은 임의의 각종 적당한 수단에 의해 적절한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 진핵세포주를 플라스미드 DNA로 형질감염시키기 위한 가장 효율적인 방법은 주어진 세포 유형에 따라 변한다. 벡터를 도입시킨 후, 수여체 세포를 선택 배지에서 배양하며, 이는 벡터 함유 세포를 선택하여 성장시킨다. 클로닝된 유전자 분자(들)을 발현시키면 말단이 잘린 VRP 또는 그의 단편들이 생산된다. 이는 형질전환된 세포 자체에서 또는 이들 세포를 분화시키기 위해 유도시킨 후 (예를 들면, 신경아세포종 세포에 브로모데옥시우라실을 투여하는 등에 의해) 일어날 수 있다. 본 발명의 펩티드를 형성하기 위해 다양한 배양 조건을 이용할 수 있다. 가장 바람직한 조건은 생리학적 조건을 모방하는 조건이다.

안정한 형질감염체의 생산은 예를 들면, 적절한 세포주를 pCEP4와 같은 진핵세포 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 수행할 수 있으며, 이때, 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드 또는 서브유닛에 대한 코딩 서열이 다중 클로닝 부위로 클로닝된다. 이들 발현 벡터는 다양한 포유동물 세포에서 원하는 DNA 분자를 높은 수준으로 전사시키는 사람 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV)와 같은 프로모터 부위를 포함한다. 또한, 이들 벡터는 관심있는 DNA 분자를 안정하게 발현하는 세포의 선별을 위한 유전자를 포함한다. pCEP4 벡터에서 선별가능한 마커는 형질감염되지 않은 세포를 사멸시키기 위해 배양액에 첨가되는 대사 억제제인 하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 효소를 암호화한다.

형질감염된 DNA를 안정하게 통합시킨 세포는 상기한 바와 같이 선택 배지에 대한 내성에 의해 동정할 것이며, 클로날 세포주는 내성 콜로니의 확장에 의해 생산될 것이다. 이들 세포주에 의한 말단이 잘린 VRP의 DNA의 발현은 용액 하이브리드화 및 노던 블롯(Northern blot) 분석에 의해 평가할 것이다.

제약 조성물 및 치료 용도

본 발명의 한가지 목적은 말단이 잘린 VRP를 치료용으로 적합한 제약 조성물로 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서 말단이 잘린 VRP를 포함하는 제약 조성물 치료 유효량을 투여함으로써 환자에서 혈관형성을 자극하는 방법을 제공한다.

"치료 유효량"은 환자에게서 원하는 치료 효과를 나타내는 화합물의 양이다. 예를 들면, 질병 또는 장애와 관련하여, 치료 유효량은 질병 또는 장애의 증상들 중 한가지 이상을 일정 정도 감소시키거나, 질병 또는 장애와 관계되거나 원인이 되는 생리학적 또는 생화학적 파라미터들을 부분적으로 또는 완전히 정상으로 되돌리는 양이다. 환자를 치료하기 위해 사용될 때, 치료 유효량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 50 ㎎/㎏ 이하, 더 바람직하게는 10 ㎎/㎏ 이하, 더 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 이하인 것으로 기대되는 양이다. 화합물의 양은 환자의 연령, 체격 및 질환에 의존한다.

환자에 대한 본 발명의 화합물의 최적 제형과 투여 방식은 구체적인 질병 또는 장애, 원하는 효과와 환자의 유형 등 당업계에 공지되어 있는 요인들에 의존한다. 본 발명의 화합물은 일반적으로 사람 환자를 치료하기 위해 사용할 것이지만, 또한 다른 영장류, 양, 소 및 가금 등의 농장 동물, 스포츠용 동물과 말, 개 및 고양이 등의 애완동물과 같은 다른 척추 동물에서 유사하거나 동일한 질병을 치료하기 위해 사용할 수도 있다.

바람직하게는, 치료 유효량은 제약 조성물로서 제공된다. 제약 제제 또는 조성물은 사람과 같은 다세포 유기체에 투여하기에 적합한 형태의 약제 또는 조성물을 나타낸다. 적합한 형태는 부분적으로는 경구, 경피 또는 주사와 같은 투여 경로에 의존한다. 이러한 형태는, 약제 또는 조성물이 다세포 숙주 또는 배양액에 표적 세포가 존재하는지 존재하지 않는지 표적 세포에 도달하도록 해야 한다. 예를 들면, 혈류로 주사된 제약 제제 또는 조성물은 가용성이어야 한다. 다른 요인들은 당업계에 알려져 있으며 독성과 약제 또는 조성물이 그 효과를 발휘하는 것을 방지하는 형태 등의 고려 사항을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 제약학적으로 허용되는 염 (예를 들면, 산 부가염) 및(또는) 그의 복합물로서 제형화될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 이들이 투여되는 농도에서 무독성인 염이다. 이러한 염으로 제조하면 조성물이 그의 생리학적 효과를 발휘하는 것을 방해하지 않으면서 조성물의 물리화학적 특성을 변화시켜 약물학적 사용을 용이하게할 수 있다. 물성에 있어서 유용한 변화의 예로는 경점막 투여를 촉진시키기 위해 융점을 저하시키고, 보다 고농도의 약물 투여를 촉진시키기 위해 용해도를 증가시키는 것을 포함한다.

제약학적으로 허용되는 염은 황산염, 염산염, 인산염, 술폰산염, 술팜산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 락트산염, 타르타르산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 시클로헥실술폰산염, 시클로헥실술팜산염 및 퀴닌산염을 함유하는 산 부가염과 같은 산 부가염을 포함한다. 제약학적으로 허용되는 염은 염산, 황산, 인산, 술폰산, 술팜산, 아세트산, 시트르산, 락트산, 타르타르산, 말론산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 시클로헥실술폰산, 시클로헥실술팜산 및 퀴닌산과 같은 산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 염은 예를 들면, 생성물의 유리 산 또는 유리 염기 형태를, 염에 대해 불용성인 용매나 매질 중에서 또는 이후 진공에서 또는 동결 건조되어 제거되는 물과 같은 용매 중에서 1 당량 이상의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써, 또는 존재하는 염의 이온을 적당한 이온 교환 수지 상에서 다른 이온으로 교환시킴으로써 제조할 수 있다.

화합물의 투여를 용이하게 하기 위해 담체 또는 부형제를 또한 사용할 수 있다. 담체 및 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 예를 들면, 락토즈, 글루코즈 또는 수크로즈, 또는 많은 종류의 전분, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 생리학적으로 적합한 용매들을 포함한다. 조성물 또는 제약 조성물은 정맥내, 복강내, 피하 및 근육내, 경구, 외용 또는 경점막을 포함한 상이한 경로로 투여할 수 있다.

원하는 등장성은 염화나트륨 또는 다른 제약학적으로 허용되는 약제, 예를 들면, 덱스트로즈, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌 글리콜, 폴리올 (예를 들면, 만니톨 및 소르비톨), 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 사용하여 이룰 수 있다. 나트륨 이온을 함유하는 완충액에 대해서는 염화나트륨이 특히 바람직하다.

본 발명의 화합물은 전신 및 외용 또는 국소 투여를 포함하는, 다양한 투여 방식을 위해 제형화할 수 있다. 그 기법과 제형은 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]에서 찾을 수 있다. 또한, 문헌[왕(Wang, Y.J.) 및 핸슨(Hanson, M.A.) "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No.10, Supp. 42:2S (1988)] 참조하시오. 적합한 투여 형식은 의사들이 각각의 환자에 대해 개별적으로 가장 잘 결정할 수 있을 것이다.

전신 투여를 위해 예를 들면, 근육내, 정맥내, 복강내, 피하, 척수내 및 뇌척추내 주사 등의 주사가 바람직하다. 주사를 위해, 본 발명의 화합물은 액상 용액제, 바람직하게는 행크(Hank's)액 또는 링거(Ringer's)액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액 중에 제형화한다. 별법으로, 본 발명의 화합물은 USP 기준에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 1종 이상의 부형제 (예를 들면, 프로필렌 글리콜) 중에 제형화한다. 본 발명의 화합물은 예를 들면, 불활성 오일, 적합하게는 참기름, 낙화생유, 올리브유와 같은 식물성 오일, 또는 다른 허용되는 담체에 현탁시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 수성 담체, 예를 들면, pH 약 5.6 내지 7.4의 등장 완충액에 현탁시킨다. 이들 조성물은 종래의 멸균법으로 멸균시킬 수 있거나 멸균 여과할 수 있다. 조성물은 pH 완충제와 같은, 생리학적 조건에 근접하기 위해 필요한 경우 제약학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 유용한 완충제는 예를 들면, 아세트산나트륨/아세트산 완충제를 포함한다. 제제의 치료 유효량이 경피 주사 또는 전달된 후 수시간 또는 수일에 걸쳐 혈류에 전달되도록 저장기 또는 "데포(depot)" 서방성 제제 형태를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 고형으로 제형화되어 사용 직전에 재용해시키거나 현탁시킬 수도 있다. 동결건조형을 또한 포함한다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있거나, 분자들을 경구 투여할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투해야 하는 장벽에 적합한 침투제를 제형 중에 사용한다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 경점막 투여를 위해 담즙산염과 후시딘산 유도체를 포함한다. 또한, 침투를 촉진시키기 위해 세정제를 사용할 수도 있다. 경점막 투여는 예를 들면, 비강 스프레이를 통하거나 좌제를 이용할 수 있다. 경구 투여를 위해, 분자들을 캡슐제, 정제 및 액제와 같은 통상의 경구 투여형으로 제형화한다.

외용 투여를 위해, 본 발명의 화합물을 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이 연고제, 고약제, 겔제 또는 크림제로 제형화한다.

원하는 경우, 상기 조성물의 용액을 메틸 셀룰로즈와 같은 점증화제로 점조화시킬 수 있다. 이들은 유중수형 또는 수중유형의 유화형으로 제조할 수 있다. 아카시아 분말, 비이온성 계면활성제 (예를 들면, 트윈(Tween)) 또는 이온성 계면활성제 (예를 들면, 알칼리 폴리에테르 알코올 황산염 또는 술폰산염, 예를 들면, 트리톤(Triton))를 포함하는 제약학적으로 허용되는 다양한 유화제 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 유용한 조성물은 성분들을 일반적으로 인정되는 절차에 따라 혼합함으로써 제조한다. 예를 들면, 선택된 성분들을 혼합기 또는 다른 표준 장치 중에서 간단히 혼합하여 농축 혼합물을 형성한 다음, 이를 물 또는 점증화제를 첨가하고 가능하게는 pH를 조절하기 위해 완충제 또는 등장성을 조절하기 위해 부가의 용질을 첨가하여 최종 농도 및 점도로 조정할 수 있다.

본 발명의 각종 화합물의 투여되는 양은 표준 절차에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 환자의 연령과 체격 및 환자의 질병 또는 장애에 따라 약 1 nmole 내지 3 μmole의 분자, 바람직하게는 약 10 nmole 내지 1 μmole의 분자이다. 일반적으로, 치료 유효량은 치료할 동물의 약 0.1 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 1 내지 20 ㎎/㎏ 범위의 양이다.

의사의 사용을 위해, 조성물을 말단이 잘린 VRP, VRP 폴리펩티드 또는 VRP 서브유닛의 일정량을 함유하는 투여 단위형으로 제공할 것이다.

유전자 치료

말단이 잘린 VRP 또는 그의 유전자 서열은 또한 유전자 치료에 유용할 것이다 (문헌[밀러(Miller), Nature 357:455-460 (1992)]에서 리뷰함). 밀러는 이러한 진보가 긍정적인 초기 결과를 나타낸 사람 유전자 치료에 실제적으로 접근하게 하였다고 진술하였다. 유전자 치료의 기초 과학은 문헌[물리간(Mulligan), Science 260:926-931 (1993)]에 기술되어 있다. 유전자 치료의 한 예를 실시예 7에 제시하였고, 여기에서, 아데노바이러스 매개 유전자 치료의 이용을 설명하였다.

다른 예로서, 말단이 잘린 VRP 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포내에 삽입시키고, 세포를 시험관 내에서 배양한 다음 다수를 환자에게 주사하거나 주입할 수도 있다. 다른 예에서, 선택된 프로모터 (예를 들면, 스트롱(strong) 프로모터)를 포함하는 DNA 절편을 내인성 말단이 잘린 VRP를 갖는 세포내로 전달하여, 프로모터 절편이 내인성 말단이 잘린 VRP 유전자의 발현을 강화시키도록 한다 (예를 들면, 프로모터 절편은 내인성 말단이 잘린 VRP 유전자에 직접 결합되도록 세포내로 전달된다).

유전자 치료는 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 네이키드 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 사용을 포함할 수 있다. 별법으로, 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전공학 처리된 세포를 주사할 수도 있다. 실시예 7은 혈관형성 치료를 제공하기 위해 아데노바이러스 벡터를 사용하는 유전자 치료 방법을 설명한다.

레트로바이러스, 백시나 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 몇몇 RNA 바이러스 또는 소 유두종 바이러스 등의 바이러스로부터 유래된 발현 벡터를, 재조합 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들면, cDNA)을 표적 세포 집단에 전달하기 위해 사용할 수도 있다. 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제작하기 위해 당업계의 기술자에게 공지되어 있는 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[마니아티스 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 아우스벨(Ausubel) 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술되어 있는 기법들을 참조하시오. 별법으로, 단백질 서열을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 네이키드 DNA로서 또는 재구성계, 예를 들면, 리포좀 또는 표적 세포에 전달하기 위한 다른 지질계 내에서 사용할 수 있다 (예를 들면, 문헌[펠그너(Felgner) 등, Nature 337:387-8 (1989)]을 참조하시오). 사람 유전자 치료에 사용하기 위한, 플라스미드 DNA를 세포에 직접 전달하기 위한 다른 몇몇 방법들이 존재하며, 플라스미드 DNA를 단백질에 복합시킴으로써 세포 상의 수용체에 DNA를 표적화하는 것을 포함한다. 문헌[밀러, Nature 357:455-60 (1992)]을 참조하시오.

가장 단순한 형태로, 유전자 전달은 소량의 DNA를 현미주사 과정을 통해 세포의 핵내에 간단히 주사함으로써 수행할 수 있다 [카페치(Capecchi MR), Cell 22:479-88 (1980)]. 일단 재조합 유전자가 세포내에 도입되면, 이들은 전사와 번역을 위해 세포의 정상 메카니즘에 의해 인지될 수 있고, 유전사 산물이 발현될 것이다. DNA를 보다 많은 세포에 도입시키기 위한 다른 방법들이 또한 시도되었다. 이러한 방법으로는 인산칼슘으로 DNA를 침전시켜 피노사이토시스(pinocytosis)에 의해 세포내에 도입시키는 형질감염법 [첸(Chen C.) 및 오까야마(Okayama H), Mol. Cell Biol. 7:2745-52 (1987)]; 세포를 고전압 펄스에 노출시켜 막에 구멍을 도입시키는 전기천공법 [추(Chu G.) 등, Nucleic Acids Res., 15:1311-26 (1987)]; DNA를 친지성 소낭 내에 넣고 이를 표적 세포에 융합시키는 지질감염/리포좀 융합법 [펠그너(Felgner, PL.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413-7 (1987)]; 및 작은 발사체에 결합된 DNA를 사용하는 미립자 충격법 [양(Yang NS) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9568-72 (1990)]을 포함한다. DNA를 세포내에 도입시키기 위한 다른 방법은 DNA를 화학적으로 수식된 단백질에 결합시키는 것이다.

아데노바이러스 단백질이 엔도좀을 탈안정화시키고 DNA의 세포내 업테이크를 증진시킬 수 있음이 또한 나타나 있다. DNA 복합물을 함유하는 용액에 아데노바이러스를 혼합하거나, 단백질 가교결합제를 사용하여 아데노바이러스에 공유 부착된 폴리라이신에 DNA를 결합시키면 재조합 유전자의 업테이크와 발현이 실질적으로 개선된다 (Curiel DT et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6:247-52 (1992)).

또한, 아데노 관련 바이러스 벡터가 낭포 세포내에 유전자 전달하기 위해 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다 (Gnatenko, D., J. of Invest. Med. 45:87-97 (1997)).

본 명세서에서 "유전자 전달"은 외래 핵산 분자를 세포내에 도입시키는 방법을 의미한다. 유전자 전달은 통상적으로 유전자에 의해 암호화된 특정 산물을 발현할 수 있도록 하기 위해 수행한다. 이러한 산물은 단백질, 폴리펩티드, 안티센스 DNA 또는 RNA, 또는 효소 활성 RNA를 포함할 수 있다. 유전자 전달은 배양된 세포에서 수행하거나 동물에 직접 투여하여 수행할 수 있다. 일반적으로, 유전자 전달은 핵산 분자가 비특이적 또는 수용체 매개 상호작용에 의해 표적 세포와 접촉하는 과정, 핵산 분자가 막을 통해 또는 엔도사이토시스에 의해 세포내로 업테이크되는 과정 및 핵산 분자가 플라스마막 또는 엔도좀으로부터 세포질로 방출되는 과정을 포함한다. 발현에는 이외에 핵산 분자가 세포의 핵 내로 이동하는 것과 전사를 위해 적절한 핵 인자에 결합하는 것을 필요로 할 수 있다.

본 명세서에서 "유전자 치료"는 유전자 전달의 한 형태로서 본 명세서에서 사용되는 유전자 전달의 정의 내에 포함되며, 구체적으로는, 생체내 또는 시험관내 세포에서 치료 산물을 발현시키기 위한 유전자 전달을 나타낸다. 유전자 전달은 생체외 세포에서 수행한 다음 이를 환자에게 이식할 수 있거나, 핵산 분자 또는 핵산-단백질 복합물을 환자에게 직접 투여함으로써 수행할 수 있다.

다른 바람직한 실시태양에서, 핵산 분자 서열이 특이 조직에서만 발현되는, 말단이 잘린 VRP를 암호화하는 핵산 분자 서열을 갖는 벡터를 제공한다. 조직 특이적 유전자 발현을 성취하는 방법은 국제 공개 제WO93/09236호(1992.11.3일자 출원, 1993.5.13일자 공개)에 설명되어 있는 바와 같다.

다른 바람직한 실시태양에서, 유전자 대체 방법을 설명한다. 본 명세서에서 "유전자 대체"는 동물내에서 생체내 발현되어 동물에게 결핍되거나 부족한 내인성 유전자의 기능을 제공하거나 증대시킬 수 있는 핵산 분자 서열을 공급하는 것을 의미한다.

상기 설명한 모든 전술한 벡터에서, 본 발명의 추가 측면은 벡터에 포함된 핵산 서열이 상기 정의한 바와 같이 핵산 서열의 일부 또는 전부에 대해 부가, 결실 또는 변형을 포함할 수도 있다는 것이다.

본 발명의 이해를 돕기 위해서, 다음의 실시예를 통해 일련의 실험 결과를 기재할 것이다. 본 발명에 관한 실험은 물론, 본 발명을 특정하게 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 당업자의 기술 범위내에 속하는, 현재 공지되어 있거나 이후에 개발될 본 발명의 변형들이 본 명세서에서 기재되고 이후에 특허청구된 바와 같은 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

<실시예 1＞

N-말단이 잘린 VEGF-B (des-(1-20)-p2l-VEGF-B (또는 des(2-2l)-VEGF-B)의 클로닝

첫번째 20 개 아미노산이 없는 신규 VEGF-B-관련 단백질을 제작하기 위하여, cDNA 작제물을 아래의 방법으로 제작하였다.

사람 심장 또는 골격근 cDNA 또는 사람 태아뇌 cDNA 라이브러리 또는 또다른 적합한 사람 조직 공급원으로부터 얻은 cDNA 제조물로부터, 공개된 사람 VEGF-B 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드을 써서 PCR을 수행하여, 사람 VEGF-B 코딩 DNA를 증폭시켰다. 표준적인 분자 생물학 기술 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY)을 이용하여, 자신의 5' 말단에 사람 VEGF-B의 신호 서열을 코딩하며, 그 뒤에 성숙 VEGF-B의 제1 아미노산 잔기인 프롤린의 코돈, 그 뒤에 사람 VEGF-B의 잔기 22부터 C-말단까지의 아미노산에 상응하는 코돈, 및 그 뒤에 중지 코돈이 뒤따르는 DNA 단편을 만들었다. DNA를 적절한 발현 벡터에 삽입하기 위하여 적당한 비코딩 뉴클레오티드 서열을 이 DNA 작제물의 5' 및 3' 말단에 추가했다.

이 방법에서 신호 펩티드의 절단 위치는 본래의 VEGF-B에서 발견된 것과 동일한 방식으로 보존된다. 그러나 이러한 방법은 말단이 잘린 VEGF-B의 새 N-말단 아미노산에 변화를 초래한다. des(1-20)-VEGF-B의 정상 N-말단 아미노산 잔기는 티로신 잔기지만 (mspllrrlllvallqlartqa[PVSQFDGPSHQKKVVPWIDV]YTRAT), 새로운 N-말단 아미노산은 프롤린이고 (mspllrrlllvallqlartqaPTRAT ...), 결과적으로 생기는, 말단이 잘린 VEGF-B는 des(2-2l)-VEGF-B와 같았다.

말단이 잘린 VEGF-B의 본래 아미노산(아미노산 20개 잔기 절단의 경우 티로신)의 변화는 말단이 잘린 VEGF-B의 생체 활성에 대하여 아무런 영향도 주지 않는 것으로 예상되었다. 이 방법의 장점은 신호 펩티드 서열이 유지되므로 단백질 프로세싱/분비 동안 전구체로부터 신호 펩티드의 효과적인 분해를 보장한다는 것이다.

또다른 예에서는 말단이 잘린 VEGF-B, des(1-15)-VEGF-B가 제1 15개 아미노산을 결실시켜서 제작되었다. 이 경우에, 16번 잔기 및 1번 잔기 (신 및 구 N-말단)이 동일하기 때문에(프롤린), 신호 펩티드 절단 위치는 유지된다.

mspllrrillvallqlartqa[PVSQFDGPSHQKKVV]PWIDVYTRAT...

↓

mspllrrillvallqlartqaPWIDVYTRAT..

당업자라면 다른 신호 펩티드이 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, VEGF-B 또는 VEGF-C의 신호 펩티드를 사용할 수 있는데, 이를 위해서는 말단이 잘린 단백질의 제1 아미노산이, 각 신호 펩티드 절단 위치를 보호하기 위하여, 각각 알라닌 또는 글리신이어야 한다. 또다른 별법은 다른 공지된 단백질로부터의 신호 펩티드 서열을 사용하는 것이고, 이들 중 몇몇은 말단이 잘린 des(1-20)-VEGF-B의 N-말단 티로신과 상용가능한 절단 위치를 가질 수도 있다.

또다른 별법은 본래의 VEGF-B 단백질 서열의 N-말단쪽의 절단 위치에 하나보다 오히려 두 개의 아미노산을 도입한 전구체 단백질 코딩 작제물을 제조하는 것이다. 이 방법의 목적은 절단 위치가 신호 펩티다제 기능과 상용가능하도록 더 확실히 보장하려는 것이다. 이 결과, 말단이 잘린 VEGF-B 서열의 N-말단에서 새 아미노산 2개가 도입되지만, 이러한 변화가 말단이 잘린 펩티드의 생체 기능을 변화시킬 것으로 예상되지는 않는다.

지금까지 설명한 des(1-20)-VEGF-B 발현용 DNA 제조 방법은 원하는 바에 따라 N-말단 절단부의 길이를 달리한 VEGF-B 돌연변이체를 유사한 방식으로 제조하는 데 유용하다. 또한, 상기 방법은 다른 VEGF-관련 형태 및 다른 종의 VEGF 동종형에서 목적하는 데에 따라 길이를 달리한 N-말단 절단부를 생성하는 데 유용하다.

<실시예 2＞

N-말단이 잘린 VEGF-B 서브유닛의 발현

실시예 1의 말단이 잘린 VEGF-B를 코딩하는 DNA 단편은 적절한 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

말단이 잘린 VEGF-B를 코딩하는 cDNA 함유 바쿨로바이러스 전달 벡터 pAcUW51 및 바쿨로바이러스 (Baculogold, Pharmingen, San Diego, CA)로 Sf9 (Sporoptera frugiperda) 세포를 동시감염시켰다. 재조합 바이러스의 선별 및 플라크 정제는 블루 아가(Blue agar) 오버레이를 사용하는 확립된 프로토콜(Gibco BRL)에 따라서 수행하였다. 지수적으로 증식하는 Sf9 세포를 감염 다중도를 0.05로 감염하여 고농도 재조합 바이러스 스톡을 제조했다. 말단이 잘린 VEGF-B의 발현을 위해, 무혈청 배지에서 증식중인 Sf9 세포(1xlO⁶세포/ml)를 감염다중도 10으로 재조합 바이러스로 감염시켰다. 감염 72 시간 후 상층물을 수집하였다. 본 발명의 말단이 잘린 VRP를 발현시키는데 사용될 수 있는 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포에서 VEGF 발현은 문헌 (Fiebich et al., Eur. J. Biochem. 211: 19-26, 1993)에 기재되어 있다. 이 계에서 VEGF는 포유동물 세포에서 관찰된 것과 유사하게 효율적으로 글리코실화되며 고수율로 생산되는 것으로 밝혀졌다. 사실상 당업자들은 포유동물 세포 발현계를 비롯한 여타의 다른 계에서의 발현도 본 발명의 범위내에 속한다는 것을 인식할 것이다. 바쿨로바이러스계를 써서 본 발명의 말단이 잘린 VRP를 발현시키는데 사용될 수 있는 VEGF 단백질의 발현 방법도 미국 특허 제5,521,073호 및 문헌 (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (W.H. Freeman, New York), 1992)과 같이 VEGF 발현을 기재하는 문헌에 기재되어 있다.

당업자라면 다른 발현계도 마찬가지로 기능적으로 활성인, 말단이 잘린 VRP를 발현시키는데 사용할 수 있음을 인식할 것이다.

기능적 활성의 재조합 VEGF 동종형은 PDGF의 호모다이머 및 헤테로다이머 (Schneppe et al., Gene 143, 201-09, 1994)에 관한 이전에 설명된 방법에 따라 리폴딩(refolding)함으로써 봉입체(inclusion body)로부터의 이. 콜라이(Wilting et al., Dev. Biol. 176, 76-85, 1996) 및 효모 (Mohanraj et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:750-56, 1995)에서 발현된 바 있다.

본 발명에서 VRP를 발현시키는데 사용될 수 있는 VEGF의 발현의 또다른 방법은 예를 들면 문헌(Jasny, Science 238:1653, 1987), 문헌 (Miller et al., In: Genetic Engineering, 1986), (Setlow, J.K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297)에 기재되어 있다.

<실시예 3＞

말단이 잘린 VRP 재조합체의 정제

실시예 2의 바쿨로바이러스 발현 말단이 잘린 VEGF-B를 곤충 세포 상층물으로부터 정제하기 위해 여러 표준적 기술을 사용할 수 있다. 이런 기술로는 황산암모늄 침전법, 아세톤 침전법, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 HPLC, 콘카나발린 A 친화성 크로마토그래피, 등전 초점화, 크로마토포커싱 등이 있으나, 이것으로 제한되지는 않는다. 다른 표준 단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면 히스티딘 태그, 항원 태그 등의 특이적 태그가 있는 단백질은, VEGF-B DNA에 이러한 태그 코딩 DNA를 유전자 조작 도입하고 단백질의 생체 활성과 양립가능한 방식으로 상기 태그 포함 단백질을 발현시키고 상기 태그에 관한 친화성 크로마토그래피로 정제함으로써 생산할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 생각된다.

말단이 잘린 VEGF-B 형태에 바람직한 정제 방법은 다음과 같다. Sf9 세포 상층물을 10000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기 및 바이러스 입자를 제거하였다. 그 후 상층물을 농축하고, 20 mM 트리스(pH 8.3)에 대하여 24 시간 동안 투석하였다. 투석된 상층물을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 세파로스 Q 음이온 교환 칼럼상에 로딩하였다. NaCl (O 내지 1 M NaCl)의 구배를 사용하는 구배 용출에 의해서 칼럼으로부터 단백질을 용출시켰다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 VEGF-B 인식 항체를 사용하는 ELISA에 의해서 크로마토그래피 분획들을 분석하였다. VEGF-B 면역반응성을 갖는 분획들을 모아서 농축하고, 0.1% 트리플루오르아세트산에 대하여 밤새 투석하였다. 이렇게 제조된 물질을 역상 HPLC에 의해서 추가 정제하였다. 문헌 (Esch et al., Meth. Enzymol. 103, 72-89, 1983)에 기재된 바와 같이, 전형적으로 약 2 내지 5 mg의 단백질을 반정제 C4 칼럼상에 로딩하고, 0.1% 트리플루오르아세트산의 농도 구배로 용출시켰다. 말단이 잘린 VEGF-B를 포함하는 분획을 모아서 다음 사용때까지 -80 ℃에서 저장하였다.

염기성 헤파린 결합 N-말단이 잘린 VEGF-관련 단백질 서브유닛 형태 및 그의 유사체의 바람직한 정제 방법은 본질적으로 문헌 (Connolly et al, J. Biol. Chem. 264:20017-24, 1989, Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7311-15, 1989, 또는 Plouet et al., Embo J. 8:3801-06, 1989)에 기재된 바와 같이, 헤파린 세파로스 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 병용한 후, 경우에 따라 역상 HPLC를 추가로 사용한다.

실시예 4 내지 6에 기재된 바와 같은 기능성 분석에서, 세포 또는 세포막 제조물로 이루어진 수용체 제제 및¹²⁵I-표지된 VRP를 사용하는 방사선수용체 분석을 포함하는 많은 기술을 사용하여 VRP 유사 물질의 용출을 수행함으로써 정제를 모니터링하였다.

효모 또는 포유 동물 세포 등의 다른 진핵 세포계에서 발현된 말단이 잘린 VRP도 동일한 방식으로 정제될 수 있다.

문헌 (Schneppe et al., Gene 143:201-09, 1994)에 기재된 바와 같이 포유동물 세포에서 발현된 말단이 잘린 VRP는 서브유닛의 적당한 다이머 형성을 위한 리폴딩 단계를 거쳐야 할 것이다.

<실시예 4＞

수용체-결합 분석

말단이 잘린 VRP의 VEGF 수용체로의 결합을 다양한 방식으로 평가할 수 있다. 유용한 방법은 내피세포 또는 KDR로 인공 형질감염시킨 세포, 또는 KDR 수용체의 가용성 형태 (예를 들면 KDR/알칼리성 포스파타제 융합 단백질 (Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 271:5519-23 (1996))로 VRP 유사체가 결합하는 능력을 측정하는 방법을 포함한다. 바람직한 방법은 문헌 (Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-86, 1992)에 기재되어 있다.

이 방법에서, DEAE-덱스트란 방법에 의해 DNA 1 μg/ml, DEAE 덱스트란 0.5 μg/ml 및 100 μM 클로로퀸을 함유하는 DMEM를 써서 플레이팅된 세포를 인큐베이션함으로써 KDR cDNA로 CMT-3 원숭이 신장 세포를 감염시켰다. 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션 후, 배지를 통기시키고, 세포를 1 분 동안 PBS 중의 10% DMSO에 노출시켰다. 그 후 상기 세포를 10% 소혈청 함유 DMEM로 1 회 세척한 후, 37 ℃에서 40 시간 동안 100 μM ZnCl₂및 1 μM CdCl₂함유 DMEM/10% 소혈청 중에서 인큐베이션하였다.

요오도겐(Iodogen) 방법 또는 클로라민 T 방법을 써서 VEGF-B를 방사선요오드화하였다. 세파데즈(Sephadez) G25 칼럼 또는 헤파린-세파로즈 칼럼으로 겔 여과하여 방사성표지된 VEGF-B를 초과량의 유리 요오드-125와 분리했다. 방사성표지된¹²⁵I-VEGF-B 유사체의 특이 활성은 전형적으로 10⁵cpm/ng 정도여야 한다. 방사수용체 분석을 위하여, CMT-3(10⁵세포/웰)을 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24 시간 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 0.15% 젤라틴 및 25 mM HEPES를 함유하는 pH 7.4의 DMEM 0.5 ml를 첨가하였다. 그 후, 1 내지 500 pM 농도의¹²⁵I-VEGF-B를 가하였다. 특이 결합의 측정을 위하여 0.5 nM 비표지된 VEGF-B의 존재 또는 부재하에서 결합 실험을 수행하였다. 실온에서 90 분 인큐베이션 후, 각 웰로부터의 50 μl의 배지 샘플을 사용하여 유리 방사성리간드의 농도를 결정하였고, 0.1% BSA 함유 냉각 PBS로 웰을 3 회 세척하였다. 100 mM 인산나트륨 중의 1% 트리톤 X100, pH 8.0과 함께 30 분 동안 인큐베이션함으로써 세포를 웰로부터 추출하고, 추출물의 방사성을 감마 카운터로 측정하였다.

<실시예 5＞

유사분열 촉진 분석

사람 또는 포유동물 기원의 내피세포에 대한 말단이 잘린 VRP의 유사분열 촉진 활성은 세포수의 증가, 또는 방사성 DNA 전구체의 혼입량 (티미딘 혼입량) 또는 달리 적당하게 표지된 DNA 전구체의 혼입량 (브로모-데옥시우리딘의 혼입량)으로 세포 증식을 결정하는 분석법을 비롯한 수많은 다양한 방법으로 결정할 수 있다. 생체내에서 유사분열 촉진 활성을 평가하는 방법(예를 들어, 내피세포의 유사분열 지수 결정)을 포함하여, 통상적으로 세포 증식을 측정하는데 사용되는 상기 및 다른 방법도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 생각된다. 바람직한 방법이 본 명세서에 기재되어 있다 (Bohlen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5364-68, 1994). 10% 소혈청 및 항생제 (50 μg/ml의 겐타마이신 및 0.25 μg/ml의 펑기진(fungizine))가 보충된 둘베코 개질 이글 배지 및 염기성 섬유아세포 증식인자(매 48 시마다 1 내지 10 ng/ml 첨가)의 존재하에 스톡 배양액 내에 유지된 소의 대동맥궁 내피세포를 분할비 1: 64로 주마다 통과시켰다. 유사분열 촉진 분석을 위하여, 트립신을 사용하여 스톡 플레이트로부터 세포 단일층(통과 3 내지 10)을 떼어냈다. 그 후 상기 서술한 바와 같은 DMEM 및 항생제가 존재하는 24-웰 플레이트로 약 8000 세포/웰의 밀도로 세포를 시딩(seeding)하였다. 세포 플레이팅 후 6 시간 및 48 시간 후에 다시 DMEM/0.1% 소혈청 알부민으로 적당하게 희석된 분석 시료(1 내지 10 μl)를 가하였다. 4 일 간의 배양 후, 트립신으로 플레이트로부터 내피세포를 떼어내고, 코울터(Coulter) 입자 계수기를 사용하여 계수하였다.

또다른 유사분열 촉진 활성 분석은 올로프손, 비.(Olofsson, B.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2576-81, 1996]에 나타나 있다. 제2 통과의 사람 태줄 정맥 내피세포 (HUVEC)를 10% (vol/vol) 태송아지 혈청이 보충된 M-199 배지의 96-웰 플레이트(웰 당 4 X 10³세포)로 플레이팅하고 24 동안 인큐베이션했다. 헤파린 1 내지 10 μg/ml의 존재하에 말단이 잘린 VRP를 함유하거나 또는 정제된 말단이 잘린 VRP를 함유하는 세포 배양 조정 배지를 HUVEC에 가하고, 상기 세포를 48 시간 동안 자극하였다. [³H] 티미딘(Amersham, 10 μCi/ml)이 함유된 새 세포 배양 조정 배지를 상기 세포에 가하고, 추가로 48 시간 동안 더 계속해서 자극하였다. 세포를 PBS로 세척하고 트립신으로 처리한 후 혼입된 방사성을 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 말단이 잘린 VRP의 활성을 말단이 잘리지 않은 VRP의 활성과 비교하였다.

또다른 방법에서 소의 모세혈관 내피(BCE) 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하고, 10% 태송아지 혈청으로 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 콘플루언스 (confluence)에 도달할 때까지 증식시켰다. 3% 태송아지 혈청이 보충된 MEM 중에서 72 시간 동안 세포를 쇠약하게 한 후, 무혈청 배지로 희석시킨 조정 배지를 세포에 가하고, 세포를 24 시간 동안 자극하였다. 자극의 마지막 4 시간 동안 [³H] 티미딘을 포함시켰다(1 μCi/ml). 세포를 PBS로 세척하고 NAOH로 용해시키고, 혼입된 방사성을 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 말단이 잘린 VRP의 활성을 말단이 잘리지 않은 VRP의 활성과 비교하였다. 유사분열 촉진 활성에 대한 추가 대조구로서는 소 섬유아세포 증식인자(b-FGF)를 사용할 수 있으며, 이 증식인자를 쓰면 말단이 잘린 VRP 활성을 강화하는 그 인자의 활성도 측정할 수 있다.

<실시예 6＞

말단이 잘린 VRP의 혈관형성 활성

다양한 생체내 방법을 써서 물질의 혈관형성 활성을 측정할 수 있다. 흔히 사용되는 방법으로는 병아리 융모요막 분석, 토끼, 쥐 또는 생쥐의 각막 포우치(pouch) 분석, 생쥐의 매트리겔(matrigel) 이식 분석, 토끼 귀 챔버 혈관형성 분석, 햄스터 볼 포우치 분석, 헌트 쉴링(Hunt-Schilling) 챔버 모델 및 쥐 스폰지 이식 모델을 포함한다. 새 혈관 형성을 평가하는 다른 분석법은 문헌에 서술되어 있고, 본 발명의 범위에 속하는 것으로 인정된다.

말단이 잘린 VRP의 혈관형성 활성을 입증하는 바람직한 방법은 토끼 각막 포우치 분석법이다. 이 분석법에서는 약 1 내지 1000 ng의 증식인자 및 담체인 토끼 혈청 알부민 일정량이 함유된 엘박스(Elvax)(에틸렌 비닐 아세테이트) 중합체 펠렛을 각막의 외과 절개부에 이식시킨다. 이 방법은 문헌 (Phillips and Knighton, Wound Rep. Reg. 3, 533-539, 1995; Gimbrone et al., J. Natl. Canc. Inst. 52:413-27, 1974; Risau, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3855-59, 1986)에 보다 상세하게 기재되어 있다. 그 후 각막에서 증식인자에 의해 유도된 혈관 형성을 2주에 걸쳐서 관찰하였다. 각막 사진을 이용하는 형태 측정 및 이미지 분석과 함께 반정량 분석이 가능하였다.

<실시예 7＞

말단이 잘린 VRP를 사용하는 유전자전달 매개 혈관형성 요법

말단이 잘린 VRP는 예를 들면 본 명세서에 참고 문헌으로 도입된 PCT/US96/02631 (공개 번호 W096/26742, 공개일 1996년 9월 6일)에 기재되어 있는 바와 같이, 유전자전달 매개 혈관형성 용법에 사용된다.

아데노바이러스 작제물

유전자 전달을 위해서는, 도움 없이는 복제될 수 없는 복제능력이 상실된 사람 아데노바이러스 5 계를 사용할 수 있다. ElA 및 ElB 유전자(바이러스 복제에 필수임)가 삭제된 부분적인 아데노바이러스 서열이 측면에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 및 CMV 프로모터를 포함하는 플라스미드 ACCMVPLPA의 폴리링커 중에 말단이 잘린 VRP 서브유닛 코딩 핵산 분자를 클로닝할 수 있다. 이 플라스미드와 함께 플라스미드 JM17를 사용하여 293 세포를 동시 형질감염 (리포펙션)시켰다. 여기서 플라스미드 JM17은 사람 아데노바이러스 5의 전체 게놈에다 추가로 4.3kb 삽입체를 더 포함하고 있어서, pJM17는 캡슐화되기에는 지나치게 크다. 동족 레스큐(rescue) 재조합 결과 ElA/ElB 서열이 없는 상태에서 도입유전자(transgene)를 포함하는 아데노바이러스 벡터가 생성된다. 이러한 재조합체는 포유동물 세포에서 복제되지는 않지만, ElA/ElB로 형질전환되고 이들 필수 도입유전자 생성물을 제공하는 293 세포에서는 증식할 수 있다. 통상적으로 형질감염 10 내지 14일 후에 발생하는 세포병변 효과의 증거를 얻기 위해 형질감염된 세포를 모니터링하였다. 성공적인 재조합체를 동정하기 위하여 세포병변 효과를 나타내는 플레이트로부터 얻은 세포 상층물을 56 ℃에서 60 분 동안 프로테나제 K(50 mg/ml, 0.5% 나트륨 도데실 술페이트 및 20 mM EDTA 함유)로 처리하고, 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전법으로 침전시켰다. 그 다음 말단이 잘린 VRP 서브유닛 핵산 삽입체를 증폭시키기 위해 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열에 상보적인 프라이머 (Biotechniques 15:868-72, 1993) 및 아데노바이러스 서열을 동시 증폭시키도록 고안된 프라이머 (Biotechniques 15:868-72, 1993)써서 PCR을 수행하여 성공적인 재조합체를 동정하였다. 이어서 성공적인 재조합체를 2 회 플라크 정제하였다. 293 세포에서 바이러스 입자의 적정 농도 범위가 10¹⁰내지 10¹²이 되도록 바이러스 스톡을 증식시키고, 사용전에 이중 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 재조합 아데노바이러스를 생성하는데 사용되는 계는 도입유전자 삽입체의 팩킹 한계가 5kb였다. CMV 프로모터에 의해서 유도되고 SV40 폴리아데닐화 서열을 갖는, 말단이 잘린 VRP 유전자는 패키지 범위(constraint)를 잘 만족한다. 재조합 백터는 표준적 방법으로 플라크 정제된다. 생성된 바이러스 벡터는 293 세포에서 바이러스 입자 적정 농도가 10¹⁰내지 10¹²이 될 때까지 증식된다. 세포를 80 % 콘플루언스에서 감염시키고, 36 내지 48 시간 후에 수거하였다. 동결-해동 사이클 후, 세포 찌꺼기를 표준 원심분리에 의해서 펠렛화하고, 바이러스를 이중 CsCl 구배 한외원심분리에 의해서 추가 정제하였다 (불연속 1.33/1.45 CsCl 구배, 5 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7.8) 중에서 제조된 세슘, 90,000 x g (2 시간), 105,000 x g (18 시간)). 생체내 주입 전에, G25 세파덱스와 같은 세파로스 칼럼을 통한 겔 여과에 의해서 바이러스 스톡을 탈염시켰다. 생성된 바이러스 스톡은 최종 바이러스 적정 농도 약 10¹⁰내지 10¹²바이러스 입자 범위였다. 따라서, 아데노바이러스 작제물은 야생형 (증식할 가능성이 있는) 바이러스가 없도록 고도로 정제되어야 한다.

혈관 형성을 위한 돼지 허혈 모델

기구 사용을 위한 살균 조건 하에서 집 돼지(30-40 kg)에게 좌측 개흉술을 수행하였다 (Hammond, et al. J Clin Invest. 92:2644-52 (1993), Roth, et al. J. Clin. Invest. 91:939-49, 1993). 좌심방 및 대동맥에 카테테르를 넣어 부위별 혈류를 측정 및 압력 모니터 수단을 공급하였다. 좌심방을 와이어로 봉합하여 ECG 기록 및 대동맥 페이싱(pacing)을 가능하게 하였다. 마지막으로, 아메로이드 물질을 포함하는 금속 고리인 아메로이드 조임기(ameroid)를 인접 좌측 굴곡 관상 동맥(LCx) 주변에 위치시켰다 (Hammond et al. J. Clin. Invest. 92:2644-52 (1993)). 허혈 정도가 안정되게 발생된 후, 처리군에게 CMV 프로모터에 의해서 작동되는, 말단이 잘린 VRP 유전자 포함 아데노바이러스 작제물을 투여했다. 대조구 동물에게는 CMV 프로모터에 의해서 작동되는 리포터 유전자 lacZ 포함 아데노바이러스 작제물을 써서 유전자를 전달했다.

아메로이드 도입 후 35 + 3 일에 연구를 개시하였고, 이 때 측지 혈관 발생 및 페이싱-유도 기능장애는 변동이 없었다 (Roth, et al., Am. J. Physiol 253:1-112791288, 1987, Roth, et al. Circulation 82:1778-89). 의식있는 동물을 줄에 매달아 좌심실(LV), 좌심방 (LA) 및 대동맥의 압력 및 심전도를 디지탈 형식 온 라인으로 기록하였다(쉴 때와, 200 bpm에서 심방 페이싱 동안). 휴레 팩커드 초음파 화상 시스템을 사용하여 2차원 및 M-모드 이미지를 얻었다. 중앙 유두 근육 정도의 우측 흉골 진입경로로로부터 이미지를 얻고, VHS 테이프상에 기록하였다. 기준 상태의 동물에서 이미지를 기록하고, 다시 좌심방 페이싱(HR=200 bpm) 동안 이미지를 기록하였다. 이러한 연구는 유전자 전달 하루 전에 수행하였고, 그 후 14 ± 1 일 후에 반복하였다. 속도-압력 생성물 및 좌심방 압력은 유전자 전달 전 및 후에 양 그룹 모두에서 유사해야 하고, 이는 심근 산소 요구량 및 부하 조건이 유사함을 나타낸다. 표준화된 기준을 사용하여 초음파 심장 촬영을 수행하였다(Sahn, et al. Circulation 58:1072, 1978). 5 회 연속 박동으로부터 말단-심장 확장 벽 두께(EDWTh) 및 말단-심장 수축 벽 두께(ESWTh)를 측정하여 평균하였다. 벽두께 백분율(%WTh)을 [(EDWTh-ESWTh)/EDWTh] X 100로 계산하였다. 데이타 분석은 동물이 어떤 유전자를 받았는지에 대한 정보를 알지 못하는 상태에서 이루어져야 한다. 초음파 심장 촬염 결과의 재현성을 입증하기 위해서는 높은 상관관계(r 2=0.90, p=0.005)를 나타내는 연속 2일 동안 동물을 촬영해야 한다.

아메로이드 도입 35 ± 3 일 후, 아메로이드 밀봉 한참 후, 유전자 전달 전에 심장 페이싱(200 bprn) 동안 좌심방에 주사되는 조영 물질(Levovist)을 사용하여 조영 초음파 심장 촬영을 수행하였다. 유전자 전달 후 14 ± 1일에 연구를 반복하였다. 비디오 강도의 객관적 척도를 제공하는 컴퓨터-비디오 분석 프로그램 (Color Vue II, Nova Microsonics, Indianapolis, Indiana)을 사용하여 비디오 이미지로부터 피크 조영 강도를 측정했다. 동물이 받은 유전자에 대한 지식 없이 조영 연구를 분석하였다.

연구 종결시, 동물을 마취시키고 중심선 흉개술를 수행하였다. 단두증 동맥을 분리하고 캐눌라를 삽입하고, 그외 큰 혈관을 결찰했다. 동물에게 헤파린 (10,000 IU) 및 파라베린 (60 mg) 정맥 주사를 놓았다. 심장 확장성 심박동 정지를 유발하기 위하여 염화칼륨을 주입하고, 대동맥을 가로질러 조였다. 단두증 동맥 캐눌라 (120 mmHg 압력)를 통하여 염수를 투여하여 관상 동맥을 관류시켰다. 심장이 잘 고정될 때까지 (10 내지 15 분) 글루타르알데히드 용액(6.25%, 0.1 M 카코딜레이트 완충액)을 관류시켰다(120 mmH 압력). 그 후, 심장을 떼어내고, 색상-코드 염료를 사용하여 확인된 베드(bed)를 좌측 전방 하행 (LAD), 좌측 회선동맥 (LCx) 및 우측 심동맥을 통해 전방으로 주입하였다. 아메로이드를 검사하여 밀봉을 확인하였다. 정상적으로 관류된 허혈 부위로부터 채취된 시료를 3개로 나누고, 심내막 및 심외막 1/3에는 플라스틱을 끼워넣었다. 모세혈관 수를 정량하기 위하여 상기 기재한 바와 같이 현미경 분석을 수행하였다(MathieuCostello, et al. Am. J. Physiol. 359:H204, 1990). 각 부시료 (각 부위의 심내막 및 심외막)로부터 1 ㎛ 두께의 횡단 절편 4 개를 취하고, 포인트-카운팅(point-counting)을 사용하여 40OX 배율에서 섬유 수 당 모세혈관 수의 비를 결정하였다. 부시료 당 20 내지 25의 높은 파워 필드가 계수되었다. 경벽 모세혈관 대 섬유 수 비율이 부위당 평균 40 내지 50 필드가 되도록 각 부위 범위내 모세혈관 수 대 섬유 수 비율은 심내막 및 심외막에서 비슷해야 한다.

부위별 기능 및 혈류의 개선이 도입유전자 발현에 의한 결과임을 입증하기 위해 PCR 및 RT-PCR을 사용하여, 말단이 잘린 VRP 유전자를 전달받은 동물 심근 내에서 형질도입된, 말단이 잘린 VRP DNA 및 mRNA을 검출할 수 있다. CMV 프로모터 [GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC] (서열 41)에 대한 센스 프라이머 및 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 내부 서열에 대한 안티센스 프라이머를 사용하는 PCR을 통해 예상된 500 bp 단편을 증폭시켰다. 말단이 잘린 VRP 서브유닛 서열의 초반부에 대한 센스 프라이머 및 말단이 잘린 VRP의 내부 서열에 대한 안티센스 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 통해 예상된 400 bp 단편을 증폭시켰다.

마지막으로, VRP에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 말단이 잘린 VRP 유전자를 전달받은 동물의 심근 및 세포내에서 유전자 전달후 48 시간 및 14 ± 1 일 후에 말단이 잘린 VRP 발현 여부를 입증할 수 있다.

도움 없이는 복제할 수 없는 복제능력이 상실된 사람 아데노바이러스 5 계를 써서 도입유전자 포함 벡터를 제조했다. 생체내 주입될 벡터는 고도로 정제되어야 하며, 야생형(복제 능력 보유) 아데노바이러스가 함유되어서는 안된다. 이런 방식으로 심장내 아데노바이러스 감염 및 염증성 침윤을 최소화한다. 관상 카테테르를 통해서 관상 동맥의 관강에 벡터를 직접 주입함으로써, 유전자의 위치를 효율적으로 지정할 수 있다. 이러한 방식으로 투여할 때 간 세포 내에서는 도입유전자 발현이 없어야 하고, 관내 주입 후 언제라도 소변내에서 바이러스 RNA가 발견되어서는 안된다.

좌우 관상 동맥 양쪽에 모두 2.0 ml씩 작제물(아데노바이러스의 바이러스 입자 약 10¹¹개를 함유하는 4.0 ml)을 주입하였다 (LCx 베드로의 측지 흐름은 양쪽 혈관으로부터 나오는 것으로 보임). 동물을 마취시키고, 우측 경동맥을 절단하여 동맥에 접근한 후, 5F 코르디스 쉬쓰(Cordis sheath)를 위치시켰다. 5F 다용도 (A2) 심장 카테테르를 사용하여 관상 동맥을 구속하였다. 좌측 주요 관상 동맥으로 조영제를 주입하여 LCx 아메로이드의 밀봉을 확인하였다. 그 후, 카테테르 팁을 동맥 관강 내 1 cm에 위치시켜 주사 중 인접 대동맥까지 최소한의 물질이 손실되게 하였다. 이 방법을 각 돼지에게 수행하였다.

일단 유전자 전달이 수행되면, 3 가지 전략을 사용하여 유전자의 성공적인 삽입 및 발현을 입증하였다. (1) 몇몇 작제물은 리포터 유전자(lacZ)를 포함할 수 있고, (2) 관련 베드로부터 심근을 샘플링하고, 면역블롯팅을 수행하여 말단이 잘린 VRP의 존재를 정량하고, (3) PCR을 사용하여 말단이 잘린 VRP mRNA 및 DNA를 검출하였다.

얻어진 부위별 수축 작용 데이타에서, 대조구 돼지가 유전자 전달 전과 14 ± 1 후에 허혈 부위내 페이싱-유도 기능장애의 유사한 정도를 보이는 것으로 나타났다. 대조적으로, 말단이 잘린 유전자 전달을 받는 돼지는 페이싱 동안 허혈 부위에서 벽두께 증가가 나타나며, 이는 본 발명에 따른 말단이 잘린 VRP 서브유닛 유전자 전달은 페이싱 동안 허혈 부위에서 개선된 수축과 관련되어 있음을 입증하였다. 통상적으로 관류된 부위(심실간 격벽)에서의 벽두께 증가는 페이싱 동안 정상적이고, 유전자 전달에 의해서 영향받지 않아야 한다. 흉곽을 가로지른 초음파 심장 촬영에 의해 측정된 기능의 저하 백분율은 동일한 모델에서 동맥 페이싱 동안 초음파 미세측정에 의해서 측정된 백분율과 매우 유사하고 (Hammond, et al. J. Clin. Invest. 92:2644, 1993), 이는 허혈 기능장애의 평가를 위한 초음파 심장 촬영의 정확성을 입증한다.

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Collateral Therapeutics

9360 Towne Centre Drive, Suite 110

San Diego, California 92121

USA

(ii) TITLE OF INVENTION: TRUNCATED VEGF-RELATED PROTEINS

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 41

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Lyon ＆ Lyon

(B) STREET: 633 West Fifth Street

Suite 4700

(C) CITY: Los Angeles

(D) STATE: California

(E) COUNTRY: U.S.A.

(F) ZIP: 90071-2066

(v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: 3.5" Diskette, 1.44 Mb

storage

(B) COMPUTER: IBM Compatible

(C) OPERATING SYSTEM: IBM P.C. DOS 5.0

(D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows 2.0

(vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: PCT/US98/07801

(B) FILING DATE: 20 April 1998

(C) CLASSIFICATION:

(vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/842,984

(B) FILING DATE: 25 April 1997

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: Warburg, Richard J.

(B) REGISTRATION NUMBER: 32,327

(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 221/062-PCT

(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONE: (213) 489-1600

(B) TELEFAX: (213) 955-0440

(C) TELEX: 67-3510

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 188 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln

20 25 30

Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

35 40 45

Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val

50 55 60

Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

65 70 75 80

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

85 90 95

Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

115 120 125

Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg

145 150 155 160

Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu

165 170 175

Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

180 185

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 206 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln

20 25 30

Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

35 40 45

Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

50 55 60

Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

65 70 75 80

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

85 90 95

Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

115 120 125

Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

130 135 140

Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser

145 150 155 160

Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His

165 170 175

Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala

180 185 190

Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

195 200 205

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 419 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe

20 25 30

Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala

35 40 45

Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser

50 55 60

Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met

65 70 75 80

Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln

85 90 95

Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala

100 105 110

His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys

115 120 125

Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe

130 135 140

Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr

145 150 155 160

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

165 170 175

Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu

180 185 190

Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

195 200 205

Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

210 215 220

Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn

225 230 235 240

Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

245 250 255

Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

260 265 270

Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

275 280 285

Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

290 295 300

Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys

305 310 315 320

Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

325 330 335

Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

340 345 350

Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

355 360 365

Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

370 375 380

Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser

385 390 395 400

Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

405 410 415

Gln Met Ser

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 170 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly

20 25 30

Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro

130 135 140

Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys

145 150 155 160

His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg

165 170

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 221 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

Met Arg Arg Cys Arg Ile Ser Gly Arg Pro Pro Ala Pro Pro Gly Val

1 5 10 15

Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg

20 25 30

Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro

35 40 45

Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

50 55 60

Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

65 70 75 80

Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

85 90 95

Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu

100 105 110

Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

115 120 125

Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

130 135 140

Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser

145 150 155 160

Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro

165 170 175

Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys

180 185 190

Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu

195 200 205

Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

210 215 220

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 133 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Met Lys Leu Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr

1 5 10 15

Leu Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys

20 25 30

Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr

35 40 45

His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

50 55 60

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro

65 70 75 80

Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

85 90 95

Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys

100 105 110

Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

115 120 125

Pro Arg Arg Arg Arg

130

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 148 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:

Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Gln Val Val Val Ala Leu Leu Ile Cys

1 5 10 15

Met Tyr Asn Leu Pro Glu Cys Val Ser Gln Ser Asn Asp Ser Pro Pro

20 25 30

Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro

35 40 45

Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

50 55 60

Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys

65 70 75 80

Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

85 90 95

Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn

100 105 110

Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

115 120 125

Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

130 135 140

Glu Pro Arg Arg

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 160 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

Pro Ser His Gln Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg

1 5 10 15

Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu

20 25 30

Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

35 40 45

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50 55 60

Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser

65 70 75 80

Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

85 90 95

Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile

100 105 110

Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr

115 120 125

Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg

130 135 140

Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

145 150 155 160

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 155 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro

1 5 10 15

Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val

20 25 30

Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50 55 60

Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu

65 70 75 80

Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

85 90 95

Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys

115 120 125

Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn

130 135 140

Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

145 150 155

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 152 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val

1 5 10 15

Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu

20 25 30

Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp

35 40 45

Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln

50 55 60

Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu

65 70 75 80

Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala

85 90 95

Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg

100 105 110

Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg

115 120 125

Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr

130 135 140

Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

145 150

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 150 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:

Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val

1 5 10 15

Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro

20 25 30

Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

35 40 45

Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50 55 60

Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu

65 70 75 80

His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys

85 90 95

Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln

100 105 110

Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe

115 120 125

Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg

130 135 140

Cys Arg Lys Pro Arg Lys

145 150

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 147 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:

Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser

1 5 10 15

Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val

20 25 30

Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys

35 40 45

Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln

50 55 60

Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln

65 70 75 80

Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser

85 90 95

Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp

100 105 110

Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys

115 120 125

Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys

130 135 140

Pro Arg Lys

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 145 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:

Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu

1 5 10 15

Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

20 25 30

Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

35 40 45

Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu

65 70 75 80

Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg

85 90 95

Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg

100 105 110

Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly

115 120 125

Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg

130 135 140

Lys

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 178 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:

Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg

1 5 10 15

Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu

20 25 30

Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

35 40 45

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50 55 60

Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser

65 70 75 80

Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

85 90 95

Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro

100 105 110

His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro

115 120 125

Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly

130 135 140

Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly

145 150 155 160

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly

165 170 175

Gly Ala

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 173 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:

Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro

1 5 10 15

Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

20 25 30

Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50 55 60

Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu

65 70 75 80

Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp

85 90 95

Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln

100 105 110

Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro

115 120 125

Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala

130 135 140

Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala

145 150 155 160

Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

165 170

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 168 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:

Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val

1 5 10 15

Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro

20 25 30

Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

35 40 45

Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50 55 60

Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu

65 70 75 80

His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro

85 90 95

Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro

100 105 110

Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His

115 120 125

Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr

130 135 140

Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala

145 150 155 160

Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

165

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 163 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:

Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu

1 5 10 15

Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

20 25 30

Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

35 40 45

Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu

65 70 75 80

Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr

85 90 95

Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala

100 105 110

Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro

115 120 125

Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro

130 135 140

Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys

145 150 155 160

Gly Gly Ala

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 194 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:

Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg

1 5 10 15

Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu

20 25 30

Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

35 40 45

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50 55 60

Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser

65 70 75 80

Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

85 90 95

Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr

100 105 110

Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala

115 120 125

Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro

130 135 140

Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro

145 150 155 160

Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln

165 170 175

Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu

180 185 190

Arg Arg

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 189 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:

Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro

1 5 10 15

Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

20 25 30

Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50 55 60

Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu

65 70 75 80

Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

85 90 95

Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

100 105 110

Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser

115 120 125

Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro

130 135 140

Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys

145 150 155 160

Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu

165 170 175

Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

180 185

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 184 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:

Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val

1 5 10 15

Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro

20 25 30

Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

35 40 45

Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50 55 60

Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu

65 70 75 80

His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys

85 90 95

Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val

100 105 110

Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr

115 120 125

Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His

130 135 140

His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg

145 150 155 160

Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr

165 170 175

Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

180

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 179 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21:

Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu

1 5 10 15

Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

20 25 30

Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

35 40 45

Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu

65 70 75 80

Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala

85 90 95

Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser

100 105 110

Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser

115 120 125

Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp

130 135 140

Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys

145 150 155 160

Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys

165 170 175

Leu Arg Arg

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 307 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:

His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys

1 5 10 15

Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe

20 25 30

Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr

35 40 45

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

50 55 60

Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu

65 70 75 80

Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

85 90 95

Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

100 105 110

Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

130 135 140

Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

145 150 155 160

Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

165 170 175

Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

180 185 190

Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys

195 200 205

Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

210 215 220

Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

225 230 235 240

Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

245 250 255

Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

260 265 270

Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser

275 280 285

Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

290 295 300

Gln Met Ser

305

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 302 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:

Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro

1 5 10 15

Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn

20 25 30

Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu

50 55 60

Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys

65 70 75 80

Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser

85 90 95

Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser Leu

100 105 110

Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro Thr

115 120 125

Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu Asp

130 135 140

Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe His

145 150 155 160

Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln Cys

165 170 175

Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys Glu

180 185 190

Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe Pro

195 200 205

Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys

210 215 220

Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly Lys

225 230 235 240

Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys Gly

245 250 255

Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys Thr

260 265 270

Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu Val

275 280 285

Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser

290 295 300

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 297 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24:

Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile

1 5 10 15

Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro

20 25 30

Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly

35 40 45

Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe

50 55 60

Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser

65 70 75 80

Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr

85 90 95

Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro

100 105 110

Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn

115 120 125

Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser

130 135 140

Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro

145 150 155 160

Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly

165 170 175

Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser

180 185 190

Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala

195 200 205

Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr

210 215 220

Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys

225 230 235 240

Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His

245 250 255

Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala

260 265 270

Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro

275 280 285

Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser

290 295

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 292 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:

Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val

20 25 30

Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn

35 40 45

Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro

50 55 60

Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr

65 70 75 80

Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser

85 90 95

Ile Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala

100 105 110

Asn Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg

115 120 125

Cys Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp

145 150 155 160

Glu Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser

165 170 175

Cys Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys

180 185 190

Lys Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp

195 200 205

Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln

210 215 220

Pro Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln

225 230 235 240

Lys Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys

245 250 255

Tyr Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe

260 265 270

Ser Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg

275 280 285

Pro Gln Met Ser

290

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 116 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:

Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr His

20 25 30

Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met

35 40 45

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr

50 55 60

Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp

85 90 95

Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro

100 105 110

Arg Arg Arg Arg

115

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 111 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:

Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys Gly Ser Glu Cys Lys Pro

1 5 10 15

Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr His Pro Glu Leu Thr Ser

20 25 30

Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Val Asn Val

50 55 60

Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Asn Gly Met Gln

65 70 75 80

Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp Cys Arg Pro Arg Phe

85 90 95

Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg

100 105 110

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 106 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28:

Ser Glu Val Leu Lys Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Glu Thr His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro

20 25 30

Pro Cys Val Thr Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser

35 40 45

Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu

50 55 60

Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val

65 70 75 80

Glu His Lys Lys Cys Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Thr Thr Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg

100 105

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 101 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29:

Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr 1 5 10 15

His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

20 25 30

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro

35 40 45

Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys

65 70 75 80

Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

85 90 95

Pro Arg Arg Arg Arg

100

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 121 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30:

Asn Asp Ser Pro Pro Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr

20 25 30

Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys

35 40 45

Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val

50 55 60

Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser

65 70 75 80

Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser

85 90 95

Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr

100 105 110

Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

115 120

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 116 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31:

Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro

1 5 10 15

Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

20 25 30

Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys

35 40 45

Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

50 55 60

Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn

65 70 75 80

Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

85 90 95

Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

100 105 110

Glu Pro Arg Arg

115

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 111 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32:

Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val

1 5 10 15

Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro

20 25 30

Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly

35 40 45

Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser

50 55 60

Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr

65 70 75 80

Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile

85 90 95

Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

100 105 110

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 106 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 33:

Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu

1 5 10 15

Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val

20 25 30

Lys Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala

35 40 45

Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser

50 55 60

Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile

65 70 75 80

Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr

85 90 95

Thr Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

100 105

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 167 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34:

Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln Lys Lys Val Val Pro

1 5 10 15

Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

20 25 30

Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val

35 40 45

Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile

65 70 75 80

Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

85 90 95

Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val

100 105 110

Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg

115 120 125

Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg

130 135 140

Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys

145 150 155 160

Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

165

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 185 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35:

Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser

1 5 10 15

Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

20 25 30

Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val

35 40 45

Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile

65 70 75 80

Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

85 90 95

Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys

100 105 110

Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val

115 120 125

Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr

130 135 140

His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr

145 150 155 160

Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

180 185

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 201 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 36:

Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser

1 5 10 15

Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

20 25 30

Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val

35 40 45

Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile

65 70 75 80

Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

85 90 95

Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val

100 105 110

Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser

115 120 125

Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile

130 135 140

Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln

145 150 155 160

His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg

165 170 175

Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp

180 185 190

Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

195 200

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 399 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 37:

Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ser Gly Leu

1 5 10 15

Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala Thr Ala Tyr Ala

20 25 30

Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser Ser Val Asp Glu

35 40 45

Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys Cys Gln

50 55 60

Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn Leu Asn

65 70 75 80

Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr

85 90 95

Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met

100 105 110

Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr

115 120 125

Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly

130 135 140

Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr

145 150 155 160

Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro

165 170 175

Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser

195 200 205

Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro

210 215 220

Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu

225 230 235 240

Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe

245 250 255

His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln

260 265 270

Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys

275 280 285

Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe

290 295 300

Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln

305 310 315 320

Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly

325 330 335

Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys

340 345 350

Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys

355 360 365

Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu

370 375 380

Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser

385 390 395

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 133 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 38:

Met Lys Leu Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr

1 5 10 15

Leu Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys

20 25 30

Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr

35 40 45

His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

50 55 60

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro

65 70 75 80

Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

85 90 95

Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys

100 105 110

Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

115 120 125

Pro Arg Arg Arg Arg

130

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 148 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 39:

Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Gln Val Val Val Ala Leu Leu Ile Cys

1 5 10 15

Met Tyr Asn Leu Pro Glu Cys Val Ser Gln Ser Asn Asp Ser Pro Pro

20 25 30

Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro

35 40 45

Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

50 55 60

Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys

65 70 75 80

Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

85 90 95

Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn

100 105 110

Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

115 120 125

Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

130 135 140

Glu Pro Arg Arg

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 26 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 40:

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala

20 25

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 41:

GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC 20

Claims (67)

1. 코어 서열에서 제1 시스테인에 대해 N-말단쪽의 아미노산 잔기가 1개 이상 결실된, 말단이 잘린 혈관 내피 증식인자-관련 단백질 (VRP) 서브유닛.
2. 제1항에 있어서, 상기 VRP가 사람 VRP인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
3. 제1항에 있어서, 상기 VRP가 VEGF-B, VRF-2, VEGF-C, PlGF, VEGF-3, 천연두바이러스 ORF-1 및 천연두바이러스 ORF-2로 구성된 군에서 선택된 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
4. 제1항에 있어서, 상기 VRP가 VEGF-B인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
5. 제1항에 있어서, 상기 VRP 서브유닛이 도 2의 아미노산 서열을 포함하는, 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
6. 제1항에 있어서, 상기 서브유닛의 코어 서열에서 제1 시스테인에 대해 N-말단에 있는 아미노산 잔기가 결실된, 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
7. 제1항에 있어서, 코어 서열의 N-말단 아미노산이 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
8. 제7항에 있어서, 상기 2 내지 5개의 아미노산 잔기가 VRP 서브유닛의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 바로 N-말단쪽에 있는 연속적인 아미노산 잔기 2 내지 5개로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
9. 제1항에 있어서, 상기 코어 서열의 N-말단 아미노산 서열이 6 내지 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
10. 제1항에 있어서, 상기 6 내지 10개의 아미노산 잔기가 VRP 서브유닛의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 바로 N-말단쪽에 있는 연속적인 아미노산 잔기 6 내지 10개로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
11. 제1항에 있어서, 상기 코어 서열의 N-말단 아미노산 서열이 11 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
12. 제1항에 있어서, 상기 11 내지 20개의 아미노산 잔기가 VRP 서브유닛의 코어 서열의 제1 시스테인에 대해 바로 N-말단에 있는 연속적인 아미노산 잔기 11 내지 20개로 이루어진 것인 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
13. 제1항에 있어서, 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 N-말단에 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기를 1 또는 2개 더 포함한, 말단이 잘린 VRP 서브유닛.
14. 제13항의 VRP 서브유닛 2개로 이루어진 말단이 잘린 VRP.
15. 아미노산 서열이 동일한 제1항의 VRP 서브유닛 2개로 이루어진 말단이 잘린 VRP.
16. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛인 제1 서브유닛, 및

    VRP 서브유닛 및 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛으로 구성된 군에서 선택된 서브유닛으로서, 상기 제1 서브유닛과는 아미노산 서열이 상이한 제2 서브유닛으로 이루어진,

    말단이 잘린 VRP 헤테로다이머.
17. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자.
18. 제17항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
19. 제17항에 있어서, RNA 분자인 핵산 분자.
20. 제17항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
21. 제17항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터.
22. 제21항에 있어서, 상기 핵산 분자가 자신의 5' 말단의 신호 펩티드 코딩 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 발현 벡터.
23. 제22항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 VEGF 신호 펩티드, VEGF-B 신호 펩티드, VRF-2 신호 펩티드, VEGF-C 신호 펩티드, VEGF-3 신호 펩티드 및 PlGF 신호 펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인 재조합 DNA 발현 벡터.
24. 제22항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 천연두바이러스 ORF-1 신호 펩티드 및 천연두바이러스 ORF-2 신호 펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인 재조합 DNA 발현 벡터.
25. 제22항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 VEGF-B 신호 펩티드인 재조합 DNA 발현 벡터.
26. 제22항에 있어서, 상기 신호 펩티드 코딩 DNA 서열이 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 이 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA의 3' 말단이 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 발현 벡터.
27. 제22항에 있어서, 상기 신호 펩티드 코딩 DNA 서열이 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기 2개를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 이 제1 아미노산 잔기 2개를 코딩하는 DNA의 3' 말단이 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 발현 벡터.
28. 제22항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 벡터로 형질전환될 숙주 세포 내에서 작동가능한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 발현 벡터.
29. 제21항의 재조합 DNA 발현 벡터를 포함하는 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
30. 제22항의 재조합 DNA 발현 벡터를 포함하는 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
31. 제26항의 재조합 DNA 발현 벡터를 포함하는 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
32. 제17항의 핵산 분자를 포함하는 운반 벡터.
33. 제32항에 있어서, 바이러스 운반 벡터인 운반 벡터.
34. 제17항의 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터.
35. 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자가 자신의 5' 말단의 신호 펩티드 코딩 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 벡터.
36. 제35항에 있어서, 신호 펩티드가 VEGF 신호 펩티드, VEGF-B 신호 펩티드, VRF-2 신호 펩티드, VEGF-C 신호 펩티드 및 PlGF 신호 펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인 아데노바이러스 벡터.
37. 제35항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 천연두바이러스 ORF-1 신호 펩티드 및 천연두바이러스 ORF-2 신호 펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인 아데노바이러스 벡터.
38. 제35항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 VEGF-B 신호 펩티드인 아데노바이러스 벡터.
39. 제35항에 있어서, 상기 신호 펩티드 코딩 DNA 서열이 자신의 3' 말단에서 말단이 잘리지 않은 성숙 VRP 서브유닛의 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 이 제1 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA의 3' 말단이 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 벡터.
40. 야생형 바이러스를 포함하지 않으며,

    E1A/ElB 유전자가 결실된, 부분적인 아데노바이러스 서열 및 이 부분적인 아데노바이러스 서열이 측면에 연결된 프로모터에 의해 작동되는, 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 도입유전자(transgene)를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및

    제약상 허용가능한 담체를 함유하는 여과 주입가능한 아데노바이러스 벡터 제제.
41. 제40항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 30 마이크론 필터를 통해 여과된 것인 제제.
42. 제40항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터, 심실 심근세포 특이적 프로모터 및 미오신 중쇄 프로모터로 구성된 군에서 선택된 것인 주입가능한 아데노바이러스 벡터 제제.
43. 제21항의 재조합 DNA 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 적절한 조건하에서 증식시켜서 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 숙주 세포로부터 상기 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 말단이 잘린 VRP 폴리펩티드의 제조 방법.
44. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물.
45. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈관 형성의 촉진 방법.
46. 적절한 담체 내의 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP로 내피세포를 처리하는 것을 포함하는, 시험관내에서 내피세포의 증식 또는 세포 이동을 촉진하는 방법.
47. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 1종 이상을 코딩하며 환자의 체내에서 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 핵산 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장병 환자의 치료 방법.
48. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 환자의 혈관 형성을 촉진하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 제약 조성물을 위한 치료적으로 적절한 투여 체계를 추가로 포함하는 방법.
50. 제48항에 있어서, 상기 말단이 잘린 VRP의 혈관 형성 효과를 강화하는 강화제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 강화제가 맥관형성성 FGF인 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 강화제가 FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
53. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP 및 1종 이상의 강화제를 제약상 허용가능한 담체 내에 함유하는 제약 조성물.
54. 제53항에 있어서, 상기 강화제가 맥관형성성 FGF인 제약 조성물.
55. 제54항에 있어서, 상기 강화제가 FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6으로 구성된 군에서 선택된 것인 제약 조성물.
56. 제1항의 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는 허혈 질환 환자의 치료 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛의 치료 효과의 강화제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 강화제가 FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
59. 제56항에 있어서, 상기 허혈 질환이 심근 경색, 만성 관 허혈, 만성 하지 허혈, 졸중 및 말초 혈관 질병으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
60. 제1항에 따른 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는 창상 환자의 치료 방법.
61. 제1항에 따른 말단이 잘린 VRP 서브유닛 하나 이상으로 이루어진 말단이 잘린 VRP를 적절한 담체 내에 함유하는 제약 조성물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는 혈관 투과성의 증대 방법.
62. 제1항에 따른 말단이 잘린 VRP 서브유닛 1종 이상을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며 또한 심근 내에서 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 운반 벡터를 관상 동맥 하나 또는 양자 모두에 직접 관내 주입하여 환자의 심근에 투여하는 것을 포함하는 환자의 혈관 형성의 촉진 방법.
63. 제62항에 있어서, 상기 운반 벡터가 복제능력이 상실된 아데노바이러스 벡터인 방법.
64. 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며 또한 심근 내에서 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 운반 벡터를 관상 동맥 하나 또는 양자 모두에 직접 관내 주입하여 환자의 심근에 투여하여 관상 측지 관 발생을 촉진하는 것을 포함하는 심장 허혈 환자에게서 관상 측지 관 발생의 촉진 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 운반 벡터가 복제능력이 상실된 아데노바이러스 벡터인 방법.
66. 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 코딩하는 도입유전자를 포함하며 또한 말초 혈관계에서 상기 말단이 잘린 VRP 서브유닛을 발현할 수 있는 운반 벡터를 대퇴부 동맥 하나 또는 양자 모두에 직접 대퇴부 동맥내 주입에 의해 환자의 말초 혈관계에 투여하는 것을 포함하는 말초 혈관 질병 환자에게서 혈관 발생의 촉진 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 운반 벡터가 복제능력이 상실된 아데노바이러스 벡터인 방법.