CN1260835A - 截短的vegf相关蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新型截短形式的血管内皮生长因子相关的蛋白质(VRP或VRP),它们可被用于在体外和体内刺激血管形成。本发明也提供了编码这种新型截短的VRP的核酸,以及制备截短的VRP的方法。含有截短的VRP的药物组合物和使用编码截短的VRP的核酸的基因治疗方法可被用于治疗心脏病和伤口愈合。

Description

截短的VEGF相关蛋白质

发明领域

本发明涉及新的截短形式的血管内皮生长因子(VEGF)相关蛋白质。特别是本发明涉及基本上不含有其它蛋白质的N-末端截短的VEGF相关蛋白质。这种截短的VEGF相关蛋白质可被用于体内和体外刺激血管生成。

本发明也涉及编码这种新的截短的VEGF相关蛋白质的核苷酸，含有这种核苷酸的细胞，组织和动物；使用这种核苷酸的治疗方法；和与上述所有内容相关的方法。背景

血管内皮生长因子(VEGF)，也被称作血管通透性因子(VPF)，是多种器官中的不同细胞类型产生的一族蛋白质，并以高度选择性的方式(几乎是专门地)刺激血管内皮细胞(Ferrara等，内分泌学评论，13：18-32，(1992)的综述；Dvorak等，美国生理学杂志，146：1029-39，1995；Thomas，生物化学杂志，271：603-6，1996)。这些文献以及本文引用的其它文献全部引入本文作为参考。

当在细胞培养中检测时，VEGF具有强的促细胞分裂作用(Gospodarowicz等，美国科学院院刊，86：7311-15，1989)和趋化作用(Favard等，生物学细胞(Biol.Cell)73：1-6，1991)。此外，VEGF诱导纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活剂抑制剂、和纤溶酶原激活剂受体(Mandriota等，生物化学杂志270：9709-16，1995；Pepper等，181：902-06，1991)，以及胶原酶(Unemori等，细胞生理学杂志153：557-62，1992)、调节生长中的毛细血管向组织中侵入的酶系统。VEGF也通过内皮细胞调节管状结构的形成，这是一个体外血管生成的例子(Nicosia等，美国生理学杂志，145：1023-29，1994)。

在体内，VEGF诱导血管生成(Leung等，科学246：1306-09，1989)和提高血管通透性(Senger等，科学219：983-85，1983)。现已知VEGF是重要的毛细血管形成的生理调节剂。在器官生长中，它们参与正常的新的毛细血管的形成，包括胎儿生长(Peters等，美国科学院院刊90：8915-19，1993)，组织修复(Brown等，实验医学杂志176：1375-79，1992)，月经周期，和怀孕(Jackson等，Placenta 15：341-53，1994；Cullinanand Koos，内分泌学133：829-37，1993；Kamat等，美国生理学杂志146：157-65，1995)。在胎儿发育过程中，VEGF好像在血管从血岛的从头生成中起着重要的作用(Risau和Flamme，细胞发育生物学年度评论11：73-92，1995)，这是在缺少一个单一的VEGF等位基因的胚胎中异常血管发育和致死性所证实的(Carmeliet等，自然380：435-38，1996)。而且，VEGF与许多疾病的病理性血管生长特征相关，包括实体瘤(Potgens等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 376：57-70，1995)，视网膜病(Miller等，美国病理学杂志145：574-84，1994：Aiello等，N.Engl.J.Med.331：1480-87，1994；Adamis等，美国眼科学杂志118：445-50，1994)，牛皮癣(Detmar等，实验医学杂志180：1141-46，1994)，和类风湿关节炎(Fava等，实验医学杂志180：341-46，1994)。

VEGF表达是通过激素(Schweiki等，临床调查杂志91：2235-43，1993)生长因子(Thomas，生物化学杂志271：603-06，1996)，和通过氧过少(Schweiki等，自然359：843-45，1992，Levy等，生物化学杂志271：2746-53，1996)调节的。氧过少条件下对VEGF的向上调节作为一种补偿机制特别重要，该机制通过诱导额外的毛细血管形成和导致血流增加提高组织的氧化能力。该机制被认为在肿瘤和视网膜病的病理性血管形成中起一份作用。但是，缺氧后VEGF表达的向上调节对组织修复也是必需的，例如，在表皮损伤的愈合中(Frank等，生物化学杂志270：12607-613，1995)，冠状缺血(Banai等，心血管研究28：1176-79，1994；Hashimoto等，美国病理学杂志267：H1948-H1954，1994)。

在血管缺血的动物模型中VEGF治疗性地诱导血管生成的能力已在兔慢性肢体局部缺血模型中得到证实，这是通过重复地进行肌肉注射或施用单个动脉内VEGF的剂团可提高旁系血管形成所证实的，这是通过测量局部缺血的后肢中血流量进行的(Pu等，循环88：208-15，1993；Bauters等，美国生理学杂志267：H1263-71，1994；Takeshita等，循环90[第二部分]，II-228-34，1994；Bauters等，血管外科杂志21：314-25，1995；Bauters等，循环91：2802-09，1995；Takeshita等，临床调查杂志93：662-70，1994)。在这一模型中，VEGF也显示出与碱性FGF协同作用改善局部缺血(Asahara等，循环92：[增刊2]，II-365-71，1995)。据报道，VEGF也可加速气囊损伤的大鼠颈动脉内皮的修复，从而抑制下面的平滑肌层的病理性加厚，使腔直径和血流保持不变(Asahara等，循环91：2793-2801，1995)。VEGF也显示出在犬冠状动脉中诱导EDRF(产生于内皮的松弛因子(氧化氮))-依赖性松弛，从而可能通过与血管生成不相关的第二机制提高局部缺血区域的血流(Ku等，美国生理学杂志265：H586-H592，1993)。这些数据结合在一起提供了VEGF对伤口愈合，局部缺血疾病和再狭窄具有治疗作用的证据。

VEGF家族由至少4个成员组成，VEGF-121，VEGF-165，VEGF-189，VEGF-206。最初被表征的VEGF是一种34-45kDa的糖基化的蛋白质，它由两个相同的165个氨基酸残基的亚基组成(Tischer等，生物化学生物物理学研究通讯165：1198-1206，1989)。VEGF-165 cDNA编码一个191残基的氨基酸序列，它是由一个26残基的分泌信号肽序列和165残基的成熟蛋白亚基组成的，分泌信号肽序列在该蛋白质从细胞中分泌后被切除。VEGF强烈地与肝素结合，在残基115至159之间的强碱性序列被认为与此有关(图1)(Thomas，生物化学杂志，271：603-06(1996))。VEGF家族的其它成员为具有或长或短的同源二聚体，其长度为121，189和206残基(分别为VEGF-121，VEGF-189，和VEGF-206)(Tischer等，生物化学杂志266：11947-54，1991；Park等，细胞的分子生物学4：1317-26(1993))。这4种形式的VEGF产生于VEGF基因的多达8个外显子的不同剪切(VEGF-121，外显子1-5，8；VEGF-165，外显子1-5，7，8；VEGF-189，外显子1-5，6a，7，8；VEGF-206，外显子1-5，6b，7，8(外显子6a和6b是指同一个外显子的两种不同的剪切形式))(Houck等，分子内分泌学，5：1806-14(1991))。VEGF序列含有8个保守的二硫键形成核心半胱氨酸残基。所有的VEGF基因编码指导蛋白质进入分泌途径的信号肽。但是，仅仅发现VEGF-121和-165可容易地被培养的细胞分泌，而VEGF-189和-206仍然与细胞外基质相关。这些VEGF形式具有一个额外的高碱性序列，相应于VEGF-189和-206中的残基115-139(基质靶击序列)，它赋予对细胞外基质的酸性组分的高度的亲和性(Thomas，生物化学杂志271：603-06(1996))。

各种VEGF同种型的促细胞分裂活性根据每一个同种型而有所不同。例如，VEGF-121和VEGF-165对内皮细胞具有相似的促细胞分裂活性。但是，VEGF-189和VEGF-206仅具有微弱的促细胞分裂活性(Ferrara等，内分泌学评论13：18-32，1992)。这些同种型活性的降低被归因于它们的强烈的与细胞和基质的亲和性，这是通过缺乏24残基的“基质靶击”序列的VEGF-206突变体的正常的促细胞分裂活性所证实，该“基质靶击”序列在VEGF-189和VEGF-206中均存在(图1中的残基115-139)(Ferrara等，内分泌学评论13：18-32，1992)。

由血纤维蛋白溶酶产生的VEGF-165的N-末端片断(VEGF(1-110))与KDR受体的结合与VEGF-165和VEGF-121具有相同的亲和性，而C-末端VEGF片断(111-165)不具有结合活性(Keyt等，生物化学杂志271：7788-95，1996)。令人感兴趣的是，在这一研究中，VEGF-121和VEGF-110的促细胞分裂活性与VEGF-165相比降低了约110倍，提示了VEGF-165的C-末端区域在VEGF同种型的生物学效力中的潜在作用。鉴于先前的显示VEGF-121和VEGF-165对内皮细胞生长具有相同效力的结果，这一发现的意义就不太清晰。而且，由于VEGF与KDR受体的功能性相互作用被认为至少部分依赖于细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(Cohen等，生物化学杂志，270：11322-26，1995；Tessler等，生物化学杂志，269：12456-61，1994)，可以想象，结果的不同产生于各种实验系统的不同。在这一方面，还不清楚在多大程度上细胞表面硫酸肝素调节VEGF-121(缺乏肝素结合区域)和VEGF-165(具有肝素结合区域)的功能性相互作用(Tessler等，生物化学杂志269：12456-61，1994；Cohen等，生物化学杂志，270：11322-26，1995；Gitay-Goren等，生物化学杂志，271：5519-23(1996))。VEGF与血小板来源的生长因子(PDGF)相关(Andersson等，生长因子12：159-64，1995)。VEGF也与来源于胎盘生长因子(PlGF)基因，PlGF-129和PlGF-150，的蛋白质家族相关(Maglione等，美国科学院院刊，88：9267-71，1991；癌基因8：925-31，1993)。最近已鉴定出几种额外的VEGF-相关的基因，并被命名为VEGF-B(也被称作VEGF-相关因子VRF-1)(Grimmond等，基因组研究，6：122-29，1996；Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81，1996)VRF-2(Grimmond等，基因组研究，6：122-29，1996)，和VEGF-C(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996；Lee等，美国科学院院刊，93：1988-92，1996)和VEGF-3(PCT申请第PCT/US95/07283号，1996年12月12日公开，公开号WO96/39421)。最后，已鉴定出两个病毒编码的VEGF-相关的序列，痘病毒ORF-1和ORF-2(Lyttle等，病毒学杂志，68：84-92，1994)。除了PDGF外，这些蛋白质被称作VEGF-相关的蛋白质[VRP]。VRP的例子的序列描述于图1。

这些VRP，以及目前已知的PDGF在它们的序列中具有8个半胱氨酸，它们的定位相对保守。跨越这些保守的半胱氨酸的蛋白质序列因而被称为核心序列，该序列中的第一个N-末端保守的半胱氨酸在本文中被称为“核心序列的第一个半胱氨酸”或“第一核心半胱氨酸”。

令人感兴趣的是，VEGF家族的成员可形成异源二聚体，例如由VEGF和PlGF亚基组成的异源二聚体(DiSalvo等，生物化学杂志，270：7717-23，1995；Cao等，生物化学杂志，271：3154-62，1996)。虽然VEGF具有很强的刺激血管生成和内皮细胞增殖的作用，而VEGF/PlGF异源二聚体促细胞分裂的能力较弱，并且PlGF同源二聚体具有很小的或没有促细胞分裂活性(DiSalvo等，生物化学杂志，270：7717-23，1995；Cao等，生物化学杂志，271：3154-62，1996)。在其它的实验中，发现VEGF-165/VEGF-B异源二聚体在这两个基因都转染细胞后形成(Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81，1996)。

VEGF与内皮细胞上存在的两个受体，KDR/flk-1(Terman等，生物化学生物物理学研究通讯，187：1579-86，1992)，和flt-1(De Vries等，科学，255：989-91，1992)相互作用。通过带电残基的丙氨酸扫描对VEGF-165的系统性定点突变的研究表明，残基D63，E64和E67参与VEGF与flt-1的结合，而碱性残基R82，KI84，和H86强烈地参与与KDR的结合(Keyt等，生物化学杂志，271：5638-46，1996)。

已知VRP与三个不同的内皮细胞受体中的一个或多个结合，它们中的每一个是一种单链跨膜蛋白质，具有一个大的胞外部份，该胞外部份含有7个免疫球蛋白-型区域，和一个具有酪氨酸激酶功能的胞质部分。这些受体为KDR/flk-1(Terman等，生物化学生物物理学研究通讯，187：1579-86，1992)，flt-1(De Vries等，科学，255：989-91，1992)，和flt-4(Pajusola等，癌症研究，52：5738-43，1992)。这些受体和各种VEGF配体之间所具有的明显的选择性目前尚未完全阐明。但是，已知VEGF与KDR和flt1结合(Terman等，生长因子，11：187-95，1994)但不与flt4结合(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996)，PlGF与flt1结合但不与KDR(Terman等，生长因子，11：187-95，1994)和flt4结合(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996)，VEGF-C与flt-4结合(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996)，但是否也与KDR结合存在争议(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996；Lee等，美国科学院院刊，93：1988-92，1996)。对于VEGF-B/VRF-1，VRF-2和病毒编码的VRP的受体特异性目前仍不清楚。但是，由于VEGF-B刺激内皮细胞的增殖(Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81，1996)，可推测VEGF-B可与KDR结合，因为KDR被认为主要负责内皮细胞对VEGF类生长因子的血管生成响应(Gitay-Goren等，生物化学杂志，271：5519-23，1996)。

大多数VRP已显示激活KDR受体，这被认为使内皮细胞具有“血管生成能力”。已经发现了VEGF-B这一活性的证据，它刺激内皮细胞的增殖(Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81，1996)，也发现了VEGF-C这一活性的证据，它刺激内皮细胞迁移和增殖(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996；Lee等，美国科学院院刊，193：1988-92，1996)，也发现了两个已知的病毒编码的VRP这一活性的证据，具报道它们是促血管生成的(Lyttle等，病毒学杂志，68：84-92，1994)。一个著名的例外是PlGF同种型同源二聚体，它对内皮细胞具有可忽略的促细胞分裂活性。但是，PlGF/VEGF异源二聚体仍保留明显的促细胞分裂活性(DiSalvo等，生物化学杂志，270：7717-23，1995；Cao等，生物化学杂志，271：3154-62，1996)。

VEGF在许多不同的组织中被表达。同样，VRP基因也在多种组织中被表达，但尤其使人感兴趣的是VEGF-B以及在较小的程度上来说VRF-2在人心脏和骨骼肌中被强烈地表达(Grimmond等，基因组研究，6：122-29，1996；Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81，1996)。实际上，VEGF-B在小鼠心脏组织中的表达明显高于VEGF(Olofsson等，美国科学院院刊，2567-81，1996)。VEGF-C在几种人类组织中也被强烈表达，最为显著的是在心脏和骨骼肌中(Joukov等，EMBO J，15：290-98，1996)。这一表达形态以及VRP对内皮细胞的精细的特异性提示了这些因子在这些组织的血管形成中起着生理性的作用。这被认为与一些病理现象相关，例如冠状局部缺血，其中需要旁系血管生成，为心肌提供足够的毛细血管。已经显示由冠状动脉结扎或缺氧诱导的瞬时局部缺血在体内在大鼠或猪心脏中快速向上调节VEGF mRNA，并且缺氧在体外在心脏肌细胞中和平滑肌细胞中诱导VEGF mRNA(Hashimoto等，美国生理学杂志，267，H1948-H1954，1994；Banai，等，心血管研究，28：1176-79，1994；循环90：649-52，1994)。心脏中VEGF和VRP的强烈表达可有助于保证在需要时诱导心血管形成的充足的和合格的调节系统的存在。在周边(下肢)血管局部缺血和脑局部缺血(中风)中也需要旁系血管形成。最后，在损伤后的组织修复中需要新血管的形成。在这一方面，有必要说明的是在皮肤损伤的愈合过程中VEGF在表皮角质化细胞中是向上调节的(Brown等，实验医学杂志，176：1375-79，1992)。因而，使用VRP对各种局部缺血疾病，例如，心肌梗塞，慢性冠状动脉缺血，慢性下肢缺血，伤口愈合和中风进行治疗可能是有益的。发明详述

本发明涉及新的截短形式的VEGF-相关的蛋白质(VRP)，优选人类VRP。本发明的截短的VRP和核苷酸分子组合物的优选的使用方式是将这种组合物用于辅助治疗患有心脏病、损伤、或其它的局部缺血疾病的病人，这是通过在这种患者中刺激血管生成来进行的。VRP的氨基酸序列包括八个二硫键-形成半胱氨酸残基，它们在VRP和VEGF蛋白质之间是保守的(核心半胱氨酸)。VRP包括，但不限于，VEGF-B，VEGF-C，ORF-1，ORF-2，和PlGF。

本发明的第一方面提供了一种截短的VRP，它在所说的亚基的核心序列的第一个半胱氨酸的N-末端方向具有至少一个氨基酸残基的缺失。这种组合物基本上不含有其它的蛋白质。优选该截去的范围从最少仅截去该成熟的蛋白质亚基的N-末端残基(不包括信号序列)到最多截去该成熟蛋白质的全部N-端氨基酸，直至并包括第一核心半胱氨酸残基的N-端(前面的)残基。在更为优选的方面，该核心序列的第一半胱氨酸所有的N-端方向的氨基酸残基，除了所说的第一半胱氨酸N-端方向紧接的1至5个氨基酸残基，被全部截去。

虽然这些氨基酸缺失可由N-末端序列中的不邻接的氨基酸残基的缺失组成，优选这些缺失为连续的氨基酸残基的缺失。因而，在一个优选的方面，本发明包括具有氨基酸残基序列缺失的人类VRP，该氨基酸序列缺失是从该N-端方向序列的N-末端直至该VRP亚基序列的核心序列的第一个半胱氨酸的逐渐增加长度的缺失。

在优选的方面，本发明提供了截短形式的VRP VEGF-B、VRF-2、VEGF-C、VEGF-3、PlGF、痘病毒ORF-1、和痘病毒ORF-2。在这种截短的VRP中，每一个亚基可独立地具有至少一个位于所说的亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上的氨基酸的缺失，或者仅仅这些亚基中的一个具有这种缺失。

在特定的实施方案中，该截短的VRP亚基含有一种其中核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上不同数目的氨基酸残基被缺失的VRP亚基。在一个方面，保留的N-端残基由来自N-端序列的连续的氨基酸残基组成。这些连续的N-端残基可能来自N-端序列中的任何位点，但是，优选从该N-端序列的N-末端开始的连续的序列，并且最优选由该VRP亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上紧接的连续的氨基酸残基组成。这种最优选的实施方案的例子描述于图2。

在其它的实施方案中，本发明的截短的VRP的核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上的氨基酸残基是随机选出的氨基酸序列。在另一个实施方案中，这些氨基酸残基来自全长VRP序列的N-末端序列，但并不必须是来自全长VRP序列的连续的氨基酸。

因而，在一个最优选的方面，本发明提供了一种截短的VRP亚基，其中，所说的亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上的氨基酸残基被截去。

在其它的方面，本发明提供了一种截短的VRP亚基，其中，核心序列的N-端方向上的氨基酸序列含有11至20，优选11至15，更优选6至10，最优选2至5个氨基酸残基。

优选该核心序列N-端的氨基酸序列含有所说的VRP亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端紧接的连续的氨基酸残基。因而，在这些优选的实施方案中，该截短的VRP含有核心序列，所需要的该核心序列的C-端序列，以及在该核心序列的第一半胱氨酸的N-端区域中还含有11至20，优选11至15，更优选6至10，最优选2至5个连续的氨基酸残基，该连续的氨基酸残基是全长VRP序列的核心序列的第一半胱氨酸的N-端紧接的氨基酸序列。

本领域普通技术人员将会看到，当截短的VRP亚基含有，例如，核心序列的第一半胱氨酸的N-端的(X)氨基酸，从而使这种截短的VRP亚基相应的全长VRP亚基在核心序列的第一半胱氨酸的N-端含有(X+1)个氨基酸。

本发明的截短的VRP包括含有两个本发明的截短的VRP亚基的截短的VRP同源二聚体，其中该两个截短的VRP亚基具有相同的氨基酸序列，也包括这样一种含有两个本发明的截短的VRP亚基的截短的VRP异源二聚体，其中该两个亚基具有彼此之间不同的氨基酸序列。

在本发明中，术语“最初的N-NN”氨基酸，是指被称作VRP的信号肽序列之后最初的N-NN氨基酸(例如，最初的10-15氨基酸)，其中，N和NN中的每一个表示氨基酸编号，例如，最初的10-15氨基酸。术语N-NN包括在信号序列之后的最初氨基酸的从N至NN中任何位点的缺失。因而，在一个更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的hVEGFB蛋白质亚基，其中最初的10-15个氨基酸缺失；优选最初的20-25个氨基酸缺失；更优选最初的23-24个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的hVRF2蛋白质亚基，其中最初的10-15个氨基酸缺失；优选最初的15-20个氨基酸缺失；更优选最初的20-25个氨基酸缺失；最优选最初的23-24个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的hVEGFC蛋白质亚基，其中最初的95-100个氨基酸缺失；优选最初的100-105个氨基酸缺失；更优选最初的105-110个氨基酸缺失；最优选最初的108-109个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的hPlGF蛋白质亚基，其中最初的16-21个氨基酸缺失；优选最初的21-26个氨基酸缺失；更优选最初的26-31个氨基酸缺失；最优选最初的29-30个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的hVEGF3蛋白质亚基，其中最初的10-15个氨基酸缺失；优选最初的15-20个氨基酸缺失；更优选最初的20-25个氨基酸缺失；最优选最初的23-24个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的pvORF1蛋白质亚基，其中最初的20-25个氨基酸缺失；优选最初的25-30个氨基酸缺失；更优选最初的30-35个氨基酸缺失；最优选最初的33-34个氨基酸缺失。

在其它的更为优选的方面中，该截短的VRP亚基含有一种截短的pvORF2蛋白质亚基，其中最初的30-35个氨基酸缺失；优选最初的35-40个氨基酸缺失；更优选最初的40-45个氨基酸缺失；最优选最初的43-44个氨基酸缺失。一些优选的截短的VRP亚基的序列的例子示于图2。

本文也提供了本文描述的编码截短的VRP亚基的核苷酸分子。这种核苷酸分子可以是，例如，DNA，cDNA或RNA。本发明也提供了含有编码该截短的VRP的核苷酸分子的重组DNA载体，以及由这种重组DNA载体转化的宿主细胞，其中，这种载体指导如本文所述的截短的VRP亚基的合成。

本发明还提供了编码VRP亚基的N-末端截短的生物合成的前体形式的核酸分子，已便于在适当的宿主系统中表达。这种核酸分子在它们的N-末端含有编码位于截短的亚基前面的信号肽的DNA。这些VEGF或VRP的信号序列可被用于构建适当的含有信号肽的截短形式的VRP。人类VEGF信号肽如下：

mnfllswvhwslalllylhhakwsqa  (I)----[SEQ ID NO：40]----或者，可使用图1所示的信号肽。优选在构建体中使用特异于截短的VRP的信号肽。

为了便于在哺乳动物细胞中在信号序列与截短形式的VRP融合后信号肽的切割，可能需要包括成熟的VRP肽序列的第一个或前两个残基，例如对于hVEGFB来说为脯氨酸(P)或脯氨酸-缬氨酸(PV)。因而，适当的核酸分子将包括编码VEGFB的信号序列的DNA，任选地跟随脯氨酸的密码子(成熟的VEGF-B的第一个残基)，任选地跟随缬氨酸的密码子(成熟的VEGF-B的第二个残基)，并跟随编码N-末端截短的VEGF-B的DNA。本发明也提供了其它的最适用于非-哺乳动物宿主的适当的信号肽融合构建体，如本领域普通技术人员所知。本领域普通技术人员将会看到，对于本发明的各种截短的VRP亚基，该信号肽应任选地包括为便于信号肽在哺乳动物细胞中切割所需的残基。

因而，本发明提供了重组DNA表达载体，其中，编码截短的VRP亚基的核酸分子的5’端与编码信号肽的DNA序列可操纵连接。该信号肽可以是人类VRP信号肽。而且，编码所说的信号肽的DNA序列可以在所说的DNA序列的3’端与编码该成熟的非-截短的VRP亚基的第一个氨基酸残基的DNA可操纵连接，并且其中编码所说的残基的所说的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP亚基的核酸分子可操纵连接。在其它方面，编码所说的信号肽的DNA序列在所说的DNA序列的3’端与该成熟的非-截短的VRP亚基的前两个氨基酸残基可操纵连接，并且其中编码所说的两个残基的所说的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP亚基的所说的核酸分子可操纵连接。因而，在优选的方面中，本发明也提供了一种如上所述的本发明的截短的VRP亚基，在所说的截短的VRP亚基的N-末端还包括成熟的非-截短的VRP亚基的第一个或前两个氨基酸残基。本领域普通技术人员将会看到，本发明的这种截短的VRP亚基包括其中核心序列的第一个半胱氨酸的N-端氨基酸的最终数目(包括可便于信号肽切割的额外的一个或两个氨基酸)比相应的全长VRP的核心序列的第一个半胱氨酸的N-端氨基酸的数目至少少一个的那些。

在其它的优选方面中，本发明提供了含有两个截短的VRP亚基的截短的VRP同源二聚体或异源二聚体，其中，所说的截短的VRP亚基在所说的截短的VRP亚基的N-末端含有成熟的非-截短的VRP亚基的第一个或前两个氨基酸残基。

在优选的方面中，编码本发明的截短的VRP亚基的重组核酸分子与可在所说的载体转化的宿主细胞中操纵的控制序列可操纵连接。本发明也提供了含有本发明的重组DNA载体的转化的或转染的宿主细胞。

本发明也包括投送载体，它含有编码本发明的截短的VRP的核酸分子。这种投送载体可以是，例如，病毒载体。这种病毒载体可以是，例如，腺病毒载体或腺-相关病毒载体。本发明的其它方面提供了一种腺病毒载体，它包括一种编码一种本发明的截短的VRP的核酸分子，在该核酸分子的5’端与一种编码信号肽的DNA序列可操纵连接。优选该信号肽选自VEGF信号肽，VEGF-B信号肽，VRF-2信号肽，VEGF-C信号肽，PlGF信号肽，VEGF-3信号肽，痘病毒ORF-1信号肽，和痘病毒ORF-2信号肽。优选所说的信号肽是VEGF-B信号肽。在优选的方面中，编码信号肽的DNA序列在该DNA序列的3’端与编码成熟的非-截短的VRP亚基的第一个氨基酸残基的DNA可操纵连接，并且其中所说的编码所说的残基的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP的核酸分子可操纵连接。在最为优选的方面中，腺病毒载体含有编码图2中的截短的VRP亚基的核酸分子。

本发明的更为优选的方面提供了一种过滤的-可注射的腺病毒载体制品，它含有一种重组腺病毒载体，所说的载体不含有野生型病毒，并含有：一种部分腺病毒序列，其中E1A/E1B基因缺失，和一种编码截短的VRP亚基的转基因，由一种被该部分腺病毒序列侧接的启动子驱动；和一种药学可接受的载体。在优选的方面中，该制品已通过30微米的滤膜过滤。在其它的优选的方面中，截短的VEGF亚基是一种图2中的截短的VEGF亚基。在另一个优选的方面中，该可注射的腺病毒载体制品含有一种选自下组的启动子：CMV启动子，室-肌细胞特异性启动子，和肌球蛋白重链启动子。

在其它的方面中，本发明提供了一种制备截短的VRP多肽的方法，包括在适当的条件下生长一种用本发明的重组DNA表达载体以允许所说的多肽表达的方式转化或转染的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所说的多肽。然后提供适当的条件使截短的VRP多肽折叠成截短的VRP亚基。在哺乳动物细胞中，这种条件可由细胞自然提供。在非-哺乳动物细胞中，必须提供适当的pH、等渗性、和还原条件，例如实施例2中所述。最为优选的是，本发明提供了一种制备截短的VRP的方法，其中，提供适当的条件使所说的截短的VRP亚基与第二种选自VRP亚基和截短的VRP亚基的VRP亚基二聚体化。本发明的优选的方面提供了制备截短的VRP同源二聚体的方法，该同源二聚体包括两个具有相同的氨基酸序列的截短的VRP亚基。

本发明的其它的方面提供了制备截短的VRP异源二聚体的方法，其中两个VRP亚基具有不同的氨基酸序列。这种异源二聚体可以由一个截短的VRP亚基和一个非-截短的VRP亚基组成，或者两个VRP亚基均为截短的。该两个亚基可以起源于不同的VRP。例如，该异源二聚体可以由一个VEGF-B亚基和一个截短的VEGF-C亚基组成，或者两个亚基均为截短的。

在更为优选的方面中，本发明提供了药物组合物，在适当的载体中含有本发明的截短的VRP亚基。本发明包括刺激血管形成的方法，包括给患者施用这种药物组合物。

本发明提供了在体外使用本发明的化合物刺激内皮细胞生长或内皮细胞转移的方法，包括用截短的VRP处理所说的内皮细胞。

本发明也提供了治疗患有心脏病的病人的方法，包括给所说的病人施用一种编码至少一种截短的VRP亚基的核酸分子，所说的核酸分子可在所说的病人中表达截短的VRP亚基。在另外的实施方案中，本发明提供了在病人中刺激血管形成的方法，包括使用治疗量的含有本发明的截短的VRP的药物组合物。

优选该药物组合物是在一种适用于治疗的投送系统中。在其它的优选的方面中，施用一种增效剂，以加强所说的截短的VRP的血管形成效应。这种增效剂包括，例如，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(FGF-2)，酸性FGF(aFGF)(FGF-1)，FGF-4，FGF-5，FGF-6，或刺激内皮细胞的任何FGF或其它的血管形成因子。因而本发明的一个方面提供了一种药物组合物，含有一种截短的VRP和一种或多种增效剂。该药物组合物也可被用于治疗患有局部缺血疾病的病人，例如心肌梗塞，慢性冠状动脉局部缺血，慢性下肢局部缺血，中风，和外周血管疾病。本发明也提供了使用本发明的药物组合物治疗损伤的方法，例如皮肤或肠损伤。

在优选的实施方案中，本发明提供了对患者刺激血管形成的方法，包括将投送载体通过在一个或两个冠状动脉内直接的冠状动脉注射投送到患者的心肌层，所说的载体含有编码至少一种截短的VRP亚基的核酸分子，其中所说的载体可在心肌层中表达截短的VRP亚基。

在其它的优选的实施方案中，该方法可被用于刺激冠状动脉旁系血管发育。

在更为优选的实施方案中，本发明提供了一种在具有外周血管疾病的病人中刺激血管发育的方法，包括将投送载体通过对一个或两个股动脉进行股动脉内注射投送到病人的外周血管系统中，所说的载体含有一种编码截短的VRP亚基的转基因，并可在外周血管系统中表达该截短的VRP亚基，从而促进外周血管发育。

本发明中使用的投送载体优选是一种病毒投送载体。在一个优选的方面，该投送载体是一种复制缺陷性腺病毒载体。在另一个优选的方面，该投送载体是一种腺相关病毒载体。附图简要说明：

图1描述了VEGF-B[SEQ ID NO：1]，VRF-2[SEQ ID NO：2]，VEGF-C[SEQ ID NO：3]，PlGF(人类PlGF-2)[SEQ ID NO：4]，VEGF-3[SEQ ID NO：5]，痘病毒ORF-1[SEQ ID NO：6]，和痘病毒ORF-2[SEQID NO：7]的氨基酸序列。小写字母表示从成熟的蛋白质切除的信号肽。核心序列的八个半胱氨酸用下划线表示。这些序列描述于下述文献中：人类VEGF-B：Grimmond等，基因组研究，6：122-29(1996)；Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81(1996)；小鼠VEGF-B：Olofsson等，美国科学院院刊，93：2567-81(1996)；人类VRF-2：Grimmond等，基因组研究，6：122-29(1996)；人类VEGF-C：Joukov等，EMBOJ，15：290-98(1996)；Lee等，美国科学院院刊，93：1988-92(1996)；PlGF：Maglione等，癌基因，8：925-31(1993)；Hauser和Weich，生长因子，9：259-68(1993)；人类VEGF3：PCT申请，PCT/US95/07283，1996年12月12日公开，公开号WO96/39421；痘病毒ORF-1和ORF-2：Lyttle等，病毒学杂志，68：84-92(1994)。

图2a-2f在相应的全长(F/L)VRP序列的下面描述截短的VRP氨基酸序列的例子。每一种截短的氨基酸序列如下：

2a(F/L)[SEQ ID NO：34](1)[SEQ ID NO：8]；2a(2)[SEQ IDNO：9]；2a(3)[SEQ ID NO：10]；2a(4)[SEQ ID NO：11]；2a(5)[SEQ ID NO：12]；2a(6)[SEQ ID NO：13]；2b(F/L)[SEQ ID NO：35]；(1)[SEQ ID NO：14]；2b(2)[SEQ ID NO：15]；2b(3)[SEQ IDNO：16]；2b(4)[SEQ ID NO：17]；2c(F/L)[SEQ ID NO：36]；(1)[SEQ ID NO：18]；

2c(2)[SEQ ID NO：19]；2c(3)[SEQ ID NO：20]；2c(4)[SEQID NO：21]；2d(F/L)[SEQ ID NO：37]；(1)[SEQ ID NO：22]；2d(2)[SEQ ID NO：23]；2d(3)[SEQ ID NO：24]；2d(4)[SEQ ID NO：25]；2e(F/L)[SEQ ID NO：38](1)[SEQ ID NO：26]；2e(2)[SEQ IDNO：27]；2e(3)[SEQ ID NO：28]；2e(4)[SEQ ID NO：29]；2f(F/L)[SEQ ID NO：39]；(1)[SEQ ID NO：30]；2f(2)[SEQ ID NO：31]；2f(3)[SEQ ID NO：32]；和2f(4)[SEQ ID NO：33]。发明详述新型截短的VRP序列的构建

本发明的第一方面描述了一种截短的VRP，它含有至少一个截短的VRP亚基。“截短的VRP亚基”是指一种VRP亚基，它具有基本上类似于VRP中的一种的氨基酸序列，例如，但不限于图1所示的序列中的一种，或它们的类似物或衍生物，其中成熟的亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端的至少一个N-末端氨基酸残基被缺失。一种“基本上类似于”VRP的序列含有一种与VEGF-B的8个半胱氨酸核心序列具有至少25％同源性的氨基酸序列，含有所说的核心序列的所有的必需的保守的半胱氨酸残基，并保留VRP活性。“截短的VRP亚基”也表示这样一种VRP亚基，其中VEGF核心序列的第一半胱氨酸N-端的至少一个N-末端氨基酸残基被缺失，并且，核心序列的至少一个半胱氨酸被缺失，其中所说的半胱氨酸是非-必需的。非-必需的半胱氨酸是指保持VRP活性所不需要的半胱氨酸。这种非-必需的半胱氨酸描述于与PDGF有关的描述中。(Potgens，等，生物化学杂志，269：32879-85(1994))。

“一致性”是指序列的一种性质，以此度量它们的相似性或关系。一致性是通过将相同残基的数目除以残基的总数目并将结果乘以100来测定的。这样，两个完全相同序列的拷贝具有100％的一致性，但不是高度保守的序列和具有缺失、增加、或替换的序列具有较低程度的一致性。在计算序列的一致性时，将两个序列从N-末端缺失的羧基末端开始进行比较。本领域普通技术人员将会意识到可使用几种计算机程序用于确定序列一致性。

截短的VRP多肽或亚基的类似物是具有相似的氨基酸序列并在某种程度上保留相关的截短的VRP多肽或亚基的一种或多种活性的功能等同物。“功能等同物”是指具有一种活性的类似物，该活性可以替换特定的截短的VRP多肽或亚基的一种或多种活性。优选的功能等同物保留特定的截短的VRP多肽或亚基的全部活性，但是，当在如本文公开的VRP功能测定中进行定量测定时该功能等同物具有较强或较弱的活性。在多数情况下，这种截短的VRP多肽或亚基必需被整合进截短的VRP二聚体，以测定功能活性。优选的功能等同物具有相关的截短的VRP多肽或亚基的活性的1％至10000％的活性，更优选10％至1000％，最优选50％至200％。

一种衍生物保留一些活性的能力可使用本文描述的技术进行测定。这些衍生物包括转译期间或转译后发生的修饰，例如，磷酸化作用，糖基化作用，交联，酰化作用，蛋白质裂解，与一种抗体分子、膜分子或其它配体连接(参见Ferguson等，1988，生物化学年度评论，57：285-320)。

特定类型的衍生物或类似物也包括氨基酸变化，例如缺失，替换，增加，和氨基酸修饰。“缺失”是指在相关的多肽中一个或多个氨基酸残基的缺失。“增加”是指在相关的多肽中一个或多个氨基酸残基的增加。多肽的增加和缺失可以是在氨基端、羧基端、和/或内部。氨基酸的“修饰”是指天然存在的氨基酸发生变化产生非-天然存在的氨基酸。“替换”是指多肽中一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基替换。衍生物可含有不同的变化的组合，包括多于一种的变化和不同类型的变化。

虽然氨基酸的变化对VRP活性的影响根据各种因素而不同，例如磷酸化、糖基化、链内连接、三级结构、和氨基酸在活性位点所起的作用或可能的别构位点，通常优选替换氨基酸来自与被替换的氨基酸相同的群组。在某种程度上来说，下列群组包含可相互替换的氨基酸：碱性氨基酸赖氨酸，精氨酸，和组氨酸；酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；中性极性氨基酸丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺和在较小程度上来说，甲硫氨酸；非极性脂肪族氨基酸甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，和亮氨酸(但是，由于大小的缘故，甘氨酸和丙氨酸更接近于缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸更为接近)；和芳香族氨基酸苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸。此外，虽然被分为不同的种类，丙氨酸，甘氨酸，和丝氨酸在某种程度上来说好像可互相替换，此外半胱氨酸适合于这一群组，或者可被划分在极性中性氨基酸中。

优选的衍生物具有一个或多个氨基酸变化，这些变化不显著影响相关的截短的VRP多肽或亚基的活性。在截短的VRP多肽或亚基的对于VRP活性所不需要的区域中，氨基酸可被缺失、增加或替换而承担较小的影响活性的风险。在对于VRP活性所必需的区域中，氨基酸的变化不是优选的，因为具有较大的影响VRP活性的风险。这些变化应为保守性的变化。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可被其它的具有相似的极性的充当功能等同物的氨基酸替换。

保守区域对于蛋白质活性来说比非保守区域更为重要。使用本文中公开的体外诱变技术或缺失分析并测定VRP活性的标准方法，可确定对于VRP活性来说重要的保守和非保守区域。

使用标准的化学技术和重组核酸分子技术可生产衍生物。对特定的多肽的修饰可以是事先设计的，如通过定点诱变和固相合成过程中的氨基酸替换，或者可以是偶然的，例如通过产生该多肽的宿主中的突变。包括衍生物的这些多肽可使用标准技术获得，例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社(1989)中所述的技术。例如，Sambrook在第15章中描述了用于克隆的DNA的定点诱变方法。

“截短的VRP多肽”是指一种含有本发明的截短的VRP亚基的氨基酸序列的多肽，或者本文所述的它们的功能类似物或衍生物。术语“截短的VRP多肽”也包括截短的VRP亚基；术语“亚基”通常是指一种已折叠成活性的三维结构的肽。

“截短的VRP”是指一种两个VRP亚基的二聚体。该两个亚基可以来源于两个不同的VRP，其中两个亚基均为截短的VRP亚基。该亚基中的一个或两个可以是截短的；该两个亚基也可以具有不同的N-末端缺失。

富集的或纯化的截短的VRP、截短的VRP亚基、截短的VRP多肽具有一些优点。本文中所使用的术语“富集的”是指特定的氨基酸序列在感兴趣的细胞或溶液中构成了比在正常的或疾病细胞中或在该序列被提取的细胞中存在的总氨基酸序列的显著较高的部分(2-5倍)。这可通过优先减少其它的氨基酸序列的存在量，或通过优先提高感兴趣的特定的氨基酸序列的存在量，或通过两者的结合来达到。但是，应当说明的是富集并不意味着不存在其它的氨基酸序列，而只是感兴趣的序列的相对量已显著提高。本文所使用的术语“显著”是指提高的水平对于造成这种提高的人来说是有用的，并且通常是指相对于其它的氨基酸序列提高了约至少2倍，优选至少5至10倍或更高。这一术语也不意味着没有其它来源的氨基酸序列。这种其它来源的氨基酸序列可以含有，例如，由酵母或细菌基因组或诸如pUC的克隆载体编码的氨基酸。这一术语仅涉及这样一种情形，其中人们进行了干预以提高所需的氨基酸序列的比例。

对于一些用途来说，纯化形式的氨基酸序列是有利的。术语“纯化的”对于一种多肽来说并不需要绝对的纯净(例如同源制备)；而只是表示该序列相对于天然环境来说较为纯净(与天然水平相比较，这一水平应高至少10倍，例如以mg/ml计量)。本发明预想的纯化为至少纯化一个数量级，优选两个或三个数量级，最优选四个或五个数量级。该物质在功能性显著水平上最好不含有污染物，例如90％，95％，或99％纯度。

本发明的另一个方面描述了一种编码截短的VRP多肽或亚基的核酸分子。

在某些情况下需要将这种核酸分子富集或纯化。所使用的术语“富集的”对于核酸分子来说是指特定的DNA或RNA序列在感兴趣的细胞或溶液中构成了比在正常的或疾病细胞中或在该序列被提取的细胞中存在的总DNA或RNA的显著较高的部分(2-5倍)。这可通过优先减少其它的DNA或RNA的存在量，或通过优先提高感兴趣的特定的DNA或RNA的存在量，或通过两者的结合来达到。但是，应当说明的是富集并不意味着不存在其它的DNA或RNA序列，而只是感兴趣的序列的相对量已显著提高。本文所使用的术语“显著”是指提高的水平对于造成这种提高的人来说是有用的，并且通常是指相对于其它的核酸提高了约至少2倍，优选至少5至10倍或更高。这一术语也不意味着没有其它来源的DNA或RNA。这种其它来源的DNA可以含有，例如由酵母或细菌基因组或诸如pUC的克隆载体。这一术语所表示的概念不同于自然发生的事件，例如病毒感染，肿瘤类型的生长，一种mRNA的水平相对于其它种类的mRNA可以自然的增高。这一术语仅涉及这样一种情形，其中人们进行了干预以提高所需的核酸的比例。

对于一些用途来说，纯化形式的核苷酸序列是有利的。术语“纯化的”对于一种核酸分子来说并不需要绝对的纯净(例如同源制备)；而只是表示该序列相对于天然环境来说较为纯净(与天然水平相比较，这一水平应高至少2-5倍，例如以mg/ml计量)。

核酸分子可以从存在的VRP核苷酸序列通过修饰来构建，使用，例如，寡核苷酸定点诱变，或通过使用限制酶切除序列，或通过本文所述的方法。可以使用标准的用于诱变的重组技术，例如体外定点诱变(Hutchinson等，生物化学杂志，253：6551，(1978)，Sambrook等，第15章，文献同上)，使用TAB(R)连接子(Pharmacia)，和PCR-定点诱变来产生这种突变。核酸分子也可通过三酯方法(triester method)或通过使用自动DNA合成仪进行合成。

本发明也描述了优选在一种细胞或一种有机体中的重组DNA载体和重组DNA表达载体。该重组DNA载体可含有在一种载体中的编码一种截短的VRP或一种它的功能衍生物的序列，该载体含有一种可有效在宿主细胞中起始转录的启动子。该重组DNA载体可含有一种在细胞中具有功能的转录起始区域和一种在细胞中具有功能的转录终止区域。

本发明也涉及一种含有上述的核酸分子或重组DNA载体从而可表达截短的VRP肽的细胞或有机体。该多肽可以从已被改变以表达该多肽的细胞中纯化出来。一种细胞被认为“已被改变以表达所需的多肽”是指这种细胞通过基因操作使其产生一种通常它不产生或者通常该细胞以较低的水平产生的蛋白质。本领域普通技术人员可容易地修改这些方法，以将基因组、cDNA、或合成的序列导入真核或原核细胞并在其中表达。

一种核酸分子，例如DNA，被认为“可表达”一种多肽如果它含有一种核酸序列，该核酸序列含有转录和转移调节信息并且这种序列与编码该多肽的核苷酸序列“可操纵连接”。基因序列表达所需要的调节区域的确切性质可以在有机体之间互不相同，但通常应包括启动子区域，该启动子区域在原核生物中含有启动子(引导RNA转录的起始)以及一种DNA序列，该DNA序列当被转录成RNA后可引导合成的起始。这种区域通常包括那些参与转录和转移起始的5’-非-编码序列，例如TATA盒，帽序列，CAAT序列，等。

例如，截短的VRP亚基或它们的片断的完整编码序列可以在一种适当的表达载体中与下述的一种或多种组合，以允许这种表达的进行：(1)一种外源启动子序列(2)一种核糖体结合位点(3)一种聚腺苷酸化信号(4)一种分泌信号。可在5’-非转译和3’-非转译序列中进行修饰，以改善原核或真核细胞中的表达；或者可以改变密码子，使得虽然它们编码相同的氨基酸，而这种密码子是所选择的表达系统优选的密码子。这种优选的密码子的使用描述于，例如，Grantham等，核酸研究，9：43-74(1981)，和Lathe，分子生物学杂志，183：1-12(1985)，其内容全部引入本文作为参考。

如果需要，基因组VRP序列的3’端的非编码区域可以与编码这种VRP亚基的核酸分子可操纵连接。这一区域可在该重组DNA载体中被用作它的转录终止调节序列，例如终止和多聚腺苷酸化。这样，通过保留天然状态下与编码VRP基因的DNA序列邻接的3’-区域，可提供转录终止信号。或者，在宿主细胞中具有功能的3’-区域可被替换。

可操纵连接是这样一种连接，其中调节DNA序列和待表达的DNA序列的连接方式允许基因序列的表达。两个DNA序列(例如启动子区域序列和截短的VRP序列)被认为是可操纵连接如果该两个DNA序列之间的连接的性质不(1)导致编码序列中移码突变的导入，(2)干扰启动子区域序列引导截短的VRP基因序列的转录的能力，或(3)干扰截短的VRP基因序列被启动子区域序列转录的能力。因而，一种启动子区域与一种DNA序列为可操纵连接如果该启动子可转录该DNA序列。这样，为表达一种截短的VRP基因，被适当的宿主识别的转录和转译信号是必需的。新型截短的VRP序列的表达和纯化

实施例2和实施例3描述了在杆状病毒中表达的本发明的新型截短的VRP序列的表达和纯化。本领域普通技术人员将会看到，本发明的截短的VRP也可在其它的细胞系统中表达，无论是真核的或原核的，这些均在本发明的范围之内。实施例4-6提供了适当的检测的例子，用于检测该新型截短的VRP的功能活性。

虽然本发明的截短的VRP可在原核细胞中表达，通常它们对产生重组蛋白质非常有效和方便，由这种细胞产生的截短的VRP将不被糖基化，因而在体内具有较短的半衰期。原核生物通常由各种品系的大肠杆菌代表。但是，也可使用其它的微生物品系，包括其它的细菌品系。被认可的原核宿主包括细菌，例如，大肠杆菌，芽孢杆菌，链霉菌，假单孢菌，沙门氏菌，沙雷氏菌，等。原核宿主必须与表达质粒中的复制子和控制序列相容。

在原核系统中，可使用含有来源于与宿主相容的种类的复制位点和控制序列的质粒载体。适当的质粒载体的例子可以包括pBR322，pUC118，pUC119等；适当的噬菌体载体可以包括γgt10，γgt11等；适当的病毒载体可以包括pMAM-neo，pKRC等。优选本发明所选择的载体具有在所选择的宿主细胞中复制的能力。

为了在原核细胞中表达截短的VRP多肽或亚基(或它们的功能衍生物)，需要将该截短的VRP序列与一种功能性原核启动子可操纵连接。这种启动子可以是组成型的或者，更为优选的是，可被调节的(即可诱导或者可脱阻抑的)。组成型启动子的例子包括噬菌体λ的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因序列的bla启动子，和pPR325的氯霉素酰基转移酶基因序列的CAT启动子，等。可诱导的原核启动子的例子包括噬菌体λ的主要右和左启动子(P_L和P_R)，大肠杆菌的trp，recA，λacZ，λacI，和gal启动子，B.Subtilis的α-淀粉酶(Ulmanen等，细菌学杂志，162：176-182(1985))和ζ-28-特异性启动子(Gilman等，基因序列，32：11-20(1984))，芽孢杆菌的噬菌体的启动子(Gryczan，In：芽孢杆菌的分子生物学，学术出版社有限公司，NY(1982))，和链霉菌启动子(Ward等，分子普通遗传学，203：468-478(1986))。原核启动子由Glick(J.Ind.Microbiot.1：277-282(1987))；Cenatiempo(Biochimie，68：505-516(1986))；和Gottesman(遗传学年度评论，18：415-442(1984))。

在原核细胞中的适当表达也需要基因序列编码序列上游的核糖体结合位点的存在。这种核糖体结合位点公开于，例如，Gold等，(微生物学年度评论，35：365-404(1981))。核糖体结合位点和其它的转译起始所需要的序列与编码截短的VRP的核酸分子可操纵连接，这是通过，例如，含有这种控制序列的合成的寡核苷酸的框内连接进行的。对于在原核细胞中表达，不需要信号肽序列。对控制序列，表达载体，转化方法等的选择依赖于表达该基因所使用的宿主细胞的类型。

本文中使用的“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这些名称包括子代。因而，术语“转化子”或“转化的细胞”包括初级受试细胞和由此衍生的培养物，而不管传代的数目。在原核细胞中表达的截短的VRP肽包括适当截短的VRP肽，其N-末端序列可从表达载体的序列推导出，和一种截短的VRP肽，它们具有由于细菌表达过程中起始甲硫氨酸的无效切割产生的N-末端甲硫氨酸，的混合物。两种类型的截短的VRP肽均被认为属于本发明的范围，因为N-末端甲硫氨酸的存在并不影响生物活性。由于故意的或偶然的突变，并不是所有的子代在DNA含量上是完全相同的。但是，正如所限定的那样，突变的子代具有与原先的转化细胞相同的功能。

优选的原核载体包括例如可在大肠杆菌中复制的质粒(例如，pBR322，ColE1，pSC101，pACYC184，πVX。这些质粒，例如，描述于Sambrook(分子克隆：实验室手册，第二版，Sambrook，Fritsch，和Maniatis编辑，冷泉港实验室出版社，(1989))。芽孢杆菌质粒包括pC194，pC221，pT127，等。这种质粒由Gryczan(芽孢杆菌的分子生物学，Academic Press，NY(1982)，第307-329页)公开。适当的链霉菌质粒包括plJ101(Kendall等，细菌学杂志，169：4177-4183(1987))，和链霉菌噬菌体，例如，φC31(Chater等，In：第六届放线菌生物学国际研讨会，Akademiai Kaido，布达佩斯，匈牙利(1986)，第45-54页)。假单孢菌质粒由John等(传染病综述，8：693-704(1986))，和Izaki(日本细菌学杂志，33：729-742(1978))进行了综述。

对可用于本发明的表达系统的真核宿主细胞没有特别限制，只要它们适用于表达截短的VRP肽。优选的真核宿主包括，例如，酵母，真菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞，或者在体内，或者在组织培养中。可被用作宿主的哺乳动物细胞包括HeLa细胞，来源于成纤维细胞的细胞，例如VERO或CHO-K1，或来源于淋巴的细胞或它们的衍生物。

本发明的截短的VRP也可在人类细胞中表达，例如，人类胚胎肾293EBNA细胞，它表达Epstein-Barr病毒核抗原1，如Olofsson，B等，美国科学院院刊93：2576-2581(1996)所述。将这些细胞用实施例2的表达载体通过磷酸钙沉淀方法进行转染，然后将细胞温浴至少48小时。然后截短的VRP肽可从上清液中纯化，如实施例3所述。

此外，也可使用植物细胞作为宿主，并且可以得到与植物细胞相容的控制序列，花椰菜花叶病毒35S和19S，和胭脂碱合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。另一种优选的宿主是昆虫细胞，例如，果蝇幼虫。使用昆虫细胞作为宿主可使用果蝇乙醇脱氢酶启动子。Rubin，科学，240：1453-1459(1988)。

可使用一系列酵母基因序列表达系统中的任何一种，它们整合了来自编码糖酵解酶的活跃表达的基因序列的启动子和终止元件，当酵母生长在富含葡萄糖的培养基中时糖酵解酶会大量产生。已知的糖酵解基因序列也可提供非常有效的转录控制信号。酵母具有非常明显的优点，它也可进行转译后肽修饰。已经存在一些使用强的启动子序列和高拷贝数的质粒的重组DNA策略，可用于在酵母中生产所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物序列上的引导序列，并分泌携带引导序列的肽(即前肽)。对于哺乳动物宿主，可使用几种可能的载体系统来表达截短的VRP肽。

根据宿主的性质，可使用很多的转录和转译调节序列。这些转录和转译调节信号可来自病毒，例如腺病毒，牛乳头瘤病毒，巨细胞病毒，猿猴病毒，等，其中这些调节信号与特定的具有高水平表达的基因序列相关联。或者，也可使用来自哺乳动物表达产物，例如肌动蛋白，胶原蛋白，肌球蛋白等的启动子。可对转录起始调节信号进行选择，使其允许阻抑或激活，从而可对该基因序列的表达进行调制。温度敏感性的调节信号是优选的，从而可通过改变温度对表达进行阻抑或起始，或者受化学品(例如代谢物)调节。

截短的VRP在真核宿主中的表达需要使用真核调节区域。这种区域通常包括足以引导RNA合成的起始的启动子区域。优选的真核启动子包括，例如，小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，细胞，31：355-365(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，自然(伦敦)，290：304-310(1981))；酵母ga14基因序列启动子(Johnston等，美国科学院院刊，79：6971-6975(1982)；Silver等，美国科学院院刊，81：5951-5955(1984))。

真核mRNA的转译是在编码第一个甲硫氨酸的密码子处起始的。由于这一原因，最好保证真核启动子和编码截短的VRP(或其功能衍生物)的DNA序列之间的连接不含有插入的可编码甲硫氨酸的密码子(即，AUG)。这种密码子的存在或者导致融合蛋白质的形成(如果该AUG密码子与截短的VRP编码序列同框)或者导致移码突变(如果该AUG密码子与截短的VRP编码序列不同框)。

截短的VRP核酸分子和可操纵连接的启动子可以以非复制型DNA(或RNA)分子，它可以是一种线性分子，或者最好以一种封闭共价环形分子被导入受体原核或真核细胞。由于这种分子是可以自动复制的，基因的表达可通过导入的序列的瞬间表达发生。或者，通过将导入的DNA序列整合进宿主染色体而产生永久表达。

可以使用一种可将所需的基因序列整合进宿主细胞染色体的载体。在染色体中已稳定整合进导入的DNA的细胞的选择通过也导入一个或多个标记来进行，从而允许含有表达载体的宿主细胞的选择。标记可以对营养缺陷型提供原养型，提供杀生物抗性，例如对抗生素或重金属例如铜等的抗性。可选择的标记基因序列可直接与待表达的基因序列相连，或通过共转染被导入同一个细胞。对于单链结合蛋白质mRNA的最适合成也可需要额外的元件。这些元件可包括剪切信号，以及转录启动子，增强子，和终止信号。含有这种元件的cDNA表达载体包括由Okayama，分子细胞生物学，3：280(1983)描述的那些。

被导入的核酸分子可整合进可在受体宿主中自动复制的质粒或病毒载体中。很多载体中的任何一种可用于这一目的。在选择特定的质粒或病毒载体中的重要的因素包括：含有载体的受体细胞从不含有载体的受体细胞中被识别和被选出的难易程度；在特定的宿主中所需的载体的拷贝数目；和是否需要能够将载体在不同种类的宿主细胞之间“穿梭”。

优选的真核质粒包括，例如，BPV，牛痘，SV40，2-微米环，等，或它们的衍生物。这种质粒是本领域公知的(Botstein等，迈阿密冬季讨论会，19：265-274(1982)；Broach，In：“酵母的分子生物学：生活周期和遗传”，冷泉港实验室，冷泉港，NY，第445-470页(1981)；Broach，细胞，28：203-204(1982)；Bollon等，J.Clin.Hematol.Oncol.，10：39-48(1980)；Maniatis，In：细胞生物学：一本综合性专著，第3卷，基因序列表达，学术出版社，NY，第563-608页(1980)。

在用于表达的含有载体或核酸分子的构建体制备后，该DNA构建体可通过任何一种适当的方式被导入适当的宿主细胞，即，转化，转染，接合，脂质体融合，电穿孔，粒子枪技术，脂转染，磷酸钙沉淀，直接微注射，DEAE-葡聚糖转染，等。用质粒DNA转染真核细胞系的最有效的方法根据细胞类型的不同而不同。在载体导入之后，将受体细胞生长在选择培养基上，选择出含有载体的细胞进行生长。克隆的基因分子的表达导致截短的VRP或其片断的产生。这可在转化的细胞中发生，或者在这些细胞被诱导分化之后发生(例如，通过对成神经细胞瘤细胞施用溴脱氧尿苷等)。可使用多种温浴条件来形成本发明的肽。最优选的条件是那些模拟生理条件的条件。

稳定的转染子的产生可通过例如用真核表达载体，例如pCEP4，转染适当的细胞系来完成，其中，截短的VRP多肽或亚基的编码序列已被克隆进多克隆位点。这些表达载体含有启动子区域，例如，人类巨细胞病毒启动子(CMV)，它在多种哺乳动物细胞中使所需的DNA分子进行高水平的转录。此外，这些载体含有用于选择稳定表达所需的DNA分子的细胞的基因。在pCEP4中的可选择标记编码一种赋予潮霉素抗性的酶。潮霉素是一种加入培养基中杀死非转染细胞的代谢抑制剂。

具有稳定整合进的转染的DNA的细胞通过它们对选择培养基的抗性而被识别，如上所述，并且克隆细胞系通过抗性集落的扩增而产生。由这些细胞系对截短的VRP DNA的表达可通过溶液杂交和Northern印迹分析进行评估。药物组合物和治疗应用

本发明的一个目的是在适用于治疗用途的药物组合物中提供截短的VRP。因而，本发明的一个方面提供了一种在病人中刺激血管形成的方法，这是通过施用治疗有效量的含有截短的VRP的药物组合物来进行的。

“治疗有效量”是指在患者中产生所需的治疗效果的化合物的量。例如，对于一种疾病或紊乱来说，它是在某种程度上降低疾病或紊乱的一种或多种症状，并部分或完全恢复至正常的与这种疾病或紊乱相关的或由其造成的生理或生化参数的量。当用于治疗病人时，这一量为0.1mg/kg至100mg/kg，优选低于50mg/kg，更优选低于10mg/kg，更优选低于1mg/kg。化合物的量依赖于与患者相关的年龄，体重，和疾病。

本发明的最适配方和对患者施用的最适方式依赖于现有技术中已知的一些因素，例如特定的疾病或紊乱，所需要的效果，以及患者的类型。虽然该化合物通常适用于治疗人类患者，它们也可被用于治疗其它脊椎动物的类似的或相同的疾病，例如其它的灵长类，家畜例如猪，牛和家禽，竞技动物和宠物例如马，狗和猫。

优选一种药物组合物提供治疗的有效量。药物制剂或组合物是指一种适合于对多细胞有机体例如人类施用的形式的制剂或组合物。适当的形式部分依赖于施用或进入的途径，例如口服，透过皮肤，或通过注射。这种形式应允许该制剂或组合物达到靶细胞，而不管该靶细胞存在于多细胞宿主中或者是在培养中。例如，注射进血液中的药物制剂或组合物应为可溶性的。现有技术也已知其它的一些因素，并包括这样一些考虑，例如防止该制剂或组合物发挥效力时的毒性和形式。

本发明要求保护的组合物也可被配制成药学上可接受的盐类(例如，酸加成盐)和/或它们的复合物。药学上可接受的盐类在它们被施用的浓度时是非毒性的盐类。这种盐类的制备通过改变组合物的物理-化学特性方便了药物的使用，而不影响组合物的生理效应的发挥。在物理性质上有用的变化的例子包括降低熔点以便于跨粘膜施用，和提高溶解度，以便于药物的高浓度施用。

药学上可接受的盐类包括酸加成盐类，例如，硫酸盐，盐酸盐，磷酸盐，磺酸盐，氨基磺酸盐，硫酸盐，乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲基苯磺酸盐，环己基磺酸盐，环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐。药学上可接受的盐类可从以下酸类获得：盐酸，硫酸，磷酸，磺酸，氨基磺酸，乙酸，柠檬酸，乳酸，酒石酸，丙二酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，对甲基苯磺酸，环己基磺酸，环己基氨基磺酸，和奎尼酸。这种盐可通过例如将游离的酸或碱形式的产物与一个或多个当量的适当的碱或酸在这种盐不溶解的溶剂或介质中反应，或者在一种溶剂例如水中反应，然后在真空除去或通过冷冻干燥或者通过在一种适当的离子交换树脂上将存在的盐的离子用另一种盐的离子交换除去。

载体或赋形剂也可用于便于该化合物的施用。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖，例如，乳糖，葡萄糖，或蔗糖，或各种类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和生理相容性溶剂。该组合物或药物组合物可通过不同的途径施用，包括静脉内，腹膜内，皮下，和肌肉内，口服，局部，或跨粘膜施用。

所需要的等渗性可使用氯化纳或其它的药学上可接受的试剂例如葡聚糖，硼酸，酒石酸钠，丙二醇，多元醇(例如，甘露糖醇，山梨糖醇)，或其它的无机或有机溶质。优选氯化纳，特别是对于含有钠离子的缓冲液。

本发明的化合物可被配制成适用于各种施用形式，包括全身，外表或局部施用。这方面的技术和配方可见于Remingtong’s PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990。也见Wang，Y.J.和Hanson，M.A.“Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stabilityand Stabilizers，”Journal of Parenteral Science and Technology，TechnicalReport No.10，Supp.42：2S(1988)。医生可以确定对于每一个病人的最适的施用形式。

对于全身施用来说，优选注射，例如，肌肉内，静脉内，腹膜内，皮下，胸腔内，或脑室内。对于注射来说，本发明的化合物被配制成液体溶液，优选用生理相容性缓冲液，例如Hank氏溶液或Ringer氏溶液。或者，本发明的化合物被配制在一种或多种按照USP标准被认为安全的赋形剂中(例如丙二醇)。它们可以，例如，被悬浮在惰性油，适当的植物油例如芝麻油，花生油，橄榄油，或其它的可接受的载体中。优选它们被悬浮在水性载体中，例如在pH为约5.6至7.4的等渗缓冲液中。这些组合物可通过常规的灭菌技术灭菌，或者可无菌过滤。当需要接近生理条件时这些组合物可含有药学上可接受的辅助物质，例如，pH缓冲剂。可使用的缓冲剂包括例如，乙酸钠/乙酸缓冲剂。可使用一种贮存缓释制品，从而使治疗有效量的这种制品在跨皮肤注射或投送后的很多小时或很多天内被投送到血液中。此外，这种化合物可被配制成固体形式，在使用前迅速重新溶解或悬浮。也包括冷冻干燥形式。

全身施用也可通过跨粘膜或跨皮肤形式，或者这些分子可通过口服施用。对于跨粘膜或跨皮肤施用，在配方中使用适于穿透障碍的穿透剂。这种穿透剂是现有技术中已知的，包括例如，对于跨粘膜施用，胆汁盐，梭链孢酸衍生物。此外，可使用清洁剂促进穿透。跨粘膜施用可以是，例如，通过鼻喷雾或者使用栓剂。对于口服施用，这种分子被配制成常规的口服施用剂型，例如，胶囊，片剂，和液体制剂。对于外表施用，本发明的化合物被配制成膏剂，油膏，胶剂，或霜剂，这通常是现有技术已知的。

如果需要，可使用增稠剂例如甲基纤维素将上述组合物的溶液增稠。它们可被制备成乳化的形式，水包油式的或者油包水式的中。可以使用任何一种药学上可接受的乳化剂，包括，例如，阿拉伯树胶粉，非离子型表面活性剂(例如吐温)，或离子型表面活性剂(例如碱金属聚酯醇硫酸盐或磺酸盐，例如，Triton)。

在本发明中有用的组合物是通过将组分按照通常接受的方法制备的。例如，可将选择的组分在一种混合器中或其它的标准装置中简单混合，产生一种浓缩的混合物，然后通过加入水或增稠剂和可能的情况下一种缓冲剂来控制pH或其它的溶质来控制等渗性，将其调整至最终的浓度和粘度。

本发明的各种化合物的施用量可通过标准方式确定。通常，治疗有效量根据患者的年龄和体重以及与患者相关的疾病或紊乱，是在该分子的约1纳摩尔和3微摩尔之间。通常，这一量是在被治疗动物的约0.1和50mg/kg之间，优选1和20mg/kg之间。

对于医生的使用，这些组合物是以含有一定量的截短的VRP，VRP多肽，或VRP亚基的剂量单元形式提供的。基因治疗

截短的VRP或其遗传序列也可用于基因治疗(由Miller，自然，357：455-460(1992)综述)。Miller描述了人类基因治疗在实际应用中已取得进展，已显示出积极的最初效果。基因治疗的基础理论描述于Mulligan，科学，260：926-931(1993)。基因治疗的一个例子描述于实施例7，该实施例描述了使用腺病毒介导的基因治疗。

作为另一个例子，含有截短的VRP编码序列的表达载体可插入细胞中，该细胞被生长于体外，然后被大量注射或输入病人。在另一个例子中，含有选择的启动子(例如强启动子)的DNA片断被转入含有内源截短的VRP的细胞，该转入方式使该启动子片断提高该内源截短的VRP基因的表达(例如，该启动子片断以它直接与该内源性截短的VRP基因相连的方式被转入细胞)。

基因治疗可涉及包括编码截短的VRP亚基的核苷酸序列的腺病毒载体，或编码截短的VRP亚基的裸露核酸分子的使用。或者，可注射含有编码截短的VRP亚基的核酸分子的工程细胞。实施例7描述了使用腺病毒载体来提供血管形成治疗的基因治疗的方法。

衍生于诸如逆病毒，牛痘病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，几种RNA病毒，或牛乳头瘤病毒的病毒可被用于向靶细胞群中投送编码重组截短的VRP亚基的核苷酸序列(例如，cDNA)。可使用本领域普通技术人员公知的方法构建含有编码序列的重组病毒载体。参见，例如，描述于Maniatis等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，NY(1989)，和Ausubel等，现代生物学方法，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，NY(1989)中的技术。或者，编码蛋白质序列的重组核酸分子可以裸露的DNA或在重新构成的系统中例如脂质体或其它的用于向靶细胞中投送的脂系统中使用(参见，例如，Felgner，等，自然，337：387-8，1989)。在人类基因治疗中存在几种其它的用于直接向细胞中转送质粒DNA的方法，并涉及将DNA通过质粒DNA与蛋白质的复合靶击细胞上的受体。参见，Miller，自然，357：455-60，1992。

在其最简单的形式中，基因转移可通过将微量的DNA通过微注射注射进细胞的核中来进行。Capecchi MR，细胞，22：479-88(1980)。在重组基因被导入细胞后，它们可以被细胞正常的转录和转译机制识别，从而产生基因产物。也曾试图使用其它的将DNA导入大量细胞的方法。这些方法包括：转染，其中用磷酸钙沉淀DNA并通过胞饮导入细胞(Chen C和Okayama H，分子细胞生物学，7：2745-52(1987))；电穿孔，其中细胞被暴露于大的电压脉冲中，在膜上产生孔(Chu G等，核酸研究，15：1311-26(1987))；脂转染/脂质体融合，其中DNA被包装在亲脂性载体中并与一种靶细胞融合(Felgner PL，等，美国科学院院刊，84：7413-7(1987))；和使用结合在小的射弹上的DNA进行颗粒轰击(Yang NS，等，美国科学院院刊，87：9568-72(1990))。用于将DNA导入细胞的另外一种方法是将DNA与化学修饰的蛋白质进行偶连。

已经发现腺病毒蛋白质可使内体不稳定并促进细胞对DNA的摄入。将腺病毒混入含有DNA复合体的溶液中，或者使用蛋白质交联剂将DNA结合在与腺病毒共价连结的聚赖氨酸上，可极大地改善重组基因的摄入和表达。Curiel DT等，美国呼吸细胞分子生物学杂志，6：247-52(1992)。

此外，已经显示腺相关病毒载体可被用于向血管细胞中进行基因投送(Gnatenko，D，调查医学杂志，45：87-97，(1997))。

本文所用的术语“基因转移”是指向细胞中导入外源核酸分子的过程。基因转移通常是为了能够表达由基因编码的特定的产物而进行的。这种产物可包括蛋白质，多肽，反义DNA或RNA，或具有酶活性的RNA。基因转移可在培养的细胞中进行或者通过直接向动物施用来进行。通常基因转移涉及核酸分子通过非特异性相互作用或受体介导的相互作用与靶细胞接触，通过细胞膜或通过胞饮作用核酸分子被细胞摄入，和核酸分子从质膜或内体向胞质中的释放。此外，表达可需要核酸分子向细胞核中的移动以及与适当的核因子结合进行转录。

本文所用的术语“基因治疗”是一种形式的基因转移，并包括在本文使用的基因转移的定义之内，并特别的表示从体内或体外细胞中表达治疗产物的基因转移。基因转移可以在活体细胞上进行，然后移植给病人，或者直接将核酸分子或核酸蛋白质复合体施用给病人来进行。

在另一个优选的实施方案中，提供了一种具有编码截短的VRP的核酸分子的载体，其中，该核酸分子序列仅在特定的组织中表达。得到组织特异性基因表达的方法描述于国际申请WO93/09236，申请日：1992年11月3日，公开日：1993年5月13日。

在另一个优选的实施方案中，提供了一种基因替换的方法。本文所用的术语“基因替换”是指提供一种可在动物活体内表达的核酸分子序列，从而提供或提高动物体内缺失或缺陷的内源基因的功能。

在上文所述的全部载体中，本发明的另一个方面是在载体中含有的核酸序列可以在该核酸的一些或全部序列上含有增加，缺失或修饰。实施例

为便于理解本发明，下文的实施例描述了一系列的实验结果。涉及本发明的实验当然不应解释为特别限定本发明。在普通技术人员公知的范围内的对本发明的已知的或随后开发的这种变化落入本文描述的本发明和后附的权利要求的范围之内。实施例1N-末端截短的VEGF-B的克隆，(des-(1-20)-p21-VEGF-B(或者des(2-21)-VEGF-B)

为了制备缺乏前面的20个氨基酸的新型VEGF-B-相关蛋白质，以下面的方式构建一个cDNA构建体。

通过PCR从人类心脏或骨骼肌cDNA，或人类胚胎脑cDNA文库，或从其它的适当的人类组织cDNA制备物扩增编码人类VEGF-B的DNA，使用相应于公开的人类VEGF-B的序列的寡核苷酸。使用标准的分子生物学技术(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY)，然后产生一种DNA片段，在其5’端编码人类VEGF-B的信号序列，后接编码成熟的VEGF-B中的第一个氨基酸一一脯氨酸的密码子，然后是相应于人类VEGF-B的从残基22至C-末端的氨基酸的密码子，后面是终止密码子。在该DNA构建体的5’和3’端加上适当的额外的非编码核苷酸序列，以允许该DNA插入适当的表达载体中。

以这种方式，用于信号肽的切割位点被保留下来，其形式与天然VEGF-B中存在的相同。但是，这一策略在新的截短的VEGF-B的N-末端氨基酸产生一个变化。虽然在des(1-20)-VEGF-B中的正常的N-末端氨基酸是一个酪氨酸残基：

mspllrrlllvallqlartqa[PVSQFDGPSHQKKVVPWIDV]YTRAT，新的N-末端氨基酸是脯氨酸，得到的截短的VEGF-B相当于des(2-21)-VEGF-B)：

mspllrrlllvallqlartqaPTRAT…

截短的VEGF-B的不同与天然氨基酸的改变(在a)20个残基截短的情况下为酪氨酸)被认为对截短的VEGF-B的生物学活性没有任何影响。这一策略的优点是信号肽序列被保留，从而保证了在蛋白质加工/分泌过程中信号肽从前体的有效切割。

在另一个实施例中，截短的VEGF-B，des(1-15)-VEGF-B，通过将最初的15个氨基酸缺失来构建。在这种情况下信号肽切割位点将被保留，因为16号残基和1号残基(新的和旧的N-末端)相同(脯氨酸)：

mspllrrillvallqlartqa[PVSQFDGPSHQKKVV]PWIDVYTRAT…

                             ↓

mspllrrillvallqlartqaPWIDVYTRAT..

本领域的普通技术人员将会理解，本发明中也可使用其它的信号肽。例如，可使用VEGF-B或VEGF-C的信号肽，为了保留各自的信号肽切割位点，这将需要截短的蛋白质的第一个氨基酸分别为丙氨酸或甘氨酸。另外的选择是使用其它的已知的蛋白质的信号肽序列；它们中的一些可具有与截短的des(1-20)-VEGF-B的N-末端酪氨酸相容的切割位点。

另一个选择是产生一个编码一种前体蛋白质的构建体，其切割位点整合了来自原先的VEGF-B蛋白质序列的N-末端的两个，而不是一个，氨基酸。这一策略的目的是为了保证切割位点更完全地与信号肽酶功能相容。这将在截短的VEGF-B序列的N-末端导入两个新的氨基酸，但这样一个变化不被认为会改变截短的肽的生物学功能。

上文描述的产生用于des(1-20)-VEGF-B的表达的DNA的策略可用于以相似的方式产生具有其它的需要的长度的N-末端截短的VEGF-B突变体。而且，该策略可被用于产生在其它的VEGF-相关形式中和它们的其它种类的同种型中其它所需长度的N-末端截短物。实施例2：N-末端截短的VEGF-B亚基的表达

来自实施例1的编码截短的VEGF-B的DNA片段可被克隆进适当的质粒载体中。

用含有编码截短的VEGF-B的cDNA的杆状病毒转移载体pAcUW51和杆状病毒(Baculogold，Pharmingen，San Diego，CA)共转染Sf9(Sporoptera frugiperda)细胞。重组病毒的筛选和嗜菌斑纯化是按照已经建立的方法使用Blue agar overlays(Gibco BRL)进行的。使用0.05的感染复数在Sf9细胞的对数生长期产生出高滴度的重组病毒。为了表达截短的VEGF-B，将Sf9细胞(1×10⁶细胞/ml)生长在无血清培养基中，并以10的感染复数用重组病毒感染。在杆状病毒感染的昆虫细胞中对VEGF的表达可用于表达本发明的截短的VRP，描述于Fiebich等，(欧洲生物化学杂志，211：19-26，1993)。在这一系统中，VEGF可以高的产率产生，并具有有效的类似于在哺乳动物细胞中看到的糖基化。事实上，本领域的普通技术人员将会看到，在其它的系统中的表达，包括哺乳动物细胞表达系统，被认为属于本发明的范围。使用杆状病毒系统的用于表达本发明的截短的VRP的表达VEGF蛋白质的方法在描述VEGF表达的文献中也有所描述，例如，美国专利5521073，和O’Reilly等，(杆状病毒表达载体：实验室手册(WH Freeman，纽约)，1992)。

本领域普通技术人员将会看到，其它的表达系统也可被用于表达功能活性的截短的VRP。

功能活性的重组的VEGF同种型在大肠杆菌中(Wilting等，发育生物学，176，76-85，1996)从内涵体通过以前描述的用于PDGF同源和异源二聚体的方法(Schneppe等，基因，143，201-09，1994)已经得到表达，并在酵母中(Mohanraj等，生物化学生物物理学通讯，215：750-56，1995)也得到表达。

另外一些可用于表达本发明的VRP的表达VEGF的方法描述于，例如，Jasny，科学，238：1653，1987；和Miller等，In：基因工程，1986)，Setlow，JK，等编著，Plenum，第8卷，第277-297页)。实施例3：重组截短的VRP的纯化

为了从实施例2的昆虫细胞上清液中纯化杆状病毒表达的截短的VEGF-B，可使用一些标准技术。这些技术包括，但不限于，硫酸铵沉淀，酮沉淀，离子交换层析，大小排阻层析，疏水相互作用层析，反相HPLC，伴刀豆球蛋白A亲和层析，等电聚焦，和层析聚焦。其它的标准蛋白质纯化技术对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，具有特异性标签的蛋白质，例如组氨酸标签，抗原标签等，可通过将编码这种标签的DNA结合在VEGF-B DNA中，从而使以与蛋白质的生物活性相容的方式含有所说标签的蛋白质表达并通过特异于该标签的亲和层析纯化来制备。这种方法被认为属于本发明的范围。

用于截短形式的VEGF-B的优选的纯化方法描述于下：将Sf9细胞上清液在1000rpm离心30分钟，除去细胞碎片和病毒颗粒。然后将上清液浓缩并相对于20mM Tris(pH8.3)透析24小时。将透析过的上清液再离心，除去不溶性材料，加样到Sepharose Q阴离子交换柱上。通过使用NaCl(0-1 MNaCl)的梯度的梯度洗脱将蛋白质从柱中洗脱出来。将层析级分通过SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳和通过使用识别VEGF-B的抗体的ELISA进行分析。将与VEGF-B免疫反应的级分收集，浓缩，并相对于0.1％三氟乙酸透析过夜。将如此制备的材料通过反相HPLC进一步纯化。通常将约2-5mg的蛋白质加样到半制备性C4柱上并使用在0.1％三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱，如Esch等，酶学方法，103，72-89，1983所述。将含有截短的VEGF-B的级分收集，并贮存在摄氏-80度下直至下次使用。

碱性的并且可与肝素结合的N-末端截短形式的VEGF-相关的蛋白质亚基及其类似物的优选纯化方法包括将肝素-琼脂糖亲和层析和阳离子交换层析结合使用，可任选地在进行反相HPLC，这些技术基本上描述于Connolly等，生物化学杂志，264：20017-24，1989，Gospodarowicz等，美国科学院院刊，86：7311-15，1989，或者，Plouet等，胚胎学杂志，8：3801-06，1989)。

通过下述的一些技术跟踪VRP类材料的洗脱监控纯化，这些技术包括使用¹²⁵I-标记的VRP和由细胞或在功能性测试中制备的细胞膜组成的受体制备物的放射受体测试，如实施例4-6所述。

在其它的真核细胞系统例如酵母或哺乳动物细胞中表达的截短的VRP可以相同的方式纯化。

在原核细胞中表达的截短的VRP可能需要经过重新折叠步骤，以使亚基进行适当的二聚体化，如Schneppe等，基因143：201-09，1994所述。实施例4：受体结合测试

截短的VRP与VEGF受体的结合可通过各种不同的方式进行评估。可使用的方法包括确定VRP类似物与内皮细胞结合的能力，或者与用KDR人工转染的细胞的结合的能力，或者与可溶形式的KDR受体(例如，一种KDR/碱性磷酸酶融合蛋白质(Gitay-Goren等，生物化学杂志，271：5519-23(1996))结合的能力。一种优选的方法描述于Terman等，生物化学生物物理学通讯，187：1579-86，1992)。

在这一方法中，KDR cDNA通过DEAE-葡聚糖方法被转染进CMT-3猴肾细胞中，这是通过将铺板的细胞与含有1μg/ml DNA，0.5μg/mlDEAE葡聚糖，和100μM氯喹的EMEM温浴进行的。在摄氏37度温浴4小时之后，将培养基吸去，并将细胞暴露于PBS中的10％DMSO 1分钟。然后将细胞用含有10％小牛血清的DMEM洗涤一次，然后在摄氏37度在含有100μM ZnCl₂和1μM CdCl₂的DMEM/10％小牛血清中温浴40小时。

使用Iodogen方法或者氯胺T方法将VEGF-B进行放射碘化。使用在Sephadez G25柱或者一种肝素-琼脂糖柱上的凝胶过滤将放射性标记的VEGF-B从过量的游离碘-125中分离出来。放射性标记的¹²⁵I-VEGF-B类似物的比活性通常应在10⁵cpm/ng的数量级。对于放射性受体测试，CMT-3(10⁵细胞/孔)被铺板在12孔培养板上。24小时后，用PBS将细胞洗涤两次，并加入0.5ml含有0.15％明胶和25mM HEPES，pH 7.4的DMEM。然后加入浓度范围为1-500 pM的¹²⁵I-VEGF-B。在存在或不存在0.5nM没有标记的VEGF-B的条件下进行结合试验，以确定特异性结合。在室温下温浴90分钟后，来自每一个孔的50μl培养基样品被用于确定游离的放射性配体的浓度，并用含有0.1％ BSA的冰冷的PBS将孔洗涤3次。将细胞通过用100mM磷酸钠中的1％Triton X 100，pH8.0，温浴30分钟从孔中抽提出来，并将抽提物在一个伽马计数器中测定放射活性。实施例5：促细胞分裂测试

截短的VRP对人类或哺乳动物来源的内皮细胞的促细胞分裂活性可通过一些不同的方法来确定，包括其中细胞增殖是通过确定细胞数目的增长或通过确定放射活性的DNA前体的整合(胸腺嘧啶的整合)或其它的适当的标记的DNA前体(溴-脱氧尿苷)的整合的测试。通常用于确定细胞增殖的这些和其它方法，包括其中促细胞分裂活性是在体内评估的方法(例如通过确定内皮细胞的有丝分裂指数)被认为属于本发明的范围。下文描述了一种优选的方法(Bohlen等，美国科学院院刊，81：5364-68，1994)：将小牛大动脉弓内皮细胞，该细胞在Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基的存在下被保留在贮存培养物中，该培养基中添加了10％小牛血清和抗生素(庆大霉素50μg/ml和两性霉素(fungizine)0.25μg/ml)和碱性成纤维生长因子(1-10mg/ml，每48小时加入一次)，以1∶64的分离比率每周传代一次。对于促细胞分裂测试，将贮存培养板上的细胞单层(传代3-10次)用胰酶游离。然后将细胞以约8000细胞/孔的密度在如上所述的DMEM和抗生素的存在下接种在24孔培养板上。在细胞铺板后6小时加入测试样品(1-10μl)，适当地在DMEM/0.1％小牛血清白蛋白)中稀释，48小时后再加入一次。培养4天之后，用胰酶将内皮细胞从培养板分离，并使用Coulter颗粒计数器计数。

另一个促细胞分裂活性测试描述于Olofsson，B等，美国科学院院刊，93：2576-81，1996)。将两次传代的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)在M-199培养基中铺板在96孔培养板上(4×10³细胞/孔)，该培养基添加了10％(体积/体积)小牛血清，并温浴24小时。将含有在1-10μg/ml肝素存在下截短的VRP或纯净的VRP的细胞培养条件培养基加入HUVEC中，并将细胞刺激48小时。将含有[³H]胸苷(Amersham；10μCi/ml)的新鲜的细胞培养条件培养基加入这些细胞中，并再刺激48小时。用PBS洗涤细胞，并用胰酶处理，通过液体闪烁计数器确定整合进的放射活性。将截短的VRP的活性与非截短的VRP的活性进行比较。

在另一个可供选择的方法中，将小牛毛细血管内皮细胞(BCE)接种在24孔培养板上，并在添加了10％小牛血清的最低必需培养基(MEM)中生长至汇合。将细胞在添加了3％小牛血清的MEM中饥饿72小时，之后，将在无血清培养基中稀释的条件培养基加入细胞中，并将细胞刺激24小时。再刺激的最后4小时中加入[³H]胸苷(1μ Ci/ml)。用PBS洗涤细胞，并用氢氧化钠裂解，通过液体闪烁计数测定整合进的放射性。将截短的VRP的活性与非截短的VRP的活性进行比较。可使用小牛成纤维细胞生长因子(b-FGF)作为促细胞分裂活性的另外一个对照，也可被用于测定截短的VRP活性的促进活性。实施例6：截短的VRP的血管形成活性

可使用一些不同的体内方法测定物质的血管形成活性。通常使用的方法包括鸡绒毛尿囊膜测试，在兔，大鼠，或小鼠中的角膜囊测试，小鼠中的matrigel移植测试，兔耳腔血管形成测试，仓鼠颊囊测试，Hunt-Schilling腔模型和大鼠海绵移植模型。其它的评估新的血管形成的测试方法在文献中已有描述，并被认为属于本发明的范围。

显示截短的VRP的血管形成活性的优选的方法是兔角膜囊测试。在这一测试中，含有约1-1000ng生长因子和恒量的作为载体的兔血清白蛋白的Elvax(乙烯乙酸乙烯酯)聚合物团粒植入角膜中的外科切口，如Phillips和Knighton，Wound Rep.Reg.3，533-539，1995；Gimbrone等，J.Natl.Canc.Inst.52：413-27，1974；Risau，美国科学院院刊，83：3855-59，1986)中的详细描述。然后在两周的期间内观察生长因子诱导的角膜血管形成。使用角膜的照片的形态测量和图像分析技术可进行半定量分析。实施例7：使用截短的VRP进行基因转移介导的血管形成治疗

使用截短的VRP进行基因转移介导的血管形成治疗，如PCT/US96/02613，公开日为1996年9月6日，公开号为WO96/26742所述，其全部内容引入本文作为参考。腺病毒构建体

一种辅助独立复制缺陷型人腺病毒5系统可被用于基因转移。编码截短的VRP亚基的核酸分子可被克隆进质粒ACCMVPLPA的多克隆位点，它含有由缺失了E1A和E1B基因(对于病毒复制来说是必需的)的部分腺病毒序列侧接的CMV启动子和SV40聚酰苷酸化信号。将该质粒与质粒JM17共转移(脂转染)进293细胞，该JM17含有完全的人类腺病毒5基因组和额外的4.3 kb的插入物，使pJM17太大而不能被包装。同源拯救重组产生了在缺失E1A/E1B序列的情况下含有转基因的腺病毒载体。虽然这些重组体在哺乳动物中是不能复制的，它们可在用E1A/E1B转化并反式提供这些必需的基因产物的293细胞中繁殖。监测被转染细胞细胞病理效应的证据，这通常在转染后10-14天出现。为识别成功的重组体，将显示细胞病理效应的培养板上的细胞上清液用蛋白酶K(50mg/ml，用0.5％十二烷基硫酸钠和20mM EDTA)在56℃处理60分钟，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。然后使用与CMV启动子和SV40聚腺苷酸序列互补的引物(生物技术，15：868-72，1993)扩增出截短的VRP亚基核酸插入物和使用被设计成共同扩增出腺病毒的引物(生物技术，15：868-72，1993)的PCR识别出成功的重组体。然后将成功的重组体进行两次斑纯化。将病毒贮存物在293细胞中繁殖至10¹⁰至10¹²病毒颗粒的滴度，并在使用前通过双CsCl梯度离心进行纯化。用于产生重组腺病毒的系统使包装限度为5kb转基因插入物。由CMV启动子驱动并具有SV40聚腺苷酸序列的截短的VRP基因是在包装限度之内。通过标准方法将重组载体进行斑纯化。将得到的病毒载体在293细胞上繁殖，至滴度为10¹⁰至10¹²病毒颗粒。在80％汇合时感染细胞，并在36-48小时收获。在冰冻-化冻循环后，通过标准的离心使细胞碎片团聚，并通过双CsCl梯度超离心将病毒进一步纯化(不连续1.33/1.45CsCl梯度；在5mM Tris，1mM EDTA(pH 7.8)；90000xg(2小时)，105000xg(18小时)制备铯)。在体内注射前，通过琼脂糖柱例如G25 Sephadex的凝胶过滤将病毒贮存物脱盐。得到的病毒贮存物具有的最终病毒滴度为约10¹⁰至10¹²病毒颗粒。这样，该腺病毒构建体被高度纯化，没有野生型(具有强的复制能力)病毒。用于血管形成的猪局部缺血模型

对家养猪在无菌条件下进行左胸廓切开术，用于器械操作。(Hammond，等，临床调查杂志，92：2644-52(1993)；Roth，等，临床调查杂志，91：939-49，1993)。将导管置入左心房和大动脉，提供一种测量区域血流的方式，并监测血压。将电线缝入左心房，以允许ECG记录和心房起搏。最后，将一个酪蛋白树脂缩窄器，一个包括酪蛋白树脂物质的金属环，置于左卷曲状冠状动脉(LCx)近端周围(Hammond等，临床医学调查杂志，92：2644-52(1993))。在达到稳定程度的局部缺血之后，治疗组接受一种腺病毒构建体，它包括一种由CMV启动子驱动的截短的VRP基因。对照动物接受用包括CMV启动子驱动的报道基因，lacZ，的腺病毒构建体进行的基因转移。

在酪蛋白树脂置入35+3天之后开始研究，这时旁系血管发育和起搏诱导的功能异常处于稳定状态(Roth，等，美国生理学杂志，253：1-11279-1288，1987，和Roth等，循环，82：1778-89)。将清醒的动物用吊索悬起，从左心室(LV)，左心房(LA)和大动脉，和心电图用数字式联网记录器记录(在休息时，和在心房起博为200 bpm时)。使用HewlettPackard超声成像系统得到两维和M-态影像。图像是从右胸骨旁方式在中乳突肌肉水平得到的，并被记录在VHS磁带上。图像是在动物处于基本状态和在右心起博(HR＝200 bpm)时记录的。这些研究是在基因转移前的1天进行的，并在14+1天之后重复进行。心律-血压积和左心室压力应在基因转移前后的两组中相似，表明相似的心肌氧需求和负荷条件。回波心电图测量是使用标准方法进行的(Sahn等，循环，58：1072，1978)。末端心脏舒张壁厚度(EDWTh)和末端心脏收缩壁厚度(ESWTh)是从5个连续的起博测量的并取平均值。壁厚度百分值(％WTH)用[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100计算的。在进行数据分析时不能知晓动物接受的是哪一种基因。为了显示回波心电图测量的可重复性，动物应在两个连续的日子进行摄影，显示出高的相关性(r²＝0.90；p＝0.005)。

在酪蛋白树脂置入后35±3天，在酪蛋白树脂完全闭合后，但在基因转移前，使用对照材料(Levovist)进行对照回波心电图研究，该对照材料是在心室起博(200bpm)期间注射进左心室的。在基因转移后14±1天后重复研究。使用基于计算机的影像分析程序(Color Vue II，NovaMicrosonics，Indianapolis，Indiana)从录像中测量峰对照强度，这提供了一个客观的图像强度测量值。对比研究的分析是在不知晓动物接受的是哪一种基因的情况下进行的。

在研究完成时，将动物麻醉，进行中线胸廓切开术。分离出短头颅动脉，插入导管，并将其它的主要的血管连接。对动物静脉内注射肝素(10000 IU)和罂粟碱(60mg)。给予氯化钾，诱导心舒张休止，并将大动脉横夹。通过短头颅动脉套管(120mmHg压力)输送盐水，以此灌注冠状动脉。灌注(120mmHg压力)戊二醛溶液(6.25％，0.1M卡可酸盐缓冲液)直至心脏被完全固定(10-15分钟)。然后移去心脏，使用通过左动脉降(LAD)，左卷曲(LCx)，和右冠状动脉注入的颜色-编码颜料识别床基。检查酪蛋白树脂确认关闭。从正常灌注的和局部缺血区域取出的样品被分成三份，并将心内和心外的三份进行塑料支撑。如前所述进行显微镜分析和毛细血管数目计数(Mathieu-Costello，等，美国生理学杂志，359：H204，1990)。从每一个亚样品(每一个区域的内心和外心)切取四个1μm厚的横切切片，并在400倍放大率下按照纤维数目率使用点计数确定毛细血管的数目。对每个亚样品计数20至25个高倍放大视野。在每一个区域内，毛细血管数目与纤维数目的比率在内心和外心中是相似的，因而，每个区域的40-50个视野应进行平均，从而提供跨粘膜毛细血管对纤维数目的比率。

为了表明改善的区域功能和血流量产生于转基因表达，可使用PCR和RT-PCR检测来自接受了截短的VRP基因转移的动物的心肌中转基因截短的VRP DNA和mRNA。使用对CMV启动子[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC][SEQ ID NO：41]的有义引物；和对内部截短的VRP亚基序列的反义引物的PCR扩增期望的500bp的片断。使用对截短的VRP亚基序列的起始处的有义引物，和对内部截短的VRP序列的反义引物的RP-PCR扩增期望的400bp的片断。

最后，使用特异于VRP的多克隆抗体，在来自接受了用截短的VRP基因的基因转移的动物的细胞和心肌基因转移后48小时以及14±1天后可显示截短的VRP的表达。

辅助独立复制缺陷型人腺病毒5系统被用于制备含有转基因的载体。被注射进体内的这种材料应为高度纯化的，不含有野生型(具有复制能力)腺病毒。因而，极大地减小了心脏中腺病毒感染和炎症浸润的可能性。通过将该材料通过冠状动脉导管直接注射进冠状动脉腔中，可能使这种基因更有效的指向靶位点。当以这种方式进行投送时，在肝细胞中不会有转基因表达，并且在冠状动脉注射后的任何时间不会在尿中发现病毒RNA。

构建体的注射(4.0ml，含有10¹¹个腺病毒颗粒)是通过将2.0ml注射进左和右冠状动脉进行的(通向LCx的旁系血流好像来自该两个血管)。将动物麻醉，通过将右颈动脉切割得到动脉通道；然后置入一个5FCordis套管。使用一个5F多用途冠状动脉导管与冠状动脉配合。通过比较对主冠状动脉的注射确认LCx酪蛋白树脂的闭合。然后将导管尖置于动脉腔中1厘米，从而在对近端大动脉注射时损失最少的材料。对每一个猪进行这一操作。

在基因转移进行之后，使用三种方法来建立基因的成功的整合和表达。(1)一些构建体可含有一种报告基因(lacZ)；(2)对相关基床的心肌进行取样，并进行免疫印迹测试，对存在的截短的VRP进行定量，和(3)使用PCR检测截短的VRP mRNA和DNA。得到的区域收缩功能数据应当显示，对照猪在以前和在基因转移后14±1天在局部缺血区域中的心搏诱导的功能异常具有相似的程度。相比之下，接受截短的基因转移的猪在心搏期间在局部缺血区域应显示壁厚度的增加，表明本发明的截短的VRP亚基基因转移与心搏期间在局部缺血区域中收缩的改善相关。在正常灌注区域(室间隔隔膜)壁的增厚在心搏期间应为正常。通过胸廓回波心电图测得的功能降低的百分率与室搏期间在同一个模型中通过声显微测量得到的降低的百分率相似(Hammond，等，临床调查杂志，92：2644，1993)，记录了回波心电图用于评估局部缺血功能异常的精确性。

                              序列表(1)总信息：

(i)申请人：Collateral Therapeutics

(ii)发明名称：截短的VEGF相关蛋白质

(iii)序列数目：41

(iv)通信地址：

    (A)收信人：Lyon & Lyon

    (B)街道：633 West Fifth Street

    (C)城市：Los Angeles

    (D)州：California

    (E)国家：USA

    (F)邮编：90071-2066

(V)计算机可读形式

    (A)介质类型：3.5”软盘，1.44Mb

    (B)计算机：IBM兼容

    (C)操作系统IBM PC-DOS 5.0

    (D)软件：FastSEQ for Windows 2.0

(Vi)目前申请资料：

    (A)申请号：08/842,984

    (B)申请日：1997年4月25日

    (C)分类：

(Vi)在先申请资料：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

(viii)律师/代理人信息：

    (A)姓名：Warburg，Richard J.

    (B)登记号：32327

    (C)案号：221/062

(ix)通讯号码：

    (A)电话：(213)489-1600

    (B)传真：(213)955-0440

    (C)电传：67-3510(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：188氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln

        20                  25                  30Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val

50                  55                  60Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

    115                 120                 125Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro

130                 135                 140Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145                 150                 155                 160Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu

            165                 170                 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

        180                 185(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：206氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln

        20                  25                  30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

    35                  40                  45Pro Arg Giu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

50                  55                  60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

    115                 120                 125Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

130                 135                 140Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser145                 150                 155                 160Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His

            165                 170                 175Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala

        180                 185                 190Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

    195                 200                 205(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：419氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe

        20                  25                  30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala

    35                  40                  45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser

50                  55                  60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65                  70                  75                  80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln

            85                  90                  95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala

        100                 105                 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys

    115                 120                 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe

130                 135                 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145                 150                 155                 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

            165                 170                 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu

        180                 185                 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

    195                 200                 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

210                 215                 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225                 230                 235                 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

            245                 250                 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

        260                 265                 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

    275                 280                 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

290                 295                 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305                 310                 315                 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

            325                 330                 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

        340                 345                 350Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

    355                 360                 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

370                 375                 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385                 390                 395                 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

            405                 410                 415Gln Met Ser(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：170氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly1               5                  10                  15Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly

        20                  25                  30Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly

    35                  40                  45Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50                  55                  60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65                  70                  75                  80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

            85                  90                  95Thr Glu Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

        100                 105                 110Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Lys Cys

    115                 120                 125Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro

130                 135                 140Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys145                 150                 155                 160His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg

            165                 170(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：221氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Arg Arg Cys Arg Ile Ser Gly Arg Pro Pro Ala Pro Pro Gly Val1               5                  10                  15Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg

        20                  25                  30Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro

    35                  40                  45Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

50                  55                  60Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys65                  70                  75                  80Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

            85                  90                  95Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu

        100                 105                 110Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

    115                 120                 125Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

130                 135                 140Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser145                 150                 155                 160Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro

            165                 170                 175Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys

        180                 185                 190Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu

    195                 200                 205Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

210                 215                 220(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：133氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Lys Leu Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr1               5                  10                  15Leu Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys

        20                  25                  30Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr

    35                  40                  45His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

50                  55                  60Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro65                  70                  75                  80Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

            85                  90                  95Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys

        100                 105                 110Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

    115                 120                 125Pro Arg Arg Arg Arg

130(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：148氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Gln Val Val Val Ala Leu Leu Ile Cys1               5                  10                  15Met Tyr Asn Leu Pro Glu Cys Val Ser Gln Ser Asn Asp Ser Pro Pro

        20                  25                  30Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro

    35                  40                  45Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

50                  55                  60Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys65                  70                  75                  80Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

            85                  90                  95Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn

        100                 105                 110Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

    115                 120                 125Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

130                   135                   140Glu Pro Arg Arg145(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：160氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Pro Ser His Gln Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg1               5                  10                  15Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu

        20                  25                  30Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

    35                  40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50                  55                  60Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser65                  70                  75                  80Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

            85                  90                  95Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile

        100                 105                 110Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr

    115                 120                 125Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg

130                 135                 140Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys145                 150                 155                 160(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：155氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro1               5                  10                  15Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val

        20                  25                  30Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

    35                  40                  45Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50                  55                  60Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu65                  70                  75                  80Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

            85                  90                  95Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys

        100                 105                 110Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys

    115                 120                 125Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn

130                 135                 140Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys145                 150                 155(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：152氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Pro Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val1               5                  10                  15Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu

        20                  25                  30Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp

    35                  40                  45Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln

50                  55                  60Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu65                  70                  75                  80Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala

            85                  90                  95Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg

        100                 105                 110Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg

    115                 120                 125Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr

130                 135                 140Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys145                 150(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：150氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val1               5                  10                  15Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro

        20                  25                  30Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

    35                  40                  45Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50                  55                  60Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu65                  70                  75                  80His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys

            85                  90                  95Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln

        100                 105                 110Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe

    115                 120                 125Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg

130                 135                 140Cys Arg Lys Pro Arg Lys145                 150(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：147氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser1               5                  10                  15Met Glu Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val

        20                  25                  30Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys

    35                  40                  45Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln

50                  55                  60Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln65                  70                  75                  80Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser

            85                  90                  95Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp

        100                 105                 110Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys

    115                 120                 125Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys

130                 135                 140Pro Arg Lys145(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：145氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu1               5                  10                  15Leu Met Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

        20                  25                  30Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

    35                  40                  45Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro

50                  55                  60Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu65                  70                  75                  80Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg

            85                  90                  95Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg

        100                 105                 110Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly

    115                 120                 125Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg

130                 135                 140Lys145(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：178氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg1               5                  10                  15Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu

        20                  25                  30Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

    35                  40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50                  55                  60Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser65                  70                  75                  80Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

            85                  90                  95Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro

        100                 105                 110His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro

    115                 120                 125Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly

130                 135                 140Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly145                 150                 155                 160Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly

            165                 170                 175Gly Ala(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：173氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro1               5                  10                  15Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

        20                  25                  30Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

    35                  40                  45Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50                  55                  60Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu65                  70                  75                  80Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp

            85                  90                  95Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln

        100                 105                 110Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro

    115                 120                 125Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala

130                 135                 140Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala145                 150                 155                 160Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

            165                 170(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：168氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val1               5                  10                  15Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro

        20                  25                  30Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

    35                  40                  45Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50                  55                  60Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu65                  70                  75                  80His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro

            85                  90                  95Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro

        100                 105                 110Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His

    115                 120                 125Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr

130                 135                 140Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala145                 150                 155                 160Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

            165(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：163氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu1               5                      10              15Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

        20                      25              30Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

    35                      40              45Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro

50                      55              60Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu65                      70              75                  80Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr

                85              90                  95Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala

            100             105                 110Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro

    115                 120                 125Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro

130                 135                 140Gly Pro Aia Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys145                 150                 155                 160Gly Gly Ala(2)SEQ ID NO：18的信息：

 (i)序列特征

    (A)长度：194氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg1               5                  10                  15Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu

        20                  25                  30Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln

    35                  40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr

50                  55                  60Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser65                  70                  75                  80Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys

            85                  90                  95Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr

        100                 105                 110Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala

    115                 120                 125Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro

130                 135                 140Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro145                 150                 155                 160Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln

            165                 170                 175Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu

        180                 185                 190Arg Arg(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：189氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro1               5                  10                  15Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala

        20                  25                  30Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys

    35                  40                  45Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val

50                  55                  60Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu65                  70                  75                  80Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys

            85                  90                  95Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro

        100                 105                 110Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser

    115                 120                 125Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro

130                 135                 140Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys145                 150                 155                 160Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu

            165                 170                 175Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

        180                 185(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：184氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val1               5                  10                  15Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro

        20                  25                  30Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly

    35                  40                  45Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu

50                  55                  60Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu65                  70                  75                  80His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys

            85                  90                  95Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val

        100                 105                 110Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr

    115                 120                 125Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His

130                 135                 140His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg145                 150                 155                 160Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr

            165                 170                 175Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

        180(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：179氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu1               5                  10                  15Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val

        20                  25                  30Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro

    35                  40                  45Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro

50                  55                  60Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu65                  70                  75                  80Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Gln Asp Arg Ala Ala

            85                  90                  95Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser

        100                 105                 110Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ser His Ser Ser

    115                 120                 125Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln His His Gln Cys Pro Asp

130                 135                 140Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys145                 150                 155                 160Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys

            165                 170                 175Leu Arg Arg(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：307氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys1               5                  10                  15Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe

        20                  25                  30Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr

    35                  40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

50                  55                  60Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu65                  70                  75                  80Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

            85                  90                  95Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

        100                 105                 110Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn

    115                 120                 125Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

130                 135                 140Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser145                 150                 155                 160Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

            165                 170                 175Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

        180                 185                 190Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys

    195                 200                 205Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

210                 215                 220Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro225                 230                 235                 240Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

            245                 250                 255Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

        260                 265                 270Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser

    275                 280                 285Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

290                 295                 300Gln Met Ser305(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：302氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro1               5                  10                  15Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn

        20                  25                  30Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys

    35                  40                  45Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu

50                  55                  60Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys65                  70                  75                  80Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser

            85                  90                  95Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser Leu

        100                 105                 110Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro Thr

    115                 120                 125Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu Asp

130                 135                 140Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe His145                 150                 155                 160Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln Cys

            165                 170                 175Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys Glu

        180                 185                 190Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe Pro

    195                 200                 205Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys

210                 215                 220Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly Lys225                 230                 235                 240Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys Gly

            245                 250                 255Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys Thr

        260                 265                 270Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu Val

    275                 280                 285Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser

290                 295                 300(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：297氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile1               5                  10                  15Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro

        20                  25                  30Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly

    35                  40                  45Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe

50                  55                  60Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser65                  70                  75                  80Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr

            85                  90                  95Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro

        100                 105                 110Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn

    115                 120                 125Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser

130                 135                 140Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro145                 150                 155                 160Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly

            165                 170                 175Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser

        180                 185                 190Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala

    195                 200                 205Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr

210                 215                 220Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys225                 230                 235                 240Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His

            245                 250                 255Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala

        260                 265                 270Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro

    275                 280                 285Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser

290                 295(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：292氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu1               5                  10                  15Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val

        20                  25                  30Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn

    35                  40                  45Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro

50                  55                  60Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr65                  70                  75                  80Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser

            85                  90                  95Ile Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala

        100                 105                 110Asn Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg

    115                 120                 125Cys Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp

130                 135                 140Ser Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp145                 150                 155                 160Glu Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser

            165                 170                 175Cys Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys

        180                 185                 190Lys Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp

    195                 200                 205Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln

210                 215                 220Pro Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln225                 230                 235                 240Lys Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys

            245                 250                 255Tyr Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe

        260                 265                 270Ser Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg

    275                 280                 285Pro Gln Met Ser

290(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：116氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys Gly1               5                  10                  15Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr His

        20                  25                  30Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met

     35                 40                  45Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr

50                  55                  60Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly65                  70                  75                  80Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp

            85                  90                  95Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro

        100                 105                 110Arg Arg Arg Arg

    115(2)SEQ ID NO：27的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：11 1氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys Gly Ser Glu Cys Lys Pro1               5                  10                  15Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr His Pro Glu Leu Thr Ser

        20                  25                  30Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys

    35                  40                  45Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Val Asn Val

50                  55                  60Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Asn Gly Met Gln65                  70                  75                  80Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp Cys Arg Pro Arg Phe

            85                  90                  95Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg

        100                 105                 110(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：106氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Ser Glu Val Leu Lys Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val1               5                  10                  15Pro Val Ser Glu Thr His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro

        20                  25                  30Pro Cys Val Thr Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser

    35                  40                  45Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu

50                  55                  60Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val65                  70                  75                  80Glu His Lys Lys Cys Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro

            85                  90                  95Thr Thr Thr Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg

        100                 105(2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：101氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr1               5                  10                  15His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

        20                  25                  30Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro

    35                  40                  45Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

50                  55                  60Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys65                  70                  75                  80Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

            85                  90                  95Pro Arg Arg Arg Arg

        100(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：121氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Asn Asp Ser Pro Pro Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys1               5                  10                  15Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr

        20                  25                  30Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys

    35                  40                  45Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val

50                  55                  60Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser65                  70                  75                  80Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser

            85                  90                  95Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr

        100                 105                 110Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

    115                 120(2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：116氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro1               5                  10                  15Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

        20                  25                  30Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys

    35                  40                  45Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

50                  55                  60Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn65                  70                  75                  80Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

            85                  90                  95Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

        100                 105                 110Glu Pro Arg Arg

    115(2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：111氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val1               5                  10                  15Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro

        20                  25                  30Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly

    35                  40                  45Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser

50                  55                  60Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr65                  70                  75                  80Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile

            85                  90                  95Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

        100                 105                 110(2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：106氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Lys Ser Gly Cys Lys Pro Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu1               5                  10                  15Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val

        20                  25                  30Lys Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala

    35                  40                  45Val Glu Thr Arg Asn Thr Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser

50                  55                   60Ser Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile65                  70                  75                  80Ser Val Thr Glu His Thr Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr

            85                  90                  95Thr Pro Thr Thr Thr Arg Glu Pro Arg Arg

        100                 105(2)SEQ ID NO：34的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：167氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln Lys Lys Val Val Pro1               5                  10                  15Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

        20                  25                  30Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Mer Gly Asn Val Val Lys Gln Leu Val

    35                  40                  45Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50                  55                  60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile65                  70                  75                  80Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

            85                  90                  95Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val

        100                 105                 110Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg

    115                 120                 125Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg

130                 135                 140Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys145                 150                 155                 160Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys

            165(2)SEQ ID NO：35的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：185氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser1               5                  10                  15Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

        20                  25                  30Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val

    35                  40                  45Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50                  55                  60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile65                  70                  75                  80Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

            85                  90                  95Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys

        100                 105                 110Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val

    115                 120                 125Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr

130                 135                 140His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr145                 150                 155                 160Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala

            165                 170                 175Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

        180                 185(2)SEQ ID NO：36的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：201氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Serl               5                  10                  15Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val

        20                  25                  30Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val

    35                  40                  45Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp

50                  55                  60Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile65                  70                  75                  80Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu

            85                  90                  95Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val

        100                 105                 110Lys Gln Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser

    115                120                  125Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ile

130                 135                 140Thr Gln Ser His Ser Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg Cys Thr Gln145                 150                 155                 160His His Gln Cys Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg

            165                 170                 175Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp

        180                 185                 190Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

    195                 200(2)SEQ ID NO：37的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：399氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ser Gly Leu1               5                  10                  15Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala Thr Ala Tyr Ala

        20                  25                  30Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser Ser Val Asp Glu

    35                  40                  45Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys Cys Gln

50              55                      60Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn Leu Asn65                  70                  75                  80Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr

            85                  90                  95Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met

        100                 105                 110Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr

    115                 120                 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly

130                 135                 140Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145                 150                 155                 160Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro

            165                 170                 175Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met

        180                 185                 190Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg Ser

    195                 200                 205Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn Lys Thr Cys Pro

210                 215                 220Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys Leu Ala Gln Glu225                 230                 235                 240Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser Thr Asp Gly Phe

            245                 250                 255His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Glu Thr Cys Gln

        260                 265                 270Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys Gly Pro His Lys

    275                 280                 285Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys Asn Lys Leu Phe

290                 295                 300Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu Asn Thr Cys Gln305                 310                 315                 320Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro Leu Asn Pro Gly

            325                 330                 335Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys Cys Leu Leu Lys

        340                 345                 350Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr Arg Arg Pro Cys

    355                 360                 365Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Glu

370                 375                 380Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro Gln Met Ser385                 390                 395(2)SEQ ID NO：38的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：133氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Met Lys Leu Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr1               5                  10                  15Leu Leu Asn Ala Asp Ser Asn Thr Lys Gly Trp Ser Glu Val Leu Lys

        20                  25                  30Gly Ser Glu Cys Lys Pro Arg Pro Ile Val Val Pro Val Ser Glu Thr

    35                  40                  45His Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu

50                  55                  60Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro65                  70                  75                  80Thr Glu Glu Val Asn Val Thr Met Glu Leu Leu Gly Ala Ser Gly Ser

            85                  90                  95Gly Ser Asn Gly Met Gln Arg Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys

        100                 105                 110Asp Cys Arg Pro Arg Phe Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro

    115                 120                 125Pro Arg Arg Arg Arg

130(2)SEQ ID NO：39的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：148氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：Met Lys Leu Thr Ala Thr Leu Gln Val Val Val Ala Leu Leu Ile Cys1               5                  10                  15Met Tyr Asn Leu Pro Glu Cys Val Ser Gln Ser Asn Asp Ser Pro Pro

        20                  25                  30Ser Thr Asn Asp Trp Met Arg Thr Leu Asp Lys Ser Gly Cys Lys Pro

    35                  40                  45Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Glu Ser Thr Asn

50                  55                  60Leu Gln Tyr Asn Pro Arg Cys Val Thr Val Lys Arg Cys Ser Gly Cys65                  70                  75                  80Cys Asn Gly Asp Gly Gln Ile Cys Thr Ala Val Glu Thr Arg Asn Thr

            85                  90                  95Thr Val Thr Val Ser Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asn

        100                 105                 110Ser Gly Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Ile Ser Val Thr Glu His Thr

    115                 120                 125Lys Cys Asp Cys Ile Gly Arg Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Arg

130                 135                 140Glu Pro Arg Arg145(2)SEQ ID NO：40的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：26氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1               5                  10                  15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala

        20                  25(2)SEQ ID NO：41的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：                          20GCAGAGCTCG  TTTAGTGAAC

Claims (67)

1.一种截短的VRP亚基，它在所说的亚基的核心序列的第一个半胱氨酸的N-末端方向具有至少一个氨基酸残基的缺失。

2.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中该VRP是人类VRP。

3.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的VRP选自VEGF-B，VRF-2，VEGF-C，PlGF，VEGF-3，痘病毒ORF-1，和痘病毒ORF-2。

4.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的VRP是VEGF-B。

5.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的VRP亚基含有图2的氨基酸序列。

6.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的亚基的核心序列的第一半胱氨酸的N-端方向上的氨基酸残基被缺失。

7.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的核心序列N-端方向上的氨基酸序列含有2至5个氨基酸残基。

8.按照权利要求7所述的截短的VRP亚基，其中所说的2至5个氨基酸残基含有紧接所说的VRP亚基的核心序列的第一半胱氨酸N-端的2至5个连续的氨基酸残基。

9.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的核心序列N-端的氨基酸序列含有6至10个氨基酸残基。

10.按照权利要求9所述的截短的VRP亚基，其中所说的6至10个氨基酸残基含有紧接所说的VRP亚基的核心序列的第一半胱氨酸N-端的6至10个连续的氨基酸残基。

11.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，其中所说的核心序列N-端的氨基酸序列含有11至20个氨基酸残基。

12.按照权利要求11所述的截短的VRP亚基，其中所说的11至20个氨基酸残基含有紧接所说的VRP亚基的核心序列的第一半胱氨酸N-端的11至20个连续的氨基酸残基。

13.按照权利要求1所述的截短的VRP亚基，在所说的截短的VRP亚基的N-末端还含有成熟的非截短的VRP亚基的最初的一个或两个氨基酸残基。

14.一种含有两个权利要求13的VRP亚基的截短的VRP。

15.一种截短的VRP，它含有两个权利要求1的VRP亚基，其中所说的两个VRP亚基具有相同的氨基酸序列。

16.一种截短的VRP异源二聚体，含有：

一种第一亚基，它含有权利要求1的截短的VRP亚基；和

一种第二亚基，它含有一种选自VRP亚基，和权利要求1的截短的VRP亚基的亚基，其中，所说的第二亚基具有与所说的第一亚基不同的氨基酸序列。

17.一种编码权利要求1的截短的VRP亚基的核苷酸分子。

18.按照权利要求17所述的核酸分子，其中这种核苷酸分子是一种DNA分子。

19.按照权利要求17所述的核酸分子，其中这种核苷酸分子是一种RNA分子。

20.一种重组DNA载体，它含有权利要求17的核酸分子。

21.一种重组DNA表达载体，它含有权利要求17的核酸分子。

22.按照权利要求21所述的重组DNA表达载体，其中，所说的核酸分子在所说的核酸分子的5’端与编码一种信号肽的DNA序列可操纵连接。

23.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的信号肽选自VEGF信号肽，VEGF-B信号肽，VRF-2信号肽，VEGF-C信号肽，VEGF-3信号肽，和PlGF信号肽。

24.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的信号肽选自痘病毒ORF-1信号肽，和痘病毒ORF-2信号肽。

25.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的信号肽是VEGF-B信号肽。

26.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的编码所说的信号肽的DNA序列在所说的DNA序列的3’端与编码成熟的非-截短的VRP亚基的第一个氨基酸残基的DNA可操纵连接，并且其中编码所说的残基的所说的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP亚基的核酸分子可操纵连接。

27.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的编码所说的信号肽的DNA序列在所说的DNA序列的3’端与编码成熟的非-截短的VRP亚基的前两个氨基酸残基的DNA可操纵连接，并且其中编码所说的两个残基的所说的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP亚基的所说的核酸分子可操纵连接。

28.按照权利要求22所述的重组DNA表达载体，其中，所说的核酸分子与控制序列可操纵连接，该控制序列在用所说的载体转化的宿主细胞中是可操纵的。

29.一种转化的或转染的宿主细胞，含有权利要求21的重组DNA表达载体。

30.一种转化的或转染的宿主细胞，含有权利要求22的重组DNA表达载体。

31.一种转化的或转染的宿主细胞，含有权利要求26的重组DNA表达载体。

32.一种投送载体，含有权利要求17的核酸分子。

33.按照权利要求32的投送载体，其中，所说的投送载体是一种病毒投送载体。

34.一种腺病毒载体，含有权利要求17的核酸分子。

35.按照权利要求34所述的腺病毒载体，其中，所说的核酸分子在所说的核酸分子的5’端与编码一种信号肽的DNA序列可操纵连接。

36.按照权利要求35所述的腺病毒载体，其中，所说的信号肽选自VEGF信号肽，VEGF-B信号肽，VRF-2信号肽，VEGF-C信号肽，和PlGF信号肽。

37.按照权利要求35所述的腺病毒载体，其中，所说的信号肽选自痘病毒ORF-1信号肽，和痘病毒ORF-2信号肽。

38.按照权利要求35所述的腺病毒载体，其中，所说的信号肽是VEGF-B信号肽。

39.按照权利要求35所述的腺病毒载体，其中，所说的编码所说的信号肽的DNA序列在所说的DNA序列的3’端与编码成熟的非-截短的VRP亚基的第一个氨基酸残基的DNA可操纵连接，并且其中编码所说的残基的所说的DNA的3’端与编码所说的截短的VRP亚基的核酸分子可操纵连接。

40.一种滤过的可注射的腺病毒载体制品，含有：一种重组腺病毒载体，所说的载体不含有野生型病毒，并含有：

一种部分腺病毒序列，其中E1A/E1B基因缺失，和

一种编码权利要求1的截短的VRP亚基的转基因，它由一种被该部分腺病毒序列侧接的启动子驱动；和

一种药学可接受的载体。

41.按照权利要求40所述的制品，其中，所说的腺病毒载体已通过一种30微米的滤器滤过。

42.按照权利要求40所述的可注射的腺病毒载体制品，其中，所说的启动自选自下组的启动子：CMV启动子，室肌细胞特异性启动子，和肌球蛋白重链启动子。

43.一种制备截短的VRP多肽的方法，包括在适当的条件下生长一种用权利要求21的重组DNA表达载体以允许所说的多肽表达的方式转化或转染的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所说的多肽。

44.一种药物组合物，在适当的载体中包括一种含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的VRP。

45.一种刺激血管形成的方法，包括对患者施用一种药物组合物，该药物组合物在适当的载体中包括一种含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的截短的VRP。

46.一种在体外刺激内皮细胞生长或细胞迁移的方法，包括用在适当的载体中含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的截短的VRP处理所说的内皮细胞。

47.一种治疗患有心脏病的病人的方法，包括对所说的病人施用一种核酸分子，该核酸分子编码至少一种权利要求1的截短的VRP亚基，所说的核酸分子可在所说的病人中表达截短的VRP亚基。

48.一种在病人中刺激血管形成的方法，包括施用治疗有效量的一种药物组合物，该药物组合物在适当的载体中含有一种包括权利要求1的至少一种截短的VRP亚基的截短的VRP。

49.按照权利要求48所述的方法，还包括一种用于所说的药物组合物的适用于治疗的投送系统。

50.按照权利要求48所述的方法，还包括施用一种加强所说的截短的VRP的血管形成效应的增效剂。

51.按照权利要求50所述的方法，其中所说的增效剂是一种血管形成FGF。

52.按照权利要求51所述的方法，其中所说的增效剂选自FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-5，和FGF-6。

53.一种药物组合物，它在一种药学可接受的载体中含有一种包括权利要求1的至少一种截短的VRP亚基的截短的VRP，和一种或多种增效剂。

54.按照权利要求53所述的药物组合物，其中所说的增效剂是一种血管形成FGF。

55.按照权利要求54所述的药物组合物，其中所说的增效剂选自在一种药学可接受的载体中的FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-5，和FGF-6。

56.一种治疗患有局部缺血疾病的病人的方法，包括施用一种治疗有效量的药物组合物，该药物组合物在适当的载体中包括一种含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的截短的VRP。

57.按照权利要求56所述的方法，还包括施用一种加强所说的截短的VRP亚基的治疗效果的增效剂。

58.按照权利要求57所述的方法，其中所说的增效剂选自FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-5，和FGF-6。

59.按照权利要求56所述的方法，其中所说的局部缺血疾病选自心肌梗塞，慢性冠状动脉局部缺血，慢性下肢局部缺血，中风，和外周血管疾病。

60.一种用于治疗患有外伤的病人的方法，包括施用治疗有效量的一种药物组合物，该药物组合物在适当的载体中包括一种含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的截短的VRP。

61.一种提高血管通透性的方法，包括施用治疗有效量的一种药物组合物，该药物组合物在适当的载体中包括一种含有至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的截短的VRP。

62.一种在患者中刺激血管形成的方法，包括将投送载体通过在一个或两个冠状动脉内直接的冠状动脉注射投送到患者的心肌层，所说的载体含有编码至少一种权利要求1的截短的VRP亚基的核酸分子，其中所说的载体可在心肌层中表达截短的VRP亚基。

63.按照权利要求62所述的方法，其中所说的投送载体是一种复制缺陷型腺病毒载体。

64.一种在具有心肌局部缺血的病人中刺激冠状动脉旁系血管发育的方法，包括将投送载体通过对一个或两个冠状动脉直接进行冠状动脉内注射投送到病人的心肌层中，所说的载体含有一种编码截短的VRP亚基的核酸分子，并能够在心肌层中表达该截短的VRP亚基，从而促进冠状动脉旁系血管发育。

65.按照权利要求64所述的方法，其中所说的投送载体是一种复制缺陷型腺病毒载体。

66.一种在具有外周血管疾病的病人中刺激血管发育的方法，包括将投送载体通过对一个或两个股动脉进行股动脉内注射投送到病人的外周血管系统中，所说的载体含有一种编码截短的VRP亚基的转基因，并能够在外周血管系统中表达该截短的VRP亚基，从而促进外周血管发育。

67.按照权利要求66所述的方法，其中所说的投送载体是一种复制缺陷型腺病毒载体。

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