JP2002534058A

JP2002534058A - 脈管内皮成長因子レセプタ一２タンパクの修飾方法およびその使用方法

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Publication number: JP2002534058A
Application number: JP2000568862A
Authority: JP
Inventors: エー．マクテイーグ，ミセル; ピンコ，クリス; ヴィー．パラスト，カムラン; アール．ゲーリング，マイケル; カン，チェン−チェン; アペルト，クルジスツトーフ; エー．ウッカシャム，ジョン; エドワードショウオルター，リチャード; マリアテムプツイズク−ラッセル，アンナ; ムロズコウスキ，バーバラ; エルネストビラフランカ，ジーサス
Original assignee: アグロンファ−マシュ−テイカルズインコ−ポレイテッド
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2002-10-15
Also published as: US20020051965A1; AU5809399A; US20020164641A1; US6316603B1; WO2000014105A1; ATE310018T1; KR100442221B1; CA2340598A1; US20020127538A1; EP1109823A4; ES2252972T3; AU760008B2; EP1109823A1; DE69928411D1; KR20010086386A; EP1109823B1; US6849721B2; US6794146B2; US6753416B2; US6784285B1

Abstract

(57)【要約】【課題】脈管内皮成長因子レセプタ一２、つまり、ＶＥＧＦレセプタ一２の触媒キナ−ゼ領域の主要部分をクロ−ニング、配列解析ならびにＸ線結晶学的手法によって単離する方法を提供すること。【解決手段】脈管内皮成長因子レセプタ一２(VEGFR2/KDR)の触媒キナ−ゼ領域を含む2.4ナ結晶構造のタンパク構築物、つまり、血管形成のキ−酵素は、非リガンドのリン酸化状態で存在する。このタンパク構築物は、修飾触媒リンカ−を含み、ＫＩＤ全体を含む構築物に匹敵するインビトロキナ−ゼ活性を有する。得られた構築物は、野生型のＫＩＤに匹敵するインビトロキナ−ゼ活性を保持し、より重要なことは、そのタンパクは完全な結晶化ができ、Ｘ線結晶学的手法によって特徴付けることができることである。更に、Ｘ線結晶学的デ−タは、種々の疾患状態の治療に適用できる治療薬を同定ならびに構築するために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

この発明は、脈管内皮成長因子レセプタ一２、つまり、ＶＥＧＦＲ−２の触媒
キナ−ゼ領域の主要部分を、クロ−ニング、配列解析ならびにＸ線結晶学的手法
（クリスタログラフィ−）によって単離する方法に関する。この発明はまた、キ
ナ−ゼインサ−トドメイン（ＫＩＤ）と呼ばれる触媒領域範囲からの種々のアミ
ノ酸残基の欠失法に関する。得られたポリペプチドは、野生型ＫＩＤのキナ−ゼ
活性に匹敵する生体外（インビトロ）キナ−ゼ活性を保持していて、ポリペプチ
ドの触媒活性に対して必要ではない。さらに重要なことは、得られたポリペプチ
ドは、そのタンパクの完全な結晶化ができて、Ｘ線クリスタログラフィ−によっ
て特徴付けることができることである。さらに、この発明は、ＶＥＧＦＲ-２に
関連する種々の疾患状態の治療において療法化合物の同定と構築に有用なＸ線結
晶学的デ−タに関する。

【０００２】

【従来の技術】

多くの生理学的出来事、たとえば、胚形成、臓器発達、発情、傷修復などには
、脈管の成長と再形成が必要である(Folkman et al., (1992) J. Biol. Chem. 2
67，10931−10934; Risau, W. (1995) FASEB J. 9, 9 26-933)。これらの有益な
方法に加えて、血管形成もまた腫瘍増殖、転移、乾癬、リウマチ様関節炎、黄斑
変性、網膜障害などの疾患状態の増殖に関与している（Pepper，M.S., (1996) V
asc. Med. 1, 259-266; Kuiper et al.，(1998) Pharmacol. Res. 37, 1−16，1
998; Kumar and Fidler, (1998) In Vivo 18, 27-34; Szekanecz et al., (1998
) J. Investig. Med . 46, 27-41; Tolentino and Adamis, (1988) Int. Ophtha
lmol. Clin. 38, 77-94）。脈管形成に影響を及ぼすことが知られているシグナ
ル経路のうち、これらの関与している脈管内皮成長因子(VEGF)は、脈管内皮細胞
にとって必須であり、選択的であることが示された(Dvorak et al., (1995) Am.
J. Path. 146, 1029-1039; Thomas, K.，(1996) Cell 271, 603-606; Ferrar a
N. and Davis-Smyth, (1997) Endocrine Rev. 18, 4-25) 。ＶＥＧＦ経路を阻
害する治療的潜在性は、種々のヒト腫瘍(Borgstrom et al., (1996) Cancer Res
. 56, 4032-4039)および虚血性網膜疾患 (Adamis et al., (1996) Arch. Ophtha
lmol. 114, 66-71)に対して活性な抗ＶＥＧＦモノクロ−ナル抗体によって直接
示された。

【０００３】通常の脈管形成と血管形成は、胚形成、傷修復、臓器再形成や、排卵中の黄体
中での卵胞発達、妊娠後の胎盤成長などの女性生殖過程などの種々の生理学的過
程において重要な役割を果たしている(Folkman & Shing, 1992)。制御されない
脈管形成および/または血管形成は、糖尿病などの疾患や、成長のためには血管
新生に依存する悪性固形腫瘍にも関与している(Klagsburn & Soker，(1993) Cur
rent Biology 3(10): 699-702; Folkham, (1991) J. Natl. Cancer Inst. 82 :4
-6; Weidner，et al., (1991) New Engl. J. Med. 324:1-5)。

【０００４】インビトロでの内皮細胞成長促進活性を持つポリペプチドがいくつか同定され
ている。それらの例としては、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞成長因子(FGF)、
脈管内皮成長因子 (VEGF)ならびに胎盤成長因子などが含まれる。ＦＧＦとは異
なって、ＶＥＧＦは内皮細胞特異性分裂誘発因子であるとの報告が最近なされて
いる(Ferrara & Henzel, (1989) Biochem. Biop hys. Res. Comm. 161:851-858;
Vaisman et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:19461-19566)。

【０００５】したがって、ＶＥＧＦが結合する特異的レセプタの同定は、内皮細胞増殖の制
御を理解するのに重要である。構造的に関連する２個のチロシンキナ−ゼ、つま
り、flt-1レセプタ一 (Shibuya et al., (1990) Oncogene 5:519-524; De Vries
et al., (1992) Science 2 55: 989-991)と、本明細書に記載するKDR/FLK-1レ
セプタ一とは高い親和性を持ってＶＥＧＦに結合することが同定されている。こ
の結果、ＲＴＫ類は内皮細胞増殖の変調と調節において役割を有していることが
推測される。

【０００６】最近の記載、たとえば、アメリカ特願第08/193829号、同第08/038596号、同第
07/975750号などには、ＶＥＧＦが内皮細胞増殖ばかりに関与しているのではな
く、通常ならびに病理学的脈管形成に対する主要な抑制剤であることが強く示唆
されている(Klagsbur n & Soker, (1993) Current Biology 3:699-702; Houck,
et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:26031-26037)。

【０００７】 VEGFは、１２１−２０６残基の少なくとも4個のスプライス変異型に発現され
るホモ二量体のサイトカインである(Ferrara and Davis-Smyth, 1997)。血管内
皮細胞は、VEGFに対する少なくとも２個の高親和性レセプタ一、つまりVEGF-R1/
Flt-lとVEGFR-2/KD Rとを発現する。VEGF-R1とVEGFR-2とは、７個のイムノグロ
ブリン様セグメントを含有しかつVEGF、短メンブレンスパンニング(結合)領域、
ならびにチロシンキナ−ゼ活性を有する細胞質ゾルドメインを結合する。キナ−
ゼドメインは、細胞外ならびに近傍メンブレン（ジャクスタメンブレン）領域に
直接続いていて、それ自身別のドメイン（ポストキナ−ゼドメイン）によって続
いていて、それはシグナル導入のために別のタンパクを結合する機能を有する。
これら２個のレセプタ一は、異なるシグナル経路と機能を有するように思われ、
これらは内皮細胞の有糸分裂において主たる重要性を有する (Waltenberger et
al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 26988-26995; Seetharm et al., (1995) Onc
ogene 10, 135-147; Shalaby et al., (1995) Nature 376, 576-579)。

【０００８】 FGFとVEGFとは共に強力な脈管由来の因子であり、新生毛細血管の形成を惹起
する。FGFを有するヒト胸がん腫セルラインMCF-7をトランスフェクションすると
、ヌ−ドマウスに静注したときに、進行的に成長し転移する腫瘍を形成するセル
ラインになる。FGFは、胸腫瘍が進行してエストロゲン非依存、抗エストロゲン
抵抗性転移表現型になるのに決定的な役割を果たしている(McLeskey et al., (1
993) Cancer Res. 53:2168-2177)。胸腫瘍セルは、新生血管形成を増進し、同時
転移を増加し、インビボにおける成長がトランスフェクションしていない腫瘍よ
りもより急激な成長を示した。FGFは、NIH-3T3セルへ形質転換して、マウス乳が
んの腫瘍形成ならびに転移に関わっていることが示されている。FGF過発現は、
ヒト副腎がん腫セルラインの腫瘍形成表現型を授け、FGFが上皮セルの形質導入
にも役割を果たしていることを示唆している。FGFに対するポリクロ−ナル中和
抗体は、Ｂａｌｂ／ｃヌ−ドマウスに腫瘍を形成するＫ１０００セル（ｂＦＧＦ
のリ−ダ−配列でトランスフェクションした）を移植したＢａｌｂ／ｃヌ−ドマ
ウスにおける腫瘍形成を阻止した(Hori et al., (1991) Cancer Res. 51: 6180-
9184)。

【０００９】新生脈管形成、腫瘍形成ならびに転移におけるFGFの役割によって、FGFのセル
内シグナル化を予防することによって抗FGF活性を発揮する強力な抗ガン剤とし
てのFGF抑制剤がこの技術分野において必要である。

【００１０】これとは対照的に、VEGFは、内皮細胞特異性マイトジェンであり、種々の腫瘍
セルによって解放され、原位置でヒト腫瘍セルに発現される血管形成誘発剤であ
る。FGFとは異なって、VEGFをエンコ−ドするcDNA配列を有するセルラインをト
ランスフェクションしても形質導入を促進しなかったが、インビボでの腫瘍成長
を促進した(Ferrara, N., and Davis-Smyth, T. (1997))。更に、VEGFを中和し
たポリクロ−ナル抗体を投与しても、ヒト黄紋筋肉腫、膠芽細胞腫多形ならびに平滑筋肉腫セルラインがヌ−ドマウスに成長することを抑制した (Kim et al.,
(1993) Nature 362: 841-843)。

【００１１】内皮細胞増殖ならびに潜在的な脈管形成ならびに/もしくは血管形成の規制と
変調に対するレセプタ一チロシンキナ−ゼ (RTK)の重要性に鑑みて、RTK抑制剤
を同定する多くの試みが種々の方策を用いて行われた。かかる方策としては、た
とえば、突然変異リガンド(アメリカ特許第4966849号)、可溶性レセプタ一なら
びに抗体(国際公開WO94/10202; Kendall & Thomas, (1994) Proc. Nat. Acad. S
ci. 90:10705-09; Kim, et al., 1993)、RNAリガンド(Jellinek, et al., (1994
) Biochemistry 3:10450-56)、タンパクキナ−ゼC抑制剤 (Schuc hter, et al.,
(1991) Cancer Res. 51:682-687); Takano, et al. (1993) Mol. Bio. Cell 4:
358A; Kinsella, et al., (1992) Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright, et al.,
(1992) J. Cellular Phys. 152:448-57)、チロシンキナ−ゼ抑制剤 (国際公開W
O 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94 /14808; U.S. Pat. No. 5,330,
992; Mariani, et al., (1994) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268)が挙げ
られる。

【００１２】最近、チロシンキナ−ゼ抑制剤として作用する小分子を同定する試みがなれて
いる。たとえば、ビス単環式、二環式もしくは複素環式アリール化合物 (国際公
開WO 92/20642)、ビニレン−アザインド−ル誘導体 (国際公開WO94/14808) なら
びに 1-シクロプロピル-4-ピリジルキノロン(アメリカ特許第5,330,992号) が一
般にはチロシンキナ−ゼ抑制剤として記載されている。スチリル化合物 (アメリ
カ特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物 (アメリカ特許第5,302,
606号)、ある種のキナゾリン誘導体 (ヨーロッパ特許出願第0 566 266 A1号),セ
レノインドール類ならびにセレナイド類 (国際公開WO 94/03427), 三環式ポリハ
イドロキシル化合物 (国際公開WO 92/21660) ならびにベンジルホスホン酸化合
物 (国際公開WO 91/15495)がガン治療に使用するチロシンキナ−ゼ抑制剤として
使用する化合物として記載されている。しかしながら、これらの化合物はいずれ
も以前にはVEGFR-2レセプタ一の酵素的機能には一切関連していなかった。同様
に、これらの化合物は以前にはいずれも脈管形成ならびに/もしくは血管形成の
規制にも一切関連していなかった。

【００１３】したがって、当該分野において、PDGF, FGF, EGFならびにVEGF経路の小分子ア
ンタゴニストを個々にもしくはグループとして開発する必要性がある。その上、
これらのサイトカインがセル内の共通第２メッセンジャー経路を介してシグナル
を発信するならば、かかるアンタゴニストは、冠状再発狭窄症、腫瘍関連血管形
成、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、慢性炎症、糸球セルもしくは糸球
体間質セルの増殖に関連するある種の腎臓疾患、網膜血管増殖に関連する眼疾患
などでかつ広い範囲の疾患の進行を治療したり、予防するための広範な治療活性
を有する。この発明は、多数もしくは多種のアッセイによって活性になることが
示された共通シグナル機構や、一群の活性な治療剤を見出すと共に、共通セル内
シグナル中間体を見出すことによって完成した。

【００１４】配列ホモロジ−と全体のドメイン構造に基づいて、VEGFRは、血小板由来成長
因子レセプタ一ファミリ−（PDGFR）に属している。血小板由来成長因子レセプ
タ一ファミリ−（PDGFR）にはまた、PDGFRα、PDGFRβ、幹セル成長因子レセプ
タ一（c-kit）、コロニ−刺激因子−１レセプタ一（CSF-1R/c-fms） (van der G
eer et al., (1994) Ann. Rev. Cell Biol. 10, 251-337)が含まれる。このファ
ミリ−の他のタンパクキナ−ゼに比べると、このファミリ−の成員は、触媒キナ
−ゼドメイン中にキナ−ゼインサ−トドメイン（ＫＩＤ）と呼ばれる、約６５−
９７残基のインサ−ト（挿入断片）を含んでいる。PDGFRファミリ−内では、Ｋ
ＩＤの長さは異なっていて、配列ホモロジ−は低い。PDGFRα、PDGFRβ、c-kit
およびCSF-1RからのＫＩＤの欠失または突然変異は、このドメインが固有キナ−
ゼ活性にとっては必要でないが、ＫＩＤチロシン残基の自己リン酸化によるシグ
ナル形質導入に関わる他のタンパクの結合にとっては重要であることを示してい
る(T aylor et al., (1989) EMBO J. 8, 2029-2037; Heidaran et al., (1991)
Mol. Cell. Biol. 11,134-142; Yu et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3780
-3785; Kazlauskas et al., (1992) Mol．Cell. Biol. 12, 2534-2544; Lev et
al., (1992) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 89, 678 -682; Reedjik et al., (19
92) EMBO J. 11,1365-1372; Bazenet et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 69
26-6936)。VEGFRに対するシグナル経路とＫＩＤの特定の役割は未だ完全には決
定されていないけれども、VEGFR-2 KIDは、自己リン酸化部位であると知られて
いる２個のチロシンを含んでいる(Dougher-Vermazen et al., (1994) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 205, 728-738)。

【００１５】第１サイクリックＡＭＰ依存タンパクキナ−ゼ(cAPK)構造の決定(Knighton et
al., (1991) Science 253, 407-413)以来、種々のタンパクキナ−ゼの構造が報
告されている(Johnson et al., (1996) Cell 85, 149-158での論評)。レセプタ
一タンパクチロシンキナ−ゼ（ＲＴＫ）のうち、インスリンレセプタ一(IRK) (H
ubbard, etal., (1994) Nature 372, 746 -754; Hubbard, (1997) EMBO J. 16,
5572-5581) と、繊維芽細胞成長因子レセプタ一−１(FGFR1) (Mohammadi et al.
, (1996) Cell 86, 577-87; Mohammadi et at., (1997) Science 276, 955-960)
の構造は決定されている。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】

この発明は、６８残基ＫＩＤの１８残基を含むVEGFR-2 タンパクの修飾キナ−
ゼドメインの作成、反応特性および構造決定を提供する。リン酸化VEGFR-2触媒
ドメインのこの2.4Å結晶構造は、PDGFRファミリ−のキナ−ゼドメインの最初に
報告された構造である。この構造は、PDGFRファミリーの他の成員に関すること
もあるVEGFR-2のKIDドメインの配向に対する洞察を与える。更に、VEGFR-2キナ
−ゼの抑制には幅広い臨床的用途があるので、この構造は、療法剤としての小分
子VEGFR-2抑制剤の構造に基づく設計に対する目標についての3次元的記載を提供
する。

【００１７】この発明の目的は、レセプタ一チロシンキナ−ゼファミリ−(RTK)に含まれる
種々のタンパクに対する特異的なアゴニストもしくはアンタゴニストである候補
化合物をスクリーニングする有効な方法であって、候補化合物の結合をモデル化
するためにＸ線結晶学的デ−タの分子モデル化に使用するために、RTK、特にVEG
FR-2レセプタ一を結晶化する方法を提供することである。

【００１８】この方法は、たとえば下記のような活性を有する潜在的な療法化合物を設計し
、スクリーニングする方法を提供するものであって、かかる活性としては、たと
えば、 (1 ) 糖尿病性網膜症、空洞化血管腫、カポジ肉腫、内皮様細胞からなる
腫瘍の進行ならびに、新規な血液供給の発達を予防することによるガン細胞の成
長を処置または予防するのに有用な新規な血管形成を抑制すること、(2)種々の
形式ならびに病因性の糖尿病性糸球体硬化症ならびにその他の糸球体腎炎の発達
を処理または予防するのに有用な糸球体間質細胞ならびに/もしくは糸球体上皮
細胞のサイトカイン誘発増殖に起因する腎疾患の発達を抑制すること、(3) 滑液
細胞の増殖に起因するリウマチ様関節炎に伴う関節破壊を予防すること、(4) ケ
ラチノサイトの増殖ならびに炎症細胞の蓄積に起因する乾癬の顕在化を抑制する
こと、(5)冠状血管の再発狭窄症もしくはその他の動脈血管に続く血管形成に関
与する促進じゅく腫を阻止すること、(6) じゅく腫形成に起因する冠状動脈疾患
ならびにその他の脈管疾患を抑制すること、(7) her-2-neuレセプタ−の過発
現によって刺激された胸ガンなどの腫瘍の進行を処置または予防する、PDGF, FG
F, EGF もしくは VEGFなどのその他のサイトカインに対するパラ分泌（パラクリ
ン）もしくはオ−トクリン仲介応答によるじゅく腫形成、冠状動脈疾患ならび
にその他の脈管疾患を抑制することなどが含まれる。この発明に係る方法は、シ
グナル形質導入を阻害する化合物を投与することから構成される。

【００１９】この発明は、反復医薬品設計プロセスに使用される方法を開発するのに有用で
ある。このプロセスは、その効能を改善するためにVEGFR-2レセプタ−に結合す
る新規医薬品候補化合物の新規な設計によってVEGFR-2に対して有効なアゴニス
トならびにアンタゴニストを同定する。本明細書で開示するＸ線結晶学的座標は
、VEGFR-2 タンパクの触媒作用部位と、医薬品結合部位の３次元モデルを作成で
きる。

【００２０】新規な設計は、主に、フラグメントまたは原子を、基質アナログ構造を参照す
ることなしに、立体的なまたは静電気的な相補性に基づいた部位に構築し、結合
するコンピュ−タプログラムを使用して、分子を作成することからなる。医薬品
設計プロセスは、目標ＲＴＫの構造が少なくとも2.8Åの解像度まで解決された
後に開始される。その構造を2.8Åまたはそれ以上の解像度にその場所にある「
固定」水分子で精製することにより、医薬品設計を実施するより好適な条件を提
供することができる。

【００２１】この発明の別の目的は、RTKファミリ中のタンパクのＫＩＤを同定し、タンパ
クが結晶化できかつＸ線結晶学的手段による測定に適するように、上記ＫＩＤ中
の欠失を発展させることである。

【００２２】この発明の更に別の目的は、PDGF, EGF, VEGFその他の遺伝子のRTKファミリの
成員からのＫＩＤ領域が、そのＫＩＤ領域からアミノ酸が欠失することによって
修飾され、得られたポリペプチド生成物に好適な物理的特性を付与するように修
飾する方法を提供することである。かかる好適な物理的特性の例としては、溶解
性の増加、温度変化に対する安定性が大きくなることによって、ポリペプチドを
核磁気共鳴、高効率（スル−プット）スクリ−ニング（ＨＴＳ）、生化学的特性
測定法、Ｘ線結晶学的手法、熱量測定法、その他の診断手段による分析に適する
ようにすることなどが挙げられる。

【００２３】この発明の更に別の目的は、ナノモル単位で有効な可能性がある新規医薬品候
補分子の新規設計によるRTKファミリ中のタンパクに対する潜在的なアゴニスト
ならびにアンタゴニストの医薬品設計法に使用されるスクリ−ニングを開発す
ることである。欠失によって突然変異したＫＩＤおよびRTKファミリ中の上記タ
ンパクのその他の種々の欠失に基づいて提供されたＸ線結晶学的座標は、RTKフ
ァミリ中のタンパクの活性な結合部位の３次元モデルを作成することができる。

【００２４】

【発明の実施の形態】

VEGFR-2タンパクのクローニング VEGFR-2の細胞質ドメインに対するコード配列 (Terman et al., (1992) Bioch
em Biophys. Res. Commun. 87, 1579-86)は、ヒト大動脈cDNAプ−ル(C lontech
Palo Alto, CA, USA)からのPCR (Mullis et al., (1986). Biotechnology 24, 1
7-27)によって増幅した。２個の重なり合っている配列は個々に増幅された。そ
の２個の重なり合っている配列は、全細胞質ドメインを表したVcyt (残基M806-V
1356)と、インスリンレセプタ−キナ−ゼ触媒ドメイン (Wei et al., (1995) J.
Biol. Chem. 270, 8122-8130) との第1級アミノ酸配列位置合わせに基づく境界
を有するVcat (残基C817M-G1191)とである。

【００２５】 Vcytに対するPCRオリゴヌクレオチドプライマ−配列は次の通りである。 Vcyt5 5'-CAGCATATGGATCCAGATGAACTCCCATTGG-3'(配列番号１) Vcyt3 5'-GCGGTCGACTTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTG-3'(配列番号２) Vcatに対するPCRオリゴヌクレオチドプライマ−配列は次の通りである。 Vcat5 5'-GCACATATGGAACGACTGCCTTATG ATGCCAGG-3'(配列番号３) Vcat3 5'-CCTGTCGACTTATCCAGAATCCTCTTCCATGCTCAAAG-5' (配列番号４)

【００２６】増幅されたDNAは制限酵素NdeIとSaIIによって消化し、E. coliプラスミドpET2
4a (Novagen Madison, WI, USA)にリゲートして、その配列を照合した。Genbank
のオリジナルVEGFR-2配列(Accession number 346345)に比べて、2個のヌクレオ
チドの相違は、VcytとVcatの両方におけるコドン変化(Glu848-Val ならびに Asn
835-Lys)に基づくことが認められた。この発明に係る配列は、その後のVEGFR-2
Genbank寄託物 (Accession numbers 2655412 ならびに 3132833)と一致する。

【００２７】 Mute-Geneインビトロ突然変異誘発キット (Bio-Rad Hercules, CA, USA)を用
いて、ヌクレオチド部位指向突然変異誘発 (Kunkel, 1985)によって突然変異が
導入された。Vcat DNAフラグメントは、NdeI\--XhoI消化物を用いてpET24aベク
タからベクタpMGH4にサブクロ−ンし(Schoner et al., 1986, Ken et al., 1992
)、このベクタを用いて、キットにて供給されたE. coil株CJ236中にssDNAウラシ
ルテンプレ−ト（マイナス鎖）を作成した。オリゴ(5'-CTCAGCAGGATTGATAAGACTA
CATTGTTC-3')が設計されて、Ｃ末端の先端を切って残基D1171にした構築物(ト Vc at(AG1172-Gl191)) を創製した。別のオリゴ(5'-GAATTTGTCCCCTACAAGGAAGCTCCTG AAGATCTG-3')が設計されて、FGFR-1との配列アラインメントに基づいてインサ−
トキナ−ゼドメインの中心の５０残基(残基T940-E989) を欠失した(Mohammadi e
t at, 1996)。配列分析によって、偶発的なGlu990-Val突然変異を検出した。全
ての修飾酵素と制限酵素はNew England Biolabsから、オリゴヌクレオチドはGen
osys Biotechnologyから購入した。

【００２８】 VEGFR2Δ50構築物は、数ステップで生製され、必要な突然変異をバキュロウイ
ルス(baculovirus)発現ベクタpAcSG2 (Pharmingen San Diego, CA, USA)中に組
み込んだ。ステップ１は、Vcytに対するコ−デイング領域をpET24aベクタからベ
クタpAcSG2のNcoI-KpnI部位にＰＣＲによるサブクロ−ン化である。ステップ２
では、プラスミドpMGH4-Vcat(ΔT940-E989, E990V)からの2358bp ScaI-BgIII DN
A フラグメントを、pM GH4-Vcat (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172-G1191) ベクタ
を作製するpMGH4-Vcat(ΔG1172-G1191)からの1695bp BgIII-Scal DNA フラグメ
ントにリゲ−ト（結合）する。ステップ３では、pMGH4-Vcat (ΔT940-E989, E9
90V,ΔG1172-G1191)からの9l3bp BstElI-EagI DNA フラグメントを、VEGFR2Δ50
とも呼ばれる、pAcSG2-Vcyt (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172 -G1191)を作製する
pAcSG2-Vcytからの3290bp EagI-BstEll DNA フラグメントにリゲ−ト（結合）す
る。この最終構築物は、全コ−デイング領域に亘って配列されかつ解析して、野
生型配列（図１の配列）からのこれらの既知の突然変異だけを含むことを確認し
た。図１は、VEGFR2の触媒ドメインに対する２次的構造の指定（Procheckによる）
と、その他の代表的なレセプタ−チロシンキナ−ゼとの配列アラインメントを示
す。αヘリックスはαＢ−αIとして、β鎖はβ１−β８として指定されている
。VEGFR2Δ50における５０残基の切失部位は、|で示されている。VEGFR2Δ50中
のE990Vの突然変異部位は＊で示される。配列は、VEGFR2（ここではこのように
報告されている）；FGFR1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P11362)；IRK (EMBL
タンパクデ−タ−ベ−ス#A18657；番号はMohammadi et al., 1996による); VEGF
R1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P17948); PDGFRα (スイスタンパクデ−タ
−ベ−ス#P17948) からである。

【００２９】 DNAエンコ−ド用VEGFR2Δ50は、製造者(Pharmingen San Diego, CA, USA)のプ
ロトコルによる直線化したバキュロウイルスDNAを持つSf9セルにトランスフェク
ションされた。このトランスフェクションからの単一プラ−クを単離し、高タイ
タ−ストックを生成した。全てのストックは、バキュロウイルスDNAと、ポリヘ
ドロンフォワ−ドとリバ−スプライマ−(Invitrogen)を使用したインサ−トのPC
R増殖によって調べた。Sf21セルは、1-1.5百万セル／ｍＬ、MOI=5で7 2時間感染
させ、遠心分離して得た。

【００３０】 Sf21セルからのVEGFR2Δ50の精製セルペレットを20 mM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% (v/v) グリセ
ロ−ル中でのド−ンス（dounce）ホモゲナイズと超音波処理をして溶菌した。溶
菌液をTi45ロ−タで35,000 rpm、50分間遠心分離した。可溶性フラグメントは、
40 ml Q-30アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填し、20 mM Tris pH 8.0, 5 mM
DTT, 5% (v/v) グリセロ−ルに溶解した20 mMから600 mMまでのNaCl勾配液の
２０カラム容量で溶出した。VEGFR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガス
トリン基質ペプチド基質(Boehringer Mannheim)に対して測定したキナ−ゼ活性
の存在によってプ−ルした。プ−ルした物質は、40 mLヒドロキシアパタイト(Bi
o-Rad) カラムに充填し、20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% グリ
セロ−ルでよく洗浄した。タンパクは、リン酸カリ、pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM
DTT, 5%グリセロ−ルの０mMから50 mMまでの直線勾配液500 mLで溶出した。VEG
FR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガストリンペプチドに対して測定し
たキナ−ゼ活性の存在によってプ−ルした。このカラムからの物質は、20 mM Tr
is pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルで１：１の割合で希釈し、8
mL Q-15アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填した。タンパクは20 m M Tris p
H 8.0, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルのNaCl勾配(20 mM-175 mM)液で希釈した。VEG
FR2Δ50タンパクは上記のようにしてプ−ルした。このプ−ルに4M (NH₄)₂SO₄を
最終濃度が0.6 Mになるように添加し、10 mL HP-フェニルセファロ−スカラム (
Pharmacia)に充填した。VEGFR2Δ50タンパクは、20 mM Tris、5 mM DTTに溶解し
た(NH₄)₂SO₄の0.6 Mから0 Mまでの逆直線勾配液200 mLで溶出した。精製VEGF R
2Δ50タンパクは、500 ml G-25カラム(Pharmacia)で50 mM Hepes pH 7.5, 10 mM
DTT, 10%グリセロ−ル, 25 mM NaClを用いてバッファ−交換し、10 kDカットオ
フポリスルホンメンブレン(Amicon)で1 mgタンパク/mLに濃縮した。最終物質は
、分割し、液体窒素でフラッシュ冷凍し、７０℃で保存した。

【００３１】動的アッセイタンパク (4 mM), ATP (3 mM), MgCl₂ (40 mM), DTT (5 mM)をHepes (100 mM
), 10% グリセロ−ル, pH 7.5に溶解し、４℃、１時間の条件下で自己リン酸化
した精製VEGFR2Δ50タンパクに対してカプルド（共役）スペクトル光度アッセイ
を行った。

【００３２】前方向へのカプルドスペクトル光度アッセイチロシンキナ−ゼアッセイはベックマンDU 650スペクトル光度計で測定した。
ADPの産生は、ホスホエノ−ルピルベ−ト (PEP) を使用したピルビン酸塩キナ−
ゼ(PK)と乳酸デヒドロゲネ−ス(LDH)との作用を介してのNADHの酸化に関連して
いた。NAD Hの酸化は、340 nm (e340 = 6.22 cm^-1mM^-1)での吸光度の減少を追
跡して行った。一般的な反応溶液は、200 mM Hepes, pH 7.5、異なる濃度のポリ
(E₄Y₁) (Sigma), ATP ならびに MgCl₂に溶解した1 mM PEP, 250 mM NADH, 50単
位のLDH/mL, 20単位のPK/mL, 5 mM DTTを含んでいる。アッセイは40 nM VEGFR2
Δ50タンパクを用いて開始した。

【００３３】逆方向へのカプルドスペクトル光度アッセイ A TPの産生は、ヘキソキナ−ゼ(HK)とグルコ−ス−６−ホスフェ−トデヒドロ
ゲネ−ス(G6PD)との作用を介してのNADHの産生に関連していた。このアッセイで
は、HKはATPを変換してADPとグルコ−ス−６−ホスフェ−トとにする作用を触媒
する。グルコ−ス−６−ホスフェ−トデヒドロゲネ−スは、G6PDによって酸化さ
れてD-6-ホスホグルコノピラノ−ス-1,5-ラクトンになる。この場合、NADからNA
DHへの付随的な還元は340 nmでモニタ−できる。一般的なアッセイ用溶液は、グ
ルコ−ス(10 mM), NAD (40 mM), DTT (5 mM), MgCl₂ (4 mM), HK (15 unit/mL),
G6PD (15 unit/lmL)、指示濃度のADPとホスホ−ポリ(E₄Y)を含んでいる。反応
はVEGFR2Δ50タンパク(600-900 nM)を添加して開始した。

【００３４】 VEGFR2Δ50タンパクの潜在的アゴニストとアンタゴニストの評価上記スペクトル光度アッセイと動的アッセイとに基づいて、候補化合物を競合
する上記アッセイに添加することによってVEGFR2Δ50タンパクの潜在的候補アゴ
ニストとアンタゴニストを評価できる。上記したように、VEGFR2Δ50タンパク活
性の速度（動態）は、ガストリンペプチドに対して測定した。候補化合物の存在
もしくは不存在下での活性を測定し、得られた速度デ−タを比較した。レセプタ
一に対する候補化合物の親和性は、競合的なアンタゴニストを示す速度カ−ブの
右側へのシフトまたは、非競合的な拮抗を示す最大活性の低下に反映されよう。
反対に、速度カ−ブの左側へのシフトは、VEGFR2Δ50タンパクに対する競合的な
アゴニストを示す。これについての総論としては、Bourne, H .R., et al. (198
7) Basic & Clinical Pharmacology (Katzung, et al., eds) (Ch. 3) 9-22を参
照のこと。

【００３５】結晶化と質量分析のためのVEGFR2Δ50タンパクのインビトロ自己リン酸化冷凍VEGFR2Δ50タンパクの分割量を冷水に入れて解凍し、４℃でプ−ルした。
MgCl₂とATPとをそれぞれ26 mMと4 mMになるように添加した。VEGFR2Δ50を４℃
で１時間培養した。ついで、この物質（VEGFR2Δ50 P）を10mM Hepes pH7.5, 10
mM DTT, 10mM NaClの溶液中でバッファ−交換し、Centriprep-10 (Amicon)を用
いて5mgタンパク/mLに濃縮した。

【００３６】質量分光測定法トリプシン消化：精製VEGFR2Δ50とVEGFR2Δ50 Pのトリプシン消化は、タンパ
ク0.37 mg/mLを25mM NH₄HCO₃に溶解し、pH7.7、反応容量100μL、２日間、３７
℃の条件下で行った。

【００３７】 MALDI/MS：MALDI/MS分析は、ボイジャ−・エリ−ト搭載遅延抽出型タイム−オ
ブ−フライト質量スペクトロメ−タ(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham
, MA, USA)で行った。消化タンパクサンプル１μLを、アセトニトリル50% (v/v)
溶液と0.25% (w/w)トリフルオロ酢酸との水溶液中でマトリックス(a-シアノ-4-
ヒドロキシ桂皮酸)１μLと混合した。サンプルに337nmで操作した窒素レ−ザを
照射した。

【００３８】 NanoESI-MS：NanoESI-MS分析は、NanoESIソ−ス(Pr otana A/S, デンマ−ク)
で改造したtriple quadrapole質量スペクトロメ−タ(PE Sciex API III、アルバ
−タ州, カナダ)で行った。ESI電圧を700Vに設定し、オリフィス設定を100Vに維
持した。消化タンパク３μLを、メタノ−ル７μLとギ酸0.5μLと混合した後、こ
のサンプル４μLを質量スペクトロメ−タに注入した。イオンスキャンを使用し
てホスホペプチドの配列を得た。

【００３９】結晶化とデ−タ収集精製したリン酸化VEGFR2Δ50を、Centricon-10遠心濃縮機を使用して平均して
5 mgタンパク/mLに濃縮した。結晶は、点滴蒸気拡散法を４℃で行って成長させ
た。タンパク溶液２μLと母液溶液(100mM Hepes(pH 7.2), 2M (NH₄)₂S0₄, 2% (
v/v)モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルmW=550)２μLとを含む点滴を、
β−メルカプトエタノ−ル50mMを添加した母液の1mLリザ−バ上で平衡させた。
結晶は３ないし４日後に現れ、２１日経つと0.3 x 0.2 x 0.5mmの大きさに成長
した。

【００４０】 X線回折デ−タセットを、Supper焦点ミラ−とMAR345 MAR Researchイメ−ジ・
プレ−ト検出器を取り付けたRigaku RU-2OO型回転アノ−ドX線発生器(CuKα)を5
0kV、100mAで操作して収集した。凍結結晶のデ−タ収集は、結晶を凍結防止剤溶
液 (100mM Hepes (pH7.2), 2.2M (NH₄)₂S0₄, 0.6M sucrose, 0.55M glucose, 2
% (v/v) モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルMW=550)中に入れ、その結
晶を液体窒素中でフラッシュ冷凍し、-186℃の窒素流中に入れて行った。デ−タ
は統合し、DENZOとSCALEPACK (Otwinowski, 1993)を用いてスケ−ル化した。収
集したデ−タの統計は表２に示す。

【００４１】初期タンパク相は、AmoRe分子置換プログラム(Navaza, 1994)、検索プロ−ブ
としてのFGFR1構造の分子１(Mohammadi et at., 1996; PDB entry 1FGK)、nativ
elデ−タセットを用いて得た。正確な溶液を、FGFR1側鎖を含有させ、検索モデ
ルからの活性ル−プ(6 40-660)の可動残基、Ｎ末端(464-467)、短ル−プ(517-52
0)、Ｃ末端(760-762)から除去することによって作製した。この正確な溶液は、
その回転ならびに翻訳機能の頂点ピ−クが相関係数0.31であった。AMORe中での
剛体純化によって相関係数は0.49に、12.0 - 4.0 Å解像範囲におけるR因子は46
.3%に改良された。この溶液の正確さは、KAu(CN)₂誘導体を用いた示差Fourierに
よる計算よってクロスチェックした。この誘導体は、0.5mM KAu(CN)₂を含むリ
ザ−バ液中に結晶を３日間浸漬し、次いで重原子濃度を5mMに増加させた後、再
度６４時間浸漬した。デ−タセットのスケ−ル化、Patterson計算、Fourier計算
、位相の作製は、Xtalview (McRee et al., 1992)を用いて行った。

【００４２】モデルはXplorバ−ジョン3.1 (Brunger, 1992)を用いて精製した。電子密度マ
ップ計算とモデル取り付けはXtalView (McRee et al., 1992) を用いて行った。
精製は４℃で収集したデ−タセット(native2)を用いて開始し、-186℃で収集し
たデ−タセット(native3) を用いて完了した。この最終Ｒ因子は8-2.4 Å (Fo
> 2δ)の範囲におけるテ−タに対して20.2%である。全原子に対する平均Ｂ値は、
タンパクに対しては31.8 Å²、水分子に対しては42.8 Å²である。最終モデルに
は、残基820-939, 998-1047, 1064-1168が含まれていて、これら残基のうち、K8
38, R842, F845, K939, D998, K1023, R1027, Y1038, K1039, K111 0, E1113の
側鎖は、翻訳処理可能密度の不足のためにＣαを越えてモデル化できなかった。
モデル中の２７５残基のPROCHECK (Laskowski et al., 1993) ショ−を用いて行
った主鎖捩り角度の分析では、Ramachandranプロットの非許容範囲では何も発生
しなかったし、強許容範囲ではわずかに４個に発生した。１８２個の水分子が、
３δよりも大きな電子密度ピ−クに合致し、タンパクとその他の水分子に対して
合理的に水素結合が作成される位置に所在した。種々のキナ−ゼ構造の重ね合わせはグラフィックプログラムInsight II (Mole
cular Simulations Inc, San Diego, CA, USA)を用いて行った。

【００４３】実施例１：構造決定ＫＩＤの６８残基のうち５０の中心残基が欠失しているヒトVEGFR-2のチロシ
ンキナ−ゼドメインはバキュロウイルス／昆虫セルシステム中で発現させた。完
全長VEGFR-2の１３５６残基のうち、この構築物（VEGFR2Δ50）は、細胞質ゾル
ドメインの残基806-939と990-1171を含んでいる（図１）。VEGFR2Δ50はまた野
生型VEGFR-2に対比して、ＫＩＤ中における１点突然変異（E990V）を含んでいる
。

【００４４】その自己リン酸化を触媒することに加えて、VEGFR2Δ50はまたポリ(E₄Y)外生
基質のリン酸化を触媒することができる。詳細な動的分析（表１）では、その反
応パラメ−タは、全ＫＩＤを含む匹敵するVEGFR-2タンパクのそれとほぼ同じで
あるKID (Parast et al, 報道による)ことが明らかになっている。これらの結果
を総合すると、VEGFR2Δ50は完全に活性な機能的酵素である。したがって、ＫＩ
Ｄの５０個の中心残基の欠失はホスホトランスファ−反応の触媒工程に対しては
何ら観察される効果が観察されなかった。また、ＫＩＤ領域からの６０個以上の
アミノ酸の欠失が酵素活性の減少の原因であると決定した。

【００４５】表１：VEGFR2Δ50の反応係数

【００４６】

【表１】

【００４７】 VEGFR2Δ50配列は、６個のリジン、５個のアルギニン、８個のグルタミン酸、
５個のアスパラギン酸残基と含み（図１）、親水性であり、高帯電性である。最
初に、完全なＫＩＤを持つVEGFR-2触媒ドメインを含む数個のタンパク構築物が
生成された。これらのタンパク構築物を結晶化する徹底的な試みは失敗してわず
かな結晶をも生成できなかった後、VEGFR2Δ50を生成して、高荷電ＫＩＤは結晶
化と干渉するという考えを試験した。ダイナミック光散乱させることにより、１
４個の荷電残基を排除したこのVEGFR2Δ50構築物は、全ＫＩＤを含むタンパク構
築物よりも温度とタンパク濃度に対して著しい安定性を示した。

【００４８】結晶化のために、精製したVEGFR2Δ50をMgATPと培養してインビトロで自己リ
ン酸化した。完全長リン酸化VEGFR2Δ50(VEGFR2Δ50P)タンパクと、一般的な消
化ペプチドのMatrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)とnanoele
ctrospray ionization (NanoESI)質量分光測定分析とは、ここに記載する自己リ
ン酸化条件を使用してのY1059のリン酸化を示している。2.2 Åに回折するVEGFR
2Δ50Pの結晶は、非リガ−ト状態で得られた。この結晶は、非対称ユニット中に
１個のVEGFR2Δ50Pを有する斜方晶形スペ−スグル−プP2₁2₁2₁に属する。初期の
結晶学的位相は、検索モデルとしてFGFR1の非リン酸化キナ−ゼドメインの構造
を使用した分子置換(Mohammadi et al., 1996)によって決定した。分子置換溶液
の正確性は金シアナイド誘導体を用いてクロスチェックした。しかしながら、こ
の誘導体デ−タはモデルを構築する電子密度マップの位相計算には使用しなかっ
た。その構造は、Ｒ因子が8-2.4Åデ−タ(Fo>2δ)に対して20.2%にまで精製され
た。不秩序のためにバックボ−ン原子がモデル化されなかったVEGFR2Δ5 0P残基
には、Ｎ末端残基806-819、ＫＩＤの残基990-997、活性化ル−プの残基1048-106
3、Ｃ末端残基1169-1171が含まれている。構造決定についての統計は表２に示す
。

【００４９】表２：VEGFR2Δ50P構造決定についての統計

【００５０】

【表２】

【００５１】キナ−ゼの全体的な折り畳みセリン／スレオニンとチロシンタンパクキナ−ゼの両方の上記報告の構造に類
似して、VEGFR2Δ50Pは、２つのロ−ブに折り畳まれていて、ホスホトランスフ
ァ−の触媒作用はその２つのロ−ブの間の割れ目において起こる(Cox et al.の
論説1994; Johnson et al., 1996)。VEGFR2Δ50P構造ののＣαトレ−スは図２に
示す。キナ−ゼの２次的構造要素は、cAPK (Knighton et al., 1991)に元来付与
された慣行に従って命名されている（図１）。Ｎ末端ロ−ブ（ほぼ残基820-920
）は、１本のαヘリックス（αＣ）を持つ捩れたβシ−ト中に折れ曲がっている
。β構造は、５本の逆平行鎖（β１−β５）からなり、そのうちの３本鎖（β１
−β３）は大きく曲がっていて、他の２本鎖（β４−β５）の上に曲がりくねっ
ている。大きい方のＣ末端ドメイン（ほぼ残基921-313）は、２本の逆平行なβ
鎖（β７−β８）を含み、これらはＮ末端βシ−トに隣接するＣ末端ドメインの
頂部に位置している。７本のαヘリックス（αＤ、αＥ、αＥ−Ｆ、αＧ、αＨ
、αＩ）は、Ｃ末端ドメインの残存コアを形成する。他のキナ−ゼ同様、VEGFR2
Δ50Pは、２個の機能的に重要な領域、つまり、グリシンリッチヌクレオチド結
合ル−プ（残基841-846）、触媒ル−プ（残基1026-1033）および活性ル−プ（残
基104 6-1075）を含む（図１、図２（Ａ））。図２は、VEGFR2Δ50P, FGFR1, IRKPの全体的な重なりを示し、キナ−ゼドメイ
ン構造のバックボ−ンを示す。図２（Ａ）はVEGFR2(VEGFR2Δ50P)のキナ−ゼド
メイン構造、図２（Ｂ）はFGFR1(PDB entry 1FGKの分子Ａ, Mohammadi et al.,
1996)のキナ−ゼドメイン構造、図２（Ｃ）はIRKP(PDB entry 1IR3, Hubbard et
al., 1997)のキナ−ゼドメイン構造のそれぞれのバックボ−ンを示す。図２（
Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、Ｃ端末ドメインを重ねて作成した同一図である。末端
の位置はＮとＣで示した。ヌクレオチド結合ル−プ（オレンジ色）、キナ−ゼイ
ンサ−トドメイン（ピンク色）、活性ル−プ（黄色）はハイライトで強調して表
示した。図２（Ｃ）では、結合AMP-PNPは緑色で、ペプチド基質は赤色で示した
。図はINSIGHT IIで作成した。

【００５２】報告されたキナ−ゼ構造のうち、VEGFR2Δ50Pの構造は、ほぼ５５％の配列が
一致しているFGFR1の触媒ドメインの構造(Mohammed et al., 1996; PDB e ntry
1FGK)にもっとも類似している（図１）。FGFR1構造溶液の結晶学的な非対称ユニ
ット中の２つの分子は非常に類似しているので、VEGFR2Δ50Pとの比較は主にFGF
R1の分子Ａについてだけ記載する。Ｎ末端ロ−ブの鎖（β１−β５）の８２Ｃα
位置もしくはFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間のＣ末端ロ−ブの１５２Ｃα位置残基（
αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ）の最も小さい四角形の重ね合わせは、そ
れぞれ0.40Åと0.52Åのｒｍｓ偏差になる。２つのロ−ブ間のほぼ５°の相対的
回転は、それより僅かに大きくかつ開いているVEGFR2Δ50Pのロ−ブ内割れ目に
なる。この割れ目の端の等しいＣα（FGFR1のK523、R675とVEGFR2Δ50PのS877,
R1080）間の距離を測定すると、VEGFR2Δ50Pでは25.3Åであったのに対して、FG
FR1では23.2Åであった。しかしながら、この回転は、種々のリガ−ト（結合）
状態やリン酸化状態におけるキナ−ゼ構造間に認められるそれよりもずっと大き
な相対的なロ−ブの回転に比べれば小さな差でしかない(Johnson et al., (1996
) Cell 85, 149-158)。たとえば、VEGFR2Δ50Pについてここで見られるロ−ブ内
配向は、ATPアナログAMP-PNPとペプチド基質に結合したIRKのリン酸化キナ−ゼ
ドメインの三元コンプレックス構造において見られるそれよりも２０°程より一
層開いた立体配座をしている(Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581; PDB en
try lIR3) (図２（Ｃ）)。

【００５３】Ｎ末端ロ−ブのβ鎖位置はVEGFR2Δ50PとFGFR1との間においてよく一致してい
るのに対して、それらの構造は、残基W827に始まる第１の保存領域に先行するＮ
末端残基において著しく分岐している(図２（Ａ）と図２（Ｂ）)。VEGFR2Δ50P
の最初の１４個の残基(M806-E819)は完全に未秩序で、次の７個の残基(L820-R82
6)は拡張ル−プ構造を形成する。残基806-819は活性なキナ−ゼ領域の一部を形
成していないが、VEGFR-2の傍メンブレン（ジャクスタメンブレン：juxtamembra
ne）領域の代わりの部分もしくは隣接しているようである。残基820-826は、類
似する残基もまたFGFR1, IRKと非レセプタ−チロシンキナ−ゼLck (Yamaguchi a
nd Hendrickson, (1996) Nature 384, 484-489)の構造においては秩序立ってい
るので、柔軟ではあるが、キナ−ゼドメインの一部であると思われる。VEGFR2Δ
50Pの構造と他のキナ−ゼ構造との間の他の相違はキナ−ゼインサ−トドメイン
と活性化ル−プで起こる（後述する）。

【００５４】触媒ル−プとATP結合部位タンパクキナ−ゼにおいては、αＥとβ７との間のル−プは、ホスホトランス
ファ−反応における触媒的塩基として機能すると信じられている非変異アスパラ
ギン酸(D1028)が含まれているので、触媒ル−プと呼ばれている(Johnson et al.
, 1996)。このアスパラギン酸は、その配列HRDLAARNがタンパクチロシンキナ−
ゼ中に高度に保存されている残基(H1026-N1033)の伸長部分の一部である。VEGFR
2Δ50Pにおいては、このル−プのバックボ−ン位置と最側鎖位置とは、非リガン
ドFGFR1と三元リン酸化IRK (IRKP)コンプレックス構造における位置と類似して
いる。これらの前述した構造に見られるように、触媒ル−プのアスパラギン酸(D
1028)の側鎖カルボキシレ−トは保存アルギニン(R1032)とアスパラギン(N1033)
の側鎖に水素結合している(図３)。

【００５５】図３は、VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。（Ａ）は VEGFR2Δ50P
の構造と（Ｂ）は IRKP (PDB entry 1 IRS; Hubbard et al., 1997)の構造の触
媒作用部位の断面を示していて、原子は、元素によって色彩を施した（炭素は緑
色、酸素は赤色、窒素は青色、硫黄は黄色、リンはピンク色、マグネシウムはオ
レンジ色）。(A) VEGFR2Δ50Pはタンパク原子だけを含んでいて、(B) IRKPはタ
ンパク原子、AMP-PNP原子、Mg²⁺を含んでいる。図はINSIGHT IIを用いて作成し
た。

【００５６】タンパクキナ−ゼのATP結合部位は、Ｎ末端とＣ末端のロ−ブ間の割れ目に存
在する（図２（Ｃ））。VEGFR2Δ50Pにとっては、この部位を形成する残基は主
に２つのロ−ブを結合する残基E917-N923と、β１とβ２の部分を含む残基L840-
I849と、残基G841-G846のグリシンリッチル−プとから構成されている。グリシ
ンリッチル−プはまたヌクレオチド結合ル−プとも呼ばれ、その位置が種々の活
性化されリガンドされた状態のキナ−ゼ構造中において異なる柔軟なフラグメン
トである。VEGFR2Δ50Pにおいて、このル−プは、かなり秩序立って配列されて
いて、全ての原子はR842 とF845の側鎖を除いてモデル化できた。このル−プの
相対的位置と立体配置とは、非リゲ−トFGFR1構造において観察されるそれと類
似している。しかしながら、この位置は、IRKP三元コンプレックス構造の位置と
は著しく異なっている。このIRKP三元コンプレックス構造では、Ｎ末端とＣ末端
のロ−ブの２０°程の相対的回転によってVEGFR2Δ50P構造中よりもＣ末端ロ−
ブに５Åほど近くにあるグリシンリッチル−プになる。

【００５７】結合ATPもしくはATPアナログを持つ報告されたキナ−ゼ構造において、アデニ
ン環は、タンパクバックボ−ンを持つ２個の保存水素結合を作成する。AMP-PCP
が結合したFGFR1の構造 (Mohammed et al., 1996)において、これらの水素結合
は、アデニンNH₂とE562 (E917 VEG FR2ΔP)のバックボ−ンC=Oとの間と、アデニ
ンN1とA546 (C919 VEGFR2Δ50P)のバックボ−ンNHとの間に存在する。ここで提
示した構造は結合ヌクレオチドを含んでいないけれども、これらバックボ−ン原
子の位置がFGFR1に類似していることは、これらの水素結合がVEGFR2Δ50P-ATPコ
ンプレックス中に形成され、したがってアデニンが類似する位置に結合するのが
期待されることを示している（図４）。

【００５８】図７は、VEGFR2Δ50PとFGFR1の触媒作用部位を示していて、VEGF R2Δ50PとFG
FR1(AMP-PCP) コンプレックス(molecule B, Mohammadi et al., 1996) の構造の
ヌクレオチド結合部位の重ね合わせにおけるＣαトレ−スといくつかの側鎖を示
す立体図である。この重ね合わせは、Ｃ末端のヘリックス (D, E, F, G, H, I)
のＣα位置を用いて行った。VEGFR2Δ50Pの炭素原子は黄色で、FGFR1の炭素原子
は紫色で示した。他のタンパク原子に対しては、酸素が赤色、窒素が青色、硫黄
が緑色に色付けした。FGFR1構造のAMP-PCPはオレンジ色で描いた。ラベルはVEGF
R2Δ50P残基に対応する。図はXfit (McRee et al., (1992) J. Mol. Graph. 10.
44-46)で作成した。

【００５９】疾患に関与するキナ−ゼのATP結合部位の変化は、治療薬としての選択的ATP競
合抑制剤を設計するに当たっては相当重要である。FGFR1とVEGFR2Δ50PとのATP
結合部位を比較すると、その部位の全体的な構築は保存されているが、いくつか
の配列の違いがリガンド結合に対する接近領域の形状の違いになっていることが
判る。この部位におけるFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間の特定の配列の違いは、V899
(1545 FGFR1), F918 (Y563 FGFR1), C919 (A564 FGFR1), C1045 (A640 FGFR1)
が含まれている(図７)。同様に、三元IRKPコンプレックス構造と比較すると、 V
916 (M1076 IRK), F918 (L1078), C919 (M1079 IRK), L1035 (Ml139 IRK), なら
びに C1045 (G1149 IRK)におけるアデニン部位の変化が判る。VEGFR2Δ50P構造
をセリン／スレオニンキナ−ゼ構造と比較すると、アデニン部位におけるより大
きな配列と構造の変化さえも見られ、これらの相違が選択的ATP競合抑制剤を設
計するのに有用であることを示唆している。

【００６０】活性化ル−プタンパクキナ−ゼは、活性化ル−プ(A-loop)と呼ばれる大きな柔軟なル−プを
含んでいて、その立体配座はキナ−ゼ活性を規制すると仮定される(図２)。多く
のキナ−ゼにおいては、ＡＬの立体配座は、特定のA-loop残基のリン酸化によっ
て制御される(J ohnson et al., 1996)。そのル−プは、一般的には保存残基DFG
から始まり、保存APE配列で終わるものとして規定される(Johnson et al.,
1996)。VEGFR-2において、このフラグメントは、Dl046-El075に対応し、２個の
チロシン(Y1054、Y1059)を含む。Y1054とY1059の両方は、VEGFR-2の細胞質ゲル
ドメインがE. coilに発現されたときに、自己リン酸化部位になることが見いだ
された(Dougher-Vermazen et al., 1994)。V EGFR2Δ50に対してここに記載した
インビトロ自己リン酸化プロトコルを用いて、Yl059に安定したリン酸化部位が
示されたけれども、Y1054のリン酸化を示す証拠は発見されなかった。

【００６１】ここで提示された非リガンドVEGFR2Δ50P構造において、A-loopは非常に易動
性であって、翻訳可能な電子密度は、ル−プのほとんどの中心部分(G1048-G1063
)には存在していなかった。この不秩序は、他のキナ−ゼ構造から差し引いたA-l
oopの可動性と一致している。たとえば、非リン酸化FGFR1キナ−ゼ構造の非対称
ユニット中の２個の分子のうち、A-loopの中心は、分子Ａにおいて比較的高い温
度因子を持ち、分子Ｂにおいては完全に不規則に配列していた。残基1048-1063
はVEGFR2Δ50P中にモデル化できなかったけれども、明白な電子密度が残基Dl064
-El075に対して存在していて、これらの残基が非リン酸化FGFR1構造において観
察されるような立体配座に類似した立体配座を採用していることを明らかに示し
ている。D1064-P1068のセグメントは、触媒作用を有する残基D1028とR1032とに
隣接する拡張構造を有する(図３（Ａ）)。(MgAMP-PNP)ペプチド−IRKPコンプレ
ックス構造の構造を比較すると、このVEGFR2Δ50P構造中のR1066-P1068の位置は
、基質結合に対して抑制的であることが示される。P1066は、三元IRK3Pコンプレ
ックス構造中のペプチド基質のチロシン側鎖に割り付けられた等価スペ−スを占
有している。残基 L1069-E1075の立体配座は、三元IRKPコンプレックス構造中の
立体配座と類似しているが、２つの構造間のP1068 (P1172 IRK)で完全に方向が
変化している。IRK構造において、このプロリンに対してＮ末端の構造残基は、
αＥＦに対して向いているのに対して、VEGFR2Δ50Pにおいてはタンパクの反対
側のαＤに対して向いている(図２、図３)。

【００６２】結晶化前のY1059のリン酸化にもかかわらず、残基D1064-P1068に対してここで
見られた立体配座は、非リン酸化FGFR1構造における類似残基に対して観察され
た阻害的立体配座に類似している。VEGFR2Δ50のY1059は、タンパクチロシンキ
ナ−ゼの間の比較的に保存されたリン酸化部位に対応する。三元IRKPコンプレッ
クス構造とリン酸化リンパ球キナ−ゼ(Lck) 構造(Yamaguchi and Hendrickson,
1996)において、この位置のチロシン(Y1163 IRK, Y594 Lck)はリン酸化され、A-
loopは、リン酸化cAPK三元コンプレックス構造(Zheng et al., 1993)において観
察されたものと類似する非阻害的立体配座を有する。この位置でのホスフェ−ト
群が他のタンパク残基と行う相互反応は、基質とATPとの結合を可能にするA-loo
pの立体配座を安定化する助けになると信じられている(Johnson et al., 1996;
Hubbard, 1997)。しかしながら、ここに記載したこのVEGFR2Δ50構造は、同様な
オ−プンなA-loop立体配座を示さず、むしろル−プの多くが不秩序に配列してい
る阻害的立体配座を有しているので、VEGFR2Δ50Pのモノリン酸化A-loopは数個
の立体配座が関与する動的平衡状態で存在し、かつ、ここで観察された立体配座
はこの結晶環境において最も好ましいものであることが可能である。

【００６３】キナ−ゼインサ−トドメインキナ−ゼインサ−トドメインは、キナ−ゼＣ末端ロ−ブに発生し、ヘリックス
αＤとαＥとを結合する。VEGFR-2において、この領域はN933からL1000までの６
８残基の伸長に対応する (図1)。残基T940-E989の欠失による内因性キナ−ゼ活
性に対する上記したような効果の不足は恐らく驚くべきことではない。何故なら
ば、ＫＩＤドメインの端は、触媒部位から比較的離れたところ（約35−40Å）に
ありかつ活性化ル−プの位置のタンパクから反対側にある(図２−４)からである
。これらの結果はCSF-1レセプタ一キナ−ゼに対する結果と一致している。CSF-1
レセプタ一キナ−ゼに対する結果においては、CSF-1ＫＩＤの６４残基の５８残
基だけの欠失によってペプチド基質をリン酸化する能力が１０％ほど減少した(T
aylor et al., 1989)。しかしながら、βPDGFRの９８残基全て欠失させると、ペ
プチド基質に対するキナ−ゼ活性が８０％ほども減少した(Severinsson et al.,
(1990) Mol. Cell. Biol. 10, 801-809)。したがって、この発明は、合成触媒
リンカ−を生産することができる。その合成触媒リンカ−は、ＫＩＤの大部分が
触媒作用に対して必要ではなく、むしろ少数の残基だけが存在して、αＤとαＥ
との間のリンカ−を形成し、適切なキナ−ゼ構造を維持するようにしなければな
らない。

【００６４】 αＤに続くVEGFR2Δ50P構造において、残基N933-P937は、緩やかに曲がってい
て、その端がＣ末端でαＤとαＩとの軸に対してほぼ垂直になっている拡張鎖を
形成する。異なるフ−リエマップでは、電子密度は、残基N933-P937に対しては
強くはっきりしていて、Y938とK939（Y938とK939との側鎖はモデル化されていな
い）とに対しては弱くなっている(図５)。VEGFR2Δ50における５０残基の欠失は
、K939に直接続き、それによってK939の直ぐＣ末端の残基はV990であり、全長VE
GFR-2の残基番号を維持している。残基V990-K997の配列は秩序立ってなく、翻訳
可能な電子密度はD998でまた始まる。次いで、残基D998-T1001は、残基L1002で
αＥと結合する短鎖を形成する(図５と図６)。

【００６５】図５は、VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインの電子密度マップを示す
。2.4Åで算出し、1.2δで等高線を描き、精製したモデルと重ね合わせた2Fo-Fc
マップの立体図である。炭素原子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色
に描いた。水分子は赤十字に描写した。図はXfit (McRee et al., 1992)で作成
した。

【００６６】図６は、VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインを示す。VEGFR2Δ50Pのキ
ナ−ゼインサ−トドメインの秩序立って配列した残基を示す立体断面図。炭素原
子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色に、硫黄原子は緑色に描いた。
図は、図５から約１８０°回転した図であって、Xfit (McRee et al., 1992)で
作成した。

【００６７】ＫＩＤのＮ末端とＣ末端における２本の鎖は、他のキナ−ゼ構造のこの領域で
見られる立体配座とは異なる疑似２本鎖平行βシ−トの構造を形成する。したが
って、ＫＩＤの２つの端では、VEGFR-2におけるこのドメインの全体的なＫＩＤ
の立体配座と位置とを安定化する助けとなる種々の相互作用が行われる。K931の
側鎖は、E954の側鎖とのイオン相互作用を行い、またD998のバックボ−ンカルボ
ニルと水素結合する（図６）。鎖間の水素結合相互作用には、L1000 NH とのE93
4バックボ−ンC=O, L1000 C=OとのV936 NH、L1002 NH とのP937 C=O が含まれる
。これらの極性相互作用に加えて、F935、P937、L100の側鎖は広範な疎水性接触
に関与している。F935の側鎖は、L928, P937, L1000, L1002, L1005, L1001, Y1
130 の側鎖によって形成された疎水性ポケット中に存在する(図５、図６)。L100
0側鎖はまた、Y927, K931, H 1004, Y1008の側鎖に対して束になっている。

【００６８】本発明者によって、ＫＩＤの部分の欠失はまた修飾VEGFR-2ポリタンパクに対
してその他の有用でかつ望ましい特徴を付与する。修飾ポリペプチドは、溶液中
でより高温に曝されたときに、野生型タンパクよりもより高い安定性を示した。
さらに、修飾ポリペプチドはまた、野生型タンパクよりもより改良された溶解度
を示した。当業者にとっては、これらの性質がこの発明の種々の商業的側面を改
良できることは明らかである。修飾タンパクの潜在的な用途の例としては、遺伝
子チップ技術(Affymax, Inc,)、ファ−ジ・デイスプレイペプチド・ライブラリ
−(New England BioLabs, Inc.製The Ph.D. Kit)ならびにFT-NMR による深層分
析などに基づく種々の方法にするレセプタ−に対する潜在的リガンドの高能率ス
クリ−ニング（ＨＴＳ）が含まれる。

【００６９】したがって、ＫＩＤ全体が欠失でき、PDGFαとβのようなその他の関連ＲＴＫ
や、その他の上記したタンパク中にいくらかの触媒活性を保持することが考えら
れる。さらに、この発明の１つの実施形態においては、全体のＫＩＤを欠失して
、少なくとも１個のアミノ酸の合成触媒リンカ−と置換して、タンパクの触媒活
性と結晶化の両方を保持することもできる。

【００７０】 PDGFRαタンパクのクロ−ニングこの実施例においては、PDGFRαポリタンパクのクロ−ニングをVEGFR-2に対し
て上述した方法に従って行った。PDGFRαに対するコ−ド化配列は、Matsui, T.,
et al., (1989) Science 243:800-804 (Accession No. 66814)に記載した配列
から誘導した。次いで、タンパクの細胞質ドメインと触媒作用ドメイン中に位置
する残基を解読するPCRオリゴヌクレオチドプライマを作成した。PDGFRαの触媒
作用ドメインは、図１の残基689 (N)から始まり、残基791(T)で終了するように
示されている。

【００７１】クロ−ニングと精製工程の残りの工程は、VEGFR2Δ50タンパクに対して記載し
た工程と類似するものであってもよく、また当業者にとって公知の技術を使用す
ることもできる。ＲＴＫファミリ−の他の成員ならびに他の用途も使用することができ、かつ、
上記実施例に何ら限定されるものではない。

【００７２】「配列表」

【表３】

【００７３】「配列表」

【表４】

【００７４】「配列表」

【表５】

【００７５】「配列表」

【表６】

【００７６】「配列表」

【表７】

【００７７】

【表８】

【００７８】「配列表」

【表９】

【００７９】

【表１０】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 VEGFR2の触媒ドメインに対する２次的構造の指定（Procheckによる）と、その
他の代表的なＲＴＫとの配列連携を示す。

【図２（Ａ）】キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。

【図２（Ｂ）】キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。

【図２（Ｃ）】キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。

【図３（Ａ）】 VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。

【図３（Ｂ）】 VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。

【図４】 VEGFR2Δ50PとFGFR1の触媒作用部位を示す。

【図５】 VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインの電子密度マップを示す。

【図６】 VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインを示す。

【図７】結晶化とデータ収集工程におけるVEGFR2に対して得られたＸ線結晶座標。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３Ｇ０１Ｎ 23/20 // Ｇ０１Ｎ 23/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パラスト，カムランヴィー．アメリカ合衆国カリフォルニア州92109、サン・デイエゴ、ダイアモンド・ストリート1855、５−218号 (72)発明者ゲーリング，マイケルアール．アメリカ合衆国カリフォルニア州92115、サン・デイエゴ、コリエール・アベニュー 5468 (72)発明者カン，チェン−チェンアメリカ合衆国カリフォルニア州92014、デル・メール、ヂュランゴ・ドライブ 13951 (72)発明者アペルト，クルジスツトーフアメリカ合衆国カリフォルニア州92064、ポーウエイ、メープルウッド・ストリート 14500 (72)発明者ウッカシャム，ジョンエー．アメリカ合衆国カリフォルニア州92029、エスコンデイト゛、シェデイリッジ・アベニュー2426 (72)発明者ショウオルター，リチャードエドワードアメリカ合衆国カリフォルニア州92040、レイクサイド、コールデントップ・ドライブ13329 (72)発明者テムプツイズク−ラッセル，アンナマリアアメリカ合衆国カリフォルニア州92130、サン・デイエゴ、カミント・ボレーゴ4785 (72)発明者ムロズコウスキ，バーバラアメリカ合衆国カリフォルニア州92024、エンシニタス、ストラトフォード・ドライブ1066 (72)発明者ビラフランカ，ジーサスエルネストアメリカ合衆国カリフォルニア州92103、サン・デイエゴ、ウパス・ストリート1282 Ｆターム(参考） 2G001 AA01 BA18 CA01 EA01 GA01 KA08 LA01 RA02 2G045 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FA11 FA40 FB02 FB03 FB04 JA01 JA20 4B024 AA01 AA11 BA10 CA10 EA02 GA11 HA01 4B050 CC04 DD20 FF17 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ27 QR32 QR63

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】修飾レセプタ一チロシンキナ−ゼ（ＲＴＫ）ポリペプチドと
相互作用する能力について候補化合物をアッセイする方法であって、（ａ）該修飾ＲＴＫ遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくは
その変異型を発現する工程であって、該構築物においては、該修飾ＲＴＫ遺伝子
が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、前記ポリペプチドと前記候補物質と
の相互作用のためにアッセイをすることができるポリペプチドの型を産生するこ
とができるホスト中において、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ−ト
ドメイン（ＫＩＤ）からの少なくとも１個のアミノ酸からなる工程と、（ｂ）前記修飾ポリペプチドを前記候補物質に接触させる工程と、（ｃ）前記ポリペプチドと前記候補物質との相互作用を評価する工程とからな
ることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項２】請求項１に記載する方法において、前記評価工程が、（ａ）前記修飾ポリペプチドをＸ線結晶学的手法に適した条件下で結晶化する
工程と、（ｂ）前記Ｘ線結晶学的手法を前記ポリペプチドに施す工程とから更に構成さ
れていること。
【請求項３】修飾VEGFR-2レセプタ一ポリペプチドと相互作用する能力に
ついて候補化合物をアッセイする方法であって、（ａ）該修飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくは
その変異型を発現する工程であって、該構築物においては、該修飾VEGFR-2遺伝
子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、前記ポリペプチドと前記候補物質
との相互作用のためにアッセイをすることができるポリペプチドの型を産生する
ことができるホスト中において、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ−
トドメイン（ＫＩＤ）からの少なくとも１個のアミノ酸からなる工程と、（ｂ）前記修飾ポリペプチドを前記候補物質に接触させる工程と、（ｃ）前記ポリペプチドと前記候補物質との相互作用を評価する工程とからな
ることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項４】請求項２に記載する方法において、前記評価工程が、（ａ）前記修飾ポリペプチドをＸ線結晶学的手法に適した条件下で結晶化する
工程と、（ｂ）前記Ｘ線結晶学的手法を前記ポリペプチドに施す工程とから更に構成さ
れていること。
【請求項５】修飾ＲＴＫ遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列
もしくはその変異型であって、該構築物においては、該修飾ＲＴＫ遺伝子が合成
触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、ＲＴＫ遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ
−トドメインからの少なくとも１個のアミノ酸からなること。
【請求項６】修飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列
もしくはその変異型であって、該構築物においては、該修飾VEGFR-2遺伝子が合
成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼイ
ンサ−トドメインからの少なくとも１個のアミノ酸からなることを特徴とする修
飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくはその変異型。
【請求項７】請求項６に記載する単離オリゴヌクレオチド配列が配列番号
５に示すDNA配列もしくはその変異型からなること。
【請求項８】請求項６に記載する単離オリゴヌクレオチド配列が配列番号
６に示すDNA配列もしくはその変異型からなること。
【請求項９】修飾ＲＴＫ遺伝子ポリペプチドの活性に対するアゴニストも
しくはアンタゴニストである化合物を評価する方法であって、該ポリペプチドに
おいては、該修飾ＲＴＫ遺伝子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、該修
飾ＲＴＫポリペプチドの触媒領域のキナ−ゼインサ−トドメインからの少なくと
も１個のアミノ酸からなる方法が、（ａ）前記修飾ＲＴＫポリペプチドを結晶化する工程と、（ｂ）前記結晶化した修飾ＲＴＫポリペプチドに対して結晶学的座標を得る工
程と、（ｃ）前記修飾ＲＴＫポリペプチドに対する結晶学的座標をコンピュ−タアル
ゴリスムに適用して、前記アルゴリスムが、前記ポリペプチドに対するアゴニス
トもしくはアンタゴニストとして作用する分子を設計するのに使用するのが適し
た前記ＲＴＫポリペプチドのモデルを作成する工程と、（ｄ）反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなること。
【請求項１０】修飾VEGFR-2遺伝子ポリペプチドの活性に対するアゴニス
トもしくはアンタゴニストである化合物を評価する方法であって、該ポリペプチ
ドにおいては、該修飾VEGFR-2遺伝子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は
、該修飾VEGFR-2ポリペプチドの触媒領域のキナ−ゼインサ−トドメインからの
少なくとも１個のアミノ酸からなる方法が、（ａ）前記修飾VEGFR-2ポリペプチドを結晶化する工程と、（ｂ）前記結晶化した修飾VEGFR-2ポリペプチドに対して結晶学的座標を得る
工程と、（ｃ）前記修飾VEGFR-2ポリペプチドに対する結晶学的座標をコンピュ−タア
ルゴリスムに適用して、前記アルゴリスムが、前記ポリペプチドに対するアゴニ
ストもしくはアンタゴニストとして作用する分子を設計するのに使用するのに適
した前記VEGFR-2ポリペプチドのモデルを作成する工程と、（ｄ）反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなること。
【請求項１１】請求項１０に記載する方法において、前記修飾VEGFR-2ポ
リペプチドが配列番号５のVEGFR2Δ50ポリペプチドからなること。
【請求項１２】第８図のＸ線結晶学的座標を有するVEGFR-2遺伝子構築物
をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくはその変異型。
【請求項１３】Ｘ線結晶学的手法による測定に適するようにレセプタ一チ
ロシンキナ−ゼファミリ−のタンパクもしくはポリペプチドを作成する方法であ
って、（ａ）前記タンパクのキナ−ゼインサ−トドメインを同定すること、（ｂ）前記キナ−ゼインサ−トドメインから特定数のアミノ酸残基を欠失させ
て、該修飾ポリペプチドが安定した立体配座を有し、Ｘ線結晶学的手法による測
定に適する結晶状態を形成すること、（ｃ）前記修飾ポリペプチドを結晶化することを特徴とする方法。
【請求項１４】ＲＴＫポリペプチドと相互作用をする化合物の医薬品設計
方法であって、（ａ）目標ＲＴＫポリペプチドのＫＩＤ部分を欠失させること、（ｂ）前記目標ＲＴＫポリペプチドを結晶化すること、（ｃ）前記目標ＲＴＫポリペプチドのＸ線結晶を解像すること、（ｄ）前記目標ＲＴＫポリペプチドのＸ線結晶解像から得られたデ−タを、前
記ポリペプチドに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子
設計に使用するのに適する前記目標ＲＴＫポリペプチドのモデルを作成するコン
ピュ−タアルゴリスムに適用すること、（ｅ）反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなることを特徴とする方法。
【請求項１５】修飾VEGFR-2ポリペプチドと相互作用をする化合物の医薬
品設計方法であって、（ａ）該修飾VEGFR-2ポリペプチドのＫＩＤ部分を欠失させること、（ｂ）前記修飾VEGFR-2ポリペプチドを結晶化すること、（ｃ）前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのＸ線結晶を解像すること、（ｄ）前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのＸ線結晶解像から得られたデ−タを、
前記ポリペプチドに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分
子設計に使用するのに適する前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのモデルを作成する
コンピュ−タアルゴリスムに適用すること、（ｅ）反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記修飾VEGFR-2ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくは
アンタゴニストを同定する工程とからなることを特徴とする方法。
【請求項１６】請求項１５に記載する方法において、前記修飾VEGFR-2ポ
リペプチドが配列番号５のVEGFR2Δ50ポリペプチドであること。