KR20010086386A

KR20010086386A - 혈관 내피세포 성장인자 수용체-2 단백질의 변형 및사용방법

Info

Publication number: KR20010086386A
Application number: KR1020017003019A
Authority: KR
Inventors: 미첼에이. 맥틱; 크리스 핀코; 캠런브이. 패러스트; 마이클알. 제링; 첸-첸 칸; 크지스즈토프 에이펠트; 존에이. 위커섐; 리차드에드워드 쇼월터; 안나-마리아 템프직-러셀; 바바라 로츠코프스키; 지저스어네스토 빌라프란카
Original assignee: 개리 이. 프라이드만; 아구론 파마슈티컬스, 인크.
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2001-09-10
Also published as: EP1109823A1; US20020164641A1; US20020127538A1; ATE310018T1; AU760008B2; US6784285B1; EP1109823B1; CA2340598A1; AU5809399A; KR100442221B1; DE69928411D1; US6316603B1; WO2000014105A1; US6849721B2; EP1109823A4; US6794146B2; ES2252972T3; JP2002534058A; US20020051965A1; US6753416B2

Abstract

혈관 생성에서의 주요 효소인 혈관 내피세포 성장인자 수용체 2 (VEGFR 2/KDR)의 촉매반응 키나제 영역을 포함하는 단백질 구성의 2.4Å 결정구조가 배위되지 않고 인산화된 상태에서 결정되었다. 이 단백질 구성은 변형된 촉매반응 링커를 포함하고, 생체외 키나제 활성이 전체 KID를 포함한 구성과 비슷하다. 결과적인 구성체는 야생형 KID의 것과 비슷한 생체외 키나제 활성을 보유하며, 더 중요하게는 X선 결정법으로 구별할 수 있도록 단백질의 완전한 결정화를 허용한다. 본 발명은 여러 질병 상황의 치료에서 가능한 치료 화합물의 확인과 구성을 위한 X선 결정학 데이터의 사용을 개시한다.

Description

혈관 내피세포 성장인자 수용체-2 단백질의 변형 및 사용방법{Modifications of The VEGF Receptor-2 Protein and Methods of Use}

배아 발생, 기관 발달, 발정, 상처 치유를 포함하는 많은 생리학적인 사건은 혈관의 성장 및 변형을 필요로 한다(Folkman et al., (1992)J. Biol. Chem.267, 10931-10934; Risau, W. (1995) FASEB J. 9, 926-933 참조). 이와 같은 유익한 과정이외에, 혈관생성은 종양 성장, 전이, 건선, 류머티스성 관절염, 반점 퇴화 및망막증과 같은 질병 상태의 증식과도 관련되어 있다(Pepper, M.S., (1996)Vasc. Med.1, 259-266; Kuiper et al., (1998)Pharmacol. Res.37, 1-16, 1998; Kumar and Fidler, (1998)In Vivo18, 27-34; Szekanecz et al., (1998)J. Investig. Med.46, 27-41; Tolentino and Adamis, (1988)Int. Ophthalmol. Clin.38, 77-94 참조). 혈관생성에 영향을 주는 것으로 알려진 신호 경로들 중에서도, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)를 수반하는 것들이 필수적이며 혈관 내피 세포에 선택적이라는 것이 알려져 있다(Dvorak et al., (1995)Am. J. Path.146, 1029-1039; Thomas, K., (1996)Cell271, 603-606; Ferrara N. and Davis-Smyth, (1997)Endocrine Rev.18, 4-25 참조). VEGF 경로를 억제하는 것의 치료학적 가능성은, 다양한 인간 종양(Borgstrom et al, (1996)Cancer Res.56, 4032-4039 참조)과 허혈성 망막질환(Adamis et al., (1996)Arch. Ophthalmol.114, 66-71 참조)에 대해 활성을 보이는 항VEGF 단일클론 항체에 의해, 직접 입증된 바 있다.

정상적인 혈관형성(vasculogeulsis)과 혈관생성(augiogeuesis)은 태아 발달, 상처 치유, 기관 재생과 배란 중의 황체에서 난포 발달과 임신 후의 태반 성장과 같은 여성 생식 과정 등의 여러 생리학적인 과정에서 중요한 역할을 한다(Folkman & Shing, 1992 참조). 통제되지 않은 혈관형성 및/또는 혈관생성은 당뇨병과 같은 질병은 물론, 혈관화(vascularization)에 그 성장이 의존하는 악성 충실성 종양(malignant solid tuwors)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Klagsburn & Soker, (1993)Current Biology3(10):699-702; Folkham, (1991)J. Natl. Cancer Inst.82:4-6; Weidner, et al., (1991)New Engl. J. Med.324:1-5 참조).

생체외 내피세포 성장 촉진 활성을 가진 여러 종류의 폴리펩티드가 확인된 바 있다. 예를 들면, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자(FGF, Fibroblastic Growth Factor), 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)와 태반 성장인자 등이다. FGF와 달리, VEGF는 내피세포 특이성 유사 분열물질이라고 최근에 보고된 바 있다(Ferrara & Henzel, (1989)Biochem. Biophys. Res. Comm.161:851-858; Vaisman et al., (1990)J. Biol. Chem.265:19461-19566 참조).

그러므로, VEFG가 결합하는 특이성 수용체를 확인하는 것은 내피세포 증식의 조절을 이해하는데 중요하다. 구조적으로 연관된 두 개의 티로신 키나제가 높은 친화력으로 VEGF와 결합하는 것으로 확인되는데 그 중 하나는 flt-1 수용체(Shibuya et al., (1990)Oncogene5:519-524; De Vries et al., (1992)Science255:989-991 참조)이고 나머지 하나는 여기에서 논의하는 KDR/FLK-1 수용체이다. 결과적으로, 내피세포 증식의 조절과 통제에 있어 RTK가 모종의 역할을 하고 있다고 추측되어 왔다.

미국특허출원 08/193,829호, 08/038,596호 및 07/975,750호에 기재된 정보와 같은 최근의 공개 정보들은 VEGF가 내피세포 증식으?? 원인이 될 뿐 아니라 정상적인 그리고 병리상의 혈관생성의 주요 조절자라는 것을 강력히 제시하고 있다. 일반적인 것은 Klagsburn & Soker, (1993)Current Biology3:699-702; Houck, et al., (1992)J. Biol. Chem.267:26031-26037를 참조할 것.

VEGF는 최소한 4개의 121-206 잔기의 접합-변형(splice-variant) 형태로 나타나는 호모다이머릭 사이토킨(homodimeric cytokine)이다(Ferrara and Davis-Smyth, 1997 참조). 혈관 내피세포는 적어도 2개의 VEGF 즉, VEGF-R1/Flt-1과 VEGFR-2/KDR를 위한 고친화력 수용체를 발현한다. VEGF-R1 및 VEGFR-2는 각각이 7개의 면역글로블린 류의 단편을 포함하고 VEGF와 결합하는 세포외 도메인과, 짧은 세포막 스패닝 영역과, 티로신 키나제 활성을 가진 세포질 도메인으로 구성되는 수용체 티로신 키나제이다. 키나제 도메인은 세포외 및 막옆(juxtamembrane) 영역 바로 뒤에 있고, 그 뒤에는 다른 도메인(포스트 키나제 도메인)이 뒤따르는데, 이 도메인은 이 키나제 영역을 다시 신호 형질 도입을 위한 다른 단백질과 결합에 기능을 수행할 수도 있다. 이 두 수용체들은 내피세포의 유사분열에서 가장 중요한 VEGFR-2와 다른 신호 경로 및 기능을 가지는 것으로 보인다(Waltenberger et al., (1994)J. Biol. Chem.269, 26988-26995; Seetharm et al., (1995)Oncogene10, 135-147; Shalaby et al., (1995)Nature376, 576-579 참조).

FGF와 VEGF는 모두 새로운 모세혈관 형성을 유발하는 유력한 혈관생성 인자이다. 사람의 유방암 세포계 MCF-7에 FGF를 트랜스펙션하게 되면, 무모마우스(nude mouse)에 주사(s.c.)하였을 때 진행성 발육 및 전이성 암을 형성하는 세포계가 나타난다. FGF는 유방암이 에스트로겐-무관, 항 에스토로겐 저항성 전이성 표현형으로 진행되는데 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다(McLeskey et al., (1993)Cancer Res.53: 2168- 2177 참조). 유방암 세포는 트랜스펙트되지 않은 암보다 생체 내에서 증가된 혈관신생이 증가되고 자발적 전이성이 증가되며 더욱 성장이 빨라지는 것을 나타낸다. FGF는 NIH-3T3 세포에서 변형되며 종양형성과 쥐유암(mouse mammary tumor)의 전이에 관련이 있는 것으로 밝혀진 바 있다.FGF 과발현(overexpression)은 사람의 부신암종 세포계에 종양형성 표현형을 주는데, 이는 FGF가 내피세포의 변형에 역할을 할지 모른다는 추측을 가능케 한다. FGF에 대한 다클론 중화 항체는 Balb/c 무모마우스에서 암을 형성하는 K100 세포(bFGF의 선도 서열로 트랜스펙트된것)로 이식한 Balb/c 무모마우스에서 암 성장을 억제하였다(Hori et al., (1991)Cancer Res.51: 6180-9184 참조).

혈관신생, 종양형성 및 전이에서의 FGF의 역할로 인해, 당 업계에서는 FGF의 세포내 신호를 방해함으로써 항 FGF 활성을 나타내는 효능있는 항암제로의 FGF 억제제가 요구되고 있다.

이에 반해서, VEGF는 내피세포 특이성 유사분열물질로서, 다양한 암세포에서 방출되고 인간 암세포 원위치에서 발현되는 혈관생성 유도인자이다. FGF와 달리, VGEF를 인코딩하는 cDNA 서열로 세포계를 트랜스펙션하는 것은 형질전환을 촉진하는 것이 아니라 생체 내의 종양 성장을 촉진한다(Ferrara, N., and Davis-Smyth, T. (1997) 참조). 더욱이, VEGF를 중화하는 다클론 항체의 투약도 무모마우스에서 사람의 횡문근육종, 교모세포종 다형과 평할근육종 세포계의 성장을 억제했다(Kim et al., (1993)Nature362: 841-843 참조).

내피세포 증식과 혈관생성의 가능성 및/또는 혈관형성의 통제, 조절 및 조정에 대한 수용체 티로신 키나제(RTKs)의 중요성을 고려하여, 다양한 접근법에 의해 RTK 억제제를 확인하기 위해 수많은 시도가 이루어졌는데, 이러한 접근법에는 돌연변이 리간드의 사용(미국 특허 4,966,849호), 수용성 수용체와 항체의 사용 국제특허출원(WO94/10202호; Kendall & Thomas, (1994)Proc. Natl. Acad. Sci.90:10705-09; Kim, et al., 1993), RNA 리간드의 사용(Jellinek, et al., (1994)Biochemistry3:10450-56), 단백질 키나제 C 억제제의 사용(Schuchter, et al., (1991)Cancer Res.51:682-687); Takano, et al., (1993)Mol. Bio. Cell4:358A; Kinsella, et al., (1992)Exp. Cell Res.199:56-62; Wright, et al., (1992)J. Cellular Phys.152:448-57)및 티로신 키나제 억제제의 사용(WO94/03427; WO92/21660; WO91/15495; WO94/14808; 미국특허 5,330,992호; Mariani, et al., (1994)Proc. Am. Assoc. Cancer Res.35:2268)이 포함된다.

보다 최근에는, 티로신 키나제 억제제로 작용하는 작은 분자를 확인하기 위한 시도들이 행해졌다. 예를 들어, 비스 단일고리, 이중고리 또는 헤테로고리 아릴 화합물(PCT WO92/20642), 비닐렌-아자인돌 유도체(PCT WO94/14808)와 1-싸이크로프로필-4-피리딜-퀴놀론(미국특허 5,330,992호)이 티로신 키나제 억제제로서 일반적으로 기술되어있다. 스티릴 화합물(미국특허 5,217,999호), 스티릴 치환 피리딜 화합물(미국특허 5,302,606호), 일부 퀴나졸린 유도체(유럽특허출원 0 566 266 A1), 셀레노인돌 및 셀레노이드(PCT WO94/03427), 삼중고리 폴리하이드로옥실 화합물(PCT WO92/21660)과 벤질 포스포닉산 화합물(PCT WO91/15495)은 암 치료에 쓰이는 티로신 키나제 억제제로 사용되는 화합물로 기술된 바 있다. 그렇지만, 이들 화합물 중 어떤 것도 이전까지 VEGFR-2 수용체의 효소적 기능과 연관시켜진 적이 없다. 마찬가지로, 이들 화합물 중 어떤 것도 혈관생성 및/또는 혈관형성의 조절과 연관시켜진 적이 없다.

그러므로, 당업계에서는 PDGF, FGF, EGF와 VEGF 경로의 작은 분자 길항제를개별적으로 또는 그룹으로써 개발할 필요가 있다. 더욱이, 이들 사이토킨이 세포내에서 통상적인 2차 전령 경로를 통해 신호를 보낸다면, 이와 같은 길항제는 관상 레스테노시스, 종양 관련 혈관생성, 죽상경화증, 자가면역 질환, 급성 염증, 사구체 또는 혈관 간세포의 증식과 관련된 신장질환, 망막혈관 증식과 관련된 안과 질환 등과 같은 다양한 질병의 진행을 방해하거나 치료하는 광범위한 치료적 활성을 가질 것이다. 본 발명은 공통적인 신호 메카니즘과, 다수의 그리고 다양한 효과예측 시험에 의해 활성을 갖는 것으로 밝혀진 활성 치료 작용제 그룹과, 공통적인 세포간 신호 중간체를 발견함으로써 이루어졌다.

서열 상동성과 전반적인 도메인 구조를 토대로, VEGFR은 혈소판-유도 성장인자 수용체 계통(PDGFR)에 속해지는데, 이 계통은 PDGFR, PDGFR, 간세포(stem cell) 성장인자 수용체(c-kit)및 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R/c-fms)도 포함한다(van der Geer et al., (1994)Ann. Rev. Cell Biol.10, 251-337 참조). 다른 단백질 키나제와 비교해볼 때, 이 계통의 멤버들은 다른 단백질 키나제에 대응하는 촉매반응 키나제 도메인 내에서 키나제 삽입영역(KID)이라고 부르는 약 65-97 잔기의 삽입을 포함한다. PDGFR 계통 내에서, KID는 길이가 서로 다르고 낮은 서열 상동성을 가진다. PDGFR, PDGFR, c-kit 및 CSF-1R로부터 KID를 결실 또는 돌연변이시킴으로써 이 도메인이 본질적인 키나제 활성에 필요한 것은 아니고 신호 형질도입에 관여되는 다른 단백질의 KID 티로신 잔기의 자동 인산화 반응을 통한 결합에 중요하다는 것을 알 수 있었다(Taylor et al., (1989)EMBO J.8, 2029-2037; Heidaran et al., (1991)Mol. Cell. Biol.11,134-142; Yu et al., (1991)Mol. Cell, Biol.11, 3780-3785; Kazlauskas et al., (1992)Mol. Cell. Biol.12, 2534-2544; Lev et al., (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 678-682; Reedjik et al., (1992)EMBO J.11, 1365-1372; Bazenet et al., (1996)Mol. Cell. Biol.16, 6926-6936 참조). KID의 신호 경로와 특이성 역할이 VEGFR에 대해 아직 완전히 결정되지는 않았지만, VEGFR-2 KID는 자동 인산화 반응 위치로 알려진 두 개의 티로신을 포함한다(Dougher-Vermazen et al., (1994)Biochem. Biophys. Res. Comm.205, 728-738 참조).

첫번째 고리 모양의 AMP-의존성 단백질 키나제(cAPK) 구조의 결정(Knighton et al., (1991)Science253, 407-413 참조) 이후로, 다양한 단백질 키나제 구조가 보고되었다(Johnson et al., (1996)Cell85, 149-158에서 검토되었음). 수용체 단백질 티로신 키나제들(RTKs) 중에서도, 인슐린 수용체(IRK)(Hubbard, et al., (1994)Nature372, 746-754; Hubbard, (1997)EMBO J.16, 5572-5581 참조)와 섬유아세포 성장인자 수용체-1(FGFR-1)(Mohammadi et al., (1996)Cell86, 577-87; Mohammadi et al., (1997)Science276, 955-960 참조)의 키나제 도메인의 구조가 결정된 바 있다.

본 발명은 혈관 내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor) 수용체-2(VEGFR-2)의 촉매반응 키나제 지역의 핵심 부분을 클로닝, 서열화 및 X선 결정학을 통해 단리하는 것을 개시한다. 또한, 본 발명은 키나제 삽입 도메인(KID, kinase insert domain)이라 칭해지는 촉매반응 영역으로부터 여러 아미노산 잔기들을 결실(deletion)하는 것도 개시한다. 결과적인 폴리펩티드는 야생형 KID와 비교하여 견줄만한 생체외 키나제 활성을 유지하며 폴리펩타이드의 촉매반응 활성에 필수불가결하지는 않은데, 더욱 중요한 것은 X선 결정학 방법으로 구조결정이 가능하도록 단백질이 완전히 결정화되게 해준다는 것이다. 아울러, 본 발명은 VEGFR-2와 관련된 여러 질병 상태의 치료에 쓰이는 치료용 화합물의 식별과 구성에 유용한 X선 결정학 자료를 개시한다.

도 1은 VEGFR2의 촉매반응 영역을 위한 2차 구조 할당(프로첵(Procheck)에 의해 제공됨)과 다른 대표적 수용체 티로신 키나제와의 서열 정열을 보여준다. 나선은 B-1으로 나타내었고, β가닥은 1-8로 나타낸다. VEGFR2 50에서 50 잔기 결실의 위치는 1로 나타낸다. VEGFR2D50에서 E990 돌연변이 위치는 *로 표시한다. 서열은 다음과 같이 구할 수 있다.: VEGFR2(여기에 기록됨); FGFR1(스위스 단백질 데이터베이스 #P11362); IRK(EMBL 단백질 데이터베이스 #A18657; 번호 매기는 방법은 Mohammadi et al., 1996 에서와 같음); VEGFR1(스위스 단백질 데이터베이스 #P17948); PDGFR(스위스 단백질 데이터베이스 #P17948)

도 2는 VEGFR2 50P, FGFR1과 IRKP의 전체 주름을 나타내며, (A) VEGFR2(VEGFR2 50P), (B) FGFR1 (PDB 엔트리 1FGK의 A 분자, Mohammadi et al., 1996 참조)와 (C) IRKP (PDB 엔트리 11R3, Hubbard et al., 1997 참조)의 키나제 영역의 구조의 중심을 나타낸다. A, B와 C에 보인 시계는 C-단말 영역의 중첩에서 발생하는 시계와 동일하다. 말단의 위치는 N과 C로 나타낸다. 뉴클레오티드 결합 고리(오렌지색), 키나제 삽입 영역(분홍색)과 활성 고리(노란색)는 밝게 강조하였다. (C)에서 묶인 AMP-PNP는 녹색으로 나타내고 펩티드 기질은 빨간색으로 나타내었다. 그림은 INSIGHT II를 이용하여 생성되었다.

도 3은 VEGFR2 50P와 IRKP의 촉매반응 부위를 나타내며, (A) VEGFR2 50P와 (B) IRKP (PDB 엔트리 1IR3; Hubbard et al., 1997 참조) 구조의 촉매반응 부위의 단면도이다. 원자는 원소형에 따라 색을 칠하였다: 탄소(녹색), 산소(빨간색), 질소(파란색), 황(노란색), 인(분홍색) 그리고 마그네슘 이온(오렌지색). (A)는 단백질 원자만 포함한다. (B)는 단백질 원자, AMP-PNP 원자 그리고 Mg²⁺이온을 포함한다. 그림은 INSIGHT II를 이용하여 생성되었다.

도 4는 VEGFR2 50P 와 FGFR1의 뉴클레오티드 결합 부위이며, C 자취와 VEGFR2 50P와 FGFRI-(AMP-PCp) 착물(분자 B, Mohammadi et al., 1996 참조) 구조의 뉴클레오티드 결합 부위의 중첩된 측쇄를 나타내는 입체도이다. 중첩은 C 말단 로브(lobe)의 나선(D,E,F,G,H 및 I)의 C 위치를 사용하였다. VEGFR2 50P의 탄소 원자는 노란색으로, FGFR1의 탄소 원자는 보라색으로 나타내었다. 다른 단백질 원자에 대한 색깔: 산소(빨간색), 질소(파란색) 및 황(노란색). FGFR1 구조에서의 AMP-PCP는 오렌지색으로 그렸다. 표지는 VEGFR2 50P 잔기에 대응한다. 그림은Xfit(McRee et al., (1992) J. Mol. Graph. 10, 44-46. 참조)을 이용하여 생성되었다.

도 5는 VEGFR2 50P의 키나제 삽입 영역 면적의 전자 밀도 지도이다. 2.4Å에서 계산되고 1.2에서 윤곽을 잡고 정밀화된 모형과 중첩된 2Fo-Fc 지도의 입체 도이다. 탄소 원자는 노란색, 산소 원자는 빨간색, 질소 원자는 파란색이다. 물 분자는 붉은 색 십자가로 그렸다. 그림은 Xfit(McRee et al., 1992 참조)을 이용하여 생성되었다.

도 6은 VEGFR2 50P의 키나제 삽입 영역으로, VEGFR2 50P의 키나제 삽입 영역의 정돈된 잔기를 보이는 입체 단면도이다. 탄소 원자는 노란색, 산소 원자는 빨간색, 질소 원자는 파란색이며, 황 원자는 초록색이다. 관측 방향이 도 5에서 대략 180°정도 회전되었다. 도면은 Xfit(McRee et al., 1992 참조)으로 작성되었다.

도 7은 결정화와 데이터 수집 부문에서 밝혀진 방법에 기초한 VEGFR-2에 대한 결과적인 X선 결정학 좌표를 보여준다.

본 발명은 68 잔기 KID의 18 잔기를 포함하는 VEGFR-2 단백질의 변형된 키나제 도메인의 발생, 동적인 특징부여 및 구조 결정을 개시한다. 이 인산화된 VEGFR-2 촉매반응 영역의 2.4 Å 결정 구조는 PDGFR 계통의 키나제 도메인에 대해 첫번째로 보고 되는 구조이다. 이 구조는 다른 PDGFR 멤버들과도 관련이 있을 수있는 VEGFR-2의 KID 영역의 지향성에 대한 통찰력을 제공한다. 더욱이, VEGFR-2 키나제의 억제는 광범위한 임상 응용을 갖기 때문에, 이 구조는 치료제로서의 소분자 VEGFR-2 억제제의 구조기반 설계를 위한 타겟의 3차원 구조 묘사를 제공한다.

본 발명의 목적은 X-선 결정학 데이터의 분자모델링을 사용하여 후보 화합물의 결합을 모델링하여, 수용체 티로신 키나제 계통(RTK)에 포함될 수 있는 여러 단백질의 촉진제 또는 길항제로의 후보 화합물을 RTK와 특히 VEGFR-2 수용체의 결정화에 의해 효과적으로 스크리닝하는 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

(1) 당뇨병 망막병증, 해면상혈관종, 카포시육종, 내피유사세포로 구성된 종양과 암세포의 성장 등이 새로이 공급되는 혈액으로 전파되는 것을 치료 또는 진행을 방해하는데 유용한 새로운 혈관의 형성을 억제하는 것; (2) 당뇨병성 사구체 경화증과 여타의 다양한 종류와 병원체의 사구체신염을 치료 또는 진행을 방해하는데 유용하도록, 사이토킨에 의해 유발되는 혈관 간세포 및/또는 사구체 내피세포 증식으로 인한 신장 질환의 발달을 억제하는 것; (3) 윤활세포의 증식으로 인한 류마티스성 관절염을 수반하는 관절 파손을 방지하는 것; (4) 각질 세포의 증식 및 염증 세포의 누적으로 인한 건선의 증상 발현을 억제하는 것; (5) 혈관확장에 따른 관상혈관 또는 다른 동맥혈관의 레스테노시스와 관련된 죽상생성의 가속화 억제하는 것; (6) 죽상생성과, 죽상생성으로 인한 관상동맥 질환 및 다른 혈관 질환을 억제하는 것; (7) her-2-neu 수용체의 과대발현을 통해 자극되는 유방암과 같은 종양을 치료 또는 진행을 방해하는데 유용하도록, PDGF, FGF EGF 또는 VEGF 같은 다른 사이토킨에 대해 파라크린 또는 오토크린에 의해 중개되는 응답을 통해 종양이 성장하는 것을 억제하는 것;과 같은 활성을 가지는 잠재적인 치료용 화합물을 설계하고 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 본 발명의 방법은 신호 형질도입을 억제하는 화합물의 투여를 포함한다.

본 발명은 반복에 의한 약품 설계 과정에 사용되는 방법을 개발하는데 유용하다. 상기 과정은, VEGFR-2 수용체에 결합하여 그 효능을 향상시키는 신약 후보 분자의 새로운 설계에 의해, VEGFR-2에 대해 가능성이 있는 촉진제와 길항제를 확인한다. 여기에서 공개되는 X선 결정학 좌표들은 촉매반응 부위와 VEGFR-2 단백질의 약품 결합 부위의 3차원적 모델의 생성을 가능하게 해준다.

새로운 설계는, 기초과 될 유사구조를 참조하지 않고서, 단편 또는 원자를 구성하고 입체적 및 정전기적 상보성을 토대로 부위에 연결시키는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분자를 발생시키는 것으로 주로 이루어진다. 약품 설계 과정은 타겟 RTK의 구조가 적어도 2.8Å의 해상도로 해석된 이후에 시작된다. 제 위치에 "고정된" 물분자를 이용하여 2.5Å 또는 그 이상의 해상도로 구조를 정밀화한 것은 약품 설계를 시도하기 위한 보다 최적의 조건을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 RTK 계통에서 단백질의 KID를 확인하고, 단백질이 결정화되어 X선 결정학적 수단으로 측정하기에 적합하도록 상기 KID의 결실을 발전시키는 것이다.

본 발명의 다음 목적은 결과 폴리펩티드 생성물의 유리한 물리적 특성을 파악할 수 있도록 하기 위하여, KID 영역으로부터의 아미노산을 결실함으로써 PDGF, EGF, VEGF와 같은 RTK 유전자 계통의 일원으로부터의 KID 영역을 변형하는 과정을개시하는 것이다. 이와 같은 유리한 물리적 특성의 예로는 용해도 증가와 폴리펩티드가 핵자기공명, 고효율 스크리닝, 생화학적 특성화, X선 결정학, 열량측정법 및 다른 진단 도구에 의한 분석에 적합하도록 해주는 온도 변화에 대한 안정성 증가를 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 잠재적으로 나노몰(10억분의 1몰)의 효능을 가진 신약후보분자의 새로운 설계에 의해 RTK 계통의 단백질에 대한 가능성 있는 촉진제와 길항제의 약품설계 과정에 사용되는 스크리닝 방법을 개발하는 것이다. 결실에 의해 돌연변이된 KID와 상기 RTK 계통 단백질의 그밖의 다양한 결실에 기초하여 밝혀지는 X선 결정학 좌표는 RTK 계통 단백질의 활성 결합 부위의 3차원적 모델 생성을 가능하게 해준다.

VEGFR-2 단백질의 클로닝

VEGFR-2의 세포질 영역에 대한 코딩 서열(Terman et al., (1992)Biochem Biophys. Res. Commun.187, 1579-86 참조)은 인간 대동맥 cDNA 풀(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 PCR(Mullis et al., (1986).Biotechnology24, 17-27 참조)에 의해 증폭되었다. 두 개의 중첩 서열을 독립적으로 증폭하였다. 이 중첩 서열은 전체 세포질 도메인을 나타내는 Vcyt(잔기 M806-V1356)와 인슐린 수용체 키나제 촉매반응 도메인(Wei et al., (1995)J. Biol. Chem.270, 8122-8130 참조)과 함께 주 아미노산 서열 정열에 기초한 경계를 가진 Vcat(잔기 C817M-G1191)이다.

Vcyt에 대한 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다.:

Vcyt5 5'-CAGCATATGGATCCAGATGAACTCCCATTGG-3' (서열번호 1) 및

Vcyt3 5'-GCGGTCGACTTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTG-3' (서열번호 2).

Vcat를 위한 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다.:

Vcat5 5'-GCACATATGGAACGACTGCCTTATGATGCCAGC-3' (서열번호 3) 및

Vcat3 5'-CCTGTCGACTTATCCAGAATCCTCTTCCATGCTCAAAG-5'(서열번호 4).

증폭된 DNA는 제한효소 Ndel과 Sall로 소화시키고, E. coli 플라스미드 pET24a (Novagen Madison, WI)속으로 결찰한 후 서열을 확인하였다. 젠뱅크(Genbank)의 원래의 VEGFR-2 서열(기탁번호: 346345)과 비교해볼 때, Vcyt와 Vcat 모두에서 코돈 교환(Glu848-Val 및 Asn835-Lys)을 가져오는 두 개의 뉴클레오티드 차이가 주목되었다. 우리의 서열은 후속된 VEGFR-2 젠뱅크 기탁본(기탁번호 2655412 및 3132833)와 합치되었다.

(Bio-Rad Hercules, CA)사의 Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit를 사용하여 올리고뉴클레오티드 부위 지향 돌연변이유발(Kunkel, 1985 참조)에 의해 돌연변이를 도입하였다. Vcat DNA 단편은 Ndel-Xhol 다이제스트를 사용하여 pET24a 벡터로부터 벡터 pMGH4(Schoner et al., 1986, Kan et al., 1992 참조) 서브클론하고, 이 벡터를 사용하여 장비(kit)에 제공되는 E. coli 가닥 CJ236에 ssDNA 우라실 주형(결손 가닥)을 생성하였다. 올리고(5'-CTCAGCAGGATTGATAAGACTACATTGTTC -3')를 설계하여 잔기 D1171에서 C 말단을 절단하는 구성체(Vcat(G1172-G1191))을 생성하였다. 또 하나의 올리고(5'-GAATTTGTCCCCTACAAGGAAGCTCCTGAAGATCTG-3')를 설계하여 FGFR1(Mohammadi et al, 1996 참조)의 서열 정열을 토대로 삽입 키나제 도메인의 중앙 50 잔기(잔기 T940-E989)를 제거하였다. 서열 분석에서 우연한 Glu990-Val 돌연변이가 발견되었다. 모든 DNA 변형 및 제한 효소는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)에서 구입하였고 올리고뉴클레오티드는 제노시스 바이오 테크놀로지(Genosys Biotechnology)에서 구입하였다.

필요한 돌연변이들을 바큘로바이러스 발현 벡터 pAcSG2 (Pharmingen San Diego, CA)로 결합하기 위하여 VEGFR2 50 구성체를 몇 가지 단계로 만들었다. 단계 1; Vcyt에 대한 코딩 영역을 pET24a 벡터로부터 벡터 pAcSG2의 Ncol-Kpnl 부위로 PCR 서브클론하였다. 단계 2; 플라스미드 pMGH4-Vcat(T940-E989, E990V)로부터의 2358bp ScaI-BgIII DNA 단편을 pMGH4-Vcat(G1172-G1191)로부터의 1695bp BgIII-ScaI DNA 단편으로 결찰하여, pMGH4-Vcat(T940-E989, E990V, G1172-G1191) 벡터를 생성하였다. 단계 3; pMGH4-Vcat(T940-E989, E990V, G1172-G1191)로부터의 913bp BstEII-EagI DNA 단편을 pAcSG2-Vcyt로부터의 3290bp EagI-BstEII DNA 단편으로 결찰하여, pAcSG2-Vcyt(T940-E989, E990V, G1172-G1191)를 생성하였는데, 이것을 VEGFR2 50 이라고 칭하기도 한다. 이 마지막 구성체의 서열을 전체 코딩 지역에 걸쳐 검증하여 야생형 서열(도 1에 도시된 서열)로부터의 이들 공지된 돌연변이만 포함하는 것을 확인하였다.

DNA 인코딩 VEGFR2 50을, 제작업체(Pharmingen, San Diego, CA)의 프로토콜에 따라서 선형화된 바큘로바이러스 DNA와 함께 Sf9 세포로 트랜스펙트하였다. 단 하나의 플라크(plaque)를 이 트랜스펙션에서 단리하고 높은 역가의 스톡들을 발생하였다. 모든 스톡을 바큘로바이러스 DNA의 단리와 다면체 순방향 및 역방향 프라이머(Invitrogen)를 사용한 삽입의 PCR 증폭으로 검사하였다. Sf21 세포를 MOI=5에서 72시간 동안 1-1.5 백만 세포/mL의 속도로 감염시키고 원심분리기로 수확하였다.

Sf 21 세포로부터의 VEGFR2 50의 정제

세포 펠렛을 20nM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT 및 5% (v/v) 글리세롤하에서 다운스 균질화 및 초음파분해로 용해된다. 용해액을 Ti45 회전자에서 35,000rpm으로 50분간 원심분리하였다. 용해된 부분을 40 ml Q-30 음이온 교환 컬럼(Pharmacia)에 적재하고 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT 및 5%(v/v) 글리세롤에 NaCl을 20 mM에서 600 mM까지 변화를 주어 20 컬럼 부피로 용출시켰다. VEGFR2 50 단백질을 SDS-PAGE 겔 분석에 의해 그리고 가스트린 기질 펩티드 기질(Boehringer Mannhelm)에 대해 측정한 키나제 활성의 존재에 의해 저장되었다. 저장된 물질은 40 mL 하이드로옥시아파타이트(Bio-Rad) 컬럼에 채워지고 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM DTT와 5% 글리세롤로 철저하게 세정되었다. 단백질은 선형 기울기로 0에서 50 mM의 인산 칼륨 pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM DTT와 5% 글리세롤 500 mL로 용출시켰다. VEGFR2 50 단백질은 SDS-PAGE 겔 분석과 가스트린 기질 펩티드 기질(Boehringer Mannhelm)에 대해 측정한 키나제 활성의 존재에 의해 저장되었다.이 컬럼에서 나온 물질은 20 mM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT와 5% 글리세롤과 1:1로 희석하여, 8 mL Q-15 음이온 교환 컬럼 (Pharmacia)에 넣었다. 단백질은 180 mL의 선형 NaCl 기울기(20 mM-175 mM)로 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT과 5% 글리세롤로 용출시켰다. VEGFR2 50 단백질은 앞서와 마찬가지로 저장되었다. 4M (NH₄)₂SO₄는 저장액에 첨가되어 최종 농도가 0.6M이 되었으며 저장액은 10 mL HP-페닐 세파로제 컬럼 (Pharmacia)에 넣었다. VEGFR2 50 단백질은 200 mL의 0.6 M에서 0 M까지 선형 역기울기의 (NH₄)₂SO₄와 20 mM Tris 와 5 mM DTT로 용출시켰다. 정밀화된 VEGFR2 50 단백질은 500 ml G-25 컬럼 (Pharmacia)에서 50 mM Hepes pH 7.5, 10 mM DTT, 10 % 글리세롤과 25 mM NaCl에 넣어져 완충 교환이 되고, 10 kD 컷오프 폴리술폰 막 (Amicon)을 통하여 1 mg 단백질/mL로 농축되었다. 최종 물질은 분취되고 액체 질소로 순간 냉동되어-70'C에서 저장되었다.

반응속도 분석

결합된 분광광도분석은 다음 조건하에서 자동 인산화된 정밀화 VEGFR2 50 단백질에 대해 수행되었다: pH 7.5, 4℃, 1시간 동안 Hepes (100 mM) 속에 단백질(4 mM), ATP (3 mM), MgCl₂(40 mM), DTT (5 mM)과 10% 글리세롤.

순방향의 결합 분광광도 분석

티로신 키나제 분석은 벡먼(Beckman) DU 650 분광광도계를 사용하여 측정하였다. ADP의 생성은 피부르산 키나제 (PK)와 유산탈수소효소(LDH)의 작용을 통해 포스포에놀피부르산(PEP)을 사용한 NADH의 산화와 결합된다. NADH의 산화는 340nm (e₃₄₀=6.22 cm^-1mM^-1)에서의 흡광도의 감소로 측정된다. 전형적인 반응 용액은 다음을 포함한다: pH 7.5, 200 mM Hepes 속에 1 mM PEP, 250 mM NADH, LDH/mL의 50 단위, PK/mL의 20 단위, 5 mM DTT와 여러 농도의 poly(E₄Y₁) (Sigma), ATP와 MgCl₂. 분석은 VEGFR2 50 단백질 40 nM로 시작된다.

역반응의 결합 분광광도 분석

ATP 생성은 헥소키나제 (HK)와 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PD)의 작용을 통하여 NADH의 생성으로 결합된다. 이 분석에서 HK는 ATP가 ADP와 글루코스-6-포스페이트로 전환하는 것을 촉진시킨다. 글루코스-6-포스페이트는 340nm에서 측정되는 NAD에서 NADH로의 환원과 동시에 G6PD에 의해 D-6-포스포글루코노피라노스-1,5-락톤으로 산화된다. 전형적인 분석 용액은 다음을 포함한다.: 글루코스 (10 mM), NAD (40 mM), DTT (5 mM), MgCl₂(4 mM), HK (15 unit/mL), G6PD (15 units/mL)와 ADP와 포스포-폴리(E₄Y)의 지시된 농도. 반응은 VEGFR2 50 단백질 (600-900 nM)의 첨가로 시작된다.

VEGFR2 50 단백질의 가능성있는 촉진제와 길항제의 평가

앞서의 분광광도 및 동적 분석에 근거하여, 후보 화합물을 상기 분석에 경쟁하여 첨가함으로써 VEGFR2 50 단백질의 가능성있는 후보 촉진제와 길항제를 평가할 수 있다. 전술한 바와 같이, VEGFR2 50 단백질의 활성의 반응속도는 가스트린 펩티드에 대해 측정된다. 후보 화합물의 존재 및 부재시의 활성은 측정되고 결과의반응속도 자료는 비교된다. 수용체에의 후보물질의 친화도는 경쟁적인 길항제를 나타내는 반응속도 곡선의 오른쪽으로의 이동이나 비경쟁적인 길항작용을 나타내는 최고 활성의 감소로 반영될 것이다. 역으로, 반응속도 곡선에서 왼쪽으로의 이동은 VEGFR2 50 단백질에 대한 경쟁적인 촉진제를 나타낸다. 일반적인 사항은 Bourne, H.R., et al. in, (1987)Basic & Clinical Pharmacology(Katzung, et al., eds) (Ch. 3) 9-22을 참조할 것.

결정화와 질량분석법을 위한 VEGFR2 50의 생체외 자동인산화

냉동된 VEGFR2 50 단백질의 분액은 차가운 물에 넣어 해동되고 4℃로 저장된다. MgCl₂와 ATP는 각각 26 mM과 4 mM씩 첨가된다. VEGFR2 50은 4℃에서 1시간 동안 배양된다. 이 물질(VEGFR2 50P)은 10 mM Hepes 7.5, 10 mM DTT와 10 mM NaCl 용액에서 완충 교환되며 Centriprep-10 (Amicon 제품)을 사용하여 5 mg 단백질/mL로 농축된다.

질량 분석법

트립신 소화 : 정밀화된 VEGFR2 50과 VEGFR2 50P의 트립신 소화는 pH. 7.7에서 25 mM NH₄HCO₃내에 0.37 mg/ML 단백질을 사용하여 반응 용량 100L로 2일간 37℃에서 수행한다.

MALDI/MS : MALDI-MS 분석은 지연 추출을 하는 비행시간형 질량분석계(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA)인 Voyager-Elite로 수행되었다. 소화된 단백질 시료 1L는 아세토니트릴과 0.25%(w/w) 트리플로로 아세트산 수용액의 50% (v/v) 용액 내의 (a-시아노-4-하이드록시-신나믹 산) 매트릭스 1L와 혼합된다. 시료는 337nm에서 작동한 질소 레이저로 조사되었다.

NanoESI-MS. NanoESI-MS분석은 Protana A/S (Denmark)에서 온 NanoESl 출처에서 변형된 삼중 쿼드라폴 질량분석계 (PE Sciex API Ill, Alberta, Canada)로 수행되었다. ESl 전압은 700 V로 맞추고 구멍 설정은 100 V로 유지하였다. 소화된 단백질 3L는 메틸 알콜 7L와 포름산 0.5L와 혼합하고, 이 시료의 4L는 질량분석계로 주입되었다. 이온 주사는 포스포펩티드의 서열을 얻기 위해 사용되었다.

결정화 및 데이터 수집

정련된 인산화 VEGFR2 50는 Centricon-10 원심분리 농축기를 사용하여 평균적으로 5 mg 단백질/mL이 되도록 농축되었다. 결정은 4℃에서 현적 증기 확산법으로 성장되었다. 단백질 용액 2 L와 모액용액 (pH 7.2에서 100 mM Hepes , 2 M (NH₄)₂S0₄와 2% (v/v) 모노에틸에테르 폴리에틸렌 글리콜 mW=550) 2L를 포함한 현적은 50mM 멜캡토에탄올이 첨가된 모액 용액의 1mL 저장기 위로 평형을 유지시켰다. 결정은 3-4일 후에 나타났고 21일 동안 0.3 x 0.2 x 0.5 mm 로 성장했다.

X선 회절 자료 세트는 50 kV 와 100 mA로 운행되고 슈퍼 초점 거울과 MAR345 MAR 리서치 영상판 검출기가 장착된 Rigaku RU-200 회전 음극 X-선 발생기 (CuK)를 사용하여 수집되었다. 냉동 결정의 자료모음은 결정을 저온보호용액(pH 7.2에서 100mM Hepes, 2.2 M (NH₄)₂S0₄, 0.6 M 자당, 0.55 M 포도당과 2% (v/v) 모노에틸에테르 폴리에틸렌 글리콜 MW=550)으로 옮기고, 액체질소에서 급속 냉각을 한 후, 냉동된 결정을 -186℃의 질소 흐름에 옮겨서 수행되었다. 통합되고 DENZO and SCALEPACK(Otwinowski, 1993 참조) 자료 모음 통계를 사용하여 계량된 자료는 표2와 같다.

최초 단백질 상태는 AMoRe 분자 교환 프로그램 (Navaza, 1994 참조), FGFR1 구조(Mohammadi et al.,1996; PDB 엔트리1FGK)를 탐침으로 한 분자 1과 네이티브 1 자료 세트를 이용하여 얻어진다. 정확한 해답은 FGFR1 측쇄를 포함하고 검색모형에서 활성 고리(640-660), N-단말 (464-467), 짧은 고리 (517-520)와 C-단말 (760-762)의 유동 잔기를 제거하여 얻어진다. 정확한 해답은 상관계수 0.31을 가진 회전과 병진 함수에서 최고점이었다. AMoRe에서 강체 정밀화는 상관계수 0.49와 12.0-4.0Å 해상범위에서 R-인자 46.3%로 해답을 향상시켰다. 이 해답의 정확도는 KAu(CN)₂유도체로 한 위상차 푸리에 (difference Fourier) 계산으로 재검사하였다. 이 유도체는 결정을 0.5 mM KAu(CN)₂을 포함한 저장기 용액에 3일간 담그고 무거운 원자의 농도를 5mM로 증가시킨 후 64시간을 더 담가서 발생시켰다. 자료 세트의 계량, 패터슨 계산, 푸리에 계산과 위상의 발생은 Xtalview (McRee et al., 1992 참조)를 사용하여 하였다.

모형의 정밀화는 Xplor 버전 3.1 (Brunger, 1992 참조)을 이용하였다. 전자 밀도 지도의 계산과 모형 맞춤은 XtalView (McRee et al., 1992 참조)을 사용하였다. 정밀화는 4℃에서 얻은 자료 세트(네이티브2)를 사용하여 시작되었고 -186℃에서 얻은 자료 세트(네이티브3)를 사용하여 완성되었다. 최종 R-인자는8-2.4Å(Fo>2δ) 범위의 자료에서 20.2%이다. 모든 원자에 대한 평균 B 값은 단백질은 31.8Å²이고 물분자는 42.8Å²이다. 최종 모형은 잔기 820-939, 998-1047과 1064-1168을 포함하며; 이 잔기 중에서 K838, R842, F845, K939, D998, K1023, R1027, Y1038, K1039, K1110 과 Ell13의 측쇄는 해석할 만큼 밀도가 부족하여 C 아래로 모형화하지 못하였다. PROCHECK (Laskowski et al.,1993 참조)를 사용하여 수행한 주 사슬 비틀림 각도의 분석은 모형의 275 잔기 중에서 허용되지 않은 구역에는 전혀 나타나지 않고 라마챤드란 도시(Ramachandran plot)에서 일반적으로 허용되는 구역에 4개만이 나타났음을 보인다. 182 물분자는 3δ보다 큰 전자 밀도 피크에 맞았고 단백질이나 다른 물분자와 적당한 수소 결합을 만드는 부위에 놓여졌다.

여러 키나제 구조의 중첩은 그래픽 프로그램 Insight II (Molecular Simulations Inc, San Diego, CA 제작)를 사용하여 수행하였다.

실시예 1 - 구조 결정

KID의 68 잔기 중에서 50 중앙 잔기가 부족한 인간 VEGFR-2의 티로신 키나제 영역은 바큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 발현된다. VEGFR-2의 총길이 1356 잔기 중에서 이 구성(VEGFR2 50)은 세포질 영역의 잔기 806-939과 990-1171을 포함한다 (도 1). VEGFR2 50은 KID 와 연관된 야생형 VEGFR-2 내에서 일 부분 돌연변이 (E990v)를 포함한다.

자동 인산화 반응을 촉매작용 시키는 것에 덧붙여 VEGFR2 50은 폴리(E₄Y) 외인성 기질의 인산화를 촉매작용 시키는 것이 가능하다. 상세한 반응속도 분석(도 1)은 반응속도 계수가 전체 KID를 포함한 유사한 VEGFR-2 단백질 구성의 것과 거의 동일하다는 것을 드러낸다(Parast et al., in press 참조). 이 결과들을 취합하면 VEGFR2 50은 완전히 활성인 기능 효소라는 것을 나타낸다. 그러므로, KID의 50 중앙 잔기의 결실은 인산기 전이 반응의 촉매적 단계에 관찰되는 효과가 없다. KID 지역의 60개 이상의 아미노산의 결실은 효소의 활성의 감소를 가져온다는 것이 측정되었다.

VEGFR2 50의 반응속도 상수
순방향 반응
기질	KM (mM)	kcat (s^-1)	kcat/KM (s^-1M^-1)
MgATP	0.153	13.3	87 x 10³
폴리(E₄Y)	2.1		63 x 10²
Mg²⁺	6.8		20 x 10²
역방향 반응
기질	KM (mM)	kcat (s^-1)	kcat/KM (s^-1M^-1)
MgADP	0.056	0.13	23 x 10²
P-폴리(E₄Y)	1.0		13 x 10¹

VEGFR-2 KID 서열은 친수성이고 고도로 대전되어 있으며, 6개의 리신, 5개의 아르기닌, 8개의 글루탐 산과 5개의 아스파르트 산 잔기를 포함한다(도 1). 처음에 전체 KID와 함께 VEGFR-2 촉매반응 영역을 포함하는 몇 개의 단백질 구성이 생성된다. 수준미달의 결정조차 산출하는데도 실패한 단백질 구조를 결정화하려는 소모적인 시도 후에, 고도로 대전된 KID가 결정화를 방해한다는 생각을 시험하기 위해 VEGFR2 50 구성을 만들었다. 동적 광 산란으로 측정된 바와 같이 14개의 대전된 잔기를 제거한 VEGFR2 50 구성은 전체 KID를 포함한 단백질 구성보다 온도와단백질 농축에서 현저히 좋은 안정성을 나타낸다.

결정화를 위해, 정제된 VEGFR2 50는 MgATP와 함께 배양되어 생체 외에서 자동 인산화 된다. 전체 길이가 인산화된 VEGFR2 50 (VEGFR2 50P) 단백질과 일반적으로 소화된 펩티드의 매트릭스 지원 레이저 탈습 이온화 (MALDI)와 나노전기분무 이온화 (NanoESI) 질량분광 분석은 여기에 묘사된 자동 인산화 조건을 이용하는 Y1059의 인산화를 나타낸다. 2.2Å으로 회절하는 결정이 결찰된 상태가 아닌 VEGFR2 50P 중에서 얻어진다. 이 결정은 비대칭 단위에 하나의 VEGFR2 50P 분자가 있는 사방정 공간군 P2₁2₁2₁에 속한다. 초기의 결정학적 상태는 FGFR1 (Mohammadi et al., 1996 참조)의 인산화되지 않은 키나제 영역의 구조를 검색 모형으로 이용한 분자 교환에 의해 결정된다. 분자 교환 해법의 정확도는 시안화 금 유도체를 이용하여 재검사되었다. 그렇지만, 유도체 자료는 모형을 만드는데 사용된 전자 밀도 지도의 상태 계산에는 사용되지 않는다. 구조는 8-2.4Å(Fo>2δ) 자료에서 R-인자가 20.2%가 되도록 정밀화되었다.

중심 원자가 불규칙성 때문에 모형화되지 않은 VEGFR2 50P 잔기는 N-단말 잔기 806-819, KID의 잔기 990-997, 활성 고리의 잔기 1048-1063과 C-단말의 잔기 1169-1171을 포함한다. 구조 결정 통계는 표 2에 나타나있다.

VEGFR2 50P 구조 결정 통계
데이터 세트	네이티브(3)	네이티브(1)	네이티브(2)	KAu(CN)₂
데이터 해상도 (Å)	15-2.2	20-3.0	15-2.4	15-3.1
R_sym(%)	5.2^a(19.6)^b	8.4(19.2)	7.0(21.9)	7.1(19.5)
완성도 (%)	93.0(81.0)	97.5(98.4)	98.8(98.8)	96.5(95.0)
온도(℃)	-186	room(∼21)	4	4
단위 셀 a (Å)	95.41	97.10	98.52	97.71
단위 셀 b (Å)	96.04	96.94	96.50	96.97
단위 셀 c (Å)	38.22	38.63	38.56	38.52
정밀화 해상도 (Å)	8-2.4	--	--	--
정밀화된 R (%)	20.2^c,d	--	--	--

^aR_sym=hkl_i|I _i(hkl)-<I(hkl)>|/hkl_i I _i(hkl)

^b괄호속의 값은 최고일 때(해상도 쉘)

^cR=hkl||F_o(hkl)|-|F_c(hkl)||/hkl|F_o(hkl)|

단, F_o와 F_c는 각각 관측되고 계산된 구조 인자이다(F_o>2).

^d모형은 275 단백질 잔기와 182 물분자를 포함한다.

전체 키나제 주름

이전에 보고된 세린/트레오닌과 티로신 단백질 키나제의 구조와 비슷하게, VEGFR2 50P는 두 개의 로브 사이의 틈에서 일어나는 인산 전달의 촉매작용과 함께 두 개의 로브로 속으로 포개진다 (Cox et al., 1994; Johnson et al., 1996 참조). VEGFR2 50P 구조의 C 자취는 도 2a에 보였다. 키나제 2차 구조적 요소는 cAPK (Knighton et al., 1991 참조)에 대해 원래 주어진 관례에 따라 나타냈다 (도 1). N-단말 로브 (약 820-920 잔기)는 하나의 나선(C)으로 꼬인 시트 속으로 포개진다. 구조는 3개(1-3)는 크게 구부러져서 다른 두 가닥(4-5) 위로 말려있는 5개의 역평행 가닥(1-5)으로 이루어진다. 큰 C-단말 영역(약 921-313 잔기)은 N-단말 -시트에 붙은 C-단말 영역의 위에 놓여진 2개의 역평형 가닥(7-8)을 포함한다. 7개의 -나선 ( D, E, E-F, G, H, I)은 C-단말 영역의 남아있는 핵심을 형성한다. 다른 키나제처럼 VEGFR2 50P는 2개의 기능적으로 중요한 고리 지역을 가진다: 글리신이 풍부한 뉴크레오티드 결합 고리(잔기 841-846), 촉매반응 고리(잔기 1026-1033)와 활성화 고리 (잔기 1046-1075) (도 1과 2a).

보고된 키나제 구조 중에서 VEGFR2 50P 구조는 약 55%의 동일한 서열을 공유하는 FGFR1 (Mohammadi et al., 1996 참조; PDB 엔트리 1FGK)의 촉매 반응 영역의 것과 가장 가깝게 닮았다(도 1). FGFR1 구조 해답의 결정학적 비대칭 단위의 두 분자가 매우 닮았기 때문에, VEGFR2 50P에 대한 비교는 주로 FGFR1 분자 A에 대해서만 설명될 것이다. N-단말 로브의 (1-5)의 82C 부위 또는 FGFR1과 VEGFR2 50P 사이의 C-단말 로브의 152C 부위 잔기 (D, E, F, G, H, I)의 최소 자승 중첩은 각각 0.40 Å과 0.52 Å의 rms 편차로 나타난다. 두 개의 로브간의 약 5°의 상대적인 회전은 VEGFR2 50P의 로브간의 틈이 약간 커지고 잘 열리게 한다. 틈 끝의 동등한 C(FGFR1의 K523와 R675, VEGFR2 50P의 S877과 R1080)간의 거리의 측정은 이 거리가 FGFR1에서는 23.2Å인 것에 비해 VEGFR2 50P에서는 25.3Å로 나타났다. 그렇지만 이것은 여러 결찰과 인산화 상태의 키나제 구조 사이에서 관측되는 상대적으로 더 큰 로브 회전과 비교하여 작은 차이이다 (Johnson et al., (1996)Cell85, 149158 참조). 예를 들어, VEGFR2 50P에서 로브 간에 보이는 방향은 ATP를 닮은 AMP-PNP와 펩티드 기질과 결합된 IRK의 인산화 키나제 영역의 3성분 복합체 구조에서 보이는 것보다 약 20°도 열린 형태이다 (Hubbard, (1997)EMBO J. 16, 5572-5581 참조; PDB 엔트리 1IR3) (도 2c).

N-단말 돌출부의 -가닥 부위가 VEGFR2 50P와 FGFR1 사이에서 잘 맞는 반면에, 구조는 W827 잔기에서 시작하는 첫 번째 유지 지역을 앞서는 N-단말 잔기에서 두드러지게 벗어난다 (도 2a와 2b). VEGFR2 50P의 첫 번째 14 잔기 (M806-E819)는 완전히 무질서하고 다음 7 잔기 (L820-R826)는 확장고리 구조를 형성한다. 806- 819 잔기는 활성 키나제 지역의 부분을 형성하지 않고 대신 VEGFR-2의 막 옆 구역의 부분을 형성하던지 인접하는 것으로 보인다. 비록 구부러지기 쉬운 잔기인 유사한 잔기가 FGFR1, IRK와 비수용체 티로신 키나제 Lck의 구조에서 정렬되어 있지만, 820-826 잔기는 키나제 영역의 일부분으로 보인다(Yamaguchi and Hendrickson, (1996)Nature384,484-489 참조). VEGFR2 50P 구조와 다른 키나제 구조 사이의 다른 차이는 키나제 삽입 영역과 활성 고리에서 일어난다(다음에서 논의).

촉매반응 고리와 ATP 결합 부위

단백질 키나제에서 E와 7 사이의 고리는 인산전달 반응에서 촉매반응 염기로 기능한다고 믿어지는 불변 아스파르트 산(D1028)을 포함하기 때문에 촉매반응 고리라고 부른다 (Johnson et al., 1996 참조). 아스파르트 산은 서열HRDLAARN이 단백질 티로신 키나제 중에서 매우 잘 보존되는 잔기(H1026-N1033)의 확장의 일부분이다. VEGFR2 50P에서 중심 부위와 이 고리의 가장 측쇄 부위는 배위되지 않은 FGFR1과 3성분 인산화 IRK (IRKP) 복합체 구조의 것과 비슷하다. 앞서의 구조에서 보인 바와 같이 촉매반응 고리 아스파르트 산(D1028)의 측쇄 카르복실산은 보존된아르기닌(R1032)과 아스파라긴(N1033)의 측쇄와 수소결합을 한다 (도 3).

단백질 키나제의 ATP 결합 부위는 N과 C-단말 로브 사이의 틈에 있다 (도 2c). VEGFR2 50P에서 이 부위를 형성하는 잔기는 주로 두 로브를 연결하는 잔기 E917-N923 및 1,2 부분과 G841-G846의 글리신이 풍부한 고리의 부분을 포함하는 잔기 L840-1849 로 구성된다. 뉴클레오티드 결합 고리라고도 불리는, 글리신이 풍부한 고리는 유연한 조각으로 그 부위가 여러 활성화되고 배위된 상태에 있는 키나제 구조에 따라 달라진다. VEGFR2 50P에서 이 고리는 꽤 잘 정렬되었고 R842와 F845의 측쇄를 제외하고 모든 원자는 모형화될 수도 있다. 이 고리의 상대 위치와 형태는 배위되지 않은 FGFR1 구조에서 관측되는 것과 닮았다. 그렇지만 이 구조는 N과 C-단말 로브의 약 20°상대 회전으로 글리신이 풍부한 고리가 VEGFR2 50P 구조보다 C-단말 로브에 5Å 더 가까이 있도록 된 IRKP 3차 복합체 구조와 두드러지게 다르다.

이미 보고된 ATP 또는 ATP 유사체와 결합된 키나제 구조에서 아데닌 고리는 단백질 중심과 2개의 보존된 수소 결합을 만든다. AMP-PCP가 묶인 FGFR1 구조(Mohammadi et al., 1996 참조)에서 이들 수소 결합은 아데닌 NH2와 E562 (E917 VEGFR2 50P)의 중심 C=O사이와 아데닌 N1과 A546 (C919 VEGFR2 50P)의 중심 NH 사이에 있다. 비록 여기에 나타낸 구조가 결합된 뉴클레오티드를 포함하지 않지만, FGFR1에서 이들 중심 원자의 부위에서의 유사성은 이 수소 결합이 VEGFR2 50P-ATP 복합체 내에 형성되어 아데닌이 비슷한 위치에 결합할 것이 예측된다는 것을 나타낸다 (도 4).

질환과 관련된 키나제의 ATP 결합 부위에서의 변화는 치료제로서 선택적인 ATP-경쟁 억제제의 설계에 상당한 중요성을 가진다. FGFR1와 VEGFR2 50P의 ATP 결합 부위의 비교는 부위의 전체 구조가 보존될 때, 몇 개의 서열 차이가 배위자 결합을 위한 접근 범위의 모양의 차이를 낳는다는 것을 보여준다. 이 부위에서 FGFR1과 VEGFR-2 간의 특정 서열 차이는 다음을 포함한다: V899 (I545 FGFR1), F918 (Y563 FGFR1), C919 (A564 FGFR1)과 C1045 (A640 FGFR1) (도 4). 마찬가지로, 3차 IRKP 복합체 구조의 비교는 V916 (M1076 IRK), F918(L1078), C919 (M1079 IRK), L1035 (M1139 IRK)와 C1045 (Gl149 IRK)에서 아데닌 위치의 변화를 나타낸다. 아데닌 위치에서 서열과 구조의 더 큰 변화가 VEGFR2 50P 구조와 세린/트레오닌 키나제 구조가 비교될 때 관찰되며, 이 차이는 선택적인 ATP-경쟁 억제제의 설계에 유용하다는 것을 시사한다.

활성화 고리

단백질 키나제는 활성화 고리(A-loop)라고 부르는 큰 유연한 고리를 포함하며, 그 고리의 형태는 키나제 활성을 조절한다고 여겨진다.(도 2) 많은 키나제에서 AL의 형태는 특정 A-고리 잔기의 인산화에 의해 조절된다(Johnson et al., 1996 참조). 고리는 보존된 잔기 DFG를 시작으로 하고 보존된 APE 서열을 끝으로 하도록 일반적으로 정의될 수 있다 (Johnson et al., 1996 참조). VEGFR-2에서 이 조각은 D1046-E1075에 대응하고 두 개의 티로신(Y1054과 Y1059)을 포함한다. Y1054과 Y1059 모두 VEGFR-2의 세포질 영역이 E. coil에서 발현될 때 자동 인산화 위치에 있는 것이 발견된다(Dougher-Vermazen et al., 1994 참조). VEGFR2 50에 대해 여기에서 설명된 생체 외 자동 인산화 프로토콜을 이용하면, 안정적인 인산화 위치가 Y1059에서 표시되지만, Y1054의 인산화의 증거는 검출되지 않았다.

여기에 나타난 배위되지 않은 VEGFR2 50P 구조에서, A-고리는 상당히 유동적으로 나타나고 해석할 수 있는 전자 밀도는 고리의 중앙 분할(G1048-G1063)의 대부분에 나타나지 않았다. 이 무질서는 다른 키나제 구조로부터 추론한 A-고리의 유동성과 일치한다. 예를 들어, 인산화되지 않은 FGFR1 키나제 구조의 비대칭 단위의 두 분자 중에서 A-고리의 중앙은 분자 A에서 상대적으로 높은 온도 인자를 갖고 분자 B에서는 완전히 무질서하다. 비록 잔기 1048-1063이 VEGFR2 50P에서 모형화될 수 없지만, 명백한 전자 밀도가 잔기 D1064-E1075에 대해 존재하며, 이 잔기들이 인산화되지 않은 FGFR1 구조에서 관찰되는 것과 비슷한 형태를 수용한다는 것이 명백하게 나타났다. D1064-P1068의 조각은 촉매반응 잔기D1028과 R1032의 옆에 놓인 확장 구조를 가진다 (도 3a). (MgAMP-PNP)-펩티드- IRKP 복합체 구조와의 비교는 이 VEGFR2 50P 구조에서 R1066-P1068의 부위가 기질 결합을 억제한다는 것을 나타낸다. P1066은 3차 IRK3P 복합체 구조에서 펩티드 기질의 티로신 측쇄에 할당된 것과 동등한 공간을 차지한다. 잔기 L1069-E1075의 형태는 3차 IRKP 복합체 구조의 것과 비슷하지만, 두 구조 간에 P1068 (P1172 IRK)에서 완전한 방향의 변화가 있다. IRK 구조에서는 이 프롤린 에 대해 잔기 N-단말이 EF를 향하고 있는데 VEGFR2 50P에서는 단백질의 반대쪽에 있는 D를 향하고 있다 (도 2와 3).

결정화에 앞선 Y1059의 인산화에도 불구하고, 잔기 D1064-P1068의 여기에서 보여지는 형태는 인산화되지 않은 FGFR1 구조에서 비슷한 잔기에서 관찰되는 억제형태와 닮았다. VEGFR2 50에서 Y1059는 단백질 티로신 키나제 중에서 상대적으로 보존된 인산화 부위에 대응한다. 3차 IRKP 복합체 구조와 인산화 임파구 키나제 (Lck) 구조 (Yamaguchi and Hendrickson, 1996 참조)에서 이 부위에 있는 티로신 (Y1163 IRK, Y394 Lck)은 인산화되고, A-고리는 인산화된 cAPK 3차 복합체 구조에서 관찰되는 것과 비슷한 비억제 형태를 가진다 (Zheng et al., 1993 참조). 이 부위에서 다른 단백질 잔기와 함께 만드는 인산 군의 상호작용은 기질과 ATP의 결합을 허용하는 A-고리 형태를 안정화하는데 도움을 준다고 믿어진다 (Johnson et al., 1996; Hubbard, 1997 참조). 그렇지만, 여기에서 설명된 이 VEGFR2 50P 구조는 열린 A-고리와 비슷한 형태를 나타내지 않고 무질서한 고리의 많은 부분과 함께 억제하는 형태를 가지기 때문에, VEGFR2 50P의 단일 인산화 A-고리는 몇 가지의 형태를 포함하는 동적 평형으로 존재하고 여기에서 관찰되는 형태가 이 결정 환경에서 가장 선호되는 형태이다.

키나제 삽입 도메인:

키나제 삽입 영역은 키나제 C-단말 로브에서 일어나고 D와 E 나선을 연결한다. VEGFR-2에서 이 영역은 N933에서 L1000까지의 68 잔기에 해당한다 (도 1). 잔기 T940-E989의 결실로 인한 고유의 키나제 활성(앞에서 언급함) 효과의 부족은 KID 영역의 끝이 촉매반응 부위와 활성화 고리의 위치로부터 단백질의 반대쪽으로 상대적으로 멀리 떨어져서 (약 35-40Å) 일어나기 때문에 놀라운 일은 아닐 것이다 (도 2). 이 결과는 CSF-1 KID의 64 잔기 중에서 58의 결실만으로 펩티드 기질을 인산화시키는 능력이 10% 감소하는 CSF-1 수용체의 경우와도 일치한다 (Taylor etal., 1989 참조). 그렇지만, PDGFR의 98 잔기 전체의 결실은 펩티드 기질에로의 키나제 활성을 80% 감소시키게 된다 (Severinsson et al., (1990)Mol. Cell. Biol, 10, 801-809 참조). 그래서, 본 발명은 KID의 대부분이 촉매작용을 위해 필요하지 않고, 잔기의 소수만이 요구에 맞는 키나제 구조를 유지하기 위해 αD와 αE 사이에 링커를 형성하기 위해 존재해야 한다는 것을 인정하는 합성 촉매반응 링커의 생산을 허용한다.

D 다음의 VEGFR2 50구조에서, 잔기 N933-P937은 느슨한 회전과 C-단말에서 D와 I 축에 대해 거의 수직인 말단을 가진 확장된 가닥을 형성한다. 다른 푸리에 지도에서 전자 밀도는 잔기 N933-P937에 대해 강하고 명확하며 Y938과 K939에 대해 약하게 된다 (Y938과 K939의 측쇄는 모형화 되지 않음) (도 5). VEGFR2 50에서 50 잔기의 결실은 C-단말에 대해 K939인 잔기가 즉시 V990이 되도록 직접 K939을 따르게하여 전체 길이 VEGFR-2에서 잔기 순서를 유지한다. 잔기 V990-K997은 무질서해지고 해석할 수 있는 전자 밀도는 D998에서 다시 시작한다. 잔기 D998-T1001은 잔기 L1002에서 E와 연결하는 짧은 가닥을 형성한다 (도 5 와 6).

KID의 N-단말과 C-단말의 말단의 두 가닥은 다른 키나제 구조의 이 지역에서 보이는 형태와 다른 가짜 두가닥 평행 -시트 구조를 형성한다. KID의 두 말단은 VEGFR-2의 이 영역에서 전체 형태와 위치를 안정시키는데 도움이 될 수 있는 여러 상호작용을 만든다. K931의 측쇄는 E934의 측쇄와 이온 상호작용을 하고 D998의 중심 카르보닐기와 수소 결합을 만든다 (도 6). 가닥들간의 수소결합 상호작용은 다음을 포함한다 : E934 중심 C=O 에서 L1000 NH, V936 NH 에서 L1000 C=O 및 P937C=O에서 L1002 NH. 이들 극성 상호작용에 덧붙여, F935, P937 및 L1000의 측쇄는 광범한 소수성 접촉에 포함된다. F935의 측쇄는 L928, P937, L1000, L1002, L1005, L1101 및 Y1130의 측쇄에 의해 형성되는 소수성 주머니에 자리잡고 있다 (도 5와 6). L1000 측쇄도 Y927, K931, H1004 및 Y1008의 측쇄에 대해 담겨진다.

KID의 일부의 결실도 변형된 VEGFR-2 폴리프로틴에 다른 유용하고 바람직한 특성을 준다는 것이 출원인에 의해 발견되었다. 변형된 폴리펩티드는 야생형 단백질에 비해 용액에서 더 높은 온도에 노출되었을 때 더 큰 안정성을 보여 왔다. 덧붙여서, 변형된 폴리펩티드는 야생형 단백질보다 향상된 용해도를 나타낸다. 당업계의 숙련자에게는 이런 성질들이 본 발명의 여러 상업적인 면에서의 향상을 허용한다는 것이 명백하다. 변형된 단백질의 가능한 사용의 예는 유전자 칩 기술 (Affymax, Inc.) 파지(phage)-표시 펩티드 라이브러리 (New England BioLabs, Inc. 사의 The Ph.D. Kit(등록상표임)에 의함) 및 FT-NMR을 통한 심층 분석에 기반한 것을 포함하는 여러 방법에 의한 수용체를 위한 가능성 있는 배위자의 고효율 약효 검색을 포함한다.

전체 KID는 결실될 수 있고, PDGF와 앞에서 언급된 단백질과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 다른 RTK에서 약간의 촉매 활성을 유지할 수 있다는 것이 예상된다. 더군다나, 실시예에서 전체 KID는 결실되고 단백질의 촉매적 활성과 결정성 모두가 유지되도록 최소한 하나의 아미노산의 합성 촉매반응 링커와 교체된다.

PDGFR 단백질의 클로닝

이 예에서, PDGFR 폴리프로틴은 상기 VEGFR-2를 위해 약술한 방법을 사용하여 클로닝된다. PDGFR의 코딩 서열은 마쯔이(Matsui) 등이 밝힌 서열로부터 유도된다(Matsui,T., et al., (1989)Science243:800-804 (Accession No. 66814) 참조). 그 다음, 단백질의 세포질영역과 촉매반응 영역에 위치한 잔기들에 대한 유전정보를 가진 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머가 코드로 만들어진다. PDGFR의 촉매반응 영역은 도1에서 잔기 689 (N)에서 시작하여 잔기791 (T)로 끝난다.

클로닝 및 정제 단계의 나머지는 VEGFR2 50 단백질에 대해 기재한 것과 유사하고 당업자들에게 공지된 기술을 사용한다.

RTK 계통의 다른 일원과 본 명세서에 기재된 데이터의 다른 사용방법은 보여진 실시예에 국한되는 것은 아니다.

Claims

변형된 수용체 티로신 키나제(RTK) 폴리펩티드와 상호작용하는 능력에 대해 후보 화합물을 분석하는 방법으로서,

a) 상기 후보 물질과의 상호작용을 분석할 수 있는 형태의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 숙주 내에서, 상기 변형된 RTK 유전자 구성체를 인코딩하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체를 발현하되, 여기서 상기 RTK 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 VEGFR-2 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인(KID)으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 단계;

b) 상기 변형된 폴리펩티드를 상기 후보 물질에 노출시키는 단계; 및

c) 상기 후보 물질와 상기 폴리펩티드의 상호작용을 평가하는 단계;

를 포함하는 후보 화합물 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 평가 단계가

a) X선 결정법에 적합한 조건에서 상기 변형된 폴리펩티드를 결정화하는 단계; 및

b) 상기 폴리펩티드에 대해 상기 X선 결정법을 수행하는 단계;

를 더 포함하는 후보 화합물 분석 방법.
변형된 VEGFR-2 수용체 폴리펩티드와 상호작용하는 능력에 대해 후보 화합물을 분석하는 방법으로서,

a) 상기 후보 물질과의 상호작용을 분석할 수 있는 형태의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 숙주 내에서, 상기 변형된 VEGFR-2 유전자 구성체를 인코딩하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체를 발현하되, 여기서 상기 VEGFR-2 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 VEGFR-2 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인(KID)으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 단계;

b) 상기 변형된 폴리펩티드를 상기 후보 물질에 노출시키는 단계; 및

c) 상기 후보 물질와 상기 폴리펩티드의 상호작용을 평가하는 단계;

를 포함하는 후보 화합물 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 평가 단계가

a) X선 결정법에 적합한 조건에서 상기 변형된 폴리펩티드를 결정화하는 단계; 및

b) 상기 폴리펩티드에 대해 상기 X선 결정법을 수행하는 단계;

를 더 포함하는 후보 화합물 분석 방법.
변형된 RTK 유전자 구성체를 인코딩하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체로서, 여기서 상기 RTK 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 RTK 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체.
변형된 VEGFR-2 유전자 구성체를 인코딩하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체로서, 여기서 상기 VEGFR-2 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 VEGFR-2 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 단리된 DNA 서열 또는 그 변체.
제6항에 있어서, 서열번호 5의 DNA 서열 또는 그 변체를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드 서열.
제6항에 있어서, 서열번호 6의 DNA 서열 또는 그 변체를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드 서열.
변형된 RTK 유전자 폴리펩티드의 활성의 촉진제 또는 길항제인 화합물을 평가하는 방법으로서, 여기서 상기 RTK 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 RTK 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하며,

a) 상기 변형된 RTK 폴리펩티드를 결정화하는 단계;

b) 상기 결정화되어진 변형된 RTK 폴리펩티드에 대한 결정학 좌표를 획득하는 단계;

c) 상기 결정화되어진 변형된 RTK 폴리펩티드에 대한 상기 결정학 좌표를 컴퓨터 알고리즘에 적용하여, 상기 알고리즘이 상기 폴리펩티드에 대해 촉진제 또는 길항제로 작용할 분자를 설계하는데 사용하기에 적합한 상기 RTK 폴리펩티드의 모형을 생성하도록 하는 단계; 및

d) 반복 과정에 의해 여러 분자 구조들을 상기 컴퓨터 생성 모형에 적용함으로써 상기 폴리펩티드에 대해 가능성 있는 촉진제 또는 길항제를 확인하는 단계;

를 포함하는 화합물 평가 방법.
변형된 VEGFR-2 유전자 폴리펩티드의 활성의 촉진제 또는 길항제인 화합물을 평가하는 방법으로서, 여기서 상기 VEGFR-2 유전자는 합성 촉매반응 링커를 함유하고 상기 링커는 VEGFR-2 유전자 촉매반응 영역의 키나제 삽입 도메인으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하며,

a) 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드를 결정화하는 단계;

b) 상기 결정화되어진 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드에 대한 결정학 좌표를 획득하는 단계;

c) 상기 결정화되어진 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드에 대한 상기 결정학 좌표를 컴퓨터 알고리즘에 적용하여, 상기 알고리즘이 상기 폴리펩티드에 대해 촉진제 또는 길항제로 작용할 분자를 설계하는데 사용하기에 적합한 상기 VEGFR-2 폴리펩티드의 모형을 생성하도록 하는 단계; 및

d) 반복 과정에 의해 여러 분자 구조들을 상기 컴퓨터 생성 모형에 적용함으로써 상기 폴리펩티드에 대해 가능성 있는 촉진제 또는 길항제를 확인하는 단계;

를 포함하는 화합물 평가 방법.
제10항에 있어서, 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드가 서열번호 5의 VEGFR2 50을 포함하는 화합물 평가 방법.
도 5의 X선 좌표를 가지는 VEGFR-2 유전자 구성체를 인코딩하는 DNA 서열 또는 변체을 포함하는 단리된 DNA 서열.
X선 결정법에 의한 분석에 적당하도록 수용체 티로신 키나제 계통의 단백질 또는 폴리펩티드를 조제하는 방법으로서,

a) 상기 단백질의 촉매반응 영역 내의 키나제 삽입 도메인을 확인하는 단계;

b) 변형된 폴리펩티드가 X선 결정법으로 측정하는데 적당한 결정 상태를 형성할 수 있는 안정적인 형태를 가지도록 상기 키나제 삽입 도메인으로부터 소정 개수의 아미노산 잔기를 결실시키는 단계; 및

c) 상기 변형된 폴리펩티드를 결정화하는 단계;

를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 조제 방법.
RTK 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물을 위한 약품 설계 방법으로서,

a) 타겟 RTK 폴리펩티드의 KID의 일부를 결실시키는 단계;

b) 상기 타겟 RTK 폴리펩티드를 결정화하는 단계;

c) 상기 타겟 RTK 폴리펩티드를 X선 결정법으로 해상(resolving)하는 단계;

d) 상기 타겟 RTK 폴리펩티드의 X선 결정법을 해상하여 생성되는 데이터를, 상기 폴리펩티드에 대해 촉진제 또는 길항제로 작용할 분자를 설계하는데 사용하기에 적합한 상기 타겟 RTK 폴리펩티드의 모형을 생성하는 컴퓨터 알고리즘에 적용하는 단계; 및

e) 반복 과정에 의해 여러 분자 구조들을 상기 컴퓨터 생성 모형에 적용함으로써 상기 타겟 RTK 폴리펩티드에 대해 가능성 있는 촉진제 또는 길항제를 확인하는 단계;

를 포함하는 약품 설계 방법.
변형된 VEGFR-2 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물을 위한 약품 설계 방법으로서,

a) 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드의 KID의 일부를 결실시키는 단계;

b) 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드를 결정화하는 단계;

c) 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드를 X선 결정법으로 해상(resolving)하는 단계;

d) 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드의 X선 결정법을 해상하여 생성되는 데이터를, 상기 폴리펩티드에 대해 촉진제 또는 길항제로 작용할 분자를 설계하는데 사용하기에 적합한 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드의 모형을 생성하는 컴퓨터 알고리즘에 적용하는 단계; 및

e) 반복 과정에 의해 여러 분자 구조들을 상기 컴퓨터 생성 모형에 적용함으로써 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드에 대해 가능성 있는 촉진제 또는 길항제를 확인하는 단계;

를 포함하는 약품 설계 방법.
제15항에 있어서, 상기 변형된 VEGFR-2 폴리펩티드가 서열번호 5의 VEGFR-2 50 폴리펩티드를 포함하는 약품 설계 방법.