ES2252972T3 - Modificaciones de la proteina vegfr-2 y procedimiento de uso. - Google Patents
Modificaciones de la proteina vegfr-2 y procedimiento de uso.Info
- Publication number
- ES2252972T3 ES2252972T3 ES99945505T ES99945505T ES2252972T3 ES 2252972 T3 ES2252972 T3 ES 2252972T3 ES 99945505 T ES99945505 T ES 99945505T ES 99945505 T ES99945505 T ES 99945505T ES 2252972 T3 ES2252972 T3 ES 2252972T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vegfr
- polypeptide
- modified
- protein
- vegfr2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Una secuencia aislada de ADN que codifica una proteína VEGFR-2 modificada, en la que dicha proteína VEGFR-2 contiene un ligador catalítico sintético, en la que dicho ligador es el dominio de inserción de la proteína quinasa de la región catalítica del VEGFR-2, que tiene eliminados los residuos T940 a E989.
Description
Modificaciones de la proteína
VEGFR-2 y procedimiento de uso.
La presente invención revela el aislamiento de
una porción clave de la región catalítica de la quinasa del
receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular o
VEGFR-2 (Vascular Endotelial Growth Factor
Receptor 2) a través de la clonación, la secuenciación y la
cristalografía por rayos X. También se revela la eliminación de
varios residuos aminoacídicos de una zona de la región catalítica
denominada dominio de inserción de la quinasa (KID, Kinase Insert
Domain). El polipéptido resultante conserva una actividad
quinasa in vitro comparable con la del KID de tipo natural, y
no es necesaria para la actividad catalítica del polipéptido y, lo
que es más importante, permite la cristalización completa de la
proteína de manera que puede ser caracterizada mediante
cristalografía por rayos X. La presente invención revela además los
datos de la cristalografía por rayos X que son útiles para la
identificación y la construcción de compuestos terapéuticos en el
tratamiento de las condiciones de varias enfermedades asociadas con
el VEGFR-2.
Muchos eventos fisiológicos, incluyendo la
embriogénesis, el desarrollo de órganos, el estro y la cicatrización
de heridas, requieren un crecimiento y una remodelación vascular
(Folkman et al., (1992) J. Biol. Chem. 267,
10931-10934; Risau, W. (1995) FASEB J. 9,
926-933). Además de participar en estos procesos
beneficiosos, la angiogénesis también participa en la proliferación
de estados de enfermedades tales como crecimiento tumoral,
metástasis, psoriasis, artritis reumatoide, degeneración macular y
retinopatía (Pepper, M. S., (1996) Vasc. Med. 1,
259-266; Kuiper et al., (1998) Pharmacol.
Res. 37, 1-16, 1998; Kumar y Fidler, (1998)
In Vivo 18, 27-34; Szekanecz et al.,
(1998) J. Investig. Med. 46, 27-41; Tolentino
y Adamis, (1998) Int. Ophthalmol. Clin. 38,
77-94. De las rutas de señalización conocidas por
influir en la formación vascular, las relacionadas con el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF, Vascular Endotelial
Growth Factor) han demostrado ser esenciales y selectivas para
las células endoteliales vasculares (Dvorak et al., (1995)
Am. J. Path. 146, 1029-1039; Thomas,
K., (1996) Cell 271, 603-606; Ferrara
N. y Davis-Smyth, (1997) Endocrine Rev. 18,
4-25). Se ha demostrado el potencial terapéutico de
inhibir la ruta del VEGF directamente mediante anticuerpos
monoclonales anti-VEGF que fueron activados contra
una variedad de tumores humanos (Borgström et al., (1996)
Cancer Res. 56, 4032-4039) y la enfermedad
retinal isquémica (Adamis et al., (1996) Arch. Ophthalmol.
114, 66-71).
La vasculogénesis y la angiogénesis normales
desempeñan importantes papeles en una variedad de procesos
fisiológicos tales como el desarrollo embrionario, la cicatrización
de heridas, la regeneración de órganos y procesos reproductivos
femeninos tales como el desarrollo de folículos en el cuerpo lúteo
durante la ovulación y el crecimiento de la placenta después del
embarazo (Folkman y Shing, 1992). La vasculogénesis y/o angiogénesis
incontroladas han estado asociadas con enfermedades tales como la
diabetes, así como con tumores sólidos malignos que dependen de la
vascularización para su crecimiento. Klagsburn y Soker, (1993)
Current Biology 3(10): 699-702;
Folkham, (1991) J. Natl. Cancer Inst. 82:
4-6; Weidner, et al., (1991) New Engl. J.
Med. 324: 1-5.
Se ha realizado la identificación de varios
polipéptidos con actividad promotora del crecimiento celular
endotelial in vitro. Los ejemplos incluyen el factor de
crecimiento fibroblástico ácido y básico (FGF, Fibroblastic
Growth Factor), el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) y el factor de crecimiento de la placenta. A diferencia del
FGF, se ha informado recientemente que el VEGF es un factor
mitogénico específico de las células endoteliales (Ferrara y
Henzel, (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm., 161:
851-858; Vaisman et al., (1990) J. Biol.
Chem. 265: 19461-19566).
Por lo tanto, es importante identificar los
receptores específicos a los que se une el VEGF para comprender la
regulación de la proliferación de las células endoteliales. Se han
identificado dos tirosina quinasas estructuralmente relacionadas
que se unen al VEGF con una afinidad elevada: el receptor
flt-1 (Shibuya et al., (1990) Oncogene
5: 519-524; De Vries et al., (1992)
Science 255: 898-991) y el receptor
KDR/FLK-1, tratados en la presente memoria. Por
consiguiente, se ha conjeturado que los RTK (Receptor Tyrosine
Kinases, receptores tirosina quinasa) pueden desempeñar un papel
en la modulación y la regulación de la proliferación de las células
endoteliales.
Revelaciones recientes, tales como la información
expuesta en las solicitudes de patente estadounidenses con nº de
serie: 08/193.829; 08/038.596 y 07/975.750, sugieren
convincentemente que el VEGF no sólo es responsable de la
proliferación de las células endoteliales, sino que también es el
regulador principal de la angiogénesis normal y patológica. Véase,
en general, Klagsburn y Soker, (1993) Current Biology
3:699-702; Houck et al., (1992) J. Biol.
Chem. 267: 26031-26037.
El VEGF es una citoquina homodimérica que se
expresa en al menos cuatro formas de variante de empalme de los
residuos 121-206 (Ferrara y
Davis-Smyth, 1997). Las células endoteliales
vasculares expresan al menos dos receptores de afinidad elevada
para el VEGF: VEGF-R1/Flt-1 y
VEGFR-2/KDR. Los receptores VEGF-R1
y VEGFR-2 son receptores tirosina quinasa, cada uno
de ellos compuesto de un dominio extracelular que contiene 7
segmentos tipo inmunoglobulina, y que se unen al VEGF, una región
corta de membrana y un dominio citosólico que posee actividad
tirosina quinasa. El dominio quinasa sigue directamente a las
regiones extracelulares y yuxtamembrana, y a su vez, está seguido
por otro dominio (dominio post-quinasa), que puede
funcionar en la unión de otras proteínas para la transducción de
señales. Estos dos receptores parecen tener rutas de señalización y
funciones distintas, siendo el VEGFR-2 de
importancia principal en la mitosis de células endoteliales
(Waltenberger et al., (1994) J. Biol. Chem, 269,
26988-26995; Seetharm et al., (1995) Oncogene
10, 135-147; Shalaby et al., (1995)
Nature 376, 576-579).
Tanto el FGF como el VEGF son potentes factores
angiogénicos que inducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos
capilares. La transfección de la línea celular MCF-7
de carcinoma de mama humano con FGF resultó en líneas celulares que
forman tumores metastáticos y de crecimiento progresivo al
inyectarse (s.c.) en ratones desnudos. El FGF puede desempeñar un
factor de importancia fundamental en la progresión de los tumores de
mama hacia a un fenotipo metastático resistente antiestrogénico y
estrógeno-independiente (McLeskey et al.,
(1993) Cancer Res. 53: 2168-2177). Las
células tumorales mamarias mostraron un aumento de la
neovascularización, un aumento de la metástasis espontánea y un
crecimiento más rápido in vivo que el de los tumores no
transfectados. Se ha demostrado que el FGF se transforma en células
NIH-3T3 y está implicado en la tumorigénesis y la
metástasis de tumores mamarios en ratones. La sobreexpresión del
FGF confirió un fenotipo tumorigénico en una línea celular de
carcinoma suprarrenal humano, lo que sugiere que los FGF también
pueden desempeñar una función en la transformación de las células
epiteliales. Los anticuerpos policlonales neutralizantes contra el
FGF inhibieron el crecimiento del tumor en ratones Balb/c desnudos
a los que se transplantaron células K1000 (transfectadas con la
secuencia líder del bFGF) que producen la formación de tumores en
estos ratones (Hori et al., (1991) Cancer Res. 51:
6180-9184).
Debido al papel del FGF en la neovascularización,
la tumorigénesis y la metástasis, existe la necesidad en la técnica
por inhibidores del FGF como potentes agentes anticancerígenos que
ejerzan su actividad anti-FGF evitando la
señalización intracelular del FGF.
Por el contrario, el VEGF es un factor mitogénico
específico de las células endoteliales y un inductor de la
angiogénesis que es liberado por una variedad de células tumorales y
expresado en células tumorales humanas in situ. A diferencia
del FGF, la transfección de líneas celulares con una secuencia de
ADNc que codifica el VEGF no promovió la transformación, sino que
facilitó el crecimiento del tumor in vivo (Ferrara, N., y
Davis-Smyth, T. (1997)). Además, la administración
de un anticuerpo policlonal que neutralizó el VEGF también inhibió
el crecimiento de líneas celulares de rabdomiosarcoma, glioblastoma
multiforme y leiomiosarcoma humanos en ratones desnudos (Kim et
al., (1993) Nature 362: 841-843).
En vista de la importancia del receptor tirosina
quinasa (RTK) en el control, la regulación y la modulación de la
proliferación de células endoteliales y, potencialmente, la
vasculogénesis y/o angiogénesis, se han realizado muchos intentos
por identificar los "inhibidores" del RTK, usando una variedad
de enfoques, incluido el uso de ligandos mutantes (patente
estadounidense nº: 4.966.849), receptores y anticuerpos solubles
(Solicitud nº: WO 94/10202; Kendall y Thomas, (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci., 90: 10705-09; Kim et al.,
1993), ligandos de ARN (Jellinek et al., (1994)
Biochemistry 3:10450-56), inhibidores de la
proteína quinasa C (Shuchter et al., (1991) Cancer
Res., 51: 682-687); Takano et al., (1993)
Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., (1992)
Exp. Cell. Res. 199: 56-62; Wright et
al.,(1992) J. Cellular Phys. 152:
448-57) e inhibidores de la tirosina quinasa (WO
94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente
estadounidense nº: 5.330.992; Mariani et al., (1994) Proc.
Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268).
Más recientemente, los intentos se han enfocado
en la identificación de moléculas pequeñas que actúan como
inhibidores de la tirosina quinasa. Por ejemplo, los compuestos
arilo bis monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT WO
92/20642), los derivados de vinileno-azaindol (PCT
WO 94/14808) y las
1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas
(patente estadounidense nº: 5.330.992) han sido generalmente
descritos como inhibidores de la tirosina quinasa. Los compuestos
de estirilo (patente estadounidense nº: 5.217.999), los compuestos
de piridilo estiril-sustituidos (patente
estadounidense nº: 5.302.606), ciertos derivados de quinazolina
(solicitud EP nº: 0566266 AI), los selenoindoles y seleniuros (PCT
WO 94/03427), los compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO
92/21660) y los compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO
91/15495) han sido descritos como compuestos destinados a un uso
como inhibidores de la tirosina quinasa en el tratamiento del
cáncer. Sin embargo, ninguno de estos compuestos ha sido
previamente asociado con la función enzimática del receptor
VEGFR-2. Asimismo, ninguno de estos compuestos ha
sido asociado con la regulación de la vasculogénesis y/o la
angiogénesis.
Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica
por desarrollar moléculas pequeñas antagonistas de las rutas del
PDGF, FGF, EGF y VEGF individualmente o en grupo. Además, si estas
citoquinas señalizan a través de una segunda ruta mensajera común
dentro de la célula, tales antagonistas tendrán una amplia actividad
terapéutica para tratar o prevenir la progresión de una amplia
selección de enfermedades, tales como restenosis coronaria,
angiogénesis asociada a tumores, aterosclerosis, enfermedades
autoinmunitarias, inflamación aguda, ciertas enfermedades del riñón
asociadas con la proliferación de células glomerulares o
mesangiales, y enfermedades oculares asociadas con la proliferación
de vasos retinales. La presente invención fue realizada mediante el
descubrimiento de un mecanismo de señalización común, un grupo de
agentes terapéuticos activos, que demostraron ser activos mediante
un amplio número y una variedad
de análisis predictivos, y mediante el descubrimiento de un producto intermedio de la señalización intracelular común.
de análisis predictivos, y mediante el descubrimiento de un producto intermedio de la señalización intracelular común.
En base a la homología de secuencias y a la
estructura global de dominios, los VEGFR pertenecen a la familia de
los receptores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGFR, Platetet-Derived Growth Factor
Receptor), que también incluye el PDGFR, PDGFR, el receptor del
factor de crecimiento de células madre (c-kit) y el
receptor del factor-1 estimulante de colonias
(CSF-1R/c-fms) (Van der Geer et
al., (1994) Ann. Rev. Cell Biol., 10,
251-337). En comparación con otras proteínas
quinasas, los miembros de esta familia contienen una inserción de
aproximadamente 65-97 residuos, denominada dominio
de inserción de la quinasa (KID), dentro del dominio catalítico de
la quinasa en relación con otras proteínas quinasas. Dentro de la
familia de los PDGFR, los KID son de longitud variable y una
homología de secuencias baja. La eliminación o mutación del KID del
PDGFR, PDGFR, c-kit y CSF-1R ha
indicado que este dominio no es necesario para la actividad quinasa
intrínseca, pero que es importante para la unión de otras proteínas
que participan en la transducción de señales mediante la
autofosforilación de residuos tirosina del KID (Taylor et
al., (1989) EMBO J. 8, 2029-2037;
Heidaran et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11,
134-142; Yu et al., (1991) Mol. Cell.
Biol. 11, 3780-3785; Kazlauskas et al.,
(1992) Mol. Cell. Biol. 12, 2534-2544;
Lev et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
89, 678-682; Reedjik et al., (1992)
EMBO J. 11, 1365-1372; Bazenet et
al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16,
6926-6936). Aunque las rutas de señalización y el
papel específico del KID todavía no están completamente
determinados para los VEGFR, el KID del VEGFR-2
contiene dos tirosinas que son conocidas por ser sitios de
autofosforilación (Dougher-Vermazen et al.,
(1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 205,
728-738).
Desde la determinación de la primera estructura
de proteína quinasa AMP-dependiente cíclica (cAPK,
cyclic AMP-dependent Protein Kinase)
(Knighton et al., (1991) Science 253,
407-413) se ha informado acerca de una variedad de
estructuras de la proteína quinasa (revisadas en Johnson et
al., (1996) Cell 85, 149-158).
Entre los receptores con actividad tirosina quinasa (RTK), se han
determinado estructuras del dominio de la quinasa receptora de
insulina (IRK, Insulin Receptor Kinase) (Hubbard, et
al., (1994) Nature 372, 746-754;
Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581)
y del receptor-1 del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGFR1, Fibroblast Growth Factor
Receptor-1) (Mohammadi et al., (1996)
Cell 86, 577-87; Mohammadi et
al., (1997) Science 276,
955-960).
La presente invención revela la generación, la
caracterización cinética y la determinación de la estructura de un
dominio quinasa modificado de la proteína VEGFR-2,
que contiene 18 de los 68 residuos el KID. Esta estructura de
cristal de 2,4 \ring{A} del dominio catalítico
VEGFR-2 fosforilado es la primera estructura de un
dominio quinasa de la familia de los PDGFR de la que se tiene
información. Esta estructura ofrece la oportunidad de llegar a
comprender bien la orientación del dominio KID del
VEGFR-2, que puede ser de relevancia para otros
miembros de la familia de los PDGFR. Además, como la inhibición de
la quinasa del VEGFR-2 tiene una amplia
aplicabilidad clínica, esta estructura proporciona una descripción
tridimensional del objetivo de diseñar, en base a la estructura,
inhibidores del VEGFR-2 de moléculas pequeñas como
agentes terapéuticos.
Un objeto de la presente invención consiste en
revelar un procedimiento eficaz para detectar compuestos candidatos
que sean agonistas o antagonistas específicos de varias proteínas
que se pueden incluir en la familia de los receptores tirosina
quinasa (RTK) mediante la cristalización de los receptores RTK y, en
concreto, del receptor VEGFR-2 con el fin de usar
la modelización molecular de los datos obtenidos mediante
cristalografía por rayos X para modelizar la unión de los
compuestos candidatos.
Se revela un procedimiento para diseñar y
detectar compuestos potencialmente terapéuticos con actividades
tales como la de: (1) inhibir la formación de nuevos vasos
sanguíneos, que es útil para tratar o prevenir la progresión de la
retinopatía diabética, los hemangiomas cavernosos, el sarcoma de
Kaposi, los tumores constituidos por células de tipo endotelial y
el crecimiento de células cancerígenas, evitando que desarrollen un
nuevo riego sanguíneo; (2) eliminar el desarrollo de enfermedades
del riñón debidas a la proliferación inducida por citoquinas de
células mesangiales y/o células epiteliales glomerulares, que
resulta útil para tratar o prevenir la progresión de la
glomerulosclerosis diabética y otras glomerulonefritis de varios
tipos y etiologías; (3) evitar la destrucción de articulaciones que
acompaña a la artritis reumatoide debida a la proliferación de
células sinoviales; (4) eliminar las manifestaciones de psoriasis
debidas a la proliferación de queratinocitos y la acumulación de
células inflamatorias; (5) eliminar la aterogénesis acelerada
relacionada con la restenosis de los vasos coronarios u otros vasos
arteriales que sigue a una angioplastia; (6) eliminar la
aterogénesis, la enfermedad de las arterias coronarias y otras
vasculopatías debidas a la aterogénesis; y (7) eliminar el
crecimiento tumoral mediante respuestas mediadas por la paracrina o
la autocrina hacia otras citoquinas tales como PDGF, FGF, EGF o
VEGF, que es útil en el tratamiento y la prevención de la progresión
de tumores tales como el cáncer de mama estimulado mediante la
sobreexpresión del receptor
her-2-neu, en el que el
procedimiento de la invención comprende administrar un compuesto
que inhiba la transducción de señales.
La presente invención es útil en el desarrollo de
procedimientos que son usados en el procedimiento iterativo del
diseño de fármacos. El procedimiento identifica los agonistas y los
antagonistas potenciales del VEGFR-2 mediante el
diseño de novo de novedosas moléculas candidatas a
convertirse en fármacos que se unen al receptor
VEGFR-2 para aumentar su fuerza. Las coordenadas
cristalográficas por rayos X reveladas en la presente memoria
permitirán la generación de modelos tridimensionales del sitio
catalítico y el sitio de unión al fármaco de la proteína
VEGFR-2.
El diseño de novo consiste
fundamentalmente en la generación de moléculas mediante el uso de
programas informáticos que construyen y enlazan fragmentos o átomos
en un sitio basándose en la complementariedad estérica y
electrostática, sin hacer referencia a las estructuras análogas de
sustrato. El procedimiento de diseño de fármacos comienza cuando se
resuelve la estructura de un RTK diana a al menos una resolución de
2,8 \ring{A}. El refinado de la estructura a una resolución de
2,5 \ring{A} o mejor, con moléculas de agua "fijas" en su
sitio, proporciona condiciones más óptimas para llevar a cabo el
diseño de fármacos.
La memoria identifica dominios KID de proteínas
de la familia de los RTK y desarrolla supresiones en dichos KID, de
manera que las proteínas serán cristalizables y adecuadas para su
medición mediante procedimientos cristalográficos por rayos X.
La memoria revela un procedimiento por medio del
cual las regiones KID de un miembro de la familia de los RTK de
genes tales como PDGF, EGF, VEGF y otros, son modificadas mediante
la eliminación de aminoácidos de las regiones KID para conferir
características físicas favorables al producto polipeptídico
resultante. Los ejemplos de tales características físicas
favorables son el aumento de la solubilidad, una mayor estabilidad
frente a variaciones térmicas, lo que hace que el polipéptido sea
adecuado para su análisis mediante resonancia magnética nuclear, un
rendimiento elevado de detección, caracterizaciones bioquímicas,
cristalografía por rayos X, calorimetría y otros procedimientos de
diagnosis.
Todavía otro objeto de esta invención consiste en
desarrollar procedimientos de detección usados en el procedimiento
de diseño de fármacos para detectar agonistas y antagonistas
potenciales de proteínas de la familia de los RTK mediante el
diseño de novo de novedosas moléculas candidatas a formar
fármacos con potencias potencialmente nanomolares. Las coordenadas
cristalográficas por rayos X basadas en la eliminación de dominios
KID mutados y en otras varias eliminaciones de dichas proteínas de
la familia de los RTK, permitirán la generación de modelos
tridimensionales del sitio de unión activo de las proteínas de la
familia de los RTK.
Figura 1: asignaciones de estructura secundaria
(como las ofrecidas por Procheck) para el dominio catalítico del
VEGFR-2 y alineamiento de secuencias con otro
receptor tirosina quinasa representativo. Las hélices son
designadas por B-1, las cadenas \beta son
designadas por 1-8. La eliminación del sitio de 50
residuos en el VEGFR-2 viene indicada mediante I.
El sitio de la mutación E990V del VEGFR2D50 es designado por un *.
Las secuencias son de: VEGFR-2 (aquí informado);
FGFR1 (base de datos suiza de proteínas #P11362); IRK (base de datos
de proteínas EMBL #A18657; numeración como la de Mohammadi et
al., 1996); # VEGFR1 (base de datos suiza de proteínas
#P17948); PDGFR (base de datos suiza de proteínas #P17948).
Figura 2: pliegue total de
VEGFR-2 50P, FGFR1 e IRPK.
Representación del eje de las estructuras de los
dominios quinasa de (A) VEGFR2 (VEGFR2 50P), (B) FGFR1 (molécula A
de la entrada 1FGK del PDB, Mohammadi et al., 1996), y (C)
IRKP (entrada 1IR3 del PDB, Hubbard et al., 1997). Las
vistas mostradas en A, B y C son vistas idénticas generadas a partir
de las superposiciones de los dominios C-terminales.
Las posiciones de los terminales son designadas por N y C. El bucle
de unión a nucleótidos (naranja), el dominio de inserción de la
quinasa (rosa) y el bucle de activación (amarillo) están marcados.
En (C), el enlace AMP-PNP se muestra en color verde
y el sustrato peptídico, en rojo. La figura fue preparada con
INSIGHT II.
INSIGHT II.
Figura 3: sitio catalítico de
VEGFR-2 50P e IRPK.
Sección del sitio catalítico de las estructuras
de (A) VEGFR2 50P y (B) IRPK (entrada 1IR3 del PDB; Hubbard et
al., 1997). Los átomos están coloreados según el tipo de
elemento: carbono (verde), oxígeno (rojo), nitrógeno (azul), azufre
(amarillo), fósforo (rosa) e ión de magnesio (naranja). (A) sólo
incluye átomos de proteínas. (B) incluye átomos de proteínas, átomos
AMP-PNP e iones de Mg^{2+}. La figura fue generada
usando INSIGHT II.
Figura 4: sitio de unión a nucleótidos de la
VEGFR2 50P y del FGFR1.
Vista estereoscópica que muestra el trazo C y
algunas cadenas laterales de una superposición de sitios de unión a
nucleótidos de la estructura de la VEGFR2 50P y del complejo
FGFR1-(AMP-PCP) (molécula B, Mohammadi et
al., 1996). La superposición fue realizada usando las posiciones
C de las hélices (D, E, F, G, H e I) de los lóbulos
C-terminales. Los átomos de carbono de la VEGFR2 50P
se muestran en amarillo y los átomos de carbono del FGFR1 se
muestran en morado. El color del resto de átomos de proteína es:
oxígeno (rojo), nitrógeno (azul) y azufre (verde). El
AMP-PCP de la estructura del FGFR1 está representado
en naranja. Las etiquetas corresponden a los residuos de la VEGFR2
50P. La figura fue creada con Xfit (McRee et al., (1992)
J. Mol. Graph. 10, 44-46).
Figura 5: mapa de densidad de electrones del área
del dominio de inserción de la quinasa de la VEGFR2 50P.
Vista estereoscópica de un mapa
2F_{O}-F_{C} calculado a 2,4 \ring{A} y acotado
a 1,2, y superpuesto con el modelo refinado. Los átomos de carbono
son amarillos, los de oxígeno son rojos y los átomos de nitrógeno
son azules. Las moléculas de agua están representadas como cruces
rojas. La figura fue creada con Xfit (McRee et al.,
1992).
Figura 6: dominio de inserción de la quinasa de
la VEGFR-2 50P. Sección estereoscópica que muestra
los residuos ordenados del dominio de inserción de la quinasa de la
VEGFR2 50P. Los átomos de carbono son amarillos, los de oxígeno son
rojos, los átomos de nitrógeno son azules y los átomos de azufre son
verdes. La vista está girada aproximadamente 180º con respecto a la
figura 5. La figura fue creada con Xfit (McRee et al.,
1992).
La secuencia codificante (Terman et al.,
(1992) Biochem Biophys. Res. Commun. 187,
1579-86) para el dominio citoplásmico del
VEGFR-2 fue amplificada por PCR (Polymerase Chain
Reaction, reacción en cadena de la polimerasa) (Mullis et
al., (1986). Biotechnology 24, 17-27)
desde una mezcla de ADNc de aorta humana (Clontech Palo Alto, CA).
Se amplificaron independientemente dos secuencias solapantes. Vcyt
(residuos M806-V1356), que representaba el dominio
citoplásmico completo, y Vcat (residuos
C817M-G1191), cuyos límites estaban basados en un
alineamiento de secuencias de aminoácidos primarios con el dominio
catalítico del receptor quinasa de insulina (Wei et al.,
(1995) J. Biol. Chem. 270,
8122-8130).
Las secuencias cebadoras de oligonucleótidos por
PCR para la Vcyt fueron:
- Vcyt5 5'-CAGCATATGGATCCAGATGAACTCCCATTGG-3' y
- Vcyt3 5'-GCGGTCGACTTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTG-3'
Las secuencias cebadoras de oligonucleótidos por
PCR para la Vcat fueron:
- Vcyt5 5'-GCACATATGGAACGACTGCCTTATGATGCCAGC-3' y
- Vcyt3 5'-CCTGTCGACTTATCCAGAATCCTCTTCCATGCTCAAAG-5'
El ADN amplificado fue digerido con las enzimas
de restricción Ndel y Sall, ligadas dentro del plásmido pET24a de
E. coli (Novagen Madison, WI) y la secuencia verificada. Al
compararlo con la secuencia original del VEGFR-2 del
banco de genes (número de adquisición 346345) se advirtieron dos
diferencias en los nucleótidos que resultaron en cambios de codón
(Glu848-Val y Asn835-Lys) tanto en
Vcyt como en Vcat. Nuestra secuencia coincide con los depósitos
posteriores del banco de genes de VEGFR-2 (números
de adquisición 2655412 y 3132833).
Se introdujeron mutaciones mediante mutagénesis
dirigida en sitios oligonucleótidos (Kunkel, 1985) usando el equipo
de mutagénesis in vitro de Muta-Gene
(Bio-Rad Hercules, CA). El fragmento de ADN de Vcat
fue subclonado a partir del vector pET24a usando una digestión
Ndel-Xhol dentro del vector pMGH4 (Schoner et
al., 1986, Kan et al., 1992) y se usó este vector para
generar el molde uracilo de ADNmc (cadena negativa) en la cadena
CJ236 de E. coli suministrada en el equipo. Se diseñó un
oligo
(5'-CTCAGCAGGATTGATAAGACTACATTGTTC-3')
para crear un constructo (Vcat(G1172-G1191))
que truncó el terminal C al residuo D1171. Se diseñó otro oligo
(5'-GAATTTGTCCCCTACAAGGAAGCTCCTGAAGATCTG-3')
para eliminar los 50 residuos centrales (residuos
T940-E989) del dominio de inserción de la quinasa,
basándose en un alineamiento de secuencias con el FGFR1 (Mohammadi
et al., 1996). El análisis de las secuencias detectó una
mutación involuntaria de Glu990-Val. Todas las
modificaciones de ADN y las enzimas de restricción fueron adquiridas
en New England Biolabs, y los oligonucleótidos, en Genosys
Biotechnology.
El constructo VEGFR2 50 fue realizado en varias
etapas para combinar las mutaciones necesarias en el vector de
expresión del baculovirus pAcSG2 (Pharmingen San Diego, CA). Etapa
1: se subclonó por PCR la región codificante para Vcyt del vector
pET24a a los sitios Ncol-Kpnl del vector pAcSG2.
Etapa 2: Se ligó un fragmento de ADN de los sitios
Scal-BgIII de 2358bp del plásmido
pMGH4-Vcat (T940-E989, E990V) con un
fragmento de ADN de los sitios BgIII-Scal de 1695bp
del pMGH4-Vcat (G1172-G1191),
creando un vector pMGH4-Vcat
(T940-E989,E990V, G1172-G1191).
Etapa 3: Se ligó un fragmento de ADN de los sitios
BstEII-Eagl de 913bp del plásmido
pMGH4-Vcat (T940-E989,E990V,
G1172-G1191 ) con un fragmento de ADN de los sitios
Eagl-BstEII de 3290bp del
pAcSG2-Vcyt, creando un vector
pAcSG2-Vcyt (T940-E989,E990V,
G1172-G1191), también denominado VEGFR2 50. Se
verificó la secuencia de este constructo final a lo largo de toda
la región codificante y se confirmó que sólo contiene estas
mutaciones conocidas de la secuencia de tipo natural (secuencia
mostrada en la figura 1).
Se transfectó el ADN codificante del VEGFR2 50 en
células Sf9 con ADN de baculovirus linearizado según el protocolo
del fabricante (Pharmingen San Diego, CA). Se aislaron placas
individuales de esta transfección y se generaron patrones de alto
valor. Se examinaron todos los patrones mediante el aislamiento del
ADN baculoviral y la amplificación por PCR de la inserción usando
los cebadores poliédricos directos e inversos (Invitrogen). Se
infectaron las células Sf21 a 1-1,5 millones de
células/mL a un MOI = 5 durante 72 horas y se cosecharon mediante
centrifugación.
Se lisaron las pellas celulares mediante la
homogeneización con un Dounce y el tratamiento con ultrasonidos en
20 mM de Tris pH 8,0, 0,20 mM de NaCl, 5 mM de DTT y glicerol al 5%
(v/v). Se centrífugo el lisado durante 50 minutos a 35.000 rpm en
un rotor Ti45. Se cargó la fracción soluble en una columna de
intercambio aniónico Q-30 de 40 ml (Pharmacia) y se
eluyó con un gradiente de NaCl de 20 mM a 600 mM en 20 mM de Tris pH
8,0, 5 mM de DTT y glicerol al 5% (v/v) sobre 20 volúmenes de
columna. Se elaboró una mezcla de proteína VEGFR2 50 mediante
análisis por electroforesis SDS-PAGE y mediante la
presencia de actividad quinasa medida frente a sustrato de péptido
gastrina (Boehringer Mannheim). Se cargó el material mezclado sobre
una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad) de 40 mL y
se lavó en profundidad con 20 mM de Tris, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 5
mM de DTT y glicerol al 5%. Se eluyó la proteína usando un gradiente
lineal de 500 mL de 0 a 50 mM de fosfato de potasio, pH 8,0, 50 mM
de NaCl, 5 mM de DTT y glicerol al 5%. Se elaboró una mezcla de
proteína VEGFR2 50 mediante análisis por electroforesis
SDS-PAGE y mediante la presencia de actividad
quinasa medida frente al péptido gastrina. Entonces se diluyó 1:1 el
material de esta columna con 20 mM de Tris, pH 8,0, 20 mM de NaCl, 5
mM de DTT y glicerol al 5%, y se cargó sobre una columna de
intercambio aniónico Q-15 de 8 mL (Pharmacia). Se
eluyó la proteína usando un gradiente de NaCl lineal de 180 mL (20
mM-175 mM) en 20 mM de Tris, pH 8,0, 5 mM de DTT y
glicerol al 5%. Se realizó una mezcla de proteína VEGFR2 50 como se
describe anteriormente. Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} 4
M a la mezcla a una concentración final de 0,6 M y se cargó la
mezcla sobre una columna HP-fenil sefarosa de 10
mL (Pharmacia). Se eluyó la proteína VEGFR2 50 usando un gradiente
lineal inverso de 200 mL de (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,6 M a
0 M en 20 mM de Tris y 5 mM de DTT. La proteína VEGFR2 50 purificada
fue intercambiada con un tampón en 50 mM de HEPES, pH 7,5, 10 mM de
DTT, glicerol al 10% y 25 mM de NaCl sobre una columna
G-25 de 500 ml (Pharmacia), y concentrada hasta 1 mg
de proteína/mL a través de una membrana de polisulfona con un corte
de 10 kD (Amicon). Se separaron partes alícuotas del material final
y se ultracongeló en N_{2} líquido, para almacenarlo a -70ºC.
Los análisis espectrofotométricos acoplados
fueron realizados con proteína VEGFR2 50 purificada que fue
autofosforilada en las siguientes condiciones: proteína (4 mM), ATP
(3 mM), MgCl_{2} (40 mM), DTT (5 mM), en HEPES (100 mM), glicerol
al 10%, pH 7,5 a 4ºC durante 1 hora.
Los ensayos con tirosina quinasa fueron
monitorizados usando un espectrofotómetro DU 650 de Beckman. La
producción de ADP fue acoplada a la oxidación del NADH usando
fosfoenolpiruvato (PEP) a través de las acciones de la piruvato
quinasa (PK, Pyruvate Kinase) y la deshidrogenasa láctica
(LDH, Lactic DeHydrogenase). Se monitorizó la oxidación del
NADH siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm (e_{340} =
6,22 cm^{-1} mM^{-1}). Las soluciones típicas de reacción
contenían: 1 mM de PEP, 250 mM de NADH, 50 unidades de LDH/mL, 20
unidades de PK/mL, 5 mM de DTT, en 200 mM de HEPES, pH 7,5 y
concentraciones variables de poli(E4Y1) (Sigma), ATP y
MgCl_{2}. Los análisis se iniciaron con 40 nM de proteína VEGFR2
50.
Se acopló la generación de ATP a la producción
del NADH mediante la acción de la hexoquinasa (HK,
HexoKinase) y la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PD, Glucose-6-Phosphate
Dehydrogenase). En este análisis, la HK cataliza la conversión
del ATP a ADP y glucosa-6-fosfato.
Luego la glucosa-6-fosfato es
oxidada a
D-6-fosfogluconopiranosa-1,5-lactona
mediante la G6PD con la reducción concomitante de NAD a NADH, que
puede ser monitorizada a 340 nm. La solución típica del análisis
contenía: glucosa (10 mM), NAD (40 mM), DTT (5 mM), MgCl_{2} (4
mM), HK (15 unidades/mL), G6PD (15 unidades/mL) y las
concentraciones indicadas de ADP y
fosfo-poli(E4Y). Las reacciones fueron
iniciadas con la adición de la proteína VEGFR2 50
(600-900 nM).
En base a los análisis espectrofotométricos y
cinéticos anteriores, es posible evaluar los candidatos agonistas o
antagonistas potenciales de la proteína VEGFR2 50 mediante la
adición competitiva de los compuestos candidatos en el análisis
anterior. Como se expone anteriormente, las cinéticas de la
actividad de la proteína VEGFR2 50 fueron medidas frente al péptido
gastrina. Se mide la actividad en presencia y en ausencia de un
compuesto candidato, y se comparan los datos cinéticos resultantes.
La afinidad del candidato por el receptor quedará reflejada en el
cambio hacia la derecha de las curvas cinéticas, que indica un
antagonista competitivo, o con el descenso de la actividad máxima,
que indicaría un antagonismo no competitivo. Por el contrario, un
cambio de las curvas cinéticas hacia la izquierda indicaría un
agonista competitivo de a la proteína VEGFR2 50. Véase, en general,
Bourne, H. R., et al., en (1987) Basic & Clinical
Pharmacology (Katzung et al., eds (Cap. 3)
9-22.
Se descongelaron partes alícuotas de proteína
VEGFR2 50 congelada mediante su inmersión en H_{2}O fría, y se
mezclaron a 4ºC. Se añadió MgCl_{2} y ATP a 26 mM y 4 mM,
respectivamente. Se incubó VEGFR2 50 a 4ºC durante 1 hora. Entonces
se intercambió este material (VEGFR2 50P) con un tampón en una
solución de 10 mM de HEPES, pH 7,5, 10 mM de DTT y 10 mM de NaCl, y
se concentró usando un Centripep-10 (Amicon) a 5 mg
de proteína/mL.
Digestión con tripsina: las digestiones
con tripsina de VEGFR2 50 y VEGFR2 50P purificados fueron realizadas
a 37ºC usando 0,37 mg/ML de proteína en 25 mM de NH_{4}HCO_{3}
a pH 7,7 con un volumen de reacción de 100 L durante dos días.
\newpage
MALDI (Matriz-Assisted Laser
Desorption Ionization, ionización por desorción láser asistida
por matriz) / EM: Los análisis MALDI/EM fueron realizados en un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de
Voyager-Elite con extracción retrasada (PerSeptive
Biosystems, Inc., Framingham, MA). Se mezcló un volumen de 1 L de
muestra de proteína digerida con 1 L de matriz (ácido
a-ciano-4-hidroxi-cinámico)
en una solución al 50% (v/v) de acetonitrilo y ácido
trifluoroacético al 0,25% (p/p) en agua. Las muestras fueron
radiadas con un láser de nitrógeno manejado a 337 nm.
NanoIES-EM. Los análisis de
NanoIES-EM fueron realizados en un espectrómetro de
masas de triple cuadrupolo (PE Sciex API III, Alberta, Canadá)
modificado con una fuente de NanoIES de Protana A/S (Dinamarca). El
voltaje de la IES fue fijado a 700 V y las configuraciones de los
orificios fueron mantenidas a 100 V. Se mezclaron 3 L de proteína
digerida con 7 L de metanol y 0,5 L de ácido fórmico, y luego se
inyectaron 4 L de esta muestra en el espectrómetro de masas. Se
usaron detectores de iones para obtener la secuencia de
fosfopéptidos.
Se concentró VEGFR2 50 fosforilado purificado a
una media de 5 mg de proteína/mL usando un concentrador centrífugo
Centricon-10. Se agrandaron los cristales mediante
el procedimiento de difusión de vapor en gotas pendientes a 4ºC.
Las gotas que contenían 2 L de solución proteica y 2 L de una
solución de licor madre (100 mM de HEPES a 7,2, 2M de
(NH_{4})_{2}SO_{4} y monometiléter polietilen glicol al
2% (v/v) PM = 550) fueron equilibradas por encima de una reserva de
1 mL de la solución de licor madre, a la que se habían añadido 50 mM
de mercaptoetanol. Los cristales aparecieron tras
3-4 días y se agrandaron hasta 0,3 x 0,2 x 0,5 mm
durante 21 días.
Las colecciones de datos de difracción por rayos
X recogidas usando un generador de rayos X de ánodo giratorio Rigaki
RU-200 (CuK) manejado a 50 kV y 100 mA, y equipado
con espejos de super enfoque y un detector de placa de imágenes de
investigación MAR345 MAR. La recogida de los datos relativos a los
cristales congelados fue realizada transfiriendo un cristal a una
solución crioprotectora (100 mM de HEPES a pH 7,2, 2,2 M de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,6 M de sacarosa, 0,55 M de
glucosa y monometiléter polietilen glicol al 2% (v/v) PM = 550),
ultracongelando el cristal en nitrógeno líquido y transfiriendo
luego el cristal congelado a una corriente de nitrógeno a -186ºC.
Los datos fueron integrados y sometidos a escala usando DENZO y
SCALEPACK (Otwinowski, 1993). En la tabla 2, se ofrece las
estadísticas de la colección de datos.
Se obtuvieron las fases proteicas iniciales
usando el programa de reemplazo molecular AMoRe (Navaza, 1994), la
molécula 1 de la estructura del FGFR1 (Mohammadi et al.,
1996; entrada 1FGK del PDB) como sonda de búsqueda y la colección
de datos native1. Se alcanzó la solución correcta incluyendo las
cadenas laterales de FGFR1 y quitando de los residuos móviles del
bucle de activación (640-660) el terminal N
(464-467), un bucle corto (517-520)
y el terminal C (760-762) del modelo de búsqueda. La
solución correcta fue el máximo de las funciones de rotación y
translación con un coeficiente de correlación de 0,31. El refinado
de los cuerpos rígidos en el programa AMoRe mejoró la solución a un
coeficiente de correlación de 0,49 y un factor-R del 46,3%
en el intervalo de resoluciones de 12,0-4,0
\ring{A}. Se verificó la exactitud de esta solución mediante el
cálculo de una diferencia Fourier con un derivado de
Kau(CN)_{2}. Este derivado fue generado empapando un
cristal durante 3 días en una solución de reserva que contenía 0,5
mM de Kau(CN)_{2}, y aumentando luego la
concentración de átomos pesados hasta 5 mM y empapándolo durante 64
horas más. El escalado de las colecciones de datos, los cálculos de
Patterson, los cálculos de Fourier y la generación de las fases
fueron realizados usando el Xtalview (McRee et al.,
1992).
El refinado del modelo fue realizado usando el
programa Xplor versión 3.1 (Brünger, 1992). Los cálculos de los
mapas de densidad de electrones y el ajuste del modelo fueron
realizados usando el programa XtalView (McRee et al., 1992).
Se comenzó el refinado usando una colección de datos recogida a 4ºC
(native2) y se completó usando una colección de datos (native3)
recogida a -186ºC. El factor-R final es de 20,2%
para los datos del intervalo de 8-2,4 \ring{A}
(F_{O} > 2\delta). El valor B medio para todos los átomos es
de 31,8 \ring{A}^{2} para átomos de proteínas y de 42,8
\ring{A}^{2} para las moléculas de agua. El modelo final incluye
los residuos 820-939, 998-1047 y
1064-1168; de estos residuos, las cadenas laterales
de K838, R842, F845, K939, D998, K1023, R1027, Y1038, K1039, K1110
y E1113 no pudieron ser modelizadas más allá de C debido a la falta
de densidad interpretable. El análisis de los ángulos de torsión de
la cadena principal como el realizado usando PROCHECK (Laskowski
et al., 1993) muestra que de los 275 residuos del modelo no
se da ninguno en la región deshabilitada y que sólo se dan 4 en la
región generosamente habilitada de una línea de Ramachandran. Se
ajustaron 182 moléculas de agua a los máximos de densidad de
electrones que eran mayores de 3 \delta y estaban localizados en
posiciones para formar enlaces de hidrógeno razonables con la
proteína u otras moléculas de agua.
Las superposiciones de varias estructuras quinasa
fueron realizadas usando el programa de gráficos Insight II
(Molecular Simulations Inc., San Diego, CA).
El dominio tirosina quinasa del
VEGFR-2 humano al que le faltaban 50 residuos
centrales de los 68 residuos del KID fue expresado en un sistema
celular de baculovirus/insecto. De los 1.356 residuos del
VEGFR-2 de longitud completa, este constructo
(VEGFR2 50) contiene los residuos 806-939 y
990-1171 del dominio citosólico (Figura 1). El
VEGFR2 50 también contiene la mutación de un punto (E990V) dentro
del KID en comparación con el VEGFR-2 de tipo
natural.
Además de catalizar su autofosforilación, el
VEGFR2 50 también es capaz de catalizar la fosforilación de un
sustrato exógeno poli(E4Y). El análisis detallado de su
cinética (tabla 1) reveló que sus parámetros cinéticos eran casi
idénticos a los de un constructo de proteína VEGFR-2
comparable que contenía el KID completo (Parast et al., en
imprenta). La agrupación de estos resultados indica que el VEGFR2 50
es una enzima funcional completamente activa. Por lo tanto, la
eliminación de los 50 residuos centrales del KID no ha producido
ningún efecto sobre las etapas catalíticas de la reacción de
fosfotransferencia. También se determinó que la eliminación de más
de 60 aminoácidos de la región KID produjo una disminución de la
actividad de la enzima.
| Reacción directa | |||
| Sustrato | K_{M} (Mm) | K_{cat} (s^{-1}) | K_{cat}/K_{M} (s^{-1}M^{-1}) |
| MgATP | 0,153 | 13,3 | 87 x 10^{3} |
| Poli(E_{4}Y) | 2,1 | 63 x 10^{2} | |
| Mg^{2+} | 6,8 | 20 x 10^{2} |
\vskip1.000000\baselineskip
| Reacción inversa | |||
| Sustrato | K_{M} (Mm) | K_{cat} (s^{-1}) | K_{cat}/K_{M} (s^{-1}M^{-1}) |
| MgADP | 0,056 | 0,13 | 23 x 10^{2} |
| P-poli(E_{4}Y) | 1,0 | 13 x 10^{1} |
La secuencia KID del VEGFR-2 es
hidrófila y está altamente cargada, conteniendo 6 residuos de
lisina, 5 residuos de arginina, 8 residuos de ácido glutámico y 5
residuos de ácido aspártico (figura 1). Inicialmente se generaron
varios constructos proteicos que contenían el dominio catalítico del
VEGFR-2 con el KID completo. Después de que varios
intentos exhaustivos por cristalizar estos constructos proteicos no
llegaron a producir ni siquiera cristales marginales, se creó el
constructo VEGFR2 50 para probar la idea de que el KID altamente
cargado estaba interfiriendo en la cristalización. Según lo
determinado mediante dispersión dinámica de la luz, este constructo
VEGFR2 50, que eliminó 14 residuos cargados, mostró una estabilidad
sustancialmente mejor a la temperatura y a la concentración de
proteínas que los constructos proteicos que contenían el KID
completo.
Para realizar la cristalización, se realizó la
autofosforilación in vitro del VEGFR2 50 purificado mediante
su incubación con MgATP. El análisis mediante ionización por
desorción láser asistida por matriz (MALDI,
Matriz-Assisted Laser Desorption Ionization)
y mediante espectrometría de masas mediante ionización por
nanoelectrospray (NanoIES) de la proteína VEGFR2 50 (VEGFR2 50P)
fosforilada de longitud completa y de péptidos digeridos por
triptina indica la fosforilación de Y1059 usando las condiciones de
autofosforilación aquí descritas. Se obtuvieron cristales
difractantes a 2,2 \ring{A} de la VEGFR2 50P en un estado
desligado. Los cristales pertenecen al grupo espacial ortorómbico
P2_{1}2_{1}2_{1} con una molécula de la VEGFR2 50P en la
unidad asimétrica. Las fases cristalográficas iniciales fueron
determinadas mediante reemplazo molecular usando la estructura del
dominio quinasa no fosforilado del FGFR1 (Mohammadi et al.,
1996) como modelo de búsqueda. La exactitud de la solución del
reemplazo molecular fue verificada usando un derivado del cianuro de
oro. Sin embargo, no se usaron los datos del derivado para los
cálculos de fase de los mapas de densidad de electrones usados para
construir el modelo. La estructura ha sido refinada a un
factor-R de 20,2% para los datos de
8-2,4 \ring{A} (F_{O} > 2\delta).
Los residuos de la VEGFR2 50P para los que no se
modelizaron átomos estructurales debido al desorden incluyen los
residuos N-terminales 806-819,
residuos 990-997 del KID, residuos
1048-1063 del bucle de activación y residuos
1169-1171 del terminal C. En la tabla 2, se incluyen
las estadísticas de la determinación de la estructura.
| Colección de datos | Native (3) | Native (1) | Native (2) | KAu(CN)_{2} |
| Resolución de datos (\ring{A}) | 15-2,2 | 20-3,0 | 15-2,4 | 15,3,1 |
| Rsim (%) | 5,2ª (19,6)^{b} | 8,4 (19,2) | 7,0 (21,9) | 7,1 (19,5) |
| Totalidad (%) | 93,0 (81,0) | 97,5 (98,4) | 98,8 (98,8) | 96,5 (95,0) |
| Temperatura (ºC) | -186 | ambiente(\sim21) | 4 | 4 |
| Célula unitaria a (\ring{A}) | 95,41 | 97,10 | 98,52 | 97,71 |
| Célula unitaria b (\ring{A}) | 96,04 | 96,94 | 96,50 | 96,97 |
| Célula unitaria c (\ring{A}) | 38,22 | 38,63 | 38,56 | 38,52 |
| Resolución del refinado (\ring{A}) | 8-2,4 | - | - | - |
| R refinado (%) | 20,2^{c,d} | - | - | - |
| ^{a}Rsim = hkl il|^{/}i (hkl)-</(hkl)>|^{/}hkl i^{/}i (hkl) | ||||
| ^{b} El valor entre paréntesis es para el más alto (estructura de resolución) | ||||
| ^{c}R = hkl||F_{o}(hkl)|-|F_{c} (hkl)||^{/} hkl|F_{o}(hkl)| | ||||
| \hskip0.5cm en la que F_{o} y F_{c} son los factores estructurales observados y calculados, respectivamente (F_{o} > 2) | ||||
| ^{d}El modelo incluye 275 residuos de proteína y 182 moléculas de agua. |
Análoga a las estructuras anteriormente
presentadas de proteínas quinasa tanto de serina/treonina como de
tirosina, la VEGFR2 50P está plegada en dos lóbulos con la catálisis
de la fosfotransferencia teniendo lugar en una hendidura entre dos
lóbulos (revisado en Cox et al., 1994; Johnson et al.,
1996). En la figura 2a, se muestra el trazo AC de la estructura de
la VEGFR2 50P. Los elementos estructurales secundarios de la
quinasa son designados (figura 1) según la convención ofrecida
originalmente a la cAPK (Knighton et al., 1991). El lóbulo
del terminal N (aproximadamente, los residuos
820-920) se pliega en una hoja retorcida con una
hélice (C). La estructura comprende cinco cadenas antiparalelas
(1-5), tres de las cuales (1-3)
están altamente curvadas y se enroscan sobre las otras dos cadenas
(4-5). El dominio C-terminal más
largo (aproximadamente, los residuos 921-313)
contiene dos cadenas antiparalelas (7-8), que se
extienden en la parte superior del dominio
C-terminal adyacente a la hoja
N-terminal. Hay siete hélices (D, E,
E-F, G, H, I) que forman el resto del núcleo del
dominio C-terminal. Como otras quinasas, la VEGFR2
50P contiene dos regiones de bucle funcionalmente importantes: el
bucle de unión a nucleótidos ricos en glicina (residuos
841-846), el bucle catalítico (residuos
1026-1033) y el bucle de activación (residuos
1046-1075) (figuras 1 y 2a).
De las estructuras de quinasa presentadas, la
estructura de la VEGFR2 50P es la que más se asemeja a la del
dominio catalítico del FGFR1 (Mohammadi et al., 1996; entrada
1FGK del PDB) con la que comparte aproximadamente el 55% de
identidad secuencial (figura 1). Como las dos moléculas de la unidad
asimétrica cristalográfica de la solución estructural del FGFR1 son
muy similares, las comparaciones con respecto a la VEGFR2 50P serán
fundamentalmente descritas sólo para la molécula A del FGFR1. El
solapamiento de los mínimos cuadrados de las posiciones 82C de
(1-5) del lóbulo N-terminal o de los
residuos de las posiciones 152C (D, E, F, G, H, I) del lóbulo
C-terminal entre el FGFR1 y la VEGFR2 50P resultan
en las respectivas desviaciones rms de 0,40 \ring{A} y 0,52
\ring{A}. Una rotación relativa de aproximadamente 5º entre los
dos lóbulos resulta en que la hendidura interlobular de la VEGFR2
50P es ligeramente más larga y más abierta. La medida de las
distancias entre los C equivalentes (K523 y R675 del FGFR1, S877 y
R1080 de la VEGFR2 50P) en los extremos de la hendidura revelan que
esta distancia es de 25,3 \ring{A} en la VEGFR2 50P en comparación
con los 23,2 \ring{A} del FGFR1. Sin embargo, ésta es una
diferencia menor, si se compara con las rotaciones lobulares
relativas mucho más largas observadas entre las estructuras quinasa
de varias ligaduras y los estados de fosforilación (Johnson et
al., (1996) Cell 85, 149-158).
Por ejemplo, la orientación interlobular aquí observada para la
VEGFR2 50P se encuentra en una configuración aproximadamente 20º más
abierta que la observada en la estructura compleja ternaria del
dominio de la quinasa fosforilada del enlace IRK al
AMP-PNP análogo de ATP y un sustrato peptídico
(Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581;
entrada 1IR3 del PDB) (figura 2c).
Mientras que las posiciones de -cadena del lóbulo
N-terminal coinciden bien entre la VEGFR2 50P y el
FGFR1, las estructuras divergen significativamente en los residuos
N-terminales que preceden a la primera región
conservada que comienza en el residuo W827 (figura 2a y 2b). Los 14
primeros residuos (M806-E819) de la VEGFR2 50P
están completamente desordenados y los siete siguientes residuos
(L820-R826) forman una estructura de bucle
extendido. Es probable que los residuos 806-819 no
formen parte de la región quinasa activa, sino que, en cambio,
formen parte de, o sean adyacentes a, la región yuxtamembrana del
VEGFR-2. Los residuos 820-826
parecen formar parte del dominio quinasa, aunque de uno flexible,
como los residuos análogos también se encuentran ordenados en las
estructuras del FGFR1, de la IRK y la Lck de tirosina quinasa no
receptora (Yamaguchi y Hendrickson, (1996) Nature
384, 484-489). En el dominio de inserción de
la quinasa y en el bucle de activación se dan otras diferencias
entre la estructura de la VEGFR2 50P y otras estructuras quinasa
(tratadas más abajo).
En las proteínas quinasa, el bucle entre E y 7 ha
sido denominado bucle catalítico pues contiene un ácido aspártico
invariante (D1028) que se cree que funciona como una base catalítica
en la reacción de fosfotransferencia (Johnson et al., 1996).
Este ácido aspártico es parte del tramo de residuos
(H1026-N1033) cuya secuencia HRDLAARN está
altamente conservada entre las proteínas tirosina quinasas. En la
VEGFR2 50P, la posición del eje y las posiciones de la mayoría de
las cadenas laterales de este bucle son similares a las del FGFR1 no
ligado y las estructuras complejas ternarias de la IRK fosforilada
(IRKP). Como se observa en estas estructuras anteriores, el
carboxilato de cadena lateral del ácido aspártico del bucle
catalítico (D1028) está unido mediante puentes de hidrógeno a las
cadenas laterales de la arginina conservada (R1032) y la asparagina
(N1033) (figura 3).
El sitio de unión a ATP de las proteínas quinasa
se encuentra en la hendidura entre los lóbulos
N-terminal y C-terminal (figura 2c).
Para la VEGFR2 50P, los residuos que forman este sitio están
fundamentalmente constituidos por residuos
E917-N913, que unen los dos lóbulos, y los residuos
L840-I849 que incluyen las partes de 1, 2 y el bucle
rico en glicina de G841-G846. El bucle rico en
glicina, también denominado bucle de unión a nucleótidos, es un
segmento flexible cuya posición difiere entre las estructuras
quinasa en varios estados activados y ligados. En la VEGFR2 50P,
este bucle está bastante bien ordenado y todos los átomos pudieron
ser modelizados a excepción de las cadenas laterales de R842 y
F845. La posición relativa y la configuración de este bucle es
similar a las observadas en la estructura del FGFR1 no ligada. Sin
embargo, esta posición es sustancialmente diferente a la de la
estructura compleja ternaria de la IRKP en que la rotación relativa
de aproximadamente 20º de los lóbulos N-terminales y
C-terminales resulta en que el bucle rico en glicina
está 5 \ring{A} más próximo del lóbulo C-terminal
que en la estructura de la VEGFR2 50P.
En las estructuras quinasa presentadas con ATP
unido o un análogo de ATP, el anillo de adenina forma dos enlaces
de hidrógeno conservados con el eje de la proteína. En la estructura
del FGFR1 con un enlace AMP-PCP (Mohammadi et
al., 1996) estos enlaces de hidrógeno están dispuestos entre el
NH_{2} de la adenina y el eje C = 0 de E562 (E917 VEGFR2 50P) y
entre el N1 de la adenina y el eje NH de A546 (C919 VEGFR2 50P).
Aunque la estructura aquí presentada no contiene un nucleótido
unido, las similitudes en las posiciones de estos átomos
estructurales con respecto a las del FGFR1 indican que estos
enlaces de hidrógeno se formarían en un complejo VEGFR2
50P-ATP y, por lo tanto, se espera que la adenina se
una en una posición similar (figura 4).
La variación de los sitios de unión a ATP de las
quinasas que participan en las enfermedades es de una importancia
considerable para el diseño de inhibidores selectivos competitivos
con ATP como compuestos terapéuticos. La comparación realizada
entre los sitios de unión a ATP del FGFR1 y de la VEGFR2 50P revela
que mientras que se conserva la arquitectura global del sitio, las
diversas diferencias secuenciales resultan en diferencias en la
forma de la zona accesible para la unión a ligandos. Las diferencias
secuenciales específicas entre el FGFR1 y el
VEGFR-2 en este sitio incluyen: V899 (I545 FGFR1),
F918 (Y563 FGFR1), C919 (A564 FGFR1) y C1045 (A640 FGFR1) (figura
4). De manera similar, la comparación con respecto a la estructura
compleja ternaria de la IRKP revela una variación en el sitio de
adenina en V916 (M1076 IRK), F918 (L1078), C919 (M1079 IRK), L1035
(M1139 IRK) y C1045 (G1149 IRK). Se observa una variación secuencial
y estructural incluso mayor en el sitio de adenina cuando se compara
la estructura de la VEGFR2 50P con las estructuras quinasa de
serina/treonina, sugiriendo que estas diferencias son útiles en el
diseño de inhibidores selectivos competitivos con el ATP.
Las proteínas quinasa contienen un largo bucle
flexible, denominado bucle de activación (bucle-A o
B.A.) cuya configuración se postula para regular la actividad
quinasa (figura 2). En muchas quinasas, la configuración del B.A.
está controlada por la fosforilación de residuos específicos del
bucle-A (Johnson et al., 1996). Se puede
definir el bucle en general como un bucle que comienza con los
residuos conservados DFG y termina en la secuencia APE conservada
(Johnson et al., 1996). En el VEGFR-2, este
segmento se corresponde con D1046-E1075 y contiene
dos tirosinas (Y1054 y Y1059). Se descubrió que tanto Y1054 como
Y1059 eran sitios de autofosforilación cuando el dominio citosólico
del VEGFR-2 se expresaba en E. coli
(Dougher-Vermazen et al., 1994). Mediante el
uso del protocolo de autofosforilación in vitro aquí descrito
para la VEGFR2 50P, se indica un sitio de fosforilación estable en
Y1059, sin embargo, no se detectaron pruebas de fosforilación de
Y1054.
En esta estructura de la VEGFR2 50P no ligada
aquí presentada, el bucle-A parece bastante móvil, y
no se observó una densidad de electrones interpretable para la
mayor parte de la porción central del bucle
(G1048-G1063). Este desorden concuerda con la
movilidad del bucle-A deducida de otras estructuras
quinasa. Por ejemplo, de las dos moléculas de la unidad asimétrica
de la estructura quinasa FGFR1 no fosforilada, el centro del
bucle-A tiene factores de temperatura relativamente
elevados en la molécula A y está completamente desordenado en la
molécula B. Aunque no fue posible modelizar los residuos
1048-1063 en la VEGFR2 50P, se observó una densidad
de electrones inequívoca para los residuos
D1064-E1075, que indica claramente que estos
residuos adoptan una configuración similar a la observada en la
estructura del FGFR1 no fosforilado. El segmento de
D1064-P1068 tiene una estructura extendida que se
desarrolla adyacente a los residuos catalíticos D1028 y R1032
(figura 3a). La comparación con la estructura del complejo
(MgAMP-PNP)-péptido-IRKP
indica que la posición de R1066-P1068 en esta
estructura de la VEGFR2 50P inhibe la unión al sustrato. P1066 ocupa
un espacio equivalente localizado en la cadena lateral de tirosina
del sustrato peptídico de la estructura compleja ternaria de la
IRK3P. La configuración de los residuos L1069-E1075
es similar a la de la estructura compleja ternaria de la IRKP, sin
embargo, se produce un cambio direccional completo en P1068 (P1172
IRK) entre las dos estructuras. En la estructura de la IRK, los
residuos N-terminales a esta prolina se dirigen
hacia EF, mientras que en la VEGFR2 50P, están dirigidos hacia D en
el lado opuesto de la proteína (figuras 2 y 3).
A pesar de la fosforilación de Y1059 previa a la
cristalización, la configuración aquí observada para los residuos
D1064-P1068 es similar a la configuración
inhibitoria observada para los residuos análogos de la estructura
del FGFR1 no fosforilado. Y1059 de VEGFR2 50 corresponde a un sitio
de fosforilación relativamente conservado entre proteínas tirosina
quinasa. En la estructura compleja ternaria de la IRKP y la
estructura de la quinasa linfocita fosforilada (Lck) (Yamaguchi y
Hendrickson, 1996), la tirosina de esta posición (Y1163 IRK, Y394
Lck) está fosforilada, y el bucle-A tiene una
configuración no inhibitoria similar a la observada en una
estructura compleja ternaria de la cAPK fosforilada (Zheng et
al., 1993). Se cree que las interacciones que el grupo fosfato
de esta posición realiza con otros residuos proteicos ayudan a
estabilizar una configuración de bucle-A que
permite la unión al sustrato y a ATP (Johnson et al., 1996;
Hubbard, 1997). Sin embargo, como esta estructura de la VEGFR2 50P
aquí descrita no muestra una configuración de
bucle-A abierto similar, sino que, en su lugar,
presenta una configuración inhibitoria con gran parte del bucle
desordenado, es posible que el bucle-A
monofosforilado de la VEGFR2 50P exista en un equilibrio dinámico
que suponga varias configuraciones, y que la configuración aquí
observada es la más favorecida en este entorno cristalino.
El dominio de inserción de la quinasa tiene lugar
en el lóbulo C-terminal de la quinasa y conecta las
hélices D y E. En el VEGFR-2, esta región
corresponde a un tramo de 68 residuos desde N933 a L1000 (figura 1).
La falta de efecto sobre la actividad intrínseca de la quinasa
(anteriormente indicada) de la eliminación de los residuos
T940-E989 puede que no sorprenda, pues los extremos
del dominio KID están relativamente lejos (aproximadamente
35-40 \ring{A}) del sitio catalítico y en el lado
contrario de la proteína desde la posición del bucle de activación
(figura 2). Estos resultados concuerdan con los obtenidos para la
quinasa del receptor CSF-1, en la que la eliminación
de 58 de los 64 residuos del KID del CSF-1 sólo
disminuye en un 10% su capacidad de fosforilar un sustrato
peptídico (Taylor et al., 1989). La eliminación de los 98
residuos del PDGFR, sin embargo, resultó en un descenso del 80% de
la actividad quinasa hacia un sustrato peptídico (Severinsson et
al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10,
801-809). Por lo tanto, la presente invención
permite la producción de un ligador catalítico sintético que
reconoce que no se necesita la mayoría del KID para la catálisis,
sino que sólo es necesaria la presencia de un pequeño número de
residuos para formar un ligador entre \alphaD y \alphaE con el
fin de mantener una estructura de quinasa competente.
En la estructura de la VEGFR2 50P siguiente a D,
los residuos N933-P937 forman una vuelta abierta y
una cadena extendida cuyos extremos son aproximadamente
perpendiculares a los ejes de D e I del terminal C. En varios mapas
de Fourier distintos, la densidad de electrones es fuerte y clara
para los residuos N933-P937, y se debilita para
Y938 y K939 (las cadenas laterales de Y938 y K939 no están
modelizadas) (figura 5). La eliminación de los 50 residuos del
VEGFR2 50 sigue directamente a K939, de manera que el residuo
inmediatamente C-terminal de K939 es V990,
manteniéndose la numeración de residuos en el
VEGFR-2 de longitud completa. Los residuos
V990-K997 están desordenados, y la densidad de
electrones interpretable vuelve a comenzar en D998. Los residuos
D998-1001 forman entonces una cadena corta que se
une a E en el residuo L1002 (figuras 5 y 6).
Las dos cadenas de los extremos
N-terminal y C-terminal del KID
forman una pseudo estructura de hojas paralelas bicatenaria que se
diferencia de las configuraciones vistas en esta región de otras
estructuras quinasa. Los dos extremos del KID realizan, por tanto,
una variedad de interacciones que pueden ayudar a estabilizar la
configuración global y la posición de este dominio en el
VEGFR-2. La cadena lateral de K931 establece una
interacción iónica con la cadena lateral de E934 y forma también un
enlace de hidrógeno con el eje carbonilo de D998 (figura 6). Las
interacciones de los enlaces de hidrógeno entre las cadenas
incluyen: el eje C=O de E934 con el NH de L1000, el NH de V936 con
el C=O de L1000 y el C=O de P937 con el NH de L1002. Además de
estas interacciones polares, las cadenas laterales de F935, P937 y
L1000 participan en amplios contactos hidrófobos. La cadena lateral
de F935 se acomoda en un bolsillo hidrófobo formado por las cadenas
laterales de L928, P937, L1000, L1002, L1005, L1101 e Y1130 (figuras
5 y 6). La cadena lateral de L1000 también se empaqueta contra las
cadenas laterales de Y927, K931, H1004 e Y1008.
Los solicitantes han descubierto que la
eliminación de porciones del KID también confiere otras
características útiles y deseables a la poliproteína
VEGFR-2 modificada. El polipéptido modificado mostró
una mayor estabilidad cuando se sometió a temperaturas más altas en
solución que la proteína de tipo natural. Además, el polipéptido
modificado también mostró una mejor solubilidad que la proteína de
tipo natural. Resulta evidente para los expertos en la técnica que
estas propiedades permiten mejoras en varios aspectos comerciales de
la presente invención. Los ejemplos de usos potenciales para las
proteínas modificadas incluyen la detección de alto rendimiento de
ligandos potenciales para el receptor mediante varios procedimientos
que incluyen los basados en la tecnología de micromatriz de ADN
(Affymax, Inc.), genotecas de péptidos mediante visualización de
fagos (The Ph. D. Kit® de New England BioLabs, Inc.) así como
análisis en profundidad mediante FT-RMN.
Por lo tanto, se considera que es posible
eliminar el KID completo y mantener alguna actividad catalítica en
otros RTK relacionados tales como, pero sin limitarse a, PDGF y
otras proteínas anteriormente mencionadas. Además, en una
realización de la invención se elimina el KID completo y se
reemplaza por un ligador catalítico sintético de al menos un
aminoácido tal que se conserva tanto la actividad catalítica como la
capacidad de cristalización de la proteína.
En este ejemplo, la poliproteína PDGFR es clonada
usando los procedimientos resumidos para el VEGFR-2
anterior. La secuencia codificante para PDGFR deriva de la secuencia
revelada por Matsui T., et al., (1989) Science
243:800-804 (nº de adquisición: 66814).
<110> Dra. McTigue, Michele A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modificaciones de la proteína
VEGFR-2 y procedimientos de uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proteína VEGFR-2
modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 0125-0016
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
08-09-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: genoteca de ADNc de aorta humana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Una secuencia aislada de ADN que codifica una
proteína VEGFR-2 modificada, en la que dicha
proteína VEGFR-2 contiene un ligador catalítico
sintético, en la que dicho ligador es el dominio de inserción de la
proteína quinasa de la región catalítica del
VEGFR-2, que tiene eliminados los residuos T940 a
E989.
2. Un procedimiento para analizar un compuesto
candidato en cuanto a su capacidad para interactuar con un
polipéptido del receptor VEGFR-2 modificado que
comprende:
a) expresar una secuencia aislada de ADN que
codifica la proteína VEGFR-2 modificada, en la que
dicha proteína VEGFR-2 contiene un ligador
catalítico sintético, en la que dicho ligador es el dominio de
inserción de la quinasa (KID) del VEGFR-2 que tiene
eliminados los residuos T940 a E989, en un hospedador capaz de
producir una forma del polipéptido cuya forma puede ser analizada
en cuanto a la interacción de dicho polipéptido con dicha sustancia
candidata;
b) exponer dicho polipéptido modificado a dicha
sustancia candidata;
c) evaluar la interacción de dicho polipéptido
modificado con dicha sustancia candidata;
d) cristalizar dicho polipéptido modificado en
una condición adecuada para la cristalografía por rayos X; y
e) llevar a cabo dicha cristalografía por rayos X
en dicho polipéptido.
3. Un procedimiento para analizar compuestos que
son agonistas o antagonistas de la actividad de un polipéptido
modificado de la proteína VEGFR-2, en el que dicha
proteína VEGFR-2 modificada contiene un ligador
catalítico sintético, en el que dicho ligador es el dominio de
inserción de la quinasa de la región catalítica del polipéptido
VEGFR-2 que tiene los residuos T940 a E989
eliminados, que comprende:
a) cristalizar dicho polipéptido
VEGFR-2 modificado;
b) obtener las coordenadas cristalográficas para
dicho polipéptido VEGFR-2 modificado
cristalizado;
c) aplicar dichas coordenadas cristalográficas
para dicho polipéptido VEGFR-2 modificado en un
algoritmo informático, tal que dicho algoritmo generará un modelo de
dicho polipéptido VEGFR-2 que será adecuado para su
uso en el diseño de moléculas que actuarán como agonistas o
antagonistas de dicho polipéptido; y
d) aplicar un procedimiento iterativo por medio
del cual se aplican varias estructuras moleculares a dicho modelo
generado por ordenador para identificar los agonistas o los
antagonistas potenciales de dicho polipéptido.
4. Un procedimiento de diseño de fármacos para
los compuestos que interactúan con los polipéptidos
VEGFR-2 modificados que comprende:
a) eliminar una porción del KID del polipéptido
VEGFR-2 modificado;
b) cristalizar dicho polipéptido
VEGFR-2 modificado;
c) resolver la cristalografía por rayos X de
dicho polipéptido VEGFR-2 modificado;
d) aplicar los datos generados a partir de la
resolución de la cristalografía por rayos X de dicho polipéptido
VEGFR-2 modificado a un algoritmo informático que
generará un modelo de dicho polipéptido VEGFR-2
modificado adecuado para su uso en el diseño de moléculas que
actuarán como agonistas o antagonistas de dicho polipéptido; y
e) aplicar un procedimiento iterativo por medio
del cual se aplican varias estructuras moleculares a dicho modelo
generado por ordenador para identificar los agonistas o los
antagonistas potenciales de dicho polipéptido
VEGFR-2 modificado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9950398P | 1998-09-08 | 1998-09-08 | |
| US99503P | 1998-09-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2252972T3 true ES2252972T3 (es) | 2006-05-16 |
Family
ID=22275320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99945505T Expired - Lifetime ES2252972T3 (es) | 1998-09-08 | 1999-09-07 | Modificaciones de la proteina vegfr-2 y procedimiento de uso. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6316603B1 (es) |
| EP (1) | EP1109823B1 (es) |
| JP (1) | JP2002534058A (es) |
| KR (1) | KR100442221B1 (es) |
| AT (1) | ATE310018T1 (es) |
| AU (1) | AU760008B2 (es) |
| CA (1) | CA2340598A1 (es) |
| DE (1) | DE69928411D1 (es) |
| ES (1) | ES2252972T3 (es) |
| WO (1) | WO2000014105A1 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014105A1 (en) * | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Modifications of the vegf receptor-2 protein and methods of use |
| CA2404658A1 (en) * | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Ismail Moarefi | 3d structure of polypeptides containing a tpr-structure motif with chaperone-binding function, crystals thereof and compounds for inhibition of said peptides |
| DK1294929T3 (da) * | 2000-06-07 | 2005-12-12 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Fremgangsmåde til påvisning af VEGF-kinasedomænemodulatorer |
| DE60110802T2 (de) * | 2000-08-18 | 2005-10-06 | Agouron Pharmaceuticals, Inc., San Diego | Heterozyklische-hydroximino-fluorene und ihre verwendung zur inhibierung von proteinkinasen |
| DE60138645D1 (de) * | 2000-12-21 | 2009-06-18 | Smithkline Beecham Corp | Pyrimidinamine als angiogenesemodulatoren |
| US20040009890A1 (en) * | 2002-01-07 | 2004-01-15 | Erickson John W. | Broad spectrum inhibitors |
| US20040229293A1 (en) * | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Po-Ying Chan-Hui | Surface receptor complexes as biomarkers |
| CA2521106A1 (en) * | 2003-04-01 | 2004-10-14 | Monogram Biosciences, Inc. | Intracellular complexes as biomarkers |
| EP1618133A1 (en) * | 2003-04-17 | 2006-01-25 | Pfizer Inc. | Crystal structure of vegfrkd: ligand complexes and methods of use thereof |
| EP1697508A2 (en) * | 2003-12-05 | 2006-09-06 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Crystal structure of interleukin-2 tyrosine kinase (itk) and binding pockets thereof |
| WO2006047505A2 (en) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Janssen Pharmaceutica, N.V. | Crystal structure of the c-fms kinase domain |
| JO3067B1 (ar) | 2008-10-27 | 2017-03-15 | Glaxosmithkline Llc | بيرميدينات بيرازولو امينو كمثبطات ل fak |
| WO2023164224A1 (en) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Functionalized nanoclusters and their use in treating bacterial infections |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4966849A (en) | 1985-09-20 | 1990-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| US5217999A (en) | 1987-12-24 | 1993-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase |
| US6372438B1 (en) * | 1988-02-02 | 2002-04-16 | The Regents Of The University Of California | Human platelet-derived growth factor receptors |
| WO1991015495A1 (en) | 1990-04-02 | 1991-10-17 | Pfizer Inc. | Benzylphosphonic acid tyrosine kinase inhibitors |
| US5302606A (en) | 1990-04-16 | 1994-04-12 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase |
| WO1992020642A1 (en) | 1991-05-10 | 1992-11-26 | Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. | Bis mono-and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit egf and/or pdgf receptor tyrosine kinase |
| EP0586608A1 (en) | 1991-05-29 | 1994-03-16 | Pfizer Inc. | Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors |
| EP0654024A1 (en) | 1992-08-06 | 1995-05-24 | Warner-Lambert Company | 2-thioindoles (selenoindoles) and related disulfides (selenides) which inhibit protein tyrosine kinases and which have antitumor properties |
| US5330992A (en) | 1992-10-23 | 1994-07-19 | Sterling Winthrop Inc. | 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones |
| DE69233803D1 (de) | 1992-10-28 | 2011-03-31 | Genentech Inc | Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten |
| US6037329A (en) * | 1994-03-15 | 2000-03-14 | Selective Genetics, Inc. | Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment |
| AU7250298A (en) | 1997-04-25 | 1998-11-24 | Collateral Therapeutics, Inc. | Truncated vegf-related proteins |
| WO2000014105A1 (en) * | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Modifications of the vegf receptor-2 protein and methods of use |
| JP4230222B2 (ja) * | 2000-10-30 | 2009-02-25 | 株式会社プロテインクリスタル | タンパク質複合体およびその製造方法 |
-
1999
- 1999-09-07 WO PCT/US1999/020319 patent/WO2000014105A1/en active IP Right Grant
- 1999-09-07 AT AT99945505T patent/ATE310018T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-07 ES ES99945505T patent/ES2252972T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-07 JP JP2000568862A patent/JP2002534058A/ja active Pending
- 1999-09-07 EP EP99945505A patent/EP1109823B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-07 AU AU58093/99A patent/AU760008B2/en not_active Ceased
- 1999-09-07 US US09/390,326 patent/US6316603B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-07 DE DE69928411T patent/DE69928411D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-07 CA CA002340598A patent/CA2340598A1/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-02-18 US US09/506,906 patent/US6784285B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-03-08 KR KR10-2001-7003019A patent/KR100442221B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-08-28 US US09/939,832 patent/US6794146B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-28 US US09/939,754 patent/US6849721B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-28 US US09/939,833 patent/US6753416B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1109823A1 (en) | 2001-06-27 |
| US20020051965A1 (en) | 2002-05-02 |
| WO2000014105A1 (en) | 2000-03-16 |
| AU760008B2 (en) | 2003-05-08 |
| US6794146B2 (en) | 2004-09-21 |
| JP2002534058A (ja) | 2002-10-15 |
| KR20010086386A (ko) | 2001-09-10 |
| EP1109823B1 (en) | 2005-11-16 |
| KR100442221B1 (ko) | 2004-07-30 |
| US20020164641A1 (en) | 2002-11-07 |
| DE69928411D1 (de) | 2005-12-22 |
| US6849721B2 (en) | 2005-02-01 |
| EP1109823A4 (en) | 2003-06-18 |
| US6753416B2 (en) | 2004-06-22 |
| ATE310018T1 (de) | 2005-12-15 |
| US20020127538A1 (en) | 2002-09-12 |
| US6316603B1 (en) | 2001-11-13 |
| CA2340598A1 (en) | 2000-03-16 |
| AU5809399A (en) | 2000-03-27 |
| US6784285B1 (en) | 2004-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McTigue et al. | Crystal structure of the kinase domain of human vascular endothelial growth factor receptor 2: a key enzyme in angiogenesis | |
| ES2252972T3 (es) | Modificaciones de la proteina vegfr-2 y procedimiento de uso. | |
| EP0931152A2 (en) | Crystal structures of a protein tyrosine kinase | |
| JP2001524128A (ja) | キナゾリン系化合物によりセリン／トレオニン蛋白質キナーゼ機能を調節する方法 | |
| EP1240194A2 (en) | Novel human protein kinases and protein kinase-like enzymes | |
| US20030224500A1 (en) | Modified MEK1 and MEK2, crystal of a peptide: ligand: cofactor complex containing such modified MEK1 or MEK2, and methods of use thereof | |
| US20030235899A1 (en) | Catalytic domain of the human effector cell cycle checkpoint protein kinase Chk1 materials and methods for identification of inhibitors thereof | |
| US20040009568A1 (en) | Catalytic domains of the human hepatocyte growth factor receptor tyrosine kinase, and materials and methods for identification of inhibitors thereof | |
| Verstraete et al. | Inducible production of recombinant human Flt3 ectodomain variants in mammalian cells and preliminary crystallographic analysis of Flt3 ligand–receptor complexes | |
| EP1345966A2 (en) | Crystallized cytoplasmic tie2 receptor tyrosine kinase domain and method of determining and designing modulators of the same | |
| JP4556033B2 (ja) | Ｄｎａオリゴマー大型単結晶育成法 | |
| US20050197492A1 (en) | Crystal structure of VEGFRKD: ligand complexes and methods of use thereof | |
| Sala | Analysis and inhibition of oncogenic RET-dependent signalling | |
| US20050037476A1 (en) | Modified Wee1, crystals of peptide: inhibitor complexes containing such modified Wee1, and methods of use thereof | |
| WO2017139321A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting kinase activity | |
| Phan | Protein crystal growth from biphasic system, structural and mechanistic studies of Escherichia coli and human thymidylate synthase, and crystal structure of human Sp17 | |
| Huang et al. | The Structure of a Human p110a/p85a Complex Elucidates the Effects of Oncogenic PI3Ka Mutations | |
| JP2000504201A (ja) | 細胞質性チロシンキナーゼ | |
| Tweedlie | Structural Studies of Serum Albumins and Chloramphenicol Acetyltransferases | |
| Bovenkamp | Al1 Rights Reserved | |
| Wazer et al. | CpG methylation in exon 3 as a basis for breast tumor-specific loss of expression of the tumor suppressor gene NES-1 |