JP2000504201A

JP2000504201A - 細胞質性チロシンキナーゼ

Info

Publication number: JP2000504201A
Application number: JP8512363A
Authority: JP
Inventors: アリタロ，カーリ
Original assignee: ヘルシンキ、ユニバーシティ、ライセンシング、リミテッド、オサケ、ユキチュア
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-09
Publication date: 2000-04-11
Also published as: WO1996011275A1; EP0783583A1; DE69535039D1; AU701901B2; ATE329035T1; NO971553L; EP0783583B1; DE69535039T2; CA2201870A1; AU3655195A; NO971553D0

Abstract

(57)【要約】細胞質性チロシン・キナーゼ分子、これら分子をコードするＤＮＡ；およびこれらの使用および生産方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞質性チロシンキナーゼ発明の分野本発明は一般に、新規細胞質性チロシンキナーゼ、これをコードする遺伝子、ならびに診断および治療方法におけるその使用に関するものである。発明の背景細胞および組織の維持、分化および修復に関与する細胞プロセスは、一つには、成長因子および他のリガンドがそれらの受容体へ結合することにより制御される細胞間および細胞内シグナルにより調節される。遺伝子発現の調節および生化学的経路の活性化と不活性化とを調節するために細胞により利用される最も重要なシグナルの様式はチロシンリン酸化である。多数のチロシン・キナーゼが知られており、通常これらは、上皮増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子Ｉ）血小板由来増殖因子、および繊維芽細胞増殖因子等のポリペプチド増殖因子に対するトランスメンブラン受容体として存在する。概論は、ウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）らによるＣｅｌｌ，６１・２４３−２５４（１９９０）；およびヘルジン（Ｈｅｌｄｉｎ）らによるＣｅｌｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１：５５５− ５５６（１９９０）を参照のこと。中でも本発明にとり重要なのは、それらのリガンドとしての造血増殖因子を認識する幾つかの受容体チロシン・キナーゼである。これらの中には、コロニー刺激因子１に対する受容体であるｃ−ｆｍｓ受容体チロシン・キナーゼ［シェル（Ｓｈｅｒｒ）らによるＣｅｌｌ４１６６５− ６７６（１９８５）］、およびヒユアング（Ｈｕａｎｇ）らによるＣｅｌｌ６３：２２５−２３３（１９９０）中に報告された原始的で十分特徴化していない造血増殖因子であるｃ−ｋｉｔ、が包含される。一般的にチロシン・キナーゼは、構造的特徴に準拠してフアミリー、サブフアミリー、およびクラスに分けられる。一般には２つの広い分類があり、これらの中には膜結合チロシン受容体キナーゼおよび非受容体チロシン・キナーゼが包含され、これらには細胞質および核性チロシン・キナーゼが包含される。チロシン受容体キナーゼの１例は表皮増殖因子受容体キナーゼのフアミリーであり、これらは細胞外ドメインと共にトランスメンブラン受容体キナーゼのサブフアミリーを形成する。このサブフアミリーは、インスリン受容体キナーゼ等の他のものに加えて、相同性でシステインに富む繰り返し体をそれらの細胞外ドメイン中に含む。ヒライ（Ｈｉｒａｉ）らのＳｃｉｅｎｃｅ，２３８：１７１７−１７２０（１９８７）参照。他の膜結合型受容体チロシンキナーゼは、免疫グロブリン上科の特徴である細胞外折りたたみを含んでいる。上記非受容体チロシン・キナーゼは、しばしばＳｒｃ様キナーゼを含む単一グループとして言及されてきたが、現在では、この非受容体チロシン・キナーゼは幾つかのフアミリーに分けられ得ることが認識されている。［ボレン（Ｂｏ１ｅｎ），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２０２５−２０３１（１９９３）；ワング（Ｗａｎｇ），ＴＩＢＳ１９,３７３− ３７６（１９９４）］。例えば、新規に同定された非受容体チロシンキナーゼフアミリーは、ＴＥＣＮＩＴＫ（同時にＴＳＫまたはＥＭＴとしても知られている）およびＢＴＫ（以前はＡＴＫまたはＥＭＢとして知られる）の３つの独立クローン化遺伝子を含んでいる。これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は一般的にキイロシヨウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓｒｃ２８Ｃチロシン・キナーゼに相同である。かかるペプチド類は一般に、そのチロシン・キナーゼドメインの上流にＳＨ3 およびＳＨ2 ドメインを含んでいる。しかしＴＥＣ／ＩＴＫ／ＢＴＫによりコードされるぺプチド類は、典型的には長いＮ−末端領域も含んでおり、この領域は一般的にＳｒｃ様キナーゼ中に保存されている共通ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ）残基を保有していない。そのかわり、このＴＥＣ／ＩＴＫ／ＢＴＫフアミリーのタンパク質のＮ末端領域は、ムサチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）らによるＴＩＢＳ，１８：３４３−３４８（１９９３）中に記載されるプレックストリンホモロジー（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎｈｏｍｏｌｏｇｙ）（ＰＨ）ドメインを含んでいる。最後に上記ＴＥＣ／ＩＴＫ／ＢＴＫフアミリーは一般的にペプチド類からなり、これらのペプチドは短いＣ末端を有し、殆どのＳｒｃ様キナーゼ中に見いだされる調節チロシンリン酸化部位が欠失している。上記プレックストリン・ドメインのコアは７つの鎖からなる逆平行βシートである。このＣ末端は折りたたまれて長いαヘリックスを形成している。このドメインは静電的に極性化され、かつペプチドまたは小タンパク質等のリガンドへの結合に関与し得るポケットを含んでいる。このコア構造は全てのＰＨドメイン中に保存されるが、これらのドメインは推定の結合ポケットを取り囲むループに関して多くの変化が見られる。プレックストリン・ドメインの機能については未だ知られていないが、これらは複合Ｇ−タンパク質のβおよびγサブユニットに結合することが判った。ＴＥＣチロシン・キナーゼをコードする遺伝子は、ネズミ肝癌細胞中に同定され、後程、試験された全てのネズミ造血細胞ライン中に発現されることが判明した。［マノ（Ｍａｎｏ）らのＯｎｃｏｇｅｎｅ，８：４１７−４２４（１９９３）］。上記フアミリーの他の２つのメンバーのＩＴＫおよびＢＴＫは、Ｔ細胞およびＢ細胞それぞれの発展のある段階で選択的に発現される。ＩＴＫｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞活性化に際してＩＬ−２により誘導され、かつＢＴＫにおける突然変異はＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（バートン病、ＸＬＡ）の原因であると考えられており、この病気は、冒された雄中での成熟Ｂ細胞の循環が欠失していることに特徴がある。他のタンパク質との、機能的に重要な相互作用に関与し得るＰＨまたはＳＨ2 ドメインにおける点変異を包含する、各種の異なったＢＴＫ突然変異がＸＬＡのネズミモデル中に記載されている。細胞質チロシン・キナーゼは、リガンド活性化トランスメンブラン受容体と会合して、リガンド誘発シグナルの開始または増幅をするらしいことが報告されている。例えば、造血細胞中のＴ細胞およびＢ細胞受容体ならびにサイトカイン受容体は、それらのシグナルを変換する目的でＳｒｃチロシンキナーゼフアミリーの、ある種のメンバーと結合する。これらの受容体へのリガンド結合に際しては、特定細胞内基質のチロシン・リン酸化が急速に増加することが観測される。したがって、これらのシグナル経路は、刺激された受容体により補充され、かつ活性化された、特定の細胞内チロシン・キナーゼに依存するように見える。このＳｒｃフアミリーのメンバーは細胞系統選択的態様で発現され、このことは上記仮説とは矛盾しない。種々のサイトカイン受容体もキナーゼのＪＡＫフアミリーと相互作用してこれを活性化し、一方では転写レギユレータを直接的にリン酸化する。サイトカイン受容体とは対照的に、殆どの増殖因子受容体は固有のチロシン・キナーゼ活性を含んでいる。血小板由来増殖因子受容体および肝細胞増殖因子／散乱因子（ｓｃａｔｔｅｒｆａｃｔｏｒ）受容体等の、これら受容体の或る種の受容体の自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）チロシル残基は、ｃ−Ｓｒｃ等の細胞質チロシン・キナーゼのＳＨ2 ドメインに結合する。細胞質チロシン・キナーゼの活性化受容体複合体への補充は、他のＳＨ2 ドメイン含有シグナル変換器と共同して、および恐らくＳＨ3 ドメインに結合するタンパク質と共同してシグナルを増幅することができる。本発明は、特性をＴＥＣ／ＩＴＫ／ＢＴＫサブフアミリーと共有する新規細胞質性受容体チロシンキナーゼの提供にあり、このキナーゼは細胞の成長および分化ならびに各種タイプの腫瘍形成に対するマーカーとして有用で、かつ脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）チロシンリン酸化が原因の疾患の診断と治療に有用である。本発明における細胞質チロシン・キナーゼを使用すると、成長因子またはサイトカイン受容体を単離することが可能であり、これらのシグナルは当分野の標準法により、かかるキナーゼを介して媒介される。発明の概要本発明は、造血細胞の成長および／または増殖を刺激することができる新規細胞質性チロシンキナーゼを提供する。好ましい実施態様における本発明のタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３中に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＸタンパクである。好ましい実施態様ではまた、本発明はＢＭＸをコードするｃＤＡＮを提供する。好ましい実施態様では、本発明によるＢＭＸチロシンキナーゼは、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで、造血細胞の成長および／または分化を刺激し得るＢＭＸタンパク質断片を含む。好ましい実施態様では、本発明はＢＭＸタンパク質断片をコードするＤＮＡも提供し、この断片は造血細胞の成長および／または分化を刺激し得るものである。また本発明は、モノクロナール抗体を包含する、本発明のタンパク質に向かって指向する抗体およびそれを生産するハイブリドーマも提供する。本発明による方法は、組織を本発明による検出可能ラベル化ＤＮＡまたは抗体にさらし；この組織を洗浄し、かつ洗浄後に組織中に残留しているラベルを検出する工程を含む、造血細胞の成長および／または分化を検出する手段を含むものである。ＤＮＡおよびタンパク質のラベル化方法ならびにハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）および免疫組織化学用の組織を調製する方法は当分野で周知である。また本発明はユニークなチロシン・キナーゼを提供するものであり、このキナーゼの活性が特定インヒビターにより阻害される結果、ＢＭＸを発現する細胞の成長または分化に影響を及ぼす。本発明のその他の態様および特徴は、次の詳細な記載を考慮することにより当業者には明瞭になるはずである。図面の説明図１は、ＢＭＸ（ＳＥＱＩＤＮＯ:３）、ＢＴＸ(ＳＥＱ IＤＮＯ:４）、ＩＴＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、ＴＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＤＳｒｃ２８Ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）および共通配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を示す。図２Ａは、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞からのポリＡ＋ＲＮＡのノーザンブロットおよびハイブリッド形成分析を示す。図２Ｂは、ＨＵＶＥＣ細胞からの抗ＢＭＸおよび抗ＳＥＸ免疫沈降物（対照）のウエスタンブロツトを示す。図２Ｃは、ＢＭＸ含有ベクターまたはエンプテイ・ベクター（ＭＯＣＫ）を用いてトランスフエクションしたＣＯＳ細胞からのＢＭＸ免疫沈降物の抗ＰＴｙｒウエスタン分析を示す。図２Ｄは、ｉｎｖｉｔｒｏでキナーゼ反応に処したＣＯＳ−トランスフエクション細胞（BＭX）からの免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図３は、ＢＭＸレトロウイルス発現ＢＭＸまたは抗ＢＭＸ抗血清を用いて直接的に溶解（”−”にて表示のレーン）または免疫沈降（ＩＰ）させたコントロールウイルス感染（ｃ）ＮＩＨ3 Ｔ3細胞のウエスタンブロットを示す。図４は、染色体の略図表示と共に、ＢＭＸコード遺伝子の極在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す、正常の中期ヒト染色体およびＸ染色体の拡大図を示す。発明の詳細な説明本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示すＢＭＸチロシン・キナーゼ等の新規チロシンキナーゼ；上記キナーゼの断片；および上記キナーゼおよび上記断片をコードするＤＮＡを提供する。かかるｃＤＮＡは骨髄および内皮細胞源から構築されたゲノムライブラリーから単離された。このＢＭＸコードｃＤＮＡはアミノ酸６７５をコードする２０２５ｂｐの読み取り枠を含む。このタンパク質産物は単一チロシン・キナーゼドメイン、ＳＨ2 ドメイン、およびSＨ3 ドメインを含む。このチロシン・キナーゼドメインはＢＴＫＮＩＴＫ）およびＴＥＣのチロシン・キナーゼドメインに約７０％相同であることは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３をＳＥＱＩＤＮＯ：４、５、および６とそれぞれと比較することにより判る。本発明による断片は、造血細胞の成長および／または分化を刺激または阻害する能力を保持している、元のままのキナーゼの１次構造の任意の部分である。本発明によるＢＭＸ細胞質性チロシンキナーゼは、Ｂｔｋ）Ｉｔｋ、Ｔｅｃ、およびキイロショウジョウバエＳｒｃ２８Ｃチロシンキナーゼのアミノ酸配列に極めて相同な演繹アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示される）を有している。その密接相同配列を有する上記ＢＭＸ配列のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を図１に示す。この図を検討すると、このＢＭＸｃＤＮＡの位置３６におけるコドンＡＴＧはその翻訳開始部位であることを暗示している。このコドンはｋｏｚａｋ共通翻訳開始配列（ＡＡＴＡＴＧＧ）中に含まれている。キナーゼ類のＳｒｃフアミリーのメンバーの可変Ｎ末端ドメインは、トランスメンブラン受容体と相互作用することが報告されている［ムステリン（Ｍｕｓｔｅｌｉｎ）らのＴＩＢＳ：１８：２１５−２２０（１９９３）］。図１に示すように、ＢＭＸのＮ末端領域はＴＥＣ、ＩＴＫ、およびＢＴＫのものと有意の相同性を有する。ＢＭＸのＮ末端ドメインはまた、各種ＧＰＴアーゼ活性化（ＧＡＰ）タンパク質中および他のキナーゼ中ならびに細胞骨格タンパク質中に見いだされるＰＨ（プレックストリン相同）共通配列に匹敵する領域を有している。このプレクストリン・ドメインのコアは７つの鎖からなる逆平行βシートであり、そのＣ末端部分は折りたたまれて長いαヘリックスを形成している。このプレックストリン・ドメインは静電的に極性化され、かつ推定のリガンド結合ドメインを含んでいる。サイトカイン受容体とは対照的に、殆どの増殖因子受容体は固有のチロシンキナーゼ活性を含んでいる。ある種の増殖因子受容体（例えば、血小板由来増殖因子受容体）の自己リン酸化チロシル残基は、ｃ−Ｓｒｃ等の細胞質チロシン・キナーゼのＳＨ2 ドメインと結合する。細胞質チロシン・キナーゼの活性化増殖因子受容体複合体への補充は、シグナル変換器（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ）を含有する他のＳＨ3 およびＳＨ2 と上記チロシン・キナーゼがこの複合体を介して結合することにより、シグナルを増幅する。本発明のＢＭＸタンパク質はＳＨ2 およびＳＨ3 ドメインの両方を有している。しかし、このＢＭＸＳＨ3 ドメインは、この共通配列から変化して、そのＣ末端にＳｅｒおよびＧＩｕ残基に富む２つの強い親水性部分を含むようになる。この相違はスプライスの変動に起因できる。上記のことは、本発明チロシンキナーゼが増殖因子受容体の活性部分に結合し、かつ、本発明のタンパク質の極在性に起因して、造血細胞ライン中でそれを行うという実質的証拠を提供する。したがって、本発明タンパク質は造血細胞ラインの刺激に有用である。その上、本発明ＤＮＡは造血細胞増殖および発癌の検出における診断試薬としても有用である。また本発明の抗体およびペプチドは成長因子の活性を阻害するのにも有用である。次の実施例は、本発明タンパク質、ＤＮＡの単離、特性化、極在化および用途の詳細、ならびにその使用方法の詳細を提供するものである。実施例１本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび分析グアニジウムチオシアナート抽出法により正常のヒト骨髄から全ＲＮＡを調製した。次いでトリ骨髄芽球症（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）ウイルス逆転写酵素１０Ｕを用いて、オリゴ−ｄＴプライマー０．５μｇ）デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸の各１μＭ、ならびにＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）１０Ｕの存在下、２μｇのＲＮＡのアリクウォット逆転写した。この反応緩衝液は５０ｍＭトリスＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、６ｍＭＭｇＣｌ₂、４０ｍＭＫＣｌおよび１ｍＭジチオスレイトールを含有した。反応内容物を４２℃で１時間保温し、次いで５２℃で３０分、さらに９５℃で５分間保温した。次いでこの逆転写ｃＤＮＡの約３％を、３ＵＤｙｎａｚｙｍｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）Ｈｅｌｉｎｋi、ＦＩ）を用いて、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂含有反応緩衝液中で、かつデオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸の各２００５μｍの存在下、反応容量１００ｍＬ中でＰＣＲ法により増幅した。これらのプライマーは、５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＡ（Ａ／ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＴ（Ｃ／Ｇ）ＣＡＣ（Ａ／Ｃ）Ｇ（Ｇ／Ａ）ＧＡＣ−３’（Ｏ．１５ｍ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡ（Ｇ／Ａ）ＧＧＣＣＡＴＣＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｇ／Ｃ／Ａ）ＡＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＧＧ−３’（０．１５ｍ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）であり、センスおよびアンチセンスプライマーそれぞれを表わした。両プライマーは、公知キナーゼからの保存チロシン・キナーゼドメインから得られた。増幅のためのプロトコールは「パーキン・エルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ＤＮＡＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒ４８０」を用いて、容量１００μＬ中、３５サイクルで、９５℃で９０秒;４２℃で１２０秒；６８℃で１８０秒であった。新規ＢＭＸコード配列を表す１５０ｂｐ（７）ｃＤＮＡ産物が得られた。この生成物をメーカーの指示に従ってＴＡクローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲベクターへとサブクローニングした。上記ＰＣＲ増幅ＢＭＸ産物（Ｂ1 と呼称）をランダムプライミングを使用した３２ｐＣＴＰで放射性ラベル化し、ヒト骨髄ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から構築したオリゴ−ｄＴ−プライマーλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。このＢ1ｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅およびフランキング読み取り枠により得られた配列を包んでおり、細胞質チロシン・キナーゼが、新規に同定されたＢｔｋキナーゼと極めて密接に関連することを予言していた。このＢ１ｃＤＮＡをノーザンブロット法のプローブに使用した場合、いずれの試験細胞ライン中にも特定シグナルは検出されなかった。それにもかかわらず、ＲＮＡの逆転写ＰＣＲ増幅により得られた結果によれば、ＢＭＸは骨髄中のみならず、内皮細胞中にも発現されると思われた。したがって、全長cＤＮＡを得る目的で内皮細胞ＲＮＡ由来のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリ−ニングした。いくつかの陽性プラークを選び、最も長い約２．４ｋｂ（Ｅ７）のＢＭＸｃＤＮＡインサートをｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローンし、次いでサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ鎖終端法を用いて両鎖について配列決定した。上記Ｅ7 クローンは、受託番号Ｎｏ．ＡＴＣＣ７５９０７として１９９４年１０月５日付でｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１（ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ,Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２）に寄託されたものである。上記配列のコンピユーター分析は、デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）らのＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９８４）中に報告されたようなＧＣＧプログラムを用いて遂行した（上記文献を本明細書中に包含する）。得られた上記ＢＭＸ配列を図１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３中に示す。このＥ7サブクローンは６７５のアミノ酸をコードし得る読み取り枠を含んでいた。この演繹アミノ酸配列はＴＥＣ、ＩＴＫ、およびＢＴＫの配列に極めて相同性であり、ならびにキイロショウジョウバエＳｒｃ２８Ｃチロシンキナーゼに極めて相同性であった。配列アラインメントは、このｃＤＮＡの位置３６のＡＴＧが翻訳開始部位であることを暗示した。上記ＢＭＸタンパク質は、ＰＨドメイン（図１の暗い領域）を含む２１０残基のＮ末端領域を有しているが、共通ミリスチル化部位は含まれていない。このＳｒｃフアミリーの可変アミノ末端ドメインはトランスメンブラン受容体との相互作用に関与する。したがって、ＢＭＸの長いＮ末端領域がＢｔｋ、ＩｔｋおよびＴｅｃキナーゼと高度の相同性を共有することを指摘するのは興味深い。上記分子の当該部分は、未だ知られていない受容体またはシグナル変換器と共同して、ある役割りを有し得る。この領域では、これらの４つのチロシン・キナーゼの配列は塩基性アミノ酸残基に富み、かつそれらはｓＡＲＫおよびＲＡＣ等のキナーゼ中の、およびダイナミン（ｄｙｎａｍｉｎ）、キネシンおよびスペクトリン中の、ある種のＧＴＰアーゼ活性化タンパク（ＧＡＰ）およびＧＤＰ−ＧＴＰ交換因子（ＳＯＳ１等）等の多数のタンパク中に見いだされるＰＨドメインに対するコンセンサスに適合する。上記ＰＨドメインの次に、ＳＨ3 およびSＨ2 ドメイン（図１の囲み領域）が続く。比較のために、キイロショウジョウバエＳｒｃ２８ＣＴＫ配列の対応領域も図１に示す。ＢＭＸのアミノ酸残基１８５−２０６と２０７−２２８（図１の水平矢印）との間の配列はヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で互いに約８０％同一であり、この区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）がＢＭＸＤＮＡ配列の重複に由来することを暗示している。後者区間（２０７−２２８）は、このＢＭＸＳＨ3 ドメインのＮ末端部分に属している。ＳＨ3ドメインの特徴はＢＭＸ／ＢＴＫ／ＩＴＫ／ＴＥＣチロシン・キナーゼフアミリーの全てのメンバーに共通であるが、配列のいくつかは上記コンセンサスと異なっている。このＢＭＸＳＨ3 配列（位置２４３におけるＷＷモチーフの下流）のＣ末端部分は他のキナーゼのものと異なっており、かつＳｅｒおよびＧｌｕ残基に富む、２つの強い親水性区間を含んでいる。対照的に、上記ＳＨ2 ドメインは、他のチロシンキナーゼ（図１）と比較すると、ＢＭX配列中によくに保存されている。このチロシン・キナーゼドメイン（矢印）内で、Ｇｌｙ（４３４）ＸＧｌｙＸＸＧｌｙ配列を含有するＡＴＰ結合モチーフおよびＬｙｓ４３５残基を図１中にマークする。ＢＭＸ（７）Ｔｙｒ５６６残基はｃ−Ｓｒｃの保存Ｔｙｒ４１６自己リン酸化部位に相当する。この触媒ドメインの次に短いＣ末端尾部が続き、ここに非保存自己リン酸化部位が見いだされる。多重停止コドンは、このＢＭＸ配列のコドン６７５の後に見いだされた。いくつかのヒト胎児および成人組織からのポリアデニル化ＲＮＡをＢＭＸＲＮＡの場合についてノザンブロット法およびハイブリッド形成ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により分析した。ＢＭＸ転写物は胎児および成人の心臓の両方で顕著であった。一層弱いシグナルが胎児肺および腎臓から得られ；また成人の骨格筋、胎盤、肺、肝臓、睾丸、卵巣、小腸および大腸から得られた。成人腎臓、膵臓および前立腺はオートラジオグラムの長時間露出後にのみシグナルを与え、一方胎児もしくは成人の脳または胎児肝臓もしくは腎臓からはなんらのシグナルも得ることができなかった。このように、ＢＭＸは関連Ｂｔｋ、ＩｔｋおよびＴｅｃチロシン・キナーゼよりも一層広く発現されるように思われる。これらのハイブリッド形成シグナルの少なくとも一部は、これら器官中の造血細胞に由来する可能性がある。実施例２ＢＭＸタンパク質の発現および分析ＢＭＸレトロウイルスをｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクター中に構築させた。このｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターはモルゲンステルン（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ）らによるＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９９０）中に報告がある。次いで生成ベクターを、ペア（Ｐｅａｒ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９０：８３９２−８３９６（１９９３）（引用により本明細書に包含する）に報告されているようなＢＯＳＣ２３細胞中にトランスフエクションした。次いで４８時間後に上澄みを収集し、ＮＩＨ3 Ｔ3 細胞の感染に用いた。ピユーロマイシン中の２週間の増殖により上記感染細胞を選択した。上記ＢＭＸｃＤＮＡインサートを含むｐＭＴ2 ベクター１０μｇによりＣＯＳ細胞をリン酸カルシウム法を用いてトランスフエクションした(このベクターはカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）らのＣｅｌｌ.Ｂｉｏｌ,９９４６−９５８に報告があり、この文献を引用により本明細書中に包含する）。成長の３６ −４８時間後、ウエスタンブロット法の場合には、この細胞を電気泳動サンプル緩衝液:２．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１２５ＭトリスＴｒｉｓ・ＨＣ１（pＨ６．８）を用い、または免疫沈降の場合には氷冷ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭトリスＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ１５０ｍＭ)１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００)1％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）１０ｍｇ／ｍＬペプスタチン含有、１００５ｇ／ｍＬロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、０．０５ＴＩＵ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム］を用いて抽出した。上記透明上澄みは、ＢＭＸアミノ酸残基５９９−６７５を発現するように工作したＧＳＴ融合タンパク質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてウサギ中で生じた抗ＢＭＸ抗血清５μＬを用いて免疫沈降させた。対照としては無関連タンパク質（Ｌ．Ｔ．，調製において）に対するプレ免疫血清および抗ＳＥＸ抗血清を使用した。試料を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析し、次いで抗ＢＭＸ抗血清（図２Ｂ）の１：１０００希釈液または図２Ｃ（Ｚｙｍｅｄ）に示されるようなＰＹ２０抗ホスホチロシン・モノクロナール抗体を用いたウエスタンブロット法および検出により、さらにマウス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ複合抗体およびメーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の指示に従ったＥＣＬ検出によって分析した。別法として、上記免疫沈降物を２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、および１０ｍＣｉ［³²Ｐ］−ＡＴＰ中、室温で１０分間キナーゼ反応に処し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフイーにかけた。結果を図２Ａ−２Ｄに示す。図２Ａは、ヒト臍帯静脈内皮細胞からのＲＮＡの、ＢＭＸプローブを用いた、ノーザンブロット分析を示す（図中ではラベル化ＢＭＸＮＢ）。２．７ｋｂ（７）ｍＲＮＡバンドが見られる。このＢＭＸタンパク質の免疫沈降に続く抗ＢＭＸ抗体を用いた免疫ブロット法により、図２Ｂおよび図３にみられるような見かけ分子量８０ｋＤの弱いバンドが検出された。かかるバンドは対照免疫沈降物中には見られなかった。ＢＭＸレトロウイルスを発現するＮＩＨ3 Ｔ3 細胞からの、およびＢＭＸプラスミド発現ベクターを用いてトランスフエクションしたＣＯＳ細胞からのＢＭＸの免疫沈降および免疫ブロット法でも、８０ｋＤポリペプチドが検出され、このペプチドは図２Ｃ（α−ＰＴｙｒＷＢ）に示すように、チロシルリン酸化されたものであった。しかし、かかるポリペプチドは図２Ｄに示すように免疫複合体キナーゼ反応［³²Ｐ］−ＡＴＰでは、ほんの僅かにラベル化されただけであった。実施例３ＢＭＸ遺伝子の染色体局在化２４種間の体細胞ハイブリッドからなされたサザンブロットをＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）のＭｕｔａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得た。ＢＭＸ遺伝子の染色体局在性を決定するために、ヒト染色体の画定のセットを含むヒト・ネズミ（ｒｏｄｅｎｔ）体細胞ハイブリッドからのＤＮＡをＢＭＸプローブを用いるサザンブロット法およびハイブリッド形成により分析した。ＤＮＡ試料２４中、ヒト特定シグナルが２つのヒト／チヤイニーズハムスターハイブリッド中に観察され、１つはヒト染色体１およびＸを含み、他はヒトＸ染色体のみを含むことが観察された。この分析によれば、上記ＢＭＸ遺伝子はＸ染色体中に局在化していることを示していた。このようＸ染色体上の所謂骨髄キナーゼ遺伝子であるＢＭＸが選択された。ｐＷＥ１５におけるヒト胎盤コスミド・ライ（１９８８）中に記載］、およびヒトＸ染色体酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーを上記ＢＭＸｃＤＮＡの［³²Ｐ］ラベル化インサートを用いてスクリーニングした。純粋になるまで陽性クローンを再スクリーニングし、サザンブロット法およびハイブリッド形成により確認した。５−ブロモデオキシウリジン同調リンパ球培養物から調製した、ヒト中期染色体を伴うスライドをプレハイブリッド形成し（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）、次いでリヒター（Ｌｉｃｈｔｅｒ）らのＨｕｍａｎＧｅｎｅｔ．，８０：２２４−２３４（１９８８）中に記載のように実質的にハイブリダイゼーション形成させた（この文献を引用により本明細書中に含める）。このＢＭＸコスミドの４つのＥｃｏＲＩ断片（１、１．５、２．３、および２．５ｋｂ）をニックトランスレーションによりビオチン−１６−ｄＵＴＰを用いてラベル化後、プローブとして用いた。この４つのプローブを５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０％デキストラン硫酸、Ｃｏｔ−ＩＤＮＡ２５μｇおよびサケ精子ＤＮＡ８ｍｇの混合物（７５℃で５分間変性および次いで３７℃で３０分間プレアニーリングした）中にプールした。ハイブリド形成後、上記スライドをストリンジェントに洗浄し、シグナルを蛍光させ、増幅させ、かつ上記染色体をプロピジウム・ヨウ化物およびＤＡＰＩを用いて対比染色させた。結果を分析し、かつ共焦レーザー走査型顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で写真撮影した。このＢＭＸｃＤＮＡを用いたハイブリッド形成により単離されたゲノムコスミドクローンはハイブリッドパネル中の染色体Ｘおよび１８からのシグナルを与えた。したがって、このクローンの全ての４つのＢＭＸ陽性ＥｃｏＲI断片はラベル化され、かつＢＭＸ遺伝子をさらに局在化するためのｉｎｓｉｔｕでのハイブリッド形成の蛍光に使用された。このプローブはＸｐ２２．２−ｐ２１（図４）において特定シグナルを与えた。次いでこのＢＭＸｃＤＮＡをＸｐ２１およびＸｐ２２領域からＹＡＣｓへとハイブリッド形成した。４００ｋｂＩＣＲＦＹＡＣ９００Ｇ１０９６および３５０ｋｂＣＥＰＨＹＡＣ２４４Ｇ７はＢＭＸに対して陽性であった。ＦＩＳＨでの分析によると、これら両方のＹＡＣは非キメラであった；前者はＤＸＳ２０７およびＤＸＳ１９７遺伝子座に対して陽性であり、後者はＤＸＳ１９７のみに対して陽性であった。ＢＭＸは、ＤＸＳ１９７およびＤＸＳ４３に対して陽性のＹＡＣに対して陰性であったから、これはＢＭＸをバンドＸｐ２２．２におけるＤＸＳＩ９７とＤＸＳ２０７遺伝子座の間に位置づけるものである。好ましい態様によってこの発明を説明してきた。したがって、本発明のさらなる局面は、本明細書の記載により当業者には明らかになるはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。２．造血細胞の成育を刺激することができる、請求項１記載のタンパク質の断片。３．請求項１に記載のタンパクをコードするＤＮＡ。４．請求項２に記載のタンパク質断片をコードするＤＮＡ。５．（ａ）検出可能にラベル化した請求項３に記載のＤＮＡに対して、上記造血細胞を含む組織をさらし、（ｂ）上記組織を洗浄し、（ｃ）上記組織中における上記ラベルを検出する、工程を含む、造血細胞の増殖を検出する方法。６．請求項１記載のタンパク質に対して特異的に反応性を示す抗体。