DE69535039T2

DE69535039T2 - Cytoplasmatische Tyrosinkinase

Info

Publication number: DE69535039T2
Application number: DE69535039T
Authority: DE
Inventors: Kari Alitalo
Original assignee: Licentia Oy
Current assignee: Licentia Oy
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-09
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2015-10-10
Also published as: WO1996011275A1; JP2000504201A; CA2201870A1; AU3655195A; AU701901B2; ATE329035T1; EP0783583B1; NO971553D0; NO971553L; DE69535039D1; EP0783583A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine neue cytoplasmatische Tyrosinkinase, das diese codierende Gen und deren Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Zelluläre Prozesse, welche an der Aufrechterhaltung, Differenzierung und Reparatur von Zellen und Geweben beteiligt sind, werden zum Teil durch interzelluläre und intrazelluläre Signale, welche durch die Bindung von Wachstumsfaktoren und anderen Liganden an deren Rezeptoren kontrolliert werden, reguliert. Eine wichtige Form der Signalaussendung, welche von Zellen dazu verwendet wird, die Genexpression und die Aktivierung oder Deaktivierung von biochemischen Wegen zu regulieren, ist die Tyrosinphosphorylierung. Zahlreiche Tyrosinkinasen sind bekannt, welche üblicherweise als Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktor, Insulin, der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor 1, die von Thrombocyten gebildeten Wachstumsfaktoren und die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, vorliegen. Vgl. allgemein Ullrich et al., Cell 61 (1990), 243–254; und Heldin et al., Cell Regulation 1 (1990), 555–556. Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind mehrere Rezepiortyrosinkinasen, die hämatopoetische Wachstumsfaktoren als ihre Liganden erkennen. Diese schließen die c-fms-Rezeptor-Tyrosinkinase, welche den Rezeptor für den Kolonie-stimulierenden Faktor 1 bildet, Sherr et al., Cell 41 (1985), 665–676, und c-kit, einen primitiven und weniger gut charakterisierten hämatopoetischen Wachstumsfaktor, welcher bei Huang et al., Cell 63 (1990), 225–233, beschrieben ist, ein.
Tyrosinkinasen werden basierend auf strukturellen Eigenschaften üblicherweise in Familien, Untertamilien und Klassen unterteilt. Allgemein gibt es zwei umfassende Klassifikationen, welche membrangebundene Tyrosinrezeptorkinasen und Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen, die cytoplasmatische und nukleäre Tyrosinkinasen einschließen, beinhalten. Ein Beispiel für Tyrosinrezeptorkinasen stellt die Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorkinasen dar, die eine Unterfamilie der Transmembran-Rezeptorkinasen mit extrazellulären Domänen bilden. Diese Unterfamilie zusammen mit anderen, wie zum Beispiel den Insulin-Rezeptorkinasen, enthalten homologe cysteinreiche Wiederholungen in ihren extrazellulären Domänen. Vgl. Hirai et al., Science 238 (1987), 1717–1720. Andere membrangebundene Rezeptortyrosinkinasen weisen extrazelluläre Faltungen auf, welche für die Immunglobulin-Superfamilie charakteristisch sind.
Die Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen werden häufig als eine einzelne Gruppe beschrieben, welche Src-ähnliche Kinasen umfasst, aber es ist nun erkannt worden, dass die Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen in mehrere Familien unterteilt werden können. Bolen, Oncogene 8 (1993), 2025–2031; Wang, TIBS 19 (1994), 373–376.
Beispielsweise schließt eine neuerdings identifizierte Nichtrezeptor-Tyrosinkinase-Familie drei unabhängig voneinander clonierte Gene, TEC, ITK (auch bekannt als TSK oder EMT) und BTK (vorher bekannt als ATK oder EMB), ein. Die Proteine, welche durch diese Gene codiert werden, sind im Allgemeinen homolog zu der Src28C-Tyrosinkinase von Drosophila melanogaster. Derartige Peptide enthalten stromaufwärts der Tyrosinkinase-Domäne im Allgemeinen SH3- und SH2-Domänen. Jedoch enthalten die Peptide, welche durch TEC/ITK/BTK codiert werden, auch typischerweise eine lange N-terminale Region, welche keinen Konsensus-Myristylierungsrest aufweist, der im Allgemeinen in Src-ähnlichen Kinasen konserviert ist. Statt dessen enthalten die N-terminalen Regionen der Proteine der TEC/ITK/BTK-Familie eine Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne, welche bei Musacchio et al., TIBS 18 (1993), 343–348, beschrieben ist. Letztlich besteht die TEC/ITK/BTK-Familie im Allgemeinen aus Peptiden, die einen kurzen C-Terminus besitzen, der keine regulatorische Tyrosinphosphorylierungsstelle aufweist, welche in den meisten Src-ähnlichen Kinasen vorkommt.
Den Kern der Pleckstrin-Domäne bildet ein antiparalleles beta-Faltblatt, welches aus sieben Strängen besteht. Der C-Terminus ist in Form einer langen alpha-Helix gefaltet. Die Domäne ist elektrostatisch polarisiert und weist eine Tasche auf, welche bei der Bindung an einen Liganden wie ein Peptid oder ein kleines Protein beteiligt sein kann. Diese Kernstruktur ist in allen PH-Domänen konserviert, wobei diese jedoch eine große Variation hinsichtlich der Schleifen, welche die mutmaßliche Bindungstasche umgeben, aufweisen. Die Funktionen der Pleckstrin- Domänen sind noch unbekannt, obgleich gezeigt worden ist, dass sie an die β- und γ-Untereinheiten von komplexen G-Proteinen binden.
Das Gen, welches die TEC-Tyrosinkinase codiert, wurde in murinen Hepatokarzinomzellen identifiziert, und später wurde gezeigt, dass es in allen murinen hämatopoetischen Zelllinien, welche untersucht wurden, exprimiert wird. Mano et al., Oncogene 8 (1993), 417–424. Die anderen zwei Mitglieder der Familie, ITK und BTK, werden jeweils in bestimmten Stadien der T-Zell- bzw. B-Zell-Entwicklung selektiv exprimiert. Die Expression der ITK-mRNA wird bei der T-Zell-Aktivierung durch IL-2 induziert, und es wird angenommen, dass Mutationen in BTK für eine X-chromosomale Agammaglobulinämie (Burton-Krankheit, XLA), eine Erkrankung, welche durch einen Mangel an zirkulierenden reifen B-Zellen in betroffenen Männern gekennzeichnet ist, verantwortlich sind. Mehrere verschiedene BTK-Mutationen sind in murinen Modellen der XLA beschrieben worden, einschließlich Punktmutationen in den PH- oder SH2-Domänen, welche an funktionell wichtigen Wechselwirkungen mit anderen Proteinen beteiligt sein können.
Es ist berichtet worden, dass cytoplasmatische Tyrosinkinasen mit Ligandaktivierten Transmembranrezeptoren eine Verbindung eingehen, wobei sie anscheinend Liganden-induzierte Signale initiieren oder verstärken. Zum Beispiel gehen die T-Zell- und B-Zell-Rezeptoren und die Cytokinrezeptoren in hämatopoetischen Zellen mit bestimmten Mitgliedern der Src-Tyrosinkinase-Familie eine Verbindung ein, um deren Signale umzuwandeln. Nach Ligandenbindung an diese Rezeptoren wird eine rasche Zunahme der Tyrosinphosphorylierung von spezifischen intrazellulären Substraten beobachtet. Diese Signalwege scheinen daher von spezifischen intrazellulären Tyrosinkinasen, welche durch die stimulierten Rezeptoren rekrutiert und aktiviert werden, abhängig zu sein. Die Mitglieder der Src-Familie werden in einer Zelllinien-selektiven Weise exprimiert, was mit dieser Hypothese übereinstimmt. Mehrere Cytokinrezeptoren interagieren auch mit der JAK-Familie von Kinasen und aktivieren diese, welche wiederum transkriptionelle Regulatoren direkt phosphorylieren.
Im Gegensatz zu Cytokinrezeptoren besitzen die meisten Wachstumsfaktorrezeptoren eine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität. Autophosphorylierte Tyrosylreste einiger dieser Rezeptoren, wie zum Beispiel dem von Thrombocyten gebildeten Wachstumsfaktor-Rezeptor und dem Hepatocyten-Wachstumsfaktor/Streuungsfak tor-Rezeptor, binden an SH2-Domänen von cytoplasmatischen Tyrosinkinasen wie c-Src. Die Rekrutierung einer cytoplasmatischen Tyrosinkinase an einen aktivierten Rezeptorkomplex kann durch Assoziation mit anderen Signalumwadlern, welche eine SH2-Domäne enthalten, und möglicherweise mit Proteinen, welche an die SH3-Domäne binden, das Signal verstärken.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue cytoplasmatische Rezeptortyrosinkinase bereit, welche die gleichen Eigenschaften wie die Mitglieder der TEC/ITK/BTK-Unterfamilie besitzt und als ein Marker für Zellwachstum und Differenzierung sowie für verschiedene Arten der Tumorbildung und bei der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, welche aus einer deregulierten Tyrosinphosphorylierung resultieren, nützlich ist. Unter Verwendung einer gegenwärtig beanspruchten cytoplasmatischen Tyrosinkinase ist es möglich, den Wachstumsfaktor oder den Cytokinrezeptor, deren Signale durch solche Kinasen übertragen werden, durch Verfahren, welche Standard auf dem Fachgebiet sind, zu isolieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue cytoplasmatische Tyrosinkinasen bereit, welche fähig sind, das Wachstum und/oder die Proliferation von hämatopoetischen Zellen zu stimulieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Protein ein BMX-Protein, welches die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung cDNAs, welche BMX codieren, bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße BMX-Tyrosinkinase ein Fragment des BMX-Proteins, welches in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen, entweder in vivo oder in vitro, zu stimulieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine DNA bereit, welche ein Fragment des BMX-Proteins codiert, wobei das Fragment in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, welcher gegen die Proteine der Erfindung gerichtet ist, einschließlich eines monoclonalen Antikörpers und eines Hybridoms, das diesen produziert.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Mittel zum Nachweis des Wachstums und/oder der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens von Gewebe mit einer nachweisbar markierten DNA oder einem erfindungsgemäßen Antikörper; des Waschens des Gewebes und des Nachweisens irgendeines Markers, welcher nach dem Waschen in dem Gewebe verbleibt. Die Verfahren zur Markierung von DNA und Protein und die Verfahren zur Vorbereitung von Gewebe für eine Hybridisierung und eine Immunhistochemie sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine einzigartige Tyrosinkinase bereit, deren Aktivität durch spezifische Inhibitoren mit nachfolgenden Auswirkungen auf das Wachstum oder die Differenzierung von Zellen, welche BMX exprimieren, gehemmt wird.
Weitere Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung werden für den Fachmann unter Berücksichtigung der folgenden ausführlichen Beschreibung davon ersichtlich.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aminosäuresequenzen von BMX (SEQ ID NO: 3), BTK (SEQ ID NO: 4), ITK (SEQ ID NO: 5), TEC (SEQ ID NO: 6), DSrc28C (SEQ ID NO: 8) und der Konsensussequenz (SEQ ID NO: 7).
2A ist ein Northern-Blot und zeigt die Hybridisierungsanalyse von PolyA+-RNA aus Endothelzellen der menschlichen Umbilikalvene (HUVEC) und aus menschlichen HT-1080-Fibrosarkomzellen.
2B ist ein Western-Blot von Anti-BMX- und Kontroll-anti-SEX-Immunpräzipitaten von HUVEC-Zellen.
2C zeigt eine Anti-PTyr-Western-Analyse von BMX-Immunpräzipitaten von COS-Zellen, welche mit einem BMX enthaltenden Vektor oder einem leeren Vektor (MOCK) transfiziert wurden.
2D zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Immunpräzipitaten von transfizierten COS-Zellen (BMX), welche einer in-vitro-Kinasereaktion unterzogen wurden.
3 ist ein Western-Blot von NIH3T3-Zellen, infiziert mit einem BMX-Retrovirus, welches BMX exprimiert, oder einem Kontrollvirus (C), die direkt lysiert (Bahnen gekennzeichnet mit "-") oder unter Verwendung von Anti-BMX-Antiserum immunpräzipitiert (IP) wurden.
4 zeigt normale menschliche Metaphasenchromosomen und eine Vergrößerung des X-Chromosoms, welche die Lokalisierung des BMX codierenden Gens zeigt, sowie eine schematische Darstellung des Chromosoms.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Tyrosinkinasen, wie zum Beispiel die BMX-Tyrosinkinase, welche in SEQ ID NO: 3 angegeben ist; Fragmente dieser Kinasen; und DNA, welche diese Kinasen und diese Fragmente codiert, bereit. Solche cDNAs wurden aus Genombanken isoliert, die aus Knochenmark- und Endothelzellquellen konstruiert wurden. Die BMX codierende cDNA umfasst einen offenen Leserahmen von 2025 bp, welcher 675 Aminosäuren codiert. Das Proteinprodukt umfasst eine einzelne Tyrosinkinase-Domäne, eine SH2-Domäne und eine SH3-Domäne. Die Tyrosinkinase-Domäne weist eine Homologie von etwa 70% mit den Tyrosinkinase-Domänen von BTK, ITK und TEC auf, wie durch einen Vergleich von SEQ ID NO: 3 mit SEQ ID NO: 4, 5 bzw. 6 gezeigt wurde. Ein erfindungsgemäßes Fragment ist jeder Teil der Primärstruktur der intakten Kinase, der die Fähigkeit beibehält, das Wachstum und/oder die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen zu stimulieren oder zu hemmen.
Eine erfindungsgemäße cytoplasmatische BMX-Tyrosinkinase weist die in SEQ ID NO: 3 angegebene abgeleitete Aminosäuresequenz auf, welche zu den Sequenzen von Btk, Itk, Tec und den Src28C-Tyrosinkinasen von Drosophila melanogaster in hohem Grade homolog ist. Der Abgleich der BMX-Sequenz mit seinen am stärksten homologen Sequenzen ist in 1 gezeigt. Die Durchsicht dieser Figur legt nahe, dass das ATG-Codon in Position 36 der BMX-cDNA die Translationsinitiationsstelle ist. Dieses Codon ist in einer Kozak-Konsensus-Translationsinitiationssequenz (AATATGG) eingebaut.
Es ist berichtet worden, dass die variablen N-terminalen Domänen von Mitgliedern der Src-Familie von Kinasen mit Transmembranrezeptoren interagieren. Mustelin et al., TIBS 18 (1993), 215–220. Wie in 1 gezeigt ist, weist die N-terminale Region von BMX eine signifikante Homologie mit denjenigen von TEC, ITK und BTK auf. Die N-terminale Domäne von BMX enthält auch eine Region, die mit der PH (Pleckstrin-Homologie)-Konsensussequenz, welche in verschiedenen GPTase-aktivierenden Proteinen (GAP) und in anderen Kinasen sowie Cytoskelett proteinen vorkommt, vergleichbar ist. Den Kern der Pleckstrin-Domäne bildet ein antiparalleles beta-Faltblatt, das aus sieben Strängen besteht, und der C-terminale Teil ist in Form einer langen alpha-Helix gefaltet. Die Pleckstrin-Domäne ist elektrostatisch polarisiert und enthält eine mutmaßliche Liganden-Bindungsdomäne.
Im Gegensatz zu Cytokinrezeptoren besitzen die meisten Wachstumsfaktorrezeptoren eine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität. Autophosporylierte Tyrosylreste einiger Wachstumsfaktorrezeptoren (z.B. der von Thrombocyten gebildete Wachstumsfaktorrezeptor) binden an die SH2-Domänen von cytoplasmatischen Tyrosinkinasen wie c-Src. Die Rekrutierung einer cytoplasmatischen Tyrosinkinase an einen aktivierten Wachstumsfaktor-Rezeptorkomplex verstärkt das Signal durch diesen Komplex durch die Assoziation der Tyrosinkinase mit anderen signalübertragenden Molekülen, welche SH3 und SH2 enthalten.
Die beanspruchten BMX-Proteine enthalten sowohl SH2- als auch SH3-Domänen. Jedoch unterscheidet sich die BMX-SH3-Domäne von der Konsensussequenz insofern, als sie zwei stark hydrophile Bereiche, welche reich an Ser- und Glu-Resten sind, in ihrem C-Terminus einschließt. Dieser Unterschied kann auf eine Spleißvariation zurückzuführen sein. Das Vorangehende ist ein wesentlicher Hinweis, dass die erfindungsgemäßen Tyrosinkinasen aktive Teile von Wachstumsfaktorrezeptoren binden und dass dies aufgrund der Lokalisierung der beanspruchten Proteine auch für hämatopoetische Zelllinien zutreffend ist.
Demgemäß sind die erfindungsgemäßen Proteine zur Stimulierung von hämatopoetischen Zelllinien nützlich. Außerdem sind die erfindungsgemäßen DNAs als diagnostische Reagenzien beim Nachweis der Proliferation und Onkogenese von hämatopoetischen Zellen nützlich. Antikörper und Peptide der Erfindung sind zusätzlich zur Hemmung der Aktivität von Wachstumsfaktoren nützlich. Die folgenden Beispiele beinhalten Einzelheiten zur Isolierung, Charakterisierung, Lokalisierung und Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine, DNAs und den Verfahren zur Verwendung davon.
Beispiel 1
Clonierung und Analyse einer die erfindungsgemäßen Proteine codierenden cDNA
Aus normalem menschlichem Knochenmark wurde mit Hilfe einer Guanidinthiocyanat-Extraktion die gesamte RNA präpariert. Ein Aliquot von 2 μg RNA wurde dann unter Verwendung von 10 U der reversen Transkriptase des Vogel-Myeloblastose-Virus in Gegenwart von 0,5 μg Oligo-dT-Primer, jeweils 1 μM Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanintriphosphat, Desoxycytosintriphosphat sowie Desoxythymidintriphosphat und 10 U RNAsin (Promega, Madison, WI) umgekehrt transkribiert. Der Reaktionspuffer enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 6 mM MgCl₂, 40 mM KCl und 1 mM Dithiothreit. Die Reaktionsinhalte wurden bei 42°C für 1 Stunde, dann bei 52°C für 30 Minuten und anschließend bei 95°C für 5 Minuten inkubiert.
Ungefähr 3% der revers transkribierten cDNA wurden dann mittels PCR in einem Reaktionsvolumen von 100 ml unter Verwendung von 3 U Dynazyme (Finnzymes, Helsinki, Fl) in einem Reaktionspuffer, umfassend 1,5 mM MgCl₂, und in Gegenwart von jeweils 200 5 μM Desoxyadenosintriphosphat, Desoxycytosintriphosphat, Desoxyguanintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat amplifiziert. Die Primer waren:
5'-GGTCTAGAA(A/g)AA(A/G)TT(C/T)GT(C/G)CAC(A/C)G(G/A) GAC-3' (0.15 m) (SEQ ID NO:1) und
5'-GCTCTAGA(G/A)GGCCATCCA(T/C)TT(G/C/A)AC(T/C/A)GG-3' (0.15 m) (SEQ ID NO: 2)
welche entsprechend den Sense- bzw. Antisense-Primer darstellten. Beide Primer wurden von konservierten Tyrosinkinase-Domänen aus bekannten Kinasen erhalten. Das Protokoll für die Amplifikation war 90 Sekunden bei 95°C; 120 Sekunden bei 42°C; und 180 Sekunden bei 68°C für 35 Zyklen in einem Volumen von 100 μl in einem Perkin-Eimer DNA-Thermocycler 480. Ein 150 by großes cDNA-Produkt, das die neuen BMX codierenden Sequenzen darstellt, wurde erhalten. Dieses Produkt wurde unter Verwendung eines TA-Clonierungskits (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers in einen pCR-Vektor subcloniert.
Das vorstehend beschriebene, PCR-amplifizierte BMX-Produkt, bezeichnet als B1, wurde unter Verwendung eines Zufallsprimers mit ³²P-CTP radioaktiv markiert und für die Durchmusterung einer Oligo-dT-geprimten λgt10-cDNA-Bank, die aus menschlicher Knochenmark-RNA aufgebaut wurde (Clontech), verwendet. Die B1-cDNA umfasste die mit Hilfe der PCR-Amplifikation erhaltene Sequenz sowie einen umgebenden offenen Leserahmen, wodurch eine cytoplasmatische Tyrosinkinase vorhergesagt wird, welche mit der vor kurzem identifizierten Btk-Kinase sehr eng verwandt ist. Wenn die B1-cDNA als Sonde für die Untersuchung von Northern-Blots verwendet wurde, konnte kein spezifisches Signal in irgendeiner der untersuchten Zelllinien nachgewiesen werden. Anhand der Ergebnisse, welche durch die reverse Transkription-PCR-Amplifikation der RNA erhalten wurden, zeigte sich dennoch, dass BMX nicht nur im Knochenmark, sondern auch in Endothelzellen exprimiert wird. Daher wurde eine von Endothelzellen-RNA abgeleitete menschliche cDNA-Bank durchmustert, um eine cDNA in vollständiger Länge zu erhalten. Mehrere positive Plaques wurden ausgewählt, und die längste BMX-cDNA-Insertion von etwa 2,4 kb (E7) wurde in ein pGEM-Plasmid (Promega) subcloniert und mit Hilfe des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens nach Sanger auf beiden Strängen sequenziert. Der E7-Clon wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, am 5. Oktober 1994 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 75907 hinterlegt. Computeranalysen der Sequenzen wurden unter Verwendung des GCG-Programms durchgeführt, wie bei Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 387–395, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben. Die erhaltene BMX-Sequenz ist in 1 und in SEQ ID NO: 3 angegeben.
Der E7-Subclon enthielt einen offenen Leserahmen, welcher 675 Aminosäuren codieren konnte. Die abgeleitete Aminosäuresequenz war zu den Sequenzen von TEC, ITK und BTK und zu der Src28C-Tyrosinkinase von Drosophila melanogaster in hohem Grade homolog. Ein Sequenzabgleich legte nahe, dass das ATG in Position 36 der cDNA die Translationsinitiationsstelle war.
Das BMX-Protein wies eine N-terminale Region von 210 Resten auf, welche eine PH-Domäne (schraffierter Bereich in 1), aber keine Konsensus-Myristylierungsstelle umfasst. Die variablen aminoterminalen Domänen der Src-Familie sind an der Wechselwirkung mit Transmembranrezeptoren beteiligt. Demzufolge ist es interessant anzumerken, dass die lange N-terminate Region von BMX einen hohen Homologiegrad mit den Btk-, Itk- und Tec-Kinasen aufweist. Dieser Teil des Moleküls kann eine Rolle bei der Assoziation mit bislang unbekannten Rezeptoren oder signalübertragenden Molekülen spielen. In dieser Region sind die Sequenzen dieser vier Tyrosinkinasen reich an basischen Aminosäureresten, und sie entsprechen sich hinsichtlich der Konsensussequenz für die PH-Domäne, die in einer Reihe von Proteinen, wie zum Beispiel bestimmten GTPase-aktivierenden Proteinen (GAP) und GDP-GTP-Austauschfaktoren (wie SOS1), in Kinasen wie sARK und RAC sowie in Dynamin, Kinesin und Spectrin zu finden ist.
An die PH-Domäne schließt sich eine SH3- und eine SH2-Domäne (eingerahmter Bereich in 1) an. Zum Vergleich sind in 1 auch die entsprechenden Regionen der Src28C-TK-Sequenz von Drosophila melanogaster angegeben. Die Sequenzen zwischen den Aminosäureresten 185–206 und 207–228 (waagrechte Pfeile in 1) von BMX zeigen sowohl auf der Nucleotid- als auch der Aminosäureebene eine Übereinstimmung von etwa 80%, was nahe legt, dass dieser Bereich durch eine Verdopplung der BMX-DNA-Sequenz entstanden ist. Der letztere Bereich (207–228) gehört zu dem N-terminalen Teil der BMX-SH3-Domäne.
Obgleich die Merkmale von SH3-Domänen für alle Mitglieder der BMX/BTK/ITK/TEC-Tyrosinkinase-Familie üblich sind, weichen einige der Sequenzen von der Konsensussequenz ab. Der C-terminale Teil der BMX-SH3-Sequenz (stromabwärts des WW-Motives in Position 243) unterscheidet sich von denen der anderen Kinasen und enthält zwei stark hydrophile Bereiche, welche reich an Ser- und Glu-Resten sind. Im Gegensatz dazu ist die SH2-Domäne in der BMX-Sequenz im Vergleich zu den anderen Tyrosinkinasen hinreichend konserviert (1). Innerhalb der Tyrosinkinase-Domäne (Pfeile) sind in 1 das ATP-Bindungsmotiv, enthaltend die Gly(434)XGlyXXGly-Sequenz, und der Lys435-Rest markiert. Der Tyr566-Rest von BMX entspricht der konservierten Tyr416-Autophosphorylierungsstelle von c-Src. An die katalytische Domäne schließt sich ein kurzer C-terminaler Schwanz an, worin nichtkonservierte Autophosphorylierungsstellen zu finden sind. Im Anschluss an das Codon 675 der BMX-Sequenz wurden mehrere Stoppcodons identifiziert.
Polyadenylierte RNAs aus mehreren menschlichen, fetalen und adulten Geweben wurden mit Hilfe eines Northern-Blots und einer Hybridisierung auf BMX-RNA untersucht. BMX-Transkripte wurden vorwiegend in sowohl dem fetalen als auch dem adulten Herz nachgewiesen. Schwächere Signale wurden von der Lunge und der Niere des Fetus, sowie von dem Skelettmuskel, der Plazenta, der Lunge, der Leber, den Hoden, des Ovars sowie des Dünn- und Dickdarms des Adulten erhalten. Von der Niere, der Bauchspeicheldrüse und der Prostata des Adulten wurden erst nach einer sehr langen Exposition des Autoradiogramms Signale erhalten, während von dem fetalen oder adulten Gehirn oder von der fetalen Leber oder Niere kein Signal erhalten werden konnte. Folglich scheint BMX im Vergleich zu den verwandten Btk-, Itk- und Tec-Tyrosinkinasen eine weiter verbreitete Expression zu zeigen. Wenigstens ein Teil dieser Hybridisierungssignale kann von hämatopoetischen Zellen in diesen Organen herrühren.
Beispiel 2
Expression und Analyse des BMX-Proteins
Ein BMX-Retrovirus wurde in den pBABEpuor-Vektor konstruiert. Der pBABEpuor-Vektor ist bei Morgenstern et al., Nucl. Acids Res. 12 (1990), 387–395, beschrieben. Der erhaltene Vektor wurde dann in BOSC23-Zellen transfiziert, wie bei Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8392–8396, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist. Der Überstand wurde dann 48 Stunden später gesammelt und für die Infektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Die infizierten Zellen wurden durch Züchten in Puromycin für 2 Wochen selektiert. COS-Zellen wurden mit 10 μg des pMT2-Vektors, welcher bei Kaufman et al., Cell. Biol. 9, 946–958, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist und die BMX-cDNA-Insertion enthält, unter Anwendung der Calciumphosphat-Methode transfiziert. Nach Züchten für 36–48 Stunden wurden die Zellen mit Elektrophoreseprobenpuffer (2,5% Natriumdodecylsulfat, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) für einen Western-Blot oder mit eiskaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, enthaltend 10 mg/ml Pepstatin, 100 5 g/ml Leupeptin, 0,05 TIU/ml Aprotinin, 1 mM PMSF und 1 mM aktiviertes Natriumorthovanadat) für eine Immunpräzipitation extrahiert. Die geklärten Überstände wurden mit 5 μl Anti-BMX-Antiserum, erzeugt in Kaninchen unter Verwendung eines GST-Fusionsproteins (Pharmacia), welches derart konstruiert ist, dass es die BMX-Aminosäurereste 599–675 exprimiert, immunpräzipitiert. Präimmunserum und Anti-SEX-Antiserum gegen ein nicht verwandtes Protein (L.T., in Vorbereitung) wurden als Kontrollen verwendet.
Die Proben wurden in einer 7,5% SDS-PAGE, gefolgt von einem Western-Blot und dem Nachweis unter Verwendung einer 1:1000-Verdünnung des Anti-BMX-Antiserums (2B) oder mittels der monoclonalen PY20-anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Zymed), wie in 2C gezeigt, gefolgt von Peroxidase-konjugierten Antikörpern gegen Maus-Immunglobuline und einem ECL-Nachweis gemäß den An weisungen des Herstellers (Amersham), untersucht. Alternativ wurden die Immunpräzipitate einer Kinasereaktion in 25 mM HEPES, pH 7,2, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂ und 10 mCi [³²P]-ATP für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer SDS-PAGE und einer Autoradiographie, unterzogen.
Die Ergebnisse sind in den 2A–2D gezeigt. 2A zeigt eine Northern-Blot-Analyse von RNA aus menschlichen Endothelzellen der Umbilikalvene unter Verwendung der BMX-Sonde (bezeichnet als BMX-NB in der Figur). Es ist eine 2,7 kb große mRNA-Bande erkennbar. Eine Immunpräzipitation des BMX-Proteins, gefolgt von einem Immunblot mit Anti-BMX-Antikörpern, führte zu dem Nachweis einer schwachen Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 80 kD, wie in den 2B und 3 gezeigt ist. Diese Bande wurde bei Kontroll-Immunpräzipitaten nicht beobachtet. Eine Immunpräzipitation und ein Immunblot von BMX aus NIH3T3-Zellen, welche ein BMX-Retrovirus exprimieren, und aus COS-Zellen, die mit einem BMX-Plasmid-Expressionsvektor transfiziert sind, führte ebenfalls zu dem Nachweis eines 80 kD-Polypeptids, welches Tyrosyl-phosphoryliert war, wie in 2C gezeigt ist (α-PTyr-WB). Jedoch wurde dieses Polypeptid in Immunkomplex-Kinasereaktionen mit [³²P]-ATP nur schwach markiert, wie in 2D gezeigt ist.
Beispiel 3
Chromosomale Lokalisierung des BMX-Gens
Ein Southern-Blot, welcher aus 24 somatischen Interspezies-Zellhybriden hergestellt wurde, wurde vom Mutant Cell Repository of the Coriell Institute (Camden, NJ) erhalten.
Zur Ermittlung der chromosomalen Lokalisierung des BMX-Gens wurden die DNAs von somatischen Mensch-Nagetier-Zellhybriden, die definierte Sätze von menschlichen Chromosomen enthalten, mit Hilfe eines Southern-Blots und einer Hybridisierung mit der BMX-Sonde untersucht. In den 24 DNA-Proben wurden bei zwei Mensch/Chinesischer Hamster-Hybriden humanspezifische Signale beobachtet, wobei eines davon die menschlichen Chromosomen 1 und X enthält, und das andere nur das menschliche X-Chromosom enthält. Diese Analyse zeigte an, dass das BMX-Gen auf dem Chromosom X lokalisiert ist. Daher wurde die Bezeichnung Knochenmark-Kinase-Gen auf dem X-Chromosom, BMX, gewählt. Eine menschliche Plazenta-Cosmidbank in pWE15, welche bei Lichter et al., Human Genet. 80 (1988), 224– 234, beschrieben ist, sowie eine Bank unter Verwendung eines menschlichen X-Chromosoms/künstlichen Hefechromosoms (YAC) wurden mit der [³²P]-markierten Insertion der BMX-cDNA durchmustert. Positive Clone wurden bis zur Reinheit erneut durchmustert und durch einen Southern-Blot und eine Hybridisierung bestätigt.
Objektträger mit menschlichen Metaphasenchromosomen, hergestellt aus 5-Bromdesoxyuridin-synchronisierten Lymphocytenkufturen, wurden vorhybridisiert und dann hybridisiert, wie im Wesentlichen bei Lichter et al., Human Genet. 80 (1988), 224–243, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist. Vier EcoRl-Fragmente (1, 1,5, 2,3 und 2,5 kb) des BMX-Cosmids wurden nach Markierung mit Biotin-16-dUTP durch eine Nicktranslation als Sonden verwendet. Die vier Sonden wurden in einem Gemisch aus 50% Formamid, 2x SSC, 1% Tween-20, 10% Dextransulfat, 25 μg Cot-1-DNA und 8 mg Lachssperma-DNA vereinigt, bei 75°C für 5 Minuten denaturiert und dann bei 37°C für 30 Minuten voranneliert. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger stringent gewaschen, das Signal wurde fluoreszierend gemacht und verstärkt, und die Chromosomen wurden mit Propidiumiodid und DAPI gegengefärbt. Die Ergebnisse wurden analysiert und mit Hilfe eines konfokalen Laserrastermikroskops (Zeiss) fotografiert.
Ein genomischer Cosmid-Clon, welcher durch die Hybridisierung mit der BMX-cDNA isoliert wurde, ergab Signale von Chromosom X und 18 in der Hybridreihe. Daher wurden alle vier BMX-positiven EcoRl-Fragmente dieses Clons markiert und ohne eine Fluoreszenzmarkierung in einer in-situ-Hybridisierung verwendet, um das BMX-Gen weiter zu lokalisieren. Diese Sonde ergab ein spezifisches Signal in Xp22.2-p21 (4). Die BMX-cDNA wurde dann mit YACs aus der Xp21- und Xp22-Region hybridisiert. Das 400 kb große ICRF-YAC 90001096 und das 350 kb große CEPH-YAC 244G7 waren für BMX positiv. Diese beiden YACs waren nicht chimär, wie durch eine FISH-Analyse gezeigt wurde; wobei das Erstere bezüglich der DXS207- und DXS197-Loci und das Letztere nur bezüglich DXS197 positiv war. Da der Nachweis von BMX auf YACs, welche für DXS197 und DXS43 positiv waren, negativ war, liegt BMX zwischen den DXS197- und DXS207-Loci in Bande Xp22.2.
Die Erfindung ist im Hinblick auf die bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben worden. Demgemäß werden weitere Aspekte der Erfindung für den Fachmann aus der Lektüre der vorliegenden Anmeldung ersichtlich. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein mit Tyrosinkinase-Aktivität, umfassend die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz oder einen Teil dieser Sequenz, der Tyrosinkinase-Aktivität hat und in der Lage ist, das Wachstum von hämatopoetischen Zellen zu stimulieren.
Protein nach Anspruch 1, das in der Lage ist, das Wachstum von hämatopoetischen Zellen zu stimulieren.
Rekombinante DNA, die das Protein von Anspruch 1 codiert.
Verfahren zum Nachweis des Wachstums von hämatopoetischen Zellen, umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen von Gewebe, umfassend die hämatopoetischen Zellen, mit einer nachweisbar markierten DNA nach Anspruch 3; (b) Waschen des Gewebes; und (c) Nachweisen der Markierung in dem Gewebe.
Antikörper, der spezifisch mit dem Protein nach Anspruch 1 reagiert und der andere verwandte Tyrosinkinasen nicht erkennt.