DE69736807T2

DE69736807T2 - Lipid kinase

Info

Publication number: DE69736807T2
Application number: DE69736807T
Authority: DE
Inventors: Bart Vanhasebroeck; Michael Derek Waterfield
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Priority date: 1996-06-01
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2017-05-31
Also published as: DE69736807D1; CN1220701A; JP3902663B2; EP0914448B1; CA2256483A1; DK0914448T3; US20050064572A1; US6849420B2; US20030099627A1; CN1260360C; HK1020751A1; NZ332634A; GB9611460D0; US20060018893A1; AU719354B2; CA2256483C; ES2274543T3; JP2000517165A; US7422886B2; ATE342364T1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Lipidkinase, die zur PI3-Kinasefamilie (PI3K-Familie) gehört, und genauer betrifft die Erfindung verschiedene Aspekte der neuen Lipidkinase, insbesondere, aber nicht ausschließlich, einen Nachweis der Expression dieser Kinase, um Motilität oder Invasion von Zellen wie Metastasen von Krebszellen zu diagnostizieren oder vorherzusagen; ferner betrifft sie Mittel zum Beeinflussen dieser Expression oder zum Hemmen der Kinase, um diese Motilität oder Invasion zu verstärken oder zu reduzieren oder zu verhindern und so die Bewegung der ausgewählten Zellen zu verbessern oder einzuschränken.
Ein Überblick über die Enzyme der PI3-Kinasefamilie findet sich in unserer parallel anhängigen Patentanmeldung WO93/21328. Kurz gesagt zeigt diese Klasse von Enzymen Phosphoinositid-3-Kinaseaktivität (Phosphoinositid wird im Folgenden als PI bezeichnet). Nachdem unser Wissen über zelluläre Signaltransduktionssysteme und zelluläre Second Messenger-Systeme wichtige Fortschritte gemacht hat, ist bekannt, dass die PI3Ks eine Hauptrolle bei der Regulierung der Zellfunktion spielen müssen. Tatsächlich ist bekannt, dass PI3Ks Mitglieder einer wachsenden Zahl potenzieller Signalproteine sind, die mit entweder durch Ligandenstimulation oder als Folge von Zelltransformation aktivierten Protein-Tyrosinkinasen assoziieren. Sobald sie dann assoziiert sind, sorgen sie für einen wichtigen Komplex im Signalweg der Zelle und steuern Ereignisse bis zu einem bestimmten Abschluss.
PI3-Kinasen katalysieren das Anhängen von Phosphat an die 3'-OH-Position des Inositolrings von Inositollipiden, wobei sie Phosphatidylinositolmonophosphat, Phosphatidylinositoldiphosphat und Phosphatidylinositoltriphosphat bilden (Whitman et al., 1988, Stephens et al., 1989 und 1991). Eine Familie von PI3-Kinaseenzymen wurde nun in so verschiedenen Organismen wie Pflanzen, Schleimpilzen, Hefen, Fruchtfliegen und Säugern identifiziert (Zvelebil et al., 1996).
Es ist denkbar, dass verschiedene PI3-Kinasen für die Bildung verschiedener 3'-phosphorylierter Inositollipide in vivo verantwortlich sind. Auf Basis ihrer in vitro-Lipidsubstratspezifität lassen sich drei PI3-Kinase-Klassen unterscheiden. Enzyme einer ersten Klasse haben eine breite Substratspezifität und phosphorylieren PtdIns, PtdIns(4)P und PtdIns(4,5)P₂. Klasse I-PI3-Kinasen umfassen p110α, p110β und p110γ von Säugern (Hiles et al., 1992; Hu et al., 1993; Stephens et al., 1994; Stoyanov et al., 1995).
P110α und p110β sind eng verwandte PI3-Kinasen, die mit p85-Adapterproteinen und mit GTP-gebundendem Ras interagieren.
Zwei 85 kDa-Untereinheiten, p85α und p85β, wurden kloniert (Otsu et al., 1992). Diese Moleküle enthalten eine N-terminale src-Homologie-3-Domäne (SH3-Domäne), eine Region mit Breakpoint-Cluster (bcr)-Homologie, die von zwei prolinreichen Regionen flankiert wird, und zwei src-Homologie-2-Domänen (SH2-Domänen). Allen verkürzten p85-Proteinen, die durchalternatives Spleißen aus dem p85α-Gen gebildet oder von anderen Genen als denen für p85α/β codiert werden, fehlen die SH3-Domäne und die bcr-Region, die durch einen charakteristischen kurzen N-Terminus ersetzt zu sein scheinen (Pons et al., 1995; Inukai et al., 1996; Antonetti et al. 1996). Die SH2-Domänen, die in allen p85-Molekülen vorhanden sind, verleihen den heterodimeren p85/p 110-PI3Ks die Fähigkeit, mit phosphorylierten Tyrosinresten an zahlreichen Rezeptoren und anderen zellulären Proteinen zu interagieren. Im Gegensatz zu p110α und β interagiert p110γ nicht mit p85, sondern assoziiert stattdessen mit einem p101-Adapterprotein (Stephens et al., 1996). P110γ-Aktivität wird durch G-Proteinuntereinheiten stimuliert.
PI3Ks einer zweiten Klasse enthalten Enzyme, die zumindest in vitro PtdIns und PtdIns(4)P, aber nicht PtdIns(4, 5)P₂ phosphorylieren (MacDougall et al., 1995; Virbasius et al., 1996, Molz et al., 1996). Diese PI3Ks enthalten an ihrem C-Terminus alle eine C2-Domäne. Die Rolle dieser Klasse II-PI3Ks in vivo ist unbekannt.
Eine dritte PI3K-Klasse hat eine auf PtdIns beschränkte Substratspezifität. Diese PI3Ks sind homolog zu Hefe-Vps34p, das bei Hefe an der Migration neu gebildeter Proteine vom Golgi-Apparat zur Vakuole beteiligt ist, dem Äquivalent zum Lysosom von Säugern (Stack et al., 1995). Sowohl Vps34p von Hefe als auch von Säugern treten in einem Komplex mit Vps15p auf, einer 150 kDa-Serin/Threonin-Proteinkinase (Stack et al., 1995; Volinia et al., 1995; Panaretou et al., zur Veröffentlichung eingereicht).
PtdIns(3)P liegt in Zellen konstitutiv vor, und seine Menge bleibt bei extrazellulärer Stimulation größtenteils unverändert. Im Gegensatz dazu sind PtdIns(3, 4)P₂ und PtdIns(3, 4, 5)P₃ in ruhenden Zellen so gut wie nicht vorhanden, werden aber bei Stimulation durch zahlreiche verschiedene Wachstumsfaktoren rasch produziert, was eine wahrscheinliche Funktion als Second Messenger vermuten lässt (Stephens et al., 1993). Man beginnt gerade erst, die Rolle von PI3Ks und ihren phosphorylierten Lipiden bei der Zellphysiologie zu verstehen. Diese Lipide können eine doppelte Rolle erfüllen: Außer dass sie physikalische, ladungsvermittelte Wirkungen auf die Krümmung der Lipiddoppelschicht ausüben, besitzen sie auch die Fähigkeit mit spezifischen Bindungsproteinen zu interagieren und ihre Lokalisation und/oder Aktivität zu modulieren. Zu den potenziellen Zielen dieser Lipide gehören Proteinkinasen, wie Proteinkinase C-Isoformen, Proteinkinase N/Rho-aktivierte Kinasen und Akt/RAC/Proteinkinase B (Toker et al., 1994; Palmer et al., 1995; Burgering und Coffer, 1995); Franke et al., 1995; James et al., 1996; Klippel et al., 1996). Akt/RAC/Proteinkinase B befindet sich wahrscheinlich stromaufwärts von Zielen wie p70 S6-Kinase und Glycogensynthasekinase-3 (Chung et al., 1994; Cross et al., 1995). PI3Ks beeinflussen auch die Aktivität kleiner GTP-bindender Proteine wie Rac und Rab5, möglicherweise daddurch, dass sie den Nukleotidaustausch regulieren (Hawkins et al., 1995; Li et al., 1996). Letztlich kann die Kombination dieser Wirkungen zu Umlagerungen des Zytoskeletts, DNA-Synthese/Mitogenese und Überleben und Differenzierung von Zellen führen (Vanhaesebroeck et al., 1996).
Wir beschreiben hier eine neue Klasse I-PI3-Kinase von Säugern, die wir p110δ genannt haben. Diese neue PI3-Kinase verkörpert die Klasse I-PI3-Kinasefamilie, indem sie p85α, p85β und p85γ bindet. Daneben bindet sie auch GTP-ras, zeigt aber wie p110α keine Bindung an rho und rac. Sie hat mit p110α und p110β auch die gleiche breite GTP-Phosplioinositidlipidsubstratspezifität, und sie zeigt ferner Proteinkinaseaktivität und weist eine ähnliche Wirkstoffempfindlichkeit wie p110α auf.
Sie ist jedoch durch ihre selektive Gewebeverteilunggekennzeichnet. Im Gegensatz zu p110α und p110β, die ubiquitär exprimiert zu werden scheinen, ist die Expression von p110δ in Populationen weißer Blutzellen, d. h. Milz, Thymus und besonders peripheren Blutleukozyten, besonders hoch. Neben dieser Beobachtung haben wir auch gefunden, dass p110δ in den meisten Melanomen exprimiert wird, aber in keinerlei Melanozyten, den normalen, das Gegenstück zu Melanomen bildenden Zellen. Angesichts der natürlichen Verteilung von p110δ in Geweben, die bekanntermaßen Motilität oder Invasion zeigen, und ferner der Expression von p110δ in Krebszellen vermuten wir, dass p110δ eine Rolle bei Zellmotilität oder -invasion spielen muss, und so kann die Expression dieser Lipidkinase in Krebszellen das metastatische Verhalten von Krebszellen erklären kann.
Ein weiteres neues Merkmal von p110δ ist dessen Fähigkeit, in einer Mn²⁺-abhängigen Weise zu autophosphorylieren. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass Autophosphorylierung zu Hemmung der Lipidkinaseaktivität des Proteins führt. Daneben enthält p110δ getrennte Module für eine potenzielle Protein:Protein-Interaktion, die eine prolinreiche Region beinhalten (siehe 1, Position 292-311, wobei 8 von 20 Aminosäuren Prolin sind), und eine Region, die einer basischen Leucin-Zipper (bZIP)-Domäne ähnelt (Ing et al., 1994 und Hirai et al., 1996). Solche biochemischen und strukturellen Unterschiede zwischen p85-bindenden PI3-Kinasen weisen darauf hin, dass sie unterschiedliche Funktionen erfüllen und/oder in vivo differenziell reguliert werden.
Wir offenbaren hier ein Nukleinsäuremolekül menschlichen Ursprungs und entsprechende Aminosäuresequenzdaten für p110δ. Mit dieser Information ist es möglich, die Expression von p110δ in verschiedenen Gewebetypen zu bestimmen und insbesondere seine Expression in Krebsgewebe zu bestimmen, um die Motilität oder Invasivität solcher Gewebe zu diagnostizieren und so das Potenzial vorherzusagen, dass sekundäre Tumoren auftreten. Ferner ist es auch möglich, Mittel bereitzustellen, die die Expression von p110δ beeinträchtigen oder auf andere Weise seine Funktion stören. Mit den hier bereitgestellten Sequenzdaten ist es beispielsweise möglich, Antisensematerial bereitzustellen, das die Expression von p110δ verhindert.
Wie oben erwähnt, umfasst die Erfindung Antisense-Oligonukleotide, die selektiv an ein Nukleinsäuremolekül binden, das für ein PI3Kδ-Protein codiert, um Transkription und/oder Translation von PI3Kδ-Genen zu senken. Dies ist im Grunde bei jedem medizinischen Zustand wünschenswert, bei dem eine Verminderung der Expression des PI3Kδ-Genprodukts wünschenswert ist, einschließlich der Verminderung irgendwelcher Ausdrucksformen eines Tumorzellphänotyps, die einer PI3Kδ-Genexpression zuzuschreiben sind. Auf diese Weise können Antisensemoleküle verwendet werden, um solche Ausdrucksformen eines Tumorzellphänotyps zu verlangsamen oder zu stoppen.
Der Begriff "Antisense-Oligonukleotid" oder "Antisense", wie er hier verwendet wird, beschreibt ein Oligonukleotid, d.h. ein Oligoribonukleotid, ein Oligodesoxyribonukleotid, ein modifiziertes Oligoribonukleotid oder ein modifiziertes Oligodesoxyribonukleotd, das unter physiologischen Bedingungen an DNA bindet, die ein bestimmtes Gen umfasst, oder an ein mRNA-Transkript dieses Gens, und dadurch die Transkription des Gens und/oder die Translation der mRNA hemmt. Die Antisensemoleküle sind so konstruiert, dass sie Transkription oder Translation eines Zielgens bei Hybridisierung mit dem Zielgen stören. Der Fachmann erkennt, dass die genaue Länge des Antisense-Oligonukleotids und sein Komplementaritätsgrad mit dem Ziel vom jeweiligen spezifischen Ziel abhängen, einschließlich der Sequenz des Targets und der jeweiligen Basen, die diese Sequenz ausmachen. Bevorzugt wird das Antisense-Oligonukleotid so konstruiert und ausgelegt, dass es unter physiologischen Bedingungen selektiv mit dem Ziel bindet, d.h. dass es unter physiologischen Bedingungen deutlich stärker an die Zielsequenz bindet als an irgendeine andere Sequenz in der Zielzelle. Auf Basis der in 9 dargestellten DNA-Sequenz oder auf Basis allelischer oder homologer genomischer Sequenzen und/oder DNA-Sequenzen kann ein Fachmann ohne weiteres beliebige geeignete Antisensemoleküle zur erfindungsgemäßen Verwendung auswählen und synthetisieren. Für eine ausreichend selektive und starke Hemmung sollten solche Antisense-Oligonukleotide wenigstens 7 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996) und vorzugsweise wenigstens 15 aufeinanderfolgende Basen umfassen, die mit dem Ziel komplementär sind. Ganz besonders bevorzugt umfassen die Antisense-Oligonukleotide eine komplementäre Sequenz von 20-30 Basen. Obwohl Oligonukleotide mit einer Antisensestruktur zu irgendeiner beliebigenRegion des Gens oder des mRNA-Transkripts ausgewählt werden können, entsprechen die Antisense-Oligonukleotide bei bevorzugten Ausführungsformen Stellen am N-Terminus oder 5' stromaufwärts, wie Translationsinitiationsstellen, Transkriptionsinitiationsstellen oder Promotorstellen. Daneben kann auch auf 3'-untranslatierte Regionen gezielt werden. Targeting von mRNA-Spleißstellen kamauf diesem Gebiet ebenfalls zur Anwendung, könnte aber bei alternativem mRNA-Spleißen weniger vorteihaft sein. Außerdem zielt das Antisense vorzugsweise auf Stellen, bei denen keine Sekundärstruktur der mRNA zu erwarten ist (siehe z. B. Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994) und an denen man keine Proteinbindung erwartet. Obwohl 9 eine cDNA-Sequenz offenbart, kann ein Fachmann schließlich leicht die der cDNA von 9 entsprechende genomische DNA ableiten. Die vorliegende Erfindung stellt daher auch Antisense-Oligonukleotide bereit, die zu der 9 entsprechenden genomischen DNA komplementär sind. Ähnlich lassen sich ohne unzumutbare Versuche Antisense-Oligonukleotide für allelische oder homologe DNAsund genomische DNAs konstruieren.
Bei einer Gruppe von Ausführungsformen können die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung aus "natürlichen" Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder irgendeiner Kombination davonbestehen. Das heißt, das 5'-Ende eines nativen Nukleotids und das 3'-Ende eines anderen nativen Nukleotids können wie in natürlichen Systemen über eine internukleosidische Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft sein. Diese Oligonukleotide können nach fachmännisch bekannten Verfahren, die manuell oder mit einem automatischen Synthesegerät durchgeführt werden können, hergestellt werden. Sie können auch rekombinant mit Vektoren produziert werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen können die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung aber auch "modifizierte" Oligonukleotide enthalten. Das heißt, die Oligonukleotide können auf verschiedene Weise modifiziert werden, durch die ihre Hybridisierung an das Target nicht verhindert wird, durch die aber ihre Stabilität oder das Targeting verbessert oder die therapeutische Wirksamkeit in anderer Weise verstärkt wird.
Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid", wie er hier verwendet wird, beschreibt einOligonukleotid, bei dem (1) wenigstens zwei seiner Nukleotide über eine synthetische Internukleosidbindung kovalent miteinander verknüpft sind (d.h. über eine andere Bindung als eine Phosphpdiesterbindung zwischen dem 5'-Ende eines Nukleotids und dem 3'-Ende eines anderen Nukleotids) und/oder (2) eine chemische Gruppe, die normalerweise nicht mit Nukleinsäuren assoziiert ist, kovalent an das Oligonukleotid gebunden wurde. Bevorzugte synthetische Internukleosidbindungen sind Phosphorothioate, Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Phosphatester, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Phosphattriester, Acetamidate, Peptide und Carboxymethylester.
Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" umfasst auch Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder einem kovalent modifzierten Zucker. Beispielsweise umfassen modifizierte Oligonukleotide Oligonukleotide mit Gerüstzuckern, die kovalent an andere niedermolekulare organische Gruppen als an eine Hydroxygruppe in 3'-Position und eine Phosphatgruppe in 5'-Position gebunden sind. Modifizierte Oligonukleotide können also eine 2'-O-alkylierte Ribosegruppe enthalten. Ferner können modifizierte Oligonukleotide Zucker wie Arabinose anstelle von Ribose enthalten. Modifizierte Oligonukleotide können ferner Basenanaloga wie C-5-propinmodifizierte Basen enthalten (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Die vorliegende Erfindung zieht daher pharmazeutische Formulierungen in Betracht, die, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, modifizierte Antisensemoleküle enthalten, die zu Nukleinsäuren komplementär sind, die für PI3Kδ-Proteine codieren, und mit diesen hybridisieren.
Antisense-Oligonukleotide können als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann die Antisense-Oligonukleotide in Kombination mit irgendwelchen üblichen physiologisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Trägern enthalten, wie sie auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Zusammensetzungen sollten steril sein und eine therapeutisch wirksame Menge der Antisense-Oligonukleotide in einer Gewichts- oder Volumeneinheit enthalten, die sich zur Verabreichung an einen Patienten eignet. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein nichttoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs nicht beeinträchtigt. Der Begriff "physiologisch verträglich" bezeichnet ein nichttoxisches Material, das mit einem biologischen System wie einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe oder einem Organismus kompatibel ist. Die Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Träger beinhalten Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel und andere Substanzen, wie sie dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine neue PI3-Kinase zu identifizieren und so Mittel zum Vorhersagen der wahrscheinlichen Motilität oder Invasivität von Zellen bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mittel bereitzustellen, die die Expression von p110δ verstärken oder verringern oder verhindern, und/oder Mittel, die die Funktion von p110δ stören, um die Motilität oder Invasivität von Zellen zu verbessern oder zu hemmen bzw. zu verhindern.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird daher ein isoliertes autophosphorylierendes Polypeptid bereitgestellt, das PI3-Kinaseaktivität besitzt, dargestellt durch die in 1A gezeigte Aminosäuresequenz.
Idealerweise stammt das Polypeptid aus weißen Blutzellen und wird typischerweise in Melanomen exprimiert, noch vorteilhafter ist das Polypeptid humanen Ursprungs.
Außerdem ist das Polypeptid fähig, mit p85-Untereinheiten von Säuger-PI3-Kinasen zu assoziieren und idealerweise aktive Komplexe zu bilden.
Besonders bevorzugt hat das Polypeptid die in 1A gezeigte Aminosäuresequenz, die insbesondere durch eine prolinreiche Domäne gekennzeichnet ist.
Bezugnahme auf den Begriff "homolog" soll hier Material ähnlicher Art oder gemeinsamer Herkunft oder mit solchen Merkmalen umfassen, wie sie hier beschrieben sind und die das Protein kennzeichnen, oder Material, dessen entsprechendes Nukleinsäuremolekül, beispielsweise unter stringenten Bedingungen, an das in 9 gezeigte Nukleinsäuremolekül hybridisiert. Übliche Hybridisierungsbedingungen sollten 50 % Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,2 % SDS, 200 μg/ml denaturierte, ultraschallbehandelte Heringssperma-DNA und 200 μg/ml Hefe-RNA bei einer Temperatur von 60 °C beinhalten (Bedingungen beschrieben in der Offenlegungsschrift WO 93/21328).
Idealerweise wird das Polypeptid mit rekombinanter Technologie produziert und ist üblicherweise humanen Ursprungs.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Antikörper gegen wenigstens einen Teil des erfindungsgemäßen Polypeptids bereitgestellt, wobei der Antikörper polyklonal oder monoklonal sein kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das ganze in 9 gezeigte Nukleinsäuremolekül oder ein Teil davon bereitgestellt, wobei das Molekül für ein autophosphorylierendes Polypeptid mit PI3-Kinaseaktivität codiert.
In Falle, dass ein Teil des Moleküls bereitgestellt wird, wird der Teil entsprechend seinem Zweck ausgewählt; beispielsweise kann es wünschenswert sein, einen Teil mit Kinaseaktivität zur anschließenden Verwendung anzuwählen oder einen anderen Teil, der am besten zur Antikörperproduktion geeignet ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekülkonstrukt bereitgestellt, das ein ganzes Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder einen Teil davon umfasst, wobei sich letzteres Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle einer Kontrollsequenz und im passenden Leserahmen befindet, so dass eine Expression des entsprechenden Proteins gewährleistet ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Wirtszellen bereitgestellt, die, idealerweise mit dem Konstrukt der Erfindung, transformiert wurden, so dass sie ein ganzes in 9 gezeigtes Nukleinsäuremolekül oder einen Teil davon enthalten und so die Expression eines ganzen entsprechenden Polypeptids oder eines signifikanten Teils davon ermöglichen.
Idealerweise sind diese Wirtszellen eukaryontische Zellen, beispielsweise Insektenzellen wie Zellen der Spezies Spodoptera frugiperda, wobei das Baculovirus-Expressionssystem verwendet wird. Dieses Expressionssystem wird in den Fällen bevorzugt, in denen eine posttranslationale Modifikation erforderlich ist. Wenn keine solche Modifikation erforderlich ist, kann auch ein prokaryontisches System verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Diagnostizieren der Motilität von Zellen bereitgestellt, das das Prüfen einer Probe der Zellen auf Expression des Polypeptids der Erfindung umfasst.
Idealerweise werden Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob in diesen Zellen mRNA, die dem Polypeptid der Erfindung entspricht, exprimiert wird, beispielsweise mit PCR-Methoden oder durch Northern Blot-Analyse. Alternativ kann jede andere übliche Methode durchgeführt werden, um eine Expression nachzuweisen.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Antagonisten bereitgestellt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wirksam hemmen, welches ein Screening von Kandidatenmolekülen auf solche Aktivität mit dem Polypeptid der Erfindung oder Fragmenten davon umfasst.
Vorteilhaft kann das Screening künstliche Methoden wie computergestützte Methoden oder übliche Labormethoden beinhalten.
Idealerweise wird das obige Verfahren durchgeführt, indem Zellen, von denen bekannt ist, dass sie das erfindungsgemäße Polypeptid entweder natürlich oder auf Grund von Transfektion exprimieren, dem entsprechenden Antagonisten ausgesetzt werden und dann deren Motilität verfolgt wird.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren kompetitive Bindungsassays beinhalten, um Mittel zu identifizieren, die selektiv und im Idealfall irreversibel an das erfindungsgemäße Polypeptid binden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Mittel umfasst, das die Aktivität oder Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids wirksam verstärkt oder hemmt, die für eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Verwendung formuliert wurde und die gegebenenfalls auch ein Verdünnungsmittel, einen Träger oder einen Hilfsstoff beinhaltet und/oder in Form einer Dosierungseinheit vorliegt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Regulieren der Motilität von Zellen bereitgestellt, welches umfasst, dass eine Population der Zellen entweder einem Antikörper oder dem Polypeptid der Erfindung oder Antisensematerial, wie hier beschrieben, ausgesetzt wird.
Alternativ können die Zellen in dem oben genannten Verfahren alternativ oder zusätzlich dem Polypeptid der Erfindung ausgesetzt werden, um die effektiven Mengen des Polypeptids zu erhöhen und so die Zellmotilität zu verstärken.
Das oben genannte Verfahren kann in vitro durchgeführt werden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Mittels zur Regulierung der Zellmotilität bereitgestellt, das die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wirksam hemmt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids zum Verstärken der Zellmotilität bereitgestellt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Antisense-Oligonukleotiden, die idealerweise wie hier beschrieben modifiziert sind, zur Hybridisierung an die erfindungsgemäße Nukleinsäure bereitgestellt.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun unter Bezug auf die folgenden Figuren, Materialien und Methoden lediglich beispielhaft beschrieben, wobei:
1(A) zeigt translatierte Aminosäuresequenz von humaner p110δ-cDNA. Die prolinreiche Region und die bZIP-ähnliche Domäne sind durch leere bzw. schraffierte Boxen angezeigt. (B) Dotplot-Vergleich der vollständigen Aminosäuresequenz von p110δ mit der von p110α und p110β. Nichtkonservierte Sequenzmotive sind unterstrichen. Dotplot-Vergleiche erfolgten mit dem Programm COMPARE (UWGCG-Paket: Devereux et al., 1984). (C) Vergleich der HR3-flankierenden p110δ-Aminosäuresequenzmit den entsprechenden homologen Regionen von p110α und p110β. Die Aminosäurenummerierung ist die von p110δ. Prolinreiche Region: kritische Proline, die die Bildung einer linksgängigen Typ II-Polyprolinhelix in p110δ ermöglichen, sind mit einem Stern gekennzeichnet. bZIP-Region: konservierte L/V/I-Reste der Leucinzipper-Region sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.
2. Interaktion von p110δ mit p85 und Ras. (A) Insektenzellen wurden mit rekombinantem Baculovirus, das für GST-p110δ codiert, allein oder in Kombination mit Viren infiziert, die entweder für p85α, β oder γ codierten. Nach zwei Tagen wurde GST-p110δ aus den Zelllysaten mit Glutathion-Sepharose affinitätsgereinigt, gewaschen und durch SDS-PAGE und Coomassiefärbung analysiert. (B) P110δ wurde aus 500 μg humanem Neutrophilenzytosol immunpräzipitiert und mittels Western Blotting auf Anwesenheit verschiedener p85-Isoformen untersucht. rec = rekombinantes, aus Sf9-Zellen gereinigtes p85. (C) GST-p110α/85α und GST-p110δ/85α (0,25 μg) wurden mit der angegebenen Menge (in μg) an GTP- oder GDP-beladenem V12-Ras inkubiert, gewaschen und wie beschrieben durch Western Blotting auf die Anwesenheit von Ras untersucht (Rodriguez-Viciana et al., 1994, 1996).
3. (A) In vitro-Lipidsubstratspezifität von p110δ. GST-p110δ/p85α wurde in einem Lipidkinaseassay verwendet, wobei die angegebenen Substrate in Gegenwart von Mg²⁺ verwendet wurden. Am Origin wurden gleiche cpm gefunden. (B) HPLC-Analyse des von GST-p110δ/p85α gebildeten PtdIns-Phosphorylierungsprodukts. Gezeigt sind die Elutionszeiten des deacylierten Produkts von p110δ (durchgezogene Linie) und der Glycerophosphoinositol-3P- und Glycerophosphoinositol-4P-Standards (gepunktete Linie). Die Positionen der AMP- und ADP-Kontrollen sind durch Pfeile gezeigt.
4. Proteinkinaseaktivität von p110δ. (A) GST-p110α oder GST-p110δ, im Komplex mit den angegebenen p85-Untereinheiten, wurden einer in vitro-Proteinkinasereaktion in Gegenwart von Mn²⁺ unterworfen und durch SDS-PAGE, Coomassiefärbungund Autoradiographie weiteranalysiert. (B, C) p110α und p110δ ohne Tag [Wildtyp (WT) oder kinasedefiziente Mutanten (p110δ-R916P und p110δ-R894P)], im Komplex mit p85α oder β an PDGF-Rezeptor-Phosphopeptidkügelchen, wurden einer in vitro-Kinasereaktion unterworfen und wie unter (A) beschrieben weiteranalysiert. Offene und geschlossene Pfeilspitzen deuten auf p110- bzw. p85-Proteine. Rechte Tafel in (B): Phosphoaminosäureanalyse von p85α und p110δ.
5. Empfindlichkeit von p110δ-Lipidkinaseaktivität gegenüber Wirkstoffen. Die Hemmung von p110δ/p85α (volle Kreise) und p110α/p85α (ungefüllte Kreise) ist auf die Aktivität in Abwesenheit des Wirkstoffs Wortmannin normiert. Diese Wertepunkte sind die Mittelwerte (ASE) von drei Versuchen.
6. Northern Blot-Analyse der Expression von p110α, p110β und p110δ.
7. Analyse der Proteinexpression von p110α und p110δ. Es wurden 100 μg Gesamtzelllysat pro Spur aufgetragen. Blutplättchen wurden entweder in Lysispuffer wie unter Material und Methoden beschrieben oder in Laemmli-Gelauftragspuffer, der 2-Mercaptoethanol enthielt, lysiert. PMBC, periphere mononukleäre Blutzellen; PBL, periphere Blutlymphozyten.
8. Beteiligung von p110α und p110δ am Zytokin-Signalweg. Zelllinien Ba/F3 (A) und MC/9 (B) wurden mit den angebenen Zytokinen stimuliert. Proben von unbehandelten Kontrollzellen sind mit Con bezeichnet. Gesamtzelllysate und p110α- und p110δ-IPs wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und es wurden zweifache Blots präpariert, die mit p110δ/85α (Tafeln a, b und d) oder p110α/85α (Tafeln c und e) bezeichnet wurden. Immunoblotting nativer Blots erfolgte mit 4G10 (Anti-PTyr, Tafeln a) und Anti-p110α (Tafeln c). Die Blots wurden anschließend "Stripping und Reprobing" mit Anti-SHP2 unterzogen. (A, Tafel b), Anti-Kit-(B, Tafel b), Anti-p110δ-(Tafeln d) und Anti-p85-Antikörper (Tafeln e). Die Pfeilspitzen geben die Positionen von p170 (IRS-2), p100 und p70 (SHP2) (A, Tafel a) und von p150 (c-Kit) und p100 (B, Tafel b) an.
9. Vollständige humane cDNA-Sequenz von p110δ.
10 zeigt Immunfluoreszenzbilder von murinen Makrophagen, denen affinitätsgereinigte Antikörpern gegen p110δ mikroinjiziert worden waren. Die Abbildung der Makrophagenzytoskelette erfolgte mit Phalloidinkonjugiertem Rhodamin.
MATERIAL UND METHODEN
Klonierung von p110δ
Einzelheiten der Isolierung von partiellen PI3-Kinase-cDNA-Klonen mittels RT-PCR auf Basis homologer Regionen zwischen bovinem p110α und S. cerevisiae-Vps34p wurden beschrieben (Volinia et al., 1995: McDougall et al., 1996). Dieser Ansatz lieferte ein partielles p110δ-cDNA-Fragment aus der T-Zelllinie MOLT4, das dann verwendet wurde, um eine mit Oligo(dT)-Primern versehene U937-cDNA-Genbank zu screenen (Volinia et al., 1995). Komplementäre DNA war in mit EcoRI-XhoI verdauten Lambda ZAPII-Vektor kloniertes EcoRI-XhoI (Stratagene). Unter vier Millionen gescreenten Klonen wurden sechs positive Primärplaques gefunden, von denen drei bei zwei weiteren Screeningrundenpositiv blieben. Die cDNA-Inserts in pBluescript wurden durch Ausschneiden in vivo nach den Angaben des Herstellers (Stratagene) präpariert. Drei repräsentative pBluescript-Klone (0_5.1, 0_9,1 und 0_11.1) wurden durch Restriktionskartierung und PCR charakterisiert, und es wurde gefunden, dass sie Inserts mit Größen zwischen 4,4 kb (0_11.1) und 5,0 kb (0_5.1, 0_9.1) enthielten. Klon 0_9.1 wurde für eine genaue Charakterisierung verwendet. Eine Restriktionskartierung seines Inserts ergab das Fehlen einer internen XhoI-Stelle und die Anwesenheit von zwei internen EcoRI-Stellen, die sich 223 bzw. 3862 Nukleotide 3' von der Insertionsstelle der EcoRI-cDNA befanden (Nukleotid 1 = unterstrichenes Nukleotid der 9). Folglich spaltete ein gemeinsamer Verdau mit EcoRI und XhoI das 0_9.1-Insert in drei Fragmente, die weiterhin als EcoRI-Fragment I (Nukleotid 1-222), EcoRI-Fragment II (Nukleotid 223-3861) und EcoRI-XhoI-Fragment III (Nukleotid 3862-5000) bezeichnet sind. Beide Stränge der Fragmente 1 und II wurden mit dem "Taq DyeDeoxy Terminator Cycle"-Sequenzierungssystem (ABI) sequenziert, und die vollständige cDNA-Sequenz ist in 9 gezeigt. Es wurde ein offener Leserahmen gefunden, der die Nukleotide 195-3330 des 0_9.1-Inserts umspannt. Ein im Leserahmen liegendes Stoppcodon geht dem potenziellen Startcodon voraus, das sich in einer günstigen Konstellation für eine Translationsinitiation befindet (Kozak, 1991). Dies fuhrt zu 196 Nukleotiden untranslatierter 5'-Region (UT) und etwa 2,2 kb 3'-UT. In den sequenzierten 5'-Enden der 0_5.1-, 0_9.1- und 0_11.1-Klone wurden zwei unterschiedliche, aber verwandte untranslatierte 5'-Regionen gefunden, die die Existenz von wenigstens zwei leicht unterschiedlichen Messenger-RNAs anzeigen.
Konstruktion von Expressionsvektoren für p110δ
Die verwendeten Insektenzellen-Transfervektoren waren pVL1393 (für p110δ ohne Tag; InVitrogen) und pAcG3X (für GST-p110δ; Davies et al., 1993). Die für p110δ codierende Region wurde in zwei Schritten in diese Vektoren subkloniert. Zuerst wurden die Expressionsvektoren durch Linkerinsertion an der Mehrfachklonierungsstelle so manipuliert, dass sie einen Teil der Sequenz des EcoRI-Fragments I von p110δ enthielten, der das Startcodon (an Nukleotid 197; siehe oben) bis zur zweiten EcoRI-Stelle (Nukleotid 223; siehe oben) umspannt. In letztere EcoRI-Stelle wurde das EcoRI-Fragment II von p110δ subkloniert, gefolgt von einer Selektion auf Klone mit Inserts in korrekter Orientierung. Der erste Schritt für die Insektenzellenvektoren war Spaltung mit BamHI-EcoRI, gefolgt von Insertion des folgenden Linkers (Linker I):
GATCCCCACCATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCATGG (Sense.: 5'-3')
(Antisense: 5'-3')AATTCCATGGGGCAGTCCACCCCAGGGGGCATGGTGGG
Dieser Linker enthält das ATG mit einer optimalen Kozak-Konsensussequenz (Kozak, 1991). Weitere p110δ-Derivate wurden mittels PCR unter Verwendung von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) hergestellt. Hierbei wurde p110δ-EcoRI-Fragment II, subkloniert in pBluescript-SK (auch als pBluescript-p110δ-EcoII bezeichnet), als eine Matrize verwendet. Bei diesen PCR-Reaktionen wurde die untranslatierte 3'-Region des EcoRI-Fragment II-Inserts entfernt. Die zur Erzeugung der Mutation R894P verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt: mutagenes Sense-Oligonukleotid = PRIMER 1 (mutagene Reste unterstrichen) =
5'-GTGTGGCCACATATGTGCTGGGCATTGGCGATCCGCACAGCGACA ACATCATGATCCG,
Antisense = PRIMER 2 =
5'-GGCCCGGTGCTCGAGAATTCTACTGCCTGTTGTCTTTGGACACGT
Eine parallele PCR wurde mit Primer 2 und einem Sense-Primer (PRIMER 3 = 5'-GTGTGGCCACATATGTGCTGGGCATTGGCG) durchgeführt, der die Wildtyp-p110δ-Sequenz intakt ließ. Alle PCR-Produkte wurden mit NdeI und XhoI gespalten, in mit NdeI-XhoI geöffneten pBluescript-p110δ-EcoII subkloniert und sequenziert. Korrekte Klone wurden dann als EcoRI-Kassette in mit EcoRI geöffneten pVL1393, der Linker I enthielt, transferiert, gefolgt von Selektion auf Klone mit Insert in korrekter Orientierung.
Expression von p110δ in Insektenzellen
Plasmid-DNA wurde mit BaculoGold-DNA (Pharmingen, San Diego, CA) unter Verwendung von Lipofectin-Reagens (Gibco) cotransfiziert. Rekombinante Plaques wurden isoliert und mit etablierten Verfahren charakterisiert (Summers und Smith, 1987).
Zellkultur
Zellen wurden in einem humidifizierten Inkubator mit 5 %iger CO₂-Atmosphäre in RPMI 1640-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 20 μM 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin und 2 mM Glutamin supplementiert war. Ba/F3 ist eine IL3-abhängige murine Prä-B-Zelllinie (Palacios und Steinmetz, 1985) und MC/9 ist eine IL3-abhängige murine Mastzelllinie (Nabel et al., 1981). Sowohl Ba/F3 als auch MC/9 wurden als Quelle für murines IL3 in 10 % (v/v) konditioniertem Medium gehalten, das von WEHI3B stammte. Myeloide FDMAC11/4.6 (FD-6)-Progenitorzellen sind eine eigene Variante von FDMAC11, die in Reaktion auf IL4 sowie IL3, GM-CSF und CSF-1 wächst (Welham et al., 1994a). Diese Zellen wurden in 3 % (v/v) IL4-konditionierem Medium gehalten, das von AgX63/OMIL4-Zellen stammte (Karasuyama und Melchers, 1988).
Lipidkinaseassay
Der Test auf Lipidkinaseaktivität erfolgte im Wesentlichen wie bei Whitman et al. (1985) beschrieben. Der Lipidkinaseassay-Puffer war 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl und 0,5 mM EGTA. Lipide wurden von Sigma bezogen. Die Endkonzentration an ATP und Mg²⁺ bei dem Assay war standardmäßig 0,5 bzw. 3,5 mM, wobei Lipide in Konzentrationen von 0,2-0,4 mM eingesetzt wurden. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Kinasereaktion 10 min bei 37 °C. Das Lösungsmittel für die DC-Auftrennung der Reaktionsprodukte war Propan-1-ol/2 M Essigsäure/5 M H₃PO₄ (65:35:1). Tests von Wirkstoffeffekten auf die Kinase erfolgten 10 min bei 25 °C mit PtdIns als Substrat in Gegenwart von 40 μM ATP (Endkonzentration); alle Teströhrchen enthielten 1 % DMSO. Die Aktivität wurde durch Phosphorimager-Analyse (Molecular Dynamics) von mittels DC aufgetrennten Lipidprodukten quantifiziert.
HPLC-Analyse
[³²P]-PtdIns3P, hergestellt durch Phosphorylierung von PtdIns mit rekombinantem p110α, und [³²P]-PtdIns4P, gebildet durch Umwandlung von PtdIns mit A431-Membranen in Gegenwart von 0,5 % NP-40, wurden als Standards verwendet. Glycerophosphoinositole, die durch Deacylierung von Lipiden mit Methylamin gebildet worden waren (Clarke und Dawson, 1981), wurden durch Anionenaustausch-HPLC an einer PartisphereSAX-Säule (Whatman International) mit einem linearen Gradienten von 1 M (NH₄)₂HPO₄ gegen Wasser (0-25 % B; 60 min) bei 1 ml/min aufgetrennt. Radioaktive Peaks wurden mit einem angeschlossenen Detektor (Reeve Analytical, Glasgow) nachgewiesen. ADP- und ATP-Nukleotidstandards, die als interne Kontrollen zugegeben worden waren, um Übereinstimmung zwischen den Läufen zu gewährleisten, wurden durch Extinktion bei 254 nm nachgewiesen.
In vitro-Proteinphosphorylierungsassay und Wirkung auf Lipidkinaseaktivität
Präzipitierte Proteine wurden 30 min bei 37 °C in Proteinkinaseassaypuffer (20 mM Tris·HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 50 μM ATP und 1 mM MnCl₂·4H₂O, 5-10 μCi[γ-³²P]ATP/ml) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer gestoppt und die Reaktionsprodukte durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Phosphoaminosäureanalyse erfolgte auf einem Hunter-Dünnschichtelektrophoresesystem (CBS Scientific Co., Del Mar, CA) wie beschrieben (Jelinek und Weber, 1993).
Interaktion von kleinen GTP-bindenden Proteinen mit PI-3K in vitro
Bindung von ras, rac und rho an GST-PI3K erfolgte wie beschrieben (Rodriguez-Viciana et al., 1995, 1996).
Antikörper, Immunpräzipitationen und Immunoblotting
Monoklonale Antikörper gegen bovines p85α (U1, U13) und p85β(T15) wurden beschrieben (End et al., Reif et al., 1993): Ein monoklonaler Antikörper (I2) gegen bovines p85γ wurde in unserem Labor entwickelt. Polyklonales Kaninchenantiserum gegen GST-humanes p85α (AA 5-321) wurde freundlicherweise von Dr. P. Shephard, University College London, zur Verfügung gestellt. Polyklonale Kaninchenantiseren wurden gegen ein C-terminales Peptid von p110δ (C)KVNWLAHNVSKDNRQ₁₀₄₄ und gegen ein N-terminales Peptid von humanem p110α (CGG)SVTQEAEEREEFFDETRR₈₈ gebildet. Um Antikörper zu erzeugen, die gegen die phosphorylierte Form von p110δ gerichtet sind, wurde die Peptidsequenz 1044 bei der Peptidsynthese am Serinrest phosphoryliert. Ein Antiserum gegen den C-Terminus von humanem p110α (KMDWIFHTIKQHALN) wurde feundlicherweise von Dr. Roya Hooshmand-Rad (Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Schweden) zur Verfügung gestellt. Antikörper wurden mit an Actigel (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) oder an AF-Amino ToyoPearl TSK-Gel (Tosho Co., Japan) gekoppelten Peptiden affinitätsgereinigt. Es wurde gefunden, dass die Antikörper für die PI3K spezifisch waren, gegen die sie gerichtet waren (getestet gegen die folgende, in Sf9-Zellen exprimierte Gruppe von PI-3Ks: bovines p110α, humanes p110β (C. Panaretou und R.S.; unveröffentlichte Ergebnisse), humanes p110γ (Stoyanov et al., 1995), p110δ, PI-spezifische 3-Kinase (Volinia et al., 1995). Periphere Blutzellen wurden über einen Ficollgradienten gereinigt (Lymphoprep; Nycomed, Oslo, Norwegen). Neutrophilenzytosol wurde wie beschrieben durch Ultraschallbehandlung präpariert (Wientjes et al., 1993). Der Lysispuffer war 1 % Triton-X100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM NaVO₃, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,27 TIU/ml Aprotinin und 10 μM Leupeptin. Bei einigen Versuchen wurden 1 mM Diisopropylfluorophosphat und 27 mM Na-p-tosyl-L-lysin-chlormethylketon(Hydrochlorid) zugegeben. Der für die Zytokinexperimente verwendete Lysispuffer war 50 mM Tris·HCl, pH 7,5, 10 % (v/v) Glycerin, 1 % (v/v) NP-40, 150 mM NaCl, 100 μM Natriummolybdat, 500 μM Natriumfluorid,100 μM Natriumorthovanadat, 1 mM EDTA, 40 μg/ml PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin, 0,7 μg/ml Pepstatin, 1 mM DIFP, 1 mM TLCK. Zytokinstimulierte Zellen wurden pelletiert und bei 2 × 10⁷ Zellen/ml wie beschrieben lysiert (Welham und Schrader, 1992), außer dass die Lysate vor den weiteren Analysen 5 min in einer Mikrofuge bei 4 °C geklärt wurden. Immunpräzipitationen wurden wie beschrieben durchgeführt (Welham et al., 1994a). PDGF- Rezeptorpeptid (YpVPMLG) wurde entsprechend den Angaben des Herstellers an Actigel gekoppelt. C-terminales Antiserum gegen p110δ wurde sowohl für Immunpräzipitationen als auch zum Immunoblotting verwendet. Bei p110α wurden die C- und N-terminalen Antiseren für Immunpräzipitationen bzw. Western Blot-Analyse verwendet.
SDS-PAGE und Immunoblotting erfolgten wie beschrieben (Laemmli, 1970; Welham und Schrader, 1992; Welham et al., 1994a). Zum Immunoblotting wurden die Antikörper in den folgenden Konzentrationen verwendet: 4G10, monoklonaler Antiphosphotyrosinantikörper 0,1 μg/ml; Anti-p110α und -p110δ 0,25 μg/ml; Anti-p85 1:4000; Anti-c-Kit (Santa Cruz Biotechnology, sc-168) 0,4 μg/ml, Anti-SHP (Santa Cruz Biotechnology, sc-280) 0,1 μg/ml und Anti-IRS-2 (Gabe von Dr.M. White, Joslin Diabetes Center, Boston, MA) 1:1000.
Sowohl Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziege-Anti-Maus- und Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper (Dako, Dänemark) wurden in einer Konzentration von 0,25 μg/ml verwendet. Immunoblots wurden mit dem ECL-System (Amersham) entwickelt. Blots wurden wie bereits beschrieben einem "Stripping und Reprobing" unterzogen (Welham et al., 1994a).
Injektion von Antikörpern gegen p110δ und p110α in CSF-1-stimulierte Mausmakrophagen
Die murine Makrophagenzelllinie BAC1 wurde bei Mikroinjektionsexperimenten mit Antikörpern verwendet. Die polyklonalen Peptidantikörper gegen p110δ waren entweder gegen das C-terminale Peptid 1044 (beschrieben auf S. 12, Material und Methoden) oder die Peptidsequenz (C)R222KKATVFRQPLVEQED₂₃₈ gerichtet. Polyklonale Seren wurden vor der Mikroinjektion affinitätsgereinigt und wurden in einer Konzentration von 0,5-5 mg/ml eingesetzt. Ein polyklonales Kontrollpeptidantiserum gegen humanes p110α ist wie auf S. 12 von Material und Methoden beschrieben. Vor der Mikroinjektion wurden die Bac1-Zellen 24 Stunden für Colony Stimulating Factor 1 (CSF1) gehungert. Dann wurden Antikörper in die CSF1-gehungerten Zellen injiziert und 10-15 Minuten CSF1 exponiert, bevor das Zytoskelett mikroinjizierter Bac1-Zellen mit Phalloidin-konjugiertem Rhodamin sichtbar gemacht wurde (Präparation und Sichtbarmachung von Zellen erfolgt wie bei Allen et al., 1997 beschrieben).
Zellstimulationen
Stimulation von Zellen mit verschiedenen Wachstumsfaktoren erfolgte wie beschrieben (Welham und Schrader, 1992), außer dass die Zellen vor der Stimulation mit 2 × 10⁷/ml in serumfreiem RPMI resuspendiert wurden. Chemisch synthetisiertes murines IL3 und IL4 wurde freundlicherweise von Dr. [an Clark-Lewis (University of British Columbia, Vancouver) zur Verfügung gestellt. Rekombinantes murines SCF wurde von R&D Systems Europe (Abingdon, Oxon) bezogen. Die Konzentration der Wachstumsfaktoren und die Stimulationsdauer (2 Minuten für SCF; 10 Minuten für IL3 und IL4) waren zuvor optimiert worden, um maximale Tyrosinphosphorylierung von Rezeptoren und zellulärenSubstraten zu erhalten. Diese waren wie folgt, IL3 10 μg/ml (Welham und Schrader, 1992), IL4 10 μg/ml (Welham et al., 1994a) und SCF 50 ng/ml (M.J.W., unveröffentlichte Beobachtungen).
Northern Blot-Analyse
Northern Blots von humaner PolyA⁺-RNA (Clontech) wurden mit "Random Prime"-markiertem EcoRI-Fragment II von pBluescript-Klon 0_9.1 hybridisiert. Dann erfolgte ein "Stripping und Reprobing" mit nachfolgenden Sonden: internes 2,1 kb-EcoRI-XhoI-Fragment von humanem p110α (Volinia et al., 1994) und 5 kb-EcoRI-XhoI-cDNA von humanem p110β (C. Panaretou; unveröffentlichte Ergebnisse).
Mit den oben beschriebenen Materialien und Methoden waren wir in der Lage, Daten zu erklären, die die neue Lipidkinase und insbesondere eine PI3-Kinase beschreiben, die wir p110δ genannt haben. Daten, die diese Kinase betreffen, werden nun zum Vergleich von p110δ mit anderen Mitgliedern der PI3-Kinasegruppe beschrieben, um so deren jeweilige Eigenschaften zu vergleichen und gegenüberzustellen.
ERGEBNISSE
Klonierung von p110δ
Für die RT-PCR-Reaktionen mit mRNA aus der humanen T-Zell-Leukämiezelllinie MOLT4 wurden degenerierte Primer auf Basis konservierter Aminosäuresequenzen (GDDLRQD und FHI/ADFG) in der Kinasedomäne von bovinem p110α und von S. cerevisiae-Vps34p verwendet. Es wurde eine partielle cDNA erhalten, die zu anderen bekannten humanen P13Ks homolog, aber von diesen verschieden war. Dieses PCR-Fragment wurde als Sonde verwendet, um eine U937-Monozytengenbank zu screenen und den entsprechenden vollständigen Klon zu isolieren (für Einzelheiten, siehe Materialien und Methoden und 9). Eine Sequenzanalyse ergab einen potenziellen offenen Leserahmen, vor dem sich ein Stoppcondon im Raster befand. Das potenzielle Startcodon fand sich ebenfalls in einer günstigen Konstellation zur Translationsinitiation (Kozak, 1991). Dieser offene Leserahmen von 3135 Nukleotiden sagt ein Protein mit 1044 Aminosäuren mit einer berechneten Molekülmasse von 119.417 Dalton voraus (1A). Ein Vergleich der Aminosäuresequenz mit anderen PI3Ks zeigte, dass dieses Protein am engsten mit humanem p110β (58 % Gesamtidentität; Hu et al., 1993) und entfernter mit humanem p110α (41 % Identität; Volinia et al., 1994), G-Protein-reguliertem humanem p110γ (35 % Identität; Stoyanov et al., 1995) und dem humanen vps34p-Analogen (28 % Identität; Volinia et al., 1995) verwandt ist. Die hier beschriebene neue PI3K wird im Folgenden als p110δ bezeichnet.
Ein Dotplot-Vergleich bei hoher Stringenz (1B) zeigt, dass p110α, β und δ in der p85-bindenden Region (AS 20-140 von p110α; Dhand et al., 1994) sowie in der C-terminalen PI-Kinase-Domäne (PIK-Domäne) (HR2) und dem katalytischen Zentrum (AS 529 bis Ende von p110α, Zvelebil et al., 1996) stark homolog sind. Eine weitere Region mit höher Sequenzhomologie, die die AS 370-470 von p110δ umspannt, wurde zwischen der p85-Bindungsstelle und HR2 gefunden. Diese Region enthält die sogenannte HR3-Signatur (WxxxLxxxIxIxDLPR/KxAxL), die bei allen p85-bindenen PI3Ks und bei p110γ konserviert ist. Der dem N-Terminus am nächsten gelegene Bereich mit Sequenzunterschieden zwischen p110α und p110β/δ überlappt mit der in p110α als zur Ras-Bindung ausreichend definierten Region (AS 133-314 in p110α; Rodriguez-Viciana et al., 1996). In p110δ wurden zwei weitere strukturelle Motive identifiziert. Das Erste ist eine prolinreiche Region (1B, C), für die ein Molecular Modelling anzeigt, dass sie eine linksgängige Typ II-Polyprolinhelix bilden kann, die das Potenzial besitzt, mit SH3-Domänen zu interagieren (Daten nicht gezeigt). p110α und p110β fehlen in der entsprechenden Region entscheidenden Proline für eine ähnliche Faltung. Das zweite Motiv ist eine Region, die einer basischen Leucin-Zipper-Domäne (bZIP-Domäne) ähnelt und sich unmittelbar C-terminal von HR3 befindet (1B, C). Eine bZIP-Region befindet sich sowohl in p110δ als auch in p110β (und auch im Drosophila-p110 (Leevers et al., 1997)), während die basische Komponente dieser Domäne in p110α weniger hervortritt (1C). Ein Modelling der p110δ-ZIP-Region zeigt, dass die Anordnung ihrer L/V/I-Reste leicht die Bildung einer Helixstruktur zulässt, die einen dimeren Coiled-Coil-Protein-Zipper-Komplex bilden kann (Daten nicht gezeigt).
p110δ bindet die p85-Adapter- und Ras-Proteine
Um die Vorhersage aus dem Aminosäuresequenzvergleich zu beweisen, dass p110δ p85-Untereinheiten binden könnte, wurde p110δ zusammen mit rekombinanten Baculoviren, die für p85α, p85β oder p85γ (Letzteres ist eine bovine 55 kDa-p85-Isoform, die zu p55^PIK, p55α und p85/AS53 homolog ist (Pons et al., 1995); Inukai et al., 1996; Antonetti et al., 1996)) codieren, in Insektenzellen als ein Glutathion-S-transferase (GST)-Fusionsprotein exprimiert. Wie sich aus 2A ergibt, wurden alle p85-Adaptorsubtypen effizient zusammen mit GST-p110δ aus coinfizierten Zellen aufgereinigt.
Die Frage, ob katalytische Untereinheiten von verschiedener Klasse I-p110 in vivo Bindungspräferenzen für unterschiedliche p85-Adapterproteine zeigen, wurde bislang nicht angesprochen. Mit Antiserum, das für p110δ spezifisch war, fanden wir, dass sowohl p85α als auch p85β in p110δ-Immunpräzipitaten von verschiedenen weißen Blutzellen vorhanden waren (2B zeigt die Daten für humane Neutrophile; es ist zu beachten, dass p85γ in Leukozyten nicht exprimiert wird). Ähnliche Ergebnisse wurden für p110α erhalten (Daten nicht gezeigt). In diesen Immunkomplexen wurde auch ein 45 kDa-Protein beobachtet, das mit p85α-Antikörpern reagiert (2B). Die Natur dieses Proteins ist bislang noch unklar, es könnte jedoch einem 45 kDa-Protein ähneln, dessen Anwesenheit bereits in p85- und p110-IPs aus verschiedenen Geweben beschrieben wurde (Pons et al., 1995).
Von p110α und p110β wurde gezeigt, dass sie mit Ras-GTP interagieren (Kodaki et al., 1995; Rodriguez-Viciana et al., 1994 und 1996). Die für diese Interaktion erforderliche Region liegt zwischen den AS 133 und 314 dieser PI3Ks (Rodriguez-Viciana et al., 1996). Trotz der in dieser Region im Vergleich mit p110α und p110β relativ geringen Sequenzkonservierung (1C) sind bestimmte, anscheinend kritische Aminosäuren konserviert, da p110δ in vitro GTP-abhängig mit Ras interagiert (2C).
p110δ bindet ras, aber nicht rac oder rho
Es wurde gefunden, dass Inkubation von GST-p110δ/p85α GTP-gebundenes Wildtyp-ras oder onkogenes V12-ras zurückhält (2C). Dies war mit GDP-beladenem ras oder mit A38-ras, einer funktionell toten ras-Mutante, nicht der Fall. Ähnlich wie für p110α konnte keine Bindung von rho und rac gezeigt werden (Daten nicht gezeigt).
Lipidkinaseaktivität von p110δ
Es wurde gefunden, dass p110δ, wenn es in Gegenwart von Mg²⁺ getestet wird, PtdIns, PtdIns4P und PtdIns(4, 5)P₂ phosphoryliert (3A). Eine HPLC-Analyse bestätigte, dass diese Lipide an der D3-Position phosphoryliert werden (3B). die in vitro-Substratpräferenz war PtdIns > PtdIns4P > PtdIns(4, 5)P₂ (Daten nicht gezeigt). Die Lipidkinaseaktivität war in Gegenwart von Mn²⁺ geringer als in Gegenwart von Mg²⁺ (getestet über den Konzentrationsbereich von 0,25 bis 16 mM; Daten nicht gezeigt). Die spezifische Aktivität von p110δ, isoliert aus SF9-Zellen, war um einen Faktor 2-5 geringer als die von p110α (Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass p110δ eine echte Klasse I-PI3K ist.
p110δ phosphoryliert p85 nicht, sondern autophosphoryliert
Es wurde gezeigt, dass die p85-Untereinheit ein Substrat für eine Mn²⁺-abhängige Phosphorylierung durch die katalytische Untereinheit von p110α ist (Carpenter et al., 1993; Dhand et al., 1994). Im Gegensatz dazu konnte GST-p110δ coexprimiertes p85α, p85β oder p85γ unter verschiedenen in vitro-Bedingungen nicht phosphorylieren (Teildaten gezeigt in 4A; Aktivität war weder in Gegenwart von Mg²⁺ noch von Mn²⁺ zu sehen). p85γ fehlt eine SH3-Domäne, und die fehlende Phosphorylierung dieses Moleküls durch p110δ spricht gegen die Möglichkeit, dass eine intermolekulare Interaktion der p85α/β-SH3-Domäne mit der prolinreichen Region von p110δ eine effiziente Phosphorylierung der p85-Moleküle durch p110δ verhindert. Um auszuschließen, dass p110δ p85 bereits während der in vivo-Coexpression in Insektenzellen vollständig phosphoryliert hatte, wurde exogenes gereinigtes p85α zu immobiliertem GST-p110δ gegeben. Nach Wegwaschen von überschüssigem p85 wurde gefunden, dass gebundenes p85 von p110α effizient phosphoryliert wird, aber erneut nicht von p110δ (Daten nicht gezeigt). Wenn p110δ ohne Tag im Komplex mit 85α oder p85β einem in vitro-Kinaseassay in Gegenwart von Mn²⁺ unterworfen wurde, autophosphorylierte p110δ ((4B; es ist zu beachten, dass diese Aktivität bei immobilisiertem GST-p110δ weitgehend fehlt (4B)). Eine solche Phosphorylierung war bei p110α/p85-Komplexen nicht zu sehen, bei denen wiederum gefunden wurde, dass p85 phosphoryliert ist (4B). Phosphoaminosäureanalyse zeigte, dass die Phosphorylierung an p110δ an Serin erfolgte (4B). Es wurde beobachtet, dass sowohl die Phosphorylierung von p85 durch p110α als auch die Autophosphorylierung von p110δ großenteils Mn²⁺-abhängig war, wobei in Gegenwart von Mg²⁺ nur sehr schwache Phosphorylierung erfolgte (Daten nicht gezeigt). Autophosphorylierung von p110δ führte zu einer geringeren Lipidkinaseaktivität.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die beobachtete Phosphorylierung von p110δ auf eine copräzipitierte Proteinkinase zurückzuführen ist, wurde eine kinasedefiziente p110δ-Mutante erzeugt. Dies erfolgte, indem Arginin 894 in p110δ in Prolin überführt wurde, was p110δ-R894P lieferte. Der mutierte Argininrest befindet sich in dem konservierten DRX₃NX_12-13DFG-Motiv der Kinasedomäne, das wahrscheinlich wie in Proteinkinasen Teil der katalytischen Schleife bildet (Taylor et al., 1992, Zvelebil et al., 1996). Von einer ähnlichen Mutation in bovinem p110α (R916P) wurde gefunden, dass sie die katalytische Aktivität vollständig ausschaltet (Dhand et al., 1994). Wie aus 4C eindeutig hervorgeht, war in Insektenzellen exprimiertes p110δ-R894P in p110δ-Präzipitaten nicht mehr phosphoryliert, was darauf hinweist, dass Letzteres tatsächlich eine Fähigkeit zur Autophosphorylierung besitzt. Ähnlich wurde gefunden, dass die Lipidkinaseaktivität bei p110δ-R894P verloren gegangen war (Daten nicht gezeigt).
Wir haben polyklonale Antiseren gegen die phosphorylierte Form von p110δ hergestellt. Die C-terminale Peptidsequenz 1044 war am Serinrest 1033 phosphoryliert und wurde verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Das gegen das phosphorylierte Peptid gerichtete Antiserumermöglichte es uns nachzuweisen, dass p110δ in vivo phosphoryliert wird und dass diese Phosphorylierung bei Zytokinstimulation verstärkt wird (Ergebnisse nicht gezeigt).
Wirkstoffempfindlichkeit der katalytischen Aktivität von p110δ
Es wurde gefunden, dass die Lipidkinaseaktivität von p110α und δ gegenüber einer Hemmung durch Wortmannin und LY294002 mit einem IC₅₀ von 5 nM (für Wortmannin) und 0,5 μM (für LY294002) ähnlich empfindlich ist (5). Ähnlich wurde die Autophosphorylierungsaktivität von p110δ ebenfalls durch Wortmannin im Nanomolbereich gehemmt (Daten nicht gezeigt).
Gewebeverteilung von p110δ
Das Expressionsmuster von p110δ wurde durch Northern Blot-Analyse von PolyA⁺-RNA aus Humangeweben untersucht und mit dem von p110α und p110β verglichen. Es wurde gefunden, dass eine einzelne Messenger-mRNA-Spezies von etwa 6 kb in Populationen weißer Blutzellen, d. h. Milz, Thymus und besonders Leukozyten von peripherem Blut (Letzteres enthält alle weißen Blutzellen, wobei nur der größte Teil der Erythrozyten entfernt ist) besonders stark exprimiert wird (6). In einigen Northern Blot-Experimenten wurde auch ein ~5 kb-Messenger für p110δ beobachtet (Daten nicht gezeigt). In den meisten anderen untersuchten Geweben wurde nur eine geringe Expression von p110δ-Messenger-RNA gefunden, wenngleich es schwierig ist, die Möglichkeit auszuschließen, dass eine Blutzellkontamination für dieses p110δ-mRNA-Signal verantwortlich ist. In den meisten untersuchten Geweben wurde auch eine Expression von p110α und p110β gefunden (6).
Für p110α und δ spezifische Antikörper wurden dann verwendet, um die Expression dieser PI3Ks auf Proteinebene zu testen. Beim Testen verschiedener Rattengewebe wurde in Milz und Thymus, aber in keinem der anderen getesteten Gewebe, ein 110 kDa-Protein gefunden, das mit p110δ-Antikörpern reagierte. (7). Dieses Muster bestätigt großenteils die Daten der oben beschriebenen Northern Blot-Analyse. P110δ fand sich auch in primären sowie in transformierten weißen Blutzellen, und zwar unabhängig von ihrem Differenzierungsstadium (7). Bei den primären Blutzellen waren sowohl die Lymphoid- als auch die Myeloidzellpopulationen für p110δ positiv, nicht jedoch Blutplättchen (7). Sowohl T-Zelllinien (z. B. Jurkat, HPB A11) als auch B-Zelllinien (z. B. Raji, HFB1) exprimierten p110δ (7). Das 110 kDa-p110δ wurde nicht in Rat-1-, NIH 3T3- und Swiss-3T3-Fibroblasten, LS174T- und COLO 320HSR-Kolonadenokarzinomen, A431-Epidermoidkarzinomen, ECC-1-Endometriumkarzinomen und HEp-2-Kehlkopfkarzinomen (7) und nicht in CHO-Chinese Hamster-Ovarien, der POC-Zelllinie von kleinzelligem Lungenkrebs, porcinen und bovinen Aortenendothelzellen, MDA-MB-468-Brustadenokarzinomen und primären humanen Muskel- und Fibroblastenzellen (Daten nicht gezeigt) gefunden. Daraus ist zu schließen, dass p110δ anscheinend selektiv in Leukozyten exprimiert wird.
Im Gegensatz zu p110δ wurde p110α in den meisten untersuchten Geweben und Zelllinien gefunden, einschließlich den weißen Blutzellen (7).
Mikroinjektion von polyklonalen Anti-p110δ-Antikörpern in CSF-1-stimulierte Mausmakrophagen
Die mögliche Funktion von p110δ wurde durch eine Reihe von Mikroinjektionsexperimenten mit Antiseren gegen p110δ und p110α an der Mausmakrophagenzelllinie Bac1 weiter untersucht. Vor der Mikroinjektion wurden die Bac1-Zellen 24 Stunden ohne CSF1 gehungert. CSF1-Hungerung bereitet Zellen darauf vor, sich zu teilen und motil zu werden, wenn sie anschließend CSF-1 ausgesetzt werden. Affinitätsgereinigte polyklonale Anti-p110δ-Antikörper wurden in CSF1-gehungerte Bac1-Zellen injiziert und anschließend 10-15 Minuten CSF1 ausgesetzt.
Die mikroinjizierten Bac1-Zellen zeigten deutliche Änderungen in der Zellmorphologie. Die normale Zellmembranfaltung verschwindet und zytoplasmatische Retraktion tritt auf. Das Zytoskelett mikroinjizierter Bac1-Zellen wurde mit einem Phalloidin-Rhodamin-Konjugat sichtbar gemacht, und 10 zeigt eine repräsentative Probe solcher Zellen, die eine desorganisierte Zytoskelettanordnung zeigen. Die Injektion von Anti-p110α liefert keinen gleichwertigen Effekt.
Interessanterweise zeigt sich ein ähnlicher Phänotyp bei Expression des dominant negativen kleinen GTP-bindenden Proteins rac, N17RAC. Dies lässt vermuten, dass p110δ Teil der gleichen Signalkaskade sein könnte, die an Zytoskelettorganisation und Zellmotilität beteiligt sein könnte.
p110δ ist am Zytokinsignalweg beteiligt
Bei Leukozyten wurden p85-bindende PI3Ks mit zahlreichen verschiedenen Signalereignissen einschließlich Signaltransduktion über Zytokin und komplementäre Rezeptoren, Integrine, Fc-Rezeptoren,B- und T-Zellantigenrezeptoren und ihre Begleitmoleküle wie CD28 in Verbindung gebracht (Übersichtsartikel von Stephens et al., 1993; Fry, 1994). Daher ist klar, dass zahlreiche Signalprozesse potenziell mit p110δ zusammenhängen könnten. Angesichts der Tatsache, dass unterschiedliche p110s mit den gleichen p85-Isoformen komplexiert zu sein scheinen, ist es eine entscheidende Frage, ob selektive Kupplung von p110δ an die oben genannten Signal/Rezeptor-Komplexe in Zellen erfolgt, die auch andere Klasse I-PI3Ks enthalten (2B). Wir sind die wichtige Frage im Zusammenhang mit der Zytokinsignaltransduktion angegangen, die in verschiedenen Leukozytentypen auftritt.
Verschiedene Zytokinfamilien transduzieren Signale über diskrete Klassen von Rezeptoren, die gemeinsame gp130-, β- oder γ-Ketten aufweisen, oder über Rezeptoren mit intrinsischer Tyrosinkinaseaktivität (Übersicht bei Taga und Kishimoto, 1995). Obwohl keine PI3K-Aktivierung durch Zytokinsignaltransduktion über gp130 beschrieben wurde, wurde eine Aktivierung von p85-bindender PI3K in Reaktion auf Zytokinsignaltransduktion über die gemeinsame β-Kette (z. B. IL3), die gemeinsame γ-Kette (z. B. IL4) oder über Tyrosinkinaserezeptoren (wie c-kit, der Stammzellfaktor (SCF) bindet) gezeigt (Wang et al., 1992; Gold et al., 1994). Wir untersuchten die Fähigkeit von IL3, IL4 und SCF, in zytokinabhängigen Leukozytenzelllinien an p110δ und p110α zu kuppeln. Es wurde gefunden, dass ein identisches Muster phosphotyrosinhaltiger Proteine, das für das für die Stimulation verwendete Zytokin spezifisch war, mit p110α- und p110δ-Antikörpern copräzipitierte (8, Tafel a). Bei der auf IL3 und IL4 reagierenden Prä-B-Zelllinie Ba/F3 und der Myeloidprogenitorzelllinie FD-6 (8A; Daten für FD-6 sind nicht gezeigt) induzierte IL3-Behandlung bei p110α/δ-IPs das Auftreten eines unbekannten 100 kDa-Proteins und des 70 kDa-Proteins Tyrosinphosphatase, SHP2 (8A, Tafel b). Durch Immunoblotting wurde gezeigt, dass das 170 kDa-Protein, das bei IL4-Stimulation copräzipitierte (8A, Tafel a) IRS-2 ist, das Hauptsubstrat IL4-induzierter Phosphorylierung in diesen Zellen (Daten nicht gezeigt). 8B zeigt die Ergebnisse ähnlicher Analysen in MC/9-Mastzellen. Nach SCF-Stimulation enthielten sowohl p110α- als auch p110δ-IPs ein nicht identifiziertes tyrosinphosphoryliertes 100 kDa-Protein sowie ein als c-kit identifziertes 150 kDa-Protein, den SCF-Rezeptor (8B, Tafeln a und b). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass p110α und p110δ keine offensichtlichen Unterschiede bei ihrer Rekrutierung an eine Vielzahl aktivierter Zytokinrezeptorkomplexe zeigen. Zusätzlich offenbart die Beteiligung von wenigstens zwei Mitgliedern der p85-bindenden PI3K-Klasse am Zytokinsignalweg eine bislang nicht erkannte Komplikation der Signaltransduktionswege stromab dieser Zytokinrezeptoren.
Expression von PI3-Kinase-p110-Untereinheiten in murinen und humanen Melanomzelllinien
Die Expression von p110δ wurde in verschiedenen murinen und humanen Melanomzelllinien weiter untersucht. Ein charakteristisches Merkmal eines Melanoms ist die aggressive Natur der mit diesem Krebs assoziierten Metastasen. Die mögliche Beteilung von p110δ an Metastasen wurde durch Analyse der relativen Häufigkeit von p110δ-Protein in einer Reihe muriner und humaner Zelllinien untersucht. Western Blots wurden verwendet, um die Mengen an p110α und β sowie p110δ festzustellen. J774, eine murine Zelllinie, wurde als positive Kontrolle für die murinen Western Blots verwendet. Als Kontrolle für den humanen Western Blot wurden neonatale Melanozyten verwendet. Tabelle 1 zeigt, dass p110α und β sowohl in Kontroll- als auch in Melanomzelllinien sowohl muriner als auch humaner Herkunft konstitutiv exprimiert werden. Interessanterweise zeigt die murine Kontrollzelllinie J744 im Vergleich mit den murinen Melanomzelllinien deutlich geringere Mengen p110δ. In humanen neonatalen Melanozyten finden sich jedoch nachweisbare Mengen p110δ. Dies lässt sich durch die Natur dieser humanen Kontrollzellen erklären. Die Expression von p110δ in diesen Kontrollzellen lässt sich durch die relativ kurz zurückliegende Migration dieser Zellen in die menschliche Haut erklären, und daher können sich in diesen Zellen Restmengen von p110δ befinden. Adulte Melanozyten haben längere Verweilzeiten in der Haut und die Menge an p110δ kann entsprechend ihrer terminalen Differenzierung bis auf nicht nachweisbare Mengen reduziert sein.
Wir haben eine neue humane p110-Untereinheit, p110δ, beschrieben, die Teil der PI3-Kinasefamilie ist. p110δ zeigt ein begrenztes Expressionsmuster, indem es nur in Populationen weißer Blutzellen und insbesondere in peripheren Blutleukozyten in signifikanten Mengen akkumuliert. Die motile Natur dieser Zellen ließ uns vorschlagen, dass dieses Mitglied der PI3-Kinasefamilie über Zytoskelettreorganisation an der Regulierung der Motilität von Zellen beteiligt sein könnte. Die Daten, die die murinen und humanen Melanomzelllinien betreffen, sind interessant, hinsichtlich der humanen Melanome aber nicht schlüssig. Die Verwendung von Gewebebiopsien von normalen humanen Melanozyten und humanen Melanomen wird es ermöglichen, dies zu erklären.
Tabelle 1 Expression von p110-Untereinheiten in murinen Melanomen
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Claims

Isoliertes autophosphorylierendes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid durch die in 1A gezeigte Aminosäuresequenz dargestellt wird.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid zur Assoziation mit wenigstens einem p85-Adapter-Polypeptid von einem Säuger fähig ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid durch eine prolinreiche Domäne gekennzeichnet ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 3, wobei sich die prolinreiche Domäne idealerweise an Position 292-311 der in 1A gezeigten Proteinsequenzdaten befindet, sich aber auch an einer homologen Stelle in einer äquivalenten PI3-Kinase befinden kann.
Isoliertes Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid von einem Säuger stammt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid von einem Menschen stammt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid codiert, wie es von der Aminosäuresequenz in 1A dargestellt wird, oder ein Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an das in 9 gezeigte Nukleinsäuremolekül hybridisiert und für ein autophosphorylierendes Polypeptid mit PI3-Kinaseaktivität codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäuresequenz entweder cDNA oder genomische DNA ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Molekül ein klonierter rekombinanter Vektor ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Molekül, oder ein Teil davon, zur rekombinanten Expression des Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 geeignet ist.
Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder 10 transfiziert oder transformiert ist, wobei die Nukleinsäure die rekombinante Synthese eines ganzen oder eines Teils des Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 steuert.
Wirtszelllinie nach Anspruch 11, wobei die Zelllinie eine Insektenzelllinie ist.
Verwendung des rekombinant exprimierten Polypeptids gemäß Anspruch 10 oder des isolierten Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von der Aminosäuresequenz in 1A dargestellt wird.
Antikörper oder Teil davon, wobei der Antikörper wenigstens einen Teil des Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 bindet.
Diagnostisches Verfahren zur Identifizierung der gewebespezifischen Expression des Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Bestimmung der Anwesenheit von einem oder beidem, nämlich dem relevanten Polypeptid und/oder der hierfür codierenden mRNA und/oder cDNA in einer Probe von Zellen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren das Binden von wenigstens zwei Nukleinsäuremolekülprimern, die zur Hybridisierung an wenigstens einen ausgewählten Teil des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls geeignet sind, an die cDNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Verfahren das Bereitstellen der Bedingungen zum Amplifizieren und Reinigen wenigstens eines Teils des Nukleinsäuremoleküls gemäß irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10 mit Hilfe der Primer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren die Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 14 zum Nachweis des Polypeptids umfasst, wobei die Verwendung entweder ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation oder Immunfluoreszenz beinhaltet.
Verfahren zur Identifzierung von Mitteln, die die Kinaseaktivität des Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 wirksam modulieren, umfassend, dass das Polypeptid in vitro Mitteln ausgesetzt wird, die modulierende Wirkungen aufweisen könnten, und anschließend Beobachten der Kinaseaktivität des Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei potentielle Antagonisten mit computergestütztem Modelling oder mit herkömmlichen Laborverfahren gescreent werden.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei Zellen, die das Polypeptidgemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 exprimieren, potentiellen Antagonisten ausgesetzt werden und die Motilität der Zellen verfolgt wird.
Pharmazeutische/veterinärmedizinische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der die Aktivität des Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 wirksam moduliert.
Pharmazeutische/veterinärmedizinische Zusammensetzung nach Anspruch 22, die gegebenenfalls ferner einen Füllstoff, einen Träger oder einen Exzipienten umfasst und/oder in Form einer Dosierungseinheit vorliegt.
Verwendung von entweder dem Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 oder dem Antikörper gemäß Anspruch 14 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Regulierung der Motilität von Zellen.
Pharmazeutische/veterinärmedizinische Zusammensetzung, umfassend ein Antisense-Oligonukleotid, das zur Hybridisierung an ein Nukleinsäuremolekül geeignet ist, wie es durch die Nukleinsäuresequenz in 9 dargestellt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Antisense-Oligonukleotid modifizierte Nukleotide umfasst.