KR20160091440A - 혈액 종양에 대한 요법 - Google Patents

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마이클 더블유. 갤러틴
로저 쥐. 울리치
닐 기제
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길리아드 칼리스토가 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 혈액 종양 및 염증성 질환의 치료를 위한 신규 치료 전략에 관한 방법을 제공한다. 특히, 이러한 방법은 화학식 A의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염, 및 임의적인 제약상 허용되는 부형제의 투여를 포함한다:
<화학식 A>
Figure pat00032

[식 중, R은 H, 할로, 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬이다].

Description

혈액 종양에 대한 요법{THERAPIES FOR HEMATOLOGIC MALIGNANCIES}
관련 출원
본 출원은 미국 출원 일련 번호 61/245,196 (2009년 9월 23일 출원); 61/231,278 (2009년 8월 4일 출원); 61/180,768 (2009년 5월 22일 출원); 61/155,057 (2009년 2월 24일 출원); 61/142,845 (2009년 1월 6일 출원); 및 61/114,434 (2008년 11월 13일 출원)를 우선권으로 주장하고, 이들은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 치료학 및 의약 화학 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 혈액 종양 및 특정 기타 상태의 치료를 위한 특정 퀴나졸린 유도체의 용도에 관한 것이다.
배경기술
3'-인산화 포스포이노시티드를 통한 세포 신호전달이 다양한 세포 프로세스, 예를 들어, 악성 형질전환, 성장 인자 신호전달, 염증 및 면역에 관련되었다. 이러한 인산화된 신호전달 생성물을 생성시키는 것을 담당하는 효소인 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI 3-키나제; PI3K)는 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 이의 인산화된 유도체를 이노시톨 고리의 3'-히드록실에서 인산화시키는, 바이러스 종양단백질 및 성장 인자 수용체 타이로신 키나제와 관련된 활성으로서 최초로 확인되었다.
PI 3-키나제 활성화는 세포 성장, 분화 및 아폽토시스가 포함되는 광범위한 세포성 응답에 수반되는 것으로 여겨진다.
PI 3-키나제의 초기 정제 및 분자 클로닝에서, PI 3-키나제가 p85 및 p110 서브유닛으로 구성된 이종이량체임이 밝혀졌다. 별개의 110 kDa 촉매 서브유닛 및 조절 서브유닛으로 각각 구성된, PI3K α, β, δ, 및 γ로 명명된 4가지 별개의 클래스 I PI3K가 확인되었다. 더욱 구체적으로, 촉매 서브유닛 중 3개, 즉, p110α, p110β 및 p110δ 각각은 동일한 조절 서브유닛인 p85과 상호작용하는 한편; p110γ는 별개의 조절 서브유닛인 p101과 상호작용한다. 인간 세포 및 조직에서의 이러한 PI3K들 각각의 발현 패턴이 또한 상이하다.
PI 3-키나제의 p110δ 이소형(isoform)의 확인이 문헌 [Chantry et al., J Biol Chem, 272: 19236-41 (1997)]에 기술되어 있다. 인간 p110δ 이소형이 조직-제한 방식으로 발현되는 것이 관찰되었다. 이는 림프구 및 림프 조직에서 높은 수준으로 발현되어, 이러한 단백질이 면역계에서의 PI 3-키나제-매개 신호전달에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. PI3K의 p110β 이소형 또한 특정 암에서 PI3K-매개 신호전달에서 역할을 할 수 있다.
암, 염증성 질환 및 자가면역질환과 관련된 PI3K 매개 장애에 관한 치료가 요구된다.
개요
본 발명은 퀴나졸리논 유형 화합물들의 클래스, 및 이러한 화합물들을 암, 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 혈액 종양인 암, 예컨대 백혈병 및 림프종이 본원에서의 방법에 의해 치료된다. 퀴나졸리논 화합물을 다른 치료적 처치와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에서 사용하는 방법이 또한 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암 또는 자가면역 상태인 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 화학식 A의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염, 및 임의적인 제약상 허용되는 부형제의 용도를 제공한다:
<화학식 A>
Figure pat00001
[식 중, R은 H, 할로, 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬이다].
한 실시양태에서, 화합물은 우세적으로 S-거울상이성질체이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, R은 플루오로 (F)이고, 퀴나졸리닐 고리의 위치 5 또는 6에 부착된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, R은 H 또는 F이고; R'은 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 I"의 화합물이다:
<화학식 I">
Figure pat00002
일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 II"의 화합물이다:
<화학식 II">
Figure pat00003
상기 실시양태들 중 일부에서, 자가면역 질환은 알레르기성 비염, 천식, COPD, 또는 류마티스 관절염이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 상태는 암이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 혈액 종양이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 혈액 종양은 백혈병이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 혈액 종양은 림프종이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 혈액 종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 다발 골수종 (MM), 비-호지킨 림프종 (NHL), 외투 세포 림프종 (MCL), 소포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), B-세포 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 급성 림프구성 백혈병 (ALL)이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML)이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL)이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 다발 골수종 (MM)이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 B-세포 림프종이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 B-세포 또는 T-세포 ALL이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 호지킨 림프종이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암 또는 난소암이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 화학요법 치료에 대해 불응성이거나, 또는 화학요법으로의 치료 후 재발 상태이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여하기 위해 제조된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 추가적인 치료제는 프로테아솜(proteasome) 억제제이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 추가적인 치료제가 화학식 A의 화합물과 조합된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 추가적인 치료제는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 추가적인 치료제는 보르테조밉이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 적어도 일군의 2가지 이상의 작용제와 함께 투여하기 위해 제조되고, 이때 상기 작용제 군은 하기 a-q로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손);
b) R CHOP (리툭시맙 CHOP);
c) 하이퍼CVAD (과분별화 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 시타라빈);
d) R-하이퍼CVAD (리툭시맙-하이퍼CVAD);
e) FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론);
f) R-FCM (리툭시맙, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론);
g) 보르테조밉 및 리툭시맙;
h) 템시롤리무스 및 리툭시맙;
i) 템시롤리무스 및 벨케이드®;
j) 요오드-131 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)®) 및 CHOP;
k) CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손);
l) R-CVP (리툭시맙-CVP);
m) ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드);
n) R-ICE (리툭시맙-ICE);
o) FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙);
p) FR (플루다라빈, 리툭시맙); 및
q) D.T. PACE (덱사메타손, 탈리도미드, 시스플라틴, 아드리아마이신(Adriamycin)®, 시클로포스파미드, 에토포시드).
상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 화학식 A의 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물 내에 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 다발 골수종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), B 세포 ALL, T 세포 ALL, 호지킨 림프종, 유방암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 하기 화학식 I" 또는 화학식 II"의 화합물의 용도를 제공한다:
<화학식 I">
Figure pat00004
<화학식 II">
Figure pat00005
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 화학요법 치료에 대해 불응성이거나, 또는 화학요법으로의 치료 후 재발 상태이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 Akt 인산화 활성을 구성적으로 발현하는 암에 걸려 있다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 p110δ 활성은 높고 p110α 활성은 낮은 암에 걸려 있다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 보르테조밉과 조합되어 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 보르테조밉 또는 카르필조밉과 함께 투여하기 위해 제조된 혈액암 치료용 약제의 제조에서의, 화합물 I" 또는 II"의 용도를 제공한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 화합물 투여로부터 12시간 이상의 기간에 걸쳐 호염기구에서 PI3Kδ 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 PI3Kγ 활성화를 위한 EC50 수준 미만인 평균 혈액 농도를 유지한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 화합물 투여로부터 12시간 이상의 기간에 걸쳐 100 nM 내지 1100 nM의 평균 혈장 농도를 유지한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 표준 화학요법 치료에 대해 저항성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 하나 이상의 림프절 비대가 있다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 2가지 이상의 선행 화학요법 치료를 받았고, 2가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법 치료에 대해 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 각각의 화학요법 치료는 플루다라빈, 알킬화제, 리툭시맙, 알렘투주맙, 및 상기 열거된 치료 a-q로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 LB 세포를 사용하여, 화합물 I과 조합된 다양한 농도의 시토카인 IGF-1 및 IL-6의 함수로서 다발 골수종 (MM) 세포 성장의 그래프 요약을 나타낸다.
도 2는 48시간 후의 다양한 농도의 화합물 I, 및 골수 기질 세포(BMSC)의 존재 및 부재의 함수로서 다발 골수종 (MM) 세포의 세포 성장의 그래프 요약을 나타낸다.
도 3은 다양한 농도의 화학식 I의 화합물의 함수로서 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스의 그래프 요약을 나타낸다.
도 4는 여러 상이한 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주에서의 세포 생육력, Akt (Ser473) 인산화의 감소, 및 카스파제(caspase) 3 활성화에 대한 화합물 I의 효과의 요약 차트를 나타낸다.
도 5는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주의 세포 주기에 대한 화합물 I의 효과의 요약을 나타낸다.
도 6은 48시 및 72시의 유방암 T47D 및 HS-578T 세포주에서의 세포 성장에 대한 다양한 농도의 화합물 I의 효과의 그래프 요약을 나타낸다.
도 7은 48시 및 72시의 난소 IGROV-I 및 OVCAR-3 세포주의 세포 성장에 대한 다양한 농도의 화합물 I의 효과의 그래프 요약을 나타낸다.
도 8은 다수의 백혈병 및 림프종 세포주에서의 Akt 인산화에 대한 화합물 I의 효과의 요약을 나타낸다.
도 9는 화합물 I의 존재 또는 부재의 함수로서 다양한 조혈계 암 세포주에서의 Akt 및 pAkt의 SDS-PAGE 영상 및 디스플레이를 나타내어, 화합물 I이 Akt 인산화를 억제함을 보여준다.
도 10은 다양한 농도의 화학식 I의 화합물의 함수로서 유방암 세포주에서의 아폽토시스성 및 생육성 세포 집단의 그래프 요약을 나타내어, 이러한 화합물이 아폽토시스를 유도함을 실연한다.
도 11은 50, 100 및 200 ㎎ 용량의 화합물 I의 경구 투여 후 12시간에 걸친 건강한 인간 대상의 혈액 내의 화합물 I의 농도를 나타낸다.
도 12는 외투 세포 림프종으로 진단된 인간 환자에서의 28일 (1 사이클)의 화합물 I로의 치료 후의 병변 면적과 치료 전의 병변 면적의 비교를 나타낸다.
도 13은 28일 (1 사이클)의 화학식 I의 화합물로의 치료 후의 4주 기간에 걸친 환자의 혈액 내의 ALC (절대 림프구 수)를 나타낸다.
도 14는 제28일의 투여 (50 ㎎ BID) 후 6시간에 걸친 외투 세포 림프종 (MCL)이 있는 환자 또는 그렇지 않은 환자의 혈액 내의 화합물 I의 농도를, 동일한 투약 계획을 사용한 또는 100 ㎎ BID의 화합물 I을 투약한 제7일 (D7)의 정상적인 건강한 지원자의 혈액 내의 농도와 비교하여, 나타낸다.
도 15는 림프종 및 백혈병 세포주들 패널에서의 PI3K 이소형 발현을 나타낸다.
도 16A는 화합물 I에 노출된 백혈병 세포주에서의 세포 생육력 및 아폽토시스 데이터를 나타낸다. 도 16B에서, 아넥신 염색은 처리된 세포에서의 아폽토시스 증가를 가리킨다.
도 17A-D는 CLL 환자 세포에서의 상이한 PI3K 이소형 발현의 PAGE 결과를 나타낸다.
도 18은 화합물 I의 존재 하에서의 (A) 카스파제 3 및 (B) PARP 절단의 유도를 나타낸다.
도 19는 화합물 I에 대한 노출에 의해 야기된 예후가 불량한 환자로부터의 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스 증가를 나타내어, 화합물 I이 약물 저항성 환자에서 효과적임을 실연한다.
도 20은 화학식 I의 화합물에 대한 노출에 의해 야기된 불응성/재발 환자로부터의 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스 증가를 나타낸다.
도 21은 0.1, 1.0, 10 μM의 화합물 I의 존재 또는 부재 하에서의 포스포-Akt 생산의 결과를 나타낸다.
도 22는 호염기구에서의 PI3K 신호전달과 관련된 유동 세포측정법 결과를 나타내어, 무자극 (A)과 비교하여 (B) 항-FCεR1 또는 (C) fMLP가 CD63 발현을 증가시킨다는 것을 실연한다.
도 23은 호염기구에서의 화합물 I에 의한 PI3K 억제의 억제를 나타내고, 화합물 I이 p110δ 경로에 의해 유도된 CD63 발현의 억제에서 특히 효과적이지만, p110γ 경로에 의해 유도된 발현을 억제하는데 마이크로몰 농도에서 또한 효과적임을 실연한다.
도 24는 (A) 건강한 지원자에서의 상이한 용량의 화합물 I의 단일 용량 투여, 및 (B) 12시간 기간에 걸쳐 유효 투여량을 유지하는 약동학 프로파일의 약동학 데이터를 나타낸다.
도 25는 표적을 벗어난 활성을 거의 나타내지 않는, (A) 글루코스 및 (B) 인슐린 수준에 대한 다양한 용량의 화합물 I의 효과를 나타낸다.
도 26A는 DLBCL 세포주들의 패널에서의 PI3K 이소형 발현을 나타낸다.
도 26B는 화합물 I의 존재 또는 부재 하에서의 DLBCL 세포주 내의 pAkt의 SDS-PAGE 영상을 나타낸다.
도 27은 SDS-PAGE에서의 ALL 세포주 내의 Akt 및 S6의 인산화에 대한 10 μM 농도의 화합물 I의 효과를 나타낸다.
도 28은 단계적인 화합물 I 희석물로의 처리 후의 Akt, S6, 및 GSK-3β의 인산화의 용량 의존적 감소를 나타낸다.
도 29는 cFLIP의 하향조절, 카스파제 3의 절단, 및 PARP의 절단에서의 ALL 세포주에 대한 화합물 I의 용량 의존적 효과를 나타낸다.
도 30은 A) MM 세포주 및 B) 환자 MM 세포; 및 C) MM.1S 및 LB 세포에서의 p110δ의 발현을 나타낸다.
도 31A는 p110δ siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (허위)로 형질감염된 LB 및 INA-6 세포로부터의 p110δ의 발현을 나타낸다.
도 31B는 p110δ siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (허위)로의 형질감염 후의 INA-6 세포 성장의 그래프를 나타낸다.
도 31C는 48시간 동안 화합물 I과 함께 또는 화합물 I 없이 배양된 생육성 세포의 ％를 나타낸다.
도 31D는 48시간 동안 0 내지 20 μM 농도의 화합물 I과 함께 배양된 후의 생육성 MM 세포의 ％를 나타낸다.
도 31E는 72시간 동안 다양한 농도의 화합물 I과 함께 배양된 후의 건강한 도너로부터의 생육성 말초 혈액 단핵 세포의 ％를 나타낸다.
도 31F는 120시간 동안 화합물 I (0-5 μM)과 함께 배양된 INA-6 세포로부터의 용해물의 면역블롯팅 결과를 나타낸다.
도 32는 A) INA-6 세포를 화합물 I 또는 LY294002와 함께 12시간 동안; B) INA-6 및 MM.1S 세포를 다양한 농도의 화합물 I과 함께 6시간 동안; C) LB 및 INA-6 세포를 화합물 I과 함께 0-6시간 동안 배양한 후의 AKT 및 ERK 발현 프로파일의 면역블롯을 나타낸다.
도 33A는 화합물 I로 6시간 동안 처리된 INA-6 및 LB MM 세포 및 LC3 축적의 형광 및 투과 전자 현미경 영상을 나타낸다; 화살표는 자가포식소체를 가리킨다.
도 33B는 5 μM의 화합물 I 또는 혈청 고갈로 6시간 동안 처리된 INA-6 세포의 형광 현미경검사 영상을 나타낸다.
도 33C는 화합물 1 및 3-MA (3-메틸 아데닌, 공지된 자가포식 억제제)로 처리된 또는 처리되지 않은 INA-6 세포로부터의 LC3 및 베클린-1 단백질 수준의 면역블롯을 나타낸다.
도 33D는 100 μM 이하의 3-MA로 24시간 동안 처리한 후의 p110δ 양성 LB 세포의 ％ 성장을 나타낸다.
도 34는 다양한 양의 IL-6 또는 IGF-1의 존재 또는 부재 하에 0, 5, 및 10 μM의 화합물 I과 공동-배양된 A) LB 또는 B) INA-6 세포의 성장 억제 수준을 나타낸다; 범례: 대조군 배지 (■); 5.0 μM (▧) 또는 10 μM (□)의 화합물 I.
도 34C 및 34D는 BMSC의 존재 하에서의 MM 세포 성장 억제를 나타낸다. 34C에 대한 범례: 대조군 배지 (□), 2.5 μM (▒), 5 μM (▧), 및 10 μM (■)의 화합물 I.
도 34E는 화합물 I 또는 대조군 배지와 함께 48시간 동안 배양된 BMSC로부터의 배양 상청액 내의 IL-6의 면역블롯을 나타낸다.
도 34F는 BMSC와 함께 또는 BMSC 없이 배양된 화합물 I로 처리된 INA-6 세포에서의 AKT 및 ERK 발현 프로파일의 면역블롯을 나타낸다.
도 34G는 48시간 동안 화합물 I과 함께 배양한 후의 2명의 상이한 환자에서의 ％ BMSC 세포 성장을 나타낸다.
도 35A는 0, 1 및 10 μM의 화합물 I과 함께 8시간 동안 배양된 HuVEC (인간 배꼽 정맥 내피 세포) 및 평가된 미세관 형성의 현미경 영상을 나타낸다.
도 35B는 화합물 I로 처리된 HuVEC 세포에서의 내피 세포 관 형성을 요약하는 막대 차트를 나타낸다.
도 35C는 증가되는 화합물 I의 배양 농도의 함수로서 HuVEC의 ％ 세포 성장을 도해하는 그래프를 나타낸다.
도 35D는 8시간 동안 화합물 I과 함께 배양한 후의 HuVEC 세포 용해물의 Akt 및 ERK 발현 감소를 나타낸다.
도 36A는 시간의 함수로서 0, 10 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏의 화합물 II로 처리된 인간 MM 이종이식물이 있는 SCID 마우스에서의 종양 부피를 도해하여, 인간 이종이식물 종양에 대한 강한 생체내 활성을 나타낸다.
도 36B는 화합물 II로 12일 동안 처리된 마우스 대 대조군 마우스에 대한 인간 MM 이종이식물로부터의 종양을 비교하는 사진을 나타낸다.
도 36C는 경시적으로 0, 10 및 30 ㎎/㎏ 화합물 II로 처리된 인간 MM 이종이식물이 있는 SCID 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 36D는 대조군과 비교하여 화합물 II로 처리된 마우스로부터 수확된 종양의 면역-조직화학 분석으로부터의 영상을 나타내고, 이때 CD31 및 P-AKT 양성 세포는 진갈색이다.
도 36E는 대조군과 비교하여 화합물 II로 처리된 마우스로부터 수확된 종양 조직으로부터의 PDK-I 및 AKT 수준을 검출하는 면역블롯이다.
도 36F는 ELISA에 의해 결정된 4주 처리 기간에 걸쳐 0, 10 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏의 화합물 II로 처리된 마우스에서 측정된 sIL6R 수준의 차트를 나타낸다.
도 37A는 다양한 양의 보르테조밉 (B)과 함께 화합물 I로 처리한 후의 생육성 LB 또는 INA-6 MM 세포의 ％를 나타낸다; 범례: 배지 (■), 화합물 I 1.25 μM (▧), 2.5 μM (▒), 또는 5.0 μM (□).
도 37B는 6시간 동안 화합물 I 및/또는 보르테조밉으로 처리된 INA-6 세포에서의 AKT의 인산화 수준을 비교하는 면역블롯을 나타낸다.
도 38은 (A) 소포성 림프종 세포주들의 패널에서의 PI3K 이소형 발현; (B) 화합물 I에의 노출 후의 pAkt, Akt, pS6 및 S6의 발현 감소; 및 (C) 용량-의존적 방식의 화합물 I에의 노출 후의 PARP 및 카스파제-3 절단 증가를 나타낸다.
도 39는 (A) 다양한 양의 화합물 I에서의 1차 MCL 세포에서의 구성적 PI3K 신호전달의 양; (B) 생존 인자 및 다양한 양의 화합물 I을 함유하는 MCL 세포주에서의 pAkt 생산 감소를 나타낸다.
도 40은 (A) 화합물 I로의 치료 전 및 (B) 화합물 I로의 1회 사이클의 치료 후의 CLL 환자에서의 거대 림프절병의 컴퓨터 단층촬영 겨드랑이 영상을 나타낸다.
발명을 수행하는 방식
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 업계 용어, 표기 및 기타 과학 용어 및 용어법은 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 지닌다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미의 용어가 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되고, 본원에서의 이같은 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 비하여 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 이해되어야 하지는 않는다. 다수의 본원에 기술되거나 언급된 기술 및 절차는 당업자에 의해 잘 이해되고, 통상적인 방법론을 사용하여 일상적으로 이용된다. 적합하게는, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 달리 언급되지 않는 한 제조사가 규정한 프로토콜 및/또는 파라메터에 따라 일반적으로 수행된다.
본원에서 제공된 일반적인 방법의 논의는 설명의 목적을 위해서만 의도된다. 다른 별법적인 방법 및 실시양태가 본 개시내용의 검토 시 당업자에게 명백할 것이다.
접속사 "또는"으로 연결된 아이템들의 군은 이러한 군들 간의 상호 배타성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 그보다는 달리 확실하게 언급되지 않는 한 "및/또는"으로 또한 해석되어야 한다. 본 발명의 아이템들, 요소들 또는 성분들이 단수로 기술 또는 청구될 수 있지만, 단수에 대한 한정이 명확하게 언급되지 않는 한 복수가 이의 범주 내인 것으로 생각된다.
본 발명은 암 및 염증성 질환의 치료를 위한 신규 치료 전략에 관한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 대상에게 하기 화학식 A의 화합물, 또는 이의 제약상 허용되는 염, 및 임의적인 제약상 허용되는 부형제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다:
<화학식 A>
Figure pat00006
[식 중, R은 H, 할로, 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬이다].
특정 실시양태에서, 할로는 F이고; R'는 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
특정 실시양태에서, 하기의 구조로, R이 퀴나졸리닐 고리의 위치 5에 부착된다:
Figure pat00007
특정 실시양태에서, 하기의 구조로, R이 퀴나졸리닐 고리의 위치 6에 부착된다:
Figure pat00008
본원에서 사용된 용어 '화합물'은, 달리 상술되지 않는 한, 화학식 A의 화합물, 예컨대 화합물 I, 화합물 II, 또는 거울상이성질체, 예컨대 I" 또는 II", 또는 거울상이성질체 혼합물을 지칭한다.
"화학식 I의 화합물" 또는 "화합물 I"은 화학식 I의 구조의 화학적 화학물 5-플루오로-3-페닐-2-[1-(9H-퓨리-6-닐아미노)-프로필]-3H-퀴나졸린-4-온을 지칭한다:
<화학식 I>
Figure pat00009
I"로 명시되는 화합물 I의 S-거울상이성질체가 하기에 제시된다:
<화학식 I">
Figure pat00010
"화학식 II의 화합물" 또는 "화합물 II"는 화학식 II의 구조의 화학적 화학물 2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸)-6-플루오로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온을 지칭한다:
<화학식 II>
Figure pat00011
II"로 명시되는 화합물 II의 S-거울상이성질체가 하기에 제시된다:
<화학식 II">
Figure pat00012
한 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학식 II의 화합물이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 R- 및 S-거울상이성질체의 라세미 혼합물이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 거울상이성질체들의 혼합물로서 사용되고, 종종 S-거울상이성질체가 강화된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 우세적으로 S-거울상이성질체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 화학식 A의 화합물은 80％ 이상이 S-거울상이성질체이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 주로 S-거울상이성질체로 구성되고, 이때 화합물은 적어도 66-95％, 또는 85-99％의 S-거울상이성질체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물의 거울상이성질체 과량 (e.e.)은 S-거울상이성질체 90％ 이상 또는 95％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 화합물의 S-거울상이성질체 과량 (e.e.)은 98％ 이상 또는 99％ 이상이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 95％ 이상의 S-거울상이성질체를 포함한다. 실시예 섹션에서 제공되는 세포 실험 및 환자 실험에서, 사용된 화합물 I의 샘플은 S-거울상이성질체가 95％를 초과하였다.
구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 화학식 I 또는 II의 화합물은 80％ 이상이 S-거울상이성질체이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 주로 S-거울상이성질체로 구성되고, 이때 화합물은 적어도 66-95％, 또는 85-99％의 S-거울상이성질체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 거울상이성질체 과량 (e.e.)은 S-거울상이성질체 90％ 이상 또는 95％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 S-거울상이성질체 과량 (e.e.)은 98％ 이상 또는 99％ 이상이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 95％ 이상의 S-거울상이성질체를 포함한다. 실시예 섹션에서 제공되는 세포 실험 및 환자 실험에서, 사용된 화합물 I의 샘플은 S-거울상이성질체가 95％를 초과하였다.
특정 실시양태에서, 화합물은 다른 PI3K 이소형과 비교하여 PI3K p110δ를 선택적으로 억제한다.
특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 알레르기성 비염, 천식, COPD, 또는 류마티스 관절염이다.
특정 실시양태에서, 암은 혈액 종양 및/또는 고형 종양이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈액 종양은 백혈병 또는 림프종이다.
일부 실시양태에서, 림프종은 성숙 (말초) B-세포 신생물이다. 구체적인 실시양태에서, 성숙 B-세포 신생물은 B-세포 만성 림프구성 백혈병 / 소림프구성 림프종; B-세포 전림프구성 백혈병; 림프형질세포성 림프종; 변연대 림프종, 예컨대 지라 변연대 B-세포 림프종 (+/- 융모 림프구), 림프절 변연대 림프종 (+/- 단핵구모양 B-세포), 및 점막-관련 림프 조직 (MALT) 유형의 림프절외 변연대 B-세포 림프종; 모발상 세포 백혈병; 형질 세포 골수종/형질세포종; 소포성 림프종, 여포 중심; 외투 세포 림프종; 미만성 거대 B-세포 림프종 (종격 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 및 1차 삼출 림프종 포함); 및 버킷 림프종/버킷 세포 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 림프종은 다발 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 외투 세포 림프종 (MCL), 소포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM) 또는 B-세포 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가적인 특정 실시양태에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 소림프구성 림프종 (SLL)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 급성 림프구성 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병으로 또한 알려져 있고, 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 양쪽 용어 모두 골수 내의 백혈구, 림프구로부터 시작하는 암 유형을 기술한다.
일부 실시양태에서, 비-호지킨 림프종 (NHL)은 2가지 카테고리인 공격적 NHL 또는 무통성 NHL 중 하나에 속한다. 공격적 NHL은 급속하게 성장하고, 비교적 빠르게 환자의 사망에 이를 수 있다. 치료되지 않은 경우의 생존은 수개월 또는 심지어 수주 내로 측정될 수 있다. 공격적 NHL의 예로는 B-세포 신생물, 미만성 거대 B-세포 림프종, T/NK 세포 신생물, 역형성 거대 세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 백혈병/림프종, 전구체 T-림프모구성 백혈병/림프종, 버킷 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병 (HTLV1+), 원발성 CNS 림프종, 외투 세포 림프종, 다형성 이식후 림프구증식 장애 (PTLD), AIDS-관련 림프종, 진성 조직구성 림프종, 및 모구성 NK-세포 림프종이 포함된다. 공격적 NHL의 가장 통상적인 유형은 미만성 거대 세포 림프종이다.
무통성 NHL은 느리게 성장하고, 진행된 단계로 질환이 진전될 때까지 대부분의 환자에 대해 명백한 증상을 나타내지 않는다. 무통성 NHL에 걸린 환자의 치료되지 않은 경우의 생존은 수년 내로 측정될 수 있다. 비-제한적인 예로는 소포성 림프종, 소림프구성 림프종, 변연대 림프종 (예컨대 림프절외 변연대 림프종 (점막 관련 림프 조직 - MALT 림프종으로 또한 공지됨), 림프절 변연대 B-세포 림프종 (단핵구모양 B-세포 림프종), 지라 변연대 림프종), 및 림프형질세포성 림프종 (발덴스트롬 마크로글로불린혈증)이 포함된다.
일부 경우에, 조직학적 형질전환이 일어날 수 있고, 예를 들어, 환자의 무통성 NHL이 공격적 NHL로 전환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 공격적 NHL 또는 무통성 NHL에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 외투 세포 림프종 (MCL), 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 소포성 림프종 (FL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 소림프구성 림프종 (SLL), 다발 골수종 (MM), 및 변연대 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 상태의 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 재발된 상태 또는 불응성 상태의 환자에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다.
특정 실시양태에서, 암 또는 자가면역 질환은 암 또는 자가면역 질환에 걸리지 않은 대상체에서의 PI3K 활성과 비교하여 비정상적인 PI3K 활성과 관련된다.
특정 실시양태에서, 바람직한 대상체는 화학요법 치료에 대해 불응성이거나, 또는 화학요법으로의 치료 후에 재발 상태이다. 별법적인 실시양태에서, 대상체는 신생(de novo) 환자이다.
특정 실시양태에서, 방법은 상기 환자에서 PI3Kδ 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
공지된 치료제로의 치료를 받는 대상체는 치료에 대한 저항을 경험할 수 있다. 예를 들어, 보르테조밉이 재발/불응성 MM, 재발 MM 및 새롭게 진단된 MM에 대해 FDA에서 승인되었지만, 일부 환자는 보르테조밉에 응답하지 않고, 그 밖의 환자들은 보르테조밉에 대한 저항성을 획득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 퀴나졸리논 화합물은 공지된 치료제의 효능을 상승작용적으로 증대시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물은 본원에 기술된 치료제들 중 임의의 것을 증대시킬 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물은 프로테아솜 억제제를 상승작용적으로 증대시킨다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 화학요법적 치료에 대해 저항성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 프로테아솜 억제제에 대해 저항성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 보르테조밉 또는 카르필조밉에 대해 저항성이다. 한 예에서, 본원에 기술된 화합물은 보르테조밉-유도 MM 세포독성을 상승작용적으로 증대시킨다. 이론에 제한되지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본원에 논의된 화합물은 AKT의 보르테조밉-유도 인산화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 프로테아솜 억제제 치료에 대한 저항성을 극복하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제에 대해 저항성이거나 치료제에 대한 저항성이 발달된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
이론에 제한되지 않으면서, 화학식 A의 화합물과 통상적인 요법 사이의 상승작용적인 효과는 말초 순환 내로의 종양 세포 이동을 유도하는 본 발명의 화합물의 능력에 기인할 수 있다. 종양 세포의 말초 순환을 유도하는 것은 종양 상에 작용하고 종양을 더욱 효과적으로 중화하는 통상적인 요법의 능력을 증가시킨다. 이러한 상승작용이 CLL 환자에서 실연되었다.
따라서, 방법은 화학식 A의 화합물에 더하여 환자에게 상기 환자에서 상기 암 또는 자가면역질환을 치료하도록 선택된 치료적 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제 및/또는 치료적 시술을 투여하는 단계를 포함한다. "치료제"는 본원에서 사용되는 바와 같은 하나 이상의 화합물을 지칭할 수 있다. 치료제는 표준 화학요법 약물 또는 실험 화학요법 약물일 수 있다. 치료제는 1가지를 초과하는 화학요법 약물의 조합물을 포함할 수 있다. 전형적인 화학요법 약물 조합물이 본원의 a-q에서 열거된다. 치료될 질환의 유형에 따라 특정 치료제가 선택될 수 있다. 특정 혈액학적 질환에 대한 통상적인 화학요법 치료의 비-제한적인 예가 하기 섹션에서 기술된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 조혈계 암 환자, 예를 들어, CLL 환자를 보르테조밉 및 화학식 A의 화합물 (예를 들어, 화학식 I, II, I", 또는 II")로 치료하는 방법을 제공하고, 이때 조합물은 상승작용적인 효과를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 치료제는 보르테조밉 (벨케이드®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드, 페리포신, 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라(Viagra)®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2-항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄패쓰(Campath)-1H®, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2-1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, PEG화 리포솜형 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 프레드니솔론, 클라드리빈, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료적 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 멘사, 재조합 인터루킨-12, 재조합 인터루킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스탯, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포푼진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 항-CD20 모노클로날 항체, 클로람부실, 펜토스타틴, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 항-CD40, 및 오파투무맙, 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 치료제들의 조합물은 상기 열거된 조합물 a-q와 같이 현행 요법 및 실험 요법에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 바람직하게는 프로테아솜 억제제이다. 일부 실시양태에서, 방법은 화합물을 프로테아솜 억제제와 함께 투여하는 것을 포함한다. 프로테아솜 억제제에는 천연 및 합성 화합물이 포함된다. 프로테아솜 억제제의 비-제한적인 예로는 밀레니엄 파마슈티칼즈(Millennium pharmaceuticals)가 '벨케이드®'로 판매하는 보르테조밉 ([(1R)-3-메틸-1-({(2S)-3-페닐-2-[(피라진-2-일카르보닐)아미노]프로파노일}아미노)부틸]보론산); 프로테올릭스 인코포레이티드(Proteolix, Inc)에서 개발한 카르필조밉 (PR-171) 및 경구 유사체 PR-047이 포함된다. 프로테아솜 억제제의 기타 예로는 디술피람; 락타시스틴; 합성 화합물 예컨대 PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 및 아클라시노마이신; 칼파인 억제제, 예컨대 CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341; 비닐 술폰 트리펩티드 억제제; 리토나비르; PI-083; (+/-)-7-메틸로무랄리드; 및 (-)-7-메틸로무랄리드가 포함된다. 특정 실시양태에서, 화학식 A의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 함께 투여된다. 더욱 특정한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 조합되어 투여된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 화학식 II의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 조합되어 투여된다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염; 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다:
<화학식 I>
Figure pat00013
한 실시양태에서, 조성물에서 S-거울상이성질체가 강화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염; 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다:
<화학식 II>
Figure pat00014
한 실시양태에서, 조성물에서 S-거울상이성질체가 강화된다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물과 추가적인 치료제의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 다발 골수종 (MM)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 I 또는 II이다. 구체적인 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 I"이다. 다른 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 II"이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 추가적인 치료제는 프로테아솜 억제제이다. 구체적인 실시양태에서, 추가적인 치료제는 보르테조밉이다. 구체적인 실시양태에서, 환자에서 다발 골수종을 치료하는 방법은 화합물 I"를 보르테조밉과 함께 투여하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 환자에서 다발 골수종을 치료하는 방법은 화합물 II"를 보르테조밉과 함께 투여하는 단계를 포함한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 60％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 70％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 80％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 90％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 95％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 98％ 이상이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"는 거울상이성질체 과량이 99％ 이상이다.
특정 실시양태에서, 치료제들의 조합물이 화학식 A의 화합물과 함께 투여되고, 이때 상기 조합물은 하기 a-q로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손);
b) R-CHOP (리툭시맙-CHOP);
c) 하이퍼CVAD (과분별화 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 시타라빈);
d) R-하이퍼CVAD (리툭시맙-하이퍼CVAD);
e) FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론);
f) R-FCM (리툭시맙, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론);
g) 보르테조밉 및 리툭시맙;
h) 템시롤리무스 및 리툭시맙;
i) 템시롤리무스 및 벨케이드®;
j) 요오드-131 토시투모맙 (벡사르®) 및 CHOP;
k) CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손);
l) R-CVP (리툭시맙-CVP);
m) ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드);
n) R-ICE (리툭시맙-ICE);
o) FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙);
p) FR (플루다라빈, 리툭시맙); 및
q) D.T. PACE (덱사메타손, 탈리도미드, 시스플라틴, 아드리아마이신®, 시클로포스파미드, 에토포시드).
별법적인 실시양태에서, 화합물이 치료적 시술과 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 치료적 시술은 말초 혈액 줄기 세포 이식, 자가 조혈 줄기 세포 이식, 자가 골수 이식, 항체 요법, 생물학적 요법, 효소 억제제 요법, 전신 방사선조사, 줄기 세포 주입, 골수 파괴 + 줄기 세포 보조, 시험관내-처리 말초 혈액 줄기 세포 이식, 제대혈 이식, 면역효소 기술, 면역조직화학 염색 방법, 약리학적 연구, 저-LET 코발트-60 감마선 요법, 블레오마이신, 통상적인 수술, 방사선 요법, 고-용량 화학요법 및 비-골수파괴성 동종이형 조혈 줄기 세포 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플을 혈액 화학 분석, 염색체 전위 분석, 바늘 생검, 형광 원위치 혼성화, 실험 바이오마커 분석, 면역조직화학 염색 방법, 유동 세포측정법 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 분석 절차로 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
명명 목적을 위해, 화합물의 퀴나졸리닐 및 퓨리닐 성분이 이에 따라 번호가 매겨진다:
Figure pat00015
본원에서 사용된 용어 "알킬"은 치환되지 않은 경우 C 및 H만 함유하는, 직쇄, 분지쇄 및 고리형 1가 탄화수소 라디칼, 및 이들의 조합을 포함한다. 예로는 메틸, 에틸, 이소부틸, 시클로헥실, 시클로펜틸에틸 등이 포함된다. 각각의 이러한 기 내의 전체 탄소 원자 개수가 때때로 본원에 기술되고, 예를 들어, 이러한 기가 10개까지의 탄소 원자를 함유할 수 있는 경우 이는 1-10C 또는 C1-C10 또는 C1-10으로 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다. 플루오로 및 클로로가 종종 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "선택적 PI3Kδ 억제제" 또는 "선택적 PI3Kβ 억제제" 등은 각각 PI3Kδ 또는 PI3Kβ 이소자임을 PI3K 패밀리의 하나 이상의 다른 이소자임보다 더욱 효과적으로 억제하는 화합물을 지칭한다. 선택적 억제제는 PI3K의 다른 이소자임에 대해서 또한 활성일 수 있지만, 다른 이소자임을 동일한 정도로 억제하기 위해서는 더 높은 농도를 필요로 한다. "선택적"은 필적하는 화합물보다 특정 PI 3-키나제를 더 많이 억제하는 화합물을 기술하도록 또한 사용될 수 있다. "선택적 PI3Kδ 억제제" 화합물은 PI3K 억제제로 통상적으로, 그리고 포괄적으로 명시되는 화합물, 예를 들어, 워트만닌 또는 LY294002보다 PI3Kδ에 대해 더욱 선택적인 것으로 이해된다. 부수적으로, 워트만닌 및 LY294002는 "비-선택적 PI3K 억제제"로 간주된다. 특정 실시양태에서, 선택적으로 PI3Kδ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하는 임의 유형의 화합물이 본 발명의 방법에서 선택적 PI3Kδ 억제제로서 사용될 수 있다. 또한, 선택적으로 PI3Kδ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하고 허용가능한 약리학적 성질을 지니는 임의 유형의 화합물이 본 발명의 치료 방법에서 선택적 PI3Kδ 억제제로서 사용될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, 본 발명의 화합물로 p110 델타 억제를 표적화하는 것은 혈액 종양 치료를 위한 신규 접근법을 제공하는데, 이는 이러한 방법이 구성적 신호전달을 억제하여 종양 세포의 직접적인 파괴를 초래하기 때문이다. 또한, 이론에 제한되지 않으면서, p110 델타 억제는 종양 세포 귀향, 생존 및 증식에 결정적인 미세환경 신호를 억압한다.
별법적인 실시양태에서, 선택적으로 PI3Kβ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하는 임의 유형의 화합물이 본 발명의 방법에서 선택적 PI3Kβ 억제제로서 사용될 수 있다. 또한, 선택적으로 PI3Kβ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하고 허용가능한 약리학적 성질을 지니는 임의 유형의 화합물이 본 발명의 치료 방법에서 선택적 PI3Kβ 억제제로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "치료하는"은 장애를 억제하는 것, 즉, 이의 발달을 저지하는 것; 장애를 경감시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 야기하는 것; 또는 장애를 완화시키는 것, 즉, 장애와 관련된 증상들 중 하나 이상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "치료하는"은 장애에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 장애에 걸린 것으로 진단되지는 않은 동물에서 장애가 발생하는 것을 예방하는 것을 지칭한다. "장애"는 비-제한적으로 의학적 장애, 질환, 상태, 증후군 등을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 "자가면역 질환"은 조직 손상이 신체 자신의 구성물의 체액성 또는 세포-매개 응답과 관련되는 장애들의 임의의 군을 지칭한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 호염기구 및/또는 비만 세포의 기능을 억제함으로써, 과도한 또는 바람직하지 않은 호염기구 및/또는 비만 세포 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료를 가능하게 하는 방법을 포함한다. 이러한 방법에 따라, 호염기구 및/또는 비만 세포 내의 포스파티딜이노시톨 3-키나제 델타 (PI3Kδ)의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제하는 본 발명의 화합물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방법은 PI3Kδ 억제제를 호염기구 및/또는 비만 세포에 의해 자극된 히스타민 방출을 억제하는데 충분한 양으로 사용한다. 따라서, 이같은 화합물 및 기타 PI3Kδ 선택적 억제제의 사용은 히스타민 방출을 특징으로 하는 질환, 즉, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, ARDS, 폐기종 및 관련 장애와 같은 장애가 포함되는 알레르기성 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 관절염 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 단일관절성 관절염, 골관절염, 통풍성 관절염, 척추염; 베체트병; 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소성 쇼크, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 및 독성 쇼크 증후군; 패혈증, 외상 또는 출혈에 대해 2차적인 다발성 장기 손상 증후군; 안과 장애 예컨대 알레르기성 결막염, 봄철 결막염, 포도막염, 및 갑상선-관련 눈병; 호산구 육아종; 폐 또는 호흡 장애 예컨대 천식, 만성 기관지염, 알레르기성 비염, ARDS, 만성 폐 염증 질환 (예를 들어, 만성 폐쇄성 폐 질환), 규폐증, 폐 사르코이드증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐기종, 폐렴, 기관지확장증 및 폐 산소 독성; 심근, 뇌 또는 사지의 재관류 손상; 섬유증 예컨대 낭성 섬유증; 켈로이드 형성 또는 반흔 조직 형성; 죽상경화증; 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반 루푸스 (SLE), 자가면역성 갑상샘염, 다발 경화증, 일부 형태의 당뇨병, 및 레이노이드 증후군; 및 이식 거부 장애 예컨대 이식물-대-숙주 질환 (GVHD) 및 동종이식 거부; 만성 사구체신염; 염증성 장 질환 예컨대 만성 염증성 장 질환(CIBD), 크론병, 궤양성 대장염 및 괴사성 전장염; 염증성 피부병 예컨대 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 건선 또는 두드러기; 감염으로 인한 열 및 근육통; 중추 또는 말초 신경계 염증 장애 예컨대 수막염, 뇌염, 및 경미한 외상으로 인한 뇌 또는 척수 손상; 쇼그렌 증후군; 백혈구 누출을 수반하는 질환; 알콜성 간염; 세균성 폐렴; 항원-항체 복합체 매개 질환; 혈액량감소성 쇼크; I형 당뇨병; 급성 및 지연형 과민증; 백혈구 질환 및 전이로 인한 질환 상태; 열 손상; 과립구 수혈-관련 증후군; 및 시토카인-유도 독성과 같은 질환을 치료하는 방법을 가능하게 한다.
이러한 방법은 재관류 손상, 즉, 조직 또는 장기가 허혈에 이어지는 재관류 기간을 겪는 상황으로부터 초래되는 손상을 입은 또는 입을 수 있는 대상체를 치료하는데 유용할 수 있다. 용어 "허혈"은 동맥혈 유입의 폐쇄로 인한 국소화된 조직 빈혈을 지칭한다. 일시적인 허혈에 이어지는 재관류는 감염된 구역 내의 혈관의 내피를 통한 호중구 활성화 및 이행을 특징적으로 초래한다. 활성화된 호중구의 축적은 차례로 반응성 산소 대사산물의 생성을 초래하고, 이는 관련된 조직 또는 장기의 성분들을 손상시킨다. "재관류 손상"의 이러한 현상은 혈관 발작 (전체적 및 국소성 허혈 포함), 출혈성 쇼크, 심근 허혈 또는 경색, 장기 이식, 및 뇌 혈관경련과 같은 상태와 일반적으로 관련된다. 설명하자면, 재관류 손상은 혈액 제공이 저지되었던 심장이 재관류되기 시작할 때 심장 정지 동안 또는 심장 우회 시술의 종료 시에 발생한다. PI3Kδ 활성의 억제는 이같은 상황에서의 재관류 손상의 양 감소를 초래할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양의 치료 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 이러한 암은 유방암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 PI3Kβ에 의해 매개되는 비정상적이거나 바람직하지 않은 세포 신호전달 활성과 관련되는 고형 종양의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 췌장암; 방광암; 결장직장암; 유방암 (전이성 유방암 포함); 전립선암 (안드로겐-의존적 및 안드로겐-비의존적 전립선암 포함); 신장암 (예를 들어, 전이성 신장세포 암종 포함); 간세포암; 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 세기관지폐포 암종 (BAC), 및 폐의 샘암종 포함); 난소암 (예를 들어, 진행성 상피성 또는 원발성 복막암 포함); 자궁경부암; 위암; 식도암; 두경부암 (예를 들어, 두경부의 편평 세포 암종 포함); 흑색종; 신경내분비암 (전이성 신경내분비 종양 포함); 뇌 종양 (예를 들어, 신경교종, 역형성 희소돌기아교세포종, 성인 다형성 아교모세포종, 및 성인 역형성 별아교세포종 포함); 골암; 및 연조직 육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
p110δ의 유전적 제거가 면역계에 제한되는 가벼운 표현형을 초래하는 것으로 발견되었다. 일반적인 관찰은 총체적인 해부학적 또는 거동 이상이 없이 가임성인 생물을 포함한다. 조직학적 검사에서, 주요 장기가 정상으로 보이는 것으로 드러났다. 전체 클래스 I PI3K 활성이 B 및 T 세포에서 30-50％ 감소되었다. 더욱이, 감염에 대한 감수성에서의 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 조혈계에 대한 효과는 정상적인 말초 혈액 세포 수, 지라 및 림프절 내의 종자 중심의 결여 및 림프 저형성증의 발생, 골수 내의 B220 + IgM + B 세포 전구세포의 개수 감소, 혈청 면역글로불린 수준 감소, 및 흉선에서의 정상적인 T 세포 발달을 포함한다.
p110δ의 유전적 제거는 종양발생에 중요한, 골수 및 B 세포 신호전달에 영향을 미친다. 특히, 타이로신 키나제 신호전달, 발달, 증식 및 생존이 골수 세포에서 영향을 받는다. B 세포 기능이 가장 영향을 받고, 여기에는 증식, 분화, 아폽토시스, 및 B 세포 생존 인자 (BCR, CD40, IL-4, 케모카인)에 대한 응답이 포함된다. 따라서, 본 발명은 이러한 골수 및 B 세포 기능들 중 하나 이상이 비정상적이거나 바람직하지 않은 질환 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
분자 수준에서 p110α, p110β, p110δ, p110γ, (hvPS34, mTOR, DNA-PK, 및 기타)를 표적으로 하는 팬(pan) PI3K 억제제는 차례로 모든 조직을 표적으로 한다. 잠재적인 임상 적응증에는 암이 포함되지만, 임상 유해 사례에 암 환자에서의 고인슐린혈증이 포함된다. 잠재적인 임상 적응증에 암, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기 및 COPD가 포함되는 경우에 염증을 매개하는 세포 및 암 세포를 표적으로 하는 p110δ 선택적 억제제의 장점은 치료가 잘 허용되고 고인슐린혈증과 같은 부작용이 방지된다는 것이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 암, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기, COPD, 또는 본 발명의 화합물로 치료가능한 기타 상태에 대해, 인슐린 저항성 또는 제2형 당뇨병에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 과도한 인슐린 상태 또는 경향이 있는 이같은 치료를 필요로 하는 환자에 대해, 본 발명의 화합물은 팬-PI3K 억제제에 비해 특히 유리하다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 I"의 화합물이 바람직한데, 인슐린 신호전달에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 혈액 종양을 치료하는 것에 치료 이점을 제공하기 때문이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PI3K p110δ를 억제하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PI3K p110β 또는 p110γ를 억제하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 표적을 벗어나는 활성이 거의 없거나 없다. 특히, 이러한 방법에서 사용되는 화학식 I의 화합물은 실시예 16의 표 3에 요약된 것들이 포함되는 300가지를 초과하는 단백질 키나제에 대한 활성을 거의 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 팬-PI3K 억제제의 투여를 포함하는 방법과 비교하여 암 환자에서 고인슐린혈증 효과가 없거나 최소이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 Akt 인산화를 매개하는 세포를 표적화하는데 유용한데, 이는 화학식 A의 화합물이 Akt 인산화를 억제하기 때문이다. 따라서, 한 실시양태에서, 조혈계 암 예컨대 림프종, 백혈병 또는 다발 골수종과 관련하여 상승된 Akt 인산화를 나타내는 환자를 선택함으로써, 본 발명의 화합물로의 치료에 적절한 환자를 선택할 수 있다.
본원의 방법은 표적을 벗어나는 책임을 피하고, hERG 억제가 없고 유의한 P450 억제가 없어 수용체 그람 스크린에서 음성 결과를 특징으로 한다.
본 발명의 방법의 또 다른 장점은 안전성 약리학 연구에서 실연된 바와 같이 불리한 심혈관, 호흡기 또는 중추 신경계 효과가 없다는 것이다. 또한, 래트 및 개에서의 28일 독성 연구에서 높은 치료 지수, 예를 들어, NOAEL (관찰가능한 역효과가 없는 수준: no observable adverse effect level) ≫ 10 μM이 실연되었다. 이는 노출된 군과 이의 적합한 대조군 사이에 독성학적 효과의 빈도 또는 중증도에서의 통계학적으로 또는 생물학적으로 유의한 증가가 없는 화학물질의 가장 높은 실험 용량이다. 역효과는 전체 생물의 수행능력에 영향을 미칠 수 있거나 추가적인 챌린지에 응답하는 생물의 능력을 감소시키는 기능적 손상 및/또는 병리학적 병변을 초래하는 임의의 효과로서 정의된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 일련의 표준 테스트에서 비-유전자독성이다.
본 발명의 또 다른 장점은 1개 또는 2개의 PI3K 이소형에 대한 화합물 선택성이 팬-PI3K 억제 화합물에 비해 개선된 안전성 프로파일을 초래한다는 것이다. 또 다른 장점에서, 화합물 I은 양호한 표적 적용범위와 함께 약동학 프로파일이 유리하고, 글루코스 또는 인슐린 수준에 대한 역효과가 없으며, 정상적인 건강한 지원자가 통상적으로 사용되는 치료 용량을 초과하는 용량에서 이를 잘 허용한다. 본 발명의 또 다른 장점에는 본원의 실시예에서 실연되는 바와 같이 광범위한 혈액 종양을 치료하는 능력이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 것에 대해 지시된다. 특정 실시양태에서, 암은 혈액 종양이다. 구체적인 실시양태에서, 혈액 종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발 골수종 (MM), 및 비-호지킨 림프종 (NHL)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 비-호지킨 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (LDBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM) 및 림프형질세포성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
PI3K는 다수의 혈액 종양에 연루되고, 화합물 I로의 치료에 관련된 개념의 전임상 증거가 확립되어 있다. 하기의 표는 특정 혈액 종양 및 1차 환자 세포 또는 질환 세포주에 대한 작용 방법을 요약한다.
Figure pat00016
본원에서 제공되는 데이터는 본 발명의 화합물이 림프종 및 백혈병을 치료하는데 유용하다는 것을 실연한다. 림프종 및 백혈병은 일반적으로 p110의 델타 이소형을 선택적으로 발현하고, 예를 들어, 도 15는 p110δ가 대부분의 림프종 세포주에서 우세한 반면, p110α는 일반적으로 관찰되지 않음을 나타낸다. 또한, 도 16A에 제시된 데이터는 6개의 상이한 백혈병 세포주로부터의 세포 배양물이 화합물 I에 대해 민감하였고, 5-10 마이크로몰 농도의 이러한 화합물에 강하게 영향을 받았음을 나타낸다. 도 8 및 9는 화합물 I이 여러 세포주에서 Akt(Ser473) 생산을 억제한다는 것을 지지한다.
예를 들어, CLL은 신호전달 목적을 위해 주로 p110δ를, 그리고 정도는 덜하지만 p110γ를 생산하며, 따라서 p110δ 및/또는 p110γ를 억제하는 화합물이 이러한 세포들에 대한 선택적 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다. 예를 들어, 실시예 3은 예후가 불량한 환자들로부터 취해진 세포 (도 19), 및 다른 CLL 치료에 대해 저항성인 것으로 나타난 환자들로부터의 세포 (도 20)를 포함하는 CLL 세포에서 화합물 I에 대한 용량-의존적 세포독성 (도 3)을 나타낸다. 또한, 실시예 13 및 도 13은 28일 사이클 동안 50 ㎎ BID로 CLL 환자에게 투여된 화합물 I이 유의한 치료 효과를 제공함을 실연한다. 림프구에서의 ALC 농도 백분율 감소가 관찰된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물을 사용하여 약물 저항성 CLL에 걸린 CLL 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 한편으로, 실시예 17은 신호전달을 위해 p110α에 주로 의존하는 섬유모세포 세포주가 화합물 I에 대해 민감성이지 않았음을 시사한다. 따라서, 한 측면에서, 환자 선택은 신호전달을 위해 p110α에 주로 의존하는 암에 걸린 환자를 제외하는 것을 포함할 수 있다.
화학식 A의 화합물은 B-세포 및 T-세포 림프종 양쪽 모두가 포함되는 림프종을 치료하는데 또한 유용하다. 도 4의 데이터는 6개의 상이한 ALL 세포주가 화합물 I에 대해 민감성이었고, 이는 6개의 세포주 모두에서 세포 생육력에서의 유의한 감소를 초래하였음을 나타낸다.
도 12 및 실시예 12는 50 ㎎ BID의 화합물 I로 28일 동안 치료된 외투 세포 림프종 환자가 평균적으로 종양 부하에서의 44％ 감소를 경험하였음을 나타낸다. 또한, 도 14는 28일 사이클 말기의 MCL 환자가 정상적인 건강한 지원자 (NHV)에서 관찰된 것과 유사한 50 ㎎ 용량의 투여 후의 화합물 I의 혈장 수준을 경험하였음을 나타낸다; 따라서, 화합물이 치료 사이클 과정에 걸쳐 과도하게 축적되거나 환자가 치료 사이클 과정에 걸친 증가된 대사에 의해 내성이 되지 않는다.
또한, 화학식 A 또는 화학식 I의 화합물은 Akt 인산화 활성을 구성적으로 발현하는 조혈계 암을 치료하는데 유용하다. 실시예 8, 및 도 8 및 9에서 B-세포 림프종, T-세포 림프종, ALL, 악성 조직구증, DLBCL 및 AML이 포함되는, 구성적 Akt 인산화를 나타내는 암 세포주들이 열거된다. 이러한 세포가 화합물 I에 노출되면 Akt 인산화의 감소가 초래된다. 구성적 Akt 인산화가 13개의 세포주 중 13개에서 화합물 I에 의해 억제되었음을 나타내는 실시예 19를 또한 참조한다.
특정 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 구체적인 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다. 예를 들어, 도 6은 화합물 I이 2가지 유방암 세포주의 세포 증식을 감소시킴을 나타내고, 도 10은 3가지 상이한 유방암 세포주에 대한 세포독성을 도해한다. 유사하게, 도 7은 화합물 I이 2가지 난소암 세포주에 대해 세포독성임을 나타낸다.
고형 종양의 치료를 위해, p110β에 대해 양호한 활성 (예를 들어, 약 1 μM 미만, 바람직하게는 약 250 nM 미만의 IC50 - 실시예 15 참조)을 나타내는 화학식 A의 화합물을 사용하는 것이 유리한데, 이는 고형 종양이 p110δ보다는 또는 p110δ보다 많이 이러한 이소자임을 종종 이용하기 때문이다. 따라서, IC50이 약 250 nM 미만인 화학식 A의 화합물이 고형 종양의 치료에 바람직하다; 본원에서 실연되는 바와 같이 화합물 I, I", II, 또는 II"이 이러한 용도에 적절하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료의 대상체는 화학식 A의 화합물의 사용에 의해 치료가능한 것으로 본원에 기술된 상태들 중 하나 이상으로 진단된 개체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에서 지정된 암으로 진단되었고, 하나 이상의 통상적인 화학요법제로의 치료에 대해 불응성인 것으로 증명되었다. 예를 들어, 프로테아솜 억제제, 자가 줄기 세포 이식, CHOP 요법, 리툭시맙, 플루다라빈, 알렘투주맙, 통상적인 항암 뉴클레오시드 유사체 및 알킬화제와 같은 치료에 응답하지 못한 환자가 본원에 기술된 치료 방법에 빈번하게 응답한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료는 1가지 또는 1가지를 초과하는 이같은 치료가 제공된 환자에 대해 지시된다.
특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 알레르기성 비염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 류마티스 관절염이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 B-세포, 또는 B 림프구, 관련 질환에 대해 지시된다. B-세포는 자가면역 질환의 발병기전에서 역할을 한다.
화학식 A (특히 화학식 I, I", II 및 II")의 화합물은 본원에 기술된 상태의 다양한 대상체, 특히 인간에서의 혈액암을 치료하는데 적절하다. 일부 실시양태에서, 혈액 종양의 치료를 위해 선택된 대상체는 치료 후의 재발을 겪고 있는 대상체이거나, 또는 다른 치료에 대해 불응성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 다른 암 약물에 대해 저항성인 혈액 종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 높은 수준의 p110δ 활성을 나타내는 혈액 종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비교적 낮은 수준의 p110α 활성을 나타내는 혈액 종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 Akt 인산화 활성을 구성적으로 발현하는 혈액 종양의 치료를 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 대상에게 본원에 기술된 화학식 A의 화합물을 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용되는 요법과 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 "요법" 또는 "치료"는 화학식 A의 화합물의 사용을 포함하지 않는 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용되는 임의의 주지된 통상적인 또는 실험적인 형태의 치료에 의한 암 또는 자가면역 질환의 치료이다. 특정 실시양태에서, 화학식 A의 화합물과 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용되는 통상적인 또는 실험적인 요법의 조합은 조합되지 않은 치료에 의해 수득되는 결과에 비해 우수한 이롭고/이롭거나 바람직한 치료 결과를 제공한다. 특정 실시양태에서, 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용되는 요법은 당업자에게 주지되어 있고, 문헌에 기술되어 있다. 요법에는 화학요법, 및 화학요법, 생물학적 요법, 면역요법, 방사성면역요법, 및 모노클로날 항체 및 백신의 사용의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 조합 방법은 요법 투여와 동시에 또는 요법 투여 기간 동안에 투여되는 화학식 A의 화합물을 제공한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 다른 화학요법 치료와 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 조합 방법은 요법 투여 전 또는 후에 투여되는 화학식 A의 화합물을 제공한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 1가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 2가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 3가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 4가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 구성된 군으로부터 선택된 1가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 구성된 군으로부터 선택된 2가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 구성된 군으로부터 선택된 3가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 구성된 군으로부터 선택된 4가지 이상의 표준 또는 실험적 화학요법에 대해 불응성이다.
조합 투여에 관한 정확한 상세사항들은 실험적으로 결정될 수 있다. 화학식 A의 화합물을 선택된 요법과 함께 투여하는 것의 순서 및 시기결정의 개선은 개별적인 대상체, 대상체에서 치료될 상태의 성질, 및 일반적으로 주치의의 판단에 맞춰질 것이다.
실험적 또는 표준 요법의 비-제한적인 예가 하기에 기술된다. 또한, 특정 림프종의 치료가 문헌 [Cheson, B. D., Leonard, J. P., "Monoclonal Antibody Therapy for B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma" The New England Journal of Medicine 2008, 359(6), p. 613-626]; 및 [Wierda, W.G., "Current and Investigational Therapies for Patients with CLL" Hematology 2006, p. 285-294]에 검토되어 있다. 미국에서의 림프종 발생 패턴이 문헌 [Morton, L.M., et al., "Lymphoma Incidence Patterns by WHO Subtype in the United States, 1992-2001" Blood 2006, 107(1), p. 265-276]에 개요되어 있다.
비-호지킨 림프종, 특히 B 세포 기원의 비-호지킨 림프종의 치료는 모노클로날 항체, 표준 화학요법 접근법 (예를 들어, CHOP, CVP, FCM, MCP 등), 방사선면역요법, 및 이들의 조합, 특히 항체 요법과 화학요법의 통합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 접합되지 않은 모노클로날 항체의 비-제한적인 예로는 리툭시맙, 알렘투주맙, 인간 또는 인간화 항-CD20 항체, 루밀리시맙, 항-TRAIL, 베바시주맙, 갈릭시맙, 에프라투주맙, SGN-40, 및 항-CD74가 포함된다. 비-호지킨 림프종/B-세포 암의 치료에서 사용되는 실험적 항체 작용제의 비-제한적인 예로는 오파투무맙, ha20, PRO131921, 알렘투주맙, 갈릭시맙, SGN-40, CHIR-12.12, 에프라투주맙, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 밀라투주맙, 및 베바시주맙이 포함된다. 임의의 모노클로날 항체가 리툭시맙, 플루다라빈, 또는 화학요법제/요법과 조합될 수 있다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 화학요법의 표준 요법의 비제한적인 예로는 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손), FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론), CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), MCP (미톡산트론, 클로람부실, 및 프레드니솔론), R-CHOP (리툭시맙 + CHOP), R-FCM (리툭시맙 + FCM), R-CVP (리툭시맙 + CVP), 및 R-MCP (R-MCP)가 포함된다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 방사성면역요법의 비-제한적인 예로는 이트륨-90-표지 이브리투모맙 티욱세탄, 및 요오드-131-표지 토시투모맙이 포함된다. 이러한 치료제들은 재발 또는 불응성 소포성 또는 저등급 림프종에 걸린 대상체에서의 사용에 대해 승인되어 있다.
외투 세포 림프종에 대한 치료적 처치에는 조합 화학요법 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손), 하이퍼CVAD (과분별화 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 시타라빈) 및 FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론)이 포함된다. 또한, 이러한 요법들에 모노클로날 항체 리툭시맙 (리툭산(Rituxan))이 보충되어 조합 요법 R-CHOP, 하이퍼CVAD-R, 및 R-FCM이 형성될 수 있다. 기타 접근법은 상기 언급된 요법들 중 임의의 것을 줄기 세포 이식 또는 ICE (이포스파미드, 카르보플라틴 및 에토포시드)로의 치료와 조합하는 것을 포함한다.
외투 세포 림프종 치료에 대한 또 다른 접근법은 면역요법 예컨대 리툭시맙 (리툭산)과 같은 모노클로날 항체를 사용하는 것을 포함한다. 리툭시맙은 변연대 림프종, WM, CLL 및 소림프구성 림프종이 포함되는 다른 무통성 B-세포 암에 대해 또한 효과적이다. 리툭시맙과 화학요법제의 조합물이 특히 효과적이다. 변형된 접근법은 모노클로날 항체가 방사성동위원소 입자와 조합된 방사성면역요법, 예컨대 요오드-131 토시투모맙 (벡사르®) 및 이트륨-90 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®)이다. 또 다른 예에서, 벡사르®가 CHOP와의 순차적 치료에서 사용된다. 또 다른 면역요법 예는 개별적인 환자의 종양의 유전적 구성을 기초로 하는 암 백신을 사용하는 것을 포함한다. 림프종 백신의 예는 GTOP-99 (마이백스(MyVax)®)이다.
외투 세포 림프종을 치료하는 것에 대한 또 다른 접근법은 고용량 화학요법과 커플링된 자가 줄기 세포 이식이다.
외투 세포 림프종을 치료하는 것에 대한 또 다른 접근법은 프로테아솜 억제제, 예컨대 벨케이드® (보르테조밉 또는 PS-341), 또는 항-혈관형성 작용제, 예컨대 탈리도미드를, 특히 리툭산과 조합하여, 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 치료 접근법은 Bcl-2 단백질의 분해를 일으키고 화학요법에 대한 암 세포 민감도를 증가시키는 약물, 예컨대 오블리메르센 (제나센스(Genasense))를 다른 화학요법제와 조합하여 투여하는 것이다. 또 다른 치료 접근법은 세포 성장의 억제 및 심지어 세포 사망을 일으킬 수 있는 mTOR 억제제를 투여하는 것을 포함한다; 비-제한적인 예는 템시롤리무스(Temsirolimus) (CCI-779), 및 템시롤리무스와 리툭산®, 벨케이드® 또는 기타 화학요법제의 조합물이다.
MCL에 대한 다른 최근의 요법이 문헌 [Nature Reviews; Jares, P. 2007]에 개시되어 있다. 비-제한적인 예로는 플라보피리돌(Flavopiridol), PD0332991, R-로스코비틴 (셀리실립(Selicilib), CYC202), 스티릴 술폰, 오바토클락스(Obatoclax) (GX15-070), 트레일(TRAIL), 항-트레일 DR4 및 DR5 항체, 템시롤리무스 (CCI-779), 에베롤리무스(Everolimus) (RAD001), BMS-345541, 쿠르쿠민(Curcumin), 보리노스탯(Vorinostat) (SAHA), 탈리도미드(Thalidomide), 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®, CC-5013), 및 젤다나마이신(Geldanamycin) (17-AAG)이 포함된다.
발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 치료하기 위해 사용되는 기타 치료의 비-제한적인 예로는 페리포신, 보르테조밉 (벨케이드®), 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2-항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄패쓰-1H, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2-1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료적 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 멘사, 재조합 인터루킨-12, 재조합 인터루킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스탯, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포푼진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 요오드 I-131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 및 PEG화 리포솜형 독소루비신 히드로클로라이드, 및 이들의 임의의 조합물이 포함된다.
미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 약물 요법을 치료하기 위해 사용되는 기타 치료제의 비-제한적인 예 (문헌 [Blood 2005 Abramson, J.])로는 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 항-CD20 모노클로날 항체, 에토포시드, 블레오마이신, 발덴스트롬에 대해 열거된 작용제들 중 다수, 및 이들의 임의의 조합, 예컨대 ICE 및 R-ICE가 포함된다.
발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 치료하기 위해 사용되는 치료적 시술의 비-제한적인 예로는 말초 혈액 줄기 세포 이식, 자가 조혈 줄기 세포 이식, 자가 골수 이식, 항체 요법, 생물학적 요법, 효소 억제제 요법, 전신 방사선조사, 줄기 세포 주입, 골수 파괴 + 줄기 세포 보조, 시험관내-처리 말초 혈액 줄기 세포 이식, 제대혈 이식, 면역효소 기술, 약리학적 연구, 저-LET 코발트-60 감마선 요법, 블레오마이신, 통상적인 수술, 방사선 요법, 및 비-골수파괴성 동종이형 조혈 줄기 세포 이식이 포함된다.
만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위해 사용되는 기타 치료제의 비-제한적인 예 (문헌 [Spectrum, 2006, Fernandes, D.])로는 클로람부실(Chlorambucil) (류케란(Leukeran)), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide) (실록산(Cyloxan), 엔독산(Endoxan), 엔독사나(Endoxana), 시클로스틴(Cyclostin)), 플루다라빈(Fludarabine) (플루다라(Fludara)), 펜트스타틴(Pentstatin) (니펜트(Nipent)), 클라드리빈(Cladribine) (레우스타린(Leustarin)), 독소루비신(Doxorubicin) (아드리아마이신®, 아드리블라스틴(Adriblastine)), 빈크리스틴(Vincristine) (옹코빈(Oncovin)), 프레드니손(Prednisone), 프레드니솔론(Prednisolone), 알렘투주맙(Alemtuzumab) (캄패쓰, 맵캄패스(MabCampath)), 발덴스트롬에 대해 열거된 작용제들 중 다수, 및 화학요법과 화학면역요법의 조합 (통상적인 조합 요법인 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손); R-CVP (리툭시맙-CVP); ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드); R-ICE (리툭시맙-ICE); FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙); 및 FR (플루다라빈, 리툭시맙) 포함)이 포함된다.
특정 실시양태에서, 방법은 I 또는 II의 화합물에 더하여 상기 환자에게 상기 환자에서 상기 암 또는 자가면역 질환을 치료하도록 선택된 치료적 유효량의 하나 이상의 치료제 및/또는 치료적 시술을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 I 또는 II의 화합물에 더하여 상기 환자에게 a) CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손); b) R-CHOP (리툭시맙-CHOP); c) 하이퍼CVAD (과분별화 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 시타라빈); d) R-하이퍼CVAD (리툭시맙-하이퍼CVAD); e) FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론); f) R-FCM (리툭시맙, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론); g) 보르테조밉 및 리툭시맙; h) 템시롤리무스 및 리툭시맙; i) 템시롤리무스 및 벨케이드®; j) 요오드-131 토시투모맙 (벡사르®) 및 CHOP; k) CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손); 1) R-CVP (리툭시맙-CVP); m) ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드); n) R-ICE (리툭시맙-ICE); o) FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙); 및 p) FR (플루다라빈, 리툭시맙)로 구성된 군으로부터 선택된 치료제들의 조합물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 화합물은 당업계에 주지된 통상적으로 이해되는 제형 기술을 사용하여 동물 대상에 대한 투여를 위해 제형될 수 있다. 특정 투여 방식 및 화학식 A의 화합물에 적절한 제형을 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 확인할 수 있다.
본 발명의 화합물은 전구약물의 형태, 즉, 대상에게의 투여 후 본 발명의 화합물을 방출하는 보호된 형태로 제조될 수 있다. 전형적으로, 보호기가 체액 내에서, 예컨대 혈류 내에서 가수분해되어 활성 화합물을 방출하거나, 또는 생체 내에서 산화 또는 환원되어 활성 화합물을 방출한다. 전구약물에 관한 논의가 문헌 [Smith and Williams Introduction to the Principles of Drug Design. Smith, H.J.; Wright, 2nd ed., London (1988)]에서 확인된다.
본 발명의 화합물은 순수한 화학물질로 투여될 수 있지만, 전형적으로는 제약 조성물 또는 제형 형태로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 화학식 A의 화합물 및 생체적합성(biocompatible) 제약 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 조성물은 부형제(들) 또는 기타 제약상 허용되는 담체와 혼합된 화학식 A의 화합물을 유일한 활성 모이어티(moiety)로서 또는 다른 작용제, 예컨대 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 올리고- 또는 폴리펩티드, 약물, 또는 호르몬과 조합하여 포함할 수 있다. 담체 및 기타 성분은 제형의 다른 성분과 혼화성이고 이의 수용자에게 해롭지 않은 한 제약상 허용되는 것으로 간주될 수 있다.
제약 조성물은 적절한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제형되고, 제약상 사용될 수 있는 제제 내로의 활성 화합물의 프로세싱을 용이하게 하는 부형제 및 보조물을 임의적으로 포함할 수 있다. 투여 양식이 일반적으로 담체의 성질을 결정한다. 예를 들어, 비경구 투여를 위한 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 비경구 투여에 적절한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물 및 기타 생리학적으로 적합한 용액으로부터 선택될 수 있다. 비경구 투여용으로 바람직한 담체는 생리학적으로 친화성인 완충제 예컨대 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액, 또는 생리학적으로 완충된 염수이다. 조직 또는 세포 투여를 위해, 투과될 특정 장벽에 대해 적합한 침투제가 제형에서 사용된다. 이같은 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 단백질을 포함하는 제제에 대해, 제형은 안정화 물질, 예컨대 폴리올 (예를 들어, 수크로스) 및/또는 계면활성제 (예를 들어, 비-이온성 계면활성제) 등을 포함할 수 있다.
별법적으로, 비경구 용도의 제형은 적합한 유성 주사 현탁액으로 제조된 활성 화합물의 분산액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클에는 지방유, 예컨대 참기름, 및 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜이 포함된다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 적절한 안정화제 또는 제제가 고도로 농축된 용액이도록 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 또한 함유할 수 있다. 활성 작용제의 pH-민감성 용해 및/또는 지속적인 방출을 제공하는 수성 중합체, 예를 들어, 메타크릴산 중합체, 예컨대 롬 아메리카 인코포레이티드(Rohm America Inc.) (미국 뉴저지 피스카터웨이)로부터 입수가능한 유드라짓(Eudragit)® 시리즈가 코팅제 또는 매트릭스 구조물로서 또한 사용될 수 있다. 에멀션, 예를 들어, 수중유 또는 유중수 분산액이 또한 사용될 수 있고, 임의적으로는 유화제 또는 분산제 (계면 활성 물질; 계면활성제)에 의해 안정화된다. 현탁액은 현탁제 예컨대 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천, 트라가칸트 검, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
화학식 A의 활성 화합물을 함유하는 리포솜이 비경구 투여용으로 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 리포솜은 인지질 또는 기타 지질 물질로부터 유도된다. 리포솜 형태의 조성물은 다른 성분, 예컨대 안정화제, 방부제, 부형제 등을 또한 함유할 수 있다. 바람직한 지질에는 천연 및 합성 양쪽 모두의 인지질 및 포스파티딜 콜린 (레시틴)이 포함된다. 리포솜의 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Prescott (Ed.), Methods in Cell Biology, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, New York (1976)] 참조.
경구 투여에 적절한 투여량으로 화학식 A의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 당업계에 주지된 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제형할 수 있다. 경구 투여용으로 제형된 제제는 정제, 알약, 캡슐, 카세(cachet), 당의정, 로젠지(lozenge), 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 또는 분말의 형태일 수 있다. 설명하자면, 활성 화합물을 고체 부형제와 함께 조합하고, 생성된 혼합물을 임의적으로 분쇄하고, 원한다면 적절한 보조물을 첨가한 후, 과립들의 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어(core)를 수득함으로써 경구 사용을 위한 제약 제제를 수득할 수 있다. 경구 제형은 비경구 용도에 대해 기술된 것들과 유형 면에서 유사한 액체 담체, 예를 들어, 완충 수용액, 현탁액 등을 사용할 수 있다.
바람직한 경구 제형에는 정제, 당의정 및 젤라틴 캡슐이 포함된다. 이러한 제제는 하기의 것들이 비-제한적으로 포함되는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다:
a) 희석제, 예컨대 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨이 포함되는 당;
b) 결합제, 예컨대 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 옥수수, 밀, 쌀, 감자 등으로부터의 전분;
c) 셀룰로스 물질, 예컨대 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 및 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 검, 예컨대 아라비아 검 및 트라가칸트 검, 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐;
d) 붕해 또는 가용화 작용제 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 전분, 한천, 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨, 또는 비등성 조성물;
e) 윤활제, 예컨대 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및 폴리에틸렌 글리콜;
f) 풍미제 및 감미료;
g) 예를 들어, 제품 식별 또는 활성 화합물의 양 (투여량) 특성화를 위한, 착색제 또는 안료; 및
h) 기타 성분, 예컨대 방부제, 안정화제, 팽윤제, 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염, 및 완충제.
일부 바람직한 경구 제형에서, 제약 조성물은 상기 (a) 군으로부터의 1개 이상의 물질, 또는 상기 (b) 군으로부터의 1개 이상의 물질, 또는 상기 (c) 군으로부터의 1개 이상의 물질, 또는 상기 (d) 군으로부터의 1개 이상의 물질, 또는 상기 (e) 군으로부터의 1개 이상의 물질을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 상기 (a)-(e) 군으로부터 선택된 2개의 군 각각으로부터의 1개 이상의 물질을 포함한다.
젤라틴 캡슐에는 젤라틴으로 제조된 압입형(push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 코팅제 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 밀봉형 연질 캡슐이 포함된다. 압입형 캡슐은 충전제, 결합제, 윤활제, 및/또는 안정화제 등과 혼합된 활성 성분(들)을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 화합물이 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 적절한 유체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 내에 용해 또는 현탁될 수 있다
당의정 코어에 적절한 코팅제 예컨대 진한 당 용액이 제공될 수 있고, 이는 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 또한 함유할 수 있다.
제약 조성물은 활성 화합물의 염으로서 제공될 수 있다. 염은 수성 또는 기타 양성자성 용매에서 상응하는 유리 산 또는 염기 형태보다 더 가용성인 경향이 있다. 제약상 허용되는 염이 당업계에 주지되어 있다. 산성 모이어티를 함유하는 화합물은 적절한 양이온과 함께 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적절한 제약상 허용되는 양이온에는, 예를 들어, 알칼리금속 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨) 및 알칼리토금속 (예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 양이온이 포함된다.
염기성 모이어티를 함유하는 화학식 A의 화합물은 적절한 산과 함께 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berge, et al., J. Pharm Sci, 66:1 (1977)]에 제약상 허용되는 염이 상세하게 기술되어 있다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 원위치에서 제조될 수 있거나, 또는 유리 염기 관능기를 적절한 산과 반응시킴으로써 별도로 제조될 수 있다.
대표적인 산 부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포롤술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트 (이소티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트 또는 술페이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트 또는 히드로겐 포스페이트, 글루타메이트, 바이카르보네이트, p-톨루엔술포네이트 및 운데카노네이트가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 제약상 허용되는 산 부가염을 형성하도록 사용될 수 있는 산의 예로는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산, 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산이 비-제한적으로 포함된다.
염기성 질소를 함유하는 기가 저급 알킬 할로겐화물 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디알킬 술페이트 예컨대 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 술페이트; 장쇄 알킬 할로겐화물 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 아릴알킬 할로겐화물 예컨대 벤질 및 페네틸 브로마이드; 및 기타 등등과 같은 작용제로 4급화될 수 있다. 이에 의해, 용해도 또는 분산성이 변형된 생성물이 수득된다.
제약상 허용되는 담체 내에 제형된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적합한 용기 내에 놓고, 지시된 상태의 치료용으로 표지할 수 있다. 따라서, 투약 형태의 본 발명의 화합물 및 화합물의 사용을 위한 설명서를 함유하는 표지를 포함하는 용기와 같은 제조품이 또한 구현된다. 키트가 본 발명에서 또한 구현된다. 예를 들어, 키트가 투약 형태의 제약 조성물, 및 의학적 상태의 치료에서의 조성물의 사용을 위한 설명서를 함유하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 어느 쪽이든, 표지 상에 지시된 상태는 염증성 장애, 암 등의 치료를 포함할 수 있다.
투여 방법
화학식 A의 화합물을 포함하는 제약 조성물은 비경구 및 장 기술이 포함되는 임의의 통상적인 방법에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 비경구 투여 양식에는 조성물이 위장관을 통과하는 경로 이외의 경로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 척수내, 근육내, 관절내, 경막내 및 심실내 주사에 의해 투여되는 양식이 포함된다. 장 투여 양식에는, 예를 들어, 경구 (구강 및 설하 포함) 및 직장 투여가 포함된다. 경상피 투여 양식에는, 예를 들어, 경점막 투여 및 경진피 투여가 포함된다. 경점막 투여에는, 예를 들어, 장 투여, 뿐만 아니라 비강 투여, 흡입 투여 및 심폐 투여; 질 투여; 및 직장 투여가 포함된다. 경진피 투여에는 패치 및 이온도입(iontophoresis) 기구, 뿐만 아니라 페이스트, 고약 또는 연고의 국소 도포가 예를 들어 포함되는 수동 및 능동 경진피 또는 경피 양식이 포함된다. 고압 기술, 예를 들어, 파우더젝트(POWDERJECT)™를 사용하여 비경구 투여가 또한 달성될 수 있다.
수술 기술에는 디포(depot) (저장소) 조성물의 이식, 삼투압 펌프 등이 포함된다. 염증 치료를 위한 바람직한 투여 경로는 관절염과 같은 국소 장애를 위한 국소적 또는 국부적 전달, 또는 광범위한 장애를 위한 전신 전달, 예를 들어, 재관류 손상 또는 패혈증과 같은 전신성 상태를 위한 정맥내 전달일 수 있다. 호흡관이 수반되는 질환, 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 및 폐기종이 포함되는 기타 질환에 대해, 스프레이, 에어로졸, 분말 등의 흡입 또는 심폐 투여에 의해 투여가 달성될 수 있다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술의 시행 전, 동안 또는 후에 투여된다. 선택된 제형 및 투여 경로는 개별적인 대상체, 대상체에서 치료될 상태의 성질, 및 일반적으로 주치의의 판단에 맞춰질 것이다.
세포를 암 세포인 것으로 확인시키는 마커를 발현하는 암 세포에 대한 표적화된 전달을 위해 화합물을 변형 또는 유도체화시킴으로써 화학식 A의 화합물의 치료 지수가 강화될 수 있다. 예를 들어, 기존에 기술된 바와 같이, 화합물이 암 세포에 근접하여 자신의 효과를 국소적으로 발휘하도록, 암 세포에 대해 선택적이거나 특이적인 마커를 인식하는 항체에 화합물을 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pietersz, et al., Immunol Rev, 129:57 (1992)]; [Trail, et al., Science, 261:212 (1993)]; 및 [Rowlinson-Busza, et al., Curr Opin Oncol, 4:1142 (1992)] 참조). 이러한 화합물의 종양에 대해 지시된 전달은, 특히 방사선조사 치료 또는 화학요법으로부터 초래될 수 있는 잠재적인 비-특이적 독성을 최소화함으로써, 치료 이점을 강화한다. 또 다른 측면에서, 화학식 A의 화합물 및 방사성동위원소 또는 화학요법제가 동일한 항-종양 항체에 접합될 수 있다.
작용제 자체 및 작용제의 제형의 특성이 투여되는 작용제의 물리적 상태, 안전성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 소거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 이같은 약동학 및 약역학 정보를 전임상 시험관내 및 생체내 연구를 통해 수집한 후, 임상 시험 과정 중에 인간에서 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량을 먼저 생화학적 및/또는 세포-기반 분석법으로부터 추정할 수 있다. 그후, 투여량을 동물 모델에서 제형하여, 특정 PI3K 이소형 또는 이소형들의 조합물의 발현 또는 활성을 조정하는 바람직한 혈중 농도 범위를 달성한다. 인간 연구를 수행함에 따라, 다양한 질환 및 상태를 위한 적합한 투여량 수준 및 치료 기간에 관하여 추가적인 정보들이 판명될 것이다.
본 발명의 화합물이 잘 허용되지만, 치료 투여량에 대한 한계의 예는 상승된 간 기능 테스트 (LFT)이다. LFT는 환자의 혈청 또는 혈장에 대한 표준 임상 생화학 테스트를 수반하여, 환자의 간의 상태에 관한 정보를 제공한다. 정상 범위를 벗어나는, 알라닌 트랜스아미나제(transaminase), 아스파테이트 트랜스아미나제, 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 빌리루빈, 및 감마 글루타밀 트랜스펩티다제(transpeptidase)와 같은 수준이 가능한 간 독성을 신호할 수 있다. 상승된 간 기능 테스트 값 및 이어지는 간 독성에 대한 가능성을 피하거나 감소시키기 위해 치료 화합물의 투약이 조정될 수 있다. 예를 들어, 대상에게 증가되는 용량의 화합물을 투여할 수 있다. 특정 용량에서, 대상체에서 정상 범위를 벗어나는 LFT 수준 상승이 발달되기 시작하여, 이러한 투여량에서 잠재적인 간 독성을 신호한다. 이에 응답하여, LFT 수준이 치료 의사가 판단 시 허용가능한 범위, 예를 들어, 치료될 대상에 대해 정상인 범위 내이거나 정상의 약 25％ 내지 50％ 이내인 수준으로 감소되도록 하는 양으로 투여량이 감소될 수 있다. 따라서, 간 기능 테스트를 사용하여 화합물의 투여량을 적정할 수 있다.
예를 들어, LD50 (집단의 50％에 대해 치사성인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 이같은 화합물의 독성 및 치료 효능을 표준 제약 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 이는 전형적으로 LD50/ED50 비율로 표현된다. 큰 치료 지수를 나타내는, 즉 독성 용량이 유효 용량보다 실질적으로 더 높은 화합물이 바람직하다. 이같은 세포 배양 분석법 및 추가적인 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간 용도를 위한 투여량 범위를 제형하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는 이같은 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 혈중 농도의 범위 내이다.
치료-관련 독성 증상들에 의해 투여량이 제한될 수 있다. 상승된 간 기능 테스트 이외의 이같은 증상에는 빈혈, 시력 혼탁, 설사, 구토, 피로, 점막염, 말초 부종, 발열, 말초 신경병증, 흉막 삼출, 야간 발한, 및 좌위호흡, 또는 이들의 조합이 포함된다. 특정 용량에서, 대상체에서 허용불가능한 수준의 이같은 증상이 발달되면, 유해 사례가 제거되고 더 이상 유해하지 않도록 투여량이 감소될 수 있거나, 또는 치료 의사가 판단 시 허용가능한 수준으로 투여량이 감소될 수 있다.
환자에 대한 화합물의 적합한 용량을 결정하는 것에서의 또 다른 고려사항은 혈장 내에서 순환되고 있는 원하는 농도이다. 특정 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/㎖이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 75-2,000 ng/㎖이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 500-2,000 ng/㎖이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/㎖이며, 이때 화합물은 화학식 I, I", II, 또는 II"의 화합물이고, 약 50 ㎎, 100 ㎎, 또는 200 ㎎의 양으로 경구 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/㎖이며, 이때 화합물은 화학식 I의 화합물이고, 약 50 ㎎, 100 ㎎, 또는 200 ㎎의 양으로 경구 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 내의 화합물의 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/㎖이며, 이때 화합물은 화학식 II의 화합물이고, 약 50 ㎎, 100 ㎎, 또는 200 ㎎의 양으로 경구 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 혈장 내의 최대 농도가 투여로부터 2시간 이내에 달성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8시간 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 10 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 일으키도록, 그리고 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 피크 혈장 농도를 일으키도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8시간 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 100 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 일으키도록, 그리고 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 피크 혈장 농도를 일으키도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8시간 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 200 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 일으키도록, 그리고 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 피크 혈장 농도를 일으키도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 화합물의 최저(trough) 농도가 치료 효과, 예컨대 암 세포의 아폽토시스가 관찰되는 범위 내인 혈장 농도를 일으키도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 혈장 내의 PI3Kδ 이소형 활성화 EC50 이상의 최저 혈장 농도를 일으키도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 12시간 이상의 기간 동안 세포 내에서 PI3Kδ 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 PI3Kγ 활성화에 대한 EC50 수준 미만인 최저 혈액 농도를 일으키도록 선택된다. 예를 들어, 전혈 혈장 내에서 PI3K δ 호염기구 활성화에 대한 EC50 값이 65 nM이고, PI3K γ 호염기구 활성화에 대한 EC50 값이 1100 nM이면, 선택된 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 8-12시간의 기간 동안 60 nM 내지 1100 nM의 화합물의 최저 혈장 농도를 제공한다. 유사하게, PI3Kδ 호염기구 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 PI3K -α, -β 또는 -γ 호염기구 활성화에 대한 EC50 수준 미만인 최저 혈액 농도를 일으키도록 투여량이 선택될 수 있다. 당업자는 생체 내에서의 PI3K 이소형 활성화 또는 억제에 대한 EC50 값을 결정할 수 있다. 별법적인 실시양태에서, 약물의 최저 농도의 상위 범위는 혈장 내의 PI3K -γ, -α, 또는 -β 이소형의 EC50 값을 초과할 수 있고, 이에 의해 한정되지 않는다. 또한, 약물의 혈액 농도 범위는 혈액 종양을 치료하는데 있어서 치료적으로 이로운 한편, 바람직하지 않은 부작용을 최소화하는 수준이다.
예를 들어, 델타-선택적인 한편, 화합물은 임상적으로 유용하도록, 즉 신호전달을 위해 p110γ에 의존하는 암에 대해 효과적이도록 p110γ에 대해 충분한 활성을 나타낼 수 있는데, 이는 다른 이소형, 특히 알파 이소형에 비교하여 여전히 선택적이면서 p110γ의 억제를 위한 유효 투여량을 초과하는 혈장 수준이 달성될 수 있기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화합물의 투여량은 p110δ 및 p110γ를 선택적으로 억제하는데 효과적인 혈액 농도를 초래하도록 선택된다.
일부 실시양태에서, 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 8시간 내지 12시간의 기간 동안 65 nM 내지 1100 nM의 최저 혈장 농도를 제공한다. 일부 상기 실시양태에서, 상기 기간은 화합물 투여로부터 12시간 이상이다.
특정 실시양태에서, 치료적 유효량으로 화합물이 투여된다.
특정 실시양태에서, 20-500 ㎎/일의 용량으로 화합물이 투여된다. 특정 실시양태에서, 50-250 ㎎/일의 용량으로 화합물이 투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물은 25 내지 150 ㎎/용량의 용량으로 투여되고, 하루에 2회 용량이 투여된다 (예를 들어, 25 내지 150 ㎎ 용량으로 BID 투약). 바람직한 실시양태에서, 대상체는 하루에 2번 50 ㎎ 내지 100 ㎎의 화학식 A의 화합물로 치료된다.
특정 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 처음에는 매일 20-500 ㎎ 용량의 화합물을 투여하는 단계 및 임상 효능이 달성될 때까지 상기 용량을 점진적으로 증가시키는 단계를 포함한다. 약 25, 50, 또는 100 ㎎의 증량이 용량을 증가시키는데 사용될 수 있다. 투여량은 매일, 이틀에 한번, 일주일에 2번, 또는 1주일에 1번 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 임상 효능이 달성된 용량과 동일한 용량의 화합물을 투여함으로써 또는 상기 용량을 효능이 유지될 수 있는 수준으로 점진적으로 감소시킴으로써 상기 환자를 계속 치료하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 처음에는 매일 20-500 ㎎ 용량의 화합물을 투여하는 단계 및 6일 이상에 걸쳐 상기 용량을 50-400 ㎎/일의 총 투여량으로 증가시키는 단계를 포함한다. 임의적으로, 투여량이 약 750 ㎎/일로 추가로 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화합물은 매일 2회 이상 투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물은 경구적으로, 정맥 내로 또는 흡입에 의해 투여된다. 바람직하게는, 화합물이 경구 투여된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 약 50 ㎎ BID의 투여량 또는 약 100 ㎎ BID의 투여량으로 경구 투여된다.
본 발명의 방법을 위해, 투약 시기 및 순서를 조절하는 임의의 효과적인 투여 처방계획이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 작용제의 용량은 유효량의 작용제를 포함하는 제약 투여량 단위를 포함한다. 본원에서 사용된 "유효량"은 하나 이상의 제약 투여량 단위의 투여를 통해 PI3Kδ 발현 또는 활성을 조정하고/하거나 대상의 생리학적 파라메터에서의 측정가능한 변화를 유도하는데 충분한 양을 지칭한다. "유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 완화시키는데 필요한 양을 또한 지칭할 수 있다.
화학식 A의 화합물에 대한 적절한 투여량 범위는 이러한 고려사항들에 따라 변하지만, 일반적으로, 화합물은 체중 1 ㎏ 당 10.0 ㎍ - 15 ㎎; 체중 1 ㎏ 당 1.0 ㎍ - 10 ㎎/㎏, 또는 체중 1 ㎏ 당 0.5 ㎎ - 5 ㎎의 범위로 투여된다. 따라서, 전형적인 70 ㎏의 인간 대상에 대해, 투여량 범위는 1회 분량 당 700 ㎍-1050 ㎎; 70 ㎍-700 ㎎; 또는 35 ㎎-350 ㎎이고, 하루에 2회 이상의 용량이 투여될 수 있다. 투여량은, 예를 들어, 정맥내 투여와 비교하여, 화합물이 경구 또는 경피 투여되는 경우에 더 높을 수 있다. 화학식 A의 화합물의 감소된 독성은 비교적 높은 용량의 치료적 투여를 허용한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 750 ㎎/일까지의 본 발명의 화합물의 경구 투여가 적절하다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 50 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 100 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 200 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 350 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 백혈병, 림프종 및 다발 골수종의 치료를 위해, 하루에 1회 또는 바람직하게는 2회 경구 투여되는, 1회 분량 당 약 50-350 ㎎의 투여량이 종종 적절하다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 750 ㎎/일까지의 화합물 I" 또는 II"의 경구 투여가 적절하다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 50 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 100 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 200 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 350 ㎎ BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 백혈병, 림프종 및 다발 골수종의 치료를 위해, 하루에 1회 또는 바람직하게는 2회 경구 투여되는, 1회 분량 당 약 50-350 ㎎의 화학식 I" 또는 II"의 화합물의 투여량이 종종 적절하다.
화합물은 단일 볼루스(bolus) 용량으로, 정맥내 또는 경피 투여에서와 같이 경시적인 용량으로, 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다.
7일 이상 동안 투약이 계속될 수 있다. 일부 실시양태에서, 매일 투약하는 것이 약 28일 동안 계속된다. 일부 실시양태에서, 투약이 약 28일 동안 계속된 후, 7일 이상 동안 중단된다. 일부 실시양태에서, 완전한 사이클은 28일 동안 계속 매일 투약하는 것이다. 각각의 사이클 후 환자에서의 임상 응답의 평가를 측정할 수 있다. 임상 결과를 사용하여 투여량을 증가시킬지, 감소시킬지, 중단할지 또는 유지할지 결정할 수 있다.
투여 경로에 따라, 적절한 용량을 체중, 체표면적, 또는 장기 크기에 따라 계산할 수 있다. 최종 투여량 처방계획은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 요인, 예를 들어, 작용제의 특이적 활성, 질환 상태의 정체 및 중증도, 환자의 응답성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 및 임의의 감염의 중증도를 고려하여, 양질의 의료의 관점에서 주치의에 의해 결정될 것이다. 고려할 수 있는 추가적인 요인에는 투여 시간 및 빈도, 약물 조합, 반응 민감도, 및 치료에 대한 내성/응답이 포함된다. 임의의 본원에 언급된 제형을 수반하는 치료에 적합한 투여량의 추가적인 개선은, 특히 개시된 투여량 정보 및 분석법, 뿐만 아니라 인간 임상 시험에서 관찰된 약동학 데이터의 견지에서, 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 일상적으로 수행된다. 적합한 투여량은 용량 응답 데이터와 함께 체액 또는 기타 샘플 내의 작용제의 농도를 결정하기 위한 확립된 분석법의 사용을 통해 확인될 수 있다.
투약 빈도는 화학식 A의 화합물의 약동학 파라메터 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하도록 또는 원하는 효과를 유지하도록 투여량 및 투여가 조정된다. 따라서, 제약 조성물은 화합물의 원하는 최소 수준을 유지하는데 필요한 대로 단일 용량, 분리된 다중 용량, 연속 주입, 지속 방출 디포, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다. 단기 작용 제약 조성물 (즉, 짧은 반감기)은 하루에 1회 또는 하루에 1회 초과 (예를 들어, 하루에 2회, 3회, 또는 4회)로 투여될 수 있다. 장기 작용 제약 조성물은 3일 내지 4일마다, 일주일마다, 또는 2주에 1번 투여될 수 있다. 펌프, 예컨대 피하, 복강내 또는 경막하 펌프가 연속 주입에 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에 유리하게 응답할 대상에는 의학적 및 수의학적 대상체가 포함되고, 일반적으로 인간 환자가 포함된다. 본 발명의 방법이 유용한 기타 대상에는 고양이, 개, 대형 동물, 조류 예컨대 닭이 있다. 일반적으로, 화학식 A의 화합물이 이로울 임의의 대상체가 본 발명의 방법의 투여에 적합하다. 일부 상기 실시양태에서, 환자는 del(17p) 또는 del(11q)의 세포유전학적 특성이 있다. 일부 상기 실시양태에서, 환자는 림프절병에 걸린 환자이다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 환자에서의 림프절병의 크기를 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 10％ 만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 25％ 만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 30％ 만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 40％ 만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 50％ 만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1회의 치료 사이클 후 림프절병의 크기를 적어도 75％ 만큼 감소시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 I, II의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 치료제를 상태의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 상태가 암 또는 자가면역 상태인, 상태의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 치료제는 프로테아솜 억제제이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 치료제는 보르테조밉이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 상태는 혈액 종양이다. 바람직한 실시양태에서, 상태는 다발 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B-세포 ALL, T-세포 ALL 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 S-거울상이성질체로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 95％ 이상의 S-거울상이성질체를 포함한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 상기 화합물 및 치료제의 투여는 화합물과 치료제의 조합 없이 수득되는 결과보다 우월한 상승작용적인 이점을 제공한다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하지만 이를 한정하지는 않도록 제공된다. 하기의 실시예에서, '화학식 I의 화합물' 또는 '화학식 I'에 대한 언급은 여기에서 제시된 S-거울상이성질체를 지칭하고, 이러한 실시예에서 사용된 샘플은 키랄(chiral) HPLC 방법에 의해 측정시 98.2％ee를 나타냈다:
Figure pat00017
또한, 이러한 화합물의 분석은 물질의 하기의 특성들을 나타냈다:
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
실시예 1
MM 세포에서의 세포 성장의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 다발 골수종 (MM) 세포에서 시토카인 (IGF-1 및 IL-6)의 세포 성장 자극 효과를 억제한다는 것을 실연한다. LB 세포 (골수단구성 골수종 세포주)를 48시간 동안 대조군 배지와 함께; 화학식 I의 화합물과 함께 IL-6 또는 IGF-1의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. MM 세포 성장에 대한 화학식 I의 화합물의 억제 효과를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라소듐 브로마이드 (MTT; 케미콘 인터내셔날(Chemicon International)) 염료 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. 48시간 배양의 마지막 4시간 동안 각각의 웰에 대해 10 ㎕의 5 ㎎/㎖ MTT에 이어서 100 ㎕의 0.04 N HCl을 함유하는 이소프로판올로 세포를 펄싱(pulsing)하였다. 분광광도계 (모레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 570/630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과의 요약이 도 1에서 제시된다. 0.625 μM - 2.5 μM의 화합물 I의 노출이 세포 성장 자극 시토카인의 존재 하에서도 MM 세포 성장을 억제하였다.
실시예 2
세포독성에 대한 BMSC 의 효과
본 실시예는 골수 기질 세포 (BMSC)가 화합물 I-유도 LB 세포 세포독성으로부터 보호하지 않는다는 것을 실연한다. LB 세포를 대조군 배지와 함께, 그리고 화학식 I의 화합물과 함께 48시간 동안 BMSC의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. [3H]-티미딘 흡수 분석법을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 모든 데이터는 3중 실험의 평균 (± SD)을 나타낸다. 결과의 요약이 도 2에서 제시된다. LB 세포 성장이 BMSC의 존재 하에서도 0.625 μM - 10 μM의 화합물 I에의 노출 후에 감소되었다.
실시예 3
CLL 세포의 아폽토시스에 대한 화합물의 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 환자 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 실연한다. 오하이오 주립 대학교로부터 CLL 연구 협회를 통해 B-CLL 환자로부터 말초혈을 수득하였다. 1차 CD19-양성 세포를 로제트-셉(Rosette-Sep) (스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies))을 사용하여 단리하였다. 세포를 37℃, 5％ CO2, 및 높은 습도에서 10％ 열-불활성화 소 태아 혈청, 2 mM/ℓ L-글루타민, 및 페니실린 (100 유닛/㎖)/스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖; 인비트로젠(Invitrogen))이 보충된 RPMI 1640 (인비트로젠)에서 유지시켰다. 화학식 I의 화합물 또는 배지와 함께 96시간 동안 인큐베이션한 후, 5×105개의 세포를 PBS로 세정하고 나서, 2 ㎕의 아넥신(Annexin) V-FITC 모액 (바이오휘태커 인코포레이티드(BioWhittaker, Inc)) 및 10 ㎕의 20 ㎍/㎖ PI (시그마(Sigma))를 함유하는 결합 완충제 (10 mM/ℓ HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM/ℓ NaCl, 5 mM/ℓ KCl, 1 mM/ℓ MgCl2, 1.8 mM/ℓ CaCl2) 내에 재현탁시켰다. 실온에서 10분 동안 빛-차단 구역에서 인큐베이션한 후, 팩스캔(FACScan)™ (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 유동 세포측정법에 의해 검사물을 정량하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, CLL 환자 세포를 화합물 I로 처리하면 아폽토시스가 초래되었고, 결과는 용량-의존적인 것으로 보였다.
도 19에서 데이터가 가리키는 바와 같이, 예후가 불량한 환자로부터의 CLL 세포에서 화합물 I-유도 아폽토시스가 나타났다.
도 20에 나타난 바와 같이, 화합물 I-유도 아폽토시스가 불응성/재발 환자로부터의 CLL 세포에서 효과적인 것으로 또한 나타났다.
실시예 4
ALL 세포주에서의 화합물의 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 T-ALL 및 B-ALL (급성 림프모구성 백혈병) 백혈병 세포주 양쪽 모두에서 세포 사망이 동반되는 세포 증식의 저하 및 Akt 인산화의 감소를 초래한다는 것을 실연한다. 알라마르블루(AlamarBlue) 분석법 (인비트로젠)을 사용하여 세포주의 생육력 분석법을 수행하였다. 100 ㎕ 부피의 세포 (1×106개/웰)를 96웰의 편평 바닥 플레이트 내에 놓고, 화학식 I의 화합물 (2× 최종 농도로 100 ㎕/웰) 또는 배지 단독을 플레이트에 첨가하였다. 모두 4중으로 수행하였다. 정해진 시간 (48시간) 동안 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 ㎕ 알라마르블루®를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 인큐베이션하고, 530-560 nm에서의 광학 밀도를 스펙트라맥스(SpectraMax)® M5 플레이트 판독기 2001을 사용하여 수득하였다. 세포 생육력은 처리된 세포/대조군 샘플 간의 흡광도의 백분율로서 표현되었다. 이러한 결과들이 도 4에 제시된 표에서 요약된다. 화합물 I에의 노출이 다양한 ALL 세포주에서의 세포 생육력의 실질적인 감소, 뿐만 아니라 Akt 인산화의 감소를 초래하였다.
실시예 5
ALL 세포 사이클에 대한 화합물의 효과
본 실시예는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주 CCRF-SB를 화학식 I의 화합물로 처리하면 G0/G1 세포 주기 정지가 초래된다는 것을 실연한다. 화학식 I의 화합물의 존재 하에서의 성장, 및 정상적인 성장 조건 하에서의 요오드화 프로피듐-염색 CCRF-SB 세포의 대표적인 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석. G0-G1, S, 및 G2-M 단계의 세포의 평균 백분율이 막대그래프 아래의 표에 계산되어 있다. 결과가 도 5에서 제시된다.
실시예 6
유방암 세포 증식의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 유방암 세포주의 증식을 억제한다는 것을 실연한다. T47D 및 HS-578T 세포주를 혈청 + 지시된 농도의 화학식 I의 화합물의 존재 하에 성장시켰다. 알라마르블루® 분석법 (인비트로젠) 96웰 플레이트에 의해 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 증식 분석법의 결과가 평균 세포 백분율 값으로 표현되고, 도 6에 제시된다.
실시예 7
난소암 세포주 증식의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 난소암 세포주의 증식을 억제한다는 것을 실연한다. IGROV-1 및 OVCAR-3 세포주를 혈청 + 지시된 농도의 화학식 I의 화합물의 존재 하에 성장시켰다. 알라마르블루 분석법 (인비트로젠) 96웰 플레이트에 의해 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 증식 분석법의 결과가 평균 세포 백분율 값으로 표현되고, 도 7에 제시된다.
실시예 8
Akt 인산화의 감소
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 구성적 Akt 인산화를 나타낸 조혈 종양 세포주에서 구성적 Akt 인산화를 감소시킨다는 것을 실연한다. 백혈병 및 림프종 세포주의 대형 패널을 구성적 Akt 인산화에 대해 평가하였다. 이러한 세포주들은 B-림프종, T-림프종, ALL, 악성 조직구증, DLBCL 및 AML을 나타낸다. 혈청 의존적 Akt 인산화를 나타낸 세포주를 2시간 동안 화학식 I의 화합물로 처리하였다. 그후, 세포를 용해시키고, 크기에 따라 분획화하고, 포스포-Akt(Ser473)에 대해 지시된 항체로 면역블롯팅하였다. 결과가 도 8에 제시된다. 화합물 I에의 노출 후 모든 세포주에 대해 Akt(Ser473)에서의 감소가 달성되었다.
실시예 9
DLBCL 에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 미만성 거대 B-세포 림프종 세포에서 PI3K 신호전달을 차단하고 아폽토시스를 유도한다는 증거를 제공한다. 도 26A에 제시된 바와 같이 P110δ가 DLBCL 세포주에서 발현되었다. 도 26B는 화합물 I에의 노출이 여러 DLBCL 세포주에서 pAKT 수준을 감소시켰음을 나타낸다.
실시예 10
유방암 세포에서의 아폽토시스의 유도
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 유방암 세포주에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 실연한다. HS-578T, T47D, 및 MCF7 세포를 화학식 I의 화합물 또는 상응하는 DMSO 농도로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스성 세포의 백분율을 아넥신 V-FITC/7AAD 염색에 의해 결정하였다. 왼쪽 아래: 생육성 세포 (아넥신 V-FITC/PI 음성); 오른쪽 아래: 초기 아폽토시스성 세포 (아넥신 V-FITC 양성 단독); 오른쪽 위: 중기/후기 아폽토시스 세포 (아넥신 V-FITC/7AAD 이중-양성); 및 왼쪽 위: 후기 아폽토시스성/괴사성 (7AAD 양성 단독). 왼쪽 아래 사분면 (생육성 세포)을 제외한 각각의 사분면 내의 세포의 백분율이 지시된다. 유사한 결과들을 제공한 3회의 상이한 실험 중 대표적인 1회의 실험이 도 10에서 제시된다.
실시예 11
건강한 지원자에서의 제7일의 항정 상태 혈액 수준
본 실시예는 제7일의 건강한 인간 대상의 혈액 내의 화학식 I의 화합물의 농도에 관한 데이터를 제공한다. 연구 제7일에 50, 100, 또는 200 ㎎ BID의 화학식 I의 화합물의 경구 투여 후 12시간의 기간에 걸쳐 농도를 측정하였다. 도 11은 투여로부터 12시간의 기간에 걸친 약물의 혈장 농도를 주시한다. 모든 용량에 대해 약물의 최대 농도가 2시간 이내에 달성되었다. 50, 100 또는 200 ㎎ BID의 상기 화합물의 투여는 적어도 12시간 동안 호염기구에서 PI3Kδ EC50 농도를 초과하는 농도 수준을 초래하였다.
또한, 17-400 ㎎의 화학식 I의 화합물이 건강한 지원자에게 투여된 단일 용량 연구를 수행하였다. 혈액 내의 화합물의 농도를 투여로부터 24시간에 걸쳐 측정하였고, 결과가 도 24A에서 제시된다. 약 6시간에, 투여된 모든 용량에 대한 혈액 내의 화합물 I의 농도는 약 100 nM 이상이었다. 약 12시간에, 용량 50 ㎎ 이상에 대한 혈액 내의 화합물 I의 농도는 50 nM을 초과하였다. 투여로부터 2시간 이내에 혈액 내의 화합물 I의 최대 농도가 달성되었다.
또 다른 실험에서, 평균 화합물 I 농도를 건강한 지원자 (N=6)에서 50 ㎎ BID 투약으로부터 제7일에 측정하였다. 전혈 호염기구 활성화 분석법에서 결정된 바와 같이, 평균 최저 농도는 PI3Kδ에 대한 EC50보다 높았고, 평균 피크 농도는 PI3Kγ에 대한 EC50보다 낮았다 (도 24B). 본 실시예는 50 ㎎ BID로 투여된 화합물 I의 농도 범위가 적어도 12시간 동안 전혈에서 ED50 PI3Kδ 호염기구 활성화 수준을 초과하지만 최소 ED50 PI3Kγ 호염기구 수준 활성화 수준보다 낮은 수준이라는 것을 실연한다.
하기의 표 1은 연구 대상들의 개관을 제공하고, 이때 단일 용량 (SD) 또는 다중 용량 (MD)의 화학식 I의 화합물이 다양한 양으로 대상에게 투여되었다. "n" 값은 각각의 군 내의 대상의 수를 지칭한다.
<표 1>
Figure pat00021
실시예 12
외투 세포 림프종 환자에서의 병변에 대한 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물로의 1회 (28일)의 치료 사이클 후의 외투 세포 림프종 환자의 병변 면적에 관한 데이터를 제공한다. 6개의 병변의 면적을 치료 전 및 치료 사이클 후에 측정하였다. 50 ㎎ BID의 화학식 I의 화합물의 28일의 경구 투여에 대한 응답은 치료 전의 면적과 비교하여 병변 면적의 감소를 초래하였고, 종양 부하에서의 44％ 감소를 나타냈다. 결과가 도 12에서 확인되는 막대 그래프로 요약된다.
실시예 13
치료에 대한 CLL 환자의 응답
본 실시예는 화학식 I의 화합물의 경구 투여로의 1회 (28일)의 치료 사이클 후의 CLL 환자의 혈액 내의 절대 림프구 수 (ALC)의 농도에 관한 데이터를 제공한다. 혈액 ALC 농도를 1회의 치료 사이클의 완료 후 4주 시간에 걸쳐 측정하였다. 처리 결과로서 림프구증가증에서의 55％ 감소 및 림프절병에서의 38％ 감소가 관찰되었다. ALC 농도의 현저한 감소가 제1주와 제2주 사이에 관찰되었다 (도 13).
실시예 14
림프종 환자 대 건강한 지원자의 비교
본 실시예는 림프종 환자 대 정상적인 건강한 지원자의 화학식 I의 화합물의 농도를 비교하는 데이터를 제공한다. 외투 세포 림프종 환자에서 50 ㎎ BID의 화합물을 경구 투여한 지 제28일에, 혈액 내의 화합물의 농도를 투여 후 6시간의 기간에 걸쳐 측정하였다. 투여로부터 제7일의 정상적인 건강한 지원자에서의 50 및 100 ㎎ 경구 투여의 농도를 또한 측정하였다. 결과가 도 14에서 요약된다. 따라서, 화합물이 치료 사이클 과정에 걸쳐 과도하게 축적되거나 환자가 치료 사이클 과정에 걸친 증가된 대사에 의해 내성이 되지 않았다.
실시예 15
다양한 키나제에서의 화합물 I의 활성
본 실시예는 표 2에 요약된 바와 같은 키나제 클래스들에 걸친 화합물 I의 IC50 프로파일을 나타낸다. p110δ에 대해 특히 활성이면서, 화합물 I은 p110γ에 대해 또한 활성이었고, 화합물의 실연된 높은 NOAEL 수준으로 인해, 심지어 p110β에 대해 비-독성인 용량에서 치료적으로 유용하기에 충분히 활성인 한편; 클래스 II-V 포스포이노시티드 키나제에 대해서 활성을 거의 나타내지 않았다. 따라서, 델타-선택적이면서, 화합물은 임상적으로 유용하기에, 즉 신호전달을 위해 p110γ에 의존하는 암에 대해 효과적이기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는데, 이는 다른 이소형, 특히 알파 이소형에 비해 여전히 선택적이면서 p110γ의 억제를 위한 유효 투여량을 초과하는 혈장 수준이 달성될 수 있기 때문이다.
<표 2>
Figure pat00022
실시예 16
키놈 ( kinome ) 범위에 걸친 단백질 키나제 스크린에서의
화합물 I의 표적을 벗어나지 않는 활성
본 실시예는 키놈 범위에 걸친 키나제 스크린에서 화합물 I이 표적을 벗어나는 활성이 거의 없거나 없다는 것을 나타낸다. 350가지를 초과하는 단백질 키나제의 게놈 범위에 걸친 스크린인 앰비트(Ambit)의 키놈스캔(KINOMEscan)™를 사용했을 때, 10 μM에서 어떠한 활성도 검출하지 못했다. 이러한 스크린에서의 일부 키나제의 예가 하기 표 3에서 제시된다.
<표 3>
Figure pat00023
실시예 17
p110 δ에 대한 화합물 I의 선택성
본 실시예는 이소형 특이적 세포-기반 분석법에서 측정 시 화합물 I이 p110δ에 대해 선택적임을 실연한다.
스위스-3T3 섬유모세포 및 RAW-264를 96웰 조직 배양 플레이트에 시딩(seeding)하고, 90％의 전면성장에 도달하도록 하였다. 세포를 고갈시키고, 비히클 또는 단계적인 화합물 I 희석물로 2시간 동안 처리하고, 각각 PDGF 또는 C5a로 자극하였다. Akt 인산화 및 전체 AKT를 ELISA에 의해 검출하였다. 정제된 B-세포를 비히클 또는 단계적인 화합물 I 희석물로 30분 동안 실온에서 처리한 후, 정제된 염소 항-인간 IgM을 첨가하였다. 결과는 IgM 가교에 의해 유도된 상대적인 [3H] 티미딘 혼입으로서 표현된다.
<표 4>
Figure pat00024
실시예 18
백혈병 및 림프종 세포주에서의 p110 δ의 발현
본 실시예는 PI3K p110δ가 광범위한 백혈병 및 림프종 세포주에서 고도로 발현된다는 것을 실연한다.
PI3K p110δ는 광범위한 백혈병 및 림프종 세포주에서 증식 및 생존을 촉진한다. 이러한 세포 유형들 중에서, MCL, DLBCL, AML, ALL, 및 CML을 조사하였다.
림프종 및 백혈병 세포주들의 패널의 PI3K p110 α, β, γ 및 δ의 발현이 도 15에서 실연된다. 106개의 세포로부터의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, α, β, γ 및 δ 이소형에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 정제된 재조합 p110 단백질이 대조군으로서 사용되었다. 항-액틴 항체를 사용하여 샘플들의 등가의 로딩을 평가하였다. p110δ는 일관적으로 높은 수준으로 발현된 한편, 다른 p110 이소형들은 고도로 가변적이었다. 문헌 [Sujobert, et al., Blood 2005 106(3), 1063-1066]에 논의된 바와 같이 PI3K p110δ는 환자 AML 세포에서 균일하게 발현되는 것으로 공지되어 있다.
실시예 19
p110 δ에 대한 화합물 I의 억제 효과
실시예 19는 p110δ의 화합물 I 억제가 구성적 경로 활성화가 있는 백혈병 및 림프종 세포주에서 PI3K 신호전달을 차단한다는 것을 나타낸다.
백혈병 및 림프종 세포주에서 PI3K 경로가 빈번하게 규제를 벗어난다. 48％의 세포주, 또는 27개 중 13개에 구성적 p-AKT가 있는 것으로 확인되었다. 또한, PI3K 경로 활성화가 p110δ에 의존적이었다. 화합물 I이 13개의 세포주 중 13개에서 구성적 AKT 인산화를 억제하는 것으로 확인되었다.
도 9의 PAGE 결과는 구성적 AKT 인산화가 B-세포 및 T-세포 림프종이 포함되는 11개의 세포주 각각에서 화합물 I의 존재에 의해 억제되었음을 실연한다. 세포를 2시간 동안 10 μM 화합물 I과 함께 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 SDS-PAGE 상에 러닝(running)시키고, PDVF 막으로 옮기고, 적합한 항체로 프로빙(probing)하였다. 화합물 I이 11개의 세포주 중 11개에서 구성적 AKT 인산화를 억제하는 것으로 확인되었다. T-ALL 및 B-ALL 세포주에 대한 추가적인 세포주 데이터가 도 27에서 제시된다. 광범위한 농도의 화합물 I (0.1 μM 내지 10 μM)에의 노출 후 Akt 및 S6 인산화의 감소를 음영계측기에 의해 정량하였고, 백분율 변화로 표현되었다 (도 28).
실시예 20
화합물 I이 백혈병 세포주에서의 증식 및 아폽토시스를 억제한다
실시예 20은 화합물 I이 백혈병 세포주에서 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도한다는 것을 실연한다. 도 16A-B는 24시간 동안의 화합물 I로의 처리가 용량 의존적 방식으로 세포 생육력을 감소시켰음을 나타낸다.
10 ％ FBS 혈청의 존재 하에 성장된 ALL 세포주에 대한 증식 분석법 (알라마르블루®) 및 측정을 24시에 수행하였다. 96웰 플레이트 내의 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 화합물 I에 의한 PI3K 신호전달의 억제는 세포 주기 진행의 차단 및/또는 세포 사망을 초래하였다. 6개의 백혈병 세포주 각각에서, 10 마이크로몰 농도의 화합물 I로 생육력이 40-50％만큼 감소하였다 (도 16A).
화합물 I에 의한 아폽토시스의 유도. 세포를 DMSO (비히클), 1 μM 또는 10 μM 화합물 1로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스성 세포의 백분율을 아넥신 V-FITC/7AAD 염색에 의해 결정하였다. 유사한 결과들을 제공한 여러 실험들을 대표하는 1회의 실험이 도 16B에 제시된다.
실시예 21
CLL 세포에서의 p110 δ의 발현
본 실시예는 환자 CLL 세포에서의 PI3K p110δ 및 p110 δ 이소형 발현을 실연한다.
PI3K 매개 신호전달 경로가 CLL에 연루되었다. 이러한 경로는 세포 증식, 아폽토시스의 방지, 및 세포 이동에서의 역할이 있다. 환자 CLL 세포 내의 PI3K 이소형 발현을 결정하기 위해 노력하였다.
CLL 환자 인구학이 하기 표 5에서 요약된다.
<표 5>
Figure pat00025
도 17A-D의 PAGE 영상은 환자 A-E의 CLL 세포에서의 p110α, p110δ, p110β, 및 p110γ의 발현을 비교한다. p110δ 및 p110γ가 다른 PI3K 이소형과 비교하여 각각의 환자에서 발현되었다.
실시예 22
화합물 I이 카스파제 3 및 PARP 의 절단을 유도한다
본 실시예는 화합물 I이 카스파제 3 및 PARP의 절단을 유도하였음을 실연한다. 도 18A-B는 1, 10 μM의 화합물 I 또는 25 μM의 LY294002의 존재 하에서의 카스파제 3 및 PARP (폴리(ADP) 리보스 중합효소) 절단의 결과를 나타낸다.
추가적인 실험에서 화합물 I이 카스파제 2 및 PARP 절단을 유도하는 것의 증거가 제공되었다. 세포를 화합물 I 또는 비히클 단독과 함께 24시간 동안 배양하였다. 그후, 세포를 용해시키고, 크기에 따라 분획화하고, FLIP에 대해 지시된 항체로 면역블롯팅하였다 (도 29). 추가적으로, 전체 세포 용해물을 전체 카스파제-3, 절단된 카스파제-3, 절단된 PARP, 및 BSA로 코팅된 MDS (메조 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics)) 멀티스폿(multispot) 96웰 4-스폿 플레이트에 첨가하였다. 단백질을 SULFO-TAG 시약으로 표지된 항체로 검출하고, 정량하였다. 5 또는 10 μM의 화합물 I에의 노출 시 카스파제 3 및 PARP 절단에서의 용량 의존적 응답이 달성되었다.
실시예 23
화합물 I이 PI3K 신호전달을 차단한다
본 실시예는 화합물 I이 환자 AML 세포에서 PI3K 신호전달을 차단한다는 것을 실연한다. PI3Kδ가 AML 환자 세포에서의 신호전달에서 연루된다. 도 21은 화합물 I의 부재 또는 0.1, 1.0, 10 μM의 화합물 I의 존재 하에서의 포스포-Akt 생산의 결과를 나타낸다. 이는 화합물 I이 환자 AML 세포에서 포스포-Akt 생산을 감소시킨다는 증거를 제공한다.
실시예 24
전혈을 기초로 하는 호염기구에서의 PI3K 신호전달의 측정
본 실시예는 CD63 표면 발현의 유도에 의한 유동 세포측정법을 사용하는 PI3K 신호전달의 측정을 위한 전혈 분석법을 실연한다.
호염기구에서의 PI3K 신호전달의 억제는 화합물 I이 유용한 약역학 마커이도록 한다. CD63 표면 발현에 의해 PI3K 신호전달이 모니터링된다. 특히, p110δ는 FCεR1 신호전달을 매개하고, p110γ는 fMLP 수용체 신호전달을 매개한다. 호염기구 상에서의 PI3K 매개 CD63 발현의 유동 세포측정법 분석은 하기의 순차적인 단계들을 포함한다:
1. 말초 혈액 수집
2. 호염기구 자극 (fMLP 또는 항-FCεR1 Mab)
3. 호염기구 표지 (항-CCR3-FITC 및 항-CD63-PE)
4. 세포 용해 및 고정
5. 유동 세포측정법에 의한 분석
도 22A-C는 A) 무자극, B) 항-FCεR1로의 자극, 또는 C) fMLP로의 자극의 결과를 비교한다.
도 23은 화합물 I이 p110δ-매개 신호전달이 가장 중요한 경우에 특히 활성이지만, p110γ가 사용되는 경우에도 또한 비교적 활성임을 나타낸다: 이는 p110δ 테스트에 대해 ≪ 1 μM, p110γ 테스트에 대해 약 10 μM에서 SD63 발현에서의 50％ 감소를 달성하였다. 호염기구 활성화를 인간 전혈에서 플로우2 캐스트(Flow2 CAST)® 키트를 사용하여 측정하였다. 항-FcεRI mAb 또는 fMLP로의 호염기구의 활성화 전에 전혈 샘플을 비히클 또는 단계적인 화합물 I 희석물로 처리하였다. 세포를 항-인간 CD63-FITC와 항-인간 CCR3-PE mAb의 조합물로 염색하였다. 게이트형 호염기구 집단 내의 CD63 양성 세포의 백분율을 여러 처리 군에서 결정하고, 비히클 대조군에 대해 표준화하였다.
실시예 25
화합물 I이 CLL 환자에서 림프절병을 감소시킨다
본 실시예는 del[17p]가 있는 CLL 환자에서의 거대 림프절병의 크기 감소의 증거를 제공한다. del(17p)가 있는 환자가 겨드랑이 림프절병에 걸렸고, 이를 컴퓨터 단층촬영 (CT)에 의해 영상화하여 5.9 ㎝ × 4.1 ㎝의 기준선 측정치를 제공하였다 (도 40A). 화합물 I로의 1회 사이클의 치료 후, 림프절병이 3.8 × 1.8 ㎝의 치수로 감소되었다 (도 40B). 치료 사이클은 200 ㎎ BID 또는 350 ㎎ BID의 화합물 I의 28일의 연속적인 경구 투약이었다.
실시예 26
대상의 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 화합물 I의 제한된 효과
본 실시예는 화합물 I로의 치료가 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 효과가 거의 없거나 없다는 것을 실연한다. 화합물 I을 50-200 ㎎ BID로 10일까지의 기간에 걸쳐 대상에게 투여하였다. 도 25A-B에 제시된 바와 같이, 혈액 글루코스 및 인슐린 농도를 경시적으로 측정하고, 위약 결과와 비교하였다.
혈액 글루코스 농도가 가장 높은 투여량의 화합물 I로의 10일의 치료 후에도 일정하게 유지되었다. 인슐린 수준이 화합물 I로의 7일의 치료 후에 정상 범위 내에서 유지되었다. 이는 화합물 I이 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 효과가 거의 없거나 없다는 증거를 제공하였다.
실시예 27
재료 및 방법
본 실시예는 다발 골수종의 치료에서 화합물 I을 사용하는 것에 관련된 실시예 28-35에 기술된 실험을 수행하는 재료 및 방법에 대한 정보를 제공한다.
재료
칼리스토가 파마슈티칼스(Calistoga Pharmaceuticals) (워싱톤주 시애틀)에서 p110δ 억제제인 화합물 I 및 화합물 II를 제공하였다. 사용된 화합물 I 및 II의 샘플은 S 거울상이성질체가 95％를 초과하였다. 화합물 I을 디메틸 술폭시드에 10 mM로 용해시키고, 시험관내 연구를 위해 -20℃에서 보관하였다. 화합물 II를 1％ 카르복시 메틸셀룰로스 (CMC)/0.5％ 트윈(Tween) 80에 용해시키고, 생체내 연구를 위해 4℃에서 보관하였다. 재조합 인간 P110α, β, γ, 및 δ를 0.1％ BSA를 함유하는 무균성 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 재구성시켰다. 보르테조밉은 밀레니엄 파마슈티칼스(Millennium Pharmaceuticals) (매사추세츠주 캠브리지)에서 제공하였다. 3-메틸아데닌은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미저리주 세인트루이스)에서 구입하였다.
세포 배양
스티븐 로센(Steven Rosen) 박사 (일리노이주 시카고의 노스웨스턴 유니버시티(Northwestern University))가 Dex-민감성 (MM.1S) 및 저항성 (MM.1R) 인간 MM 세포주를 친절하게 제공하였다. H929, RPMI8226, 및 U266 인간 MM 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (버니지아주 머내서스)로부터 수득하였다. 윌리엄 달톤(William Dalton) 박사 (플로리다주 탐파의 리 모핏 캔서 센터(Lee Moffitt Cancer Center))가 멜팔란-저항성 RPMI-LR5 및 독소루비신 (Dox)-저항성 RPMI-Dox40 세포주를 친절하게 제공하였다. 에드워드 톰슨(Edward Thompson) 박사 (갤버스톤의 유니버시티 오브 텍사스 메디컬 브랜치(University of Texas Medical Branch))가 OPM1 혈장 세포 백혈병 세포를 제공하였다. 레나테 부르거(Renate Burger) 박사 (독일 킬의 유니버시티 오브 킬(University of Kiel))가 IL-6-의존적 인간 MM 세포주 INA-6을 제공하였다. LB 인간 MM 세포주는 실험실에서 확립되었다. 표현형 분석에서 세포유전학 이상이 드러나지 않았다. 표현형 분석이 표 6에서 제공된다. LB 세포주의 CD 발현 프로파일은 유동 세포측정법 분석에 의해 정의되었다.
<표 6>
Figure pat00026
모든 MM 세포주를 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 골수 기질 세포 (BMSC)를 15％ 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (라이프 테크놀러지즈)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)에서 배양하였다. 건강한 지원자로부터 수집된 혈액 샘플을 피콜-파크(Ficoll-Paque)™ 구배에 의해 프로세싱하여, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)를 수득하였다. 헬싱키 선언 및 다나-파버 캔서 인스티튜트(Dana-Farber Cancer Institute) (매사추세츠주 보스턴)의 임상시험 심사 위원회의 승인에 따라 BM 샘플로부터 환자 MM 및 BM 세포를 수득하였다. BM 단핵 세포를 피콜-파크™ 밀도 침강을 사용하여 분리하고, 항-CD138 마그네틱 활성화 세포 분리 마이크로비드 (캘리포니아주 오번의 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))로의 양성 선별에 의해 혈장 세포를 정제하였다 (>95％ CD138+). 로제트셉(RosetteSep) 음성 선별 시스템 (캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버의 스템셀 테크놀로지즈)을 사용하여 MM 환자의 BM으로부터 종양 세포를 또한 정제하였다.
성장 억제 분석법
MM 세포주, PBMC, 및 BMSC의 성장에 대한 화합물 I의 성장 억제 효과를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라-소듐 브로마이드 (MTT; 캘리포니아주 테메큘라의 케미콘 인터내셔날) 염료 흡광도를 측정함으로써 평가하였다.
BM에서의 측분비성 MM 세포 성장에 대한 화합물 I의 효과
MM 세포 (2×104개의 세포/웰)를 BMSC로 코팅된 96웰 플레이트 (코스타(Costar), 매사추세츠주 캠브리지)에서 약물의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 배양하였다. [3H]-티미딘 (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 매사추세츠주 보스턴) 흡수에 의해 DNA 합성을 측정하였고, 이때 [3H]-티미딘 (0.5 μCi/웰)이 48시간 배양의 마지막 8시간 동안 첨가되었다. 모든 실험을 4중으로 수행하였다.
P110 δ 발현의 일시적인 녹다운(knockdown)
INA-6 세포 및 LB 세포를 셀 라인 뉴클레오펙터 키트(Cell Line Nucleofector Kit) V (아맥사 바이오시스템즈(Amaxa BIosystems), 메릴랜드주 게이더스버그)를 사용하여 siRNA 온-타겟(ON-TARGET) + 스마트(SMART) 풀 P110δ 또는 비-특이적 대조군 듀플렉스 (다마콘 라파예트 코포레이션(Dharmacon Lafayette), 콜로라도)로 일시적으로 형질감염시켰다.
면역형광
사이토스핀(cytospin) 시스템 (써모 샨돈(Thermo Shandon), 펜실베니아주 피츠버그)을 사용하여 5분 동안 500 rpm에서의 원심분리에 의해 생육성 MM 세포 (2.5×104개)를 유리 슬라이드 상에 펠렛화시켰다. 세포를 저온 무수 아세톤 및 메탄올에서 10분 동안 고정시켰다. 고정 후, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고 나서, 60분 동안 PBS 내의 5％ FBS로 차단하였다. 그후, 슬라이드를 항-CD138 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology), 캘리포니아주 산타 크루즈)와 함께 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS에서 세정하고, 염소 항-마우스 IgG와 함께 1시간 동안 ℃에서 인큐베이션하고, 니콘(Nikon) E800 형광 현미경검사를 사용하여 분석하였다.
아크리딘 오렌지 염색으로의 산성 소포체 ( AVO )의 검출 및 정량
세포질 단백질의 격리 및 AVO의 발달에 의해 자가포식을 특성화하였다. 화합물 I 또는 3MA로 처리된 세포에서의 AVO를 검출 및 정량하기 위해, 최종 농도 1 ㎍/㎖의 아크리딘 오렌지로 15분 동안 생체 염색을 수행하였다. 샘플을 형광 현미경 하에 검사하였다.
혈관형성 분석법
화합물 I의 항-혈관형성 활성을 시험관내 혈관형성 분석법 키트 (케미콘(Chemicon), 캘리포니아주 테메큘라)를 사용하여 결정하였다. HUVEC 및 내피 세성장 배지를 론자(Lonza) (미국 메릴랜드주 워커스빌)로부터 수득하였다. HUVEC를 화합물 I과 함께 중합 매트릭스 젤 상에서 37℃에서 배양하였다. 8시간 후, 관 형성을 라이카(Leika) DM IL 현미경검사 (라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), 독일 베츨라르)를 사용하여 평가하고, IM50 소프트웨어 (라이카 마이크로시스템즈 이미징 솔루션즈(Leica Microsystems Imaging Solutions), 영국 캠브리지)로 분석하였다. HUVEC 세포 이동 및 재배열이 가시화되었고, 분지점의 개수를 계수하였다.
웨스턴 블롯팅
MM 세포를 화합물 I과 함께 또는 화합물 I 없이 배양하고, 수확하고, 세정하고, 방사성면역침전 분석법 (RIPA) 완충제, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드 (5 ㎎/㎖)를 사용하여 용해시켰다. 전체 세포 용해물을 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 분리에 적용하고, 퓨어 니트로셀룰로스(Pure Nitrocellulose) 막 (바이오-래드 래버러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 허큘리스)으로 옮기고, 항-AKT, 포스포(p)-AKT (Ser473, Thr 308), ERK1/2, P-ERK1/2, P-PDK1, STAT, P-STAT, P-FKRHL, P-70S6K, LC3, 및 PI3K/p110α Ab (셀 시그널링, 매사추세츠주 댄버스); 항-p110β, PI3K/p110δ, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH), α-튜불린, 및 액틴 Ab (산타 크루즈 바이오테크놀러지, 캘리포니아); 및 항-p110γ Ab (알렉시스(Alexis), 캘리포니아주 샌디에고): 및 항-LC3 Ab (앱젠트(Abgent), 캘리포니아주 샌디에고)로 면역블롯팅하였다.
ELISA
MM 세포와 공동배양된 인간 BMSC에 의한 시토카인 분비를 ELISA에 의해 평가하였다. BMSC를 96웰 플레이트에서 INA-6 세포와 함께 또는 INA-6 세포 없이 다양한 농도의 화합물 I과 함께 배양하였다. 48시간 후, 상청액을 수확하고, -80℃에서 보관하였다. 시토카인을 듀오(Duo) 세트 ELISA 발색 키트 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 측정하였다. 모든 측정을 3중으로 수행하였다.
인간 시토카인 어레이
배양 상청액 내의 시토카인 수준을 프로테옴 프로파일러 안티바디 어레이 패널 A(Proteome Profiler Antibody Arrays Panel A) (R&D 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 평가하였다. BMSC와의 공동-배양물로부터의 상청액을 제조사의 설명서에 따라, 37개의 시토카인에 대한 Ab가 배열된 막과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다.
인간 MM의 뮤린 이종이식 모델
CB17 SCID 마우스 (48-54일령)를 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories) (매사추세츠주 윌밍턴)로부터 구입하였다. 모든 동물 연구를 다나-파버 캔서 인스티튜트의 동물 윤리 위원회가 허가한 프로토콜에 따라 수행하였다. 100 ㎕ RPMI-1640 내의 3×106개의 LB 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 촉진가능했을 때, 마우스를 10 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏ 위관영양(gavage)을 1일 2회 제공하는 치료 군에 할당하였고, 대조군 내의 7마리의 마우스에게는 비히클 단독을 제공하였다. 최장 수직 종양 직경의 캘리퍼 측정을 격일로 수행하여, 타원의 3D 부피를 나타내는 하기의 식을 사용하여 종양 부피를 추정하였다: 4/3 × (폭/2)2 × (길이/2). 종양이 2 ㎝에 도달했을 때 또는 동물이 빈사 상태일 때 동물을 희생시켰다. 치료 첫날부터 사망까지 생존을 평가하였다. 치료 첫날부터 최초의 희생일까지 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 평가하였고, 상기 최초의 희생일은 대조군에 대해서는 제12일, 치료 군에 대해서는 제17일 및 제19일이었다. 캐논 익시(IXY) 디지털 700 카메라로 영상을 포착하였다. 40u/0.60의 라이카 DFC300 FX 카메라 및 라이카 DM IL 현미경 (라이카, 독일 하이델베르그)으로 종양 영상의 생체외 분석을 포착하였다.
인간 태아 골 이식물을 CB17 SCID-마우스 (SCID-hu) 내로 이식하였다. 골 이식 4주 후, 2.5×106개의 INA-6 세포를 RPMI-1640 배지 100 ㎕의 최종 부피로 이식물 내의 인간 골수강 내로 직접 주사하였다. INA-6 세포로부터의 가용성 인간 IL-6 수용체 (shuIL-6R)의 수준 증가가 SCID-hu 마우스에서의 MM 세포 성장 및 질환 부하의 지표물로서 사용되었다. INA-6 세포를 주사하고 나서 약 4주 후에 마우스에서 측정가능한 혈청 shuIL-6R이 발달되었고, 그 후 10 또는 30 ㎎/㎏ 약물 또는 비히클 단독을 7주 동안 매일 제공하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA, R&D 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)을 사용하여 shuIL-6R 수준에 대해 평가하였다.
통계학적 분석
던(Dunn) 다중 비교 테스트에 의해 통계학적 유의성을 결정하였다. 유의성의 최소 수준은 p<0.05였다. 카플란 마이어(Kaplan-Meier) 곡선 및 로그-순위 분석을 사용하여 생존을 평가하였다. 화합물 I과 보르테조밉의 조합 효과를 캘쿠신(CalcuSyn) 소프트웨어 프로그램 (바이오소프트(Biosoft), 미주리주 퍼거슨)을 사용하여 이소볼로그램(isobologram) 분석에 의해 분석하였다; 조합 지수 (CI) <0.7이 상승작용적인 효과를 가리킨다.
실시예 28
MM 세포에서의 p110 델타의 발현
본 실시예는 p110δ가 환자 MM 세포에서 고도로 발현된다는 것을 실연한다. PI3K/p110 발현을 평가하기 위해, 재조합 인간 PI3K/p110α, β, γ, 및 δ 단백질에 대한, 이러한 이소형들에 대한 특이적 면역반응성이 있는 Ab들이 사용되었다. 11개의 MM 세포주 (MM.1S, OPM1, OPM2, RPMI8226, DOX40, LR5, MM.1R, U266, INA-6, H929, 및 LB), 뿐만 아니라 24개의 환자 MM 샘플에서의 p110δ의 발현을 평가하였고, 도 30A 및 30B에 면역블롯이 제시된다. 도 30A는 특이적 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 검출된 MM 세포주에서의 p110-α, -β, -γ, 및 -δ의 발현을 나타낸다. 항-α-튜불린 MAb가 로딩 대조군 구실을 하였다. 환자 MM 세포 내의 p110δ를 항-P110δ Ab를 사용하여 면역블롯팅에 의해 검출하였다 (도 30B).
항-GAPDH MAb가 로딩 대조군 구실을 하였다. INA-6 및 LB 세포는 p110δ를 강하게 발현한 반면, MM.1S, OPM1, MM.1R, Dox40, U266 또는 H929는 p110δ 발현이 없었다 (도 30A).
MM.1S 및 LB 세포에서의 p110δ 발현을 면역형광 분석에 의해 확인하였다 (도 30C). SDS 샘플 완충제 내의 인간 재조합 P110-α, -β, -γ, -δ 단백질을 3분 동안 가열한 후 젤 상에 로딩하였다. (레인 당 10-20 ㎍.) 재조합 인간 P110-α, -β, -γ, -δ 단백질을 면역블롯 분석에 의해 검출하였다. P110δ 특이적 FITC 접합 2차 항체를 사용하여 MM1S 및 LB 세포에서 P110δ의 수준을 측정하였다. P110δ는 녹색으로 염색되고, 핵산 (DAPI)은 청색으로 염색되었다.
웨스턴 블롯팅에서, p110δ 발현과 다른 이소형 (α, β 및 γ)의 발현 사이의 상관관계가 드러나지 않았다. 중요하게, 모든 환자 MM 세포가 p110δ를 또한 발현하였다 (도 30B).
실시예 29
MM 세포에 대한 화합물 I의 세포독성
본 실시예는 화합물 I이 p110δ가 있는 세포에 대해 선택적인 세포독성이 있다는 것을 실연한다. 구체적으로, 건강한 도너로부터의 말초 혈액 단핵 세포에서는 세포독성이 없으면서 화합물 I이 세포독성 p110δ 양성 MM 세포, 뿐만 아니라 1차 환자 MM 세포에서 세포독성을 강력하게 유도하였고, 이는 유리한 치료 지수를 시사한다.
MM 세포에서의 p110δ 녹다운의 성장 억제 효과를 평가하였다. LB 및 INA-6 세포를 P110δ siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (허위)로 형질감염시켰다. 24시간 후, P110δ의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다 (도 31A 참조). INA-6 세포를 p110δ siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염시킨 후, 72시간 동안 배양하였다. 세포 성장을 MTT 분석법에 의해 평가하였다 (도 31B 참조). 데이터는 대조군의 배수로 표현되는, 3중 배양물의 평균 ± SD이다. p110δ siRNA로의 형질감염이 p110δ를 하향 조절하고, 72시에 MM 세포 성장을 억제하였지만, 허위 siRNA는 그렇지 않았다 (도 31A 및 31B). MM 세포주, PBMC, 및 환자 MM 세포에서의 p110δ 특이적 소형 분자 억제제 화합물 I의 성장 억제 효과를 평가하였다.
화합물 I이 용량- 및 시간-의존적 방식으로 LB 및 INA-6 MM 세포 (p110δ-양성)에 대해 세포독성을 유도하였다; 반면에, p110δ-음성 세포주에서는 최소 세포독성이 주목되었다 (도 31C). 도 31C에 대한 범례: LB (□), INA-6 (△), RPMI 8226(○), OPM2 (◇), H929 (●), U266 (◆), RPMI-LR5 (▲) 및 OPM1 (■). MM 세포를 48시간 동안 화합물 I과 함께 또는 화합물 I 없이 배양하였다.
중요하게, 화합물 I이 환자 MM 세포에 대해 세포독성을 유도하였고 (도 31D), 이때 20 μM까지의 농도에서 4명의 건강한 지원자로부터의 PBMC에서는 세포독성이 없었다 (도 31E). 음성 선별에 의해 BM으로부터 단리된 환자 MM 세포를 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다. 건강한 도너로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포를 화합물 I과 함께 72시간 동안 배양하였다. 데이터는 미처리 대조군의 백분율로 표현되는, 3중 배양물의 MTT 분석법에 의해 평가된 평균 ± SD 생육력을 나타낸다. 이러한 결과들은 화합물 I에 대한 민감도가 P110δ 발현과 관련됨을 강하게 시사하고, 유리한 치료창(therapeutic window)을 시사한다.
화합물 I에 의해 유도된 세포독성이 아폽토시스를 통한 것인지 여부를 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석에 의한 카스파제 및 PARP의 절단을 시험하였다. INA-6 세포를 화합물 I (0-5μM)과 함께 120시간 동안 배양하였다. 전체 세포 용해물을 항-카스파제-3, -8, -9, PARP, 및 α-튜불린 Ab를 사용하는 면역블롯팅에 적용하였다. FL은 전장 단백질을 가리키고, CL은 절단된 단백질을 가리킨다. 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3, 및 PARP의 유의하게 증가된 절단이 120시간 동안 화합물 I로 처리된 INA-6 MM 세포에서 관찰되었다 (도 31F). 이러한 결과들은 화합물 I에 의해 촉발된 세포독성이, 적어도 부분적으로, 카스파제-의존적 (내인성 및 외인성 양쪽 모두) 아폽토시스를 통해 매개된다는 것을 가리킨다.
실시예 30
화합물 I에 의한 AKT 및 ERK 인산화의 억제
본 실시예는 화합물 I에 의한 AKT 및 ERK 인산화의 억제를 실연한다.
PI3K의 중요한 하류 이펙터는 세린/트레오닌 단백질 키나제 AKT이고, 이는 키나제 도메인의 활성화 루프 내의 Thr308 및 C-말단 꼬리 내의 Ser473의 인산화에 의해 활성화된다. 양쪽 부위의 인산화는 PI3K에 의해 생성되는 막 포스포이노시티드와 AKT의 N-말단 플렉스트린 상동성 도메인 간의 상호작용을 요구한다. 화합물 I이 양쪽 도메인을 억제하는 것으로 나타났고, 이는 P110δ가 MM 세포주에서 PI3K 신호전달을 담당하는 우세한 이소형임을 시사한다.
화합물 I에 의한 INA-6 세포의 AKT 및 ERK 경로의 억제를 시험하였다. INA-6 세포를 화합물 I 또는 LY294002와 함께 12시간 동안 배양하였다 (도 32A). 액틴 Ab가 로딩 대조군으로서 사용되었다. INA-6 및 MM.1S 세포를 화합물 I (0, 0.25, 1.0, 5.0 μM)과 함께 6시간 동안 배양하였다 (도 32B). LB 및 INA-6 세포를 화합물 I과 함께 0-6시간 동안 배양하였다 (도 32C). 전체 세포 용해물을 AKT, P-AKT (Ser473 및 Thr308), ERK1/2, P-ERK1/2, P-PDK1, 및 P-FKRHL 항체를 사용하는 면역블롯팅에 적용하였다. α-튜불린이 로딩 대조군으로 사용되었다.
화합물 I은 p110δ 양성 INA-6 세포에서 AKT 및 ERK1/2의 인산화를 유의하게 차단하였지만 (도 32A), P110δ 발현이 낮은 MM.1S 세포에서는 AKT 또는 ERK의 인산화에 영향을 미치지 않았다 (도 32B). 화합물 I은 시간- 및 용량-의존적 방식으로 INA-6 및 LB MM 세포에서 상류 PDK-1 및 하류 FKHRL의 인산화를 또한 유의하게 억제하여 (도 32C), 이러한 세포들에서의 PI3K/AKT 및 ERK 경로 양쪽 모두의 억제를 추가로 확증하였다.
실시예 31
화합물 I이 AVO 발달 및 자가포식을 유도한다
본 실시예는 아폽토시스 및 자가포식 양쪽 모두를 촉발하는 화합물 I의 능력을 실연한다.
AKT가 자가포식을 조절하므로, LB 및 INA-6 MM 세포에서 자가포식을 유도하는 것에서의 화합물 I의 탐구를 수행하였다.
INA-6 및 LB MM 세포를 5 μM 화합물 I로 6시간 동안 처리하였다. 화합물 I 처리는 형광 현미경검사 또는 투과 전자 현미경검사에 의해 증명되는 바와 같이, LB 및 INA-6 세포에서의 LC3 축적을 유도하였다. 자가포식소체 형성이 LC3 축적에 의해 명백하게 나타났다; 화살표는 자가포식소체를 가리킨다 (도 33A).
INA-6 세포를 5 μM 화합물 I 또는 혈청 고갈로 6시간 동안 처리하고, 1 ㎍/㎖ 아크리딘 오렌지로 15분 동안 염색하고, 형광 현미경검사에 의해 분석하였다 (도 33B).
3-MA와 함께 또는 3-MA 없이 화합물 I로 처리된 INA-6 세포로부터의 용해물의 LC3 및 베클린-1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 LC3 및 베클린-1 단백질 수준을 결정하였다 (도 33C). GAPDH가 로딩 대조군 구실을 하였다.
면역형광 분석은 화합물 I (5 μM, 6시간) 처리로 촉발된 INA-6 및 LB 세포에서의 현저하게 증가된 LC3 염색을 나타냈다 (도 33A). 전자 현미경검사 분석 또한 화합물 I로 처리된 MM 세포에서 증가된 자가포식 공포 (화살표)를 나타냈다. 자가포식은 산성 소포체 (AVO) 발달로서 특성화되기 때문에, 아크리딘 오렌지 염색을 수행하였다. 도 33B에 나타난 바와 같이, 아크리딘 오렌지로의 생체 염색은 화합물 I로 처리된 LB 및 INA-6 세포에서 AVO의 발달을 드러냈다. 또한, 현저하게 증가된 LC3-II 및 베클린 단백질이 화합물 I로의 6시간 처리 후 INA-6 MM 세포에서 검출되었고, 이는 3-MA 자가포식 억제제에 의해 차단되었다 (도 33C).
100 μM 이하의 농도에서 3-MA에 의해 INA-6 및 LB 세포에서의 세포독성이 유도되지 않았다 (도 33D). P110δ 양성 LB 세포 (◆)를 24시간 동안 3-MA (0-100 μM)로 처리하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다.
이러한 결과들은 화합물 I이 카스파제/PARP 절단의 유도보다 더 빠른 시점에 AVO의 발달 및 자가포식을 유도한다는 것을 가리킨다.
자가포식은 세포 성분을 분해시키고, 세포 구성물을 재활용시키며, 다양한 세포 스트레스에 응답한다. 본 실시예에서, 자가포식의 특징물인 LC3-II가 p110δ 양성 MM 세포주에서 화합물 I 처리에 의해 유도되었다. 중요하게, 세포질 내의 자가포식 공포의 존재, AVO의 형성, LC3의 미세관-관련 단백질 I과 자가포식소체의 막 회합, 및 LC3-II 단백질의 현저한 유도에 의해 증명되는 바와 같이, 화합물 I 처리가 자가포식의 현저한 증가를 초래하였다. 전자 현미경검사 분석에서, 화합물 I이 자가포식소체를 유도하였음이 확증되었다. LC3-II는 LC3-I 전환을 통해 발현되었다. 역으로, 화합물 I에 의해 유도된 자가포식이 자가포식의 특이적 억제제인 3-MA에 의해 억제되었다. 이러한 연구들은 화합물 I의 초기 세포독성 효과가 자가포식과 관련된다는 것을 시사한다.
실시예 32
화합물 I이 BMSC 의 존재 하의 세포 성장을 억제한다
본 실시예는 BMSC로의 측분비성 MM 세포 성장을 억제하는 화합물 I의 능력을 실연한다.
IL-6 및 IGF-1이 MM 세포에서 성장 및 항-아폽토시스를 유도하기 때문에, 화합물 I을 INA-6 및 LB MM 세포에서 이러한 시토카인들의 효과를 극복하는 것에서 시험하였다. LB 및 INA-6 세포를 IL-6 (1 및 10 ng/㎖) (도 34A) 또는 IGF-1 (10 및 100 ng/㎖) (도 34B)의 존재 또는 부재 하에 대조군 배지 (■); 또는 5.0 μM (▧) 또는 10 μM (□)의 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다. 72시간 배양의 마지막 8시간 동안 [3H]-티미딘 혼입을 측정함으로써 DNA 합성을 결정하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다. IL-6 또는 IGF-1이 화합물 I에 의해 유도된 성장 억제에 대해 보호하지 않았다 (도 34A 및 34B).
BM 미세환경이 MM에서 증식 및 약물-저항성을 부여하므로, BMSC의 존재 하에서의 화합물 I의 MM 세포 성장 억제 효과를 시험하였다.
LB 및 INA-6 MM 세포를 BMSC의 존재 또는 부재 하에 대조군 배지 (□), 및 2.5 μM (▒), 5 μM (▧), 및 10 μM (■)의 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다 (도 34C). [3H]-티미딘 혼입에 의해 DNA 합성을 결정하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다.
화합물 I (0-2.5 μM)로 처리된 BMSC로부터의 배양 상청액 내의 IL-6을 ELISA에 의해 측정하였다 (도 34D). 오차 막대는 SD (±)를 가리킨다.
BMSC를 1.0 μM 화합물 I 또는 대조군 배지와 함께 48시간 동안 배양하였다; 배양 상청액 내의 시토카인을 시토카인 분석법을 사용하여 검출하였다 (도 34E).
BMSC와 함께 또는 BMSC 없이 배양된 INA-6 세포를 화합물로 48시간 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 지시된 항체를 사용하는 면역블롯팅에 적용하였다 (도 34F). 액틴이 로딩 대조군의 구실을 하였다.
2명의 상이한 환자 (□, ◇)로부터의 BMSC를 화합물 I (0-20μM)로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생육력을 MTT 분석법에 의해 평가하였다 (도 34G). 값들은 3중 배양물의 평균 ± SD를 나타낸다.
중요하게, 화합물 I이 BMSC에 의해 유도된, 성장 및 시토카인 분비 (도 34C-E), 뿐만 아니라 AKT 및 ERK의 인산화 (도 34F)를 억제하였다. 반면에, BMSC에서의 유의한 성장 억제가 주목되지 않았다 (도 34G). 이러한 결과들은 화합물 I이 BM 미세환경의 상황에서 측분비성 MM 세포 성장을 차단한다는 것을 가리킨다.
실시예 33
화합물 I이 혈관형성성 HuVEC 세관 형성을 억제한다
본 실시예는 HuVEC 세관 형성을 억제하는 화합물 I의 능력을 실연한다. 혈관형성에서의 PI3K, 특히 p110 이소형의 역할을 조사하였다. 내피 세포는 종양 성장을 위한 혈관형성의 본질적인 조절인자이다. Akt 및 ERK 경로 양쪽 모두 내피 세포 성장, 및 혈관형성의 조절과 관련되고, 중요하게, 내피 세포가 p110δ를 발현한다. 본 실시예는 화합물 I이 Akt 인산화의 하향 조절과 관련하여 시험관내 모세혈관-유사 관 형성을 차단한다는 것을 또한 실연한다.
혈관형성에 대한 P110δ 억제의 효과를 탐구하였다. HuVEC를 0, 1.0, 또는 10 μM의 화합물 I로 8시간 동안 처리하고, 내피 세포에 의한 관 형성을 평가하였다 (도 35A). HuVEC 세포를 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 표면 상에 플레이팅하고, 화합물 I의 존재 또는 부재 하에 8시간 동안 세관이 형성되도록 하였다. 내피 세포 관 형성을 현미경 분석에 의해 측정하였다 (도 35B). *P<0.005.
HuVEC를 화합물 I (0-20μM)과 함께 48시간 동안 배양하고, 생육력을 MTT 분석법에 의해 평가하였다 (도 35C). 데이터는 대표적인 실험으로부터의 3중 웰의 평균 ± SE이다. 따라서, 화합물 I이 용량-의존적 방식으로 모세혈관-유사 관 형성을 억제하였고 (p<0.05) (도 35B), 이때 세포독성이 관련되지 않았다 (도 35C).
AKT 및 ERK1/2의 인산화 및 발현이 화합물 I 처리에 의해 HuVEC 세포에서 현저하게 하향 조절되었다. HuVEC를 화합물 I (0-200μM)과 함께 8시간 동안 배양하고, 세포 용해물을 지시된 항체들을 사용하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다 (도 35D). 액틴이 로딩 대조군으로서 사용되었다.
이러한 발견들은 화합물 I이 AKT 및 ERK 활성의 하향 조절과 관련하여 혈관형성을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 34
화합물 II가 생체 내에서 MM 세포 성장을 억제한다
본 실시예는 생체 내에서 인간 MM 세포 성장을 억제하는 화합물 II의 능력을 실연한다.
P110δ 억제제의 생체내 효능을 SCID 마우스에 인간 MM 세포가 피하 주사된 이종이식 모델에서 평가하였다.
5×106개의 LB 세포가 주사된 마우스에게 하루에 2번 대조군 비히클 (● ), 및 화합물 II 10 ㎎/㎏ (□) 또는 30 ㎎/㎏ (○)을 경구 처리하였다. 평균 종양 부피를 재료 및 방법에서와 같이 계산하였다 (도 36A). 오차 막대는 SD (±)를 나타낸다.
12일 동안 대조군 비히클 (위쪽 패널) 또는 화합물 II (30 ㎎/㎏) (아래쪽 패널)로 처리된 마우스로부터의 대표적인 전신 영상 (도 36B).
화합물 II (30 ㎎/㎏)로 처리된 마우스 (오른쪽 패널) 및 대조군 마우스 (왼쪽 패널)로부터 수확된 종양을 CD31 및 P-AKT Ab를 사용하는 면역조직화학 분석에 적용하였다. CD31 및 P-AKT 양성 세포는 진갈색이었다 (도 36D).
마우스를 화합물 II 10 ㎎/㎏ ( - - ), 30 ㎎/㎏ (...) 또는 대조군 비히클 ( - )로 처리하였다. 치료 첫날부터 희생시킬 때까지 카플란-마이어 곡선을 사용하여 생존을 평가하였다 (도 36C).
대조군 비히클 또는 화합물 II (30 ㎎/㎏)로 처리된 마우스로부터 종양 조직을 수확하였다. 인산화된 PDK-1 및 AKT (Ser473)의 단백질 수준을 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다 (도 36E). 액틴이 로딩 대조군으로서 사용되었다.
SCID 마우스 내에서의 인간 골 칩 내에 생착된 INA-6 세포의 성장을 shuIL-6R의 일련의 혈청 측정에 의해 모니터링하였다. 마우스를 화합물 II 10 ㎎/㎏ (□), 30 ㎎/㎏ (△) 또는 대조군 비히클(●)로 처리하고, shuIL-6R 수준을 매주 ELISA에 의해 결정하였다 (도 36F). 오차 막대는 SD (±)를 가리킨다.
화합물 II (p110 δ 억제제)가 대조군 마우스 (n=7)와 비교하여 처리군 (n=7)에서 MM 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 종양 부피의 비교는 대조군 대 처리군에서 통계학적으로 유의한 차이를 나타냈다 (대조군 대 10 ㎎/㎏: P<0.05; 대조군 대 30 ㎎/㎏: P<0.01) (도 36A). 대조군 마우스에 비해 처리된 마우스에서 종양 성장의 현저한 감소가 제12일에 관찰되었다 (도 36B). 카플라-마이어 곡선 및 로그-순위 분석은 대조군에서의 15일 (95％ 신뢰 구간, 12-17일)의 평균 전체 생존 (OS) 대 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 화합물 II로 처리된 군에서의 각각 23일 (95％ CI, 15-34일) 및 32일 (95％ CI, 27-49일)을 나타냈다. 대조군 마우스와 비교하여 평균 OS의 통계학적으로 유의한 연장이 처리군에서 또한 관찰되었다 (대조군 대 10 ㎎/㎏: P=0.086; 대조군 대 30 ㎎/㎏: P=0.056) (도 36C). 중요하게, 비히클 단독 또는 화합물 II로의 처리가 체중에 영향을 미치지 않았다. 또한, 면역조직화학 분석 (도 36D) 및 면역블롯 분석 (도 36E)에서, 화합물 II 처리 (30 ㎎/㎏)가 p-Akt 및 p-PDK-1을 유의하게 억제하였을 뿐만 아니라, CD31 양성 세포 및 미세관 밀도를 유의하게 감소시켰음 (p<0.01)이 확증되었다 (도 36D). 이는 화합물 II가 Akt 경로의 억제를 통해 생체 내에서 혈관형성을 억제할 수 있음을 시사한다.
생체 내에서 인간 BM 미세환경의 상황에서의 MM 세포 성장에 대한 화합물 II의 활성을 시험하기 위해, IL-6 의존적 INA-6 세포가 SCID-마우스 내에 피하 이식된 인간 골 칩 내로 직접 주사되는 SCID-hu 모델을 사용하였다. 이러한 모델은 INA-6 인간 MM 세포의 인간 IL-6/BMSC-의존적 성장이 있는 인간 BM 미세환경을 재현한다. 이러한 SCID-hu 마우스를 화합물 II 또는 비히클 단독으로 4주 동안 처리하고, 혈청 shuIL-6R을 종양 부하 마커로서 모니터링하였다. 도 36F에 나타난 바와 같이, 화합물 II 처리가 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다. INA-6 세포에 의해 방출되는 혈청 shuIL-6R 수준 감소에 의해 증명되는 바와 같이 이러한 모델에서의 유의한 종양 성장 억제가 관찰되어, p110δ 억제가 생체 내에서의 BM 미세환경의 MM 성장 촉진 활성을 차단한다는 것이 확증되었다. 총괄적으로, 이러한 데이터는 화합물 II에 의한 p110δ의 억제가 유의하게 생체 내에서 MM 성장을 억제하고 생존을 연장시킨다는 것을 실연한다.
실시예 35
보르테조밉과 조합된 화합물 I이 상승작용적인 세포독성을 나타낸다
본 실시예는 상승작용적인 MM 세포독성을 매개하는 보르테조밉과 조합된 화합물 I의 효과를 실연한다.
상승작용적인 MM 세포독성 유도에서의 화합물 I과 보르테조밉을 조합하는 것의 효과를 연구하였다. LB 및 INA-6 MM 세포를 배지 (■) 및 1.25 μM (▧), 2.5μM (▒), 또는 5.0μM (□)의 화합물 I과 함께, 보르테조밉 (0-5 nM)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 세포독성을 MTT 분석법에 의해 평가하였다; 데이터는 4중 배양물의 평균 ± SD를 나타낸다 (도 37A).
INA-6 세포를 화합물 I (5 μM) 및/또는 보르테조밉 (5 nM)으로 6시간 동안 처리하였다. 포스포-AKT (ser473) 항체를 사용하여 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해 AKT의 인산화를 결정하였다 (도 37B). 액틴이 로딩 대조군의 구실을 하였다.
화합물 I이 보르테조밉의 세포독성을 강화하였다. 보르테조밉 (2.5, 5.0 nM)에 첨가된 증가되는 농도의 화합물 I (1.5-5.0 μM)이 LB 및 INA-6 MM 세포에서 상승작용적인 세포독성을 촉발하였다 (도 37A 및 표 7). 중요하게, 보르테조밉 처리에 의한 포스포-Akt의 유도가 화합물 I의 존재 하에 억제되었다 (도 37B).
<표 7>
Figure pat00027
실시예 36
소포성 림프종 세포주에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 소포성 림프종 세포에서 PI3K 신호전달을 차단하고 아폽토시스를 유도한다는 증거를 제공한다. 도 38A에 제시된 바와 같이 P110δ가 FL 세포주들에서 발현되었다. 세포가 화합물 I에 노출되었을 때 특정 세포주들이 pAkt, Akt, pS6 및 S6의 생산 감소를 나타냈다 (도 38B). 0.1 μM 및 0.5 μM에서 24시간 후 용량-의존적 방식으로 PARP 및 카스파제-3의 절단이 화합물 I에의 노출 후 관찰되었다 (도 38C).
실시예 37
1차 MCL 세포에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 MCL에 대해 효과적임을 실연한다. 0.1 μM 또는 1 μM의 화합물 I에 노출되었을 때 화합물 I이 2명의 환자의 1차 MCL 세포에서의 구성적 PI3K 신호전달을 용량 의존적 방식으로 차단하는 것으로 확인되었다 (도 39A). 화합물 I은 MCL 세포주에서 생존 인자 및 케모카인 신호전달을 억제하는 것으로 또한 관찰되었다. 도 39B는 화합물 I의 존재 하에 여러 생존 인자에 노출된 MCL 세포주에서 pAkt의 유의한 감소를 나타냈다.

Claims (20)

  1. (a) 화학식 I의 화합물:
    <화학식 I>
    Figure pat00028

    또는 이의 제약상 허용되는 염, 및 임의적인 제약상 허용되는 부형제; 및
    (b) 모노클로날 항체
    를 포함하는, 인간에서 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 다발 골수종 (MM), 외투 세포 림프종 (MCL), 소포성 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)의 치료를 위한 약제.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 I"의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염인 약제:
    <화학식 I">
    Figure pat00029
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가 항-CD20 모노클로날 항체인 약제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가 리툭시맙 또는 오파투무맙 또는 이들의 조합물인 약제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가 리툭시맙인 약제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간이 화학요법 치료에 대해 불응성이거나, 또는 화학요법으로의 치료 후 재발 상태인 약제.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염이, 화합물 투여로부터 12시간 이상의 기간에 걸쳐 호염기구에서 포스파티딜이노시톨 3-키나제δ 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 포스파티딜이노시톨 3-키나제γ 활성화에 대한 EC50 수준 미만인 평균 혈액 농도를 유지하는 것인 약제.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염이, 화합물 투여로부터 12시간 이상의 기간에 걸쳐 100 nM 내지 1100 nM의 평균 혈장 농도를 유지하는 것인 약제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간이 표준 화학요법 치료에 대해 저항성인 약제.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간이 림프절 비대를 갖는 것인 약제.
  11. 제6항에 있어서, 인간이 두 가지, 세 가지, 또는 네 가지의 표준 또는 실험적 화학요법 치료에 대해 불응성인 약제.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간이 통상적인 화학요법제로 치료를 받았던 것인 약제.
  13. 제12항에 있어서, 치료가 알킬화제로의 치료를 포함하는 것인 약제.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염 50 ㎎ 내지 150 ㎎을 인간에게 하루에 2번 투여하는 것인 약제.
  15. (a) 화학식 I의 화합물:
    <화학식 I>
    Figure pat00030

    또는 이의 제약상 허용되는 염, 및 임의적인 제약상 허용되는 부형제; 및
    (b) 모노클로날 항체, 및 제약상 허용되는 담체
    를 포함하는, 인간에서 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 다발 골수종 (MM), 외투 세포 림프종 (MCL), 소포성 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)의 치료를 위한 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 모노클로날 항체가 항-CD20 모노클로날 항체인 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 모노클로날 항체가 리툭시맙 또는 오파투무맙 또는 이들의 조합물인 제약 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 모노클로날 항체가 리툭시맙인 제약 조성물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 I"의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염인 제약 조성물:
    <화학식 I">
    Figure pat00031
    .
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제약 조성물 및 인간에서 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 다발 골수종 (MM), 외투 세포 림프종 (MCL), 소포성 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)의 치료에서의 조성물의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.
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