DE10232723A1

DE10232723A1 - Testsystem zur Auffindung von Inhibitoren von Inositolphosphatkinasen und Verwendungen dieser Inhibitoren für die Prophylaxe oder Therapie von proliferativen Erkrankungen

Info

Publication number: DE10232723A1
Application number: DE2002132723
Authority: DE
Inventors: Georg W. Prof. Dr. Mayr; Marcus M. Nalaskowski; Kirsten Dr. Hillemeier
Original assignee: Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
Current assignee: Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2002-07-16
Publication date: 2004-02-05
Also published as: AU2003254631A8; WO2004009833A3; WO2004009833A2; AU2003254631A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testsystem mit einer IP3K und/oder einer IPMK zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein neues humanes Gen, Verwendungen dieses Gens in Screening Verfahren, ein Testsystem mit diesem Gen und Verwendungen verschiedener Substanzen zur Hemmung dieses Gens oder seines Genprodukts.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein neues humanes Gen, Verwendungen dieses Gens in Screening Verfahren, ein Testsystem mit diesem Gen, Verwendungen verschiedener Substanzen zur Hemmung dieses Gens oder seines Genprodukts.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Die Inositol-Phospholipide (Phosphoinositide) sind die Ausgangsverbindungen bei der Bildung der Botenstoffe Inositol 1,4,5-trisphosphat {Ins(1,4,5)P₃} und Diacylglycerol {DAG}.

In der Plasmamembran wie auch in der nukleären Membran (v.a. in der inneren Membran) ist das Polyphosphoinositid Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat {PtdIns(4,5)P₂} enthalten. Dieses wird aus Phosphatidylinositol {PtdIns} durch zwei spezifische Phosphoinositid-Kinasen der Plasma- und der Kernmembran, PI4K und PI4P5K, welche zunächst (durch PI4K) die 4-Position des Inositolringes des PtdIns zum Phosphatidylinositol-4-Phosphat {PtdIns4P} und in einer zweiten Phosphorylierungsreaktion (durch PI4P5K) die 5-Position des PtdIns4P zum PtdIns(4,5)P₂ phosphorylieren. Die hydrolytische Spaltung dieses Phosphoinositides in DAG und Ins(1, 4, 5)P₃ erfolgt durch Phospholipase C (PLC) (Berridge und Irvine, 1984), welche ebenfalls sowohl an der Plasmamembran als auch an der Kernmembran (Maraldi et al., 1999) aktivierbar ist.

Es konnten verschiedene Isoformen der PLC in unterschiedlichen Geweben von Säugetieren nachgewiesen werden. Diese Isoformen werden in die drei Gruppen β, γ und δ eingeteilt (Berridge, 1993). Die Aktivierung von PLC erfolgt über zwei unterschiedliche Wege. Eine Vielzahl G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (Dessauer et al., 1996), z.B. für die Agonisten Acetylcholin, Histamin und Vasopressin, stimuliert die Subtypen der Isoform PLC-ß an der Plasmamembran. Durch die Bindung von Wachstumsfaktoren (EGF, PDGF etc.) an Rezeptor-Tyrosinkinasen findet eine Dimerisierung dieser Rezeptoren und hierdurch wiederum die gegenseitige Phosphorylierung (sogenannte Autophosphorylierung) von Tyrosinresten statt. Über die SH2-Domänen, die in der γ-Isoform der PLC vorkommen, kann diese Isoform des Enzyms an die Tyrosinphosphat-Domänen des aktivierten Rezeptors binden. Durch diese Membrantranslokation – nur dort ist das Substrat der PLC vorhanden – sowie durch Phosphorylierung von Tyrosinresten dieser Isoform erfolgt eine Aktivierung der PLC-? (Berridge, 1993). Der Aktivierungsmechanismus für die PLC-δ konnte bislang noch nicht im Detail aufgeklärt werden. Das Enzym besitzt ein EF-Hand-Motiv, wodurch eine Beeinflussung der Aktivität durch Calcium möglich ist (Berridge, 1993). Weiterhin besitzt es eine außerhalb des katalytischen Zentrums gelegene Bindungsdomäne für PtdIns(4,5)P₂ so dass vermutet werden kann, dass diese Isoform durch Calcium und die Verfügbarbeit von Substrat aktiviert werden könnte.

Das fettlösliche DAG verbleibt in der Plasma- bzw. Kernmembran und aktiviert die Ca²⁺- und DAG-abhängigen Isoformen der Proteinkinase C (PKC), die durch Phosphorylierung von Zellproteinen an zahlreichen intrazellulären Regulationsmechanismen beteiligt sind.

DAG wird nun zum einen durch Lipasen unter Entstehung von Arachidonsäure deacyliert, die Vorstufe für die Synthese von ebenfalls als Botenstoffe agierenden Eicosanoiden ist. Zum anderen wird DAG nach Transport zum ER durch eine spezifische DAG-Kinase zur Phosphatidsäure phosphoryliert und anschließend unter Beteiligung von Cytidin-5'-triphosphat (CTP) in CDP-Diacylglycerol umgewandelt. Mit myo-Inositol wird hieraus PtdIns synthetisiert. PtdIns wird durch einen PtdIns Carrier zur Plasmamembran und zur Kernmembran zurücktransportiert und in diesen Membranen erfolgt nun die Resynthese von PtdIns(4,5)P₂ über PtdIns4P (Shears, 1991), wodurch der "Phosphoinositidzyklus" in seinem Lipidanteil geschlossen wird.

Das wasserlösliche Ins(1,4,5)P₃ diffundiert in das Zytosol und bindet an den Ins(1,4,5)P₃-Rezeptor des endoplasmatischen Retikulums (ER), bei dem es sich um einen tetrameren intrazellulären Rezeptor-Ca^2–-Kanal handelt (Berridge, 1993). Hierdurch wird dieser Kanal geöffnet, so dass im Lumen des ER gespeichertes Ca²⁺ in das Zytosol ausströmt. Intrazelluläres Calcium spielt eine große Rolle in vielen zellulären Prozessen wie z.B. Zellwachstum, Zellmobilität, Muskelkontraktion und Sekretion.

Die Inaktivierung des Ins(1,4,5)P₃-Signals kann durch zwei Metabolisierungswege erfolgen. Durch Isoformen I bis III der Inositolpolyphosphat-5-phosphatase wird Ins(1,4,5)P₃ an der 5-Position zum Ins(1,4)P₂ dephosphoryliert. Weitere Dephosphorylierungen folgen in der 1- und 4-Position unter Bildung von myo-Inositol, welches in die Resynthese von Phosphoinositiden eingeht (Mayr, 1988; Shears, 1991). Erst hierdurch wird der "Phosphoinositidzyklus" auch in seinem Inositolphosphatanteil geschlossen.

Der andere Metabolisierungsweg ist die Phosphorylierung von Ins(1,4,5)P₃ an der 3-Position mit Hilfe von Inositol 1,4,5-trisphosphat 3-Kinasen {Ins(1,4,5)P₃-3-Kinasen oder IP3K's} zum Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphat {Ins(1,3,4,5)P₄} (Irvine et al., 1986) .

Inositol 1,4,5-trisphosphat 3-Kinase (IP3K)

Inositol 1,4,5-trisphosphat 3-Kinase (IP3K) Aktivität wurde ubiquitär in allen bisher untersuchten tierischen Geweben gefunden (Irvine et al., 1986). Dieses Enzym spielt eine zentrale Rolle in dem anabolen Signal-Stoffwechsel von Inositolphosphaten in tierischen Zellen. Es metabolisiert den sekundären Botenstoff Ins(1,4,5)P₃ unter Mitwirkung von ATP zum Ins(1,3,4,5)P₄. Hierdurch wird nicht nur der sekundäre Botenstoff Ins(1,4,5)P₃ eliminiert, sondern in Form dieses 3-phosphorylierten Produktes ein Hauptsubstrat für die Biosynthese aller höher phosphorylierten Inositole (Inositoltetrakis-, -pentakis- und -hexakisphosphate) gebildet. Die Ins(1,4,5)P₃ 3-Kinasen binden Ins(1,4,5)P₃ mit hoher Affinität und hoher Spezifität. Dieses wird anhand der niedrigen K_m-Werte verdeutlicht, die in einem Bereich von 0.4 – 2.1 μM gefunden wurden (Ryu et al., 1987; Yamaguchi et al., 1988; Shin et al., 1995; Bertsch et al., 1999).

Isoformen der IP3K

Dieses Enzym wurde aus der glatten Muskulatur der Schweineaorta, aus Rattenhirn, aus Rattenleber, aus Rinderhirn und aus menschlichen Thrombozyten aufgereinigt. Die ermittelten Molekulargewichte der IP3K aus diesen verschiedenen Quellen liegen in einem Bereich von 32 – 93 kDa. Diese Heterogenität der Polypeptide war auf die Existenz von Isoformen der Kinase (Takazawa et al., 1990) oder auf eine Proteolyse während der Proteinaufreinigung (Lee et al., 1990) zurückzuführen. Weiterhin wurde die Ins(1,4,5)P₃ in Makrophagen, in humanen Lymphozyten, im Rattenthymus und in der Retina identifiziert.

Aus etlichen Organen menschlicher sowie tierischer Herkunft ist es gelungen, cDNA's für verschiedene Isoformen der IP3K zu klonieren. Unter Verwendung von spezifischen Antikörpern konnte erstmals ein cDNA-Klon aus Rattenhirn isoliert werden, der für ein ca. 50 kDa großes Polypeptid mit IP3K Aktivität bei rekombinanter Expression codiert (Choi et al., 1990, Takazawa et al., 1990b). Die Expression dieser cDNA in COS-Zellen führte zur Synthese eines 53 kDa großen Polypeptides, welches mit der aus Rattenhirn gereinigten IP3K übereinstimmte (Choi et al., 1990). Dieses IP3K Enzym wird sehr spezifisch nur im ZNS exprimiert (die mRNA ist auch im Hoden exprimiert) und hat den Namen IP3K-A erhalten.

1991 konnten zwei unterschiedliche cDNA-Klone aus menschlichem Hirngewebe isoliert werden, die als Isoform A und B bezeichnet wurden (Takazawa et al., 1991a, Takazawa et al., 1991b). Der Klon der Isoform A weist eine 93%-ige Homologie zur cDNA aus Rattenhirn auf (Takazawa et al., 1991b). Zwischen den Isoformen A und B dagegen liegen größere Unterschiede in der Sequenz vor. Diese kommen hauptsächlich im Bereich der in der Isoform B längeren N-terminalen Domäne vor, deren Funktion bislang noch nicht vollständig geklärt ist. Die größte Homologie besitzen diese Isoformen in ihrer C-terminal gelegenen katalytischen Domäne (Takazawa und Erneux, 1991). Auch in einer allen Isoformen eigenen Calmodulin-Bindungsdomäne, welche direkt N-terminal vor der katalytischen Domäne gelegen ist, sind die Aminosäuresequenzen stark konserviert. Erst 2001 konnten durch die Arbeitsgruppe von Mayr (siehe Genbank gi:14329671) sowie durch Dewaste (Dewaste et al., 2002) Volllängenformen der Isoformen B aus Ratte und Mensch kloniert werden. Während die c-DNAs für die Isoformen A von Ratte und Mensch jeweils ein Protein von 51 kDa codieren, codieren die Volllängen cDNAs für die Isoformen B von Ratte und Mensch jeweils für ein Polypeptid von ca. 102 kDa. Sie besitzen also eine jeweils ca. 65 kDa große N-terminale Domäne mit noch weitgehend unbekannter Funktion. Der Grund für die zuvor gefundenen kürzeren codierenden cDNAs für die Isoform B waren Fehler sowohl bei der Klonierung einer für ein 75 kDa langes Polypeptid codierenden cDNA der Ratte (Thomas et al., 1994) als auch bei der Klonierung einer für ein 64 kDa Polypeptid codierenden humanen cDNA (Vanweyenberg et al., 1995). Diese kürzeren Proteine wie auch bis hin zur C-terminal gelegenen katalytischen Domäne verkürzte Fragmente des Enzyms waren bei rekombinanter Expression jeweils aktiv.

Die aus humanen Thrombozyten isolierte, ca. 80 kDa große IP3K wurde nicht von spezifischen Antikörpern, die Peptidsequenzen der humanen Isoformen A und B erkennen, detektiert. Dies gab Anlass für die Annahme einer dritten Isoform der IP3K (Communi et al., 1994). Eine solche dritte Isoform C wurde mittlerweile kloniert und im Humangenom gefunden. Eine cDNA- dieser Isoform wurde aus humanem Placenta- sowie aus humanem Schilddrüsengewebe im Jahr 2000 kloniert und sie kodiert für ein 75 kDa Polypeptid mit IP3K-Aktiviät bei rekombinanter Expression (Untersuchungsergebnisse der Erfinder; Dewaste et al., 2000) .

In Vogelerythrozyten konnten zwei Formen der Ins(1,4,5)P₃ 3-Kinase nachgewiesen werden. Hierbei handelt es sich um eine lösliche, Ca^2–/Calmodulin (Ca^2–/CaM) -insensitive und um eine membrangebundene mäßiggradig Ca²⁺/CaM-sensitive Form der Kinase (Morris et al., 1987). Die cytosolische, Ca²⁺/CaM-insensitive Form konnte gereinigt und kloniert werden (Bertsch et al., 1999). Es handelte sich bei dem sehr aktiven aus Erythrozyten gereinigten Enzym um ein 34 kDa großes, ganz offensichtlich N-terminal proteolytisch trunkiertes Polypeptid, welches nur noch die katalytische Domäne enthält. Auch ein entsprechend trunkiertes, bakteriell exprimiertes und gereinigtes Enzym zeigte identische enzymatische Eigenschaften. Die aus der vollständig klonierten cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz des codierten ca. 51 kDa großen Polypeptides weist vor allem in einer ca. 15 kDa großen Domäne N-terminal von der CaM Bindungsdomäne eine sehr hohe Homologie zu allen zuvor klonierten Isoformen A auf und nahezu keine Sequenzidentitäten zu den Isoformen B und C. Auch in der katalytischen Domäne weist diese Isoform am meisten Aminosäureidentitäten mit der Isoform A auf. Es handelt sich demnach klar um avine IP3K-A.

Anhand von Northernblot-Untersuchungen konnte eine gewebe- und zellspezifische Expression der IP3K Isoformen in Mensch und Ratte nachgewiesen werden. Die mRNA der Isoform A wird speziell im Gehirn und im Hoden der Ratte exprimiert, wobei Peptidantikörper nur einen klaren Nachweis des Enzyms im Gehirn ermöglichten.

Die mRNA für die Isoform B dagegen wird hauptsächlich in der Lunge, im Thymus, im Herzen, im Hoden und im Gehirn exprimiert. Weiterhin konnte die mRNA für IP3K-B in der humanen nicht-differenzierten promyelozytischen Leukämiezelllinie (HL-60) sowie in der humanen Gliomazelllinie (HTB-138) identifiziert werden (Vanweyenberg et al., 1995).

Die humane Isoform C der IP3K wird im Pankreas, im Skelettmuskel, in der Leber, in der Lunge und in der Plazenta exprimiert. Ebenso konnte eine geringere Expression in der Niere sowie im Gehirn nachgewiesen werden (Dewaste et al., 2000). Diese Isoform ist offensichtlich in einigen Blutzelllinien vorhanden und wird (zumindest bei der Ratte) in bestimmten Epithelzellen besonders stark (Untersuchungen der Erfinder) und in den meisten anderen Geweben nur schwach exprimiert.

Regulation der IP3K

Neben den verschiedenen Molekulargewichten, den Unterschieden in der Aminosäuresequenz sowie den unterschiedlichen gewebe- und zellspezifischen Expressionsmustern der drei Isoformen der IP3K konnten auch Unterschiede in der Regulation der Kinaseaktivität nachgewiesen werden.

Die Aktivität der IP3K wird sowohl durch Ca²⁺/CaM als auch durch Proteinphosphorylierung reguliert (Communi et al., 1995). Das aus verschiedenen Gewebe und Zelltypen gereinigte Enzym wird sehr unterschiedlich stark durch Ca²⁺/CaM stimuliert. Während die Isoform A bereits ohne CaM-Aktivierung sehr aktiv ist und durch Ca²⁺-CaM etwa um den Faktor 2 aktiviert wird, wird die Isoform B, welche ohne CaM Aktivierung nur gering aktiv ist, durch CaM sehr stark aktiviert. Die Isoform C scheint durch Ca²⁺-CaM schwächer als die Isoform B aktiviert zu werden (Dewaste et al., 2000).

Mehrere Studien ergaben, das IP3K durch PKC und cAMPabhängige Proteinkinase (PKA) phosphorylierbar sind. Es konnte gezeigt werden, dass eine Phosphorylierung der IP3K-A aus Rattenhirn durch PKA zu einer 1.8-fachen Erhöhung der Enzymaktivität führte. Wurde dagegen dieses Protein mittels der PKC phosphoryliert, reduzierte sich die Aktivität auf 25 der basalen Aktivität (Lin et al., 1990; Sim et al., 1990; Woodring und Garrison, 1997). Weiterhin wurde die IP3K-A durch die Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaMK-) phosphoryliert, wodurch die Enzymaktivität um das 8–10-fache anstieg und der K_m-Wert für CaM sich von 52 nM auf 2 nM verringerte (Communi et al., 1997). Entsprechend den Untersuchungen der Erfinder ist eine entsprechende Regulation auch an der Isoform B nachzuweisen.).

In Rattenfibroblasten konnte eine weitere Regulation der IP3K beobachtet werden. Wurden diese Zellen mit dem Onkogen v-src transformiert, erhöhte sich die Aktivität der Kinase um das 6–8-fache im zytosolischen Extrakt (Johnson et al., 1989; Mattingly et al., 1991; Woodring & Garrison, 1996). Dieses lässt auf eine Beteiligung von Proteintyrosinkinasen an der Regulation schließen, da durch die Transformation mit v-src das Produkt pp60^v-src gebildet wird, welches Tyrosinkinaseaktivität besitzt. Allerdings scheint nicht das Enzym selbst phosphoryliert zu werden, da in allen drei Isoformen keine prädizierten Tyrosin-Phosphorylierungsstellen gelegen sind.

Schlüsselrolle der IP3K bei Signaltransduktion und Biosynthese hochphosphorylierter Inositolphosphate.

Die zentrale Bedeutung der IP3K wird auch durch das ubiquitäre Vorkommen zumindest jeweils einer Isoform in allen bisher untersuchten tierischen Geweben und Zelltypen. (Irvine et al., 1986) sowie auf Grund ihrer hohen spezifischen Aktivität (von ca. 1 bis 30 U/mg je nach CaM-Aktivierungszustand) deutlich.

In Sekunden- bis Minutenperioden durch PLC Aktivierung freigesetztes Ins(1,4,5)P₃ wird hierdurch nahezu unverzögert in Ins(1,3,4,5)P₄ konvertiert. Durch diese Phosphorylierung wird Ins(1,4,5)P₃ eliminiert und das in tierischen Zellen bislang einzig bekannte Substrat für die Biosynthese aller höher phosphorylierten Inositole (InsP₄, InsP₅, InsP₆) gebildet.

Weiterhin kommt es durch die Konversion zu Ins (1,3,4,5)P₄ nicht nur zu einer Beendigung des Ins(1,4,5)P₃-Signals, in Neuronen scheint es auch zu einer Sensitisierung für ein nachfolgendes Ins (1,4,5)P₃-Signal zu kommen (Irvine und Schell, 2001) . Durch das entstandene Ins(1,3,4,5)P₄ wird die 5-Phosphatase, welche neben IP3K für die Elimination von Ins(1,4,5)P₃ zuständig ist und von welcher es in vielen Zellen mehr als eine Isoform zu geben scheint (s.o.), kompetitiv blockiert. Das beruht darauf, dass dieses Enzym das letztere InsP4 Isomer ca. 10-fach affiner bindet als Ins(1,4,5)P₃, das Ins (1,3,4,5)P₄ jedoch deutlich langsamer als Ins (1,4,5)P₃ dephosphoryliert. Bei einer schnellen erneuten Ins(1,4,5)P₃ Freisetzung ist deshalb die 5-Phosphatase für die Dephosphorylierung von Ins(1,4,5)P₃ partiell blockiert. In der Konsequenz dauert nun das Ins(1,4,5)P₃ Signal bei gleicher freigesetzter Menge an Ins(1,4,5)P₃ vermutlich länger an oder erreicht ein höheres Maximum.

Die weitere Metabolisierung von Ins(1,3,4,5)P₄ erfolgt vor allem durch eine Dephosphorylierung durch die oben erwähnte 5-Phosphatase zu Ins(1,3,4)P₃. (Erneux et al., 1998). Sowohl ausgehend von Ins(1,3,4)P₃, als auch direkt aus Ins(1,3,4,5)P₄ kann das in allen Zellen in der höchsten Konzentration (5–60μM) vorhandene InsP₅ Isomer, Ins (1,3,4,5,6)P₅, synthetisiert werden. Direkt aus Ins(1,3,4,5)P₄ bewerkstelligt dies über eine Phosphorylierung an 6-OH eine Inositolphosphat-Multikinase (IPMK), welche ebenfalls homolog zur IP3K ist, sich jedoch in der Sequenz und in der Substratselektivität stärker von den IP3K's unterscheidet (s.u.). Ins(1,3,4)P₃ wird durch eine von IPMK verschiedene Ins(1,3,4)P₃-5/6-Kinase (Wilson und Majerus, 1996) zu Ins Ins(1,3,4,6)P₄ phosphoryliert, letzteres wird dann durch eine Ins(1,3,4,6)P₄-5-Kinase (nach unseren unveröffentlichten Daten ist dies IPMK) abermals zu Ins(1,3,4,5,6)P₅ phosphoryliert. Interessanterweise wird durch Ins(1,3,4)P₃-5/6-Kinase aus Ins(1,3,4)P₃, auch wieder zum Teil Ins(1,3,4,5)P₄ gebildet, es wird so möglicherweise dafür gesorgt, dass Ins(1,3,4,5)P₄ möglichst lange hoch bleibt.

Inositolpolyphosphat-Multikinase (IPMK) als IP3K komplementierendes multifunktionales Enzym.

Neben den drei Isoformen der IP3K gibt es in allen Eukaryonten ein weiteres Enzym, welches Ins(1,4,5)P₃ zu Ins(1,3,4,5)P₄ phosphorylieren kann. Dieses Enzym, welches als Inositolpolyphosphat Multikinase (IPMK) bezeichnet wird (Shears, 2000), wurde zuerst in Hefe als das schon länger charakterisierte Genprodukt des Gens ArgRIII identifiziert. Das nukleäre Hefeprotein ArgRIII hat vielfältige Funktionen. Es ist ein Transkriptions-Regulator im Arginin-Metabolismus (El Bakkoury et al., 2000), eine Inositol Polyphosphat Multikinase (Saiardi et al., 1999; Odom et al., 2000; Zhang et al., 2001) mit einer wichtigen Rolle im Inositolphosphat-Metabolismus (Saiardi et al., 2000) und ein wichtiger Faktor beim mRNA-Export aus dem Zellkern (Saiardi et al. 2000; York et al., 1999) .

Die enzymatischen Eigenschaften von ArgRIII wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen in vitro untersucht. ArgRIII phosphoryliert verschiedene Inositolphosphate an 3- und 6-Position. Das Ins(1,4,5)P₃ wird umgesetzt zum Ins(1,3,4,5)P₄ (Saiardi et al., 1999) und zum Ins(1,4,5,6)P₄ (Saiardi et al., 1999; Odom et al., 2000). Es erfolgt eine weitere Umsetzung des Ins (1,3,4,5)P₄ (Saiardi et al., 1999; Zhang et al., 2001) und des Ins (1,4,5,6)P₄ (Saiardi et al., 1999; Odom et al., 2000) zum Ins (1,3,4,5,6)P₅. Außerdem kann ArgRIII auch eine Pyrophosphatgruppe einfügen. Das Ins(1,3,4,5,6)P₅ wird umgesetzt zu einem PP-InsP₄ (Zhang et al., 2001).

Die enzymatischen Eigenschaften von ArgRIII wurden auch in vivo untersucht (Saiardi et al., 2000). Hierzu wurde das Inositolphosphat-Profil von ArgRIII-Deletions-Hefen mit dem von Wildtyp-Hefen verglichen. Die Konzentrationen von Ins(1,4,5)P₃ und InsP₂ sind im Deletionsstamm stark erhöht. Durch Phospholipase C-Aktivität wird Ins(1,4,5)P₃ gebildet, das nicht mehr durch ArgRIII umgesetzt wird. Es erfolgt ein teilweiser Abbau zum InsP₂. Die Inositolphosphate Ins(1,4,5,6)P₄ und Ins(1,2,4,5,6)P₅ sind nicht mehr nachweisbar. Ihre Synthese verläuft also in vivo ausschließlich ArgRIII-abhängig.

Ins(1,3,4)P₄ und ein weiteres InsP₄-Isomer, sowie Ins(1,3,4)P₅ und Ins(1,3,4,5,6)P₅ können hingegen auch ArgRIII-unabhängig gebildet werden. Bemerkenswerterweise wird Ins(1,3,4,5)P₄ sogar nur in der Deletionsmutante gebildet.

Die in vitro gezeigte Bildung von Ins(1,3,4,5)P₄ durch ArgRIII wird also in vivo nicht gesehen.

Über ArgRIII-unabhängige Stoffwechselwege wird zwar weiterhin InsP₆, PP-InsP₅ und PP2-InsP₄ gebildet, wenn auch in gegenüber dem Wildtyp stark bzw. deutlich verringerten Mengen. ArgRIII spielt also in vivo eine wichtige Rolle im Inositolphosphat-Metabolismus der Hefe.

Ein homologes Protein wurde aus der Ratte kloniert und charakterisiert (Saiardi et al., 2001). Das menschliche Gen wurde erstmals von zweien der Erfinder identifiziert und kloniert, bakteriell exprimiert und charakterisiert. Diese Klonierung und eine erste Charakterisierung als ebenfalls nukleäres Enzym sowie die Verwendung des menschlichen Gens oder Proteins für das unten erläuterte Screeningverfahren sind Bestandteil dieser Erfindung. Neben der o.g. Phosphorylierung kann dieses Enzym eine relativ große Zahl weiterer biologischer Inositolphosphat-Isomere spezifisch phosphorylieren. Einige dieser zusätzlichen von uns in vitro nachgewiesenen Phosphorylierungsreaktionen (Publikation eingereicht) sind mit Wahrscheinlichkeit ebenfalls für die Biosynthese bestimmter zellulärer InsP₅ Isomere und von InsP₆ aus niedrig phosphorylierten Inositolen von Bedeutung. Auch das menschliche Enzym kann unter bestimmten Bedingungen Diphosphoinositolphosphate aus Ins(1,3,4,5,6)P₅ synthetisieren.

Die IPMK, von der bisher in höheren Vertebratengenomen im Gegensatz zur IP3K bisher nur immer ein funktionales Gen gefunden wurde, kann über ihre zum Teil mit der IP3K-analoge Reaktionsselektivität bei genügend starker Expression (IP3K besitzt eine bis zu 10-mal höhere spezifische Aktivität für die Phosphorylierung von Ins(1,4,5)P₃ als IPMK) die Funktion des ersteren Enzyms u.U. substituieren. Eine pharmakologische Hemmung von IP3K könnte also ggf. durch eine Überexpression von IPMK zumindest teilweise kompensierbar sein. Daneben erfüllt die IPMK bei der Biosynthese von höheren Inositolphosphaten ganz spezifische Funktionen, welche offensichtlich spezifisch für dieses Enzym sind und welche abgeleitet von den Ergebnissen der Hefemutanten, zumindest dort auch nicht durch andere Enzyme voll substituierbar sind.

Die Biosynthese hochphosphorylierter Inositole und vor allem von InsP₆ ist essentiell für das normale Zellwachstum

Eine Deletion des Gens für das nukleäre Protein ArgRIII hemmt auch in Gegenwart von genügend Arginin massiv das Hefewachstum, offensichtlich über die Hemmung der Biosynthese von InsP₆ Isomeren und vor allem von InsP₆. Eine entsprechende Deletionsmutante in Hefe zeigt eine deutlich erniedrigte InsP₆ Biosynthese und einen stark gehemmten Export der Polymerase II abhängigen polyadenylierten mRNAs (York et al., 1999; Saiardi et al., 2000). Darüber hinaus zeigt diese Hefemutante eine stark veränderte und gestörte Struktur der intrazellulären Vakuolen. Diese sind bei der Mutante stark fragmentiert.

Beide offensichtlich durch den Mangel an bestimmten InsP₅ Isomeren und die Abnahme von InsP₆ bedingten Störungen könnten essentiell für das gehemmte Wachstum der Hefen sein. Da in einem Screening nach den polyA+-RNA Export hemmenden Hefemutanten auch eine Mutante mit fehlender PLC (s.o.) sowie eine Mutante mit einer fehlenden, offensichtlich nur in Pilzen vorhandenen, ebenfalls nukleär lokalisierten Ins(1,3,4,5,6)P₅-2-Kinase, welche in Hefe für die ausreichende nukleäre InsP6-synthese essentiell zu sein scheint, identifiziert wurden, wird diese Hypothese noch weiter erhärtet.

Die Störungen der vakuolären Sortierungsprozesse könnte darauf zurückzuführen sein, dass InsP₆ durch seine Wechselwirkung mit Adapterproteinen (AP2, AP3/AP180, Arrestin ß, COPI, Synaptotagmin, siehe Zusammenfassung: Irvine und Schell, 2001) bei einer Reihe von speziellen Membran-Sortierungsprozessen eukaryontischer Zellen eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus konnte kürzlich eine durch InsP₆ aktivierte Proteinkinase nachgewiesen werden (Hilton et al., 2001), welche bei der Regulation der endozytotischen Maschinerie durch modulierte Wechselwirkung des durch die Kinase phosphorylierten Pacsin/Syndapin mit Dynamin eine wichtige Rolle spielt.

Untersuchungen der Erfinder an wachsenden Zellen haben gezeigt, dass beim Zellwachstum in etwa parallel zur DNA-Replikation eine Verdoppelung des zellulären InsP₆ stattfindet. Diese Beobachtung ist mit der Hypothese kompatibel, dass eine bestimmte Menge an zellulärem InsP₆ für die normale Zellteilung essentiell ist.

Eine für das normale Zellwachstum überaus wichtige Rolle spielt InsP₆ bei der sog. nicht-homologen Ligation von chromosomalen DNA-Doppelstrangbrüchen (non-homologous endjoining, NHEJ). Dieser Prozess wird von einem Komplex aus fünf verschiedenen Proteinen (zwei mit den chromosomalen Bruchenden assoziierten Komplexen aus DNA-PK, Ku80 und Ku70, der Ligase IV und dem Protein XRCC4 katalysiert. Eine zellfreie Durchführung dieser Ligationsreaktion mit chromatographisch gereinigten Proteinen war nur möglich, wenn ein Nicht-Proteinfaktor aus einer anderen chromatographischen Fraktion wieder zugesetzt wurde, welcher durch eine präzise Analyse als InsP₆ identifiziert wurde (Hanakahi et al. 2000). Weitere Untersuchungen zeigten, dass InsP₆ hierbei mit der Untereinheit Ku interagieren musste und nicht mit DNA-PK (Ma und Lieber, 2002). Aus dieser essentiellen Rolle von InsP₆ bei diesem in höheren Eukaryonten sehr bedeutsamen Mechanismus der Doppelstrangbruch-Reparatur lässt sich eine weitere kausale Rolle der InsP₆-Biosynthese beim normalen Zellwachstum ableiten. Nicht-reparierte Doppelstrangbrüche verhindern im Normalfall bei Zellen den Eintritt in die S-Phase bzw. in die Mitosephase.

Die Tatsache, dass alle Wachstumshormone und Wachstumsfaktoren zu einer Stimulation der PLC führen und dass in v-src-transformierten Fibroblasten die IP3K Aktivität signifikant ansteigt, untermauert weiter die Bedeutung der Biosynthese von Inositolphosphaten beim Zellwachstum. In diesen Fällen ist die Aktivierung der PLC-γ bzw. PLC-β deutlich länger anhaltend, im Maximum der InsP₃ Freisetzung oft moderater als bei Agonisten-Stimulationen, welche vor allem Calciumsignale auslösen. Dies und die Überexpression von IP3K in zahlreichen Tumorzelllinien, z.B. auch in Jurkat Zellen, weist darauf hin, dass diese Stimulation der PLC und der IP3K vor allem der Biosynthese von höher phosphorylierten Inositolphosphaten dienen.

LITERATUR

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Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen

Proliferative Erkrankungen zeichnen sich dadurch aus, dass Zellen eines Gewebes nicht mehr der gewebespezifischen Kontrolle der Zellproliferation unterliegen. An dieser gewebespezifischen Kontrolle sind rezeptorassoziierte Proteinkinasen und einige Phosphoinositidkinasen und Proteinkinasen der zellulären Signalübertragungswege wesentlich beteiligt. Daher stellen besonders diese Kinasen Zielstrukturen für die Suche nach Inhibitoren dar. Die Hoffnung ist, mit Hilfe derartiger Inhibitoren neue Wirkstoffe für die Therapie von proliferativen Erkrankungen, besonders von Tumorerkrankungen zu finden.

Die bisher für diese Wirkstoffsuche ausgewählten Kinasen sind umfassend von Sedlacek Drugs 59:435-476, 2000 und Sedlacek Critical Reviews in Oncology/Hematology, 38: 139-170, 2001 beschrieben worden.

Gegenstand der Erfindung ist nun der überraschende Befund, dass neben diesen bislang für die Tumorzellproliferation als wesentlich angesehenen Protein- und Phosphoinositidkinasen die Inositolphosphatkinasen IP3K und IPMK auch entscheidend an der Proliferation von Zellen beteiligt ist und die Hemmung von IP3K und IPMK bei jedem bisher in vitro am rekombinanten Enzym identifizierten potenten Hemmstoff die Proliferation von Tumorzellen hemmt und in der Regel auch zu deren Apoptose führt.

Gegenstände der Erfindung sind in den Patentansprüchen 14 bis 23 angegeben.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen, dadurch charakterisiert, dass es aus einer (a oder b), zwei (a + c oder a + b oder b + c) oder drei (a + b + c) der folgenden Komponenten besteht bzw. diese enthält:

a) eine IP3K aus welcher Spezies und in welcher Isoform auch immer (A, B, oder C), wobei diese IP3K mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IP3K und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IP3K derartig zu hemmen in der Lage ist, dass das Substrat Ins(1,4,5)P₃ nicht oder nur gering phosphoryliert wird.
b) Eine IPMK aus welcher Spezies auch immer und in welcher Isoform auch immer, wobei die IPMK mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IPMK und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IPMK derartig zu hemmen in der Lage ist, dass eines seiner Substrate nicht oder nur gering phosphoryliert wird. Im besonderen ist Gegenstand der Erfindung die humane Isoform der IPMK und das humane Gen für dieses Enzym, welches gemäß dieser Erfindung identifiziert und in der humanen Form kloniert wurde, die Verwendung der DNA-Sequenz dieses Genes oder von Teilen hieraus für die Expression des Enzyms oder eines Teiles des Enzyms in welchen Zellen auch immer, die Verwendung des vollständigen oder partiellen Genproduktes sowie von Genprodukten, welche homolog sind zu dem erfindungsgemäßen Genprodukt oder von aktivierenden oder inaktivierenden Mutationen des erfindungsgemäßen Genes.
c) Eine Zelle, bevorzugt einer Tumorzelle, zu welcher eine Substanz, welche in der Lage ist, eine IP3K zu hemmen, hinzugegeben wird und geprüft wird, ob diese Substanz das Wachstum der Zelle hemmt und/oder die Zelle tötet.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Substanzen, welche in der Komponente a) bzw. b) und in der Komponente c) des erfindungsgemäßen Testsystems Wirksamkeit zeigen und die Verwendung dieser Substanzen für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung.

Zu diesen erfindungsgemäßen Substanzen gehören Quercetin, Myricetin und deren Derivate, Gossypol, Aurintricarbon- säure (Aurintricarboxylic acid, ATA), Hypericin und die Grüntee-Catechinderivate ECG und EGCG. Für diese Substanzen ist bereits eine antitumorale Wirksamkeit beschrieben worden.

Zu den erfindungsgemäßen Substanzen gehören des weiteren Ellagsäure, 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon, Fisetin, Galangin, Robinetin, Luteolin, Chrysin, Amentoflavon, Pyrogallolrot, Brompyrogallolrot, Bengalrosa B, Chinalizarin, Chlorogensäure, Bis-Tyrphostin, und Rottlerin. Die antiproliferative Wirksamkeit dieser Substanzen ist neu.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Verabreichung einer Kombination von mindestens zwei der erfindungsgemäßen (verschiedenen, aus einer oder beiden der vorstehenden Gruppen) Substanzen für die Prophylaxe und oder Therapie einer proliferativen Erkrankung. Die Kombination kann erfolgen in Form der Herstellung eines Gemisches aus gleichen oder ungleichen Anteilen der erfindungsgemäßen Substanzen und die Verabreichung des Gemisches zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung. Die Kombination kann jedoch auch erfolgen durch Verabreichung der jeweiligen erfindungsgemäßen Einzelsubstanzen getrennt voneinander entweder gleichzeitig oder nacheinander innerhalb eines Zeitraumes, in welchem die Wirkung der zuerst verabreichten Substanz noch anhält. Dieser Zeitraum umfasst im Regelfall maximal zwei Wochen. Bevorzugt werden die maximal antitumoral wirksamen, nicht toxischen Dosen der jeweiligen erfindungsgemäßen Substanzen miteinander kombiniert.

Die erfindungsgemäßen Substanzen werden als wässrige Lösung, als Suspension, als Salbe, als Pulver, als Granulat, in Kapseln oder als Tabletten verabreicht. Die Herstellung der jeweiligen Wirkstoffzubereitung ist dem Fachmann geläufig.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgt vorzugsweise oral. Salben werden lokal, Lösungen und Suspensionen werden bevorzugt parenteral verabreicht. Die parenterale Verabreichung kann in das Gefäßsystem, in ein Organ, in eine Körperhöhle oder in das Bindegewebe erfolgen.

Beispiele zur Erläuterung des Erfindungsgedankens

Methoden

Expression und Reinigung der rekombinanten IP3K-A, der rekombinanten humanen IP3K-B und ihrer Mutanten und der sowie der rekombinanten IP3K-C aus Ratte

Die rekombinante IP3K-A aus Huhn (Gg-IP3K-A) und deren Mutanten, die rekombinante humane IP3K-B (Hs-IP3K-B) sowie die IP3K-C der Ratte (Rn-IP3K-C) wurden wie folgt rekombinant hergestellt:

Ein Fragment der Gg-IP3K-A von 306 Aminosäuren, welches die C-terminale katalytische Domäne und eine benachbarte Calmodulin-Bindungsdomäne aufweist, wurde in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert und durch Phosphocellulose- sowie Calmodulin-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt (Bertsch et al. 1999).

In gleicher Weise wurden die durch gezielte Mutagenese hergestellten Mutanten der IP3K-A exprimiert und gereinigt. In diesen Mutanten ist jeweils die Aminosäure Lysin durch eine andere Aminosäure (Arginin, Glutamin, Leucin, Asparaginsäure, Glutaminsäure) ausgetauscht worden (Bertsch et al., 2000). Die m-RNA für die Herstellung rekombinanter humaner IP3K-B (Hs-IP3K-B) wurde aus humanen myeloischen TF 1-Zellen mittels einer Total-RNA-Präparation isoliert. Die cDNA für diese Isoform wurde von der Poly-A+ RNA mittels RT-PCR kloniert. Anschließend wurde ein c-DNA-Fragment von 976 Basenpaaren, welches die Calmodulin-Bindungsdomäne und die katalytische Domäne enthält, in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert. Die Aufreinigung des Enzyms bis zur Homogenität erfolgte mit Hilfe einer P11-Phosphocellulose- und einer Calmodulin-Sepharose-Säule analog der Methode von Bertsch et al. (1999).

Die c-DNA für die Herstellung rekombinanter IP3K-C aus Ratte (Rn-IP3K-C) wurde aus einer Ratten c-DNA Bibliothek in Volllängenform kloniert (Schmale, unveröffentlicht). Anschließend wurde ein c-DNA Fragment, welche die Calmodulin-Bindungsdomäne und die katalytische Domäne enthält, in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert und analog der Isoform B aufgereinigt.

Expression und Reinigung von rekombinanter humaner IPMK

Ein Expressionsvektor für die Volllängenform der HsIPMK wurde durch PCR-Techniken erzeugt. Das gemäß dieser Erfindung entdeckte offene Leseraster der HsIPMK (siehe Anhang 1) wurde hierzu mit folgendem Primerpaar amplifiziert: 5'AGCCATGGCATGGCAACAGAGCCACCATCC3' (Seq.-ID 1), 5'AGCTCGAGTCAATTGTCTAAAATACTTCGAAG3' (Seq.-ID 2). Eine NcoI Restriktionsstelle wurde am 5'-Ende eingefügt, eine XhoI Restriktionsstelle am 3'-Ende. Das PCR-Produkt wurde zuerst in den pGEM T Easy vector (Promega, Mannheim, Germany) kloniert. Das offene Leseraster wurde vollständig re-sequenziert und dann wurde das erzeugte Fragment über die eingefügten Restriktionsstellen in einen pETl7b basierten Expressions-Vektor (Novagen, Madison, USA) subkloniert.

Das rekombinante Fusionsprotein mit einem N-terminalen Streptag wurde in E. coli BL21(DE3)pLysS[pREP4] überexprimiert. Nach zwei Stunden Induktion mit 0,5mM IPTG bei 37°C wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 4000g für l0min geerntet und in 1/20 des Kulturvolumens resuspendiert (50mM HEPES pH7,5; 1mM EDTA; 1mM DTT; 0.5% TritonX-100; 0.5mM Benzamidin; 1mM PMSF). Nach Sonifikation für eine Minute wurde das Lysat bei 12000g für l0min (4°C) zentrifugiert. Die HEPES Konzentration im Überstand wurde durch 1:2 Verdünnung auf 25mM eingestellt, hierbei wurde die Konzentration der anderen Komponenten erhalten. Der Überstand wurde auf eine DEAE-Sephacel Säule gegeben und die HsIPMK wurde überwiegend im Durchfluss gefunden, während die anderen Proteine zum überwiegenden Teil gebunden wurden. Zur weiteren Anreicherung des Proteins wurde der Durchfluss auf eine Phosphocellulose Säule gegeben, gewaschen und eluiert mit folgendem Puffer (25mM HEPES pH7,5; 750mM NaCl; 1mM EDTA; 1mM DTT; 0.1% TritonX-100).

Das gereinigte Protein und BSA Standard Proben wurden auf einer SDS-PAGE getrennt und die Produkte wurden mit Coomassie Blau gefärbt. Digitalisierte Bilder wurden mit einem Durchlicht Scanner Sharp JX-325 (Sharp) erzeugt. Die Menge von HsIPMK wurde mit dem Programm ImageMaster1D (Pharmacia) quantifiziert. Nach Auftrennung durch SDS-PAGE und Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose Membran wurde die HsIPMK mit Nterminalem Strep-tag mit einem Avidin-alkalische-Phosphatase Konjugat (Bio-Rad, California, USA) nachgewiesen.

Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C und IPMK im gekoppelten optischen Test Die Enzymaktivitätsbestimmungen wurden mit Hilfe eines gekoppelten optischen Tests, in dem die Bildung von ADP aus ATP (Phosphatdonor) durch IP3K mit dem Verbrauch an NADH mittels der Pyruvatkinase- und Lactatdehydrogenase-Reaktionen gekoppelt wurde, durchgeführt. Dargestellt ist dies am Beispiel der Reaktion von IP3K, welche mit IPMK analog durchgeführt wurde:

ADP, ein Produkt der IP3K-Katalysereaktion, reagiert unter Mitwirkung von Pyruvatkinase (PK) mit Phosphoenolpyruvat (PEP) zu ATP und Pyruvat. Die Lactatdehydrogenase (LDH) reduziert in Gegenwart von NADH das entstandene Pyruvat zum Laktat. Die Abnahme an NADH wurde in einem thermostatisierten Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 339 nm oder 440 nm und einer Temperatur von 30°C gemessen. Für die Messungen wurden Quarzküvetten oder Plastikküvetten mit einer Schichtdicke von 10 mm verwendet. Der Standardreaktionsmix hatte die folgende Zusammensetzung: 0.2 mM NADH, 1 mM PEP, 10 mM Triethanolamin-HCl pH 7.5, 30 mM KCl, 1 mM DTT, 500 μM ATP, 5 U/ml L-LDH, 2.5 U/ml PK. Das Endvolumen des Testmixes betrug 800 μl. Zu diesem Mix, der bei 30 °C für 10 Minuten vorinkubiert wird, wurde die in 10 mM Triethanolamin-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT vorverdünnte IP3K mit einer Endkonzentration von 4.8 nM bis 100 nM und die IPMK in einer Konzentration von 140 nM (maximal 10 μl) pipettiert. Nach einer weiteren Inkubation von 10 Minuten bei 30 °C und Messung des basalen Umsatzes von ATP in Abwesenheit des zweiten Substrats (herrührend von der Kontamination der Kopplungsenzympräparation mit ATPasen) wurde die maximale Enzymaktivität durch Zugabe von 25 μM Ins(1,4,5)P₃ (8 μl einer 2.5 mM Stocklösung) gemessen. Die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten für NADH (ε = 6.3 l*mmol^–1*cm^–1) aus den Steigungen der Kurven ermittelt.

Zur Bestimmung des apparenten K_m-Wertes (K_m,app) für Ins(1,4,5)P₃ wurden die jeweiligen Ansätze durch Zugabe unterschiedlicher Endkonzentrationen von Ins(1,4,5)P₃ (2, 3, und 5 μM, 6.4 – 16 μl aus einer 0.25 mM Stocklösung; 10, 15 und 25 μM, 3.2 – 8 μl aus einer 2.5 mM Stocklösung) gestartet und bis zur kompletten Substratumsetzung verfolgt ("single transient", Gutfreund 1972). Die ATP-Konzentration wurde innerhalb einer Messreihe konstant gehalten, variierte aber von Messreihe zu Messreihe (125–1000 μM).

Zur Bestimmung der apparenten K_m-Werte für ATP wurde dessen Konzentration zwischen 62.5 und 1000 μM variiert und die Reaktion mit jeweils 25 μM Ins(1,4,5)P₃ gestartet.

Inhibierung der Aktivitäten von IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C sowie IPMK

Zur Herstellung von Stocklösungen wurden die Hemmstoffe unter Lichtausschluss mit einer Konzentration von 3 – 20 mM in DMSO gelöst und bei – 20 °C gelagert. Vor Gebrauch wurden Aliquots dieser Stocklösungen bis zu einer Konzentration von 0.05 – 1 mM mit DMSO verdünnt. Die Enzymaktivitäten wurden unter Anwendung des oben dargestellten gekoppelten optischen Tests gemessen, indem die Reaktion mit 25 μM Ins(1,4,5)P, gestartet wurde. In Abwesenheit eines Hemmstoffes und bei einer Enzymkonzentration von 4.8 nM verblieb die Enzymaktivität für 10 bis 15 Minuten bei der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (V_max) von 1 μM/min. In dieser Periode wurden die Hemmstoffe unter Lichtausschluss in Volumina von 1 – 2 μl stufenweise bis zum Erreichen des maximalen Hemmeffekts oder einer Konzentration von 100 μM dazu pipettiert. Die Endkonzentration von DMSO betrug maximal 3% (v/v) und hatte keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, wie Kontrollmessungen ergaben. Diese Messungen wurden ebenfalls mit der humanen Ins(1,4,5)P₃ 3-Kinase B durchgeführt, die in einer Konzentration von 16.88 nM vorlag.

Untersuchung des Einflusses der Hemmstoffe auf die Kopplungsenzyme des optischen Tests Der Standardreaktionsmix wurde bei 30 °C für 10 Minuten sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Hemmstoff und ohne Zugabe von IP3K oder IPMK inkubiert. Anschließend wurde ADP in einer Endkonzentration von 10 μM zum Reaktionsmix pipettiert und der schnelle Verbrauch an NADH gemessen. Bei keinem der getesteten Hemmstoffe konnte eine Hemmung der Aktivität der Kopplungsenzyme (PK, LDH) beobachtet werden.

Zellkulturen

Kultivierung von in Suspension wachsenden humanen Leukämiezellen (Jurkat T-Zellen, HL60-Zellen).

Für die Kultivierung von Jurkat T-Zellen wurde die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzahlbestimmungsgerätes (Coulter Counter, bestimmt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 2 × 10⁵/ml in 25 cm³- bzw. 75 cm³- oder 3 × 10⁵/ml in 175 cm3-Kulturflaschen mit Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10% FBS) verdünnt. Diese Subkultivierung war nach 2 – 3 Tagen wieder erforderlich, wenn die Substrate des Mediums von den Zellen metabolisiert waren.

Kultivierung von adhärenten Fibroblasten der Maus (NIH 3T3) sowie von Ovarialcarcinom-Zellen des chinesischen Hamster (CHO-Zellen)

Die Ablösung der Fibroblasten vom Boden der Zellkulturflasche erfolgte durch Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung. Anschließend wurde ein 10-faches Volumen an serumhaltigen Medium dazugegeben, wodurch das Trypsin inaktiviert wird. Danach wurde die Zellzahl mit Hilfe des Coulter Counters bestimmt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 1 × 10⁵/ml in 25 cm³- oder in 75 cm³-Kulturflaschen mit Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS) ausgesät. Die Subkultivierung wurde jeweils nach 3 – 4 Tagen wiederholt, da die Substrate des Wachstumsmediums von den Zellen verstoffwechselt waren.

Kultivierung von humanen Mammacarcinom-Zellen (MCF7) sowie von humanen Coloncarcinoma-Zellen (HT29).

Die Ablösung der adhärent wachsenden Zellen vom Boden der Zellkulturflasche erfolgte durch Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung. Anschließend wurde ein 10-faches Volumen an serumhaltigen Medium dazugegeben, wodurch das Trypsin inaktiviert wird. Danach wurde die Zellzahl mit Hilfe des Coulter Counters bestimmt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 1 x 10⁵/ml in 25 cm³- oder in 75 cm³-Kulturflaschen mit Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10% FBS) ausgesät. Die Subkultivierung wurde bei MCF-7 Zellen jeweils nach 3 – 4 Tagen, bei HAT-29 Zellen jeweils nach 2–3 Tagen wiederholt, da die Substrate des Wachstumsmediums von den Zellen verstoffwechselt waren.

Bestimmung der Vitalität von Zellen

200 μl der homogenen Zellsuspension wurden in ein Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf) pipettiert und mit 200 μl einer 0.4%-igen Trypanblau-Lösung (in 0.81% NaCl, 0.06% KCl) versetzt. Anschließend wurde der Testansatz mit einer Pipette durchmischt und in der Neubauer-Zählkammer (Fa. Greiner) die ungefärbten (lebend) und die blau angefärbten (toten) Zellen ausgezählt und in Prozenten angegeben.

Proliferationshemmung von Jurkat T-Zellen, HL60 Zellen und HT29 Zellen

Die exponentiell wachsenden Zellen in Suspensionskultur (Jurkat, HL60) bzw. die bis zu einer Konfluenz von 70% herangewachsenen durch Trypsin-Behandlung in Suspension gebrachten HT29 Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁴/200μl Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 2% FBS) in 96-Loch-Platten ausgesät. Zur Analyse des Hemmstoffeffektes auf die Zellproliferation wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz für 72 Stunden sowie mit dem entsprechender Volumen an DMSO als Kontrolle im Dunkeln inkubiert, wobei nach 24 Stunden ein Mediumwechsel und die Zugabe an frischem Hemmstoff erfolgte. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde die Zellzahl sowie die Überlebensrate der Zellen ermittelt.

Für diese Analyse wurden zunächst die Hemmstoffe unter Lichtausschluss mit einer Konzentration von 3 – 20 mM in DMSO gelöst und bei –20 °C gelagert. Vor Gebrauch wurden Aliquots dieser Stocklösungen mit Wasser bis zu einer Konzentration von 2 – 2000 μM verdünnt, aus denen wiederum die weiteren Verdünnungen der jeweiligen Testsubstanzen mit einer Mischung von DMSO:Wasser, die dem im Aliquot vorhandenen Mischungsverhältnis entspricht, angefertigt wurden. Da für jeden Reaktionsansatz eines Hemmstoffes immer das gleiche Volumen pipettiert wurde, wurde die Konzentration an DMSO konstant gehalten. Die Endkonzentration von DMSO im Medium betrug maximal 0.5 % (v/v) und hatte keinen Einfluss auf die Proliferation der Zellen wie Kontrollmessungen ergaben.

Proliferationshemmung von NIH 3T3-Zellen, CHO-Zellen und MCF7-Zellen

Die NIH 3T3-Zellen sowie die CHO-Zellen und die MCF-7-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁹/200μl Wachstumsmedium (DMEM + 2% FBS bzw. RPMI 1640 + 2% FBS) in 96-Loch-Platten ausgesät. Zur Analyse des Hemmstoffeffektes auf die Zellproliferation wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz für 72 Stunden sowie mit dem entsprechenden Volumen an DMSO als Kontrolle im Dunkeln inkubiert, Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde die Zellzahl sowie die Überlebensrate der Zellen ermittelt. Nach 24 Stunden erfolgte bei diesen Zelllinien kein Mediumwechsel sowie keine Zugabe an frischer Testsubstanz.

Die Herstellung der Hemmstofflösungen erfolgte wie bei den Jurkat T-Zellen beschrieben.

Einfluss von Hemmstoffen auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen

Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10⁶/25 ml Wachstumsmedium in 75 cm³-Zellkulturflaschen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanz versetzt. Das entsprechende Volumen an DMSO wurde auf die Kontrollzellen pipettiert. Nach weiteren 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel sowie die Zugabe von frischem Hemmstoff. Nach einer insgesamt 48-stündigen Inkubationszeit wurden 1 x 10⁵ Zellen entnommen, bei 2000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und das alte Medium abgesaugt. Anschließend wurden die Zellen in 200 μl gekühltem PBS resuspendiert, in 1 ml bei –20 °C vorgekühltem Methanol pipettiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Hiernach wurden die Zellen bei 2000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das PBS/Methanol-Gemisch wurde abgegossen, die Zellen in 500 μl kaltem PBS resuspendiert und mit 5 μl einer 5 mg/ml RNAse (Endkonzentration: 50 μg/ml) sowie mit 25 μl einer 1 mg/ml Propidiumiodid-Lösung (Endkonzentration: 50 μg/ml) versetzt. Es folgte eine Inkubation von 30 Minuten bei 37 °C im Dunkeln. Die Verteilung der DNA wurde mittels eines Durchflusszytometers (Fa. Becton Dickinson) gemessen, wobei 20000 Zellen pro Messung verwendet wurden. Die DNA-Verteilung wurde anschließend mit Hilfe des Computerprogramms ModFit kalkuliert.

5-Bromo-2'deoxy-uridin-Einbau in Jurkat T-Zellen

Die exponentiell wachsenden Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁴/100 μl RPMI 1640 Medium, 10% FBS, in einer 96-Loch-Platte in einem Volumen von 100 μl/Loch ausgesät. Nach 24 Stunden erfolgte sowohl die Zugabe des Hemmstoffs in unterschiedlichen Konzentrationen als auch die Zugabe an entsprechendem Volumen DMSO als Kontrolle. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer wassergesättigten, 5% CO2-haltigen Atmosphäre für 48 Stunden inkubiert, wobei nach 24 Stunden ein Mediumwechsel und die Zugabe an frischen Hemmstoff erfolgte. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 10 μl einer 110 μM BrdU labeling solution auf die Zellen pipettiert (Endkonzentration 10 μM) .

Die Zellen wurden über 16 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Hiernach wurde 10 Minuten bei 1500 Upm zentrifugiert und das Medium vorsichtig abgesaugt. Die Zellen wurden dann 2 Stunden bei 60 °C getrocknet, mit 200 μl/Loch einer bei –20 °C vorgekühlten Fixierlösung fixiert und anschließend 30 Minuten bei –20 °C inkubiert. Hiernach wurden die Zellen 3 × mit je 250 μl/Loch RPMI 1640 Medium, 10 % FBS gewaschen, mit 100 μl/Loch Nuclease working solution versetzt und 30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Danach wurden die Zellen wieder 3 × mit je 250 μl/Loch RPMI 1640 Medium, 10 % FBS gewaschen, mit 100 μl/Loch einer Anti-BrdU-POD working solution (Endkonzentration: 200 mU/ml) versetzt und für weitere 30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 3 × mit je 250 μl/Loch PBS gewaschen, mit 100 μl/Loch einer Peroxidase substrate solution (ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin sulfonat (6)]-diammoniumsalz Konzentration: 1mg/ml) versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Grünfärbung (2 – 30 Minuten) inkubiert. Die anschließende Messung erfolgte bei 405 nm und 492 nm im Mikrotiterplatten-Reader.

Hemmung der IP3K Aktivität in vitalen Jurkat T-Zellen

Die Jurkat T-Zellen wurden in einer Dichte von jeweils 4 × 10⁷/200 ml Wachstumsmedium in 175 cm³-Zellkulturflaschen ausgesät und bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde eine bestimmte Konzentration des Hemmstoffes, gelöst in DMSO, auf die Zellen gegeben. Als Kontrolle wurden die Zellen einem entsprechenden Volumen an DMSO ausgesetzt. Die Endkonzentration an DMSO betrug maximal 0.1% und hatte keinen Einfluss sowohl auf das Wachstum der Zellen als auch auf die Aktivität der endogenen IP3K wie Kontrollmessungen des Inositolphosphat-Spektrums in trichloressigsauren Zellextrakten unter besonderer Berücksichtigung des Ins(1,4,5)P₃ und des Ins(1,3,4,5)P₄ ergaben. Die Zellen wurden anschließend über 24 bzw. 48 Stunden bei 37 °C und in einer 5 CO2-haltigen Atmosphäre in einem Brutschrank inkubiert. Vor Zugabe des Hemmstoffes sowie nach 24 und 48 Stunden unter Hemmstoff- bzw. DMSO-Inkubation wurden die Zellen mit Hilfe eines Coulter Counters gezählt, die Anzahl an lebenden Zellen mittels Trypanblau-Färbung ermittelt. Sodann wurden die Zellen mit Trichloressigsäure extrahiert und einer Untersuchung des Inositolphosphat-Spektrums mittels der MDD-HPLC Technik (Mayr 1990) unterzogen.

LITERATUR

Bertsch U, Haefs M, Moller M, Deschermeier C, Fanick W, Kitzerow A, Ozaki S, Meyer HE, Mayr GW.Gene 1999 Mar 4;228(1-2):61-71 Bertsch U, Deschermeier, C, Fanick, W, Girkontaite, I, Hillemeier, K, Johnen, H, Weglöhner, W, Emmrich, F und Mayr, G.W.: J Biol Chem 2000 Jan 21,275(3):15575-64 Gutfreund, H. (ed); Enzymes: Physical Principles Wiley & Sons Ltd., London 1972,189 – 203 Mayr GW: Methods in Inositide Research (ed. Irvine, RF). Raven Press, London 1990, 83-108.

Ergebnisse Bestimmung der K_m,app-Werte von IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C und IPMK für Ins(1,4,5)P₃ und ATP sowie der maximalen spezifischen Aktivitäten V_max

Zur Bestimmung der apparenten K_m-Werte der IP3K Isoformen und der IPMK für ATP wurden die maximalen Umsatzgeschwindigkeiten (V_max) bei variierenden ATP-Konzentrationen (125 – 1000 μM) und einer initialen sättigenden Konzentration an Ins(1,4,5)P₃ von 25 μM gemessen. Die K_m-Werte für ATP wurden durch eine hyperbolische Funktion gemäß der Michaelis-Menten-Kinetik bestimmt. Die Km,app Werte für Ins(1,4,5)P₃ wurde aus single-transients (Gutfreund 1972) durch Verfolgung des NADH-Verbrauchs bis zum vollständigen Umsatz kleiner initialer Ins(1,4,5)P₃ Konzentrationen in Gegenwart von 500 μM ATP bestimmt. Tabelle 1 gibt Aufschluss über die gefundenen enzymologischen Parameter für die drei verschiedenen Isoenzmye der IP3K und für HsIPMK. Die Daten der IP3K-A entstammen hierbei der Publikation von Bertsch et al. (1999) und Bertsch et al. (2000) Tabelle 1 K_m-Werte für ATP und Ins(1,4,5)P₃ und V_max-Werte (+/–Ca²⁺-CaM) von Gg-IP3K-A, Hs-IP3K-B, Rn-IP3K-C und Hs-IPMK

Im folgenden wurde bei aufgefundenen Hemmstoffen der IP3K-A jeweils im Detail getestet, ob diese kompetitiv oder nicht-kompetitiv oder gemischt kompetitiv bezüglich beider Substrate wirkten.

Hemmstoffe der IP3K-Isoformen A, B und C

Zur Aufklärung der Rolle der IP3K-A bzw. seiner Isoformen sowie der z.T. durch IPMK gebildeten höher phosphorylierten Inositole in der intakten Zelle wurde ein umfangreiches Screening von chemischen und pflanzlichen Verbindungen auf einen Hemmeffekt der entsprechenden Enzyme durchgeführt. Die Inhibierung der IP3K- und IPMK-Aktivitäten wurde aufgrund von Veröffentlichungen über Proteinkinasen-, Phospholipase Csowie Phosphatidylinositol 3-Kinasehemmstoffe (Matter et al., 1992; Ruckstuhl et al., 1979; Sanger et al., 1977; Srivastava, 1985) mit zahlreichen Substanzen aus der Gruppe der Flavonoide durchgeführt. Ein besonders umfangreiches Screening wurde mit IP3K-A durchgeführt, da dieses Enzym in sehr großen Mengen mit hohen spezifischen Aktivitäten herstellbar ist.

Anhand der unter Substratsättigung durchgeführten Messungen, bei denen der Hemmstoff stufenweise bis zum Erreichen des maximalen Hemmeffekts bzw. einer Konzentration von 100 μM dazu pipettiert wurde, konnten aus der Gruppe der Flavonoide (Flavone und Flavonole) fünf Verbindungen mit submikromolaren IC₅₀-Werten für IP3K-A identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um Quercetin, Myricetin, Myricetintrimethylether, Amentoflavon und 3',4^',7,8-Tetrahydroxyflavon.

Im Gegensatz zu den obigen Flavonoiden hemmten die Catechine (Flavan-3-ole) Catechin und Epicatechin die IP3K-A in einem deutlich geringeren Maße (IC₅₀: > 100 μM). Die Catechin-Derivate, die am C3-Atom des Chromon-Ringsystems einen Gallussäure-Substituenten tragen, Epicatechingallat (ECG) und Epigallocatechingallat (EGCG), verursachten jedoch wiederum einen starken Hemmeffekt der IP3K-A. Die IC₅₀-Werte des ECG sowie EGCG betragen 94 nM und 120 nM. Das Stereoisomer des ECG, (-)-Catechin-3-gallat, zeigte einen um den Faktor 500 erhöhten IC₅₀-Wert .

Aus der Gruppe der Isoflavone wurden Genistein und Daidzein, potente Tyrosinkinasehemmstoffe (Akiyama et al., 1987; Spinozzi et al., 1994; Tamaoki & Nakano, 1990), getestet. Diese Substanzen besitzen in Bezug auf die IP3K-A nur eine sehr schwache Hemmwirkung (IC₅₀: 116 μM und 131 μM). Flavonoide als Hemmstoffe IP3K-A Aktivität sind in Tabelle 2 bzw. 1 dargestellt.

Die Perylenchinone Hypericin und Pseudohypericin zeigen Hemmeffekte an Proteinkinasen (Takahashi et al., 1989). Aufgrund dessen wurde der Einfluss dieser Proteinkinase-Hemmstoffe bezüglich der IP3K-Aktivität untersucht. Das Hypericin besitzt eine photodynamische Aktivität. Deswegen wurden die Messungen sowohl im Dunkeln als auch nach vorheriger Bestrahlung der Probe mit Laborlicht durchgeführt.

Aus diesen Messungen stellt sich Hypericin als weiterer potenter Hemmstoff der IP3K-A dar {IC₅₀: 200 nM (Dunkelheit), 75 nM (Bestrahlung)}. Dagegen konnte für Pseudohypericin nur ein deutlich höherer IC₅₀-Wert von 2.4 μM gemessen werden.

Ebenso wurde Calphostin C, ein Perylenchinon Analogon des Hypericin (Kobayashi et al., 1989; Bruns et al., 1991), getestet und ein IC50-Wert von 1.0 μM gemessen. Die Messungen mit Calphostin C und mit Pseudohypericin wurden unter Lichtausschluss durchgeführt.

Aus der Gruppe der Triphenylmethane als entfernte Strukturanaloga von ECG konnten Pyrogallolrot sowie Brompyrogallolrot als spezifische Inhibitoren der IP3K-A mit IC₅₀-Werten von 0.90 μM bzw. 1.04 μM identifiziert werden.

Der beste Triphenylmethan-Hemmstoff war jedoch Aurintricarbonsäure (ATA) mit einem IC₅₀-Wert von 0.15 μM.

Anthrachinone, die in der Literatur als Hemmstoffe der Topoisomerase II (Lee et al., 1996) beschrieben wurden, wurden ebenfalls auf einen Hemmeffekt am Enzym analysiert. Von diesen Verbindungen wurde Chinalizarin als der potenteste Hemmstoff (IC₅₀: 2.40 μM) identifiziert. Adriamycin, in der Literatur als ein potenter Inhibitor der IP3K (da Silva et al., 1994) beschrieben, wurde auch analysiert. Allerdings zeigte diese Substanz weder als Akglykon (IC₅₀: 62 μM), hergestellt durch eine Säurehydrolyse, noch als Glykosid (IC₅₀: > 200 μM) gute Hemmeigenschaften.

Aus der Gruppe der Tyrphostine, die als Proteintyrosinkinase-Inhibitoren bekannt sind (Gazit et al., 1991), konnte das Bis-Tyrphostin als ein guter Hemmstoff der IP3K-A identifiziert werden (IC₅₀: 0.7 μM) .

Weiterhin wurde Wortmannin, ein sehr potenter Hemmstoff der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI 3-Kinase) (Sarkaria et al., 1998) auf einen Hemmeffekt untersucht. Diese Verbindung zeigte an der IP3K-A bei weitem keine so stark ausgeprägte Hemmung (IC₅₀: 2.3 μM) wie an der PI 3-Kinase (IC₅₀: 5 nM) .

Basierend auf der für Flavonoide ermittelten Struktur-Funktionsbeziehung wurden die Verbindungen Gossypol (polyphenolisches Binaphthalin) und Ellagsäure (phenolisches Bislakton) auf einen Hemmeffekt untersucht. Die beiden Substanzen erwiesen sich als sehr potente Inhibitoren des Enzyms, wobei Gossypol und Ellagsäure von allen bisher untersuchten Stoffen die höchst potenten Hemmstoffe darstellten (IC₅₀: Gossypol: 58 nM, Ellagsäure: 36 nM).

Da die meisten der als Hemmstoffe der IP3K-A identifizierten Verbindungen strukturell eine Art von Symmetrie von phenolischen Carbonylgruppen-tragenden Substrukturen ("Zweihändigkeit") aufweisen, wurden weiterhin Biflavonoide auf einen Hemmeffekt an diesem Enzym untersucht. Apigenin, als Monomer ein schwacher Hemmstoff der IP3K-A (IC₅₀: 8.3 μM), weist als Dimer, wie im daraus resultierenden Amentoflavon (3.9.), eine um den Faktor 10 erhöhte Potenz (IC₅₀: 0.50 μM) auf .

Ein weiterer Proteinkinasehemmer, das Rottlerin (Gschwendt et al., 1994), welches ebenfalls eine "Zweihändigkeit" aufweist, konnte ebenso als ein potenter Hemmstoff (IC₅₀: 1.21 μM) identifiziert werden.

Nicht alle der hoch potenten Inhibitoren zeigten eine komplette Inaktivierung der IP3K-A Aktivität unter hohen Hemmstoffkonzentrationen. Eine vollständige Hemmung der Enzymaktivität (97%) konnte für Gossypol, ECG, EGCG, Hypericin; ATA und 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon gemessen werden. Dagegen hemmte Ellagsäure die IP3K-A bis zu 75%, Quercetin zu 80 und Myricetin zu 85 =. Es gab hierbei keine Korrelation zwischen Hemmstoffpotenz und Vollständigkeit der Hemmung.

Weitere Stoffklassen als Hemmstoffe der IP3K-A sind in Tabelle 3 bzw. 2 dargestellt.

Basierend auf diesen umfangreichen Messungen konnten insgesamt neun sehr potente Hemmstoffe (IC₅₀: < 0.6 μM) der IP3K-A gefunden werden und eine ganze Reihe weiterer Hemmstoffe mit IC₅₀ werten unter und um 3 μM.

Alle potenten Hemmstoffe der IP3K-A mit IC₅₀ Werten < 1μM zeigten einen "mixed type" Hemmtyp des Enzyms in Bezug auf das Substrat ATP, während die Bindung des Substrates Ins(1,4,5)P₃ von keinem der Hemmer beeinflusst wurde, d.h. die Hemmstoffe wirkten nicht-kompetitiv in Bezug auf Ins(1,4,5)P₃.

Die meisten dieser potenten Inhibitoren wurden weiterhin auf ihren Hemmeffekt an der humanen IP3K-B getestet. Diese Isoform ist ubiquitärer als die Isoform A, welche nur in Neuronen und Testes und zumindest bei Vögeln auch in Erythrozyten exprimiert wird. Deshalb sollte die Frage geklärt werden, ob die Inhibitoren der A-Form auch die Aktivität der weiter verbreiteten B-Isoform hemmen können.

Bei diesen Messungen stellte sich heraus, dass Hypericin, ATA und Chinalizarin ähnliche oder niedrigere IC₅₀-Werte bei humaner IP3K-B im Vergleich zu Gg-IP3K-A aufwiesen. In Tabelle 4 sind sowohl die IC₅₀-Werte als auch die maximal erreichten Enzymhemmungen zusammengestellt.

Die Messungen der Hemmeffekte an der Gg-IP3K-A der HsIP3K-B erfolgten wie oben beschrieben. Es wurden sowohl die IC₅₀-Werte als auch die maximalen Hemmeffekte (% max.) der potentesten Inhibitoren analysiert.

Die potentesten Inhibitoren von Gg-IP3K-A und Hs-IP3K-B sind in Tabelle 4 bzw. 3 dargestellt.

Schließlich wurden noch zwei sehr gute Hemmstoffe der IP3K Isoformen A und B (Quercetin und 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon) auf ihre Wirkung an der IP3K-C untersucht. Es zeigte sich hierbei für Quercetin eine etwas bessere Hemmung als bei der B-Isoform, während 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon diese Isoform deutlich schlechter hemmte als IP3K-B. Es ist zu vermuten, dass diese Isoform sich in ihrem spezifischen Selektivitätsspektrum für weitere Hemmstoffe etwa im Bereich dieser Abweichungen unterscheidet. Auffällig ist, dass dieses Enzym sich ganz offensichtlich unter den gewählten Testbedingungen in der maximalen Hemmbarkeit von IP3K-B unterscheidet.

Inhibitoren von IP3K-C sind in Tabelle 5 bzw. 4 dargestellt.

Es zeigt sich nach dieser Hemmstoffsuche und Charakterisierung zwar für jede Isoform der IP3K ein unterschiedliches Selektivitätsprofil der potenten Hemmstoffe, jedoch ist dieses zumindest für IP3K-A und IP3K-B nicht so different, dass nicht mit einer Hemmung beider Isoformen durch einen potenten Hemmstoff, aufgespürt an IP3K-A, gerechnet werden kann. Für die IP3K-C sind die Daten noch nicht ausreichend, um zu beurteilen, ob hier mit weiteren Hemmstoffen vielleicht eine selektive Hemmung dieser stark epithelial exprimierten Isoform möglich sein könnte.

Analyse von Genstruktur und Proteinsequenz der humanen Inositolpolyphosphat Multikinase (HsIPMK)

Das multifunktionelle Hefeprotein ArgRIII ist eine Inositolpolyphosphat Multikinase, aber auch ein Transkriptionsregulator und ein wichtiger Faktor des mRNA Exportweges (El Bakkoury et al., 2000; Saiardi et al., 2000).

Das humane Homolog des Hefe ArgRIII Proteins ist eine Inositolphosphat Multikinase. Das Gen des humanen Homologen hat die chromosomale Lokalisation 10q21. Sechs Exons leisten einen Beitrag zur kodierenden Sequenz. Das offene Leseraster kodiert für ein Protein von 416 Aminosäuren (berechnetes Molekulargewicht: 47219,40 Dalton). Die Aminosäuresequenz zeigt eine 82% Ähnlichkeit zur Ratten IPMK. Funktional wichtige Motive sind konserviert zwischen den Säugetier IPMKs und ArgRIII. Die höchste Ähnlichkeit zeigt die Inositolphosphat Bindungsstelle. Die ATP Bindungsstelle und die katalytisch wichtige SSLL-Domäne sind ebenfalls klar konserviert.

Zusammensetzung von funktional wichtigen Bereichen von HsIPMK und ArgRIII

Lokale Sequenz Alignments von funktional wichtigen Bereichen des Hefe ArgRIII Proteins mit den korrespondierenden Sequenzen der HsIPMK sind in der 5 dargestellt. Die Nummern beziehen sich auf die Position der ersten Aminosäure in der Primärsequenz des dargestellten Proteins. Der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren wird benutzt. Konservierte Reste sind schwarz hinterlegt, ähnliche Reste sind grau hinterlegt. Die invariablen Reste in diesen Motiven sind markiert (*).

Verifizierung der nukleären Lokalisation der humanen IPMK

Das Hefeprotein ArgRIII ist im Zellkern lokalisiert (E1 Bakkoury et al., 2000). Diese Lokalisation ist angemessen für seine Aufgaben in der Transkriptionsregulation und im mRNA-Export. Die Kenntnis über die intrazelluläre Verteilung der HsIPMK bringt Einsichten über ihre möglicherweise ähnlichen Funktionen. NRK52E Zellen wurden transient transfiziert mit der HsIPMK cDNA fusioniert mit einem C-terminalen bzw. N-terminalen fluoreszierenden Protein-Tag. Beide Anordnungen der Proteinsequenzen im Fusionsprotein wurden benutzt, um die Möglichkeit von sterischen Effekten des fusionierten fluoreszierenden Proteins auszuschließen, die zur Proteinmissfaltung führen könnten. Die Linkersequenz besteht hauptsächlich aus kleinen Aminosäuren, um eine hohe Flexibilität sicherzustellen. Beide Fusionsproteine waren vorherrschend in den Kernen der transfizierten Zellen lokalisiert. Das fluoreszierende Protein allein war gleichmäßig zwischen Kern und Zytoplasma verteilt. Die nukleäre Lokalisation wurde bestätigt durch eine Co-Färbung der DNA im Kern mit 4',6Diamidino-2phenylindole dihydrochloride (DAPI). Overlays der DAPI-Fluoreszenz mit der Fluoreszenz des Fusionsproteins bestätigen die Lokalisation in einem einzigen Organell, dem Kern. Proteine mit einer maximalen Größe von ca. 40kDa können passiv durch den Kernporenkomplex translozieren. Größere Proteine können nur durch aktiven Transport in den Kern gelangen (Cole und Hammell, 1998). Da die HsIPMK mit dem Fluoreszierenden ProteinTag ein Molekulargewicht von ca. 75kDa hat, muss ein aktiver NLS-gerichteter Transport über die Kernmembran auftreten.

Hemmstoffe der Hs-IPMK

Da IPMK ebenfalls Ins(1,4,5)P₃ zu Ins(1,3,4,5)P₄ phosphorylieren kann und dieses Enzym darüberhinaus etliche für die Biosynthese hochphosphorylierter Inositolphosphate wesentliche Schritte katalysiert (s. Einleitung), wurde die Hemmbarkeit dieses Enzyms ebenfalls im Detail untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen für die Hemmstoffe dieses Enzym abermals eine Präferenz von polyphenolischen Strukturen. Die besten Hemmstoffe für IPMK scheinen jedoch immer saure Funktionen zu tragen. Als Hemmstoffe der Hs-IPMK, welche auch IP3K effektiv im Bereich unter oder um 1μM IC₅₀, inhibieren, wurden die Triphenylmethane Aurintricarbonsäure (ATA) und Bengalrosa, die Ellagsäure und das Gossypol identifiziert (Tabelle 6 bzw. 6). Die IPMK sehr gut hemmende Phenylacrylsäure Chlorogensäure ist hingegen ein sehr schlechter IP3K-Hemmstoff. Andererseits zeigt der potente IP3K-Inhibitor Quercetin bei IPMK nur eine sehr schwache Hemmung, ebenso das Säurefuchsin, und nicht alle sauren Polyphenole sind gute Hemmstoffe der IPMK (Tabelle 7 bzw. 7).

Wirkung von Inhibitoren der IP3K bzw. der IPMK auf das Wachstum kultivierter Zellen

Da einige der effektivsten Hemmstoffe der IP3K als Inhibitoren des Zellwachstums (Agullo et al., 1996; Ahmad et al., 1997; Band et al., 1989; Chen et al., 1998; Kang et al., 1997; Okabe et al., 1997; Rodgers et al., 1998; Wang et al., 2000) bekannt waren und gerade in einer jüngsten Arbeit hierzu recht gut vergleichbare Daten vorgelegt wurden (Caltagirone et al., 2000), ergab sich die Hypothese, dass IP3K-Isoformen und IPMK ein gemeinsames kausal bedeutsames da besonders hochaffines intrazelluläres Ziel für diese antiproliferativen Wirkstoffe sein könnten. Deshalb wurde die Wirkung aller identifizierten potenten IP3K-Hemmstoffe bzw. IPMK-Hemmstoffe alleine und in besonders ausgewählten Zweierkombinationen auf das Zellwachstum unter einheitlichen Bedingungen an verschiedenen humanen und anderen Tumorzelllinien (Jurkat T-Zellen, humane T-Zell-Lymphomzellen; MCF7-Zellen, humane Mammacarcinomzellen; HT29, humane Colonkarzinomzellen; HL60, undifferenzierte promyeloische Leukämiezellen; CHO-Zellen, eine Hamster-Ovarialkarzinom-Zelllinie) sowie an der Mäuse-Fibroblastenzelllinie NIH 3T3- analysiert.

Wirkungen von IP3K- und IPMK-Hemmstoffen auf Jurkat T-Zellen

Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellproliferation wurden die Jurkat T-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert Nach jeweils 24 Stunden erfolgte die Bestimmung der Zellzahl mittels des Coulter Counters. Diese Analytik wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.

Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Proliferationshemmung der Jurkat T-Zellen nachgewiesen werden.

Gossypol und Hypericin stellten sich als Inhibitoren mit dem stärksten Hemmeffekt heraus, wobei Gossypol (IC₅₀: 1.15 μM) allerdings eine sehr geringe "therapeutische Breite" (Dosisverhältnis zwischen antiproliferativen und zelltötenden Effekt, siehe unten) zeigte. Bei Konzentrationsunterschieden von bereits 0.5 μM konnten sehr unterschiedlich ausgeprägte Hemmeffekte beobachtet werden.

Da laut Literaturangaben Hypericin (Agostinis et al., 1995, Agostinis et al., 2002) unter Lichteinfluss ein wesentlich effektiverer Hemmstoff ist, wurde die Analyse des Hemmeffektes auf die Proliferation auch unter Bestrahlung durchgeführt. Hierbei konnte ein IC₅₀-Wert von 0.17 μM ermittelt werden. Wurden die Versuche unter Lichtausschluss durchgeführt, zeigte Hypericin erst bei einer Konzentration von 2 μM einen schwach ausgeprägten Effekt auf das Zellwachstum.

ATA und (–)-ECG erwiesen sich von allen getesteten Hemmstoffen als die schwächsten Inhibitoren des Zellwachstums von Jurkat T-Zellen. Für diese Verbindungen konnten IC₅₀-Werte im Bereich von je ca. 30 μM ermittelt werden.

Zur Ermittlung der Zytotoxizität der Inhibitoren wurde der Anteil an lebenden Zellen unter Verwendung der Trypanblau-Färbemethode durchgeführt.

Hierbei stellte sich heraus, dass in Gegenwart von Gossypol , (–)-EGCG und Hypericin in einer Konzentration des 2- bis 3-fachen IC₅₀-Wertes des Hemmers des Zellwachstums über eine Inkubationszeit von 72 Stunden nur bis zu 10% der Zellen überlebten. Dieses deutet auf eine Aktivierung der Apoptose hin. Bei allen anderen getesteten Inhibitoren konnte eine Vitalität von 49% (Myricetin) bis 89% (ECG) bestimmt werden.

Effekte von antiproliferativen IP3K und IPMK Hemmstoffen der Jurkat Zellen auf den Zellzyklus

Zur Analyse der antiproliferativen und zelltötenden Hemmstoffeffekte auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen wurde das Verhältnis von Zellen in G₀/G₁-, S und G₂/M- Phase bei steigenden Hemmstoffkonzentrationen bestimmt. Hierbei wurde die Verteilung der mit Propidiumjodid gefärbten DNA mittels der Durchflusszytometrie gemessen. Es wurden jeweils 20.000 Zellen analysiert. Die Resultate wurden als prozentuale Verteilung der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus dargestellt. Diese Versuche wurden mit den Inhibitoren (–)-EGCG, Quercetin, Gossypol und 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon durchgeführt.

Effekte von (–)-EGCG

Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung der Zellen mit steigenden Konzentrationen an (–)-EGCG (0 – 40 μM) über einen Zeitraum von 48 Stunden eine Anhäufung der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus hervorrief. Der prozentuale Anteil der Zellen in dieser Phase stieg von 36% ± 0.6% in der Kontrolle auf 55% + 3.5% unter einer Konzentration von 40 μM (–)-EGCG an. Gleichzeitig nahm der prozentuale Anteil der Zellen in der G₀/G₁-Phase von 52% ± 0.9% (Kontrolle) auf 35% ± 4.2% (40 μM) ab. Der Anteil der Zellen in der G₂/M-Phase veränderte sich unter dem Einfluss des Hemmstoffes nicht.

Effekte von Gossypol

Unter dem Einfluss von Gossypol (0 – 2 μM) wurde der Zellzyklus der Jurkat T-Zellen ebenfalls bevorzugt in der S-Phase geblockt. Der Prozentsatz der Zellen in dieser Phase stieg von 37% ± 3.5% in der Kontrolle auf 48% ± 4.0% unter einer Gossypol-Konzentration von 2 μM.

Parallel hierzu konnte eine Abnahme der Zellen in der G₀/G₁-Phase von 52% ± 2.9% (0 μM) auf 46% ± 2.2% (2 μM) analysiert werden. Der prozentuale Anteil der Zellen in der G₂/M-Phase blieb unverändert.

Effekte von 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon

Dieser Hemmstoff, der in einem Konzentrationsbereich von 0 μM bis 20 μM eingesetzt wurde, bewirkte abermals einen Anstieg des Prozentsatzes der Zellen in der S-Phase (0 μM: 42% ± 1.4%, 20 μM: 66% ± 4.0%). Zugleich konnte eine Abnahme des Zellanteils in der G₀/G₁-Phase von 51% ± 2.9% (0 μM) auf 22% ± 2.1% (20 μM) festgestellt werden.

In der G₂/M-Phase konnte bei einer Inhibitorkonzentration von 20 μM zusätzlich ein leichter Anstieg des prozentualen Anteils der Zellen gemessen werden (0 μM: 11% ± 0.7%, 20 μM: 16% ± 0.4%), der bei einer Konzentration von 10 μM noch nicht detektiert wurde (12% ± 0.3%).

Effekte von Quercetin

Deutlich komplexer als bei den obigen Hemmstoffen waren die Effekte verschiedener Konzentrationen von Quercetin auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen.

Unter dem Einfluss von 5 μM Quercetin verminderte sich zunächst der Anteil an Zellen in der S-Phase von 40% ± 1.4% (0 μM) auf 35% ± 5.3% (5 μM). Bei einer Konzentration von werden, der sich bei 20 μM Quercetin wieder auf 41% ± 1.5% verringerte (Tab. 3.14.). Gleichzeitig konnte eine Abnahme des Anteils an Zellen in der G₀/G₁-Phase von 49% ± 1.0% in der Kontrolle über 31% ± 5.1% bei 5 μM auf 10% ± 2% bei einer Hemmstoffkonzentration von 20 μM analysiert werden. In der G₂/M-Phase erfolgte zunächst eine prozentuale Zunahme der Zellen von 11% ± 0.4% (0 μM) auf 36% ± 2.3% (5 μM).

Dagegen erniedrigte sich der Anteil der Zellen bei einer Konzentration von 10 μM Quercetin auf 21% ± 2.5%. Bei einer Dosis von 20 μM des Flavonols erhöhte sich wiederum der prozentuale Zellanteil auf 50% ± 5.3%.

Die unterschiedlichen Prozentwerte in den einzelnen Kontrolluntersuchungen basieren auf der Verwendung verschiedener Zellkulturansätze.

Vitalität und Apoptose der wachstumsgehemmten Jurkat-T-Zellen Parallel zu den Zellzyklusuntersuchungen wurde der Anteil an lebenden Zellen unter Verwendung der Trypanblau-Färbemethode durchgeführt.

In den Kontrollen konnte eine Vitalität von 81 – 85% analysiert werden.

Unter dem Einfluss von (–)-EGCG wurden bei einer Konzentration von 10 μM 80%, bei 20 μM 81% und bei 40 μM 68% vitale Zellen nachgewiesen.

In Gegenwart von 5 μM 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon haben sich 74% der Zellen, bei einer Konzentration von 10 μM 68% und bei 20 μM 52% als vital erwiesen.

In Anwesenheit von 5 μM Quercetin waren noch 70%, bei 10 μM 59% und unter 20 μM 45% der Zellen vital.

Wurden die Zellen mit dem Hemmstoff Gossypol versetzt, konnte bei Anwesenheit von 1 μM eine 82%-ige, bei 2 μM eine 70%-ige und unter 4 μM Gossypol eine 14%-ige Vitalität bestimmt werden.

Anhand der Ergebnisse der Zellzyklusuntersuchung konnte ebenfalls aufgezeigt werden, dass die Jurkat T-Zellen unter dem Einfluss der getesteten Hemmstoffe in Apoptose gehen. Apoptotische Zellen bilden eine hypoploide Zellpopulation, die allgemein als Sub-G₁-Peak bezeichnet wird. Dieser Sub-G₁-Peak konnte bei den mit Hemmstoff behandelten Jurkat T-Zellen analysiert werden.

5-Bromo-2'-deoxy-uridin-Einbau in Jurkat T-Zellen als Maß für die Beeinflussung der DNA-Synthese durch IP3K und IPMK Hemmstoffe

Da die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass alle Hemmstoffe der IP3K-A den Zellzyklus der Jurkat T-Zellen in der S-Phase blockierten, wurde anhand des 5-Bromo-2'-deoxy-uridin-Einbaus (BrdU) die DNA-Synthese der Zellen überprüft. Diese Analyse diente zur Klärung der Frage, ob die Blockade in der S-Phase auf eine Hemmung der DNA-Synthese zurückzuführen ist.

Die Jurkat T-Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁴/100 μl ausgesät und für 48 Stunden in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des Hemmstoffes bei 37°C in einer 5 CO₂-haltigen Atmosphäre inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Vitalität der Jurkat T-Zellen mit Hilfe der Trypanblau-Färbemethode und der BrdU-Einbau untersucht. Als Hemmstoffe wurden Gossypol, ATA, (–)-EGCG sowie 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon eingesetzt.

(-)-EGCG, welches den Zellzyklus in der S-Phase blockiert, beeinflusst die DNA-Synthese bei der maximal eingesetzten Konzentration von 20 μM nicht signifikant. Bei dieser Konzentration konnte eine deutliche Hemmung der Proliferation sowie mittels der Trypanblau-Färbemethode 50% vitale Zellen ermittelt werden.

Ebenso wurde durch 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon die DNA-Synthese nicht signifikant beeinflusst. Dagegen konnte eine leichte Hemmung der Synthese durch Gossypol ermittelt werden. Bei einer Konzentration von 1 μM und einem prozentualen Anteil von 66% lebenden Zellen wurde die DNA-Synthese um 16% erniedrigt. Bei der maximal eingesetzten Konzentration an Gossypol (3 μM) wurde eine 21%-ige Inhibition der DNA-Synthese analysiert.

Wurden die Jurkat T-Zellen für 48 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen an ATA inkubiert, konnte eine Stimulierung der DNA-Synthese um 17% beobachtet werden.

Hemmstoffeffekte auf den Inositolpolyphosphat-Metabolismus in Jurkat T-Zellen

Da der beobachtete Block des Zellwachstums durch IP3K-Hemmstoffe in der S-Phase ganz offensichtlich nicht mit dieser Hemmung der DNA-Synthese korreliert ist, wurde nun die Möglichkeit näher analysiert, dass der antiproliferative Effekt wie auch der S-Phasenblock mit einer Hemmung des Inositolphosphat-Metabolismus korrelieren und vielleicht kausal zusammenhängen könnte. Es wurde also untersucht, ob die IP3IK-Hemmstoffe in den intakten Zellen über die Inhibition dieses Enzyms die Biosynthese der höheren Inositolphosphate hemmt.

Die Effekte von Quercetin und Gossypol auf die Konzentrationen der höher phosphorylierten Inositole in humanen Jurkat T-Zellen wurden mittels der MDD-HPLC-Analytik (Mayr, 1990) analysiert.

Zunächst wurden die Zellen in An- und Abwesenheit von 30 μM Quercetin bzw. 3 μM Gossypol über 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden diese für die HPLC-Analyse der Inositolphosphate aufgearbeitet und die zellulären Inositolphosphate gemessen.

Wirkung von Quercetin

Im Vergleich zu den Kontrollen konnte unter Behandlung der Jurkat T-Lymphozyten mit 30 μM Quercetin ein Rückgang der Konzentration an Ins(1,3,4)P₃, des Dephosphorylierungsproduktes des Produktes der IP3K {Ins(1,3,4,5)P₄}, um 49% nach 48 Stunden Inkubation analysiert werden.

Parallel hierzu wurde wie erwartet eine Abnahme der Konzentration an Ins(1,3,4,5)P₄ um 68% und an Ins(1,4,5,6)P₄ um 77 gemessen.

Ebenso wurde eine Verringerung in der Konzentration an InsP5-Isomeren beobachtet. Insbesondere bei Ins(1,3,4,5,6)P₅ konnte ein Rückgang um 68% ermittelt werden. Bei dem Isomer Ins(1,2,4,5,6)P₅ wurde dagegen nur eine nicht signifikante Abnahme analysiert.

Auch die Konzentrationen an noch höher phosphorylierten Inositolen nahmen unter dem Einfluss von Quercetin ab (InsP₆: –44%, InsP₇ (5-PPInsP₅): –19%).

In der Menge an Ins(1,5,6)P₃ konnte kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollen festgestellt werden.

Gleichzeitig konnte eine deutliche Zunahme in der Konzentration an den InsP₅-Isomeren Ins(1,2,3,4,6)P₅ und Ins(1,2,3,4,5)P₅ im Vergleich zur Kontrolle unter dem Einfluß von Quercetin festgestellt werden.

Wirkung von Gossypol

Unter der Behandlung von Jurkat T-Zellen mit 3 μM Gossypol konnte eine Abnahme der Konzentration an Ins(1,3,4)P₃ um 35 nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden detektiert werden. Ebenso nahmen die Konzentrationen an Ins(1,3,4,5)P₄ um 39%, an Ins(1,3,4,6)P₄ um 33% und an Ins(1,4,5,6)P₄ um 61% ab. Parallel hierzu wurde auch eine Verringerung der Konzentration der InsP₅-Isomeren Ins(1,2,3,4,5)P₅ um 28% sowie Ins(1,3,4,5,6)P₅ um 24% analysiert, die sich aber aufgrund einer statistischen Analyse (t-Test) nicht als signifikant herausstellte.

Die Konzentrationen der höher phosphorylierten InsPs verringerten sich ebenfalls unter dem Einfluss von Gossypol (InsP₆: –25%, InsP₇ (5-PPInsP₅): –35%).

Keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollen konnte in der Konzentration der Isomeren Ins(1,5,6)P₃, Ins(1,2,4,5,6)P₅ und Ins(1,2,3,4,6)P₅ ermittelt werden.

Bei allen InsP-Isomeren {Ausnahme Ins(1,3,4,5)P₄} konnte nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden kein Rückgang der Konzentrationen der jeweiligen Isomeren im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet werden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass während des Versuchs keine Zugabe an frischem Gossypol erfolgte, so dass nach 24 Stunden der Hemmstoff vollständig von den sehr dicht gewachsenen Zellen abgebaut oder z.B. über eine Multi-Drogen-Resistenz-Transportprotein (MDR)-Expression eliminiert wurde und somit keinen Effekt mehr auf den Inositolphosphatstoffwechsel hatte.

Antiproliferative Kombinationen an IP3K und IPMK Hemmstoffen getestet an Jurkat T-Zellen

Auf Grund der Beobachtung, dass die meisten der potenten Hemmstoffe sowohl der IP3K als auch der IPMK jeweils der Gruppe der pflanzlichen Polyphenole zugehören ergab sich die interessante Hypothese, dass Pflanzen diese als Insekten-Phytoalexine bekannten Substanzen (Harborne & Grayer 1994) möglicherweise in ihrer Evolution zur Wachstumshemmung dieser Fraßfeinde in der Weise entwickelt haben, dass mehrere antiproliferativ wirksame Flavonoide bzw. Polyphenole anderer Grundstruktur sich in ihrem antiproliferativen Effekt addieren. Der Grund für die Kombination verschiedener antiproliferativer Polyphenole in einer Pflanzenspezies könnte darin liegen, dass es für die Pflanzen "pharmakologisch" als vorteilhaft erwiesen hat, mehrere antiproliferative Wirkstoffe additiv zu kombinieren um zwar das Wachstum der Fraßfeinde, v.a. der Insekten zu unterdrücken, sie andererseits aber nicht zu töten bzw. sie nicht in ihrer Fortpflanzungsfähigkeit zu schädigen. Denn die meisten dieser Fraßfeinde sind gleichzeitig Vektoren für die Befruchtung entsprechender Pflanzen. Es könnte sich bei der hier beobachteten Akkumulation von antiproliferativen Polyphenolen um ein seit über 100 Mio Jahren laufendes Evolutionsexperiment handeln, bei welchem Pflanzen im wesentlichen nicht genotoxische antiproliferative Wirkprinzipien durch Kombination von mehreren Wirkstoffen in genügend niedriger Kombinationsdosis erworben haben. Bei bestimmten Insekten wurde gezeigt, dass selbst extrem hohe Gesamtkonzentrationen bestimmter durch Pflanzenfraß aufgenommener Flavonoide nicht zu toxischen Wirkungen führen, so dass für einige der Mitglieder dieser Verbindungen von völlig fehlender Genotoxizität ausgegangen werden kann.

Wenn sich diese Hypothese der biologisch-evolutionär erprobten Kombination antiproliferativer pflanzlicher Polyphenole im Detail bestätigen ließe, so könnte gerade in der Kombination derartiger Substanzen in pflanzlicher Nahrung neben den bekannten antibiotischen Wirkungen im Darm und den antioxidativen und chelatorischen Eigenschaften ein unschätzbarer biologischer Vorteil liegen.

Entsprechende Kombinationsexperimente durchgeführt in Form von Wachstums-Hemmexperimenten von Jurkat-T-Zellen haben diese Hypothese voll bestätigt. In jedem Falle einer solchen Wirkstoffkombination von zwei potenten Hemmstoffen von IP3K (Gossypol und Myricetin, Gossypol und ATA, Quercetin und ATA) bzw. von IP3K (Quercetin, Gossypol, Myricetin und ATA) und IPMK (ATA und mit Einschränkung Gossypol) wurde ein Effekt der Kombination dieser Substanzen beobachtet, welcher sich wir folgt beschreiben lässt und durch die Daten in den Tabellen 8 und 9 belegt ist:

1. die Zugabe einer Konzentration eines (zweiten) potenten IP3K-Hemmstoffes im Bereich unterhalb seines IC₅₀-Wertes seiner wachstumshemmenden Wirkung bewirkt eine Sensitisierung für die wachstumshemmende Wirkung eines ersten IP3K-Hemmstoffes oder eines IPMK-Hemmstoffes, d.h. eine signifikante Erniedrigung des IC₅₀-Wertes für die Wirkung dieses letzteren Hemmstoffes im Vergleich zum IC₅₀, dieser Substanz allein (8 bzw. Tabelle 8; die IC50-Werte wurden durch Fits von sigmoidalen Hill-Funktionen an die Zellzahl vs. Inhibitorkonzentrationsdaten nach 48 und 72 Stunden Zellwachstum ermittelt; 100 Hemmung bedeutet kein Wachstum und Persistenz der initialen Zellzahl; (1) Inhibition >100% bedeutet Apoptose-bedingte Abnahme der Zellzahl unter den initialen Wert).
2. Eine präzise quantitative Analyse des Hemmeffektes bei Kombination zweier IP3K-Hemmstoffe bzw. eines IP3K- und eines IPMK-Hemmstoffes in Konzentrationen unterhalb oder im Bereich ihrer IC50-Werte ergibt in jedem Fall eine ausgeprägtere Hemmwirkung des Zellwachstums als wie sie durch lineare Addition der beiden isolierten Hemmeffekte errechenbar ist. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Dosis-Wirkungsfunktionen der einzelnen Hemmstoffe im Bereich ihres ansteigenden Schenkels nicht linear sind und zumeist Hill-Koeffizienten von <–1 aufweisen, kann hieraus mit Sicherheit eine additive Wirkung der Kombination zweier submaximal konzentrierter Hemmstoffe abgeleitet werden. In einigen Fällen ist der über die lineare Addition hinausgehende Hemmeffekt so ausgeprägt, dass eine Potenzierung der Wirkung der Kombination dieser Hemmstoffe (z.B. Gossypol bei Konzentrationen <1μM und ATA) vermutet werden kann (Tabelle 9 bzw. 9: Additivität von IP3K/IPML Inhibitoren bei der Wachstumshemmung von Jurkat Zellen).

Es zeigt sich in der hier bewiesenen Additivität ein neuer, interessanter Ansatz für eine neue antiproliferative Kombinations-Pharmakotherapie.

Weiterhin könnte die sinnvolle Kombination naturidentischer antiproliferativ wirksamer pflanzlicher Polyphenole sich zu einem Erfolg versprechenden Prinzip von "Neutraceuticals" entwickeln.

Proliferationshemmung von NIH 3T3-Zellen

Zur Bestimmung der Hemmstoffeffekte auf die Zellproliferation von NIH 3T3-Zellen wurden diese mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Diese Versuche wurden mit den an Jurkat T-Zellen getesteten Hemmstoffen der IP3K-A durchgeführt.

Für alle getesteten Inhibitoren der IP3K konnte auch bei dieser Zelllinie eine Proliferationshemmung der NIH 3T3-Zellen nachgewiesen werden.

Gossypol zeigte wie bei den Jurkat T-Zellen den stärksten Effekt (IC₅₀: 1.37 μM), wobei diese Verbindung auch bei diesen Zellen eine sehr geringe "therapeutische Breite" (Dosisverhältnis zwischen antiproliferativen und zelltötenden Effekt) besaß.

Für (–)-ECG konnte ein um Faktor 1.7 niedrigerer IC₅₀-Wert im Vergleich zu den Jurkat T-Zellen bestimmt werden.

Dagegen hemmte Quercetin die Proliferation der NIH 3T3-Zellen um Faktor 2 geringer (IG₅₀: 52.5 μM) .

Hypericin zeigte nach 15-minütiger Bestrahlung mit Laborlicht bei einer Konzentration von 200 nM eine deutliche Hemmung der Proliferation, die allerdings nicht so stark ausgeprägt war wie bei den Jurkat T-Zellen. Wurde der Versuch unter Lichtausschluss durchgeführt, konnte ein sehr geringfügiger Hemmeffekt (7% Proliferationshemmung) bei einer Konzentration von 300 nM festgestellt werden.

ATA hemmte die Proliferation der NIH 3T3-Zellen um Faktor 5 stärker (IC₅₀: 6.25 μM) als diejenige der Jurkat T-Zellen.

Die IC₅₀-Werte aller anderen getesteten Hemmstoffe unterscheiden sich nicht signifikant von den bei den Jurkat T-Zellen analysierten Werten.

Bei der Ermittlung der Zytotoxizität der Inhibitoren stellte sich heraus, dass bei (–)-ECG, Quercetin und 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon in einer Konzentration des 2- bis 3-fachen IC₅₀-Wertes des Zellwachstums über eine Inkubationszeit von 72 Stunden bis zu 70% der Zellen überlebten. Für Hypericin konnte bei einer Konzentration von 200 nM nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden eine Überlebensrate der Zellen von 51% gemessen werden.

Bei (-)-EGCG und Myricetin wurden bei einer Konzentration des 4-fachen IC₅₀-Wertes des Zellwachstums nach 72 Stunden 50 bzw. 34% vitale Zellen analysiert.

Die geringste Zytotoxizität besaß ATA, die auch den schwächsten Hemmeffekt auf die Proliferation aufwies. Bei einer Konzentration des 24-fachen IC₅₀-Wertes des Zellwachstums überlebten 55% der Zellen.

Bei Gossypol dagegen starben alle Zellen bei einer Konzentration des 3.5-fachen IC₅₀-Wertes des Zellwachstums ab.

Proliferationshemmung von MCF7-Zellen

Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellproliferation wurden die MCF7-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden untersucht. Diese Analytik wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.

Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Proliferationshemmung der MCF7-Zellen nachgewiesen werden (Tabelle 10 bzw. 10) .

Gossypol zeigte wie bei den Jurkat T-Zellen sowie bei den NIH 3T3-Zellen den stärksten antiproliferativen Effekt der getesteten Hemmstoffe (IC₅₀: 0.72 μM). Auch bei dieser Zelllinie besaß Gossypol eine geringe "therapeutische Breite" (Dosisverhältnis zwischen antiproliferativen und zelltötenden Effekt).

Quercetin (IC₅₀: 7.1 μM) zeigte bei diesen Zellen eine deutlich (4 – 7,5 ×) bessere antiproliferative Wirkung als bei Jurkat und 3T3.

3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon (IC₅₀: 16.6 μM) und (–)-EGCG (IC₅₀: 22.0 μM) hemmten das Wachstum der MCF-7-Zellen mit annähernd gleichem Effekt. NIH 3T3-Zellen wurden von diesen Verbindungen mit gleicher Intensität gehemmt. Die Proliferation der Jurkat T-Zellen wurde von 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon um das 2-fache und von (–)-EGCG um das 1.4-fache stärker gehemmt.

ATA stellte sich als Inhibitor mit dem geringsten Hemmeffekt an dieser Zelllinie heraus (IC₅₀: 123.7 μM).

Proliferationshemmung von HL60 Zellen

Die Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellproliferation der HL60-Zellen wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.

Hierfür wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden kultiviert und gezählt.

Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Proliferationshemmung der HL60-Zellen nachgewiesen werden (Tabelle 10 bzw. 10) .

Gossypol stellte sich auch an dieser Zelllinie wieder als die Verbindung mit dem stärksten antiproliferativen Effekt heraus. Allerdings ist dieser Effekt deutlich schwächer ausgeprägt als an den anderen getesteten Zelllinien. (–)-EGCG war an diesen Zellen nur um den Faktor 1,7 schwächer wirksam als Gossypol (IC₅₀ 5,2 μM). Hingegen stellte sich das (–)-ECG im Vergleich zum (–)-EGCG an dieser Zelllinie als Inhibitor mit einem deutlich weniger ausgeprägten antiproliferativen Effekt heraus.

Quercetin inhibierte die Zellproliferation im Vergleich zum Gossypol um Faktor 5 schwächer.

Für 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon und (–)-ECG, die ähnliche Hemmeffekte auf die Proliferation der HL60-Zellen aufweisen, konnte eine 10-fach geringere Hemmwirkung als durch Gossypol ermittelt werden. ATA konnte als Verbindung mit dem schwächsten antiproliferativen Effekt identifiziert werden. Allerdings war die Hemmwirkung nicht ganz so schwach wie bei den MCF7-Zellen.

Proliferationshemmung von HT29 Zellen

Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellproliferation wurden die HT29-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden analysiert. Diese Analytik wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.

Gossypol zeigte wie bei den Jurkat T-Zellen, NIH 3T3-Zellen, HL60-Zellen und MCF7-Zellen den stärksten antiproliferativen Effekt von den getesteten Hemmstoffen.

Dagegen konnte für ATA wiederum die geringste Hemmwirkung unter den getesteten Inhibitoren beobachtet werden. Bislang zeigte ATA nur bei den NIH 3T3-Zellen einen ausgeprägten Hemmeffekt .

Alle anderen potenten Hemmstoffe der IP3K und der IPMK zeigten ebenfalls einen antiproliferativen Effekt auf die HT29-Zellen. Da jedoch die Zellversuche noch nicht abgeschlossen sind, können bislang für diese Inhibitoren keine vollständigen Daten angeführt werden.

Zusammenfassung der antiproliferativen Wirkungen von IP3K und IPMK-Hemmern auf Zellkulturen (Tabelle 10 bzw. 10: Proliferationshemmung verschiedener getesteter Zelllinien nach 72 Stunden; *: Bestrahlung mit Laborlicht; Angegeben sind Mittelwerte ± SD für die Proliferationshemmung nach 72 Stunden Zellkultivierung)

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Identifizierung und Klonierung eines ARGRIII-homologen Gens aus Mensch

11 bzw. Seq.-ID 3, 4 und 5 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz des humanen ArgRIII-homologen Gens, des Gens für die humane Form von Inositolpolyphosphat-Multikinase (GenBank Acc: AF 432853; gesperrt) sowie die hierdurch codierte Aminosäurensequenz.

Zuerst wurde mit der bekannten Aminosäure-Sequenz des Hefeproteins ArgRIII (GenBank Acc.: X05328.1; GenBank gi: 3375) eine Homologee-Suche in der HTGS-Datenbank mit dem tBLASTn-Programm durchgeführt. Diese Datenbank umfasst die im Rahmen des Humangenomprojektes gewonnen Sequenzen, die noch nicht vollständig assembliert sind. Diese Suche lieferte u.a. den Homo sapiens Chromosom 10 Klon RP11-637J22 (GenBank Acc.: AL358155.10; GenBank gi: 11322007). Ein Offenes Leseraster (ORF) in diesem Klon weist nach Translation deutliche Ähnlichkeiten zur ArgRIII-Sequenz auf, insbesondere zu der putativen Inositolphosphat-Bindungsstelle. Aus diesem genomischen Klon wurde durch Analyse der putativen Splicestellen und Homologievergleich eine hypothetische cDNA assembliert. Mit der hypothetischen cDNA-Sequenz wurde die humane EST Datenbank mit dem BLASTn Programm durchsucht. Diese Suche lieferte u.a. den Homo sapiens cDNA Klon IMAGE:4510867 (Gen-Bank Acc: BG258567; GenBank gi: 12768383). Laut Sequenzdaten enthält dieser Klon am 5'-Ende die vollständige codierende Sequenz. Der Klon wurde vom UK HGMP, Hinxton, England bezogen. Der Klon wurde beidsträngig sequenziert.

Der ORF war vollständig und entsprach der hypothetischen cDNA-Sequenz. An der Nukleotidposition 458 des ORFs war jedoch ein Ein-Basen-Einschub vorhanden, der zum Verlust des Leserasters und einem frühzeitigem Stop-Codon führte. Der Einschub wurde durch QuikChange-Mutagenese (9) entfernt. Die cDNA-Sequenz (1) des humanen ARGRIII-homologen Gens wurde in der GeneBank Datenbank hinterlegt (s.o).

Die chromosomale Lokalisation des humanen ARGRIII-homologen Gens ist 10q21. Die codierende Sequenz ist auf sechs Exons verteilt. Das offene Leseraster codiert für ein Protein mit 416 Aminosäuren (Berechnetes Molekulargewicht: 47219,40 Dalton). Das entsprechende Gen ist in der NCBI Datenbank zwar wegen der identifizierten Exons als putatives Gen assigniert, jedoch ohne Zuordnung zu einer bestimmten Proteinfunktion. FIG. 1 (Tabelle 2) Flavonoide als Hemmstoffe IP3K-A Aktivität

FIG. 2 (Tabelle 3) Weitere Stoffklassen als Hemmstoffe der IP3K-A

FIG. 3 (Tabelle 4) Die potentesten Inhibitoren von Gg-IP3K-A und Hs-IP3K-B

FIG. 4 (Tabelle 5) Inhibitoren von IP3K-C

FIG. 5 Inositol Polyphosphate Binding Site

FIG. 6 (Tabelle 6) Potente Hemmstoffe von Hs-IPMK

FIG. 7 (Tabelle 7) Schlechte Hemmstoffe von Hs-IPMK

FIG. 8 (Tabelle 8) IC50-Werte für die Wachstumshemmung von Jurkat Zellen durch Kombination zweier IP3K bzw. IPMK Inhibitoren

FIG. 9 (Tabelle 9) Additivität von IP3K/IPMK Inhibitoren bei der Wachstumshemmung von Jurkat Zellen

FIG. 10 (Tabelle 10) Proliferationshemmung verschiedener getesteter Zelllinien nach 72 Stunden

FIG. 11

SEQUENCE LISTING

Claims

Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen, dadurch charakterisiert, dass es aus folgenden Komponenten besteht: a) eine IP3K aus welcher Spezies und in welcher Isoform auch immer (A, B, oder C), wobei diese IP3K mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IP3K und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IP3K derartig zu hemmen in der Lage ist, dass das Substrat Ins(1,4,5)P3 nicht oder nur gering phosphoryliert wird. b) Eine IPMK aus welcher Spezies auch immer und in welcher Isoform auch immer, wobei die IPMK mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IPMK und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IPMK derartig zu hemmen in der Lage ist, dass eines seiner Substrate nicht oder nur gering phosphoryliert wird. c) Eine Zelle, bevorzugt einer Tumorzelle, zu welcher eine Substanz, welche in der Lage ist, eine IP3K zu hemmen, hinzugegeben wird und geprüft wird, ob diese Substanz das Wachstum der Zelle hemmt und/oder die Zelle tötet.
Testsystem nach Anspruch 1) dadurch charakterisiert, dass die Komponente b) die humane Isoform der IPMK (Seq.) enthält, oder ein Protein, welches homolog ist zu dieser Isoform oder ein Protein, welches eine aktivierende oder inaktivierende Mutation dieser Isoform darstellt.
Das humane Gen (Seq.) für die IPMK gemäß Anspruch 2), die Verwendung der DNA-Sequenz dieses Genes oder von Teilen hieraus für die Expression des Enzyms oder eines Teiles des Enzyms in einer beliebigen Zelle, und die Verwendung des vollständigen oder partiellen Genproduktes für ein Testsystem gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche.
Verwendung des Testsystems nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Auffindung und Prüfung eines das Zellwachstum hemmenden Wirkstoffes.
Wirkstoffe für die Hemmung des Zellwachstums, aufgefunden in einem Testsystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Wirkstoff nach Anspruch 5) ausgewählt aus einer Gruppe, umfassend bzw. bestehend aus "Ellagsäure, 3',4',7,8-Tetrahydroxyflavon, Fisetin, Galangin, Robinetin, Luteolin, Chrysin, Amentoflavon, Pyrogallolrot, Brompyrogallolrot, Bengalrosa B, Chinalizarin, Chlorogensäure, Bis-Tyrphostin, Rottlerin".
Kombinationen von mindestens zwei Wirkstoffen gemäß Anspruch 5) und 6) zur Hemmung des eines Zellwachstums.
Kombination von mindestens einem Wirkstoff gemäß Anspruch 5) und 6) mit mindestens einem Wirkstoff ausgewählt aus einer Gruppe, umfassend bzw. bestehend aus "Quercetin, Myricetin und deren Derivate, Gossypol, Aurintricarbonsäure (Aurintricarboxylic acid, ATA), Hypericin, die Grüntee-Catechinderivate ECG und EGCG".
Zubereitung enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Verwendung als Nahrungsmittelergänzung oder als Arzneimittel.
Verwendung einer Zubereitung für die Nahrungsmittelergänzung nach Anspruch 9) für die Prophylaxe einer proliferativen Erkrankung.
Verwendung einer Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 9) für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung.
Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 9) und 11) für die Verabreichung auf die Haut, auf die Schleimhaut, in die Unterhaut, in das Blutgefäßsystem, in eine Körperhöhle, in das Bindegewebe, in die Muskulatur, in ein Organ, in ein Gelenk oder für die orale oder rektale Verabreichung oder inhalative Aufnahme.
Verwendung einer Arzneimittelzubereitung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung, umfassend eine Krebserkrankung, eine Leukämie, ein Sarkom, einen benignen Tumor, eine Entzündung, eine Rheumaerkrankung, eine Autoimmunerkrankung, und/oder eine Organabstoßung.
Nukleinsäure (RNA, DNA) enthaltend ein Fragment einer Länge von zumindest 12, vorzugsweise von zumindest 18, höchstvorzugsweise zumindest 24, beispielsweise zumindest 90, Nukleotiden aus einer der Sequenzen Seq.-ID 3 oder 4, oder bestehend hieraus, eine allelische Variante einer solchen Nukleinsäure, eine zu einer vorstehenden Nukleinsäure zumindest 90%ig, insbesondere zumindest 95°ig, homologe Nukleinsäure, eine zu einer vorstehenden Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, oder eine mit einer vorstehenden Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure.
Peptid enthaltend ein Fragment einer Länge von zumindest 4, vorzugsweise von zumindest 6, höchstvorzugsweise zumindest 8, beispielsweise zumindest 30, Aminosäuren aus der Sequenz Seq.-ID 5 oder bestehend hieraus, oder codiert durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 14.
Expressionskassette bzw. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 14.
Mit einem Vektor bzw. einer Expressionskassette nach Anspruch 16 transformierte prokaryontische oder eukaryontische Zelle.
Antisense oder Ribozym gegen eine Nukleinsäure nach Anspruch 14.
Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper oder Phage Display Antikörper, gegen ein Peptid nach Anspruch 15.
Substanz mit einem Mw von weniger als 10000, weniger als 5000, weniger als 2000, oder weniger als 1000, spezifisch bindend an ein Peptid nach Anspruch 15.
Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 14 oder eines Peptids nach Anspruch 15 in einem Screening Verfahren zur Findung daran bindender Substanzen.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 15 in einem Verfahren gemäß Merkmal b) des Anspruchs 1, wobei eine hemmende Substanz selektiert wird.
Verwendung eines Wirkstoffes oder mehrerer, insbesondere zwei oder drei, der Wirkstoffe nach Anspruch 6, optional kombiniert mit einem Wirkstoff nach Anspruch 8, und/oder eines Stoffes oder mehrerer Stoffe nach einem der Ansprüche 18 – 20, ggf. kombiniert mit einem oder mehreren der Stoffe nach Anspruch 6 und/oder 8, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Nahrungsmittelergänzung zur Hemmung des Zellwachstums, insbesondere zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung nach Anspruch 13.