DE69933460T2

DE69933460T2 - Mitogen- und stress-aktivierte proteinkinasen, die zwei kinase domänen enthalten, und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69933460T2
Application number: DE69933460T
Authority: DE
Inventors: Dario Alessi; Maria Deak; Philip Invergowrie by Dundee COHEN; University of Dundee Matilde CAIVANO
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: DE69933460D1; WO1999067283A3; WO1999067283A8; JP4588215B2; US7122360B1; EP1109918B1; EP1109918A2; WO1999067283A2; JP2002518036A; AU4273099A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, Polynukleotide und Verwendungen hiervon, und betrifft insbesondere Mitglieder der Protein-Kinase-Familie, die zwei Kinase-Domänen enthalten.
Es wurden zehn Mitglieder der Mitogen-aktivierten Protein-Kinase-Familie (MAPK) in Säugetierzellen identifiziert (Übersicht in Cohen, 1997). Zwei dieser Familienmitglieder, nämlich MAPK1/ERK1 und MAPK2/ERK2 werden in starkem Maße durch Polypeptid-Wachstumsfaktoren aktiviert, deren Rezeptoren Protein-Tyrosin-Kinasen sind, sowie durch tumorfördernde Phorbolester, aber in wesentlich schwächerer Weise (in den meisten Zell-Kontexten) durch Stress-Stimulatoren und proinflammatorische Zytokine. Im Gegensatz hierzu werden die anderen Mitglieder der MAPK-Familie in starkem Maß durch Stresssignale und proinflammatorische Zytokine aktiviert, aber nur schwach (in den meisten Zell-Kontexten) durch Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Phorbolester. Aus diesem Grund werden sie häufig als durch Stress aktivierte Protein-Kinasen (SAPKs) bezeichnet.
Eine wesentliche Aufgabe in diesem Bereich ist es, die physiologischen Substrate und Rollen einer jeden der MAPKs und SAPKs zu identifizieren, doch trägt zu diesem Problem der Befund bei, dass eine Reihe der Substrate selbst von Protein-Kinasen gebildet wird, die wahrscheinlich zahlreiche physiologische Rollen besitzen. So aktivieren MAPK1/ERK1 und MAPK2/ERK2 drei eng aufeinander bezogene Protein-Kinasen, die als MAPK-aktivierte Protein-Kinasen Ia, Ib und Ic (MAPKAP-K1a/b/c, auch als RSK1/2/3 bezeichnet) bekannt sind (Sturgill et al., 1988 und Zhao et al 1995), während SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß zwei eng miteinander in Beziehung stehende Enzyme aktivieren, die als MAPKAP-K2 (Freshney et al., 1994; Rouse et al. 1994) und MAPKAP-K3 bezeichnet werden (Clifton et al., 1996; McLaughlin et al., 1996). Eine Reihe von Beweislinien zeigt an, dass die MAPKAP-K1-Isoformen in vivo Substrate für die MAPKs/ERKs sind und dass MAPKAP-K2/K3 in vivo Substrate für die SAPK2/p38-Isoformen sind. Beispielsweise hemmt der Wirkstoff PD 98059, der die Aktivierung von MAPKs/ERKs dadurch unterdrückt, dass er die Aktivierung ihrer stromaufwärtigen Aktivator-MAPK-Kinase-1 (MKK1) verhindert, auch die Aktivierung der MAPKAP-K1-Isoformen (Alessi et al., 1995), aber nicht MAPKAP-K2/K3 (Clifton et al., 1996).
Umgekehrt verhindert der Wirkstoff SB 203580, der ein spezieller Inhibitor von SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß ist, die Aktivierung von MAPKAP-K2/K3 (Cuenda et al., 1995; Clifton et al., 1996).
Die MAPKAP-K1-Isoformen sind insoweit ungewöhnlich, als sie jeweils zwei Protein-Kinase-Domänen mit einem einzigen Polypeptid enthalten, und dass eine Rolle der C-Terminal-Kinase-Domäne darin besteht, die N-Terminal-Kinase-Domäne zu aktivieren, was es letzterer erlaubt, exogene Substrate zu phosphorylieren (Bjorbaek et al., 1995; Vik und Ryder, 1997; Dalby et al., 1998). Die durch Phorbolester induzierte Aktivierung von MAPKAP-K1a in COS1-Zellen wird von der Phosphorylierung von sechs Residuen (Ser222, Thr360, Ser364, Ser381, Thr574 und Ser737) begleitet, von denen vier (Ser222, Ser364, Ser381 und Thr574) für die Aktivierung kritisch sind. Die MAPKs/ERKs phosphorylieren Thr574 in der C-Terminal-Domäne und Thr360 und Ser364, die zwischen den beiden Kinase-Domänen angeordnet sind. Die Phosphorylierung von Thr574 aktiviert die C-Terminal-Domäne, die dann Ser381 phosphoryliert. Die kombinierte Phosphorylierung von Ser364 und Ser381 löst die Aktivierung der N-Terminal-Domäne unter der Voraussetzung aus, dass Ser222 ebenfalls phosphoryliert ist (Dalby et al., 1998). Die Identität der Ser222-Kinase ist unklar.
Die Wichtigkeit von MAPKAP-K1 in der Zellfunktion wird durch den Befund angezeigt, dass Inaktivierungs-Mutationen im MAPKAP-K1b (RSK2)-Gen die Ursache des Coffin-Lowry-Syndroms sind, einer Erkrankung, die mit fortschreitenden Skelett-Abnormitäten und schwerwiegender mentaler Retardierung verbunden ist (Trivier et al., 1996). Obwohl die MAPKAP-K1-Isoformen in vitro viele Proteine phosphorylieren, war es noch nicht möglich, ihre physiologische(n) Rolle(n) zu definieren. Den MAPKAP-K1-phosphoryliert den Transkriptionsfaktor CREB (Cyclic AMP Response Element Binding Protein) in vitro und das Residuum (Ser133), von dem bekannt ist, dass es in vivo die Aktivierung auslöst (Xing et al., 1996). Es wird auch berichtet, dass MAPKAP-K1b die wesentliche Kinase ist, die auf CREBtide (ein synthetisches Peptid, das der Sequenz entspricht, die Ser133 umgibt) einwirkt, das in Lysaten detektiert werden kann, die aus NFG-stimulierten PC12-Zellen zubereitet werden (Gintry et al, 1994; Xing et al., 1996). Darüber hinaus wird die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 durch Signale induziert, welche die MAPK/ERK-Kaskade aktivieren, und durch PD 98059 verhindert (Pende et al., 1997). Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass CREB ein physiologisches Substrat für MAPKAP-K1 sein kann, doch wird die Möglichkeit, das CREB durch eine andere Protein-Kinase, die bezüglich MAPKs/ERKs „stromabwärts" liegt, phosphoryliert wird, ist nicht auszuschließen.
MAPKAP-K2/K3 phosphoryliert auch CREB bei Ser133 in vitro (Tan et al., 1996) und MAPKAP-K2 ist die Haupt-CREBtide-Kinase, die in Lysaten detektiert wird, die aus SK-N-MC-Zellen zubereitet werden, die mit einem Fibroblast-Wachstumsfaktor stimuliert oder durch Inkubation mit Natriumarsenit gestresst wurden (Tan et al., 1996). Darüber hinaus induzieren diese Stimuli die Phosphorylierung von Ser133 in SK-N-MC-Zellen und die Phosphorylierung wird durch SB 203580 verhindert (Tan et al., 1996). Diese Befunde deuten darauf hin, dass CREB ein physiologisches Substrat für MAPKAP-K2/K3 sein kann, doch wird die Möglichkeit, dass CREB durch eine andere Protein-Kinase phosphoryliert wird, die „stromabwärts" von SAPK2/p38 liegt, durch diese Daten nicht ausgeschlossen.
MAPK1/ERK1 und MAPK2/ERK2 phosphorylieren MAPKAP-K1-Isoformen in vivo (aber nicht MAPKAP-K2/K3) und SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß phosphorylieren MAPKAP-K2/K3 in vivo (aber nicht MAPKAP-K1). Es wurden jedoch kürzlich zwei eng verwandte Protein-Kinasen identifiziert, die in vitro und in vivo sowohl durch MAPKs/ERKs als auch SAPK2/p38 aktiviert werden. Aus diesem Grund wurden sie als MAPK-integrierende Kinasen-1 und Kinasen-2 (MNK1, MNK2) bezeichnet (Fukunaga & Hunter, 1997; Waskie wicz et al., 1997). Wie MAPKAPK2/K3, sind MNK1 und MNK2 Einzelkinasen-Domän-Enzyme. Ein physiologisches Substrat von MNK1 kann der Protein-Synthese-Einleitungsfaktor eIF4E sein. MNK phosphoryliert eIF4E bei Ser209 in vitro (Waskiewicz et al., 1997), das Residuum, dessen Phosphorylierung durch Wachstumsfaktoren oder Phorbolester in vivo induziert wird. Die durch Wachstumsfaktoren induzierte Phosphorylierung von Ser209 wird durch PD 98059 verhindert, während die durch Stresssignale induzierte Phosphorylierung von Ser209 durch SB 203580 unterdrückt wird (Wang et al., 1998).
Wir beschreiben jetzt die Identifizierung und Charakterisierung von zwei neuen Protein-Kinasen, die MAPKAP-K1-Isoformen insofern ähneln, als sie zwei Protein-Kinase-Domänen mit einem einzelnen Polypeptid enthalten. Anders als MAPKAP-K1 (aber ähnlich wie MNKs) werden sie in vitro und in vivo jedoch sowohl durch MAPKs/ERKs als auch SAPK2/p38 aktiviert, und aus diesem Grund wurden sie als Mitogen- und Stress-aktivierte Protein-Kinasen 1 und –2 (MSK1, MSK2) bezeichnet. Wir liefern auch Beweise, die darauf hinweisen, dass MSK1 und/oder MSK2 als MAPKAP-K1 oder MAPKAP-K2/K3 die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren CREB und ATF1 durch Wachstumsfaktoren und Stresssignale vermitteln können.
Entzündungs-Vermittler, wie z.B. Prostaglandine, Leukotriene, Interleukin-1 (IL-1) und TNF werden in Makrophagen während einer bakterieller Infektion durch Signalübertragungspfade erzeugt, die getriggert werden, wenn ein Lipopolysaccharid (LPS; Endotoxin), eine Komponente der Zellwand von gram-negativen Bakterien mit dem CD14-Rezeptor in Wechselwirkung tritt. Diese Entzündungs-Vermittler spielen Schlüsselrollen bei der Steigerung von Immunreaktionen, die nötig sind, um die bakterielle Infektion zu bekämpfen. Ihre Überproduktion kann aber auch die Ursache von chronischen Entzündungserkrankungen und septischen Schocks sein. Aus diesem Grund können Wirkstoffe, die in der Lage sind, die Produktion von Entzündungs-Vermittlern zu unterdrücken, bei der Behandlung dieser Krankheitszustände nützlich sein. Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert einen Raten-Begrenzungsschritt bei der Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen und wird synthetisiert, wenn Makrophagen LPS exponiert werden (Dubois et al (1998) FASEB j 12, 1063-1073).
CREB kann bei der Transkription des induzierbaren Cyclooxygenase-2 (COX2)-Gens eine Rolle spielen. Es scheint, dass COX2 bei der Transkription oder bei Translationspegeln reguliert wird. Das COX2-Protein scheint schnell deaktiviert oder abgebaut zu werden (siehe z.B. Marshall et al (1979) „Constraints on prostaglandin synthesis in tissues" J Biol Chem 262, 3510-3517). Die mRNA kann auch instabil sein: der lange 3'-untranslatierte Teil von COX2 mRNA enthält mehrfache Kopien der Shaw-Kamen-Sequenz (AUUUA), die ein Merkmal von Frühreaktions-Genen mit einem schnellen mRNA-Abbau sind (Kosaka et al. (1994) Eur J Biochem 221, 889-897).
Die CREB-Steuerung der COX2-Expression wird von Montminy (1997) in Ann Rev Biochem 66, 807-822 diskutiert.
CREB kann auch die Expression des c-Fos-Gens (oder Fos-Gens) induzieren. Dieses Gen ist wichtig bei der Steuerung der Proliferation und Differentiation. Eine fehlerhafte Steuerung von c-Fos kann bei Krebs eine Rolle spielen und die Hemmung der Fos-Transkription kann als Antikrebs-Behandlung nützlich sein, die bei den meisten Krebsarten angewendet werden kann.
Der Promotor für IL-1 enthält ein zyklisches AMP-Reaktions-Element (Chandra et al. (1995) J Immunol 155, 4535-4543).
ATF1 scheint eine zu CREB ähnliche Rolle zu spielen und kann gegen CREB austauschbar sein.
Wir haben eine neue durch Mitogen- und Stress-aktivierte Protein-Kinase identifiziert (die wir als MSK1 bezeichnen) und ein mit ihr eng in Beziehung stehendes Homolog (dass wir als MSK2 bezeichnen) die in einem einzelnen Polypeptid zwei Protein-Kinase-Domänen enthalten. MSK1 (802 Residuen) zeigt eine 40%-ige Gesamt-Aminosäurensequenz-Identität mit der durch MAP-Kinase aktivierten Protein-Kinase-1 (MAPKAP-K1, die auch als p90 RSK bezeichnet wird) einem weiteren Enzym mit zwei Kinase-Domänen. Die N- und C-Terminal-Kinase-Domänen von MSK1 sind zu 54% und 44% identisch mit den entsprechenden Domänen in MAPKAP-K1, und die vier eine Phosphorylierung aktivierenden Schlüsselstellen in MAPKAP-K1 werden in MSK1 beibehalten. Ähnlich wie MAPKAP-K1 (Sturgill et al., 1988)) wird MSK1 in vitro durch MAPK2/ERK2 aktiviert, doch wird es anders als MAPKAP-K1 ebenfalls durch Stress-aktivierte Protein-Kinase2a (SAPK2, die auch als p38ß und SAPK2/p38ß2 bezeichnet wird) aktiviert. Zu diesen Befunden passt, dass endogenes MSK1 in 293-Zellen entweder durch Polypeptid-Wachstumsfaktor- oder Phorbolester-Stimulation oder durch UV-Strahlungs-Exposition, oxidativen und chemischen Stress aktiviert wird, während MAPKAP-K1 nur durch Wachstumsfaktor- oder Phorbolester-Stimulation signifikant aktiviert wird. Die Aktivierung von MSK1 durch eine Wachstumsfaktor- oder Phorbolester-Stimulation wird durch den Wirkstoff PD 98059 verhindert, der die Aktivierung der MAPK-Kaskade unterdrückt, während die Aktivierung von MSK1 durch UV-Strahlung, oxidativen und chemischen Stress in starkem Maß durch SB 203580 verhindert wird, einem spezifischen Inhibitor von SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß. In HeLa-Zellen, werden sowohl PD 98059 als auch SB 203580 benötigt, um die Aktivierung von MSK1 durch TNF zu unterdrücken, da dieser Wirkstoff sowohl die MAPK/ERK- als auch die SAPK2/p38-Kaskaden aktiviert. Die Aktivierung von MSK1 entweder durch Phorbolester oder durch UV-Strahlung wird dadurch aufgehoben, dass einzelne Inaktivierungsmutationen entweder in der N-Terminal- oder C-Terminal-Kinase-Domäne erzeugt werden. MSK1 ist im Zellkern lokalisiert und phosphoryliert den Transkriptionsfaktor CREB bei Ser133.
In vitro ist CREB ein wesentlich besseres Substrat für MSK1 als MAPKAP-K1 und MAPKAP-K2, die ebenfalls CREB bei Ser133 phosphorylieren. Ein synthetisches Peptid, das der Sequenz entspricht, die Ser133 umgibt, wird mit einem bemerkenswert niedrigen Km-Wert (< 0,1 μM) phosphoryliert. Wir zeigen, dass die Effekte von SB 203580 und PD 98059 in Bezug auf die durch EGF, UV und TNF induzierte Aktivierung von CREB und ATF1 die Einflüsse dieser Inhibitoren auf die MSK1-Aktivierung widerspiegeln. Diese Befunde deuten zusammen mit anderen Beobachtungen darauf hin, dass MSK1 und MSK2 die durch Wachstumsfaktoren und Stress induzierte Aktivierung von CREB vermitteln können.
Wir liefern den Nachweis, dass MSK1 und MSK2 die Transkription der Gene für die proinflammatorischen Mediatoren COX-2 und IL-1 und die Induktion des proinflammatorischen COX-2-Proteins regulieren können. Wir zeigen, dass MSK1 und MSK2 beide aktigviert sind, wenn Makrophagen mit LPS stimuliert werden. Zusammensetzungen, die die Aktivierung oder Aktivität von MSK1 und MSK2 unterdrücken, können die LPS-induzierte Phosphorylierung von CREB und ATF1 und/oder des Transkriptionsfaktors C/EPPß, die Transkription der COX-2- und IL-1-Gene und die Induktion des COX-2-Proteins verhindern.
CREB/ATF1 scheint für die Transkription von COX-2 nötig zu sein; Inhibitoren von MSK1 können nützlich bei der Behandlung von Krankheiten oder Zuständen sein, bei denen COX2 eine Rolle spielt, oder bei denen nicht-steroidale anti-inflammatorische Substanzen (NSAIDs), insbesondere COX2-selektive Inhibitoren sich als nützlich erwiesen haben. Solche Krankheiten oder Zustände können solche umfassen, bei denen angenommen wird, dass Entzündungsprozesse eine Rolle spielen, oder bei denen Schmerzbekämpfung nützlich sein kann.
CREB/ATF1 kann für die Transkription von c-Fos erforderlich sein, und daher können Inhibitoren von MSK1/MSK2 nützlich bei der Behandlung von Krankheiten oder Zuständen sein, bei denen c-Fos eine Rolle spielt. Solche Krankheiten oder Zustände können Krebs umfassen.
Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das die folgende Aminosäuresequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon oder ein Fusionsprodukt einer solchen Variante oder eines Fragments oder eines Derivats umfasst. Wir sind der Auffassung, dass das Polypeptid, dessen Aminosäuresequenzen oben wiedergegeben sind, Mitogen- und Stress-aktivierte Protein-Kinasen sind.
Die Polypeptide, deren Aminosäuresequenzen oben wiedergegeben sind, werden hier als MSK1 (Mitogen- und Stress-aktivierte Protein-Kinase 1, die erste dargestellte Sequenz) oder MSK2 bezeichnet (Mitogen- und Stress-aktivierte Protein-Kinase 2; die zweite Sequenz ist eine Teilsequenz eines menschlichen MSK2, die dritte Sequenz ist eine Teilsequenz einer Splice-Variante des menschlichen MSK2, die vierte Sequenz ist eine Teilsequenz des menschlichen MSK2 und die fünfte Sequenz ist eine Teilsequenz von Mäuse-MSK2).
Die Aminosäuresequenz von MSK1 ist auch in 1 (MSK1) dargestellt. Eine partielle Aminosäuresequenz von menschlichem MSK2 ist auch in 2C dargestellt. Das Maus-MSK2 ist eine Variante des menschlichen MSK2 und ist ebenfalls in 2C wiedergegeben.
Unter dem Ausdruck „im wesentlichen rein" verstehen wir, dass das besagte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist. Somit schließen wir jede Zusammensetzung ein, deren Proteingehalt zu wenigstens 30 Gew.-% dieses Polypeptid ist, vorzugsweise zu wenigstens 50 Gew.-%, in stärker bevorzugter Weise zu wenigstens 70 Gew.-%, in noch stärker bevorzugter Weise zu wenigstens 90 Gew.-% und in besonders bevorzugter Weise zu wenigstens 95 Gew.-%.
Somit umfasst die Erfindung auch Zusammensetzungen, die dieses Polypeptid und eine Beimengung enthalten, wobei diese Beimengung weniger als 70 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise weniger als 50 Gew.-% der Zusammensetzung, stärker bevorzugt weniger als 30 Gew.-% der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt weniger als 10 Gew.-% der Zusammensetzung und in besonders bevorzugter Weise weniger als 5 Gew.-% der Zusammensetzung ist.
Die Erfindung umfasst auch dieses im Wesentlichen reine Polypeptid, wenn es ex vivo mit anderen Komponenten kombiniert wird, wobei diese anderen Komponenten nicht all diejenigen Komponenten sind, die in der Zelle gefunden werden, in der sich das Polypeptid findet.
Varianten (unabhängig davon, ob sie natürlich oder auf andere Weise auftreten) können unter Verwendung von Verfahren der Protein-Konstruktion und der orts-gerichteten (sitedirected) Mutagenese hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, wobei die unten beschriebenen rekombinanten Polynukleotide verwendet werden.
Unter dem Ausdruck „Fragment des Polypeptids" verstehen wir jedes Fragment, das die Aktivität beibehält oder das in anderer Hinsicht nützlich ist, beispielsweise zur Verwendung bei der Erzeugung von Antikörpern oder bei einer Bindungs-Untersuchung.
Unter „Fusionsprodukt des Polypeptids" verstehen wir das besagte Polypeptid, das mit irgendeinem anderen Polypeptid fusioniert ist. Beispielsweise kann das Polypeptid mit einem Polypeptid, wie z.B. Glutathion-S-Transferase (GST) oder Protein A fusioniert sein, um die Reinigung des Polypeptids zu erleichtern. Beispiele solcher Fusionsprodukte mit GST werden im Beispiel 1 wiedergegeben. In ähnlicher Weise kann das Polypeptid mit einem Oligo-Histidin-Tag, wie z.B. His6, oder einem Epitop fusioniert sein, das von einem Antikörper erkannt wird, wie z.B. das allgemein bekannte Myc-Tag-Epitop. Fusionsprodukte mit irgendeiner Variante, einem Fragment oder einem Derivat des besagten Polypeptids liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung.
Unter „Varianten" des Polypeptids verstehen wir Einfügungen (insertions), Ausschneidungen (deletions) und Substitutionen entweder konservativ oder nicht-konservativ. Insbesondere verstehen wir hierunter Varianten des Polypeptids, bei denen derartige Veränderungen die Aktivität des Polypeptids nicht wesentlich ändern. Varianten von MSK1 oder MSK2 umfassen nicht Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz des menschlichen MAPKAP-K1a/b/c umfassen, das auch als Rsk1/2/3 bekannt ist. Varianten von MSK1 oder MSK2 umfassen auch nicht Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz von Drosophila melanogaster p70 S6-Kinase umfassen, wie dies in WO 98/03662 beschrieben ist. Dieses Polypeptid ist ungefähr zu 55% identisch mit MSK1 oder MSK2 in der N-Terminal-Domäne und ist insgesamt ungefähr zu 20% identisch.
Es sei darauf hingewiesen, dass eine Variante, die im wesentlichen alles einer oben wiedergegebenen Sequenz (d.h. im wesentlichen die gesamte Länge von MSK1) oder im wesentlichen die volle Länge des menschlichen oder des von der Maus stammenden MSK2 umfasst, das im wesentlichen die gesamte menschliche oder von der Maus stammende MSK2-Sequenz aufweist, wie oben gezeigt, besonders nützlich sein kann. Unter „im wesentlichen die gesamte" wird verstanden, dass zumindest 80%, vorzugsweise 90%, oder in noch stärker bevorzugter Weise 95%, 98% oder 100% (d.h. alles) dieser Sequenz umfasst werden. Unter „im Wesentlichen die volle Länge" wird verstanden, dass zumindest 80%, vorzugsweise 90%, noch stärker bevorzugt 95%, 98% oder 100% (d.h. alles) der Sequenz der vollen Länge des Polypeptids umfasst werden.
Unter „konservativen Substitutionen" werden Kombinationen, wie z.B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr verstanden.
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Polypeptidvariante eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu wenigstens 65%, in stärker bevorzugter Weise zu wenigstens 75%, noch stärker bevorzugt zu wenigstens 80%, noch stärker bevorzugt zu wenigstens 90% und in besonders bevorzugter Weise zu wenigstens 95% oder 99% Identität mit der oben wiedergegebenen Aminosäuresequenz besitzt.
Die Prozent-Sequenz-Identität zwischen zwei Polypeptiden kann unter Verwendung geeigneter Computerprogramme, beispielsweise des GAP-Programms der University of Wisconsin Genetic Computing Group ermittelt werden, und es sei darauf hingewiesen, dass die Prozent-Identität in Relation zu Polypeptiden berechnet wird, deren Sequenzen optimal ausgerichtet worden sind.
Die Ausrichtung kann alternativ unter Verwendung des Clustal-W-Programms (Thompson et al., 1994) durchgeführt werden. Die verwendeten Parameter können die folgenden sein: Fast pairwise alignment parameters: K-tuple(word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent. Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0,05.
Scoring matrix: BLOSUM.
Somit kann, unter der Verwendung dieser Parameter, MSK1 eine 42–44%-ige Gesamtidentität mit dem nächstliegenden Homologen in der NCBI-Datenbank, nämlich MAPKAP-K1a, b und c haben.
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung schafft ein im Wesentlichen reines menschliches MSK1-Polypeptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz
oder natürlicherweise auftretenden, allelischen Varianten hiervon besteht. Die Aminosäuresequenz ist auch als Translation einer Polynukleotid-Sequenz in 1 dargestellt.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung liefert ein im wesentlichen reines MSK2-Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz
oder
oder natürlicherweise auftretenden allelischen Varianten hiervon besteht.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung liefert ein im Wesentlichen reines, die volle Länge besitzendes, menschliches MSK2-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz

oder natürlicherweise auftretende allelische Varianten hiervon umfasst. Es sei darauf hingewiesen, dass jede der oben genannten Sequenzen nicht die vollständige Aminosäuresequenz des die volle Länge besitzenden menschlichen MSK2 ist.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung liefert ein im Wesentlichen reines, die volle Länge besitzendes Maus-MSK2-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz

oder natürlicherweise auftretende, allelische Varianten hiervon umfasst. Es sei darauf hingewiesen, dass die obige Sequenz nicht die gesamte Aminosäuresequenz des die volle Länge besitzenden Maus-MSK2 ist.
Es ist wesentlich, dass die Variante oder das Fragment oder das Derivat oder das Fusionsprodukt des besagten Polypeptids oder das Fusionsprodukt der Variante oder des Fragments oder des Derivats mindestens 30% der Enzymaktivität von MSK1 bezüglich der Phosphorylierung von Crosstide (GRPRTSSFAEG; siehe Beispiel 1), CREB oder CREBtide (ein synthetisches Peptid, das der Sequenz entspricht, die Ser133 umgibt (EILSRRPSYRK; siehe Beispiel 1) oder vorzugsweise bezüglich der Phosphorylierung eines GST-CREB-Fusions-Proteins, beispielsweise des Proteins, das im Beispiel 1 beschrieben ist, oder von MSK2 bezüglich der Phosphorylierung von Crosstide, CREB, einem GST-CREB-Fusions-Protein, wie oben erwähnt, oder CREBtide in geeigneter Weise besitzt. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Variante oder das Fragment oder das Derivat oder das Fusionsprodukt des Polypeptids, oder das Fusionsprodukt der Variante oder des Fragments oder des Derivates wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 70% und noch mehr bevorzugt wenigstens 90% der Enzymaktivität von MSK1 bezüglich der Phosphorylierung von CREB oder der oben beschriebenen Alternativen oder von MSK2 bezüglich der Phosphorylierung von Crosstide oder der oben beschriebenen Alternativen in geeigneter Weise besitzt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein rekombinantes Polynukleotid, das ein Polypeptid kodiert, wie es gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder das eine Variante, ein Fragment, ein Derivat oder ein Fusionsprodukt dieses Polypeptids oder ein Fusionsprodukt dieser Variante, des Fragments oder Derivates kodiert, welches die hier beschriebene Aktivität besitzt. Die bevorzugten Varianten und Ausschlüsse für diese Polynukleotid-Variante sind die gleichen wie beim ersten Gesichtspunkt der Erfindung mit der Ausnahme, dass die folgenden Expressed Sequence Tags (ESTs) ebenfalls ausgeschlossen sind:
ETS bezogen auf menschliches MSK1: AA158572, AA158571, AA255846, AA699729, AA134359, AA314565, N31641, AA305163, WO4930, AA134358, AA322270, H09985, AA255996, R11235, N57096, T97538, T97584, H09986, R11183, HSCOJE081, AA472165, AA897221, AA389168, AA061016, AA444366.
ESTs, bezogen auf menschliches MSK2: AA568895, AA857431, H41647, AA443601, AA678670, H53714; AA627558, H46268, R17109, AA955129.
ESTs bezogen auf Mäuse-MSK2: AA267490, AA444366, AA061016, AA389168, AA472165, AA657108.
Alle ESTs werden durch die Gen-Datenbank-Zugriffsnummer identifiziert, wie im Beispiel 1 beschrieben.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein rekombinantes Polynukleotid, das für die Expression eines Polypeptids geeignet ist, wie es gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder das für die Expression einer Variante oder eines Fragments oder eines Derivats eines Fusionsprodukts des Polypeptids oder eines Fusionsprodukts einer solchen Variante oder Fragments oder Derivats geeignet ist, das die Aktivität wie hier beschrieben besitzt. Bevorzugte Formen und Ausflüsse dieser Polynukleotid-Variante sind die gleichen wie beim ersten Gesichtspunkt der Erfindung.
Unter „geeignet für die Expression" wird verstanden, dass das Polynukleotid ein Polynukleotid ist, das translatiert werden kann, um das Polypeptid zu bilden, beispielsweise RNA, oder dass das Polynukleotid (das vorzugsweise DNA ist), welches das Polypeptid der Erfindung kodiert, in einen Expressionsvektor, wie z.B. in ein Plasmid in der geeigneten Ausrichtung und mit dem richtigen Leserahmen für eine Expression eingefügt wird. Das Polynukleotid kann mit dem geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Steuernukleotid-Sequenzen verbunden sein, die von irgendeinem gewünschten Wirt erkannt werden; solche Steuerungen können im Expressionsvektor enthalten sein.
Es wird nicht davon ausgegangen, dass jedes der oben aufgeführten ESTs ein Polynukleotid in der oben definierten Weise ist; um Zweifel zu vermeiden, werden jedoch die oben ausgeschlossenen ESTs weiter auch aus diesem Gesichtspunkt der Erfindung ausgeschlossen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein replizierbarer Vektor, der geeignet ist, ein Polypeptid wie im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert zu exprimieren oder der geeignet ist, eine Variante oder ein Fragment oder ein Fusionsprodukt dieses Polypeptids oder ein Fusionsprodukt dieser Variante oder des Fragments oder Derivates zu exprimieren, das die hier beschriebene Aktivität besitzt. Bevorzugte Formen und Ausschlüsse für diese Polynukleotid-Variante sind die gleichen wie beim ersten Gesichtspunkt der Erfindung. Beispielsweise kann der replizierbare Vektor geeignet sein, ein Fusionsprodukt des Polypeptids wie im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert, insbesondere ein GST-Fusionsprodukt zu exprimieren, wie dies beispielsweise im Beispiel 1 beschrieben ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Polynukleotid, das ein Fusionsprodukt des Polypeptids, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder ein Fusionsprodukt einer Variante oder eines Fragments oder eines Derivates kodiert, das die beschriebene Aktivität besitzt, insbesondere ein GST-Fusionsprodukt. Ein weiterer Gesichtspunkt ist ein Vektor, der für die Replikation in einer Säugetier/eukaryotischen Zelle geeignet ist, ein Polynukleotid umfasst, das das Polypeptid oder eine Variante oder ein Fragment oder ein Derivat oder ein Fusionsprodukt des Polypeptids kodiert, wie im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert, oder ein Fusionsprodukt einer Variante oder eines Fragments oder eines Derivates, das die beschriebene Aktivität besitzt, insbesondere ein GST-Fusionsprodukt. Die folgenden ESTs-Klone können Vektoren sein, die für die Replikation in einer Säugetier/eukaryotischen Zelle geeignet sind und werden aus diesem Gesichtspunkt der Erfindung ausgeschlossen: AA389168; AA678670. Es wird nicht angenommen, dass irgendwelche anderen der ESTs, die von anderen Gesichtspunkten der Erfindung ausgeschlossen wurden, Vektoren im oben definierten Sinne sind; es wird jedoch darauf hingewiesen, dass irgendwelche anderen der ESTs-Klone, die ein solcher Vektor sein können, ebenfalls ausgeschlossen werden.
Merkmale von Vektoren, die für die Replikation in Säugetier/eukaryotischen Zellen geeignet sind, sind dem Fachmann allgemein bekannt, und Beispiele werden weiter unten angeführt. Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vektor für eine Replikation sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen geeignet sein kann.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotid-Sequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon. Die Nukleotid-Sequenz, die MSK1 kodiert, ist in 1 zusammen mit der Translation des betreffenden offenen Leserahmens dargestellt.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotid-Sequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon, das ein Protein mit der gewünschten Aktivität kodiert.
Die oben genannten Polynukleotide kodieren teilweise menschliche (zwei Splice-Varianten) MSK2 bzw. Mäuse-MSK2. Es sei darauf hingewiesen, dass Sequenzen, die Mäuse- oder Menschen-MSK2 mit voller Länge kodieren, durch die Routineverwendung von Verfahren erhalten werden können, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, wobei die oben gezeigten Sequenzen verwendet werden. So können PCR-Verfahren verwendet werden, insbesondere Verfahren, die entwickelt wurden, um 5' cDNA-Sequenzen zu erzeugen (beispielsweise das „RACE"-Verfahren, wie es dem Fachmann bekannt ist).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Sequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon, das ein Protein mit der gewünschten Aktivität kodiert. Die Nukleotid-Sequenz, die MSK1 kodiert, ist in 1 zusammen mit der Translation des entsprechenden offenen Leserahmens dargestellt.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotid-Sequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon, das ein Protein mit der gewünschten Aktivität kodiert.
Die obigen Polynukleotide kodieren teilweise menschliche (zwei Splice-Varianten) MSK2 bzw. Mäuse-MSK2.
Eine die volle Länge aufweisende menschliche MSK2-Polypeptid-Sequenz kann die folgende sein, wie sie durch die Gen-Bank-Eintrags-Zugangsnummer AJ010119 wiedergegeben ist (Pierrat et al (1998) J Biol Chem 273 (45), 29661-29671):
Eine die volle Länge besitzende menschliche MSK2-Nukleotid-Sequenz kann die folgende sein, wie sie in der Gen-Bank-Eintrags-Zugangsnummer AJ010119 wiedergegeben ist (Pierrat et al (1998) J Biol Chem 273 (45), 29661-29671):
Es sei darauf hingewiesen, dass ein exprimierter Sequenz-Tag-Klon (EST-Klon) nicht ein rekombinantes Polynukleotid ist, wie es oben definiert wurde, da ihm die Sequenzen fehlen, die für die Translation und somit die Expression des exprimierten Sequenz-Tags erforderlich sind. EST-Sequenzen können in dem Vektor Uni-ZAP XR, pT7T3D-Pac, pBluescript SK-, Lafmid BA oder pCMV-SPORT2-Vektor geklont werden.
Ein Polynukleotid, das ein Fragment des rekombinanten Polynukleotids umfasst, das ein Polypeptid der Erfindung oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat kodiert, wie es hier beschrieben wurde, kann ebenfalls nützlich sein. Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid ein Fragment, das eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden, vorzugsweise wenigstens 14 Nukleotiden und in noch mehr bevorzugter Weise von wenigstens 18 Nukleotiden besitzt. Solche Polynukleotide sind als PCR-Primer nützlich. Ein Polynukleotid, das komplementär zu dem Polynukleotid oder einem Fragment hiervon ist, das ein Polypeptid der Erfindung oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat kodiert, kann ebenfalls nützlich sein. Solche komplementären Polynukleotide sind dem Fachmann allgemein als Antisense-Polynukleotide bekannt.
Die Polynukleotide oder rekombinanten Polynukleotide der Erfindung können DNA oder RNA, vorzugsweise DNA sein. Die Polynukleotide können in der kodierenden Sequenz Introns enthalten oder nicht; vorzugsweise ist das Polynukleotid eine cDNA.
Eine „Variation" des Polynukleotids umfasst ein Polynukleotid, das (i) verwendet werden kann, um ein Protein oder ein Fragment hiervon zu erzeugen, das seinerseits nützlich ist, Antikörper zuzubereiten, die sich speziell an das durch das Polynukleotid kodierte Protein binden oder (ii) eine Antisense-Sequenz ist, die dem Gen oder einer Variation des Typs (i) entspricht, wie dies eben definiert wurde. Beispielsweise können unterschiedliche Codons substituiert werden, die die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren, wie das ursprüngliche Codon. Alternativ können die substituierten Codons eine andere Aminosäure kodieren, die die Aktivität oder Immunogenizität des Proteins nicht beeinflusst, oder die dessen Aktivität oder Immunogenizität verbessern oder auf andere Weise verändern kann. Beispielsweise können eine orts-gerichtete Mutagenese oder andere Verfahren verwendet werden, um einzelne oder mehrfache Mutationen zu erzeugen, wie z.B. Ersetzungen, Einfügungen, Ausschneidungen und Transpositionen, wie dies von Botstein und Shortle in „Strategies and Applications of In vitro Mutagenesis" Science, 229: 193-210 (1985) beschrieben wird, wobei der Inhalt dieses Artikels hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Da solche modifizierten Polynukleotide durch die Anwendung von bekannten Verfahren auf die hier gegebene Lehre erzielt werden können, liegen solche modifizierten Polynukleotide im Rahmen der beanspruchten Erfindung.
Darüber hinaus sieht der Fachmann, dass die Polynukleotid-Sequenz (oder Fragmente hiervon, welche ein Polypeptid der Erfindung kodiert bzw. kodieren, verwendet werden kann, um andere Polynukleotid-Sequenzen zu erhalten, die mit ihr unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren. Solche Polynukleotide umfassen jede genomische DNA. Somit umfasst das Polynukleotid der Erfindung ein Polynukleotid, das zu wenigstens 60%, vorzugsweise zu 70% und noch mehr bevorzugt wenigstens zu 80% und in besonders bevorzugter Weise zu 90% homolog mit dem gemäß dem Verfahren der Erfindung identifizierten Polynukleotid ist, vorausgesetzt, dass dieses homologe Polynukleotid ein Polypeptid kodiert, das in wenigstens einigen der unten beschriebenen Verfahren verwendet werden kann oder auf andere Weise nützlich ist.
Die Prozent-Homologie kann beispielsweise durch das GAP-Programm der University of Wisconsin Genetic Computer Group ermittelt werden.
DNA-DANN-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Hybridisierung kann in einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, die zwischen 0,1 XSSC und 6XSSC enthält und bei Temperaturen im Bereich von 55°C bis 70°C. Es ist aus dem Stand der Technik allgemein bekannt, dass je höher die Temperatur oder je niedriger die SSC-Konzentration ist, die Hybridisierungsbedingungen umso stringenter sind. Unter einer hohen „Stringenz" verstehen wir 2XSSC und 65°C. 1XSSC ist ein 0,15M NaCl/0,015M Natriumzitrat. Polynukleotide, die bei hoher Stringenz hybridisieren, liegen im Rahmen der beanspruchten Erfindung.
„Varianten" des Polynukleotids umfassen auch Polynukleotide, bei denen relativ kurze Stücke (beispielsweise 20 bis 50 Nukleotide) ein hohes Maß von Homologie (wenigstens 80% und vorzugsweise wenigstens 90% oder 95%) mit äquivalenten Abschnitten des Polynukleotids der Erfindung besitzen, obwohl die Gesamthomologie zwischen den beiden Polynukleotiden wesentlich kleiner sein kann. Dies ist deswegen der Fall, weil wich tige aktive Stellen oder Bindestellen selbst dann gemeinsam vorhanden sein können, wenn die allgemeine Struktur des Proteins eine andere ist.
Es wurde eine Vielzahl von Verfahren entwickelt, um in wirksamer Weise Polynukleotide, insbesondere DNA mit Vektoren beispielsweise über komplementäre, kohäsive Termini zu verbinden. Geeignete Verfahren werden in Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY beschrieben.
Ein wünschbarer Weg zur Modifikation der DNA, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert, ist die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion, wie sie von Saiki et al (1988) Science 239, 487-491 beschrieben wird. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die DNA in einen geeigneten Vektor einzubringen, beispielsweise durch Arbeiten an geeigneten Restriktionsstellen, oder es kann verwendet werden, um die DNA auf andere nützliche Weisen zu verändern, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Bei diesem Verfahren wird die DNA, die enzymatisch amplifiziert werden soll, von zwei speziellen Primern flankiert, die ihrerseits in die amplifizierte DNA aufgenommen werden. Diese speziellen Primer können Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen enthalten, die verwendet werden können, um eine Klonierung in Expressionsvektoren unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchzuführen.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, die RNA) wird dann in einem geeigneten Wirt exprimiert, um ein Polypeptid zu erzeugen, das die Verbindung gemäß der Erfindung umfasst. Somit kann die DNA, die das Polypeptid kodiert, das die Verbindung der Erfindung bildet, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren verwendet werden, die geeigneter Weise unter Berücksichtigung der hier gegebenen technischen Lehre modifiziert werden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids der Erfindung zu transformieren. Solche Verfahren umfassen die Verfahren, die in folgenden US-Patentschriften beschrieben sind: 4,440,859, vom 3. April 1984 für Rutter et al., 4,530,901 vom 23. Juli 1985 für Weissman, 4,582,800 vom 15. April 1986 für Crowl, 4,677,063 vom 30. Juni 1987 für Mark et al., 4,678,751 vom 7. Juli 1987 für Goeddel, 4,704,362 vom 3. November 1987 für Itakura et al, 4,710,463 vom 1. Dezember 1987 für Murray, 4,757,006 vom 12. Juli 1988 für Toole, Jr. et al., 4,766,075 vom 23. August 1988 für Goeddel et al und 4,810,648 vom 7. März 1989 für Stalker; der Inhalt all dieser Druckschriften wird hier durch Bezugnahme mit aufgenommen.
Die DNA (oder im Fall eines retroviralen Vektors, die RNA), welche das Polypeptid kodiert, das die Verbindung der Erfindung bildet, kann mit einer großen Anzahl von anderen DNA-Sequenzen für die Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die Begleit-DNA hängt von der Natur des Wirtes, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon ab, ob eine episomale Aufrechterhaltung oder Integration gewünscht wird.
Allgemein wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie z.B. ein Plasmid in geeigneter Ausrichtung und in einem für die Expression richtigen Leserahmen eingefügt. Erforderli chenfalls kann die DNA mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Kontroll-Nukleotid-Sequenzen verbunden werden, die von den gewünschten Wirt erkannt werden, obwohl solche Kontrollen im allgemeinen im Expressionsvektor zur Verfügung stehen. Der Vektor wird dann in den Wirt mit Hilfe eines Standardverfahrens eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher ist es erforderlich, transformierte Wirtszellen zu selektieren. Ein Selektionsverfahren umfasst das Inkorporieren einer DNA-Sequenz in den Expressionsvektor mit den erforderlichen Kontrollelementen, die für ein wählbares Merkmal in der transformierten Zelle, wie z.B. eine antibiotische Widerstandsfähigkeit kodiert. Alternativ kann das Gen für ein solches auswählbares Merkmal auf einem anderen Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu ko-transformieren.
Wirtszellen, die durch die rekombinante DNA gemäß der Erfindung transformiert worden sind, werden dann über einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, unter Berücksichtigung der hier gegebenen technischen Lehre kultiviert, um die Expression des Polypeptids zu ermöglichen, das dann gewonnen werden kann.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (beispielsweise E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (beispielsweise Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilzen (beispielsweise Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
Die Vektoren umfassen prokaryotisches Replikon, wie z.B. das ColE1 ori für die Propagation in einem Prokaryoten, selbst wenn der Vektor für die Expression in einer anderen, nicht prokaryotischen Zellart verwendet werden soll. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor, wie z.B. einen prokaryotischen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) von Genen in einer bakteriellen Wirtszelle, beispielsweise E. coli, zu steuern, die hiermit transformiert wird.
Ein Promotor ist ein Expressions-Steuerelement, das von einer DNA-Sequenz gebildet wird, welche es ermöglicht, dass eine Bindung von RNA-Polymerase und eine Transkription auftreten. Promotor-Sequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirtszellen kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmid-Vektoren vorgesehen, die geeignete Restriktions-Stellen für das Einfügen eines DNA-Segments der vorliegenden Erfindung enthalten.
Typische prokaryotische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) bezogen werden können und pTrc99A und pKK223-3, die von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA zu beziehen sind.
Ein typisches Säugetierzellen-Vektor-Plasmid ist pSVL, das von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA geliefert wird. Dieser Vektor verwendet den SV40-Late-Promoter, um die Expression von klonierten Genen anzutreiben, wobei der höchste Pegel der Expression in T-Antigen erzeugenden Zellen, wie z.B. COS-1-Zellen gefunden wird.
Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetier-Expressions-Vektor ist pMSG, der ebenfalls von Pharmacia geliefert wird. Dieser Vektor verwendet die Glukocorticoid-induzierbaren Promoter des Long-Terminal-Repeats des Mäuse-Gesäuge-Tumor-Virus, um die Expression des klonierten Gens anzutreiben.
Geeignete Hefe-Plasmid-Vektoren sind pRS403-406 und pRS413-416, die im Allgemeinen von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA geliefert werden. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Yeast Integrating Plasmids (YIps) und umfassen die auswählbaren Hefemarker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3. Die Plasmide pRS413-416 sind Yeast Centromere Plasmids (YCps).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit einem Polynukleotid-Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert worden ist. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen und stammen typischerweise von einem Stamm von E. coli, wie z.B. von den E. coli-Stämmen DH5, die von Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA geliefert werden und RR1, die von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (No ATCC 31343) geliefert werden. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefe-, Insekten- und Säugetier-Zellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie z.B. von Mäusen, Ratten, Affen oder menschliche Fibroblast-Zell-Linien. Hefe-Wirtszellen umfassen YPH499, YPH500 und YPH501, die im Allgemeinen von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA geliefert werden. Zu den bevorzugten Säugetier-Wirtszellen gehören Zellen vom Eierstock des chinesischen Hamsters (CHO), die von ATCC unter der Bezeichnung CCL61 geliefert werden, sowie NIH Schweizer Mäuse-Embryozellen NIH/3T3, die von ATCC unter der Bezeichnung CRL 1658 geliefert werden sowie abgeleitete Affennieren-COS-1-Zellen, die von ATCC unter der Bezeichnung CRL 1650 geliefert werden. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Baculovirus-Expressions-Vektoren transfiziert werden können.
Die Transformation von geeigneten Zellwirten mit einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung wird durch allgemein bekannte Verfahren bewerkstelligt, die typischerweise von dem Typ des verwendeten Vektors abhängen. Bezüglich der Transformation von prokaryotischen Wirtszellen, siehe z.B. Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 und Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Die Transformation von Hefezellen wird von Sherman et al (1986) in Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY beschrieben. Das Verfahren von Beggs (1978) Nature 275, 104-109 ist ebenfalls nützlich. Bezüglich von Wirbeltierzellen stehen Reagenzien, die für die Transfektion solcher Zellen nützlich sind, beispielsweise Calciumphosphat und DEAE-Dextran oder Liposom-Zubereitungen von Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA zur Verfügung.
Elektroporation ist ebenfalls nützlich, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren und ist aus dem Stand der Technik für die Transformation von Hefezellen, bakteriellen Zellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen allgemein bekannt.
Beispielsweise können viele Bakterien-Arten durch die Verfahren transformiert werden, die von Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646 beschrieben werden; dieser Artikel wird hier durch Bezugnahme mit aufgenommen. Die größte Anzahl von Transformanten wird durchweg nach einer Elektroporation der DNA-Zellen-Mischung gewonnen, die in 2,5 × PEB suspendiert wird, wobei 6250 V pro cm bei 25:FD verwendet werden.
Verfahren zur Transformation von Hefe durch Elektroporation werden in Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182 beschrieben.
Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch allgemein bekannte Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die sich aus der Einführung eines Expressions-Konstrukts der vorliegenden Erfindung ergeben, kultiviert werden, um das Polypeptid der Erfindung zu erzeugen. Die Zellen können geerntet und aufgelöst (lysiert) werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorhandensein der DNA unter Verwendung eines Verfahrens untersucht werden, wie es von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird. Alternativ kann das Vorhandensein des Proteins im Überstand unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden, wie im Folgenden beschrieben wird.
Zusätzlich zur direkten Untersuchung hinsichtlich des Vorhandenseins von rekombinanter DNA kann eine erfolgreiche Transformation das allgemein bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rekombinante DNA in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Beispielsweise erzeugen Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine, die eine geeignete Antigenizität zeigen. Proben von Zellen, von denen vermutet wird, dass sie transformiert wurden, werden geerntet und unter Verwendung geeigneter Antikörper bezüglich des Proteins untersucht.
Somit betrifft zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst die vorliegende Erfindung auch eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (in klonaler Hinsicht homogene) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur abgeleitet wurde, in einem Nährmedium.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids der Erfindung oder einer Variante eines Derivates, eines Fragmentes oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder eines Derivats, wobei das Verfahren die Kultivierung einer Wirtszelle, welche ein rekombinantes Polynukleotid oder einen replikablen Vektor umfasst, der das besagte Polypeptid kodiert, und die Isolation dieses Polypeptids oder einer Variante, eines Derivates, eines Fragmentes oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder eines Derivates aus dieser Wirtszelle umfasst. Verfahren zur Kultivierung von Wirtszellen und zum Isolieren von rekombinanten Proteinen sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Die Erfindung umfasst auch ein Polypeptid, eine Variante, ein Fragment, ein Derivat oder ein Fusionsprodukt hiervon, oder ein Fusionsprodukt einer Variante, eines Fragments oder eines Derivates, die durch das oben beschriebene Verfahren gemäß der Erfindung erhalten werden können.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft einen Antikörper, der bezüglich eines Polypeptids der Erfindung reaktiv ist. Beispiele solcher Antikörper und von Verfahren zur Zubereitung solcher Antikörper werden im Beispiel 1 erläutert.
Antikörper, die auf das Polypeptid der Erfindung reaktiv sind, können durch Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind. Insbesondere können die Antikörper polyklonal oder monoklonal sein.
Geeignete monoklonale Antikörper, die bezüglich des Polypeptides reaktiv sind, können durch bekannte Verfahren zubereitet werden, beispielsweise durch Verfahren, wie sie in „Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) und in „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", SGR Hurrell (CRC Press 1982) beschrieben werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper unter Verwendung einer geeigneten Peptidsequenz erzeugt, die aus der gegebenen Aminosäure-Sequenz von MSK1 oder MSK2 in geeigneter Weise erhalten werden kann. Es ist bevorzugt, wenn polyklonale Antipeptid-Antikörper hergestellt werden. Geeignete Peptide, die aus MSK1 erhalten werden können umfassen LTVKHELRTANLTGHAEKV (entsprechend den Residuen 26 bis 44 von MSK1) und FKRNAAVIDPLQFHMGVER (entsprechend den Residuen 384 bis 402 von MSK1) wie im Beispiel 1 erläutert. Ein geeignetes Peptid, das aus MSK2 erhalten werden kann, ist FKRNAAVIDPLQFHMGVER (entsprechend den Residuen 753 bis 772 von MSK2).
Es ist besonders bevorzugt, wenn der Antikörper nicht wesentlich mit einer anderen Protein-Kinase mit zwei Kinase-Domänen, wie z.B. MAPKAP-K1a/b/c reagiert. Demgemäß kann es bevorzugt sein, wenn Peptide basierend auf der MSK1- oder MSK2-Sequenz verwendet werden, die sich signifikant von jeglichen Peptiden unterscheiden, die in irgendwelchen anderen durch Stress aktivierten Protein-Kinasen, wie z.B. MAPKAP-K1a/b/c gefunden werden. Es kann auch bevorzugt sein, dass ein Antikörper mit MSK1 aber nicht merklich mit MSK2 reagiert und umgekehrt.
Peptide, bei denen eines oder mehrere der Aminosäure-Residuen chemisch modifiziert werden, bevor oder nachdem das Peptid synthetisiert wird, können unter der Voraussetzung verwendet werden, dass die Funktion des Peptids, nämlich die Produktion von spezifischen Antikörpern in vivo, im Wesentlichen unverändert bleibt. Solche Modifikationen umfassen die Bildung von Salzen mit Säuren oder Basen, insbesondere physiologisch akzeptablen organischen oder anorganischen Säuren und Basen, die Bildung eines Esters oder Amids einer Terminal-Carboxyl-Gruppe und die Anheftung von Aminosäure-Schutzgruppen wie z.B. N-t-Butoxycarbonyl. Solche Modifikationen können das Peptid gegen einen in vivo erfolgenden Metabolismus schützen. Die Peptide können als einzelne Kopien oder als mehrfache, beispielsweise Tandem-Repeats vorhanden sein. Solche Tandem- oder Mehrfach-Repeats können selbst ausreichend antigenisch sein, um die Verwendung eines Trägers zu vermeiden. Es kann vorteilhaft sein, wenn das Peptid als Ring ausgebildet ist, wobei das N-Terminal- und das C-Terminal-Ende miteinander verbunden sind, oder ein oder mehrere Cys-Residuen an einem Ende hinzuzufügen, um die Antigenizität zu erhöhen und/oder zu ermöglichen, dass Disulfid-Bindungen gebildet werden. Wenn das Peptid kovalent an einen Träger, vorzugsweise ein Polypeptid gebunden ist, dann ist die Anordnung vorzugsweise so, dass das Peptid der Erfindung einen Ring bildet.
Gemäß den gegenwärtigen Immunologie-Theorien sollte bei jeder immunogenen Zubereitung eine Trägerfunktion vorhanden sein, um das Immunsystem zu stimulieren oder seine Stimulation zu erhöhen. Es wird angenommen, dass die besten Träger ein T-Zellen-Epitop verkörpern (oder zusammen mit dem Antigen erzeugen). Die Peptide können beispielsweise durch Quervernetzung mit einem gesonderten Träger, wie z.B. Serums-Albuminen, Myoglobinen, bakteriellen Toxoiden und Keyhole-limpet-Hämocyanin verbunden werden. Kürzlich entwickelte Träger, die T-Zellen-Hilfe bei der Immunreaktion induzieren, umfassen das Heptatitis-B-Kernantigen (das auch als Nukleocapsid-Protein bezeichnet wird, vermutliche T-Zellen-Epitope, wie z.B. Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, beta-Galactosidase und das 163-171-Peptid von Interleukin-1. Die letztgenannte Verbindung kann entweder als Träger oder als Adjuvans oder als beides betrachtet werden. Alternativ können mehrere Kopien des gleichen Peptids oder von verschiedenen Peptiden gemäß der Erfindung miteinander quervernetzt werden; in diesem Fall gibt es keinen gesonderten Träger als solchen, doch kann eine Trägerfunktion durch diese Quervernetzung erzeugt werden. Geeignete Quervernetzungswirkstoffe umfassen solche, wie sie in den Sigma and Pierce-Katalogen aufgelistet sind, beispielsweise Glutaraldehyd, Carbodiimid und Succinimidyl-4-(N-maeimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, wobei der letztgenannte Wirkstoff die SH-Gruppe an den C-Terminal-Cystein-Residuum (wenn vorhanden) ausnützt.
Wenn das Peptid durch Expression einer geeigneten Nukleotid-Sequenz in einem geeigneten Wirt hergestellt wird, dann kann es vorteilhaft sein, das Peptid als Fusionsprodukt mit einer Peptidsequenz zu exprimieren, die als Träger wirkt. Kabigen's „Ecosec"-System ist ein Beispiel für eine solche Anordnung.
Das Peptid gemäß der Erfindung kann mit anderen Antigenen verknüpft sein, um eine doppelte Wirkung zu erzielen.
Peptide können durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasen-Peptid-Synthese synthetisiert werden, wie dies von Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 und dort angegebenen Quellen beschrieben wird. Der zeitweilige N-Amino-Gruppenschutz wird durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe (Fmoc) geliefert. Eine wiederholte Aufspaltung dieser in starkem Maße Basen-labilen Schutzgruppe wird unter Verwendung von 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid bewirkt. Seitenketten-Funktionalitäten können als ihre Butlyäther (im Fall von Serinthreonin und Tyrosin), Butylester (im Fall von Glutaminsäure und Asparginsäure), Butyloxycarbonyl-Derivate (im Fall von Lysin und Histidin), Trityl-Derivate (im Fall von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl-Derivate (im Fall von Arginin) geschützt werden. Wenn Glutamin oder Asparagin C-End-Residuen sind, wird für den Schutz der Seitenketten-Amido-Funktionalitäten die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-Gruppe verwendet. Der Festphasen-Support basiert auf einem Polydimethylacrylamid-Polymer, das aus den drei Monomeren Dimethylacrylamid (Gerüst-Monomer), Bisacryloylethylendiamin (Quervernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungswirkstoff) gebildet wird. Der aufspaltbare Peptid/Harz-verknüpfte Wirkstoff, der verwendet wird, ist das Säure-labile 4-Hydroxymethyl-phenoxy-Essigsäure-Derivat. Alle Aminosäuren-Derivate werden in Form ihrer vorgeformten symmetrischen Anhydrid-Derivate mit Ausnahme von Asparagin und Glutamin zugegeben, die unter Verwendung des umgekehrten, durch N,N-Dicyclohexylcarbodiimid/1-hydroxybenzotriazol vermittelten Kopplungsvorgangs zugegeben werden. Alle Kopplungs- und Schutzaufhebungs-Reaktionen werden unter Verwendung von Ninhydrin, Trinitrobenzen-Sulfonsäure oder Isotin-Testverfahren überwacht. Nach der Vervollständigung der Synthese werden die Peptide von dem Harzträger unter gleichzeitiger Entfernung der die Seitenketten schützenden Gruppe durch eine Behandlung mit 95% Trifluoressigsäure abgespalten, die eine 50%-ige Reinigungs- bzw. Radikalfänger-Mischung enthält. Als Radikalfänger werden üblicherweise Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser verwendet, wobei die genaue Wahl von den konstituierenden Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids abhängt. Trifluoressigsäure wird durch Verdampfung in vacuo mit nachfolgender Pulverisierung mit Diethyläther entfernt, wodurch das Rohpeptid geliefert wird. Alle vorhandenen Reinigungsstoffe bzw. Radikalfänger werden durch ein einfaches Extraktionsverfahren entfernt, das bei Gefriertrocknung der wässrigen Phase das von Reinigungsmitteln freie Rohpeptid liefert. Reagenzien für die Peptidsynthese sind im Allgemeinen von Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd., Nottingham NG7 2QJ, UK verfügbar. Die Reinigung kann durch irgendein einzelnes oder irgendwelche kombinierte Verfahren wie z.B. Größen-Exlusions-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und (prinzipiell) Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie durchgeführt werden. Die Analyse der Peptide kann unter Verwendung der Dünnschicht-Chromatographie, der Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, der Aminosäure-Analyse nach einer Säurehydrolyse und durch eine massenspektrometrische Analyse durch Beschuss mit schnellen Atomen (FAB) durchgeführt werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Identifizierung einer medikamenten-ähnlichen Verbindung oder Leitverbindung für die Entwicklung einer medikamenten-artigen Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids, wie es beim ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, moduliert, wobei das Verfahren das in Berührung Bringen einer Verbindung mit dem Polypeptid oder einer geeigneten Variante, einem Fragment, einem Derivat oder einem Fusionsprodukt hiervon oder einem Fusionsprodukt einer Variante, Fragment oder Derivat hiervon und die Ermittlung umfasst, ob die Protein-Kinase-Aktivität des besagten Polypeptids im Vergleich zur Aktivität dieses Polypeptids oder der Variante, des Fragments, des Derivats oder des Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder Derivats hiervon, so wie sie beschrieben wurden, in Abwesenheit dieser Verbindung verändert wurde.
Der Ausdruck „medikamenten-artige Verbindung" ist dem Fachmann wohl bekannt und kann umschließen, dass eine Verbindung gemeint ist, die Merkmale besitzt, die sie für eine Verwendung in der Medizin beispielsweise als den aktiven Bestandteil in einem Me dikament geeignet machen. So kann beispielsweise eine medikamenten-artige Verbindung ein Molekül sein, das durch die Verfahren der organischen Chemie, weniger bevorzugt durch Verfahren der Molekularbiologie oder Biochemie synthetisiert werden kann, und ist vorzugsweise ein kleines Molekül, das weniger als 5000 Dalton Molekulargewicht besitzt und das wasserlöslich sein kann. Eine medikamenten-artige Verbindung kann zusätzlich Merkmale einer selektiven Wechselwirkung mit einem speziellen Protein oder speziellen Proteinen aufweisen und bioverfügbar und/oder in der Lage sein, zelluläre Zielmembranen zu durchdringen, doch es sei darauf hingewiesen, dass diese Merkmale nicht entscheidend sind.
Der Ausdruck „Leitverbindung" ist dem Fachmann in ähnlicher Weise allgemein bekannt und kann die Bedeutung umfassen, dass die Verbindung, obwohl sie selbst nicht für eine Verwendung als Medikament geeignet ist (beispielsweise weil sie in Bezug auf ihr beabsichtigtes Ziel nur schwach wirksam oder in ihrer Wirkung nicht selektiv ist, weil sie instabil, schlecht löslich oder schwierig zu synthetisieren ist oder eine schlechte Bioverfügbarkeit besitzt) als Ausgangspunkt für die Konstruktion anderer Verbindungen dienen kann, die wünschenswertere Eigenschaften besitzen können.
Die Verbindung kann mit dem Polypeptid der Erfindung in Wechselwirkung treten und seine Aktivierung durch MAPK2 oder SAPK2/p38 beispielsweise durch Hemmung modulieren, wie noch genauer erläutert wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass es wünschenswert ist, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität des Polypeptids in vivo modulieren können. So versteht sich, dass Reagenzien und Bedingungen, die bei dem Verfahren verwendet werden, so ausgewählt werden können, dass die Wechselwirkungen zwischen dem Polypeptid und seinem Substrat im wesentlichen die gleichen sind wie zwischen menschlichem MSK1 oder MSK2 und ihrem Substrat oder ihren Substraten in vivo. Ein Beispiel für ein Substrat des MSK1-Polypeptids ist CREB oder ATF1.
Bei einer Ausführungsform vermindert die Verbindung die Aktivität des Polypeptids. Beispielsweise kann die Verbindung sich im Wesentlichen reversibel oder im Wesentlichen irreversibel an die aktive Stelle des Polypeptids binden. Bei einem weiteren Beispiel kann sich die Verbindung an einen Teil des Polypeptids binden, der nicht die aktive Stelle ist, um so in die Bindung des Polypeptids an sein Substrat einzugreifen. Bei einem weiteren Beispiel kann sich die Verbindung an einem Teil des Polypeptids binden, um so die Aktivität des Polypeptids durch einen allosterischen Effekt zu vermindern. Dieser allosterische Effekt kann ein allosterischer Effekt sein, der bei der natürlichen Regulierung der Aktivität dieses Polypeptids eine Rolle spielt, beispielsweise bei der Aktivierung des Polypeptids durch einen „stromaufwärtigen Aktivator" wie z.B. MAPK2 oder SAPK2/p38.
Die Verbindung Ro318220 ist ein Beispiel für einen Inhibitor der MSK1- und MSK2-Aktivität, wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben. Diese Verbindung hemmt andere Protein-Kinasen zusätzlich zu MSK1 und MSK2, doch sind manche dieser anderen Protein-Kinasen, beispielsweise MAPKAP-K2 im starken Maße bei Verbindungskonzentrationen nicht beeinflusst, welche die MSK1-Aktivität aufheben, wie im Beispiel 1 beschrieben.
Bei einer weiteren Ausführungsform erhöht die Verbindung die Aktivität des besagten Polypeptids. Beispielsweise kann sich die Verbindung an einen Teil des Polypeptids binden, bei dem es sich nicht um die aktive Stelle handelt, um so die Bindung des Polypeptids an sein Substrat zu unterstützen. In einem weiteren Beispiel kann sich die Verbindung an einen Teil des Polypeptids binden, um so die Aktivität des Polypeptids durch einen allosterischen Effekt zu erhöhen. Dieser allosterische Effekt kann ein allosterischer Effekt sein, der bei der natürlichen Regulierung der Aktivität dieses Polypeptids eine Rolle spielt, beispielsweise bei der Aktivierung des Polypeptids durch einen „stromaufwärtigen Aktivator" wie z.B. MAPK2 oder SAPK2/p38.
Bequemerweise nützt das Verfahren die Tatsache aus, dass MSK1 oder MSK2 CREB oder CREBtide oder ATF1 oder Crosstide in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise phosphoryliert, doch kann jedes geeignete Substrat verwendet werden. So kann die Phosphorylierung von CREB oder CREBtide oder ATF1 oder Crosstide unter Verwendung von Verfahren gemessen werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
Bequemerweise verwendet das Verfahren eine Untersuchung, die im Wesentlichen die gleiche sein kann, wie sie im Beispiel 1 beschrieben wird. Im Beispiel 1 wird die Phosphorylierung von CREB oder ATF1 durch MSK1 gemessen. Es ist bevorzugt, dass das MSK1 oder MSK2 rekombinantes MSK1 oder MSK2 ist. Es ist bevorzugt, dass das Substrat, beispielsweise CREB oder ATF1 rekombinant ist.
Alternativ kann eine Änderung in der Aktivität des Substrates gemessen werden. Beispielsweise kann die Aktivität von CREB oder ATF1 als Transkriptionsfaktor gemessen werden. Dies kann dadurch erfolgen, dass die Bindung von CREB oder ATF1 an DNA gemessen wird, welche die geeignete Bindestelle enthält, wie dies im Stand der Technik bekannt ist, oder durch Messen der Expression einer RNA aus einem Promotor, der durch CREB oder ATF1 reguliert wird. Dies kann in einem Ganzzellen-System oder unter Verwendung von gereinigten oder teilweise gereinigten Komponenten erfolgen. In ähnlicher Weise kann die Expression eines Proteins gemessen werden, das durch eine RNA kodiert wird, die von einem Promotor transkribiert ist, der durch CREB oder ATF1 reguliert wird. Das Protein kann ein Protein sein, das durch CREB oder ATF1 physiologisch reguliert wird, oder es kann sich um ein „Reporter-Protein" handeln, wie dies dem Fachmann wohl bekannt ist (d.h. es kann ein rekombinantes Konstrukt verwendet werden). Ein Reporter-Protein kann ein Protein sein, dessen Aktivität leicht untersucht werden kann, beispielsweise ß-Galactosidase, Chloramphenicol-acetyltransferase oder Luciferase (siehe z.B. Tan et al (1996)).
Proteine, die physiologisch durch CREB reguliert werden, können COX2 und IL-1 sein. Somit kann die Hemmung von CREB dadurch gemessen werden, dass die Exprimierung von COX2 oder IL-1 unter Umständen gemessen wird, unter denen eine COX2- oder IL-1-Expression erwartet werden kann, wie im Beispiel 5 beschrieben. Somit kann COX2 in RAW 264 Mäuse-Makrophagen oder J774.2 Makrophagen unter Endotoxin-Exposition der Makrophagen exprimiert werden, wie dies beispielsweise von Mitchell et al (1994) PNAS 90, 11693-11697 und Dubois et al (1998) FASEB J 12, 1063-1073 beschrieben wird. J774.2- und RAW-264-Zellen können von European Collection of Animal Cell Cul ture, Salisbury, UK bezogen werden. Die Exprimierung von COX2 oder IL-1 kann durch irgendein übliches Verfahren, beispielsweise unter Verwendung PCR gemessen werden, um das Vorhandensein von COX2- oder IL-1-mRNA zu erkennen, sowie durch auf Antikörpern basierende Untersuchungen, um COX2- oder IL-1-Protein zu detektieren, oder durch Untersuchungen zum Detektieren der COX2-Enzym-Aktivität, beispielsweise durch Messung der Menge von Prostaglandinen, beispielsweise von PGE2, das dadurch produziert wird, dass die Zellen Arachidonsäure ausgesetzt werden (dem Substrat von COX2). Geeignete Untersuchungen werden im Beispiel 5 sowie von Mitchell et al (1994), Slater et al (1995) Am J Obstet Gynecol 172(1), 77-82, oder in WO 94/14977 beschrieben. Es können statt der direkten Produkte von COX2 Prostaglandin-Metaboliten gemessen werden, da Prostaglandine instabil sein und schnell metabolisiert werden können.
Es wird nötig sein, verschiedene Kontrolluntersuchungen durchzuführen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, um zu ermitteln, ob eine Verbindung die Aktivierung von CREB beeinflusst, statt andere Einflüsse auf Vorgänge zu haben, die zu dem führen, was auch immer gemessen wird. Es können jedoch Untersuchungen, bei denen z.B. Prostaglandin-Pegel gemessen werden, nützlich sein, um die Nützlichkeit von Verbindungen in einem Ganz-Zellen- oder in einem in vivo System zu bestätigen, und sie können nützlich sein, das Konzept in unterschiedlichen Situationen, beispielsweise bei unterschiedlichen Erkrankungsmodellen zu bewerten. Es sei darauf hingewiesen, dass Untersuchungen, bei denen z.B. der Effekt einer Verbindung auf die COX2-Expression oder -Aktivität gemessen wird, gemeinsam mit anderen Untersuchungen verwendet oder unter Verwendung der Ergebnisse anderer Untersuchungen interpretiert werden kann, in denen der Effekt der Verbindung auf die Fähigkeit von beispielsweise MSK1 CREB zu phosphorylieren, in direkterer Weise gemessen wird.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sieht ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung vor, die sich an CREB oder ATF1 (oder ein anderes Substrat des Polypeptids, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, vorzugsweise an MSK1) bindet und entweder dessen Aktivierung durch das Polypeptid, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, vorzugsweise durch MSK1 erhöht oder verhindert, wobei das Verfahren die Ermittlung umfasst, ob eine Verbindung die Wechselwirkung von CREB oder ATF1 (oder eines anderen Substrats des Polypeptids, wie es gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung definiert wurde, vorzugsweise von MSK1) oder eines geeigneten Fragments, einer Variante, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines geeigneten Fusionsproduktes eines Fragments, einer Variante oder eines Derivates mit dem Polypeptid erhöht oder verhindert, oder die Ermittlung, ob die Verbindung im wesentlichen die Aktivierung von CREB oder ATF1 (oder eines anderen Substrats des Polypeptids, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, vorzugsweise von MSK1) oder eines geeigneten Fragments, einer Variante, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines geeigneten Fusionsproduktes eines Fragments, einer Variante oder eines Derivates durch das Polypeptid im wesentlichen blockiert, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde.
Geeignete Untersuchungen können ähnlich zu den oben beschriebenen Untersuchungen sein.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivierung des Polypeptids, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, durch einen „stromaufwärtigen Aktivator" verändert, beispielsweise durch MAPK2/ERK2 oder SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2. Unter einem „stromaufwärtigen Aktivator" wird ein Molekül verstanden, das mit dem Polypeptid gemäß der Erfindung mit dem Ergebnis wechselwirkt, dass die Protein-Kinase-Aktivität des Polypeptids der Erfindung erhöht wird. Es kann sich dabei um ein Polypeptid handeln. Vorzugsweise ist es ein physiologischer Aktivator von nativem MSK1 oder MSK2.
Das Verfahren umfasst die Ermittlung, ob eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen (a) einem Polypeptid, wie es im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder einem geeigneten Fragment, einer Variante, einem Derivat oder einem Fusionsprodukt hiervon oder einem geeigneten Fusionsprodukt eines Fragmentes, einer Variante oder eines Derivates und (b) einem „stromaufwärfigen Aktivator", beispielsweise MAPK2/ERK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2, oder einer geeigneten Variante, einem Derivat, einem Fragment oder einem Fusionsprodukt hiervon oder einem geeigneten Fusionsprodukt einer Variante, einem Derivat oder einem Fragment erhöht oder unterbricht, oder die Ermittlung, ob die Verbindung im wesentlichen die Aktivierung des besagten Polypeptids oder einer geeigneten Variante, Fragments, Derivats oder Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes eines solchen Fragments, Derivats oder Fusionsproduktes durch einen „stromaufwärtigen Aktivator" oder eine geeignete Variante, Derivat, Fragment oder Fusionsprodukt hiervon im wesentlichen blockiert. Es sei darauf hingewiesen, dass die Verbindung sich entweder mit dem stromaufwärtigen Aktivator oder dem Polypeptid der Erfindung oder mit beiden verbinden oder mit diesen in Wechselwirkung treten kann.
Beispiele von Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivierung von MSK1 und MSK2 zu verändern, umfassen Inhibitoren von SAPK2/p38, z.B. einen Pyridinylimidazol-Inhibitor von SAPK2/p38, wie er dem Fachmann bekannt ist, beispielsweise SB203580 oder FHPI (4,(4-Fluorphenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol).
Der Ausdruck „Pyridinylimidazol-Inhibitor" ist dem Fachmann bekannt und umschließt Verbindungen, die einen Pyridyl-Ring und einen Imidazol-Ring mit Substituenten aufweisen, die sich an SABK2a/p38 binden und/oder dieses hemmen (oder weniger bevorzugt, von denen bekannt ist, dass sie die IL-1-Produktion von Monozyten hemmen) wie dies bei Gallagher et al (1997) Bioorg Med Chem 5(1), 49-64 beschrieben wird. Pyridinylimidazol-Inhibitoren werden beispielsweise auch in WO 95/02591 diskutiert. Verbindungen dieser Art sind bekannte Inhibitoren von speziellen Protein-Kinasen und cytokinsuppressive Anti-Entzündungs-Wirkstoffe (CSAIDs). Die Verwendung dieser Verbindungen bei der Erforschung von Signalisierungspfaden wird zusammengefasst in Cohen (1997) Trends Cell Biol 7, 354-361.
Es sei darauf hingewiesen, dass das numerische Maß der Bindungsaffinität oder Hemmung IC₅₀ für eine spezielle Verbindungs-Protein-Kombination von dem genau verwendeten Untersuchungssystem abhängt. Ein Pyridinylimidazol kann als Pyridinylimidazol-Inhibitor betrachtet werden, wenn es eine Bindung IC₅₀ oder Kinase IC₅₀ für SAPK2a/p38 (CSBP) von weniger als 100 μM, vorzugsweise weniger als 10 μM, in noch mehr bevorzugter Weise weniger als 1 oder 0,1 oder 0,01 μM besitzt, wie von Gallagher et al. dargestellt.
Beispiele von Pyridinylimidazol- Inhibitoren umfassen SB202190 (ein 2,4,5-Triarylimidazol), SB 203580 (ein weiteres 3,4,5-Triarylimidazol) und Derivate wie z.B. die 3'-iodinierte Verbindung, wie sie in Tong et al (1997) Nature Structural Biology (4/4), 311-316 beschrieben wird. Ein Derivat, bei dem die p-Methylsulphinylphenyl-Gruppe entfernt ist, kann ebenfalls als Inhibitor wirken. Substituenten können am N1-Atom des Imidazol-Rings gemacht werden, und Substitutionen, die an der 2-Position des Imidazol-Rings gemacht wurden, können zum N1-Atom bewegt werden, ohne dass ein merklicher Verlust an Potenz eintritt.
Beispiele von Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivierung von MSK1 und MSK2 zu verändern, umfassen Inhibitoren von MAPK2/ERK2 oder Inhibitoren der Aktivierung von MAPK2/ERK2, beispielsweise Inhibitoren von MAPK-Kinase 1-Aktivität (MKK1) oder Aktivierung, beispielsweise PD98059 oder UO126.
MAPK2/ERK2 ist ein bekannter Aktivator von MAPKAP-K1. Es wird hier gezeigt, dass es auch ein Aktivator des Polypeptids der Erfindung ist, das als MSK1 oder MSK2 bekannt ist. Durch den Ausdruck „Aktivierung von MSK1" wird angegeben, dass die Fähigkeit von MSK1, CREB oder ATF1 (oder alternative Substrate, wie sie oben aufgeführt wurden) zu phosphorylieren, nach der Behandlung von MSK1 beispielsweise durch MgATP und MAPK2/ERK2 erhöht wird.
Die Expression von MAPK2/ERK2, SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß2 als aktivierte GST-Fusionsprodukte wird im Beispiel 1 beschrieben, in dem auch Referenzen angegeben werden, welche die Sequenzen der oben genannten Proteine beschreiben.
Somit ist ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung die Verwendung von MAPK2/ERK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2 für die Aktivierung des Polypeptids der Erfindung, beispielsweise von MSK1 oder MSK2.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Polypeptids, das mit der Protein-Kinase (Polypeptid der Erfindung) in Wechselwirkung tritt, wobei das Verfahren folgendes umfasst (1) in Berührung Bringen (a) der Protein-Kinase, wie sie im ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder einer geeigneten Variante, eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder eines Derivats hiervon mit (b) einer Zusammensetzung, die ein Polypeptid enthalten kann, das mit besagter Protein-Kinase zusammenwirkt, (2) Detektieren des Vorhandenseins eines Komplexes, der die Protein-Kinase und ein Polypeptid enthält, und optional (3) Identifizieren irgendeines Polypeptids, das an die Protein-Kinase gebunden ist.
Bei einer Ausführungsform kann die Zusammensetzung Zellmaterial enthalten. Insbesondere können die Zellen aus den folgenden Typen ausgewählt werden: (1) Zellen, die keine MSK1- oder MSK2-Aktivität selbst dann haben, wenn sie stimuliert werden, (2) Zellen, die eine MSK1- oder MSK2-Aktivität haben, nachdem sie einer Stimulation ausgesetzt wurden, die jedoch einem Stimulus nicht ausgesetzt wurden, und (3) Zellen des Typs 2 nachdem sie dem Stimulus ausgesetzt wurden. Polypeptide, die sich nur in einem Subset der Typen 1 bis 3 finden, sind von besonderem Interesse und können weiter gekennzeichnet werden. Ein solches Peptid kann ein Aktivator von MSK1 oder MSK2 sein. Alternativ kann es ein Deaktivator von MSK1 oder MSK2 sein.
Es sei darauf hingewiesen, dass das Verfahren in einer Zelle durchgeführt werden kann, beispielsweise unter Verwendung des Hefe-2-Hybrid-Systems, wie es im Stand der Technik bekannt ist. In diesem Beispiel würden cDNAs, die von der mRNA der drei oben beschriebenen Zellarten kopiert wurden, verwendet werden.
Es sei weiterhin darauf hingewiesen, dass ein transgenes Tier, bei dem ein MSK1- oder MSK2-Gen geändert ist und/oder bei dem ein rekombinantes MSK1- oder MSK2-Gen vorhanden ist, beispielsweise ein Nagetier, insbesondere eine Maus nützlich sein kann, um beispielsweise ein Substrat von MSK1 oder MSK2 zu identifizieren.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Aktivierung des Polypeptids, wie es gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, durch ein wechselwirkendes Polypeptid beispielsweise MAPK2 oder SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2 blockiert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, dass ermittelt wird, ob eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen (a) einer Protein-Kinase, wie sie gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder einem geeigneten Fragment, einer geeigneten Variante, einem geeigneten Derivat oder einem geeigneten Fusionsprodukt hiervon oder einem geeigneten Fusionsprodukt eines Fragmentes, einer Variante oder eines Derivates und (b) dem besagten wechselwirkenden Polypeptid oder einer geeigneten Variante, einem Derivat, einem Fragment oder einem Fusionsprodukt hiervon oder einem geeigneten Fusionsprodukt einer Variante, eines Derivats oder eines Fragmentes erhöht oder unterbricht, oder das Ermitteln, ob die Verbindung im wesentlichen die Aktivierung des Polypeptids gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung oder einer geeigneten Variante, eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes eines Fragmentes, Derivates oder Fusionsproduktes durch das wechselwirkende Peptid oder eine geeignete Variante, ein Derivat, ein Fragment oder eines Fusionsprodukt hiervon im wesentlichen blockiert.
Günstigerweise ist das besagte Polypeptid gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung oder das Fragment, das Derivat, die Variante oder das Fusionsprodukt hiervon, das bzw. die bei diesem Verfahren verwendet wird, eine Substanz, die durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt wird. In ähnlicher Weise ist es bevorzugt, wenn das CREB oder ATF1 oder das Fragment, Derivat, die Variante oder das Fusionsprodukt hiervon, das bei dem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wird, welche die Aktivität der besagten Protein-Kinase modulieren, eine Substanz ist, die durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt wird. In ähnlicher Weise ist es bevorzugt, wenn das MAPK2/ERK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2 oder ein anderer „stromaufwärtiger Ak tivator" oder ein Fragment, ein Derivat, eine Variante oder ein Fusionsprodukt hiervon, das bzw. die bei dem Verfahren verwendet wird, eine Substanz ist, die durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass es erforderlich sein kann, das Polypeptid der Erfindung zu aktivieren, bevor es bei Untersuchungen verwendet wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid gemäß der Erfindung (MSK1 oder MSK2) in vitro dadurch aktiviert, dass das Polypeptid mit MAPK2/ERK2 und MgATP behandelt wird, wie im Beispiel 1 beschrieben. Es ist besonders bevorzugt, wenn das MSK1 oder MSK2 das rekombinante Polypeptid ist, das gemäß den Verfahren der Erfindung erzeugt wurde.
Es sei darauf hingewiesen, dass unter dem Ausdruck „geeignet" verstanden wird, dass die besagten Komponenten in dem Verfahren diejenigen sind, die Wechselwirkungen oder Aktivitäten besitzen, die im wesentlichen die gleichen wie diejenigen von MSK1 oder CREB oder ATF1 oder anderen Substraten oder des stromaufwärtige Aktivators wie z.B. MAPK2/ERK2 oder SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38ß2 sind, wie dies der Fall sein kann, der jedoch bequemer bei einer Untersuchung verwendet werden kann. Beispielsweise sind Fusionsprodukte von MSK1 oder CREB besonders nützlich, da diese Fusionsprodukte einen Bestandteil enthalten können, der es ermöglicht, das Fusionsprodukt ohne weiteres zu reinigen.
Es sei darauf hingewiesen, dass die beschriebenen Verfahren in Zellen durchgeführt werden können. Reporter-Gen-Konstrukte können durch Verfahren zubereitet werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die hier gegebene technische Lehre Verwendung findet. Beispielsweise kann ein Reporter-Gen-Konstrukt mit einer von CREB oder ATF1 abhängigen Promoter-Sequenz hergestellt werden. Dieses Konstrukt kann zusammen mit einem MSK1- oder MSK2-Konstrukt in eine Zelllinie eingeführt werden, in deren Eltern-Zelllinie CREB oder ATF1 in Reaktion auf bekannte Stimuli aktiviert ist, und bei der das endogene MSK1- oder MSK2-Gen deaktiviert worden ist. Alternativ könnte das Reporter-Gen-Konstrukt in die Zelllinie eingeführt werden, in der CREB oder ATF1 in Reaktion auf bekannte Stimuli aktiviert ist. Die Expression des Reporter-Gens hängt von der Aktivität von MSK1 oder MSK2 ab und somit kann der Effekt der Verbindungen gemessen werden. Bei einem weiteren Beispiel kann das Reporter-Gen für die Zellen tödlich sein, oder alternativ kann es den Zellen ermöglichen, unter ansonsten tödlichen Bedingungen zu überleben. Das Überleben der Zellen kann dann gemessen werden, beispielsweise unter Verwendung von kolorimetrischen Untersuchungen für die mitochondriale Aktivität, wie z.B. die Verminderung von WST-1 (Boehringer). WST-1 ist ein Formosa-Farbstoff, der eine Änderung beim Absorbieren oder Empfangen von Elektronen über Succinatdehydrogenase erfährt. Bei einer weiteren Anwendungsform wird das Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet.
Die Erhöhung oder Unterbrechung der Wechselwirkung zwischen dem besagten Polypeptid gemäß der Erfindung und MSK1 oder MSK2 oder einem wechselwirkenden Polypeptid, wie es oben definiert wurde, oder geeigneten Derivaten, Fragmenten, Fusionsprodukten oder Varianten kann in vitro unter Verwendung von Verfahren gemessen werden, die aus dem Stand der Technik der Biochemie allgemein bekannt sind; diese umfas sen alle Verfahren, die verwendet werden können, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Die besagte Wechselwirkung kann auch in einer Zelle gemessen werden, beispielsweise unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Erfindung Screening-Untersuchungen für Wirkstoffe schafft, die bei der Modulation, beispielsweise bei der Verstärkung oder Hemmung der Aktivität von MSK1 oder MSK2 oder deren Wechselwirkungen mit stromaufwärtigen Aktivatoren nützlich sein können. Die Verbindungen, die in den Verfahren identifiziert werden, können selbst als Wirkstoff nützlich sein, oder sie können Leitverbindungen für die Konstruktion und Synthese von wirksameren Verbindungen bilden.
Es sei darauf hingewiesen, dass Screening-Untersuchungen, die einen Betrieb mit hohem Durchsatz ermöglichen, besonders bevorzugt sind. Beispielsweise können sie die auf Zellen basierenden Untersuchungen umfassen, die beschrieben wurden, sowie Protein-Protein-Bindungs-Untersuchungen. Ein weiteres Beispiel ist ein auf SPA (Scintillation Proximity Assay) basierendes System, wie es im Beispiel 2 beschrieben wird.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt schafft die Erfindung eine Verbindung, die durch die Screening-Verfahren der Erfindung identifiziert werden kann, wobei die Verbindung nicht Ro318220, PD98059 oder ein bekannter Pyridinylimidazol-Inhibitor von SAPK2/p38, beispielsweise SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorphenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) ist. Die Verbindung kann eine Verbindung sein, die die Aktivität von MSK1 oder MSK2 erhöht oder eine Verbindung, die diese Aktivität hemmt. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt ist eine solche Verbindung für die Verwendung in der Medizin vorgesehen.
Der Transkriptionsfaktor CREB ist für die Produktion von IL-1 und dem Enzym Cyclo-Oxygenase 2 oder Prostaglandin-Synthase-2 (COX2/PGS-2) in vivo erforderlich. Es wird hier gezeigt, dass CREB durch MSK1/MSK2 aktiviert werden kann. Somit können Inhibitoren von MSK1 den Effekt von Inhibitoren von IL-1 und/oder COX2 haben und können daher die gleichen klinischen Indikationen besitzen wie Inhibitoren von IL-1-Aktivität und/oder COX2.
IL-1 ist ein Entzündungs-Vermittler. COX2 ist allgemein den Fachleuten als proinflammatorisches Enzym bekannt, das bei der Synthese der proinflammatorischen Signalisierungsmolekül-Prostaglandine aus Arachidonsäure eine Rolle spielen. Cyclo-Oxygenase 1 (COX1) ist ein hierzu in Beziehung stehendes Enzym, das konstitutiv exprimiert wird, während COX2 bei einer Entzündung früh exprimiert wird infolge der proinflammatorischen Signalisierungs-Pfade. Inhibitoren von COX1, wie z.B. Aspirin können eine Entzündung vermindern, doch haben sie Nebeneffekte, wie z.B. gastrointestinale Schäden, einschließlich Geschwüren. Es wurden daher große Anstrengungen unternommen, um die Entwicklung von selektiven Inhibitoren von COX2, wie z.B. Meloxicam zu entwickeln. Viele COX2-Inhibitoren haben aber auch eine COX1-Inhibitor-Aktivität.
Selektive COX2-Inhibitoren können anti-inflammatorische, analgetische und antipyretische Aktivitäten besitzen, die mit denen von nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Substanzen (NSAIDs), die COX1-Inhibitoren umfassen, vergleichbar sind, doch können sie deren Nebeneffekte vermeiden (für eine Übersicht siehe Botting (1996) Drug News & Perspec 9(2), 123-128).
Inhibitoren der MSK1/MSK2-Aktivität oder Aktivierung (wie z.B. die oben erläuterten Verbindungen der Erfindung) können daher bei Verfahren der Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen nützlich sein, die unten diskutiert werden und bei denen IL-1, COX2 oder Prostaglandine eine Rolle spielen.
Solche Erkrankungen und Zustände umfassen solche, bei denen eine Entzündung oder eine Gewebeverletzung auftritt, inflammatorische Erkrankungen, bei denen COX2-Inhibitoren untersucht worden sind, umfassen Osteoarthritis, rheumatische Arthritis, Spondylitis ankylosans oder andere rheumatologische und Schmerz-Indikationen. Andere Krankheiten, bei denen Entzündung eine Rolle spielt, und bei der MSK1/MSK2-Inhibitoren nützlich sein können, umfassen Asthma, Psoriasis, septischen Schock und Morbus Crohn. Prostaglandine spielen eine Rolle bei Uteruskontraktionen und -Schmerzen und bei Wehen (siehe beispielsweise Pulkkinen (1993) Drugs 46(suppl 1), 129-133 und Slater et al (1995) Am J Obset Gynecol 172(1), 77-82). Weitere Krankheiten, bei denen MSK1/MSK2-Inhibitoren nützlich sein können, sind in WO 96/41645 aufgeführt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Verwendung irgendeines Screening-Verfahrens gemäß der Erfindung für die Identifizierung eines Moleküls, das bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen nützlich sein kann.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Verwendung von irgendeinem Screening-Verfahren gemäß der Erfindung bei der Identifizierung eines Moleküls, das bei der Behandlung eines Patienten nützlich sein kann, der eine Modulation, beispielsweise eine Verminderung oder eine Erhöhung der Aktivität von COX2 oder IL-1 benötigt.
Es wird angenommen, dass eine Verbindung, die durch eines der erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifiziert werden kann, bei der Behandlung von inflammatorischen Erkrankungen nützlich sein kann. Zu den inflammatorischen Erkrankungen gehören rheumatoide Arthritis, Psoriase, septischer Schock, Asthma und Morbus Crohn sowie andere Erkrankungen und Zustände, wie sie oben erläutert wurden.
Die Screening-Verfahren können Verbindungen identifizieren, die entweder aktivieren oder hemmen. Verbindungen mit jeder dieser Aktivitäten können geeignet sein, doch ist es bevorzugt, dass die Verbindungen die durch MSK1 oder MSK2 vermittelte Phosphorylierung hemmen.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt sieht die Erfindung eine Verwendung von (1) einem Inhibitor der SAPK2/p38-Kaskade, nämlich des bekannten Pyridinylimidazol-Inhibitors von SAPK2/p38, SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorphenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) und (2) eines Inhibitors der MAPKK/ERK-Kaskade, nämlich von PD98059 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten vor, der eine Modulation, beispielsweise eine Verminderung oder eine Erhöhung der Aktivität von COX2 benötigt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt sieht die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors der SAPK2/p38-Kaskade, nämlich des bekannten Pyridinylimidazol-Inhibitors von SAPK2/p38, SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorphenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten vor, der eine Modulation, beispielsweise eine Verminderung oder eine Erhöhung der Aktivität von COX2 benötigt, wobei dem Patienten der bekannte Inhibitor der MAPK/ERK-Kaskade PD98059 verabreicht wird, verabreicht wurde oder künftig verabreicht werden wird.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sieht eine Verwendung des bekannten Inhibitors der MAPK/ERK-Kaskade PD98059 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten vor, der eine Modulation, beispielsweise eine Verminderung oder eine Erhöhung der Aktivität von COX2 benötigt, wobei dem Patienten der bekannte Inhibitor der SAPK2/p38-Kaskade, SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorphenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) verabreicht wird, verabreicht wurde oder künftig verabreicht werden wird.
COX2 kann bei Langzeit-Potenzierungen und synaptischer Plastizität eine Rolle spielen und seine Expression kann dem apoptotischen Zelltod vorausgehen und kann bei neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. der Alzheimer'schen Erkrankung eine Rolle spielen. Fokale Ischämie kann eine COX2-Expression in kortikalen Neuronen induzieren, bei denen eine spezielle Absterb-Wahrscheinlichkeit nach einem ischämischen Vorfall besteht.
COX2 kann bei Änderungen der Schmerzwahrnehmung nach Gewebeverletzungen (Hyperalgesie und Allodynie) eine Rolle spielen, und somit können Inhibitoren von MSK1 bei der Schmerzbekämpfung nützlich sein. Die Expression von COX2 kann bei Migräne eine Rolle spielen, und somit können Inhibitoren von MSK1, wie sie oben identifiziert wurden, bei der Behandlung von Migräne nützlich sein.
COX2 kann bei Krebs eine Rolle spielen. Die Hemmung von COX2 kann bei der Prävention oder Behandlung von Krebs nützlich sein. COX2 kann Angiogenese fördern. Die Hemmung von COX2 kann Antikrebs-Wirkungen zeigen, beispielsweise bei Dickdarm-Krebs, bei der Erhöhung des Pegels von Arachidonsäure, die ihrerseits die Konversion von Sphingomyelin in Ceramid stimulieren kann, was als Vermittler der Apoptose vorgeschlagen wurde. Somit können MSK1-Inhibitoren, wie sie hier beschrieben werden, bei der Behandlung oder Prävention von Krebs nützlich sein.
Es wurde vermutet, dass NSAIDs und Corticosteroide (auch anti-entzündliche) bei der Verzögerung des Einsetzens oder bei einer Verlangsamung des Fortschreitens der Alzheimer'schen Krankheit selbst dann nützlich sein können, wenn sie in geringen Dosen verwendet werden, die ausreichend für eine analgetische Wirkung aber kleiner als Dosen sind, die für eine anti-inflammatorische Behandlung eingesetzt werden. Es wurde gezeigt, dass die COX2-Expression bei der Alzheimer'schen Erkrankung in Gehirn- und Glial-Zellen in Reaktion auf inflammatorische Vermittler erhöht ist. Eine Über-Expression von COX2 in Neuronen in einem transgenen Mausmodell kann zu einer ß-Amyloid-Neurotoxizität in vitro führen, wodurch Annahme unterstützt wird, dass COX2 bei der Alzheimer'schen Erkrankung eine Rolle spielt. Somit können MSK1-Inhibitoren, wie sie hier beschrieben werden, bei der Behandlung oder Prävention der Alzheimer'schen Erkrankung oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sein.
Die oben erwähnten Verbindungen der Erfindung oder Zubereitungen hiervon können durch jedes herkömmliche Verfahren einschließlich einer oralen oder parenteralen (d.h. subkutanen oder intramuskulären) Injektion verabreicht werden. Die Behandlung kann aus der Verabreichung einer einzelnen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen Zeitraum hinweg bestehen.
Zwar ist es möglich, eine Verbindung gemäß der Erfindung allein zu verabreichen, doch ist es bevorzugt, sie als pharmazeutische Zubereitung zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern zu verabreichen. Der oder die Träger müssen in dem Sinn „akzeptabel" sein, dass sie mit der Verbindung gemäß der Erfindung kompatibel und für ihre Empfänger nicht schädlich sind. Typischerweise sind die Träger Wasser oder eine Salzlösung, das bzw. die steril und pyrogenfrei ist.
Weitere Gesichtspunkte der Erfindung sehen eine Verwendung eines Polypeptids (Protein-Kinase) wie sie beim ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, bei einer Screening-Suche nach Verbindungen vor, welche die Aktivität der besagten Protein-Kinase hemmen oder die Wechselwirkungen dieser Protein-Kinase blockieren.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Satz von Teilen vorgesehen, sie bei der Durchführung der Screening-Verfahren nützlich sind. Somit kann ein solcher Teilesatz ein Polypeptid gemäß der Erfindung und ein Substrat dieses Polypeptids, beispielsweise Crosstide (GRPRTSSFAEG), CREB oder CREBtide (EILSRRPSYRK) oder ein CREB-Fusionsprotein, beispielsweise GST-CREB oder ATF1 oder ein Fusionsprotein hiervon umfassen. Alternativ kann der Teilesatz ein Polypeptid der Erfindung und ein Protein umfassen, das bei der Aktivierung des Polypeptids der Erfindung so wie oben beschrieben nützlich ist, beispielsweise MAPK2. Der Teilesatz kann (1) ein Polypeptid der Erfindung, (2) ein Substrat für dieses Polypeptid, wie es oben beschrieben wurde, und (3) ein Protein umfassen, das in der oben beschriebenen Weise für die Aktivierung des Polypeptids nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung wird nun noch mehr im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele erläutert.
Figurenbeschreibungen
1. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des menschlichen MSK1. Die unterstrichenen Residuen entsprechen den Kinase-Domänen. Die in fetten Buchstaben wiedergegebenen Residuen (Ser212, Ser360, Ser377 und Thr581) sind mutmaßlich Phosphorylierungs-Aktivierungsstellen. Das vermutliche Bipartite-Kern-Lokalisierungssignal (Robins et al., 1991) zwischen Residuen 726 bis 745 (das in MAPKAP-K1a/b nicht vorhanden ist) ist mit Sternchen gekennzeichnet. Das Stopp-Codon ist mit einem Dreieck in durchgezogenen Linien gekennzeichnet.
2. Ausrichtung der Aminosäure-Sequenzen von MSK1 mit eng verwandten Kinasen. Die Ausrichtung wurde unter Verwendung des Clustal-W-Programms (Thompson et al., 1994) durchgeführt. Identische Residuen sind schwarz schraffiert. (A) Ausrichtung von MSK1 mit menschlichen MAPKAP-K1-Isoformen. Die Residuen, die den Schlüssel-Aktivierungs-Phosphorylierungs-Stellen auf MAPKAP-K1a (Ser222, Ser364, Ser381 und Thr574) sind mit Sternchen gekennzeichnet. (B) Ausrichtung der N-Terminal-Kinase-Domäne (MSK1-N) und der C-Terminal-Kinase-Domäne (MSK-C) von MSK1 mit den Kinase-Domänen von MAPKAP-K2/3 und MNK1. Es gibt keine signifikante Homologie in den nicht katalytischen Bereichen dieser Kinase. (C) Ausrichtung des menschlichen MSK1 mit von der Maus (mMSK2) und vom Menschen MSK2 stammenden Teilsequenzen. Die vermutlichen Aktivierungs-Phosphorylierungs-Stellen sind mit Sternchen gekennzeichnet.
3. Expression und Reinigung von GST-MSK1 und seine Aktivierung durch MAPK2/ERK2 und SAPK2. (A) GST-MSK1 (2 μg Protein) und GST-MAPKAP-K1a (2 μg Protein) gereinigt aus unstimulierten und durch TPA stimulierten Zellen wurden auf einem 7,5% SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoresiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Position der molekularen Masse-Marker, ß-Galactosidase (116 kDa) und Glykogenphosphorylase (97 kDa) sind dargestellt. Die Aktivität eines jeden Proteins wurde unter Verwendung des Peptidsubstrats Crosstide (GRPRTSSFAEG) untersucht. (B) GST-MSK1 oder (C) GST-MAPKAP-K1a abgeleitet von nicht stimulierten Zellen wurde entweder mit MAPK2/ERK2 (8 U/ml, offene Kreise), SAPK2b/p38ß (1 U/ml, geschlossene Quadrate), SAPK3/p38γ (1 U/ml, offene Dreiecke) oder SAPK4/p38δ (1 U/ml, geschlossene Dreiecke), 10 mM Mg(Ac)₂ und 100 μM nicht markiertem ATP im Puffer B inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden gleiche Mengen entnommen, 10-fach in Puffer B, der 1 mg/ml BSA enthielt verdünnt, und bezüglich der Aktivität in Bezug auf Crosstide untersucht. In parallelen Experimenten wurde die Aktivität von MAPK2/ERK2 und all den SAPK-Enzymen mit Ausnahme von SAPK1/JNK1γ unter Verwendung von Myelin-Basis-Protein untersucht. SAPK1/JNK1γ wurde unter Verwendung von ATF2 untersucht (Daten nicht dargestellt). Die Ergebnisse sind als ± Standardfehler des Mittelwerts für sechs Bestimmungen (zwei unabhängige Experimente) dargestellt. Der Fehler für den jeden Punkt ist < 15%. (D) GST-MSK1 wurde mit MAPK2/ERK2 und SAPK-Enzymen wie oben mit der Ausnahme inkubiert, dass ([³²P]ATP verwendet wurde. Nach 20 min wurden die Reaktionen durch die Zugabe von SDS beendet, die Proben wurden auf einem 7,5% Polyacrylamidgel elektrophoresiert und die Coomassie-Blau-Färbungsbänder, die GST-MSK1 entsprachen, durch Autoradiographie aufgezeichnet. In zwei getrennten Experimenten wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
4. Erzeugung von Antikörpern, die insbesondere MSK2 immunologisch ausfällen. (A) Aktivierte GST-MSK1 gereinigt aus mit TPA-stimulierten 293-Zellen (50 μl bei 1,0 U/ml) wurde 30 min bei 4°C auf einer Schüttelplattform mit Protein-G-Sepharose-Kügelchen (5 μl) inkubiert, die mit den Anzeige-Antikörpern (5 μg) gekoppelt waren, in Anwesenheit oder Abwesenheit des angezeigten Peptid-Immunogens (1 mM) und dann eine 1 min bei 13.00 × g zentrifugiert. Die Kügelchen wurden gewaschen, wie dies unten unter der Überschrift „Materialien und Methoden" beschrieben ist, und hinsichtlich der Aktivität auf Crosstide untersucht. (B) und (C) wie bei A mit der Ausnahme, dass aktiviertes GST-MAPKAP-K1a, das von mit TPA stimulierten 293-Zellen (B) abgeleitet war, oder MAPKAP-K1b (C) mit den angezeigten Antikörpern durch Immunreaktion ausgefällt und die gewaschenen Immuno-Ausfällungen auf Aktivität bezüglich Crosstide untersucht wurden.
5. Aktivierung von endogenem MSK1 durch TPA, EGF und zellulären Stress. 293-Zellen wurden 16 h lang die Serumsnährstoffe entzogen; dann wurden sie in Anwesenheit von 50 μM PD98059 (offene Balken) oder von 10 μM SB203580 (gestrichelte Striche) oder in Abwesenheit beider Verbindungen (durchgezogene Balken) eine 1 h lang inkubiert. Die Zellen wurden entweder unstimuliert gelassen (Vergleichskontrolle) oder mit TPA (200 ng/ml, 10 min), EGF (100 ng/ml, 10 min), Natriumarsenit (0,5 mM, 30 min) stimuliert, einer UV-Strahlung ausgesetzt (200 J/m² und dann 30 min auf 37°C gehalten) oder H₂O₂ (2 mM, 30 min) in ständiger Anwesenheit oder bei Fehlen von Inhibitoren ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert und MSK1 (A), MAPKAP-K1a/b (B) oder MAPKAP-K2 (C) wurde aus dem gleichen Lysat durch Immunreaktion ausgefällt und untersucht. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für zwei getrennte Experimente dargestellt, wobei jede Ermittlung dreifach durchgeführt wurde.
6. Wirkung der Mutation von MSK1 auf die Aktivierung durch TPA und UV in 293-Zellen. 293-Zellen wurden vorübergehend mit DNA-Konstrukte exprimierenden Flag-Epitopen transfiziert, an welche Wildtyp-MSK1-, N-Terminal(NT)-„Kinase-Dead"-MSK1 und C-Terminal(CT)-„Kinase-Dead"-MSK1 angeheftet war. Die Zellen wurde 1 h mit 50 μM PD98059, 10 μM SB203580 oder ohne eine dieser beiden Verbindungen inkubiert. Sie wurden dann 10 min mit TPA (200 ng/ml) stimuliert oder einer UV-Strahlung (200 J/m² und dann für 30 min auf 37°C gehalten) in der fortgesetzten Anwesenheit oder in Abwesenheit von Inhibitoren exponiert. Die Zellen wurden lysiert und das MSK1 wurde aus den Lysaten durch Immunreaktion ausgefällt und mit Crosstide untersucht. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für drei getrennte Experimente dargestellt, wobei jede Ermittlung dreifach ausgeführt wurde, (B) 2 μg Protein aus jedem Lysat wurden auf einem 10% SDS/Polyacrylamidgel elektrophoresiert und unter Verwendung von monoklonalen Flag-Antikörpern immuno-geblottet. Es wurde kein immun-reaktives MSK1-Protein in nicht transfizierten Zellen beobachtet (Daten nicht dargestellt). Das MSK1 mit angeheftetem Flag-Epitop wandert gemeinsam mit Glykogenphosphorylase (offensichtliche Masse 97 kDa).
7. MSK1 ist hauptsächlich in den Kernen von Zellen und MAPKAP-K1 im Cytosol lokalisiert. 293-Zellen, die Wildtyp-MSK1 mit angeheftetem N-Terminal-Flag-Epitop oder MAPKAP-K1a mit N-Terminal-angeheftetem HA-Epitop exprimieren, wurden in einem serumsfreien Medium 16 h inkubiert und dann entweder unstimuliert gelassen oder mit TPA (100 ng/ml, 10 min) stimuliert, bevor sie durch Formaldehyd fixiert, sektioniert und mit Immun-Gold für das geeignete Tag (Flag für MSK1) gekennzeichnet wurden (A + B) oder mit HA für MAPKAP-K1a (C). Die Quantisierung der Konzentration von MSK1 oder MAPKAP-K1a im Kern (Nuc) und Cytoplasma (Cyt) von Zellen wurde durchgeführt, wie dies im Folgenden im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die TPA-Stimulation keinen messbaren Effekt auf die Lokalisierung von MSK1 oder MAPKAP-K1a hat. Die Daten stammen von drei unabhängigen Experimenten. Für MSK1 sind die Vergleiche n = 9, 9 und 14, für TPA n + 10, 11 und 15. Für MAPKAP-K1a sind die Vergleiche insgesamt n = 22; für TPA insgesamt n = 9 (wobei Zellen ausgeschlossen wurden, die übermäßige Zusammenballungen von immunreaktiven Material im Cytoplasma aufwiesen). Die Balken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar, der nach Cochran (1953) berechnet wurde. (C) Ausgewählte Proben von MSK1 (C, unstimuliert und D, mit TPA stimuliert) und für MAPKAP-K1a (E, unstimuliert) sind dargestellt, um die Strukturen und die Kennzeichnungsverteilungen darzustellen. Der Balken ist 500 nm.
8. MSK1 phosphoryliert CREB bei Ser133. (A) Vergleich der Substrat-Besonderheiten von MSK1, MAPKAP-K1a und MAPKAP-K1b bezüglich der angezeigten Peptide und CREB. Die Phosphorylierung und Analyse wurden durchgeführt, wie dies im Folgenden im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben ist. Die Standardfehler für alle wiedergegebenen kinetischen Konstanten lagen in einem Bereich < ± 20% des Standardfehlers des Mittelwerts und die Daten sind als Mittelwerte für zwei unabhängige Experimente wiedergegeben. Die V_max-Werte sind als Prozentsatz des Wertes dargestellt, der unter Verwendung von Crosstide (GRPRTSSFAEG, Peptid 1) als Substrat erhalten wurde. Das Peptid EILSRRPSYRK, das den Residuen 126-136 von CREB entspricht, wird als CREBtide bezeichnet. Die Serin-Residuen, die fett dargestellt sind, entsprechen den phosphorylierten Serin-Residuen auf den Peptiden. Die V_max-Werte von MSK1, MAPKAP-K1a und MAPKAP-K1b bezüglich Crosstide sind 200 U/mg, 350 U/mg bzw. 800 U/mg. (B) GST-MSK1 (durchgezogene Balken), GST-MAPKAP-K1a (offene Balken), MAPKAP-K1b (gestrichelte Balken) oder GST-MAPKAP-K2 (diagonale Balken) wurden mit den angegebenen Substraten untersucht. Unter den verwendeten Bedingungen phosphorylierte GST-MAPKAP-K2 das Ser98 der 341-Aminosäure-Splice-Variante von CREB (Gonzalez et al, 1989) mit einem 10-fach höheren Pegel als Ser133 (Daten nicht dargestellt). Die Phosphorylierung von CREB durch MAPKAP-K2, die in der Figur dargestellt ist, ist korrigiert, um nur den Beitrag der Ser133-Phosphorylierung zur Gesamt-Inkorporation von Phosphat in CREB darzustellen. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für drei getrennte Experimente dargestellt, wobei jede Bestimmung dreifach ausgeführt wurde. (C) CREB, das mit MSK1 phosphoryliert worden war, wurde mit Trypsin aufgeschlossen und auf einer Vydac 218TP54 C18-Säule (Separations Group, Hesperia, CA) chromatographiert, in 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser äquilibriert. Die Säule wurde mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (diagonale Linie) bei einer Strömungsrate von 0,8 ml/min entwickelt und es wurden Fraktionen von 0,4 ml gesammelt. 75% der auf die Säule angewendeten Radioaktivität wurden von dem ³²P-enthaltenden Hauptpeptid bei 13% Acetonitril gewonnen (der Rest der Radioaktivität war auf zahlreiche kleinere Spitzen verteilt). Die Peptid-Karte von CREB, das mit MAPKAP-K1b phosphoryliert worden war, war identisch mit der von CREB, das mit MSK1 phosphoryliert worden war (Daten nicht dargestellt).
9. Wirkung von Ro318220 auf die Aktivität von MSK1. (A) Wirkung von Ro318220 auf GST-MSK1 (geschlossene Kreise), gemischte PKC-Isoformen (offene Kreise), GST-MAPKAP-K1b und MAPKAP-K2 (offene Dreiecke) in vitro. Die Ergebnisse sind in Relation zu Kontroll- bzw. Vergleichsinkubationen dargestellt, bei denen der Inhibitor weggelassen wurde und sind als Mittelwert von zwei Experimenten dargestellt, wobei jede Ermittlung dreifach durchgeführt wurde. Der Fehler für jeden Punkt ist ± 10%. (B) 293-Zellen wurden eine Stunde lang mit 5 μM Ro318220 (Ro) oder in Abwesenheit eines Inhibitors (-) vorbehandelt, bevor sie einer UV-Strahlung (200 J/m²) ausgesetzt oder unbehandelt gelassen (-) wurden und wurden dann weitere 30 min in fortgesetzter Anwesenheit von Ro318220 inkubiert. Die Zellen wurden lysiert, MAPKAP-K2 wurde durch Immunreaktion ausgefällt und untersucht. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für zwei getrennte Experimente dargestellt, wobei jede Ermittlung dreifach durchgeführt wurde. (C) Wie oben mit der Ausnahme, dass die 293-Zellen 2 h in 32-Phosphat (0,1 mCi/ml) vor einer Behandlung mit Inhibitoren inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann entweder einer UV-Strahlung (200 J/m²) ausgesetzt oder unbehandelt gelassen (-) und weitere 20 min in fortgesetzter Anwesenheit von Inhibitoren inkubiert. Nach einer Zell-Lysis wurde aus den Zellextrakten HSP27 durch Immunreaktion ausgefällt (Cuenda et al, 1995) durch Immunreaktion ausgefällt und auf einem 15% Polyacrylamidgel entwickelt und auto-radiographiert.
10. Ro318220 hemmt EGF und die durch UV-Strahlung induzierte Phosphorylierung von CREB. 293-Zellen wurden entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 5 μM Ro 318220 (Ro), 10 μM SB203580 (SB), 50 μM PD98059 (PD) vorbehandelt und dann entweder (A, D) einer UV-Strahlung (200 J/m², 30 min und dann 30 min bei 37°C gehalten), oder (B, E) EGF (100 ng/ml, 15 min) oder (C) Forskolin (20 μM, 15 min) ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine wurden auf 10% Acrylamidgelen getrennt und unter Verwendung eines Phosphor-spezifischen Antikörpers immuno-geblottet, der sowohl CREB als auch ATF1 erkennt, wenn eine Phosphorylierung auf Ser133 bzw. Ser63 stattfindet. Die Position von CREB und ATF1 auf dem Blott ist angegeben.
11. Aktivierung von MSK1 durch TNF. HeLa-Zellen wurden 2 h lang in einem serumsfreien Medium in Anwesenheit von 50 μM PD98059 (durchgezogene Kreise), 10 μM SB203580 (offene Dreiecke), 50 μM PD98059 plus 10 μM SB203580 (durchgezogene Dreiecke) oder in Abwesenheit jeder dieser beiden Verbindungen (offene Kreise) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit TNF (10 ng/ml) über die angegebenen Zeiträume in ständiger Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren stimuliert, lysiert und es wurde MSK1 (A), MAPKAP-K2 (B) und MAPKAP-K1a/b (C) aus dem gleichen Lysat durch Immunreaktion ausgefällt und untersucht. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für zwei getrennte Experimente dargestellt, wobei jede Bestimmung dreifach durchgeführt wurde.
12. Wirkung von PD98059, SB203580 und Ro318220 auf die durch TNF induzierte CREB-Phosphorylierung. HeLa-Zellen wurden 2 h in einem serumsfreien Medium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 (PD), 10 μM SB203580 (SB) und 5 μM Ro318220 (Ro) in der angegebenen Weise inkubiert. Die Zellen wurden dann mit TNF (10 ng/ml) über die angegebenen Zeiträume hinweg in ständiger Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren stimuliert, lysiert und die Proben wurden bezüglich der Phosphorylierung von CREB und ATF1 in der in der Beschreibung von 11C wiedergegebenen Weise immuno-geblottet. Die Position von CREB und ATF1 auf dem Blot ist angegeben. Die Expositionszeit (exp) der Blots vor der Entwicklung ist angegeben.
13. Einfluss von PD98059, SB203580 und Ro318220 auf die durch NGF induzierte Aktivierung von CREB und MSK1 in PC12-Zellen. PC12-Zellen wurden 2 hin einem serumsfreien Medium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM Pd98059 (PD) oder 10 μM SB203580 (SB) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit NGF (30 ng/ml) 15 min in ständiger Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen bezüglich der Phosphorylierung von CREB (A) immuno-geblottet oder verwendet, um MSK1 (B) oder MAPKAP-K1 (C) nach ihrer Immun-Ausfällung aus den Lysaten zu untersuchen.
14. Einfluss von PD98059, SB203580 und Ro318220 auf eine durch Arsenit und FGF induzierte Aktivierung von CREB und MSK1 in SK-N-MC-Zellen. SK-N-MC-Zellen wurden 1 h in einem serumsfreien Medium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 (PD), 10 μM SB203580 (SB) und 5 μM Ro318220 (Ro) inkubiert. Die Zellen wurden dann 15 min mit Natriumarsenit (0,5 mM) oder FGF (50 ng/ml) in ständiger Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen sowohl auf MSK1 (A) als auch MAPKAP-K1 (B) als auch MAPKAP-K2 (C) nach ihrer Immun-Ausfällung aus den Lysaten untersucht oder bezüglich der Phosphorylierung von CREB und ATF1 (D) immuno-geblottet.
15. Einfluss von PD98059, SB303580 und Ro318220 auf die durch LPS-induzierte Aktivierung von CREB und MSK1 in RAW-Makrophagen. RAW-264-Makrophagen wurden in einem serumsfreien Medium 2 h inkubiert, dann 1 h in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 (PD), 10 μM SB203580 (SB) oder 5 μM Ro318220 (Ro) weiter inkubiert. Die Zellen wurden dann mit LPS (100 ng/ml) 1 h in der fortgesetzten Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen sowohl auf MSK1 (A), als auch MAPKAP-K1 (B) als auch MAPKAP-K2 (C) nach ihrer Immun-Ausfällung aus den Lysaten untersucht oder bezüglich der Phosphorylierung von CREB und ATF1 (D) immuno-geblottet.
16. Aminosäure- und Nukleotid-Sequenzen von menschlichem MSK2 und eine Splice-Variante von menschlichem MSK2.
17. Aktivierung von MSK1 und MSK2 durch LPS in RAW-264-Makrophagen. Die Makrophagen wurden für die angegebenen Zeiten mit (offene Symbole) und ohne (geschlossene Symbole) 100 ng/ml LPS stimuliert. Die MSK1-Aktivität (A) oder MSK2-Aktivität (B) wurden dann nach einer Immun-Ausfällung aus den Lysaten gemessen. Die Er gebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für zwei Ermittlungen von zwei getrennten Scheiben dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erhalten.
18. Einfluss von Inhibitoren auf die durch LPS induzierte Aktivierung von Protein-Kinasen in RAW-264-Makrophagen. Makrophagen wurden 1 h in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 μM UO 126 (U) und/oder 10 μM SB203580 (SB), oder 5 μM Ro318220 (Ro) inkubiert, dann 1 h mit oder ohne 100 ng/ml LPS inständiger Anwesenheit oder Abwesenheit der Inhibitoren stimuliert. MSK1 (A), MSK2 (B), MAPKAP-K1 (C) und MAPKAP-K2 (D) wurden dann nach einer Immun-Ausfällung aus den Lysaten untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für zwei Ermittlungen von zwei getrennten Scheiben dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erhalten.
19. Durch LPS-induzierte Phosphorylierung von CREB und ATF1 in RAW-264-Makrophagen. (A) Makrophagen wurden für die angegebenen Zeiten mit LPS (100 ng/ml) stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen des Lysats (30 μg Protein) in SDS denaturiert, auf einem 10% Polyacrylamidgel elektrophoresiert, auf eine Nitrozellulose-Membran überführt und mit Phospho-CREB-Antikörper immuno-geblottet. Die Positionen der molekularen Massemarker Glykogen, Phosphorylase (97 kDa), Rinderserum-Albumin (66 kDa), Ovalbumin (43 kDa) und Carbonanhydrase (30 kDa) sind angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei weiteren Experimenten erzielt. (B) Wie bei A mit der Ausnahme, dass die Makrophagen 1 h lang in Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 und/oder 10 μM SB203580 (SB), oder 5 μM Ro318220 (Ro) inkubiert, dann 1 h in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 ng/ml LPS und in ständiger Anwesenheit oder Abwesenheit der Inhibitoren stimuliert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei weiteren Experimenten erzielt.
20. Durch LPS stimulierte Induktion von COX2-Protein in RAW-264-Makrophagen. (A) Makrophagen wurden für die angegebenen Zeiten mit LPS (100 ng/ml) stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen des Lysats (30 μg Protein) mit einem COX2-Antikörper immuno-geblottet (siehe Beschreibung von 19 bezüglich der Details und der molekularen Massen-Marker). Ähnliche Ergebnisse wurden in drei weiteren Experimenten erzielt. (B) Wie bei A mit der Ausnahme, dass die Makrophagen 1 h in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 (PD) und/oder 10 μM SB203850 (SB) oder 5 μM Ro318220 (Ro) inkubiert, dann 4 h in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 ng/ml LPS und der beständigen Anwesenheit oder Abwesenheit der Inhibitoren stimuliert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei weiteren Experimenten erzielt.
21. Wirkung von PD98059 und SB203580 auf die Gen-Transkription in RAW-264-Makrophagen. (A) Zellen wurden für die angegebenen Zeiten mit LPS (100 ng/ml) stimuliert. Die gesamte RNA wurde zu jedem Zeitpunkt extrahiert und die mRNA, die IL-1, COX2 und HRPT kodiert, wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion ermittelt (Abschnitt 2.6). (B) wie bei A mit der Ausnahme, dass die Makrophagen 1 h in der Anwesenheit oder Abwesenheit von PD98059 (50 μM) und/oder SB203580 (10 μM), oder Ro318220 (5 μM) inkubiert, dann 3 h in der Abwesenheit oder Anwesenheit von LPS und in der fortwährenden Anwesenheit oder Abwesenheit der Inhibitoren stimuliert wurden. RTPCR wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden durchgeführt, die Fragmente von IL-1, COX2 und HPRT kodieren. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erzielt.
22. Wirkung von Forskolin auf die CREB-Phosphorylierung und die COX2-Induktion in RAW-264-Makrophagen. (A) Makrophagen wurden 1 h mit LPS (100 ng/ml) und 15 min mit Forskolin (F) (20 μM) plus IBMX (10 μM) stimuliert. Nach der Zell-Lysis wurden gleiche Mengen des Lysats (30 μg Protein) mit einem Phosphor-spezifischen CREB-Antikörper immuno-geblottet (siehe Beschreibung von 19 bezüglich der Details und der molekularen Massen-Marker). (B) Makrophagen wurden 3 h mit LPS (100 ng/ml) oder Forskolin (20 μM) plus IBMX (10 μM) stimuliert und es wurde ein Immunoblotting mit einem spezifischen COX2-Antikörper durchgeführt (wie dies im Folgenden im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben ist). Die Marker-Proteine sind so, wie in 19 dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erzielt.
Beispiel 1: Durch Mitogen und Stress aktivierte Protein-Kinase (MSK1), ein neues Zwei-Kinasen-Domänen-Enzym, das direkt durch MAPK und SAPK2/p38 aktiviert wird, und das die Aktivierung von CREB vermitteln kann.
Wir haben eine neue durch Mitogen und Stress aktivierte Protein-Kinase (MSK1) und ein hiermit eng verwandtes Homolog (MSK2) identifiziert, die zwei Protein-Kinase-Domänen in einem einzigen Polypeptid enthalten. MSK1 (802 Residuen) zeigt eine 43%-ige Gesamt-Aminosäuresequenz-Identität mit durch MAP-Kinase aktivierte Protein-Kinase-1 (MAPKAP-K1), die auch als p90 RSK bezeichnet wird, einem weiteren „Zwei-Kinasen-Domän-Enzym". Die N- und C-Terminal-Kinase-Domänen von MSK1 sind zu 54% und 44% identisch mit entsprechenden Domänen in MAPKAP-K1 und die vier Phosphorylierung aktivierenden Schlüsselstellen in MAPKAP-K1 werden in MSK1 beibehalten. Wie MAPKAP-K1 wird MSK1 in vitro durch MAPK2/ERK2 aktiviert, doch wird es anders als MAPKAP-K1 auch durch die durch Stress aktivierte Protein-Kinase 2a (SAPK2a, die auch als p38 bezeichnet wird) und SAPK2b/p38ß2 aktiviert. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wird endogene MSK1 in 293-Zellen sowohl durch Polypeptid-Wachstumsfaktor- als auch Phorbolester-Stimulation oder durch UV-Strahlungs-Exposition, oxidativen und chemischen Stress aktiviert, während MAPKAP-K1 in signifikanter Weise nur durch Wachstumsfaktor-Phorbolester-Stimulation aktiviert wird. Die Aktivierung von MSK1 durch eine Wachstumsfaktor/Phorbolester-Stimulation wird durch den Wirkstoff PD98059 verhindert, der die Aktivierung der MAPK-Kaskade unterdrückt, während die Aktivierung von MSK1 durch UV-Strahlung, oxidativen und chemischen Stress in hohem Masse durch SB203580 verhindert wird, bei dem es sich um einen speziellen Inhibitor von SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß handelt. In HeLa-Zellen sind sowohl PD98059 und SB203580 erforderlich, um die Aktivierung von MSK1 durch TNF, NGF bzw. FGF zu unterdrücken, weil dieser Agonist sowohl die MAPK/ERK- als auch die SAPK2/p38-Kaskade aktiviert. Die Aktivierung von MSK1 wird dadurch aufgehoben, dass einzelne Inaktivierungs-Mutationen entweder in der N-Terminal- oder der C-Terminal-Kinase-Domäne erzeugt werden. MSK1 befindet sich im Kern von nicht stimulierten oder stimulierten Zellen, während MAPKAP-K1a in hohem Maße unter den gleichen Bedingungen cytosolisch ist. MSK1 phosphoryliert den Transkriptionsfaktor CREB bei Ser133 mit einem Km-Wert, der wesentlich kleiner ist als bei PKA, MAPKAP-K1 und MAPKAP-K2. Ein Peptid, das der das Ser133 umgebenden Sequenz entspricht, wird mit einem bemerkenswert niedrigen Km-Wert (< 0,1 μM) phosphoryliert. Die Wirkungen von SB203580, PD98059 und Ro318220 auf die durch einen Agonisten induzierte Aktivierung von CREB und ATF1 in vier Zelllinien spiegeln die Wirkungen dieser Inhibitoren auf die MSK1-Aktivierung und schließen eine Rolle für MAPKAP-K2, MAPKAP-K3 und MAPKAP-K1 bei diesem Vorgang aus. Diese Befunde deuten zusammen mit anderen Beobachtungen darauf hin, dass MSK1 die durch Wachstumsfaktor und Stress induzierte Aktivierung von CREB vermittelt.
Ergebnisse
Identifizierung von MSK1 als neue MAPKAP-K1-bezogene Kinase. Wir verwendeten die DNA-Sequenz, welche die N-Terminal-Kinase-Domäne von MAPKAP-K1 kodiert, um die NCBI EST-Databank abzufragen. Diese Suche identifizierte ein EST (AA1158571), das einen cDNA-Klon mit voller Länge eines neuen Mitglieds dieser Subfamilie kodiert, der im Folgenden als MSK1 bezeichnet wird. Der offene Leserahmen kodierte ein Protein mit 802 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 89,9 kDa. Es gibt ein Stopp-Codon unmittelbar 5' bezüglich des vorher gesagten initiierenden ATG-Codons. Die MSK1-Polypeptid-Domäne besaß zwei Protein-Kinase-Domänen (1), von denen beide die 11 Subdomänen enthielten, die für alle Protein-Kinasen charakteristisch sind (Hanks et al., 1988). MSK1 zeigte die größte Ähnlichkeit mit den drei Isoformen des MAPKAP-K1, das ebenfalls Zwei-Kinasen-Domäne besitzt (2A). Die N-Terminal- und die C-Terminal-Kinase-Domänen von MSK1 waren zu 54% und 44% identisch mit den entsprechenden Kinase-Domänen von MAPKAP-K1. Die Gesamt-Identität zwischen MAPKAP-K1 und MSK1 betrug 43%. Wir identifizierten 14 menschliche EST-Klone, die Fragmente von MSK1 kodieren, die von vielen Geweben abgeleitet sind (Tabelle 1), was anzeigt, dass MSK1 ein im großen Umfang exprimiertes Enzym ist. Tabelle 1 Genbank-Zugangsnummern für menschliche MSK1-ESTs: Gewebe, von denen EST abgeleitet ist
Genbank-Zugangsnummern für Mäuse-MSK1-ESTs:
Genbank-Zugangsnummern für menschliche MSK2-ESTs:
Genbank-Zugangsnummern für Mäuse-MSK2-ESTs:
Eine Northern-Blot-Analyse von menschlichen Geweben zeigte, dass MSK1 als 4-kb-Transcript in allen untersuchten Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Bauchspeicheldrüse) exprimiert wurde, wobei die höchsten Pegel im Gehirn-, Muskel- und Plazenta-Zellen auftraten (Daten nicht dargestellt). Eine Ausrichtung der N- und C-Terminal-Kinase-Domänen von MSK1 mit anderen Protein-Kinasen, die durch MAPK-Familien-Mitglieder aktiviert werden, ist in 2B dargestellt.
Wir fanden auch EST-cDNA-Klone (Tabelle 1), die eine weitere Protein-Kinase kodieren, deren Aminosäuresequenz zu 75% mit MSK1 aber nur zu 40% mit MAPKAP-K1 identisch war, und die wir als MSK2 bezeichnet haben. Die sich nahezu über die gesamte Länge erstreckende Kodierungs-Sequenz von Mäuse-MSK2 und die partielle Sequenz von menschlichem MSK2 sind in Ausrichtung mit MSK1 in 2C dargestellt. Die von der Maus und vom Menschen stammenden MSK2-Sequenzen weisen eine 90%-ige Aminosäuresequenz-Identität auf. Wir identifizierten acht menschliche EST-cDNA-Klone, die Fragmente von MSK2 kodieren, die wir aus einer Reihe von Zellen und Geweben ableiteten. Sechs davon waren Tumorzellen-Linien. Eine Northern-Blot-Analyse von menschlichen Geweben zeigte, dass MSK2 als ein 3 kb-Transkript mit einer ähnlichen Verteilung wie MSK1 exprimiert wurde (Ergebnisse nicht dargestellt).
Aktivierung von MSK1 in vitro durch MAPK2/ERK2 und SAPK2/p38. Die vier Phosphorylierungs-Aktivierungs-Schlüsselstellen, die in MAPKAP-K1a vorhanden sind (siehe Einleitung) werden in MSK1 und MSK2 beibehalten (2). Zwei der vier Stellen in MAPKAP-K1 (Ser360 und Thr581), auf die Prolin-Residuen folgen, werden durch MAPK phosphoryliert (2C). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass MSK1 und MSK2 durch ein oder mehrere MAPKs aktiviert werden können. Um die Aktivierung von MSK1 und MAPKAP-K1a durch MAPKs zu vergleichen, wurden beide Enzyme in menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) am Amino-Terminus exprimiert (im folgenden als GST-MSK1 und GST-MAPKAP-K1a bezeichnet). Beide Proteine wurden auf Glutathion-Sepharose gereinigt und zeigten ein einziges Coomassie-Blaufärbungs-Hauptband, wenn sie einer SDS/Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen wurden (3A). Die offensichtliche Molekularmasse von GST-MSK1, die durch eine SDS/Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese abgeschätzt wurde (116 kDa) war geringfügig größer als GST-MAPKAP-K1a (3A), was damit konsistent ist, dass das zuletzt genannte Enzym um 62 Aminosäuren kürzer ist (2A).
Es ist bekannt, das MAPKAP-K1 eine hohe Aktivität bezüglich des als Crosstide (GRPRTSSFAEG) bezeichneten Peptids besitzt (Alessi et al., 1996a). GST-MSK1 und GST-MAPKAP-K1a, die aus 293-Zellen gereinigt worden waren, die über Nacht ohne Nährstoffe gelassen worden waren, besaßen eine geringe Aktivität bezüglich dieses Substrats (2–4 U/mg), was durch eine Inkubation mit MgATP und aktiviertem MAPK2/ERK2 mehr als 100-fach verstärkt wurde (3B und 3C). GST-MSK1 konnte ebenfalls in ähnlicher Weise durch SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß aktiviert werden (4A), während MAPKAP-K1a nicht aktiviert werden konnte (3C). SAPK1/JNK1γ und SAPK3/p38ß aktivierten weder GST-MSK1 noch GST-MAPKAP-K1a. SAPK4/p38δ war ein schwacher Aktivator für GST-MSK1 und aktivierte GST-MAPKAP-K1a nicht. Die Fähigkeit von MAPK2/ERK2 (Daten nicht dargestellt) und SAPK2/p38 (3D) GST-MSK1 zu aktivieren, entsprachen dem Ausmaß der Phosphorylierung dieses Enzyms.
Endogene MSK1 wird in vivo durch EGF und TPA über den MAPK/ERK-Pfad und durch Stress-Stimuli über den SAPK2/p38-Pfad aktiviert. Die in 3 dargestellten Experimente zeigten die Möglichkeit auf, dass MSK1 in Reaktion auf Stimuli aktiviert werden kann, welche die SAPK2/p38-Isoformen aktivieren, und ebenso auch Stimuli, welche die klassische MAPK/ERK-Kaskade aktivieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden drei MSK1-Antikörper erzeugt, einer gegen die Residuen 26 bis 44 (Antikörper „A"), ein zweiter gegen die Residuen 384 bis 402 (Antikörper „B") und ein dritter gegen die Residuen 716 bis 734 (Antikörper „C"). Alle drei Antikörper fällten MSK1 durch Immunreaktion quantitativ (nicht dargestellt) aus und die Immun-Ausfällung von exprimierter MSK1 (4A) oder endogener MSK1 in Zell-Lysaten (nicht dargestellt) wurde durch Inkubation mit dem geeigneten Peptid-Immunogen verhindert.
Der in dieser Studie verwendete MAPKAP-K1-Antikörper fällt durch Immunreaktion sowohl MAPKAP-K1a als auch MAPKAP-K1b (4b und 4C, Alessi et al., 1995) aus, aber nicht MSK1 (4A). Darüber hinaus fällte keine der MSK1-Antikörper MAPKAP-K1a oder MAPKAP-K1b durch Immunreaktion aus (4B und 4C). Die Peptidsequenz, die verwendet wird, um den MSK1-Antikörper „A" zu erzeugen, wird in MSK2 nicht beibehalten und die 19 Residuen-Peptide, die verwendet wurden, um die Antikörper „B" und „C" zu erzeugen, besitzen nur 9 bzw. 12 beibehaltene Residuen mit MSK2. Alle drei MSK1-Antikörper fällten durch Immunreaktion ähnliche Pegel von MSK1-Aktivität sowohl in 293-Zellen, die EGF, TPA oder Stress ausgesetzt waren, oder in HeLa-Zellen aus, die mit TNF stimuliert worden waren (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse zeigen, dass MSK2 nicht gemeinsam durch Immunoreaktion mit MSK1 ausgefällt wird.
Endogenes MSK1 wurde mit dem Antikörper „A" durch Immunoreaktion aus den Lysaten von 293-Zellen ausgefällt, die zuvor mit EGF, 12-O-Tetradekanoylphorbol-13-acetat (TPA) stimuliert oder zellulärem Stress (Natriumarsenit, UV-Strahlung oder Wasserstoffperoxid) ausgesetzt worden waren. Diese Experimente zeigten, dass MSK1 in starkem Maße durch alle diese Stimuli aktiviert worden war (5A). Interessanterweise wurde die Aktivierung von MSK1 durch EGF und TPA in starkem Maß durch PD98059, einem spezifischen Inhibitor der Aktivierung von MAP-Kinase Kinase-1 (Alessi et al., 1995), aber nicht durch SB203580 verhindert, einem spezifischen Inhibitor von SAPK2a/p38 und SAPK2b/p38ß (Cuenda et al., 1995). Im Gegensatz hierzu wurde die Aktivierung von MSK1 durch Stress-Stimuli in starkem Maß durch SB203580, aber nicht durch PD98059 gehemmt (5A). Identische Ergebnisse wurden erzielt, wenn anstelle der Antikörper „A" die Antikörper „B" oder „C" verwendet wurden (Daten nicht dargestellt).
Die durch EGF und TPA erfolgende Stimulation von Zellen aktivierte in starkem Maße MAPKAP-K1a/b in 293-Zellen und, wie bei der Aktivierung von MSK1, wurde dies in starkem Maße durch PD98059 aber nicht durch SB203580 unterdrückt (5B). Stress-Stimuli induzierten keine merkliche Aktivierung von MAPKAP-K1a/b (5B), doch induzierten sie eine starke Aktivierung von MAPKAP-K2, was durch SB203580 aber nicht durch PD98059 verhindert wurde (5C). MAPKAP-K2 wurde durch EGF oder TPA nicht merklich aktiviert (5C).
Die Aktivierung von MSK1 durch TPA und UV-Strahlung erfordert beide Kinase-Domänen. Um herauszufinden, welche Kinasedomäne von MSK1 für seine Aktivierung in vivo erforderlich war, transfizierten wir 293-Zellen mit DNA-Expressions-Konstrukten, die Wildtyp-MSK1 (WT-MSK1), ein mutiertes MSK1, bei dem die N-Terminal-Kinase-Domäne durch eine Punktmutation deaktiviert sein sollte (NT-Kinase-Dead-MSK1) und einen weiteren Mutanten kodiert, bei dem die C-Terminal-Kinase-Domäne deaktiviert sein sollte (CT-Kinase-Dead-MSK1). Alle diese Konstrukte besaßen eine N-Terminal- Markierung „Flag" (siehe Methoden), um ihre Immuno-Ausfällung und Untersuchung aus Zell-Lysaten zu ermöglichen. Die Stimulation der Zellen mit TPA oder durch eine UV-Strahlungs-Exposition induzierte eine 200-fache bzw. 30-fache Aktivierung der Wildtyp-MSK1. Ähnlich zu den Ergebnissen mit endogenem MSK1 wurde die Aktivierung von transfiziertem MSK1 durch TPA durch PD98059 aber nicht durch SB203580 verhindert, während die UV-induzierte Aktivierung durch SB203580 verhindert wurde, durch PD98059 aber unbeeinflusst blieb (6A). Das transfizierte Wildtyp-Enzym wurde ebenfalls 50- bis 100-mal stärker durch EGF, basische FGF und Serum aktiviert und die Aktivierung wurde durch PD98059 aber nicht durch SB203580 verhindert (Daten nicht dargestellt). Diese Beobachtungen bestätigen die Ergebnisse, die durch die Immuno-Ausfällung der endogenen Protein-Kinase erhalten wurden, d.h., dass MSK1 in Zellen entweder über die klassische MAP-Kinase-Kaskade oder über den SAPK2a/p38-Pfad aktiviert werden kann.
Im Gegensatz besaß keiner der NT-Kinase-Dead-Mutanten und auch keiner der CT-Kinase-Dead-Mutanten von MSK1 eine merkliche Aktivität sowohl vor noch nach der Zell-Stimulation mit TPA oder einer UV-Strahlungs-Exposition (6A). Beide „Kinase-Dead"-MSK1-Mutanten wurden mit dem gleichen Pegel exprimiert wie das Wildtyp-MSK1-Protein (6B). Diese Beobachtungen zeigen auch, dass die MSK1-Aktivität, deren Messung in 6 dargestellt ist, auf MSK1 selbst und nicht auf einer kontaminierenden Kinase beruht, die gemeinsam mit MSK1 durch Immunoreaktion ausgefällt wird.
MSK1 befindet sich in den Zellkernen und MAPKAP-K1a im Zytoplasma. Die subzelluläre Lokalisierung von Wildtyp-MSK1, das in 293-Zellen überexprimiert worden war, wurde durch quantitative Immuno-Elektronen-Mikroskopie untersucht (7). MSK1 befand sich in starkem Maße im Kern von nicht stimulierten Zellen. Die Dichte von MSK1 im Kern-Kompartment war 12- bis 30-mal höher als im Zytoplasma (7A und 7C). Die Aktivierung von MSK1 durch Stimulation mit TPA (7A und 7D) oder durch UV-Strahlungs- Exposition (Daten nicht dargestellt) führte zu keinerlei Änderung in der subzellulären Lokalisierung von MSK1. MSK1 besitzt ein mutmaßliches Bipartit-Nuklear-Lokalisierungssignal (Robins et al., 1991) zwischen den Residuen 726 bis 748 (1), das bei MAPKAP-K1a/b nicht vorhanden ist. Mit diesen Beobachtungen stimmt überein, dass MAPKAP-K1a dann, wenn es in Zellen überexprimiert war, sich hauptsächlich im Zytoplasma befand (7B). Darüber hinaus wurde keine merkliche Translokation von MAPKAP-K1a zum Kern nach einer TPA-Stimulation von Zellen (7B und 7E) beobachtet, welche eine 100-fache Aktivierung dieser Kinase induziert (Daten nicht dargestellt).
MSK1 ist in vitro eine extrem wirksame CREB-Kinase. Die Substrat-Spezifitäten von MSK1 und MAPKAP-K1a wurden nach einer Expression der GST-Fusions-Proteine in 293-Zellen untersucht, der eine TPA-Stimulation und Reinigung aus den Zell-Lysaten folgte (3A). Es wurde gefunden, dass die spezifische Aktivität von GST-MSK1 bei einer Sättigungskonzentration von Crosstide (GRPRTSSFAEG, Peptid 1, 8A) ähnlich zu der von MAPKAP-K1a ist (siehe Beschreibung von 8). Der Km-Wert für Crosstide war 2–3 μM für MSK1, MAPKAP-K1a oder MAPKAP-K1b. Crosstide wird durch MAPKAP-K1 in wirksamer Weise phosphoryliert, da es zwei Arginine enthält, die sich drei und fünf Residuen N-Terminal zu dem Serin befinden, das phosphoryliert wird. Aus diesem Grund wird das Peptid KKRNRTLSVA (Peptid 2, 8A) durch MAPKAP-K1a/b mit Km- und V_max-Werten phosphoryliert, die mit denen für Crosstide nahezu identisch sind. Es wurde gefunden, dass dieses Peptid sogar noch wirksamer durch MSK1 phosphoryliert wird, wobei der Km-Wert 0,2 μM ist. Eine Veränderung des Arginins bei Position n-3 in KKRNRTLSVA zu Lysin (Peptid 3, 8A) erhöhte den Km-Wert ungefähr 100-fach für MSK1 und in gleicher Weise für MAPKAP-K1a/b. Eine Veränderung des Arginin an der Position n-5 in Leucin (Peptid 4, 8A) erhöhte jedoch den Km-Wert für MSK1 nicht merklich, obwohl der Km-Wert für MAPKAP-K1a/b 5-fach erhöht wurde. Diese Experimente zeigen an, dass MSK1 ein Arginin an der Position n-3 benötigt, aber kein basisches Residuum an der Position n-5.
Es wurde berichtet, dass MAPKAP-K1b (Xing et al., 1996) und MAPKAP-K2 (Tan et al., 1996) die Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB durch Wachstumsfaktoren bzw. Stress-Stimuli vermitteln. Angesichts der vorherrschenden Lokalisierung von MSK1 im Kern war es daher interessant, die Effizienz, mit der es CREB phosphorylierte, mit diesen anderen Protein-Kinasen zu vergleichen. Diese Experimente führten zu dem überraschenden Befund, dass CREB ein erstaunlich gutes Substrat für MSK1 ist, da es mit einem Km-Wert von 2 μM und mit einem V_max ähnlich wie Crosstide oder KKRNRTLSVA phosphoryliert wird. Im Gegensatz hierzu wurde CREB durch PKA mit einem Km-Wert von 17 μM unter den gleichen Bedingungen phosphoryliert (Daten nicht dargestellt), während der Km-Wert zu hoch war, um gemessen zu werden, wenn die Phosphorylierung durch MAPKAP-K1a/b (8A) oder MAPKAP-K2 (Daten nicht dargestellt) katalysiert wurde. Infolge hiervon war, wenn die Aktivitäten von MSK1, MAPKAP-K1a/b und MAPKAP-K2 bezüglich Crosstide und/oder des Peptids KKLNRTLSVA angepasst wurden, die Rate der Phosphorylierung von 5 μM CREB durch MSK1 30-fach höher als durch MAPKAP-K1a, 12-fach höher als durch MAPKAP-K1b und 60-fach höher als durch MAPKAP-K2 (8B). Im Gegensatz war MAPKAP-K2 wesentlich aktiver in Bezug auf Hitzeschock-Protein 27 (eines seiner physiologischen Substrate, Cuenda et al, 1995) als MSK1 oder MAPKAP-K1a/b (8B).
Das Residuum auf die CREB, das durch MSK1 phosphoryliert wurde, wurde durch tryptischen Abbau ermittelt, auf den eine Chromatographie des Abbauproduktes auf einer C18-Säule folgte. Ein mit ³²P-gekennzeichnetes Hauptpeptid wurde beobachtet, das mit 15% Acetonitril ausgewaschen wurde (8C). Dieses Peptid enthielt Phosphoserin, und wenn es einer Festphasen-Sequenzierung unterworfen wurde, wurde ³²P-Radioaktivität nach dem dritten Zyklus des Edman-Abbaus freigesetzt (Daten nicht dargestellt). Seine Identität wurde durch eine MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermittelt, die zeigte, dass das Molekulargewicht dies Peptids (758,33) identisch mit dem des erwarteten tryptischen Phosphopeptids war, das die Residuen 31–35 umfasst und bei Ser133 phosphoryliert wurde (berechnete Masse 758,36). MAPKAP-K1b, von dem bekannt ist, dass es das gleiche Residuum phosphoryliert (Xing et al., 1996) markierte das gleiche tryptische Peptid wie MSK1 (Daten nicht dargestellt).
Mit dem mit dem CREB-Protein erhaltenen Ergebnissen übereinstimmend wurde ein synthetisches Peptid (das als CREBtide bezeichnet wird) und den Residuen 126 bis 136 von CREB entspricht (EILSRRPSYRK, Peptid 5, 8A) mit einem Km-Wert phosphoryliert, der zu klein war, um gemessen zu werden (< 0,1 μM). Im Gegensatz hierzu phosphorylierten MAPKAP-K1a und MAPKAP-K1b dieses Peptid ziemlich schlecht mit Km-Werten, die mindestens 200-fach größer waren (8A).
Beweis, dass MAPKAP-K2 die Phosphorylierung von CREB und ATF1 durch UV-Strahlung oder EGF in 293-Zellen nicht vermittelt. Das Staurosporin-Analog Ro318220 hemmt alle PKC-Isoformen (Davis et al., 1989) sowie MAPKAP-K1a/b, mit IC₅₀-Werten von 10 bis 30 nM (Alessi 1997, 9A). Bei der vorliegenden Arbeit wurde gefunden, dass Ro318220 ein gleichermaßen potenter Inhibitor von MSK1-Aktivität in vitro (9A) ist. Ro318220 hemmt MAPKAP-K2 in vitro selbst bei 10 μM nicht merklich (11A) noch beeinflusst es die Aktivierung von MAPKAP-K2 in vivo in Reaktion auf UV-Strahlung (9B). Weiterhin beeinflusste eine Inkubation von Zellen mit Ro318220 nicht merklich die durch UV-Strahlung induzierte Phosphorylierung von HSP27, einem physiologischen Substrat für MAPKAP-K2 (Cuenda et al., 1995, 9C). In parallelen Experimenten wurde die Phosphorylierung von HSP27 durch UV-Strahlung durch SB203580 blockiert. Die zyklische von AMP abhängige Protein-Kinase, die die Phosphorylierung von CREB und ATF1 induziert durch Agonisten vermittelt, welche die Pegel von zyklischem AMP erhöhen, wie z.B. Forskolin (Gonzalez und Montminy 1989) wird ebenfalls durch Ro318220 bei 10 μM nicht merklich gehemmt (Davis et al., 1989).
Die in 9 dargestellten Ergebnisse ergaben eine Möglichkeit, die Rolle von MAPKAP-K2 bei der Vermittlung der Phosphorylierung von CREB bei Ser133 (und seinem nahen Verwandten ATF1 bei Ser63) zu bewerten. Wir beobachteten, dass CREB und ATF1 nach einer UV-Strahlungs-Exposition von 293-Zellen oder nach einer Behandlung mit EGF schnell phosphoryliert wurden, und dass die Phosphorylierung durch 5 μM Ro318220 stark gehemmt wurde (10A und 10B). Im Gegensatz war die Phosphorylierung von CREB und ATF1 induziert durch Forskolin, das die Phosphorylierung von CREB durch die von zyklischem AMP abhängige Protein-Kinase induziert (Gonzalez et al, 1989) durch 5 μM Ro318220 unbeeinflusst (10C). Wie die Aktivierung von MSK1 wurde die durch UV-Strahlung induzierte Phosphorylierung von CREB und ATF1 durch SB203580 aber nicht durch PD98059 gehemmt (10D), während eine durch EGF induzierte CREB-Phosphorylierung durch PD98059 und nicht durch SB203580 verhindert wurde (10E).
Nachweis, dass weder MAPKAP-K2 noch MAPKAP-K1 die Phosphorylierung von CREB und ATF1 durch TNF in HeLa-Zellen vermittelt.
Endogenes MSK1 wurde schnell (aber nur vorübergehend) durch den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) in HeLa-Zellen aktiviert. Interessanterweise variierte der Einfluss von SC203580 und PD98059 auf die Aktivierung von MSK1 mit der Zeit der Stimulation. Nach 5 min wurde die Aktivierung durch SB203580 vollständig gehemmt, blieb aber durch PB98059 unbeeinflusst. Nach 15 min war jedoch die Aktivierung von MSK1 sowohl durch SB203580 als auch PD98059 teilweise blockiert und nahezu vollständig unterdrückt, wenn beide Wirkstoffe zusammen zugegeben wurden (11A). Diese Beobachtungen werden durch die unterschiedlichen Aktivierungsraten der SAPK2/p38- und MAPK/ERK-Kaskaden erklärt. Somit wird nach 5 Minuten TNF-Stimulation der SAPK2-Pfad aktiviert, wie dies durch die Aktivierung von MAPKAP-K2 angezeigt wird (was durch SB203580 aber nicht durch PD98059 gehemmt wird). Im Gegensatz hierzu wird die MAPK/ERK2-Kaskade nach 5 min nicht aktiviert, wie dies durch das Fehlen einer Aktivierung von MAPKAP-K1a/b angezeigt wird (11B und 11C). Es wird jedoch sowohl die MAPK/ERK- als auch die SAPK2/p38-Kaskade nach 15 min einer TNF-Stimulation aktiviert, wie dies durch die Aktivierung sowohl von MAPKAP-K1a/b und MAPKAP-K2 angezeigt wird. Die Aktivierung von MAPKAP-K1a/b nach 15 min wird durch PD98059 aber nicht durch SB203580 unterdrückt (11B und 11C).
Stimulierung von HeLa-Zellen mit TNF induzierte schnell die Phosphorylierung von CREB und ATF1. Nach 5 min wurde die Phosphorylierung von CREB und ATF1 durch SB203580 verhindert, blieb aber durch PD98059 unbeeinflusst (12A). Nach 15 min wurde die durch TNF induzierte Phosphorylierung von CREB durch SB203580 teilweise unterdrückt, durch PD98059 leicht unterdrückt und in Anwesenheit beider Verbindungen vollständig verhindert (12B). Die Einflüsse von SB203580 und PD98059 auf die Aktivierung von CREB waren daher ähnlich ihren Einflüssen auf die durch TNF induzierte Aktivierung von MSK1 (11). Die durch TNF induzierte CREB-Phosphorylierung wurde durch 5 μM Ro318220 vollständig blockiert (12C), doch blieb die Aktivierung von MAPKAP-K2 durch diesen Wirkstoff unbeeinflusst (Daten nicht dargestellt).
Beweis, dass die CREB-Phosphorylierung bei Ser133 in PC12-Zellen mit der Aktivierung von MSK1 statt der von MAPKAP-K1 oder von MAPKAP-K2 korreliert ist. Eine NGF-Stimulation einer PC12-Zell-Linie induzierte die Phosphorylierung von CREB (13A) und die Aktivierung von MSK1 (13B). Die Phosphorylierung von CREB und die Aktivierung von MSK1 waren durch eine Inkubation der Zellen entweder mit PD98059 oder SB203580 nicht merklich beeinflusst, wurden aber in Anwesenheit beider Wirkstoffe stark gehemmt (13). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Hemmung sowohl des MAPK/ERK- als auch des SAPK2/p38-Pfades erforderlich ist, um eine CREB-Phosphorylierung bei Ser133 und die MSK1-Aktivierung in diesen Zellen zu verhindern, und dies wird unten im Abschnitt „Diskussion" erläutert.
Wie MSK1 wurde auch MAPKAP-K1 durch NFG 5-fach aktiviert, doch war im Gegensatz zu MSK1 die Aktivierung von MAPKAP-K1 durch SB203580 unbeeinflusst und durch PD98059 nur teilweise gehemmt und nicht weiter gehemmt durch eine Kombination beider Wirkstoffe. Somit stand die MAPKAP-K1-Aktivität nicht in Korrelation mit der CREB-Phosphorylierung. Wie früher berichtet (Rouse et al., 1994) induzierte NGF keine signifikante Aktivierung von MAPKAP-K2-Aktivierung in PC23-Zellen. Darüber hinaus wurde eine durch NGF induzierte CREB-Phosphorylierung durch 5 μM Ro318220 unterdrückt (Daten nicht dargestellt) was wiederum eine Rolle für MAPKAP-K2/K3 ausschließt.
Nachweis, dass CREB-Phosphorylierung bei Ser133 in SK-N-MC-Zellen in Korrelation mit der Aktivierung von MSK1 statt mit der von MAPKAP-K1 oder MAPKAP-K2 steht. Frühere Arbeiten dieses Labors zeigten, dass die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 in SK-N-MC-Zellen, die entweder durch Natriumarsenit oder FGF induziert wird, durch SB203580 unterdrückt wird (Tan et al., 1996). Bei der vorliegenden Arbeit bestätigten wir, dass die durch Natriumarsenit induzierte Aktivierung von CREB und MSK1 in diesen Zellen durch SB203580 aber nicht durch PD98059 verhindert wird. Die durch FGF induzierte Phosphorylierung von CREB wurde jedoch sowohl durch SB203580 als auch PD98059 nur geringfügig gehemmt und es war das Vorhandensein beider Wirkstoffe erforderlich, um die CREB-Phosphorylierung vollständig zu unterdrücken (14D). In ähnlicher Weise wird die durch FGF induzierte Aktivierung von MSK1 in diesen Zellen ebenfalls in Anwesenheit entweder von SB203580 oder PD98059 nur teilweise unterdrückt aber in Anwesenheit beider Verbindungen verhindert (14A).
Im Gegensatz zu MSK1 wurde die Aktivierung von MAPKAP-K2 durch Natriumarsenit und FGF durch SB203580 vollständig aber durch PD98059 nicht unterdrückt (14C), und Ro318220 (das die Aktivierung oder Aktivität von MAPKAP-K2 nicht beeinflusst) unterdrückt in starkem Maß die Phosphorylierung von CREB bei Ser133. Diese Befunde zeigen, dass die MAPKAP-K2-Aktivität nicht geschwindigkeitsbegrenzend für die CREB-Phosphorylierung bei Ser133 ist. Um jegliches Missverständnis zu vermeiden, sei darauf hingewiesen, dass Ro318220 ein reversibler Inhibitor der MSK1-Aktivität ist und die MSK1-Aktivierung in Zellen nicht beeinflusst (14A). Sobald die Zellen lysiert worden sind und MSK1 aus den Lysaten durch Immunoreaktion ausgefällt worden ist, und der Ro318220-Inhibitor entfernt worden ist, wird somit MSK1 nicht länger gehemmt.
Im Gegensatz zu MSK1 wurde die Aktivierung von MAPKAP-K1 durch FGF durch PD98059 aber nicht durch SB203580 aufgehoben (14B). PD98059 unterdrückte jedoch (in der Abwesenheit von SB203580) die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 nicht merklich.
Bakterielles Endotoxin stimuliert die MSK1- und CREB-Phosphorylierung in der RAW-264-Mäuse-Makrophagen-Zelllinie. Wie in 15 dargestellt, führt eine LPS-Stimulierung von RAW-264-Makrophagen zu einer MSK1- und CREB/ATF1-Phosphorylierung. 50 μM PD98059 oder 10 μM SB203580 scheinen die Phosphorylierung von MSK1 und von CREB/ATF1 zu hemmen.
Diskussion
Wir geben hier die Sequenz einer neuen, in großem Umfang exprimierten Protein-Kinase, die als MSK1 bezeichnet wird (1) und die nahezu vollständige Sequenz einer eng verwandten Protein-Kinase MKS2 (2 und 16 und Tabelle 1) an. MSK1 und MSK2 sind am meisten ähnlich (40% Gesamt-Aminosäuren-Sequenz-Identität) mit den Isoformen von MAPKAP-K1, denen sie auch insofern ähneln, als sie zwei Protein-Kinase-Domänen mit einem einzigen Polypeptid besitzen (2). Die N-Terminal-Kinase-Domäne von MAPKAP-K1 phosphoryliert exogene Substrate, während die einzige bekannte Rolle der C-Terminal-Domäne darin besteht, die N-Terminal-Domäne zu aktivieren (siehe Einleitung). Die Bedeutung der C-Terminal-Kinase-Domäne von MAPKAP-K1 wird durch die Ergebnisse angezeigt, dass eine Inaktivierungs-Mutation die Aktivierung der N-Terminal-Kinase-Domäne um 85% bis 90% unterdrückt (Leighton et al., 1996). Im Gegensatz hebt eine inaktivierende Mutation in der C-Terminal-Kinase-Domäne von MSK1 (wie eine inaktivierende Mutation in der N-Terminal-Kinase-Domäne) die Aktivierung vollständig auf (8). Wenn angenommen wird, dass der Aktivierungsmechanismus von MSK1 analog zu dem von MAPKAP-K1 ist, wie dies durch die Beibehaltung der vier Schlüssel-Phosphorylierungs-Stellen nahe gelegt wird (2), dann zeigt dies an, dass die C-Terminal-Kinase-Domäne von MSK1 für die Aktivierung der N-Terminal-Domäne wesentlich ist.
MSK1 wird in vivo entweder durch die MAPK/ERK-Kaskade oder den SAPK2/p38-Pfad aktiviert. Dies wurde durch den Befund gezeigt, dass PD98059 in starkem Maße die Aktivierung von endogener oder transfizierter MSK1 durch Wachstumsfaktoren und Phorbolester unterdrückt, während SB203580 die Aktivierung unterdrückt, die durch eine UV-Strahlungs-Exposition oder oxidativen Stress induziert wird (5 und 6). Mit diesen Befunden stimmt überein, dass MSK1 in vitro entweder durch MAPK2/ERK2 oder durch SAPK2/p38 aktiviert werden kann (3). Einige Signale, wie z.B. TNF in HeLa-Zellen (110), FGF in SK-N-MC-Zellen (14) und NGF in PC12-Zellen (13) aktivieren sowohl die MAPK2/ERK2- als auch die SAPK2/p38-Kaskade und beide Signalwege tragen zur Aktivierung von MSK1 in diesen Zellen bei. Warum MSK1 und MNK1 (Fukunaga & Hunter, 1997 und Waskiewicz et al., 1997) in vitro durch beide MAP-Kinase-Familienmitglieder aktiviert werden können, während MAPKAP-K1 nur durch MAPK2/ERK2 aktiviert werden kann, ist unklar. Es wird angenommen, dass dem MAPKAP-K1 entweder ein Motiv fehlt, das für die Erkennung durch SAPK2/p38 erforderlich ist, oder dass es ein Motiv enthält, das eine Erkennung durch diese Enzyme verhindert.
Der Befund, dass MSK1 in vivo durch Signale aktiviert wird, welche die Aktivierung der MAPK/ERK-Kaskade oder des SAPK2/p38-Pfades auslösen, legt nahe, dass es ähnlich wie in MNK1 eine Rolle bei der Integration von Effekten von verschiedenen extrazellulären Signalen spielt. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Substrate von MSK1 Proteine sind, die in Reaktion sowohl auf Mitogen- als auch auf Stress-Signale phosphoryliert wer den. Zwei solche Proteine sind die Transkriptionsfaktoren CREB und ATF1 (siehe Einleitung), und wir haben gefunden, dass CREB in vitro ein bemerkenswert gutes Substrat für MSK1 (8) ist. MSK1 phosphoryliert CREB nur bei Ser133, d.h. der Aktivierungsstelle, die in vivo in Reaktion auf Mitogen- oder Stress-Signale phosphoryliert wird. Der Km-Wert für die Phosphorylierung von CREB durch MSK1 ist wesentlich kleiner als für die Phosphorylierung durch PKA < MAPKAP-K1 oder MAPKAP-K2 (8). MSK1 phosphoryliert CREBtide an den äquivalenten Residuen und mit einem beachtlich kleinen Km-Wert, von dem geschätzt wird, dass er unter 0,1 μM liegt (8A). Nach unserer Kenntnis ist dies der niedrigste Km-Wert für jedes Peptid-Substrat einer jeden Protein-Kinase, der bisher identifiziert wurde. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass MSK1 (und/oder MSK2) die Aktivierung von CREB durch Mitogen und Stress-Stimuli vermitteln kann, und die Lokalisierung im Kern von MSK1 (7) ist mit einer solchen Rolle konsistent.
MAPKAP-K2 kann die Aktivierung von CREB durch Stress-Signale oder FGF in der neuronalen Zelllinie SK-N-MC vermitteln (Tan et al.,1996). Bei der vorliegenden Arbeit wurden jedoch weder die Aktivierung von MAPKAP-K2 in vivo noch seine Aktivität in vitro (9 und 14) durch Ro318220 bis zu 10 μM beeinflusst; doch 5 μM Ro318220 unterdrückten die CREB-Phosphorylierung bei Ser133 in Reaktion auf all die Signale, die MAPKAP-K2 in SK-N-MC-Zellen und anderen Zelllinien aktivieren (10, 12 und 14). Zusätzlich haben wir gefunden, dass MAPKAP-K2 die alternativ gesplicte CREB-Variante (Gonzalez et al., 1989) wesentlich schneller bei Ser98 als bei Ser133 phosphoryliert, doch wurde keine Phosphorylierung von CREB bei Ser98 nach einer Stimulation durch Agonisten beobachtet, die MAPKAP-K2 stark aktivieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die MAPKAP-K2/K3-Aktivität nicht geschwindigkeitsbegrenzend für die durch Stress induzierte Aktivierung der CREB-Aktivierung in SK-N-MC-Zellen ist. Die einzige andere Protein-Kinase, von der bekannt ist, dass sie durch Stress-Stimuli aktiviert wird, und die CREB bei Ser133 phosphoryliert, ist MSK1. MSK1 phosphoryliert CREB weit wirksamer als MAPKAP-K2 in vitro (8) und wird in hohem Maße durch Ro318220 gehemmt (9). Aus diesen Gründen ist MSK1 (und/oder MSK2) zurzeit der beste Kandidat für die Vermittlung der Stress induzierten CREB-Phosphorylierung bei Ser133.
MSK1 und MAPKAP-K1 werden beide durch MAPKs/ERKs nach einer Zell-Stimulation durch Wachstumsfaktoren oder Phorbolester aktiviert, phosphorylieren beide CREB bei Ser133 und werden beide in starkem Maße durch Ro318220 gehemmt. Dies führt zu der Frage, ob die durch Wachstumsfaktoren oder Phorbolester induzierte Aktivierung von CREB durch MSK1 oder eine MAPKAP-K1-Isoform vermittelt wird. Es wurde berichtet, dass MAPKAP-K1b eine wesentlich wirksamere CREB-Kinase als MAPKAP-K1a ist (Xing et al., 1996) und dass MAPKAP-K1b die Haupt-CREB-Kinase war, die in Lysaten messbar ist, die aus durch NGF stimulierten PC12-Zellen bereitet wurden (Ginty et al., 1994; Xing et al., 1996). In unseren Versuchen phosphorylierten jedoch MAPKAP-K1a und MAPKAP-K1b CREB oder CREBtide mit einer ähnlichen Kinetik (8) und keine war auch nur bei weitem so effizient wie MSK1 (8).
Darüber hinaus gibt es zahlreiche Beispiele, dass von der biochemisch gefundenen Haupt-Protein-Kinase im weiteren Verlauf nicht gezeigt werden konnte, dass sie in vivo bezüglich eines speziellen Substrates das relevante Enzym ist. Beispielsweise ist MAPKAP-K1 die durch Insulin stimulierte Haupt-Protein-Kinase in Extrakten, die aus L6-Myotuben zubereitet wurden, die die Glykogen-Synthase-Kinase-3 phosphoryliert und inaktiviert (Cross et al., 1994), und doch haben spätere Arbeiten, bei denen PD98059 verwendet wurde, seine Beteiligung in diesem Prozess ausgeschlossen (Cross et al., 1995). Der Grund, warum MSK1 zuvor nicht durch biochemische Analyse entdeckt wurde, kann darauf beruhen, dass die MSK1-Aktivität in wesentlich weniger starkem Maße hervortritt als die MAPKAP-K1- und MAPKAP-K2-Aktivitäten in den untersuchten Zellen. Das geringe Hervortreten der MSK1-Aktivität in Zellen im Vergleich zu MAPKAP-K1- und MAPKAP-K2 kann erklären, warum die MSK1-Aktivität durch frühere chemischen Analysen nicht gefunden werden konnte (Xing et al., 1996 und Tan et al, 1996).
Vor kurzem haben Xing et al., (1998) berichtet, dass sowohl SB203580 als auch PD98059 erforderlich sind, um die durch NGF induzierte Phosphorylierung von CREB in P12-Zellen zu verhindern. Wir haben diese Beobachtungen bestätigt (13A) und auch gezeigt, dass NGF MSK1 in diesen Zellen aktiviert (13B). Wie die Phosphorylierung von CREB wird die Aktivierung von MSK1 durch NGF in diesen Zellen nur in Anwesenheit sowohl von SB203580 als auch PD98059 signifikant gehemmt. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Aktivierung sowohl der MAPK/ERK-Kaskade als auch des SAPK2/p38-Pfades ausreichend ist, um eine maximale Aktivierung von MSK1 und CREB-Phosphorylierung bei Ser133 zu erzeugen. Im Gegensatz wird die durch NGR induzierte Aktivierung von MAPKAP-K1-Isoformen durch SB203580 nicht beeinflusst und durch PD98059 nur teilweise gehemmt (sowohl beim Fehlen als auch in Anwesenheit von SB203580). Somit können MAPKAP-K1-Isoformen alleine nicht für die durch NGF induzierte Phosphorylierung von CREB bei Ser133 verantwortlich sein.
Die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 ist auch wesentlich besser mit der Aktivierung von MSK1 in durch TNF stimulierten HeLa-Zellen (vergleiche 11 und 12) und in SK-N-MC-Zellen korreliert, die mit FGF behandelt wurden (14). In beiden Fällen wurden die MAPK- und SAPK2/p38-Pfade aktiviert und sowohl die Unterdrückung der CREB-Phosphorylierung bei Ser133 als auch die Aktivierung von MSK1 erforderten das Vorhandensein sowohl von SB203580 als auch PD98059. In SK-N-MC- und HeLa-Zellen unterdrückte PD98059 vollständig die Aktivierung von MAPKAP-K1 durch FGF bzw. TNF, hatte aber nur einen geringen Einfluss auf die durch diese Wirkstoffe induzierte CREB-Phosphorylierung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass für eine oder mehrere MAPKAP-K1-Isoformen (oder einer bis jetzt noch nicht identifizierten Protein-Kinase) eine Rolle bei der Aktivierung von CREB durch Wachstumsfaktoren oder Phorbolester zwar nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, doch deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass MSK1 (und/oder MSK2) die Aktivierung von CREB durch diese Stimuli vermittelt.
Materialien und Methoden
Materialien. Peptide für Protein-Kinase-Untersuchungen wurden in Dundee von Mr. F.B. Caudwell (MRC unit) synthetisiert, und diejenigen, die verwendet wurden, um Antikörper zu erzeugen, wurden von Dr. G. Blomberg (University of Bristol, U.K.) synthetisiert. Protein-G-Sepharose und Glutathion-Sepharose wurden von Pharmacia (Milton Keynes, UK), alkyliertes Trypsin von Promega (Southampton, UK), Gewebekultur-Reagenzien, Mikrocystin-LR und EGF von Life Technologies Inc. (Paisley, UK), 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) von Sigma-Aldrich (Poole, Dorset, UK), Natriumarsenit und Wasserstoffperoxid (H₂O₂, Aristar grade) von E. Merck (Lutterworth, UK), SB203580 und PD 98059 von Calbiochem (Nottingham, UK) und der pCR 2.1-TOPO-Klonierungsvektor von Invitrogen (Leek, Niederlande) gekauft. Aktiviertes GST-MAPK2/ERK2 (Alessi et al., 1994), GST-SAPK1/JNKIγ (Lawler et al., 1997), GST-SAPK2a/p38a, GST-SAPK2b/p38ß und GST-SAPK3/p38γ (Cuenda et al., 1997), GST-SAPK4/p38δ (Goedert et al., 1997), GST-MAPKAP-K2 (Ben-Levy et al., 1995) und GST-MAPKAP-K3 (Clifton et al., 1996) wurden in Bakterien exprimiert und in vitro maximal unter Verwendung der geeigneten, stromaufwärtigen Kinase-Kinase aktiviert, wie zuvor beschrieben. MAPKAP-K1b wurde aus Kaninchen-Skelett-Muskeln von Dr. N. Morrice in der MRC Unit gereinigt, wie zuvor beschrieben (Sutherland et al., 1993). GST-MAPKAP-Kinase-2 wurde in Bakterien exprimiert und in vitro unter Verwendung von GST-MAPK aktiviert, wie zuvor beschrieben (BenLevy et al., 1995). PKA wurde aus Rinderherz zubereitet, wie dies dem Fachmann bekannt ist.
Antikörper. Die Antikörper MSK1 „A", MSK1 „B" und MSK „C" wurden in Schafen gegen die Peptide LTVKHELRTANLTGHAIKV (entsprechend den Residuen 26 bis 44 von MSK1), FKRNAAVIDPLQFHMGVIR (entsprechend den Residuen 384 bis 402 von MSK1) und KATFHAFNKYKREGFCLQN (entsprechend den Residuen 716 bis 734 von MSK1) erzeugt. Antikörper, die MAPKAP-K2 spezifisch durch Immunoreaktion ausfällen (Clifton et al., 1996) oder sowohl MAPKAP-K1a als auch MAPKAP-K1b (Alessi et al., 1995) wurden in Schafen gegen die Peptide KEDKERWEDVKEEMTS (Residuen 343 bis 358 von menschlichem MAPKAP-K2) und RNQSPVLEPVGRSTLAQRRGIKK (Residuen 712 bis 734 von menschlichem MAPKAP-K1b) erzeugt. Alle in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden auf CH-Sepharose-Säulen affinitätsgereinigt, mit der geeignete Peptide kovalent gebunden waren und sind im Handel von UBI (Lake Placid, USA) erhältlich. Eine monoklonale Antikörper-Erkennung der Flag-Epitope wurde von Anachem (Luton, UK) gekauft. Ein Kaninchen-Polyklonal-Antikörper, der HSP27 erkennt, wurde von Stressgen (York, UK) gekauft.
Pufferlösungen. Puffer A – 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mm EGTA, 1 mm EDTA, 1% (nach Masse) Triton-X 100, 1 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natirumpyrophosphat, 0,27 M Sucrose, 1 M Mikrocystin-LR, 0,1% (Vol.-%) ß-Mercaptoethanol und „vollständige" Proteinase-Inhibitoren-Cocktails (eine Tablette pro 50 ml Boehringer Mannheim, Lewes, UK). Puffer B – 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM ß-Mercaptoethanol.
Klonierung von MSK1 und MSK2. Die Sequenz von MSK1 wurde durch Sequenzieren der menschlichen EST cDNA (AA15 8571) erhalten, die vom I.M.A.G.E.-Konsortium (Lennon et al., 1996) bezogen wurde. Die Mäuse- und Menschen-MSK2-Sequenzen wurden durch Sequenzieren einiger der in Tabelle 1 gezeigten EST cDNA-Klone erhalten. Die Mäuse-MSK2-Sequenz wurde durch Sequenzieren von EST-Inserts erhalten: AA472165; AA389168. Die Human-MSK2-Sequenz wurde durch Sequenzieren von EST-Inserts erhalten: H46268; AA568895. Die DNA-Sequenzierung wurde in einem Applied Biosystems 373A-Automatik DNA-Sequenzer unter Verwendung des Taq dye terminator cycle sequencing kits durchgeführt.
Zubereitung der DNA-Expressions-Konstrukte, die GST-MSK1, Flag-MSK1 und GST-MAPKAP-K1a kodieren. Ein DNA-Konstrukt, das Human-MSK1 mit dem FLAG DYKDDDDK-Epitop-Tag am N-Terminus (Flag-MSK1) exprimiert, wurde in folgender Weise zubereitet: Eine PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wobei als Template die MSK1 cDNA und die Oligonukleotide 5'GAGATCTGCCACCATGGACTACAAGGACGAC GATGACAAGGAGGAGGAGGGTGGCAGCAGCGGCG-3' (eine BgIII-Stelle umfassend, die unterstrichen ist) und 5'-GGATCCATTTCTGTGAACTCTTCTG-3' verwendet wurden. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in einem pTopo-Vektor ligiert. Es wurde eine Dreifach-Ligation durchgeführt, um ein Voll-Längen-Flag-MSK1-Konstrukt in dem pCMV5-Säugetier-Expressions-Vektor (Anderson et al., 1989) durch Ausschneiden des N-Terminal-MSK1-PCR-Produktes aus dem pTopo-Vektor als ein EcoRI-EcoRV-Fragment zu erzeugen und dies zusammen mit dem C-Terminal-EcoRV-KpnI-Fragment von MSK1 in die EcoRI-KpnI-Stellen des pCMV5-Vektors zu einzubinden. Ein GST-MSK1-Expressions-Konstrukt wurde durch Subklonieren der Flag-MSK1 cDNA aus dem pCMV5-Vektor als BgIII-KpnI-Fragment in die BamHI- und KpnI-Stellen des pEBG2T-Expressions-Vektors zubereitet (Sanchez et al., 1994). Voll-Längen-Flag-MSK1-Mutanten (im pCMV5-Vektor), bei denen entweder die N-Terminal- oder die C-Terminal-Kinase-Domänen inaktiviert worden waren, wurden durch Verändern der beibehaltenen Asp195- und Asp565-Residuen in der Subdomäne VII der Kinasedomäne in Ala zubereitet. Dies wurde unter Verwendung der auf PCR basierenden Mega-Primer-Vorgehensweise erreicht. Ein GST-MAPKAP-K1a-Expressions-Konstrukt wurde durch Subklonieren von HA-MAPKAP-K1a aus dem pGEX4T.1-Vektor (wie bei Dalby et al., 1998 beschrieben) als ein NotI-NotI-Fragment in die NotI-Stelle des pEBG2T-Expressions-Vektors zubereitet. Die Struktur aller dieser Expressions-Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung nach einer Reinigung aus Bakterien unter Verwendung des Quiagen-Plasmid-Mega-Kits gemäß den Vorschriften des Herstellers verifiziert.
Expression von GST-MSK1 und GST-MAPKAP-K1a. Zwanzig 10 cm im Durchmesser messende Scheiben mit menschlichen, embryonalen Nieren-293-Zellen wurden kultiviert und jede Scheibe mit 20 μg DNA transfiziert, die entweder GST-MSK1 oder GST-MAPKAP-K1a kodiert, unter Verwendung eines modifizierten Kalziumphosphat-Verfahrens (Alessi et al., 1996b). 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen 16 h ohne Nährstoffe gelassen (serum starved) und dann entweder unstimuliert gelassen oder mit TPA (200 ng/ml, 15 min) stimuliert und es wurde jede Scheibe von Zellen in 1 ml eiskaltem Puffer A lysiert. Die 20 Lysate wurden gepooled bei 4°C 10 min bei 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand 60 min auf einer rotierende Plattform mit 1 ml Glutathion-Sepha rose inkubiert, die zuvor im Puffer A abgeglichen worden war. Die Suspension wurde 1 min bei 3000 × g zentrifugiert, die Kügelchen wurden dreimal mit 10 ml des Puffers A gewaschen, der 0,5 M NaCl enthielt, und dann drei weitere Male mit 10 ml des Puffers B, der 0,27 M Sucrose enthielt. GST-MSK1 oder GST-MAPKAP-K1a wurden aus dem Harz bei Umgebungstemperatur mit drei jeweils 1 ml betragenden Portionen von Puffer B ausgewaschen, der 20 mM Glutathion und 0,27 M Sucrose enthielt. Die. kombinierten ausgewaschenen Substanzen (0,5 mg/ml Protein für GST-MSK1, und 0,1 mg/ml GST-MAPKAP-K1a) wurden in gleiche Teile aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff schlagartig eingefroren und bei –80°C gelagert.
Zelkultur, Stimulation und Zell-Lysis. Menschliche embryonale Nieren-293-Zellen und HeLa-Zellen wurden bis zum Zusammenwachsen kultiviert und 16 h in Dulbecco's Modified Eagle's Medium inkubiert, aus dem fötales Kälberserum weggelassen worden war. HeLa- und SK-N-MC-Zellen wurden bis zum Zusammenfließen auf Scheiben mit 10 cm Durchmesser kultiviert und 2 h in Dulbecco's Modified Eagle's Medium inkubiert, aus dem fötales Kälberserum weggelassen war. PC12-Zellen, die hohe Pegel des NGF-Rezeptors exprimieren und die innerhalb weniger Stunden nach der Zugabe von NGF beginnen, zu differenzieren, wurden 2 h in Dulbecco's Modified Eagle's Medium inkubiert, aus dem fötales Kälberserum weggelassen worden war (Rouse et al., 1994). Aufgrund der hohen Pegel des NGF-Rezeptors in diesen Zellen konnte der PD98059-Inhibitor die durch GNF induzierte Aktivierung von MAPK nur teilweise unterdrücken (Alessi et al., 1995). Die Zellen wurden dann für die in den Figuren-Beschreibungen angegebenen Zeiten mit 50 μM PD98059, 10 μM SB203580, 5 μM Ro318220 oder dem äquivalenten Volumen von DMSO zur Kontrolle inkubiert, so, wie in den Figuren-Beschreibungen angegeben stimuliert und die Zellen dann in 0,1 ml von eiskaltem Puffer A lysiert. Die Lysate wurden augenblicklich in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die Protein-Konzentrationen wurden unter Verwendung von Rinderserum-Albumin als Standard ermittelt (Bradford et al., 1976).
Immuno-Ausfällung und Untersuchung von MSK1, MAPKAP-K2 und MAPKAP-K1. Die Menge von Zell-Lysat, die für jede Immuno-Ausfällung verwendet wurde, war: MSK1 (500 μg Protein), MAPKAP-K2 (50 μg Protein) und MAPKAP-K1a/b (50 μg Protein). Die Lysate wurden bei 4°C 30 min auf einer Schüttelplattform mit 5 μg eines jeden Antikörpers inkubiert, gekoppelt an 5 μl Protein G-Sepharose. Die Immuno-Ausfällungen wurden zweimal mit 1 ml des Puffers A gewaschen, der 0,5 M NaCl enthielt, und einmal mit 1 ml des Puffers B. Die Standard-MSK1- oder MAPKAP-K1a/b-Untersuchung (50 ml) enthielt: gewaschenes Protein-G-Sepharose-Immuno-Präzipitat, 50 ml Tris/HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1% (bezüglich Volumen), 2-Mercaptoethanol, 2,5 μM PKI (Peptid-Inhibitor von zyklischer AMP-abhängiger Protein-Kinase), Crosstide (30 μM), 10 mM Mg(Ac)₂ und 0,1 nM [³²(P]ATP (100–200 cpm/pmol). Die Assays wurden 10 min bei 30°C durchgeführt, wobei die Assay-Röhrchen ständig gerührt wurden, um das Immuno-Präzipitat in Suspension zu halten, dann wurden sie beendet und in der beschriebenen Weise analysiert (Alessi et al., 1994). MAPKAP-K2 wurde in der gleichen Weise mit der Ausnahme untersucht, dass das Peptid KKLNRTLSVA (30 μM) als Substrat verwendet wurde. Die Einheit der Aktivität war diejenige Enzymmenge, welche die Phosphorylierung von einem nmol des Peptid-Substrats in 1 min katalysierte.
Expression von CREB. Der E. coli Stamm BL21, der mit einem DNA-Konstrukt transformiert war, das die 341-Aminosäure-Splice-Variante von CREB kodiert (Gonzalez et al., 1989), das uns freundlicherweise von M.J. Comb (New Englang Biolabs, Boston, USA) überlassen worden war, wurden mit 0,3 mM Isopropyl-(D-thiogalactosid) 5 h bei 37°C induziert. Das GST-CREB wurde auf Glutathion-Sepharose wie zuvor für GST-MAPK2/ERK2 gereinigt (Alessi et al., 1994) und gegen Puffer B dialysiert, der 50% Glycerol enthielt, und bei –20°C gelagert. Die Zubereitung zeigte zwei Hauptbänder bei 62 kDa und 43 kDa sowie eine Reihe von kleineren Bändern. Nur die 62 kDa- und 43kDa-Bänder wurden durch MAPKAP-K1 und MSK1 phosphoryliert. Die Protein-Konzentration von CREB wurde durch Vergleich der Intensität der 62 kDa- und 43 kDa-Bänder in Relation zu einem Rinderserum-Albumin-Standard abgeschätzt.
Immunoblotting für phosphoryliertes CREB und ATF1. Zellextrakte wurden zubereitet und das Immunoblotting dieser Extrakte wurde in der beschriebenen Weise durchgeführt (Tan et al., 1996) unter Verwendung eines phosphor-spezifischen Antikörpers, der CREB erkennt, das an Ser133 phosphoryliert ist, und ATF1, das an Ser63 phosphoryliert ist, und der von UBI (Lake Placid, USA) gekauft worden war. Die Detektion der phosphorylierten CREB- und ATF1-Proteine wurde unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-Reagens (Amersham) durchgeführt.
Phosphorylierung von CREB und HSP27 durch MSK1 und MAPKAP-K1a/b (siehe 8). MSK1 und MAPKAP-K1a, die als GST-Fusions-Proteine exprimiert worden waren, wurden von durch TPA stimulierten 293-Zellen gereinigt (3) und das MAPKAP-K1b wurde von Kaninchen-Skelett-Muskel-Zellen gereinigt (Sutherland et al., 1993). Die in 8 angegebenen Peptide sowie CREB und HSP27 wurden bes 30°C mit 2 U/ml GST-MSK1, GST-MAPKAP-K1a oder GST-MAPKAP-K1b im Puffer B inkubiert, der 10 mM Mg(Ac)₂, 100(M[(³²P]ATP(1 × 10⁶ cpm/nmol), 10 μM PKI und 1 μM Mikrocystin-LR enthielt. Nach einer 10-minütigen Inkubation wurde die Aufnahme von Phosphat in die Peptide unter Verwendung von P81-Phosphocellulose-Papier ermittelt (Alessi et al., 1994) und die Aufnahme von Phosphat in CREB und HSP27 wurde durch die Zugabe von Trichloroessigsäure (0,2 Vol von 100%) gemessen, und die Probe wurde dann 1 h auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde 10 min bei 13.000 × g zentrifugiert, der Überstand weg gegossen und das Pellet fünf mal mit 0,2 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Die aufgenommene ³²P-Radioaktivität wurde dann durch eine Cerenkov-Zählung ermittelt. Um die Stelle in CREB aufzufinden, die durch MSK1 und GST-MAPKAP-K1b phosphoryliert worden war, wurde das Pellet erneut in 0,3 ml von 50 mM Tris/HCl bei einem pH-Wert 8,0, 0,1% (bezüglich des Volumens) reduziertem Triton-X-100 suspendiert, das 2 μg alkyliertes Trypsin enthielt, nach einer Inkubation für 16 h bei 30°C und das Abbauprodukt 5 min bei 13.00 × g zentrifugiert. Der Überstand, der 95% der ³²P-Radioaktivität enthielt, wurde auf einer Vydac-C18-Säule chromatographiert, wie in der Beschreibung von 8 beschrieben. Die Michaelis-Konstanten (Km-Wert) und V_max-Werte wurden von doppelt reziproken Blots von 1/V gegen 1/S ermittelt, wobei V die Anfangsrate der Phosphorylierung und S die Substratkonzentration ist.
Transfektion von MSK1 in 293-Zellen. 293-Zellen wurden auf Scheiben mit 10 cm Durchmesser kultiviert und mit dem pCMV5-Vektor transfiziert, der die Flag-Epitop-mar kierten MSK1-Konstrukte kodiert, unter Verwendung eines modifizierten Kalzium-Phosphat-Verfahrens (Alessi et al., 1996b). 24 h nach der Transfektion wurde von den Zellen das Serum 16 Stunden lang weggenommen und sie wurden mit TPA stimuliert oder einer UV-Strahlung ausgesetzt. Die Zellen wurden dann in 1 ml eiskaltem Puffer A lysiert, bei 13.000 × g 5 min zentrifugiert und das Flag-markierte MSK1-Protein wurde aus gleichen Mengen Lysats (die 25 μg Protein enthielten) unter Verwendung von 2 μg FLAG-Antikörper immuno-ausgefällt, gekoppelt an 5 μl Protein-G-Sepharose.
Die Immuno-Präzipitate wurden inkubiert, gewaschen und, wie oben beschrieben, auf die MSK1-Aktivität untersucht.
Immuno-Elektronen-Mikroskopie. Die Zellen wurden in 8% Paraformaldehyd in 0,2 M Pipes pH 7,2 wenigstens einen Tag fixiert, unter Verwendung eines Gummi-Policeman abgeschabt und als Pellet in 10% Schweinehaut-Gelatine eingebettet. Die Blöcke konnten sich für wenigstens 15 min in 2,1 M Sucrose/PBS voll saugen, bevor sie auf Eisenträgern montiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Ultradünne Kryoschnitte wurden dann auf einem Reichert Ultracut E Dulbecco's Kryomicrotom bei –100°C zubereitet und auf mit Karbon/Formvar beschichteten Gittern montiert. Die Gitter wurden zunächst auf 0,5 Fischhaut-Gelatine/PBS (5 min) inkubiert, gefolgt durch Anti-Flag-Maus-monoklonale Antikörper (15 g/ml); dann Kaninchen-antimaus-Antikörper (2 (g/ml Southern Biotechnology Associates Inc. Birmingham AL, USA) und zuletzt auf Protein-A-8 nm-Gold-Komplex, in der zuvor beschriebenen Weise zubereitet (Lucocq 1993). Waschungen mit PBS folgten jedem der Affinitäts-Reagenzien, die dann selbst in 0,5% Fischhaut-Gelatine/PBS verdünnt wurden. Schließlich wurden nach Waschungen in destilliertem Wasser die Schnitte in Methylcellulose/Uranylacetat kontrastiert.
Das Labelling wurde in der folgenden Weise quantifiziert. Bei einer Vergrößerung von 15.000 wurden Mikrofotografien der gekennzeichneten Zell-Profile genommen, die beide Zytoplasma und Kerne enthielten (diese nuklear gewichteten Schnitte ermöglichten es, Daten von diesen Kompartments in einzelnen Zellen miteinander zu vergleichen). Cytoplasma- und Kernbereiche wurden unter Verwendung einer Punkte-Zählung mit einem quadratischen Gitterraster mit einem Linienabstand von 1 cm abgeschätzt und die Gold-Markierungen gezählt (Lucocq, 1994). Die Fehlerkoeffizienten wurden nach Cochran 1953 berechnet.
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Beispiel 2: Alternative Untersuchungen
Es wurde ein Szintillations-Proximity-Assay (SPA)-System (Amersham International) verwendet, um die Aufnahme von ³²P-Radioaktivität in CREB oder CREBtide zu bestätigen. In diesem System wird die Probe mit Kügelchen gemischt, die ein Szintillationsmittel und Antikörper umfassen, die sich an CREB oder CREBtide binden. Üblicherweise wird dies in einem 96-Well-Format durchgeführt. Die Platte wird dann unter Verwendung eines geeigneten Szintillations-Zählers ausgezählt, wobei bekannte Parameter für die ³²P-SPA-Untersuchungen verwendet werden. Nur ³²P, das sich in der Nähe der Szintillationsmittel befindet, d.h. nur solches, das an CREB oder CREBtide gebunden ist, das dann an den Antikörper gebunden ist, wird detektiert.
Beispiel 3: Untersuchung nach Komponenten, welche die MSK1-Aktivität verändern
Eine Untersuchung wird mit CREB durchgeführt, wie dies in Beispiel 1 oder Beispiel 2 beschrieben ist. Die Verbindungen werden in der Untersuchung getestet, und diejenigen, die zu einer Hemmung oder einer Aktivierung von MSK1 führen, werden für weitere Stu dien selektiert. Um zu bestätigen, dass beobachtete Effekte nicht auf Effekten an CREB beruhen, werden die Verbindungen auf Wirkungen auf die Fähigkeit von MSK1 zur Phosphorylierung eines anderen Substrates als eines Peptidsubstrates, beispielsweise von Crosstide untersucht, das von CREB strukturell verschieden ist. Diejenigen Verbindungen, die ähnliche Effekte auf die Phosphorylierung von CREB und das Peptidsubstrat ausüben, werden selektiert. Die Verbindungen können auch in Bezug auf Wirkungen auf aktiviertes und inaktives CREB getestet werden.
Beispiel 4: Untersuchung nach Polypeptiden, die mit MSK1 in Wechselwirkung treten
Ein Hefe-2-Hybrid-Untersuchungssystem wird aufgebaut, um Polynukleotide zu identifizieren, die Polypeptide kodieren, die in der Lage sind, sich mit MSK1 in einer ausreichend stabilen Weise zu assoziieren; um zu ermöglichen, dass eine transkriptionale Aktivierung auftritt. Die Polynukleotide sind (in getrennten Experimenten) cDNAs, die von mRNA von Zellen kopiert sind, die in der Lage sind, MSK1 zu exprimieren, vor oder nach einer Stimulation, die MSK1 aktivieren kann, und von Zellen, die MSK1 nicht exprimieren. Wechselwirkungen, die nur in einer Untergruppe dieser Zellarten gefunden werden, sind von besonderem Interesse.
Das von dem Polynukleotid kodierte Polypeptid wird durch Sequenzieren des Inserts nach dem Sanger-Verfahren ermittelt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um eine vorhergesagte Aminosäure-Sequenz zu erhalten.
Beispiel 5: Rolle von MAP-Kinase-Kaskaden bei der Vermittlung der Induktion von Cyclooxygenase-2 und Interleukin-1 durch Lipopolysaccharid in RAW-264-Makrophagen.
Lipopolysaccharid (LPS)-Stimulation von RAW-264-Makrophagen löste die Aktivierung von durch Mitogen und Stress aktivierten Protein-Kinasen-1 und -2 (MSK1, MSK2) und ihrer vermuteten Substrate, den Transkriptionsfaktoren CREB und ATF1 aus. Die Aktivierung von MSK1/MSK2 wurde durch Vorinkubation der Zellen mit einer Kombination von zwei Wirkstoffen verhindert, welche die Aktivierung der klassischen MAP-Kinase-Kaskade bzw. SAPK2a/p38-Kaskade unterdrücken, doch war die Hemmung bei Anwesenheit von jeweils nur einem dieser Inhibitoren nur teilweise. Die durch LPS stimulierte Aktivierung von CREB und ATF1, die Transkription der Cyclooxygenase-2 (COX2)- und Interleukin-1ß-Gene (deren Promotoren CRE enthalten) und die Induktion des COX2-Proteins wurden durch die gleiche Wirkstoff-Kombination sowie durch Ro318220, einem potenten Inhibitor von MSK1/MSK2 verhindert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass zwei verschiedene MAP-Kinase-Kaskaden für die durch LPS induzierte Aktivierung von CREB/ATF1 und die Transkription der COX2- und IL-1-Gene geschwindigkeitsbegrenzend sind. Sie deuten auch darauf hin, dass MSK1/MSK2 eine wichtige Rolle bei diesen Vorgängen spielen können und somit interessante Ziele für neue anti-entzündliche Wirkstoffe sind.
Materialien und Verfahren
Materialien. Reagenzien und Antibiotika für die Zellkultur wurden von Life Technologies (Paisley U.K.), PD 98059 von New England Biolabs (Baverly, USA), Ro318220 und SB 203580 von Calbiochem (Nottingham, U.K.), Forskolin und 3-Isobutyl-1-methylxyanthin (IBMX) von Sigma (Poole, U.K.), ein „vollständiger" Proteinase-Hemmer-Cocktail von Boehringer (Lewes, U.K.), ein affinitäts-gereinigter, polyklonaler Ziegen-anti-COX2-Antikörper von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornien), affinitäts-gereinigtes polyklonales Kaninchen-Anti-Phospho-CREB von Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, N.Y.), [γ-³²P]-ATP und ECL-Reagenzien von Amsterdam (Bucks, UK), RNeasy Mini-Kit von QIAGEN Ltd. (West Sussex, U.K.) und das Access-RT-PCR-System von Promega (Southampton, U.K.) gekauft. Mäuse-RAW-264-Makrophagen wurden von der European Cell Culture Collection (Wilts, UK) erhalten, während LPS und UO126 Geschenke von Dr. John Lee (SmithKline Beecham, PA USA) und Dr. Sue Cartlidge (Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, U.K.) waren.
Zell-Kultur und Stimulation. RAW-264-Makrophagen wurden in einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus 10% (V/V) durch Hitze inaktivierten fötalem Kälberserum, 10 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin aufbewahrt. Am Tag vor der Stimulation wurden die Makrophagen mit einer Dichte 2 × 10⁶-Zellen pro 6 cm Platte ausgestrichen und 2 h vor der Stimulation wurde das Medium entfernt und durch 2 ml DMEM ersetzt. Die Zellen wurden dann mit 100 ng/ml LPS oder 20 μM Forskolin plus 10 μM IBMX für die in den Figuren-Beschreibungen angegebenen Zeiten stimuliert. Dort wo dies angegeben ist, wurde SB 203590 (10 μM) und/oder PD98059 (50 μM) oder UO126 (10 μM) oder Ro318220 (5 μM) 1 h vor der Stimulation zugegeben.
Zell-Lysis. Nach der Stimulation wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden in 0,2 ml eiskaltem Lysis-Puffer (50 mM Tris-Acetat pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% (Gew./Vol.) Triton X-100, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumglycerophosphat, 50 mM NaF, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Sucrose, 2 μM Mikrocystin-LR, 1 mM Benzamidin, 0,1% (V/V) 2-Mercaptoethanol und „vollständigem" Proteinase-Inhibitor-Cocktail – eine Tablette pro 50 ml) angelöst. Die Proben wurden dann schlagartig in flüssigem Stickstoff eingefroren und in gleichen Mengen bei –80°C bis zur Analyse gelagert. Die Protein-Konzentrationen wurden gemäß [7] ermittelt.
Immunoblotting. Für das Immunoblotting von CREB wurden Kern-Zell-Extrakte zubereitet, wie in [2] beschrieben und das Immunoblotting wurde durchgeführt unter Verwendung eines phosphor-spezifischen Antikörpers, der CREB erkennt, das an Ser133 phosphoryliert ist, und ATF1, das an Ser63 phosphoryliert ist. Für das Immunoblotting von COX2 wurde Zell-Lysat (30 μg Protein) in SDS denaturiert, auf 10% Polyacrylamidgel elektrophoresziert, auf eine Nitrocellulose-Membran übergeführt und mit einem Anti-COX2-Antikörper (1,0 mg/ml) immuno-geplottet. Die Detektion von phosphoryliertem CREB und ATF1 und COX2 wurde unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Reagenziums (ECL) durchgeführt.
Immuno-Ausfällung und Untersuchung von Protein-Kinasen. Alle Antikörper wurden wie im Beispiel 1 erzeugt. MSK2 wurde aus Zell-Lysaten (1 mg Protein) mit einem Antikörper durch Immunoreaktion ausgefällt, der gegen das Peptid RAPVASKGAPRRANGPLPPS entsprechend den Residuen 753 bis 772 von MSK2 erzeugt worden war. Die Immuno-Präzipitate wurden gewaschen und bei 30°C untersucht, wie im Beispiel 1 beschrieben. Eine Einheit der MSK1- oder MSK2-Aktivität wurde als die Menge definiert, welche die Aufnahme von 1 nmol von Phosphat in das Peptid GRPRTSSFAEG in 1 min katalysiert. Das durch MAP-Kinase aktivierte Protein (MAPKAP-K1, das als auch als p90RSK bekannt ist) wurde durch Immunoreaktion aus den Zell-Lysaten (50 μg Protein) mit einem Antikörper ausgefällt, der gegen das Peptid RNQSPVLEPVGRSTLAQRRGIKK erzeugt worden war, das den Residuen 605 bis 627 von Mäuse-MAPKAP-K1b (RSK2-Isoform) entspricht. Dieser Antikörper fällt MAPKAP-K1a (RSK1) ebenso durch Immunoreaktion aus, wie MAPKAP-K1b [8]. Die Immuno-Präzipitate wurden gewaschen und bei 30°C untersucht, wie in [8] beschrieben. Eine Einheit der MAPKAP-K1-Aktivität wurde als diejenige Menge definiert, welche die Aufnahme 1 nmol von Phosphat in [G245, G246]S6-(218-249)] in 1 min katalysiert (ein Peptid, das eng mit dem C-Terminus von ribosomalem Protein S6 verwandt ist). MAPKAP-K2 wurde in identischer Weise wie MAPKAP-K1 unter Verwendung eines Antikörpers durch Immunoreaktion ausgefällt, der gegen das Peptid MTSALATMRVDYEQIK erzeugt worden war, das den Residuen 356 bis 371 des menschlichen Proteins entspricht. Dieser Antikörper fällt MAPKAP-K2 ebenso durch Immunoreaktion aus, wie MAPKAP-K2 [9]. MAPKAP-K2 wurde untersucht wie bei [10] beschrieben und eine Einheit war die Menge des Enzyms, die die Aufnahme von 1 nmol Phosphat in das Peptid KKLNRTLSVA in 1 min katalysiert.
Reverse Transkript-Polymerase-Kettenreaktionen. Die Gesamt-RNA wurde aus durch LPS stimulierten oder zur Kontrolle dienenden RAW-264-Zellen unter Verwendung des Rneasy-Mini-Kits entsprechend den Vorschriften des Herstellers zubereitet. Die Gesamt-RNA wurde gemessen und es wurden 100 ng revers-transkribiert unter Verwendung der Promega-AMV-Reverse-Transkriptase (5 U/ml) mit den Oligonukleotiden GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG und GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT (die für die „housekeeping-Gene" Hypoxanthinguanin-phosphoribosyl-Transferase, HPRT kodieren), AAGCTCTCCACCTCAATGGACAG und CTCAAACTCCACTTTGCTCTTGA, (das für das IL-1-Gen kodiert) und CAGCAAATCCTTGCTGTTCC und TGGGCAAAGAATGCAAACATC (das für das COX2-Gen kodiert). Die Bedingungen für die PCR-Vermehrung der sich ergebenden First-Stand-DNA-Template waren 94°C, eine Denaturierung für 30 s, ein 60°C Anlassen für 1 min, 68°C Extension für 1 min, 30 Zyklen unter Verwendung von thermostabiler TfI-DNA-Polymerase (5 U/ml) und 1 mM MgSO₄. Die PCR-Produkte zeigten ein einzelnes Band von 352bp für HPRT und ein einzelnes Band von 515bp für COX2.
Ergebnisse
Die durch LPS induzierte Aktivierung von MSK1 und MSK2 wird durch zwei verschiedene MAP-Kinase-Kaskaden vermittelt. LPS aktiviert sowohl die klassische MAPK-Kaskade als auch den SAPK2a/p38-Pfad in Makrophagen, wie durch die Aktivierung von MAPKAP-K1 (das auch als p90 RSK bezeichnet wird) bzw. MAPKAP-K2 gezeigt wird [11 ]. Die Aktivierung von beiden Enzymen ist vorübergehend, wobei ein Scheitel nach 30 bis 60 min vor einem Abfall auf nahezu Basispegel nach 2 h auftritt [11]. In der vorliegenden Studie wurden ähnliche Befunde für MSK1 und MSK2 erhalten. Die Aktivität dieser Enzyme ist in nicht stimulierten Makrophagen vernachlässigbar, steigt aber nach einer Stimulation mit LPS stark an. Aktivierungsscheitel nach 30 bis 60 min und danach ein Abfall (17A und 17B).
Um zu identifizieren, welcher Signal-Übertragungsweg bzw. -Wege die Aktivierung von MSK1 und MSK2 vermittelt bzw. vermitteln, untersuchten wir die Eiflüsse von SB203580 (Sektion 1) und UO126, das, wie PD98059 (Abschnitt 1) die Aktivierung/Aktivität von MKK1 hemmt [12]. Diese Studien zeigten, dass eine Konzentration von UO126, welche die Aktivierung von MAPKAP-K1 vollständig unterdrückt (18C) die Aktivierung von MSK1 und MSK2 nur teilweise hemmt (18A und 18B). In ähnlicher Weise werden MSK1 und MSK2 von SB203580 (18A und 18B) bei Konzentrationen nur teilweise gehemmt, welche die Aktivierung von MAPKAP-K2 (18D) vollständig blockieren. Im Gegensatz hierzu ist die Aktivierung von MSK1 und MSK2 nahezu vollständig unterdrückt, wenn Makrophagen in Anwesenheit sowohl von UO126 als auch SB203580 inkubiert werden (18A und 18B). Diese Beobachtungen zeigten an, dass die durch LPS induzierte Aktivierung von MSK1 und MSK2 durch zwei verschiedene MAP-Kinase-Kaskaden vermittelt wird.
Die durch LPS induzierte Phosphorylierung von CREB und ATF1 wird durch zwei verschiedene MAP-Kinase-Kaskaden vermittelt. Zwei vermutliche physiologische Substrate für MSK1/MSK2 sind die Transkriptionsfaktoren CREB und ATF1. Wie in 19A dargestellt, induziert LPS die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 und die Phosphorylierung von ATF1 bei Ser63. Wie die Aktivierung von MSK1 und MSK2 zeigt die Phosphorylierung von CREB und ATF1 nach 1 h einen Scheitel und kehrt nach 2 h nahezu auf den Basispegel zurück. In ähnlicher Weise wird durch die LPS induzierte Phosphorylierung von CREB und ATF1 durch SB203580 teilweise gehemmt, durch PD98059 teilweise gehemmt und in Anwesenheit von beiden Wirkstoffen vollständig gehemmt (19B).
Die durch LPS stimulierte Induktion von COX2 und IL-1 wird durch zwei verschiedene MAP-Kinase-Kaskaden vermittelt. Der COX2-Promotor enthält ein CRE[5]. Wir beschlossen daher, zu untersuchen, ob die Signal-Pfade, welche die durch LPS stimulierte Induktion dieses Enzyms vermitteln, die gleichen sind, wie diejenigen, die benötigt werden, um CREB zu aktivieren. Das COX2-Protein ist in nicht stimulierten Makrophagen nicht messbar, wird aber 2 h nach einer LPS-Exposition stark induziert. Die Induktion ist nach 4 h maximal und hält wenigstens 8 h an (20A). Die Induktion von COX2 wird durch SB203580 teilweise gehemmt, durch PD98059 teilweise gehemmt und in Anwesenheit von beiden Wirkstoffen nahezu vollständig unterdrückt (20B).
Um diese Ergebnisse durch ein unabhängiges Verfahren zu bestätigen, untersuchten wir die Einflüsse von LPS auf die COX2-Gen-Transkription. LPS induziert in starkem Maße COX2 mRNA, die nach 2 h der Stimulation einen Maximalpegel erreicht, der für wenigstens 8 h aufrechterhalten wird (21A). Die Induktion von COX2-mRNA wird durch SB203580 teilweise unterdrückt, durch PD98059 teilweise unterdrückt und in Anwesenheit von beiden Inhibitoren nahezu vollständig unterdrückt (21B).
Wir untersuchten auch die Signalüberfragungspfade, welche die Induktion des proinflammatorischen Cytokins IL-1 vermitteln, dessen Promotor ebenfalls ein CRE enthält. Der zeitliche Verlauf der Induktion der IL-1-Gen-Transkription kann von dem der Induktion des COX2-Gens nicht unterschieden werden (21A). Interessanterweise wird die Induktion von IL-1-mRNA ebenfalls durch PD98059 teilweise gehemmt, durch SB203580 teilweise gehemmt und in Anwesenheit von beiden Wirkstoffen vollständig gehemmt (21B).
Im Gegensatz hierzu ist die mRNA, die das „housekeeping"-Gen HPRT kodiert, durch LPS, PD98059 und/oder SB203580 unbeeinflusst (21).
Einfluss von Ro318220 auf durch LPS induzierte Aktivitäten. Ro318220 ist ein potenter Inhibitor von MSK1 und einigen anderen Protein-Kinasen, doch viele andere Protein-Kinasen, wie z.B. MAPKAP-K2 sind bei Wirkstoff-Konzentrationen unbeeinflusst, welche die MSK1-Aktivität aufheben ([1,3], weiter unten erläutert). Ro318220 (5 μM) beeinflusst die durch LPS induzierte Aktivierung von MSK1 und MSK2, MAPKAP-K1 oder MAPKAP-K2 nicht (18), was zeigt, dass keine der „stromaufwärtigen" Protein-Kinasen in diesem Signal-Pfad durch diese Verbindung gehemmt werden. Ro318220 (5 μM) verhindert jedoch vollständig die durch LPS induzierte Phosphorylierung von CREB bei Ser133 und ATF1 bei Ser63 (19). Die gleiche Konzentration von Ro318220 unterdrückt auch die durch LPS stimulierte Induktion des COX2-Proteins (4B) und die Transkription der COX2- und IL-1-Gene (21B). Im Gegensatz hierzu wird die mRNA, die HPRT kodiert, durch Ro318220 nicht beeinflusst.
Die Aktivierung von CREB ist nicht ausreichend, um die Synthese von COX2- oder IL-1 zu induzieren. Die Phosphorylierung von CREB bei Ser133 und ATF1 bei Ser63 wird auch durch PKA in vivo katalysiert und kann daher durch Wirkstoffe induziert werden, welche die intrazelluläre Konzentration von zyklischem AMP erhöhen, wie z.B. von Forskolin. Die Stimulation von Makrophagen mit Forskolin triggerf eine Phosphorylierung von CREB und ATF1 die der Stimulation ähnlich ist, die durch LPS induziert wird (22). Dies wird jedoch nicht durch PD98059 plus SB203580 oder durch Ro318220 unterdrückt (Daten nicht dargestellt). Im Gegensatz zu LPS induziert Forskolin nicht das Auftreten einer signifikanten Menge von COX2-Protein. Dieser Befund wird unten noch betrachtet.
Diskussion
In diesem Papier zeigen wir, dass MSK1 und das nahe verwandte MSK2 in RAW-264-Makrophagen vorhanden sind, und das beide Kinasen in Reaktion auf LPS vorübergehend aktiviert werden (17). Die Aktivierungsraten und die Inaktivierung sind ähnlich zu denen von MAPKAP-K1 und MAPKAP-K2, die üblicherweise „stromabwärtige" Reporter der Aktivierung der klassischen MAP-Kinase-Kaskade bzw. des SAPK2a/p38-Pfa des sind. Die durch LPS induzierte Aktivierung von MSK1 und MSK2 wird teilweise durch Wirkstoffe gehemmt, die eine Aktivierung der klassischen MAP-Kinase-Kaskade hemmen, teilweise gehemmt durch SB203580 (einem Inhibitor von SAPK2a/p38) und nahezu vollständig gehemmt, wenn die Makrophagen in Anwesenheit von beiden Wirkstoffen inkubiert werden (18). Die Aktivität von MSK2 in Makrophagen ist wesentlich geringer als die von MSK1 und dies ist auch der Fall bei 293-Zellen, HeLa-Zellen und PC12-Zellen (Ergebnisse nicht dargestellt).
Die Transkriptionsfaktoren CREB und ATF1 können physiologische Substrate von MSK1 (siehe Beispiel 1) und MSK2 [13] sein, und die vorliegende Studie stimmt mit dieser Hypothese ebenfalls überein. Somit wurde CREB und ATF1 vorübergehend mit einer ähnliche Kinetik phosphoryliert, wie die Aktivierung/Inaktivierung von MSK1 und MSK2, wobei die Phosphorylierung dadurch verhindert wurde, dass die Makrophagen mit Inhibitoren sowohl der klassischen MAP-Kinase-Kaskade als auch des SAPK2a/p38 inkubiert wurden, doch nur teilweise durch die Hemmung eines dieser Pfade. Darüber hinaus wurde die Phosphorylierung von CREB auch durch Ro318220 bei Konzentrationen verhindert (3B), welche MSK1 und MSK2 aber nur einige wenige andere Protein-Kinasen hemmen. MAPKAP-K2, MAPKAP-K3 und PKA phosphorylieren ebenfalls CREB und ATF1 an Ser133 bzw. Ser63. Diese Protein-Kinasen können jedoch nicht geschwindigkeitsbegrenzend für die durch LPS induzierte Aktivierung von CREB und ATF1 sein, im Gegensatz zu früheren Berichten [1, 2], da sie in vivo durch die Konzentrationen von Ro318220 nicht beeinflusst werden, die bei diesen Experimenten verwendet wurden (siehe Beispiel 1 und [1]).
Zwei Gene in Makrophagen, die ein CRE enthalten sind diejenigen, die COX2 [5] und IL-1ß [6] kodieren. Wir haben gefunden, dass die durch LPS induzierte Transkription dieser Gene und die Synthese von COX2-Protein durch genau die gleichen Kombinationen von Inhibitoren verhindert wird, welche die Aktivierung von CREB verhindern, d.h. SB203580 plus PD98059 oder Ro318220. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass MSK1/MSK2 die Transkription der COX2- und IL-1ß-Gene zumindest teilweise durch Phosphorylierung von CREB stimulieren können. Es wurde jedoch berichtet, dass auch ein anderer Transkriptionsfaktor, C/EBPß eine kritische Rolle bei der Aktivierung der COX2- [14] und IL-1ß-[15]-Gene bei bestimmten Zelllinien spielt. Darüber hinaus wird berichtet, dass C/EBPß durch die durch MAPK/ERK katalysierte Phosphorylierung eines speziellen Threonin-Residuums in NIH 3T3-Zellen [16] aktiviert wird, und ebenso durch SAPK2/p38 in 3T3-L1-Preadipocyten [17]. Somit können PD98059/UO126 und SB203580 die Transkription von COX2 und IL-1ß dadurch unterdrücken, dass die Aktivierung von C/EPBß sowie die Aktivierung von CREB gehemmt werden. Das Erfordernis von C/EBPß sowie von CREB kann erklären, warum die Aktivierung von CREB alleine, die durch zyklische AMP erhöhende Wirkstoffe induziert wird, nicht ausreichend ist, um eine signifikante Transkription des COX2-Gens zu induzieren. Experimente, die sich mit diesen Möglichkeiten befassen, werden durchgeführt, doch kann die direkte Phosphorylierung von C/EBPß durch MAPKs/ERKs und SAPK2a/p38 nicht für die Einflüsse von Ro318220 auf die Transkription der COX2- und IL-1ß-Gene verantwortlich sein, da diese MAP-Kinase-Familienmitglieder ([3] Ergebnisse nicht dargestellt) und die Signal-Pfade, die zu ihrer Aktivierung führen (18) gegen diesen Wirkstoff resistent sind.
Literatur

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SEQUENCE LISTING

Claims

Ein im Wesentlichen reines Polypeptid (MSK1), das folgendes umfasst: die Aminosäuresequenz
oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon oder ein Fusionsprodukt einer solchen Variante, eines solchen Fragments oder eines solchen Derivates umfasst, die bzw. das zumindest 30% der Enzymaktivität von MSK1 hinsichtlich der Phosphorylierung von Crosstide (GRPRTSSFAEG), CREB, CREBtide (EILSRRPSYRK) oder eines GST-CREB-Fusionsproteins besitzt, oder ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das die Aminosäuresequenz

oder eine Variante, ein Fragment, ein Fusionsprodukt oder ein Derivat hiervon, oder ein Fusionsprodukt einer solchen Variante, eines solchen Fragments oder eines solchen Derivates, die bzw. das wenigstens 30% der Enzymaktivität von MSK1 bezüglich der Phosphorylierung von Crosstide (GRPRTSSFAEG), CREB, CREBtide (EILSRRPSYRK) oder eines GST-CREB-Fusionsproteins besitzt.
Eine Variante des Polypeptids nach Anspruch 1, bei der die Aminosäuresequenz dieser Variante wenigstens zu 65% mit der gegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Eine Variante des Polypeptids nach Anspruch 2, bei der die Aminosäuresequenz dieser Variante zumindest zu 75% mit der gegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Eine Variante des Polypeptids nach Anspruch 3, bei der die Aminosäuresequenz der Variante zumindest zu 90% mit der gegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Rekombinantes Polynukleotid, das für die Exprimierung eines Polypeptids geeignet ist, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert wurde, und das ein Polynukleotid umfasst, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Polynukleotid, das eine Fusion des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit irgendeinem anderen Polypeptid kodiert.
Vektor, der für die Replikation einer eukaryotischen Säugetier- oder Menschenzelle geeignet ist und ein Polynukleotid umfasst, welches das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, wobei es sich bei diesem Vektor nicht um ein EST-Klon AA389168 oder AA678670 handelt.
Polynukleotid oder Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, das bzw. der keine Introns enthält.
Wirtszelle, die ein rekombinantes Polynukleotid oder einen replizierbaren Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 8 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder einer Variante, eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon, oder eines Fusionsproduktes dieser Variante, dieses Fragments oder dieses Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 9 umfasst, welches dieses Polypeptid oder eine Variante, ein Fragment, ein Derivat oder ein Fusionsprodukt hiervon oder ein Fusionsprodukt einer Variante oder eines Fragments oder eines Derivats exprimiert, und Isolieren dieses Polypeptids oder dieser Variante, dieses Fragments, dieses Derivats oder dieses Fusionsproduktes hiervon oder des Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder eines Derivats.
Polypeptid oder Variante, Fragment, Derivat oder Fusionsprodukt hiervon oder Fusionsprodukt der Variante, des Fragments oder des Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die bzw. das durch das Verfahren nach Anspruch 10 erhalten werden kann.
Antikörper, der bezüglich eines Polypeptids reaktiv ist, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 4 und 11 definiert wurde.
Antikörper nach Anspruch 12, wobei der Antikörper nicht mit einer anderen Zwei-Kinase-Domän-Protein-Kinase reagiert.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 1 moduliert, wobei das Verfahren das In-Berührung-Bringen einer Verbindung mit diesem Polypeptid oder einer Variante, eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes einer Variante, eines Fragments oder eines Derivats hiervon nach Anspruch 1 und das Ermitteln umfasst, ob die Aktivität des genannten Polypeptids im Vergleich zur Aktivität der besagten Proteinkinase oder der Variante, des Fragments, des Derivats oder des Fusionsprodukts hiervon oder eines Fusionsprodukts einer Variante, eines Fragments oder eines Derivats hiervon in Abwesenheit von dieser Verbindung verändert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Aktivität vermindert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Aktivität erhöht ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die sich an CREB oder ATF1 oder C/EBPβ bindet und dessen Aktivierung durch das Polypeptid nach Anspruch 1 entweder erhöht oder vermindert, wobei das Verfahren die Ermittlung umfasst, ob eine Verbindung die Wechselwirkung von CREB oder ATF1 mit dem Polypeptid nach Anspruch 1 erhöht oder verhindert, oder die Ermittlung, ob die Verbindung die Aktivierung von CREB oder ATF1 oder C/EBPβ durch das Polypeptid nach Anspruch 1 blockiert.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivierung eines Polypeptids nach Anspruch 1 durch MAPK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38β2 blockiert, wobei das Verfahren die Ermittlung, ob eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen (a) einem Polypeptid, einem Fragment, einer Variante, einem Derivat oder einem Fusionsprodukt hiervon oder einem Fusionsprodukt eines Fragments, einer Variante oder eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und (b) MAPK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38β2 erhöht oder unterbricht, oder die Ermittlung, ob die Verbindung die Aktivierung des besagten Polypeptids oder einer Variante, eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes hiervon oder eines Fusionsproduktes eines Fragments, eines Derivats oder eines Fusionsproduktes durch MAPK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38β2 blockiert.
Verwendung von MAPK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38β2 für die in-vitro erfolgende Aktivierung des Polypeptides nach Anspruch 1.
Verfahren zum Identifizieren eines Polypeptids, das mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 in Wechselwirkung tritt, wobei das Verfahren folgendes umfasst: 1) In-Berührung-Bringen a) des Polypeptids nach Anspruch 1 mit b) einer Zusammensetzung, die ein solches wechselwirkendes Polypeptid enthalten kann, 2) Detektieren des Vorhandenseins eines Komplexes, der das Polypeptid nach Anspruch 1 und ein wechselwirkendes Polypeptid enthält, und wahlweise 3) Identifizieren irgendeines wechselwirkenden Polypeptids, das an das Polypeptid nach Anspruch 1 gebunden ist.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Aktivierung eines Polypeptids nach Anspruch 1 blockiert, durch ein Polypeptid, das durch das Verfahren nach Anspruch 20 identifiziert wird, wobei das Verfahren die Ermittlung, ob eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen a) einem Polypeptid nach Anspruch 1 und b) dem durch das Verfahren nach Anspruch 20 identifizierten Polypeptid erhöht oder unterbricht, oder die Ermittlung umfasst, ob die Verbindung die Aktivierung des Polypeptids nach Anspruch 1 durch das durch das Verfahren nach Anspruch 20 identifizierte Polypeptid blockiert.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1, bei einer Screening-Untersuchung nach Verbindungen, welche die Aktivität des Polypeptids oder die Aktivierung des Polypeptids modulieren.
Teilesatz, der ein Polypeptid nach Anspruch 1, der (1) Crosstide (GRPRTSSFAEG), CREBtide (EILSRRPSYRK), CREB, ATF1 oder ein CREB- oder ATF1-Fusionsprotein und/oder MAPK2, SAPK2a/p38 oder SAPK2b/p38β2 umfasst.
Verwendung von (1) SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorophenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) und (2) PD98059 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten, der eine Modulation der Aktivität von COX2 benötigt.
Verwendung von SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorophenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der eine Modulation der Aktivität von COX2 benötigt, wobei dem Patienten PD98059 verabreicht worden ist, verabreicht wird oder verabreicht werden wird.
Verwendung von PD98059 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der eine Modulation der Aktivität von COX2 benötigt, wobei dem Patienten SB203580 oder FHPI (4-(4-Fluorophenyl)-2-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol) verabreicht worden ist, verabreicht wird oder verabreicht werden wird.