JP2002518036A - ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの用途 - Google Patents

ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの用途

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Abstract

(57)【要約】 ドラッグのスクリーニングアッセイに有用であり、描写に提供されたアミノ酸配列を有する本質的に純粋な二つのキナーゼドメインを有するプロテインキナーゼ、それの変異体、融合体、フラグメント又は融合体。ＣＲＥＢ及びＣＯＸ２活性の調節におけるそれの応用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポリペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの用途、特に二つのキナ
ーゼドメインを有するプロテインキナーゼ（ｔｈｅ ｔｗｏ−ｋｉｎａｓｅ ｄ
ｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）ファミリーのメンバーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
１０のマイトジェン活性（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテイン
キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーメンバーは哺乳類細胞で同定されてきている（
Ｃｏｈｅｎ，１９９７参照）。これらのうちの二つ、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１及び
ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、受容体がプロテインチロシンキナーゼであるポリペプ
チド成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）及び腫瘍促進性（ｔｕｍｏｕｒ
ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）ホルボールエステルにより強く活性化されるが、（ほと
んどの細胞環境（ｃｅｌｌ ｃｏｎｔｅｘｔｓ）においては）ストレス刺激（ｓ
ｔｒｅｓｓ ｓｔｉｍｕｌｉ）及び炎症サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａ
ｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）によってはほとんど活性化されない。対称的に
、他のＭＡＰＫファミリーメンバーは、ストレスシグナル（ｓｔｒｅｓｓ ｓｉ
ｇｎａｌ）及び炎症サイトカインにより強く活性化されるが、（ほとんどの細胞
環境においては）ポリペプチド成長因子及びホルボールエステルによりほんの少
し活性化されるだけである。この理由から、それらはしばしばストレス活性（ｓ
ｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫｓ）と言われ
る。
【０００３】 この分野の主要な試みは生理的基質とＭＡＰＫｓ及びＳＡＰＫｓのそれぞれの
役割を同定することであるが、多くの基質がそれ自身複数の生理的役割を有する
プロテインキナーゼであることから問題が生じる。従って、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ
１及びＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、ＭＡＰＫ活性（ＭＡＰＫ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
）プロテインキナーゼ−１ａ，１ｂ及び１ｃ（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃ，
またＲＳＫ１／２／３として知られる）として知られる三つの密接に関係するプ
ロテインキナーゼを活性化する（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ等．，１９８８及びＺｈａｏ
等１９９５）。一方ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βは、ＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ等．，１９９４；Ｒｏｕｓｅ等．，１９９６
）及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６；ＭｃＬａｕｇｈｌ
ｉｎ等．，１９９６）と名称付けされる二つの密接に関係する酵素を活性化する
。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）はＭＡＰＫｓ／ＥＲ
Ｋｓのためのインビボでの基質であり、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３はＳＡＰＫ２
／ｐ３８のためのインビボでの基質であるということがいくつかの証拠ライン（
ｌｉｎｅｓ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）からわかる。例えば、上流活性化因子（
ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＭＡＰＫキナーゼ−１（ＭＫＫ１）の
活性化を阻害することによりＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓの活性化を抑制するドラッグ
ＰＤ９８０５９もまた、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームの活性化を阻害する
が（Ａｌｅｓｓｉ等．，１９９５）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の活性化を阻害
しない（Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６）。
【０００４】 反対に、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特異的阻害剤で
あるドラッグＳＢ２０３５８０は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の活性化を阻害す
る（Ｃｌｕｅｎｄａ等．，１９９５；Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６）。
【０００５】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームは、一つのポリペプチド内に二つのプロテ
インキナーゼドメインをそれぞれ含んでいる点で異質であり、Ｃ末端キナーゼド
メインの一つの役割は、Ｎ末端キナーゼドメインが外因性基質（ｅｘｏｇｅｎｏ
ｕｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）をリン酸化できるようにＮ末端キナーゼドメイン
を活性化することである（Ｂｊｏｒ ｂａｅｋ等．，１９９５；Ｖｉｋ及びＲ
ｙｄｅｒ，１９９７；Ｄａｌｂｙ等．，１９９８）。ＣＯＳ１細胞においてホル
ボールエステルに誘導される（Ｔｈｅ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化は六つの残基（Ｓｅｒ２２２，Ｔｈｒ３６
０，Ｓｅｒ３６４，Ｓｅｒ３８１，Ｔｈｒ５７４及びＳｅｒ７３７）のリン酸化
に付随し、六つの残基のうちの四つ（Ｓｅｒ２２２，Ｓｅｒ３６４，Ｓｅｒ３８
１及びＴｈｒ５７４）が活性化に重要である。ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓはＣ末端ド
メインのＴｈｒ５７４及び二つのキナーゼドメイン間に位置するＴｈｒ３６０及
びＳｅｒ３６４をリン酸化する。Ｔｈｒ５７４のリン酸化はＣ末端ドメインを活
性化し、それからＳｅｒ３８１をリン酸化する。Ｓｅｒ２２２もまたリン酸化さ
れるなら、Ｓｅｒ３６４及びＳｅｒ３８１の結合リン酸化（Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉ
ｎｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）はＮ末端ドメインの活性化を引き起
こす（Ｄａｌｂｙ等．，１９９８）。Ｓｅｒ２２２キナーゼの同定は不明確であ
る。
【０００６】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（ＲＳＫ２）遺伝子における突然変異を不活性化するこ
とがコフィンローリー症候群（Ｃｏｆｆｉｎ Ｌｏｗｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）
，進行性骨格異常（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｋｅｌｅｔａｌａｂｎｏｒｍａ
ｌｉｔｉｅｓ）及び厳しい精神遅滞に関係する病気の原因になることから、細胞
機能におけるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の重要性が指摘されている（Ｔｒｉｖｉｅｒ等
．，１９９６）。しかしながら、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームは多くのタ
ンパク質をインビトロでリン酸化するが、生理的役割はまだ定義付けされていな
い。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、インビトロで転写因子ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答因
子結合タンパク）をリン酸化する、すなわちインビボで活性化を引き起こすと知
られる残基（Ｓｅｒ１３３）をリン酸化する（Ｘｉｎｇ等．，１９９６）。ＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１ｂはまた、ＣＲＥＢｔｉｄｅ（Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致す
る合成ペプチド）に作用する主要なキナーゼであると報告されており、ＣＲＥＢ
ｔｉｄｅはＮＧＦ刺激性（ＮＧＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）ＰＣ １２細胞から
調整されるライゼートで検出できる（Ｇｉｎｔｙ等．，１９９４；Ｘｉｎｇ等．
，１９９６）。さらに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードを活性化するとともにＰＤ
９８０５９により阻害されるシグナルによって、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢの
リン酸化が誘導される（Ｐｅｎｄｅ等．，１９９７）。これらのことから、ＣＲ
ＥＢがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の生理的基質となるかもしれないが、ＭＡＰＫｓ／Ｅ
ＲＫｓの“下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）”に存在する別のプロテインキナーゼ
によりＣＲＥＢがリン酸化されるという可能性は除外されない。
【０００７】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３もまたインビトロにおいてＳｅｒ１３３でＣＲＥＢ
をリン酸化する（Ｔａｎ等．，１９９６）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、繊維芽細胞
成長因子で刺激化される（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）又は亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏ
ｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）とのインキュベーションによりストレスされる（
ｓｔｒｅｓｓｅｄ）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞から調整されるライゼートで検出される
主要なＣＲＥＢｔｉｄｅキナーゼとなる（Ｔａｎ等．，１９９６）。さらに、こ
れら刺激（ｓｔｉｍｕｌｉ）はＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のＳｅｒ１３３のリン酸化を
誘導するが、ＳＢ ２０３５８０によりリン酸化は阻害される（Ｔａｎ等．，１
９９６）。これらのことから、ＣＲＥＢはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の生理的基
質になると思われるが、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の“下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）
”に存在する別のプロテインキナーゼによりＣＲＥＢがリン酸化されるという可
能性はこのデータにより除外されない。
【０００８】 ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１及びＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２はインビボでＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ１アイソフォームをリン酸化し（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３をリン酸化しない
）、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βはインビボでＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ２／Ｋ３をリン酸化する（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１をリン酸化しない）。しか
しながら、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓ及びＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８両方によりインビト
ロ及びインビボで活性化され、二つの密接に関係するプロテインキナーゼがより
最近になって同定されてきている。これらのことからＭＡＰＫ統合（ＭＡＰＫ−
ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）キナーゼ−１及び−２（ＭＮＫ１，ＭＮＫ２）と名称
付けられる（Ｆｕｋｕｎａｇａ及びＨｕｎｔｅｒ，１９９７；Ｗａｓｋｉｅｗｉ
ｃｚ等．，１９９７）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３様、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は
一つのキナーゼドメインを有する酵素である。ＭＮＫ１の一つの生理的基質は、
タンパク合成開始因子（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔ
ｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）ｅｌＦ４Ｅである。インビトロにおいて、ＭＮＫはＳｅ
ｒ２０９でｅｌＦ４Ｅをリン酸化する（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ等．，１９９７）
。この残基は、成長因子又はホルボールエステルによりインビボでリン酸化が誘
導される残基である。Ｓｅｒ２０９のリン酸化を誘導する成長因子はＰＤ ９８
０５９により阻害され、一方ストレスシグナルにより誘導されるＳｅｒ２０９の
リン酸化はＳＢ ２０３５８０により抑制される（Ｗａｎｇ等．，１９９８）。
【０００９】 我々は二つの新しいプロテインキナーゼの同定及びキャラクタリゼーション（
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を記載する。前記キナーゼは一つのポリペ
プチド内に二つのプロテインキナーゼドメインを含むＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソ
フォームに類似する。しかしＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と異なり（ＭＮＫｓと類似）、
それらはインビトロ及びインビボでＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓ又はＳＡＰＫ２／ｐ３
８のいずれかにより活性化される。この理由から、それらはマイトジェン及びス
トレス活性（Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プ
ロテインキナーゼ−１及び−２（ＭＳＫ１，ＭＳＫ２）と名称付けされている。
我々はまた、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３よりもむしろ、
ＭＳＫ１及び／又はＭＳＫ２が成長因子及びストレスシグナルにより転写因子Ｃ
ＲＥＢ及びＡＴＦ１の活性化を仲介すると思われる証拠を述べる。
【００１０】 細菌感染（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の間ずっと、プロスタ
グランジン、ロイコトリエンス、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及びＴＮＦ
のような炎症伝達物質（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）が、
グラム陰性菌の細胞壁の成分となるリポ多糖（ｌｉｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ）（ＬＰＳ；エンドトキシン）がＣＤ１４受容体に相互作用する際に引き起
こされるシグナル導入経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔ
ｈｗａｙ）を経由して、マクロファージに産生される。これら炎症伝達物質は細
菌感染と戦うのに必須な免疫応答を開始するのに重要な役割を果たす。しかしな
がら、それらの過剰産生はまた、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａ
ｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）及び敗血症性ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ
）の原因になる可能性がある。これらの理由から、炎症伝達物質の産生を抑制で
きるドラッグがこれらの症状を処置するのに有用となる。シクロオキシゲナーゼ
−２（ＣＯＸ−２）はプロスタグランジン及びロイコトリエンス産生における律
速段階を触媒し、マクロファージがＬＰＳにさらされる場合に合成される（Ｄｕ
ｂｏｉｓ等（１９９８）ＦＡＳＥＢ Ｊ １２，１０６３−１０７３）。
【００１１】 ＣＲＥＢは誘導（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）シクロオキゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）
遺伝子の転写に関与するかもしれない。ＣＯＸ２は転写又は翻訳レベルで調節さ
れるようである。ＣＯＸ２タンパクは不活性化又は迅速に破壊されるようである
（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ等（１９７９）“組織におけるプロスタグランジン
合成の抑制（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ）”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２
，３５１０−３５１７参照）。ｍＲＮＡもまた不安定かもしれない：ＣＯＸ２ｍ
ＲＮＡの長３’非翻訳領域は、迅速なｍＲＮＡ破壊に関する初期応答遺伝子（ｅ
ａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｓ）の特性をもつショー−カメン配列（
ｔｈｅ Ｓｈａｗ−Ｋａｍｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＡＵＵＵＡ）の多重コピ
ー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）を含んでいる（Ｋｏｓａｋａ等（１９９
４）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２１，８８９−８９７）。
【００１２】 ＣＯＸ２発現のＣＲＥＢ調節はＭｏｎｔｍｌｎｙ（１９９７）Ａｎｎ Ｒｅｖ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ６６，８０７−８２２に議論されている。
【００１３】 ＣＲＥＢはまた、ｃ−Ｆｏｓ（又はＦｏｓ）遺伝子の発現を誘導する。この遺
伝子は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ）の調節に重要である。ｃ−Ｆｏｓの異常調節（Ａｂｅｒｒａｎｔ ｃ
ｏｎｔｒｏｌ）が癌に関与するかもしれなし、Ｆｏｓ転写の阻害がほとんどの癌
に適応できる抗癌療法（ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と
して有用になるかもしれない。
【００１４】 ＩＬ−１のプロモーターは環状ＡＭＰ応答因子を含んでいる（Ｃｈａｎｄｒａ
等（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５，４５３５−４５４３）。
【００１５】 ＡＴＦ１はＣＲＥＢと同様の役割を担いそうであり、ＣＲＥＢと互換性がある
かもしれない。
【００１６】 一つのポリペプチド内に二つのプロテインキナーゼドメインを含む新しいマイ
トジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ（いわゆるＭＳＫ１）及び密接に
関係する類似体（いわゆるＭＳＫ２）を我々は同定している。ＭＳＫ１（８０２
残基）は、ＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１，
またはｐ９０ＲＳＫと名称付けされる）の全アミノ酸配列と４０％の相同性を示
し、“二つのキナーゼドメイン”を有する酵素である。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端
キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の対応するドメインと５４％及び４４
％の相同性を有し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の四つの鍵となる活性リン酸化部位（ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）がＭＳＫ
１に保持されている。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１同様（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ等（１９９８
））、ＭＳＫ１はＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２によりインビトロで活性化される。しか
し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と異なり、ＭＳＫ１はまたストレス活性プロテインキナ
ーゼ２ａ（ＳＡＰＫ２ａ，またはｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２と名称付
けされる）により活性化される。これらの点に一致して、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１が
成長因子／ホルボールエステル刺激によってのみはっきりと活性化されるにもか
かわらず、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＭＳＫ１はポリペプチド成長因子／
ホルボールエステル刺激、又は、ＵＶ放射，酸化的及び化学的ストレス（ｏｘｉ
ｄａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ）への照射（ｅｘｐｏ
ｓｕｒｅ）のどちらかにより２９３細胞において活性化される。成長因子／ホル
ボールエステル刺激によるＭＳＫ１の活性化は、ＭＳＰＫカスケードの活性化を
抑制するドラッグＰＤ ９８０５９により阻害される。一方、ＵＶ放射，酸化的
及び化学的ストレスによるＭＳＫ１の活性化は、ＳＢ ２０３５８０，すなわち
ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８βの特異的阻害剤により大きく
阻害される。ヒーラ細胞（Ｈｅｒａ ｃｅｌｌｓ）において、ＴＮＦがＭＡＰＫ
／ＥＲＫ及びＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの両方を活性化するので、このアゴ
ニストによるＭＳＫ１の活性化を抑制するのにＰＤ ９８０５９及びＳＢ ２０
３５８０の両方が必要とされる。ホルボールエステル又はＵＶ放射のどちらかに
よるＭＳＫ１の活性化は、Ｎ末端又はＣ末端キナーゼドメインのどちらかにおい
て単不活性化変異（ｓｉｎｇｌｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏ
ｎｓ）を作製することにより廃止される。ＭＳＫ１は細胞の核に局在化され、Ｓ
ｅｒ１３３で転写因子ＣＲＥＢをリン酸化する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
インビトロにおいては、ＣＲＥＢが、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化する
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりもＭＳＫ１のより優れた基質と
なる。Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致する合成ペプチドは、極度に低いＫｍ値（
＜０．１μＭ）でリン酸化される。我々は、ＥＧＦ，ＵＶ及びＴＮＦにより誘導
される（ｔｈｅ ＥＧＦ，ＵＶ ａｎｄ ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＣＲＥＢ及
びＡＴＦ１の活性化に関するＳＢ ２０３５８０及びＰＤ ９８０５９の効果に
は、ＭＳＫ１活性化に関するこれら阻害剤の効果が反映されることを示す。他の
観測に加えて、これらのことから、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２は、成長因子及びスト
レスにより誘導されるＣＲＥＢの活性化を仲介するように思われる。
【００１８】 我々は、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２が、炎症伝達物質ＣＯＸ−２及びＩＬ−１の遺
伝子の転写、及び、炎症ＣＯＸ−２タンパクの誘導を調節するかもしれないとい
う証拠を示す。我々は、マクロファージがＬＰＳで刺激される場合にＭＳＫ１及
びＭＳＫ２両方が活性化されるということを示す。ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の活性
化及び活性を抑制する化合物が、ＬＰＳに誘導されるＣＲＥＢ及びＡＴＦ１及び
／又は転写因子Ｃ／ＥＢＰβのリン酸化，ＣＯＸ−２及びＩＬ−１遺伝子の転写
，及びＣＯＸ−２タンパクの誘導を阻害するかもしれない。
【００１９】 ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１はＣＯＸ−２の転写に必須のようである；ＭＳＫ１の阻害
剤は、ＣＯＸ２が関係する、又は、非ステロイド抗炎症（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉ
ｄａｌ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＳＡＩＤｓ），特にＣＯ
Ｘ２選択的阻害剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）が有用とされ
る病気又は症状の治療に有用かもしれない。そのような病気又は症状には、炎症
プロセス（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）が関与すると思わ
れる、又は、無痛覚症（ａｎａｌｇｅｓｉａ）が有利となる病気又は症状が含ま
れる。
【００２０】 ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１はｃ−Ｆｏｓの転写に必須なので、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の
阻害剤がｃ−Ｆｏｓの関係する病気又は症状の治療に有用となるかもしれない。
そのような病気又は症状には、癌が含まれる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の側面は、アミノ酸配列 又は 又は 又は 又は 又はそれの変異体、フラグメント、融合体、派生物、又は前記変異体、フラグメ
ント、派生物の融合体を有する本質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）純粋な
（ｐｕｒｅ）ポリペプチドを提供する。アミノ酸配列が上述されるようなポリペ
プチドが、マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ
ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ
）であると考えられる。
【００２２】 上述されたようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＭＳＫ１（マイトジ
ェン及びストレス活性プロテインキナーゼ１；一番目の配列に示される）又はＭ
ＳＫ２（マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ２；二番目の配列は
ヒトＭＳＫ２の一部の配列である，三番目の配列はヒトＭＳＫ２のスプライス変
異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ）の一部の配列である，四番目の配列はヒ
トＭＳＫ２の一部の配列であり、五番目の配列はマウスＭＳＫ２の一部の配列で
ある）として本明細書に参照される。
【００２３】 ＭＳＫ１のアミノ酸配列はまた、図１に示される（ＭＳＫ１）。ヒトＭＳＫ２
の一部のアミノ酸配列もまた、図２ｃに示される。マウスＭＳＫ２はヒトＭＳＫ
２の変異体であり、マウスＭＳＫ２もまた図２ｃに示される。
【００２４】 “本質的に純粋（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）”とは、前記ポリ
ペプチドに他のタンパク質が本質的にフリーであることを我々は意味している。
従って、前記ポリペプチドとして重量にするとタンパク質含量（ｐｒｏｔｅｉｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ）の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに
好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％を含有す
るいずれかの組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含み、最も好ましくはタンパ
ク質含量の９５％が前記ポリペプチドである。
【００２５】 従って、本発明はまた、前記ポリペプチドと混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ
）を含有する組成物を含んでいる。前記混入物は、重量にして前記組成物の７０
％より少ない、好ましくは前記組成物の５０％より少ない、さらに好ましくは３
０％より少ない、またさらに好ましくは１０％より少なく、最も好ましくは重量
にして５％より少ない。
【００２６】 本発明はまた、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で他の成分が混ぜ合わせられた
場合の本質的に純粋な前記ポリペプチドを含むが、前記他の成分は前記ポリペプ
チドが存在する細胞中の全ての成分ではない。
【００２７】 変異体（Ｖａｒｉａｎｔｓ）（自然に起こる（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕ
ｒｉｎｇ）か又はそれ以外）は、以下に示す組換ポリヌクレオチドを用い、その
技術分野においてよく知られたタンパク質工学及び部位特異的変異誘発（ｓｉｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の方法を使用して作製されて
もよい。
【００２８】 “前記ポリペプチドのフラグメント”に関して、活性を保持する、又は、例え
ば抗体作製（ｒａｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）又は結合測定法（ａ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）に用いる他の方法において有用となるあらゆるフラ
グメントを含んでいる。
【００２９】 “前記ポリペプチドの融合体”に関して、何らかの他のポリペプチドが融合さ
れた前記ポリペプチドを含んでいる。例えば、前記ポリペプチドの精製を容易に
するために、前記ポリペプチドはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）又はプロテインＡのようなポリペプチドに融合されてもよい。ＧＳＴへのそ
のような融合体の一例は実施例１に与えられる。同様に、前記ポリペプチドは、
Ｈｉｓ６のようなオリゴ−ヒスチジンタグ（ｏｌｉｇｏ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ
ｔａｇ）、又は、よく知られたマイクタグエピトープ（Ｍｙｃ ｔａｇ ｅｐｉ
ｔｏｐｅ）のような抗体により認識されるエピトープに融合されてもよい。前記
ポリペプチドの変異体、フラグメント又は派生物いずれかへの融合体もまた、本
発明の範囲に含まれる。
【００３０】 ポリペプチドの“変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）”とは、保存的（ｃｏｎｓｅｒ
ｖａｔｉｖｅ）又は非保存的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）いずれかの
挿入、欠損及び置換を含んでいる。特に、そのような変化によって前記ポリペプ
チドの活性が本質的に変わらないポリペプチドの変異体を含んでいる。ＭＳＫ１
又はＭＳＫ２の変異体はまた、Ｒｓｋ１／２／３としても知られるヒトＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ＭＳＫ
１又はＭＳＫ２の変異体はまた、ＷＯ ９８／０３６６２に開示されるようなキ
イロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｐ７
０ Ｓ６キナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。このポリペ
プチドは、Ｎ末端ドメインにおいてＭＳＫ１又はＭＳＫ２とほぼ５５％の相同性
があり、全体ではほぼ２０％の相同性がある。
【００３１】 上述した配列の全て（すなわち、本質的に全長のＭＳＫ１）と、又は、上述し
たヒト又はマウスＭＳＫ２配列の全てを本質的に含む全長ヒト又はマウスＭＳＫ
２とを本質的に含む変異体が、特に有用になることが認識されるだろう。“本質
的に全て（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｌｌ）”には、前記配列の少なくと
も８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％，９８％，１００％（す
なわち全て）が意図される。“本質的に全長（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆ
ｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）”には、全長ポリペプチド配列の少なくとも８０％、好
ましくは９０％、さらに好ましくは９５％，９８％又は１００％（すなわち全て
）を含むことが意図される。
【００３２】 “同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）”に
は、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌ
ｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；及びＰｈｅ，Ｔｙｒのような組合せ（ｃ
ｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）が意図される。
【００３３】 ポリペプチド変異体が、上述したアミノ酸配列と少なくとも６５％、さらに好
ましくは少なくとも７５％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、もっとさ
らに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は９９％
の相同性をもつアミノ酸配列を有するなら、特に好ましい。
【００３４】 二つのポリペプチド間のパーセント配列相同性（Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、例えばウィスコンシン大学遺伝子コン
ピューティンググループ（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰプログラ
ムのような適するコンピュータープログラムを用いて決定される。そして、配列
（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）が最適に配列される（ａｌｉｇｎｅｄ）ポリペプチドに
ついてパーセント相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が算出される。
【００３５】 代わりとしてクラスタルＷプログラム（ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ｐｒｏ
ｇｒａｍ）を用い、配列（Ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が実施されてもよい（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等．，１９９４）。用いられるパラメーターは以下の通りであ
る： Ｆａｓｔ ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：Ｋ
−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ；１，ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ；５，ｇａｐ
ｐｅｎａｌｔｙ；３，ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｏｐ ｄｉａｇｏｎａｌｓ；５
．Ｓｃｏｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ｘ ｐｅｒｃｅｎｔ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａ
ｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ
；１０，ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ；０．０５． Ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ．
【００３６】 従って、これらパラメーターを用いると、ＭＳＫ１は、ＮＣＢＩデータベース
において最も近接した類似体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）；ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
，ｂ及びｃと全体で４２−４４％の相同性を有する。
【００３７】 本発明の詳しい実施例は、アミノ酸配列 からなる本質的に純粋なヒトＭＳＫ１ポリペプチド、又は、自然に起こる（ｎａ
ｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）それのアレリック（ａｌｌｅｌｉｃ）変
異体を提供する。そのアミノ酸配列はまた、ポリヌクレオチド配列の翻訳として
図１に示される。
【００３８】 本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列 又は 又は からなる本質的に純粋なＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそれのアレ
リック変異体を提供する。
【００３９】 本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列 又は を含む本質的に純粋な全長ヒトＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそれ
のアレリック変異体を提供する。上述した配列のそれぞれが、全長ヒトＭＳＫ２
の全部のアミノ酸配列ではないと認識されるだろう。
【００４０】 本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列 を含む本質的に純粋な全長マウスＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそ
れのアレリック変異体を提供する。上述した配列が、全長マウスＭＳＫ２の全部
のアミノ酸配列ではないと認識されるだろう。
【００４１】 必須ではないけれども、前記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、
融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の融合体が、Ｃｒｏｓｓｔｉｄ
ｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ；実施例１参照）、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ
（Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致する合成ペプチド（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ；
実施例１参照））のリン酸化、又は（好ましくは）例えば実施例１に記載のＧＳ
Ｔ−ＣＲＥＢ融合タンパクのリン酸化に関して、ＭＳＫ１の酵素活性の少なくと
も３０％を有することが特に好ましい。あるいは、必須ではないけれども、前記
ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラ
グメント、派生物の融合体が、上述したＣｒｏｓｓｔｉｄｅ、ＣＲＥＢ、ＧＳＴ
−ＣＲＥＢ融合タンパク又は適するＣＲＥＢｔｉｄｅに関して、ＭＳＫ２の酵素
活性の少なくとも３０％を有することが特に好ましい。前記ポリペプチドの変異
体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の
融合体が、ＣＲＥＢ又は上記した代わりになるべきもののリン酸化に関して、Ｍ
ＳＫ１の酵素活性のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さ
らに好ましくは少なくとも９０％を有するなら、さらに好ましい。あるいは、前
記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フ
ラグメント、派生物の融合体が、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ又は上記されて適する代わ
りになるべきもののリン酸化に関して、ＭＳＫ２の酵素活性のうちの少なくとも
５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％を有
するなら、さらに好ましい。しかしながら、例えば別のポリペプチドに相互作用
することにより又は抗体をつくる際の（ｉｎ ｒａｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ）抗原として、酵素活性をもっていない変異体、融合体、派生物、フラグ
メントがやはり有用となることが認識されるだろう。
【００４２】 本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチ
ドをコード化する、又は前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラグメント又
は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体をコード化する
組換ポリヌクレオチドを提供する。以下に表現された配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）（ＥＳＴｓ）がまた排除されるという点を
除いては、前記ポリヌクレオチド変異体として好ましいもの及び排除するもの（
Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｓ）は、本発明の第一の
側面と同様である：
【００４３】 ヒトＭＳＫ１に関するＥＳＴｓ：ＡＡ１５８５７２，ＡＡ１５８５７１，ＡＡ
２５５８４６，ＡＡ６９９７２９，ＡＡ１３４３５９，ＡＡ３１４５６５，Ｎ３
１６４１，ＡＡ３０５１６３，ＷＯ４９３０，ＡＡ１３４３５８，ＡＡ３２２２
７０，Ｈ０９９８５，ＡＡ２５５９９６，Ｒ１１２３５，Ｎ５７０５９，Ｔ９７
５３８，Ｔ９７５８４，Ｈ０９９８６，Ｒ１１１８３，ＨＳＣ０ＪＥ０８１，Ａ
Ａ４７２１６５，ＡＡ８９７２２１，ＡＡ３８９１６８，ＡＡ０６１０１６，Ａ
Ａ４４４３６６．
【００４４】 ヒトＭＳＫ２に関するＥＳＴｓ：ＡＡ５６８８９５，ＡＡ８５７４３１，Ｈ４
１６４７，ＡＡ４４３６０１，ＡＡ６７８６７０，Ｈ５３７１４，ＡＡ６２７５
５８，Ｈ４６２６８，Ｒ１７１０９，ＡＡ９５５１２９．
【００４５】 マウスＭＳＫ２に関するＥＳＴｓ：ＡＡ２６７４９０，ＡＡ４４４３６６，Ａ
Ａ０６１０１６，ＡＡ３８９１６８，ＡＡ４７２１６５，ＡＡ６５７１０８．
【００４６】 実施例１に記載のように、全てのＥＳＴｓはジーンバンク取得番号（ｔｈｅ
Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）により同定される。
【００４７】 本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチ
ドを発現するのに適する、又は前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラグメ
ント又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体を発現す
るのに適する組換ポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチド変異体と
して好ましいもの及び排除するものは、本発明の第一の側面と同様である。
【００４８】 “発現するのに適する（ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）
”とは、そのポリヌクレオチドが、例えばＲＮＡのようにポリペプチドを形成す
るように翻訳されるポリヌクレオチドであること、又は、本発明のポリペプチド
をコード化するポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）が、発現に関して
適切な配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と正しいリーディングフレームを成し
て、プラスミドのような発現ベクターに組み込まれることが意図される。そのポ
リヌクレオチドは、何らかの望まれた宿主により認識される適する転写及び翻訳
調節制御ヌクレオチド配列につながれる。；そのような操作は発現ベクターに組
み込まれているだろう。
【００４９】 上にリスト化したＥＳＴｓのうちのどれかが、上記に定義されたようなポリペ
プチドであるとは考えられない。；しかし、疑いをなくすために、上述に排除さ
れたＥＳＴｓがさらに本発明のこの側面から排除される。
【００５０】 従って、本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたポリペプ
チドを発現するのに適する、又は、前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラ
グメント又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体を発
現するのに適する複製可能なベクターである。前記ポリヌクレオチド変異体とし
て好ましいもの及び排除するものは、本発明の第一の側面と同様である。例えば
、この複製可能なベクターは、例えば実施例１に記載されるように、本発明の第
一の側面に定義されたようなポリペプチドの融合体、特にＧＳＴ融合体を発現す
るのに適する。
【００５１】 本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたポリペプチドの融
合体、又は変異体又はフラグメント又は派生物の融合体、特にＧＳＴ融合体をコ
ード化するポリヌクレオチドである。またさらなる側面は、哺乳類／真核細胞に
おいて複製に適するベクターであり、本発明の第一の側面に定義されたようなポ
リペプチド、又は変異体又はフラグメント又は派生物又はこのポリペプチドの融
合体、又は変異体又はフラグメント又は派生物の融合体、特にＧＳＴ融合体をコ
ード化するポリヌクレオチドを有する。以下に示すＥＳＴｓクローンは、哺乳類
／真核細胞における複製に適し、本発明のこの側面から排除されるベクターとな
る：ＡＡ３８９１６８；ＡＡ６７８６７０。本発明の他の側面から排除されるＥ
ＳＴｓのどれかが上述に定義されるようなベクターであるとは考えられない；し
かし、そのようなベクターとなるＥＳＴｓのどれかがまた排除されると認識され
るだろう。
【００５２】 哺乳類／真核細胞において複製に適するベクターの特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｓｔｉｃｓ）は、当業者によく知られており、以下に例が示される。原核及び
真核細胞両方において、ベクターが複製に適することが認識されるだろう。
【００５３】 一つの好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列 又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。ＭＳＫ１をコー
ド化するヌクレオチド配列は、関連するオープンリーディングフレームの翻訳と
ともに図１に示される。
【００５４】 別の好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列 又は 又は 又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。
【００５５】 上述のポリヌクレオチドは、一部のヒト（二つのスプライス変異体）又はマウ
スＭＳＫ２それぞれをコード化する。上述した配列を用いると、全長マウス又は
ヒトＭＳＫ２をコード化する配列は、当業者によりよく知られる方法を日常的に
用いることで入手されることが認識されるだろう。従って、ＰＣＲ法、特に５’
ｃＤＮＡ配列を合成するために改良された方法（例えば、当業者によく知られる
ような“ＲＡＣＥ”法）が用いられるだろう。
【００５６】 好ましい実施例において、このポリヌクレオチドは配列 又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。ＭＳＫ１をコー
ド化するヌクレオチド配列は、関連するオープンリーディングフレームの翻訳と
ともに図１に示される。
【００５７】 別の好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列 又は 又は 又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。
【００５８】 上述したポリヌクレオチドは、一部のヒト（二つのスプライス変異体）又はマ
ウスＭＳＫ２それぞれをコード化する。
【００５９】 全長ヒトＭＳＫ２ポリペプチド配列は以下に示され、ジーンバンクエントリー
取得番号ＡＪ０１０１１９に与えられる（Ｐｉｅｒｒａｔ等（１９９８）Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（４５），２９６６１−２９６７１）：
【００６０】 全長ヒトＭＳＫ２ポリヌクレオチド配列は以下に示され、ジーンバンクエント
リー取得番号ＡＪ０１０１１９に与えられる（Ｐｉｅｒｒａｔ等（１９９８）Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（４５），２９６６１−２９６７１）：
【００６１】 翻訳に必要な配列を欠き、かつそれゆえに表現された配列タグの発現を欠く場
合、表現された配列タグ（ＥＳＴ）クローンは上述に定義されるような組換ポリ
ヌクレオチドではないことが認識されるだろう。ＥＳＴ配列は、ベクターＵｎｉ
−ＺＡＰＸＲ，ｐＴ７Ｔ３Ｄ−Ｐａｃ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−，Ｌａ
ｆｍｉｄ ＢＡ又はｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ２ベクターでクローンされる（ｂｅ
ｃｌｏｎｅｄ）だろう。
【００６２】 本発明のポリペプチド又は変異体、フラグメント、融合体、派生物をコード化
する、組換えポリヌクレオチドのフラグメントを含むポリヌクレオチドもまた有
用でありうる。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは少なくともヌクレオチド１
０個の長さのフラグメントを含んでおり、少なくとも１４個の長さであることが
より好ましく、少なくとも１８個の長さであることが更に好ましい。これらのポ
リヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして有用である。このように本発明の
ポリペプチド又は変異体、フラグメント、融合体、派生物をコード化するポリヌ
クレオチド（又はそれらのフラグメント）に相補的なポリヌクレオチドもまた有
用となる。このような相補的ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチ
ドとして、当業者によく知られている。
【００６３】 本発明のヌクレオチド又は組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好
ましくはＤＮＡでありうる。これらのポリヌクレオチドはそのコード配列の中に
イントロンを含んでもよいし、含まなくてもよい。；このポリヌクレオチドはｃ
ＤＮＡであることが好ましい。
【００６４】 このようなポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、（ｉ）前
記ポリヌクレオチドにコード化されたタンパク質に特異的に結合する抗体の生産
に、順次利用されるタンパク質又はそのフラグメントの合成に使用可能なもの、
又は（ｉｉ）その遺伝子あるいは（ｉ）で定義された変異型（ｖａｒｉａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｙｐｅ）に対応するアンチセンス配列を含む。例えば、同一のアミ
ノ酸をコードする異なるコドンは、原形のコドンとして代用されることができる
。変わりになるべきものとして、代用コドンは、タンパク質の活性あるいは免疫
原性に影響しない、又はその活性や免疫原性を高め或いは逆に調節する、異なる
アミノ酸をコードしうる。例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅの“Ｓ
ｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔ
ｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１９３−２１０（１
９８５）に述べられたように、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）又はその他の技術が、置換、挿入、欠失、転移の
ような、一重又は多重の突然変異を発生するのに活用され、この技術が参考とし
て本明細書に組み込まれている。このような修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ポ
リヌクレオチドは、既知の技術を本明細書に組み込まれた教示（ｔｈｅ ｔｅａ
ｃｈｉｎｇ）に応用することにより入手可能であるので、このように修飾された
ポリヌクレオチドは特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある。
【００６５】 さらに、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列（若しく
はそれらのフラグメント）が、高度にストリンジェントな条件下で、これらとハ
イブリダイズする他のポリヌクレオチド配列を得るのに使用できることは、当業
者に認識されるだろう。このようなポリヌクレオチドはあらゆるゲノムＤＮＡ（
ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を含む。よって、本発明のポリヌクレオチドは、本発
明の手法により同定されるポリヌクレオチドと、少なくとも６０％、好ましくは
７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０
％の相同性を示すポリヌクレオチドを含んでいるが、これは、このような相同な
ポリヌクレオチドが、少なくとも以下に述べる手法のいくつかに於いて使用可能
、若しくは有用であるポリペプチドをコード化する場合に於いてである。
【００６６】 パーセント相同性（Ｐｅｒ ｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、例えばウィス
コンシン大学遺伝子コンピューターグループ（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）
のＧＡＰプログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）により測定できる。
【００６７】 ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＡＮ−ＲＮＡ，又はＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーシ
ョンは、０．１×から６×の濃度の標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）を含有
する水溶液中で、５５ｏＣから７０ｏＣの温度において実施される。この技術分
野に於いて、温度が高いほど、又は標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）の濃度
が低いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになること
がよく知られている。ここでいう“高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｃｙ）”とは、２×標準食塩−クエン酸緩衝液と６５ｏＣを意味す
る。１×標準食塩−クエン酸緩衝液は０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウムである。高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅ
ｎｃｙ）の状態でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、特許請求の範囲に記
載された発明の範囲に含まれる。
【００６８】 このポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）”はまた、比較的短
いストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）（例えば２０個から５０個のヌクレオチド
）が、本発明のポリヌクレオチドと同等のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）と
高い割合の相同性（少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０又は９５％）
を示すポリペプチドを、たとえこれら二つのポリヌクレオチドの全体における相
同性がこれよりもかなり低いとしても、含むものとする。これは、タンパク質の
全体的な構造が異なる場合でも、その重要な活性又は結合部位が共有されうるか
らである。
【００６９】 ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、例えば相補的な付着末端を経由して、ベク
ターに使用可能に結合させるために、様々な手法が開発されている。適当な手法
が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記
載されている。
【００７０】 本発明のポリヌクレオチドをコード化するＤＮＡを修飾する望ましい方法は、
Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１により開示さ
れたように、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この手法は、例えば適
当な制限部位に於いて処理を行うなどして、ＤＮＡを適するベクターへと導入す
るのに使用される。あるいは、この技術分野において知られる他の有用な方法で
、ＤＮＡを修飾するのにこの手法が使用される。
【００７１】 この手法では、酵素により増幅される（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｍｐ
ｌｉｆｉｅｄ）ＤＮＡは、２個の特異的なプライマーに隣接され、これらのプラ
イマーはそれら自体がこの増幅されたＤＮＡに組み込まれる。前記の特異的なプ
ライマーは、この技術分野で既知の手法を用いての発現ベクターの中へクローニ
ングするのに使用されうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【００７２】 このＤＮＡ（レトロウィルスベクターの場合はＲＮＡ）は、それから、本発明
の化合物を含有するポリペプチドを産生するのに適する宿主で発現される。ゆえ
に、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するこのＤＮＡは、発現
ベクターを構成するために、既知の技術に従い用いられ、本明細書に含まれる教
示（ｔｈｅ ｔｅａｃｈｉｎｇ）を考慮して適切に修飾される。その後、このＤ
ＮＡは、本発明のポリペプチドの発現及び産生に適する宿主細胞を形質転換する
のに用いられる。このような技術は、Ｒｕｔｔｅｒ等に１９８４年４月３日に発
行されたＵＳＰ．４，４４０，８５９、Ｗｅｉｓｓｍａｎに１９８５年７月２３
日に発行されたＵＳＰ．４，５３０，９０１、Ｃｒｏｗｌに１９８６年４月１５
日に発行されたＵＳＰ．４，５８２，８００、Ｍａｒｋ等に１９８７年６月３０
日に発行されたＵＳＰ．４，６７７，０６３、Ｇｏｅｄｄｅｌに１９８７年７月
７日に発行されたＵＳＰ．４，６７８，７５１、Ｉｔａｋｕｒａ等に１９８７年
１１月３日に発行されたＵＳＰ．４，７０４，３６２、Ｍｕｒｒａｙに１９８７
年１２月１日に発行されたＵＳＰ．４，７１０，４６３、Ｔｏｏｌｅ，Ｊｒ等に
１９８８年７月１２日に発行されたＵＳＰ．４，７５７，００６、Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ等に１９８８年８月２３日に発行されたＵＳＰ．４，７６６，０７５、Ｓｔａ
ｌｋｅｒに１９８９年３月７日に発行されたＵＳＰ．４，８１０，６４８におい
て開示されたものを含み、これらは全て、参考として本明細書に組み込まれてい
る。
【００７３】 本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するＤＮＡ（レトロウィル
スベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主へ導入するために、他の多種多様な
ＤＮＡ配列と結合される。結合するＤＮＡ（Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ＤＮ
Ａ）は、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、又はエピソーム保持（ｅｐｉ
ｓｏｍａｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）或いは組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ
）が望ましいのかどうかに依存するだろう。
【００７４】 一般的に、ＤＮＡは、発現するために適切な配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
）及び正確なリーディングフレームを成して、プラスミドなどの発現ベクターに
導入される。必要ならば、ＤＮＡを、目的の宿主により認識される適切な転写及
び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合させるが、このような調節は通常、発現
ベクターにおいて可能である。その後、このベクターは標準的な技術によって宿
主に導入される。一般的に、すべての宿主がベクターによって形質転換されるわ
けではない。それゆえに、形質転換された宿主細胞を選別することが必要になる
。選別する技術の一つは、あらゆる必要な調節因子（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍ
ｅｎｔｓ）を有し、形質転換された細胞中で、抗生物質耐性のような選択的特性
をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに組み込むことを必要とする。変わり
になるべきものとして、そのような選択特性を保持する遺伝子は他のベクターに
も存在し、目的の宿主細胞を共形質転換する（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）のに
用いられる。
【００７５】 本発明の組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞は、その後、目的のポリ
ペプチドの発現がなされるように、本明細書で開示された教示（ｔｈｅ ｔｅａ
ｃｈｉｎｇｓ）を考慮して、十分な期間、当業者に知られた適切な環境の下で培
養され、それから回収される（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）。
【００７６】 バクテリア（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（ｙｅｓｔ）（例えばサッカロミセスセレビシエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（ｆｉｌａｍｅ
ｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））
、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ）を含む多くの発現
システム（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）が知られている。
【００７７】 そのベクターが、たとえ他の原核生物以外の細胞タイプの発現に使われるとし
ても、そのベクターはＣｏｌＥ１ ｏｒｉのような原核生物での増殖のための原
核生物レプリコン（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含んでいる
。このベクターはまた、それとともに形質転換された、大腸菌のようなバクテリ
ア宿主細胞で、遺伝子の発現（転写と翻訳）を方向付けできる原核生物プロモー
ターのような適切なプロモーターも含むことができる。
【００７８】 プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写の開始を許容するＤＮＡ配
列によって形成される発現調節要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｅｌｅｍｅｎｔ）である。模範的な細菌宿主に適合するプロモーター配列（Ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）は、本発明のＤＮＡ断片の挿入に便利な制
限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含むプラスミドベクター（ｖｅ
ｃｔｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ）に、典型的に備えられている。
【００７９】 典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９と、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ，ＵＳＡで入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３である。
【００８０】 典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはクロ
ーンされた遺伝子の発現を駆動させるためにＳＶ４０後期プロモーター（ｌａｔ
ｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用し、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞（Ｔ
ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｏｄｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）で高いレベルの発現が確
認される。
【００８１】 誘導哺乳類発現ベクター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）の例として、ｐＭＳＧがあり、このベクターも
またＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。このベクターは、クローンされた
遺伝子の発現を駆動させるために、マウス乳がんウィルスの長末端リピート（ｌ
ｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）のグルココルチコイド誘導プロモー
ター（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ
）を使用する。
【００８２】 有用な酵母プラスミドはｐＲＳ４０３−４０６とｐＲＳ４１３−４１６で、通
常Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐ
ＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（Ｙｅａｓ
ｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＩｐｓ）であり、酵母選
択性遺伝標識（ｙｅａｓｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）ＨＩＳ３、
ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は
酵母動原体プラスミド（Ｙｅａｓｔ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ
）（ＹＣｐｓ）である。
【００８３】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ）で形質転換された宿主細胞に関する。この宿主細胞は、原核又は真核のどち
らかでありうる。バクテリア細胞には原核宿主細胞が好ましく、典型的には、例
えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ
．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手可能な大腸菌株ＤＨ５と、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＴＣ）ｏｆ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（Ｎｏ ＡＴＣＣ ３１３４３
）から入手可能なＲＲ１のような大腸菌の一株である。好ましい真核宿主細胞と
しては、酵母、昆虫や哺乳類の細胞を含むが、マウスやラット、サル、ヒトの繊
維芽細胞系由来の細胞のような脊椎動物細胞がより好ましい。酵母宿主細胞とし
ては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから通常入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５０
０、ＹＰＨ５０１を含む。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＣＣＬ６１として
ｔｈｅ ＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈ
ａｍｓｔｅｒ）卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ １６５８としてｔｈｅ ＡＴＣＣ
から入手可能なＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ ｍｏｕｓｅ胚細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｃｅｌ
ｌ）ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＲＬ １６５０としてｔｈｅ ＡＴＣＣから入手可能な
サルの腎臓由来の（ｋｉｄｎｅｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ＣＯＳ−１細胞を含む。好
ましい昆虫細胞としては、バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現ベ
クターでトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）されるＳｆ９細胞が
ある。
【００８４】 本発明のＤＮＡ構造を有する、適当な細胞宿主の形質転換は、使用されるベク
ターのタイプに典型的に依存するよく知られた手法により遂行することができる
。原核生物の形質転換に関しては、例えばＣｏｈｅｎ等（１９７２）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９，２１１０と、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の
形質転換はＳｈｅｒｍａｎ等（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａ
ｔｕｒｅ２７５，１０４−１０９の手法も有用である。脊椎動物細胞に関しては
、例えばカルシウムホスフェート（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｄ
ＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ、ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎのような
、これらの細胞のトランスフェクションにおいて有用な試薬が、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡから
入手可能である。
【００８５】 エレクトロポレーションもまた、細胞を形質転換及び／或いはトランスフェク
ションするのに有用であり、またこの技術は、酵母細胞、バクテリア細胞、昆虫
細胞、脊椎動物細胞を形質転換する技術分野でよく知られている。
【００８６】 例えば、多くのバクテリア種は、参考として本明細書に組み込まれたＬｕｃｈ
ａｎｓｋｙ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７−６４６に
記載された手法によって、形質転換されてもよい。たくさんの形質転換体が、ｃ
ｍ当たり６２５０Ｖ、２５：ＦＤ条件下で（ｕｓｉｎｇ ６２５０Ｖ ｐｅｒ
ｃｍ ａｔ ２５：ＦＤ）２．５×ＰＥＢ中に懸濁された（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ
）ＤＮＡ細胞混合物（ＤＮＡ−ｃｅｌｌ ｍｉｘｔｕｒｅ）のエレクトロポレー
ションに続いて一貫して回収される。
【００８７】 エレクトロポレーションによって酵母を形質転換させる手法は、Ｂｅｃｋｅｒ
とＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）のＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，
１８２において開示されている。
【００８８】 適切に形質転換された細胞、つまり本発明のＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ）を有する細胞は、よく知られた技術で同定することができる。例えば、本発
明の発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の導入の結果と
してできた細胞は、本発明のポリペプチドを生産するようになる。細胞は収集、
溶解され、それらのＤＮＡの内容（ｃｏｎｔｅｎｔ）は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１
９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３又はＢｅｒｅｎｔ等（１９８５）
Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８に記載されたような手法を用いて、目的のＤＮＡが
含まれているかどうか、試験される。代わりに、上清のタンパク質の存在が以下
に記載した抗体を用いることによって検出される。
【００８９】 組換えＤＮＡの存在の直接的なアッセイ（ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｓｓａｙｉｎ
ｇ）に加えて、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指揮できる場合には、成
功した形質転換は、よく知られた免疫学的手法によって確認される。例えば、発
現ベクターとの形質転換に成功した細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を生
産する。形質転換されたと思われる細胞のサンプルは、収集され、適する抗体を
用いてそのタンパク質をアッセイされる。
【００９０】 それゆえに、形質転換された宿主細胞自体に加え、本発明は、栄養培地でのそ
れらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローニングされて均一な）培
養もしくはモノクローナル培養から派生する培養も、深く考慮している。
【００９１】 本発明の更なる側面は、本発明のポリペプチド、又はそれの変異体、派生物、
フラグメント又は融合体、又は変異体、フラグメント、派生物の融合体を作製す
る方法を提供する。この方法は、前記ポリヌクレオチドをコード化する組換えポ
リヌクレオチド又は複製可能なベクター（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒ
）を有する宿主細胞の培養と、前記ポリペプチド又はそれの変異体、派生物、フ
ラグメント又は融合体、又は変異体、フラグメント又は派生物の融合体を前記宿
主細胞から単離することを有する。宿主細胞の培養方法と、組換えタンパク質の
単離方法は、この技術分野に於いて良く知られている。
【００９２】 本発明はまた、本発明の上記の方法によって入手可能なポリペプチド、又はそ
れの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は前記変異体又はフラグメン
ト又は派生物の融合体も含んでいる。
【００９３】 本発明のまた更なる側面は、本発明のポリペプチドに対して反応する抗体を提
供する。そのような抗体及びそのような抗体を調整する方法の例は、実施例１に
記載されている。
【００９４】 本発明の前記ポリペプチドに対して反応する抗体は、この技術分野においてよ
く知られた手法で作製される。特に、この抗体はポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌ
ｏｎａｌ）又はモノクローナルである。
【００９５】 前記ポリペプチドに対して反応する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術
によって調整される。またそれら既知の技術の例は、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ
Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）や、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＳＧＲ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９
８２）に開示されている。
【００９６】 好ましい実施例において、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の特定なアミノ酸配列から得
られる、あらゆる適したペプチド配列を適切に使用することによって、これらの
抗体は作製される。ポリクローナルアンチペプチド抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が作られれば好ましい。Ｍ
ＳＫ１から得ることのできる適当なペプチドには、実施例１で論じるように、Ｌ
ＴＶＫＨＥＬＲＴＡＮＬＴＧＨＡＥＫＶ（ＭＳＫ１の２６から４４の残基に一致
する）とＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥＲ（ＭＳＫ１の３８４から４０
２の残基に一致する）が含まれる。ＭＳＫ２から得られる適当なペプチドはＦＫ
ＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥＲ（ＭＳＫ２の７５３から７７２の残基に一
致する）である。
【００９７】 ＭＫＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃのような他の二つのキナーゼドメインを有する
プロテインキナーゼに対し、これらの抗体が本質的に反応しなければ、特に好ま
しい。従って、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２配列に基づくペプチドで、ＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ１ａ／ｂ／ｃのような他のストレス活性プロテインキナーゼにおいて見つけら
れるペプチドとは顕著に異なるペプチドが用いられることが好ましいだろう。ま
た、抗体が、ＭＳＫ１に対しては反応するがＭＳＫ２に対しては本質的には反応
しない、若しくはその逆であることも好ましいだろう。
【００９８】 ペプチドが合成される前後で、一個若しくはそれ以上のアミノ酸残基が化学的
に修飾される（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ペプチドは、そのペプチドの機能、すなわち
生体内における特定の抗体の生産する機能が本質的に変化しなければ、使用され
る。このような修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、酸又は塩基、特に生理学
的に受容される有機又は無機の酸及び塩基とによる塩の形成、カルボキシル基末
端のエステル又はアミドの形成、Ｎ末端ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔ−ｂｕｔ
ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）のようなアミノ酸保護基の付着（ａｔｔａｃｈｉｎｇ
）を含む。このような修飾は、これらのペプチドを生体内の代謝から守る。この
ようなペプチドは、単コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ）として、又は例えば縦
列反復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ）のような多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ ｃｏｐｙ）として存在する。このような縦列又は多重反復（ｔａｎｄｅｍ
ｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｐｅａｔ）はそれら自体抗原として、キャリア（
ｃａｒｒｉｅｒ）の使用を回避するのに十分である。またこのようなペプチドは
、Ｎ末端とＣ末端を結合させてループ（ｌｏｏｐ）を形成したり、抗原性を高め
るため及び／又はジスルフィド結合の形成を許容するために一個又はそれ以上の
Ｃｙｓ残基を末端に付着したりするのに有利である。このようなペプチドがキャ
リアに、好ましくはポリペプチドに共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｌｉｎｋ
ｅｄ）するとき、その組み合わせ（Ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は適して
おり、本発明のペプチドはループを形成する。
【００９９】 最近の免疫学的理論によれば、キャリア機能（ｃａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ）はあらゆる免疫系統（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ
）で、免疫機構の刺激や刺激の増強によって現れる。もっとも優れたキャリア（
ｃａｒｒｉｅｒ）は、Ｔ細胞エピトープ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を形
成する（又は、抗原と共に、つくる）。そのペプチドは、血清アルブミン、ミオ
グロビン、細菌性毒素やキーホールツタノハガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）のような別のキャリアと、例えば架
橋によって結合する。さらに最近では、Ｔ細胞を誘導する進化したキャリア（ｄ
ｅｖｅｌｏｐｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ）は、Ｂ型肝炎コア抗原（ヌクレオキャプシ
ド蛋白ともいわれる）や、トレオニン（Ｔｈｒ）−アラニン（Ａｌａ）−セリン
（Ｓｅｒ）−グリシン（Ｇｌｙ）−バリン（Ｖａｌ）−アラニン（Ａｌａ）−グ
ルタミン酸（Ｇｌｕ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−アスパ
ラギン（Ａｓｎ）−システイン（Ｃｙｓ）のようなＴ細胞エピトープ（Ｔ−ｃｅ
ｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）と推測されるもの、β−ガラクトシダーゼ、そしてイ
ンターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）の１６３〜１７１ペプチド
を含む、免疫応答を助ける。後者の化合物は、キャリアとして、又はアジュバン
トとして、又はその両方として、様々にみなされてもよい。また一方、本発明と
同じか又は異なるペプチドのいくつかのコピー（ｃｏｐｉｅｓ）は、互いに架橋
されてもよい。この場合、それ自体分離したキャリア（ｓｅｐａｒａｔｅ ｃａ
ｒｒｉｅｒ）はないが、キャリアの機能はそれらの架橋によって提供されてもよ
い。適する架橋剤には、シグマ又はピースのカタログｔｈｅ Ｓｉｇｍａ ａｎ
ｄ Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇｕｅのような中で挙げられている、例えばグ
ルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、カルボジイミド（ｃａｒ
ｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、そしてサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（
Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｔｅ）などが含まれ、後者の試薬（ａｇｅｎｔ）は、（存在すれば）
Ｃ末端システイン残基のＳＨ基（ｔｈｅ−ＳＨ ｇｒｏｕｐ）を利用する。
【０１００】 仮にペプチドが、適当な宿主（ｈｏｓｔ）中の適当なヌクレオチド配列の発現
によって調整された場合、ペプチドは、キャリアとしてはたらくペプチド配列と
の融合生成物として発現するのが有利かもしれない。Ｋａｂｉｇｅｎの“エコシ
ステム”（“Ｅｃｏｓｅｃ ｓｙｓｔｅｍ”）は、そのような調整（ａｒｒａｎ
ｇｅｍｅｎｔ）の例である。
【０１０１】 本発明のペプチドは、二重効果（ａ ｄｕａｌ ｅｆｆｅｃｔ）をもたらすほ
かの抗原と結合している。
【０１０２】 ペプチドは、Ｌｕ等（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６，３４３３で発
表、開示されている、ｔｈｅ Ｆｍｏｃ−ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｍｏｄｅの固相
ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ−ｆａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
）によって合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基の保護は、９−フルオレニ
ルメチロキシカルボニル基（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒ
ｂｏｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）（Ｆｍｏｃ）で行われる。この強塩基不安定性の保護
基の再開裂は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏ
ｒｍａｍｉｄｅ）中で２０％ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ）を用いてなされ
る。側鎖の機能性は、それらのブチルエーテル（ｂｕｔｙｌ ｅｔｈｅｒｓ）（
セリン、トレオニン、チロシンの場合）、ブチルエステル（ｂｕｔｙｌ ｅｓｔ
ｅｒｓ）（グルタミン酸、アスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導
体（ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（リジン、ヒ
スチジンの場合）、トリチル誘導体（ｔｒｉｔｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（
システインの場合）、そして４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンス
ルホニル誘導体（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎ
ｚｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（アルギニンの場合）と
して、保護されてもよい。グルタミン又はアスパラギンがＣ末端残基であるとこ
ろは、４，４−ジメトキシベンズヒドリル基（４，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅ
ｎｚｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）が、側鎖アミドの機能性の保護に利用される。
固相支持（ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ−ｆａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、ジメチルアク
リルアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（バックボーンモノマー
ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｍｏｎｏｍｅｒ）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（ｂ
ｉｓａｃｒｙｌｏｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ）（架橋物質ｃｒｏｓ
ｓ ｌｉｎｋｅｒ）、そして、アクリロイルサルコシンメチルエステル（ａｃｒ
ｙｌｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）（機能試薬ｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌｉｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の三つのモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒｓ
）から構成される、ポリジメチルアクリルアミドポリマー（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔ
ｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｏｌｉｍｅｒ）を基礎としている。ペプチドか
ら樹脂への開裂可能に結合する試薬には、酸不安定性の４−ヒドロキシメチルフ
ェノキシ酢酸誘導体（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅ
ｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が用いられる。全てのアミノ酸誘導
体は、逆向きのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール（Ｎ，Ｎ−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
／１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）が仲介するカップリング過
程を用いて加えられるアスパラギンとグルタミンを除き、予め形成された（ｐｒ
ｅｆｏｒｍｅｄ）それらの対称無水物誘導体（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌａｎｈｙ
ｄｒｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）として加えられる。全てのカップリング
および脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応は、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙ
ｄｒｉｎ）、トリニトロベンゼンスルホン酸（ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ
ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、又はイソチンテスト過程（ｉｓｏｔｉｎ
ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いてモニターされる。合成完了時、ペプチ
ドは、５０％不純物除去剤混合物（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｍｉｘ）を含む９５％
トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）処理による側
鎖保護基の除去に伴って、樹脂支持体（ｒｅｓｉｎ ｓｕｐｐｏｒｔ）から解離
される。一般的に用いられる不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）は、エタン
ジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ア
ニソール（ａｎｉｓｏｌｅ）と水（ｗａｔｅｒ）で、合成されているペプチドの
成分であるアミノ酸に基いて厳密に選ばれる。トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕ
ｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）は減圧蒸発によって除去され、引き続いてジエ
チルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）で磨砕し、粗ペプチドを得る。存
在するあらゆる不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）は、水相の凍結乾燥によ
る単純な抽出工程（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって取り
除かれ、不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）のない粗ペプチドを与える。ペ
プチド合成の試薬は、一般にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（
ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＮＧ７ ２ＱＪ，ＵＫから得られる。精
製は、サイズ除去クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ ｅｘｃｈ
ａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）そして（主要なものに）逆相高速液
体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒａｐｈｙ）のような技術の
、一つによって又は組み合わせて行われてもよい。ペプチドの分析は、薄層クロ
マトグラフィー（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、逆
相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅ
ｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒａｐｈｙ）、酸加
水分解後のアミノ酸分析（ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）、高速原
子衝突マススペクトル分析（ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（Ｆ
ＡＢ）ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて行
われてもよい。
【０１０３】 本発明のさらなる側面は、発明の第一の側面で定義されたポリペプチド活性を
調節するドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）又はドラ
ッグ様化合物（ｄｒｕｇ ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）開発のための誘導化合
物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を同定する方法を提供する。その方法は、化
合物と、ポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融
合体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体との接触、及び前記
化合物が存在しない状態において、前記ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性
が、前記ポリペプチド、又はそれの前記変異体、フラグメント、派生物又は融合
体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体の活性と比較して変化
するかどうかの測定とを有する。
【０１０４】 ドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という用語は、
当業者によく知られたものであり、例えば薬の中の活性成分として、医療分野で
の使用がふさわしいかもしれない特徴を持つ化合物という意味を含んでもよい。
従って、例えば、ドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）
は、分子生物学や生化学の技術者よりも、むしろ有機化学者によって合成される
のが好ましい分子かもしれない。そして、５０００ダルトン分子量より小さく、
水溶性であるような、小さな分子であることが好ましいかもしれない。ドラッグ
様化合物（ｄｒｕｇ ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、さらに、特定のタンパ
ク質やタンパク質群との選択的相互作用や、生物学的利用性、そして／又は標的
細胞膜を通過するという特徴を示すが、これらの特徴は絶対的なものでないこと
が認識されるであろう。
【０１０５】 誘導化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という用語は、同様に当業者に知
られており、化合物そのものは薬として用いられるのにふさわしくないかもしれ
ないが（例えば目的とする標的に対する効能が弱い、作用が非選択的である、不
安定である、溶けにくい、合成するのが困難である、生物学的利用性が低いなど
の理由で）、より望ましい特徴を持つ他の化合物をデザインする出発点を与え得
る化合物という意味を含んでもよい。
【０１０６】 その化合物は、さらに以下で述べるように、例えばＭＡＰＫ２又はＳＡＰＫ２
／ｐ３８によってその活性化を阻害するような、本発明のポリペプチドと相互作
用したり、調節したりすることによって作用するかもしれない。
【０１０７】 生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてポリペプチドの活性を調節しうる化合物を
同定するのが望ましいことが理解されるであろう。従って、生体内において、前
記ポリペプチドとその基質との相互作用が、ヒトＭＳＫ１又はＭＳＫ２とその基
質や基質群との間の相互作用と実質上同じになるように、その方法の中で用いら
れる試薬と条件が選ばれるかもしれないということが理解されるであろう。前記
ＭＳＫ１ポリペプチドの基質の例は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１である。
【０１０８】 一つの実施例において、その化合物は前記ポリペプチドの活性を低下させる。
例えば、その化合物は実質上可逆的に、又は実質上非可逆的に前記ポリペプチド
の活性部位に結合するかもしれない。さらなる例としては、その化合物は、前記
ポリペプチドがその基質に結合するのを妨げるために、前記ポリペプチドの活性
部位ではない部分に結合するかもしれない。また、さらなる例としては、その化
合物は、アロステリック効果によって前記ポリペプチドの活性を低下させるため
に、前記ポリペプチドの一部分に結合するかもしれない。このアロステリック効
果は、例えばＭＡＰＫ２やＳＡＰＫ２／ｐ３８のような上流活性化因子（ｕｐｓ
ｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）による前記ポリペプチドの活性化のように、
前記ポリペプチド活性の自然法則に含まれるアロステリック効果かもしれない。
【０１０９】 化合物Ｒｏ３１８２２０は、実施例１および実施例５で述べられているように
、ＭＳＫ１やＭＳＫ２の阻害剤の例である。この化合物は、ＭＳＫ１およびＭＳ
Ｋ２に加えて他のプロテインキナーゼを阻害するが、例えばＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２
のような、これらの他のプロテインキナーゼのいくつかは、実施例１で述べられ
ているように、ＭＳＫ１活性を除去する化合物濃度では十分に変化を受けない。
【０１１０】 さらなる実施例において、その化合物は前記ポリペプチドの活性を高める。例
えば、その化合物は、前記ポリペプチドのその基質への結合を助けるために、前
記ポリペプチドの活性部位ではない部分に結合するかもしれない。さらなる例で
は、その化合物は、アロステリック効果によって前記ポリペプチドの活性を高め
るために前記ポリペプチドの一部分に結合するかもしれない。このアロステリッ
ク効果は、例えばＭＡＰＫ２やＳＡＰＫ２／ｐ３８のような”上流活性化因子（
ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”による前記ポリペプチドの活性化の
ように、前記ポリペプチドの活性の自然法則に含まれるアロステリック効果でも
よい。
【０１１１】 都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているようにＭＳＫ１又は
ＭＳＫ２が、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ、又はＡＴＦ１又はＣｒｏｓｓｔｉ
ｄｅをリン酸化するという事実を利用するが、適当ないかなる基質が用いられて
もよい。従って、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ又はＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＡＴ
Ｆ１のリン酸化は当業者によく知られた技術を用いて測定されるかもしれない。
【０１１２】 都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているものと実質的に同様
かもしれない定量（ａｓｓａｙ）を利用する。実施例１では、ＭＳＫ１によるＣ
ＲＥＢ又はＡＴＦ１のリン酸化が測定される。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２は、組換え
ＭＳＫ１又はＭＳＫ２であることが好ましい。基質は、例えばＣＲＥＢやＡＴＦ
１のように、組換え体であることが好ましい。
【０１１３】 もう一つのものとして、基質の活性における変化が測定されるかもしれない。
例えば、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の転写因子としての活性が測定されるかもしれな
い。これは、当該学術分野でよく知られているように、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の
、適当な結合部位を持つＤＮＡへの結合をを測定することによって行われてもよ
く、又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって調節されるプロモーターからのＲＮＡの
発現を測定することによって行われてもよい。これは、細胞システム全体の中で
、又は精製された、又は部分的に精製された成分を用いることで、行われてもよ
い。同様に、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１で調節されるプロモーターから転写されるＲ
ＮＡによってコードされているタンパクの発現が、測定されるかもしれない。そ
のタンパクは、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって生理学的に調節されているかもし
れないし、又は当業者によく知られている”リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔ
ｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）”かもしれない（すなわち、組換え体構造が用いられる
かもしれない）。リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）は
、例えば−グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）又
はルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（例えばＴａｎ等（１９９６）参照
）のように、活性が容易に測定されるかもしれない。
【０１１４】 ＣＲＥＢによって生理学的に調節されているプロテイン群は、ＣＯＸ２とＩＬ
−１かもしれない。従って、ＣＲＥＢの阻害は、実施例５に示されるように、Ｃ
ＯＸ２又はＩＬ−１の発現が予想される環境下において、ＣＯＸ２又はＩＬ−１
の発現を測定することによって測定されるかもしれない。従って、ＣＯＸ２は、
例えばＭｉｔｃｈｅｌｌ等（１９９４）ＰＮＡＳ ９０，１１６９３−１１６９
７、およびＤｕｂｏｉｓ等（１９９８）ＦＡＳＥＢ Ｊ １２，１０６３−１０
７３に示されるように、エンドトキシンに暴露したＲＡＷ ２６４ネズミ科マク
ロファージ又はＪ７７４．２マクロファージにおいて発現するかもしれない。Ｊ
７７４．２とＲＡＷ２６４細胞は、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ
，ＵＫから得られてもよい。ＣＯＸ２とＩＬ−１の発現は、何らかの簡便な方法
、例えば、ＣＯＸ２又はＩＬ−１ ｍＲＮＡの存在を検出するＰＣＲや、ＣＯＸ
２又はＩＬ−１タンパクを検出する抗体に基づいた定量、また、例えば（ＣＯＸ
の基質である）アラキドン酸に細胞を暴露してつくられるＰＧＥ２のようなプロ
スタグランジンの量を測定することによるＣＯＸ２の酵素活性を検出する定量な
どを用いて測定されるかもしれない。適した定量は、実施例５、Ｍｉｔｃｈｅｌ
ｌ等（１９９４）、Ｓｌａｔｅｒ等（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙ
ｎｅｃｏｌ １７２（１），７７−８２又はＷＯ ９４／１４９７７に記載され
るだろう。プロスタグランジンは不安定であって速やかに代謝されるので、ＣＯ
Ｘ２の直接の生成物よりもむしろプロスタグランジン代謝物が測定されるだろう
。
【０１１５】 いかなる測定が行われても、導く過程における何らかの他の効果を持つよりも
、むしろ化合物がＣＲＥＢの活性化に影響を及ぼしているのを測定するために、
当業者によく知られているように、様々なコントロール定量を行うことが必要で
あろう。しかしながら、例えばプロスタグランジン量が測定されるような定量は
、細胞全体や生体内システムにおける化合物の有用性の評価や、例えば疾患にお
ける異なるモデルなど、異なる状況における概念の評価に有用かもしれない。例
えばＣＯＸ２の発現や活性における化合物の効果が測定される定量は、平行して
用いられてもよいし、また、例えばＭＳＫ１がＣＲＥＢをリン酸化するような能
力における化合物の効果が、より直接的に測定されるような他の定量からの結果
を用いて解釈されてもよいことが認識されるであろう。
【０１１６】 本発明のさらなる側面は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は、本発明の第一の側面
で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１の他の基質、）に結合し、かつ
、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１によりそ
の活性を促進又は阻害する化合物を同定する方法を提供する。その方法は、ＣＲ
ＥＢ又はＡＴＦ１（又は、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ま
しくはＭＳＫ１の他の基質）、又はそれらの適するフラグメント、変異体、派生
物又は融合体、又はフラグメント、変異体、派生物の適する融合体と、本発明の
第一の側面で定義されたポリペプチド（好ましくはＭＳＫ１）との相互作用を、
化合物が促進するか又は阻害するかの測定、又は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は
本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１の他の基質
）、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメ
ント、変異体、派生物の適する融合体の活性化を、本発明の第一の側面で定義さ
れたようなポリペプチドにより、この化合物が実質的に遮断するかどうかの測定
を有する。
【０１１７】 適当な定量は、上記と同様である。
【０１１８】 本発明のさらなる側面は、“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖ
ａｔｏｒ）”、例えばＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２又はＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡ
ＰＫ２ｂ／ｐ３８β２により本発明の第一の側面で定義されたポリペプチドの活
性化を調節する化合物を同定する方法を提供する。”上流活性化因子（ｕｐｓｔ
ｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”という言葉において、本発明のポリペプチド
と相互作用した結果、本発明のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を高める
分子が意味される。それは一つのポリペプチドでもよい。好ましくは、それは天
然ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の生理学的な活性化因子である。
【０１１９】 その方法は、化合物が、（ａ）本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド
、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメン
ト、変異体又は派生物の適する融合体と、（ｂ）“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒ
ｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”、例えばＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ
／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２、又はそれらの適する変異体、派生物、
フラグメント又は融合体、又は変異体、派生物又はフラグメントの適する融合体
との間の相互作用を促進するか又は崩壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）かの測定、又
は、この化合物は、“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ
）”又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体により、前記ポ
リペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は
前記フラグメント、派生物又は融合体の融合体の活性化を実質的に遮断するかど
うかの測定を有する。その化合物は、上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃ
ｔｉｖａｔｏｒ）又は本発明のポリペプチドのいずれか一方と、又はその両方と
、相互作用するか又は結合してもよいことが認識されるであろう。
【０１２０】 ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を調節できる化合物の例は、例えば当業者に知ら
れている、ＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉ
ｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）や、例えばＳＢ２０３５８０
やＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎ
ｙｌ）−２−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ
）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）などの、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の阻害剤を含む。
【０１２１】 ”ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）”という用語は、当業者によく知られたものであり、Ｇａ
ｌｌａｇｈｅｒ等（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５（１），４
９−６４で述べられているように、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８と結合する及び／又は
ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８を阻害する（また、あまり好ましくはないが、単球からの
ＩＬ−１の生成を阻害することで知られる）置換基を伴った、ピリジン環（ｐｙ
ｒｉｄｙｌ ｒｉｎｇ）とイミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｉｎｇ）か
らなる化合物を含む。ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍ
ｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はまた、例えば、ＷＯ９５／０２５９１
の中で論議されている。このタイプの化合物は、サイトカイン抑制抗炎症薬（ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｄｒｕｇｓ）（ＣＳＡＩＤｓ）のように、特定のプロテインキナーゼ阻害剤と
して知られる。これらの化合物のシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔ
ｈｗａｙ）研究における使用法は、Ｃｏｈｅｎ（１９９７）Ｔｒｅｎｓ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ ７，３５４−３６１の中で示されている。
【０１２２】 特定の化合物／タンパクとの結合に対する結合親和性や阻害ＩＣ５０を数値で
表した測定値は、厳密な定量システムに基いていることが認識されるであろう。
ピリジニルイミダゾール（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）は、Ｇａｌ
ｌａｇｈｅｒ等において述べられているように、もしＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８（Ｃ
ＳＢＰ）に対し１００μＭより少ない、好ましくは１０μＭより少ない、さらに
、より好ましくは１又は０．１、又は０．０１μＭより少ない結合ＩＣ５０（ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ＩＣ５０）又はキナーゼＩＣ５０（ｋｉｎａｓｅ ＩＣ５０）を
持つ場合、ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏ
ｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とみなされるかもしれない。ピリジニルイミダゾー
ル阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の例
は、Ｔｏｎｇ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ４（４），３１１−３１６で述べられているように、ＳＢ ２０２１９０
（ａ ２，４，５−ｔｒｉａｒｙｌｉｍｉｄａｓｏｌｅ）、ＳＢ ２０３５８０
（もう一つの３，４，５−ｔｒｉａｒｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）そして、３’−
ヨード化化合物（３’−ｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のような誘導
体を含む。ｐ−メチルスルフィニルフェニル基（ｐ−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｉ
ｎｙｌｐｈｅｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）が除去された誘導体は、また阻害剤としても
作用するかもしれない。置換基は、イミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｉ
ｎｇ）のＮ１原子につくられるかもしれず、イミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌ
ｅ ｒｉｎｇ）の２位の位置につくられた置換基は、効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）の
重大な損失を伴わずにＮ１原子に移されるかもしれない。
【０１２３】 ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を調節できる化合物の例は、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ
２の阻害剤やＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２の活性化の阻害剤、例えばＭＡＰＫキナーゼ
１（ＭＫＫ１）活性又は活性化の阻害剤、例えばＤＰ９８０５９又はＵＯ１２６
を含む。
【０１２４】 ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、知らているＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化因子である
。ここでは、ＭＳＫ１やＭＳＫ２として知られる本発明のポリペプチドの活性化
因子としても示されている。”ＭＳＫ１の活性化”という言葉において、ＣＲＥ
Ｂ又はＡＴＦ１（又は上記で挙げられるような基質の他のもの）をリン酸化する
ＭＳＫ１の能力は、次のＭＳＫ１の処理、例えばＭｇＡＴＰとＭＡＰＫ２／ＥＲ
Ｋ２により増大することが意味される。
【０１２５】 活性化されたＧＳＴ融合体としてのＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ
３８とＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２の発現は、実施例１で述べられており、その中
で上記タンパク質の配列を示している。
【０１２６】 従って、本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチド、例えばＭＳＫ１又
はＭＳＫ２の活性化に関するＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又は
ＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２の用途である。
【０１２７】 本発明のさらなる側面は、本発明のプロテインキナーゼ（ポリペプチド）と相
互作用するポリペプチドを同定する方法を提供する。その方法は、（１）（ａ）
本発明の第一の側面で定義された前記プロテインキナーゼ、又はそれの適する変
異体、フラグメント、派生物又は融合体、又はそれの変異体、フラグメント又は
派生物の融合体と、（ｂ）前記プロテインキナーゼと相互作用するポリペプチド
を含有する化合物との接触（２）前記プロテインキナーゼとポリペプチドを含有
する複合体の存在の検出、及び任意に（３）どのポリペプチドが前記プロテイン
キナーゼと結合するのかの同定を有する。
【０１２８】 一つの実施例において、その構造物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は細
胞成分からなるかもしれない。特に、細胞は次のようなタイプから選ばれるかも
しれない：（１）刺激を受けたときもＭＳＫ１又はＭＳＫ２活性を持たない細胞
、（２）刺激にさらされた後ＭＳＫ１又はＭＳＫ２活性を持つが、それほどさら
されてはいない細胞、（３）刺激にさらした後の（２）のタイプの細胞。タイプ
１〜３のみのサブセットにみられるポリペプチド群は、特に興味深いものがあり
、さらに特徴づけられるかもしれない。そのようなペプチドは、ＭＳＫ１又はＭ
ＳＫ２の活性化因子かもしれない。また一方では、それはＭＳＫ１又はＭＳＫ２
の不活性化因子かもしれない。
【０１２９】 その方法は、たとえば当該学術分野でよく知られている酵母二ハイブリッドシ
ステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、細胞の
中で行われてもよいことが認識されるであろう。この例では、前記三つのタイプ
の細胞由来のｍＲＮＡから複製されたｃＤＮＡが用いられる。
【０１３０】 ＭＳＫ１又はＭＳＫ２遺伝子が変化される、及び／又は、組換ＭＳＫ１又はＭ
ＳＫ２遺伝子が存在するトランスジェニック動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎ
ｉｍａｌ）、例えば齧歯類、特にマウスが、例えばＭＳＫ１又はＭＳＫ２の基質
の同定に有用かもしれないことが、さらに認識されるであろう。
【０１３１】 本発明のさらなる側面は、相互作用するポリペプチド、例えばＭＡＰＫ２又は
ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２により、本発明の第一の側
面で定義されたポリペプチドの活性化を遮断する化合物を同定する方法を提供す
る。その方法は、化合物が、（ａ）本発明の第一の側面で定義されたプロテイン
キナーゼ、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフ
ラグメント、変異体、派生物の適する融合体と、（ｂ）前記相互作用するポリペ
プチド、又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体、又は変異
体、派生物、フラグメントの適する融合体との間の相互作用を促進するか又は崩
壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）かの測定、又は、この化合物が、本発明の第一の側
面によるポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融
合体、又は前記フラグメント、派生物、融合体の融合体の活性化を、前記相互作
用するポリペプチド又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体
により、実質的に遮断するかどうかの測定を有する。
【０１３２】 都合のよいことには、この方法の中で用いられる本発明の第一の側面による前
記ポリペプチド、又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体は、遺伝
子組み換え技術によって産生されるものである。同様に、もし、前記プロテイン
キナーゼの活性を調節する化合物を同定する方法において用いられた、ＣＲＥＢ
又はＡＴＦ１又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体が、遺伝子組
み換え技術によって産生されるものであれば好ましい。同様に、もしその方法の
中で用いられるＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ
／ｐ３８β２又は他の”上流活性化因子”（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔ
ｏｒ）又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体が、遺伝子組み換え
技術によって産生されるものであれば好ましい。
【０１３３】 定量に用いる前に本発明のポリペプチドを活性化することが必要となることが
認識されるだろう。好ましい実施例では、本発明のポリペプチド（ＭＳＫ１又は
ＭＳＫ２）は、実施例１で述べられているように、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
でＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とＭｇＡＴＰでポリペプチドを処理することにより活性
化される。もし、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２が、本発明の方法によってつくられた組
み換えポリペプチドであれば、特に好ましい。
【０１３４】 “適する（ｓｕｉｔａｂｌｅ）”という言葉において我々が意味するものは、
その方法の中の前記化合物は、場合によりＭＳＫ１又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１又
は他の基質、又はＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２
ｂ／ｐ３８β２のような上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ）と実質的に同じ相互作用と活性を持つが、定量に用いるのにより簡便である
もの、ということが認識されるであろう。例えば、ＭＳＫ１又はＣＲＥＢの融合
体は、前記融合体が容易に精製されるような部分を含んでいるかもしれないので
、特に有用である。
【０１３５】 述べられている方法は、細胞の中で行われることが認識されるであろう。”レ
ポーター遺伝子”（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）の構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ）は、本明細書の教示を用い、当業者に知られている方法により調整されるだ
ろう。例えば、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）の構築物（ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１依存性プロモーター配列でつくら
れるかもしれない。この構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ
２構築物とともに、母細胞株がＣＲＥＢ又はＡＴＦ１が知られた刺激に対する応
答で活性化され、内因性のＭＳＫ１又はＭＳＫ２遺伝子が不活性化されている、
細胞株に導入されるかもしれない。また一方で、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ ｇｅｎｅ）構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１が
知られた刺激に対する応答で活性化される細胞株に導入されることができる。レ
ポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）の発現は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ
２の活性に依存し、従って化合物の影響は測定されることができるであろう。さ
らなる例では、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）は細胞にとっ
ては致命的なものかもしれず、また一方では、ほかの致命的な条件のもとで細胞
を生存させるかもしれない。従って、細胞の生存が、例えばＷＳＴ−１（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）の還元などのミトコンドリア活動性に対する比色定量を用いて
測定されることができる。ＷＳＴ−１は、サクシネートデヒドロゲナーゼ（ｓｕ
ｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を介して受け取る電子の吸収に
おいて変化を受ける台湾染料である。さらなる例では、酵母二ハイブリッドシス
テム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）が使われる。
【０１３６】 前記本発明のポリペプチドと、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２又は上記で定義された相
互作用ポリペプチド、又は適する派生物、フラグメント、融合体又は変異体との
相互作用の促進又は崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が、生物化学の技術分野にお
いてよく知られている方法、またタンパク−タンパク相互作用を評価するのに用
いることができる何らかの方法を用いて、生体外で測定される。
【０１３７】 前記相互作用はまた、当該学術分野でよく知られている酵母二ハイブリッドシ
ステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、細胞内
でも測定されることができる。
【０１３８】 本発明は、例えばＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性、又はその上流活性化因子（ｕ
ｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）との相互作用の、促進又は阻害のいずれ
かを調節するのに有用かもしれないドラッグのスクリーニング検定法（ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）を提供することが認識されるであろう。その方法で同
定される化合物は、それ自体がドラッグとして有用かもしれないし、又はより効
果的な化合物のデザインや合成のための誘導化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄ）を示すかもしれない。
【０１３９】 高い処理能力を持つスクリーニング検定（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）
が特に好ましいことが認識されるであろう。例は、述べられている細胞に基いた
検定（ａｓｓａｙ）と、タンパク−タンパク結合検定（ａｓｓａｙ）を含んでも
よい。さらなる例は、実施例２で述べられているＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔ
ｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）に基いたシステム（ＳＰＡ−ｂａｓ
ｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）である。
【０１４０】 本発明のさらなる側面は、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合
物を提供する。ここでこの化合物はＲｏ３１８２２０、ＰＤ９８０５９、又は既
知のＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ
ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨ
ＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ
ｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではない。
この化合物は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性を、促進する化合物、又は阻害する
化合物だろう。またさらなる側面は、医療用の化合物を提供する。
【０１４１】 転写因子ＣＲＥＢは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ＩＬ−１および酵
素シクロオキシケナーゼ２又はプロスタグランジンシンターゼ−２（ＣＯＸ２／
ＰＧＳ−２）の産生に必要とされる。我々はここに、ＣＲＥＢはＭＳＫ１／ＭＳ
Ｋ２によって活性化されることを示す。従って、ＭＳＫ１の阻害剤は、ＩＬ−１
及び／又はＣＯＸ２の阻害剤の効果を持つだろうし、それゆえに、ＩＬ−１活性
及び／又はＣＯＸ２の阻害剤と同様の臨床適応を持つだろう。
【０１４２】 ＩＬ−１は、炎症伝達物質（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）
である。ＣＯＸ２は、プロ炎症シグナル物質（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であるプロスタグランジンのア
ラキドン酸からの合成に関わる、プロ炎症酵素（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ ｅｎｚｙｍｅ）として当業者にはよく知られている。ＣＯＸ２がプロ炎症シ
グナル経路の結果、炎症の初期で発現されるのに対し、シクロオキシゲナーゼ１
（ＣＯＸ１）は、組織的に発現される関連酵素（ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
）である。アスピリンのようなＣＯＸ１阻害剤は、炎症を抑えるかもしれないが
、しかし胃潰瘍を含む胃腸障害などの副作用を持つ。それゆえに、メロキシカム
のような選択的ＣＯＸ２阻害剤の開発にさらなる努力が向けられている。しかし
、多くのＣＯＸ２阻害剤はまた、ＣＯＸ１に対する活性も持つ。
【０１４３】 選択的ＣＯＸ２阻害剤は、副作用を回避しながら、ＣＯＸ１阻害剤を含む非ス
テロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）に匹敵する、抗炎症、鎮痛、そして解熱作
用を持つかもしれない（Ｂｏｔｔｉｎｇ（１９９６）Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ＆
Ｐｅｒｓｐｅｃ ９（２），１２３−１２８に示される）。
【０１４４】 それゆえに、（前述の本発明の化合物のような）ＭＳＫ１／ＭＳＫ２活性や活
性化の阻害剤は、ＩＬ−１、ＣＯＸ２、又はプロスタグランジンが関係している
後述の疾患又は状態の治療の方法において有用かもしれない。
【０１４５】 そのような疾患や状態は、炎症又は組織の傷害に関連するものを含む。ＣＯＸ
２阻害剤が研究された炎症性疾患には、骨関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ）、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、強直
性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、そして他のリウ
マチ性や痛みの適応症を含む。炎症が関係し、またＭＳＫ１／ＭＳＫ２阻害剤が
有用かもしれない他の疾患は、喘息（ａｓｔｈｍａ）、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓ
ｉｓ）、敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、炎症性内臓疾患（ｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を含む。プロスタグラン
ジンは、子宮の収縮と痛み、および分娩に関係している（例えばＰｕｌｋｋｉｎ
ｅｎ（１９９３）Ｄｒｕｇｓ ４６（ｓｕｐｐｌ １），１２９−１３３および
Ｓｌａｔｅｒ等（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７２（
１），７７−８２参照）。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２阻害剤が有効かもしれないさらな
る疾患は、ＷＯ ９６／４１６４５に列挙されているだろう。
【０１４６】 本発明のさらなる側面は、炎症性疾患の治療に有用となり得る分子の同定にお
いて、本発明のスクリーニング方法のいずれかの用途である。
【０１４７】 本発明のさらなる側面は、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の活性の調節、例えば減少又
は増加を必要とする患者の治療に有用となり得る分子の同定において、本発明の
スクリーニング方法のいずれかの用途である。
【０１４８】 本発明のスクリーニング方法のいずれかによって同定可能な化合物は、炎症性
疾患の治療に有用となり得ると考えられている。炎症性疾患は、慢性関節リウマ
チ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓｉ
ｓ）、敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、
そして炎症性内臓疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓ
ｅ）、また上記のような他の疾患又は状態を含む。
【０１４９】 従って、本発明のさらなる側面は、炎症性疾患の患者を治療する方法を提供す
る。その方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の有効
量を患者に投与することを有する。ここでこの化合物は、既知のＳＡＰＫ２／ｐ
３８のピリジニルイミダゾール（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）阻害
剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｌｐｈｅｎ
ｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄ
ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではない。そのスクリーニング方法は、活性化又は
阻害する化合物を同定するだろう。いずれかの活性を持つ化合物が適するだろう
が、その化合物がＭＳＫ１又はＭＳＫ２により仲介されるリン酸化を阻害するこ
とが好ましい。
【０１５０】 またさらに発明は、患者の炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における、
本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の用途を提供する。ここ
でこの化合物はＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐ
ｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２
０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒド
ロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４
−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）
−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１５１】 本発明の更なる側面は、患者を治療する方法を提供し、患者はＣＯＸ２又はＩ
Ｌ−１の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とする
ものである。この方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能である
効果的な量の化合物を患者に投与することを有し、ここでこの化合物はＳＡＰＫ
２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉ
ｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ
（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−
（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎ
ｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄ
ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。スクリーニング方法は、活性化するか
阻害する化合物を同定するだろう。どちらかの活性がある化合物は適当であろう
が、その化合物はＭＳＫ１又はＭＳＫ２により仲介されるリン酸化を阻害するこ
とが好ましいだろう。
【０１５２】 またさらに発明は、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ
）、例えば減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造における
、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供する。ここ
でこの化合物は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（
ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ
２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒ
ドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（
４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ
）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１５３】 また本発明の更なる側面は、患者を治療する方法を提供し、患者はＣＯＸ２の
活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加（好ましくは減少）を
必要とするもので、この方法は、（１）ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓ
ｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、既知であるＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミ
ダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−
２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（
ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））と、
（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９
８０５９とを患者に投与することを有する。
【０１５４】 また本発明の更なる側面は、（１）ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃ
ａｄｅ）の阻害剤、例えば、既知であるＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダ
ゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）
、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２
−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（Ｆ
ＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘ
ｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））と、（
２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８
０５９、との用途を、ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減
少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造において提供する。
【０１５５】 また、本発明の更なる側面は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄ
ｅ）の阻害剤、例えば、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知であるピリジニルイミダゾー
ル阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例
えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２
−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰ
Ｉ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐ
ｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））の用途を、
ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とす
る患者を治療するための薬剤の製造において提供する。ここで、この患者は、Ｍ
ＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９
をすでに投与されているか今後投与されるものである。
【０１５６】 また、本発明の更なる側面は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ
）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９の用途を、ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎ）、例えば、減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の
製造において提供し、ここでこの患者は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａ
ｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知であるピリジニルイ
ミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）
−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）
（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒ
ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））を
すでに投与されているか今後投与されるものである。
【０１５７】 そのような、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物は、アポ
トーシスが伴われる病気を治療することに有用であるとさらに考えられる。例え
ば、そのような化合物はアポトーシスを抑制するかもしれず、これは細胞損傷過
程の間又は細胞損傷過程に続く細胞生存を助けるだろう。そのような病気の例は
、限定はされないが、虚血性疾患（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、例
えば発作（ｓｔｒｏｋｅ）と心筋梗塞、神経損傷（ｎｅｕｒａｌ ｉｎｊｕｒｙ
）と心筋梗塞を含む。
【０１５８】 ＣＯＸ−２は長期間の増強作用とシナプスの塑性に伴われるだろうし、発現は
アポトーシス細胞死に優先し、アルツハイマー病のような神経退行性の病気に伴
われるだろう。焦点となっている虚血（ｉｓｃｈａｅｍｉａ）は、皮質神経での
ＣＯＸ２発現を含み、これは特に虚血性付随（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｉｎｃｉｄ
ｅｎｔ）に続く死のようなものであろう。
【０１５９】 本発明の化合物のいくつか、例えば、ＣＲＥＢの増大した活性化をもたらす化
合物はアポトーシスを助けるだろう。アポトーシスを助けている症状は、炎症の
分解を含むためになりうる。ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の減少した活性をもたらす本
発明の化合物は、アポトーシスを阻害するだろう。
【０１６０】 したがって、本発明のさらなる側面は、虚血性疾患の患者を治療する方法を提
供し、この方法は、本発明のスクリーニング方法により同定可能である、効果的
な量の化合物を患者に投与することを有するもので、ここでこの化合物はＳＡＰ
Ｋ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍ
ｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰ
Ｉ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５
−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅ
ｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉ
ｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１６１】 また更に発明は、患者の虚血性疾患を治療するための薬剤の製造における、本
発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供し、ここでこの
化合物は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒ
ｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３
５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキ
シフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆ
ｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５
−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１６２】 ＣＯＸ２は組織損傷（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａとａｌｌｏｄｙｎｉａ）に続
いて起こる痛覚の変化に伴われ得るので、ＭＳＫ１の阻害剤は無痛覚症に有用だ
ろう。ＣＯＸ２の発現は、偏頭痛に伴われ得るため、ＭＳＫ１の阻害剤は偏頭痛
の治療に有用であろう。従って、本発明のさらなる側面は、偏頭痛を持つ又は無
痛覚症をわずらう患者を治療する方法を提供し、この方法は、本発明のスクリー
ニング方法により同定可能であって、効果的な量の化合物を患者に投与すること
を有する。
【０１６３】 ＣＯＸ２は、がんに関わる。ＣＯＸ２を阻害することはがんを防止又は治療す
ることに有用であろう。ＣＯＸ２は血管形成を促進し得る。ＣＯＸ２の阻害は、
例えば結腸がんで、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）のセラ
ミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）への変換を順々に刺激しうるアラキドン酸（ａｒａｃ
ｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）のレベルを増加することにより、抗がん剤効果を持
つだろうが、これはアポトーシスの仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として既に示唆
されている。従って、上記本発明の化合物のようなＭＳＫ１阻害剤は、がんの治
療又は防止に有用だろう。
【０１６４】 本発明の化合物はまた、アルツハイマー病の治療又は防止に有用だろう。ＮＳ
ＡＩＤｓとコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）（抗炎症性
でもある）はアルツハイマー病の発病の遅延又は進行を遅らせることに有用であ
ると示唆されており、たとえ低用量で使用したとしても、鎮痛効果には十分であ
るが、抗炎症性治療のために用いられるよりも効果は少ない。ＣＯＸ２発現は、
炎症性の仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）に応じてアルツハイマー病の脳と膠細胞
で高められることが示されている。形質転換したマウスモデルのニューロンでの
ＣＯＸ２の過剰発現は、インビトロでの（−アミロイド（−ａｍｙｌｏｉｄ）神
経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を導くだろうから、アルツハイマー病で
のＣＯＸ２の役割を裏付けている。従って、ＭＳＫ１阻害剤は、アルツハイマー
病及び他の神経退行性の病気の治療又は防止に有用だろう。
【０１６５】 Ｆｏｓは細胞のがん化及び悪性がんに伴うだろう。従って、本発明のさらなる
側面は、がんを持つ患者を治療する方法を提供し、この方法は本発明のスクリー
ニング方法により同定可能である効果的な量の化合物を患者に投与することから
なり、ここでこの化合物はＰＤ９８０５９ではない。この化合物はＲｏ３１８２
２０でないことが好ましい。
【０１６６】 また本発明のさらなる側面は、がんを治療するための薬剤の製造における、本
発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供し、ここでこの
化合物はＰＤ９８０５９ではない。この化合物はＲｏ３１８２２０でないことが
好ましい。
【０１６７】 前述の本発明の化合物又はこれらの調合物は、内服や非経口（例えば、皮下又
は筋肉）注射を含む従来のいずれかの方法により投与され得る。治療は一回の服
用、又は時間間隔を開けた複数回の服用からなるだろう。
【０１６８】 本発明の化合物が単独で投与されることが可能である間に、それを薬剤の調合
として１つ又はそれ以上の受容可能なキャリアと共に示すことが好ましい。キャ
リアは、本発明の化合物と適合可能であるという意味で“受容可能”でなければ
ならず、それらの受容体に有害であってはならない。典型的には、キャリアは無
菌かつ発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）フリーの水又は塩類溶液だろう。
【０１６９】 従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物
と、薬学的に受容可能なキャリアとを有する薬剤の組成を提供するもので、ここ
で、この化合物はＰＤ９８０５９、Ｒｏ３１８２２０、又はＳＡＰＫ２／ｐ３８
の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌ
ｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４
−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリ
ジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２
−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍ
ｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１７０】 本発明のさらなる側面は、化合物のためのスクリーニングアッセイ（ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）においての、本発明の第一の側面で定義されたような
ポリペプチド（プロテインキナーゼ）の用途を提供するものである。その化合物
は前記プロテインキナーゼの活性を阻害するか、前記プロテインキナーゼの相互
作用を妨げる。
【０１７１】 本発明のさらなる側面は、前記スクリーニング方法を行う際に有用なパーツキ
ット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を提供する。従って、パーツキットは、本発
明のポリペプチドと、このポリペプチドの基質とを有する。ポリペプチドの基質
は、例えば、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）、ＣＲＥＢ又はＣ
ＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）、又は、例えばＧＳＴ−ＣＲＥＢ又
はＡＴＦ１又はそれらの融合タンパク質であるＣＲＥＢ融合タンパク質である。
代わりになるべきものとして、このキットは、本発明のポリペプチドと、上記の
ような本発明のポリペプチドを活性化するのに有用なタンパク質、例えばＭＡＰ
Ｋ２、を有してもよい。このキットは、（１）本発明のポリペプチドと（２）上
記のような、前記ポリペプチドの基質と、（３）上記のような、前記ポリペプチ
ドを活性化する際に有用なタンパク質とを有してもよい。
【０１７２】
【発明の実施の形態】
本発明は以下の図と実施例とを参照してより詳細に説明される。
【０１７３】 実施例１：マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）及びストレス活性化されたプロテ
インキナーゼ（ＭＳＫ１）、新規な２つのキナーゼドメイン酵素は、ＭＡＰＫと
ＳＡＰＫ２／ｐ３８によって直接活性化されるもので、おそらくＣＲＥＢの活性
化を仲介するだろう。
【０１７４】 私達は、２つのプロテインキナーゼドメインを単一のペプチドに含む、新規な
マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）及びストレス活性プロテインキナーゼ（ＭＳＫ
１）及び密接に相関した同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（ＭＳＫ２）を同定した
。ＭＳＫ１（８０２残基）は、ＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ−１（Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ｐ９０ ＲＳＫともいう）他の“２つのキナーゼドメイン”
酵素に対して全アミノ酸配列の４３％が相同性を示す。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端
キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での対応するドメインに対して５４％
及び４４％が同一であり、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での４つの主要な活性化リン酸化
部位はＭＳＫ１に保持されている。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と同様に、ＭＳＫ１はＭ
ＡＰＫ２／ＥＲＫ２によりインビトロで活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と
異なり、ＭＳＫ１はストレス活性プロテインキナーゼ２ａ（ＳＡＰＫ２ａ、ｐ３
８ともいう）及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２によっても活性化される。これらの
結果と一致して、内因性のＭＳＫ１は、２９３細胞内で、ポリペプチド成長因子
／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｏｎ）によって、又はＵＶ放射、酸化的及び化学的ストレスへの暴露によっての
いずれかにより活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は意味深いことに成長因子
／ホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
）刺激のみで活性化される。成長因子／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏ
ｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によるＭＳＫ１の活性化は、ドラッ
グＰＤ ９８０５９、これはＭＡＰＫカスケード（ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ）
の活性を抑制する、により阻害されるが、一方ＵＶ放射、酸化的及び化学的スト
レスによるＭＳＫ１の活性化はＳＢ ２０３５８０、すなわちＳＡＰＫ２ａ／ｐ
３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特定の阻害剤によりほとんど阻害される。ヒ
ーラ（ＨｅＬａ）細胞では、ＰＤ ９８０５９とＳＢ ２０３５８０との両方が
それぞれＴＮＦ、ＮＧＦ、及びＦＧＦによるＭＳＫ１の活性化抑制に必要とされ
る。なぜなら、このアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）はＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＳＡ
ＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方を活性化するからである
。ＭＳＫ１の活性化は、Ｎ末端又はＣ末端キナーゼドメインのどちらかにおける
変異を単一（ｓｉｎｇｌｅ）不活性化させることにより終了する。ＭＳＫ１は非
刺激又は刺激細胞の核に局在化するが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは、同じ条件下で
はほとんど細胞質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）に局在化する。ＭＳＫ１は、ＰＫ
Ａ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２より非常に低いＫｍ値で、転
写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）ＣＲＥＢをＳｅｒ１３３
においてリン酸化する。Ｓｅｒ１３３周辺の配列に対応するペプチドは、著しく
低いＫｍ値（＜０．１（Ｍ）でリン酸化される。４つの細胞系内でのＣＲＥＢ及
びＡＴＦ１の作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）誘導活性化でのＳＢ ２０３５８０、Ｐ
Ｄ ９８０５９及びＲｏ ３１８２２０の効果は、これらの阻害剤のＭＳＫ１活
性化での効果を反映し、この過程でのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３
及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の役割を排除している。これらの結果は他の観察結果と
共に、ＭＳＫ１はＣＲＥＢの成長因子及びストレス誘導活性化を仲介するだろう
ということを示唆している。
【０１７５】 結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
【０１７６】 新規なＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１関連キナーゼとしてのＭＳＫ１の同定。私達は、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＮ末端キナーゼドメインをコード化するＤＮＡ配列を使用し
、ＮＣＢＩ ＥＳＴデータベースに質問した（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）。この
調査は、このサブファミリーの新規なメンバーの全長ｃＤＮＡクローンをコード
化する１つのＥＳＴ（ＡＡ１１５８５７１）を同定した。以下ＭＳＫ１という。
オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、
分子量８９．９ｋＤａの８０２のアミノ酸のタンパク質をコード化した。５’か
ら予測された開始ＡＴＧコドンのすぐに終止コドンがある。ＭＳＫ１ポリペプチ
ドドメインは２つのプロテインキナーゼドメイン（図１）を持ち、その両方とも
全プロテインキナーゼの１１のサブドメインの特徴を含んでいた（Ｈａｎｋｓ等
、１９８８）。ＭＳＫ１はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の３つのアイソフォームと最大の
類似性を示し、これはまた２つのキナーゼドメイン（図２Ａ）を持つ。ＭＳＫ１
のＮ末端及びＣ末端キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の対応するキナー
ゼドメインと５４％及び４４％が同一であった。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＳＫ１
間の全一致は４３％であった。私達は、多くの組織由来のＭＳＫ１のフラグメン
ト（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコード化する１４のヒトＥＳＴクローン（表１）を同
定したが、これはＭＳＫ１が幅広く発現する酵素であることを示している。
【０１７７】 表１ ヒトＭＳＫ１ ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ） ＥＳＴの由来組織 ＡＡ３１４５６５、ＡＡ３０５１６３ 結腸がん腫 ＡＡ１３４３５９、ＡＡ１３４３５８ 結腸 ＡＡ６９９７２９、Ｒ１１２３５、Ｔ９７５８４、Ｔ９７５３８、Ｒ１１１８３
胎児の肝臓脾臓 Ｗ０４９３０ 胎児の肺 ＡＡ１５８５７２、ＡＡ１５８５７１ 膵臓 ＡＡ３２２２７０ 小脳 Ｈ０９９８５、ＨＯ ９９８６、Ｆ０５７０１、ＨＳＣ０ｊＥ０８１ 幼児の脳 Ｎ３１６４１、Ｎ５７０９６ 胎盤 ＡＡ２５５８４６、ＡＡ２５５９９６ 胚中心Ｂ 細胞 ＡＡ８９７２２１ 混合の
【０１７８】 マウスＭＳＫ１ ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ
ｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ） ＡＡ４７２１６５ 乳腺 ＡＡ３８９１６８、ＡＡ０６１０１６ 胚 ＡＡ４４４３６６ 心臓
【０１７９】 ヒトＭＳＫ２ ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ） Ｈ４１６４７ 成人の脳 Ｒ１７１０９ 脂肪細胞 Ｔ１９７６５ 心臓血管の システム Ｒ７１９６９、ＡＡ６３１８９７、ＡＡ５０５８４２ 乳房腫瘍 ＡＡ４４３６０１ 卵巣腫瘍 ＡＡ６７８６７０ ゲスラーウィルムス（Ｇｅｓｓｌｅｒ Ｗｉｌｍｓ）腫瘍 ＡＡ５７０６６８１ 前立腺腫瘍 ＡＡ５９４５５９、ＡＡ５７６９７９、ＡＡ５６８８９５ 結腸腫瘍 ＡＡ８５７４３１ 咽頭 がん腫
【０１８０】 マウスＭＳＫ２ ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃ
ｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ） ＡＡ４７２１６５ 乳腺 ＡＡ３８９１６８ 胚 ＡＡ０６１０１６ 胎児 ＡＡ６５７１０８ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ＡＡ２６７４９０ リンパ節 ＡＡ４４４３６６ 心臓
【０１８１】 ヒト組織のノーザンブロット分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）は、ＭＳＫ１は調べられた全組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及
び膵臓）で４ｋｂ転写物として発現されることを示し、脳、筋肉及び胎盤におい
て最高レベルで観察された（データは示さず）。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端キナー
ゼドメインの配列は、ＭＡＰＫファミリーメンバーにより活性化される他のプロ
テインキナーゼと共に、図２Ｂに示す。
【０１８２】 私達はまた、別のプロテインキナーゼ、これのアミノ酸配列の７５％はＭＳＫ
１と同一でありＭＡＰＫＡＰＫ１とは４０％のみ同一である、をコード化するＥ
ＳＴ ｃＤＮＡクローン（表１）を見出し、これをＭＳＫ２と名づけた。マウス
（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＳＫ２のほぼ全長のコード配列及びヒトＭＳＫ２の部分配列
をＭＳＫ１と並べて図２Ｃに示す。マウス（ｍｕｒｉｎｅ）及びヒトＭＳＫ２配
列はアミノ酸配列が９０％一致する。私達は、多数の細胞及び組織由来であるＭ
ＳＫ２のフラグメントをコード化する８つのヒトＥＳＴ ｃＤＮＡクローンを同
定した。このうち６つは腫瘍細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）であった。ヒト組
織のノーザンブロット分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）
は、ＭＳＫ２は３ｋｂ転写物として、ＭＳＫ１のそれと同様の分布で発現するこ
とを示した（結果は示さず）。
【０１８３】 ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２およびＳＡＰＫ２／ｐ３８によるインビトロ（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）におけるＭＳＫ１の活性化。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（イントロダクシ
ョン参照）に存在する４つの重要な活性リン酸化部位（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）が、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２の
中に保存される（図２）。プロリン残基（ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）
へと続くＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｓｅｒ ３６０およびＴｈｒ ５８１）の中の４
つの部位のうち２つは、ＭＡＰＫによってリン酸化される（図２Ｃ）。これらの
観察によって、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２が１以上のＭＡＰＫによって活性化され
ているだろうということが示された。ＭＡＰＫによるＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−
Ｋｌａとの活性化を比較するために、両方の酵素が、ヒト胚腎臓２９３細胞（ｈ
ｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌｓ）の中で、
アミノ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質（ｆｕｓｉｏ
ｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（以下、ＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ
−Ｋ１ａと呼ぶ）として発現された。両方のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は
、グルタチオン−セファローゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）で精製され、そして、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ｐ
ｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）にか
けたとき、単一で主要なクーマシーブルー染色帯（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕ
ｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂａｎｄ）を示した（図３Ａ）。ＳＤＳ／ポリアクリル
アミドケル電気泳動（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって概算されたＧＳＴ−ＭＳＫ１の見かけの分
子量（１１６ｋＤａ）は、アミノ酸で６２分子分短い後者の酵素（図２Ａ）と一
致したＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（図３Ａ）よりわずかに大きかった。
【０１８４】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）と名
付けられたペプチドに対して高い活性を有することが知られている（Ａｌｅｓｓ
ｉ等、１９９６ａ）。一晩中血清枯渇された（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖｅｄ）２
９３細胞から精製されたＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
は、ＭｇＡＴＰおよび活性ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とのインキュベーションによっ
て１００倍以上に強められた基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（２−４ Ｕ／ｍｇ）
に対する低い活性を有した（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＧＳＴ−ＭＳＫ１もまたＳＡ
ＰＫ２ａ／ｐ３８およびＳＡＰＫ２ｂ／３８βによって同様に活性化された（図
４Ａ）が、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは活性化されなかった（図３Ｃ）。ＳＡＰＫ１
／ＪＮＫ１γおよびＳＡＰＫ３／ｐ３８βは、ＧＳＴ−ＭＳＫ１とＧＳＴ−ＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１ａとの両方を活性化させなかった。ＳＡＰＫ４／ｐ３８δは、Ｇ
ＳＴ−ＭＳＫ１の弱い活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で、ＧＳＴ−ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ１ａを活性化させなかった。ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（データ省略）およ
びＳＡＰＫ２／ｐ３８（図３Ｄ）のＧＳＴ−ＭＳＫ１を活性化させる能力には、
この酵素のリン酸化の程度と相関関係があった。
【０１８５】 内因性ＭＳＫ１（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＭＳＫ１）は、インビトロ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）でＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を介してＥＧＦおよびＴＰＡによって、さ
らに、ＳＡＰＫ２／ｐ３８経路を介してストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ
ｓｔｉｍｕｌｉ）によって活性化される。図３に表される実験によって、ＭＳＫ
１が古典ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ
ｃａｓｃａｄｅ）を活性化させる刺激と同様にＳＡＰＫ／ｐ３８アイソフォー
ム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を活性化させる刺激に応答して活性化される可能性が生
じた。この可能性を調べるために、三つの抗体が作製された（ｗｅｒｅ ｒａｉ
ｓｅｄ）、１つは残基２６から４４に対する（ａｇａｉｎｓｔ）（抗体“Ａ”）
、２番目は残基３８４から４０２に対する（抗体“Ｂ”）、３番目は残基７１６
から７３４に対する（抗体“Ｃ”）。３つすべての抗体は量的にＭＳＫ１を免疫
沈降させ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）（図示せず）、発現された
ＭＳＫ１（図４Ａ）または細胞ライゼート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）中の内
因性ＭＳＫ１の免疫沈降は、適切なペプチド免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）との
インキュベーションによって阻害された。
【０１８６】 この研究で使用されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの両方を免疫沈降させる（図４Ｂおよび図４Ｃ、Ａｌｅｓｓ
ｉ等、１９９５）が、しかし、ＭＳＫ１を免疫沈降させなかった（図４Ａ）。さ
らに、どのＭＳＫ１抗体も、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまたはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ
を免疫沈降させなかった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＭＳＫ１抗体“Ａ”を作製さ
せる（ｒａｉｓｅ）のに使用されたペプチド配列は、ＭＳＫ２の中で保存されず
、抗体“Ｂ”及び“Ｃ”を作製させる（ｒａｉｓｅ）のに使用された１９残基ペ
プチドは、ＭＳＫ２とともにそれぞれ９および１２の保存残基（ｃｏｎｓｅｒｖ
ｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）しか有していない。３つすべてのＭＳＫ１抗体は、Ｅ
ＧＦ、ＴＰＡまたはストレスに曝された２９３細胞およびＴＮＦによって刺激さ
れたヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）の両方の中で、同様のＭＳＫ１活性の
レベルを免疫沈降させた。これらの結果より、ＭＳＫ２はＭＳＫ１とともに同時
免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）されないことが示さ
れる。
【０１８７】 内因性ＭＳＫ１は、ＥＧＦ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢
酸塩（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔ
ａｔｅ）（ＴＰＡ）によって前もって刺激され、または、細胞性ストレス（ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ）（亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓ
ｅｎｉｔｅ）、ＵＶまたは過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）
）に曝された２９３細胞のライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）から抗体“Ａ”によっ
て免疫沈降された。これらの実験によって、ＭＳＫ１はこれら全ての刺激によっ
て強く活性化されることが示された（図５）。興味深いことに、ＥＧＦおよびＴ
ＰＡによるＭＳＫ１の活性化は、ＰＤ９８０５９、すなわち、ＭＡＰキナーゼキ
ナーゼ−１（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−１）の活性化の特定の阻害
剤によって大きく阻害された（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）が、しかし、ＳＢ２
０３５８０、すなわち、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８およびＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの
特定の阻害剤によって阻害されなかった（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）。対照的
に、ストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ ｓｔｉｍｕｌｉ）によるＭＳＫ１の
活性化は、ＳＢ２０３５８０によって大きく阻害されたが、しかし、ＰＤ９８０
５９によって阻害されなかった（図５Ａ）。抗体“Ｂ”または抗体“Ｃ”が抗体
“Ａ”の代わりに使用されたときも、同じ結果が得られた（データ省略）。
【０１８８】 細胞のＥＧＦおよびＴＰＡ刺激によって、２９３細胞中でＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
ａ／ｂが大きく活性化された。ＭＳＫ１の活性化のように、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
ａ／ｂの活性化はＰＤ９８０５９によって抑制されるが、ＳＢ２０３５８０によ
って抑制されなかった（図５Ｂ）。ストレス性刺激は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／
ｂの重要な活性化を誘発させなかった（図５Ｂ）が、しかし、ＳＢ２０３５８０
によって阻害されるがＰＤ９８０５９によって阻害されないＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２
の活性化を大きく誘発させた（図５Ｃ）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ＥＧＦまたは
ＴＰＡによってあまり活性化されなかった（図５Ｃ）。
【０１８９】 ＴＰＡおよびＵＶによるＭＳＫ１の活性化は、両方のキナーゼドメイン（ｋｉ
ｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）を要求する。ＭＳＫ１のキナーゼドメイン（ｋｉｎ
ａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での活性化のために要
求されることを立証するために、我々は、野生型ＭＳＫ１（ＷＴ−ＭＳＫ１）、
Ｎ末端キナーゼドメインが点突然変異によって不活性化される突然変異ＭＳＫ１
（ＮＴ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ＭＳＫ１）、および、Ｃ末端キナーゼドメイ
ンが不活性化されるさらなる突然変異体（ＣＴ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ＭＳ
Ｋ１）をエンコードするＤＮＡ発現構築物（ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）で、２９３細胞をトランスフェクションした（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｅｄ）。全ての構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）は、これらの免疫沈降
と細胞ライゼート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）からの検定（ａｓｓａｙ）とを
可能にするために、Ｎ末端“フラグ”タグ（方法参照）を有した。ＴＰＡによる
細胞の刺激またはＵＶの照射によって、それぞれ野生型ＭＳＫ１の２００倍、３
０倍に活性化が誘発された。内因性ＭＳＫ１についての結果と同様に、ＴＰＡに
よるトランスフェクションされたＭＳＫ１（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＭＳＫ１
）の活性化は、ＰＤ９８０５９によって阻害されたが、ＳＢ２０３５８０によっ
て阻害されなかった。一方、ＵＶ誘発活性化（ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ）は、ＳＢ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ９８０５９に
よって影響されなかった（図６Ａ）。トランスフェクションされた野生型酵素は
、ＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）および血清によって５０から１
００倍に活性化された。活性化は、ＰＤ９８０５９によって阻害されたが、ＳＢ
２０３５８０によって阻害されなかった（データ省略）。これらの観察によって
、内因性プロテインキナーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎ
ａｓｅ）の免疫沈降によって得られた結果、すなわち、ＭＳＫ１が、古典ＭＡＰ
キナーゼカスケード（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａ
ｄｅ）によって、もしくは、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路を介することによって、
細胞内で活性化されることが確証される。
【０１９０】 対照的に、ＮＴ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ＭＳＫ１、ＣＴ ｋｉｎａｓｅ−
ｄｅａｄ ＭＳＫ１の両方とも、ＴＰＡによる細胞刺激またはＵＶ照射の前後に
検出可能な活性を有していなかった（図６Ａ）。両方の”キナーゼ死（ｋｉｎａ
ｓｅ ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１突然変異体は、野生型ＭＳＫ１タンパク質（ｗｉｌ
ｄ ｔｙｐｅ ＭＳＫ１ ｐｒｏｔｅｉｎ）と同じ濃度に発現された（図６Ｂ）
。これらの観察によって、図６で測定されたＭＳＫ１の活性は、ＭＳＫ１自体に
よるもので、ＭＳＫ１とともに同時免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐ
ｉｔａｔｅｄ）された混入キナーゼ（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｋｉｎａｓｅ）
によるものではないことが立証される。
【０１９１】 ＭＳＫ１は核に局在化しており、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは細胞質に局在化して
いる。２９３細胞中で過剰発現された（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）野生型Ｍ
ＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）は、定量免
疫電子顕微鏡法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって調査された（図７）。ＭＳＫ１は、主に刺激を
受けていない細胞（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）の核に局在化され
ていた。核区画（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中のＭＳＫ１の密
度は、細胞質中に比べて１２から３０倍高かった（図７Ａおよび７Ｃ）。ＴＰＡ
での刺激によるＭＳＫ１の活性化（図７Ａおよび７Ｄ）またはＵＶ照射によるＭ
ＳＫ１の活性化（データ省略）によって、ＭＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌ
ｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）で一切変化が誘発されなかった。ＭＳＫ１は、
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに存在しない残基７２６から７４８まで（図１）の間
に、推定二分裂核局在シグナル（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｎｕ
ｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を有している（Ｒｏｂ
ｉｎｓ等、１９９１）。この観察と一致して、細胞中で過剰発現された場合、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは主に細胞質中に局在化した（図７Ｂ）。さらに、このキナ
ーゼの１００倍の活性化を誘発する（データ省略）細胞のＴＰＡ刺激をした後（
図７Ｂおよび７Ｅ）、核へのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの重要な転座（ｔｒａｎｓｌ
ｏｃａｔｉｏｎ）は観測されなかった。
【０１９２】 ＭＳＫ１は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において非常に有用なＣＲＥＢ
キナーゼである。ＭＳＫ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの基質特異性（ｓｕｂｓ
ｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）は、ＴＰＡ刺激および細胞ライゼー
ト（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）からの精製へと続く２９３細胞内のＧＳＴ融合
タンパク質（ＧＳＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現後に比較された
（図３Ａ）。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１、図８
Ａ）の飽和濃度でのＧＳＴ−ＭＳＫ１の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのそれと同じであることが分かった（図８の
凡例参照）。ＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＫｍは、ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａま
たはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに対して２から３（Ｍであった。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ
は、リン酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からＮ末端側へ３番目および５番目
の残基に位置する２つのアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）を含んでいるので、
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１によって効果的にリン酸化される。この理由から、ペプチド
ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ（ペプチド２、図８Ａ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに
よって、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅとほぼ同一のＫｍおよびＶｍａｘの値でリン酸化さ
れる。このペプチドがＭＳＫ１によってさらに効果的にリン酸化されることが分
かり、Ｋｍ値は０．２（Ｍであった。ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡにおけるポジション
ｎ−３のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をリシン（ｌｙｓｉｎｅ）に交換す
ること（ペプチド３、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと同様にＭ
ＳＫ１に対するＫｍが約１００倍に増加した。しかしながら、ポジションｎ−５
のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）に交換する
こと（ペプチド４、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに対するＫｍ
が５倍に増加したにもかかわらず、ＭＳＫ１に対するＫｍがあまり増加しなかっ
た。これらの実験から、ＭＳＫ１は、ポジションｎ−３にアルギニン（ａｒｇｉ
ｎｉｎｅｓ）を要求するが、ｎ−５に塩基性残基（ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ
）を要求しないことが示される。
【０１９３】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（
Ｔａｎ等、１９９６）は、それぞれ成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）
、ストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ ｓｔｉｍｕｔｉ）によって転写因子Ｃ
ＲＥＢ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＣＲＥＢ）の活性化を仲
介することが報告されていた。優勢的なＭＳＫ１の核局在化を考慮すると、これ
ら他のプロテインキナーゼと比較して、ＭＳＫ１がＣＲＥＢをリン酸化させる効
率を比較することは、それ故、興味深いことであった。これらの実験によって、
ＣＲＥＢがＫｍ値２（ＭおよびＣｒｏｓｓｔｉｄｅまたはＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ
と同様なＶｍａｘでリン酸化される驚くほどよいＭＳＫ１に対する基質であると
いう驚くべき知見が導き出された。対照的に、ＰＫＡによって、ＣＲＥＢが同じ
条件下でＫｍ値１７（Ｍでリン酸化された（データ省略）が、一方、リン酸化が
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（図８Ａ）またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（データ省略）
によって触媒作用されたとき、Ｋｍは高すぎて測定できなかった。その結果、Ｍ
ＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性がＣｒｏｓ
ｓｔｉｄｅおよび／またはペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対して相性がよいと
き、ＭＳＫ１による５（Ｍ ＣＲＥＢのリン酸化速度は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
に比べて３０倍速く、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに比べて１２倍速く、ＭＡＰＫＡＰ
−Ｋ２に比べて６０倍速かった（図８Ｂ）。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、
ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと比べて、熱ショックタンパク質２７
（その生理的基質（ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｓ）の一つ、Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）に対してはるかにより活性的であった
（図８Ｂ）。
【０１９４】 ＭＳＫ１によりリン酸化されたＣＲＥＢ上の残基は、Ｃ１８カラムでの消化物
（ｄｉｇｅｓｔ）のクロマトグラフィーへと続くトリプシン消化（ｔｒｙｐｔｉ
ｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって立証された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）。１
５％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で溶出されたある主要な３２
Ｐ−標識ペプチド（３２Ｐ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）が観察された
（図８Ｃ）。このペプチドはホスホセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）を含
み、さらに、固相シーケンス（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
）にかけたとき、Ｅｄｍａｎ分解（Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の３
番目のサイクル後に３２Ｐ放射能が解放された（データ省略）。その同定（ｉｄ
ｅｎｔｉｔｙ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメトリー（ｍａｓｓ ｓ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって立証されたが、その質量スペクトロメトリー
は、ペプチドの分子量（７５８．３３）が、残基１３１から１３５を有しＳｅｒ
１３３でリン酸化されている予期されたトリプシンホスホペプチド（ｅｘｐｅ
ｃｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）の分子量（７５８
．３６）と同一であるということを示した。同じ残基をリン酸化させることが知
られているＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）は、ＭＳＫ１と同じ
トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を標識化した（データ
省略）。
【０１９５】 ＣＲＥＢタンパク質によって得られた結果と一致して、ＣＲＥＢの残基１２６
から１３６（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ、ペプチド５、図８Ａ）に対応する合成ペ
プチド（ＣＲＥＢｔｉｄｅと呼ばれる）は、低すぎて測定できないほどのＫｍ値
（＜０．１（Ｍ）でリン酸化された。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、少なくとも２００倍高いＫｍ値でかなり乏しくこのペプ
チドをリン酸化させた。
【０１９６】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２が２９３細胞中でＵＶまたはＥＧＦによってＣＲＥＢおよ
びＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。星形胞子類似体（ｓｔａｕｒｏ
ｓｐｏｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）Ｒｏ ３１８２２０は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１ａ／ｂと同様に、ＩＣ５０値（ＩＣ５０ ｖａｌｕｅｓ）が１０から３０ｎＭ
までの範囲で（Ａｌｅｓｓｉ １９９７、図９Ａ）、全てのＰＫＣアイソフォー
ムを阻害する（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。本研究において、Ｒｏ ３１８２２
０は、インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）同程度の効力を持つ（ｅｑｕａｌｌｙ
ｐｏｔｅｎｔ）ＭＳＫ１活性の阻害剤であることが分かった（図９Ａ）。Ｒｏ
３１８２２０は、インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）１０（ＭでもＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ２をあまり阻害せず（図１１Ａ）、さらに、インビボで（ｉｎ ｖｉｖｏ
）ＵＶに応答してもＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化に影響を及ぼさない（図９Ｂ）
。さらに、ＲＯ ３１８２２０を有する細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂ
ａｔｉｏｎ）は、ＨＳＰ２７のＵＶ誘発リン酸化（ＵＶ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２に対する生理的基質（ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にあまり影響を及ぼさなかった
（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５、図９Ｃ）。並行した実験において、ＵＶによるＨ
ＳＰ２７のリン酸化は、ＳＢ２０３５８０によって遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ
）。ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのように環状ＡＭＰ濃度を増加させるアゴニスト（ａｇ
ｏｎｉｓｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍｏｎｔｍｉｎｙ １９８９）によって誘発
されるＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介する環状ＡＭＰ依存性プロテイ
ンキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ）もまた、１０（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０によってあまり阻害されな
かった（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。
【０１９７】 図９に示される結果によって、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化（およびＳ
ｅｒ６３で近い関係のＡＴＦ１（ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＴＦ１）の
リン酸化）を仲介する間に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の役割を評価する機会が提供さ
れた。我々は、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１が、２９３細胞のＵＶの照射またはＥＧ
Ｆによる処理後にすばやくリン酸化されること、および、リン酸化が５（Ｍ Ｒ
ｏ ３１８２２０によって大きく阻害されることを観測した（図１０Ａおよび１
０Ｂ）。対照的に、環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを介してＣＲＥＢリン
酸化を誘発させる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎによる
ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化が５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０によって影響
されなかった（図１０Ｃ）。ＭＳＫ１の活性化のように、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ
１のＵＶ誘発リン酸化が、ＳＢ ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ ９
８０５９によって阻害されず（図１０Ｄ）、一方、ＥＧＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化
（ＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、
ＰＤ ９８０５９によって阻害されるが、ＳＢ ２０３５８０によって阻害され
なかった（図１０Ｅ）。
【０１９８】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１がヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅ
ｌｌｓ）の中でＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。 内因性ＭＳＫ１が、ヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）の中で腫瘍壊死因子（
ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）（ＴＮＦ）によってすばやく
（しかし、一時的に）活性化された。興味深いことに、ＭＳＫ１の活性化に対す
るＳＣ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９の影響は、刺激時間とともに変化
した。５分後、活性化はＳＢ ２０３５８０によって完全に阻害されたが、ＰＤ
９８０５９によって影響されなかった。しかしながら、１５分後、ＭＳＫ１の
活性化がＳＢ ２０３５８０、ＰＤ ９８０５９のうちいずれか一方によって部
分的に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）が、両方のドラッグが一緒に加えられたな
らば、ほぼ完全に抑制された（図１１Ａ）。これらの観察は、ＳＡＰＫ２／ｐ３
８およびＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の異なる活性化速度
によって説明される。従って、ＴＮＦ刺激から５分後、（ＳＢ ２０３５８０に
よって阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によって阻害されない）ＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ２の活性化によって判断されるように、ＳＡＰＫ２経路が活性化される。対照
的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化の欠如によって判断されるように、５
分経過後も、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードは活性化されない（図１１Ｂおよび１
１Ｃ）。しかしながら、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の
両方の活性化によって判断されるように、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／
ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方が、ＴＮＦ刺激から１５分後、活
性化される。１５分後におけるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化は、ＰＤ ９
８０５９によって抑制されるが、ＳＢ ２０３５８０によって抑制されない（図
１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【０１９９】 ＴＮＦによるヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）の刺激は、ＣＲＥＢおよび
ＡＴＦ１のリン酸化をすばやく誘発した。５分後、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリ
ン酸化は、ＳＢ ２０３５８０によって阻害されたが、ＰＢ ９８０５９によっ
て影響されなかった（図１２Ａ）。１５分後、ＣＲＥＢのＴＮＦ誘発リン酸化（
ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３
５８０によって部分的に抑制され、ＰＤ ９８０５９によってわずかに抑制され
、両方の化合物の存在下では完全に阻害された（図１２Ｂ）。ＣＲＥＢの活性化
へのＳＢ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９の影響は、それ故、ＴＮＦ誘発
ＭＳＫ１活性化（ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＳＫ１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）
へのそれらの影響に類似していた（図１１）。ＴＮＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化（Ｔ
ＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、５（
Ｍ Ｒｏ ３１８２２０によって完全に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）（図１２
Ｃ）が、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化はこのドラッグによって影響されなかった
（データ省略）。
【０２００】 ＰＣ１２細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１またＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関があるという証
拠。ＰＣ１２細胞株のＮＧＦ刺激は、ＣＲＥＢのリン酸化（図１３Ａ）およびＭ
ＳＫ１の活性化（図１３Ｂ）を誘発させた。ＣＲＥＢのリン酸化およびＭＳＫ１
の活性化は、ＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０のうちいずれか一方を有す
る細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によってあまり影響され
ないが、両方のドラッグの存在下では強く阻害された（図１３）。これらの結果
によって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８経路の両方の阻害が、Ｓ
ｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化およびこれら細胞内でのＭＳＫ１活性化を阻害
するのに必要であることが示され、このことは、さらにディスカスション（Ｄｉ
ｓｃｕｓｓｉｏｎ）で考察される。
【０２０１】 ＭＳＫ１のように、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１もまたＮＧＦによって５倍に活性化さ
れたが、ＭＳＫ１と対比して、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化はＳＢ ２０３５８
０によって影響されず、ＰＤ９８０５９によって部分的に阻害され、両方のドラ
ッグの組み合わせによってさらに阻害されなかった。従って、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１の活性には、ＣＲＥＢのリン酸化と相関がなかった。以前に報告されたように
（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）、ＮＧＦは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化のうちど
の重要な活性化をもＰＣ２３細胞内で誘発しなかった。さらに、ＮＧＦ誘発ＣＲ
ＥＢリン酸化は、５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０によって抑制され（データ省略）
、再びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３に対する役割を排除した。
【０２０２】 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関がある
という証拠。この研究所での先行する研究によって、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄ
ｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）、ＦＧＦのうちいずれか一方によって誘発されるＳ
Ｋ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化が、ＳＢ ２０３５
８０によって抑制される（Ｔａｎ等、１９９６）。本研究において、我々は、こ
れらの細胞内でのＣＲＥＢおよびＭＳＫ１の亜ヒ酸ナトリウム誘発活性化（ｓｏ
ｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、Ｓ
Ｂ ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によっては阻害され
ないことを確証した。しかしながら、ＣＲＥＢのＦＧＦ誘発リン酸化（ＦＧＦ−
ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３５８０、
ＰＤ ９８０５９のうちいずれか一方によってわずかに阻害されたが、完全にＣ
ＲＥＢのリン酸化を抑制するには両方のドラッグの存在が必要であった（図１４
Ｄ）。同様に、それらの細胞内のＭＳＫ１のＦＧＦ誘発リン酸化は、ＳＢ２０３
５８０、ＰＤ９８０５９のうちいずれか一方の存在によって部分的にのみ抑制さ
れるが、両方の化合物の存在によって阻害される（図１４Ａ）。
【０２０３】 ＭＳＫ１と対比して、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）
およびＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化は、ＳＢ ２０３５８０によっ
て完全に阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によって阻害されず（図１４Ｃ）、そ
して、（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化または活性に影響を及ぼさない）Ｒｏ ３
１８２２０は、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化を大きく抑制した。これらの
知見によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン
酸化に対して速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。
混乱を避けるために、Ｒｏ ３１８２２０は、ＭＳＫ１活性の可逆的阻害剤であ
り、細胞内でＭＳＫ１活性に影響を及ぼさないことに注意すべきである。ひとた
び細胞が溶解され（ｌｙｓｅｄ）、ＭＳＫ１がライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）か
ら免疫沈降されると（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）、Ｒｏ ３１８
２２０阻害剤は除去され、従って、ＭＳＫ１はもはや阻害されない。
【０２０４】 ＭＳＫ１と対比して、ＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化は、ＰＤ ９
８０５９によって廃止されたが（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）、ＳＢ ２０３５８０に
よって廃止されなかった（図１４Ｂ）。しかしながら、（ＳＢ ２０３５８０が
存在していない状態での）ＰＤ ９８０５９は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリ
ン酸化をあまり抑制しなかった。
【０２０５】 細菌内毒素（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）は、ＲＡＷ ２６４
マウスマクロファージ細胞系統（ＲＡＷ ２６４ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈ
ａｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）内でＭＳＫ１およびＣＲＥＢリン酸化に刺激を与
える。図１５に示すように、ＲＡＷ ２６４マクロファージのＬＰＳ刺激によっ
て、ＭＳＫ１およびＣＲＥＢ／ＡＴＦ１リン酸化がもたらされる。５０（Ｍ Ｐ
Ｄ ９８０５９または１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０が、ＭＳＫ１およびＣＲＥ
Ｂ／ＡＴＦ１のリン酸化を阻害しているように見える。
【０２０６】 ディスカスション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
【０２０７】 我々は、新規で幅広く発現されたＭＳＫ１と呼ばれるプロテインキナーゼの配
列（図１）と、近い関係のＭＳＫ２のほぼ完全な配列（図２、図１６および表１
）をここに示す。ＭＳＫ１およびＭＳＫ２は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォ
ームと非常に類似していており（全体のアミノ酸配列に対して４０％の相同性（
ｉｄｅｎｔｉｔｙ））、単一ポリペプチドに２つのプロテインキナーゼドメイン
（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）を有する点でそれらがＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォームと類似している（図２）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
のＮ末端キナーゼドメインが外因性基質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅｓ）をリン酸化するが、一方では、唯一知られたＣ末端ドメインの役割がＮ
末端ドメインを活性化することである（イントロダクション（Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ）参照）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＣ末端キナーゼドメインの重要性は、
不活性突然変異（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）がＮ末端キナ
ーゼドメインの活性化を８５から９０％抑制するという知見によって示される（
Ｌｅｉｇｈｔｏｎ等、１９９６）。対照的に、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメイ
ン内の不活性な突然変異は（Ｎ末端キナーゼドメイン内の不活性な突然変異のよ
うに）、完全に活性化を廃止する（ａｂｏｌｉｓｈｅｓ）（図８）。もし、４つ
の重要なリン酸化部位の保存によって示唆されたように（図２）ＭＳＫ１の活性
化のメカニズムがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のそれと類似しているならば、これによっ
て、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメインがＮ末端ドメインの活性化に不可欠であ
ることが示される。
【０２０８】 ＭＳＫ１が、インビボで（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード、Ｓ
ＡＰＫ２／ｐ３８経路のうちいずれか一方によって活性化される。このことは、
ＰＤ ９８０５９が成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）およびホルボー
ルエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒｓ）によって内因性またはトランスフ
ェクションされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＭＳＫ１の活性化を大きく抑制す
るが、一方では、ＳＢ ２０３５８０がＵＶの照射または酸化的ストレス（ｏｘ
ｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）によって誘発された活性化を抑制するという知
見によって立証された（図５および図６）。これらの知見に一致して、ＭＳＫ１
がインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２／ｐ３
８のうちいずれか一方によって活性化されることが可能である（図３）。ヒーラ
細胞内のＴＮＦ（図１１０、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＦＧＦ（図１４）およびＰ
Ｃ１２細胞内のＮＧＦ（図１３）など、幾つかのシグナル（ｓｉｇｎａｌｓ）が
、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２およびＳＡＰＫ２／ｐ３８の両方を活性化させ、そして
、両方のシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ）は、これら
の細胞内でＭＳＫ１の活性化に寄与する。ＭＳＫ１およびＭＮＫ１（Ｆｕｋｕｎ
ａｇａ、Ｈｕｎｔｅｒ、１９９７およびＷａｓｋｉｅｗｉｃｚ等、１９９７）が
インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）両方のＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（
ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ）によって活性化される
ことが可能である一方、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１がＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２によっての
み活性化されることが可能であるかという理由は不明瞭である。思うに、ＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１が、ＳＡＰＫ２／ｐ３８による認識のために必要とされる動機（ｍ
ｏｔｉｆ）を欠いているか、これらの酵素による認識を阻止する動機を含んでい
るかである。
【０２０９】 ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）またはＳＡＰＫ２／ｐ３８経
路の活性化を引き起こすシグナルによってＭＳＫ１がインビボで（ｉｎ ｖｉｖ
ｏ）活性化されるという知見は、ＭＮＫ１のように、それが様々な細胞外シグナ
ル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｓ）の効果を統合する役割を演
じていることを示している。従って、ＭＳＫ１の基質は、おそらく、マイトジェ
ン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎ
ａｌｓ）の両方に応答してリン酸化されるタンパク質である。そのような２つの
タンパク質は、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）ＣＲ
ＥＢおよびＡＴＦ１であり（イントロダクション参照）、我々は、ＣＲＥＢがイ
ンビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＭＳＫ１に対する驚くほど良い基質であること
が分かった（図８）。ＭＳＫ１は、Ｓｅｒ １３３でのみ、すなわち、インビボ
で（ｉｎ ｖｉｖｏ）マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シ
グナル（ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｓ）に応答してリン酸化される活性化部位
（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）でＣＲＥＢをリン酸化させる。ＭＳＫ１に
よるＣＲＥＢのリン酸化に対するＫｍは、ＰＫＡ＜ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＭ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ２によるリン酸化に比べてはるかに低い（図８）。ＭＳＫ１は、
同等の残基で、０．１（Ｍ未満と概算された驚くほど低いＫｍでＣＲＥＢｔｉｄ
ｅをリン酸化させる（図８Ａ）。我々の知識の中で、この値は、これまで同定さ
れてきた（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）いかなるプロテインキナーゼのいかなるペプ
チド基質に対する最も低いＫｍ値である。これらの観察によって、ＭＳＫ１（お
よび／またはＭＳＫ２）がマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス
性刺激によるＣＲＥＢの活性化を仲介し、そして、ＭＳＫ１の核局在化（ｎｕｃ
ｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）（図７）はそのような役割と矛盾しないことが示
唆される。
【０２１０】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ニューロン細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ｎｅｕｒｏｎａｌ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）でストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ
ｓｉｇｎａｌｓ）またはＦＧＦによってＣＲＥＢの活性化を仲介するであろう
（Ｔａｎ等、１９９６）。しかしながら、本研究では、インビボでの（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化もインビトロでのその活性（図９および１
４）も１０（ＭまでのＲｏ ３１８２２０によって影響されず、５（Ｍ Ｒｏ
３１８２２０は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞および他の細胞株でＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を
活性化させるすべてのシグナルに応答してＳｅｒ１３３でＣＲＥＢリン酸化を抑
制する（図１０，１２および１４）。さらに、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は代わるべき
ものとしてのスプライスＣＲＥＢ２変異体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐ
ｌｉｃｅｄ ＣＲＥＢ２ ｖａｒｉａｎｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）
をＳｅｒ１３３よりすばやくＳｅｒ９８でリン酸化させるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
２を強く活性化させるアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）による刺激後、Ｓｅｒ９８
でのＣＲＥＢのリン酸化は観測されないことが分かった。これらの結果から、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３活性がＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＣＲＥＢのストレス誘発
活性化（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｎ）に対して速度制
限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。ストレス性刺激によ
って活性化されることが知られており、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化させ
る唯一の他のプロテインキナーゼはＭＳＫ１である。ＭＳＫ１はインビトロで（
ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりもはるかに効率的にＣＲＥＢをリン
酸化させ（図８）、Ｒｏ３１８２２０によって強く（ｐｏｔｅｎｔｌｙ）阻害さ
れる（図９）。これらの理由から、現時点において、ＭＳＫ１（および／または
ＭＳＫ２）が、Ｓｅｒ１３３でのストレス誘発ＣＲＥＢリン酸化（ｓｔｒｅｓｓ
−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を仲介するも
っともよい候補である。
【０２１１】 ＭＳＫ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、両方とも、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒｓ）またはホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒｓ）
による細胞刺激の後に、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓによって活性化され、それらは、
両方とも、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化させ、さらに、それらは、両方と
も、Ｒｏ ３１８２２０によって強く阻害される。このことによって、ＣＲＥＢ
の成長因子／ホルボールエステル誘発活性化（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｐ
ｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）がＭＳＫ１
またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームによって仲介されるかどうかという疑
問が浮上している。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａよりもかなり
効果的なＣＲＥＢキナーゼであり（Ｘｉｎｇ等、１９９６）、また、ＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１ｂは、ＮＧＦ刺激ＰＣ１２細胞（ＮＧＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＰＣ
１２ ｃｅｌｌｓ）から調製されたライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）内で検出可
能な主要なＣＲＥＢキナーゼである（Ｇｉｎｔｙ等、１９９４；Ｘｉｎｇ等、１
９９６）ことが報告されている。しかしながら、我々の研究によると（ｉｎ ｏ
ｕｒｈａｎｄｓ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは同様な
キナーゼでＣＲＥＢまたはＣＲＥＢｔｉｄｅをリン酸化させたが（図８）、両方
ともＭＳＫ１ほどわずかに（ｒｅｍｏｔｅｌｙ）効果的ではなかった（図８）。
【０２１２】 さらに、生化学的に検出された主要なプロテインキナーゼがインビボで（ｉｎ
ｖｉｖｏ）特定の基質に対する関連酵素でないことがその後示された例が多く
ある。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（
ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３）をリン酸化させ、お
よび、不活性化させるＬ６ミオチューブ（Ｌ６ ｍｙｏｔｕｂｅｓ）から調製さ
れた抽出物中の主要なインスリン誘発プロテインキナーゼ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）であるが（Ｃｒｏｓｓ等
、１９９４）、それでも、ＰＤ ９８０５９を使用したその後の研究はこのプロ
セス（ｐｒｏｃｅｓｓ）でその掛かり合い（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を排除し
た（Ｃｒｏｓｓ等、１９９５）。ＭＳＫ１が生化学的分析によって事前に検出さ
れなかった理由として、検査された細胞内でのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ２の活性と比較して、かなり低いＭＳＫ１の活性に原因があるのかも
しれない。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２と比較して細胞内の低
いＭＳＫ１の活性によって、ＭＳＫ１活性が事前の生化学的分析によって検出さ
れなかった理由が説明されるだろう（Ｘｉｎｇ等、１９９６およびＴａｎ等、１
９９６）。
【０２１３】 最近、Ｘｉｎｇ等（１９９８）は、ＳＢ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５
９の両方がＰＣ１２細胞内でＣＲＥＢのＮＧＦ誘発リン酸化（ＮＧＦ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を妨げなければならないことを報告
した。我々は、この観察を確証し（図１３Ａ）、ＮＧＦがこれらの細胞内でＭＳ
Ｋ１を活性化することを実証した（図１３Ｂ）。ＣＲＥＢのリン酸化のように、
ＮＧＦによるＭＳＫ１の活性化は、これらの細胞内においてＳＢ ２０３５８０
およびＰＤ ９８０５９の両方の存在下でのみかなり阻害される。これらの観察
によって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）、ＳＡＰＫ２／ｐ３
８経路のうちいずれか一方の活性化がＭＳＫ１の最大の活性化およびＳｅｒ１３
３でのＣＲＥＢのリン酸化を引き起こすのに十分であることが示される。対照的
に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームのＮＧＲ誘発活性化（ＮＧＲ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３５８０によって影響されず、
ＰＤ ９８０５９によって（ＳＢ ２０３５８０が存在していない状態または存
在している状態で）部分的に阻害されるだけである。従って、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１アイソフォーム単体では、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのＮＧＦ誘発リン酸化（
ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を説明することが
できない。
【０２１４】 Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化には、ＴＮＦ刺激ヒーラ細胞（ＴＮＦ−
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）（図１１と１２との比較）およ
びＦＧＦ処理ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＦＧＦ−ｔｒｅａｔｅｄ ＳＫ−Ｎ−ＭＣ
ｃｅｌｌｓ）（図１４）におけるＭＳＫ１の活性化とよりよい相関がある。両方
の状況において、ＭＡＰＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８経路が活性化され、ＭＳＫ
１の活性化と同様にＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化の抑制には、ＳＢ ２０
３５８０およびＰＤ ９８０５９の両方の存在が必要であった。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ
およびヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）において、ＰＤ ９８０５９はそれ
ぞれＦＧＦおよびＴＮＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化を完全に抑制し、そ
れぞれのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）によって誘発されたＣＲＥＢリン酸化に
わずかに影響をもたらした。
【０２１５】 概して、成長因子／ホルボールエステルによるＣＲＥＢの活性化における１以
上のＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（または未だ同定されていないままのプ
ロテインキナーゼ）に対する役割が完全に排除されることができないが、我々の
結果によって、ＭＳＫ１（および／またはＭＳＫ２）がそれらの刺激によるＣＲ
ＥＢの活性化を仲介することが示唆される。
【０２１６】 材料および方法
【０２１７】 材料。プロテインキナーゼの検定のためのペプチドが、ＤｕｎｄｅｅでＦ．Ｂ
．Ｃａｕｄｗｅｌｌ氏によって合成され（ＭＲＣユニット）、抗体を作製する（
ｒａｉｓｅ）のに使用されたペプチドは、Ｇ．Ｂｌｏｍｂｅｒｇ博士（Ｂｒｉｓ
ｔｏｌ大学、イギリス）によって合成された。プロテインＧ−セファロース（Ｇ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびグルタチオンセファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏ
ｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｏｎ Ｋｅｙｎｅ
ｓ、イギリス）から購入され、アルキル化されたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅ
ｄ ｔｒｙｐｓｉｎ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、イギリス
）から購入され、組織培養試薬（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅａｇｅｎ
ｔｓ）、ミクロシスチン−ＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ）およびＥＧＦ
は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｉｓｌｅｙ、イギリ
ス）から購入され、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢酸塩（１２
−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）（
ＴＰＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ、イギリ
ス）から購入され、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）およ
び過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）（Ｈ２Ｏ２，Ａｒｉｓｔ
ａｒ ｇｒａｄｅ）は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、イギリス）
から購入され、ＳＢ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９は、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、イギリス）から購入され、ｐＣＲ ２．１−Ｔ
ＯＰＯクローニングベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ（Ｌｅｅｋ、オランダ）から購入された。活性化されたＧＳＴ−ＭＡ
ＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ
１（（Ｌａｗｌｅｒ等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８ａ、ＧＳＴ
−ＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βおよびＧＳＴ−ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（Ｃｕｅｎｄａ
等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（Ｇｏｅｄｅｒｔ等、１９９７
）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ等、１９９５）およびＧＳ
Ｔ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（Ｃｌｉｆｔｏｎ等、１９９６）が、バクテリアで発現
され、上述のようにインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）適切な上流キナーゼキナ
ーゼ（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）を使用することで最大
限に活性化された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、上述のようにＭＲＣユニットでＮ
．Ｍｏｒｒｉｃｅ博士によってウサギ骨格筋から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａ
ｎｄ等、１９９３）。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、バクテリアで発現
され、上述のようにインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＧＳＴ−ＭＡＰＫを使用
することで活性化された（ＢｅｎＬｅｖｙ等、１９９５）。ＰＫＡは、当業者に
知られているウシの心臓（ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ）から調製された。
【０２１８】 抗体。ＭＳＫ１“Ａ”、ＭＳＫ１“Ｂ”およびＭＳＫ“Ｃ”は、ヒツジ（ｓｈ
ｅｅｐ）においてそれぞれペプチドＬＴＶＫＨＥＬＲＴＡＮＬＴＧＨＡＥＫＶ（
ＭＳＫ１の残基２６から４４に対応）、ＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥ
Ｒ（ＭＳＫ１の残基３８４から４０２に対応）および、ＫＡＴＦＨＡＦＮＫＹＫ
ＲＥＧＦＣＬＱＮ（ＭＳＫ１の残基７１６から７３４に対応）に対して作製され
た（ｒａｉｓｅｄ）。特にＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫沈降し（Ｃｌｉｆｔｏｎ等
、１９９６）、またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの両方
を免疫沈降する（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）抗体は、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）に
おいてペプチドＫＥＤＫＥＲＷＥＤＶＫＥＥＭＴＳ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の
残基３４３から３５８）およびＲＮＱＳＰＶＬＥＰＶＧＲＳＴＬＡＱＲＲＧＩＫ
Ｋ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの残基７１２から７３４）に対して作製された（
ｒａｉｓｅｄ）。この研究で使用される全ての抗体は、適切なペプチドが共有結
合されたＣＨ−セファロースカラム（ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ
ｓ）でアフィニティー精製され（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、ＵＢ
Ｉ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、アメリカ）から商業的に入手可能である。フラッ
グエピトープ（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識するモノクローナル抗体（ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ａｎａｃｈｅｍ（Ｌｕｔｏｎ、イ
ギリス）から購入された。ＨＳＰ２７を認識するウサギポリクローナル抗体（ｒ
ａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅ
ｎ（Ｙｏｒｋ、イギリス）から購入された。
【０２１９】 緩衝溶液。緩衝液Ａ−５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７
．５，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍｍ ＥＤＴＡ，１％（質量比）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００，１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖ
ａｎａｄａｔｅ），５０ｍＭ フッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉ
ｄｅ），５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ），０．２７Ｍ スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ），１（Ｍミクロシスチン
−ＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ），０．１％（体積比）（−メルカプト
エタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）および“完全な”プロテイナー
ゼ阻害剤反応混液（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａ
ｉｌ）（５０ｍｌあたり１錠Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗ
ｅｓ，イギリス）。緩衝液Ｂ−５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）
ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ（−メルカプトエタノール（ｍｅ
ｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）。
【０２２０】 ＭＳＫ１およびＭＳＫ２のクローニング。ＭＳＫ１の配列は、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ
．Ｅ．協会（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から入手されたヒト
ＥＳＴ ｃＤＮＡ（ＡＡ１５ ８５７１）を配列決定すること（ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）によって得られた（Ｌｅｎｎｏｎ等、１９９６）。マウス（ｍｏｕｓｅ
）およびヒトＭＳＫ２配列は、表１に示されるＥＳＴ ｃＤＮＡクローンのうち
の幾つかを配列決定することによって得られた。マウスＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ
挿入断片（ＥＳＴ ｉｎｓｅｒｔｓ）、ＡＡ４７２１６５，ＡＡ３８９１６８を
配列決定することによって得られた。ヒトＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ挿入断片（Ｅ
ＳＴ ｉｎｓｅｒｔｓ）、Ｈ４６２６８，ＡＡ５６８８９５を配列決定すること
によって得られた。ＤＮＡ塩基配列決定（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、
Ｔａｑダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ｔａｑ ｄｙｅ ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）を使用する
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサー（３
７３Ａ ａｕｔｏｍａｔｉｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）によって行われた。
【０２２１】 ＧＳＴ−ＭＳＫ１、Ｆｌａｇ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
をコード化するＤＮＡ発現構築物（ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｓ）の調製。Ｎ末端でフラグ（ＦＬＡＧ）ＤＹＫＤＤＤＤＫエピトープ
タグ（ｔａｇ）とともにヒトＭＳＫ１を発現するＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔ）は次のように調製された。ＰＣＲ反応が、鋳型として、ＭＳＫ１ ｃＤＮ
Ａおよびオリゴヌクレオチド５’ＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡ
ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧ
ＣＡＧＣＧＧＣＧ−３’（下線が引かれていないＢｇｌＩＩ部位を組み込んでい
る）および５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧ−３’
を使用することで行われた。生じたＰＣＲ生成物は、ｐＴｏｐｏベクターに連結
反応された（ｌｉｇａｔｅｄ）。その後、三重連結反応（ｔｒｉｐｌｅ ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ）は、ＥｃｏＲｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントとしてｐＴｏｐｏベクタ
ーからＮ末端ＭＳＫ１ ＰＣＲ生成物を除去し、ＭＳＫ１のＣ末端ＥｃｏＲＶ−
ＫｐｎＩフラグメントとともにこれをｐＣＭＶ５ベクターのＥｃｏＲｌ−Ｋｐｎ
Ｉ部位に連結反応する（ｌｉｇａｔｉｎｇ）ことによって、ｐＣＭＶ５哺乳動物
発現（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９８９）ベクターで全長Ｆｌａｇ−ＭＳＫ１構築
物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を生成するためにセットアップされた。ＧＳＴ−ＭＳ
Ｋ１発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ｐＥＢＧ２Ｔ（Ｓａｎｃｈｅｚ等、
１９９４）発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位へのＢｇｌＩＩ−Ｋｐ
ｎＩフラグメントとしてｐＣＭＶ５ベクターからＦｌａｇ−ＭＳＫ１ ｃＤＮＡ
をサブクローニングすることにより調製された。Ｎ末端キナーゼドメイン、Ｃ末
端キナーゼドメインのうちいずれか一方が不活性された（ｐＣＭＶ５ベクター内
の）全長Ｆｌａｇ ＭＳＫ１突然変異体は、キナーゼドメインのサブドメインＶ
ＩＩ内の保存されたＡｓｐ１９５およびＡｓｐ５６５残基をアラニン（Ａｌａ）
に変化させることによって調製された。このことは、ＰＣＲ基調メガプライマー
戦略（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用
することで達成された。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ発現構築物（ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔ）は、ｐＥＢＧ２Ｔ発現ベクターのＮｏｔＩ部位へのＮｏｔＩ−Ｎｏｔ
Ｉフラグメントとして、（Ｄａｌｂｙ等、１９９８）に記載されているｐＧＥＸ
４Ｔ．１ベクターからのＨＡ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのサブクローニングによっ
て調製された。すべての発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の構造は、製造者の
プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従ってクイアゲンプラスミドメガキット（Ｑ
ｕｉａｇｅｎ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ ｋｉｔ）を使用することによるバク
テリアからの精製後に、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証された。
【０２２２】 ＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの発現。ヒト胚腎臓２
９３細胞（ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌｓ
）の直径１０ｃｍのディッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）２０個が培養され、それぞれの
ディッシュは、改良リン酸カルシウム法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９６ｂ）を使用す
ることによって、ＧＳＴ−ＭＳＫ１、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのうちいず
れか一方をコード化するＤＮＡ ２０（ｇでトランスフェクションされた（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションしてから２４時間後、細胞は１６
時間血清枯渇され（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖｅｄ）、刺激されていないままのも
の、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ，１５分）で刺激されたものうちいずれか一方と
細胞のそれぞれのディッシュが、氷冷された１ｍｌの緩衝液Ａに溶解された（ｌ
ｙｓｅｄ）。２０のライゼートが、プールされ（ｐｏｏｌｅｄ）、４ｏＣ、１０
分間、１３，０００ｘｇで遠心分離され、そして、上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａ
ｎｔ）が、事前に緩衝液Ｂで平衡状態にされた１ｍｌのグルタチオン−セファロ
ース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使って回転台（ｒｏｔ
ａｔｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で６０分間保温された（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ
）。懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）が、１分間、３０００ｘｇで遠心分離され
、ビード（ｂｅａｄｓ）が０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有した１０ｍｌの緩衝液
Ａで３回洗浄され、さらに、０．２７Ｍスクロースを含有した１０ｍｌの緩衝液
Ｂで３回洗浄された。ＧＳＴ−ＭＳＫ１またはＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａが
、２０ｍＭグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）および０．２７Ｍスクロー
スを含有した３本の１ｍｌ緩衝液Ｂを使って、環境温度で樹脂から溶出された。
混合された溶出液（０．５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１用タンパク質および０
．１ｍｇ／ｍｌ ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ）は、アリコート（ａｌｉｑｕ
ｏｔｓ）に分割され、液体窒素中で急速冷凍され（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）、
そして、−８０℃で保管された。
【０２２３】 細胞培養、刺激、細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）。ヒト胚腎臓２９３細胞
（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌｓ）およ
びヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）が融合して（ｔｏ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃ
ｅ）培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略さ
れたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
で１６時間保温された。ヒーラおよびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が、直径１０ｃｍのデ
ィッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）上で融合して培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ
ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで２時間保温された。ＮＧＦの付加から数時
間以内に分化し始める高濃度のＮＧＦ受容体を発現させるＰＣ１２細胞が、培養
され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで２時間
保温された（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）。これらの細胞内における高濃度のＮＧ
Ｆ受容体によって、ＰＤ ９８０５９阻害剤が、ＭＡＰＫのＮＧＦ誘発活性化（
ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を部分的にのみ抑制する。そ
の後、細胞は、５０（Ｍ ＰＤ ９８０５９，１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０，
５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０または対照としての同体積のＤＭＳＯで、図の凡例
に示された時間だけ保温され、図の凡例のように刺激され、そして、細胞が１．
０ｍｌの氷冷された緩衝液Ａに溶解された（ｌｙｓｅｄ）。ライゼートは、液体
窒素の中ですぐに冷凍され、使用されるまで−８０ｏＣで保管された。タンパク
質の濃度は、標準として、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａ
ｌｂｕｍｉｎ）を使用して決定された（Ｂｒａｄｆｏｒｄ等、１９７６）。
【０２２４】 ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の免疫沈降および検
定。それぞれの免疫沈降に使用された細胞ライゼートの量は、ＭＳＫ１（５００
（ｇタンパク質）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（５０（ｇタンパク質）およびＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（５０（ｇタンパク質）であった。ライゼートは、５（ｌのプ
ロテインＧ−セファロースと結合された５（ｇのそれぞれの抗体を使って、振動
台（ｓｈａｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で４ｏＣ、３０分間保温された。免
疫沈降物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）は、０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有した１ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄され、さらに、１ｍｌの緩衝液Ｂで１
回洗浄された。標準ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ検定（５０（ｌ）
は、洗浄されたプロテインＧ−セファロース免疫沈降物（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ），５０ｍｍ トリ
ス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．１％（体積
比）２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ），２．
５（Ｍ ＰＫＩ（環状−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ−Ａ
ＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のペプチド阻害剤
），Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（３０（Ｍ），１０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍｇ（Ａｃ
）２）および０．１ｎＭ［（３２Ｐ）ＡＴＰ（１００−２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ
）を含んでいた。検定は、３０ｏＣ、１０分間行われ、検定チューブ（ａｓｓａ
ｙ ｔｕｂｅｓ）は、懸濁液中に免疫沈降物を保持するために連続的に振動され
（ａｇｉｔａｔｅｄ）、その後検定を終了させ、（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）
に記載されているように分析された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ペプチドＫＫＬＮ
ＲＴＬＳＶＡ（３０（Ｍ）が基質として使用されていることを除き、同様に検定
された。活性の１ユニット（Ｏｎｅ ｕｎｉｔ）は、１分間で１ｎｍｏｌのペプ
チド基質のリン酸化に触媒作用を及ぼす酵素の量であった。
【０２２５】 ＣＲＥＢの発現。Ｍ．Ｊ．Ｃｏｍｂ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，ボストン，アメリカ）の好意により我々に提供されたＣＲＥＢ（Ｇｏｎｚａ
ｌｅｚ等、１９８９）の３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａ
ｒｉａｎｔ）をコード化するＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で形質転換さ
れた大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ）ＢＬ２１が、０．３ｍＭのイソプ
ロピル−（−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−（−Ｄ−ｔｈｉｏｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）とともに３７ｏＣで５時間誘導された。ＧＳＴ−ＣＲＥ
Ｂが前述のようにＧＳＴ−ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）
のためにグルタチオン−セファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）を用いて精製され、５０％のグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を含む
緩衝液Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）に対して透析され（ｄｉａｌｙｓｅｄ），−２０
ｏＣで貯蔵された。この調剤（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は多数の小バンドとと
もに、６２ｋＤａと４３ｋＤａでの２つの主バンドを示した。この６２ｋＤａと
４３ｋＤａのバンドのみがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＳＫ１によってリン酸化され
た。ＣＲＥＢのタンパク質濃度は、ウシの血清アルブミン標準（ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）に関して６２ｋＤａと４３ｋ
Ｄａのバンドの強度を比較することによって見積もられた。
【０２２６】 リン酸化されたＣＲＥＢとＡＴＦ１の免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ）が調整され（ｐｒ
ｅｐａｒｅｄ）、これらの免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ
）が、記述されているように（Ｔａｎ等，１９９６）、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ Ｐｌ
ａｃｉｄ，ＵＳＡ）から購入されたＳｅｒ １３３上のリン酸化されたＣＲＥＢ
およびＳｅｒ ６３上のリン酸化されたＡＴＦ１を認識するホスホスペシフィッ
ク（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いてなされた。リン酸化ＣＲＥ
ＢとＡＴＦ１のタンパク質の検出は増強化学発光試薬（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用
いてなされた。
【０２２７】 ＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂとによるＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７のリ
ン酸化（図８参照）。ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ）として発現されたＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａがＴＰＡ刺激２９
３細胞（ＴＰＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ２９３ ｃｅｌｌｓ）から精製され（
図３）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂがラビット骨格筋（ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔ
ａｌ ｍｕｓｃｌｅ）から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等、１９９３）。
ＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７とともに図８に示されているペプチドが、１０ｍＭの
Ｍｇ（Ａｃ）２、１００（Ｍ［３２Ｐ］ＡＴＰ（１ ｘ １０６ ｃｐｍ／ｎｍ
ｏｌｅ）、１０（Ｍ ＰＫＩと１（Ｍ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲを含む緩
衝液Ｂ中の２Ｕ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１，ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまた
はＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂとともに３０ｏＣでインキュベートされた。１
０分間のインキュベーションの後，ペプチド内へのリン酸の組み込みがＰ８１ホ
スホセルロース紙（ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐａｐｅｒ）を用いて
検定され（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＣＲＥＢとＨＳＰ２７内へのリン酸の
組み込みがトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｔｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、
０．２／１００ ｖｏｌ．％（０．２ ｖｏｌ ｏｆ １００％）を添加するこ
とによって測定され、その後，その試料が氷上に１時間インキュベートされた。
この懸濁液は１３０００ｘｇで１０分間遠心分離され（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ
）、その上澄みは捨てられ、ペレットは０．２ｍｌの氷の冷水で５回洗浄された
。３２Ｐ標識されたもの（３２Ｐ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｅｄ）がその後セレンコフ・カウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏ
ｕｎｔｉｎｇ）によって検定された。ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＲＫＫＡＰ−
Ｋ１ｂによりリン酸化されたＣＲＥＢにおける部位をマッピングするために，こ
のペレットは０．３ｍｌの５０ｍＭ，ｐＨ８．０のＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２（ｇの
アルキル化されたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ）を含む０
．１ｖｏｌ．％の還元されたＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００中で再懸濁され、３０ｏ
Ｃで１６時間のインキュベーションの後，その消化物（ｄｉｇｅｓｔ）が１３０
００ｘｇで５分間遠心分離された。９５％の３２Ｐ−標識（３２Ｐ−ｒａｄｉｏ
ａｃｔｉｖｉｔｙ）を含む上澄みは、図８についての凡例に記載されているよう
に，Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（ｃｏｌｕｍｎ）を用いてクロマトグラフィーに
かけられた。ミカエリス定数（Ｋｍ）とＶｍａｘ値は、１／Ｓに対する１／Ｖの
二重逆数プロット（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｐｌｏｔｓ）から検
定された。ここで、Ｖはリン酸化の初速度であり、Ｓは基質濃度である。
【０２２８】 ＭＳＫ１の２９３細胞へのトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
）。２９３細胞が直径１０ｃｍの皿に培養され、リン酸カルシウム変法（ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓ
ｓｉ等、１９９６ｂ）を用いてフラグ・エピトープがタグされたＭＳＫ１構築物
（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｅｄ ＭＳＫ１ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ
）をコード化するｐＣＭＶ５ベクターでトランスフェクションされた（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションの２４時間後（２４ｈ ｐｏｓｔ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、この細胞から１６時間の間に血清が奪われ、ＴＰＡ
により刺激され、あるいはＵＶ放射に曝された。その後，細胞は１ｍｌの氷の冷
たい緩衝液Ａに溶解され（ｌｙｓｅｄ），１３，０００ｘｇで５分間遠心分離さ
れた後，フラグ・タグされたＭＳＫ１プロテイン（Ｆｌａｇ ｔａｇｇｅｄ Ｍ
ＳＫ１ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、５（ｌのプロテインＧ−セファロースに結合した
２（ｇのＦＬＡＧ抗体を用いて、２５（ｇプロテインを含むライゼート（ｌｙｓ
ａｔｅ）のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）から免疫沈降が行われた。免疫沈降
物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）はインキュベーションされ洗浄さ
れ，上記のようにＭＳＫ１活性について測定された（ａｓｓａｙｅｄ）。
【０２２９】 免疫電子顕微鏡法（Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
。細胞は、０．２Ｍのピペス（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ７．２において８％のパラホル
ムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）内に少なくとも１日固定さ
れ，ラバー・ポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）を用いてこすら
れ，１０％のブタの皮膚ゼラチンにペレットとして埋め込まれた。ブロックは、
鉄のスタブ（ｓｔｕｂｓ）上に固定され液体窒素で凍らせる前に、２．１Ｍのス
クロース／ＰＢＳ（ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳ）に少なくとも１５分間浸された。
その後，低温超薄片（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）がライ
ヒエット・ウルトラカット・Ｅ・低温ミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔ
ｒａｃｕｔ Ｅ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて−１００ｏＣで調整さ
れ、カーボン／ホルムバール（ｃａｒｂｏｎ／ｆｏｒｍｖａｒ）被覆グリッドに
固定された。グリッドは、まず０．５％のフィッシュ・スキンのゼラチン／ＰＢ
Ｓを用いてインキュベーションされ（５分）、その後、アンチＦＬＡＧマウス・
モノクロール抗体（ａｎｔｉ ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（１５ｇ／ｍｌ）が続いた。その後，２ｇ／ｍｌのラビ
ット・アンチマウス抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ，ＵＳＡ）が続き、最後に、タンパ
ク質にＡ−８ｎｍの金複合体（ｇｏｌｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）が前に開示されたよ
うに（Ｌｕｃｏｃｑ １９９３）調整された。ＰＢＳ洗浄が、０．５％のフィッ
シュ・スキンのゼラチン／ＰＢＳで希釈された親和性試薬（ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｒｅａｇｅｎｔｓ）の各々の後に続いた。最後に、蒸留水で洗浄した後、これら
の薄片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）はメチル・セルロース／ウラニル・アセテート（ｍ
ｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ／ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で対比され
た。
【０２３０】 ラベリング（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）は次のように定量化された。１５，０００
倍の倍率で細胞質と核（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）の両方
を持つ標識細胞（ｌａｂｅｌｌｅｄ ｃｅｌｌ）の顕微鏡写真（ｍｉｃｒｏｇｒ
ａｐｈ）が撮られた（これらの核で重くなった薄片によって、個々の細胞におけ
るコンパートメントからのデータを比較することが可能となった）。サイトプラ
ズムと核の面積は、１ｃｍの線間隔の正方形格子（ｓｑｕａｒｅ ｌａｔｔｉｃ
ｅ ｇｒｉｄ ｏｆ １ｃｍ ｌｉｎｅ ｓｐａｃｉｎｇ）を用いてカウントし
（ｐｏｉｎｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）、ゴールドラベリング（ｇｏｌｄ ｌａｂｅ
ｌｌｉｎｇ ｃｏｕｎｔｅｄ）をカウントすることによって見積もられた（Ｌｕ
ｃｏｃｑ，１９９４）。エラー係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｅｒｒ
ｏｒ）はＣｏｃｈｒａｎ １９５３によって計算された。
【０２３１】 引用文献 Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ａ．，Ｃｏｗ
ｌｅｙ Ｓ．，Ｌｅｅｖｅｒｓ Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｃ．Ｊ．
（１９９４）「マイトジェン−活性プロテイン−キナーゼ，ＭＡＰキナーゼキナ
ーゼおよびＲＡＦの検定および発現」（Ａｓｓａｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ Ｍｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｋｉｎａｓ
ｅ，ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ，ａｎｄ ＲＡＦ）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２５５，２７９−２９０； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，Ｄｕｄｌｅ
ｙ Ｄ．Ｔ．ａｎｄ Ｓａｌｔｉｅｌ Ａ．Ｒ．（１９９５）「ＰＤ−０９８０
５９は、インビトロおよびインビボでマイトジェン−活性プロテイン−キナーゼ
キナーゼの活性の特異的阻害剤である。」（ＰＤ−０９８０５９ ｉｓ ａ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ
ｋｉｎａｓｅ ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ−ｖｉｖｏ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２７０，２７４８９−２７４９４； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，Ｆ．Ｂ．，Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉ
ｃ，Ｍ．，Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９６ａ
）「プロテイン−キナーゼＢの基質特異性に関する分子の基礎、ＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−１との比較およびｐ７０ Ｓ６キナーゼ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａ
ｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ；ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡ
ＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ａｎｄ ｐ７０ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ）ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３９９，３３３−３３８； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，
Ｆ．Ｂ．，Ｃｒｏｎ，Ｐ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃｏｈｅｎ Ｐ．ａｎｄ Ｈ
ｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．（１９９６ｂ）「インシュリンおよびＩＧＦ １によるプ
ロテイン−キナーゼＢの活性化のメカニズム」（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ ｂｙ ｉｎｓ
ｕｌｉｎ ａｎｄ ＩＧＦ １）ＥＭＢＯ Ｊ．１５．６５４１−６５５１； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．（１９９７）「プロテインキナーゼＣの阻害剤であるＲ
ｏ ３１８２２０およびＧＦ １０９２０３Ｘは、等しく強力なＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−１（Ｒｓｋ−２）とのｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害剤である。」（Ｔｈ
ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｒｏ ３１８
２２０ ａｎｄ ＧＦ １０９２０３Ｘ ａｒｅ ｅｑｕａｌｌｙ ｐｏｔｅｎ
ｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１（Ｒｓｋ−
２）ａｎｄ ｐ７０Ｓ６ Ｋｉｎａｓｅ．）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０２，１２
１−１２３； Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｄａｖｉｅ，Ｄ．Ｎ．，Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｈ．，Ｊ
ｏｒｎｖａｌｌ，Ｈ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（１９８９）「ミトコ
ンドリアシトクロム−（−４５０ステロール２６−ヒドロキシラーゼ、胆汁酸生
合成酵素のクローニング、構造および発現）」（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒ
ｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−（−４５０ ｓｔｅｒｏｌ ２６−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ，ａ ｂｉｌｅ−ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙ
ｍｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，８２２２−８２２９； Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ，Ｒ．，Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｄｏｚａ，Ｙ．Ｎ．，
Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｐ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ｊ．ａ
ｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，（１９９５）「ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２の活性化の
ために必要な新規なリン酸化部位の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｒｅｑｕｉｒ
ｅｄ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−２
）ＥＭＢＯ Ｊ．１４．５９２０−５９３０； Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）「タンパク質−色素結合の原理を用い
た、タンパク質のマイクログラム量の定量化のための迅速かつ感度の高い方法」
（Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉ
ｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，７２，２４８−２５４； Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ．，Ｚｈａｏ Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｅ．（１
９９５）「ｐ９０（ＲＳＫ）キナーゼドメインのための分岐機能的役割」（Ｄｉ
ｖｅｒｇｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｐ９０（ＲＳＫ
）ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１８８４
８−１８８５２； Ｃｈｅｎ Ｒ．Ｈ．，Ｓａｍｅｃｋｉ Ｃ．ａｎｄ Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ．（１９
９２）「ＥＲＫ−コード化され、ＲＳＫ−コード化されたプロテインキナーゼの
核局在化および調節」（Ｎｕｃｌｅａｒ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ−ｅｎｃｏｄｅｄ ａｎｄ ＲＳＫ−ｅｎ
ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅｓ） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．１２，９１５−９２７； Ｃｌｉｆｏｎ Ａ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｇ Ｐ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１
９９６）「ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２とＭＡＰＫＡＰキナーゼ−３の基質特異性
の比較およびサイトカインと細胞ストレスによるこれらの活性化」（Ａ ｃｏｍ
ｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−２ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓ
ｅ−３ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９２，
２０９−２１４； Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｗ．Ｃ．（１９５３）「サンプリング技術」（Ｓａｍｐｌｉｎ
ｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
； Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「哺乳動物細胞におけるＭＡＰおよびＳＡＰキナ
ーゼの生理的基質のための調査」（Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ＭＡＰ ａｎｄ ＳＡＰ ｋ
ｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．７，３５３−３６１； Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ，Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ，Ｃｏｈｅｎ Ｐ，Ａｎｄｊｅ
ｌｋｏｖｉｃ Ｍ ａｎｄ Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ（１９９５）「インスリ
ンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害はプロテイン−キナーゼ
−Ｂによって仲介される。」（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ
−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｓ ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ−Ｂ．）Ｎａｔｕｒｅ ３７
８，７８５−７８９； Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ．，Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅ
，Ｊ．Ｒ．，ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｕｎｄａｌ，Ｈ．Ｓ．，Ｃｏｈｅ
ｎ Ｐ．「インスリンまたはラット骨格筋細胞系１６における成長因子１様イン
スリンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害は、ワートマニンに
よって遮断されるが、ラパミシンによっては遮断されない。」（Ｔｈｅ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−
３ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｒ ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ １６ ｉｓ ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ｗｏｒｔｍａｎｎｉ
ｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｒａｐａｍｙｃｉｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｊ ３０３，２１−２６； Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｄｏｚａ，Ｙ．Ｎ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｒ
．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．（１９
９５）「ＳＢ ２０３５８０は、細胞ストレスとインターロイキン−１によって
刺激されるＭＡＰキナーゼ同族体の特異的阻害剤である。」（ＳＢ ２０３５８
０ ｉｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａ ＭＡＰ ｋ
ｉｎａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ
ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
−１．）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６４，２２９−２３３； Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，ＢｕｅｅＳｃｈｅｒｒｅｒ Ｖ．ａｎ
ｄ Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞ストレスによ
るストレス活性プロテインキナーゼ−３（ＳＡＰＫ３）の活性化はＳＡＰＫＫ３
（ＭＫＫ６）を介して仲介される。ＳＡＰＫ３とＳＡＰＫ２（ＲＫ／ｐ３８）の
特異性の比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−３（ＳＡＰＫ３）ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｖｉａ ＳＡＰＫＫ３（ＭＫＫ６）； Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＳＡＰＫ３ ａｎｄ ＳＡＰＫ２（ＲＫ／
ｐ３８））ＥＭＢＯ Ｊ．１６，２９５−３０５； Ｄａｌｂｙ Ｋ．Ｎ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ Ｆ．Ｂ．，
Ａｖｒｕｃｈ Ｊ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９８）「窒素−活性プロテ
インキナーゼ（ＭＡＰＫ）によって誘導し得るＭＡＰＫ−活性プロテインキナー
ゼ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）における調節リン酸化部位の同定」（Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉ
ｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒｎｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ
ｎａｓｅ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）ｔｈａｔ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂ
ｙ ＭＡＰＫ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１４９６−１５０５； Ｄａｖｉｓ Ｐ．Ｄ．，Ｈｉｌｌ Ｃ．Ｈ．，Ｋｅｅｃｈ Ｅ．，Ｌａｗｔｏｎ
Ｇ．，Ｎｉｘｏｎ Ｊ．Ｓ．，Ｓｅｄｇｗｉｃｋ Ａ．Ｄ．，Ｗａｄｓｗｏｒ
ｔｈ Ｊ．，Ｗｅｓｔｍａｃｏｔｔ Ｄ．ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｓ．Ｅ
．（１９８９）「プロテインキナーゼ−Ｃの強力な選択的阻害剤」（Ｐｏｔｅｎ
ｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎ
ａｓｅ−Ｃ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５９，６１−６３； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｎ．Ｗ．，Ｒａｗｌｉｎｓｏｎ Ｌ．，Ｇｕｅｓｄｏｎ Ｆ
．，Ｊｏｎｅｓ Ｅ．，Ｃｏｗｌｅｙ Ｓ．，Ｈｓｕａｎ Ｊ．ａｎｄ Ｓａｋ
ｕｌａｔｖａｌａ Ｊ．（１９９４）「インターロイキン−１は、ＨＳＰ２７を
リン酸化する新規なプロテイン−キナーゼカスケードを活性化する。」（Ｉｎｔ
ｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
−ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｔｈａｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＰ２７．）Ｃｅｌｌ ７８，１０
３９−１０４９； Ｆｕｋｕｎａｇａ Ｒ．ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ．（１９９７）「プロテイン
キナーゼ基質を同定するための新規な発現スクリーニング方法によって分離され
た、ＭＮＫ１、新しいＭＡＰキナーゼ−活性プロテインキナーゼ」（ＭＮＫ１，
ａ ｎｅｗ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｃｒｅｅｎｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１９２
１−１９３３； Ｇｉｎｔｙ Ｄ．Ｄ．，Ｂｏｎｎｉ Ａ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．
Ｅ．（１９９４）「神経成長因子は、ＣＲＥＢのリン酸化を通してｃ−Ｆｏｓ転
写を刺激するラス−依存プロテインキナーゼを活性化する。」（Ｎｅｒｖｅ ｇ
ｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ Ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃ−
Ｆｏｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＥＢ．）Ｃｅｌｌ ７７，７１３−７２５； Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｃｒａｘｔｏｎ Ｍ．，Ｊａｋｅ
ｓ Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞スト
レスによる新規なストレス活性プロテインキナーゼＳＡＰＫ４の活性化はＳＫＫ
３（ＭＫＫ６）を介して仲介される。その基質特異性と他のＳＡＰキナーゼのそ
れとの比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｅｓ
ｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ ｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＳＡＰＫ４ ｂｙ
ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｓ
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＳＫＫ３（ＭＫＫ６）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ
ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ
ｏｆ ｏｔｈｅｒ ＳＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，３５６３
−３５７１； Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｇ．Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｋ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｗ．Ｈ．，Ｋａｒｒ Ｄ．，Ｍｅｎｚｅｌ Ｐ．，Ｂｉｇｇｓ Ｗ．，Ｖａｌｅ
Ｗ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ Ｍ．Ｒ．（１９８９）「その配列によっ
て予測される環状ＡＭＰ−調節核因子ＣＲＥＢ上のリン酸化部位のクラスター」
（Ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ
ｆａｃｔｏｒ ＣＲＥＢ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）Ｎａｔｕｒｅ ３３７，７４９−７５２； Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｇ．Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ Ｍ．Ｒ．（１９８９
）「環状ＡＭＰは、Ｓｅｒ １３３でＣＲＥＢのリン酸化によるソマトスタチン
遺伝子転写」を刺激する。（Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｓ
ｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＥＢ ａｔ Ｓｅｒ １３３．）Ｃｅ
ｌｌ，５９，６７５−６８０； Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１
９８８）「プロテインキナーゼファミリーの保存の特徴および触媒ドメインの推
論される系統発生」（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ｐｈｙｌｏ
ｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１，４２−５２； Ｌａｗｌｅｒ Ｓ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．ａｎｄ Ｃｏ
ｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「ストレス活性プロテインキナーゼ−１（ＳＡＰＫ１
／ＪＮＫ）の新規な活性化因子であるＳＫＫ４」（ＳＫＫ４，ａ ｎｏｖｅｌ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｋｉｎａｓｅ−１（ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ）） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４
，１５３−１５８； Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ａｕｆｆｒａｙ，Ｃ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏ
ｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｂ．（１９９６）「Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．
協会； ゲノムの組み込み分子分析」とそれらの発現（Ｔｈｅ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ
．Ｅ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｙｓ
ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３，１５１−１５２； Ｌｅｉｇｈｔｏｎ Ｉ．Ａ．，Ｄａｌｂｙ Ｋ．Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ Ｆ．
Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９６）「ｐ７
０ Ｓ６キナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の特異性の比較がｐ７０ Ｓ６キ
ナーゼのための相対比基質を同定する。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１のＮ末端キナ
ーゼドメインはタンパク質のリン酸化にとって不可欠である。」（Ｃｏｍｐａｒ
ｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐ７０ Ｓ６
ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅ
ｓ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏ
ｒ ｐ７０ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ．Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓ
ｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｓ ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．３７５，２８９−２９３； Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）「免疫電子顕微鏡法のための顆粒の遺伝標
識；「微細構造免疫細胞化学」の第８章」（“Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｒ
ｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，
Ｃｈａｐｔｅｒ ８ ｉｎ“Ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｃｙ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”）； Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）「金のラベリングと免疫ラベルされた超薄
片における抗原の定量」（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ ｌａｂ
ｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｅｄ
ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏ
ｍｙ １８４，１−１３； Ｉｏｒｄａｎｏｖ Ｍ．，Ｂｅｎｄｅｒ Ｋ．，Ａｄｅ Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄ
Ｗ．，Ｓａｃｈｓｅｎｍａｉｅｒ Ｃ．，Ｅｎｇｅｌ Ｋ．，Ｇａｅｓｔｅｌ
Ｍ．，Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｈｅｒｒｌｉｃｈ Ｐ．（１９９
７）「ＣＲＥＢはｐ３８／ＨＯＧ−１依存プロテインキナーゼを介してＵＶＣに
より活性化される。」（ＣＲＥＢ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＵＶＣ
ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐ３８／ＨＯＧ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｋｉｎａｓｅ．）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１００９−１０２２； Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎ Ｍ．Ｍ．，Ｋｕｍａｒ Ｓ．，Ｍｃｄｏｎｎｅｌｌ Ｐ
．Ｃ．，Ｖａｎｈｏｒｎ Ｓ．，Ｌｅｅ Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｖｉ Ｇ．Ｐ．ａｎｄ
Ｙｏｕｎｇ Ｐ．Ｒ．（１９９６）「マイトジェン活性プロテイン（ＭＡＰ）
キナーゼ−活性プロテインキナーゼ−３、ＣＳＢＰ ｐ３８ＭＡＰキナーゼの新
規な基質の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｇｅｎ−
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）Ｋｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ−３，ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｏｆ ＣＳＢＰ ｐ３８ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１，８４８８−８４９２； Ｐｅｎｄｅ Ｍ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｔ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｐ．Ｂ．，Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ Ｊ．Ｔ．，Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ．ａｎｄ Ｇａｌｌｏ Ｖ（１９９７）
「祖先膠細胞における神経伝達物質−，成長因子−誘導ｃＡＭＰ応答因子結合タ
ンパク質のリン酸化；カルシウムイオン、プロテインキナーゼＣおよびマイトジ
ェン活性プロテインキナーゼ／リボソームＳ６キナーゼ経路の役割」（Ｎｅｕｒ
ｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ−ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃ
ｅｄ ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐ
ｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ； Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ，ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ，ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ ｐ
ａｔｈｗａｙ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１２９１−１３０１； Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｊ．，Ｄｉｌｗｏｒｔｈ Ｓ．Ｍ．，Ｌａｓｋｅｙ Ｒ．Ａ．
，ａｎｄ ｄｉｎｇｗａｌｌ Ｃ．（１９９１）「ヌクレオプラスミン核標的配
列における２つの相互依存塩基性ドメイン；２つに分かれた核標的配列のクラス
の同定」（Ｔｗｏ ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ
ｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ； Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ
ｏｆ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）Ｃｅｌｌ，６４，６１５−６２３； Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｉｇｏｎ，Ｓ．，Ｍｏｒａｎｇｅ，
Ｍ．，Ａｌｏｎｓｏ−Ｌｌａｍａｚａｒｅｓ Ａ．，Ｚａｍａｎｉｌｏ，Ｄ．，
Ｈｕｎｔ，Ｔ．ａｎｄ Ｎｅｂｒｅｄａ，Ａ．（１９９４）「ストレスおよびＭ
ＡＰＫＡＰキナーゼ−２と小さな熱ショックタンパクのリン酸化を刺激する熱シ
ョックによってトリガーされる新規なキナーゼカスケード」（Ａ ｎｏｖｅｌ
ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙ ｓｔｒｅｓｓ ａｎ
ｄ ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＭＡＰＫＡＰ ｋ
ｉｎａｓｅ−２ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓ
ｍａｌｌ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｃｅｌｌ ７８，１０２
７−１０３７； Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｉ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．ｔ．，Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｙｅ
ｅ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ａｖｒｕｃｈ，Ｊ．，Ｋｙｒｉａｋｉ
ｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．（１９９４）「転写因子を調節するスト
レス−活性経路におけるＳＡＰＫ／ＥＲＫの役割」（Ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＡＰＫ
／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆ
ａｃｔｏｒ ｃ−Ｊｕｎ）Ｎａｔｕｒｅ，３７２，７９４−７９８； Ｓｔｕｒｇｉｌｌ Ｔ．Ｗ．，Ｒａｙ Ｌ．Ｂ．，Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｅ．ａｎｄ
Ｍａｌｌｅｒ Ｊ．Ｌ．（１９８８）「インスリン−刺激性ＭＡＰ−２キナー
ゼはリボソーム−プロテインＳ６キナーゼ−ＩＩをリン酸化し活性化する。」（
Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＭＡＰ−２ Ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ Ｋｉｎａｓｅ−ＩＩ．）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，７１５−
７１８； Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｄ．Ｇ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．
（１９９３）「ＲＳＫ２のウサギ当量としてのインスリン−刺激性プロテインキ
ナーゼ−１の同定。マイトジェン活性プロテインキナーゼによる活性化の間にリ
ン酸化される２トレオニンの同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉ
ｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−１ ａ
ｓ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ ＲＳＫ２； Ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｙｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙＭｉｔｏｇｅｎ−Ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２１２，５８１−５８８； Ｔａｎ Ｙ．，Ｒｏｕｓｅ Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ａ．Ｈ．，Ｃａｔｉａｔｉ Ｓ
．，ｃｏｈｅｎ Ｐ．ａｎｄ ｃｏｍｂ Ｍ．Ｊ．（１９９６）「ＦＧＦとスト
レスはｐ３８ＭａｐキナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２を含む経路を介してＣ
ＲＥＢおよびＡＴＦ−１を調節する。」（ＦＧＦ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅ
ｇｕｌａｔｅ ＣＲＥＢ ａｎｄ ＡＴＦ−１ ｖｉａ ａ ｐａｔｈｗａｙ
ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｐ３８ Ｍａｐ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ
ｋｉｎａｓｅ−２．） ＥＭＢＯ Ｊ．１５，４６２９−４６４２； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ
，Ｔ．Ｊ．（１９９４）「配列の重量、位置比ギャップペナルティおよび最大重
量の選択により進行性の複数の配列の感受性を改良するクラスタル−Ｗ」（Ｃｌ
ｕｓｔａｌ−Ｗ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎ
ｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇ
ｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２，４６７
３−４６８０； Ｔｒｉｖｅｒ Ｅ．，Ｄｅｃｅｓａｒｅ Ｄ．，Ｊａｑｕｏｔ Ｓ．，Ｐａｎｎ
ｅｔｉｅｒ Ｓ．，Ｚａｃｋａｉ Ｅ．，Ｙｏｕｎｇ Ｉ．，Ｍａｎｄｅｌ Ｊ
．Ｌ．，Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ Ｐ．ａｎｄ Ｈａｎａｕｅｒ Ａ．（１
９９６）「コフィンローリー症候群に関連するキナーゼＲＳＫ−２における変異
」（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＲＳＫ−２ ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３８４，５６７−５７０； Ｖｉｋ Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｒｙｄｅｒ Ｊ．Ｗ．（１９９７）「ゼノプスｐｐ９
０ｒｓｋの自律リン酸化の主要部位としてのセリン３８０の同定」（Ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ３８０ ａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ
ｓｉｔｅ ｏｆ ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ ｐｐ９０ｒｓｋ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
２３５，３９４−４０２； Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｆｌｙｎｎ，Ａ．，Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｊ．，Ｗｅｂ
ｂ，Ｂ．Ｌ．Ｊ．，Ｖｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｂａｉｎｅｓ，Ｉ．Ａ．，Ｃｏｏｐ
ｅｒ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｐｒｏｕｄ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）「ホルボールエステ
ル、細胞ストレスおよびサイトカインに応答して、真核開始因子ｅＩＦ４Ｅは、
はっきり識別できるＭＡＰキナーゼ経路によって仲介される。」（Ｔｈｅ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉ
ｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅＩＦ４Ｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｈｏｒｂ
ｏｌ ｅｓｔｅｒｓ，ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９３７３−９３７７； Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ Ａ．Ｊ．，Ｆｌｙｎｎ Ａ．，Ｐｒｏｕｄ Ｃ．Ｇ．ａ
ｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ Ｊ．Ａ．（１９９７）「マイトジェン活性プロテインキナ
ーゼはセリン／トレオニンキナーゼＭＮＫ１およびＭＮＫ２を活性化する。」（
Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅｓ ａｃ
ｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ
ＭＮＫ１ ａｎｄ ＭＮＫ２．）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１９０９１９２０； Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｉｎｔｙ Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ
．（１９９６）「Ｒｓｋ２による遺伝子活性化に対するラス−ＭＡＰＫ経路の連
結、成長因子調節ＣＲＥＢキナーゼ」（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７３，９５９−９６３； Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｋｏｒｎｈａｕｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｘｉａ，Ｚ，Ｔｈｉｅｌｅ
，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒ，Ｍ．Ｅ．（１９９８）「神経成長因子は
細胞外シグナル−調節キナーゼおよびｐ３８マイトジェン活性プロテインキナー
ゼ経路を活性化し、ＣＲＥＢセリン１３３リン酸化を刺激する。」（Ｎｅｒｖｅ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐ３８ Ｍ
ｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈ
ｗａｙｓ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＣＲＥＢ ｓｅｒｉｎｅ １３３ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８８，１９
４６−１９５５； Ｚｈａｏ Ｙ．，Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ．，Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚ Ｓ．，Ｍｏ
ｒｔｏｎ Ｃ．Ｃ．ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｅ．（１９９５）「ＲＳＫ３は
、新規なＰＰ９０（ＲＳＫ）アイソフォームをユニークＮ末端配列−成長因子刺
激キナーゼ機能および核転移とともにコード化する。」（ＲＳＫ３ ｅｎｃｏｄ
ｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＰＰ９０（ＲＳＫ）ｉｓｏｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ａ ｕ
ｎｉｑｕｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎ
ｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
５，４３５３−４３６３ １．
【０２３２】 実施例２：代替アッセイ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｓｓａｙｓ）
【０２３３】 閃光近接分析（Ａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓ
ｓａｙ）（ＳＰＡ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
）が、３２Ｐ放射性物質のＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅへの組込みを定量
するのに使用される。このシステムでは、サンプルは、シンチラント（ｓｃｉｎ
ｔｉｌｌａｎｔ）とＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅに結合する抗体とを含む
ビード（ｂｅａｄｓ）と混合される。これは９６−ウエルフォーマット（９６−
ｗｅｌｌ ｆｏｒｍａｔ）において行われると便利である。それからプレート（
ｐｌａｔｅ）は、適切なシンチレーションカウンター（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉ
ｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ）で、３２Ｐ ＳＰＡアッセイの既知のパラメーターを用
いて、測定される。シンチラント（ｔｈｅ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）に近接し
た３２Ｐのみ、つまり後に抗体に結合されるＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅ
に結合している３２Ｐのみが測定される。
【０２３４】 実施例３：ＭＳＫ１活性を調節する化合物のアッセイ
【０２３５】 アッセイは、実施例１あるいは実施例２に記述されたように、ＣＲＥＢを用い
て準備される。化合物はこのアッセイで調べられ、ＭＳＫ１の阻害または活性化
を高めるものが、更なる研究のために選別される。観測されたいかなる効果もＣ
ＲＥＢによる効果に由来するものではないことを確認するために、化合物は、例
えばＣｒｏｓｓｔｉｄｅのように、ＣＲＥＢとは化学構造上異なるペプチド基質
のような他の基質をリン酸化できるＭＳＫ１の効果の有無を試験される。ＣＲＥ
Ｂとペプチド基質のリン酸化に於いて、類似の効果を持つ化合物は選別される。
化合物はまた、活性化されたＣＲＥＢと不活性ＣＲＥＢにおける効果の有無も試
験される。
【０２３６】 実施例４：ＭＳＫ１と相互作用するポリペプチドの分析
【０２３７】 酵母二ハイブリッドアッセイシステム（ａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉ
ｄ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）は、転写の活性化の発生を許容するのに十分安
定した条件において、ＭＳＫ１と結合可能なポリペプチドをコード化するポリヌ
クレオチドを特定するために準備される。このようなポリヌクレオチドは、（別
個の実験において）、ＭＳＫ１を活性させられる刺激の前または後に、ＭＳＫ１
を発現できる細胞からの、またＭＳＫ１を発現しない細胞からのｍＲＮＡからコ
ピーされたｃＤＮＡである。このような細胞のタイプのみの部分集合（ｓｕｂｓ
ｅｔ）に見られる相互作用は、特に興味深い。
【０２３８】 ポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドは、予想されたアミノ酸配列
を得るために、実施例１で記述したようにサンガー法（ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ
ｍｅｔｈｏｄ）により挿入物を配列することによって、測定される。
【０２３９】 実施例５：ＲＡＭ ２６４マクロファージのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａ
ｃｃｈａｒｉｄｅ）による、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅ
ｎａｓｅ−２）とインターロイキン−１の誘導調整における、ＭＡＰキナーゼカ
スケード（ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ）の役割
【０２４０】 ＲＡＷ２６４マクロファージのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ）（ＬＰＳ）刺激は、マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ−
１及び−２（ＭＳＫ１、ＭＳＫ２）と、それらの推定される基質、転写因子ＣＲ
ＥＢとＡＴＦ１の活性化を引き起こした。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の活性化は、従来
のＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８の活性化をそれぞれが抑制
する２種の薬品の混合物と共に、細胞を前保温することによって抑制されたが、
阻害は、いずれの阻害物の存在下に於いても部分的なものであった。ＣＲＥＢと
ＡＴＦ１のＬＰＳ刺激活性化（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）（
ＣＯＸ−２）とインターロイキン−１β遺伝子（これらプロモーターはＣＲＥを
含む）の転写、及びＣＯＸ−２タンパク質の誘導は、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の効力
の高い阻害剤であるＲｏ ３１８２２０によるときと同様に、同じ薬品の組み合
わせによって阻害された。我々の得た結果は、二つの異なるＭＡＰキナーゼカス
ケードは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１のＬＰＳに誘導される活性化（ＬＰＳ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と、ＣＯＸ−２とＩＬ−１遺伝子の転写とに対
する、律速段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）であることを示している。これ
らはまた、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２がこの過程において重要な役割を担っており、ゆ
えに新規な抗炎症薬（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇ）の開発の
ための魅力的な標的であることを示唆している。
【０２４１】 材料と方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）
【０２４２】 材料。細胞培養に用いた試薬と抗体はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（
Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ）から、ＰＤ ９８０５９はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ（Ｂａｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）から、Ｒｏ ３１８２２０とＳＢ ２
０３５８０はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から、ｆｏ
ｌｓｋｏｌｉｎと３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（
ＩＢＭＸ）はＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で、“完全な“プロテイナーゼプ
ロテイナーゼ阻害剤混合物（“ｃｏｍｐｌｅｔｅ”ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｌｅｗｅｓ，Ｕ
Ｋ）から、ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｇｏ
ａｔ ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２ ａｎｔｉｂｏｄｙはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から
、ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｂｂｉｔ
ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢはＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｉｎｇ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，Ｎ．Ｙ．）から、［γ−３２Ｐ
］−ＡＴＰとＥＣＬ試薬はＡｍｓｔｅｒｄａｍ（Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）から、Ｒｎ
ｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔはＱＩＡＧＥＮ社から、ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ
ＳｙｓｔｅｍはＰｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）から購入さ
れた。マウスのＲＡＷ ２６４マクロファージはｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｗｉｌｔｓ，ＵＫ）から入手
され、ＬＰＳとＵ０１２６はＤｒ．Ｊｏｈｎ Ｌｅｅ（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ
Ｂｅｅｃｈａｍ，ＰＡ ＵＳＡ）とＤｒ．Ｓｕｅ Ｃａｒｔｌｉｄｇｅ（Ｚｅｎ
ｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から提供
された。
【０２４３】 細胞培養と刺激。ＲＡＷ２６４マクロファージは、１０％（ｖ／ｖ）熱処理不
活性化された子牛の胎児性血清（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｅｔ
ａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）と１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｎ）と１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を
加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥ
Ｍ）で、９５％ ａｉｒ／５％ ＣＯ２の大気中（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）にお
いてに、保持された。刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の前日にマクロファージ
は６ｃｍ培養皿（ｐｌａｔｅ）あたり細胞２×１０６個の密度で培養され、刺激
の２時間前に培地は取り除かれ、ＤＭＥＭ２ｍｌに取り替えられた。細胞はそれ
から、数値記号に（ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｇｕｒｅ ｌｅｇｅｎｄｓ）指示された
時間の間、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、若しくは２０μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
と１０μＭ ＩＢＭＸで刺激される。指示されているように、ＳＢ ２０３５９
０（１０μＭ）及び／又はＰＤ９８０５９（５０μＭ）、又はＵ０１２６（１０
μＭ）又はＲｏ ３１８２２０（５μＭ）が、刺激の一時間前に添加された。
【０２４４】 細胞溶解。刺激の後、培地は吸引され、細胞は、０．２ｍｌの氷温溶解バッフ
ァー（ｉｃｅ ｃｏｌｄ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％（ｗ
／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａ
ｄａｔｅ、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０
ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．２７
Ｍ スクロース、２μＭ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ、１ｍＭ ｂｅｎｚａ
ｍｉｄｉｎｅ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、および５０ｍｌ
あたり１錠の”ｃｏｍｐｌｅｔｅ”プロテイナーゼ阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅｉ
ｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ））に可溶化された（ｓｏｌ
ｕｂｉｌｉｚｅｄ）。その後サンプルは液体窒素の中で急速冷凍され、分析され
るまでアリコートで（ｉｎ ａｌｉｑｕｏｔｓ）−８０℃で保存された。タンパ
ク質濃度は［７］に従って測定される。
【０２４５】 免疫ブロッティング。ＣＲＥＢの免疫ブロッティングのために、核細胞抽出物
（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ）記載されたように用意され［
２］、免疫ブロッティングは、Ｓｅｒ １３３でリン酸化されるＣＲＥＢとＳｅ
ｒ ６３でリン酸化されるＡＴＦ１を認識する、リン酸選択性（ｐｈｏｓｐｈｏ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いて実施された。ＣＯＸ−２の免疫ブロッティン
グのために、細胞溶解液（３０μｇタンパク質）は、ＳＤＳ中で変性され（ｄｅ
ｎａｔｕｒｅｄ）、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、ニトロセ
ルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）へ転移され（
ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）、抗ＣＯＸ−２抗体（ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）（１．０ｍｇ／ｍｌ）と免疫ブロッティングされた。リン酸化された
ＣＲＥＢとＡＴＦ１とＣＯＸ−２の検出は、強化された化学発光試薬（ｔｈｅ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（
ＥＣＬ）を用いて実施された。
【０２４６】 免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）とプロテインキナーゼ
のアッセイ。すべての抗体は、実施例１に記載したように培養された。ＭＳＫ２
は、細胞溶解液（１ｍｇたんぱく質）から、ＭＳＫ２の残基７５３−７７２に対
応するペプチドＲＡＰＶＡＳＫＧＡＰＲＲＡＮＧＰＬＰＰＳに対して生産される
抗体と、免疫沈降された。免疫沈降物は、実施例１に記載したように３０℃で、
洗浄および分析された。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性の１単位は、リン酸基１ｎ
ｍｏｌのペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧへの１分間の組み込みを触媒する量と
してさだめられた。ＭＡＰキナーゼに活性化されたタンパク質（ＭＡＰｋｉｎａ
ｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ｐ９０Ｒ
ＳＫとしても知られる）は、細胞溶解液（５０μｇタンパク質）から、マウスの
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（ＲＳＫ２ イソ型）の残基６０５−６２７に対応するペ
プチドＲＮＱＳＰＶＬＥＰＶＧＲＳＴＬＡＱＲＲＧＩＫＫに対して生産される抗
体と、免疫沈降された。この抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂと同様にＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１ａ（ＲＳＫ１）も免疫沈降する［８］。免疫沈降物は、記載されたよう
に、３０℃で洗浄及び分析された［８］。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１活性の１単位は、
リン酸基１ｎｍｏｌの［Ｇ２４５，Ｇ２４６］Ｓ６−（２１８−２４９）］（リ
ボソームタンパク質Ｓ６のＣ末端に密接に関連したペプチド）への１分間の組み
込みを触媒する量としてさだめられた。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ヒトタンパク質
の残基３５６−３７１に対応するペプチドＭＴＳＡＬＡＴＭＲＶＤＹＥＱＩＫに
対して生産される抗体を用いて、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と同様の手法で、免疫沈降
された。この抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２と同様に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３も免疫
沈降した［９］。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は記載されたようにアッセイされ［１０］
、１単位は、リン酸基１ｎｍｏｌのペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡへの１分間の
組み込みを触媒する酵素の量とした。
【０２４７】 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）。全体のＲＮＡは、Ｌ
ＰＳ刺激（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）又はコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ
）ＲＡＷ２６４細胞から、実験手引書（ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従ってＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて用意さ
れた。全体のＲＮＡは測定され、１００ｎｇが、オリゴヌクレオチドＧＴＴＧＧ
ＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧとＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣ
ＴＡＴＡＧＧＣＴ（“ハウスキーピング遺伝子”ヒポキサンチングアニンホスホ
リボシル転移酵素（ｈｙｐｏｘａｎｔｔｈｉｎｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＨＰＲＴをコードする）、Ａ
ＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧとＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴ
ＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡ（ＩＬ−１遺伝子をコードする）とＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣ
ＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣとＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＴＣ（ＣＯＸ
−２遺伝子をコードする）とともにＰｒｏｍｅｇａ ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／
ｍｌ）を用いて逆転写された。結果物である（ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ）一本鎖ＤＮ
ＡテンプレートのＰＣＲ増幅のための条件は、耐熱性Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラー
ゼ（５Ｕ／ｍｌ）及び１ｍＭ ＭｇＳＯ４を用い、９４度において変性を３０秒
間、６０度においてアニーリングを１分間、６８度においてエクステンション（
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を１分間、３０サイクルであった。ＰＣＲ生成物（ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）は、ＨＰＲＴの３５２ｂｐの単一のバンドを示し、ＣＯＸ−２の５
１５ｂｐの単一のバンドを示した。
【０２４８】 結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
【０２４９】 ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳに誘導される活性化は、二つの異なるＭＡＰキナ
ーゼカスケードによって仲介される。ＬＰＳは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（ｐ９０
ＲＳＫとも呼ばれる）とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化においてそれぞれ示したよ
うに、マクロファージの従来のＭＡＰＫカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路
の両方を活性化する［１１］。両方の酵素の活性化は一過性のものであり、３０
−６０分後に最高値に達し、その後、２時間後に基底状態の近くまで低下する［
１１］。本研究で、ＭＳＫ１とＭＳＫ２において、類似した結果が得られている
。これらの酵素の活性は、刺激を受けていないマクロファージに於いてはごくわ
ずかであるが、ＬＰＳによる刺激の後には非常に高められる。活性化は、３０−
６０後に最高に達し、その後低下する（Ｆｉｇ１７Ａと１７Ｂ）。
【０２５０】 どちらのシグナル形質導入経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｐａｔｈｗａｙ（ｓ））が、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を仲介するのかを特定
するために、我々はＳＢ ２０３５８０（Ｓｅｃｔｉｏｎ １）と、ＰＤ ９８
０５９（Ｓｅｃｔｉｏｎ １）のようにＭＫＫ１の活性化／活性を阻害するＵＯ
１２６の効果を調べた。これらの実験は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性（図１８Ｃ
）を完全に抑制するＵＯ１２６の濃度は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化（図１８
Ａと１８Ｂ）を部分的に阻害するのみであることを明らかにした。同様に、ＭＳ
Ｋ１とＭＳＫ２は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化（図１８Ｄ）を完全に遮断する
濃度において、ＳＢ ２０３５８０によって、部分的に阻害されるのみである（
図１８Ａと１８Ｂ）。逆に、ＵＯ１２６とＳＢ ２０３５８０の両方とも存在す
る条件下でマクロファージがインキュベイションされた場合、ＭＳＫ１とＭＳＫ
２の活性化は、ほぼ完全に抑制される（図１８Ａと１８Ｂ）。これらの観測は、
ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳにより誘導される活性化は（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、２つの異なるＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰ
ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ）に仲介されることを示した。
【０２５１】 ＬＰＳに誘導される（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＣＲＥＢとＡＴＦ１のリン酸
化は、２つの異なるＭＡＰ キナーゼカスケード（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｃａ
ｓｃａｄｅｓ）に仲介される。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２のための２種の推定される生
理学的な基質は、転写因子ＣＲＥＢとＡＴＦ１である。図１９Ａに示されたよう
に、ＬＰＳは、ＣＲＥＢとＳｅｒ １３３のリン酸化と、ＡＦＴ１とＳｅｒ６３
のリン酸化を誘導する。ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化のように、ＣＲＥＢとＡＴ
Ｆ１のリン酸化は、１時間後に最高に達し、２時間後に基底レベルまで戻る。同
様に、ＣＲＥＢとＡＴＦ１のＬＰＳに誘導されたリン酸化（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃ
ｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３５８０によって部分
的に阻害され、ＰＤ ９８０５９によって部分的に阻害され、両方ともの薬剤が
存在するとき完全に阻害される（図１９Ｂ）。
【０２５２】 ＬＰＳに刺激された（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）ＣＯＸ−２とＩＬ−１
の誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、２つの異なるＭＡＰキナーゼカスケード（Ｍ
ＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ）に仲介される。ＣＯＸ−２プロモータ
ーはＣＲＥを含む［５］。それゆえに、我々は、この酵素のＬＰＳに刺激された
誘導（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を仲介するシグナ
ル伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）が、ＣＲＥＢを活性化する
ために求められるものと同じであるかどうかを試験することとした。ＣＯＸ−２
タンパク質は、刺激されていないマクロファージ中には確認されなかったが、Ｌ
ＰＳに暴露してから２時間後には強く誘導された。誘導は、４時間後に最大とな
り、最低８時間保持された（図２０Ａ）。ＣＯＸ−２の誘導は、ＳＢ ２０３５
８０によって部分的に阻害され、ＰＤ ９８０５９によって部分的に阻害され、
両方ともの薬剤が存在するとき完全に抑制される（図２０Ｂ）。
【０２５３】 これらの結果を独立した方法で確認するために、我々はＣＯＸ−２の遺伝子転
写におけるＬＰＳの効果を調べた。ＬＰＳはＣＯＸ−２ ｍＲＮＡを強く誘導し
、２時間刺激した後に最高レベルに達して最低８時間保持される（図２１Ａ）。
ＣＯＸ−２ ｍＲＮＡの誘導は、ＳＢ ２０３５８０によって部分的に抑制され
、ＰＤ ９８０５９によって部分的に抑制され、両方ともの阻害剤が存在すると
きほぼ完全に抑制される（図２１Ｂ）。
【０２５４】 我々はまた、そのプロモーターもＣＲＥを含む炎症サイトカインＩＬ−１（ｐ
ｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＬ−１）を仲介するシグ
ナル形質導入伝達経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗ
ａｙ）も調べた。ＩＬ−１遺伝子転写誘導の時間工程（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ
）は、ＣＯＸ−２遺伝子のものから見分けることはできない（図２１Ａ）。興味
深いことに、ＩＬ−１ｍＲＮＡもまた、ＰＤ ９８０５９に部分的に阻害され、
ＳＢ ２０３５８０によって部分的に阻害され、両方ともの薬剤が存在するとき
完全に阻害される（図２１Ｂ）。
【０２５５】 逆に、“ハウスキーピング”遺伝子ＨＰＲＴをコード化するｍＲＮＡは、ＬＰ
Ｓ及び／又はＰＤ ９８０５９及び／又はＳＢ ２０３５８０によって影響され
ない。
【０２５６】 ＬＰＳに誘導される活性（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）
におけるＲｏ ３１８２２０の効果。 Ｒｏ ３１８２２０は、ＭＳＫ１といくつかの他のプロテインキナーゼの強力な
阻害剤であるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のような他の多くのプロテインキナーゼは
、ＭＳＫ１の活性を除去する薬剤濃度においては、影響されない（［１，３］、
後に論じられた）。Ｒｏ ３１８２２０（５μＭ）は、ＬＰＳに誘導される（Ｌ
ＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＭＳＫ１及びＭＳＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ２の活性化には影響せず（図１８）、これらのシグナル伝達経路（ｓｉ
ｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）において、この化合物によって阻害される“
上流（ａｐｓｔｒｅａｍ）”のプロテインキナーゼは無いことを示している。し
かしながら、Ｒｏ ３１８２２０（５μＭ）は、Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢ
とＳｅｒ６３におけるＡＴＦ１の、ＬＰＳに誘導される（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅ
ｄ）リン酸化を完全に阻害する（図１９）。同じ濃度のＲｏ ３１８２２０はま
た、ＣＯＸ−２タンパク質のＬＰＳに刺激される（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ
ｄ）誘導と（図４Ｂ）、ＣＯＸ−２とＩＬ−１遺伝子の転写（図２１Ｂ）を抑制
する。逆に、ＨＰＲＴをコード化するｍＲＮＡはＲｏ ３１８２２０によって影
響されない。
【０２５７】 ＣＲＥＢの活性化は、ＣＯＸ−２またはＩＬ−１の合成を誘導するには不充分
である。Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢと、Ｓｅｒ６３におけるＡＴＦ−１のリ
ン酸化もまたインビボでＰＫＡに触媒され、それゆえ、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎのよ
うな環状ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）の細胞内濃度を上昇させるアゴニスト
に誘導され得る。ｆｏｌｓｋｏｌｉｎによるマクロファージの刺激は、ＬＰＳに
よるもの（図２２）に類似した、ＣＲＥＢとＡＴＦ−１のリン酸化を引き起こす
。しかしながらこれは、ＰＤ ９８０５９とＳＢ ２０３５８０とによって、又
はＲｏ ３１８２２０によって抑制されない（データは示されていない）。ＬＰ
Ｓとは異なり、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎは顕著な量のＣＯＸ−２タンパク質が現れる
ことを誘導しない。この発見は、後に考察される。
【０２５８】 ディスカッション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
【０２５９】 本明細書において我々は、ＭＳＫ１と密接に関連したＭＳＫ２がＲＡＷ２６４
マクロファージに存在し、双方のキナーゼはＬＰＳに応答して、一時的に活性化
されることを証明した（図１７）。活性化と不活性化の割合は、それぞれ従来の
ＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路の活性化の便利な“下流
（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）”リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ）である、ＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化と不活性化の割合に類似している。
ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳに誘導される活性化は、従来のＭＡＰキナーゼカス
ケードの活性化を阻害する薬剤に部分的に阻害され、ＳＢ ２０３５８０（ＳＡ
ＰＫ２ａ／ｐ３８の阻害剤）に部分的に阻害され、マクロファージが双方のタイ
プの薬剤の存在下でインキュベーションされたときほぼ完全に阻害される（図１
８）。マクロファージにおけるＭＳＫ２の活性は、ＭＳＫ１のものよりもはるか
に低く、２９３、ヒーラ及びＰＣ１２細胞においても同様である（結果は示され
ていない）。
【０２６０】 転写因子ＣＲＥＢとＡＴＦ１は、ＭＳＫ１（実施例１を参照のこと）とＭＳＫ
２［１３］の生理学的な基質であり、本研究はこの仮説と一致している。したが
って、ＣＲＥＢとＡＴＦ１は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化／不活性化と類似の
速度で（ｗｉｔｈ ｓｉｍｉｌａｒ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、一時的にリン酸化さ
れ、リン酸化はマクロファージを、従来のＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ
２ａ／ｐ３８双方の阻害剤とともにインキュベーションすることにより阻害され
たが、これらの経路のうち一つを阻害することにより部分的にのみ阻害された。
さらに、ＣＲＥＢのリン酸化は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２は阻害するが、わずかな他
のプロテインキナーゼを阻害するのみである濃度において、Ｒｏ３１８２２０（
図３Ｂ）によっても阻害された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３及
びＰＫＡもまた、ＣＲＥＢとＡＴＦ１を、それぞれＳｅｒ１３３とＳｅｒ６３に
おいて、リン酸化する。しかしながら、先の報告［１，２］とは異なり、これら
のプロテインキナーゼは、ＣＲＥＢとＡＴＦ１のＬＰＳに誘導される活性化に対
する、律速段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）にはなり得ない。なぜなら、そ
れらは、これらの実験に用いたＲｏ ３１８２２０の濃度には、インビボでは影
響されないからである（実施例１と［１］を参照のこと）。
【０２６１】 ＣＲＥを含むマクロファージの２つの遺伝子は、ＣＯＸ−２［５］とＩＬ−１
β［６］をコード化するものである。我々は、ＬＰＳに誘導されるこれらの遺伝
子の転写とＣＯＸ−２タンパク質の合成は、ＣＲＥＢの活性化を阻害するのとま
ったく同じ阻害剤の組み合わせ、つまりＳＢ ２０３５８０とＰＤ ９８０５９
またはＲｏ ３１８２２０によって阻害されることを発見した。これらの結果は
、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２は、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの遺伝子の転写を、少なくと
も部分的に、ＣＲＥＢをリン酸化することによって刺激することを示唆する。し
かしながら、他の転写因子、Ｃ／ＥＢＰβは、ある細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
）でのＣＯＸ−２［１４］とＩＬ−１β［１５］遺伝子の活性化において、決定
的な役割を果たすことが報告されている。さらに、Ｃ／ＥＢＰβは、３Ｔ３−Ｌ
Ｉ早期脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）においてＳＡＰＫ２／ｐ３８に
より活性化されるの［１７］と同様に、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞において特定のトレ
オニン残基（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）のリン酸化を触媒するＭＡ
ＰＫ／ＥＲＫにより活性化される［１６］ことが報告されている。それゆえに、
ＰＤ９８０５９／ＵＯ１２６とＳＢ ２０３５８０は、ＣＲＥＢの活性化と同様
にＣ／ＥＰＢβの活性化も阻害することによって、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの転
写を抑制する。ＣＲＥＢ同様にＣ／ＥＰＢβに対する要求は、環状ＡＭＰ活性剤
（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって誘導され
る、ＣＲＥＢの活性化だけでは、ＣＯＸ−２遺伝子の顕著な転写を誘導するのに
不充分なのかを説明しうる。これらの可能性に焦点を当てた実験はいまだ進行中
であるが、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓとＳＡＰＫ２ｓ／ｐ３８によるＣ／ＥＢＰβの
直接的なリン酸化は、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの遺伝子転写におけるＲｏ ３１
８２２０の効果を説明できない。なぜなら、このようなＭＡＰキナーゼファミリ
ーメンバー（［３］と結果（ｒｅｓｕｌｔｓ）は示していない）とそれらの活性
化を導くシグナル伝達経路（図１８）は、このドラッグに抵抗を示すからである
。
【０２６２】 引用文献
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＭＳＫ１のヌクレオチドと推論されたアミノ酸配列である。下線が引かれ
た残基はキナーゼドメインに対応する。太字で示された残基（Ｓｅｒ２１２、Ｓ
ｅｒ３６０、Ｓｅｒ３７７、Ｔｈｒ５８１）は、リン酸化部位を活性化すると推
定される。残基７２６から７４５間（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂには存在しない
）の推定上の二者間の（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル（Ｒｏｂｉｎｓ
等、１９９１）は、アスタリスクで示される。終止コドンは黒三角で示される。
【図２】 密接に関連したキナーゼと共にＭＳＫ１のアミノ酸配列を配列したものである
。この配列は、クラスタルＷプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ
）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９４）を用いて行った。同一の残基には、黒い影
を付けている。（Ａ）ＭＳＫ１をヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（ｉｓ
ｏｆｏｒｍｓ）とともに配列したもの。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ上の活性化する重
要なリン酸化部位に対応する残基（Ｓｅｒ２２２、Ｓｅｒ３６４、Ｓｅｒ３８１
、Ｔｈｒ５７４）は、アスタリスクでしるしを付してある。（Ｂ）ＭＳＫ１のＮ
末端（ＭＳＫ１−Ｎ）とＣ末端（ＭＳＫ１−Ｃ）キナーゼドメインを、ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ２／３及びＭＮＫ１のキナーゼ領域と共に並べたものである。これらの
キナーゼの非触媒領域では重要な相同性はない。（Ｃ）ヒトＭＳＫ１を、部分的
なマウス（ｍＭＳＫ２）及びヒトＭＳＫ２配列と共に並べたものである。推定上
の活性化するリン酸化部位をアスタリスクで示している。
【図３】 ＧＳＴ−ＭＳＫ１の発現と精製及び、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とＳＡＰＫ２とに
よるその活性化。（Ａ）非刺激（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）細胞及びＴＰＡ刺
激細胞から精製されたＧＳＴ−ＭＳＫ１（２（ｇタンパク質）とＧＳＴ−ＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１ａ（２（ｇタンパク質）とを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ケル（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動し、クーマ
シーブルーで染色した。分子量マーカーである（−ガラクトシダーゼ（（−ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）（１１６ｋＤａ）とグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇ
ｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（９７ｋＤａ）の位置が示され
ている。各タンパク質の活性はペプチド基質（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）を用いて定量した（ａｓ
ｓａｙｅｄ）。非刺激細胞由来（Ｂ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１又は（Ｃ）ＧＳＴ−ＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１ａを、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（８Ｕ／ｍｌ、白丸）、ＳＡＰＫ２
ｂ／ｐ３８β（１Ｕ／ｍｌ、黒四角）、ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（１Ｕ／ｍｌ）白
三角）、又はＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（１Ｕ／ｍｌ、黒三角）のいづれかと共に、
１０ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２と１００μＭ非ラベル化ＡＴＰとバッファーＢ内で培
養した。示されている時間において、アリコートが回収され、１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡを含むバッファーＢで１０倍に希釈され、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対しての活
性を定量された。平行する実験で、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、及びＳＡＰＫ１／Ｊ
ＮＫ１（以外の全てのＳＡＰＫ酵素の活性を、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙ
ｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）
。ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１（はＡＴＦ２を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）（デ
ータは示していない）。この結果を、６つの測定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｓ）の±ＳＥＭとして表している（２つの独立した実験）。各点の誤差は、＜１
５％である。（Ｄ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１を、（［３２Ｐ］ＡＴＰを使用したこと以
外は、上記のＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２及びＳＡＰＫ酵素と一緒にインキュベートし
た。２０分後、ＳＤＳを加えることにより反応は終了し、試料を７．５％ポリア
クリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動し、Ｇ
ＳＴ−ＭＳＫ１に対応するクーマシーブルー染色バンドをオートラジオグラフィ
ーにかけた。２つの別個の実験で同じような結果が得られた。
【図４】 特にＭＳＫ１を免疫沈降する抗体の発生。（Ａ）ＴＰＡ刺激２９３細胞（１．
０Ｕ／ｍｌで５０（ｌ）から精製された活性ＧＳＴ−ＭＳＫ１を４ｏＣで３０分
間、示されたペプチド免疫原（１ｍＭ）の存在下又は非存在下で、示された抗体
（５（ｇ）に結合されたタンパク質Ｇ−セファロース（Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）ビーズ（５（１）と共に振とう台で培養し、その後１３，０００ｘｇで１分間
遠心分離にかけた。ビード（ｂｅａｄｓ）は材料及び方法で記載したように洗浄
し、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。（Ｂ）及び（Ｃ）ＴＰＡ刺激
２９３細胞由来の活性ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ１ｂ（Ｃ）を示されている抗体で免疫沈降した以外はＡと同様にし、洗浄した
免疫沈降物のＣｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。
【図５】 ＴＰＡ、ＥＧＦ及び細胞ストレスによる内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）Ｍ
ＳＫ１の活性化。２９３細胞を１６時間血清飢餓とし、その後５０（Ｍ ＰＤ９
８０５９（白抜き棒）、１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０（斑点棒）の存在下で、
又はいずれの化合物もない状態（黒棒）で、１時間培養した。細胞は非刺激（対
照）（ｃｏｎｔｒｏｌ）のまま放置するか、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ、１０分
）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１０分）、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．５ｍＭ、３０分）のいづれかで刺激するか、ＵＶ放射
（２００Ｊ／ｍ２、その後３７ｏＣで３０分放置）又は、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ、３
０分）にさらすかのいづれかとし、阻害剤の存在下又は非存在下は連続的とした
。細胞を溶菌し、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｂ）又はＭＡＰ
ＫＡＰＫ２（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した。データは独立した実
験の３回実行した各測定を±ＳＥＭ平均値として表してある。
【図６】 ２９３細胞内でのＴＰＡ及びＵＶによる活性化におけるＭＳＫ１の突然変異の
効果。２９３細胞を、フラッグ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識された野生型ＭＳＫ
１、Ｎ末端（ＮＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１及びＣ
末端（ＣＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１を発現するＤ
ＮＡ構築物に、瞬間的にトランスフェクトした（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。こ
の細胞を、５０（Ｍ ＰＤ ９８０５９、１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０と共に
、又は両化合物の非存在下で１時間培養した。それらをその後、１０分間ＴＰＡ
（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激するか、ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、その後３７ｏ
Ｃで３０分放置）暴露し、これらは阻害剤の連続存在下又は非存在下で行った。
細胞を溶菌し、ＭＳＫ１を溶菌液から免疫沈降し、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅで定量し
た。データは、独立した３つの実験を各３回実行した測定を±ＳＥＭ平均値とし
て表してある。（Ｂ）各溶菌液からの２（ｇのタンパク質を１０％ ＳＤＳ／ポ
リアクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電
気泳動し、モノクロナールフラグ抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｆｌａｇ−ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。免疫反応性ＭＳＫ１タンパク質は、
非トランスフェクト細胞中に観察されなかった（データは示していない）。フラ
ッグ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識されたＭＳＫ１はグリコーゲンホスホリラーゼ
（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（見かけ質量９７ｋＤａ）
と共泳動する。
【図７】 ＭＳＫ１は主に細胞の核に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａはサイトゾルに局在化する
。Ｎ末端にフラッグエピトープ標識された（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇ
ｇｅｄ）野生型ＭＳＫ１又はＮ末端にＨＡエピトープ標識されたＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ１ａを発現する２９３細胞を、無血清培地で１６時間培養し、その後非刺激の
ままか、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定の前にＴＰＡ（１
００ｎｇ／ｍｌ、１０分）で刺激し、分画し、適当な標識（ＭＳＫ１（Ａ＋Ｂ）
にはフラグ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｃ）にはＨＡ、のため免疫ゴールド（ｉｍ
ｍｕｎｏｇｏｌｄ）標識化した。細胞の核（Ｎｕｃ）及び細胞質（Ｃｙｔ）にお
けるＭＳＫ１又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの濃度の定量は、物質及び方法で記載し
たように行った。その結果は、ＴＰＡ刺激はＭＳＫ１及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
の局在化に検出可能な効果はないことを示している。データは３つの独立した実
験からのものである。ＭＳＫ１の対照としては、ｎ＝９、９、１４、ＴＰＡはｎ
＋１０、１１、１５である。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの対照として全部でｎ＝２２
、ＴＰＡは全部でｎ＝９である（細胞質中に免疫反応性物質の示量魂のある細胞
は除外している）。棒は、Ｃｏｃｈｒａｎ（１９５３）に従って計算した平均値
の標準誤差を表す。（Ｃ）ＭＳＫ１（Ｃ、非刺激、及びＤ、ＴＰＡ）及びＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｅ、非刺激）の選択された試料を示し、構造及び、標識化分布
を図示している。棒は５００ｎｍである。
【図８】 ＭＳＫ１はＣＲＥＢをＳｅｒ１３３でリン酸化する。（Ａ）表示されているペ
プチドとＣＲＥＢに対する、ＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ
−Ｋ１ｂの基質特異性の比較。リン酸化と分析は、材料及び方法で記載したよう
に行った。報告された全ての反応速度定数に対する標準誤差は、＜±２０％（Ｓ
ＥＭ）の範囲内であり、そのデータは２つの別個の実験の平均値として報告して
いる。Ｖｍａｘ値はＣｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１
）を基質として用いて得られた値の百分率として報告している。ＣＲＥＢの残基
１２６−１３６に対応するペプチドＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫは、ＣＲＥＢｔｉｄ
ｅと名づける。太字で表されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基は、ペプチドのリン
酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基に対応している。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに
対するＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂのＶｍａｘ値
はそれぞれ、２００Ｕ／ｍｇ、３５０Ｕ／ｍｇ、８００Ｕ／ｍｇである。（Ｂ）
ＧＳＴ−ＭＳＫ１（黒棒）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ−１ａ（白棒）、ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ−１ｂ（斑点棒）及びＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（斜線棒）は表示さ
れている基質で定量された。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を用いた条件では、Ｃ
ＲＥＢの３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ）の
Ｓｅｒ９８（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）は、Ｓｅｒ１３３に比べて１０倍
高いレベルにリン酸化された（データは示さず）。図示されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
２によるＣＲＥＢのリン酸化は、訂正され、ＣＲＥＢへのリン酸基の全取込に対
するＳｅｒ１３３リン酸化の寄与のみを示している。データは、３つの独立した
実験の各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表されている。（Ｃ）ＭＳＫ１
でリン酸化されたＣＲＥＢを、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で消化し、水で０
．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉ
ｄ）（ＴＦＡ）で平衡化したＶｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４ Ｃ１８カラム（Ｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）によりクロマトグ
ラフィーにかけた。カラムを、流速０．８ｍｌ／分、線形アセトニトリル（ａｃ
ｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）勾配（斜線）で展開し、０．４ｍｌのフラクションを回
収した。カラムに照射された放射能の７５％が、主要３２Ｐ含有ペプチドから１
３％アセトニトリルで（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）回収された（放射能の残り
は多数の小さなピークとして溶出された）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂでリン酸化さ
れたＣＲＥＢのペプチドマップは、ＭＳＫ１でリン酸化されたＣＲＥＢのものと
同一であった（データは示さず）。
【図９】 ＭＳＫ１の活性におけるＲｏ ３１８２２０の効果。（Ａ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１
（黒丸）、ＰＫＣアイソフォーム混合物（白丸）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
ｂ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（白三角）における、インビトロでのＲｏ ３１８２
２０の効果。結果は、阻害剤が取り除かれた対照インキュベーションと比較して
表し、各測定を３回行った２つの実験の平均値として示している。各点の誤差は
±１０％である。（Ｂ）２９３細胞を１時間、５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒ
ｏ）と共に又は阻害剤なしで（−）前処理し、その後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２
）にさらすかその処理をせず（−）、そしてその後さらに３０分、Ｒｏ ３１８
２２０の連続存在下で培養した。この細胞を溶菌し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫
沈降して定量した。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値
±ＳＥＭとして表す。（Ｃ）阻害剤での処理前に、２９３細胞を２時間、３２リ
ン酸塩（０．１ｍＣｉ／ｍｌ）で培養した以外は上記と同じである。細胞はその
後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２）にさらすか未処理のまま（−）とし、更に２０分
間阻害剤の連続存在下で培養した。細胞溶菌に続いて、ＨＳＰ２７を細胞抽出液
から免疫沈降し（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）、１５％ポリアクリルアミドゲル
（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で流し、オートラジオグラフィーを
行った。
【図１０】 Ｒｏ ３１８２２０は、ＣＲＥＢのＥＧＦ及びＵＶ誘導リン酸化を抑制する。
２９３細胞を、５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）、１０（Ｍ ＳＢ ２０３
５８０（ＳＢ）、５０（Ｍ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）のそれぞれ存在下及び非
存在下で前処理し、その後、（Ａ、Ｄ）ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、３０分、そ
の後３７ｏＣで３０分）、（Ｂ、Ｅ）ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１５分）、（
Ｃ）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２０（Ｍ、１５分）のいづれかにさらした。細胞を溶
菌し、タンパク質を１０％アクリルアミドゲル（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ
ｓ）で分離し、リン酸化特異抗体（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。このリン酸化特異抗体は、Ｓｅｒ１３３
とＳｅｒ６３でそれぞれリン酸化した時、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の両方を認識す
る。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。
【図１１】 ＴＮＦによるＭＳＫ１の活性化。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、５０（Ｍ
ＰＤ ９８０５９（黒丸）、１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０（白三角）、５０
（Ｍ ＰＤ ９８０５９＋１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０（黒三角）、の存在下
、又は両化合物の非存在下（白丸）で、無血清培地で培養した。その後、細胞を
、表示した時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下において、ＴＮＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）により刺激し、溶菌して、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂ）
、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した
。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表
す。
【図１２】 ＴＮＦ誘導ＣＲＥＢリン酸化におけるＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０
、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、無血清培地で
、表示されているように５０（Ｍ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）、１０（Ｍ ＳＢ
２０３５８０（ＳＢ）及び５（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は
非存在下で培養した。その後細胞を、図１１Ｃの説明文で述べたように、表示し
た時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下においてＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で
刺激し、溶菌して、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために試料を免疫ブロッ
トした。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。展開前の
ブロットの暴露時間（ｅｘｐ）を表示している。
【図１３】 ＰＣ１２細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＮＧＦ誘導活性化におけるＰＤ ９
８０５９、ＳＢ ２０３５８０、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ＰＣ１２細胞を無
血清培地で２時間、５０（Ｍ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）又は１０（Ｍ ＳＢ
２０３５８０（ＳＢ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細胞を１５分間
、ＮＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。
細胞溶菌後、アリコートをＣＲＥＢ（Ａ）のリン酸化に対して免疫ブロットした
か、溶菌液からの免疫沈降後、ＭＳＫ１（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）を
定量するのに用いた。
【図１４】 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１の亜ヒ酸塩（ａｒｓｅｎｉｔｅ
）及びＦＧＦ誘導活性化におけるＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０、Ｒｏ
３１８２２０の効果。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を１時間、無血清培地で、５０（Ｍ
ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）、１０（Ｍ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）、及び５
（Ｍ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細
胞を、１５分間、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．
５ｍＭ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、阻害剤の連続存在下又は非存在
下で刺激した。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）のいづれかについてこれらを溶菌液
から免疫沈降した後定量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために
免疫ブロットした（Ｄ）。
【図１５】 ＲＡＷマクロファージ内のＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＬＰＳ誘導活性化における
ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ＲＡＷ ２６
４マクロファージを、無血清培地で２時間培養し、その後、５０（Ｍ ＰＤ ９
８０５９（ＰＤ）、１０（Ｍ ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、又は５（Ｍ Ｒｏ
３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で１時間培養した。その後細胞をＬ
ＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激し
た。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（
Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）についてこれらを溶菌液から免疫沈降した後定
量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化に対して免疫ブロットした（Ｄ
）。
【図１６】 ヒトＭＳＫ２及びヒトＭＳＫ２のスプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉ
ａｎｔ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【図１７】 ＲＡＷ ２６４マクロファージ中のＬＰＳによるＭＳＫ１及びＭＳＫ２の活性
化。マクロファージを、表示した時間、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと共に（開符
号）、又は無しで（閉符号）刺激した。ＭＳＫ１活性（Ａ）又はＭＳＫ２活性（
Ｂ）を、溶菌液から免疫沈降後、測定した。結果を、２つの別個の皿の２つの測
定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に２つの実験から得られ
た。
【図１８】 ＲＡＷ２６４マクロファージ内のプロテインキナーゼのＬＰＳ誘導活性化にお
ける阻害剤の効果。マクロファージを１時間、１０μＭ ＵＯ １２６（Ｕ）及
び／又は１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ Ｒｏ ３１８２
２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後１時間、１００ｎｇ／ｍｌ
ＬＰＳと共に又はなしで、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。その
後、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＳＫ２（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）、及びＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ２（Ｄ）を、溶菌液から免疫沈降した後、定量した。結果を、２つの
別個の皿の２つの測定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に２
つの実験から得られた。
【図１９】 ＲＡＷ２６４マクロファージでのＬＰＳ誘導ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１リン酸化。
（Ａ）マクロファージをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で表示された時間、刺激し
た。細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリコートをＳＤＳで変性し
、１０％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で
電気泳動してニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒ
ａｎｅ）へ転移させた後、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ−）ＣＲＥＢ抗体で免疫ブロ
ットした。分子量マーカーであるグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅ
ｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（９７ｋＤａ）、子ウシ血清アルブミン（ｂ
ｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（
ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）（４３ｋＤａ）、及び炭酸脱水酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ
ａｎｈｙｄｒａｓｅ）（３０ｋＤａ）の位置が示されている。同様の結果が更
に３つの実験で得られた。（Ｂ）マクロファージを１時間、５０μＭ ＰＤ ９
８０５９及び／又は１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭＲｏ
３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後１時間１００ｎｇ
／ｍｌ ＬＰＳの存在下又は非存在下において、阻害剤の連続存在下又は非存在
下で刺激した以外はＡと同様。同様の結果が更に３つの実験で得られた。
【図２０】 ＲＡＷ２６４マクロファージでのＣＯＸ２タンパク質のＬＰＳ刺激誘導。（Ａ
）マクロファージを表示された時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。
細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリコートをＣＯＸ−２抗体で免
疫ブロットした（詳細と分子量マーカーについては図１９の説明文参照）。同様
の結果が更に３つの実験で得られた。（Ｂ）マクロファージを１時間、５０μＭ
ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）及び／又は１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）
、又は５μＭ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、そ
の後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの非存在下又は存在下で、かつ阻害剤の連続存
在下又は非存在下で４時間刺激した以外はＡと同様。同様の結果が更に３つの実
験で得られた。
【図２１】 ＲＡＷ２６４マクロファージでの遺伝子転写（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ）におけるＰＤ ９８０５９及びＳＢ ２０３５８０の効果。（Ａ）細
胞を表示された時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。全ＲＮＡを各時
間点で抽出し、ＩＬ−１、ＣＯＸ−２、及びＨＲＰＴをコード化するｍＲＮＡを
、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（セクション２．６）
を用いて決定した。（Ｂ）マクロファージを１時間、ＰＤ ９８０５９（５０μ
Ｍ）及び／又はＳＢ ２０３５８０（１０μＭ）、又はＲｏ ３１８２２０（５
μＭ）の存在下又は非存在下で培養し、その後、３時間、ＬＰＳの非存在下又は
存在下で、かつ阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した以外はＡと同様。Ｒ
ＴＰＣＲは、ＩＬ−１、ＣＯＸ−２、及びＨＰＲＴのフラグメントをコード化す
るオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いて行われた
。同様の結果が更に２つの実験で得られた。
【図２２】 ＲＡＷ２６４マクロファージでのＣＲＥＢリン酸化及びＣＯＸ−２誘導におけ
るｆｏｒｓｋｏｌｉｎの効果。（Ａ）マクロファージを、ＬＰＳ（１００ｎｇ／
ｍｌ）で１時間、又はｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｆ）（２０μＭ）とＩＢＭＸ（１０
μＭ）で１５分間刺激した。細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリ
コートをリン特異（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＣＲＥＢ抗体で免疫ブ
ロットした（詳細と分子量マーカーについては図１９の説明文参照）。（Ｂ）マ
クロファージを３時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、又はｆｏｒｓｋｏｌｉ
ｎ（２０μＭ）とＩＢＭＸ（１０μＭ）で刺激し、特異的なＣＯＸ−２抗体で免
疫ブロットを行った（物質及び方法セクション）。マーカータンパク質は図１９
と同様である。同様な結果が更に２つの実験で得られた。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１１月２５日（１９９９．１１．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６４】 このようなポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、（ｉ）前
記ポリヌクレオチドにコード化されたタンパク質に特異的に結合する抗体の生産
に、順次利用されるタンパク質又はそのフラグメントの合成に使用可能なもの、
又は（ｉｉ）その遺伝子あるいは（ｉ）で定義された変異型（ｖａｒｉａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｙｐｅ）に対応するアンチセンス配列を含む。例えば、同一のアミ
ノ酸をコードする異なるコドンは、原形のコドンとして代用されることができる
。変わりになるべきものとして、代用コドンは、タンパク質の活性あるいは免疫
原性に影響しない、又はその活性や免疫原性を高め或いは逆に調節する、異なる
アミノ酸をコードしうる。例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅの“Ｓ
ｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔ
ｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１９３−２１０（１
９８５）に述べられたように、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）又はその他の技術が、置換、挿入、欠失、転移の
ような、一重又は多重の突然変異を発生するのに活用され、この技術が参考とし
て本明細書に組み込まれている。このような修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ポ
リヌクレオチドは、既知の技術を本明細書に組み込まれた教示（ｔｈｅ ｔｅａ
ｃｈｉｎｇ）に応用することにより入手可能であるので、このように修飾された
ポリヌクレオチドは特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】 さらに、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列（若しく
はそれらのフラグメント）が、高度にストリンジェントな条件下で、これらとハ
イブリダイズする他のポリヌクレオチド配列を得るのに使用できることは、当業
者に認識されるだろう。このようなポリヌクレオチドはあらゆるゲノムＤＮＡ（
ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を含む。よって、本発明のポリヌクレオチドは、本発
明の手法により同定されるポリヌクレオチドと、少なくとも６０％、好ましくは
７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０
％の相同性を示すポリヌクレオチドを含んでいるが、これは、このような相同な
ポリヌクレオチドが、少なくとも以下に述べる手法のいくつかに於いて使用可能
、若しくは有用であるポリペプチドをコード化する場合に於いてである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６６】 パーセント相同性（Ｐｅｒ ｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、例えばウィス
コンシン大学遺伝子コンピューターグループ（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）
のＧＡＰプログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）により測定できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】 ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＡＮ−ＲＮＡ，又はＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーシ
ョンは、０．１×から６×の濃度の標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）を含有
する水溶液中で、５５℃から７０℃の温度において実施される。この技術分野に
於いて、温度が高いほど、又は標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）の濃度が低
いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになることがよ
く知られている。ここでいう“高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉ
ｎｇｅｎｃｙ）”とは、２×標準食塩−クエン酸緩衝液と６５℃を意味する。１
×標準食塩−クエン酸緩衝液は０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウムである。高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ
）の状態でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、特許請求の範囲に記載され
た発明の範囲に含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】 このポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）”はまた、比較的短
いストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）（例えば２０個から５０個のヌクレオチド
）が、本発明のポリヌクレオチドと同等のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）と
高い割合の相同性（少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０又は９５％）
を示すポリペプチドを、たとえこれら二つのポリヌクレオチドの全体における相
同性がこれよりもかなり低いとしても、含むものとする。これは、タンパク質の
全体的な構造が異なる場合でも、その重要な活性又は結合部位が共有されうるか
らである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１０】 さらなる実施例において、その化合物は前記ポリペプチドの活性を高める。例
えば、その化合物は、前記ポリペプチドのその基質への結合を助けるために、前
記ポリペプチドの活性部位ではない部分に結合するかもしれない。さらなる例で
は、その化合物は、アロステリック効果によって前記ポリペプチドの活性を高め
るために前記ポリペプチドの一部分に結合するかもしれない。このアロステリッ
ク効果は、例えばＭＡＰＫ２やＳＡＰＫ２／ｐ３８のような“上流活性化因子（
ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”による前記ポリペプチドの活性化の
ように、前記ポリペプチドの活性の自然法則に含まれるアロステリック効果でも
よい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１１】 都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているようにＭＳＫ１又は
ＭＳＫ２が、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ、又はＡＴＦ１又はＣｒｏｓｓｔｉ
ｄｅをリン酸化するという事実を利用するが、適当ないかなる基質が用いられて
もよい。従って、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ又はＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＡＴ
Ｆ１のリン酸化は当業者によく知られた技術を用いて測定されるかもしれない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１２】 都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているものと実質的に同様
かもしれない定量（ａｓｓａｙ）を利用する。実施例１では、ＭＳＫ１によるＣ
ＲＥＢ又はＡＴＦ１のリン酸化が測定される。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２は、組換え
ＭＳＫ１又はＭＳＫ２であることが好ましい。基質は、例えばＣＲＥＢやＡＴＦ
１のように、組換え体であることが好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１３】 もう一つのものとして、基質の活性における変化が測定されるかもしれない。
例えば、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の転写因子としての活性が測定されるかもしれな
い。これは、当該学術分野でよく知られているように、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の
、適当な結合部位を持つＤＮＡへの結合をを測定することによって行われてもよ
く、又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって調節されるプロモーターからのＲＮＡの
発現を測定することによって行われてもよい。これは、細胞システム全体の中で
、又は精製された、又は部分的に精製された成分を用いることで、行われてもよ
い。同様に、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１で調節されるプロモーターから転写されるＲ
ＮＡによってコードされているタンパクの発現が、測定されるかもしれない。そ
のタンパクは、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって生理学的に調節されているかもし
れないし、又は当業者によく知られている”リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔ
ｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）”かもしれない（すなわち、組換え体構造が用いられる
かもしれない）。リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）は
、例えばβ−グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
又はルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（例えばＴａｎ等（１９９６）参
照）のように、活性が容易に測定されるかもしれない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６２】 ＣＯＸ２は組織損傷（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａとａｌｌｏｄｙｎｉａ）に続
いて起こる痛覚の変化に伴われ得るので、ＭＳＫ１の阻害剤は無痛覚症に有用だ
ろう。ＣＯＸ２の発現は、偏頭痛に伴われ得るため、ＭＳＫ１の阻害剤は偏頭痛
の治療に有用であろう。従って、本発明のさらなる側面は、偏頭痛を持つ又は無
痛覚症をわずらう患者を治療する方法を提供し、この方法は、本発明のスクリー
ニング方法により同定可能であって、効果的な量の化合物を患者に投与すること
を有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６３】 ＣＯＸ２は、がんに関わる。ＣＯＸ２を阻害することはがんを防止又は治療す
ることに有用であろう。ＣＯＸ２は血管形成を促進し得る。ＣＯＸ２の阻害は、
例えば結腸がんで、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）のセラ
ミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）への変換を順々に刺激しうるアラキドン酸（ａｒａｃ
ｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）のレベルを増加することにより、抗がん剤効果を持
つだろうが、これはアポトーシスの仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として既に示唆
されている。従って、上記本発明の化合物のようなＭＳＫ１阻害剤は、がんの治
療又は防止に有用だろう。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１６４】 本発明の化合物はまた、アルツハイマー病の治療又は防止に有用だろう。ＮＳ
ＡＩＤｓとコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）（抗炎症性
でもある）はアルツハイマー病の発病の遅延又は進行を遅らせることに有用であ
ると示唆されており、たとえ低用量で使用したとしても、鎮痛効果には十分であ
るが、抗炎症性治療のために用いられるよりも効果は少ない。ＣＯＸ２発現は、
炎症性の仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）に応じてアルツハイマー病の脳と膠細胞
で高められることが示されている。形質転換したマウスモデルのニューロンでの
ＣＯＸ２の過剰発現は、インビトロでのβ−アミロイド（−ａｍｙｌｏｉｄ）神
経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を導くだろうから、アルツハイマー病で
のＣＯＸ２の役割を裏付けている。従って、ＭＳＫ１阻害剤は、アルツハイマー
病及び他の神経退行性の病気の治療又は防止に有用だろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７４】 私達は、２つのプロテインキナーゼドメインを単一のペプチドに含む、新規な
マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）及びストレス活性プロテインキナーゼ（ＭＳＫ
１）及び密接に相関した同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（ＭＳＫ２）を同定した
。ＭＳＫ１（８０２残基）は、ＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ−１（Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ｐ９０ ＲＳＫともいう）他の“２つのキナーゼドメイン”
酵素に対して全アミノ酸配列の４３％が相同性を示す。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端
キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での対応するドメインに対して５４％
及び４４％が同一であり、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での４つの主要な活性化リン酸化
部位はＭＳＫ１に保持されている。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と同様に、ＭＳＫ１はＭ
ＡＰＫ２／ＥＲＫ２によりインビトロで活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と
異なり、ＭＳＫ１はストレス活性プロテインキナーゼ２ａ（ＳＡＰＫ２ａ、ｐ３
８ともいう）及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２によっても活性化される。これらの
結果と一致して、内因性のＭＳＫ１は、２９３細胞内で、ポリペプチド成長因子
／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｏｎ）によって、又はＵＶ放射、酸化的及び化学的ストレスへの暴露によっての
いずれかにより活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は意味深いことに成長因子
／ホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
）刺激のみで活性化される。成長因子／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏ
ｌ ｅｓｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によるＭＳＫ１の活性化は、ドラッ
グＰＤ ９８０５９、これはＭＡＰＫカスケード（ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ）
の活性を抑制する、により阻害されるが、一方ＵＶ放射、酸化的及び化学的スト
レスによるＭＳＫ１の活性化はＳＢ ２０３５８０、すなわちＳＡＰＫ２ａ／ｐ
３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特定の阻害剤によりほとんど阻害される。ヒ
ーラ（ＨｅＬａ）細胞では、ＰＤ ９８０５９とＳＢ ２０３５８０との両方が
それぞれＴＮＦ、ＮＧＦ、及びＦＧＦによるＭＳＫ１の活性化抑制に必要とされ
る。なぜなら、このアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）はＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＳＡ
ＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方を活性化するからである
。ＭＳＫ１の活性化は、Ｎ末端又はＣ末端キナーゼドメインのどちらかにおける
変異を単一（ｓｉｎｇｌｅ）不活性化させることにより終了する。ＭＳＫ１は非
刺激又は刺激細胞の核に局在化するが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは、同じ条件下で
はほとんど細胞質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）に局在化する。ＭＳＫ１は、ＰＫ
Ａ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２より非常に低いＫｍ値で、転
写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）ＣＲＥＢをＳｅｒ１３３
においてリン酸化する。Ｓｅｒ１３３周辺の配列に対応するペプチドは、著しく
低いＫｍ値（＜０．１μＭ）でリン酸化される。４つの細胞系内でのＣＲＥＢ及
びＡＴＦ１の作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）誘導活性化でのＳＢ ２０３５８０、Ｐ
Ｄ ９８０５９及びＲｏ ３１８２２０の効果は、これらの阻害剤のＭＳＫ１活
性化での効果を反映し、この過程でのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３
及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の役割を排除している。これらの結果は他の観察結果と
共に、ＭＳＫ１はＣＲＥＢの成長因子及びストレス誘導活性化を仲介するだろう
ということを示唆している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９１】 ＭＳＫ１は核に局在化しており、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは細胞質に局在化して
いる。２９３細胞中で過剰発現された（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）野生型Ｍ
ＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）は、定量免
疫電子顕微鏡法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって調査された（図７）。ＭＳＫ１は、主に刺激を
受けていない細胞（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）の核に局在化され
ていた。核区画（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中のＭＳＫ１の密
度は、細胞質中に比べて１２から３０倍高かった（図７Ａおよび７Ｃ）。ＴＰＡ
での刺激によるＭＳＫ１の活性化（図７Ａおよび７Ｄ）またはＵＶ照射によるＭ
ＳＫ１の活性化（データ省略）によって、ＭＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌ
ｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）で一切変化が誘発されなかった。ＭＳＫ１は、
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに存在しない残基７２６から７４８まで（図１）の間
に、推定二分裂核局在シグナル（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｎｕ
ｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を有している（Ｒｏｂ
ｉｎｓ等、１９９１）。この観察と一致して、細胞中で過剰発現された場合、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは主に細胞質中に局在化した（図７Ｂ）。さらに、このキナ
ーゼの１００倍の活性化を誘発する（データ省略）細胞のＴＰＡ刺激をした後（
図７Ｂおよび７Ｅ）、核へのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの重要な転座（ｔｒａｎｓｌ
ｏｃａｔｉｏｎ）は観測されなかった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９２】 ＭＳＫ１は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において非常に有用なＣＲＥＢ
キナーゼである。ＭＳＫ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの基質特異性（ｓｕｂｓ
ｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）は、ＴＰＡ刺激および細胞ライゼー
ト（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）からの精製へと続く２９３細胞内のＧＳＴ融合
タンパク質（ＧＳＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現後に比較された
（図３Ａ）。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１、図８
Ａ）の飽和濃度でのＧＳＴ−ＭＳＫ１の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのそれと同じであることが分かった（図８の
凡例参照）。ＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＫｍは、ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａま
たはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに対して２から３μＭであった。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ
は、リン酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からＮ末端側へ３番目および５番目
の残基に位置する２つのアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）を含んでいるので、
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１によって効果的にリン酸化される。この理由から、ペプチド
ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ（ペプチド２、図８Ａ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに
よって、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅとほぼ同一のＫｍおよびＶｍａｘの値でリン酸化さ
れる。このペプチドがＭＳＫ１によってさらに効果的にリン酸化されることが分
かり、Ｋｍ値は０．２μＭであった。ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡにおけるポジション
ｎ−３のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をリシン（ｌｙｓｉｎｅ）に交換す
ること（ペプチド３、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと同様にＭ
ＳＫ１に対するＫｍが約１００倍に増加した。しかしながら、ポジションｎ−５
のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）に交換する
こと（ペプチド４、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに対するＫｍ
が５倍に増加したにもかかわらず、ＭＳＫ１に対するＫｍがあまり増加しなかっ
た。これらの実験から、ＭＳＫ１は、ポジションｎ−３にアルギニン（ａｒｇｉ
ｎｉｎｅｓ）を要求するが、ｎ−５に塩基性残基（ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ
）を要求しないことが示される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９３】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（
Ｔａｎ等、１９９６）は、それぞれ成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）
、ストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ ｓｔｉｍｕｔｉ）によって転写因子Ｃ
ＲＥＢ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＣＲＥＢ）の活性化を仲
介することが報告されていた。優勢的なＭＳＫ１の核局在化を考慮すると、これ
ら他のプロテインキナーゼと比較して、ＭＳＫ１がＣＲＥＢをリン酸化させる効
率を比較することは、それ故、興味深いことであった。これらの実験によって、
ＣＲＥＢがＫｍ値２μＭおよびＣｒｏｓｓｔｉｄｅまたはＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ
と同様なＶｍａｘでリン酸化される驚くほどよいＭＳＫ１に対する基質であると
いう驚くべき知見が導き出された。対照的に、ＰＫＡによって、ＣＲＥＢが同じ
条件下でＫｍ値１７μＭでリン酸化された（データ省略）が、一方、リン酸化が
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（図８Ａ）またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（データ省略）
によって触媒作用されたとき、Ｋｍは高すぎて測定できなかった。その結果、Ｍ
ＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性がＣｒｏｓ
ｓｔｉｄｅおよび／またはペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対して相性がよいと
き、ＭＳＫ１による５μＭ ＣＲＥＢのリン酸化速度は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
に比べて３０倍速く、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに比べて１２倍速く、ＭＡＰＫＡＰ
−Ｋ２に比べて６０倍速かった（図８Ｂ）。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、
ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと比べて、熱ショックタンパク質２７
（その生理的基質（ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｓ）の一つ、Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）に対してはるかにより活性的であった
（図８Ｂ）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９４】 ＭＳＫ１によりリン酸化されたＣＲＥＢ上の残基は、Ｃ１８カラムでの消化物
（ｄｉｇｅｓｔ）のクロマトグラフィーへと続くトリプシン消化（ｔｒｙｐｔｉ
ｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって立証された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）。１
５％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で溶出されたある主要な３２
Ｐ−標識ペプチド（３２Ｐ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）が観察された
（図８Ｃ）。このペプチドはホスホセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）を含
み、さらに、固相シーケンス（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
）にかけたとき、Ｅｄｍａｎ分解（Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の３
番目のサイクル後に３２Ｐ放射能が解放された（データ省略）。その同定（ｉｄ
ｅｎｔｉｔｙ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメトリー（ｍａｓｓ ｓ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって立証されたが、その質量スペクトロメトリー
は、ペプチドの分子量（７５８．３３）が、残基１３１から１３５を有しＳｅｒ
１３３でリン酸化されている予期されたトリプシンホスホペプチド（ｅｘｐｅ
ｃｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）の分子量（７５８
．３６）と同一であるということを示した。同じ残基をリン酸化させることが知
られているＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）は、ＭＳＫ１と同じ
トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を標識化した（データ
省略）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９５】 ＣＲＥＢタンパク質によって得られた結果と一致して、ＣＲＥＢの残基１２６
から１３６（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ、ペプチド５、図８Ａ）に対応する合成ペ
プチド（ＣＲＥＢｔｉｄｅと呼ばれる）は、低すぎて測定できないほどのＫｍ値
（＜０．１μＭ）でリン酸化された。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、少なくとも２００倍高いＫｍ値でかなり乏しくこのペプ
チドをリン酸化させた。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９６】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２が２９３細胞中でＵＶまたはＥＧＦによってＣＲＥＢおよ
びＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。星形胞子類似体（ｓｔａｕｒｏ
ｓｐｏｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）Ｒｏ ３１８２２０は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１ａ／ｂと同様に、ＩＣ５０値（ＩＣ５０ ｖａｌｕｅｓ）が１０から３０ｎＭ
までの範囲で（Ａｌｅｓｓｉ １９９７、図９Ａ）、全てのＰＫＣアイソフォー
ムを阻害する（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。本研究において、Ｒｏ ３１８２２
０は、インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）同程度の効力を持つ（ｅｑｕａｌｌｙ
ｐｏｔｅｎｔ）ＭＳＫ１活性の阻害剤であることが分かった（図９Ａ）。Ｒｏ
３１８２２０は、インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）１０（ＭでもＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ２をあまり阻害せず（図１１Ａ）、さらに、インビボで（ｉｎ ｖｉｖｏ
）ＵＶに応答してもＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化に影響を及ぼさない（図９Ｂ）
。さらに、ＲＯ ３１８２２０を有する細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂ
ａｔｉｏｎ）は、ＨＳＰ２７のＵＶ誘発リン酸化（ＵＶ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２に対する生理的基質（ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にあまり影響を及ぼさなかった
（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５、図９Ｃ）。並行した実験において、ＵＶによるＨ
ＳＰ２７のリン酸化は、ＳＢ２０３５８０によって遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ
）。ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのように環状ＡＭＰ濃度を増加させるアゴニスト（ａｇ
ｏｎｉｓｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍｏｎｔｍｉｎｙ １９８９）によって誘発
されるＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介する環状ＡＭＰ依存性プロテイ
ンキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ）もまた、１０μＭ Ｒｏ ３１８２２０によってあまり阻害されな
かった（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９７】 図９に示される結果によって、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化（およびＳ
ｅｒ６３で近い関係のＡＴＦ１（ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ＡＴＦ１）の
リン酸化）を仲介する間に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の役割を評価する機会が提供さ
れた。我々は、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１が、２９３細胞のＵＶの照射またはＥＧ
Ｆによる処理後にすばやくリン酸化されること、および、リン酸化が５μＭ Ｒ
ｏ ３１８２２０によって大きく阻害されることを観測した（図１０Ａおよび１
０Ｂ）。対照的に、環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを介してＣＲＥＢリン
酸化を誘発させる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎによる
ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化が５μＭ Ｒｏ ３１８２２０によって影響
されなかった（図１０Ｃ）。ＭＳＫ１の活性化のように、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ
１のＵＶ誘発リン酸化が、ＳＢ ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ ９
８０５９によって阻害されず（図１０Ｄ）、一方、ＥＧＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化
（ＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、
ＰＤ ９８０５９によって阻害されるが、ＳＢ ２０３５８０によって阻害され
なかった（図１０Ｅ）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９８】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１がヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅ
ｌｌｓ）の中でＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。 内因性ＭＳＫ１が、ヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）の中で腫瘍壊死因子（
ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）（ＴＮＦ）によってすばやく
（しかし、一時的に）活性化された。興味深いことに、ＭＳＫ１の活性化に対す
るＳＣ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９の影響は、刺激時間とともに変化
した。５分後、活性化はＳＢ ２０３５８０によって完全に阻害されたが、ＰＤ
９８０５９によって影響されなかった。しかしながら、１５分後、ＭＳＫ１の
活性化がＳＢ ２０３５８０、ＰＤ ９８０５９のうちいずれか一方によって部
分的に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）が、両方のドラッグが一緒に加えられたな
らば、ほぼ完全に抑制された（図１１Ａ）。これらの観察は、ＳＡＰＫ２／ｐ３
８およびＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の異なる活性化速度
によって説明される。従って、ＴＮＦ刺激から５分後、（ＳＢ ２０３５８０に
よって阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によって阻害されない）ＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ２の活性化によって判断されるように、ＳＡＰＫ２経路が活性化される。対照
的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化の欠如によって判断されるように、５
分経過後も、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードは活性化されない（図１１Ｂおよび１
１Ｃ）。しかしながら、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の
両方の活性化によって判断されるように、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／
ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方が、ＴＮＦ刺激から１５分後、活
性化される。１５分後におけるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化は、ＰＤ ９
８０５９によって抑制されるが、ＳＢ ２０３５８０によって抑制されない（図
１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９９】 ＴＮＦによるヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）の刺激は、ＣＲＥＢおよび
ＡＴＦ１のリン酸化をすばやく誘発した。５分後、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリ
ン酸化は、ＳＢ ２０３５８０によって阻害されたが、ＰＢ ９８０５９によっ
て影響されなかった（図１２Ａ）。１５分後、ＣＲＥＢのＴＮＦ誘発リン酸化（
ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３
５８０によって部分的に抑制され、ＰＤ ９８０５９によってわずかに抑制され
、両方の化合物の存在下では完全に阻害された（図１２Ｂ）。ＣＲＥＢの活性化
へのＳＢ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９の影響は、それ故、ＴＮＦ誘発
ＭＳＫ１活性化（ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＳＫ１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）
へのそれらの影響に類似していた（図１１）。ＴＮＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化（Ｔ
ＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、５μ
Ｍ Ｒｏ ３１８２２０によって完全に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）（図１２
Ｃ）が、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化はこのドラッグによって影響されなかった
（データ省略）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２００】 ＰＣ１２細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１またＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関があるという証
拠。ＰＣ１２細胞株のＮＧＦ刺激は、ＣＲＥＢのリン酸化（図１３Ａ）およびＭ
ＳＫ１の活性化（図１３Ｂ）を誘発させた。ＣＲＥＢのリン酸化およびＭＳＫ１
の活性化は、ＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０のうちいずれか一方を有す
る細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によってあまり影響され
ないが、両方のドラッグの存在下では強く阻害された（図１３）。これらの結果
によって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８経路の両方の阻害が、Ｓ
ｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化およびこれら細胞内でのＭＳＫ１活性化を阻害
するのに必要であることが示され、このことは、さらにディスカスション（Ｄｉ
ｓｃｕｓｓｉｏｎ）で考察される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０１】 ＭＳＫ１のように、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１もまたＮＧＦによって５倍に活性化さ
れたが、ＭＳＫ１と対比して、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化はＳＢ ２０３５８
０によって影響されず、ＰＤ９８０５９によって部分的に阻害され、両方のドラ
ッグの組み合わせによってさらに阻害されなかった。従って、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１の活性には、ＣＲＥＢのリン酸化と相関がなかった。以前に報告されたように
（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）、ＮＧＦは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化のうちど
の重要な活性化をもＰＣ２３細胞内で誘発しなかった。さらに、ＮＧＦ誘発ＣＲ
ＥＢリン酸化は、５μＭ Ｒｏ ３１８２２０によって抑制され（データ省略）
、再びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３に対する役割を排除した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０２】 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関がある
という証拠。この研究所での先行する研究によって、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄ
ｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）、ＦＧＦのうちいずれか一方によって誘発されるＳ
Ｋ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化が、ＳＢ ２０３５
８０によって抑制される（Ｔａｎ等、１９９６）。本研究において、我々は、こ
れらの細胞内でのＣＲＥＢおよびＭＳＫ１の亜ヒ酸ナトリウム誘発活性化（ｓｏ
ｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、Ｓ
Ｂ ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によっては阻害され
ないことを確証した。しかしながら、ＣＲＥＢのＦＧＦ誘発リン酸化（ＦＧＦ−
ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ ２０３５８０、
ＰＤ ９８０５９のうちいずれか一方によってわずかに阻害されたが、完全にＣ
ＲＥＢのリン酸化を抑制するには両方のドラッグの存在が必要であった（図１４
Ｄ）。同様に、それらの細胞内のＭＳＫ１のＦＧＦ誘発リン酸化は、ＳＢ ２０
３５８０、ＰＤ ９８０５９のうちいずれか一方の存在によって部分的にのみ抑
制されるが、両方の化合物の存在によって阻害される（図１４Ａ）。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０３】 ＭＳＫ１と対比して、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）
およびＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化は、ＳＢ ２０３５８０によっ
て完全に阻害されるが、ＰＤ ９８０５９によって阻害されず（図１４Ｃ）、そ
して、（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化または活性に影響を及ぼさない）Ｒｏ ３
１８２２０は、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化を大きく抑制した。これらの
知見によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン
酸化に対して速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。
混乱を避けるために、Ｒｏ ３１８２２０は、ＭＳＫ１活性の可逆的阻害剤であ
り、細胞内でＭＳＫ１活性に影響を及ぼさないことに注意すべきである。ひとた
び細胞が溶解され（ｌｙｓｅｄ）、ＭＳＫ１がライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）か
ら免疫沈降されると（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）、Ｒｏ ３１８
２２０阻害剤は除去され、従って、ＭＳＫ１はもはや阻害されない。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０４】 ＭＳＫ１と対比して、ＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化は、ＰＤ ９
８０５９によって廃止されたが（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）、ＳＢ ２０３５８０に
よって廃止されなかった（図１４Ｂ）。 しかしながら、（ＳＢ ２０３５８０が存在していない状態での）ＰＤ ９８０
５９は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化をあまり抑制しなかった。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０５】 細菌内毒素（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）は、ＲＡＷ ２６４
マウスマクロファージ細胞系統（ＲＡＷ ２６４ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈ
ａｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）内でＭＳＫ１およびＣＲＥＢリン酸化に刺激を与
える。図１５に示すように、ＲＡＷ ２６４マクロファージのＬＰＳ刺激によっ
て、ＭＳＫ１およびＣＲＥＢ／ＡＴＦ１リン酸化がもたらされる。５０μＭ Ｐ
Ｄ ９８０５９または１０μＭ ＳＢ ２０３５８０が、ＭＳＫ１およびＣＲＥ
Ｂ／ＡＴＦ１のリン酸化を阻害しているように見える。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０６】 ディスカスション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０７】 我々は、新規で幅広く発現されたＭＳＫ１と呼ばれるプロテインキナーゼの配
列（図１）と、近い関係のＭＳＫ２のほぼ完全な配列（図２、図１６および表１
）をここに示す。ＭＳＫ１およびＭＳＫ２は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォ
ームと非常に類似していており（全体のアミノ酸配列に対して４０％の相同性（
ｉｄｅｎｔｉｔｙ））、単一ポリペプチドに２つのプロテインキナーゼドメイン
（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）を有する点でそれらがＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォームと類似している（図２）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
のＮ末端キナーゼドメインが外因性基質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅｓ）をリン酸化するが、一方では、唯一知られたＣ末端ドメインの役割がＮ
末端ドメインを活性化することである（イントロダクション（Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ）参照）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＣ末端キナーゼドメインの重要性は、
不活性突然変異（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）がＮ末端キナ
ーゼドメインの活性化を８５から９０％抑制するという知見によって示される（
Ｌｅｉｇｈｔｏｎ等、１９９６）。対照的に、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメイ
ン内の不活性な突然変異は（Ｎ末端キナーゼドメイン内の不活性な突然変異のよ
うに）、完全に活性化を廃止する（ａｂｏｌｉｓｈｅｓ）（図８）。もし、４つ
の重要なリン酸化部位の保存によって示唆されたように（図２）ＭＳＫ１の活性
化のメカニズムがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のそれと類似しているならば、これによっ
て、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメインがＮ末端ドメインの活性化に不可欠であ
ることが示される。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２０９】 ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）またはＳＡＰＫ２／ｐ３８経
路の活性化を引き起こすシグナルによってＭＳＫ１がインビボで（ｉｎ ｖｉｖ
ｏ）活性化されるという知見は、ＭＮＫ１のように、それが様々な細胞外シグナ
ル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｓ）の効果を統合する役割を演
じていることを示している。従って、ＭＳＫ１の基質は、おそらく、マイトジェ
ン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎ
ａｌｓ）の両方に応答してリン酸化されるタンパク質である。そのような２つの
タンパク質は、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）ＣＲ
ＥＢおよびＡＴＦ１であり（イントロダクション参照）、我々は、ＣＲＥＢがイ
ンビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＭＳＫ１に対する驚くほど良い基質であること
が分かった（図８）。ＭＳＫ１は、Ｓｅｒ １３３でのみ、すなわち、インビボ
で（ｉｎ ｖｉｖｏ）マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シ
グナル（ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｓ）に応答してリン酸化される活性化部位
（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）でＣＲＥＢをリン酸化させる。ＭＳＫ１に
よるＣＲＥＢのリン酸化に対するＫｍは、ＰＫＡ＜ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＭ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ２によるリン酸化に比べてはるかに低い（図８）。ＭＳＫ１は、
同等の残基で、０．１μＭ未満と概算された驚くほど低いＫｍでＣＲＥＢｔｉｄ
ｅをリン酸化させる（図８Ａ）。我々の知識の中で、この値は、これまで同定さ
れてきた（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）いかなるプロテインキナーゼのいかなるペプ
チド基質に対する最も低いＫｍ値である。これらの観察によって、ＭＳＫ１（お
よび／またはＭＳＫ２）がマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス
性刺激によるＣＲＥＢの活性化を仲介し、そして、ＭＳＫ１の核局在化（ｎｕｃ
ｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）（図７）はそのような役割と矛盾しないことが示
唆される。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１０】 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ニューロン細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ｎｅｕｒｏｎａｌ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）でストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ
ｓｉｇｎａｌｓ）またはＦＧＦによってＣＲＥＢの活性化を仲介するであろう
（Ｔａｎ等、１９９６）。しかしながら、本研究では、インビボでの（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化もインビトロでのその活性（図９および１
４）も１０μＭまでのＲｏ ３１８２２０によって影響されず、５μＭ Ｒｏ
３１８２２０は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞および他の細胞株でＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を
活性化させるすべてのシグナルに応答してＳｅｒ１３３でＣＲＥＢリン酸化を抑
制する（図１０，１２および１４）。さらに、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は代わるべき
ものとしてのスプライスＣＲＥＢ２変異体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐ
ｌｉｃｅｄ ＣＲＥＢ２ ｖａｒｉａｎｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）
をＳｅｒ１３３よりすばやくＳｅｒ９８でリン酸化させるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
２を強く活性化させるアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）による刺激後、Ｓｅｒ９８
でのＣＲＥＢのリン酸化は観測されないことが分かった。これらの結果から、Ｍ
ＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３活性がＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＣＲＥＢのストレス誘発
活性化（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｎ）に対して速度制
限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。ストレス性刺激によ
って活性化されることが知られており、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化させ
る唯一の他のプロテインキナーゼはＭＳＫ１である。ＭＳＫ１はインビトロで（
ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりもはるかに効率的にＣＲＥＢをリン
酸化させ（図８）、Ｒｏ３１８２２０によって強く（ｐｏｔｅｎｔｌｙ）阻害さ
れる（図９）。これらの理由から、現時点において、ＭＳＫ１（および／または
ＭＳＫ２）が、Ｓｅｒ１３３でのストレス誘発ＣＲＥＢリン酸化（ｓｔｒｅｓｓ
−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を仲介するも
っともよい候補である。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１７】 材料。プロテインキナーゼの検定のためのペプチドが、ＤｕｎｄｅｅでＦ．Ｂ
．Ｃａｕｄｗｅｌｌ氏によって合成され（ＭＲＣユニット）、抗体を作製する（
ｒａｉｓｅ）のに使用されたペプチドは、Ｇ．Ｂｌｏｍｂｅｒｇ博士（Ｂｒｉｓ
ｔｏｌ大学、イギリス）によって合成された。プロテインＧ−セファロース（Ｇ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびグルタチオンセファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏ
ｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｏｎ Ｋｅｙｎｅ
ｓ、イギリス）から購入され、アルキル化されたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅ
ｄ ｔｒｙｐｓｉｎ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、イギリス
）から購入され、組織培養試薬（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅａｇｅｎ
ｔｓ）、ミクロシスチン−ＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ）およびＥＧＦ
は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｉｓｌｅｙ、イギリ
ス）から購入され、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢酸塩（１２
−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ）（
ＴＰＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ、イギリ
ス）から購入され、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）およ
び過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）（Ｈ２Ｏ２，Ａｒｉｓｔ
ａｒ ｇｒａｄｅ）は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、イギリス）
から購入され、ＳＢ ２０３５８０およびＰＤ ９８０５９は、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、イギリス）から購入され、ｐＣＲ ２．１−Ｔ
ＯＰＯクローニングベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ（Ｌｅｅｋ、オランダ）から購入された。活性化されたＧＳＴ−ＭＡ
ＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ
１γ（Ｌａｗｌｅｒ等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８ａ、ＧＳＴ
−ＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βおよびＧＳＴ−ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（Ｃｕｅｎｄａ
等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（Ｇｏｅｄｅｒｔ等、１９９７
）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ等、１９９５）およびＧＳ
Ｔ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（Ｃｌｉｆｔｏｎ等、１９９６）が、バクテリアで発現
され、上述のようにインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）適切な上流キナーゼキナ
ーゼ（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）を使用することで最大
限に活性化された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、上述のようにＭＲＣユニットでＮ
．Ｍｏｒｒｉｃｅ博士によってウサギ骨格筋から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａ
ｎｄ等、１９９３）。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、バクテリアで発現
され、上述のようにインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＧＳＴ−ＭＡＰＫを使用
することで活性化された（ＢｅｎＬｅｖｙ等、１９９５）。ＰＫＡは、当業者に
知られているウシの心臓（ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ）から調製された。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１８】 抗体。ＭＳＫ１“Ａ”、ＭＳＫ１“Ｂ”およびＭＳＫ“Ｃ”は、ヒツジ（ｓｈ
ｅｅｐ）においてそれぞれペプチドＬＴＶＫＨＥＬＲＴＡＮＬＴＧＨＡＥＫＶ（
ＭＳＫ１の残基２６から４４に対応）、ＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥ
Ｒ（ＭＳＫ１の残基３８４から４０２に対応）および、ＫＡＴＦＨＡＦＮＫＹＫ
ＲＥＧＦＣＬＱＮ（ＭＳＫ１の残基７１６から７３４に対応）に対して作製され
た（ｒａｉｓｅｄ）。特にＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫沈降し（Ｃｌｉｆｔｏｎ等
、１９９６）、またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの両方
を免疫沈降する（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）抗体は、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）に
おいてペプチドＫＥＤＫＥＲＷＥＤＶＫＥＥＭＴＳ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の
残基３４３から３５８）およびＲＮＱＳＰＶＬＥＰＶＧＲＳＴＬＡＱＲＲＧＩＫ
Ｋ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの残基７１２から７３４）に対して作製された（
ｒａｉｓｅｄ）。この研究で使用される全ての抗体は、適切なペプチドが共有結
合されたＣＨ−セファロースカラム（ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ
ｓ）でアフィニティー精製され（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、ＵＢ
Ｉ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、アメリカ）から商業的に入手可能である。フラッ
グエピトープ（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識するモノクローナル抗体（ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ａｎａｃｈｅｍ（Ｌｕｔｏｎ、イ
ギリス）から購入された。ＨＳＰ２７を認識するウサギポリクローナル抗体（ｒ
ａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅ
ｎ（Ｙｏｒｋ、イギリス）から購入された。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１９】 緩衝溶液。緩衝液Ａ−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．
５，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍｍ ＥＤＴＡ，１％（質量比）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００，１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎ
ａｄａｔｅ），５０ｍＭフッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）
，５ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
，０．２７Ｍスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ），１（Ｍミクロシスチン−ＬＲ（ｍ
ｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ），０．１％（体積比）β−メルカプトエタノール
（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）および“完全な”プロテイナーゼ阻害剤反
応混液（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（５
０ｍｌあたり１錠Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗｅｓ，イギ
リス）。緩衝液Ｂ−５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．５
，０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐ
ｔｏｅｔｈａｎｏｌ）。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２０】 ＭＳＫ１およびＭＳＫ２のクローニング。ＭＳＫ１の配列は、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ
．Ｅ．協会（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から入手されたヒト
ＥＳＴ ｃＤＮＡ（ＡＡ１５ ８５７１）を配列決定すること（ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）によって得られた（Ｌｅｎｎｏｎ等、１９９６）。マウス（ｍｏｕｓｅ
）およびヒトＭＳＫ２配列は、表１に示されるＥＳＴ ｃＤＮＡクローンのうち
の幾つかを配列決定することによって得られた。マウスＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ
挿入断片（ＥＳＴ ｉｎｓｅｒｔｓ）、ＡＡ４７２１６５，ＡＡ３８９１６８を
配列決定することによって得られた。ヒトＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ挿入断片（Ｅ
ＳＴ ｉｎｓｅｒｔｓ）、Ｈ４６２６８，ＡＡ５６８８９５を配列決定すること
によって得られた。ＤＮＡ塩基配列決定（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、
Ｔａｑダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ｔａｑ ｄｙｅ ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）を使用する
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサー（３
７３Ａ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）によって行われた
。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２２】 ＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの発現。ヒト胚腎臓２
９３細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌ
ｓ）の直径１０ｃｍのディッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）２０個が培養され、それぞれ
のディッシュは、改良リン酸カルシウム法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９６ｂ）を使用
することによって、ＧＳＴ−ＭＳＫ１、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのうちい
ずれか一方をコード化するＤＮＡ ２０μｇでトランスフェクションされた（ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションしてから２４時間後、細胞は１
６時間血清枯渇され（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖｅｄ）、刺激されていないままの
もの、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ，１５分）で刺激されたものうちいずれか一方
と細胞のそれぞれのディッシュが、氷冷された１ｍｌの緩衝液Ａに溶解された（
ｌｙｓｅｄ）。２０のライゼートが、プールされ（ｐｏｏｌｅｄ）、４℃、１０
分間、１３，０００ｘｇで遠心分離され、そして、上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａ
ｎｔ）が、事前に緩衝液Ｂで平衡状態にされた１ｍｌのグルタチオン−セファロ
ース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使って回転台（ｒｏｔ
ａｔｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で６０分間保温された（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ
）。懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）が、１分間、３０００ｘｇで遠心分離され
、ビード（ｂｅａｄｓ）が０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有した１０ｍｌの緩衝液
Ａで３回洗浄され、さらに、０．２７Ｍスクロースを含有した１０ｍｌの緩衝液
Ｂで３回洗浄された。ＧＳＴ−ＭＳＫ１またはＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａが
、２０ｍＭグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）および０．２７Ｍスクロー
スを含有した３本の１ｍｌ緩衝液Ｂを使って、環境温度で樹脂から溶出された。
混合された溶出液（０．５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１用タンパク質および０
．１ｍｇ／ｍｌ ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ）は、アリコート（ａｌｉｑｕ
ｏｔｓ）に分割され、液体窒素中で急速冷凍され（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）、
そして、−８０℃で保管された。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２３】 細胞培養、刺激、細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）。ヒト胚腎臓２９３細胞
（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ ｃｅｌｌｓ）およ
びヒーラ細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ）が融合して（ｔｏ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃ
ｅ）培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略さ
れたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
で１６時間保温された。ヒーラおよびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が、直径１０ｃｍのデ
ィッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）上で融合して培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ
ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで２時間保温された。ＮＧＦの付加から数時
間以内に分化し始める高濃度のＮＧＦ受容体を発現させるＰＣ１２細胞が、培養
され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで２時間
保温された（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）。これらの細胞内における高濃度のＮＧ
Ｆ受容体によって、ＰＤ ９８０５９阻害剤が、ＭＡＰＫのＮＧＦ誘発活性化（
ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を部分的にのみ抑制する。そ
の後、細胞は、５０μＭ ＰＤ ９８０５９，１０μＭ ＳＢ ２０３５８０，
５μＭ Ｒｏ ３１８２２０または対照としての同体積のＤＭＳＯで、図の凡例
に示された時間だけ保温され、図の凡例のように刺激され、そして、細胞が１．
０ｍｌの氷冷された緩衝液Ａに溶解された（ｌｙｓｅｄ）。ライゼートは、液体
窒素の中ですぐに冷凍され、使用されるまで−８０℃で保管された。タンパク質
の濃度は、標準として、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌ
ｂｕｍｉｎ）を使用して決定された（Ｂｒａｄｆｏｒｄ等、１９７６）。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２４】 ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の免疫沈降および検
定。それぞれの免疫沈降に使用された細胞ライゼートの量は、ＭＳＫ１（５００
μｇタンパク質）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（５０μｇタンパク質）およびＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（５０μｇタンパク質）であった。ライゼートは、５μｌのプ
ロテインＧ−セファロースと結合された５μｇのそれぞれの抗体を使って、振動
台（ｓｈａｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で４℃、３０分間保温された。免疫
沈降物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）は、０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含有した１ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄され、さらに、１ｍｌの緩衝液Ｂで１回
洗浄された。標準ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ検定（５０μｌ）は
、洗浄されたプロテインＧ−セファロース免疫沈降物（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ），５０ｍｍトリス（
Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．１％（体積比）
２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ），２．５μ
Ｍ ＰＫＩ（環状−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ−ＡＭＰ
−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のペプチド阻害剤），
Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（３０μＭ），１０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍｇ（Ａｃ）２
）および０．１ｎＭ［（３２Ｐ）ＡＴＰ（１００−２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を
含んでいた。検定は、３０℃、１０分間行われ、検定チューブ（ａｓｓａｙ ｔ
ｕｂｅｓ）は、懸濁液中に免疫沈降物を保持するために連続的に振動され（ａｇ
ｉｔａｔｅｄ）、その後検定を終了させ、（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）に記載
されているように分析された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ペプチドＫＫＬＮＲＴＬ
ＳＶＡ（３０μＭ）が基質として使用されていることを除き、同様に検定された
。活性の１ユニット（Ｏｎｅ ｕｎｉｔ）は、１分間で１ｎｍｏｌのペプチド基
質のリン酸化に触媒作用を及ぼす酵素の量であった。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２５】 ＣＲＥＢの発現。Ｍ．Ｊ．Ｃｏｍｂ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，ボストン，アメリカ）の好意により我々に提供されたＣＲＥＢ（Ｇｏｎｚａ
ｌｅｚ等、１９８９）の３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａ
ｒｉａｎｔ）をコード化するＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で形質転換さ
れた大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ）ＢＬ２１が、０．３ｍＭのイソプ
ロピル−（−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−（−Ｄ−ｔｈｉｏｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）とともに３７℃で５時間誘導された。ＧＳＴ−ＣＲＥＢ
が前述のようにＧＳＴ−ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）の
ためにグルタチオン−セファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）を用いて精製され、５０％のグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を含む緩
衝液Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）に対して透析され（ｄｉａｌｙｓｅｄ），−２０℃
で貯蔵された。この調剤（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は多数の小バンドとともに
、６２ｋＤａと４３ｋＤａでの２つの主バンドを示した。この６２ｋＤａと４３
ｋＤａのバンドのみがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＳＫ１によってリン酸化された。
ＣＲＥＢのタンパク質濃度は、ウシの血清アルブミン標準（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅ
ｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）に関して６２ｋＤａと４３ｋＤａ
のバンドの強度を比較することによって見積もられた。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２６】 リン酸化されたＣＲＥＢとＡＴＦ１の免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ）が調整され（ｐｒ
ｅｐａｒｅｄ）、これらの免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ
）が、記述されているように（Ｔａｎ等，１９９６）、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ Ｐｌ
ａｃｉｄ，ＵＳＡ）から購入されたＳｅｒ １３３上のリン酸化されたＣＲＥＢ
およびＳｅｒ ６３上のリン酸化されたＡＴＦ１を認識するホスホスペシフィッ
ク（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いてなされた。リン酸化ＣＲＥ
ＢとＡＴＦ１のタンパク質の検出は増強化学発光試薬（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用
いてなされた。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２７】 ＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂとによるＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７のリ
ン酸化（図８参照）。ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ）として発現されたＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａがＴＰＡ刺激２９
３細胞（ＴＰＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ２９３ ｃｅｌｌｓ）から精製され（
図３）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂがラビット骨格筋（ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔ
ａｌ ｍｕｓｃｌｅ）から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等、１９９３）。
ＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７とともに図８に示されているペプチドが、１０ｍＭの
Ｍｇ（Ａｃ）２、１００（Ｍ［３２Ｐ］ＡＴＰ（１ｘ１０６ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ
）、１０μＭ ＰＫＩと１μＭ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲを含む緩衝液Ｂ
中の２Ｕ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１，ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまたはＧＳ
Ｔ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂとともに３０℃でインキュベートされた。１０分間の
インキュベーションの後，ペプチド内へのリン酸の組み込みがＰ８１ホスホセル
ロース紙（ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐａｐｅｒ）を用いて検定され
（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＣＲＥＢとＨＳＰ２７内へのリン酸の組み込み
がトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｔｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、０．２／
１００ｖｏｌ．％（０．２ｖｏｌ ｏｆ １００％）を添加することによって測
定され、その後，その試料が氷上に１時間インキュベートされた。この懸濁液は
１３０００ｘｇで１０分間遠心分離され（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ）、その上澄
みは捨てられ、ペレットは０．２ｍｌの氷の冷水で５回洗浄された。３２Ｐ標識
されたもの（３２Ｐ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
）がその後セレンコフ・カウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ
）によって検定された。ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＲＫＫＡＰ−Ｋ１ｂにより
リン酸化されたＣＲＥＢにおける部位をマッピングするために，このペレットは
０．３ｍｌの５０ｍＭ，ｐＨ８．０のＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２μｇのアルキル化さ
れたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ）を含む０．１ｖｏｌ．
％の還元されたＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００中で再懸濁され、３０℃で１６時間の
インキュベーションの後，その消化物（ｄｉｇｅｓｔ）が１３０００ｘｇで５分
間遠心分離された。９５％の３２Ｐ−標識（３２Ｐ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔ
ｙ）を含む上澄みは、図８についての凡例に記載されているように，Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（ｃｏｌｕｍｎ）を用いてクロマトグラフィーにかけられた。ミ
カエリス定数（Ｋｍ）とＶｍａｘ値は、１／Ｓに対する１／Ｖの二重逆数プロッ
ト（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｐｌｏｔｓ）から検定された。ここ
で、Ｖはリン酸化の初速度であり、Ｓは基質濃度である。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２８】 ＭＳＫ１の２９３細胞へのトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
）。２９３細胞が直径１０ｃｍの皿に培養され、リン酸カルシウム変法（ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓ
ｓｉ等、１９９６ｂ）を用いてフラグ・エピトープがタグされたＭＳＫ１構築物
（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｅｄ ＭＳＫ１ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ
）をコード化するｐＣＭＶ５ベクターでトランスフェクションされた（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションの２４時間後（２４ｈ ｐｏｓｔ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、この細胞から１６時間の間に血清が奪われ、ＴＰＡ
により刺激され、あるいはＵＶ放射に曝された。その後，細胞は１ｍｌの氷の冷
たい緩衝液Ａに溶解され（ｌｙｓｅｄ），１３，０００ｘｇで５分間遠心分離さ
れた後，フラグ・タグされたＭＳＫ１プロテイン（Ｆｌａｇ ｔａｇｇｅｄ Ｍ
ＳＫ１ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、５μｌのプロテインＧ−セファロースに結合した
２μｇのＦＬＡＧ抗体を用いて、２５μｇプロテインを含むライゼート（ｌｙｓ
ａｔｅ）のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）から免疫沈降が行われた。 免疫沈降物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）はインキュベーションさ
れ洗浄され，上記のようにＭＳＫ１活性について測定された（ａｓｓａｙｅｄ）
。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２９】 免疫電子顕微鏡法（Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
。細胞は、０．２Ｍのピペス（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ７．２において８％のパラホル
ムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）内に少なくとも１日固定さ
れ，ラバー・ポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）を用いてこすら
れ，１０％のブタの皮膚ゼラチンにペレットとして埋め込まれた。ブロックは、
鉄のスタブ（ｓｔｕｂｓ）上に固定され液体窒素で凍らせる前に、２．１Ｍのス
クロース／ＰＢＳ（ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳ）に少なくとも１５分間浸された。
その後，低温超薄片（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）がライ
ヒエット・ウルトラカット・Ｅ・低温ミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔ
ｒａｃｕｔ Ｅ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて−１００℃で調整され
、カーボン／ホルムバール（ｃａｒｂｏｎ／ｆｏｒｍｖａｒ）被覆グリッドに固
定された。グリッドは、まず０．５％のフィッシュ・スキンのゼラチン／ＰＢＳ
を用いてインキュベーションされ（５分）、その後、アンチＦＬＡＧマウス・モ
ノクロール抗体（ａｎｔｉ ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（１５ｇ／ｍｌ）が続いた。その後，２ｇ／ｍｌのラビッ
ト・アンチマウス抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ，ＵＳＡ）が続き、最後に、タンパク
質にＡ−８ｎｍの金複合体（ｇｏｌｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）が前に開示されたよう
に（Ｌｕｃｏｃｑ １９９３）調整された。ＰＢＳ洗浄が、０．５％のフィッシ
ュ・スキンのゼラチン／ＰＢＳで希釈された親和性試薬（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒ
ｅａｇｅｎｔｓ）の各々の後に続いた。最後に、蒸留水で洗浄した後、これらの
薄片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）はメチル・セルロース／ウラニル・アセテート（ｍｅ
ｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ／ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で対比された
。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３０】 ラベリング（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）は次のように定量化された。１５，０００
倍の倍率で細胞質と核（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）の両方
を持つ標識細胞（ｌａｂｅｌｌｅｄ ｃｅｌｌ）の顕微鏡写真（ｍｉｃｒｏｇｒ
ａｐｈ）が撮られた（これらの核で重くなった薄片によって、個々の細胞におけ
るコンパートメントからのデータを比較することが可能となった）。サイトプラ
ズムと核の面積は、１ｃｍの線間隔の正方形格子（ｓｑｕａｒｅ ｌａｔｔｉｃ
ｅ ｇｒｉｄ ｏｆ １ｃｍ ｌｉｎｅ ｓｐａｃｉｎｇ）を用いてカウントし
（ｐｏｉｎｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）、ゴールドラベリング（ｇｏｌｄ ｌａｂｅ
ｌｌｉｎｇ ｃｏｕｎｔｅｄ）をカウントすることによって見積もられた（Ｌｕ
ｃｏｃｑ，１９９４）。エラー係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｅｒｒ
ｏｒ）はＣｏｃｈｒａｎ １９５３によって計算された。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３１】 引用文献 Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ａ．，Ｃｏｗ
ｌｅｙ Ｓ．，Ｌｅｅｖｅｒｓ Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｃ．Ｊ．
（１９９４）「マイトジェン−活性プロテイン−キナーゼ，ＭＡＰキナーゼキナ
ーゼおよびＲＡＦの検定および発現」（Ａｓｓａｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ Ｍｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｋｉｎａｓ
ｅ，ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ，ａｎｄ ＲＡＦ）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２５５，２７９−２９０； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，Ｄｕｄｌｅ
ｙ Ｄ．Ｔ．ａｎｄ Ｓａｌｔｉｅｌ Ａ．Ｒ．（１９９５） 「ＰＤ−０９８０５９は、インビトロおよびインビボでマイトジェン−活性
プロテイン−キナーゼ キナーゼの活性の特異的阻害剤である。」（ＰＤ−０９
８０５９ｉｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ−ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ−ｖｉｖ
ｏ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２７４８９−２７４９４； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，Ｆ．Ｂ．，Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉ
ｃ，Ｍ．，Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９６ａ
）「プロテイン−キナーゼＢの基質特異性に関する分子の基礎、ＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−１との比較およびｐ７０ Ｓ６キナーゼ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａ
ｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ；ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡ
ＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ａｎｄ ｐ７０ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ）ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３９９，３３３−３３８； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ，
Ｆ．Ｂ．，Ｃｒｏｎ，Ｐ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃｏｈｅｎ Ｐ．ａｎｄ Ｈ
ｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．（１９９６ｂ）「インシュリンおよびＩＧＦ １によるプ
ロテイン−キナーゼＢの活性化のメカニズム」（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ ｂｙ ｉｎｓ
ｕｌｉｎ ａｎｄ ＩＧＦ １）ＥＭＢＯ Ｊ．１５．６５４１−６５５１； Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．（１９９７）「プロテインキナーゼＣの阻害剤であるＲ
ｏ ３１８２２０およびＧＦ １０９２０３Ｘは、等しく強力なＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−１（Ｒｓｋ−２）とのｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害剤である。」（Ｔｈ
ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｒｏ ３１８
２２０ ａｎｄ ＧＦ１０９２０３Ｘ ａｒｅ ｅｑｕａｌｌｙ ｐｏｔｅｎｔ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１（Ｒｓｋ−２
）ａｎｄ ｐ７０Ｓ６ Ｋｉｎａｓｅ．）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０２，１２１
−１２３； Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｄａｖｉｅ，Ｄ．Ｎ．，Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｈ．，Ｊ
ｏｒｎｖａｌｌ，Ｈ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（１９８９）「ミトコ
ンドリアシトクロム−（−４５０ステロール２６−ヒドロキシラーゼ、胆汁酸生
合成酵素のクローニング、構造および発現）」（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒ
ｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−（−４５０ ｓｔｅｒｏｌ ２６−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ，ａ ｂｉｌｅ−ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙ
ｍｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，８２２２−８２２９； Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ，Ｒ．，Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｄｏｚａ，Ｙ．Ｎ．，
Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｐ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ｊ．ａ
ｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，（１９９５）「ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２の活性化の
ために必要な新規なリン酸化部位の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｒｅｑｕｉｒ
ｅｄ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−２
）ＥＭＢＯ Ｊ．１４．５９２０−５９３０； Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）「タンパク質−色素結合の原理を用い
た、タンパク質のマイクログラム量の定量化のための迅速かつ感度の高い方法」
（Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉ
ｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，７２，２４８−２５４； Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ．，Ｚｈａｏ Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｅ．（１
９９５）「ｐ９０（ＲＳＫ）キナーゼドメインのための分岐機能的役割」（Ｄｉ
ｖｅｒｇｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｐ９０（ＲＳＫ
）ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１８８４
８−１８８５２； Ｃｈｅｎ Ｒ．Ｈ．，Ｓａｍｅｃｋｉ Ｃ．ａｎｄ Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ．（１９
９２）「ＥＲＫ−コード化され、ＲＳＫ−コード化されたプロテインキナーゼの
核局在化および調節」（Ｎｕｃｌｅａｒ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ−ｅｎｃｏｄｅｄ ａｎｄ ＲＳＫ−ｅｎ
ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅｓ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１２，９１５−９２７； Ｃｌｉｆｏｎ Ａ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｇ Ｐ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１
９９６）「ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２とＭＡＰＫＡＰキナーゼ−３の基質特異性
の比較およびサイトカインと細胞ストレスによるこれらの活性化」（Ａ ｃｏｍ
ｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−２ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓ
ｅ−３ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９２，
２０９−２１４； Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｗ．Ｃ．（１９５３）「サンプリング技術」（Ｓａｍｐｌｉｎ
ｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
； Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「哺乳動物細胞におけるＭＡＰおよびＳＡＰキナ
ーゼの生理的基質のための調査」（Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ＭＡＰ ａｎｄ ＳＡＰ ｋ
ｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．７，３５３−３６１； Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ，Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ，Ｃｏｈｅｎ Ｐ，Ａｎｄｊｅ
ｌｋｏｖｉｃ Ｍ ａｎｄ Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ（１９９５）「インスリ
ンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害はプロテイン−キナーゼ
−Ｂによって仲介される。」（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ
−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｓ ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ−Ｂ．）Ｎａｔｕｒｅ ３７
８，７８５−７８９； Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ．，Ａｌｅｓｓｉ Ｄ．Ｒ．，Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅ
，Ｊ．Ｒ．，ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｕｎｄａｌ，Ｈ．Ｓ．，Ｃｏｈｅ
ｎ Ｐ．「インスリンまたはラット骨格筋細胞系１６における成長因子１様イン
スリンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害は、ワートマニンに
よって遮断されるが、ラパミシンによっては遮断されない。」（Ｔｈｅ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−
３ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｒ ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ １６ ｉｓ ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ｗｏｒｔｍａｎｎｉ
ｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｒａｐａｍｙｃｉｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｊ ３０３，２１−２６； Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｄｏｚａ，Ｙ．Ｎ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｒ
．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐａｎｄ Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．（１９９
５）「ＳＢ ２０３５８０は、細胞ストレスとインターロイキン−１によって刺
激されるＭＡＰキナーゼ同族体の特異的阻害剤である。」（ＳＢ ２０３５８０
ｉｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａ ＭＡＰ ｋｉ
ｎａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂ
ｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
１．）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６４，２２９−２３３； Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．，ＢｕｅｅＳｃｈｅｒｒｅｒ Ｖ．ａｎ
ｄ Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞ストレスによ
るストレス活性プロテインキナーゼ−３（ＳＡＰＫ３）の活性化はＳＡＰＫＫ３
（ＭＫＫ６）を介して仲介される。ＳＡＰＫ３とＳＡＰＫ２（ＲＫ／ｐ３８）の
特異性の比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−３（ＳＡＰＫ３）ｂｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖ
ｉａ ＳＡＰＫＫ３（ＭＫＫ６）； Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＳＡＰＫ３ ａｎｄ ＳＡＰＫ２（ＲＫ／ｐ
３８））ＥＭＢＯ Ｊ．１６，２９５−３０５； Ｄａｌｂｙ Ｋ．Ｎ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ Ｆ．Ｂ．，
Ａｖｒｕｃｈ Ｊ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９８） 「窒素−活性プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）によって誘導し得るＭＡＰＫ
−活性プロテインキナーゼ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）における調節リン酸化部位
の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒｎｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）ｔｈａｔ ａｒｅ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｙ ＭＡＰＫ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１
４９６−１５０５； Ｄａｖｉｓ Ｐ．Ｄ．，Ｈｉｌｌ Ｃ．Ｈ．，Ｋｅｅｃｈ Ｅ．，Ｌａｗｔｏｎ
Ｇ．，Ｎｉｘｏｎ Ｊ．Ｓ．，Ｓｅｄｇｗｉｃｋ Ａ．Ｄ．，Ｗａｄｓｗｏｒ
ｔｈ Ｊ．，Ｗｅｓｔｍａｃｏｔｔ Ｄ．ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｓ．Ｅ
．（１９８９）「プロテインキナーゼ−Ｃの強力な選択的阻害剤」（Ｐｏｔｅｎ
ｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ
ｎａｓｅ−Ｃ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５９，６１−６３； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｎ．Ｗ．，Ｒａｗｌｉｎｓｏｎ Ｌ．，Ｇｕｅｓｄｏｎ Ｆ
．，Ｊｏｎｅｓ Ｅ．，Ｃｏｗｌｅｙ Ｓ．，Ｈｓｕａｎ Ｊ．ａｎｄ Ｓａｋ
ｕｌａｔｖａｌａ Ｊ．（１９９４）「インターロイキン−１は、ＨＳＰ２７を
リン酸化する新規なプロテイン−キナーゼカスケードを活性化する。」（Ｉｎｔ
ｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
−ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｔｈａｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＰ２７．）Ｃｅｌｌ ７８，１０
３９−１０４９； Ｆｕｋｕｎａｇａ Ｒ．ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ．（１９９７）「プロテイン
キナーゼ基質を同定するための新規な発現スクリーニング方法によって分離され
た、ＭＮＫ１、新しいＭＡＰキナーゼ−活性プロテインキナーゼ」（ＭＮＫ１，
ａ ｎｅｗ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１９
２１−１９３３； Ｇｉｎｔｙ Ｄ．Ｄ．，Ｂｏｎｎｉ Ａ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．
Ｅ．（１９９４）「神経成長因子は、ＣＲＥＢのリン酸化を通してｃ−Ｆｏｓ転
写を刺激するラス−依存プロテインキナーゼを活性化する。」（Ｎｅｒｖｅ ｇ
ｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ Ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃ−
Ｆｏｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＥＢ．）Ｃｅｌｌ ７７，７１３−７２５； Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｃｒａｘｔｏｎ Ｍ．，Ｊａｋｅ
ｓ Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞スト
レスによる新規なストレス活性プロテインキナーゼＳＡＰＫ４の活性化はＳＫＫ
３（ＭＫＫ６）を介して仲介される。その基質特異性と他のＳＡＰキナーゼのそ
れとの比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｅｓ
ｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＳＡＰＫ４ ｂｙ
ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｓ ｍ
ｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＳＫＫ３（ＭＫＫ６）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ
ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ
ｏｆ ｏｔｈｅｒ ＳＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，３５６３−
３５７１； Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｇ．Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｋ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｗ．Ｈ．，Ｋａｒｒ Ｄ．，Ｍｅｎｚｅｌ Ｐ．，Ｂｉｇｇｓ Ｗ．，Ｖａｌｅ
Ｗ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ Ｍ．Ｒ．（１９８９）「その配列によっ
て予測される環状ＡＭＰ−調節核因子ＣＲＥＢ上のリン酸化部位のクラスター」
（Ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ
ｆａｃｔｏｒ ＣＲＥＢ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）Ｎａｔｕｒｅ ３３７，７４９−７５２； Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｇ．Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ Ｍ．Ｒ．（１９８９
）「環状ＡＭＰは、Ｓｅｒ １３３でＣＲＥＢのリン酸化によるソマトスタチン
遺伝子転写」を刺激する。（Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｓ
ｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＥＢ ａｔＳｅｒ １３３．）Ｃｅｌ
ｌ，５９，６７５−６８０； Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１
９８８）「プロテインキナーゼファミリーの保存の特徴および触媒ドメインの推
論される系統発生」（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ｐｈｙｌｏ
ｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１，４２−５２； Ｌａｗｌｅｒ Ｓ．，Ｃｕｅｎｄａ Ａ．，Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ．ａｎｄ Ｃｏ
ｈｅｎ Ｐ．（１９９７）「ストレス活性プロテインキナーゼ−１（ＳＡＰＫ１
／ＪＮＫ）の新規な活性化因子であるＳＫＫ４」（ＳＫＫ４，ａ ｎｏｖｅｌ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｋｉｎａｓｅ−１（ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ）） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４
，１５３−１５８； Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ａｕｆｆｒａｙ，Ｃ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏ
ｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｂ．（１９９６）「Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．
協会； ゲノムの組み込み分子分析」とそれらの発現（Ｔｈｅ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ
．Ｅ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｙｓ
ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３，１５１−１５２； Ｌｅｉｇｈｔｏｎ Ｉ．Ａ．，Ｄａｌｂｙ Ｋ．Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ Ｆ．
Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｐ．（１９９６）「ｐ７
０ Ｓ６キナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の特異性の比較がｐ７０ Ｓ６キ
ナーゼのための相対比基質を同定する。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１のＮ末端キナ
ーゼドメインはタンパク質のリン酸化にとって不可欠である。」（Ｃｏｍｐａｒ
ｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐ７０ Ｓ６
ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅ
ｓ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏ
ｒ ｐ７０ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ． Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａ
ｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＭＡＰＫＡＰ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｓ ｅｓｓｅ
ｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７５，２８９−２９３； Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）「免疫電子顕微鏡法のための顆粒の遺伝標
識；「微細構造免疫細胞化学」の第８章」（“Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｒ
ｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，
Ｃｈａｐｔｅｒ ８ ｉｎ“Ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｃｙ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”）； Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）「金のラベリングと免疫ラベルされた超薄
片における抗原の定量」（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ ｌａｂ
ｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｅｄ
ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏ
ｍｙ １８４，１−１３； Ｉｏｒｄａｎｏｖ Ｍ．，Ｂｅｎｄｅｒ Ｋ．，Ａｄｅ Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄ
Ｗ．，Ｓａｃｈｓｅｎｍａｉｅｒ Ｃ．，Ｅｎｇｅｌ Ｋ．，Ｇａｅｓｔｅｌ
Ｍ．，Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｈｅｒｒｌｉｃｈ Ｐ．（１９９
７）「ＣＲＥＢはｐ３８／ＨＯＧ−１依存プロテインキナーゼを介してＵＶＣに
より活性化される。」（ＣＲＥＢ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＵＶＣ
ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐ３８／ＨＯＧ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｋｉｎａｓｅ．）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１００９−１０２２； Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎ Ｍ．Ｍ．，Ｋｕｍａｒ Ｓ．，Ｍｃｄｏｎｎｅｌｌ Ｐ
．Ｃ．，Ｖａｎｈｏｒｎ Ｓ．，Ｌｅｅ Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｖｉ Ｇ．Ｐ．ａｎｄ
Ｙｏｕｎｇ Ｐ．Ｒ．（１９９６）「マイトジェン活性プロテイン（ＭＡＰ）
キナーゼ−活性プロテインキナーゼ−３、ＣＳＢＰ ｐ３８ＭＡＰキナーゼの新
規な基質の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｇｅｎ−
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）Ｋｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ−３，ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｏｆ ＣＳＢＰ ｐ３８ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１，８４８８−８４９２； Ｐｅｎｄｅ Ｍ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｔ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｐ．Ｂ．，Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ Ｊ．Ｔ．，Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ．ａｎｄ Ｇａｌｌｏ Ｖ（１９９７）
「祖先膠細胞における神経伝達物質−，成長因子−誘導ｃＡＭＰ応答因子結合タ
ンパク質のリン酸化；カルシウムイオン、プロテインキナーゼＣおよびマイトジ
ェン活性プロテインキナーゼ／リボソームＳ６キナーゼ経路の役割」（Ｎｅｕｒ
ｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ−ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃ
ｅｄ ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐ
ｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ； Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ，ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ，ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ ｐ
ａｔｈｗａｙ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１２９１−１３０１； Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｊ．，Ｄｉｌｗｏｒｔｈ Ｓ．Ｍ．，Ｌａｓｋｅｙ Ｒ．Ａ．
，ａｎｄ ｄｉｎｇｗａｌｌ Ｃ．（１９９１）「ヌクレオプラスミン核標的配
列における２つの相互依存塩基性ドメイン；２つに分かれた核標的配列のクラス
の同定」（Ｔｗｏ ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ
ｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ； Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ
ｏｆ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）Ｃｅｌｌ，６４，６１５−６２３； Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｉｇｏｎ，Ｓ．，Ｍｏｒａｎｇｅ，
Ｍ．，Ａｌｏｎｓｏ−Ｌｌａｍａｚａｒｅｓ Ａ．，Ｚａｍａｎｉｌｏ，Ｄ．，
Ｈｕｎｔ，Ｔ．ａｎｄ Ｎｅｂｒｅｄａ，Ａ．（１９９４）「ストレスおよびＭ
ＡＰＫＡＰキナーゼ−２と小さな熱ショックタンパクのリン酸化を刺激する熱シ
ョックによってトリガーされる新規なキナーゼカスケード」（Ａ ｎｏｖｅｌ
ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｓｔｒｅｓｓ ａ
ｎｄ ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＭＡＰＫＡＰ
ｋｉｎａｓｅ−２ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｍａｌｌ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｃｅｌｌ ７８，１０
２７−１０３７； Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｉ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．ｔ．，Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｙｅ
ｅ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ａｖｒｕｃｈ，Ｊ．，Ｋｙｒｉａｋｉ
ｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．（１９９４）「転写因子を調節するスト
レス−活性経路におけるＳＡＰＫ／ＥＲＫの役割」（Ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＡＰＫ
／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ−１ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆ
ａｃｔｏｒ ｃ−Ｊｕｎ）Ｎａｔｕｒｅ，３７２，７９４−７９８； Ｓｔｕｒｇｉｌｌ Ｔ．Ｗ．，Ｒａｙ Ｌ．Ｂ．，Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｅ．ａｎｄ
Ｍａｌｌｅｒ Ｊ．Ｌ．（１９８８）「インスリン−刺激性ＭＡＰ−２キナー
ゼはリボソーム−プロテインＳ６キナーゼ−ＩＩをリン酸化し活性化する。」（
Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＭＡＰ−２ Ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ Ｋｉｎａｓｅ−ＩＩ．）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，７１５−
７１８； Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｄ．Ｇ．，Ｃｏｈｅｎ Ｐ．
（１９９３）「ＲＳＫ２のウサギ当量としてのインスリン−刺激性プロテインキ
ナーゼ−１の同定。マイトジェン活性プロテインキナーゼによる活性化の間にリ
ン酸化される２トレオニンの同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉ
ｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−１ ａ
ｓ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ ＲＳＫ２； Ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｙｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｉｔｏｇｅｎ−
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２１２，５８１−５８８； Ｔａｎ Ｙ．，Ｒｏｕｓｅ Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ａ．Ｈ．，Ｃａｔｉａｔｉ Ｓ
．，ｃｏｈｅｎ Ｐ．ａｎｄ ｃｏｍｂ Ｍ．Ｊ．（１９９６）「ＦＧＦとスト
レスはｐ３８ＭａｐキナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２を含む経路を介してＣ
ＲＥＢおよびＡＴＦ−１を調節する。」（ＦＧＦ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅ
ｇｕｌａｔｅ ＣＲＥＢ ａｎｄ ＡＴＦ−１ ｖｉａ ａ ｐａｔｈｗａｙ
ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｐ３８ Ｍａｐ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＭＡＰＫＡＰ
ｋｉｎａｓｅ−２．） ＥＭＢＯ Ｊ．１５，４６２９−４６４２； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ
，Ｔ．Ｊ．（１９９４）「配列の重量、位置比ギャップペナルティおよび最大重
量の選択により進行性の複数の配列の感受性を改良するクラスタル−Ｗ」（Ｃｌ
ｕｓｔａｌ−Ｗ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎ
ｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇ
ｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２，４６７
３−４６８０； Ｔｒｉｖｅｒ Ｅ．，Ｄｅｃｅｓａｒｅ Ｄ．，Ｊａｑｕｏｔ Ｓ．，Ｐａｎｎ
ｅｔｉｅｒ Ｓ．，Ｚａｃｋａｉ Ｅ．，Ｙｏｕｎｇ Ｉ．，Ｍａｎｄｅｌ Ｊ
．Ｌ．，Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ Ｐ．ａｎｄ Ｈａｎａｕｅｒ Ａ．（１
９９６）「コフィンローリー症候群に関連するキナーゼＲＳＫ−２における変異
」（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＲＳＫ−２ ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３８４，５６７−５７０； Ｖｉｋ Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｒｙｄｅｒ Ｊ．Ｗ．（１９９７）「ゼノプスｐｐ９
０ｒｓｋの自律リン酸化の主要部位としてのセリン３８０の同定」（Ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ３８０ ａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ
ｓｉｔｅ ｏｆ ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ ｐｐ９０ｒｓｋ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ
．２３５，３９４−４０２； Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｆｌｙｎｎ，Ａ．，Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｊ．，Ｗｅｂ
ｂ，Ｂ．Ｌ．Ｊ．，Ｖｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｂａｉｎｅｓ，Ｉ．Ａ．，Ｃｏｏｐ
ｅｒ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｐｒｏｕｄ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）「ホルボールエステ
ル、細胞ストレスおよびサイトカインに応答して、真核開始因子ｅＩＦ４Ｅは、
はっきり識別できるＭＡＰキナーゼ経路によって仲介される。」（Ｔｈｅ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉ
ｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅＩＦ４Ｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｈｏｒｂ
ｏｌ ｅｓｔｅｒｓ，ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７１，９３７３−９３７７； Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ Ａ．Ｊ．，Ｆｌｙｎｎ Ａ．，Ｐｒｏｕｄ Ｃ．Ｇ．ａ
ｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ Ｊ．Ａ．（１９９７）「マイトジェン活性プロテインキナ
ーゼはセリン／トレオニンキナーゼＭＮＫ１およびＭＮＫ２を活性化する。」（
Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅｓ ａｃ
ｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ
ＭＮＫ１ ａｎｄ ＭＮＫ２．）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，１９０９１９２０； Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｉｎｔｙ Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ
．（１９９６）「Ｒｓｋ２による遺伝子活性化に対するラス−ＭＡＰＫ経路の連
結、成長因子調節ＣＲＥＢキナーゼ」（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７３，９５９−９６３； Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｋｏｒｎｈａｕｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｘｉａ，Ｚ，Ｔｈｉｅｌｅ
，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒ，Ｍ．Ｅ．（１９９８）「神経成長因子は
細胞外シグナル−調節キナーゼおよびｐ３８マイトジェン活性プロテインキナー
ゼ経路を活性化し、ＣＲＥＢセリン１３３リン酸化を刺激する。」（Ｎｅｒｖｅ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐ３８ Ｍ
ｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈ
ｗａｙｓ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＣＲＥＢ ｓｅｒｉｎｅ １３３ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８８，１９
４６−１９５５； Ｚｈａｏ Ｙ．，Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ．，Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚ Ｓ．，Ｍｏ
ｒｔｏｎ Ｃ．Ｃ．ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｅ．（１９９５）「ＲＳＫ３は
、新規なＰＰ９０（ＲＳＫ）アイソフォームをユニークＮ末端配列−成長因子刺
激キナーゼ機能および核転移とともにコード化する。」（ＲＳＫ３ ｅｎｃｏｄ
ｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＰＰ９０（ＲＳＫ）ｉｓｏｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ａ ｕ
ｎｉｑｕｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎ
ｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
５，４３５３−４３６３ １．
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３２】 実施例２：代替アッセイ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｓｓａｙｓ）
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３３】 閃光近接分析（Ａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓ
ｓａｙ）（ＳＰＡ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
）が、３２Ｐ放射性物質のＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅへの組込みを定量
するのに使用される。このシステムでは、サンプルは、シンチラント（ｓｃｉｎ
ｔｉｌｌａｎｔ）とＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅに結合する抗体とを含む
ビード（ｂｅａｄｓ）と混合される。これは９６−ウエルフォーマット（９６−
ｗｅｌｌ ｆｏｒｍａｔ）において行われると便利である。それからプレート（
ｐｌａｔｅ）は、適切なシンチレーションカウンター（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉ
ｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ）で、３２Ｐ ＳＰＡアッセイの既知のパラメーターを用
いて、測定される。シンチラント（ｔｈｅ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）に近接し
た３２Ｐのみ、つまり後に抗体に結合されるＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅ
に結合している３２Ｐのみが測定される。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】 ヒトＭＳＫ１のヌクレオチドと推論されたアミノ酸配列である。下線が引かれ
た残基はキナーゼドメインに対応する。太字で示された残基（Ｓｅｒ２１２、Ｓ
ｅｒ３６０、Ｓｅｒ３７７、Ｔｈｒ５８１）は、リン酸化部位を活性化すると推
定される。残基７２６から７４５間（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂには存在しない
）の推定上の二者間の（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル（Ｒｏｂｉｎｓ
等、１９９１）は、アスタリスクで示される。終止コドンは黒三角で示される。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】 密接に関連したキナーゼと共にＭＳＫ１のアミノ酸配列を配列したものである
。この配列は、クラスタルＷプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ
）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９４）を用いて行った。同一の残基には、黒い影
を付けている。（Ａ）ＭＳＫ１をヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（ｉｓ
ｏｆｏｒｍｓ）とともに配列したもの。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ上の活性化する重
要なリン酸化部位に対応する残基（Ｓｅｒ２２２、Ｓｅｒ３６４、Ｓｅｒ３８１
、Ｔｈｒ５７４）は、アスタリスクでしるしを付してある。（Ｂ）ＭＳＫ１のＮ
末端（ＭＳＫ１−Ｎ）とＣ末端（ＭＳＫ１−Ｃ）キナーゼドメインを、ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ２／３及びＭＮＫ１のキナーゼ領域と共に並べたものである。これらの
キナーゼの非触媒領域では重要な相同性はない。（Ｃ）ヒトＭＳＫ１を、部分的
なマウス（ｍＭＳＫ２）及びヒトＭＳＫ２配列と共に並べたものである。推定上
の活性化するリン酸化部位をアスタリスクで示している。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】 ＧＳＴ−ＭＳＫ１の発現と精製及び、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とＳＡＰＫ２とに
よるその活性化。（Ａ）非刺激（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）細胞及びＴＰＡ刺
激細胞から精製されたＧＳＴ−ＭＳＫ１（２μｇタンパク質）とＧＳＴ−ＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１ａ（２μｇタンパク質）とを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動し、クーマ
シーブルーで染色した。分子量マーカーであるβ−ガラクトシダーゼ（（−ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）（１１６ｋＤａ）とグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇ
ｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（９７ｋＤａ）の位置が示され
ている。各タンパク質の活性はペプチド基質（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）を用いて定量した（ａｓ
ｓａｙｅｄ）。非刺激細胞由来（Ｂ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１又は（Ｃ）ＧＳＴ−ＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ１ａを、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（８Ｕ／ｍｌ、白丸）、ＳＡＰＫ２
ｂ／ｐ３８β（１Ｕ／ｍｌ、黒四角）、ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（１Ｕ／ｍｌ、白
三角）、又はＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（１Ｕ／ｍｌ、黒三角）のいづれかと共に、
１０ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２と１００μＭ非ラベル化ＡＴＰとバッファーＢ内で培
養した。示されている時間において、アリコートが回収され、１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡを含むバッファーＢで１０倍に希釈され、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対しての活
性を定量された。平行する実験で、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、及びＳＡＰＫ１／Ｊ
ＮＫ１γ以外の全てのＳＡＰＫ酵素の活性を、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙ
ｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）
。ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１γはＡＴＦ２を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）（デ
ータは示していない）。この結果を、６つの測定（ｄｅｔｅｒ ｍｉｎａｔｉｏ
ｎｓ）の±ＳＥＭとして表している（２つの独立した実験）。各点の誤差は、＜
１５％である。（Ｄ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１を、（［３２Ｐ］ＡＴＰを使用したこと
以外は、上記のＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２及びＳＡＰＫ酵素と一緒にインキュベート
した。２０分後、ＳＤＳを加えることにより反応は終了し、試料を７．５％ポリ
アクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動し、
ＧＳＴ−ＭＳＫ１に対応するクーマシーブルー染色バンドをオートラジオグラフ
ィーにかけた。２つの別個の実験で同じような結果が得られた。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】 特にＭＳＫ１を免疫沈降する抗体の発生。（Ａ）ＴＰＡ刺激２９３細胞（１．
０Ｕ／ｍｌで５０μｌ）から精製された活性ＧＳＴ−ＭＳＫ１を４℃で３０分間
、示されたペプチド免疫原（１ｍＭ）の存在下又は非存在下で、示された抗体（
５μｇ）に結合されたタンパク質Ｇ−セファロース（Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
ビーズ（５μ１）と共に振とう台で培養し、その後１３，０００ｘｇで１分間遠
心分離にかけた。ビード（ｂｅａｄｓ）は材料及び方法で記載したように洗浄し
、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。（Ｂ）及び（Ｃ）ＴＰＡ刺激２
９３細胞由来の活性ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
１ｂ（Ｃ）を示されている抗体で免疫沈降した以外はＡと同様にし、洗浄した免
疫沈降物のＣｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】 ＴＰＡ、ＥＧＦ及び細胞ストレスによる内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）Ｍ
ＳＫ１の活性化。２９３細胞を１６時間血清飢餓とし、その後５０μＭ ＰＤ
９８０５９（白抜き棒）、１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（斑点棒）の存在下で
、又はいずれの化合物もない状態（黒棒）で、１時間培養した。細胞は非刺激（
対照）（ｃｏｎｔｒｏｌ）のまま放置するか、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ、１０
分）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１０分）、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．５ｍＭ、３０分）のいづれかで刺激するか、ＵＶ放
射（２００Ｊ／ｍ２、その後３７℃で３０分放置）又は、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ、３
０分）にさらすかのいづれかとし、阻害剤の存在下又は非存在下は連続的とした
。細胞を溶菌し、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｂ）又はＭＡＰ
ＫＡＰＫ２（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した。データは独立した実
験の３回実行した各測定を±ＳＥＭ平均値として表してある。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】 ２９３細胞内でのＴＰＡ及びＵＶによる活性化におけるＭＳＫ１の突然変異の
効果。２９３細胞を、フラッグ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識された野生型ＭＳＫ
１、Ｎ末端（ＮＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１及びＣ
末端（ＣＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１を発現するＤ
ＮＡ構築物に、瞬間的にトランスフェクトした（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。こ
の細胞を、５０μＭ ＰＤ ９８０５９、１０μＭ ＳＢ ２０３５８０と共に
、又は両化合物の非存在下で１時間培養した。それらをその後、１０分間ＴＰＡ
（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激するか、ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、その後３７℃
で３０分放置）暴露し、これらは阻害剤の連続存在下又は非存在下で行った。細
胞を溶菌し、ＭＳＫ１を溶菌液から免疫沈降し、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅで定量した
。データは、独立した３つの実験を各３回実行した測定を±ＳＥＭ平均値として
表してある。（Ｂ）各溶菌液からの２μｇのタンパク質を１０％ ＳＤＳ／ポリ
アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気
泳動し、モノクロナールフラグ抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｆｌａｇ−ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。免疫反応性ＭＳＫ１タンパク質は、非
トランスフェクト細胞中に観察されなかった（データは示していない）。フラッ
グ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識されたＭＳＫ１はグリコーゲンホスホリラーゼ（
ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（見かけ質量９７ｋＤａ）と
共泳動する。
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】 ＭＳＫ１は主に細胞の核に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａはサイトゾルに局在化する
。Ｎ末端にフラッグエピトープ標識された（Ｆｌａｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇ
ｇｅｄ）野生型ＭＳＫ１又はＮ末端にＨＡエピトープ標識されたＭＡＰＫＡＰ−
Ｋ１ａを発現する２９３細胞を、無血清培地で１６時間培養し、その後非刺激の
ままか、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定の前にＴＰＡ（１
００ｎｇ／ｍｌ、１０分）で刺激し、分画し、適当な標識（ＭＳＫ１（Ａ＋Ｂ）
にはフラグ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｃ）にはＨＡ、のため免疫ゴールド（ｉｍ
ｍｕｎｏｇｏｌｄ）標識化した。細胞の核（Ｎｕｃ）及び細胞質（Ｃｙｔ）にお
けるＭＳＫ１又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの濃度の定量は、物質及び方法で記載し
たように行った。その結果は、ＴＰＡ刺激はＭＳＫ１及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ
の局在化に検出可能な効果はないことを示している。データは３つの独立した実
験からのものである。ＭＳＫ１の対照としては、ｎ＝９、９、１４、ＴＰＡはｎ
＋１０、１１、１５である。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの対照として全部でｎ＝２２
、ＴＰＡは全部でｎ＝９である（細胞質中に免疫反応性物質の示量魂のある細胞
は除外している）。棒は、Ｃｏｃｈｒａｎ（１９５３）に従って計算した平均値
の標準誤差を表す。（Ｃ）ＭＳＫ１（Ｃ、非刺激、及びＤ、ＴＰＡ）及びＭＡＰ
ＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｅ、非刺激）の選択された試料を示し、構造及び、標識化分布
を図示している。棒は５００ｎｍである。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】 ＭＳＫ１はＣＲＥＢをＳｅｒ１３３でリン酸化する。（Ａ）表示されているペ
プチドとＣＲＥＢに対する、ＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ
−Ｋ１ｂの基質特異性の比較。リン酸化と分析は、材料及び方法で記載したよう
に行った。報告された全ての反応速度定数に対する標準誤差は、＜±２０％（Ｓ
ＥＭ）の範囲内であり、そのデータは２つの別個の実験の平均値として報告して
いる。Ｖｍａｘ値はＣｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１
）を基質として用いて得られた値の百分率として報告している。ＣＲＥＢの残基
１２６−１３６に対応するペプチドＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫは、ＣＲＥＢｔｉｄ
ｅと名づける。太字で表されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基は、ペプチドのリン
酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基に対応している。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに
対するＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂのＶｍａｘ値
はそれぞれ、２００Ｕ／ｍｇ、３５０Ｕ／ｍｇ、８００Ｕ／ｍｇである。（Ｂ）
ＧＳＴ−ＭＳＫ１（黒棒）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ−１ａ（白棒）、ＭＡＰＫ
ＡＰ−Ｋ−１ｂ（斑点棒）及びＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（斜線棒）は表示さ
れている基質で定量された。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を用いた条件では、Ｃ
ＲＥＢの３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ）の
Ｓｅｒ９８（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）は、Ｓｅｒ１３３に比べて１０倍
高いレベルにリン酸化された（データは示さず）。図示されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ
２によるＣＲＥＢのリン酸化は、訂正され、ＣＲＥＢへのリン酸基の全取込に対
するＳｅｒ１３３リン酸化の寄与のみを示している。データは、３つの独立した
実験の各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表されている。（Ｃ）ＭＳＫ１
でリン酸化されたＣＲＥＢを、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で消化し、水で０
．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ｔｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
）（ＴＦＡ）で平衡化したＶｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４ Ｃ１８カラム（Ｓｅｐ
ａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）によりクロマトグラ
フィーにかけた。カラムを、流速０．８ｍｌ／分、線形アセトニトリル（ａｃｅ
ｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）勾配（斜線）で展開し、０．４ｍｌのフラクションを回収
した。カラムに照射された放射能の７５％が、主要３２Ｐ含有ペプチドから１３
％アセトニトリルで（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）回収された（放射能の残りは
多数の小さなピークとして溶出された）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂでリン酸化され
たＣＲＥＢのペプチドマップは、ＭＳＫ１でリン酸化されたＣＲＥＢのものと同
一であった（データは示さず）。
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】 ＭＳＫ１の活性におけるＲｏ ３１８２２０の効果。（Ａ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１
（黒丸）、ＰＫＣアイソフォーム混合物（白丸）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
ｂ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（白三角）における、インビトロでのＲｏ ３１８２
２０の効果。結果は、阻害剤が取り除かれた対照インキュベーションと比較して
表し、各測定を３回行った２つの実験の平均値として示している。各点の誤差は
±１０％である。（Ｂ）２９３細胞を１時間、５μＭ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒ
ｏ）と共に又は阻害剤なしで（−）前処理し、その後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２
）にさらすかその処理をせず（−）、そしてその後さらに３０分、Ｒｏ ３１８
２２０の連続存在下で培養した。この細胞を溶菌し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫
沈降して定量した。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値
±ＳＥＭとして表す。（Ｃ）阻害剤での処理前に、２９３細胞を２時間、３２リ
ン酸塩（０．１ｍＣｉ／ｍｌ）で培養した以外は上記と同じである。細胞はその
後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２）にさらすか未処理のまま（−）とし、更に２０分
間阻害剤の連続存在下で培養した。細胞溶菌に続いて、ＨＳＰ２７を細胞抽出液
から免疫沈降し（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）、１５％ポリアクリルアミドゲル
（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で流し、オートラジオグラフィーを
行った。
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】 Ｒｏ ３１８２２０は、ＣＲＥＢのＥＧＦ及びＵＶ誘導リン酸化を抑制する。
２９３細胞を、５μＭ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）、１０μＭ ＳＢ ２０３
５８０（ＳＢ）、５０μＭ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）のそれぞれ存在下及び非
存在下で前処理し、その後、（ＡＮＤ）ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、３０分、そ
の後３７℃で３０分）、（Ｂ、Ｅ）ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１５分）、（Ｃ
）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２０μＭ、１５分）のいづれかにさらした。細胞を溶菌
し、タンパク質を１０％アクリルアミドゲル（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ
）で分離し、リン酸化特異抗体（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。このリン酸化特異抗体は、Ｓｅｒ１３３と
Ｓｅｒ６３でそれぞれリン酸化した時、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の両方を認識する
。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】 ＴＮＦによるＭＳＫ１の活性化。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、５０μＭ
ＰＤ ９８０５９（黒丸）、１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（白三角）、５０
μＭ ＰＤ ９８０５９＋１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（黒三角）、の存在下
、又は両化合物の非存在下（白丸）で、無血清培地で培養した。その後、細胞を
、表示した時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下において、ＴＮＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）により刺激し、溶菌して、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂ）
、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した
。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表
す。
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】 ＴＮＦ誘導ＣＲＥＢリン酸化におけるＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０
、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、無血清培地で
、表示されているように５０μＭ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ ＳＢ
２０３５８０（ＳＢ）及び５μＭ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は
非存在下で培養した。その後細胞を、図１１Ｃの説明文で述べたように、表示し
た時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下においてＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で
刺激し、溶菌して、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために試料を免疫ブロッ
トした。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。展開前の
ブロットの暴露時間（ｅｘｐ）を表示している。
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】 ＰＣ１２細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＮＧＦ誘導活性化におけるＰＤ ９
８０５９、ＳＢ ２０３５８０、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ＰＣ１２細胞を無
血清培地で２時間、５０μＭ ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）又は１０μＭ ＳＢ
２０３５８０（ＳＢ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細胞を１５分間
、ＮＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。
細胞溶菌後、アリコートをＣＲＥＢ（Ａ）のリン酸化に対して免疫ブロットした
か、溶菌液からの免疫沈降後、ＭＳＫ１（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）を
定量するのに用いた。
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１の亜ヒ酸塩（ａｒｓｅｎｉｔｅ
）及びＦＧＦ誘導活性化におけるＰＤ ９８０５９、ＳＢ ２０３５８０、Ｒｏ
３１８２２０の効果。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を１時間、無血清培地で、５０μＭ
ＰＤ ９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）、及び５
μＭ Ｒｏ ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細
胞を、１５分間、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．
５ｍＭ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、阻害剤の連続存在下又は非存在
下で刺激した。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡ
Ｐ−Ｋ１（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）のいづれかについてこれらを溶菌液
から免疫沈降した後定量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために
免疫ブロットした（Ｄ）。
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】 ＲＡＷマクロファージ内のＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＬＰＳ誘導活性化における
ＰＤ ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｒｏ ３１８２２０の効果。ＲＡＷ ２
６４マクロファージを、無血清培地で２時間培養し、その後、５０μＭ ＰＤ
９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ Ｒｏ
３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で１時間培養した。その後細胞を
ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激
した。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１
（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）についてこれらを溶菌液から免疫沈降した後
定量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化に対して免疫ブロットした（
Ｄ）。
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】 ヒトＭＳＫ２及びヒトＭＳＫ２のスプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉ
ａｎｔ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】 ＲＡＷ ２６４マクロファージ中のＬＰＳによるＭＳＫ１及びＭＳＫ２の活性
化。マクロファージを、表示した時間、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと共に（開符
号）、又は無しで（閉符号）刺激した。ＭＳＫ１活性（Ａ）又はＭＳＫ２活性（
Ｂ）を、溶菌液から免疫沈降後、測定した。結果を、２つの別個の皿の２つの測
定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に２つの実験から得られ
た。
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】 ＲＡＷ ２６４マクロファージ内のプロテインキナーゼのＬＰＳ誘導活性化に
おける阻害剤の効果。マクロファージを１時間、１０μＭ ＵＯ １２６（Ｕ）
及び／又は１０μＭ ＳＢ ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ Ｒｏ ３１８
２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後１時間、１００ｎｇ／ｍ
ｌ ＬＰＳと共に又はなしで、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。そ
の後、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＳＫ２（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）、及びＭＡ
ＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｄ）を、溶菌液から免疫沈降した後、定量した。結果を、２つ
の別個の皿の２つの測定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に
２つの実験から得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ 19/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/12 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 コーエン・フィリップ イギリス、ディーディー２ ５ディーキュ ー、ダンディー、インバーゴーリー バイ ダンディー、 インバーベイ ＩＩ (72)発明者 カイヴァーノ・マチルド イギリス、ディーディー１ ４エイチエ ヌ、ダンディー、メディカル サイエンシ ズ インスティテュート、 メディカル リサーチ カウンシル、 プロテイン フ ォスフォリレーション ユニット、デパー トメント オブ バイオケミストリー、 ユニバーシティー オブ ダンディー

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸配列 を有する本質的に純粋なポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生
    物又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体又はアミノ
    酸配列 又は 又は 又は を有する本質的に純粋なポリペプチド、又はそれらの変異体、フラグメント、融
    合体又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物。
  2. 【請求項２】 前記変異体のアミノ酸配列が上述されたアミノ酸配列と少なくとも６５％の相
    同性を有する請求項１に記載のポリペプチドの変異体。
  3. 【請求項３】 前記変異体のアミノ酸配列が上述されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の相
    同性を有する請求項２に記載のポリペプチドの変異体。
  4. 【請求項４】 前記変異体のアミノ酸配列が上述されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の相
    同性を有する請求項３に記載のポリペプチドの変異体。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一つに定義されたポリペプチドを発現するのに適する
    組換ポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか一つに記載のポリペプチドの融合体をコード化するポ
    リヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 哺乳類／真核細胞において、請求項１〜４のいずれか一つに記載のポリペプチ
    ドをコード化するポリヌクレオチドを有する複製に適するベクター。
  8. 【請求項８】 イントロンを含まない請求項５〜７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド
    又はベクター。
  9. 【請求項９】 請求項５〜８のいずれか一つに定義された組換ポリヌクレオチド又は複製可能
    なベクター（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒ）を有する宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 ポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は前
    記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体の作製方法であって、 前記ポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又
    は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体を発現する請求項９に定義さ
    れた宿主細胞の培養と、 前記ポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は
    前記変異体、又はフラグメント又は派生物の融合体の単離とを有する方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法により入手可能なポリペプチド、又はそれの変異体、
    フラグメント、派生物又は融合体、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物
    の融合体。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜４及び請求項１１のいずれか一つに定義されたポリペプチドに反応
    ずる抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生物
    に反応する抗体であって、 別の二つのキナーゼドメインを有するプロテインキナーゼとは本質的に（ｓｕ
    ｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）反応しない抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１に定義されたポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法で
    あって、 化合物と、前記ポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生
    物及び融合体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体との接触と
    、 前記化合物の不在下において、前記ポリペプチドの活性が前記プロテインキナ
    ーゼ、又はそれの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又はそれの変異体
    、フラグメント又は派生物の融合体の活性と比較して変化するかどうかの測定と
    を有する方法。
  15. 【請求項１５】 前記活性が減少する請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記活性が増加する請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ＣＲＥＢ（又は請求項１に定義されたポリペプチドの他の基質）に結合し、請
    求項１に定義されたポリペプチドによりその活性化を促進又は阻害する化合物を
    同定する方法であって、 化合物が、ＣＲＥＢ（又は請求項１に定義されたポリペプチドの他の基質）、
    又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント
    、変異体、派生物の融合体と、請求項１に定義されたポリペプチドとの相互作用
    を促進するか又は阻害するかの測定、又は、この化合物が、請求項１に定義され
    たポリペプチドにより、ＣＲＥＢ（又は請求項１に定義されたポリペプチドの他
    の基質）、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフ
    ラグメント、変異体又は派生物の適する融合体の活性化を本質的に遮断するかど
    うかの測定を有する方法。
  18. 【請求項１８】 ＭＡＰＫ２のような相互作用ポリペプチドにより請求項１に定義されたポリペ
    プチドの活性化を遮断する化合物を同定する方法であって、 化合物が、（ａ）本発明の第一の側面に定義されたポリペプチド、又はそれの
    適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント、変異体又
    は派生物の融合体と、（ｂ）ＭＡＰＫ２，ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２
    ｂ／ｐ３８β２のような相互作用ポリペプチド、又はそれの適する変異体、派生
    物、フラグメント又は融合体、又は変異体、派生物又はフラグメントの適する融
    合体との間の相互作用を促進するか又は崩壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）かの測定
    、又は、この化合物が、ＭＡＰＫ２，ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／
    ｐ３８β２のような相互作用ポリペプチド、又はそれの適する変異体、派生物、
    フラグメント又は融合体により、前記ポリペプチド、又はそれの適する変異体、
    フラグメント、派生物又は融合体、又は前記フラグメント、派生物又は融合体の
    融合体の活性化を本質的に遮断するかどうかの測定を有する方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１に定義されたポリペプチドの活性化のためのＭＡＰＫ２の用途。
  20. 【請求項２０】 請求項１に定義されたポリペプチドに相互作用するポリペプチドを同定する方
    法であって、 １）ａ）請求項１に定義されたポリペプチドと、ｂ）このような相互作用ポリ
    ペプチドを含有する可能性のある化合物との接触２）請求項１に定義されたポリ
    ペプチド及び相互作用ポリペプチドを含有する複合体の存在の検出３）どの相互
    作用ポリペプチドが請求項１に定義された前記ポリペプチドに結合するかの同定
    を有する方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０の方法により同定可能なポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に定義されたポリペプチドにより、請求項１に定義されたポリペプ
    チドの活性化を遮断する化合物を同定する方法であって、 化合物が、ａ）請求項１に定義されたポリペプチドと、ｂ）請求項２１に定義
    されたポリペプチド、又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合
    体、又は変異体、派生物又はフラグメントの適する融合体との相互作用を促進す
    るか又は崩壊するかの測定、又は、この化合物が、請求項２１に定義されたポリ
    ペプチド、又はこれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体により、
    請求項１に定義された前記ポリペプチドの活性化を本質的に遮断するかどうかの
    測定を有する方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１４〜１８、２０、２２のいずれか一つに記載の方法により同定可能な
    化合物であって、 Ｒｏ３１８２２０、ＰＤ９８０５９又はＳＡＰＫ／ｐ３８の既知のピリジニル
    イミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオ
    ロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イ
    ミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄ
    ｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で
    はない化合物。
  24. 【請求項２４】 医療用の請求項２３に記載の化合物。
  25. 【請求項２５】 炎症性疾患（ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の又は虚血
    性疾患（ａｎ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）の又はＣＯＸ２の活性の
    減少を必要とする患者の治療の方法であって、 ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０
    ３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロ
    キシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒ
    ｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−
    ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではなく、請求項１４〜１８、２０、２
    ２のいずれか一つに記載の方法により同定可能な有効量の化合物の患者への投与
    を有する方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドの活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節する、又は、前記ポリペ
    プチドの活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を調節する化合物のスクリーニングア
    ッセイにおいて請求項１に定義されたポリペプチドの用途。
  27. 【請求項２７】 請求項１に定義されたポリペプチドと、請求項１４〜１８、２０、２２のいず
    れか一つに定義された方法を実施するための手段とを有するパーツキット（Ａ
    ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）。
  28. 【請求項２８】 前記ポリペプチドの基質、例えばＣｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥ
    Ｇ），ＣＲＥＢｔｉｄｅ，ＣＲＥＢ，ＡＴＦ１、又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１融合
    タンパク質を有する請求項２７に記載のパーツキット。
  29. 【請求項２９】 前記ポリペプチド、例えばＭＡＰＫ２を活性化するのに有用なタンパク質を有
    する請求項２７又は請求項２８に記載のパーツキット。
  30. 【請求項３０】 本明細書に開示されたあらゆる新規な二つのキナーゼドメインを有するプロテ
    インキナーゼ。
  31. 【請求項３１】 癌患者を治療する方法であって、 ＰＤ９８０５９ではなく、請求項１４〜１８、２０、２２のいずれか一つの方
    法により同定可能な有効量の化合物をこの患者に投与することを有する方法。
  32. 【請求項３２】 癌を治療する薬剤の製造において、ＰＤ９８０５９ではなく、請求項１４〜１
    ８、２０、２２のいずれか一つの方法により同定可能な化合物の用途。
  33. 【請求項３３】 ＣＯＸ２又はＩＬ−１活性の調節を必要とする患者の治療の方法であって、 ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０
    ３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロ
    キシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒ
    ｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−
    ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではなく、請求項１４〜１８、２０、２
    ２のいずれか一つの方法により同定可能な有効量の化合物をこの患者に投与する
    ことを有する方法。
  34. 【請求項３４】 ＣＯＸ２又はＩＬ−１活性調節を必要とする患者を治療する薬剤の製造におい
    て、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２
    ０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒド
    ロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏ
    ｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４
    −ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではなく、請求項１４〜１８、２０、
    ２２のいずれか一つの方法により同定可能な化合物の用途。
  35. 【請求項３５】 ＣＯＸ２の活性調節を必要とする患者を治療する方法であって、 （１）ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの阻害剤、例えばＳＡＰＫ２／ｐ３８の既
    知のピリジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４
    −（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４
    −ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２
    −（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄ
    ａｚｏｌｅ）及び（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードの阻害剤、例えばＰＤ９８
    ０５９をこの患者に投与することを有する方法。
  36. 【請求項３６】 ＣＯＸ２の活性調節を必要とする患者を治療する薬剤の製造における、（１）
    ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの阻害剤、例えばＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピ
    リジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４
    −フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリ
    ジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４
    −ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｌｄｙｌ）ｉｍｌｄａｚｏ
    ｌｅ）及び（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードの阻害剤、例えばＰＤ９８０５９
    の用途。
  37. 【請求項３７】 ＣＯＸ２の活性調節を必要とする患者を治療する薬剤の製造におけるＳＡＰＫ
    ２／ｐ３８カスケードの阻害剤、例えばＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニル
    イミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオ
    ロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イ
    ミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄ
    ｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）の
    用途であって、 前記患者は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードの阻害剤、例えばＰＤ９８０５９を
    既に投与されているか今後投与される場合のＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの阻
    害剤の用途。
  38. 【請求項３８】 ＣＯＸ２の活性調節を必要とする患者を治療する薬剤の製造におけるＭＡＰＫ
    ／ＥＲＫカスケードの阻害剤、例えばＰＤ９８０５９の用途であって、 前記患者は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの阻害剤、例えばＳＡＰＫ２／ｐ
    ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨ
    ＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−
    ５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）
    −２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）
    ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を既に投与されているか今後投与される場合のＭＡＰＫ／
    ＥＲＫカスケードの阻害剤の用途。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1224321A2 (en) * 1999-10-13 2002-07-24 Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S (Lovens Kemiske Fabrik Produktionsaktieselskab) A method of screening for substances acting on msk1
SE9904289D0 (sv) * 1999-11-26 1999-11-26 Niklas Arnberg Method and camposition for the treatment of adenovairal ocular infections
EP1202065A1 (en) * 2000-10-25 2002-05-02 Aventis Pharma S.A. Net, a transcription factor of the TCF family, as regulator of angiogenic expression.
DK1408109T3 (da) 2001-07-16 2008-10-06 Fuyuki Ishikawa Hidtil ukendt fremgangsmåde til induktion af cellesenescens og fremgangsmåde til screening for et antiældningsmiddel
DE10220480C1 (de) * 2002-05-07 2003-09-11 Ulf R Rapp Verfahren zur Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential
US20080293716A1 (en) 2004-01-30 2008-11-27 Smithkline Beecham Corporation Chemical Compounds
CA2740970A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Oregon Health & Science University Naphthamides as anticancer agents

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5643758A (en) * 1987-03-10 1997-07-01 New England Biolabs, Inc. Production and purification of a protein fused to a binding protein
IL104369A0 (en) * 1992-01-13 1993-05-13 Smithkline Beecham Corp Novel compounds and compositions
WO1993019752A1 (en) 1992-04-07 1993-10-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibition of p70 s6 kinase
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
IL110296A (en) 1993-07-16 1999-12-31 Smithkline Beecham Corp Imidazole compounds process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6342510B1 (en) 1995-06-12 2002-01-29 G. D. Searle & Co. Treatment of inflammation and inflammation-related disorders with a combination of a cyclooxygenase-2 inhibitors and a leukotriene B4 receptor antagonist
CA2255579A1 (en) 1996-05-20 1997-11-27 Signal Pharmaceuticals, Inc. Mitogen-activated protein kinase p38-2 and methods of use therefor
GB9615498D0 (en) 1996-07-24 1996-09-04 Ciba Geigy Ag Kinase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6009032065, Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，５４（１），ｐ．８７−９６ *

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