JP2002515744A - マイトジェン活性化プロテインキナーゼｐ３８―２およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケードに関連した症状の処置のための組成物および方法が提供される。詳細には、ATF2のような基質のリン酸化および活性化を刺激する、マイトジェン活性化プロテインキナーゼp38-2、およびそのポリペプチド改変体が提供される。ポリペプチドは、例えば、p38-2キナーゼカスケードを介するシグナル伝達を阻害する抗体および他の因子を同定するために使用され得る。ポリペプチドおよび因子は、痛覚の減少におけるような種々の方法において使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 マイトジェン活性化プロテインキナーゼp38-2およびその使用方法 技術分野 本発明は、一般に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケードを研究 するため、そしてこのようなカスケードに関連する症状を処置するために有用な 組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ATF2のような基質のリン 酸化および活性化を刺激するブラジキニンによって活性化され得る、マイトジェ ン活性化プロテインキナーゼp38-2、およびその改変体に関する。本発明はまた 、p38-2キナーゼカスケードを介するシグナル伝達を阻害する抗体および他の因 子を同定するための、このようなポリペプチドの使用に関する。このような因子 は、例えば、痛覚を減少させるために使用され得る。発明の背景 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)は、種々の細胞外シグナルへの 応答において、転写因子、翻訳因子および他の標的分子を活性化する保存された シグナル伝達経路のメンバーである。MAPKは、マイトジェン活性化プロテインキ ナーゼキナーゼ(MAPKK)による配列Thr-X-Thrを有する二重リン酸化モチーフでの リン酸化によって活性化される。高等真核生物において、MAPKシグナル伝達の生 理学的役割は、増殖、ガン化、発達および分化のような細胞事象に関連している 。従って、これらの経路を介してシグナル伝達を調節する能力は、MAPKシグナル 伝達に関連するヒト疾患（例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、およびガン）の 処置および予防療法の開発を導き得る。 哺乳動物細胞において、３つの類似したMAPK経路が記載されている。最も良く 特徴づけられた経路は、細胞外シグナル調節性キナーゼ(ERK)の活性化を導く。c Jun N末端キナーゼ(JNK)の活性化を導くシグナル伝達経路およびp38 MAPKは、あ まりよく理解されていない（概説については、Davis，Trends Biochem．Sci．19 :470-473，1994;CanoおよびMahadevan，Trends Biochem．Sci．20:117-122，1 995を参照のこと）。これらのカスケードのメンバーの同定および特徴付けは、 関与するシグナル伝達経路を理解するために、そしてインビボでMAPKを活性化ま たは不活化するための方法を開発するために重要である。 インビトロでp38を活性化し得る３つのMAPKKが同定されている。MKK3は、p38 に特異的である（すなわち、JNKまたはERKを活性化しない）ようであり、一方、 MKK4はp38およびJNKの両方を活性化するようである(Derijardら、Science 267:6 82-685，1995を参照のこと)。第３のMAPKK、MEK6は、p38リン酸化の強くそして より特異的なインビボ刺激因子のようである(米国特許出願第号08/576,240を参 照のこと)。これらのタンパク質は、p38シグナル伝達経路に関連する症状を処置 するための治療方法において有用性を有するようである。しかし、このような治 療方法を正確に適応させるため、そして関与する経路の理解を得るために、この カスケードおよび関連するMAPキナーゼカスケードに関与する他のタンパク質を 同定および特徴付けることは利点がある。 従って、当該分野にはMAPキナーゼカスケードに関与するタンパク質の活性を 調節するため、そしてこのようなカスケードに関連する症状を処置するための、 改善された方法に関する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし 、そしてさらに他の関連する利点を提供する。発明の要旨 簡潔に述べると、本発明は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)p3 8-2、またはそれらの誘導体を使用する組成物および方法を提供する。１つの局 面において、本発明は、p38-2の基質を活性し得るポリペプチドを提供する。こ のポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはその誘導体を含み 得る。別のこのような局面において、ポリペプチドは、ブラジキニンによって選 択的に活性化される。 本発明はまた、ポリペプチドが構成的に不活化されないように25％より少ない アミノ酸残基が改変された、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチ ドを提供する。 関連する局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドをコードする単 離されたDNA分子、ならびにこの様なDNA分子を含む組換え発現ベクター、および このような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提 供する。 別の局面において、本発明は、p38-2の基質をリン酸化するための方法を提供 する。この方法は、上記のポリペプチドとp38-2の基質とを接触させ、それによ りp38-2の基質をリン酸化する工程を含む。 関連する局面において、患者においてp38-2の基質を活性化するための方法が 提供される。この方法は、上記のポリペプチドを薬学的に受容可能なキャリアと 組み合わせて患者に投与し、それによりp38-2の基質を活性化する工程を含む。 さらなる局面において、本発明は、p38-2カスケードを介するシグナル伝達を 調節する因子をスクリーニングする方法を提供する。１つの実施態様において、 この方法は：(a)候補因子と上記のポリペプチドとを接触させる工程、ここで接 触の工程は、候補因子とポリペプチドとを相互作用させるに十分な条件下および 時間の間、行われる；および(b)続いて、上記ポリペプチドのキナーゼ活性を調 節する候補因子の能力を測定する工程、を含む。 別の実施態様において、この方法は：(a)候補因子と、請求項１または４のい ずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを接触させる工程 、ここで接触の工程は、ポリペプチドの生成、およびポリペプチドと候補因子と の間で相互作用を可能にするに十分な条件下および時間で行われる；および(b) 続いて、p38-2活性を調節する候補因子の能力を測定する工程、を含む。 なお別の局面において、本発明は、上記のポリペプチドに結合する抗体を提供 する。 さらなる局面において、p38-2カスケードに関連する症状を処置するための方 法が提供される。この方法は、p38-2カスケードを介するシグナル伝達を調節す る因子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む。このような因子は、p38-2 キナーゼ活性を調節し得、そして／またはp38-2のリン酸化を調節し得る。１つ の実施態様において、このような方法は患者における痛覚を減少させ得る。 なおさらなる局面において、本発明は、サンプル中のマイトジェン活性化プロ テインキナーゼキナーゼ活性を検出するための方法およびキットを提供する。こ の方法は、上記のポリペプチドをリン酸化するサンプルの能力を評価し、それに よりサンプル中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ活性を検出す る工程を含む。キットは、適切な緩衝液と組み合わせたp38-2を含む。 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照 することにより明らかになる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、各々 が個別に援用されるのと同様にその全体にわたって援用される。図面の簡単な説明 図１は、標準的な１文字コードを用いて、p38-2の１次アミノ酸配列、および そのスプライシング誘導体を示す。 図2Aおよび2Bは、選択されたヒト組織におけるヒトp38-2(図2A)およびp38(図2 B)のmRNAの発現のノーザンブロット分析を示すオートラジオグラムである。RNA サイズマーカーの位置（単位kb）を左に示す。 図３は、SDS-PAGEによって決定した、インビトロ翻訳されたHA-タグ化p38-2の サイズを示すオートラジオグラムである。タンパク質サイズマーカーの位置（単 位kDa）を左に示す。 図４は、COS細胞をエピトープタグ化p38-2で一過的に感染させ（レーン１〜７ ）、UV（250nm、120J/m²；レーン２）、アニソマイシン（50ng/ml；レーン３） 、もしくはNaCl(200μM；レーン４）で45分間処理するか、または1000ngの空の 発現ベクターSrα3（レーン５）、構成的に活性な変異体MEK6(DD)の発現ベクタ ー（レーン６）、もしくはMAKP TAK1ΔN（レーン７）で同時トランスフェクトし た、COS細胞におけるp38-2キナーゼ活性の相対的なレベルを示す、オートラジオ グラムである。 図５は、ネイティブp38-2ポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を 示す。 図６は、NG108-15細胞においてポリクローナル抗体で検出された、p38およびB RKのレベルを示すイムノブロットである。内因性p38およびBRKタンパク質を、細 胞溶解物として同定されたレーンにおいて示す。左パネルにおいて、抗体を完全 長p38タンパク質に対して惹起し、そして組換えp38を38kDのバンドとして移動す る種を同定するためのスタンダードとして使用した。右パネルにおいて、抗体を BRK由来のユニークな小ペプチドに対して惹起し、そして³⁵Sメチオニンの存在下 でインビトロ転写および翻訳によって生成されたBRKタンパク質は、約40kDのバ ンドとして移動する。 図７は、ブラジキニンでの処理に続くNG108-15細胞におけるBRKのレベルを評 価するための、免疫沈降アッセイの結果を示すオートラジオグラムである。レー ン１〜５は、それぞれ、１、２、５、15および30分での非処理細胞におけるレベ ルを示す。レーン６〜10は、それぞれ、１、２、５、15および30分間１μMブラ ジキニンで処理した細胞におけるレベルを示す。 図8A〜Dは、インヒビターの存在下および非存在下における、NG108-15細胞に おいて観察された漏出および電気容量を減算した電流トレースを示す。20μM SB 203580(図8AおよびB)またはSKF106978(図8CおよびD)で透析された細胞における 、ブラジキニン(図8AおよびC)またはLeu-Enk(図8BおよびD)に対する連続応答を 示す。I_Ca,Vを、-90mVの維持電位から10秒毎に適用した０mVへの100msテストコ マンドによって活性化した(10kHzに対してサンプリング)。ブラジキニン(0.1μM )による作用の前(con)およびピークでのI_Ca,Vを示す、漏出および電気容量を減 算した電流トレースを示す。連続する線は、ゼロ電流を示す。図8EおよびFは、 ブラジキニン(図8E)およびLeu-Enk(図8F)への応答の要約を示す。平均および標 準偏差を示す。各バーの左の数字は、研究した細胞の数を示す。 図9Aおよび9Bは、SKF106978(図9A；20μM)またはSB203580(図9B；20μM)で細 胞間透析した後の、２つのNG108-15細胞におけるブラジキニン（0.1μM）適用の 前（白丸）および間（黒丸）のピークI_Ca,V−電位関係を示す。図9Cは、SB20358 0(20μM)での潅流、およびブラジキニンおよびLeu-Enk(両方とも0.1μM)の適用 の間のピークI_Ca,Vの時間経過を示す。)と20分との間に、I_Ca,Vを30秒ごとに活 性化した。時間経過の残りの部分において、I_Ca,Vを10秒ごとに活性化した。デ ータを、10kHzで得た。 図10Aは、SB203580(20μMパネルＡ₁)またはSKF106978(20μM、パネルＡ₂)でピ ペット内透析した後の２つのNG108-15細胞から得たBK(0.1μM)によるI_K,BKの活 性化を示す。データを100kHzで得た。図10Bは、BK(0.1μM)へのI_K,BK応答の要約 を示すグラフである。グラフは、平均および標準偏差を示す。図10Cは、BKによ る_Ca,Vの阻害に関する提案された経路を示す。発明の詳細な説明 上記のように、本発明は一般に、MAPキナーゼカスケードを介するシグナル伝 達を調節する（すなわち、刺激または阻害する）ための、およびこのようなカス ケードに関連する状態を処置するための組成物および方法に指向する。特に、本 発明は、MAPキナーゼp38-2またはそのポリペプチド変異体を含む組成物、ならび にp38-2の基質を活性化するためおよびp38-2活性の調節因子を同定するための、 このような組成物の使用に指向される。本明細書中で使用される場合、用語「p3 8-2ポリペプチド」は、天然のp38-2配列ならびにその変異体を含む。好ましくは 、p38-2ポリペプチドはブラジキニンにより選択的に活性化される。活性な場合 、p38-2ポリペプチドは、一般にp38-2の少なくとも１つの基質（例えば、ATF-2 、MAPKAPキナーゼ２、MAPKAPキナーゼ３、MNK1、PHAS-1および／またはSap1-a） を活性化し得る。p38-2ポリペプチドの基質は、その生物学的または酵素学的活 性が統計学的に有意な量だけ増加する場合、「活性化される」といわれる。天然 のp38-2配列の変異体は修飾され、その結果、変異体の基質をリン酸化する能力 は実質的に減少しない。 本発明はまた、p38-2活性を調節する組成物および方法を含む。一般に、p38-2 活性を阻害する組成物は、p38-2のリン酸化を阻害し得るか、またはp38-2の基質 をリン酸化する能力を阻害し得る。本明細書中で使用される場合、用語「p38-2 カスケード」は、p38-2を含む任意のシグナル伝達経路、およびp38-2活性を調節 するかまたはp38-2の基質として作用する任意の化合物を含み得るようなカスケ ードをいう。 本発明の範囲内のp38-2ポリペプチド変異体は、１つ以上の置換および／また は修飾を含み得、その結果、基質（例えば、ATF2、MAPKAPキナーゼ２、およびMA PKAPキナーゼ３）をリン酸化する変異体の能力は実質的に減少しない。特定の好 ましい実施態様において、変異体は、25％以下のアミノ酸残基で、より好ましく は20％以下のアミノ酸残基で、および最も好ましくは10％以下の残基での置換お よび／または修飾を含む。このような置換（好ましくは保存的である）は、天然 のタンパク質の非決定領域および／または決定領域において作製され得る。変異 体はまた、あるいは代替的に、ポリペプチドの活性に最小の影響を有するアミノ 酸の欠失または付加を含む他の修飾を含む。特に、変異体は、アミノ末端および ／またはカルボキシ末端にさらなるアミノ酸配列を含み得る。このような配列は 、例えば、ポリペプチドの精製または検出を容易にするために使用され得る。 上記のように、天然のp38-2配列およびその変異体を含むp38-2ポリペプチドは 、ブラジキニンにより選択的に活性化され得る。ブラジキニン（BK）は、神経伝 達物質電位依存カルシウム電流（I_Ca,V）を阻害する。代表的な線維芽細胞腫-神 経膠腫細胞株NG108-15（ATCC受託番号第HB-12317号）において、BKは、少なくと も２つのＧタンパク質（G₁₃およびRac1/Cdc42)の連続的な作用を介してI_Ca,Vを 阻害する。本発明の文脈の中で、Rac1/Cdc42の阻害作用がp38-2により媒介され ることが見出されている。 本明細書中で使用される場合、用語「選択的に活性化された」は、多くともJN Kおよび／またはERK活性の適度な刺激のみ（すなわち、約1.5倍〜３倍の間）を 産生し、そして１型および／または３型P38キナーゼのほとんどまたは全く測定 不可能な活性（すなわち、1.5倍未満）を産生する条件下での、p38-2ポリペプチ ドのキナーゼ活性の強い刺激（すなわち、少なくとも３倍）をいう。一般に、ブ ラジキニンによるp38-2ポリペプチドの選択的活性化は、免疫沈降アッセイおよ び／またはI_Ca,Vの測定を用いて評価され得る。I_Ca,Vの測定は、標準的なホール セルのパッチクランプ技術を使用して行われ得る。簡単にいえば、少なくとも２ つの神経伝達物質（ブラジキニンおよびロイエンケファリン）は、NG108-15細胞 においてI_Ca,Vの振幅を変調する。ロイエンケファリンの効果ではなく、ブラジ キニンの効果は、p38-2活性のブロックに感受性である。これらの伝達物質は、N G108-15細胞に近くに位置するキャピラリーチューブを介して適用され得る。I_{Ca ,V} は、後の分析のために、磁気テープまたはコンピューターディスクに記録され 得る。 置換および／または修飾はまた、構成的に活性または非活性のポリペプチドを 与え得る。構成的に活性なポリペプチドは、下記のように、刺激の非存在下で基 質のリン酸化を刺激する能力を示す。このようなポリペプチドは、本明細書中に 記載されるp38-2キナーゼ活性についての代表的なアッセイを使用して同定され 得る。構成的に非活性なタンパク質は、下記のように刺激された場合でさえ、基 質をリン酸化し得ないタンパク質である。構成的に活性または不活性になるよう に修飾されたタンパク質は、以下でより詳細に記載されるように、種々の疾患を 処置するための治療の代わりに一般に使用され得る。 天然のp38-2ポリペプチドをコードするDNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PC R）および当業者に周知の方法を使用して、適切なcDNAライブラリーからの増幅 により調製され得る。例えば、p38-2を発現する細胞株または組織（例えば、骨 格筋または心臓）から調製されたアダプター連結されたcDNAライブラリーは、5' 特異的正方向プライマーおよびアダプター特異的プライマーを使用して、スクリ ーニングされ得る。ヒトcDNAライブラリーを使用して同定される1.6kb cDNAは、 配列番号１および図５に提供される配列を有する。配列番号２および図１に示さ れる、コードされるp38-2ポリペプチドは、364アミノ酸の推定サイズを有し、計 算およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されるように、約42kD の分子量を有する。p38-2は、その最も近い相同体p38と73％の同一性であり（例 えば、Hanら、Science 265:808-811，1994;Leeら、Nature 372:739-746，1994を 参照のこと）、そしてMAPキナーゼファミリーメンバーに特徴的な全てのキナー ゼサブドメインは保存されている。p38-2の２つの別のスプライス変異体もまた 同定されており、配列は、図１ならびに配列番号３および配列番号４に提供され る。 本発明のポリペプチドは、培養された宿主細胞においてポリペプチドをコード する組換えDNAの発現により調製され得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌、酵 母、バキュロウイルス感染昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。組換えDNAは 、当業者に周知の技術を使用して、宿主細胞内の使用に適切な任意の発現ベクタ ー内にクローン化され得る。発現ベクターは、必須ではないが、エピトープをコ ードするDNAを含み得、その結果、組換えタンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端に エピトープを含む。グルタチオン-Sトランスフェラーゼタンパク質（GST）、HA （ヘマグルチニン）-タグ、FLAG、およびヒスチジン-タグのようなエピトープが 、当業者に周知の技術を使用して付加され得る。 この様式で発現されるDNA配列は、天然のp38-2ポリペプチドをコードし得、ま たはp38-2の別のスプライス変異体、一部、または他の変異体をコードし得る。p 38-2の変異体をコードするDNA分子は、一般に、オリゴヌクレオチド指向部位特 異的変異誘発のような標準的な変異誘発技術を使用して調製され得、そしてDNA 配列の断片は除去され、短縮型ポリペプチドの調製を可能にし得る。p38-2の変 異体のために、このような変化はいずれも、ATF2（例えば、Guptaら、Science 2 67:389-393，1995を参照のこと）、MAPKAPキナーゼ２（例えば、Rouseら、Cell 78:1027-1037，1994 Ben Levyら、EMBO J.:14:5920-6930，1995を参照のこと） 、またはMAPKAPキナーゼ３（例えば、McLaughlinら、J．Biol．Chem．271:8488- 8492，1996を参照のこと）のような基質のリン酸化を刺激する変異体の能力を減 少させるべきではない。一般に、修飾は、p38-2の特性を実質的に変化させない 天然の配列領域である非決定領域において、より容易に作成され得る。非決定領 域は、特定の領域においてp38-2配列を修飾することにより、および本明細書中 に記載されるような適切な基質を使用して、キナーゼ活性における生成した変異 体の能力をアッセイすることにより、同定され得る。 修飾は、得られる変異が基質のリン酸化を刺激する能力を実質的に保持する場 合、p38-2の決定領域においてもまた作製され得る。基質のリン酸化を刺激する 変異体の能力に対する任意の修飾の効果は、一般に、本明細書中に記載の代表的 なアッセイのようなp38-2キナーゼ活性についての任意のアッセイを使用して評 価され得る。 本発明の発現されたポリペプチドは、一般に実質的に純粋な形態において単離 される。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも80重量％の純度に、より好ま しくは少なくとも95重量％の純度に、そして最も好ましくは少なくとも99重量％ の純度に単離される。一般に、このような精製は、例えば、硫酸アンモニウム分 画、SDS-PAGE電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技 術を使用して達成され得る。本発明の方法における使用のためのp38-2ポリペプ チドは、天然か、精製されているか、または組換え体であり得る。 本発明の１つの局面において、p38-2ポリペプチドは、p38-2カスケードを介し てシグナル伝達を調節する（おそらく阻害する）抗体または薬物であり得る薬剤 を同定するために使用され得る。調節は、p38-2の発現の抑制（それが過剰発現 された場合）、ならびにp38-2のリン酸化の抑制、または基質をリン酸化する活 性化された（すなわちリン酸化された）p38-2の能力の阻害を含む。例えば、調 節薬剤は、MEK6のような１つ以上のMAPKKのキナーゼ活性を調節し得、それによ りp38-2の活性化を阻害し得る。MAPKKの既知のアクチベーターは、ストレス誘発 シグナル（例えば、UV、浸透圧ショック、DNA傷害薬剤）、アニソマイシン、LPS 、およびサイトカインを含むが、これらに限定されない。同様に、p38-2リン酸 化を阻害することによりp38-2活性を阻害する組成物は、MAPKKを中和する抗体、 MAPKKまたはp38-2の２つのリン酸化モチーフの基質結合ドメインを示す競合ペプ チド、MAPKKの転写および／または翻訳を妨げるアンチセンスポリヌクレオチド またはリボザイム、キナーゼに結合することによりMAPKKを不活化する分子、p38 -2に結合しそしてMAPKKによるリン酸化を妨げる分子、またはキナーゼから基質 へのリン酸基の転移を妨げる分子のような、MAPKK活性を阻害またはブロックす る１つ以上の薬剤を含み得る。 一般に、調節薬剤は、活性化されたp38-2ポリペプチドまたはこのようなポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、インビボまたはインビトロで、試験 化合物を組合せることにより、および、例えば、本明細書中に記載の代表的なア ッセイを使用してp38-2キナーゼ活性に対する試験化合物の効果を評価すること により、同定され得る。キナーゼ活性に対する増加または減少は、[γ³²P]-ATP のような放射活性化合物を成分の混合物に添加し、そして適切なp38-2の基質内 への放射活性の取り込みを観察し、化合物がキナーゼ活性を阻害または刺激する かどうかを決定することにより、測定され得る。簡単にいえば、候補薬剤は、１ つ以上の混合物の成分と共にプレインキュベーションされるかまたはされないで 、活性p38-2ポリペプチドおよび基質（ATF2のような）の混合物中に含まれ得る 。p38-2の活性化は、任意の種々の手段により達成され得る。代表的には、活性 化は、上記のような刺激を介して次々に活性化され得るMAPキナーゼキナーゼの 添加を含む。一般に、このようなアッセイにおける使用のための抗体または他の 薬剤の適量は、約0.1μM〜約10μMの範囲にある。次いで、p38-2キナーゼ活性に 対する薬剤の効果は、ATF2への[³²P]リン酸の取り込みを定量すること、および 取り込 みのレベルを、候補薬剤の添加なしで活性化されたp38-2を使用して達成される レベルと比較することにより、評価され得る。あるいは、ATF2へのリン酸の取り 込みは、周知の技術を使用して、リン酸化基質に対して特異的な抗体を使用して 測定され得る。別の代替において、キナーゼをコードするポリヌクレオチドは、 発現ベクターに挿入され得、そしてキナーゼの転写に対する組成物の効果は、例 えば、ノザンブロット分析により測定される。 本発明の別の局面において、p38-2ポリペプチドは、p38-2の基質のリン酸化お よび活性化のために使用され得る。１つの実施態様において、適切な緩衝液（下 記でより詳細に記載される）中で、p38-2ポリペプチドを基質およびATPと30分間 、30℃でインキュベートすることにより、基質はインビトロでリン酸化され得る 。p38-2によりリン酸化され得る任意の化合物（例えば、ATF2、MAPKAPキナーゼ ２、およびMAPKAPキナーゼ３）は、基質として使用され得る。一般に、反応成分 の量は約0.1μg〜約10μgのp38-2ポリペプチド、約0.1μg〜約10μgの基質、お よび約10nM〜約500nMのATPの範囲であり得る。次いで、リン酸化基質はGSH-セフ ァロースへの結合および洗浄により精製され得る。基質のリン酸化の程度は、一 般に、試験アリコートに[γ-³²P]ATPを添加し、そして以下に記載するように基 質のリン酸化のレベルを評価することにより、モニターされ得る。 １つ以上のp38-2ポリペプチド、上記の調節薬剤、および／またはこのような ポリペプチドおよび／または調節薬剤をコードするポリヌクレオチドはまた、患 者においてp38-2活性を調節するために使用され得る。本明細書中で使用される 場合、「患者」は、ヒトを含む任意の哺乳動物であり得、そしてp38-2カスケー ドに関連する状態でに罹患し得るか、または検出可能な疾患を有さない可能性が ある。従って、処置は現存の疾患のものであり得るか、または予防的であり得る 。p38-2カスケードに関連する状態は、心血管疾患、免疫関連疾患（例えば、炎 症性疾患、自己免疫疾患、悪性サイトカイン産生、または内毒性ショック）、細 胞増殖関連疾患（例えば、ガン、代謝性疾患、異常細胞増殖、および増殖異常ま たは細胞周期異常）、および細胞再分化関連疾患（例えば、ガン、退行性疾患、 外傷、熱、UV、もしくは化学物質による環境的ストレス、または発生および分化 における異常）を含む、病原学的にMAPキナーゼ活性に関連する任意の障害を含 む。 特に、心臓組織におけるp38-2の高い発現は、心血管疾患におけるp38-2の重要な 役割を示唆する。p38-2ポリペプチドで処置するに適した免疫学的関連の細胞増 殖疾患は、骨関節炎、虚血、再灌流傷害、外傷、特定のガンおよびウイルス性障 害、ならびに慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、および他 の急性期応答のような自己免疫疾患を含む。 本発明の文脈において、疼痛はまたp38-2カスケードに関連した状態であり、 そして疼痛はp38-2キナーゼ活性を阻害することにより処置され得ることが見出 されている。ブラジキニンは疼痛の主要なメディエーターであり、後根神経節ニ ューロンの末梢終末において作用する。これらの細胞におけるブラジキニンの作 用の１つはI_Ca,Vの阻害であり、これは、より早い速度の活動電位発生（疼痛感 覚の電気生理学的基質）を可能にする。患者内の疼痛は、p38-2キナーゼ活性を 阻害することにより、ブラジキニンアンタゴニストの血管副作用なしに、および オピオイドの習慣性の危険性なしに、軽減され得る。 処置は、p38-2ポリペプチドおよび／またはp38-2活性を調節する化合物の投与 を含み得る。患者への投与のために、薬学的組成物として１つ以上のポリペプチ ド（および／または調節薬剤）が一般に処方される。薬学的組成物は、生理学的 に受容可能なキャリア（すなわち、活性成分の活性を妨げない非毒性物質）をさ らに含む、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、または乳液であり得る。当 業者に公知である任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物中に使用され 得る。代表的なキャリアは、生理食塩水、ゼラチン、水、アルコール、天然油ま たは合成油、サッカライド溶液、グリコール、オレイン酸エチルのような注射用 有機エステル、またはこのような物質の組合せを含む。必要に応じて、薬学的組 成物は、保存剤および／または他の添加物（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレー ト剤および／または不活性ガス）および／または他の活性成分をさらに含み得る 。 あるいは、薬学的組成物は、p38-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ド、および／または調節薬剤を含み得、その結果ポリペプチドおよび／または調 節薬剤は、生理学的に受容可能なキャリアとの組合せにおいて、インサイチュで 生成される。このような薬学的組成物において、ポリヌクレオチドは、当業者に 公知の任意の種々の送達系（核酸、細菌発現系、およびウイルス発現系を含む） 、 ならびにリポソームを含むコロイド状分散系において、存在し得る。適切な核酸 発現系は、患者における発現に必須なポリヌクレオチド配列（例えば、適切なプ ロモーターおよび終止シグナル）を含む。DNAはまた、例えば、Ulmerら、Scienc e 259:1745-1749(1993)に記載されるように、「裸」であり得る。 標的化された患者の細胞に核酸配列を導入するために使用され得る種々のウイ ルスベクターとして、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、ヘルペスウイル ス、レトロウイルス、またはアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定され ない。このようなベクター中にDNAを組み込むための技術は当業者に周知である 。好ましくは、レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（Mo MuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳ガンウイルス（MuMT V）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）を含むがこれらに限定されないマウスま たはトリレトロウイルスの誘導体である。レトロウイルスベクターは、選択マー カー（形質導入された細胞の同定または選択を補助するため）の遺伝子および／ または特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子（ベ クターを標的特異的にするため）をさらに移入し得るか、または組み込み得る。 例えば、レトロウイルスベクターは、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードす るヌクレオチド配列を挿入することによって標的特異的にされ得る。標的化はま た、当業者に公知の方法によって抗体を使用して達成され得る。 ウイルスベクターは、代表的には、非病原性（欠損）の複製可能なウイルスで あり、これは感染性ベクター粒子を生じるために補助を必要とする。この補助は 、例えば、LTR中の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコ ードするプラスミドを含むが、パッケージング機構によってカプセル化のために RNA転写物が認識されることを可能にするヌクレオチド配列を欠いているヘルパ ー細胞株を使用することによって提供され得る。このようなヘルパー細胞株とし て、Ψ2、PA317、およびPA12が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。 このような細胞中に導入されたレトロウイルスベクターはパッケージされ得、そ してベクタービリオンを生じる。次いで、この方法で産生されたベクタービリオ ンは、NIH 3T3細胞のような組織細胞株を感染させるために使用され、大量のキ メラレトロウイルスビリオンを生じ得る。 p38-2ポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である 。コロイド分散系として、高分子複合体、微小カプセル（nanocapsules）、マイ クロスフェア、ビーズ、ならびに油中水型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、 およびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。インビトロおよびインビ ボでの送達ビヒクルとしての使用に好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち 、人工膜ベシクル）である。0.2〜4.0μmのサイズの範囲の大単層ベシクル（LUV ）が大きな高分子を含む水溶性の緩衝液の実質的な割合をカプセル化し得ること が示されている。RNA、DNA、およびインタクトなビリオンが、水性の内部にカプ セル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Fraleyら、 Trends Biochem．Sci．6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えてリポソームが、植 物、酵母、および細菌細胞中でのポリヌクレオチドの送達に使用されている。リ ポソームが有効な遺伝子転移ビヒクルであるために、以下の特徴が存在しなけれ ばならない：（１）生物学的活性を有さないが高い効率での目的の遺伝子のカプ セル化；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に対する優先的かつ実質的な結合 ；（３）標的細胞の細胞質への高い効率でのベシクルの水溶性内容物の送達；お よび（４）遺伝情報の正確かつ効率的な発現（Manninoら、Biotechniques 6:882 ，1988）。 リポソームの標的化は、解剖学的および機械論的因子に基づいて分類され得る 。解剖学的分類は、選択性のレベルに基づき、そして例えば、器官特異的、細胞 特異的、および／または細胞小器官特異的であり得る。機械論的標的化は、受動 的であるかまたは能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的な標的化は、 リポソームのシヌソイドキャピラリー（sinusoidal capillary）を含む器官にお ける細胞内皮系（RES）の細胞に分配される天然の傾向を利用する。一方、能動 的な標的化は、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質のような特 異的リガンドに対してリポソームをカップリングすること、あるいは天然に存在 する局在化部位以外の器官および細胞型に対する標的化を達成するためのリポソ ームの組成または大きさを変化させることによるリポソームの改変を含む。 投与の経路および頻度、さらに投与量は、患者によって変化する。一般に、薬 学的組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内（intracavity）、または 経皮的に投与され得る。１〜６用量の間で毎日投与され得る。適切な用量は、p3 8-2カスケードに関連する症状を罹患した患者の徴候において改善を示すために 十分なポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量である。このような改善は、関 連のサイトカインレベル（例えば、IL-1、IL-6、および／またはIL-8）の測定に 基づいて、炎症性応答（例えば、浮腫、移植拒絶、過敏性）をモニターするかま たは症状に関連する臨床的な徴候（例えば、痛み）の改善を通じて検出され得る 。一般に、一用量中に存在するかまたは一用量中に存在するDNAによりインサイ チュで産生されるポリペプチドの量は、宿主の体重１kgあたり約１μg〜約250μ gの範囲であり、代表的には約１μg〜約60μgの範囲である。適切な用量の大き さは、患者の大きさにともなって変化するが、代表的には、10〜60kgの動物につ いて約10mL〜約500mLの範囲である。 本発明はまた、サンプル中の有糸分裂促進物質活性化プロテインキナーゼキナ ーゼ（例えば、MEK6）活性のレベルを検出する方法を提供する。MAPKK活性のレ ベルは、一般に、p38-2ポリペプチドをリン酸化し、それによりp38-2ポリペプチ ドを活性にする（すなわち、ATF2のようなインビボの基質をリン酸化し得る）サ ンプルの能力を評価することによって決定され得る。１つの実施態様において、 キナーゼアッセイが、Derijardら、Cell 76:1025-1037，1994およびLinら、Scie nce 268:286-290，1995に記載されるように、主要でない改変を伴って実質的に 行われ得る。簡潔には、サンプルは、適切な緩衝液（例えば、20mM HEPES(pH7.6 )、５mM MnCl₂、10mM MgCl₂、１mMジチオスレイトール）中で30℃にて30分間、p 38-2および[γ-³²P]ATPとともにインキュベートされ得る。一般に、50nMの[γ-^{3 2} P]ATPを含む約１μgの組換えp38-2で十分である。次いで、タンパク質は10％ゲ ル上でのSDS-PAGEによって分離され、そしてオートラジオグラフィーに供され得 る。[³²P]ホスフェートのp38-2への取り込みは、ホスホリメージャーを使用する ような、当業者に周知の技術を使用して定量され得る。このアッセイが、リン酸 化基質に特異的な（すなわち、抗体はリン酸化基質に結合し、そしてリン酸化さ れていない基質には有意に結合しない(その結果、抗体を使用して２つの形態間 を区別し得る)）抗体および標準的な方法を使用して、未標識のホスフェートを 用いて行われ得ることが、当業者に明らかである。 p38-2のリン酸化が活性化を生じるかどうかを決定するために、共役させたイ ンビトロのキナーゼアッセイが、p38-2の基質（例えば、ATF2）を使用して、エ ピトープタグを用いてまたは用いないで行われ得る。このようなアッセイにおけ る使用のためのATF2は、Guptaら、Science 267:389-393，1995に記載されている ように調製され得る。簡潔には、上記のようなp38-2のリン酸化、GSH-セファロ ースへの結合および20mM HEPES（pH7.6）、20mM MgCl₂での洗浄によるタンパク 質の単離後、p38-2（0.1〜10μg）が、20mM HEPES（pH7.6）、20mM MgCl₂を含有 する緩衝液中でATF2（0.1〜10μg）および[γ-³²P]ATP（10〜500nM）とともにイ ンキュベートされ得る。別の緩衝液が使用され得ること、および緩衝液の成分が キナーゼ活性の有意な効果を伴わずに変化し得ることが注目されるはずである。 反応物は、SDS-PAGEによって分離され、オートラジオグラフィーによって可視化 され、そして任意の種々の公知の技術を使用して定量され得る。活性化されたp3 8-2は、このアッセイを使用して少なくとも５％以上のバックグラウンドのレベ ルでATF2をリン酸化し得る。 p38-2カスケードを介するシグナル伝達のレベルについて、抗体または他の候 補調節薬剤の影響を評価するために、キナーゼアッセイは、（サンプルよりもむ しろ）MEK6のようなMAPKKが一般的に使用されること、および候補調節薬剤がイ ンキュベーション混合物に添加されることを除いて上記のように行われ得る。候 補薬剤はATPおよびp38-2ポリペプチドの添加の前にMAPKKとともに予めインキュ ベートされ得る。あるいは、p38-2はMAPKKの添加の前に候補薬剤とともに予めイ ンキュベートされ得る。さらなる改変は、p38-2の添加の前にMAPKKとATPとの混 合物に候補薬剤を添加すること、またはMAPKKの添加の前にp38-2とATPとの混合 物に候補薬剤を添加することをそれぞれ含む。これらの全てのアッセイはさらに 、最初の予備インキュベーション工程の後に候補薬剤を除去することによってさ らに改変され得る。一般に、このようなアッセイにおける使用のための抗体また は他の候補薬剤の適切な量は、約0.1μM〜約10μMの範囲である。次いで、p38-2 のリン酸化に対する薬剤の影響が、上記のようなp38への[³²P]ホスフェートの取 り込みを定量すること、および候補薬剤の添加なしでMAPKKを使用して達成され る取り込みのレベルと比較することによって評価され得る。 p38-2活性はまた、その発現が適切な基質（例えば、ATF2）の活性化に依存し ているレポーター遺伝子でトランスフェクトされた全細胞中で測定され得る。例 えば、適切な細胞（すなわち、p38-2を発現する細胞）がルシフェラーゼのよう なレポーター遺伝子に連結されたATF2-依存性プロモーターでトランスフェクト され得る。このような系において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現（当業者に周知 の方法を使用して容易に検出され得る）はp38-2によるATF2の活性化に依存し、 これは、アクチベーターでのMAPKKの刺激またはMAPKK（例えば、MEK6）の構成的 に活性な改変体を産生する発現ベクターでの同時トランスフェクションによって 達成され得る。p38-2カスケードに対するそれらの影響を評価するために、上記 のように、候補調節薬剤がこの系に添加され得る。 あるいは、全細胞系は、GHF-1またはGAL4のような適切なDNA結合ドメインに融 合されたATF2のトランス活性化ドメインのみを使用し得る。次いで、レポーター 系が、GH-ルシフェラーゼまたはGAL4-ルシフェラーゼプラスミドを含み得る。次 いで、候補調節薬剤は、ATF2-特異的遺伝子活性化に対するそれらの影響を評価 するために系に添加される。 本発明はまた、サンプル中のp38-2ポリペプチドのレベルを検出するための方 法を提供する。p38-2またはp38-2をコードする核酸のレベルは、一般に、p38-2 またはp38-2をコードするDNAまたはRNAに結合する試薬を使用して決定され得る 。p38-2をコードする核酸を検出するために、核酸プローブまたはPCRプライマー を使用する標準的なハイブリダイゼーションおよび／またはPCR技術が、利用さ れ得る。適切なプローブおよびプライマーは、配列番号１に提供されるp38-2 cD NA配列に基づいて当業者によって設計され得る。p38-2タンパク質を検出するた めに、試薬は代表的には抗体であり、これは以下に記載のように調製され得る。 サンプル中のポリペプチドを検出するために抗体を使用する、当業者に公知の種 々のアッセイ形態が存在する。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies：A Labo ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988を参照のこと。例えば、 抗体は、サンプル由来のポリペプチドに結合し得るか、またはそれを除去し得る ように、固体支持体上に固定され得る。次いで、結合したポリペプチドは、抗体 ／ペプチド複合体に結合し、そして検出可能なレポーター群を含む第２の抗体を 使 用して検出され得る。あるいは、固定化抗体に結合するポリペプチドがレポータ ー群で標識され、そしてサンプルとの抗体のインキュベーション後に固定化抗体 に結合することを可能にする競合アッセイが利用され得る。抗体への標識ポリペ プチドの結合を阻害するサンプルの成分の程度は、サンプル中のポリペプチドの レベルを示す。これらの方法における使用に適切なレポーター群として、酵素（ 例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、 放射性核、発光群、蛍光群、およびビオチンが挙げられるが、これらに限定され ない。 本発明に含まれる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そ してp38-2および／またはその１つ以上のその改変体に特異的であり得る。好ま しい抗体は、上記のような、インビボおよびインビトロでのアッセイにおいてp3 8-2活性を阻害するかまたはブロックするそれらの抗体である。上記のように、p 38-2活性について所望の効果を有する抗体および他の薬剤が、インビボでのp38- 2の活性化を調節するために（予防的に、または現存する病気の処置のためにの いずれかで）患者に投与され得る。 抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術によって調製され得る（例えば、Ha rlowおよびLane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratory，1988を参照）。１つのこのような技術において、ポリペプチドを含む免 疫原が、好ましくは、１回以上の追加免疫を含む予め決定されたスケジュールに 従って最初に適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤ ギ）に注射され、そして動物は定期的に採血される。次いで、ポリペプチドに特 異的なポリクローナル抗体が、例えば、適切な固体支持体に結合させたポリペプ チドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清 から精製され得る。 p38-2に特異的なモノクローナル抗体またはその改変体が、例えば、Kohlerお よびMilstein，Eur．J．Immunol．6:511-519，1976の技術およびその改良技術を 使用して調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、 目的のポリペプチドと反応性である）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の 調製を含み得る。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物か ら得られた脾臓から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細 胞（好ましくは、免疫化動物と同系であるミエローマ細胞）の融合パートナーと の融合によって不死化される。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イ オン性界面活性剤と数分間組み合わされ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を 支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレートさ れ得る。好ましい選択技術は、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ ン）選択を使用する。十分な時間（通常は約１〜２週間）の後、ハイブリッドの コロニーが観察される。単一のコロニーが選択され、そしてポリペプチドに対す る結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドー マが好ましい。 モノクローナル抗体が、増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離され 得る。さらに、マウスのような適切な脊椎動物宿主の腹膜腔中へのハイブリドー マ細胞株の注入のような種々の技術が、収量を増大するために使用され得る。次 いで、モノクローナル抗体が腹水液または血液から採集され得る。混入物は、ク ロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱および抽出のような従来技術によって抗体か ら除去され得る。 本発明の関連する局面において、p38-2およびp38-2キナーゼ活性、ならびにMA PKKキナーゼ活性を検出ためのキットが提供される。このようなキットは、p38-2 またはp38-2をコードする核酸のレベルを検出するために設計され得るか、ある いは直接的なキナーゼアッセイまたは共役させたキナーゼアッセイにおいてp38- 2またはMAPKKのキナーゼ活性を検出し得、ここでp38-2のリン酸化およびキナー ゼ活性のレベルの両方が決定され得る。MAPKKまたはp38-2キナーゼ活性は、真核 生物細胞、細菌、ウイルス、生存している生物中に見出されるこのような器官お よび液体から調製された抽出物のような、任意の種々のサンプルにおいて検出さ れ得る。一般に、本発明のキットは、このアッセイで使用される試薬または緩衝 液のような要素を含む１つ以上の容器を含む。 p38-2、またはp38-2をコードする核酸のレベルを検出するためのキットは、代 表的には、p38-2タンパク質、DNAまたはRNAに結合する試薬を含む。p38-2をコー ドする核酸の検出のためには、試薬は核酸プローブまたはPCRプライマーであり 得る。p38-2タンパク質の検出のためには、試薬は代表的には抗体である。この ようなキットはまた、試薬の直接的または間接的な検出に適切なレポーター群を 含む（すなわち、レポーター群は、試薬に共有結合され得るか、またはプロテイ ンＡ、プロテインＧ、イムノグロブリンまたはレクチン（これはそれ自体が試薬 に結合し得る）のような第２の分子に結合し得る）。適切なレポーター群として 、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター 、色素、放射性核、発光群、蛍光群、およびビオチンが挙げられるが、これらに 限定されない。このようなレポーター群は、当業者に公知の標準的な方法を使用 してサンプルの成分に対する試薬の結合を直接または間接的に検出するために使 用され得る。 p38-2活性を検出するためのキットは、代表的には適切な緩衝液と組み合わせ たp38-2基質を含む。p38-2活性は、上記のようなキナーゼアッセイを行う前にp3 8-2特異的抗体を用いて免疫沈降工程を行うことによって特異的に検出され得る 。あるいは、提供される基質は、p38-2によってのみリン酸化される基質（すな わち、p38によってリン酸化されない）であり得る。p38-2のリン酸化を測定する ことに基づくMAPKKキナーゼ活性を検出するためのキットは、一般に、適切な緩 衝液と組み合わせたp38-2ポリペプチドを含む。p38-2活性を検出することに基づ くMAPKKキナーゼ活性を検出するためのキットは、一般に、適切なp38-2基質（例 えば、ATF2）と組み合わせたp38-2ポリペプチドを含む。必要に応じて、キット は、適切な緩衝液および/または活性化の後およびATF2と組み合わせる前のp38の 精製のための材料をさらに含み得る。p38-2のリン酸化および/またはキナーゼ活 性を検出することに使用するための他の試薬（例えば、リン酸化基質に特異的な 抗体(これはリン酸化基質と非リン酸化基質とを区別するために用いられ得る)） もまた提供され得る。このようなキットは、直接的または組み合わせたキナーゼ アッセイにおいて使用され得る。それらは上記のように行われ得る。 なお別の局面において、p38-2またはその改変体は、１以上の天然の上流のキ ナーゼ（すなわち、インビボでp38-2をリン酸化し、そして活性化するキナーゼ ）を同定するために使用され得る。p38-2ポリペプチドは、p38-2と相互作用する タンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッド系において使用され得る。 あるいは、発現ライブラリーは、p38-2をリン酸化するcDNAについて配列決定さ れ得る。 以下の実施例は、例証のために提供されるもであり、限定のためではない。 実施例 実施例１ p38-2 をコードするcDNAのクローニングおよび配列決定 本実施例は、ヒトMAPK p38-2をコードするcDNA分子のクローニングを例証する 。 National Center for Biotechnology Information（NCBI）Genbankデータバン クの発現配列タグ（EST）細分を、tblastnプログラムおよび照会としてヒトp38 アミノ酸配列（Hanら、Science 265:808-811，1994;Leeら、Nature 372:739-746 ，1994）を用いて、BLAST e-mailサーバーを用いて検索した。胸部cDNAライブラ リー由来のEST配列R72598が、最も高い相同性スコアを示した。EST配列R72598に 対応するクローンを、Research Genetics Inc.，(Huntsville，AL)から入手し、 そしてインサートのサイズを約0.9kbであると決定した。配列決定により、この クローンが以前には未知であった遺伝子の5'部分をコードし、そしてポリＡテー ルを有する3'末端を欠失していることが示された。3'部分を、遺伝子特異的正方 向プライマーおよびアダプターベース逆方向プライマーを用いるRACE PCRにより 骨格筋cDNAライブラリーから入手した。完全なcDNAを、共通のKpnI部位を用いた 5'部分および3'部分のpBluescript（Stratagene，La Jolla，CA）への融合連結 によって入手し、そしてミニプレップ分析によって確認した。 イントロンを有する全長クローンおよびイントロンを有さない全長クローンを 同定した。配列を、ABI 373 Automated Sequencer（Applied Biosystems，Inc. ，Foster City，CA）でダイターミネーターサイクル配列決定を用いて入手し、 そしてイントロンを有さない全長クローンの配列を配列番号１および図５に示す 。 実施例２ p38-2 のインビボ発現 本実施例は、種々のヒト組織における、p38と比較したp38-2の発現を例証する 。 ノーザンブロットを、16の異なる成体ヒト組織から単離し、変性ホルムアルデ ヒド1.2％アガロースゲル電気泳動により分画し、そして電荷改変ナイロンメン ブレン（Clontech Laboratories，Palo Alto，CA）上にトランスファーした２μ gのポリA⁺ RNAを用いて行った。ブロットを、製造業者の指示に従ってExpressHy b（Clontech Laboratories，Palo Alto，CA）を用いて、p38-2プローブ（900bp p38-2フラグメント）またはp38プローブ（850bp p38フラグメント）にハイブリ ダイズさせた。両方のプローブを、ランダムプライミング（Stratagene，La Jol la，CA）によって[α-³²P]dCTP（NEN,Boston,MA）でcDNAを標識することによっ て調製した。コントロールの目的のために、ブロットをまた、放射標識β-アク チンプローブにハイブリダイズさせた。 図2Aおよび2Bに示される結果は、p38-2が多くの成体ヒト組織において広範に 発現され、心臓および骨格筋において最も高いレベルであることを示している（ 図2A）。対照的に、p38は骨格筋のみで優勢に発現される（図2B）。さらに、p38 -2の発現は、心臓および精巣においてはp38よりも高く、一方、p38の発現は胎盤 および小腸においてはp38-2よりも高い。分析された16の組織の全てが、等量の β-アクチンmRNAを発現した（示さず）。 実施例３ p38-2 の調製 本実施例は、HA-タグp38-2のインビトロ翻訳を例証する。 HAタグp38-2を、35S-メチオニンの存在下でPromega TNT Coupled Reticulocyt e Lysate System(Promega，Madison，WI)を用いて、SP6ポリメラーゼおよびテン プレートDNA 3xHA-p38-2-SRα3を用いて、インビトロで転写および翻訳した。放 射性のインビトロ翻訳されたタンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そしてオ ートラジオグラフィーによって可視化した（図３）。 これらの結果は、エピトープタグp38-2の分子量が約42kDaであることを示して いる。実施例４ ストレス誘導因子によるp38-2の活性化 本実施例は、MAPK経路の種々の刺激因子によるp38-2の活性化を例証する。 10アミノ酸の赤血球凝集素（HA）エピトープの３つのコピーをコードする配列 をp38-2のN-末端に添加し、そして得られるcDNAを発現ベクターSRα3に連結する ことによって、エピトープタグp38-2（3xHA-p38-2-SRα3）をコードする発現ベ クターを構築した。p38-2の調節のパターンを調査するために、COS細胞を、DEAE -Dextran法によって、HA-p38-2-SRα3（上記のような）で一過的にトランスフェ クトさせた（KawaiおよびNishizawa，Mol.Cell.Biol．4:1172-1174，1984）。次 いで、これらの細胞をMAPK経路の種々の刺激因子で処理した（すなわち、UV(250 nm，120J/m²)、アニソマイシン（50ng/ml）もしくはNaCl(200μM)で45分間処理 するか、または1000ngの空の発現ベクターSrα3、構成的に活性な変異体MEK6(DD )またはMAPK TAK1ΔNの発現ベクターを用いて同時トランスフェクトさせた）。 処理の後、細胞溶解物を、記載されたように（Derijardら、Cell 76:1025-103 7，1994）溶解緩衝液中での可溶化によって調製し、そして溶解物のタンパク質 濃度をBradfordアッセイによって測定した（Bradford，Ann.Biochem．72:248-25 4，1976）。細胞溶解物を、以前に記載されたように（Guptaら、Science 267:38 9-39，1995）調製したGST-ATF2基質を用いて免疫複合体キナーゼアッセイに使用 した。アッセイを、小さな改変を加えて以前に記載されたように（Derijardら、 Cell 76:1025-1037，1994;Linら、Science 268:286-290，1995）一般的に行った 。[γ-³²P]ATPの濃度は50nMであり、そして30μgの細胞溶解物を、抗HA抗体12CA 5（Boeheringer-Mannheim Corp.，Indianapolis，IN）で２時間免疫沈降させ、 次いで１μgの組換え基質とともにインキュベートした。反応物をSDS-PAGEによ って分離した。結果を図４に示す。 これらの実験により、UV（254nm;120J/m²、45分間）、アニソマイシン（50ng/ mL、45分間）およびMEK6(DD)、MEK6の構成的に活性な改変体によるp38-2の強い 誘導が示された（図４）。細胞をNaCl、発現ベクター単独またはMAPキナーゼTAK 1ΔN（Yamaguchiら、Science 270:2008-2011，1995を参照のこと）で処理した場 合には、p38-2活性の増大は観察されなかった。これは、ATF2の誘導性のリン酸 化がMEK6およびp38-2からなるキナーゼカスケードに依存することを明白に示し ている。 実施例５ ブラジキニンによるBRKの選択的な活性化 本実施例は、BRKを強力かつ選択的に活性化するブラジキニンの能力を例証す る。 最初の実験を、NG108-15細胞（ATCC受託番号HB-12317）において示されるMAPK 経路を同定するために行った。この細胞を、公表された方法（Hamprechtら、Met hods in Enzymol．109:316-347，1985を参照のこと）に従って増殖させた。p38 に対して惹起されたポリクローナル抗体およびBRKに対してユニークである小ペ プチドを用いて、イムノブロット分析を抽出物において行った。図６に示される ように、これらのキナーゼは明白に検出され得た。 次いで、免疫沈降アッセイをブラジキニンによる刺激を調査するために行った 。図７に示される結果は、ブラジキニンがI_ca,Vにおけるブラジキニンの影響に 類似したキネティクスでBRKを刺激することを示す。従って、NG108-15細胞にお いて、ブラジキニンはBRKを強く刺激し、JNKおよびERKをわずかにのみ刺激し、 そして１型p38キナーゼを少しも活性化しない。 実施例６ ブラジキニンによるI_ca,vの阻害におけるERKおよびBRKのキナーゼ活性の インヒビターの影響 本実施例は、ブラジキニンによるI_ca,vの阻害をブロックするBRKのインヒビタ ーの使用を例証する。 ERKおよびp38キナーゼの活性化は、それぞれ、化合物PD98059（Pangら、J.Bio l.Chem．270:13585-13588，1995を参照のこと）およびSB203580（Leeら、Nature 372:739-746，1994を参照のこと）によって選択的にブロックされ得る。PD9805 9（Parke Davis）およびSB203580（SmithKline Beecham）を用いて、MAPK経路が 、ブラジキニンによるI_ca,vの阻害を媒介するかを調査した（図8A-F）。各化合 物の 細胞内透析の後、ブラジキニンによるI_ca,vの阻害を最初に調査し、そしてその 後Leu-Enkphalin（Leu-Enk）による阻害を測定した。ブラジキニンによるI_ca,v の阻害は、SB203580（20μM）の適用の後にブロックされ、一方、Leu-Enkにより 産生された阻害は保持されていた（図8A-B）。不活性アナログSKF106978（20μM (SmithKline Beecham);Leeら、Nature 372:739-746，1994を参照のこと）の適用 は、ブラジキニンまたはLeu-EnkによるI_ca,vの阻害をブロックしなかった（図8C -D）。PD98059（20μM）の適用の後、いずれかの伝達物質によるI_ca,vの阻害は 減弱されなかった（図8E-F）。同様に、ジメチルスルホキシド含有ビヒクルの適 用は効果がなかった。PD98059およびSB203580を用いた実験の結果の要旨は、図9 E-Fに示される。 ブラジキニンおよびLeu-Enkは、I_ca,vの同一の成分を阻害するが（Wilk Blasz czakら、Neuron 13:1215-1224，1994）、ブラジキニン応答のみがp38キナーゼイ ンヒビターSB203580によってブロックされる。それ故、この化合物の効果は、I_{c a,v} の直接的な抑制に起因するようではない。この結論を、広範囲の膜電位にわ たるSB203580のピークI_ca,vにおける直接的な効果を研究することによって確認 した（図9B）。コントロールとして、電流-電圧曲線を、SKF106978を用いて細胞 を透析した後に得た（図9A）。SB203580で処理した細胞（n＝２）の全てにおい て、電流-電圧相関は、コントロール細胞（n＝１）と比較して有意に変化しなか った。一方、BKによる阻害は、調査した膜電圧の全体の範囲にわたって抑制され た。これらの知見は、研究した細胞の全てにおいて一定であった。I_ca,vにおけ るSB203580の任意の直接的な作用の欠失を、実験の期間の全体についてピークI_{c a,v} をモニターすることによってさらに確認した（図10C;n＝11）。 G₁₃経路に対するSB203580の特異性を、この化合物がBKに対する二次応答、電 位非依存性K⁺電流（I_K,BK）の活性化をブロックするかどうかを調査することに よりさらに試験した。この応答は、明確なヘテロトリマーのＧタンパク質G_q/11 （Wilk-Blaszczakら、Neuron 12:109，1994を参照のこと）によって媒介される 。I_K,BKを、p38インヒビターSB203580または不活性アナログSKF106978のいずれ かを用いて透析した細胞においてWilk-Blaszczakら、Neuron 12:109，1994に記 載のように測定した（図10Aを参照のこと）。試験した全ての細胞において、SB2 03580 を用いる透析は、不活性SKF106978を用いる透析と比較して、BKによるI_K,BKの活 性化を減じなかった（図9C）。 上記の結果は、BRKの活性化が、I_Ca,VにおけるBKの阻害効果に必要とされるこ とを示す。BKの経路におけるこのキナーゼの関与は、BK応答の時間経過と類似の 時間経過に従って、BKが酵素のこのイソ型のみを強力に活性化し、そしてp38イ ンヒビターSB203580がキナーゼおよびI_Ca,Vの両方においてBKの効果をブロック するという観察によって強く支持される。SB203580の効果は選択的である。なぜ なら、それは、BKによるI_K,BKの活性化、またはLeu-EnkによるI_Ca,Vの阻害に及 ばないからである。I_Ca,Vの阻害におけるJNK関与はありそうにもない。なぜなら 、このキナーゼは、BKにより弱く刺激されるのみであり、そして高濃度のSB2035 80によってのみブロックされるからである。ERKキナーゼもまた関与しない。な ぜなら、BKによるI_Ca,Vの阻害は、MEKインヒビターPD98059に感受性ではないか らである。 上記のデータは、神経伝達物質によるイオンチャンネルの調節におけるMAPキ ナーゼ経路に関する新規な役割を規定する。細胞の増殖および分化における、成 長因子により惹起されるMAPキナーゼの効果とは対照的に、I_Ca,VにおけるBRKキ ナーゼの作用は、Ｇタンパク質結合サーペンタイン（serpentine）レセプターに より引き起こされ、そして短時間スケールにわたって表れる。従って、MAPキナ ーゼ経路は、古典的なセカンドメッセンジャー経路のそれと類似した役割を果た す。 前述から、本発明の特定の実施態様が例証の目的で本明細書中に記載されてい るが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る ことが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/50 Ｃ０７Ｋ 16/40 33/573 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ステイン，バーンド アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サン ディエゴ，ショアライン ドライブ 7190，アパートメント 6311 (72)発明者 ヤン，マリア エックス．エイチ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92111, サン ディエゴ，リンダ ビスタ ロード 8034 (72)発明者 ヤング，デイビッド ビー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92109, サン ディエゴ，モレル ストリート 4061，アパートメント シー (72)発明者 バーボサ，ミグエル エス. アメリカ合衆国 テキサス 75235，ダラ ス，ハリー ハインズ ブールバード 5323 (72)発明者 ベラーデッティ，フランセスコ アメリカ合衆国 テキサス 75235，ダラ ス，ハリー ハインズ ブールバード 5323 (72)発明者 ウィルク―ブラズクザック，エム．エイ. アメリカ合衆国 テキサス 75235，ダラ ス，ハリー ハインズ ブールバード 5323 (72)発明者 コブ，メラニー アメリカ合衆国 テキサス 75235，ダラ ス，ハリー ハインズ ブールバード 5323

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または25％より少 ないアミノ酸残基での置換および／または改変においてのみ異なるそれらの改変 体。 ２．請求項１に記載のポリペプチドの構成的に活性な改変体。 ３．ポリペプチドが構成的に不活化されるように、25％より少ないアミノ酸残基 で改変された、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 ４．p38-2の基質を活性化し得るポリペプチドであって、該ポリペプチドはブラ ジキニンによって選択的に活性化される、ポリペプチド。 ５．前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列の25％より少ない アミノ酸残基での置換および／または改変において異なる配列番号２の改変体を 含む、請求項４に記載のポリペプチド。 ６．請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離されたDN A分子。 ７．前記DNA分子が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記 載の単離されたDNA分子。 ８．請求項６に記載のDNA分子を含む、組換え発現ベクター。 ９．請求項８に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、 宿主細胞。 １０．前記宿主細胞が、細菌、酵母、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞およ び哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の宿主細胞。 １１．p38-2の基質をリン酸化する方法であって、請求項１または４のいずれか に記載のポリペプチドとp38-2の基質とを接触させて、それによりp38-2の基質を リン酸化する工程を包含する、方法。 １２．前記p38-2の基質が、ATF2、MAPKAPキナーゼ２、およびMAPKAPキナーゼ３ からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。 １３．患者におけるp38-2の基質を活性化するための医薬の製造において使用す るための、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた、請求項１または４のい ずれかに記載のポリペプチド。 １４．前記p38-2の基質が、ATF2、MAPKAPキナーゼ２、およびMAPKAPキナーゼ３ からなる群から選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。 １５．p38-2カスケードを介するシグナル伝達を調節する因子をスクリーニング するための方法であって、 (a)候補因子と請求項１または４のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させ る工程であって、該接触の工程が該候補因子と該ポリペプチドとを相互作用させ るに十分な条件下および時間の間で行われる、工程；および (b)続いて、p38-2活性を調節する該候補因子の能力を測定し、それによりp38カ スケードを介するシグナル伝達を調節する該候補因子の能力を評価する工程、を 含む、方法。 １６．p38-2カスケードを介するシグナル伝達を調節する因子をスクリーニング するための方法であって、 (a)候補因子と、請求項１または４のいずれかに記載のポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触の工程が該ポリペプチ ドの生成および該ポリペプチドと該候補因子との間の相互作用を可能にするに十 分な条件下および時間の間で行われる；および (b)続いて、p38-2活性を調節する該候補因子の能力を測定し、それによりp38-2 カスケードを介するシグナル伝達を調節する該候補因子の能力を評価する工程、 を含む、方法。 １７．請求項１または４のいずれかに記載のポリペプチドに結合する、抗体。 １８．前記抗体が前記ポリペプチドによる基質のリン酸化を阻害する、請求項１ ７に記載の抗体。 １９．p38-2カスケードに関連する症状を処置するための医薬の製造において使 用するための、p38-2カスケードを介するシグナル伝達を調節する因子。 ２０．p38-2カスケードに関連する症状を罹患した患者を処置するための医薬の 製造において使用するための、p38-2キナーゼ活性を調節する因子。 ２１．前記因子がp38-2キナーゼ活性を阻害する、請求項２０に記載の因子。 ２２．p38-2カスケードに関連する症状を罹患した患者を処置するための医薬の 製造において使用するための、p38-2のリン酸化を調節する因子。 ２３．前記因子がp38-2のリン酸化を阻害する、請求項２２に記載の因子。 ２４．前記因子がモノクローナル抗体を含む、請求項１９、２０、または２２の いずれかに記載の因子。 ２５．前記因子がポリヌクレオチドを含む、請求項１９、２０または２２のいず れかに記載の因子。 ２６．前記p38-2カスケードに関連する症状が疼痛である、請求項１９、２１ま たは２３のいずれかに記載の因子。 ２７．サンプル中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ活性を検出 するための方法であって、請求項１または４のいずれかに記載のポリペプチドを リン酸化する該サンプルの能力を評価し、それにより該サンプル中のマイトジェ ン活性化プロテインキナーゼキナーゼ活性を検出する工程を含む、方法。 ２８．前記マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼがMEK6である、請求 項２７に記載の方法。 ２９．ポリペプチドをリン酸化する前記サンプルの前記能力が、結合キナーゼア ッセイを用いて評価される、請求項２８に記載の方法。 ３０．適切な緩衝液と組み合わせたp38-2を含む、サンプル中のマイトジェン活 性化プロテインキナーゼキナーゼ活性を検出するためのキット。