JPH08502487A

JPH08502487A - 新規なクラスのｒｐｔｐアーゼ：それらの構造ドメイン及びリガンド

Info

Publication number: JPH08502487A
Application number: JP6510272A
Authority: JP
Inventors: シュレシンガー，ヨセフ; バーニー，ギラッド; エイチ．グルメ，マーティン; ユー．マルゴリス，リチャード
Original assignee: ニューヨークユニバーシティーメディカルセンター
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 1996-03-19
Also published as: WO1994009037A1; AU5443394A; CA2147167A1; EP0677063A4; NZ257713A; EP0677063A1

Abstract

(57)【要約】新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子、この新規なクラスの受容体に結合するリガンドのファミリー、及びかかる受容体及びリガンドの用途が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】新規なクラスのＲＰＴＰアーゼ：それらの構造ドメイン及びリガンド１．序本発明は、新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子、この新規なクラスの受容体に結合するリガンドのファミリー、及びかかる受容体及びリガンドの用途に関する。具体的には、この新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子のメンバーは、プロテオグリカンであり、そして／又は細胞外の炭酸脱水酵素の構造ドメインを有する。この新規なクラスの１メンバー、つまりＲＰＴＰβの特徴付けが、ここに示した実施例に記載されている。本発明の受容体タンパク質チロシンホスファターゼに結合するリガンドは、細胞外分子の細胞接着分子（ＣＡＭ）ファミリーのメンバーである。２．発明の背景２．１タンパク質リン酸化及びシグナル伝達細胞は、かなりの程度まで、それらの近隣環境からの刺激を受ける手段としての細胞外分子に依存している。これら細胞外シグナルは、分化、収縮性、分泌、細胞分裂、接触阻害、及び代謝の如き多様な細胞プロセスの正確な調節に必須である。例えば、ホルモン、成長因子、又は神経伝達物質を含むことができるこれら細胞外分子は、特定の細胞表面受容体に結合するリガンドとして働く。これらリガンドのそれらの受容体への結合は、もとの刺激の増幅及び上に挙げた別々の細胞プロセスの同調的調節の両方を引き起こす反応カスケードの引き金になる。シグナル伝達といわれるこのプロセスの中心的特徴（最近の委細については、 Posada，J．とCooper，J.A.，1992,，Mol．Biol．Cell 3:583-592；Hardie，D.G .，1990，Symp．Soc．Exp．Biol．44:241-255を参照のこと）は、ある種のタンパク質の可逆的リン酸化である。アミノ酸残基のリン酸化又は脱リン酸化は、調節されたタンパク質のコンフォメーション変化の引き金になり、それらの生物学的特性を変える。タンパク質は、タンパク質キナーゼによりリン酸化され、そしてタンパク質ホスファターゼにより脱リン酸化される。タンパク質キナーゼ及びホスファターゼは、それらが働くアミノ酸残基に従って分類され、１つのクラスはセリン−トレオニンキナーゼ及びホスファターゼであって（Scott，J.D．及び Soderling，T.R.，1992，2:289-295で検討された）、これらはセリン及びトレオニン残基に働き、そしてその他のクラスは、チロシンキナーゼ及びホスファターゼであって（Fischer，E.H．ら，1991，Science 253:401-406；Schlessinger，J ．とUllrich，A.，1992，Neuron 9:383-391；Ullrich，A．とSchlessinger，J. ，1990，Cell 61:203-212）、これらはチロシン残基に働く。更に、タンパク質キナーゼ及びホスファターゼは受容体であると定義することも、即ち、これら酵素が膜貫通リガンド結合性分子の欠くことのできない部分であると定義することも、あるいは非受容体であると定義することもでき、この場合は、それらが、リガンド結合受容体による働きにより間接的に細胞外分子に応答することを意味している。リン酸化は、リン酸化反応と脱リン酸化反応の競合を包含する動的プロセスであって、いずれかの所与の瞬間におけるリン酸化のレベルが、これら反応を触媒するタンパク質キナーゼ及びホスファターゼのその瞬間における相対的活性を反映する。タンパク質リン酸化の大部分はセリン及びトレオニンアミノ酸残基で起こるが、リン酸化はチロシン残基でも起こり、多くのオンコ遺伝子産物及び成長因子受容体が内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を有しているという発見から、大きな興味を引き始めた。今日では、成長因子のシグナル伝達、細胞周期進行及び悪性形質転換におけるタンパク質チロシンリン酸化の重要性は、十分に確証されている（Cantley，L.C．ら，1991，Cell 64:281-302；Hunter，T.，1991，Cell 64:249-270；Nurse，1990，Nature 344:503-508；Schlessinger，J．とUllrich ，A.，1992，Neuron 9:383-391；Ullrich，A．とSchlessinger，J.，1990，Cell 61:203-212）。発癌をもたらす正常成長制御経路の破壊が、優勢発癌性タンパク質の大きなグループを構成するチロシンキナーゼの活性化又は過剰発現により起こることが分かっている（Hunter，T.，1991，Cell 64:249-270において検討された）。加えて、タンパク質チロシンホスファターゼの初期精製、配列決定及びクローニング（Thomas，M.L.ら，1985，Cell 41:83）以来、追加の潜在的タンパク質チロシンホスファターゼが急速なペースで同定されている（例えば、Kaplan，R．ら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:7000-7004；Krueger，N.X．ら，199 0，EMBO J．9:3241-3252；Sap，J．ら，1990，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 87:6112-6116を参照のこと）。同定された異なるタンパク質チロシンホスファターゼの数が着実に増加しているで、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーは、タンパク質チロシンキナーゼファミリーと同じくらい大きいことが見込まれる（Hunter，T.，1989，Cell 58:1013-1016）。タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子のクローニングの報告の増加で、脱リン酸化の調節が細胞プロセスの制御において有し得る役割もより一層注目され始めた。２．２タンパク質チロシンホスファターゼ上に挙げたように、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）は、２つのサブグループ、つまり非受容体クラスと受容体クラスに分類することができる。非受容体クラスは、低分子量の細胞質ゾル性可溶性タンパク質から構成される。既知の全ての非受容体ＰＴＰアーゼは、約２３０アミノ酸残基の単一の保存された触媒性ホスファターゼドメインを含有する（例えば、Charbonneauら，1 989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5252-5256；Coolら，1989，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 86:5257-5261；Guanら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87 :1501-1502；Lombrosoら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:7242-7246を参照のこと）。配列分析により、この触媒性ドメインの約４０のアミノ酸が高度に保存され、そしてコンセンサス配列[I/V]HCXAGXXR[S/T]Gを有する１１アミノ酸残基の非常に高度に保存されたセグメントが、今日ではタンパク質チロシンホスファターゼ触媒性ドメインの特徴であると認識されている。受容体クラスは、ＲＰＴＰアーゼと呼ばれる高分子量の受容体連結ＰＴＰアーゼから構成されている。成長因子受容体と構造的に似ているので、ＲＰＴＰアーゼは、細胞外の推定上のリガンド結合性ドメイン、単一の膜貫通セグメント、及び細胞内触媒性ドメインからなる（Fischerら，1991，Science 253:401-406で検討された）。殆ど全てのＲＰＴＰアーゼのこれら細胞内セグメントは非常に類似している。これら細胞内セグメントは、約５８アミノ酸残基セグメントによって分けられた上記のタイプの２つの触媒性ホスファターゼドメインからなる。この２ドメインモチーフは、通常、膜貫通セグメントから約７８〜９５アミノ酸残基に位置しており、比較的短いカルボキシ末端アミノ酸配列がその後に続いている。唯一知られている例外は、アイソフォームＨＰＴＰβであり（Krueger，N.X．ら，1990，EMBO J．9:3241）、これはただ１つだけの触媒性ホスファターゼドメインを含有する。このＲＰＴＰアーゼの細胞内セグメントは、極めて高度に保存されているが、ＲＰＴＰアーゼ細胞外ドメインは、高度に分岐されている。例えば、一部のＲＰＴＰアーゼは、高度にグリコシル化された外部ドメインとシステインが豊富な保存領域を有する（Thomas，M.L．ら，1985，Cell 41:83；Thomas，M.L．ら，1987 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:5360；Ralph，S.J．ら，1987，EMBO J．6:12 51-1257）一方で、他のものは、フィブロネクチンIII型リピートに連結したイムノグロブリンＧ様（Ｉｇ）ドメインを含有する（Streuli，M．ら，1989，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 86:8698；Streuli，M．ら，1988，J．Exp．Med．168:152 3）。更に他のＲＰＴＰアーゼは、複数のフィブロネクチン III型リピートだけを含有する（Krueger，N.X．ら，1990，EMBO J．9:3241）一方で、一部のＲＰＴＰアーゼは、幾つかの潜在的グリコシル化部位を含有するより小さな外部ドメインを含有する（Jirik，F.R．ら，1990，FEBS Lett，273:239 ）。ＲＰＴＰを調節するリガンドは、同定されたことがない。循環性細胞外因子は、Ｉｇ及び／又はフィブロネクチンIII型リピートを含有する受容体に結合しそうもなく、そして他の表面抗原（おそらくは他の細胞上にあるもの）との相互作用が、より一層、これら受容体に係わるケースであると推測される。チロシンリン酸化の増進は、細胞の形質転換を起こす原因となることが分かっているので、タンパク質チロシンホスファターゼの発現低下又は不活性化は、可能性として、発癌をもたらし得る。この理由から、チロシン特異性ホスファターゼ遺伝子は、劣性オンコ遺伝子又は腫瘍抑圧遺伝子の候補である。この理論を支持して、ヒトＲＰＴＲアーゼ、つまりＲＰＴＰγが、腎細胞癌及び肺癌においてしばしば欠失している染色体領域、つまり３ｐ１４−２１にあることが分かっている（LaForgia，S．ら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5036-5040）。しかしながら、最近の研究は、タンパク質チロシンホスファターゼ機能は、単に抑圧性である必要はないことを示している。非受容体チロシンキナーゼのｓｒｃファミリーのメンバーが、カルボキシ末端尾部内に阻害性チロシンリン酸化部位を含有することが分かっている（Hunter，T.，1987，Cell 49:1-14により検討された）。これら部位がリン酸化されると、その分子のチロシンキナーゼ活性が阻害される（Nada，S．ら，1991，Nature 351:69-72）。更に、Ｔ細胞内では、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＣＤ４５）によるかかる阻害性部位の脱リン酸化が、チロシンリン酸化の増進を導くことが証明され（Ledbetter，J.A ．ら，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:8628-8632）、従って、ホスファターゼが活性化酵素として及び阻害性シグナリング酵素としても機能できることを示している。また、チロシン残基の脱リン酸化が、成熟化促進因子キナーゼの有糸分裂活性化における必須段階であることが示唆された（Morla，A.O．ら，１９８９，Cell 58:193-203）。合わせて考慮すると、上記観察は、ＰＴＰアーゼが、細胞制御機構において、膜貫通シグナリングの機構におけるエフェクターとして、細胞周期調節物質として、及び潜在的オンコ遺伝子及び抗オンコ遺伝子として、重要な役割を果たし得ることを示唆している。３．発明の要旨本発明は、新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子、この新規なクラスの受容体に結合するリガンドのファミリー、及びかかる受容体及びリガンドの用途に関する。具体的には、この新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子のメンバーは、プロテオグリカンであり、そして／又は細胞外の炭酸脱水酵素の構造ドメインを有する。かかる１つの受容体分子、つまりＲＰＴＰβの特徴付けが、ここに示した実施例に記載されている。本発明の受容体タンパク質チロシンホスファターゼに結合するリガンドは、細胞外分子の細胞接着分子（ＣＡＭ）ファミリーのメンバーである。ＣＡＭが受容体タンパク質チロシンホスファターゼに結合するという発見が、このタイプの受容体の天然リガンドの最初の同定を提示する。本発明の受容体タンパク質チロシンホスファターゼへの２つのＣＡＭ、即ち、Ｎ−ＣＡＭとＮｇ−ＣＡＭの結合をここに示した実施例で証明している。本発明の受容体及び受容体結合性リガンドを用いて、この受容体タンパク質チロシンホスファターゼの制御下の細胞プロセスを変調する化合物及び戦略を開発できる。かかるプロセスには、分化、代謝、細胞周期制御、及び神経細胞機能の如き正常細胞機能；ウィルス−受容体相互作用、炎症、癌性状態への細胞形質転換、及びII型インシュリン非依存性真性糖尿病の発生の如き異常又は潜在的に有害なプロセスに加えて、運動性及び接触阻害の如き細胞挙動が含まれるが、これらに限定されない。リガンド結合を妨害できる化合物が記載され、そしてＣＡＭ型リガンド、成長因子、又は細胞外マトリックス成分の如き他の潜在的リガンドを同定する方法が論じられる。４．図面の簡単な説明図１ＲＰＴＰβのアミノ酸配列。２３０８アミノ酸を含有するＲＰＴＰβのタンパク質配列を示している。疎水性シグナルペプチドに下線を付し、膜貫通ペプチドに下線を付し、そして膜貫通ペプチドを太字で明示してある。２１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を矢印で示してある。ＣＡＨ関連ドメイン及び２つのホスファターゼドメイン、つまりＤＩ及びＤIIをボックスにより示してある。図２ヒトＲＰＴＰβの染色体上の位置。Ａ．１７のげっ歯類−ヒトハイブリッドのパネル内におけるＲＰＴＰβ遺伝子の存在。十分に点刻したボックスは、左側縦列に名称を挙げたハイブリッドが上側横列に示した染色体を含有することを示し；右下半分に点刻したのは、上列に示した染色体の長腕（又は長腕の一部分、これはより小さな部分の点刻により示される）の存在を示し；左上半分に点刻したのは、上列に掲げた染色体の短腕（又は部分的短腕）の存在を示し；点刻していないボックスは、上列の染色体が存在しないことを示す；染色体７の縦列を太線で囲んでおり、この染色体の存在とＲＰＴＰβ遺伝子の存在との相関関係を際立たせるように点刻している。ハイブリッド内のＲＰＴＰβ配列の保持のパターンを右側に示してあり、そこでは、ハイブリッド内でのこの遺伝子の存在がプラス記号を有する点刻したボックスにより示され、そして遺伝子の不存在がマイナス記号を囲んだ点刻していないボックスにより示されている。Ｂ．７ｑ３１〜ｑ３３までのＲＰＴＰβ地図。正常ヒト分裂中期への１．８ｋｂＲＰＴＰβ ｃＤＮＡの染色体in situハイブリダイゼーションで、この遺伝子の７ｑへの局在が確認され、そして右側の染色体図に示した領域７ｑ３１．３〜７ｑ３２にかけて集中した染色部分のピークが明らかになった。各ドットは、オートラジオグラフィーの染色部分を表す。図３種々のマウス組織及び細胞系内でのＲＰＴＰβの発現の分析。Ａ．示した種々のマウス組織からのポリＡ＋ＲＮＡ（サンプル当たり１μｇ）を１．０％アガロース／２．２Ｍホルムアルデヒドゲルの上にのせ、前もって増幅したマウスＤＮＡ断片、つまりｐＢＳＭＢＤII（材料及び方法，第６.１.４節に説明されている）で釣り上げた。Ｂ．Ａ．のブロットからプローブを取り除いて³²Ｐ標識ラットアクチンプローブと再ハイブリダイズさせた。Ｃ．示した種々のグリア芽細胞腫及び神経芽細胞腫細胞系から単離した２０μｇの全細胞ＲＮＡ（レーン１〜５）及び１μｇのポリＡ＋ＲＮＡ（レーン６）をＲＮＡゲルの上にのせて、膜貫通領域のちょうど５’側の配列から始まって伸長しそしてホスファターゼドメインＩの全ての配列を包含する、ヒト脳幹ｃＤＮＡクローンから単離したＤＮＡ断片で釣り上げた。図４ＲＰＴＰβ転写産物の択一的スプライシングを同定するためのノーザンブロット。Ａ．完全長ＲＰＴＰβ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の概略図であって、そのタンパク質の細胞外領域内において２５８ｂｐの同一欠失を保持する２種の独立に単離されたｃＤＮＡクローンによりコードされる推定上のタンパク質と比較したもの。欠失の位置を点線により示し、その示した欠失の５ ’及び３’の両末端に残っているアミノ酸の番号を一緒に示している。ノーザン分析に用いた２つのプローブ（プローブ１及び２）の位置を示している。ＴＭ，膜貫通ペプチド；ＤＩ，ホスファターゼドメインＩ及びＤII，ホスファターゼドメインII。Ｂ．Ｌａｎ５神経芽細胞腫細胞系から単離したポリＡ＋ＲＮＡ（１μ ｇ）をＲＮＡホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてそのｃＤＮＡクローンの最５’末端から誘導した１．３ｋｂの配列を含有するヒトプローブ１（Ｐ１）及びクローンＢＳ−ｄ１４及びＣａｕ −ｄｌｌにおいて欠失された完全長ｃＤＮＡクローンの部分から誘導した１．６ｋｂの配列を含有するヒトプローブ２（Ｐ２）で釣り上げた。図５発達中の及び成体のマウス脳内のＲＰＴＰβのinsituハイブリダイゼーション分析。Ａ．胚発生２０日目（Ｅ２０）マウスによる矢状切片が、発達中の中枢神経系内でＲＰＴＰβが優先的に発現されることを示している。最高レベルの発現は、脳室ゾーン（ＶＺ）内で見られる。Ｂ．成体マウス脳による矢状切片が、小脳のプルキニエ細胞、歯状回（ＯＧ）、及び側脳室前角（ＡＨ）における発現の別個のバンドを示している。図６Ｌａｎ５細胞内での内因性ＲＰＴＰβタンパク質発現の同定。ツニカマイシンの不存在（レーン１及び２）又は存在（レーン３）下で標識した³⁵Ｓメチオニン標識Ｌａｎ５細胞の溶解産物からの正常ウサギ血清（ＮＲＳ，レーン１）及び免疫ＲＰＴＰβ抗血清（αＰＴＰβ，レーン２及び３）を用いるＲＰＴＰβ の免疫沈降。見掛け分子量は、ツニカマイシンの不存在下では約３００ｋＤで、存在下では約２５０ｋＤである。ツニカマイシンの不存在（レーン４）及び存在（レーン５）下で標識した³⁵Ｓメチオニン標識Ｌａｎ５細胞の溶解産物からのＲＫ２抗体（λａＥＧＦＲ，レーン４及び５）を用いるＥＧＦ受容体の免疫沈降。図７ＲＰＴＰβの細胞外領域内のＣＡＨ関連ドメインの同定。Ａ．ＲＰＴＰβのＣＡＨ関連ドメインのアミノ酸配列の、ＲＰＴＰγの対応するドメイン及びＣＡＨの異なる６アイソフォームとの整列化（Deutsch，H.F.，1 987，Int．J．Biochem．19:101-113）。黒色のボックスで囲んだアミノ酸配列は、ＣＡＨの全６アイソフォームにおいて同一のアミノ酸配列である。灰色の線のボックスで囲んだ配列は、ＲＰＴＰβ及びＲＰＴＰγのＣＡＨ関連ドメインの間で同一の配列である。Ｂ．プログラムを用いてアミノ酸の保存的置換を考慮した、ＲＰＴＰβ及びＲＰＴＰγのＣＡＨ関連ドメイン及びＣＡＨの６アイソフォーム間の類似性（％）がこの格子中に示されている。図８ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン１）又は対照、つまりベクターだけでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン２）³⁵Ｓ−ＮａＳＯ₄標識細胞溶解産物を用いる、免疫沈降のポリアクリルアミドゲル。用いた抗血清は、第６.１.５節に記載するように、ＲＰＴＰβに対して誘導されたものである。図９ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン１）又は対照、つまりベクターだけでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン２）³⁵Ｓ−Ｍｅｔ標識細胞溶解産物を用いる、免疫沈降のポリアクリルアミドゲル。用いた抗血清は、第６．１．５節に記載するように、ＲＰＴＰβに対して誘導されたものである。図１０ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン３及び４）又は対照、つまりベクターだけでトランスフェクトした２９３細胞からの（レーン１及び２）³⁵Ｓ−Ｍｅｔ標識細胞溶解産物を用いる、免疫沈降のポリアクリルアミドゲル。レーン２及び４は、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理した溶解産物に該当し、１及び３は、未処理溶解産物に該当する。用いた抗血清は、第６．１．５節に記載するように、ＲＰＴＰβに対して誘導されたものである。図１１Ｎｇ−ＣＡＭ−コバスフィア（Covasphere）の凝集へのプロテオグリカン３Ｆ８の作用。（Ａ）１０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、（Ｂ）３０μｇ／ｍｌ３Ｆ８プロテオグリカン、の存在下で２５℃で２時間インキュベーションした後に緑色蛍光を発生しているＮｇ−ＣＡＭ−コバスフィア。コバスフィアは、蛍光用に装備されたニコン・ダイヤフォト顕微鏡を用いて可視化し、Ｎ２０００カメラを用いて写真撮影した。図１２３Ｆ８によるＮｇ−ＣＡＭ−コバスフィア凝集の阻害。Ｎｇ−ＣＡＭで被覆したコバスフィアの超臨界（superthreshold）凝集塊の出現を２時間後にコールター（Coulter）カウンターを用いて測定した。Ｎｇ−コバスフィアの６ μｌサンプルを６０ｐｌＰＢＳの最終容量になるように、７日目の脳から得られた種々の濃度の天然３Ｆ８プロテオグリカン（ＰＧ，実線）及びコンドロイチナーゼ処理３Ｆ８プロテオグリカンコア（Ｃｈアーゼ，破線）の存在下で混合した。データは、検出された超臨界凝集塊の対照レベルの％の平均値（Ｎ＝３）±標準誤差を表す。対照サンプル中の超臨界粒子の平均レベルは、３２，５８２±７８８であった。図１３コンドロイチナーゼ処理３Ｆ８によるＮ−ＣＡＭ−コバスフィア凝集の阻害（円）。Ｎ−ＣＡＭで被覆したコバスフィアの超臨界凝集塊の出現を２時間後に測定した。コンドロイチナーゼ処理３Ｆ８を用いた。データは、検出された超臨界凝集塊の対照レベルの％の平均値（Ｎ＝３）を表す。対照サンプル中の超臨界粒子の平均レベルは、１９，９９３＋／−２，１９０であった。図１４ラット３Ｆ８及びヒトＲＰＴＰβタンパク質中に含まれる炭酸脱水酵素ドメインのアミノ酸配列の比較。上の配列はＲＰＴＰβ配列を表し、下のラインは３Ｆ８配列を表す。５．発明の詳細な説明本発明は、そのメンバーがプロテオグリカンであり及び／又は細胞外炭酸脱水酵素構造ドメインを有する新規なクラスの受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子を包含する。加えて、この新規なクラスの受容体に結合して、そのリガンドとして働く細胞外分子、つまり細胞接着分子（ＣＡＭ）のファミリーも記載されている。ＣＡＭが受容体タンパク質チロシンホスファターゼに結合するという発見は、このタイプの受容体の天然リガンドの最初の同定に相当する。本発明の受容体タンパク質チロシンホスファターゼへの２つのＣＡＭ、即ち、Ｎ−ＣＡＭとＮｇ−ＣＡＭの結合をここに示した実施例で証明している。本発明の受容体及び受容体結合性リガンドの幾つかの用途も本発明内に包含される。簡単に説明すると、この受容体及びこれら受容体結合性リガンドを用いて、この受容体タンパク質チロシンホスファターゼの制御下で細胞プロセスを変調する化合物及び戦略を開発できる。かかるプロセスには、分化、代謝、細胞周期制御、及び神経細胞機能の如き正常細胞機能；ウィルス−受容体相互作用、炎症、癌性状態への細胞形質転換、及びII型インシュリン非依存性真性糖尿病の発生の如き異常又は潜在的に有害なプロセスに加えて、運動性、接触阻害及びシグナル伝達の如き細胞挙動が含まれるが、これらに限定されない。リガンド結合を妨害できる化合物が記載され、そしてＣＡＭ型リガンド、成長因子、又は細胞外マトリックス成分の如き他の潜在的リガンドを同定する方法が議論されている。最後に、この新規なＲＰＴＰアーゼファミリーの分子の１つのメンバー、つまりＲＰＴＰβの特徴を明らかにし、そしてＣＡＭファミリーの２つのメンバー、つまりＮ−ＣＡＭとＮｇ−ＣＡＭがこの新規なＲＰＴＰアーゼクラスの受容体に結合することを示す実施例が示されている。５．１ＲＰＴＰアーゼプロテオグリカンである本発明のＲＰＴＰアーゼは、このＲＰＴＰアーゼタンパク質コアに共有結合したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖（グリカン類）から構成される高分子で修飾されていてもよい。ＧＡＧ成分は、ヘキソサミン（Ｄ −グルコサミン（ＧｌｃＮ）又はＤ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ））の如き単位からなっていてもよく、そしてヘキスロン酸（ＨｅｘＡ；Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）又はＬ−イズロン酸（ＩｄｏＡ））又は交互非分枝状配列に配置され、種々の位置に硫酸置換基を保持するガラクトース単位（ケラチン硫酸におけるようなもの）のいずれかからなっていてもよい。ＲＰＴＰアーゼ分子のグリカン主鎖には、（ＨｅｘＡ−ＧａｌＮ）_n、（ＨｅＸＡ−ＧＩＣＮ）_n、又は（Ｇａｌ− ＧｌｃＮ）_nジサッカライド単位から構成される基本的構造が含まれるが、これらに限定されない。これら構造は、ＲＰＴＰアーゼ修飾の基本的構造を含むが、かかる修飾も、個々のポリサッカライド鎖内並びにポリサッカライド鎖間に顕著な異質性を含んでいてもよい。かかる異質性は、ＧＡＧ生合成のメカニズムの考えられる副産物であり、そしてその鎖に沿った硫酸置換の差異及び１つの単位のもう１つの単位への（例えば、ＧｌｃＡからＩｄｏＡへの）エピ化が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも１つのグリカン鎖が、各プロテオグリカンＲＰＴＰアーゼのタンパク質コアに結合していなければならない。グリカン鎖は、配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙのセリン（Ｓｅｒ）アミノ酸残基でタンパク質コアに結合してもよいが、そうすることを要求されはしない。ここで、Ｇｌｙはグリシンアミノ酸残基であり、Ｘはあらゆるアミノ酸残基である。本発明のＲＰＴＰアーゼクラスのメンバーには、既知の炭酸脱水酵素アイソフォームと類似性を有するアミノ酸の細胞外伸長部分が含まれる（Deutsch，H.F. ，1987，Int．J．Biochem．19:101-113）。かかる配列は、炭酸脱水酵素活性を有しなくてもよい。１又は２以上の完全な又は部分的炭酸脱水酵素モチーフが、単一のＲＰＴＰアーゼ分子上に存在していてもよい。類似性のあるＣＡＨ領域内には、アミノ酸置換、並びに既知のＣＡＨアイソフォームから逸れる短いアミノ酸欠失、及び／又は短いアミノ酸付加が存在していてもよい。かかる逸脱性配列は、ＣＡＨへの全体的なアミノ酸配列類似性が少なくとも約２５％維持されており及び／又は第三構造若しくはそのドメインがＣＡＨのものと類似したままである限り許容できる。６節における実施例に示したものは、この新規なクラスのＲＰＴＰアーゼ分子の１メンバー、つまりＲＰＴＰβの特徴付けである。この実施例では、ＲＰＴＰ βが、ＣＡＨ様ドメインを含有するだけでなく、プロテオグリカンでもあることが示されている。５．２ＲＰＴＰアーゼリガンド本発明の受容体の好ましいリガンドとして働く分子は、細胞接着分子（ＣＡＭ）である。かかる分子には、Ｃａ²⁺非依存性ＣＡＭのクラスのあらゆるメンバー、Ｃａ²⁺依存性ＣＡＭであるカドヘリン類、及びＣａ²⁺又はＭｇ²⁺依存性ＣＡＭであるインテグリン類が含まれるが、これらに限定されない。Ｃａ²⁺非依存性ＣＡＭには、Ｎ−ＣＡＭファミリー、Ｎｇ−ＣＡＭ、Ｌ１、Ｊ１、ファシクリン（Fasciclin）III、及びＭＡＧ分子のような分子が含まれる。カドヘリン類には、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｌ−ＣＡＭ、Ｂ−カドヘリン、及びＴ−カドヘリンのような分子が含まれる。７節に示す実施例で証明されるように、ＣＡＭファミリーの分子の２つメンバー、つまりＮ−ＣＡＭとＮｇ−ＣＡＭは、この発明に記載したＲＰＴＰアーゼクラスの分子のメンバーに結合する。かつて、受容体ホスファターゼは、それらの幾つかがＣＡＭを象徴するＩｇＧ様又はフィブロネクチンIII型繰り返し体の如きモチーフを含有するので、それら自体が細胞接着分子として機能すると推測された。加えて、ＣＡＭは同種（“ 様”分子）結合を受けることが知られているので、ＩｇＧ及びフィブロネクチンモチーフを有するＲＰＴＰアーゼは同種相互作用も受けることが提案されていた。しかしながら、ＩｇＧ様及びフィブロネクチンモチーフは、同種相互作用を受けない多くの表面受容体及びタンパク質に見出されることは注目に値する。この提案とは反対に、ここに記載した６節の実施例は、ＣＡＭが、ＩｇＧ様モチーフもフィブロネクチンIII型モチーフも含有しないこの発明のＲＰＴＰアーゼ分子のリガンドとして働くことを証明している。かくして、ペプチドドメイン類似性が存在しなくても、これまで相互作用が起こると予測されたことがないこの発明に開示したＲＰＴＰアーゼクラスの分子とＣＡＭとの間に、リガンド／受容体相互作用が実際に起こるのである。本発明のリガンドは、膜貫通タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール結合膜タンパク質、又は分泌されたタンパク質であってもよい。この発明のリガンドを構成する分子は、１又は２以上のＩｇ（イムノグロブリン）ドメイン（Williams，A.F.，1987，Immunol．Today 8:298-303）、１又は２以上のフィブロネクチンIII型ドメイン（Hynes，R.O.，1990，Fibronectins，Springer-Verla g，New York）、及び／又は１又は２以上のエクトドメイン（Takeichi，M.，199 1，Science 251:1451-1455）を含むがこれらに限定されない１又は２以上のペプチドドメインを含有してもよい。Ｉｇドメインは、イムノグロブリン定常部及び可変部の両方と特徴を共有してもよい。かかる特徴には、互いにジスルフィド結合を形成する約６０アミノ酸の間隔を隔てたシステイン残基の対が含まれる。分子は、配列ＤＲＥ、ＤＸＮＤＮ、ＤＸＤ、ＤＶＮＥ、ＤＸＥ、及び／又はＤＰＤの１又は複数のアミノ酸の繰り返しを示してもよい。これら分子が膜貫通タンパク質であるなら、かかる配列はその分子の細胞外部分に存在すべきである。この発明のＲＰＴＰアーゼ分子はプロテオグリカンであり得るので、幾つかの他の非ＣＡＭ様リガンドが存在してもよい。例えば、ビトロネクチン、フィブロネクチン、及びラミニンの如きかかる細胞外マトリックス分子は、一定のプロテオグリカンのＧＡＧに結合することが知られている。また、線維芽細胞成長因子、及びシュワン細胞成長因子の如き成長因子も、プロテオグリカンＧＡＧ鎖に対する親和性を有することが証明されている。従って、細胞外マトリックス分子及び成長因子を含むがこれらに限定されない分子は、この発明中に示されるＲＰＴＰアーゼクラスの分子の潜在的なリガンドである。５．３ＲＰＴＰアーゼリガンドの用途及び投与個々の分子に依存して、ＲＰＴＰアーゼ分子のあるものは、リガンド結合で活性になることができ、そしてあるものは不活性になることができる（ここで言及される活性はＲＰＴＰアーゼのホスファターゼ活性である）。ＲＰＴＰアーゼ分子へのリガンド結合は、種々の細胞プロセスに影響を及ぼし得る。かかるプロセスには、分化、代謝、細胞周期制御、及び神経細胞機能の如き正常細胞機能；ウィルス−受容体相互作用、炎症、癌性状態への細胞形質転換、及びII型インシュリン非依存性真性糖尿病の発生の如き異常又は潜在的に有害なプロセスに加えて、運動性及び接触阻害の如き細胞挙動が含まれるが、これらに限定されない。ＲＰＴＰアーゼ／ＣＡＭ結合は、ＲＰＴＰアーゼ提示細胞（exhibitingcell）内で上に挙げたプロセスへの作用を発揮することができる。加えて、ＣＡＭは細胞表面タンパク質であることが多いので、ＲＰＴＰアーゼ／ＣＡＭ結合は、ＣＡＭ提示細胞への作用を引き出すことができる。また、ＲＰＴＰアーゼは、例えば、ＣＡＭリン酸化／脱リン酸化反応を介し、ＣＡＭリガンドそれ自体への作用を直接発揮することによって、かかる細胞プロセスの制御に寄与することができる。本発明の受容体及び受容体結合性リガンドは、ＲＰＴＰアーゼの制御下の細胞プロセスを変調することができる薬品として用いることができる。加えて、ＲＰＴＰアーゼ活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法が以下に示され、そしてかかる化合物も、上に挙げた１又は２以上の細胞プロセスを変調することができる薬品として用いることができる。これら受容体又はそれらのリガンドを直接に用いて、上に挙げた如きプロセスを変調することができる。例えば、利用可能なリガンドの内因性膜貫通受容体分子と競合し、かくして内因性ＲＰＴＰアーゼへのリガンド結合を減少又は阻害するように働き得る可溶性ＲＰＴＰアーゼを、当業者にとって周知の技術を用いて投与することができる。そのような操作の作用は、膜貫通ＲＰＴＰアーゼへのリガンド結合により、その細胞（ＲＰＴＰアーゼ提示細胞又はＣＡＭ提示細胞のいずれか）内に正常に伝達されるシグナルを活性化、減少又は遮断するものであろう。ここで用いられるＲＰＴＰアーゼは、その全縁分子、さもなければ、そのＲＰＴＰアーゼ細胞外ドメインだけ、又はそのＲＰＴＰアーゼ細胞外ドメインの一部分を含むことができる。加えて、やはり、当業者にとって周知の技術を用いて、リガンドを投与することができる。かかる投与は、正常よりも大きな数の、リガンドにより結合される膜貫通ＲＰＴＰアーゼをもたらし、これはＲＰＴＰアーゼを提示する細胞内でリガンド結合状態の増幅を潜在的に起こすであろう。また、投与されるリガンドは、受容体結合は依然として起こるが、かかる結合の正常な結果（場合次第で、受容体活性化又は不活性化）が生じないようにした前記リガンドの修飾型から構成されてもよい。そのようなデザインを有するリガンドは、可溶性ＲＰＴＰアーゼの投与と、機能的に結合したＲＰＴＰアーゼ膜貫通分子の数を少なくし、従って膜貫通ＲＰＴＰアーゼへの正常リガンド結合を介してＲＰＴＰアーゼ提示細胞の中に伝達される正常細胞外シグナルを低下させるか又は遮断する最終的作用を両操作が有する点で、たいそう同じように作用するであろう。ＣＡＭリガンド提示細胞への作用も、結合される内因性ＣＡＭリガンドの総数がより低下し、従ってかかるＣＡＭ提示細胞へのＲＰＴＰアーゼ結合の作用が低下するか又は遮断される点で、同じであろう。治療される具体的状態に依り、作用薬を全身的にも局所的にも製剤化し及び投与することができる。製剤化及び投与のための技術は、“Remington's Pharmace utical Sciences,”MackPublishing Co.，Easton，PA，latest editionに見出すことができる。適するルートには、僅かばかりの名を挙げると、経口、直腸、経粘膜、又は腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、並びに鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む腸管外送達が含まれる。注射用には、本発明の作用薬を水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、又は生理食塩緩衝液の如き生理学的に適合性の緩衝液中に配合することができる。かかる経粘膜投与用には、透過されるバリヤーに適する透過剤を製剤中に用いる。かかる透過剤は、当該技術分野において広く知られている。ＲＰＴＰアーゼ及び／又はそれらのリガンドは、上記した如き細胞プロセスの活性を変調するよう働くことができる更なる分子をスクリーニングするのに用いることもできる。例えば、ＲＰＴＰアーゼ分子に結合する化合物を同定することができる。かかるＲＰＴＰアーゼ結合性分子の単離を行う１の方法は、アガロース又はプラスチックビーズの如き固体マトリックス、マイクロタイターウェル、又はペトリ皿にＲＰＴＰアーゼ分子を付着させ、続いて付着ＲＰＴＰアーゼ分子を１は複数の潜在的ＲＰＴＰアーゼ結合性化合物の存在下でインキュベーションすること含むだろう。インキュベーション後、未結合化合物を洗い落とし、そしてＲＰＴＰ結合化合物を回収する。この操作において、多数のタイプの分子を、ＲＰＴＰアーゼ結合活性について同時にスクリーニングすることができる。結合した分子は、例えば、過剰のリガンドの添加でＲＰＴＰアーゼ分子からそれらを競い落とすことによって、ＲＰＴＰアーゼ分子から溶離できるであろう。ＲＰＴＰアーゼ分子のホスファターゼ活性への化合物の作用も確認することができる。そのような化合物は、例えば、上記の結合法の如き操作を用いて単離されたものであってもよい。ＲＰＴＰアーゼホスファターゼ活性への化合物の作用を確認するのに用いることができる１つ方法は、本発明のＲＰＴＰアーゼを発現する培養細胞の試料にそのような化合物を曝し、続いてその培養物のホスファターゼ活性を測定することを含むであろう。興味の対象である化合物を、例えば、その化合物を組織培養培地に添加することによって、細胞に伝達することができる。この組織培養試料内の細胞のホスファターゼ活性は、当該技術分野で周知の方法を用いて、その培養物内の細胞ホスホチロシンのレベルを測定することによって確認することができる（Honnegerら，1987，Cell 51:199-209；Margolisら，1989，Cell 57:1101-1107）。化合物の添加の作用を正しく確認するためには、この化合物に曝されていない同タイプの組織培養試料の細胞ホスホチロシンのレベルも測定し、次いでそれら２つのレベルを比較しなければならない。例えば、ＲＰＴＰアーゼをアフィニティカラムを含むがそれらに限定されない装置の中に入れて、前記装置に適用することによって、多数の分子を即座にスクリーニングできるようにしてもよい。ＲＰＴＰアーゼに対する親和性を有する分子は結合するであろう。かかる結合は、興味の対象である分子の部分精製もなすであろう。この精製工程を続けるためには、例えば、過剰のリガンドでＲＰＴＰアーゼからそれらを競い落とすことによって、結合した分子を上記装置から溶離させて、興味の対象である分子が必要な程度まで精製されるまで、この工程を繰り返すべきである。６．実施例：受容体タンパク質チロシンホスファターゼＲＰＴＰβ 以下の分節に、ヒト受容体タンパク質チロシンホスファターゼ分子ＲＰＴＰβ の特徴付けを記述する。このＲＰＴＰβは、細胞外炭酸脱水酵素ドメインを含有すること、およびプロテオグリカンであることが示される。さらに、ＲＰＴＰβ のｍＲＮＡおよびタンパク質は、主として脳組織において発現されることが示される。６．１材料および方法６．１．１ｃＤＮＡクローンの単離およびＤＮＡ配列分析ＲＰＴＰβのコード配列の一部分を含有するｃＤＮＡクローンは、λｇｔｌｌヒト幼児脳幹ｃＤＮＡライブラリーを低下させたストリンジェンシーの反応条件下で、両方のホスファターゼドメインを含むニックトランスレーションされたＬＣＡプローブを用いてスクリーニングした後、単離した（Kaplan，R.ら、1990， Poc．Natl．Acad．Sci．USA 87:7000-7004）。この遺伝子の５’末端が元のクローンには存在しなかったため、元のクローンの５’末端から作成したＤＮＡ断片を用いて、上記ライブラリーを再度スクリーニングした。プローブをランダムプライム法を用いて³²ＰｄＣＴＰで標識し（USB）、ハイブリダイゼーションを中位のストリンジェント条件下で４２℃で、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＬｐＨ７．６、１Ｘ Denhardt溶液、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの剪断された変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で実施した。ハイブリダイゼーション後、ファージフィルターを３回、２０分間、５０℃で、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液で洗浄し、次にオートラジオグラフィーにかけた。脳幹ライブラリーを合計３回、ＲＰＴＰβ の完全なコード配列を含む重なり合うｃＤＮＡクローンを単離するために再スクリーニングした。プラーク精製された陽性組換え体由来のｃＤＮＡ挿入配列をプラスミドベクターBlue Script（Stratagene）にサブクローン化し、Sequenase version 2.0キット（USB）を用いたジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定した。６．１．２染色体上の位置この研究に使用した親および体細胞ハイブリッドの単離、増殖ならびに特徴付けは、すでに記載されている（Durst，M.ら、1987，Proc．Nati．Acad．Sci．US A 84:1070-1074）。特定のヒト染色体または染色体領域の存在が、特定の染色体領域に位置が定められている遺伝子のためのプローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションによって確認されている。図２Ａは、使用したほとんどのハイブリッドに保持されていた染色体または染色体部分を図示する。染色体in situハイブリダイゼーションを以前に記載されたように実施した（C annizzano，L.A.ら、19991，Cancer Res．51:3818-3820）。正常なオス（４６ＸＹ）末梢血リンパ球由来の中期染色体を含有するスライドを、４℃で７〜１０日間加齢し、リボヌクレアーゼＡ（Sigma）を用いて３７℃で１時間前処理した。染色体ＤＮＡを、５０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣおよび１０％デキストラン硫酸を含有するハイブリダイゼーション混合物（ｐＨ７．０）で変性した。ハイブリダイゼーションを３７℃で一晩実施した。３９℃で、５０％ホルムアミドおよび２ＸＳＳＣを３回交換し、次に２ＸＳＳＣを５回交換して洗浄した後、スライドを脱水し、風乾して、オートラジオグラフィーにかけ、１〜３部のｐＨ９．２のホウ酸緩衝液と混合したライトーギムザ染色液でバンドに現した（ Cannizzano，L.A.ら、1991，Cancer Res. 51:3818-3820）。６．１．３ヒトＲＰＴＰβと相同的なマウス配列の単離保存されたホスファターゼドメインＩＩの２つのオリゴヌクレオチドを、ヒトＲＰＴＰβのヌクレオチド配列にしたがって合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、Clonetech（PaloAlto，CA）より購入したマウス脳ｃＤＮＡライブラリー由来のファージＤＮＡと一緒に、相同的マウスＲＰＴＰβ配列を増幅するための、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を用いたポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に使用した。増幅された産物を精製し、Blue Script プラスミドベクター（Stratagene，La Jolla，CA）にクローン化した。上に記述したＤＮＡ配列分析によって相同性が確認された。このサブクローン化した断片を、今後ｐＢＳＭＢＤＩＩと称する。６．１．４ノーザン分析全細胞ＲＮＡを、Stratagene RNA単離キットを用いて調製した。ポリＡ⁺ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー（Stratagege ）を用いてさらに選択した。ノーザン分析のため、ＲＮＡを１．０％アガロース／２．２Ｍホルムアルデヒドのゲルで分離し、毛細管現象によりナイロン膜（Sc heicher and Schuell）に移した。この膜をプレハイブリダイゼーションし、次に０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡの緩衝液を用いてハイブリダイゼーションを行い、４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２、１％ＳＤＳ）１ｍＭＥＤＴＡで６５℃ で洗浄した。種々のマウス組織より単離されたＲＮＡを含有するブロットに対し、ｐＢＳＭＢＤＩＩを鋳型として使用してランダムプライム標識化反応（USB）により³²Ｐ−標識化プローブを作成した。ヒトグリア芽細胞腫および神経芽細胞腫ＲＮＡブロットを、複数のヒトＲＰＴＰβ ｃＤＮＡクローンの異なる部分から単離した標識化制限断片を用いて釣り上げた。６．１．５抗体ヒトＲＰＴＰβのカルボキシ末端１５アミノ酸から誘導されるペプチドを以前に刊行された手順にしたがって合成し、キーホールリンペットヘモシアニンに結合した（Harlow，E．およびLane，D.，1988，Antibodies:A Laboratory Mannual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp．77-88 ）。これを免疫原として２匹のウサギに接種し、ＲＰＴＰβに対するポリクローナル抗血清を産生させた。抗ＥＧＦ受容体免疫沈降を、グリコシル化または非グリコシル化形態のＥＧＦ受容体を認識するＲＫ２抗体を用いて実施した（Kris，R.M.ら、1985，Ce ll 40:619-625）。６．１．６細胞標識化および免疫沈降ヒト神経芽細胞腫細胞系（Lan ５）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ツニカマイシンによる細胞処理は、³⁵Ｓ−メチオニン標識に先立って、培養物を１０μｇ／ｍＬツニカマイシン（Sigma）と共に１時間インキュベートすることを含んでいた。処理済細胞および未処理細胞をメチオニンを含まないＤＭＥＭで２回洗浄し、次に０．１５ｍＣｉ／ｍＬの³⁵Ｓ−メチオニン（New England Nuclearより購入）を用いて、メチオニンを含まず１％の透析したＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で４時間標識した。この標識期間に、１０μＧ／ｍＬツニカマイシンを処理済細胞の培地に添加した。次に細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、Ｈｅｐｅｓ（Ｎ− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン−スルホン酸）ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１０％グリセロール、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭエチレングリコール−ビス（Ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ｍＬあたり1０μｇのロイペプチン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、およびｍＬあたり１０μｇのアプロチニンを含有する溶解緩衝液中で溶解した。³⁵ Ｓ−ＮａＳＯ₄標識については、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、この時に標識混合物を添加した（ＮＥＸ−０４１Ｈ培地プラス１０％ウシ血清、ゲンタマイシン、および２００μＣｉ／ｍＬの³⁵Ｓ−ＮａＳＯ₄）。細胞を２０時間標識し、ＰＢＳで２回洗浄し、上記のように溶解した。細胞溶解物を澄明化し、次に免疫沈降させた。³⁵Ｓ−メチオニン標識化培養物由来の溶解物を、正常ウサギ抗血清、抗ＲＰＴＰβ抗血清、またはＲＫ２抗血清を用いて２時間４℃で免疫沈降させた。³⁵ Ｓ−ＮａＳＯ₄標識化培養物由来の溶解物は、前澄明化を行なわず、抗ＲＰＴＰβ抗血清を用いて２時間４℃で免疫沈降させた。次に、免疫複合体をプロテインＡ Sepharose（Sigma）を用いて４５分間４℃で免疫沈降させ、ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１ｐＨ７．６、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．０％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ）で１０回洗浄した。免疫沈降した物質をＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲル（³⁵Ｓ−メチオニンには７．５％、³⁵Ｓ−ＮａＳＯ₄には５％）で分析し、フルオログラフィーにかけた。６．１．７ In situハイブリダイゼーション分析新鮮な冷凍組織を、クリオスタットを用いて厚さ２０μｍの切片に切り、ゼラチンを塗布したスライド上に解凍固定した。切片を、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶かした４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、各回につき５分間０．１Ｍリン酸ナトリウムで３回洗浄し、また２ＸＳＳＣで１回１０分間洗浄した。このハイブリダイゼーション分析に使用したプローブは、ホスファターゼドメインＩＩのＲＰＴＰ β ｍＲＮＡの一部分に相補的な４９塩基オリゴヌクレオチドであった。このオリゴヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Boehri nger Mannheim）を用いて〔α−³⁵Ｓ〕ｄＡＴＰ（NEN Dupont）で標識し、Sepha dex G25クイックスピンカラム（Boerhringer mannheim）を用いて精製した。標識化プローブの比活性は、５ｘ１０³から１ｘ１０⁹ｃｐｍ／μｇの間であった。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、５０％脱イオン化ホルムアミド、４ＸＳＳＣ、１Ｘ Denhardt溶液、５００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、２５０μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡおよび１０％デキストラン硫酸を含有する緩衝液中で実施した。組織を１２時間４５℃で、標識化プローブ（１ｘ１０⁶ｃｐｍ／切片）および１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートした。特異性についての対照は、隣接切片を用いて、標識化オリゴヌクレオチドを３０倍濃度の適切な非標識化オリゴヌクレオチドで希釈し、センスプローブでハイブリダイズすることにより実施した。ハイブリダイゼーション後、切片を２ＸＳＳＣを２回交換して室温で１時間、１ＸＳＳＣを用いて５５℃で３０分間、０．５ＸＳＳＣを用いて５５℃で３０分間、０．５ＸＳＳＣを用いて室温で１５分間洗浄し、６０％、８０％および１００％エタノールで脱水した。風乾後、切片をＸ線フィルムに５〜１０日間暴露した。６．２結果６．２．１ＲＰＴＰβの１次アミノ酸配列４個の重なり合うｃＤＮＡクローンを、ＲＰＴＰβの完全なコード配列を含有するヒト脳幹ライブラリーより単離した。そのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列より推論される１次アミノ酸配列を図１に示す。ＲＰＴＰβは高分子量の、膜貫通クラスのチロシンホスファターゼに属し、２３０８アミノ酸によってコードされる。そのタンパク質はシグナルペプチド（図１で下線を引いた部分）を含有し、その後に２１個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（矢印で示した部分）を含有する１６３６アミノ酸からなる長い細胞外ドメインが続いている。疎水性膜貫通ペプチド（太字の配列）が、タンパク質の細胞外部分を、２個のタンデムに（ tandemly）繰り返されかつ保存されたホスファターゼドメイン（ＤＩおよびＤＩＩと称する）に連結している。６．２．２ヒトＲＰＴＰβの染色体上の位置ヒトＲＰＴＰβ遺伝子の染色体上の位置は、最初、明確に定められたヒト染色体または染色体領域を持つ鰯歯動物−ヒトハイブリッドのパネル（panel）を使用して決定された。１７個の齧歯動物−ヒトハイブリッド由来の、完全なヒトゲノムを表すヒト染色体領域の重なり合うサブセットを持つＤＮＡ（図２Ａ参照）を、ＥｃｏＲＩで開裂し、電気泳動にかけ、フィルターに移し、放射性標識化ヒトＲＰＴＰβプローブにハイブリダイズさせた。結果は図２Ａに要約されている。この図では、ヒト染色体７の存在が分かる。ＲＰＴＰβ遺伝子のより正確な位置が、正常なヒトリンパ球の中期染色体への染色体in sitハイブリダイゼーションにより決定された。この技法は、ＲＰＴＰ β遺伝子を７ｑ３１〜３３に、最も可能性のある位置として７ｑ３１．３〜７ｑ３２に位置づける。この位置は、図２Ｂの染色体７のスケッチの右側に図式的に示されている。６．２．３ノーザンブロット分析種々のマウス組織ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析を、ＲＰＴＰ βの組織特異的発現を確認するために実施した。この分析に使用したプローブは、ポリメラーゼチェーンリアクション法（「材料および方法」参照）により増幅された、ドメインＩＩの１３５アミノ酸をコードする４０５ヌクレオチドを含有する、ＲＰＴＰβのマウス相同体の一部分であった。ヒトｃＤＮＡクローンの対応領域とのヌクレオチド配列の比較に基づくと、マウスおよびヒトクローンは、ＲＰＴＰβのドメインＩＩのこの領域においてヌクレオチドレベルで、８８％同一である。このノーザン分析の結果（図３Ａ参照）は、それぞれ８．８および６．４ｋｂの２個の主要転写物の存在を示す。９．４ｋｂより大きいマイナーな転写物が時々観察され、これは高度に関連したホスファターゼとの交差反応を示すものかもしれない。両方の転写物は脳組織に限定され、他の組織には検出されなかった。大部分の組織にＲＰＴＰβの発現がないことは、ＲＮＡの分解によるものではない。なぜなら、無傷なアクチン転写物の存在が同じブロットを使用して観察されたからである（図３Ｂ参照）。ＲＰＴＰβの発現は脳組織に限定されたので、異なるヒトグリア芽細胞腫細胞系およびヒト神経芽細胞腫細胞系（Lan ５）におけるこのホスファターゼの発現を調べた。ヒトＲＰＴＰβプローブは、それぞれ８．８、７．５および６．４ｋｂの３個の主要転写物とハイブリッドを形成した（図３Ｃ参照）。これらの転写物は、Lan 5神経芽細胞腫細胞系から単離されたＲＮＡにのみ検出され、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの臭化エチジウム染色により測定された同量の全細胞ＲＮＡを負荷しても、４つのグリア芽細胞腫細胞系から単離されたＲＮＡには存在しなかった。上記の８．８および６．４ｋｂの転写物は、マウス脳組織より単離されたＲＮＡに観察される２つの転写物（図３Ａ参照）と大きさが等しかった。Lan５ＲＮＡにおける３つの転写物の存在は、この分析に使用したプローブが保存されたホスファターゼドメインＩの配列より誘導されたものであるため、他の高度に関連するホスファターゼとの交差ハイブリダイゼーションによるものかもしれなかった。または、別個にスプライシングされたＲＰＴＰβ転写物によるものかもしれなかった。この３つのＲＰＴＰβ転写物の性質についてさらに洞察を得るため、ヒトｃＤＮＡクローンの５’ 末端部分から単離したプローブを用いてLan５細胞から単離したＲＮＡについて、同様のノーザン分析を実施した。使用したプローブは、ＲＰＴＰβに独特の、細胞外ドメインの配列から誘導された。この分析は、図３Ｃで観察されるものと同一のハイブリダイゼーションパターンを示した。これらの結果は、３つの別個の転写物が、別個にスプライシングされたｍＲＮＡの産物であることを示唆している。６．２．４ＲＰＴＰβの変異形の同定重なり合うヒトｃＤＮＡクローンは、全体として、８．１ｋｂより大きいコードおよび非コード配列を含有しており、長さ８．８ｋｂの最長転写物を表しているようである。ヒト脳幹ライブラリーおよび別のヒト尾状核ライブラリー（Stra tagege）をスクリ−ニングした際、BsdllおよびCaudllと呼ばれる２つの独立したｃＤＮＡクローンが単離された。これらはそれぞれ、ＲＰＴＰβの細胞外ドメインから２５８１ヌクレオチドの等しい欠失を有した。この欠失は終止コドンを導入したり、またはＲＰＴＰβのオープンリーディングフレームを中断したりせず、図４Ａに示すようにアミノ酸７５４をアミノ酸１６１５に連結した。これらの欠失したクローンは、膜貫通ペプチドおよび２つのホスファターゼドメインをコードする配列に加えて、ＲＰＴＰβ遺伝子の同一の５’および３’最末端を保持していた。欠失したクローンに対応する転写物は、欠失のない全長クローンに対応する転写物より約２．６ｋｂだけ小さいであろう。図３Ｃに示すように、長さ８．８ｋｂの最長転写物より約２．４ｋｂ小さい、６．４ｋｂの転写物がある。この６．４ｋｂ転写物が欠失した形態に相当するのかどうかを確認するため、 Lan５細胞系より単離したＲＮＡを使用して、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析を実施した。このＲＮＡから複製ブロットを作成し、２つの別個のプローブとハイブリダイズさせた。一方のプローブ（プローブ１）は、欠失したｃＤＮＡクローンにも全長ｃＤＮＡクローンにも存在する、ＲＰＴＰβの５’末端にある配列から誘導した。他方のプローブ（プローブ２）は、欠失したｃＤＮＡクローンにはもはや存在しない配列を包含する。全長ＲＰＴＰβにおけるプローブＡおよびＢの位置を図４Ａに示す。ノーザン分析とこれら２本のプローブとの比較は、以下のことを明らかにした。すなわち、プローブ１３つの別個の転写物とハイブリダイズし、他方プローブ２は７．５および８．８ｋｂ転写物とハイブリダイズしたが６．４ｋｂ転写物とはハイブリダイズしなかった（図４Ｂ、Ｐ２参照）。これらの結果は、６．４ｋｂ転写物はＲＰＴＰβの欠失した、選択的にスプライシングされた形態を表す、ということの予備的証拠を提供する。７．５ｋｂ転写物の性質は、今後決定されるべきものとして残されている。６．２．５ In situハイブリダイゼーション分析ＲＰＴＰβの発現についてさらに洞察を得るため、in situハイブリダイゼーション分析を実施して発育しつつあるマウス胚におけるＲＰＴＰβの発現を調べた。ＲＰＴＰβ遺伝子発現は広汎性であるのか、または成体脳の特定領域に限定されるのかを確かめるための検査も、実施された。この分析の結果は、ＲＰＴＰ βが中枢神経系で優先的に発現されることを確認する。日齢２０のマウス胚（Ｅ２０）において、脳室ゾーン（図５Ａ参照）および脊髄に高レベルの発現が観察された。同様の発現パターンが、様々な強度レベルで、胚１３日から出生後７日まで見られた。成体脳における発現レベルは遥かに低く、小脳プルキンエ細胞層、歯状回および側脳室前角に明瞭に局在している（図５Ｂ参照）。３０倍過剰の非標識化オリゴヌクレオチドの添加は、これらの領域すべてにおける標識化を完全にブロックし、このプローブが配列特異的にｍＲＮＡとハイブリダイズしていることを示した。ノーザンブロットおよびin situハイブリダイゼーション分析の結果は、ＲＰＴＰβは中枢神経系の特定領域への限定された組織特異性を有し、それゆえ神経系の発達に重要な役割を果たしている可能性があることを示している。６．２．６内因性ＲＰＴＰβタンパク質発現ＲＰＴＰβ転写物がLan 5神経芽細胞腫細胞系において同定されたので、これらの細胞を次に内因性タンパク質発現を検出するために使用した。³⁵Ｓ−メチオニンで４時間標識した培養物から調製した細胞溶解物を、正常なウサギ血清または抗ＲＰＴＰβ抗血清で免疫沈降させた（図６参照）。約３００ｋｄの見かけ重量をもつタンパク質が、免疫血清によって認識されたが、正常なウサギ血清によっては認識されなかった（レーン１および２）。２１個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位があるので、抗ＲＰＴＰβ抗血清によって免疫沈降されたタンパク質がコアタンパク質を表すのか、またはグリコシル化形態のタンパク質を表すのかを決定する必要があった。これを行なうため、³⁵Ｓ−メチオニン標識期間中に、細胞にツニカマイシンを加えた。細胞系と比較したＲＰＴＰβ移動度に対するツニカマイシン処理の効果は、これもまたこの細胞系で発現されるＥＧＦ受容体のグリコシル化を阻止するための薬剤の能力であった。ツニカマイシン処理していない細胞溶解物およびツニカマイシンで処理した細胞から調製した溶解物を、ＥＧＦ受容体の１７０ｋｄグリコシル化形態および１３５ｋｄグリコシル化形態を認識する抗体（ＲＫ２）を用いて免疫沈降させた（Kris，R.M.ら、1985，Cell 40:619-625;および図６、レーン４および５参照）。抗ＲＰＴＰβ抗血清によって、あらかじめツニカマイシンの存在下で代謝的に標識しておいたLan５細胞から免疫沈降させたタンパク質は、処理していない細胞から単離された免疫沈降生成物よりも、速く移動した（レーン３と２を比較されたい）。図６、レーン３で検出されたタンパク質の分子量は約２５０ｋＤで、これはアミノ酸配列から推論される予測分子量が約２５４ｋｄであるコアタンパク質の分子量と一致する。６．２．７ＲＰＴＰβの細胞外ドメインにおけるカルボニックアンヒドラーゼ関連配列の存在酵素である炭酸脱水酵素（ＣＡＨ）の異なるイソフォーム（isoform）と相同性を共有する関連膜貫通型ホスファターゼＲＰＴＰγの細胞外ドメインにある２８３アミノ酸のストレッチが最近同定された。ＲＰＴＰβにおけるＣＡＨ関連アミノ酸の同様なストレッチが、タンパク質のアミノ最末端（図１でＣＡＨ様として示されている）に今しがた同定された。ＲＰＴＰβおよびＲＰＴＰγのＣＡＨ関連ドメインの整列を、ＣＡＨの６つの公知イソフォームと共に図７Ａに示す。図７Ｂは、ＲＰＴＰβのＣＡＨ関連ドメイン、ＲＰＴＰγの対応ドメイン、および６つのＣＡＨ酵素の間における保存性アミノ酸置換を考慮した類似性パーセントを示す。ＲＰＴＰβのＣＡＨ関連ドメインは、６つの異なるＣＡＨイソフォームへのアミノ酸配列類似性において、４５〜５０％の範囲内のどこかにある。最高度の類似性（５８％）は、ＲＰＴＰβおよびＲＰＴＰγのＣＡＨ関連配列の間にある。したがって、ＲＰＴＰアーゼ類、βおよびγは、細胞外ドメインにおけるＣＡＨ関連配列の存在によって特徴付けられるようなチロシンホスファターゼの新しいサブグループを代表しているように思われる。６．２．８ＲＰＴＰβはプロテオグリカンであるこの一連の実験において、ＲＰＴＰβがプロテオグリカンの特徴を示すことが実証されている。特に、ＲＰＴＰβタンパク質は高分子量の硫酸塩含有部分によって共有結合修飾され、またこのような部分はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理に対し感受性である。６．２．８．１ ³⁵硫酸塩標識ＲＰＴＰβがいかなる翻訳後修飾を受けるかという問題に着手するために、ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３個の細胞、ならびにベクターのみでトランスフェクトした２９３個の対照細胞を³⁵Ｓ−ＮａＳＯ₄で標識した。次に、抗ＲＰＴＰβ抗血清を用いた、溶解物の免疫沈降を実施した。図８に例示するゲルは、このような免疫沈降の１つの結果を示す。レーン３で分かるように、有意な量の、ＲＰＴＰβ抗血清と反応する標識化物質がゲルの泳動部分に入らない。これはレーン４のトランスフェクトされていない対照溶解物と容易に対照され、このレーンではそのような物質は検出されない。６．２．８．２ ³⁵Ｓ−メチオニン標識ＲＰＴＰβが受ける翻訳後修飾の研究を継続するにあたって、ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３個の細胞、ならびにベクターのみでトランスフェクトした２９３個の対照細胞を³⁵Ｓ−メチオニンで標識した。次に、抗ＲＰＴＰβ抗血清を用いた、溶解物の免疫沈降を実施した。図９に例示するゲルは、このような免疫沈降の１つの結果を示す。レーン４は、ＲＰＴＰβ抗血清と反応した標識化物質で、ゲルの泳動部分に入らないものを大量に含有し、またゲルのスタッキング（stacking）部分にすら入らないものを有意な量含有する。対照的に、対照溶解物を含有するレーン５は、このような物質を全く示さない。６．２．８．３コンドロイチナーゼ処理ＲＰＴＰβ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３個の細胞、ならびにベクターのみでトランスフェクトした２９３個の対照細胞を³⁵Ｓ−メチオニンで標識した。抗ＲＰＴＰβ抗血清を用いて溶解物を免疫沈降させ、次に１時間コンドロイチナーゼＡＢＣ処理した。図１０に例示するゲルは、このような免疫沈降の１つの結果を示す。レーン３および４は、それぞれ処理していない、及び処理した、ＲＰＴＰβをトランスフェクトした溶解物を含有する。見て取れるように、処理していない試料において、ゲルに入らなかった標識化物質の大半は、処理した試料には存在せず、その場所により低分子量の標識化バンドが現れた。レーン１及び２には、それぞれ処理していない、及び処理した対照溶解物が含有されている。高分子量標識化物質におけるこのようなシフトは、ここでは全く検出されない。７．実施例：細胞接着分子Ｎ−ＣＡＭおよびＮｇ−ＣＡＭは受容体タンパク質チロシンホスファターゼＲＰＴＰβのリガンドである。以下に記述する実験は、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ、すなわちヒトＲＰＴＰβ分子が、細胞接着分子Ｎ−ＣＡＭおよびＮｇ−ＣＡＭと結合することを示す。第７．２．１節は、ラットプロテオグリカン３Ｆ８がこれら２つのＣＡＭ分子に結合することを示す。第７．２．２節は、ラット３Ｆ８およびヒトＲＰＴＰβの炭酸脱水酵素ドメインがほぼ同一であることを示し、ＲＰＴＰβはラットプロテオグリカン３Ｆ８のヒト対応物であるという結論に導く。これら２つの情報は、考え合わせると、ＲＰＴＰβもまた２つのＣＡＭ分子Ｎ−ＣＡＭおよびＮｇ−ＣＡＭと結合することを示す。７．１材料および方法７．１．１タンパク質および抗体Ｎｇ−ＣＡＭおよびＮ−ＣＡＭを１４日齢の胚性ニワトリ脳より、特異的モノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（Grumet，M.およびEdelman，G.M.，1988，J．Cell Boil. 106:487-503）。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによるタンパク質の分析は、以下のことを示した。すなわち、Ｎｇ−ＣＡＭは記載されたように１３５ｋＤａの主要成分および、より少量の２００ｋＤａならびに８０ｋＤａ種（species）からなり（Grumet，M.およびEdelman，G.M.， 1988，J．Cell Biol. 106:487-503）、またＮ−ＣＡＭは以前に記載されたようにヘテロ分散種（heterodisperse spiecies）として１２ｋＤａ上に泳動した（H offman，S.ら、19982，J．Biol．chem. 257:7720-7729）。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを、７日齢または２〜２月齢のSprangue -Dawleyラットの脳よりＰＢＳを用いて抽出し、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により精製した（Kiang，W.-L.ら、1981，J．Biol．Chem. 256:1 0529-10537）。次に、３Ｆ８プロテオグリカンを、ＣＮＢｒ−活性化Sepharose 4Bに結合したモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーによって単離した（Rauch，U.ら、1991，J．Biol．Chem. 266:14785-14801 ）。コンドロイチナーゼ処理後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分析により、出生後初期の脳または成体脳由来の３Ｆ８プロテオグリカンをコンドロイチナーゼ処理して得たコアグリコプロテインは、ゲル上で４００ｋＤａの単一バンドとして移動することを示した（Rauch，U.ら、1991，J．Biol．Chem. 266:1487 5-14801）。コアタンパク質を試験するため、プロテオグリカンを４５〜６０分間３７℃で、３０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（３７℃でｐＨ８．０）に溶かしたプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣ（Seik agaku America Inc.，Rockville，MD）で消化した。１．５ｍＭコンドロイチナーゼ／μｇプロテオグリカンタンパク質という比を、３Ｆ８プロテオグリカンについて使用した。消化の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＳＤＳ− ＰＡＧＥは、分離ゲルに入らなかった大きい天然のプロテオグリカンが、酵素処理の後、明瞭なコアグリコプロテインバンドに変換されたことを示した（Rauch ，U.ら、1991，J．Biol．Chem. 266:14785-14801）。ニワトリＮｇ−ＣＡＭに対して作成されたポリクローナルウサギ抗体を、以前に記載されたように調製した（Grumet，M．ら、1984，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 81:267-271）。７．１．２ Covasphere凝集タンパク質（５０μｇ）を２００μＬの０．５μｍ Covaspheres（Duke Scie ntific Corp.，Palo Alto，CA）に共有結合させ、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡおよび１０ｍＭＮａＮ₃を含有するＰＢＳで２回洗浄し、２００ｐＬの緩衝液に以前に記載されたように再懸濁した（Grumet，M.およびEdelman，G.M.，1988，J．Ce ll biol. 106:487-503）。定量測定は、これらの条件下で約２０％のＮｇ−ＣＡＭタンパク質がCovaspheresに結合したことを示した。Covasphere凝集実験のために、ビーズ調製物における先の凝集物をまず１０〜２０秒間超音波処理して分離させた。そして、６μＬアリコート（約０．３μｇのタンパク質を含有する）を、上に示された量のタンパク質を含有する５４μｇのＰＢＳと混合した。氷上で３０分間インキュベートした後、試料を再度超音波処理し、凝集を２５℃でモニターした。Covasphereの超臨界凝集物の出現を、増幅＝０．１７、開口電流＝０．３３、しきい１０〜１００に設定した１００μｍの開口を備えたCoulter Counter（モデルZBI）で測定した；以前に記載されたように、これらの設定は、＞約４μｍの粒子の検出を可能とした（Grumet，M.およびEdelman，G.M.，1988，J．Cell Biol. 106:487-503）。２０ｍＬのＰＢＳ中に希釈された２０μＬの試料における超臨界粒子を測定した。プロテオグリカンのタンパク質分解への感受性を試験するため、０．１ｍｇ／ｍＬプロテオグリカンを含有する溶液を、１０μｇ／ｍＬのトリプシンで１時間３７℃で処理し、２μｇ／ｍＬのダイズトリプシン阻害剤を添加して反応を終結させた。７．１．３ＤＮＡ配列標準的ジデオキシ技法にしたがって、配列決定を実施した。７．２結果７．２．１ラットプロテオグリカン３Ｆ８はＣＡＭと結合する。以前の研究で、Ｎｇ−ＣＡＭ（Grumet，M．およびEdelman，G． M.，1988，J ．Cell Biol. 106:487-503）およびＮ−ＣＡＭ（Hoffman，S．およびEdelman，G .M.，1983，Poc．Natl．Acad．Sci．USA 80:5762-5766）は、リポソーム中に再構成されると、またはビーズ（Covaspheres）の表面へ共有結合されると、それぞれホモフィリック（homophilic）結合を仲介することが発見された。Ng-CAM-C ovaspheresの凝集率を、与えられたサイズより大きい凝集物を検出するためのCoulter Counterを用いて測定したところ、懸濁液中のCovaspheresの濃度に大きく依存することが示された。ビーズ表面積約８５ｃｍ²／ｍＬという濃度で、凝集物の出現は約１時間のインキュベーション後に平坦（plateau）レベルに到達しはじめることが、以前に確認されていた（Gru met，M．およびEdelman，G.M.，1988，J．Cell Biol． 106:487-503）。したがって、プロテオグリカンとＣＡＭとの間の潜在的相互作用を探究するために、Ng -CAM-Covaspheresの凝集率に対する種々のタンパク質およびプロテオグリカンの効果を試験した。ＢＳＡおよびフィブロネクチンを含有する対照タンパク質はNg -CAMを塗布したビーズの凝集を阻止しなかったが、１個の明瞭なコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、すなわち３Ｆ８が凝集を阻止した（図１１参照）。対照的に、ラット軟骨肉腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるアグレカン（ agrecan）（Doege，K.M.ら、1987，J．Biol．Chem. 262:17757-17767）は凝集を阻止せず、上記の効果はただ単にコンドロイチン硫酸の存在に関連しているのではないことを示した。この結論は、プロテオグリカンのコンドロイチナーゼ処理によって得たコアグリコプロテイン類は、Ng-CAM-Covaspheresの凝集を阻止するのに等しく効果的であったという発見によって更に支持された（図１２参照）。対照的に、阻止活性の殆どは、プロテオグリカンをトリプシンで処理すると除去された（第７．１．２節「材料および方法」参照）。これらの結果は、３Ｆ８プロテオグリカンのＮｇ−ＣＡＭ結合に対する効果は、グリコサミノグリカン鎖によって仲介されないが、あるタンパク質ドメイン（または、恐らくプロテオグリカンコアタンパク質上に存在するオリゴ糖のクラスター）が関与していることを示す。これらの結果に基づき、これから先のすべての実験は、コンドロイチナーゼで処理したプロテオグリカンを使用して実施した。３Ｆ８プロテオグリカンは、３０μｇ／ｍＬでNg-CAM-Covaspheresの凝集を阻止した（図１１参照）。プロテオグリカン類がCovasphere凝集をNg-CAMのタンパク質分解のような瑣末なメカニズムによって阻止したということは、ありそうにない。なぜなら、３Ｆ８プロテオグリカンをＮｇ−ＣＡＭとともに３７℃で１時間インキュベーションしても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した時、Ｎｇ−ＣＡＭ成分の分子サイズに何ら影響を及ぼさなかったからである。異なるプロテオグリカンの効果を比較するため、本発明者らはCovaspheresの超臨界凝集物の出現を、与えられたサイズより大きい凝集物を検出するためのCo ulter Counterを使用して測定した。Ng-CAM-Covaspheresの凝集は、濃度依存的に３Ｆ８プロテオグリカンによって阻止された（図１２参照）。プロテオグリカン類が他のＣＡＭに影響を及ぼしうるかどうかを決定するため、Ｎ−ＣＡＭを塗布したビーズを使用して、同様の一連の実験を実施した。N-CA M-Covaspheresの凝集は、濃度依存的に３Ｆ８プロテオグリカンの存在下で阻止された（図１３参照）。これらの結果は、Ng-CAM-Covaspheresを使用して得た結果と類似している（図１１および１２と比較されたい）。３Ｆ８プロテオグリカンの、Ｎｇ−ＣＡＭおよびＮ−ＣＡＭを塗布したビーズの凝集に対する阻止効果は、約１０μｇ／ｍＬで最大であった。プロテオグリカンのこの濃度での典型的なアッセイ（６０μＬ）において、溶液中のプロテオグリカンの量は０．６μｇで、Covaspheres上のＮｇ−ＣＡＭの量は約０．３μｇで（第７．１．２節「材料および方法」参照）あった。このことは、脳プロテオグリカンはＮｇ−ＣＡＭに対してほぼ化学量論的レベルでホモフィリック（homophilic）なＮｇ−ＣＡＭ結合を乱すことができることを示唆した。７．２．２ＲＰＴＰβはラットプロテオグリカン３Ｆ８のヒト対応物に相当する。ヒトＲＰＴＰβの配列と、ラット脳幹ライブラリーからクローン化された３Ｆ８と称されるプロテオグリカンの部分配列との比較（R．Margolis,個人的通信）は、これら２つのタンパク質が炭酸脱水酵素様ドメインを含有し、アミノ酸レベルで９１．９％同一である（図１４参照）ことを明らかにする。酵素の炭酸脱水酵素ファミリーの異なるメンバー間における最大アミノ酸配列同一性は６４％である。この配列情報は、これら２つのタンパク質（すなわち、マウスプロテオグリカン３Ｆ８及びヒトプロテオグリカンＲＰＴＰβ）は、相互に対応物であることを示す。ここに記述されている本発明の多くの変更および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされうることが明らかである。上に記述した特定の態様は、ただ単に例として与えられているものであり、本発明は添付の請求の範囲の表現によってのみ制限されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＡＤＹＡＥＤＣ０７Ｋ 14/71 8318−4ＨＣ１２Ｎ 9/16 Ｂ 8827−4Ｂ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/566 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 ＢＣ１２Ｒ 1:91） 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳＡＤＹＡＤＰＡＥＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バーニー，ギラッドアメリカ合衆国 10016 ニューヨーク州ニューヨーク，イースト 32エヌディーストリート 210番地 (72)発明者グルメ，マーティンエイチ. アメリカ合衆国 10128 ニューヨーク州ニューヨーク，イースト 87 ストリート 55番地 (72)発明者マルゴリス，リチャードユー. アメリカ合衆国 10016 ニューヨーク州ニューヨーク，イースト 30ティーエイチストリート 333番地

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたプロテオグリカンチロシンホスファターゼ受容体タンパク質。２．細胞外炭酸脱水酵素構造ドメインを更に含む、請求項１の受容体タンパク質。３．受容体タンパク質がＲＰＴＰβを含む、請求項２の受容体タンパク質。４．細胞外炭酸脱水酵素構造ドメインを有する単離されたチロシンホスファターゼ受容体タンパク質。５．非共有結合でリガンドに結合して受容体−リガンド複合体を形成する、請求項１、２、３、又は４の受容体タンパク質。６．リガンドが細胞接着分子である、請求項５の受容体−リガンド複合体。７．細胞接着分子がＮ−ＣＡＭである、請求項６の受容体−リガンド複合体。８．細胞接着分子がＮｇ−ＣＡＭである、請求項６の受容体−リガンド複合体。９．リガンドが成長因子である、請求項５の受容体−リガンド複合体。 10．リガンドが細胞外マトリックス成分である、請求項５の受容体−リガンド複合体。 11．請求項１、２、３、又は４の受容体タンパク質に結合するリガンドを同定する方法であって、少なくとも１種の分子を受容体タンパク質に、受容体−リガンド複合体を形成できるだけの十分な時間曝し、複合体を形成していない分子を除去し、そして該受容体タンパク質に結合した分子の存在を検出することを含む方法。 12．請求項１、２、３、又は４の受容体タンパク質に結合する分子を単離する方法であって、分子の混合物を受容体タンパク質に曝し、複合体を形成していない分子を除去し、そして該受容体タンパク質に結合した分子を溶離し、それによって該受容体タンパク質に結合できる単離された分子を得ることを含む方法。 13．請求項１、２、３、又は４の受容体タンパク質の酵素活性を変調する化合物を同定する方法であって、該受容体タンパク質を提示する細胞を既知のリガンドに、受容体−リガンド複合体を形成できるだけの十分な時間曝し、該細胞内のホスホチロシンレベルを測定して酵素活性レベルを得、そして該測定した酵素活性レベルを、リガンドに曝されていない細胞内の該酵素活性レベルと比較することを含む方法。 14．哺乳動物におけるチロシンホスファターゼ受容体の内因性酵素活性を変調する方法であって、該受容体がプロテオグリカンであるか又は細胞外炭酸脱水酵素ドメインを有するものであって、該哺乳動物に該受容体タンパク質に対する有効量のリガンドを投与して該酵素活性を変調することを含む方法。 15．哺乳動物におけるチロシンホスファターゼ受容体の内因性酵素活性を変調する方法であって、該受容体がプロテオグリカンであるか又は細胞外炭酸脱水酵素ドメインを有するものであって、該哺乳動物に有効可溶量の該受容体タンパク質又は該受容体タンパク質の細胞外ドメインを投与して該酵素活性を変調することを含む方法。 16．受容体タンパク質の酵素活性が増加する、請求項14又は15の方法。 17．受容体タンパク質の酵素活性が減少する、請求項14又は15の方法。 18．受容体タンパク質の酵素活性の変調が、分化、代謝、細胞周期制御、又は神経細胞機能を含む細胞機能を調節する、請求項14又は15の方法。 19．受容体の酵素活性の変調が、収縮性又は接触阻害を含む細胞挙動を調節する、請求項14又は15の方法。 20．受容体の酵素活性の変調が、ウィルス−受容体相互作用、炎症、癌性状態への細胞形質転換、又はII型インシュリン非依存性真性糖尿病の発生を含む異常又は有害なプロセスを調節する、請求項14又は15の方法。 21．哺乳動物における細胞接着分子機能を変調する方法であって、該哺乳動物に請求項５の受容体タンパク質に対する有効量のリガンドを投与して細胞接着分子機能を変調することを含む方法。 22．哺乳動物における細胞接着分子機能を変調する方法であって、該哺乳動物に請求項１、２、３又は４の有効可溶量の受容体タンパク質又は該受容体タンパク質の細胞外ドメインを投与して細胞接着分子機能を変調することを含む方法。