JPWO2006028241A1

JPWO2006028241A1 - 動脈硬化の予防・治療用医薬

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Publication number: JPWO2006028241A1
Application number: JP2006535860A
Authority: JP
Inventors: 広光布施; 早智雄柴田; 東條　英明; 英明東條
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2005-09-06
Publication date: 2008-05-08
Also published as: US20070248591A1; EP1797898A4; EP1797898A1; WO2006028241A1

Abstract

本発明は、グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤、グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化、糖尿病などの予防・治療剤、該予防・治療剤を得るためのスクリーニング方法およびスクリーニングキットなどを提供する。

Description

本発明は、動脈硬化の予防・治療用医薬、該医薬のスクリーニング、動脈硬化の診断薬、動脈硬化の診断マーカーなどに関する。

死亡原因の最上位を占める虚血性心疾患や脳血管障害などの虚血性臓器疾患発症の原因として粥状動脈硬化の存在は重要である。動脈硬化病変の病理形態学的特徴は、内皮下にコレステロールエステルを蓄積した主にマクロファージからなる細胞（泡沫化細胞）が集積した脂肪線条（ｆａｔｔｙｓｔｒｅａｋ）、さらに進行した状態である、平滑筋細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などの浸潤と細胞壊死像と脂質蓄積が認められる繊維性硬班（ｆｉｂｒｏｕｓｐｌａｑｕｅ）である。脂質蓄積した部位は構造的脆弱性を示し、血行力学的な力が引き金となり硬班が破綻し（ｐｌａｑｕｅｒａｐｔｕｒｅ）、組織因子と血液凝固系因子との反応により急激に血栓が形成する。冠動脈で硬班が破綻し血栓性閉塞が起きることが急性心筋梗塞、不安定狭心症、心臓性突然死などのいわゆる急性冠症候群（ａｃｕｔｅｃｏｒｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）の発症に密接に関係する事が明らかにされてきている（ＦｕｓｔｅｒＶｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６，ｐｐ２４２−２５０，１９９２）。
急性冠症候群発症の最も重要な危険因子は、いくつかの大規模疫学的調査（４Ｓｓｔｕｄｙ，ＣＡＲＥｓｔｕｄｙなど）により、血清コレステロール値、特に低密度リポタンパク質−コレステロール値（ＬＤＬ−Ｃ）であることが示されており、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるスタチン系薬剤による血清コレステロール低下療法が心疾患イベントの発症率を低下させたエビデンスは危険因子としてのＬＤＬの妥当性を証明するものである。
細胞生物学的検討から、マクロファージ細胞は、スカベンジャー受容体ファミリーと呼ばれる受容体により、血中の主要脂質担体であるＬＤＬが修飾を受けた酸化ＬＤＬを細胞内に取り込むことが明らかとなった。この受容体は細胞内コレステロール量によるネガティブフィードバックを受けず、マクロファージはこの受容体を介して過剰の酸化ＬＤＬを取り込んで泡沫化細胞となる。
高コレステロール血症患者では高ＬＤＬ血症を示し、またＬＤＬの易酸化性等が報告されている点、近年、酸化ＬＤＬの特異的抗体を用いた血中酸化ＬＤＬの定量系開発が行われ、心疾患のリスクが高い患者群での血中濃度が上昇し、さらに病変部位での酸化ＬＤＬ陽性マクロファージ細胞数が増加しており（ＥｈａｒａＳｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３，ｐｐ１９５５−１９６０，２００１）、酸化ＬＤＬによるマクロファージの泡沫化を機序とした粥状動脈硬化病変形成が生体レベルで起きていることが強く示唆されてきた。酸化ＬＤＬはマクロファージ細胞を泡沫化させるだけではなく、血管内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージ細胞に対して、動脈硬化惹起性の作用を示すが、その１つとしてアポトーシスの誘導が考えられる。本発明者らはこの泡沫化マクロファージのアポトーシスに関して、セラミドの代謝系に関わる酵素が重要な役割を演じており、動脈硬化形成に関与していることを報告している（ＷＯ０３／７８６２４号公報）。
グルコシルセラミドは、形質膜に含まれる糖スフィンゴ脂質の前駆体であり、その発現または活性調節は、生化学または病理・生理学的プロセス（発生、分化ガン化など）に関与することが知られている。グルコシルセラミドを合成する酵素（グルコシルセラミド合成酵素）のノックダウンマウスは、胎性９．５日以前に死亡することより、糖スフィンゴ脂質が発生、分化に必要な物質であることが示されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１５２５巻，１−１２頁，２００１年）。
ラクトシルセラミドは、グルコシルセラミドにガラクトースが付加されて生成した物質であり、糖スフィンゴ脂質代謝系上での複数の代謝系（ガラ系、ガングリオ系、アシアロ系、ラクト系、ネオラクト系、グロボ系、イソグロボ系）への分岐点の物質である（わかる実験医学シリーズ糖鎖生物学がわかる，４４−５２頁，２００２年）。ラクトシルセラミドを培養系に添加することにより、ヒト血管平滑筋細胞においては増殖活性が増加（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８１巻，５５４−６１頁，１９９１年）、ヒト血管内皮細胞においては接着分子であるＩＣＡＭ−１の発現上昇することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３巻，３４３４９頁，１９９８年）。
また、グルコシルセラミド合成酵素またはラクトシルセラミド合成酵素の阻害剤であるＤ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）は、インスリン刺激によるＩＲＳ−１のリン酸化を阻害するＴＮＦ−αの作用を抑制することが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７巻，３０８５−３０９２頁，２００２年）。

動脈硬化発症モデル動物で特異的に発現変動する分子を標的とし、有用な診断マーカーを確立すること、動脈硬化における血漿中のタンパクの動態を明らかにすること、更には、従来知られている動脈硬化の危険因子の制御とは異なるメカニズムで動脈硬化の予防・治療効果を示す薬剤を提供することが切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤およびラクトシルセラミド合成酵素阻害剤が、マクロファージ細胞においてコレステロール搬出活性を促進すること、また、同細胞においてラクトシルセラミドがコレステロール搬出活性を抑制することを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、グルコシルセラミド合成酵素またはラクトシルセラミド合成酵素の活性や遺伝子発現を阻害する薬剤などが、動脈硬化の予防および（または）治療に有用であると考え、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬、
〔１ａ〕グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を含有してなる糖尿病の予防・治療用医薬、
〔２〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬、
〔２ａ〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる糖尿病の予防・治療用医薬、
〔２ｂ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記〔１〕記載の動脈硬化の予防・治療用医薬、
〔２ｃ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記〔１ａ〕記載の糖尿病の予防・治療用医薬、
〔３〕グルコシルセラミド合成酵素が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔１〕または〔２〕記載の医薬、
〔４〕グルコシルセラミド合成酵素が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である上記〔１〕または〔２〕記載の医薬、
〔５〕ラクトシルセラミド合成酵素が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔１〕または〔２〕記載の医薬、
〔６〕ラクトシルセラミド合成酵素が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である上記〔１〕または〔２〕記載の医薬、
〔７〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を含有してなる上記〔１〕、〔２〕、〔２ｂ〕、下記〔１９〕または〔１９ｂ〕記載の医薬、
〔７ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を含有してなる上記〔１ａ〕、〔２ａ〕、〔２ｃ〕、下記〔１９ａ〕または〔１９ｃ〕記載の医薬、
〔８〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記〔１〕、〔２〕、〔２ｂ〕、下記〔１９〕または〔１９ｂ〕記載の医薬、
〔８ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記〔１ａ〕、〔２ａ〕、〔２ｃ〕、下記〔１９ａ〕または〔１９ｃ〕記載の医薬、
〔９〕ＧＭ３合成酵素が、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔７〕または〔８〕記載の医薬、
〔１０〕ＧＭ３合成酵素が、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である上記〔７〕または〔８〕記載の医薬、
〔１１〕配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
〔１２〕配列番号：１または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
〔１３〕動脈硬化の予防・治療用医薬である上記〔１２〕記載の医薬、
〔１３ａ〕糖尿病の予防・治療用医薬である上記〔１２〕記載の医薬、
〔１４〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる上記〔１３〕記載の医薬、
〔１５〕配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
〔１６〕配列番号：１または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる医薬、
〔１７〕動脈硬化の予防・治療用医薬である上記〔１６〕記載の医薬、
〔１７ａ〕糖尿病の予防・治療用医薬である上記〔１６〕記載の医薬、
〔１８〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる上記〔１７〕記載の医薬、
〔１９〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬、
〔１９ａ〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる糖尿病の予防・治療用医薬、
〔１９ｂ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔１〕、〔２〕または〔２ｂ〕記載の動脈硬化の予防・治療用医薬、
〔１９ｃ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔１ａ〕、〔２ａ〕または〔２ｃ〕記載の糖尿病の予防・治療用医薬、
〔２０〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔１〕、〔２〕、〔２ｂ〕、〔１９〕または〔１９ｂ〕記載の医薬、
〔２０ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔１ａ〕、〔２ａ〕、〔２ｃ〕、〔１９ａ〕または〔１９ｃ〕記載の医薬、
〔２１〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の診断薬、
〔２１ａ〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる糖尿病の診断薬、
〔２２〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔２１〕記載の診断薬、
〔２２ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる上記〔２１ａ〕記載の診断薬、
〔２３〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法、
〔２３ａ〕グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔２４〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を用いる上記〔２３〕記載の診断方法、
〔２４ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を用いる上記〔２３ａ〕記載の診断方法、
〔２５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる動脈硬化の診断薬、
〔２５ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病の診断薬、
〔２６〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる上記〔２５〕記載の診断薬、
〔２６ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる上記〔２５ａ〕記載の診断薬、
〔２７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法、
〔２７ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔２８〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる上記〔２７〕記載の診断方法、
〔２８ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる上記〔２７ａ〕記載の診断方法、
〔２９〕動脈硬化の診断薬の製造のための、グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用、
〔２９ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を用いる上記〔２９〕記載の使用、
〔２９ｂ〕糖尿病の診断薬の製造のための、グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用、
〔２９ｃ〕さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を用いる上記〔２９ｂ〕記載の使用、
〔３０〕動脈硬化の診断薬の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、
〔３０ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる上記〔３０〕記載の使用、
〔３０ｂ〕糖尿病の診断薬の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、
〔３０ｃ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる上記〔３０ｂ〕記載の使用、
〔３１〕哺乳動物の血漿中のグルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の診断方法、
〔３１ａ〕哺乳動物の血漿中のグルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの量を測定することを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔３２〕さらに、ＧＭ３の量を測定する上記〔３１〕記載の診断方法、
〔３２ａ〕さらに、ＧＭ３の量を測定する上記〔３１ａ〕記載の診断方法、
〔３３〕グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの動脈硬化の診断マーカーとしての使用、
〔３３ａ〕グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの糖尿病の診断マーカーとしての使用、
〔３４〕さらにＧＭ３を用いる上記〔３３〕記載の使用、
〔３４ａ〕さらにＧＭ３を用いる上記〔３３ａ〕記載の使用、
〔３５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔３５ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔３６〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記〔３５〕記載のスクリーニング方法、
〔３６ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記〔３５ａ〕記載のスクリーニング方法、
〔３７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
〔３７ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
〔３８〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔３７〕記載のスクリーニング用キット、
〔３８ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔３７ａ〕記載のスクリーニング用キット、
〔３９〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔３９ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４０〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４０ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４１〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
〔４１ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
〔４２〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する上記〔４１〕記載のスクリーニング用キット、
〔４２ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する上記〔４１ａ〕記載のスクリーニング用キット、
〔４３〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４３ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定することを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４４〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定する上記〔４３〕記載のスクリーニング方法、
〔４４ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定する上記〔４３ａ〕記載のスクリーニング方法、
〔４５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４５ａ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法、
〔４６〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定する上記〔４５〕記載のスクリーニング方法、
〔４６ａ〕さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定する上記〔４５ａ〕記載のスクリーニング方法、
〔４７〕グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の活性を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法、
〔４７ａ〕グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の活性を阻害することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔４８〕さらに、ＧＭ３合成酵素の活性を阻害する上記〔４７〕、下記〔４９〕または〔４９ｂ〕記載の方法、
〔４８ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素の活性を阻害する上記〔４７ａ〕、下記〔４９ａ〕または〔４９ｃ〕記載の方法、
〔４９〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法、
〔４９ａ〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔４９ｂ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする上記〔４７〕記載の動脈硬化の予防・治療方法、
〔４９ｃ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする上記〔４７ａ〕記載の糖尿病の予防・治療方法、
〔５０〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現を阻害する上記〔４７〕、〔４９〕または〔４９ｂ〕記載の方法、
〔５０ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現を阻害する上記〔４７ａ〕、〔４９ａ〕または〔４９ｃ〕記載の方法、
〔５１〕グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法、
〔５１ａ〕グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔５２〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤の有効量を投与する上記〔５１〕、下記〔５３〕または〔５３ｂ〕記載の方法、
〔５２ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤の有効量を投与する上記〔５１ａ〕、下記〔５３ａ〕または〔５３ｃ〕記載の方法、
〔５３〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法、
〔５３ａ〕グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔５３ｂ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記〔５１〕記載の動脈硬化の予防・治療方法、
〔５３ｃ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記〔５１ａ〕記載の糖尿病の予防・治療方法、
〔５４〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記〔５１〕、〔５３〕または〔５３ｂ〕記載の方法、
〔５４ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記〔５１ａ〕、〔５３ａ〕または〔５３ｃ〕記載の方法、
〔５５〕動脈硬化の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の使用、
〔５５ａ〕糖尿病の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の使用、
〔５６〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を用いる上記〔５５〕、下記〔５７〕または〔５７ｂ〕記載の使用、
〔５６ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を用いる上記〔５５ａ〕、下記〔５７ａ〕または〔５７ｃ〕記載の使用、
〔５７〕動脈硬化の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用、
〔５７ａ〕糖尿病の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用、
〔５７ｂ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記〔５５〕記載の使用、
〔５７ｃ〕さらに、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記〔５５ａ〕記載の使用、
〔５８〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記〔５５〕、〔５７〕または〔５７ｂ〕記載の使用、
〔５８ａ〕さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記〔５５ａ〕、〔５７ａ〕または〔５７ｃ〕記載の使用などを提供する。

本発明で用いられるグルコシルセラミド合成酵素（Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥＣ＿ｎｕｍｂｅｒ＝２．４．１．８０）はＵＧＣＧ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｃｅｒａｍｉｄｅｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｃｅｒａｍｉｄｅ：ＵＤＰＧｌｃｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ−ｃｅｒａｍｉｄｅｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｃｅｒａｍｉｄｅ：ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｃｅｒａｍｉｄｅｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなどとも呼ばれ、ＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）由来のグルコースをセラミドの１位の水酸基に転移することで生合成されるグルコシルセラミドの合成反応を触媒する酵素である。
本発明で用いられるラクトシルセラミド合成酵素（Ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ：ＥＣ＿ｎｕｍｂｅｒ＝２．４．１．−）はＢ４ＧＬＴ６、ＧａｌＴ−２、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ｂｅｔａＧｌｃＮＡｃｂｅｔａ１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ６などとも呼ばれ、ＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）由来のガラクトースをグルコシルセラミドへβ−１，４結合で転移することで生合成されるラクトシルセラミドの合成反応を触媒する酵素である。
本発明で用いられるＧＭ３合成酵素（ＧａｎｇｌｉｏｓｉｄｅＧＭ３ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥＣ＿ｎｕｍｂｅｒ＝２．４．９９．９）は、ＳＩＡＴ９（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ９）、ＳＡＴ−Ｉ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩ）、ＣＭＰ−シアル酸：ラクトシルセラミドα−２，３シアル酸転移酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ：ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅａｌｐｈａ−２，３−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などとも呼ばれ、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ）由来のシアル酸をβ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−１，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅの非還元末端ガラクトースにα−２，３結合で転移することで生合成されるＧＭ３（α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｙｌ−２，３−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−１，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）の合成反応を触媒する酵素である。
本発明で用いられるグルコシルセラミド合成酵素としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、このタンパク質を、本発明のタンパク質Ａまたは本発明で用いられるタンパク質Ａと称することもある）が、ラクトシルセラミド合成酵素としては、例えば、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、このタンパク質を、本発明のタンパク質Ｂまたは本発明で用いられるタンパク質Ｂと称することもある）が、ＧＭ３合成酵素としては、例えば、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、このタンパク質を、本発明のタンパク質Ｃまたは本発明で用いられるタンパク質Ｃと称することもある）が挙げられる（以下、これらのタンパク質を、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）。
本発明で用いられるタンパク質は、ヒトや温血動物（例、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられ、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、グルコシルセラミドの合成反応を触媒する酵素活性（グルコシルセラミド合成酵素活性）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、グルコシルセラミド合成酵素活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられ、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ラクトシルセラミドの合成反応を触媒する酵素活性（ラクトシルセラミド合成酵素活性）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ラクトシルセラミド合成酵素活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられ、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＧＭ３の合成反応を触媒する酵素活性（ＧＭ３合成酵素活性）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＧＭ３合成酵素活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
グルコシルセラミド合成酵素活性は、公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，３１１巻，５０−５９頁，２０００年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。具体的には、グルコシルセラミド合成酵素、セラミドおよびＵＤＰ−放射標識グルコースを反応させ、クロロホルム−メタノール抽出後のクロロホルム層の放射活性を測定する。あるいは、グルコシルセラミド合成酵素、蛍光標識セラミドおよびＵＤＰ−グルコースを反応させ、クロロホルム−メタノール抽出後、クロロホルム層を回収し、乾固後、シリカ６０の薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）によりグルコシルセラミドを分離し、蛍光イメージングが可能な機器（例、ＬＡＳ−１０００（富士フィルム社製）など）により蛍光強度を検出、測定する。
ラクトシルセラミド合成酵素活性は、公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，３１１巻，７３−８１頁，２０００年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。具体的には、ラクトシルセラミド合成酵素、グルコシルセラミドおよびＵＤＰ−放射標識ガラクトースを反応させ、クロロホルム−メタノール抽出後のクロロホルム層の放射活性を測定する。
また、細胞または組織に含まれるグルコシルセラミド量またはラクトシルセラミド量の測定方法は、公知の方法、例えば基礎生化学実験法，第５巻，第１１章，１３５−１４１頁，２０００年に記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。
具体的には、細胞ペレット（タンパク質量３ｍｇ〜５ｍｇ）に対してクロロホルム−メタノール（２：１）２ｍｌを加え、５分間程度超音波処理後、３７℃のインキュベーター中で１時間振盪して抽出する。その後、遠心分離を行いペレットと上清（脂質抽出液）に分け、ペレットに対して再度、クロロホルム−メタノール−水（１：２：０．８）１ｍｌにより３７℃で２時間振盪して再抽出する。遠心後の上清を最初に分離した上清と合わせて総脂質とする。また、組織ホモジネートに対して２０倍容量のクロロホルム−メタノール（２：１）を加え、５分間程度超音波処理後、３７℃のインキュベーター中で１時間振盪する。抽出液にメタノールを加え、クロロホルム−メタノールの比率を１：１とした後に、遠心分離によりペレットと上清（脂質抽出液）に分け、ペレットに対して再度、クロロホルム−メタノール−水（１：２：０．８）２ｍｌにより３７℃で２時間振盪して再抽出する。遠心後、上清を最初に分離した上清と合わせて総脂質とする。総脂質を酢酸型に変換した陰イオン交換カラムにかけてカラムの４〜５倍容量のクロロホルム−メタノール−水（３０：６０：８）で溶出する。溶出液からエバポレーターで溶媒を除き、クロロホルム−メタノール（１：１）０．５ｍｌに再溶解する。４ＭＮａＯＨを０．０２５ｍｌを加え、３７℃で２時間加温後、２Ｍ酢酸を０．０２５ｍｌ加える。ゲル濾過クロマトグラフィーにサンプルをかけて、クロロホルム−メタノール−水（５：５：１）で溶出する。溶出画分はエバポレーターで溶媒を除き、クロロホルム−メタノール（１：１）で溶解して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の試料とする。ＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｋ社）に試料をスポットし、クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４）などで展開後、ヘキソースを発色させるアントロン試薬、オルシノール−硫酸試薬等で、グルコシルセラミドまたはラクトシルセラミドを検出する。濃度が明確なグルコシルセラミドまたはラクトシルセラミドの内部標準とのデンシトメトリーで定量する。
ＧＭ３合成酵素活性の測定は、公知の方法、例えば、ラクトシルセラミドを基質として、ＣＭＰ−シアル酸（１０−１００ｎｍｏｌ）と酵素を、一定時間、３７℃でインキュベートし、酵素反応によって生成したＧＭ３を定量する方法（例、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１１巻，８２−９４頁，２０００年などに記載の方法など）またはそれに準じる方法などにより測定することができる。
具体的には、ＧＭ３合成酵素発現細胞株（例えばマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１株など）における細胞表層、または細胞内ＧＭ３を、抗ＧＭ３抗体を用いて量的に検出する。細胞表層ＧＭ３はホルムアルデヒドなどで固定化した後、抗ＧＭ３抗体（例、ＣｌｏｎｅＭ２５９０など）と反応させた後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭ抗体またはＡＰ標識抗マウスＩｇＭ抗体と反応させ、化学発光系あるいは発色系で検出する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７巻，４７０２８−４７０３４頁，２００２年）。また、ホルムアルデヒドなどで固定化した、または非固定の浮遊した状態の細胞と抗ＧＭ３抗体（例、ＣｌｏｎｅＭ２５９０など）とを反応した後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＭ抗体などと反応後、ＦＡＣＳで解析する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７巻，３０８５−３０９２頁，２００２年）。また、細胞内ＧＭ３量は細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００などで前処理することで検出可能となる（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．，１４１巻，５７３−５８３頁，１９８９年）。
本明細書において、「グルコシルセラミド合成酵素阻害」とは、グルコシルセラミド合成酵素の活性の阻害またはグルコシルセラミド合成酵素の産生の阻害（好ましくは、グルコシルセラミド合成酵素の活性の阻害）の何れであってもよい。
本明細書において、「グルコシルセラミド合成酵素阻害剤」とは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩；配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の産生を阻害する化合物またはその塩（好ましくは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩）の何れであってもよい。
本明細書において、「グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤」としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
本明細書において、「ラクトシルセラミド合成酵素阻害」とは、ラクトシルセラミド合成酵素の活性の阻害またはラクトシルセラミド合成酵素の産生の阻害（好ましくは、ラクトシルセラミド合成酵素の活性の阻害）の何れであってもよい。
本明細書において、「ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤」とは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩；配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の産生を阻害する化合物またはその塩（好ましくは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩）の何れであってもよい。
本明細書において、「ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤」としては、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
本明細書において、「ＧＭ３合成酵素阻害」とは、ＧＭ３合成酵素の活性の阻害またはＧＭ３合成酵素の産生の阻害（好ましくは、ＧＭ３合成酵素の活性の阻害）の何れであってもよい。
本明細書において、「ＧＭ３合成酵素阻害剤」とは、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩；配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の産生を阻害する化合物またはその塩（好ましくは、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩）の何れであってもよい。
本明細書において、「ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤」としては、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（１）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本発明で用いられるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
具体的には、後述する本発明の抗体を調製する目的には、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。
このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。
反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の１）〜５）に記載された方法が挙げられる。
１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６６年）
２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）
３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
５）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２などで表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１、配列番号：３または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（タカラバイオ（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（タカラバイオ（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｉｉ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）］，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＮ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、ＩｎＶｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（ｉ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなど、好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２または配列番号：４などで表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」、であるということができる。アンチセンスポリリボヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＴｅｃｈＪａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．ｅｄ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、動脈硬化病変部で発現が増加するので、動脈硬化の診断マーカーとして利用することが出来る。また、グルコシルセラミド合成酵素またはラクトシルセラミド合成酵素の阻害剤Ｄ−ＰＤＭＰは、インスリン刺激によるＩＲＳ−１のリン酸化を阻害するＴＮＦ−αの作用を抑制することより、本発明のタンパク質は、糖尿病性合併症の診断マーカーとして利用することも出来る。
本発明のタンパク質は、動脈硬化性疾患または糖尿病性合併症における早期診断、動脈硬化進展度または糖尿病進展度の推定のためのマーカーとして有用である。
さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質に対するアプタマーまたは本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬などは、例えば、動脈硬化の予防・治療用医薬、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤などとして使用することができる。
また、本発明のタンパク質により合成されるグルコシルセラミドまたはラクトシルセラミド、あるいはＧＭ３も動脈硬化や糖尿病の診断マーカーとして利用することが出来る。すなわち、動脈硬化性疾患または糖尿病性合併症における早期診断、動脈硬化の進展度の推定のためのマーカーとして有用である。
（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は動脈硬化病変部で発現が増加しており、さらに、本発明のタンパク質を阻害する〔以下、「本発明のタンパク質の活性を阻害すること」、「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害すること」および「本発明のタンパク質の産生を阻害すること」を総称して、「本発明のタンパク質を阻害する」と記載することがある。また、本発明のタンパク質を阻害する化合物またはその塩自体を、本発明のタンパク質の阻害剤と称することがある。さらに、本発明の動脈硬化の予防・治療用医薬には、本発明のタンパク質を阻害する化合物またはその塩自体およびこれを含有する医薬組成物などが含まれる。〕と動脈硬化の病変が改善される。また、グルコシルセラミド合成酵素またはラクトシルセラミド合成酵素の阻害剤Ｄ−ＰＤＭＰは、インスリン刺激によるＩＲＳ−１のリン酸化を阻害するＴＮＦ−αの作用を抑制する。
グルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素およびＧＭ３合成酵素は、ガングリオシド生合成系に関与する酵素である。グルコシルセラミド合成酵素はセラミドからグルコシルセラミドを、ラクトシルセラミド合成酵素はグルコシルセラミドからラクトシルセラミドを、ＧＭ３合成酵素はラクトシルセラミドからＧＭ３を合成する酵素である。つまり、ガングリオシド生合成系においてグルコシルセラミド合成酵素はＧＭ３合成酵素の上流に位置する酵素である。ＧＭ３の組織含有量の調節にグルコシルセラミド合成酵素活性が関連する例として、以下の報告が挙げられる。ハムスターにリポポリサンカライドを投与すると、肝臓でグルコシルセラミド合成酵素の発現量が増加し、グルコシルセラミド合成酵素活性の増加に伴い、肝臓中のＧＭ３量が増加する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４巻，１９７０７−１９７１３頁，１９９９年）。また、ＴＮＦ−αやＩＬ−１βを投与すると、グルコシルセラミド合成酵素発現量が増加し、同様な効果が期待できる。また、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、ＴＮＦ−αの刺激によりＧＭ３合成酵素の発現が上昇し、ＧＭ３合成酵素活性も上昇し、ＧＭ３量も増加する（ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７巻，３０８５−３０９２頁，２００２年）。つまり、グルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素、ＧＭ３合成酵素は、細胞または組織におけるＧＭ３量の調節において、例えばＴＮＦ−α刺激の場合のように、共に発現レベルで調節されている。
従って、本発明のタンパク質を阻害する化合物またはその塩は、例えば、動脈硬化の予防・治療用医薬、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤として使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
具体的なスクリーニング方法としては、例えば、
（１ａ）（ｉ）本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質Ａの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１ｂ）（ｉ）本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質Ｂの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１ｃ）（ｉ）本発明のタンパク質ＡおよびＢを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性およびラクトシルセラミド合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＡおよびＢを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性およびラクトシルセラミド合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質ＡおよびＢの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１ｄ）（ｉ）本発明のタンパク質ＡおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＡおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質ＡおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１ｅ）（ｉ）本発明のタンパク質ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質ＢおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１ｆ）（ｉ）本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性、ラクトシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞、その細胞抽出物またはその精製タンパク質のグルコシルセラミド合成酵素活性、ラクトシルセラミド合成酵素活性およびＧＭ３合成酵素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質ＢおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ａ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ａの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）本発明のタンパク質Ａおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｂ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ｂの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）本発明のタンパク質Ｂおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ｂの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｃ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質ＡおよびＢの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）本発明のタンパク質ＡならびにＢおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質ＡおよびＢの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｄ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質ＡおよびＣの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）発明のタンパク質ＡならびにＣおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質ＡおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｅ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質ＢおよびＣの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）本発明のタンパク質ＢならびにＣおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質ＢおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｆ）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣの脂質蓄積促進活性と、（ｉｖ）本発明のタンパク質Ａ、ＢならびにＣおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などが用いられる。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞内あるいは細胞外に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における各活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における脂質蓄積亢進活性を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を阻害するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質の遺伝子も、動脈硬化病変部において発現が増加しており、該遺伝子の発現を阻害すると動脈硬化の病変が改善するので、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、例えば動脈硬化の予防・治療用医薬、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤として使用することができる。
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（ｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｖ）と（ｖｉ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ｍＲＮＡなど）の量を測定して、比較する。
（３ａ）（ｖ）本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質Ａ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３ｂ）（ｖ）本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質Ｂ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ｂ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３ｃ）（ｖ）本発明のタンパク質ＡおよびＢを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＡおよびＢを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質ＡおよびＢ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａ遺伝子の発現および本発明のタンパク質Ｂ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３ｄ）（ｖ）本発明のタンパク質ＡおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＡおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質ＡおよびＣ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａ遺伝子の発現および本発明のタンパク質Ｃ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３ｅ）（ｖ）本発明のタンパク質ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質ＢおよびＣ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ｂ遺伝子の発現および本発明のタンパク質Ｃ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３ｆ）（ｖ）本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｖｉ）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣを産生する能力を有する細胞を培養し、タンパク質Ａ、ＢおよびＣ遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質Ａ遺伝子の発現、本発明のタンパク質Ｂ遺伝子の発現および本発明のタンパク質Ｃ遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などが挙げられる。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２、またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１２、またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における遺伝子の発現を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
（ｉ）本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩は、例えば、コレステロール搬出活性を促進する作用、リポタンパク取り込み活性を阻害する作用を有していることが好ましい。
コレステロール搬出活性は、公知の方法、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６巻，４３５６４−４３５６９頁，２００１年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。
放射性同位元素（例、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕など）で標識されたコレステロールまたはコレステロールエステルを含む培地で、細胞（例、マクロファージ等）を培養し、緩衝液（例、ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液、リン酸緩衝液等）で洗浄し、細胞に取り込まれなかった放射性同位元素を除く。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物存在下、上記細胞を培養後、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）、アポリポプロテインＡ１、サイクロデキストリン類などと接触させ（例、ＨＤＬ、アポリポプロテインＡ１、サイクロデキストリン類を含む培地に交換して培養する）、放射活性を測定する。細胞ライゼートの放射活性も測定し、取り込まれた放射活性の何割が培養上清に搬出されたかを計算する。
リポタンパク取り込み活性は、公知の方法、例えばＰｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８巻，４９３１−４９３５頁，１９９１年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物存在下、放射性同位元素（例、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３２Ｐ〕、〔^３３Ｐ〕、〔^３５Ｓ〕など）で標識されたリポタンパク（例、低比重リポタンパク、変性低比重リポタンパク等）を含む培地で細胞を培養し、緩衝液で洗浄後、取り込まれた放射活性をシンチレーションカウンターなどで測定する。
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物存在下、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕で標識されたリポタンパク（例、低比重リポタンパク、変性低比重リポタンパク等）を含む培地で細胞を培養し、緩衝液（例、リン酸緩衝液）で洗浄後、蛍光活性を、蛍光プレートリーダーで測定する、または細胞剥離後、取り込まれた蛍光物質で標識されたリポタンパクをＦＡＣＳで測定する。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、グルコシルセラミド合成酵素活性、ラクトシルセラミド合成酵素活性、ＧＭ３合成酵素活性など）を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩などはそれぞれ、例えば動脈硬化の予防・治療用医薬、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤として有用である。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩、および本発明の抗体は、２種以上を組み合わせて、上記疾患の予防・治療剤として使用することもできる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｃａｓｔｏｒｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、動脈硬化性疾患（例、心筋梗塞、不安定狭心症など）の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、動脈硬化性疾患（例、心筋梗塞、不安定狭心症など）の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩などの場合も、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩の場合と同様にして投与することができる。
（２）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法などを提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標凖曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３２Ｐ〕、〔^３３Ｐ〕、〔^３５Ｓ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などが用いられる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））、同書Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））、同書Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などに罹患している、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
例えば、
（ａ）本発明のタンパク質Ａに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質Ａの濃度を定量する、
（ｂ）本発明のタンパク質Ｂに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質Ｂの濃度を定量する、
（ｃ）本発明のタンパク質Ａに対する抗体および本発明のタンパク質Ｂに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質ＡおよびＢの濃度を定量する、
（ｄ）本発明のタンパク質Ａに対する抗体および本発明のタンパク質Ｃに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質ＡおよびＣの濃度を定量する、
（ｅ）本発明のタンパク質Ｂに対する抗体および本発明のタンパク質Ｃに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質ＢおよびＣの濃度を定量する、
（ｆ）本発明のタンパク質Ａに対する抗体、本発明のタンパク質Ｂに対する抗体および本発明のタンパク質Ｃに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣの濃度を定量することにより、診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
（３）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）である可能性が高いと診断することができる。
例えば、
（ａ）本発明のタンパク質Ａをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質Ａ遺伝子の発現量を定量する、
（ｂ）本発明のタンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質Ｂ遺伝子の発現量を定量する、
（ｃ）本発明のタンパク質Ａをコードするポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質ＡおよびＢ遺伝子の発現量を定量する、
（ｄ）本発明のタンパク質Ａをコードするポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質ＡおよびＣ遺伝子の発現量を定量する、
（ｅ）本発明のタンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質ＢおよびＣ遺伝子の発現量を定量する、
（ｆ）本発明のタンパク質Ａをコードするポリヌクレオチド、本発明のタンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチドを用いて、本発明のタンパク質Ａ、ＢおよびＣ遺伝子の発現量を定量することにより、診断することができる。
（４）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを医薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター、レンチウイルスベクター、リポソーム誘導体などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、治療目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）など）、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質に対するアプタマーなども、本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を抑制することができるので、例えば、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
アプタマーは、公知の方法、例えばＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇａｎｄｓｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法（ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ５６巻，５５５−５８３頁，２００５年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に、公知の方法に従いアプタマーを製造する。
上記のアプタマーを医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体（例、中和抗体）は、例えば、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。また、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調整できる。注射剤の調整方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｃａｓｔｏｒｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
（６）本発明の「本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩」、「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩」および「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩」
「本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩」は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）であればよく、例えば動脈硬化、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤または予防・治療用医薬として用いられる。
「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩」は、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）であればよく、例えば動脈硬化、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤または予防・治療用医薬として用いられる。
「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩」は、本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）であればよく、例えば動脈硬化、動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤または予防・治療用医薬として用いられる。
また、予防・治療用医薬、予防・治療剤には、「本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩」自体、「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩」自体、「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩」自体、およびこれらのいずれかを含有する医薬組成物などが含まれる。
該予防・治療剤は、上記と同様にして製造される。
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、１）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、２）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば動脈硬化性疾患、糖尿病性合併症などの予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行うことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
１）組織培養のための細胞源としての使用、
２）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
３）ＤＮＡを有する組織の細胞を標凖組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
４）上記３）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
５）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。
この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．ＭａｒｔｉｎＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものが用いられる。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば動脈硬化性疾患、糖尿病性合併症などに対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ転移非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と動脈硬化性疾患の発症度合いの違いや動脈硬化性疾患の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の発現亢進などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。本発明のタンパク質の発現亢進などによって引き起こされる疾患としては、例えば、動脈硬化性疾患、糖尿病性合併症などが挙げられる。従って、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の産生を詐害する化合物またはその塩などは、動脈硬化性疾患、糖尿病性合併症などの疾患の予防・治療剤として使用することができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質の抗体を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、動脈硬化性疾患（例、心筋梗塞、不安定狭心症など）の治療の目的で該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、動脈硬化性疾患（例、心筋梗塞、不安定狭心症など）の治療の目的で該化合物またはその塩を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものが用いられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を調節（促進または阻害；好ましくは阻害）する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の調節（促進または阻害；好ましくは阻害）、該タンパク質の機能を調節（促進または阻害；好ましくは阻害）することができるので、例えば動脈硬化性疾患、糖尿病性合併症などの予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、動脈硬化性疾患（例、心筋梗塞、不安定狭心症など）の治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を調節（促進または阻害；好ましくは阻害）する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を調節（促進または阻害；好ましくは阻害）する化合物またはその塩を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ：グリシン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｃｙｓ：システイン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ：リジン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｐｒｏ：プロリン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ｇｌｎ：グルタミン
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ：メチル基
Ｅｔ：エチル基
Ｂｕ：ブチル基
Ｐｈ：フェニル基
ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ：ホルミル
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｃｌ_２−Ｂｚｌ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｕｍ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
グルコシルセラミド合成酵素のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するグルコシルセラミド合成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ラクトシルセラミド合成酵素のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラクトシルセラミド合成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で用いられたセンスプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で用いられたアンチセンスプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１で用いられたセンスプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例１で用いられたアンチセンスプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ＧＭ３合成酵素のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するＧＭ３合成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。

以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ウサギ大動脈の動脈硬化病巣でのグルコシルセラミド合成酵素およびラクトシルセラミド合成酵素の発現検討
５週齢ニュージーランド白色家兎（Ｋｂｌ：ＮＺＷ）を０．５％コレステロール添加ＲＣ−４飼料で８週間飼育後、さらに４週間ＲＣ−４飼料で飼育した。麻酔下、頸動脈から放血した後、大動脈起始部から胸部大動脈までのサンプリングを行った。冷却生理食塩水中で血管から脂肪組織、結合組織などのトリミングを行い、冷却ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）中で保存した。大動脈を目視により動脈硬化病変が多い部分と少ない部分とに二分割し、ＲＮｅａｓｙＦｉｂｒｏｕｓＴｉｓｓｕｅＭｉｄｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを調製した。ＴａｑＭａｎＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作成した。ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動を行い半定量的に発現量を比較検討した。ＰＣＲプライマーはウサギグルコシルセラミド合成酵素及びラクトシルセラミド合成酵素の部分配列を取得し、その塩基配列情報からデザインした。
グルコシルセラミド合成酵素のセンスプライマー１（配列番号：５）およびアンチセンスプライマー２（配列番号：６）を用いて、アニーリング温度５４℃、サイクル数３６回の条件でＰＣＲ反応を行った。
ラクトシルセラミド合成酵素のセンスプライマー３（配列番号：７）およびアンチセンスプライマー４（配列番号：８）を用いて、アニーリング温度５５℃、サイクル数３４回の条件でＰＣＲ反応を行った。
アガロースゲル電気泳動の結果、同一個体での比較から、明らかに動脈硬化病変が少ない血管部分に比較して、病変が多い血管部分でグルコシルセラミド合成酵素およびラクトシルセラミド合成酵素のｍＲＮＡ発現が亢進していることが示された。従って、動脈硬化病巣では両合成酵素活性の上昇することが示された。
実施例２
（１）ＴＨＰ−１細胞におけるＤ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）のコレステロール搬出活性に対する影響
Ｄ−ＰＤＭＰは、グルコシルセラミド合成酵素活性およびラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害することが知られており（ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．，１３巻，４８１−４８６頁，１９９６年）、その濃度および処理時間に依存して細胞内のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドを枯渇させることが可能であることが知られている（ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），１１７巻，７６６−７７３頁，１９９５年）。この化合物を用いて、細胞内の糖脂質の蓄積を阻害したときのコレステロール搬出活性に対する影響を調べた。
１２ウェルプレート（ファルコン社）に１ウェル当たり８．０×１０^５個に懸濁したＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣより購入；ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ．，２６巻，１７１−１７６頁，１９８０年）を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（最終濃度：１００ｎＭ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＢＳ，２５ｍＭＨＥＰＥＳ，ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）で３日間処理しマクロファージ様に分化させた。ＰＢＳで洗浄後、［^３Ｈ］コレステロールでラベルされたβＶＬＤＬ（最終コレステロール濃度：１５０μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加し、２４時間培養させ泡沫化細胞を作製した。０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄、さらにＰＢＳで１回洗浄した後に、０、１０および２０μＭのＤ−ＰＤＭＰをそれぞれ含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加し、２４時間および４８時間処理した。細胞上清を取り除き、ヒトアポリポプロテインＡＩ（ケミコン社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（最終濃度：２５μｇ／ｍｌ）を添加してから６時間後に、細胞上清に放出された放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。さらに、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後に、０．１％ＳＤＳを含む０．１ＮＮａＯＨ水溶液で細胞を溶解し、その一部を採取し放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
コレステロール搬出時活性は、以下の式から算出した。
コレステロール搬出活性（％）
＝細胞上清の放射活性／（細胞上清の放射活性＋細胞ライセートの
放射活性）×１００
結果を表１に示す。数値は平均±標準偏差で表記した。

表１に示したように、Ｄ−ＰＤＭＰは濃度依存的、時間依存的にコレステロール搬出活性を促進させた。これより、グルコシルセラミド合成酵素活性およびラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害することは、細胞内のコレステロール搬出活性を促進し動脈硬化を退縮させることになる。
（２）ＴＨＰ−１細胞におけるスフィンゴ糖脂質のコレステロール搬出活性に対する影響
上記（１）と同様に細胞の調製を行った。調製した泡沫化細胞を洗浄した後に、１０μＭのグルコシルセラミド（マトレヤ社）およびラクトシルセラミド
（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）をそれぞれ含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加し２４時間処理した。細胞上清を取り除き、ヒトアポリポプロテインＡＩ（ケミコン社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（最終濃度：２５μｇ／ｍｌ）を添加してから６時間後に、上記（１）と同様の方法で、コレステロール搬出活性を測定した。
結果を表２および表３に示す。数値は平均±標準偏差で表記した。

表２および表３に示したように、グルコシルセラミドまたはラクトシルセラミドを培養系に外因性に添加することにより、コレステロール搬出活性が抑制された。以上の結果は、グルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドの細胞内蓄積は、動脈硬化形成促進的に作用することを示す。これより、細胞内糖スフィンゴ脂質を低下させるような化合物、例えばグルコシルセラミド合成酵素活性または（および）ラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害する化合物は、動脈硬化発症を抑制する薬剤となる妥当性が示された。
実施例３
ＴＨＰ−１細胞におけるＤ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）の変性リポタンパク取り込み活性に対する影響
６ウェルローセルバインディングプレート（ＮＵＮＣ社）に１ウェル当たり１．５×１０^６個に懸濁したＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣより購入）を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（最終濃度：１００ｎＭ）添加のＲＰＭＩ−１６４０培地（０．４％ＦＢＳ，２５ｍＭＨＥＰＥＳ，ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）またはＰＭＡ（最終濃度：１００ｎＭ）およびＤ−ＰＤＭＰ（最終濃度：２０μＭ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（０．４％ＦＢＳ，２５ｍＭＨＥＰＥＳ，ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）で２日間処理した。次に、処理した細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した後に、ＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）標識アセチルＬＤＬ（フナコシ社、最終濃度：２０μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、３７℃で９０分間、振とうさせながらインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、セルフィックスバッファー（ＢＤ社）に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）にてＤｉＩ標識アセチルＬＤＬの取り込みを解析した。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート単独で処理した細胞のＦＡＣＳ解析で得られた中間値を１００％として各条件の相対値を求めた。
結果を表４に示す。数値は平均±標準偏差で表記した。

表４より、Ｄ−ＰＤＭＰはアセチルＬＤＬの取り込み活性を抑制することが明らかとなった。
以上の結果から、マクロファージ細胞においてグルコシルセラミド合成酵素活性およびラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害することで細胞への変性リポタンパクの取り込みを抑制することが明らかとなった。つまり、グルコシルセラミド合成酵素活性または（および）ラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害する化合物は、動脈硬化病変に浸潤している単球またはマクロファージ細胞において変性リポタンパクの取り込み抑制に基づく泡沫化阻害により、抗動脈硬化的に作用する薬剤になることを示す。
実施例４
（１）グルコシルセラミド合成酵素発現ベクターの構築
配列番号：２で表される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを、２種のプライマー（配列番号：９および配列番号：１０）を用いてＰＣＲ法により合成した。
ヒト型グルコシルセラミド合成酵素遺伝子は、ＩＭＡＧＥクローン５２７４７６８（インビトロジェン社）から取得した。該反応における反応液の組成は２μｌのＩＭＡＧＥクローン５２７４７６８のプラスミドＤＮＡ、５μｌの１０×Ｐｆｕバッファー（ストラタジーン社）、１μｌのＨｏｔｓｔａｒｔＰｆｕ（ストラタジーン社）、２０μＭのプライマーを各１μｌ、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰおよび３６μｌの蒸留水を加え、液量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃・１０分の伸長反応を行った。該反応終了後、ＰＣＲピューリフィケーションキット（キアゲン社）により精製した５００ｎｇのＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩにより消化した後、クリーンアップキット（キアゲン社）で精製した。同様にｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、クリーンアップキット（キアゲン社）により精製した。
１００ｎｇのＰＣＲ産物と５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター断片および５μｌのＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ２ソリューションＩを混合して１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られた形質転換株を培養後、プラスミドＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングｖｅｒ３．１を用いてシークエンス反応を行い、３１００ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列を決定し、配列番号：２（ＯＲＦを全て含有）で表される塩基配列と一致するクローンを選択した。
（２）グルコシルセラミド合成酵素阻害剤のスクリーニング
酵素源の調製は以下に示す方法で行った。
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより購入；ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６巻，５９−７４頁，１９７７年）を血清含有ＤＭＥＭ培地で培養し、遺伝子導入の前日に１０ｃｍコラーゲンコートプレート（イワキ社）に１．２ｘ１０^６個を播種した。血清不含ＤＭＥＭ培地で洗浄後、４μｇの上記（１）で得られたヒト型グルコシルセラミド合成酵素発現ベクター、３０μｌのＬｉｐｏｐｈｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社）、および２０μｌのＰＬＵＳ試薬（インビトロジェン社）を、１．５ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ培地（インビトロジェン社）に加え、遺伝子導入を行った。３７℃，５％ＣＯ_２の条件で４８時間培養した後、ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのＭ−ＰＥＲ（ピアス社）を用いて溶解後、２７，０００ｘｇで１０分間遠心し、得られた可溶性画分を酵素源として用いた。酵素アッセイは、反応溶液５０μｌ中に、１０μｇの粗酵素溶液、５００ｎｍｏｌのトリスバッファー（ｐＨ７．５）、３０ｎｍｏｌのＣ８セラミド（バイオモル社）および３７５ｐｍｏｌの［^１４Ｃ］ＵＤＰｇｌｕｃｏｓｅ（アマシャム社、７．４ＧＢｑ／ｍｍｏｌ，９２５Ｋｂｑ／ｍｌ）を３２℃で２時間インキュベートさせた。１００μｌのクロロホルム・メタノール（２：１）を添加し反応を終了させ、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、クロロホルム層を採取し液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。活性値は以下に示す式から算出した。
グルコシルセラミド合成酵素活性（ｎｍｏｌ／ｍｇ・ｈｒ）
＝酵素反応物の放射活性（ｃｐｍ）／［^１４Ｃ］ＵＤＰ−グルコースの比放射活性
（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）×１／タンパク量（ｍｇ）・反応時間（ｈｒ）
測定した結果を表５に示す。数値は平均±標準偏差で表記した。

上記の方法を用いてグルコシルセラミド合成酵素活性を阻害することが知られているＤ−ＰＤＭＰについて検討を行い、ＩＣ_５０値をＳＡＳ前臨床パッケージｖｅｒ．５で算出したところ、１．５μＭであった。この酵素アッセイ系を用いることによりグルコシルセラミド合成酵素のスクリーリニングを行う。

本発明で用いられるタンパク質は、動脈硬化病巣で特異的に発現亢進している。よって、グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の産生を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、動脈硬化や動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤として安全に使用することができる。
さらに、（ａ）（ｉ）グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の活性を阻害および（ｉｉ）ＧＭ３合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、（ｂ）（ｉ）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害および（ｉｉ）ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、（ｃ）（ｉ）グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の産生を阻害および（ｉｉ）ＧＭ３合成酵素の産生を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、動脈硬化や動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤として安全に使用することができる。
また、グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素は、動脈硬化や動脈硬化性疾患（例、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）；冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）；大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）；腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）；末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）など）；糖尿病や糖尿病性合併症（例、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症など）；メタボリック症候群（インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、高脂血症、高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群）などの予防・治療剤のスクリーニングに有用である。

Claims

グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬。
グルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬。
グルコシルセラミド合成酵素が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１または２記載の医薬。
グルコシルセラミド合成酵素が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である請求項１または２記載の医薬。
ラクトシルセラミド合成酵素が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１または２記載の医薬。
ラクトシルセラミド合成酵素が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である請求項１または２記載の医薬。
さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を含有してなる請求項１記載の医薬。
さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる請求項２記載の医薬。
ＧＭ３合成酵素が、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項７または８記載の医薬。
ＧＭ３合成酵素が、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩である請求項７または８記載の医薬。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
配列番号：１または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
動脈硬化の予防・治療用医薬である請求項１２記載の医薬。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる請求項１３記載の医薬。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ。
配列番号：１または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる医薬。
動脈硬化の予防・治療用医薬である請求項１６記載の医薬。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる請求項１７記載の医薬。
グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の予防・治療用医薬。
さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる請求項１９記載の医薬。
グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の診断薬。
さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を含有してなる請求項２１記載の診断薬。
グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法。
さらに、ＧＭ３合成酵素に対する抗体を用いる請求項２３記載の診断方法。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる動脈硬化の診断薬。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる請求項２５記載の診断薬。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる請求項２７記載の診断方法。
動脈硬化の診断薬の製造のための、グルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または（および）ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用。
動脈硬化の診断薬の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
哺乳動物の血漿中のグルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の診断方法。
さらに、ＧＭ３の量を測定する請求項３１記載の診断方法。
グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミドの動脈硬化の診断マーカーとしての使用。
さらにＧＭ３を用いる請求項３３記載の使用。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項３５記載のスクリーニング方法。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する請求項３７記載のスクリーニング用キット。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する請求項４１記載のスクリーニング用キット。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または量を測定する請求項４３記載のスクリーニング方法。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（および）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防・治療剤のスクリーニング方法。
さらに、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの量を測定する請求項４５記載のスクリーニング方法。
グルコシルセラミド合成酵素または（および）ラクトシルセラミド合成酵素の活性を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法。
さらに、ＧＭ３合成酵素の活性を阻害する請求項４７記載の方法。
グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法。
さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現を阻害する請求項４９記載の方法。
グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法。
さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤の有効量を投与する請求項５１記載の方法。
グルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の予防・治療方法。
さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する請求項５３記載の方法。
動脈硬化の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素阻害剤または（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の使用。
さらに、ＧＭ３合成酵素阻害剤を用いる請求項５５記載の使用。
動脈硬化の予防・治療剤の製造のためのグルコシルセラミド合成酵素遺伝子または（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用。
さらに、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる請求項５７記載の使用。