WO2006028241A1 - 動脈硬化の予防・治療用医薬 - Google Patents

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Hiromitsu Fuse
Sachio Shibata
Hideaki Tojo
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Definitions

  • the present invention relates to a drug for prevention / treatment of arteriosclerosis, screening of the drug, a diagnostic agent for arteriosclerosis, a diagnostic marker for arteriosclerosis, and the like.
  • ischemic organ diseases such as ischemic heart disease and cerebrovascular disorder that occupy the top cause of death.
  • the pathomorphological features of atherosclerotic lesions are fatty streak, in which cells mainly composed of macrophages (foamed cells) that accumulate cholesterol ester under the skin are accumulated, and further progressed. It is a fibrous plaque with infiltration of smooth muscle cells, macrophages, T cells, etc., cell death, and lipid accumulation.
  • LDL-C low density lipoprotein monocholesterol levels
  • statins a HMG_CoA reductase inhibitor
  • HMG_CoA reductase inhibitor a HMG_CoA reductase inhibitor
  • Oxygen LDL not only foams macrophage cells, but also exhibits arteriosclerosis-inducing effects on vascular endothelial cells, smooth muscle cells, and macrophage cells. One of these is thought to be the induction of apoptosis. It is done.
  • the present inventors have reported that an enzyme involved in the metabolic system of ceramide plays an important role in the apoptosis of foamed macrophages and is involved in the formation of arteriosclerosis (W0 03/78624). )
  • Darcosylceramide is a precursor of glycosphingolipid contained in the plasma membrane, and its expression or activity regulation is known to be involved in biochemical or pathophysiological processes (development, differentiation, canceration, etc.) It has been.
  • An enzyme that synthesizes darcosylceramide (darcosylceramide synthase) knocks down before 9.5 days of fetality, indicating that glycosphingolipids are generated and differentiated. (Biochim. Biophys. Acta., 1525, 1-12, 2001).
  • Ratatosylceramide is a substance produced by adding galactose to dalcosylceramide. It is a multiple metabolic system on the glycosphingolipid metabolic system (gala, ganglio, cashmere, rat, neolacto, It is a substance at the branching point to the glopo- and iso-glopo-systems (Experimental Medicine Series Understanding Glycobiology, 44-52, 2002). By adding lactosylceramide to the culture system, human vascular smooth muscle It is known that proliferation activity is increased in cells (Biochem. Biophys. 'Res.
  • D-PDMP D-threo-1-phenyl-2--2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
  • darcosylceramide synthase or latatosylceramide synthase is an insulin-induced IRS-1 It has been reported to suppress the action of TNF- ⁇ , which inhibits phosphoric acid (J. Biol. Chem., 277, 3085-3092, 2002).
  • a drug for the prevention / treatment of arteriosclerosis comprising a darcosylceramide synthase inhibitor or (oppi) lactosylceramide synthase inhibitor,
  • a drug for the prevention / treatment of diabetes comprising a darcosylceramide synthase inhibitor or (and) a latatosylceramide synthase inhibitor
  • a drug for the prevention / treatment of arteriosclerosis comprising a darcosylceramide synthase gene expression inhibitor or (and) a ratatosylceramide synthase gene expression inhibitor
  • a drug for the prevention / treatment of diabetes comprising an expression inhibitor of darcosylceramide synthase gene or (and) an inhibitor of expression of lactosylceramide synthase gene,
  • composition for preventing / treating diabetes further comprising an expression inhibitor of a darcosylceramide synthase gene or (and) an inhibitor of an expression of a latatosylceramide synthase gene ,
  • lactosylceramide synthase is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof, [7] and GM 3 synthase
  • [1], [2], [2], the following [1 9] or [1 9 b], which comprises an inhibitor
  • GM 3 synthase is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a partial peptide thereof or a salt thereof. [7] or [8] the pharmaceutical according to the above,
  • [1 1] Complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof
  • An antisense polynucleotide comprising a basic sequence or a substantially complementary base sequence or a part thereof,
  • SEQ ID NO: 1 or (and) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a part thereof
  • a pharmaceutical comprising siRNA or sRNA against a polynucleotide encoding a partial peptide
  • a drug for the prevention / treatment of arteriosclerosis comprising an antibody against darcosylceramide synthase or an antibody against (oppi) lactosylceramide synthase,
  • a drug for the prevention / treatment of diabetes comprising an antibody against darcosylceramide synthase or (and) an antibody against lactosylceramide synthase,
  • a diagnostic agent for arterial stiffness comprising an antibody against darcosylceramide synthase or (and) an antibody against lactosylramide synthase,
  • a diagnostic agent for diabetes comprising an antibody against darcosylceramide synthase or (and) an antibody against lactosylceramide synthase,
  • [2 3] a method for diagnosing arteriosclerosis, characterized by using an antibody against darcosylceramide synthase or (and) an antibody against ratatosylceramide synthase,
  • Diabetes diagnosis method comprising using an antibody against darcosylceramide synthase or (and) an antibody against lactosylceramide synthase,
  • a diagnostic agent for arteriosclerosis comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof,
  • a diagnostic agent for diabetes comprising a polynucleotide having a protein or partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence,
  • [2 7] A polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof And / or a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof. Diagnostic method,
  • [2 7 a] A polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, and (and) represented by SEQ ID NO: 3
  • a method for diagnosing diabetes comprising using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof,
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 is identical or actual.
  • [31] a method for diagnosing arteriosclerosis, characterized by measuring the amount of darcosyl ceramide or (and) lactosyl ceramide in mammalian plasma,
  • [3 1 a] A method for diagnosing diabetes characterized by measuring the amount of darcosylceramide or (and) ratatosylceramide in the plasma of mammals,
  • [3 5] A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, or a salt thereof, and / or (and) SEQ ID NO: 3
  • a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerosis characterized by using a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • [3 5 a] SEQ ID NO: 1 Identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 1 A protein containing the amino acid sequence or a partial peptide thereof, or a salt thereof, or (and) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a portion thereof
  • a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for diabetes characterized by using a peptide or a salt thereof [3 6] and further comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • a screening method according to the above [3 5] which uses a protein to be produced or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, and (and) SEQ ID NO: 3 A kit for screening a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerosis, comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or a salt thereof (and) SEQ ID NO: 3 A kit for screening a prophylactic / therapeutic agent for diabetes, comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, [3 8] The screening kit according to [3 7] above, which comprises a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • SEQ ID NO . A polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide thereof And / or a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof, Screening methods for preventive and therapeutic agents,
  • the method is characterized in that a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 or a polynucleotide coding for a solitary partial peptide is used.
  • [4 1] A polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, and / or (SEQ ID NO: 3)
  • a kit for screening a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerosis comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof,
  • [4 1 a] Polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof and / or (SEQ ID NO: 3) A protein having the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof
  • a kit for screening for a prophylactic / therapeutic agent for diabetes comprising a polynucleotide encoding
  • a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerosis characterized by measuring the activity or amount of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for diabetes characterized by measuring the activity or amount of a protein or partial peptide or salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence ,
  • SEQ ID NO: 1 identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 1
  • a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence or a partial peptide thereof; and (and) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof
  • a method for screening a therapeutic agent for preventing or treating arteriosclerosis characterized by measuring the amount of the encoded polynucleotide
  • [4 5 a] Polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, and / or (SEQ ID NO: 3) A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for diabetes, characterized by measuring the amount of a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof,
  • the amount of the polynucleotide encoding the protein having the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a partial peptide thereof is measured [45] ] The screening method described in the above,
  • [4 7] a method for preventing and treating arteriosclerosis characterized by inhibiting the activity of darcosylceramide synthase or (and) latatosylceramide synthase,
  • [47a] a method for preventing / treating diabetes characterized by inhibiting the activity of darcosylceramide synthase or (and) lactosylceramide synthase,
  • [4 9b] The method for preventing and treating arteriosclerosis according to [4 7] above, further comprising inhibiting the expression of a darcosylceramide synthase gene or (and) a ratatosylceramide synthase gene,
  • a method for preventing and treating arteriosclerosis characterized by administering an effective amount of a darcosylceramide synthase gene or (and) lactosylceramide synthase gene expression inhibitor to a mammal,
  • [5 7 a] Use of darcosylceramide synthase gene or (and) lactosylceramide synthase gene expression inhibitor for the manufacture of diabetes prevention and treatment agent, [5 7 b] Furthermore, darcosylceramide synthesis The use according to [5 5] above, wherein an enzyme gene or (and) lactosylceramide synthase gene expression inhibitor is used,
  • Glucosylceramide synthase used in the present invention
  • glucosyltransf erase ceramide: UDPGlc glucosyltransferase ⁇ uridine diphosphoglucose-ceramide glucosyltransf erase ⁇ ceramide: UDP-glucose glucosyltransf erase ⁇ ceramide glucosyltransf erase etc. It is an enzyme that catalyzes the synthesis reaction of darcosylceramide that is biosynthesized by transfer to a hydroxyl group. Ratatosylceramide synthase (Lactosylceramide) used in the present invention
  • GM 3 synthase used in the present invention (Ganglioside GM3 synthase;
  • CMP-sialic acid lactosylceramide ⁇ -2,3 sialyltransferase (CMP-NeuAc: lactosylceramide alpha-2,3-sialyl transferase)
  • CMP-NeuAc lactosylceramide alpha-2,3-sialyl transferase
  • GM3 synthesized by transferring sialic acid derived from acid (CMP-N-acetylneuraminate) to the non-reducing terminal galactose of ⁇ D-galactosyl-1,4- ⁇ -D-glucosylceramide via ⁇ -2,3 bond a -N-acetylneuraminyl-2, 3- ⁇ -D-galactosyl-1,-j3 -D-glucosylceramide).
  • this protein may be referred to as protein A of the present invention or protein A used in the present invention.
  • a latatosylceramide synthesizing enzyme for example, a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (hereinafter, this protein is referred to as protein B of the present invention).
  • protein B of the present invention Alternatively, it may be referred to as protein B used in the present invention.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (Hereinafter, this protein may be referred to as protein C of the present invention or protein C used in the present invention. ) And the like (hereinafter, these proteins, sometimes referred to as protein used in the protein of the invention or).
  • the protein used in the present invention is a human warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, hidge, ushi, monkey, etc.) (for example, moon dried cells, spleen cells, nerve cells, Glial cells, knee ⁇ 8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, fat cells, immune cells (Eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts , Osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 11 is about 50% or more, preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 1 include, for example, the above-mentioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 Or a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1, and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 A protein having substantially the same activity as that of the protein is preferable.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the like. A protein consisting of the amino acid sequence represented by 1 is preferably used.
  • substantially the same activity examples include an enzyme activity that catalyzes a synthesis reaction of darcosylceramide (darcosylceramide synthase activity).
  • Substantially homogeneous means that their properties are homogeneous in nature (eg, physiologically or pharmacologically). Accordingly, it is preferable that the darcosylceramide synthase activity is equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by 3 is preferably used.
  • the activity of the same quality is catalyzed by the synthesis reaction of latatosylceramide.
  • Enzyme activity (latatosylceramide synthase activity).
  • Substantially homogeneous means that their properties are homogeneous in nature (eg, physiologically or pharmacologically).
  • the lactosylceramide synthase activity should be equivalent (eg, about 0.1 1 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1, and the like. : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 1 1 is preferably used.
  • the substantially homogeneous activity includes, for example, an enzyme activity that catalyzes a synthesis reaction of GM 3 (GM 3 synthase activity).
  • GM 3 synthase activity an enzyme activity that catalyzes a synthesis reaction of GM 3
  • substantially homogeneous means that their properties are homogeneous in nature (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, the GM 3 synthase activity should be equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.1 to: L 0 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Darcosylceramide synthase activity can be measured using known methods such as Methods in
  • the darcosylceramide is separated by (thin-layer chromatography, TLC), and the fluorescence intensity is detected and measured with a device capable of fluorescence imaging (eg LAS-1000 (manufactured by Fuji Film)).
  • a device capable of fluorescence imaging eg LAS-1000 (manufactured by Fuji Film)
  • Ratatosylceramide synthase activity can be measured using known methods such as Methods in
  • the method for measuring the amount of darcosylceramide or lactosylceramide contained in cells or yarns and weaves is a known method, for example, Basic Biochemical Experiments, Chapter 5, Chapter 11, pages 135-141, 2000. Measured by the method described or a method analogous thereto.
  • Measurement of GM3 synthase activity is performed using a known method, for example, by incubating CMP-sialic acid (10-100 nmol) and enzyme at 37 ° C for a certain period of time using ratatosylceramide as a substrate.
  • Methods for quantifying GM3 produced by eg, Methods in
  • the cell surface layer or intracellular GM3 in a GM3 synthase-expressing cell line is quantitatively detected using an anti-GM3 antibody.
  • Cell surface GM3 is immobilized with formaldehyde, reacted with anti-GM3 antibody (eg Clone M2590), then reacted with HRP-labeled anti-mouse IgM antibody or AP-labeled anti-mouse IgM antibody, chemiluminescence system or color development It is detected by the system (J. Biol. Chem., 277, 47028-47034, 2002). Moreover, was immobilized, etc.
  • the amount of intracellular GM3 can be detected by pretreatment of the cells with TritonX-100 or the like (J. Cell. Phys., 141 ⁇ , 573-583, 1989).
  • inhibitortion of darcosylceramide synthase means inhibition of darcosylceramide synthase activity or production of darcosylceramide synthase (preferably inhibition of darcosylceramide synthase activity). Either one.
  • the term “darcosylceramide synthase inhibitor” means a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or Inhibiting the production of a compound containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; Or a salt thereof (preferably a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or a compound or its salt that inhibits the activity of its partial peptide or its salt.
  • darcosylceramide synthase gene expression inhibitor refers to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or its A compound that inhibits the expression of a polynucleotide encoding a partial peptide or a salt thereof is used.
  • lactosylceramide synthase inhibition means either inhibition of latatosylceramide synthase activity or inhibition of production of latatosylceramide synthase (preferably, inhibition of lactosylceramide synthase activity). It may be.
  • lactosylceramide synthetase inhibitor refers to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof, or A compound that inhibits the activity of the salt or a salt thereof; inhibits the production of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof, or a salt thereof Compound or a salt thereof (preferably a compound that inhibits the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Or any salt thereof).
  • lactatosylceramide synthase gene expression inhibitor refers to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a portion thereof.
  • a compound that inhibits the expression of a polynucleotide encoding a peptide or a salt thereof is used.
  • GM 3 synthase inhibition refers to either inhibition of GM 3 synthase activity or inhibition of production of GM 3 synthase (preferably inhibition of GM 3 synthase activity). There may be.
  • GM 3 synthase inhibitor refers to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 A compound that inhibits the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof; or a salt thereof; SEQ ID NO: 11 a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 A compound that inhibits the production of peptide or a salt thereof, or a salt thereof (preferably a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a partial peptide thereof or Any of the compounds that inhibit the activity of salts or salts thereof).
  • GM 3 synthase gene expression inhibitor refers to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a partial peptide thereof.
  • a compound that inhibits the expression of a polynucleotide that encodes or a salt thereof is used.
  • Examples of the protein used in the present invention include (1) 1 or 2 or more of amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 11 (for example, 1 to 2). About 100 amino acids, preferably about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably a few (1 to 5) amino acids, (2) SEQ ID NO: 1, 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 1 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30 and preferably 1 to 10) (3) an amino acid sequence to which several (1 to 5) amino acids are added, (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 1 Or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30 and preferably about 1 to 10 More preferably, an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are inserted, (4) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
  • amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, The position of deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein used in the present invention has an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (forced loxyl terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, has a C-terminal group consisting of a force loxyl group (-C00H), a carboxylate (-C00- ), Amide (—C0NH 2 ) or ester (—C00R).
  • R in the ester e.g., methyl
  • E Ji lambda ⁇ , .eta. propyl isopropyl
  • .eta. C alkyl group such as butyl, for example, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl cyclopentyl, to cyclo, for example, Hue Le, alpha-naphthyl of which 6 _ 12
  • Ariru group e.g., benzyl, or phenyl one ⁇ alkyl group such as phenethyl alpha - c DOO 14
  • Ararukiru groups such as flying one Nafuchiru Cw alkyl group such as naphthylmethyl, Viva A royloxymethyl group or the like is used.
  • the protein used in the present invention has a carboxyl group (or force oxyloxylate) other than the C-terminal
  • the protein used in the present invention also includes those in which the force oxyl group is amidated or esterified. It is.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the protein used in the present invention the amino acid residue (e.g., main Chionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C M Arukanoiru such Asechiru group) Protected with, N-terminal glutamine residue produced by cleavage in vivo pyroglutamic acid, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, -0H, -SH, amino group , An imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (for example, a C acyl group such as a formyl group, an acetyl group, etc.) or a sugar chain
  • an appropriate protecting group for example, a C acyl group such as a formyl group, an acetyl group, etc.
  • complex proteins such as so-called glycoproteins bound by.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one is acceptable. Specifically, for the purpose of preparing the antibody of the present invention described later, at least 20 or more, preferably 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 11 Peptides having an amino acid sequence of 0 or more, more preferably 70 or more, more preferably .100 or more, most preferably 200 or more are used.
  • the partial peptide used in the present invention has a deletion of 1 or 2 (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably a number (1 to 5) pieces) of amino acids are inserted into the amino acid sequence, or One or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 10, more preferably about several, and more preferably about 1 to 5) may be substituted with other amino acids.
  • the C-terminus may be any one of a carboxyl group (—C00H), a carboxylate (_C00—), an amide (—C0NH 2 ), or an ester (—C00R).
  • the partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C terminus, as in the above-described protein used in the present invention.
  • a methionine residue) amino group is protected with a protecting group, the N-terminal side is cleaved in vivo and the resulting glutamine residue is pyroglutamic acid, substitution on the side chain of amino acid in the molecule A group whose group is protected with an appropriate protecting group, or a so-called glycopeptide with a sugar chain attached
  • the complex peptide is also included.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for antibody production.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal salt
  • the acid addition salts that are acceptable are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein used in the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method, or DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing a transformant containing. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxyl.
  • Xymethylmethyl phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4-one (2, 4, 4-dihydroxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4-one (2 ', 4, dimethyoxyphenyl 2-F moc aminoethyl) phenoxy Resins can be mentioned.
  • Q! -Amino group and an amino acid having an appropriately protected side chain functional group are condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein.
  • the protein or partial peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and the intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amides.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and in particular, carposimides are preferable.
  • the carpositimides include DCC, N, N′-diisopropyl carpositimide, N-ethyl N, mono (3-dimethylaminoprolyl) carpositimide, and the like.
  • a protected amino acid together with a racemization-suppressing additive (for example, HO B t, HO OB t) to the resin, or symmetrical anhydride, HOB t ester or HO OB t ester
  • a racemization-suppressing additive for example, HO B t, HO OB t
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and black mouth form, alcohols such as trifluoroethanol, etc.
  • Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof. .
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be used for protein bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, B oc, t-pentyloxy force sulfonyl, isoponyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantino oxycanoleponyl, trifluoroa cetinole, phthaloidore, honoreminore, 2-nitrophenolesnorefenenore, difeninore phosphinochi oil, Fmo c, etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example, linear, branched, such as methyl, ethyl, -propinole, butinole, t-butinole, cyclopentinole, cyclohexenole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified for example, linear, branched, such as methyl, ethyl, -propinole, butinole, t-butinole, cyclopentinole, cyclohexenole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Cyclic alkyl esterification aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzene / leestenole, 4-methoxybenzenoestenole, 4_black benzene ester, benzhydryl ester) ), Phenacyl esterification, pendinoreoxycarbonyl hydrazide, teptoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, and the like.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzene / leestenole, 4-methoxybenzenoestenole, 4_black benzene ester, benzhydryl ester
  • Phenacyl esterification pendinoreoxycarbonyl hydrazide, teptoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for esterification include, for example, low-grade (C ⁇ ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Yes.
  • examples of the group suitable for the ether group include a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r-Z, such as t one-heptyl is used.
  • protecting groups for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Biim, Boc, Trt, Fmoc, etc. .
  • activated lpoxyl groups of raw materials include corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2, 4,5-trichlorophlool, 2,4-dinitrophenol, cyanomethylanolosele, paranitrophenol, HO NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HO B t), etc.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2, 4,5-trichlorophlool, 2,4-dinitrophenol, cyanomethylanolosele, paranitrophenol, HO NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HO B t
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • -Protecting group removal (elimination) methods include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride or methanesulfone.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4
  • it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide of a protein or partial peptide for example, first, a carboxyl group of a carboxy terminal amino acid is protected by amidation, and then a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on the amino group side. After that, the protein or partial peptide from which only the protecting group of the amino group at the terminus of the peptide chain is removed and the protein or partial peptide from which only the protecting group of the C-terminal carboxyl group has been removed are removed.
  • the details of the condensation reaction are the same as described above for producing a tide and condensing these proteins or peptides in a mixed solvent as described above.
  • an ester of a protein or peptide for example, the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein or peptide.
  • a peptide ester can be obtained.
  • the partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptide.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining part, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by eliminating the protective group. can do.
  • Known condensation methods and protecting group removal include, for example: ) To 5).
  • Partial peptides can be purified and isolated.
  • a known method can be converted to an appropriate salt by a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, Alternatively, it can be converted into a free form or other salt by a method according to the method.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the protein used in the present invention described above.
  • DNA is preferred.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell 'tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell' tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • using the above-mentioned cell 'tissue prepared from totalR NA or mR NA using the above-mentioned cell 'tissue prepared from totalR NA or mR NA.
  • RT Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the protein used in the present invention examples include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 1 2 containing a base sequence that hybridizes under high stringent conditions with a base sequence represented by 2 or the like, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by 1.
  • DNA that can be hybridized with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 1 2 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 1 About 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, Most preferably, DNA containing a base sequence having about 95% or more homology is used.
  • -Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). it can.
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 Indicates conditions at 5 ° C.
  • the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 1 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 3 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, such as DNA S, SEQ ID NO: 1
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 is used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above. Also, any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • T is, for example, D having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12 NA, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO No .: 1 Contains the base sequence represented by 2 and the base sequence that hybridizes under highly stringent conditions.
  • ⁇ A portion of DN ⁇ ⁇ ⁇ that encodes a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention Containing DN ⁇ etc. is used.
  • DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 1 2 has the same significance as described above.
  • Hybridization methods The same high stringency conditions as described above are used.
  • DNAs that completely encode the proteins and partial peptides used in the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated as the proteins of the present invention)
  • the ability to amplify by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the protein of the present invention or the DNA incorporated into an appropriate vector is used. It can be selected by hybridization with DNA fragments coding for a part or all of the DNA or those labeled with synthetic DNA. For example, the method
  • the DNA base sequence is converted using PCR, a well-known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Bio), Mutan TM -K (Takara Bio), etc. Method, Gapped duplex method, Kunkel method and the like, or a method according to them.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3, terminal side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the protein expression vector of the present invention is, for example, (i) excising the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention, and (ii) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured.
  • vectors examples include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), and plasmids derived from yeast.
  • Eg, p SH19, p SH15 pacteriophages such as lambda phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and paculovirus, pAl_l l, pXT l, R c / CMV, p R c / RS V, pc DNA I / Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal parcels are mainly used, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRo cytomegalovirus
  • promoter etc. are preferably used.
  • the host is Eshierihia genus bacteria, tr p promoter, lac promoter, re cA promoter,; LP L promoter, if lpp promoter, T 7 promoter, the host is Ru der Bacillus, spol promoter, When the host is yeast such as SP02 promoter, penP promoter, etc., PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferable.
  • the expression vector contains an enhancer, a splicing signal, a carrier signal with poly A, a selectable marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexade (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), neomycin Tolerance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance).
  • dhfr gene when used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can be selected even in a medium containing no thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, In the case of yeast, MF ⁇ signal sequence, SUC 2 signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. Available.
  • a transformant can be produced by using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
  • hosts examples include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli
  • subtilis M I 1 14 [Gene, 24 ⁇ , 255 (1 983)], 207-21
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH 22 R—, NA87— 1 1A, DKD—5D, 20 B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 191 3, NCYC2036, Pichia pastoris K M71 etc. are used.
  • Insect cells for example, when the virus is Ac NPV, the larvae of the night stealer, Spodoptera frugiperda cell; SMG, MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, Trichoplusia High Five TM cells derived from ni eggs, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • SmNP V cocoon-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) are used.
  • S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711), S f 21 cells (above, Vaughn, J.L. et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
  • silkworm larvae are used as insects [Maeda et al., Nature, 3 1592, 592 (1 985)].
  • animal cells examples include monkey cells CO S-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr) cells)
  • CHO cells Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr) cells)
  • Mouse L cells mouse At T-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 ⁇ , 2110 (1972) and Gene, 17 ⁇ , 107 (1982) can be used to transform Escherichia bacterium. .
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is appropriate as the medium used for the cultivation, and carbon necessary for the growth of the transformant is included therein.
  • Source nitrogen source, inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn sheep 'liquor, peptone, force zein, meat extract, soybean cake, potato extract.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for culturing Escherichia bacterium, for example, M 9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in
  • a drug such as 3 j3-indolylacrylic acid can be added.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 ⁇ , 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 ⁇ , 5330 (1984)]. It is preferable to adjust the pH of the medium to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [3 ⁇ 61 ⁇ 6, 122, 501 (1952) ], DMEM medium [Virology, 8 ⁇ , 396 (1959)], RPMI 16 40 medium [The Journal of the American Medical Association Vol.199, 519 (1967)], 1990 medium
  • the pH is preferably about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer solution, and subjected to ultrasound, lysozyme, or frozen.
  • a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration after cells are destroyed by thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1100 TM .
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be performed by an appropriate combination of per se known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method using mainly the difference in molecular weight, ion exchange chromatography A method using a difference in charge such as luffy, a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectric focusing
  • a method using the difference in isoelectric point such as electrophoresis is used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, it is known per se. It can be converted into a free form or other salt by a method or a method similar thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing a suitable protein-modifying enzyme to act on the protein before or after purification.
  • suitable protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, agininoreendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by Western blotting or the like using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or its salt used in the present invention is either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody that can recognize the protein or partial peptide or its salt used in the present invention. There may be.
  • an antibody against a protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter, in the description of the antibody, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention), the protein of the present invention is used as an antigen, It can be produced according to known methods for producing antibodies or antisera.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal per se, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant is administered. May be given. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals that can be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges, goats, and chickens, with mice and rats being preferred.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells with myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP 2/0, AP-1, and P 3U 1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG6000) has a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubation at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the supernatant of the hybridoma is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or with a carrier, and then, Anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive material or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mouse) or protein A is added to detect monoclonal antibody bound to solid phase Monoclonal protein bound to the solid phase by adding the hybridoma culture supernatant to the solid phase adsorbed with the anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding the protein labeled with a radioactive substance or enzyme, etc. And the like, and the like.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive material or enzyme anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mouse
  • protein A is added to detect monoclonal antibody bound to solid phase
  • the selection of monoclonal antibodies can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium may be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPM I 16 40 medium containing 1-20% fetal bovine serum, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for high-pridoma culture SFM-1101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • Culture can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
  • Monoclonal Nanore antibody can be separated and purified by methods known per se, such as immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DE AE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Specific purification by collecting antibody only with solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the binding Law].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DE AE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Specific purification by collecting antibody only with solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the binding Law].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (protein antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting the antibody-containing material against and purifying the antibody.
  • an immune antigen protein antigen itself or a complex of it and a carrier protein
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are: Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by cross-linking with a carrier.
  • a method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to hapten 1 by weight is used.
  • various condensing agents can be used for the force pulling of the hapten and the carrier, but an active ester reagent containing glutaraldehyde / carpositimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithiobilidyl group is used. .
  • the condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier or diluent.
  • a carrier or diluent In order to enhance antibody production at the time of administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • the administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the method described above.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as that of the monoclonal antibody.
  • Polynucleotides encoding proteins or partial peptides used in the present invention eg, DNA (hereinafter, in the description of antisense polynucleotide, these DNAs may be abbreviated as DNA of the present invention)
  • DNA an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence or a part thereof, complementary to the base sequence of the polynucleotide of the present invention (eg, DNA)
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. Antisense DNA is preferred.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). And about 70% or more, preferably about 80 ° / 0 or more, more preferably about 9 Examples include nucleotide sequences having homology of 0% or more, most preferably about 95% or more.
  • the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention eg, start An antisense having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence in the vicinity of a codon, etc.
  • the polynucleotide is
  • an antisense polynucleotide directed to RNA degradation by RNase H it is about 70% or more, preferably about 80% or more, with the complementary strand of the entire base sequence of the DNA of the present invention including introns. More preferably, each of the antisense polynucleotides having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is suitable.
  • a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12 An antisense polynucleotide having a portion thereof, preferably, for example, a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12 Or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • Antisense polynucleotides are usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that composes antisense DNA are chemically modified phosphate residues such as phosphoroate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. May be substituted.
  • the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2'-O-methinolei, and the base moiety (pyrimidine, purine) is also chemically modified. Any one may be used as long as it hybridizes to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or ⁇ column number: 4.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the base sequence information of the DNA encoding the cloned or determined protein. And can be synthesized.
  • Such a polynucleotide (nucleic acid) can be hybridized with RNA of the protein gene of the present invention, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or through interaction with the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • a polynucleotide complementary to a selected sequence of the protein-related RNA of the present invention and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the protein-related RNA of the present invention are present in vivo and in vitro. It is useful for regulating 'controlling the expression of the protein gene of the invention, and for treating or diagnosing diseases.
  • the term “corresponding” means that the nucleotide sequence, including the gene, nucleotide sequence, or specific sequence of the nucleic acid is homologous or complementary.
  • “Corresponding” between nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide (protein) means amino acid of peptide (protein) in the order derived from nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement Usually pointing.
  • Protein gene 5 end hairpin loop, 5 'end 6 — base pair. Repeat, 5, end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3, end untranslated region, 3 , End palindromic region, and 3, end hairpin loop can be selected as a preferred target region. Any region within a protein gene can be selected as a target.
  • Antisense polyribonucleotides are two types of polyoxyribonucleotides that contain 2-deoxy-one D-lipose, polynucleotides that contain D-ribose, and other types that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • RNA DNA: DNA hybrids
  • unmodified polynucleotides or unmodified oligos
  • Nucleotides and also with known modifications, such as those with labels known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides in analogs
  • nuclease nuclease inhibitor, toxin, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc.
  • sugars eg, monosaccharides
  • side-chain groups intercurrent compounds
  • chelating compounds eg, metals, radioactive metals, fluorine, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents e.g., alkylating agents, modified bonds
  • alkylating agents eg, ⁇ -anomer nucleic acid
  • nucleoside nucleotide
  • nucleic acid may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases modified.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens or aliphatic groups, or ethers, amines, or other functional groups. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides. Is not something
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, make the antisense nucleic acid more stable in the cell, increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, increase the affinity for the target sense strand, and if it is toxic, Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense polynucleotides of the present invention may be altered, contain modified sugars, bases, bonds, donated in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form.
  • it can be used in addition form as a polycationic substance such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, or a lipid that enhances the interaction with the cell membrane or increases the uptake of nucleic acid (
  • hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterol).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and derivatives thereof (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3 'or 5' end of nucleic acids and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • Other groups include capping groups that are specifically located at the 3 'or 5 and ends of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. . Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as Daricol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. . Cells by various methods known per se Applicable to.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as D of the present invention) NA), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and the antisense polynucleotide of the DNA of the present invention. (Hereinafter, it may be abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention).
  • the expression of the protein of the present invention increases at an arteriosclerotic lesion, it can be used as a diagnostic marker for arteriosclerosis.
  • D-PDMP an inhibitor of darcosylceramide synthase or latatosylceramide synthase, suppresses the action of TF-symbol that inhibits insulin-stimulated IRS-1 phosphate. This protein can also be used as a diagnostic marker for diabetic complications.
  • the protein of the present invention is useful as a marker for early diagnosis in arteriosclerotic diseases or diabetic complications, and estimation of the degree of arteriosclerosis progression or diabetes progression.
  • an antisense polynucleotide of the gene encoding the protein of the present invention siRNA or sh RNA for the gene encoding the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, A compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention, a pharmaceutical preparation containing an antibody against the protein of the present invention or an antibody against the protein of the present invention, etc.
  • arteriosclerosis arteriosclerotic disease
  • cerebral arterial disease eg, cerebral infarction, cerebral bleeding
  • coronary artery disease eg, myocardial infarction, angina, etc.
  • Major artery disease eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.
  • Renal artery disease eg, nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.
  • Peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis, etc.
  • Diabetes and diabetic complications eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.
  • Metapolic syndrome hyperglycemia based on insulin resistance, high It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for syndromes showing multiple risk factors such as lipemia and hypertension.
  • darcosylceramide or ratatosylceramide synthesized by the protein of the present invention, or GM3 can also be used as a diagnostic marker for arteriosclerosis or diabetes. In other words, it is useful as a marker for early diagnosis of arteriosclerotic disease or diabetic complications and estimation of the progression of arteriosclerosis.
  • the expression of the protein of the present invention is increased in atherosclerotic lesions, and further inhibits the protein of the present invention [hereinafter referred to as “inhibiting the activity of the protein of the present invention”, “the gene of the protein of the present invention] “Inhibiting expression” and “inhibiting the production of the protein of the present invention” may be collectively referred to as “inhibiting the protein of the present invention”.
  • a compound that inhibits the protein of the present invention or a salt thereof itself may be referred to as an inhibitor of the protein of the present invention.
  • the medicament for preventing and treating arteriosclerosis of the present invention includes a compound that inhibits the protein of the present invention or a salt thereof, and a pharmaceutical composition containing the compound.
  • D-PDMP an inhibitor of darcosylceramide synthase or octosylceramide synthase, suppresses the action of T F-which inhibits insulin-stimulated phosphorylation of IRS-1.
  • Darcosyl ceramide synthase, lactosyl ceramide synthase, and GM3 synthase are enzymes involved in the gandarioside biosynthesis system.
  • Glucosylceramide synthase is an enzyme that synthesizes darcosylceramide from ceramide, latatosylceramide synthase synthesizes ratatosylceramide from darcosylceramide, and GM3 synthase synthesizes GM3 from ratatosylceramide.
  • glucosylceramide synthase is an enzyme located upstream of GM3 synthase in the gandarioside biosynthesis system.
  • the following report is an example in which the activity of darcosylceramide synthase is related to the regulation of the tissue content of GM3.
  • the expression level of glucosylceramide synthase increases in the liver, and the amount of GM3 in the liver increases with the increase in darcosylceramide synthase activity (J. Biol. Chem., 274). ⁇ , 19707-19713, 1999).
  • administration of TNF- ⁇ and IL-1 increases the amount of darcosylceramide synthase expression, and the same effect can be expected.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the protein of the present invention can be used, for example, as a drug for prevention / treatment of arteriosclerosis, arteriosclerotic disease (eg, cerebral arterial disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); (Eg, ischemic heart disease such as myocardial infarction, angina pectoris, etc.); large heart disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease (eg, nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.) Renal failure, etc.); peripheral arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis, etc.); diabetes, diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.); metabolic syndrome (Syndrome showing multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia and hypertension based on insulin resistance).
  • arteriosclerotic disease eg
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening for a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • a cell capable of producing B, the cell A method for screening a compound or its salt that inhibits the activity of protein B of the present invention, characterized by comparing the activity of latatosylceramide synthase of an extract or a purified protein thereof,
  • the present invention characterized by comparing the lipid accumulation promoting activity of protein A of the present invention with (iv) the lipid accumulation promoting activity of the mixture of protein A of the present invention and a test compound.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein A, B, and C of the present invention characterized by comparing the lipid accumulation promoting activity of the mixture of protein A, B, and C of the present invention and a test compound
  • a host transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • animal cells such as COS 7 cells, C HO cells, HE K 293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in the cells or outside the Itoda vesicles by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method for culturing the transformant of the present invention described above.
  • test compound examples include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.
  • the test compound may form a salt.
  • the salt of the test compound include metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, basic or acidic amino acids. And a salt thereof.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and strong salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and palium salt; and aluminum salt.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6 lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, hexylamine, dicyclohexylamine. N, N′-dibenzylethylenediamine and the like.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, benzoic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfuric acid Examples include salts with phonic acid, benzene sulphonic acid, and: -tonoleene sulfonic acid.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • preferable examples of salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. Is mentioned.
  • physiologically acceptable salts are preferred.
  • an alkali metal salt eg, sodium salt, potassium salt, etc.
  • Inorganic salts such as Lucari earth metal salts (eg, calcium salts, magnesium salts, barium salts, etc.), ammonium salts, etc.
  • Lucari earth metal salts eg, calcium salts, magnesium salts, barium salts, etc.
  • ammonium salts etc.
  • the compound has a basic functional group
  • hydrobromic acid Salts with inorganic acids such as nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, or organic acids such as acetic acid, futalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid Examples include salts with acids.
  • test compound that inhibits each activity in the above-mentioned case (ii) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, compared to the above-mentioned case (i). It can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • test compound that inhibits the lipid accumulation enhancing activity in the case of (iv) above by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of (iii) above. can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for inhibiting the physiological activity of the protein of the present invention.
  • the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, It is a compound selected from animal tissue extracts and plasma.
  • the salt of the compound the same salts as those of the test compound described above are used.
  • the expression of the gene of the protein of the present invention is also increased in the atherosclerotic lesion, and inhibition of the expression of the gene improves the atherosclerotic lesion. Therefore, a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention Or its salts, for example, drugs for the prevention and treatment of arteriosclerosis, arteriosclerotic diseases (eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (eg, myocardial infarction, angina pectoris, etc.) Ischemic heart disease); aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease (eg, renal failure due to nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.); peripheral arterial disease (eg, Diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetes, etc.) It can be used as a prophylactic
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • Screening methods include (V) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (vi) culturing cells capable of producing the protein of the present invention in the presence of a test compound.
  • the screening method is characterized by comparison with the above.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the polynucleotide encoding the protein (eg, mRNA) Measure and compare quantities.
  • the amount of protein is measured by a known method, for example, by using an antibody that recognizes the protein of the present invention, and measuring the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto. can do.
  • the measurement of the amount of mRNA is carried out by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12 or a part thereof as a probe, or a primer PCR method using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12, or a part thereof Or it can measure according to the method according to it.
  • the expression of the gene is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case (V).
  • a human compound can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the compound or a salt thereof preferably has, for example, an action of promoting cholesterol export activity and an action of inhibiting lipoprotein uptake activity.
  • Cholesterol export activity is measured by a known method, for example, the method described in J. Biol. Chem., 276, 43564-43569, 2001, or the like.
  • Cells are cultured in a medium containing cholesterol or cholesterol ester labeled with a radioisotope (eg, [3 ⁇ 4], [ 14 C], etc.), and a buffer solution (eg, ushi serum albumin) is cultured. Wash with a phosphate buffer solution, phosphate buffer solution, etc.) to remove radioisotopes that have not been taken up by cells.
  • a radioisotope eg, [3 ⁇ 4], [ 14 C], etc.
  • a buffer solution eg, ushi serum albumin
  • Radioactivity by exchanging with a medium containing The radioactivity of the cell lysate is also measured, and the percentage of the incorporated radioactivity is calculated in the culture supernatant.
  • ⁇ Lipoprotein uptake activity is measured by a known method, for example, the method described in Pro. Natl. Acad. Sci., 88, 4931-4935, 1991, or the like.
  • fluorescent substances eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences), etc.), fluorescamine
  • Cells are cultured in a medium containing lipoprotein (eg, low-density lipoprotein, denatured low-density lipoprotein, etc.) labeled with lettuce isothiocyanate, etc., and washed with a buffer (eg, phosphate buffer) Thereafter, the fluorescence activity is measured with a fluorescence plate reader, or after cell detachment, the lipoprotein labeled with the incorporated fluorescent substance is measured with FACS.
  • cyanine fluorescent dyes eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences), etc.
  • fluorescamine eg, Cells are cultured in a medium containing lipoprotein (eg, low-density lipoprotein, denatured low-density
  • the screening kit of the present invention contains a polynucleotide encoding the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell having the ability to produce the protein or partial peptide used in the present effort. Is.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof can be prepared by using the above-described test compound (eg, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, Plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.)
  • a compound selected from these or a salt thereof, and the activity of the protein of the present invention eg, darcosylceramide synthase activity, ratatosylceramide synthase activity, GM 3) a compound or a salt thereof that inhibits synthase activity, etc., a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or a compound or a salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention.
  • ischemic heart disease such as angina pectoris
  • aortic disease eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.
  • renal artery disease eg, renal sclerosis, renal sclerosis resulting from renal sclerosis, etc.
  • Peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis
  • Diabetes and diabetic complications eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.
  • Syndrome showing multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia and hypertension based on insulin resistance).
  • a compound or salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention a compound or salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, a compound or salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention, and the present invention
  • the antibodies of the invention can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for the above diseases by combining two or more kinds.
  • the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention can be formulated according to conventional means.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules) ), Syrups, emulsions and suspensions.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, joints' Includes dosage forms such as injections.
  • Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO—50 (polyoxyethylene (5 O mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like.
  • Oil 'I 1 as a raw solution For example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled into a suitable ampoule.
  • Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above-mentioned compound or a salt thereof with a usual suppository base.
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections It is preferable that 5 to 10 Omg, and other dosage forms contain 10 to 25 Omg of the above compound.
  • compositions may contain other active ingredients as long as undesirable interactions are not caused by blending with the above compounds.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or warm-blooded animals eg mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, monkeys) , Chimpanzee, etc.
  • parenterally e.g. mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, symptom, administration route, etc.
  • arteriosclerotic diseases eg, myocardial infarction, unstable angina pectoris
  • the compound or a salt thereof is about 0 per day.
  • Administer 1-10 Omg preferably about 1 ⁇ 0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, the subject of administration, symptoms, route of administration, etc., for example, arteriosclerotic disease (eg, 'myocardial
  • arteriosclerotic disease eg, 'myocardial
  • the compound or a salt thereof is administered by intravenous injection of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is convenient to do. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention is also included. It can be administered as in the case.
  • the antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention
  • the quantification of the protein of the present invention in a skin sample solution In particular, it can be used for quantification by sandwich immunoassay.
  • An antibody of the present invention is reacted competitively with a test solution and a labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution and
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the protein of the present invention.
  • detection may also be performed by yarn-and-woven staining or the like. It can.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab,) 2 , F ab ⁇ or F ab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention should be particularly limited. Rather than detecting the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the solution to be measured (for example, the amount of protein) by chemical or physical means, this is detected with a known amount of antigen. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing the solution. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • radioactive isotopes elemental eg, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [14 C], [32 P], [33 P ], [ 35 s], etc.
  • fluorescent substances eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences), etc.), fluorescamine, fluorescensiso Thiocyanate
  • enzymes eg, galactosidase, i3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • luminescent substances eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, norecigenin, etc.
  • piotin Lanthanide elements are used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and another labeled monoclonal antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), followed by insolubilization.
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the method of the labeling agent or insoluble matter can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. It may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds. It is done.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, antibodies other than the C end, for example, the N end are used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or nephrometry.
  • a competitive method the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • B / F separation Measure the labeled amount of either B or F and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is made of polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody, etc. and a solid phase antibody is used as the first antibody
  • a solid phase method using a soluble first antibody and a solid phase antibody as the second antibody is used.
  • the solid phase and the liquid phase are separated after a competitive reaction between the antigen in the test solution and the immobilized antigen against a certain amount of labeled antibody, or in the test solution. After reacting this antibody with an excessive amount of labeled antibody, the solid phase antigen is added and unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate can be obtained.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details on these general technical means, see reviews, textbooks, etc. You can shine.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • Atherosclerotic disease eg, cerebral arterial disease (eg, Coronary artery disease (eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina), etc.; Aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); Renal artery disease (eg, renal sclerosis) , Peripheral renal artery disease (eg, obstructive arteriosclerosis), etc.); diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetes) Metaneuric syndrome)
  • cerebral arterial disease eg, Coronary artery disease (eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina), etc.
  • Aortic disease eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.
  • Renal artery disease eg, renal sclerosis
  • Peripheral renal artery disease eg, obstructive arteriosclerosis
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • a subject such as a body fluid or tissue.
  • the detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, the analysis of the behavior of the protein of the present invention in a test cell, etc. Can be used.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, as a probe for humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, birds, pigs, pigs, rabbits, horses, cats, dogs, monkeys).
  • DNA or mRNA abnormalities that code for the protein of the present invention or partial peptides thereof (eg gene abnormalities) can be detected. It is useful as a genetic diagnostic agent for mutation or decreased expression, and increased or excessive expression of DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed by, for example, a known Northern hybridization PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the UbA, 86, 2766-2770 (1989)).
  • arteriosclerotic disease eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction) Coronary artery disease (eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina), etc.; Aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic release, etc.); Renal artery disease (eg, nephrosclerosis, kidney) Renal failure due to sclerosis, etc.); peripheral arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis, etc.); diabetes and diabetic complications
  • metapolitic syndrome shows multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia, hypertension based on insulin resistance
  • the antisense polynucleotide of the present invention which binds to the DNA of the present invention in a complementary manner and can suppress the expression of the DNA, has low toxicity, and the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo.
  • Atherosclerotic disease eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina pectoris, etc.) ; Aortic disease (eg, aortic aneurysm, large artery dissection, etc.); renal artery disease (eg, renal failure due to nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.); peripheral arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis) ) Diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.); Metabolic syndrome (hyperglycemia based on insulin resistance, hyperlipidemia) Multiple such as high blood pressure It can be used as a medicine for prophylactic / therapeutic agents such as syndromes with the highest risk factor).
  • atherosclerotic disease eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction
  • the antisense polynucleotide When used as a medicine, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • antisense polynucleotide for example, after inserting the above-mentioned antisense polynucleotide alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenowinores vector, an adenowinore associations virus vector, a lentinowinores vector, a ribosome derivative, etc. It can be administered orally or parenterally to humans or mammals (eg, rats, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.) according to conventional means.
  • the antisense polynucleotide can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as a trapping agent for promoting ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, it can be aerosolized and locally administered into the trachea as an inhaler.
  • the above-mentioned antisense polynucleotide can be formulated (injection) alone or together with a carrier such as ribosome for intravenous, subcutaneous, etc. It may be administered.
  • the dosage of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is used for therapeutic purposes.
  • an adult administers about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • RNA double-stranded RNA (siRNA mall (short) interfering RNA for the polynucleotide of the present invention) containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, sh RNA Ismail (short) hairpin RNA)), and ribozymes containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention can also suppress the expression of the gene of this effort and can be applied in vivo.
  • siRNA mall short interfering RNA for the polynucleotide of the present invention
  • sh RNA Ismail short
  • ribozymes containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention
  • arteriosclerotic disease eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease ( Eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina); aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease (eg, nephrosclerosis, renal sclerosis, etc.) Renal failure); peripheral Arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis, etc.); Diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.); Metapolytic syndrome (based on insulin resistance) It can be used as a medicine for prophylactic / therapeutic agents such as hyperglycemia, hyperlipidemia, syndrome showing multiple risk factors such as hypertension).
  • arteriosclerotic disease eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.
  • the double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 ⁇ , 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, there can be mentioned a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme. When the above double-stranded RNA or ribozyme is used as a medicine, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the aptamer for the protein of the present invention can also suppress the activity and function of the protein used in the present invention.
  • atherosclerotic disease eg, cerebral artery disease ( Eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina pectoris); aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease (eg, Renal failure due to nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.); peripheral arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis, etc.); diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic) Neuropathy, diabetic nephropathy, etc.) prevention of metapolic syndrome (syndrome with multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia and hypertension
  • the aptamer is obtained using a known method, for example, the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method (Annua Review of Medicine 5o ⁇ , 555-583, 2005).
  • the structure of the aptamer can be determined using a known method. Based on the structure, the aptamer is produced according to a known method.
  • Abutama As a medicine, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the antibody of the present invention is, for example, arteriosclerotic disease (eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (eg, myocardial infarction, angina pectoris, etc.) Aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal arterial disease (eg, renal failure due to nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.); peripheral arterial disease (eg, obstructive artery) ) Diabetes and diabetic complications (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.); Metapolytic syndrome (hyperglycemia, hyperlipidemia based on insulin resistance) It can be used as a medicine for prophylactic / therapeutic agents such as syndromes showing multiple risk factors such as hypertension). Alternatively, the antibody molecule itself may be used, and F (ab,) 2
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical thread of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit).
  • it can be administered as a vaccine according to a conventional method.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections, suppositories, vaccines, etc. are used as parenterals for parenteral administration, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions. You may include dosage forms, such as an agent.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • the antibody of the present invention or a salt thereof can be prepared by dissolving, suspending or emulsifying in an aseptic aqueous liquid or oily liquid used for a normal injection.
  • an aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing bud sugar and other scavengers, etc.
  • solubilizing agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (Eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO—50 ⁇ polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol Eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO—50 ⁇ polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled into a suitable ampoule.
  • a suppository used for direct bowel administration may be prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with an ordinary suppository
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (Including soft capsules), syrups, emulsions, suspensions, etc.
  • Such a composition may be produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient that is usually used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 25 mg for other dosage forms. Is preferably contained.
  • the dose of the drug containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but for example, when used for treatment / prevention of adults,
  • One dose of antibody is usually about 0.1 to 2 O mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 1 O mg / kg body weight, more preferably about 0.1 :! to 5 mg Z kg body weight. It is convenient to administer by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof refers to a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention (eg, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation production) Substance, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc., for example, arteriosclerosis, arteriosclerotic disease (eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (Eg, myocardial infarction, ischemic heart disease such as angina); aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease
  • nephrosclerosis nephrosclerosis, etc.
  • peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis, etc.
  • diabetes and diabetic complications eg, diabetic retinopathy, Diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.
  • Metabolic syndrome symptom group showing multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia and hypertension based on insulin resistance
  • the “compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention or a salt thereof” means a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention (eg, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation) Product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.), for example, arteriosclerosis, arteriosclerotic disease
  • cerebral artery disease eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.
  • coronary artery disease eg, myocardial infarction, angina, etc.
  • aortic disease eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.
  • Renal arterial disease eg, renal failure due to nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.
  • peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis, etc.
  • diabetes and diabetic complications eg, diabetic retina
  • Metapolitic syndrome symptoms showing multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia, hypertension etc. based on insulin resistance
  • a compound that inhibits the production of the protein of the present invention or a salt thereof refers to a compound that inhibits the production of the protein of the present invention (eg, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation) Product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc., for example, arteriosclerosis, arteriosclerotic disease (eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); Disease (eg, ischemia such as myocardial infarction, angina pectoris) Aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease
  • arteriosclerosis arteriosclerotic disease
  • cerebral artery disease eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.
  • Disease eg, ischemia such as myocardial infarction, angina pectoris
  • Aortic disease eg, aortic aneury
  • nephrosclerosis nephrosclerosis, etc.
  • peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis, etc.
  • diabetes and diabetic complications eg, diabetic retinopathy, Diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.
  • Metapoliic syndrome symptom group showing multiple risk factors such as hyperglycemia, hyperlipidemia and hypertension based on insulin resistance
  • preventive / therapeutic drugs and the prophylactic / therapeutic agents include “a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof” itself, “a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention or a salt thereof” itself And “a compound or a salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention” itself, and a pharmaceutical composition containing any of these.
  • the prophylactic / therapeutic agent is produced in the same manner as described above.
  • the present invention has a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (may be abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (may be abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided. '
  • Non-human mammal having the exogenous DN A of the present or its mutant DN A having the exogenous DN A of the present or its mutant DN A
  • a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in mammals.
  • a non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method , Ribofusion method, agglomeration method, microinstruction method, particle gun method, DEAE It can be produced by transferring the target DNA by the Tran method or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, living organs, tissue cells, etc. can be transferred and used for cell culture, tissue culture, etc.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing cells with the above-described embryonic cells by a cell fusion method known per se.
  • non-human mammals examples include ushi, pig, hidge, goat, usagi, inu, cat, guinea pig, hamster, mouse and rat.
  • rodents especially mice (for example, C 57B LZ6, DBA 2 etc.
  • BS CSFi system BDF system
  • B SDSFi system B SDSFi system
  • BALBZc system gun ICR system, etc.
  • rat for example, Wi star, SD, etc.
  • Examples of the “mammal” in the thread-reversible vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the non-human mammals described above.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by human mammals but the DNA of the present invention that has been isolated and extracted from mammals.
  • the mutated DNA of the present invention has a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. DNA is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DN A means DN A that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the subject animal.
  • it is generally advantageous to use it as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology to this for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice).
  • a DNA construct eg, vector
  • a DNA construct conjugated with the human DNA of the present invention downstream of various promoters capable of expressing the derived DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector for the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni-leukemia virus, vaccinia viruses, Animal viruses such as paculovirus are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include: 1) Promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni-leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) 2) Promoters derived from various mammals (eg, humans, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) Chin kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor; 3, keratin K l, 1: 1 014, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase ] 3 I subunit, dystrophy Tartrate-resistant alfa phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thycin synkinase (generally abbreviated as T ie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (N a, K-
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • terminator 1 a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • each DN derived from viruses and various mammals The sequence A can be used, and preferably the SV40 terminator of simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 upstream from promoter region, between promoter region and translation region It is possible to connect 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is derived from the liver, kidneys, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, monoremots, hamsters, rats, mice, etc.) It can be obtained as a raw material by using DNA or commercially available genomic DNA libraries as a raw material, all or part of the genomic DNA, or by using known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA. I can do it. Furthermore, exogenous abnormal DNA can produce a translation region in which the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues is altered by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by a normal DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the exogenous DN A of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer is confirmed after the producing animal. All of which means that all of the germ cells and somatic cells carry the exogenous DNA of the present invention.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. I can do it.
  • exogenous DNA of this effort at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. It means having a surplus.
  • Descendants of this type of animal that have inherited the foreign DNA of the present invention have an excess of the foreign DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and finally promotes the function of the endogenous 1 "raw normal DNA to ultimately function the protein of the present invention.
  • a normal DNA-transferred animal of the present invention can be used to produce a hyperfunction of the protein of the present invention or a protein of the present invention. It is possible to elucidate the pathologic mechanism of related diseases and to examine methods for treating these diseases.
  • preventive / therapeutic agents for diseases related to the present protein such as It can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents such as arteriosclerotic diseases and diabetic complications.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be stably subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. I can do it.
  • the target foreign DNA is It can be used as a raw material by being incorporated into a mid.
  • a DNA constructor with a promoter can be produced by ordinary DNA engineering techniques. Abnormalities of this effort at the fertilized egg cell stage DNA transfer is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after the DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cell and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the abnormal DNA of this effort is highly expressed, and finally the function of the protein of this effort is disabled by inhibiting the function of the endogenous normal DNA. It can become active refractory disease and can be used as a model animal for the disease state. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory disease of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transfer animal of the present invention.
  • the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention is capable of inhibiting the function of the normal protein (dominant negative) by the abnormal protein of the present invention in the functional inactive refractory disease of the protein of the present invention.
  • Model since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, the preventive / therapeutic agent for the protein or functional inactive refractory of the present invention It can also be used for screening tests.
  • each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, free DNA-transferred cells can be obtained and cultured or the cell line of the cultured cells can be obtained using a protease such as trypsin. Is possible.
  • a protease such as trypsin.
  • 'specification of the protein-producing cells of the present invention, the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormalities can be investigated. It becomes an effective research material for elucidating the action of the pigment.
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for diseases related to the protein of the present invention, including the functionally inactive type refractory of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the above-mentioned test method is used. In addition, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease using a quantitative method and the like. In addition, using the DNA-metastasized animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for diseases associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in the expression of DNA of the present invention.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated (2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a J3-galactosidase gene derived from E. coli),
  • a reporter gene eg, a J3-galactosidase gene derived from E. coli
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, i3 galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene is expressed under the control of the promoter for DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, i3 galactosidase gene derived from E. coli
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity against DNA of the present invention comprising administering a test compound to the animal of item (7) and detecting the expression of a reporter gene A screening method is provided.
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is an artificial mutation in the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • ES cells Non-human mammalian embryonic stem cells
  • non-human mammal those described above are used.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.
  • DNA-inactivated ES cells of the present invention or knockout ES cells of the present invention
  • DNA-inactivated ES cells of the present invention for example, the DNA of the present non-human mammal possessed by the target non-human mammal is isolated and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z ( 1 galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl transferase gene) representative reporter gene transfer etc. is inserted to disrupt exon function, or gene in intron part between exons DNA sequence that terminates transcription
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter targeting)
  • the abbreviated vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are subjected to Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of the present invention or a DNA sequence in the vicinity thereof as a probe. It can be obtained by analyzing the above DNA sequence and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector by PCR, and selecting the knockout ES cell of the present invention. it can.
  • ES cells that inactivates the DNA of the present invention by homologous recombination method
  • those already established as described above may be used, or known Evans and Kaufma. It may be newly established according to the method.
  • mouse ES cells currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative and purely immunologically genetic background
  • C57BLZ6 mice and BDFi mice in which the number of eggs collected from C 57 BLZ6 is reduced by crossing with DBAZ2 (using C 57 BL / 6 and DBAZ2 BDFi mice were obtained using C57BL / 6 mice in the background, in addition to the advantages of having a large number of eggs and strong eggs.
  • ES cells can be advantageously used in that, when a disease state model mouse is created, it is possible to substitute the C 57BL / 6 mouse for its communication background by backcrossing with a C57BL / 6 mouse.
  • blastocysts at the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, an 8-cell embryo is collected and cultured to the blastocyst for efficient use. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras.
  • One example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • Initial selection of ES cells in the initial stage can be performed by male / female discrimination, and male cells can be selected at an early stage, which greatly reduces the effort in the initial stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ability to develop on its own, so it needs to be subcultured carefully.
  • a carbon dioxide incubator preferably, 5% carbon dioxide, 95% air or
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001 to 0.5% trypsin Z 0.1 to 0.5%).
  • 5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA is used to treat the cells as single cells and seed them on newly prepared feeder cells.
  • Such passage is usually performed every 1 to 3 days. At this time, the cells are observed, and if morphologically abnormal cells are found, the cells are cultured. It is desirable to abandon the cells.
  • ES cells such as head muscles, visceral muscles, and myocardium
  • Various types of cells such as head muscles, visceral muscles, and myocardium can be obtained by culturing ES cells in a monolayer to a high density or floating culture until they form a cell conglomerate under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al. , Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by separating the ES cells of the present invention are in vitro of the protein of the present invention. Useful in cell biological studies.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly. .
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression in this effort introduces the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell, and the targeting vector of the present invention does not contain the DNA of the present invention.
  • the activated DNA sequence is knocked out by the homologous recombination by replacing the DNA sequence of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous a change. be able to.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out include a DNA sequence on the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a targeting vector. It can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used in the above.
  • a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated is cloned by gene homologous recombination, and the cells are treated at a suitable time, for example, at the 8-cell stage.
  • the created animal is artificially altered with cells that have normal normal DNA loci. It is a chimeric animal composed of both cells having different DNA loci of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimera with a normal individual. It is obtained by selecting an individual composed of cells having the DNA locus of the present invention to which, for example, coat color determination or the like.
  • the individual thus obtained is usually an individual with deficient hetero-expression of the protein of the present invention, and individuals who have deficient hetero-expression of the protein of the present invention are mated with each other, and the protein of the present invention is born from their offspring. Homo expression deficient individuals can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting betater introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. It can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination, compared to the non-human mammal.
  • germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, by mating male and female animals possessing the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and multiple homozygous animals. By breeding male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful in producing the non-human mammal deficient in the expression of DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by a deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention relates to a deficiency or damage of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by the disease is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in the expression of DNA used in the screening method include those described above.
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound. The test compound may form a salt, and the same salt as described above is used as the salt of the test compound.
  • the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators.
  • the therapeutic / prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration and intravenous injection are used, and can be appropriately selected according to the symptom of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the test compound, and the like.
  • the test compound when screening a compound having a therapeutic / preventive effect on arteriosclerotic disease, diabetic complications, etc., the test compound is administered to the non-human mammal with DNA transfer of the present invention, and the test compound is not administered.
  • the difference in the degree of onset of the group and arteriosclerotic disease and the degree of cure of the arteriosclerotic disease are observed over time in the above tissues.
  • the test animal compound when the test animal compound is administered to the test animal, the disease symptoms of the test animal are improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / prophylactic effect on diseases caused by increased expression of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well. Examples of the diseases caused by the increased expression of the protein of the present invention include arteriosclerotic diseases and diabetic complications. Therefore, a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention or a salt thereof, a compound that disrupts the production of the protein of the present invention or a salt thereof, etc. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as sex diseases and diabetic complications.
  • the compound obtained by the staring method may form a salt, and as the salt of the compound, the same salt as the salt of the test compound mentioned above is used.
  • the pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the protein antibody of the present invention described above.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic. , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, etc.
  • arteriosclerotic diseases eg, myocardial infarction, unstable angina pectoris
  • the compound or a salt thereof is about 0.1 to about L 0 O per day. mg, preferably about 1.0-5 O mg, more preferably about 1.0-2 Administer Omg.
  • the dose of the compound varies depending on the target disease, the subject of administration, symptoms, administration route, etc., for example, arteriosclerotic disease
  • the compound or its salt in the form of an injection for the purpose of treating eg, myocardial infarction, unstable angina
  • the compound or salt thereof will be administered by intravenous injection at about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day.
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • This effort promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is not effective when the DNA of the present invention introduces a reporter gene among the above-mentioned DNA expression-deficient non-human mammals.
  • An activated gene that can be expressed under the control of the promoter for DNA of the present invention is used.
  • test compound examples are the same as described above.
  • the test compound may form a salt, and the same salt as described above is used as the salt of the test compound.
  • reporter gene the same ones as described above are used, and i3_galactosidase gene (1acZ), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is encoded by the reporter gene because the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention. By tracing the expression of the promoter, the activity of the promoter can be detected.
  • a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is derived from E. coli.
  • i3_galactosidase is expressed in place of the protein of the present invention in the tissue that originally expresses the protein of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate for i3-galactosidase such as 5-promo 4_chloro-3_indolyl_i3 galactopyranoside (X-gal), The expression state of the protein in the animal body can be observed.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga 1 at room temperature or 3 7 After reacting at around 30 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the tissue sample is washed with an I mM ED TA / PBS solution to stop the i3-galactosidase reaction and observe the coloration.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits promoter activity against the DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as the salt of the compound, the same salt as the salt of the test compound described above is used.
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits; preferably inhibits) promoter activity against DNA of the present invention regulates (promotes or inhibits; preferably inhibits) the expression of the protein of the present invention, and functions of the protein can be regulated (promoted or inhibited; preferably inhibited), and is useful as a preventive / therapeutic agent for arteriosclerotic diseases, diabetic complications and the like.
  • the medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing an antibody against the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic. Can be administered to mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, rabbits, horses, cats, dogs, saps, etc.).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, rabbits, horses, cats, dogs, saps, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, etc.
  • arteriosclerotic diseases eg, myocardial infarction, unstable angina pectoris
  • oral administration of a compound or salt thereof that regulates (promotes or inhibits; preferably inhibits) promoter activity against DN DN of the present invention for therapeutic purposes generally in adults (with a body weight of 60 kg)
  • the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the dose of the compound varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, etc., but for example, it regulates (promotes or promotes) the promoter activity for DNA of this effort. Inhibiting; preferably inhibiting)
  • administering a compound or salt thereof in the form of an injection generally in adults (as 60 kg)
  • the compound is administered at a concentration of about 0.01 to Conveniently, 3 O mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection.
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present efforts is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention
  • the present invention can greatly contribute to the investigation of the cause or prevention / treatment of various diseases caused by DNA expression deficiency.
  • transgenic animal gene (Transfected animals) can be created to specifically synthesize the protein and examine its action in the living body.
  • a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion and a cell line in which it is expressed is established, a small molecule having an action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein of the present invention to be produced in the body. It can be used as a compound search system. In this specification, when a base, amino acid, etc.
  • DNA Deoxyliponucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger liponucleic acid
  • a 1 a Alanine
  • HONB 1-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyimide
  • DCC N, N '—Dicyclohexyl carpositimide
  • SEQ ID Nos in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • lactosylceramide synthase The amino acid sequence of lactosylceramide synthase is shown.
  • the base sequence of the sense primer 1 used in Example 1 is shown.
  • the base sequence of the antisense primer 2 used in Example 1 is shown.
  • the base sequence of the sense primer 3 used in Example 1 is shown.
  • the amino acid sequence of GM3 synthase is shown.
  • SEQ ID NO: 11 This shows the base sequence of DNA encoding GM 3 synthase having the amino acid sequence represented by 1.
  • the aorta was visually divided into a portion with a large amount of arteriosclerotic lesion and a portion with a small amount of arteriosclerotic lesion, and a tota no thigh was prepared using RNeasy Fibrous Tissue Midi Kit (manufactured by QIAGEN).
  • CDNA was prepared using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems). Perform PCR reaction using TaqMan Universal PGR Master Mix (Applied Biosystems) and perform agarose gel electrophoresis. The expression level was compared semi-quantitatively. PCR primers were designed from the base sequence information obtained from the partial sequences of Usagidarcosylceramide synthase and latatosylceramide synthase.
  • PCR reaction was performed using sense primer 1 (SEQ ID NO: 5) and antisense primer 2 (SEQ ID NO: 6) of darcosylceramide synthase at an annealing temperature of 54 ° C and 36 cycles. went.
  • a PCR reaction was performed using sense primer 3 (SEQ ID NO: 7) and antisense primer 4 (SEQ ID NO: 8) of lactosylceramide synthase at an annealing temperature of 55 ° C and 34 cycles. .
  • D-PDMP is known to inhibit darcosylceramide synthase activity and latatosylceramide synthase activity (Glycoconjugate J-, 13 ⁇ , 481- 486, 1996), its concentration and treatment time. It is known that intracellular dalcosyl ceramide and lactosyl ceramide can be withered depending on the cell (J Biochem (Tokyo), 117 ⁇ , 766-773, 1995). Using this compound, the effect on the cholesterol export activity when the accumulation of intracellular glycolipids was inhibited was investigated.
  • THP-1 cells purchased from ATCC; Int J Cancer., 26 ⁇ , 171-176, 1980 suspended at 8.0 ⁇ 10 5 per well on a 12-well plate (Falcon) Macrophages treated with RPMI-1640 medium (containing 10% FBS, 25 mM HEPES, penicillin / streptomycin) containing holpol 12-myristate 13-acetate (PMA) (final concentration: 100 nM) for 3 days Differentiated in the same way. After washing with PBS, [3 ⁇ 4] choleste Serum-free RPMI-1640 medium containing iS VLDL (final cholesterol concentration: 150 ⁇ g / ml) labeled with rolls was added and cultured for 24 hours to produce foamed cells.
  • RPMI-1640 medium containing 10% FBS, 25 mM HEPES, penicillin / streptomycin
  • PMA holpol 12-myristate 13-acetate
  • the cholesterol export activity was calculated from the following equation. '
  • D-PDMP promoted cholesterol export activity in a concentration-dependent and time-dependent manner.
  • inhibition of darcosylceramide synthase activity and lactosylceramide synthase activity promotes intracellular cholesterol export activity and causes regression of arteriosclerosis.
  • the cells were prepared in the same manner as in (1) above for the cholesterol export activity of glycosphingolipids in THP-1 cells. After washing the prepared foaming cells, the 10 beta Micromax Darukoshiruserami de (Matoreya Co.) and Lactosyl ceramide
  • Serum-free RPMI-1640 medium containing (CALBI0CHEM) was added and treated for 24 hours. After removing the cell supernatant and adding RPMI-1640 medium (final concentration: 25 ⁇ g / ml) containing human polypoptin ⁇ (Chemicon), cholesterol was removed in the same manner as in (1) above. Unloading activity was measured.
  • D-PDMP D-threo-1 -phenyl-2 -decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
  • Double-stranded DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 was synthesized by PCR using two kinds of primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10).
  • the human glucosylceramide synthase gene was obtained from IMAGE clone 5274768 (Invitrogen).
  • the composition of the reaction mixture in this reaction was 2 ⁇ IMAGE clone 5274768 plasmid DNA, 5 ⁇ l lO XPfu buffer (Stratagene), l ju l Hotstart Pfu (Stratagene), 20 ⁇ M
  • the primers were added with 1 ju 1 of 2.5 mM dNTP and 36 ⁇ l of distilled water to make the volume 50.
  • PCR reaction is 95 ° C ⁇ after 2 minutes, 95.
  • extension reaction was performed at 72 ° C ⁇ 10 minutes.
  • 500 ng of the PCR product purified with the PCR purification kit (Qiagen) was digested with restriction enzymes Notl and BamH! And then purified with the cleanup kit (Qiagen).
  • pcDNA3.1 (-) vector was digested with restriction enzymes Notl and BamHI and purified with a cleanup kit (Qiagen).
  • the enzyme source was prepared by the following method.
  • HEK293 cells purchased from ATCC; J Gen Virol., 36 ⁇ , pp. 59-74, 1977
  • serum-containing DMEM medium and placed on the lOcni collagen-coated plate (Iwakine) 1.2 days before gene transfer. 10 6 seeded.
  • Enzyme Atsey was prepared by adding 10 g of crude enzyme solution, 500 nmol of Tris buffer (pH 7.5), 30 nmol of C8 ceramic (Biomonole) and 375 pmol of [ 14 C] UDPglucose (Amersham) in 50 ⁇ l of reaction solution. 7.4 GBq / mmol, 925 Kbq / ml) was incubated at 32 ° C for 2 hours.
  • the reaction was terminated by adding 100 1 chlorohonole methanol (2: 1), centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, the Kuroguchi form layer was collected, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
  • the activity value was calculated from the following formula.
  • the protein used in the present invention is specifically upregulated in arteriosclerotic lesions. Therefore, a compound or its salt that inhibits the activity of darcosylceramide synthase or (and) lactosylceramide synthase, or a compound that inhibits the expression of darcosylceramide synthase gene or (and) lactosylceramide synthase gene Is its salt, darcosylceramide synthase or (and) latatosylceramide synthase production compound or its salt, for example, arteriosclerosis or arteriosclerotic disease (eg, cerebral arterial disease (eg, cerebral infarction) Coronary artery disease (eg, cardiac muscle infarction, ischemic heart disease such as angina), etc.; Aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); Renal artery disease (eg, nephrosclerosis, kidney) Renal failure due to sclerosis, etc.); peripheral arterial disease (
  • darcosylceramide synthase or (and) lactosylceramide synthase is used for atherosclerosis and atherosclerotic disease (eg, cerebral artery disease (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.); coronary artery disease (eg, myocardial infarction, Ischemic heart disease such as angina); aortic disease (eg, aortic aneurysm, aortic dissection, etc.); renal artery disease (eg, renal failure caused by nephrosclerosis, nephrosclerosis, etc.); peripheral arterial disease Diabetes and diabetic complications' (eg, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, etc.); metabolic syndrome (based on insulin resistance) It is useful for the streaking of preventive / therapeutic agents such as hyperglycemia, hyperlipidemia, syndrome showing multiple risk factors such as hypertension).
  • cerebral artery disease eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc

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Abstract

本発明は、グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤、グルコシルセラミドまたは（および）ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化、糖尿病などの予防・治療剤、該予防・治療剤を得るためのスクリーニング方法およびスクリーニングキットなどを提供する。

Description

明細 動脈硬化の予防 ·治療用医薬 技術分野 本発明は、 動脈硬化の予防 ·治療用医薬、 該医薬のスクリーニング、 動脈硬化 の診断薬、 動脈硬化の診断マーカーなどに関する。 背景技術 死亡原因の最上位を占める虚血性心疾患や脳血管障害などの虚血性臓器疾患発 症の原因として粥状動脈硬化の存在は重要である。 動脈硬化病変の病理形態学的 特徴は、 內皮下にコレステロールエステルを蓄積した主にマクロファージからな る細胞 （泡沫化細胞） が集積した脂肪線条 （fatty streak) 、 さらに進行した状 態である、 平滑筋細胞、 マクロファージ、 T細胞などの浸潤と細胞壌死像と脂質 蓄積が認められる繊維性硬班 （fibrous plaque) である。 脂質蓄積した部位は構 造的脆弱性を示し、 血行力学的な力が引き金となり硬班が破餘し （plaque rapture) 、 組織因子と血液凝固系因子との反応により急激に血栓が形成する。 冠動脈で硬班が破綻し血栓性閉塞が起きることが急性心筋梗塞、 不安定狭心症、 心臓性突然死などのいわゆる急性冠症候群 （acute coronary syndrome) の発症 に密接に関係する事が明らかにされてきている （Fuster V et al. , Ν. Engl. J. Med. , 326, pp242— 250, 1992) 。
急性冠症候群発症の最も重要な危険因子は、 いくつかの大規模疫学的調査 （4S study, CARE studyなど） により、 血清コレステロニル値、 特に低密度リポタン パク質一コレステロール値 (LDL-C) であることが示されており、 HMG_CoA還元酵 素阻害剤であるスタチン系薬剤による血清コレステロール低下療法が心疾患ィべ ントの発症率を低下させたェビデンスは危険因子としての L D Lの妥当性を証明 するものである。 ' 、 細胞生物学的検討から、 マクロファージ細胞は、 スカベンジャー受容体フアミ リーと呼ばれる受容体により、 血中の主要脂質担体である L D Lが修飾を受けた 酸化 L D Lを細胞内に取り込むことが明らかとなった。 この受容体は細胞内コレ ステロール量によるネガティブフィードバックを受けず、 マクロファージはこの 受容体を介して過剰の酸ィ匕 L D Lを取り込んで泡沫化細胞となる。
高コレステロ一ル血症患者では高 L D L血症を示し、 また L D Lの易酸^ f匕性等 が報告されている点、 近年、 酸ィヒ L D Lの特異的抗体を用いた血中酸化 L D の 定量系開発が行われ、 心疾患のリスクが高い患者群での血中濃度が上昇し、 さら に病変部位での酸化 L D L陽性マクロファージ細胞数が増加しており （Ehara S et al. , Circulation, 103, ρρ1955~1960, 2001) 、 酸化 L D Lによるマクロファ ージの泡沫化を機序とした粥状動脈硬化病変形成が生体レベルで起きていること が強く示唆されてきた。 酸ィ匕 L D Lはマクロファージ細胞を泡沫化させるだけで はなく、 血管内皮細胞、 平滑筋細胞、 マクロファージ細胞に対して、 動脈硬化惹 起性の作用を示すが、 その 1つとしてアポトーシスの誘導が考えられる。 本発明 者らはこの泡沫化マクロファージのアポトーシスに関して、 セラミドの代謝系に 関わる酵素が重要な役割を演じており、 動脈硬化形成に関与していることを報告 している （W0 03/78624号公報） 。
• ダルコシルセラミドは、 形質膜に含まれる糖スフインゴ脂質の前駆体であり、 その発現または活性調節は、 生化学または病理 ·生理学的プロセス （発生、 分化、 ガン化など） に関与することが知られている。 ダルコシルセラミ ドを合成する酵 素 （ダルコシルセラミド合成酵素） のノックダウンマウスは、 胎性 9. 5日以前に 死亡することより、 糖スフインゴ脂質が発生、 分化に必要な物質であることが示 されている （Biochim. Biophys. Acta. , 1525卷， 1 - 12頁， 2001年） 。
ラタトシルセラミ ドは、 ダルコシルセラミドにガラクトースが付加されて生成 した物質であり、 糖スフインゴ脂質代謝系上での複数の代謝系 （ガラ系、 ガング リオ系、 ァシァ口系、 ラ ト系、 ネオラクト系、 グロポ系、 イソグロポ系） への 分岐点の物質である （わかる実験医学シリーズ 糖鎖生物学がわかる， 44 - 52頁， 2002年） 。 ラクトシルセラミドを培養系に添加することにより、 ヒト血管平滑筋 細胞においては増殖活性が増加 （Biochem. Biophys.' Res. Commun. , Ιδΐ巻， 554- 61頁， 1991年） 、 ヒト血管内皮細胞においては接着分子である ICAM-1の発現 上昇することが知られている （j. Biol. Chem. , 273卷， 34349頁， 1998年） 。 また、 ダルコシルセラミド舍成酵素またはラタトシルセラミ ド合成酵素の阻害 剤である D- PDMP (D - threo- 1 - phenyl- 2 - decanoylamino - 3- morpholino - 1 - propanol) は、 インスリン刺激による IRS- 1のリン酸ィ匕を阻害する TNF- αの作用 を抑制することが報告されている （J. Biol. Chem. , 277卷， 3085 - 3092頁， 2002 年） 。 発明の開示 動脈硬化発症モデル動物で特異的に発現変動する分子を標的とし、 有用な診断 マーカーを確立すること、 動脈硬化における血漿中のタンパクの動態を明らかに すること、 更には、 従来知られている動脈硬化の危険因子の制御とは異なるメカ 二ズムで動脈硬化の予防 ·治療効果を示す薬剤を提供するこ'とが切望されている。 本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、 ダルコシルセ ラミド合成酵素阻害剤およぴラクトシルセラミド合成酵素阻害剤が、 マクロファ ージ細胞においてコレステロール搬出活性を促進すること、 また、 同細胞におい てラタトシルセラミドがコレステロール搬出活性を抑制することを見出した。 本 発明者らは、 これらの知見に基づいて、 ダルコシルセラミド合成酵素またはラタ トシルセラミ ド合成酵素の活性や遺伝子発現を阻害する薬剤などが、 動脈硬化の 予防および （または） 治療に有用であると考え、 さらに検討を重ねた結果、 本発 明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （おょぴ） ラクトシルセラミ ド合成酵素阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防 ·治療用医薬、
• 〔l a〕 ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （および） ラタトシルセラ ミ ド合成酵素阻害剤を含有してなる糖尿病の予防 ·治療用医薬、 〔2〕 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または （および） ラタ トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防 ·治 療用医薬、
〔 2 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または （および） ラ クトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる糖尿病の予防 ·治 療用医薬、
[ 2 b ] さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または （お よび） ラク トシルセラミ ド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記
〔 1〕 記載の動脈硬化の予防 ·治療用医薬、
〔 2 c〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または （お よび） ラタトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記 〔1 a〕 記載の糖尿病の予防 ·治療用医薬、
〔 3〕 ダルコシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩である上記 〔1〕 または 〔2〕 記載の医薬、
〔 4〕 ダルコシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列 からなるタンパク質またはその塩である上記 〔1〕 または 〔2〕 記載の医薬、 〔 5〕 ラクトシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩である上記 〔1〕 または 〔2〕 記載の医薬、
〔 6〕 ラクトシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列 からなるタンパク質またはその塩である上記 〔1〕 または 〔2〕 記載の医薬、 〔7〕 さらに、 G M 3合成酵素阻害剤を含有してなる上記 〔1〕 、 〔2〕 、 [ 2 ] 、 下記 〔1 9〕 または 〔1 9 b〕 記載の医薬、
( 7 a ) さらに、 GM 3合成酵素阻害剤を含有してなる上記 〔l a〕 、 〔2 a ] 〔2 c〕 、 下記 〔1 9 a〕 または 〔1 9 c〕 記載の医薬、
〔8〕 さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記 〔1〕 、 〔2〕 、 〔2 b〕 、 下記 〔1 9〕 または 〔1 9 b〕 記載の医薬、 [ 8 a ] さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる上記 〔1 a〕 、 〔2 a〕 、 〔2。〕 、 下記 〔1 9 &〕 または 〔1 9 c〕 記載の医薬、
〔 9〕 GM 3合成酵素が、 配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩である上記 〔7〕 または 〔8〕 記載の医薬、
〔1 0〕 GM 3合成酵素が、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質またはその塩である上記 〔7〕 または 〔8〕 記載の医薬、
〔1 1〕 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチド をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
〔1 2〕 配列番号： 1または （および） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部 分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に 相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含 有してなる医薬、
〔1 3〕 動脈硬化の予防 ·治療用医薬である上記 〔1 2〕 記載の医薬、 〔1 3 a〕 糖尿病の予防 ·治療用医薬である上記 〔1 2〕 記載の医薬、 〔1 4〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列ま たはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる上記 〔1 3〕 記載の医薬、
〔1 5〕 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチド をコードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R NA、
[ 1 6〕 配列番号： 1または （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRNA を含有してなる医薬、
〔17] 動脈硬化の予防 ·治療用医薬である上記 〔16〕 記載の医薬、 〔17 a〕 糖尿病の予防 ·治療用医薬である上記 〔16〕 記載の医薬、 〔18〕 さらに、 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコード するポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRN Aを含有してなる上記 〔17〕 記載の医薬、
〔19〕 ダルコシルセラミ ド合成酵素に対する抗体または （おょぴ） ラクトシ ルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の予防 ·治療用医薬、
〔 19 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクト シルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる糖尿病の予防 ·治療用医薬、
〔19 b〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （およ び） ラタ トシルセ ミ ド合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔1〕 、 〔 2〕 または 〔 2 b〕 記載の動脈硬化の予防 ·治療用医薬、
〔1 9 c〕. さらに、 ダルコシルセラミ ド合成酵素に対する抗体または （およ び） ラタトシルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔l a〕 、
[2 a) または 〔2 c〕 記載の糖尿病の予防 ·治療用医薬、
〔20〕 さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔1〕 、 〔2〕 、 〔2b〕 、 〔19〕 または 〔19 b〕 記載の医薬、
(20 a] さらに、 GM3合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔l a〕 、
〔2 a〕 、 [2 c] , 〔19 a〕 または 〔19 c〕 記載の医薬、
〔21〕 ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクトシ ルラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬ィヒの診断薬、
〔 21 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクト シルセラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる糖尿病の診断薬、
〔22〕 さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔21〕 記 載の診断薬、 [ 2 2 a ] さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を含有してなる上記 〔2 1 a ) 記載の診断薬、 .
〔2 3〕 ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラタトシ ルセラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法、
[ 2 3 a ] ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクト シルセラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔2 4〕 さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を用いる上記 〔2 3〕 記載の診 断方法、
[ 2 4 a ] さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を用いる上記 〔2 3 a〕 記載 の診断方法、
〔2 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコードするポリヌ クレオチドまたは （および） 酉己列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドを含有してなる動脈硬化の診断薬、
[ 2 5 a ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコードするポリ ヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチド をコードするポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病の診断薬、
〔2 6〕 .さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを含有してなる上記 〔2 5〕 記載の診断薬、
〔2 6 a〕 さらに—、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを含有してなる上記 〔2 5 a〕 記載の診断薬、
〔2 7〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコードするポリヌ クレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法、
[ 2 7 a ] 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチド をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔2 8〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを用いる上記 〔2 7〕 記載の診断方法、
[ 2 8 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコー ドするポリヌクレオチドを用いる上記 〔2 7 a〕 記載の診断方法、
〔2 9〕 動脈硬化の診断薬の製造のための、 ダルコシルセラミド合成酵素に対 する抗体または （および） ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用、
[ 2 9 a ] さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を用いる上記 〔2 9〕 記載の 使用、
〔2 9 b〕 糖尿病の診断薬の製造のための、 ダルコシルセラミド合成酵素に対 する抗体または （および） ラクトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用、
[ 2 9 c ] さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を用いる上記 〔2 9 b〕 記載 の使用、
〔3 0〕 動脈硬化の診断薬の製造のための、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはそ の部分べプチドをコードするポリヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン パク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、
[ 3 0 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを用いる上記 〔3 0〕 記載の使用、
C 3 O ] 糖尿病の診断薬の製造のための、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはそ の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン パク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、
〔3 0 c〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを用いる上記 〔3 0 b〕 記載の使用、
〔3 1〕 哺乳動物の血漿中のダルコシルセラミ ドまたは （および） ラクトシル セラミドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の診断方法、
〔3 1 a ] 哺乳動物の血漿中のダルコシルセラミドまたは （および） ラタトシ ルセラミ ドの量を測定することを特徴とする糖尿病の診断方法、
〔3 2〕 さらに、 GM 3の量を測定する上記 〔3 1〕 記載の診断方法、
〔3 2 a〕 さらに、 GM 3の量を測定する上記 〔3 1 a〕 記載の診断方法、
〔3 3〕 ダルコシルセラミドまたは （および） ラクトシルセラミ ドの動脈硬化 の診断マーカーとしての使用、
〔 3 3 a〕 ダルコシルセラミドまたは （および） ラクトシルセラミドの糖尿病 'の診断マーカーとしての使用、
〔3 4〕 さらに GM 3を用いる上記 〔3 3〕 記載の使用、
〔3 4 a〕 さらに GM 3を用いる上記 〔3 3 a〕 記載の使用、
〔3 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩また は （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスクリ一ユング方法、
[ 3 5 a ] 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩ま たは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする糖尿病の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、 〔3 6〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩を用いる上記 〔3 5〕 記載のスクリーニング方法、
〔3 6 a〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまた はその塩を用いる上記 〔3 5 a〕 記載のスクリーニング方法、 -
〔3 7〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩また は （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット、
[ 3 7 a ] 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩ま たは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩 を含有することを特徴とする糖尿病の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット、 〔3 8〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩を含有する上記 〔3 7〕 記載のスクリーニング用キット、
[ 3 8 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまた はその塩を含有する上記 〔3 7 a〕 記載のスクリーニング用キット、
〔3 9〕 配列番号.： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドするポリヌ クレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤 のスクリーニング方法、
[ 3 9 a ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドするポリ ヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチド をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の予防 ·治療剤 のスクリーニング方法、
〔4 0〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスク リーニング方法、
[ 4 0 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはそめ部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする糖尿病の予防 ·治療剤のスク リーニング方法、
〔4 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療 剤のスクリーニング用キット、
〔4 1 a〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチド をコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする糖尿病の予防 ·治療 剤のスクリーニング用キット、
〔4 2〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを含有する上記 〔4 1〕 記載のスクリーニング用キット、
[ 4 2 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコー ドするポリヌクレオチドを含有する上記 〔4 1 a〕 記載のスクリーニング用キッ 卜、
〔4 3〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩また は （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性または量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスクリー二 ング方法、
[ 4 3 a ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩ま たは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 の活性または量を測定することを特徴とする糖尿病の予防 ·治療剤のスクリ一二 ング方法、
〔4 4〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性または量を測定する上記 〔4 3〕 記載のスクリーニング方法、
[ 4 4 a ) さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまた はその塩の活性または量を測定する上記 〔4 3 a〕 記載のスクリーニング方法、
〔4 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防 · 治療剤のスクリ一ユング方法、
〔4 5 a〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチド をコードするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする糖尿病の予防 · 治療剤のスクリーニング方法、
〔4 6〕 さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコード するポリヌクレオチドの量を測定する上記 〔4 5〕 記載のスクリーニング方法、
[ 4 6 a ] さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコー ドするポリヌクレオチドの量を測定する上記 [ 4 5 a ) 記載のスクリーニング方 法、
〔4 7〕 ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラタトシルセラミ ド合 成酵素の活性を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療方法、
〔 4 7 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラクトシルセラミド 合成酵素の活性を阻害することを特徴とする糖尿病の予防 ·治療方法、
〔4 8〕 さらに、 GM 3合成酵素の活性を阻害する上記 〔4 7〕 、 下記 〔4 9〕 または 〔4 9 b〕 記載の方法、
〔4 8 a〕 さらに、 GM 3合成酵素の活性を阻害する上記 〔4 7 a〕 、 下記 〔4 9 a〕 または 〔4 9 c〕 記載の方法、
〔4 9〕 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラクトシルセラ ミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療方 法、
〔4 9 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラクトシルセ ラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする糖尿病の予防 ·治療方 法、
[ 4 9 b ] さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラタ トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする上記 〔4 7〕 記載の動脈硬化の予防 ·治療方法、
〔 4 9 c〕 さらに、 グノレコシノレセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラタ トシルセラミ ド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする上記 〔4 7 a〕 記載の糖尿病の予防 ·治療方法、
〔5 0〕 さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現を阻害する上記 〔4 7〕 、 〔4 9〕 または 〔4 9 b〕 記載の方法、
[ 5 0 a ] さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現を阻害する上記 〔4 7 a〕 、 [ 4 9 a ] または 〔4 9 c〕 記載の方法、
〔5 1〕 グルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （および） ラクトシルセラ ミド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の 予防 ·治療方法、
〔5 1 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （および） ラクトシルセ ラミド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする糖尿病の 予防 ·治療方法、
〔5 2〕 さらに、 GM 3合成酵素阻害剤の有効量を投与する上記 〔5 1〕 、 下 記 〔5 3〕 または 〔5 3 b〕 記載の方法、
〔5 2 a〕 さらに、 GM 3合成酵素阻害剤の有効量を投与する上記 〔5 1 a〕 、 下記 〔5 3 a〕 または 〔5 3 c〕 記載の方法、
〔5 3〕 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラクトシルセラ ミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とす る動脈硬化の予防 ·治療方法、
〔 5 3 a〕 ダルコシルセラミド合成酵素寧伝子または （および） ラクトシルセ ラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴と する糖尿病の予防 ·治療方法、
〔5 3 b〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラク トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記 〔5 1〕 記 載の動脈硬化の予防 ·治療方法、
〔5 3 c〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラク トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記 〔5 1 a〕 記載の糖尿病の予防 ·治療方法、
〔5 4〕 さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上記 〔5 1〕 、 〔5 3〕 または 〔5 3 b〕 記載の方法、
〔5 4 a〕 さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する上 記 〔5 1 a〕 、 〔5 3 a〕 または 〔5. 3 c〕 記載の方法、
〔5 5〕 動脈硬化の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素 阻害剤または （および） ラタトシルセラミド合成酵素阻害剤の使用、
〔 5 5 a〕 糖尿病の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素 阻害剤または （および） ラクトシルセラミ ド合成酵素阻害剤の使用、
〔5 6〕 さらに、 GM 3合成酵素阻害剤を用いる上記 〔5 5〕 、 下記 〔5 7〕 または 〔5 7 b〕 記載の使用、
[ 5 6 a ] さらに、 GM 3合成酵素阻害剤を用いる上記 〔5 5 a〕 、 下記 〔5 7 a〕 または 〔5 7 c〕 記載の使用、
〔5 7〕 動脈硬化の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素 遺伝子または （および） ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用、
〔5 7 a ] 糖尿病の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素 遺伝子または （および） ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用、 〔 5 7 b〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （およぴ） ラク トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記 〔5 5〕 記載の使用、
〔 5 7 c〕 さらに、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （およぴ） ラク トシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記 〔5 5 a ] 記載の使用、 〔5 8〕' さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記 〔5 5〕 、 . 〔5 7〕 または 〔5 7 b〕 記載の使用、
〔5 8 a〕 さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる上記 〔5 5 a 〕 、 [ 5 7 a ) または 〔5 7 c〕 記載の使用などを提供する。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられるダルコシルセラミド合成酵素 （Glucosylceramide
synthase ; EC_number=2. 4. 1. 80) は UGCG (UDP - glucose : ceramide
glucosyltransf erase) ceramide : UDPGlc glucosyltransferase^ uridine diphosphoglucose-ceramide glucosyltransf erase^ ceramide : UDP - glucose glucosyltransf erase^ ceramide glucosyltransf eraseなどとも呼ばれ、 UDP-グ ルコース （UDP-glucose) 由来のグルコースをセラミ ドの 1位の水酸基に転移す ることで生合成されるダルコシルセラミドの合成反応を触媒する酵素である。 本発明で用いられるラタトシルセラミド合成酵素 （Lactosylceramide
synthase : EC_number=2. 4. 1. -) は B4GLT6、 GalT - 2、 UDP-Gal.: betaGlcNAc beta 1， 4 - galactosyl transferase polypeptide 6などとも呼ばれ、 UDP-ガラク卜ース (UDP- galactose) 由来のガラクトースをグルコシルセラミドへ - 1, 4結合で転 移することで生合成されるラタトシルセラミドの合成反応を触媒する酵素である。 本発明で用いられる GM 3合成酵素 （Ganglioside GM3 synthase；
EC_number=2. . 99. 9) は、 SIAT9 (sialyltransferase 9) 、 SAT - 1
(sialyltransf erase I) 、 CMP-シアル酸：ラクトシルセラミ ド α - 2， 3シアル酸転 移酵素 (CMP-NeuAc： lactosylceramide alpha- 2， 3 - sialyl transferase) なとと ¾ 呼ばれ、 CMP-シアル酸 （CMP - N- acetylneuraminate) 由来のシアル酸を ~D- galactosyl- 1， 4- β - D- glucosylceramideの非還元末端ガラクトースに α -2， 3結合 で転移することで生合成される GM3 ( a -N-acetylneuraminyl-2, 3 - β - D - galactosyl- 1， - j3 -D-glucosylceramide) の合成反応を触媒する酵素である。 本発明で用いられるダルコシルセラミド合成酵素としては、 例えば、 配列番 号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有するタンパク質 （以下、 このタンパク質を、 本発明のタンパク質 Aまたは本発 明で用いられるタンパク質 Aと称することもある） 力 ラタトシルセラミド合成 酵素としては、 例えば、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 このタンパク質を、 本 発明のタンパク質 Bまたは本発明で用いられるタンパク質 Bと称することもあ る） 力 GM 3合成酵素としては、 例えば、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 このタンパク質を、 本発明のタンパク質 Cまたは本発明で用いられるタンパク質 Cと称することもある） が挙げられる （以下、 これらのタンパク質を、 本発明の タンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある） 。
本発明で用いられるタンパク質は、 ヒトゃ温血動物 （例、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 月干細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 ^8細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム 細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細 胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞 など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小 脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脾臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例：《 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由 来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 よ り好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス=8し05 62；フ ィルタリング =0FF) にて計算することができる。
配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 前記の配 列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番 号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を 有するタンパク質などが好ましい。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質などが挙げられ、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質 が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 ダルコシルセラミドの合成反応を触媒 する酵素活性 （ダルコシルセラミド合成酵素活性） などが挙げられる。 実質的に 同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質 であることを示す。 したがって、 ダルコシルセラミド合成酵素活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 · 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質などが挙げられ、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質 が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 ラタトシルセラミドの合成反応を触媒 する酵素活性 （ラタトシルセラミド合成酵素活性） などが挙げられる。 実質的に 同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質 であることを示す。 したがって、 ラクトシルセラミド合成酵素活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、.好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するタ ンパク質などが挙げられ、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質が好ましく用いられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 GM 3の合成反応を触媒する酵素活性 (GM 3合成酵素活性） などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が 性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したが つて、 GM 3合成酵素活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜： L 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの 活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ダルコシルセラミド合成酵素活性は、 公知の方法、 例えば Methods in
ENZYMOLOGY, 311卷， 50-59頁， 2000年などに記載の方法またはそれに準じた方法 により測定する。 具体的には、 グルコシルセラミド合成酵素、 セラミ ドぉよび UDP-放射標識グルコースを反応させ、 クロ口ホルム-メタノール抽出後のクロ口 ホルム層の放射活性を測定する。 あるいは、 ダルコシルセラミド合成酵素、 蛍光 標識セラミドおよび UDP-グルコースを反応させ、 クロ口ホルム-メタノール抽出 後、 クロ口ホルム層を回収し、 乾固後、 シリカ 60の薄層クロマトグラフィー
(thin-layer chromatography, TLC) によりダルコシルセラミドを分離し、 蛍光 イメージングが可能な機器 （例、 LAS- 1000 (富士フィルム社製） など） により蛍 光強度を検出、 測定する。
ラタトシルセラミド合成酵素活性は、 公知の方法、 例えば Methods in
ENZYMOLOGY, 311卷， 73- 81頁， 2000年などに記載の方法またはそれに準じた方法 により測定する。 具体的には、 ラクトシルセラミド合成酵素、 グルコシルセラミ ドぉよぴ UDP-放射標識ガラクトースを反応させ、 クロ口ホルム-メタノール抽出 後のクロ口ホルム層の放射活性を測定する。
また、 細胞または糸且織に含まれるダルコシルセラミ ド量またはラクトシルセラ ミ ド量の測定方法は、 公知の方法、 例えば基礎生化学実験法， 第 5卷， 第 11章， 135-141頁， 2000年に記載の方法またはそれに準じた方法により測定する。
具体的には、 細胞ペレット （タンパク質量 3mg〜5mg) に対してクロ口ホルム - メタノール （2:1) 2mlを加え、 5分間程度超音波処理後、 37°Cのインキュベータ 一中で 1時間振盪して抽出する。 その後、 遠心分離を行いペレッ トと上清 （脂質 抽出液） に分け、 ペレットに対して再度、 クロ口ホルム-メタノール -水
(1:2:0.8) 1mlにより 37°Cで 2時間振盪して再抽出する。 遠心後の上清を最初に 分離した上清と合わせて総脂質とする。 また、 組織ホモジネートに対して 20倍容 量のクロ口ホルム-メタノール （2:1) を加え、 5分間程度超音波処理後、 37°Cの インキュベータ一中で 1時間振盪する。 抽出液にメタノールを加え、 クロ口ホル ム -メタノールの比率を 1:1とした後に、 遠心分離によりペレツトと上清 （脂質抽 出液） に分け、 ペレットに対して再度、 クロ口ホルム-メタノール-水
(1:2:0.8) 2mlにより 37°Cで 2時間振盪して再抽出する。 遠心後、 上清を最初に 分離した上清と合わせて総脂質とする。 総脂質を酢酸型に変換した陰ィオン交換 カラムにかけてカラムの 4〜5倍容量のクロ口ホルム-メタノ一ル-水 (30： 60： 8) で溶出する。 溶出液からエバポレーターで溶媒を除き、 クロ口ホルム-メタノー ル （1:1) 0.5 mlに再溶解する。 4M NaOHを 0.025 mlを力 [Iえ、 37°Cで 2時間加温後、 2M酢酸を 0.025ml加える。 ゲル濾過クロマトグラフィーにサンプルをかけて、 ク ロロホルム-メタノール -水 （5:5:1) で溶出する。 溶出画分はエバポレーターで 溶媒を除き、 クロ口ホルム-メタノール （1:1) で溶解して薄層クロマトグラフィ — (TLC) の試料とする。 HPTLCプレート （Merk社） に試料をスポットし、 クロ口 ホルム-メタノール- 7j< (65：25： 4) などで展開後、 へキソースを発色させるアン トロン試薬、 オルシノール -硫酸試薬等で、 ダルコシルセラミドまたはラクトシ ルセラミドを検出する。 濃度が明確なダルコシルセラミ ドまたはラク トシルセラ ミドの内部標準とのデンシトメトリーで定量する。
GM3合成酵素活性の測定は、 公知の方法、 例えば、 ラタトシルセラミドを基質 として、 CMP-シアル酸 （10-100 nmol) と酵素を、 一定時間、 37°Cでインキュべ ートし、 酵素反応によって生成した GM3を定量する方法 （例、 Methods in
Enzymology, 311卷， 82- 94頁， 2000年などに記載の方法など）またはそれに準じ る方法などにより測定することができる。
具体的には、 GM3合成酵素発現細胞株 （例えばマウスメラノーマ B16 - F1株な ど） における細胞表層、 または細胞内 GM3を、 抗 GM3抗体を用いて量的に検出する。 細胞表層 GM3はホルムアルデヒドなどで固定化した後、 抗 GM3抗体 （例、 Clone M2590など） と反応させた後、 HRP標識抗マウス IgM抗体または AP標識抗マウス IgM 抗体と反応させ、 化学発光系あるいは発色系で検出する （J. Biol. Chem. , 277 卷， 47028- 47034頁， 2002年） 。 また、 ホルムアルデヒドなどで固定化した、 ま たは非固定の浮遊した状態の細胞と抗 GM3抗体 （例、 Clone Μ2590など） とを反応 した後、 FITC標識抗マウス IgM抗体などと反応後、 FACSで解析する （J. Biol. Chem. , 277卷， 3085-3092頁， 2002年） 。 また、 細胞内 GM3量は細胞を TritonX- 100などで前処理することで検出可能となる （J. Cell. Phys. , 141卷， 573 - 583 頁， 1989年） 。
本明細書において、 「ダルコシルセラミド合成酵素阻害」 とは、 ダルコシルセ ラミ ド合成酵素の活性の阻害またはダルコシルセラミド合成酵素の産生の阻害 (好ましくは、 ダルコシルセラミド合成酵素の活性の阻害） の何れであってもよ い。
本明細書において、 「ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤」 とは、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま たはその塩；配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 産生を阻害する化合物またはその塩 （好ましくは、 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩） の何 れであってもよい。 ' 本明細書において、 「ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤」 とし ては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドの発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
本明細書において、 「ラクトシルセラミド合成酵素阻害」 とは、 ラタトシルセ ラミド合成酵素の活性の阻害またはラタトシルセラミド合成酵素の産生の阻害 (好ましくは、 ラクトシルセラミド合成酵素の活性の阻害） の何れであってもよ い。
本明細書において、 「ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤」 とは、 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま たはその塩；配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 産生を阻害する化合物またはその塩 （好ましくは、 配列番号： 3で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩） の何 れであってもよい。
本明細書において、 「ラタトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤」 とし ては、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドの発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
本明細書において、 「GM 3合成酵素阻害」 とは、 GM 3合成酵素の活性の阻 害または GM 3合成酵素の産生の阻害 （好ましくは、 GM 3合成酵素の活性の阻 害） の何れであってもよい。
本明細書において、 「GM 3合成酵素阻害剤」 とは、 配列番号： 1 1で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその 塩；配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の産生を 阻害する化合物またはその塩 （好ましくは、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩） の何れで あってもよレヽ。
本明細書において、 「GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤」 としては、 配列番 号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの 発現を阻害する化合物またはその塩などが用いられる。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (2) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配 列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付 加したァミノ酸配列、 （3) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好まし くは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 （4) 配列番号： 1、 配列番 号： 3または配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ ノ酸配列、 または （5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク 質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本発明で用いられるタンパク質は、 ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1また は配列番号： 3で表わされるァミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルボ キシレート（- C00— ) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであつ てもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチ Λ^、 η—プロピル、 イソプロピル、 η—ブチルなどの C アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シ クロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエ ル、 α—ナフチルな どの 6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル一 ァ ルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー Cwアルキル基など の cト 14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （または力ルポ キシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C Mアルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば - 0H、 -SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの C アル力ノィル基などの C ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含ま れる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列を含有するタ ンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。 具体的には、 後述する本発明の抗体を調製する目的には、 配列番号： 1、 配列 番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列において、 少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましく は.1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチド などが用いられる。
本発明で用いられる部分べプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸 が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1 〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1 〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カル ポ^シレート （_C00— ) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであ つてもよレヽ。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有しているもの、. N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピログルタミン酸ィヒしたもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど の複合ぺプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分べプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に 許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスノレホン 酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前 述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法に よって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド 合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を逆相クロマト グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ を組み合 わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4—メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒ ドロ キシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2， ， 4， ージメ トキシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' ， 4， ージメ トキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ樹 脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 Q!—アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸 を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂 上で縮合させる。
反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種 保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施 し、 目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護ァミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N， N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N， 一 ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性ィ匕にはラセミ化抑制添カロ剤 （例えば、 HO B t , HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する力、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性ィ匕を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ ロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチルイ匕することによって、 後の反応に影響を与えないよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ 力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメ トキシベンジルォキシカル ボニル、 C l—Z、 B r— Z、 ァダマンチノレオキシカノレポニル、 トリフルォロア セチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—二トロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジフエ二ノレ ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 - プロピノレ、 ブチノレ、 t—ブチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロヘプ チル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしぐは環状ァ ルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4 - ニトロべンジ /レエステノレ、 4—メ トキシべンジノレエステノレ、 4_クロ口べンジノレ エステル、 ベンズヒ ドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ペンジノレオキ シカルポニルヒドラジド化、 tープトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （C^) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルボニル基、 ェトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテルィ匕に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラ -ル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12— B z l、 2—ニトロベンジル、 B r—Z、 t一プチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メ トキシ -2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Biim、 B o c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフヱノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2 , 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ノレコースレ、 パラニトロフエノーノレ、 HO N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N— ヒドロキシフタルイミ ド、 HO B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いら れる。 - 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾール、 ノ ラクレゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 —エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸ィ匕ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。 ·
タンパク質または部分ペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチ ド鎖の Ν末端のひ一ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分べプチ ドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺプ チドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒 中で縮合させる 6 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得ら れた保護タンパク質またはべプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護 基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗タ ンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍 結乾燥することで所望のタンパク質またはべプチドのアミド体を得ることができ る。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分べプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のぺプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用 いられる部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の:！）〜 5)に記載された方法が挙げられる。
1) M. Bodanszkyおよひ M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York 、丄 966年ノ
2) Sckroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
3) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
4) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
5) 矢島治明監修、 続医薬品の開癸、 第 14卷、 ぺプチド合成、 広川書- また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィ一.液体クロマトグラフィー '再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるレヽはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは D NAである。 D NAとしては、 ゲ ノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞'組織由来の c D NA、 前記した細胞 '組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよレ、。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より totalR NAまたほ mR NA.画分を調製したものを用いて直接 Reverse ·
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P G R法と略称す る） によって增幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2などで表される塩 基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードす る D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表される塩基配列とハイ ストリンジヱントな条件下でハイプリダイズできる D N Aとしては、 例えば配列 番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表される塩基配列と約 5 0 %以 上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは 約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相 同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用レヽ、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコア = 1 ; ミスマッチスコア =_3) にて計算することができる。- ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え は、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et a丄.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ ィブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこと ができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが できる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号 ·· 1で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質 をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコード する D NAとしては、 配列番号： 4で表される塩基配列を含有する D NAなど力 S、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D NAなどが用いら れる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D N A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列 を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲ ノム D NAライプラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ' 組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。
本努明で用いられる部分ぺプチドをコードする D N Aとし Tは、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D NAの一部分を有する D NA、 または配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番 号： 1 2で表される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイブリダィズ する塩基配列を含有 ύ 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタン パク質をコードする D N Αの一部分を含有する D N Αなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表される塩基配列とハイ ブリダィズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法おょぴハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパ ク質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAのクローエングの手段と しては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 D N A プライマーを用いて P C R法によつて増幅する力 \ または適当なベクターに組み 込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする D NA断 片もしくは合成 D NAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつ て選別することができる。 ハイプリダイゼーシ 3ンの方法は、 例えば、
Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、 P C R、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (タカラバイオ （株） ） 、 Mutan™- K (タカラバイオ （株） ） 等を用 いて、 0M- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいは それらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする D NAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 D NAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 ま た 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 T GAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D NAァ ダブターを用いて付 ¾することもできる。 本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （ii) 該 DNA断片を 適当な発現べクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 110， p TP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH19， p SH15) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， パキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl_l l、 pXT l、 R c/CMV、 p R c/RS V、 p c DNA I /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細包を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス) プロモーター、 SRo;プロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 ； LPLプロモー ター、 l p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ グナル、 ポリ A付カ卩シグナル、 選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセード （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遣 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA 'シグナル配 列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン♦シグナル配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 MF α ·シグナル配列、 SUC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン 'シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシヱリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリビア ' コリ
(Escherichia coli) K 12 · DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， JM103 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1 981)〕 ， J A221 [Journal of Molecular Biology, 1.20卷， 517 (1 978)] , HB 101 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (19 69)〕 ， C 600 [Genetics, 39卷， 440 (1 954)〕 などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus
subtilis) M I 1 14 [Gene, 24卷， 255 (1 983)〕 ， 207— 21
[Journal of Biochemistry, 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH 22 R—， NA87— 1 1A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC 191 3, NCYC2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株ィ匕糸田月包 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細月包） 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 3 15卷， 592 (1 985)〕。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 C O S-7, Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r一） 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T- 20, マウスミエローマ細胞， マウス ATDC5細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69卷， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこ とができる。
パチノレス属菌を开質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168卷， 111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182 - 187(1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75卷， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47 - 55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ノレ 263- 267(1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52卷， 456(1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする D N Aを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 '育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) ， Journal of Experiments in
Molecular Genetics, 431 - 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 j3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77卷， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Bitter， G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p H は約 5〜 8に調整するのが好ましレ、。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 2時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788 (1962) ) に非動ィ匕した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行 い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 〔3<^61^6, 122巻，501 (1952)〕 ， D ME M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本努明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおょぴ zまたは凍結融解などによつて菌体ぁる ヽは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質が分泌 . される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清と を分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離'精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リプシン、 ァ ギニノレエンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダー ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ぺプチドまた'はその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗 体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または 抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 -ヮトリが挙げられるが、 マウスおよぴラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)] に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイゥ ィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 S P 2/0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添カ卩され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜 10分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗 体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイブリ ドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R PM I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あ るいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S FM— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナノレ抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E AE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に温血動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対す る抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することがで さる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 グルタルアルデヒ ドゃカルポジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と - 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。
本発明で用いられるタンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレオ チド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 こ れらの DNAを本発明の D NAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相捕的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌク レオチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 D NAの発現 を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオチ ドであってもよいが、 アンチセンス D NAが好ましい。
本発明の D N Aに実質的に相捕的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 °/0以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げら れる。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 （i) 翻訳阻害を指向 したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位 をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補 鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最 も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、
(ii) RN a s e Hによる R NA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチド の場合は、 イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列の相補鎖と約 7 0 %以 上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適であ る。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表わされる 塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相捕的な塩 基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなど、 好まし くは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 1 2で表わされる塩 基配列を含有する D N Aの塩基配列に相捕な塩基配列、 またはその一部分を有す る了ンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリボー ス） は、 2 ' — O—メチノレイ匕などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列 番号： 2または酉 δ列番号： 4などで表わされる塩基配列を有する D NAにハイブ リダイズするものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌ クレオチドは、 公知の D N Α合成装置などを用いて製造することができる。 本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいは 決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、 合成 しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることができ、 該 RN Aの合成または機能を阻害すること ができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 '制御することができる。 本発明のタンパク 質関連 RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明のタ ンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチ ドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 '制御する のに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応す る」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相 同性を有するあるいは相捕的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列ま たは核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核 酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のァ ミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6 —ベースペア . リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋 白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パリンドロ ーム領域、 および 3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうる力 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相捕的でハイブリダィズすることが できるポリヌクレオチドとの関係は、 「アンチセンス」.であるということができ る。 アンチセンスポリリボヌクレオチドは、 2一デォキシ一 D—リポースを含有 しているポリデォキシリボヌクレオチド、 D—リボースを含有しているポリヌク レオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプ のポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー
(例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） ·または特殊 な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや RN A中に見 出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ ドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2 本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： RNAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド (または非修飾オリゴヌクレオチド) 、 さら には公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結 合 (例えば、 メチノレホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質
(ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ .インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプ チド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側 鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例えば、 アタリジン、 ソラレ ンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホ ゥ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾 された結合を持つもの (例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 こ こで 「ヌクレオシド」、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピ リミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつよ うなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチルイ匕されたプリンおよびピ リミジン、 ァシル化されたプリンおょぴピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドぉよぴ修飾されたヌクレオチド はまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変 換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （RNA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体やチォホスフヱ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計 されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 了 ンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性 をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8， pp. 395, 1992； S. T.
Crooke et al. ed. , Ant is ens e Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加する に好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合 を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるい は 5， 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうし たキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコー ルなどのダリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げら れるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞 に適用できる。
以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分ぺプチ ドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） 、 およぴ本発明の D NAのアンチセンスポリヌクレ ォチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、 動脈硬化病変部で発現が増加するので、 動脈硬化の診 断マーカーとして利用することが出来る。 また、 ダルコシルセラミド合成酵素ま たはラタトシルセラミド合成酵素の阻害剤 D- PDMPは、 インスリン刺激による IRS - 1のリン酸ィ匕を阻害する T F -ひの作用を抑制することより、 本発明のタンパク質 は、 糖尿病性合併症の診断マーカーとして利用することも出来る。
本発明のタンパク質は、 動脈硬化性疾患または糖尿病性合併症における早期診 断、 動脈硬化進展度または糖尿病進展度の推定のためのマーカーとして有用であ る。
さらに、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオ チド、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対する s i R NAまたは s h R NA、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタ ンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質 の産生を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質に対するアブタマ 一または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬などは、 例えば、 動脈 硬化の予防 ·治療用医薬、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出 血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動 脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化 症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） な ど） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病 性腎症など） ；メタポリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高 脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防 '治療 剤などとして使用することができる。
また、 本発明のタンパク質により合成されるダルコシルセラミ ドまたはラタト シルセラミド、 あるいは GM 3も動脈硬化や糖尿病の診断マーカーとして利用す ることが出来る。 すなわち、 動脈硬ィヒ性疾患または糖尿病性合併症における早期 診断、 動脈硬化の進展度の推定のためのマーカーとして有用である。
( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリ一ユング
本発明のタンパク質は動脈硬化病変部で発現が増加しており、 さらに、 本発明 のタンパク質を阻害する 〔以下、 「本発明のタンパク質の活性を阻害すること」 、 「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害すること」 および 「本発明のタンパ ク質の産生を阻害すること」 を総称して、 「本発明のタンパク質を阻害する」 と 記載することがある。 また、 本発明のタンパク質を阻害する化合物またはその塩 自体を、 本発明のタンパク質の阻害剤と称することがある。 さらに、 本発明の動 脈硬化の予防 ·治療用医薬には、 本発明のタンパク質を阻害する化合物またはそ の塩自体およびこれを含有する医薬組成物などが含まれる。 〕 と動脈硬化の病変 が改善される。 また、 ダルコシルセラミ ド合成酵素またはヲクトシルセラミド合 成酵素の阻害剤 D-PDMPは、 インスリン刺激による IRS- 1のリン酸化を阻害する T F - の作用を抑制する。
ダルコシルセラミ ド合成酵素、 ラクトシルセラミ ド合成酵素およぴ GM3合成酵 素は、 ガンダリオシド生合成系に関与する酵素である。 グルコシルセラミ ド合成 酵素はセラミ ドからダルコシルセラミ ドを、 ラタトシルセラミ ド合成酵素はダル コシルセラミ ドからラタトシルセラミ ドを、 GM3合成酵素はラタトシルセラミ ド から GM3を合成する酵素である。 つまり、 ガンダリオシド生合成系においてグル コシルセラミ ド合成酵素は GM3合成酵素の上流に位置する酵素である。 GM3の組織 含有量の調節にダルコシルセラミ ド合成酵素活性が関連する例として、 以下の報 告が挙げられる。 ハムスターにリポポリサッカライドを投与すると、 肝臓でグル コシルセラミ ド合成酵素の発現量が増加し、 ダルコシルセラミ ド合成酵素活性の 増加に伴い、 肝臓中の GM3量が増加する （J. Biol. Chem.， 274卷， 19707- 19713頁， 1999年） 。 また、 TNF- αや IL- 1 を投与すると、 ダルコシルセラミド合成酵素発 現量が増加し、 同様な効果が期待できる。 また、 3T3-L1脂肪細胞において、 TNF - aの刺激により GM3合成酵素の発現が上昇し、 GM3合成酵素活性も上昇し、 GM3量 も増加する （J Biol. Chem. , 277卷， 3085- 3092頁， 2002年) 。 つまり、 ダルコ シルセラミ ド合成酵素、 ラタトシルセラミ ド合成酵素、 GM3合成酵素は、 細胞ま たは組織における GM3量の調節において、 例えば TNF- α刺激の場合のように、 共 に発現レベルで調節されている。
従って、 本発明のタンパク質を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 動脈 硬化の予防 ·治療用医薬、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出 血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動 脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化 症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） な ど） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病 性腎症など） ；メタボリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高 脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防 ·治療 剤として使用することができる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
具体的なスクリーニング方法としては、 例えば、
(la) (i) 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出 物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性と、 （ii) 試験 化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞、 その細胞 抽出物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性とを比較す ることを特徴する本発明のタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(lb) (i) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出 -物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性と、 （ii) 試験 化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞、 その細胞 抽出物またはその精製タンパク質のラタトシルセラミド合成酵素活性とを比較す ることを特徴する本努明のタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーユング方法、
(lc) (i) 本発明のタンパク質 Aおよび Bを産生する能力を有する細胞、 その 細胞抽出物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性および ラクトシルセラミド合成酵素活性と、 （i i) 試験化合物の存在下、 本発明のタン パク質 Aおよび Bを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出物またはその精製 タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性おょぴラタトシルセラミド合成酵 素活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質 Aおよび Bの活性を阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(Id) (i) 本発明のタンパク質 Aおよび Cを産生する能力を有する細胞、 その 細胞抽出物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性と、 （ii) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aおよ び Cを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出物またはその精製タンパク質の ダルコシルセラミド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性とを比較することを 特徴する本発明のタンパク質 Aおよび Cの活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(le) (i) 本発明のタンパク質 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞、 その 細胞抽出物またはその精製タンパク質のラクトシルセラミド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性と、 （ii) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bおよ び Cを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出物またはその精製タンパク質の ラクトシルセラミ ド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性とを比較することを 特徴する本 明のタンパク質 Bおよび Cの活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(If) (i) 本発明のタンパク質 A、 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性、 ラタトシルセラミ ド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性と、 （ii) 試験化合 物の存在下、 本発明のタンパク質 A、 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞、 その細胞抽出物またはその精製タンパク質のダルコシルセラミド合成酵素活性、 ラタトシルセラミド合成酵素活性および GM 3合成酵素活性とを比較することを 特徴する本発明のタンパク質 Bおよび Cの活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(2a) (iii) 本発明のタンパク質 Aの脂質蓄積促進活性と、 （iv) 本発明のタ ンパク質 Aおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特 徴とする本発明のタンパク霄 Aの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリー ニング方法、
(2b) (iii) 本発明のタンパク質 Bの脂質蓄積促進活性と、 （iv) 本発明のタ ンパク質 Bおよび試験ィヒ合物の混合物の脂質蓄積促進活性とを比較することを特 徴とする本発明のタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩のスクリー ユング方法、
(2c) (iii) 本発明のタンパク質 Aおよび Bの脂質蓄積促進活性と、 （iv) 本 発明のタンパク質 Aならびに Bおよび試験化合物の混合物の脂質蓄積促進活性と を比較することを特徴とする本発明のタンパク質 Aおよび Bの活性を阻害する化 合物またはその塩のスクリーユング方法、
(2d) (iii) 本発明のタンパク質 Aおよび Cの脂質蓄積促進活性と、 （iv) 本 発明のタンパク質 Aならびに Cおよび試験ィヒ合物の混合物の脂質蓄積促進活性と を比較することを特徴とする本発明のタンパク質 Aおよび Cの活性を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(2e) (iii) 本発明のタンパク質 Bおよび Cの脂質蓄積促進活性と、 （iv) 本 発明のタンパク質 Bならぴに Cおよび試験ィヒ合物の混合物の脂質蓄積促進活性と を比較することを特徴とする本発明のタンパク質 Bおよび Cの活性を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(2f) (iii) 本努明のタンパク質 A、 Bおよび Cの脂質蓄積促進活性と、
(iv) 本発明のタンパク質 A、 Bならびに Cおよび試験化合物の混合物の脂質蓄 積促進活性とを比較することを特徴とする本発明のタンパク質 A、 Bおよび Cの 活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などが用いられる。 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した 本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべクタ一で形質転換された宿 主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C HO 細胞、 HE K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニン グには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細 胞内あるいは糸田胞外に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本発明のタ ンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換体の培養法 と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられる。 試験化合物は塩を形成していてもよく、 試験化合物の塩とし ては、 例えば金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸 との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例 としては、 例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム 塩、 マグネシウム塩、 パリゥム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩な どが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン 、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6ールチジン、 エタノールアミ ン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シク口へキシルアミン、 ジシ クロへキシルァミン、 N, N'—ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げ られる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫 酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えば ギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 安息香酸、 フタル酸、 フマル酸 、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスノレホン酸、 ： —トノレエンスルホン酸などとの塩が挙げられる 。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル 二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えば ァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 このうち、 生理学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸性官能 基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， カリウム塩など） 、 了 ルカリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） など の無機塩、 アンモ-ゥム塩など、 また、 化合物内に塩基性官能基を有する場合に は、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ タル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 例えば、 上記 （ii) の場合における各活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害させる試 験化合物を、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することが できる。 '
例えば、 上記 （iv) の場合における脂質蓄積亢進活性を、 上記 （iii) の場合 に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上 阻害させる試験化合物を、 本 明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選 択することができる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタンパ ク質の生理活性を阻害するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などから選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した試験化合物 の塩と同様のものが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質の遺伝子も、 動脈硬化病変部において発現が増加 しており、 該遺伝子の発現を阻害すると動脈硬化の病変が改善するので、 本発明 のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、 例えば動脈硬化 の予防 ·治療用医薬、 動脈硬ィ匕性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血な ど） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾 患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症な どに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） な ど） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病 性腎症など） ；メタボリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高 脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防 ·治療 剤として使用することができる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬 として有用である。
スクリーニング方法としては、 （V) 本発明のタンパク質を産生する能力を有 する細胞を培養した場合と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質を 産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスク リーユング方法が挙げられる。
上記方法において、 （V) と （vi) の場合における、 前記遺伝子の発現量 （具 体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするポリ.ヌクレ ォチド （例、 mR NAなど） の量を測定して、 比較する。
(3a) (v) 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する細胞を培養した場合 と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aを産生する能力を有する 細胞を培養し、 タンパク質 A遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、 比較することを 特徴とする本発明のタンパク質 A遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(3b) (v) 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する細胞を培養した場合 と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Bを産生する能力を有する 細胞を培養し、 タンパク質 B遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、 比較することを 特徴とする本発明のタンパク質 B遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(3c) (v) 本発明のタンパク質 Aおよび Bを産生する能力を有する細胞を培養 した場合と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 Aおよび Bを産生 する能力を有する細胞を培養し、 タンパク質 Aおよび B遺伝子の発現量をそれぞ れ測定し、 比較することを特徴とする本発明のタンパク質 A遺伝子の発現およぴ 本発明のタンパク質 B遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(3d) (ν)'本発明のタンパク質 Αおよび Cを産生する能力を有する細胞を培養 した場合と、 （vi) 試験ィ匕合物の存在下、 本努明のタンパク質 Aおよび Cを産生 する能力を有する細胞を培養し、 タンパク質 Aおよび C遺伝子の発現量をそれぞ れ測定し、 比較することを特徴とする本発明のタンパク質 A遺伝子の発現および 本発明のタンパク質 C遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(3e) (v) 本発明のタンパク質 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞を培養 した場合と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本楽明のタンパク質 Bおよび Cを産生 する能力を有する細胞を培養し、 タンパク質 Bおよび C遺伝子の発現量をそれぞ れ測定し、 比較することを特徴とする本発明のタンパク質 B遺伝子の発現および 本発明のタンパク質 C遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(3f) (V) 本発明のタンパク質 A、 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞を 培養した場合と、 （vi) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク質 A、 Bおよび Cを産生する能力を有する細胞を培養し、 タンパク質 A、 Bおよび C遺伝子の発 現量をそれぞれ測定し、 比較することを特徴とする本発明のタンパク質 A遺伝子 の発現、 本発明のタンパク質 B遺伝子の発現および本発明のタンパク質 C遺伝子 の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などが挙げられる。 試験ィヒ合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識する 抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。 mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2、 配 列番号： 4または配列番号： 1 2、 またはその一部を含有する核酸を用いるノー ザンハイプリダイゼーション、 あるいはプライマーとして配列番号： 2、 配列番 号： 4または配列番号： 1 2、 またはその一部を含有する核酸を用いる P C R法 またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、 上記 （vi) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （V) の場合に比べ て、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害さ せる試験ィヒ合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物として 選択することができる。
(i) 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 （ii) 本発 明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （iii) 本努明 のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 コレステロール 搬出活性を促進する作用、 リポタンパク取り込み活性を阻害する作用を有してい ることが好ましい。
コレステロール搬出活性は、 公知の方法、 例えば J. Biol. Chem. , 276卷， 43564- 43569頁， 2001年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測定す る。
放射性同位元素 （例、 〔¾〕 、 〔14C〕 など） で標識されたコレステロールまた はコレステロールエステルを含む培地で、 細胞 （例、 マクロファージ等） を培養 し、 緩衝液 （例、 ゥシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液、 リン酸緩衝液等） で洗 浄し、 細胞に取り込まれなかった放射性同位元素を除く。 上記 （i) 〜 （iii) の 化合物存在下、 上記細胞を培養後、 高密度リポタンパク （HDL) 、 アポリポプロ ティン Al、 サイクロデキストリン類などと接触させ （例、 HDL、 アポリポプロテ イン Al、 サイクロデキストリン類を含む培地に交換して培養する） 、 放射活性を 測定する。 細胞ライゼートの放射活性も測定し、 取り込まれた放射活性の何割が 培養上清に搬出されたかを計算する。 · リポタンパク取り込み活性は、 公知の方法、 例えば Pro. Natl. Acad. Sci.， 88卷， 4931- 4935頁， 1991年などに記載の方法またはそれに準じた方法により測 定する。
上記 （i) 〜 （iii) の化合物存在下、 放射性同位元素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 C1 C] 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 [3BS] など） で標識されたリポタンパク (例、 低比重リポタンパク、 変性低比重リポタンパク等） を含む培地で細胞を培 養し、 緩衝液で洗浄後、 取り込まれた放射活性をシンチレーシヨンカウンターな どで測定する。
上記 （i) 〜 （iii) の化合物存在下、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製） など） 、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチォシァネートなど〕 で標識されたリポタン パク （例、 低比重リポタンパク、 変性低比重リポタンパク等） を含む培地で細胞 を培養し、 緩衝液 （例、 リン酸緩衝液） で洗浄後、 蛍光活性を、 蛍光プレートリ 一ダ一で測定する、 または細胞剥離後、 取り込まれた蛍光物質で標識されたリポ タンパクを FACSで測定する。
本発明のスクリーニング用キットは、 本 明で用いられるタンパク質もしくは 部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 または本努明で用レヽ られるタンパク質もしくは部分べプチドを産生する能力を有する細胞を含有する ものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿など） カ ら選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明のタン パク質の活性 （例、 ダルコシルセラミド合成酵素活性、 ラタトシルセラミド合成 酵素活性、 GM 3合成酵素活性など） を阻害する化合物またはその塩、 本発明の タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質 の産生を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した試験ィヒ合物の塩と同様のものが用いられる。 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の産生を P且害する化合物またはその塩などはそれぞれ、 例えば動脈硬化の予防 ·治療用医 薬、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患
(例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全 など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など)' など） ；糖尿病や糖尿病性 合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリ ック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複 数のリスクファクタ一を示す症候群） などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の産生を 阻害する化合物またはその塩、 .およぴ本発明の抗体は、 2種以上を組み合わせて、 上記疾患の予防 ·治療剤として使用することもできる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 ' 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例 えば、 上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油 性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液として は、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いら れ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコー ル （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性 剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene ( 5 O mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 などと併用してもよい。 油' I1生液として は、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製さ.れた注射液は、 通常、 適 当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記化合物またはそ の塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合す よう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 10 Omg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記化合物が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投 与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 心筋梗塞、 不 安定狭心症など） の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物ま たはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） において は、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1 · 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与す る場合は、 該ィヒ合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投与 ルートなどによっても異なるが、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、'心筋梗塞、 不安 定狭心症など） の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物また はその塩を注射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 Ok gとして） に おいては、 一日につき該ィ匕合物またはその塩を約 0. 01〜30mg、 好ましく は約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg静脈注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を 投与することができる。
本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の タンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩などの場合も、 本発明のタンパ ク質の活性を阻害する化合物またはその塩の場合と同様にして投与することがで さる。
( 2 ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 ネ皮検液中の 本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用 することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識ィヒされた本発明のタンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体およぴ標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法などを提供 する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノ クローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 糸且織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗 体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b，）2 、 F a b \ あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔35s〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャ ムバイオサイエンス社製) など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチォ シァネートなど〕 、 酵素 （例、 _ガラクトシダーゼ、 i3—ダルコシダーゼ、 ァ ルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） .、 発光 物質 (例、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ノレシゲニンなど) 、 ピオチン、 ランタニド元素などが用いられる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常タ ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定ィ匕するのに用いられる化学結合を用レヽる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある . いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶ィ匕した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識ィ匕剤おょぴ不溶ィ匕の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本努明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し
(B /F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B ZF分離をポリエチレング リコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体と して固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体 として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一な どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築 すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年努行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical rechniques (Pa:rt A) )、 同書 Vol. ·73 (immunochemical Techniques (Part B) )、 |F0書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 |p書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) )、 |PJ書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part ェ： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することに よって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば動脈硬化性 疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離な ど） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全など） ；末梢 動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症候群
(インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスク ファクターを示す症候群） などに罹患している、 または将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。
例えば、
(a) 本発明のタンパク質 Aに対する抗体を用いて、 本発明のタンパク質 Aの濃 度を定量する、 (b) 本発明のタンパク質 Bに対する抗体を用いて、 本発明のタンパク質 Bの濃 度を定量する、
(c) 本発明のタンパク質 Aに対する抗体およぴ本発明のタンパク質 Bに対する 抗体を用いて、 本発明のタンパク質 Aおよび Bの濃度を定量する、
(d) 本発明のタンパク質 Aに対する抗体および本発明のタンパク質。に対する 抗体を用いて、 本発明のタンパク質 Aおよび Cの濃度を定量する、
(e) 本発明のタンパク質 Bに対する抗体およぴ本発明のタンパク質 Cに対する 抗体を用いて、 本発明のタンパク質 Bおよび Cの濃度を定量する、
(f) 本発明のタンパク質 Aに対する抗体、 本発明のタンパク質 Bに対する抗体 および本発明のタンパク質 Cに対する抗体を用いて、 本発明のタンパク質 A、 B および Cの濃度を定量することにより、 診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質 の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用 することができる。
( 3 ) 遺伝子診断薬
本発明の D NAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク 質またはその部分べプチドをコ一ドする D NAまたは mRNAの異常 （遺伝子異 常） を検出することができるので、 例えば、 該 D N Aまたは mRNAの損傷、 突 然変異あるいは発現低下や、 該 D NAまたは mR NAの増加あるいは発現過多な どの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダイゼーションゃ P C R—S S C P法 (Genomics,第 5卷， 874〜879頁（1989 年ノ、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the UbA,第 86 卷, 2766〜2770頁（1989年)）などにより実施することができる。 例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現増加が検出された場合や P C R— S S C P法により D NAの突然変異が検出された場合は、 例えば動脈硬 化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋 梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解 離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬ィ匕症などに起因する腎不全など） ； 末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症
(例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症 候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリ スクファクターを示す症候群） である可能性が高いと診断することができる。 例えば、
(a) 本発明のタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドを用いて、 本発明の タンパク質 A遺伝子の発現量を定量する、
(b) 本発明のタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドを用いて、 本発明の タンパク質 B遺伝子の発現量を定量する、
(c) 本発明のタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドおよび本発明のタン パク質 Bをコードするポリヌクレオチドを用いて、 本発明のタンパク質 Aおよび B遺伝子の発現量を定量する、
(d) 本努明のタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドぉよび本発明のタン パク質 Cをコードするポリヌクレオチドを用いて、 本発明のタンパク質 Aおよび C遺伝子の発現量を定量する、
(e) 本発明のタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドぉよぴ本発明のタン パク質 Cをコードするポリヌクレオチドを用いて、 本発明のタンパク質 Bおよび C遺伝子の発現量を定量する、
(f) 本発明のタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチド、 本発明のタンパク 質 Bをコードするポリヌクレオチドおよぴ本発明のタンパク質 Cをコードするポ リヌクレオチドを用いて、 本発明のタンパク質 A、 ' Βおよび C遺伝子の発現量を 定量することにより、 診断することができる。
( 4 ) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬 本発明の D NAに相捕的に結合し、 該 D NAの発現を抑制することができる本 発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明の タンパク質または本発明の D N Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動 脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全な ど） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合 併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタボリッ ク症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数 のリスクファクタ一を示す症候群） などの予防 ·治療剤などの医薬として使用す ることができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを医薬として使用する場合、 自体公知の方 法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロゥ ィルスベクター、 アデノウイノレスベクター、 アデノウイノレスァソシエーテツドウ ィルスべクタ一、 レンチウイノレスベクター、 リボソーム誘導体などの適当なベタ ターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口 的に投与することができる。 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために捕助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤 化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき る。 あるいは、 エアロゾノレ化して吸入剤として気管内に局所投与することもでき る。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目的 に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担体と ともに製剤 （注射剤) 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投 与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 治療目的で本発明のアンチセンスポ リヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） において は、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . l〜1 0 0 m g投与す る。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。
上記ァンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコ一ドす る R N Aの一部を含有する二重鎖 RN A (本発明のポリヌクレオチドに対する s i R NA mall (short) interfering RNA) 、 s h RNA Ismail (short) hairpin RNA) など） 、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部を含有す るリボザィムなども、 本努明の遺伝子の発現を抑制することができ、 生体内にお ける本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられる D N Aの機能を抑 制することができるので、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗 塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患な ど） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化 症、 腎硬ィ匕症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化 症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経 症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症候群 （ィンスリン抵抗性を基礎とする 高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの 予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部に公知のリ ポザィムを連結することによって製造することができる。 本発明のタンパク質を コードする R N Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本発 明の RN A上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。 上記の二重鎖 RNAまたはリボザィムを医薬として使用する場合、 アンチセン スポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質に対するァ プタマーなども、 本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を抑制することが できるので、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血な ど） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾 患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症な どに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） な ど） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病 性腎症など） ；メタポリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高 脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防 ·治療 剤などの医薬として使用することができる。
ァプタマ一は、 公知の方法、 例えば SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 法 (Annua丄 Review of Medicine 5o^, 555- 583貝， 2005年） を用いて取得する。 ァプタマ一の構造は、 公知の方法を用いて決定する ことができ、 その構造を基に、 公知の方法に従いアブタマ一を製造する。
上記のアブタマ一を医薬として使用する場合、 アンチセンスポリヌクレオチド と同様にして製剤化し、 投与することができる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体 （例、 中和抗体） は、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 (例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性 心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動 脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病 性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症候群 （ィンスリン抵抗性を基礎 とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 また、 抗体分子そ のものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b，）2、 F a b \ あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま液 剤として、 または適当な剤型の医薬糸且成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラ ット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的ま たは非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができる。 好ま しくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体おょぴ その塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ つても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形とし て提供される。
非経口投与のための糸且成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調整で きる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通 常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化する ことによつて調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の捕助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 ^polyoxyethylene ( 5 0 mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用 いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用して もよレ、。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直 腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す ることによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 (ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 この ような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる 担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤とし ては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g程度、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g程度、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m g程 度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する医薬の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ル ートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の治療 ·予防のために使用する場合 には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 O m g / k g体重程度、 好ましくは 0 . 1〜1 O m g / k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . ：!〜 5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1〜 3回程度、 静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに 準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて 増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提 供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
( 6 ) 本発明の 「本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩」 、 「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩」 および 「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩」 「本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩」 は、 本発明のタ ンパク質の活性を阻害する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出 液、 血漿など） であればよく、 例えば動脈硬化、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾 患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血 性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患
(例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉 塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタボリック症候群 （ィンスリン抵抗性 を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症 候群） などの予防 ·治療剤または予防 ·治療用医薬として用いられる。
「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩」 は、 本 発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） であればよく、 例えば動脈硬化、 動脈硬化性疾患
(例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭 心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離な ど） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全など） ；末梢 動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症候群 (インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスク ファクターを示す症候群） などの予防 ·治療剤または予防 ·治療用医薬として用 いられる。
「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩」 は、 本発明のタ ンパク質の産生を阻害する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチ -ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出 液、 血漿など） であればよく、 例えば動脈硬化、 動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾 患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血 性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患
(例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉 塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリック症候群 （インスリン抵抗性 を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症 候群） などの予防 ·治療剤または予防 ·治療用医薬として用いられる。
また、 予防 ·治療用医薬、 予防 ·治療剤には、 「本発明のタンパク質の活性を 阻害する化合物またはその塩」 自体、 「本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻 害する化合物またはその塩」 自体、 「本発明のタンパク質の産生を阻害する化合 物またはその塩」 自体、 およびこれらのいずれかを含有する医薬組成物などが含 まれる。
該予防 ·治療剤は、 上記と同様にして製造される。
(7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の 外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと 略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。 '
すなわち、 本発明は、
(1) 本楽明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジヱクシヨン法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57B LZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B S CSFi系統， BDF 系 統， B SDSFi系統， BALBZc系銃， I CR系統など） またはラット （例 えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる糸且換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 ^ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いつたん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の D N Aをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 (例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る DNAなどが用いられる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本努明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒ ト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草 菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はパキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好 ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 1)ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー ター、 2)各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 ァ /レブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋ク レアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 グルタチオン S—トランスフ エラーゼ、 血小板由来成長因子 ;3、 ケラチン K l， 1：1 0ぉょぴ 1 4、 コラー ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ] 3 Iサブュ ニッ ト、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファターゼ、 心房ナトリ ゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略され る） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （N a， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロプ ロティ^ "一ゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン J3 _水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 l a (E F- 1 a) 、 β了クチンく ο:および ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレプロエンケファリン A
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ターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現す ることが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 α) のプロモーター、 ヒ トおよぴニヮトリ i3ァクチンプロモーター などが好適である。
上記ベクターは、 DN A転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネータ一と呼ばれる） を有していること が好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を 用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネータ一な どが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒ トまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞おょぴ体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞およぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本努明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞およぴ体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞およぴ体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D N Aが高発現 させられており、 内在 1"生の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 '本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有すること力 ら、 本幾明のタンパク質に関連する疾患に 対する予防 ·治療剤、 例えば動脈硬化性疾患、 糖尿病性合併症などの予防 ·治療 剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラタ卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本努明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞おょぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞およぴ体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本努明の異常 D N Aが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本努 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行うことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D NA高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明のタ ンパク質の增加症状を有することから、 本努明のタンパク質または機能不活性型 不応症に対する予防 ·治療剤のスクリーユング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本努明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
1)組織培養のための細胞源としての使用、
2)本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析する力 \ または D N Aにより発現されたぺプチド組織を分析することによる、 本発明のタ ンパク質により特異的に発現あるいは活性ィ匕するべプチドとの関連性についての 解析、
3) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
4)上記 3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
5)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した D N A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統ィ匕を行なうことが可能である。 さらに、'本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およぴその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の D NA転移動物ま たは本発明の外来性 D N A発現べクターを用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
( 8 ) ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 (2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の J3—ガラクトシダーゼ遣 伝子） を導入することにより不活性化された第 （ 1 ) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DN Aが不活性化された該 DN A発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遣伝子 （例、 大腸菌由来の i3 _ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、 (8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、. DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本努明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本努明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z ( 一ガラクトシダーゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代 表とするレポータ一遣伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壌するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列
(例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壌するように構築した DNA配列を有するDNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の DNA上あるいはその近傍の DN A配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とター ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活ィ匕させる元の E S細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免 疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BLZ6マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDFi マウス （C 57 B L/6と DBAZ2との を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという 利点に加えて、 C57BL/6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 B L/6マウスとバックク ロスすることでその遣伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能であ る点で有利に用い得る。 また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P C R法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個) で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S T O,繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1-1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0. 5 %トリプシン Z 0.1〜 5 mM EDTA, 好ましくは約 0.1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に 播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行うが、 こ の際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細 胞は放棄することが望まれる。
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭項筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 Journal of Embryology and Experimental Morphology, 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分ィ匕させて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビトロにお ける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR NA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本努明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D NAが不活性ィ匕された D NA配 列が遺伝子相同 a換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックァゥトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本宪明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ値体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D NA溶液を注入することによりターゲッティングベタターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックァゥトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本楽明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリ一二ングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病などに対して治療 ·予防効果を有する化合物または その塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本努明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。 試験化合物は塩を形成していてもよく、 試験化合物の塩として は、 前記と同様のものが用いられる。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験ィ匕合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば動脈硬化性疾患、 糖尿病性合併症などに対して治療 ·予防効果を有する 化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA転移非ヒト哺乳動物に試験ィ匕 合物を投与し、 試験化合物非投与群と動脈硬化性疾患の発症度合いの違 、や動脈 硬化性疾患の治癒度合 、の違!/、を上記組織で経時的に観察する。 該スクリーニング方法において、 試験動物に試験ィヒ合物を投与した場合、 該試 験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上改善した場合、 該試験ィヒ合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効 果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の発現亢進などによって引き起こされ る疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性な予 防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリーニン グで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 本発明 のタンパク質の発現亢進などによって引き起こされる疾患としては、 例えば、 動 脈硬化性疾患、 糖尿病性合併症などが挙げられる。 従って、 本発明のタンパク質 の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻 害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の産生を詐害する化合物または その塩などは、 動脈硬化性疾患、 糖尿病性合併症などの疾患の予防 ·治療剤とし て使用することができる。
該スタリ一二ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 前記した試験ィヒ合物の塩と同様のものが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本努明のタンパク質の抗体を含有する医薬と同様にして製造することができ る。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投与ルートな どによっても異なるが、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 心筋梗塞、 不安定狭心症 など） の治療の目的で該化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 (体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該ィ匕合物またはその塩を約 0. 1〜： L 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 動脈硬化性疾患
(例、 心筋梗塞、 不安定狭心症など) の治療の目的で該ィヒ合物またはその塩を注 射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （6 O k gとして） においては、 一日に つき該化合物またはその塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜20 mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(8 b) 本発明の DN Aに対するプロモーターの活性を阻害する化合物をスク リーユング方法
本努明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本努明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遣伝 子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。 試験ィ匕合物は塩を形成 していてもよく、 試験化合物の塩としては、 前記と同様のものが用いられる。 レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 i3_ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポータ.一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明のタ ンパク質の発現する,袓織で、 本努明のタンパク質の代わりに i3 _ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4 _クロロー 3 _インドリル _ i3 一ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような i3—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現 態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X—g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TA/ P B S 溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 前記した試験ィ匕合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに対するプロモーター活性を調節 （促進または阻害；好ましく は阻害） する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現の調節 （促進ま たは阻害；好ましくは阻害） 、 該タンパク質の機能を調節 （促進または阻害；好 ましくは阻害） することができるので、 例えば動脈硬化性疾患、 糖尿病性合併症 などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サ など） に対して投与することができる。
該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投与ルートな どによっても異なるが、 例えば、 動脈硬化性疾患 （例、 心筋梗塞、 不安定狭心症 など） の治療の目的で本発明の D N Αに対するプロモーター活性を調節 （促進ま たは阻害；好ましくは阻害） する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般 的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜 2 0 m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の投与量は、 対象疾患、 投与 対象、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 本努明の D NAに対 するプロモーター活性を調節 （促進または阻害；好ましくは阻害） する化合物ま たはその塩を注射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （6 0 k gとして） にお いては、 一日につき該化合物を約 0 . 0 1〜3 O m g、 好ましくは約 0 . 1〜2 0 m g、 より好ましくは約 0 . 1〜 1 0 m g静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができ る。
このように、 本努明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー- ングする上で極めて有用であり、 本発明の D NA発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する D NAを使って、 そ の下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異 的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現 するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生能 力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用 できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature ίこよる略^ めるレヽ ίま 亥分 野における'慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相捕的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ： シトシン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジアミン四酢酸
SD S ： ドデシル硫酸ナトリゥム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ：ァラニン
V a 1 ：ノ リン
Le u ： ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ： スレ才ニン
C y s ： システィン
Me t ：メチォニン G 1 u グノレタミン酸
As
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s
P h e フエニノレアラニン
T y r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グノレタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
S e c セレノシスティン (selenocysteine
また、 中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
M e メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フヱニノレ基
TC チアゾリジンー4 (R) —カルボキサミ ド基
T o s 一トノレエンスノレフォニノレ
CHO ホルミル
B z 1 ベンジノレ
Cl2 - Bzl 2， 6—ジクロ口べンジノレ
B om ペンジノレオキシメチノレ
Z ペンジノレオキシカノレポ二ノレ
C 1一 Z 2—クロ口べンジノレォキシカノレポ二ノレ
B r -Z 2—プロモベンジルォキシカルポニル B o c ： t一ブトキシカルポニル
DNP ： ジニトロフエ二ノレ
T r t ： トリチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N_ 9 _フルォレニルメ トキシカルポニル
HOB t ： 1—ヒ ドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3, 4—ジヒ ドロー 3—ヒ ドロキシー 4一ォキソ _ 1, 2， 3
—ベンゾトリァジン
HONB ： 1-ヒ ドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3 -ジカルボキシイミ ド DCC ： N， N' —ジシクロへキシルカルポジイミ ド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ダルコシルセラミド合成酵素のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号-: 2〕
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を有するダルコシルセラミド合成酵素をコ ードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ラクトシルセラミ ド合成酵素のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するラクトシルセラミド合成酵素をコ ードする D N Aの塩基配列を示す。
ほ β列番号： 5〕 .
実施例 1で用いられたセンスプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 ]
実施例 1で用いられたアンチセンスプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられたセンスプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕 実施例 1で用いられたアンチセンスプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 4で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 丄ェ〕
GM 3合成酵素のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を有する GM 3合成酵素をコードする D N Aの塩基配列を示す。 実施例
以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。 実施例 1
ゥサギ大動脈の動脈硬化病巣でのダルコシルセラミド合成酵素およびラタトシ ルセラミド合成酵素の発現検討
5週齢ニュージーランド白色家兎 （Kbl :NZW) を 0. 5%コレステロール添加 RC- 4飼 料で 8週間飼育後、 さらに 4週間 RC-4飼料で飼育した。 麻酔下、 頸動脈から放血し た後、 大動脈起始部から胸部大動脈までのサンプリングを行った。 冷却生理食塩 水中で血管から脂肪組織、 結合組織などのトリミングを行い、 冷却 RNAlater (QIAGEN社製） 中で保存した。 大動脈を目視により動脈硬化病変が多い部分と少 ない部分とに二分割し、 RNeasy Fibrous Tissue Midi Kit (QIAGEN社製） を用い てトータノレ腿を調製した。 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems社製）を用いて cDNAを作成した。 TaqMan Universal PGR Master Mix (Applied Biosystems社製）を用いて PCR反応を行い、 ァガロースゲル電気泳動を 行レ、半定量的に発現量を比較検討した。 PCRプライマーはゥサギダルコシルセラ ミ ド合成酵素及びラタトシルセラミド合成酵素の部分配列を取得し、 その塩基配 列情報からデザインした。
ダルコシルセラミド合成酵素のセンスプライマー 1 (配列番号： 5 ) およぴァ ンチセンスプライマー 2 (配列番号： 6 ) を用いて、 アニーリング温度 54°C、 サ ィクル数 36回の条件で PCR反応を行った。
ラクトシルセラミド合成酵素のセンスプライマー 3 (配列番号： 7 ) およびァ ンチセンスプライマー 4 (配列番号： 8 ) を用いて、 アニーリング温度 55°C、 サ ィクル数 34回の条件で PCR反応を行った。
ァガロースゲル電気泳動の結果、 同一個体での比較から、'明らかに動脈硬化病 変が少ない血管部分に比較して、 病変が多い血管部分でダルコシルセラミド合成 酵素およぴラクトシルセラミド合成酵素の mRNA発現が亢進していることが示され た。 従って、 動脈硬化病巣では両合成酵素活性の上昇することが示された。 実施例 2
( 1 ) THP— 1細胞における D—PDMP (D— threo—卜 phenyl— 2— decanoylamino— 3 - morpholino-1-propanol) のコレステロール搬出活性に対する影響
D- PDMPは、 ダルコシルセラミド合成酵素活性およびラタトシルセラミド合成酵 素活性を阻害することが知られており （Glycoconjugate J -， 13卷， 481- 486頁， 1996年） 、 その濃度および処理時間に依存して細胞内のダルコシルセラミドおよ ぴラクトシルセラミドを枯渴させることが可能であることが知られている （J Biochem (Tokyo) , 117卷， 766-773頁， 1995年） 。 この化合物を用いて、 細胞内 の糖脂質の蓄積を阻害したときのコレステロール搬出活性に対する影響を調べた。
12ゥエルプレート （ファルコン社） に 1ゥエル当たり 8. 0 X 105個に懸濁した THP- 1細胞 （ATCCより購入； Int J Cancer. , 26卷， 171- 176頁， 1980年） を、 ホ ルポール 12-ミリステート 13-ァセテ一ト （PMA) (最終濃度： 100 nM) を含む RPMI- 1640培地 （10% FBS, 25 mM HEPES, ぺニシリン /ストレプトマイシンを含 む） で 3日間処理しマクロファージ様に分化させた。 PBSで洗浄後、 [¾]コレステ ロールでラベルされた iS VLDL (最終コレステロール濃度： 150 μ g/ml) を含む 無血清 RPMI- 1640培地を添加し、 24時間培養させ泡沫化細胞を作製した。 0. 2 % BSAを含む PBSで 2回洗浄、 さらに PBSで 1回洗浄した後に、 0、 10および 20 μ Mの D- PDMPをそれぞれ含む無血清 RPMI-1640培地を添加し、 24時間およぴ 48時間処理し た。 細胞上清を取り除き、 ヒトァポリポプ口ティン ΑΙ (ケミコン社） 含有 RPMI - 1640培地 （最終濃度： 25 μ g/ml) を添加してから 6時間後に、 細胞上淸に放出 された放射活性を液体シンチレーションカゥンターで測定した。 さらに、 細胞を PBSで 1回洗浄した後に、 0. 1% SDSを含む 0. 1 N NaOH水溶液で細胞を溶解し、 そ の一部を採取し放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
コレステロール搬出時活性は、 以下の式から算出した。 '
コレステロール搬出活性 （％)
= 細胞上清の放射活性/ (細胞上清の放射活性 +細胞ライセートの .
放射活性） X 100 結果を表 1に示す。 数値は平均土標準偏差で表記した。 〔表 1〕
コレステロール搬出活性 （％)
D-PDMP M) 24時間 48時間
0 1. 7士 0. 3 2. 1 ±0. 2
10 4. 4±0. 4 6. 0±0. 4
20 4. 3±0. 8 6. 8±0. 5 表 1に示したように、 D- PDMPは濃度依存的、 時間依存的にコレステロール搬出 活性を促進させた。 これより、 ダルコシルセラミド合成酵素活性およぴラクトシ ルセラミド合成酵素活性を阻害することは、 細胞内のコレステロール搬出活性を 促進し動脈硬化を退縮させることになる。 ( 2 ) THP-1細胞におけるスフインゴ糖脂質のコレステロール搬出活性に対する 上記 （1 ) と同様に細胞の調製を行った。 調製した泡沫化細胞を洗浄した後に、 10 β Μのダルコシルセラミ ド （マトレャ社） およびラクトシルセラミ ド
(CALBI0CHEM社） をそれぞれ含む無血清 RPMI- 1640培地を添加し 24時間処理した。 細胞上清を取り除き、 ヒ トァポリポプ口ティン ΑΙ (ケミコン社） 含有 RPMI- 1640 培地 （最終濃度： 25 μ g/ml) を添加してから 6時間後に、 上記 （1 ) と同様の 方法で、 コレステロール搬出活性を測定した。
結果を表 2および表 3に示す。 数値は平均士標準偏差で表記した。
〔表 2〕
ダルコシルセラミド （w M) コレステロール搬出活性 （％)
0 3. 6±0. 1
10 3. 2±0. 2
〔表 3〕
ラクトシルセラミ ド （j M) コレステロール搬出活性 (%)
0 4. 3±0. 2
10 2. 3±0. 2 表 2および表 3に示したように、 ダルコシルセラミ ドまたはラクトシルセラミ ドを培養系に外因性に添加することにより、 コレステロール搬出活性が抑制され た。 以上の結果は、 ダルコシルセラミドおよびラタトシルセラミドの細胞内蓄積 は、 動脈硬化形成促進的に作用することを示す。 これより、 細胞内糖スフインゴ 脂質を低下させるような化合物、 例えばダルコシルセラミド合成酵素活性または (および） ラクトシルセラミド合成酵素活性を阻害する化合物は、 動脈硬化発症 を抑制する薬剤となる妥当性が示された。 実施例 3
THP - 1細胞における D - PDMP (D- threo - 1 - phenyl - 2 - decanoylamino- 3- morpholino-1-propanol)の変性リポタンパク取り込み活性に対する影響
6ゥエル ローセルバインディングプレート （NUNC社） に 1ウエノレ当たり 1. 5 X 106個に懸濁した THP- 1細胞 （ATCCより購入） を、 ホルポール 12-ミリステート 13 -アセテート （PMA) (最終濃度： 100 nM) 添加の RPMI- 1640培地 （0. 4% FBS, 25 mM HEPES, ぺニシリン /ストレプトマイシンを含む） または PMA (最終濃度： 100 nM) および D - PDMP (最終濃度： 20 μ Μ) を添加した RPMI-1640培地 （0. 4% FBS, 25 raM HEPES, ペニシリン/ストレプトマイシンを含む） で 2日間処理した。 次に、 処理した細胞を無血清 RPMI- 1640培地で洗浄した後に、 Dil (1， - dioctadecyl-3, 3, 3'， 3' - tetramethylindocarbocyanine) 標識ァセチノレ LDL 7 ナコシ社、 最終濃度： 20 μ g/ml) を含む無血清 RPMI - 1640培地に懸濁し、. 37°Cで 90分間、 振とうさせながらィンキュベートした。 PBSで洗浄後、 セルフィックス バッファー （BD社） に懸濁し、 FACScan (BDバイオサイエンス社） にて Dil標識ァ セチル LDLの取り込みを解析した。 ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート 単独で処理した細胞の FACS解析で得られた中間値を 100%として各条件の相対値 を求めた。
結果を表 4に示す。 数値は平均土標準偏差で表記した。 〔表 4〕
ァセチル LDL取り込み活性 （％)
PMA添加 100 ± 18. 2
PMAおよび!)一 PDMP添力 α 28. 9± 6. 3 表 4より、 D - PDMPはァセチル LDLの取り込み活性を抑制することが明らかとな つた o
以上の結果から、 マクロファージ細胞においてダルコシルセラミ ド合成酵素活 性およぴラクトシルセラミ ド合成酵素活性を阻害することで細胞への変性リポタ ンパクの取り込みを抑制することが明らかとなった。 つまり、 ダルコシルセラミ ド合成酵素活性または （および） ラタトシルセラミド合成酵素活性を阻害する化 合物は、 動脈硬化病変に浸潤している単球またはマクロファージ細胞において変 性リポタンパクの取り込み抑制に基づく泡沫化阻害により、 抗動脈硬化的に作用 する薬剤になることを示す。 実施例 4
( 1 ) ダルコシルセラミ ド合成酵素発現べクタ一の構築
配列番号： 2で表される塩基配列を有する二本鎖 DNAを、 2種のプライマー （配 列番号： 9および配列番号： 1 0 ) を用いて PCR法により合成した。
ヒト型グルコシルセラミド合成酵素遺伝子は、 IMAGEクローン 5274768 (イン ビトロジヱン社） から取得した。 該反応における反応液の組成は 2 μ ΐの IMAGEク ローン 5274768のプラスミ ド DNA、 5 μ 1の lO XPfuバッファー （ストラタジーン 社） 、 l ju lの Hotstart Pfu (ストラタジーン社) 、 20 μ Mのプライマーを各 1 ju 1、 の 2. 5 mM dNTPおよび 36 μ 1の蒸留水を加え、 液量を 50 とした。 PCR反応 は、 95 °C · 2分の後、 95。C · 30秒、 60 V · 30秒、 72 °C · 2分のサイクルを 30回 繰り返した後、 72 °C · 10分の伸長反応を行った。 該反応終了後、 PCRピューリフ ィケーシヨンキット （キアゲン社） により精製した 500 ngの PCR産物を制限酵素 Notlおよび BamH! [により消化した後、 クリーンアップキット （キアゲン社） で精 製した。 同様に pcDNA3. 1 (-)ベクター （インビトロジェン社） を制限酵素 Notlお よび BamHIにより消化し、 クリーンアップキット （キアゲン社） により精製した。 100 ngの PCR産物と 50 ngの pcDNA3. 1 (- )ベクター断片および 5 ； u lの DNAライゲー ションキット Ver2ソリユーション Iを混合して 16 °Cで 30分間ライゲーション反応 を行った。 ライゲーシヨン反応後、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 得られた形質転 換株を培養後、 プラスミド DMを抽出し、 ビッグダイターミネータ一サイクルシ 一クェンシング ver3. 1を用いてシークェンス反応を行い、 3100 DNAシーケンサー により塩基配列を決定し、 配列番号： 2 (0RFを全て含有） で表される塩基配列 と一致するクローンを選択した。 ( 2 ) ダルコシルセラミ ド合成酵素阻害剤のスクリーニング
酵素源の調製は以下に示す方法で行つた。
HEK293細胞 （ATCCより購入； J Gen Virol. , 36卷， 59- 74頁， 1977年） を血清 含有 DMEM培地で培養し、 遺伝子導入の前日に lOcni コラーゲンコートプレート (イワキネ土） に 1. 2 X 106個を播種した。 血清不含 DMEM培地で洗浄後、 4 μ gの 上記 （ 1 ) で得られたヒト型ダルコシルセラミド合成酵素発現べクタ一、 30 μ ΐ の Lipophectamine (インビトロジェン社） 、 およぴ 20 ^ 1の PLUS試薬 （インビト ロジェン社） を、 1. 5 mlの OPTI MEM- 1培地 （インビトロジェン社） にカ卩え、 遣伝 子導入を行った。 37°C， 5%C02の条件で 48時間培養した後、 PBSで洗浄後、 1mlの M - PER (ピアス社） を用いて溶解後、 27, 000 x gで 10分間遠心し、 得られた可溶 性画分を酵素源として用いた。 酵素アツセィは、 反応溶液 50 μ 1中に、 lO gの粗 酵素溶液、 500 nmolのトリスバッファー （pH7. 5) 、 30nmol の C8セラミ ド （バイ ォモノレ社） および 375pmolの [14C] UDPglucose (アマシャム社、 7. 4GBq/mmol, 925Kbq/ml) を 32°Cで 2時間ィンキュベートさせた。 100 1のクロロホノレム · メタ ノール （2 : 1) を添加し反応を終了させ、 15000 rpmで 5分間遠心した後、 クロ口 ホルム層を採取し液体シンチレーシヨンカウンターで放射活性を測定した。 活性 値は以下に示す式から算出した。
ダルコシルセラミ ド合成酵素活性 （面 0l/mg'hr)
= 酵素反応物の放射活性 （cpm) / [14C] UDP -ダルコースの比放射活性
(cpm/nmol) X lZタンパク量 （mg) ·反応時間 （hr) 測定した結果を表 5に示す。 数値は平均土標準偏差で表記した。 〔表 5〕
ダルコシルセラミ ド合成酵素活' |·生 (nmol/mg/hr) 酵素無 0. 02 ± 0. 015
酵素有 1. 90士 0. 224 上記の方法を用いてダルコシルセラミド合成酵素活性を阻害することが知られ ている D-PDMPについて検討を行い、 IC5。値を SAS前臨床パッケージ ver. 5で算出し たところ、 1. 5 / Mであった。 この酵素アツセィ系を用いることによりダルコシル セラミド合成酵素のスクリーリニングを行う。
' 産業上の利用可能性
本発明で用いられるタンパク質は、 動脈硬化病巣で特異的に発現亢進している。 よって、 ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラクトシルセラミド合成 酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子 または （および） ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害する化合物ま たはその塩、 ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラタトシルセラミド 合成酵素の産生を阻害する化合物またはその塩などは、 例えば、 動脈硬化や動脈 硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈疾患 （例、 心 筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動脈瘤、 大動脈 解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬ィヒ症などに起因する腎不全な ど） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖尿病性合 併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メタポリッ ク症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、 高血圧などの複数 のリスクファクタ一を示す症候群） などの予防 ·治療剤として安全に使用するこ とができる。
さらに、 （a) (i) ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラタトシル セラミド合成酵素の活性を阻害および （ii) GM 3合成酵素の活性を阻害する化 合物またはその塩、 （b) (i) ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （およ ぴ） ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現を阻害および （ii) GM 3合成酵 素遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) (i) ダルコシルセラミド 合成酵素または （および） ラタトシルセラミド合成酵素の産生を阻害おょぴ (ii) GM 3合成酵素の産生を阻害する化合物またはその塩などは、 例えば、 動 脈硬化や動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など） ；冠動脈 疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 （例、 大動 脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症などに起因する 腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など） ；糖尿病や糖 尿病性合併症 （例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症など） ；メ タポリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症、'高血圧な どの複数のリスクファクターを示す症候群). などの予防 ·治療剤として安全に使 用することができる。
また、 ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラクトシルセラミ ド合成 酵素は、 動脈硬化や動脈硬化性疾患 （例、 脳動脈疾患 （例、 脳梗塞、 脳出血など ) ；冠動脈疾患 （例、 心筋梗塞、 狭心症などの虚血性心疾患など） ；大動脈疾患 (例、 大動脈瘤、 大動脈解離など） ；腎動脈疾患 （例、 腎硬化症、 腎硬化症など に起因する腎不全など） ；末梢動脈疾患 （例、 閉塞性動脈硬化症など） など). ； 糖尿病や糖尿病性合併症' (例、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性腎症 など） ；メタボリック症候群 （インスリン抵抗性を基礎とする高血糖、 高脂血症 、 高血圧などの複数のリスクファクターを示す症候群） などの予防'治療剤のス タリーエングに有用である。

Claims

請求の範囲
I . ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （および） ラクトシルセラミド 合成酵素阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防 ·治療用医薬。
2 . ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤または （および） ラクト シルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる動脈硬化の予防 ·治療 用医薬。
3 . ダルコシルセラミド合成酵素が、 配列番号.： 1で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ぺプチドまたはその塩である請求項 1または 2記載の医薬。
4 . ダルコシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質またはその塩である請求項 1または 2記載の医薬。
5 . ラタトシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ぺプチドまたはその塩である請求項 1または 2記載の医薬。
6 . ラクトシルセラミド合成酵素が、 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列か らなるタンパク質またはその塩である請求項 1または 2記載の医薬。
7 . さらに、 GM 3合成酵素阻害剤を含有してなる請求項 1記載の医薬。
8 . さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を含有してなる請求項 2記載 の医薬。
9 . GM 3合成酵素が、 配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩である請求項 7または 8記載の医薬。
1 0 . GM 3合成酵素が、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列からなるタ ンパク質またはその塩である請求項 7または 8記載の医薬。
I I . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相捕的な塩基 配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
1 2 . 配列番号： 1または （およぴ） 酉己列番号： 3で表されるァミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分 ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相 捕的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有 してなる医薬。
1 3 . 動脈硬化の予防 ·治療用医薬である請求項 1 2記載の医薬。
1 4 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列また はその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる請求項 1 3 記載の医薬。
1 5 . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R NA。
1 6 . 配列番号： 1または （および） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h RNAを 含有してなる医薬。
1 7 . 動脈硬化の予防 ·治療用医薬である請求項 1 6記載の医薬。
1 8 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s h R NAを含有してなる請求項 1 7記載の医薬。
1 9 . ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクトシル セラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の予防 ·治療用医薬。 2 0 . さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を含有してなる請求項 1 9記載の 医薬。
2 1 . ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクトシル セラミド合成酵素に対する抗体を含有してなる動脈硬化の診断薬。
2 2 . さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を含有してなる請求項 2 1記載の 診断薬。
2 3 . ダルコシルセラミド合成酵素に対する抗体または （および） ラクトシル セラミド合成酵素に対する抗体を用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法。 2 4 . さらに、 GM 3合成酵素に対する抗体を用いる請求項 2 3記載の診断方 法。
2 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ' ミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドまたは （およぴ） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドを含有してなる動脈硬化の診断薬。
2 6 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドを含有してなる請求項 2 5記載の診斬薬。
2 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ ードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の診断方法。
2 8 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドを用いる請求項 2 7記載の診断方法。
2 9 . 動脈硬化の診断薬の製造のための、 ダルコシルセラミド合成酵素に対す る抗体または （および） ラタトシルセラミド合成酵素に対する抗体の使用。
3 0 . 動脈硬化の診断薬の製造のための、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその 部分べプチドをコードするポリヌクレオチドまたは （および） 配列番号： 3で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパ ク質もしくはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの使用。
3 1 . 哺轧動物の血漿中のダルコシルセラミドまたは （および） ラタトシルセ ラミドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の診断方法。
3 2 . さらに、 GM 3の量を測定する請求項 3 1記載の診断方法。
3 3 . ダルコシルセラミドまたは （おょぴ） ラクトシルセラミドの動脈硬化の 診断マーカーとしての使用。
3 4 . さらに GM 3を用いる請求項 3 3記載の使用。
3 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩または (および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスクリ一ユング方法。
3 6 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩を用いる請求項 3 5記載のスクリーニング方法。
3 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩または (および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含 有することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット。 3 8 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩を含有する請求項 3 7記載のスクリーニング用キット。
3 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドまたは （およぴ） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療剤の スクリーニング方法。
4 0 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドを用いることを特徴とする動脈硬ィヒの予防 ·治療剤のスクリ 一二ング方法。
4 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする動脈硬化の予防 '治療剤 のスクリーニング用キット。
4 2 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドを含有する請求項 4 1記載のスクリーニング用キット。 4 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩または (および） 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性または量を測定することを特徴とする動脈硬ィ匕の予防 ·治療剤のスクリーニン グ方法。
4 4 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはそ の塩の活性または量を測定する請求項 4 3記載のスクリ一ユング方法。
4 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドをコードするポリヌク レオチドまたは （および） 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分べプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドの量を測定することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治 療剤のスクリーニング方法。 ·
4 6 . さらに、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードす るポリヌクレオチドの量を測定する請求項 4 5記載のスクリーニング方法。
4 7 . ダルコシルセラミド合成酵素または （および） ラクトシルセラミド合成 酵素の活性を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療方法。
4 8 . さらに、 GM 3合成酵素の活性を阻害する請求項 4 7記載の方法。
4 9 . ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラクトシルセラミ ド合成酵素遺伝子の発現を阻害することを特徴とする動脈硬化の予防 ·治療方法。
5 0 . さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現を阻害する請求項 4 9記載の方法。 5 1 . ダルコシルセラミド合成酵素阻害剤または （および） ラクトシルセラミ ド合成酵素阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする動脈硬化の予 防 ·治療方法。
5 2 . さらに、 GM 3合成酵素阻害剤の有効量を投与する請求項 5 1記載の方 法。
5 3 . ダルコシルセラミド合成酵素遺伝子または （および） ラクトシルセラミ ド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする 動脈硬化の予防 ·治療方法。
5 4 . さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤の有効量を投与する請求項 5 3記載の方法。
5 5 . 動脈硬化の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素阻 害剤または （および） ラタトシルセラミド合成酵素阻害剤の使用。
5 6 . さらに、 GM 3合成酵素阻害剤を用いる請求項 5 5記載の使用。
5 7 . 動脈硬化の予防 ·治療剤の製造のためのダルコシルセラミド合成酵素遺 伝子または （および） ラタトシルセラミド合成酵素遺伝子の発現阻害剤の使用。 5 8 . さらに、 GM 3合成酵素遺伝子の発現阻害剤を用いる請求項 5 7記載の
。
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