JPH10295371A - ラクトシルセラミド合成酵素及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ウリジンジホスフェート−ガラクトース
からガラクトースをグルコシルセラミドに転移させ、ラ
クトシルセラミドを合成する酵素、及びこれをコードす
る遺伝子。 【効果】 ラクトシルセラミドが大量に生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はスフィンゴ糖脂質の
生合成の出発物質の一つであるラクトシルセラミドの合
成酵素及びその遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】スフィンゴ糖脂質は細胞膜構成脂質のう
ち、種々の認識機構に関与するといわれており、その生
合成はセラミドにグルコシルセラミド合成酵素（グルコ
ース転移酵素）が作用してグルコシルセラミドが生成
し、次いでこれにラクトシルセラミド合成酵素（ガラク
トース転移酵素）が作用してラクトシルセラミドが生成
することから始まる。又、このグルコシルセラミド合成
酵素については、本出願人により既に部分精製されてい
る（特開平５−６４５８４号公報）。

【０００３】一方、ラクトシルセラミド合成に関与する
ラクトシルセラミド合成酵素はこれまでにその存在が指
摘されてきたものの、生体内では他のガラクトース転移
酵素がラクトシルセラミド合成に関与しているのか、又
はラクトシルセラミド合成に特異的なガラクトース転移
酵素が存在するのかは、蛋白、遺伝子レベルの解析がな
されていなかったために十分解明されていない。これは
糖蛋白やラクトサミンの合成に関与するガラクトース転
移酵素が弱いながらもラクトシルセラミド合成活性を持
つことが知られているためである。この酵素のラクトシ
ルセラミド合成活性は糖蛋白糖鎖やラクトサミン合成活
性に比べ非常に低い（Yamato K,YoshidaA; J.Biochem.
(Tokyo) Oct 1982, 92 (4) p1123-7）。従って、このガ
ラクトース転移酵素は、特異的なラクトシルセラミド合
成酵素とは言い難い。

【０００４】一方、チャタジーらはヒトの腎臓からラク
トシルセラミド合成酵素を精製したと報告した（Chatte
rjee S,Chosh N,Khurana S; J.Biol.Chem.Apr.5, 1992,
267(10) p7148-53）が、その構造や遺伝子のクローニ
ングは全く報告がなされていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、ラクト
シルセラミド合成酵素は様々な生理活性をもつスフィン
ゴ糖脂質の生合成の出発物質の一つであるラクトシルセ
ラミドを合成する重要な酵素であるが、これを大量に製
造する方法が確立されていない。従って、本発明の目的
は、グルコシルセラミドに特異的に作用してラクトシル
セラミドを合成する高活性のラクトシルセラミド合成酵
素、これをコードする遺伝子、及び該ラクトシルセラミ
ド合成酵素の新規製造法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、酵素
調製材料にラット脳組織を採用し、この膜画分からグル
コシルセラミドに対する基質特異性の高いガラクトース
転移酵素を単離すべく種々検討し、後記酵素学的性質を
有するラクトシルセラミド合成酵素を得た。また、ラッ
トから該酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功
し、更にマウス及びヒトからも該酵素に近似する酵素を
コードする遺伝子のクローニングに成功した。更に該遺
伝子を用いた組換えＤＮＡ技術によるラクトシルセラミ
ド合成酵素の製造法の確立にも成功し、本発明を完成す
るに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、下記の酵素学的性質
を有するラクトシルセラミド合成酵素（以下、本酵素Ａ
と称することがある）を提供するものである。

【０００８】（１）作用 ウリジンジホスフェート−ガラクトースからガラクトー
スをグルコシルセラミドに転移させ、ラクトシルセラミ
ドを合成する。 （２）基質特異性 グルコシルセラミドに強く作用し、グロボシドに弱く作
用し、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ
２にほとんど作用しない。 （３）金属要求性 マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。 （４）至適pH pH６．４〜７．４付近 （５）分子量 ５４，０００〜６８，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る）

【０００９】また、本発明は、配列番号１、３若しくは
５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若
しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加して
なるアミノ酸配列を有するラクトシルセラミド合成酵素
を提供するものである。

【００１０】また、本発明は、配列番号１、３若しくは
５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若
しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加して
なるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするラクト
シルセラミド合成酵素遺伝子を提供するものである。

【００１１】また、本発明は、配列番号２、４若しくは
６で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは２
以上の塩基が欠失、置換若しくは付加してなる塩基配列
を有するラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を提供する
ものである。

【００１２】また、本発明は上記ラクトシルセラミド合
成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡを提供するもので
ある。

【００１３】また、本発明は、上記ラクトシルセラミド
合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換
された細胞を提供するものである。

【００１４】更に、本発明は上記ラクトシルセラミド合
成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換さ
れた細胞を培養し、該培養物からラクトシルセラミド合
成酵素を採取することを特徴とするラクトシルセラミド
合成酵素の製造法を提供するものである。

【００１５】前記のラクトシルセラミド合成酵素のう
ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素はラット由
来（本酵素Ａ）であり、配列番号３のアミノ酸配列を有
する酵素はマウス由来（本酵素Ｂ）であり、配列番号５
のアミノ酸配列を有する酵素はヒト由来（本酵素Ｃ）で
ある。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素は、例えばラット、マウス、ヒトの脳に代
表される動物細胞の膜画分から得られる。具体的には、
ラット、マウス、ヒト等の脳膜画分より、界面活性剤で
可溶化後、各種アフィニティクロマトグラフィー、ゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー等により精製でき
る。

【００１７】本酵素Ａの精製を例示してより詳細に説明
する。すなわち、ラット脳をホモジナイズし、細胞分画
を行い、サスペンジョン用バッファーに懸濁して脳膜画
分を得る。この脳膜画分にトライトンＸ−１００に代表
される界面活性剤を加えて酵素を可溶化する。次いで可
溶化酵素画分をレクチン−アガロース、及びウリジンジ
ホスフェート−ヘキサノールアミンアガロースを用いた
アフィニティクロマトグラフィーに付し、更にヒドロキ
シアパタイト、ミニＱなどのイオン交換クロマトグラフ
ィーに付すことにより精製される。

【００１８】このようにして得られた本酵素Ａの酵素学
的性質を以下に示す。 （１）作用 ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）−ガラクトースから
ガラクトースをグルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）
に転移させ、ラクトシルセラミドを合成する。

【００１９】（２）基質特異性 グルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）に強く作用し、
グロボシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−
Ｃｅｒ）に弱く作用し、セラミド（Ｃｅｒ）、ラクトシ
ルセラミド（Ｌａｃ−Ｃｅｒ）、ＧＡ２（ＧａｌＮＡｃ
−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）及びＧＭ２（ＧａｌＮＡｃ
−Ｇａｌ（ＮｅｕＡｃ）−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）にほとんど
作用しない。具体的には、Ｇｌｃ−Ｃｅｒに対する活性
を１００％としたとき、グロボシドに対して１２％、セ
ラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ２に対し
て１％未満である。

【００２０】（３）金属要求性 マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。具体
的には、マンガン＞マグネシウム＞カルシウム＞カドミ
ウム＞鉄の順に２価金属イオンを要求する（図１）。

【００２１】（４）至適pH pH６．４〜７．４付近 具体的には、カコジル酸バッファーではpH６．４〜７．
４の範囲で活性を示し、pH７．２で最も高い活性を示
す。またＭＥＳバッファーではpH６．２〜７．０で活性
はほとんど変化しないが、カコジル酸バッファーに比べ
活性は低い。（図２）。

【００２２】（５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、５４，０００〜６
８，０００である。また、グリカナーゼ処理で分子量が
約５０，０００に低下するので、本酵素Ａの本質は糖蛋
白質であり、糖鎖部分が約１０，０００又はそれ以上あ
ると考えられる。上記分子量の範囲は糖鎖の付き方に由
来する。

【００２３】（６）部分アミノ酸配列 本酵素Ａをリジンペプチダーゼで消化後、逆相カラムで
ペプチド断片を分離し、その断片のうち、４断片につ
き、アミノ酸配列を決定した。その結果、少なくとも下
記の４つのペプチド断片を有していることが判明した。

【００２４】（１）Lys-X-Phe-Phe-Gly-Gly-Val-X-Gly-
Leu-Thr-Val-Glu-Gln-Phe-X-Lys （２）Lys-Glu-Arg-Gln-Phe-Ile-Asp-Gly-Leu-Asn-Asn-
Leu-Leu-Tyr-Thr-Pro-Lys （３）Lys-Tyr-Thr-Ser-Ile-Pro-X-X-X-X-Gly-Glu-Val-
Gln-Phe-Leu-Gly-Arg-Tyr-Lys （４）Lys-Tyr-Met-Tyr-Ile-Leu-Pro-Tyr-Lys

【００２５】本発明におけるラクトシルセラミド合成酵
素の活性測定はガラクトースの供与体であるＵＤＰ−ガ
ラクトースの放射ラベルガラクトースが受容体であるグ
ルコシルセラミドに転移されて生成するラクトシルセラ
ミドの放射活性を測定することにより行うことができ
る。具体的には、ＭｎＣｌ₂ を１μモル、ＣＤＰ−コリ
ンを０．７５μモル、カコジル酸ナトリウムを５μモ
ル、界面活性剤 トライトンＸ−１００を０．４mg、Ｄ
ＯＰＣ（ジオレオイルフォスファチジルコリン）を１５
０μｇ、ＵＤＰ−〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕ガラクトースを２．１ｎ
モル（２３ｋＢｑ）含む最終反応液１００μｌ中に酵素
として１２０μｇ以下の蛋白を加え、３７℃、３０分反
応させ、反応生成物をブライ−ダイヤーの方法（Bligh,
E.G. & Dyer, W.J. Can. J. Biochem.Physiol. 1959,
37, p911）で抽出し、その放射活性を測定することによ
り酵素活性を測定する。

【００２６】次に本発明酵素をコードするｃＤＮＡのク
ローニングについて説明する。まず、ｃＤＮＡライブラ
リーは、ファージ、プラスミド、コスミドのいずれをベ
クターとするものでもよく、本酵素Ａの場合には市販の
ラット脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用いるのが好ま
しい。

【００２７】本酵素ＡをコードするｃＤＮＡのプローブ
としては、前記のペプチド断片をコードするＤＮＡ断片
を合成し、これを直接用いてもよいが、該ＤＮＡ断片は
短いので、一度ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
し、前記のペプチド断片をコードするＤＮＡ断片をプラ
イマーとしてＰＣＲを行い、プローブとして有用なＤＮ
Ａ断片を得るのが好ましい。

【００２８】かくして得られたＤＮＡ断片をプローブと
し、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを用いたクローニン
グは、常法に従って行えばよいが、例えば、サウスウエ
スタン法、ノースウエスタン法、ウエストウエスタン
法、リガンドクローニング法、発現クローニング法、ポ
ジショナルクローニング法等も挙げられる。このうち、
大腸菌を宿主とするｃＤＮＡライブラリーを用い、プロ
ーブをビオチン標識しておき、プローブと結合したｃＤ
ＮＡをストレプトアビジンで選択した後、コロニーの選
択は前記のプライマーを用いたＰＣＲにより行うのが好
ましい。

【００２９】得られた本酵素ＡをコードするｃＤＮＡの
塩基配列は、配列番号２に示す通りであり、当該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列は配列番号１に示す通り
である。

【００３０】本酵素ＢについてはｃＤＮＡライブラリー
としてマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用い、本
酵素ＣについてはｃＤＮＡライブラリーとしてヒト脳由
来のｃＤＮＡライブラリーを用い、前記本酵素Ａの場合
と同様にしてクローニングを行えばよい。その結果、本
酵素Ｂ（マウス由来）をコードするｃＤＮＡの塩基配列
は配列番号４に示す通りであり、当該塩基配列から推定
されるアミノ酸配列は配列番号３に示す通りである。ま
た、本酵素Ｃ（ヒト由来）をコードするｃＤＮＡの塩基
配列は配列番号６に示す通りであり、当該塩基配列から
推定されるアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであ
る。

【００３１】これらの本発明酵素をコードするｃＤＮＡ
を用いて、本発明酵素を得るには、通常の遺伝子組換え
技術に従えばよい。すなわち、これらの遺伝子を適当な
ベクターに組み込んで組換えＤＮＡを作製し、該組換え
ＤＮＡを用いて作製した形質転換体を培養して、該培養
物から採取するのが好ましい。この組換えＤＮＡとして
は、形質転換に用いられる宿主中での発現に適した発現
用ベクターに本発明ＤＮＡを挿入して得られる発現ベク
ターが好ましい。宿主としては、原核生物、例えば大腸
菌、枯草菌などの細菌、真核性微生物、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ等の酵母、昆虫を含む高等真核生物
の培養細胞、例えばＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞等を使用す
ることができるが、このうち昆虫細胞が特に好ましい。
発現用ベクターとしては、前記の宿主細胞中で複製でき
且つ目的のポリペプチドを発現できる任意のベクター、
例えばプラスミド、バクミド等を使用できる。

【００３２】このような発現用ベクターとしては、ｐＦ
ａｓｔＢａｃ系、ｐＭＡＭ系、ｐＢａｃＰＡＫ系、ｐＣ
Ｒ３系、ｐＢｌｕｅＢａｃ系、ｐＧＥＸ系などが挙げら
れる。ＤＮＡの発現用ベクターへの挿入は、常法、例え
ばＴ₄ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応
等によって行われる。

【００３３】ｐＦａｓｔＢａｃ系ベクターとして、ｐＦ
ａｓｔＢａｃＨＴを用いた場合について説明する。この
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴは、プラスミドであり、トランス
ポゾンｍｉｎｉ ＴＮＴ配列を含み、かつその両腕にゲ
ンタマイシン耐性マーカー、バキュロウイルスプロモー
ター及び目的遺伝子挿入部位を含む。ギブコビーアール
エル社から入手可能である。

【００３４】ｐＦａｓｔＢａｃＨＴへのラクトシルセラ
ミド合成酵素遺伝子の挿入は、例えばラクトシルセラミ
ド合成酵素遺伝子のＥｃｏＲＩ断片をｐＦａｓｔＢａｃ
ＨＴのＥｃｏＲＩ切断部位に挿入するのが好ましい。

【００３５】かくして得られたｐＦａｓｔＢａｃＨＴ組
換えプラスミドを挿入するためのバクミドＤＮＡとして
は、ヘルパープラスミドとバキュロウイルスとのシャト
ルベクターとなるものであれば特に制限されないが、例
えば大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに含まれているバクミドＤＮ
Ａが好ましい。このバクミドには、コピー数を抑えるｍ
ｉｎｉ Ｆレプリコン、カナマイシン耐性マーカー及び
ｐＵＣ由来のｌａｃＺα遺伝子が含まれている。またこ
のｌａｃＺα中には、リーディングフレームを損なわな
いようにｍｉｎ−ａｔｔＴＮ７が挿入されている。

【００３６】バクミドＤＮＡの組換えは、ＤＨ１０Ｂａ
ｃのコンピテントセル中に前記ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ組
換えプラスミドを導入すればよい。形質転換体の選択
は、ｌａｃＺの欠失及びゲンタマイシン耐性獲得を指標
にすればよい。

【００３７】得られたクローンからバクミドＤＮＡを抽
出すれば本発明の組換えバクミドが得られる。なお、ラ
クトシルセラミド合成酵素遺伝子のバクミドＤＮＡへの
挿入の有無はＰＣＲにより確認できる。

【００３８】本発明組換えバクミドを導入するための宿
主細胞としては、バキュロウイルスが感染する細胞であ
れば特に制限されないが、通常昆虫細胞が用いられる。
昆虫細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ５等が挙
げられるが、通常Ｓｆ９が用いられる。導入手段として
はセルフェクチンを用いたリポソーム法が好ましい。感
染培養細胞からバキュロウイルスを得、このウイルスを
宿主細胞に再度感染させれば、ラクトシルセラミド合成
酵素を発現する形質転換昆虫細胞が得られる。

【００３９】得られた形質転換細胞を培養し、該培養物
からラクトシルセラミド合成酵素を採取すれば、ラクト
シルセラミド合成酵素が大量に生産できる。形質転換細
胞の培養は、用いた宿主細胞が増殖する条件であれば特
に制限されない。また該培養物からのラクトシルセラミ
ド合成酵素の採取は、例えば硫安分画、塩析、各種クロ
マトグラフィー等を適宜組合わせて行うことができる。

【００４０】なお、本発明においては遺伝子は、示した
塩基配列からなる遺伝子だけでなく、該塩基配列の１若
しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基
配列を有する遺伝子であっても、同様の機能を有する限
り含まれる。また酵素は、示したアミノ酸配列からなる
酵素だけでなく、該アミノ酸配列の１若しくは２以上の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を
有する酵素も同様の性質を有する限り含まれる。

【００４１】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるもの
ではない。

【００４２】実施例１ ラクトシルセラミド合成酵素の製造法 （１）ラットの脳膜画分の調製方法：全ての操作は０〜
４℃で行った。２〜３週齢のウイスター系ラット（雄雌
混合）を頸椎脱臼により屠殺した後、脳を摘出した。摘
出した脳は使用まで−８０℃で保存した。ラット脳膜画
分の採取に当たり脳をはさみで細断し９倍容のホモジナ
イズ用バッファー（０．３２Ｍの蔗糖、０．２５mMのＤ
ＴＴ、１mMのＥＤＴＡ）を加えホモジナイズした。ホモ
ジネートを８００×ｇで遠心分離した上清を更に１０，
０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈澱をサスペ
ンジョン用バッファー（０．２５Ｍの蔗糖、１mMのＤＴ
Ｔ、０．０２％のアジ化ナトリウム、プロテアーゼイン
ヒビター（ＰＭＳＦ）を含む５０mMトリス−塩酸バッフ
ァー、pH７．４）に懸濁してラット脳膜画分とした。実
験に使用するまで−１４５℃にて保存した。

【００４３】（２）酵素の可溶化：懸濁した脳膜画分に
蛋白の最終濃度が４mg／ml、トライトンＸ−１００が１
％になるようにトライトンＸ−１００を加え、０℃で２
時間放置した後１００，０００×ｇで遠心分離し、得ら
れた上清を可溶化画分とした。

【００４４】（３）ＷＧＡ（小麦胚芽レクチン）−アガ
ロースによるアフィニティクロマトグラフィー：５００
mMの塩化ナトリウム、１％のトライトンＸ−１００、１
mMのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μ
Ｍのペファブロック（プロテアーゼインヒビター）を含
む１０mMトリス−塩酸バッファーpH７．４で平衡化され
た小麦胚芽レクチン−アガロースのカラム（１５０ml）
に約１５０個のラット脳から調製した可溶化画分をアプ
ライした後、カラム容量の約１０倍量の同バッファーで
カラムを洗浄し、２００mMのＧｌｃＮＡｃを含む同バッ
ファーで酵素を溶出した（図３）。

【００４５】（４）ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロ
ースによるアフィニティクロマトグラフィー：ＷＧＡ−
アガロースから特異的に溶出された酵素サンプルにＭｎ
Ｃｌ₂を加えて１０mMとし、５００mMの塩化ナトリウ
ム、１０mMのＭｎＣｌ₂、１％のトライトンＸ−１０
０、１mMのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１
００μＭのペファブロックを含む１０mMトリス−塩酸バ
ッファーpH７．４で平衡化したＵＤＰ−ヘキサノールア
ミンアガロースのカラム（４０ml）にアプライした。非
吸着画分を洗浄後１mMのＵＤＰを含む同バッファーで酵
素を溶出した（図４）。

【００４６】（５）ヒドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィー：（４）のサンプルのバッファーをリン酸
バッファーに交換するためにＵＤＰ−ヘキサノールアミ
ンアガロースのカラムから溶出されたサンプルを１％の
トライトンＸ−１００、１mMのＤＴＴ、０．０２％のア
ジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１
０mMリン酸ナトリウムpH６．８で平衡化したＰＤ−１０
カラムにアプライし同バッファーで溶出し、蛋白画分を
得た。これを同バッファーで平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラム（０．５ml）にアプライし、酵素活性を
有する非吸着画分を次のステップに用いた。

【００４７】（６）ミニＱによるイオン交換クロマトグ
ラフィー：（５）のサンプルを１％のトライトンＸ−１
００、１mMのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、
１００μＭのペファブロックを含む１０mMリン酸ナトリ
ウムpH６．８で平衡化したミニＱカラム（ファルマシア
社製）にアプライし０から２Ｍの塩化ナトリウムの直線
濃度勾配法で酵素を溶出し、酵素活性を有する画分を回
収した（図５）。

【００４８】上記各精製ステップにおける酵素回収率を
表１に示す。また、得られた酵素の性質は、前記の通り
であった。

【００４９】

【表１】

【００５０】ミニＱカラムで得られた各フラクションの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図６に示す。

【００５１】実施例２ ラットラクトシルセラミド合成酵素の部分アミノ酸配列
の解析酵素標品をクロロホルム／メタノール濃縮後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行っ
た。染色された部分を切り取り、リジンペプチダーゼに
て一夜消化後、消化液を逆相カラムＲＰ−１８にアプラ
イし、ペプチドを分離した。液体クロマトグラフィーに
より分取したペプチド断片のうち、４つのペプチドにつ
きアミノ酸配列をアプライドバイオシステムズ社製のプ
ロテインシーケンサーを用いて解析し、表２の結果を得
た。

【００５２】

【表２】

【００５３】上記４つのうち、逆相カラムで得られたペ
プチド（１）と（２）については糖蛋白質糖転移酵素
（β1 −４ＧａｌＴ、ＥＣ２．４．１．３８）とそれぞ
れ４７．５％、４７％の相同性がありこれらの配列はそ
の間に約８０個のアミノ酸をはさんでペプチド（１）が
Ｎ末側にあると推測された。しかし、ペプチド（３）と
（４）については上記糖転移酵素と３０％程度の相同性
のある場所がＮ末側からＣ末側まで点在しているため、
場所の特定はできなかった。

【００５４】実施例３ ラットラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニ
ング：ｃＤＮＡライブラリーはラット脳より得られたマ
ラソンレディー（Marathon-Ready^TM）ｃＤＮＡｓをクロ
ーンテック社より購入した。上記アミノ酸配列のうちペ
プチド（１）と（２）からβ１−４ＧａｌＴと相同性が
低く、アミノ酸に対するコドンの縮重度の低い部分を選
択し、縮重（degenerated)プライマーを作成し、ラット
脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲはベーリンガーマンハイム社のエキスパンド^TMハ
イファイＰＣＲシステムを用いた。これにより増幅され
たＤＮＡ断片のうち、nested ＰＣＲでも主に増幅した
約３００bpのものについてプラスミドベクターにクロー
ニング（インビトローゲン社のオリジナルＴＡクローニ
ングキットを使用、ベクターはｐＣＲ２．１、大腸菌は
ＩＮＶαＦ’、少量のプラスミドの抽出はストラテジー
ン社のクリアーカットミニプレップキットを使用）し、
シークエンスを行った。シークエンスはアマシャム社の
サーモシーケンス蛍光シークエンサー用サイクルシーク
エンシングキットでサンプルをラベルし、ファルマシア
社のＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＴＭ ＤＮＡシーケンサーを
用いて行った。その結果、プライマーに用いた配列をは
さんで約２００bpの塩基配列を得ることができた。この
塩基配列から推定されるアミノ酸配列はペプチド（１）
と（２）を含み、更にペプチド（３）を含むことが判明
した。ペプチド（３）についてはその質量分析の結果か
ら、ＸＸＸＸの配列がHis-His-His-Arg であることが推
測されていたが、決定された塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列に、まさにHis-His-His-Arg の配列が含まれ
ていた。次いで、上記３’側のdegenerated primerを用
いて５’ＲＡＣＥを行ったところ、新たに、６０bpの塩
基配列が判明した。その塩基配列から推定されるアミノ
酸配列の中に、部分アミノ酸配列解析から判明したペプ
チド（４）が存在した。これですべての部分アミノ酸配
列の位置関係を特定することができた。

【００５５】これまでに判明した塩基配列をもとにオリ
ゴＤＮＡプローブを作成し、ギブコ−ビーアールエル
（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）社のジーントラッパーｃＤＮＡ
ポジティブセレクションシステムを用いてラットラクラ
トシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニングを行っ
た。プローブのオリゴＤＮＡをビオチン標識し、ジーン
II、エクソヌクレアーゼIII により１本鎖にしたｃＤＮ
Ａライブラリーとハイブリダイズした。ｃＤＮＡライブ
ラリーはギブコ−ビーアールエル社のスーパースクリプ
トｃＤＮＡライブラリー（ベクターｐＣＭＶ・ＳＰＯＲ
Ｔ２、大腸菌ＤＨ１２Ｓ）を用いた。ｃＤＮＡライブラ
リーからプラスミドの精製はクイアゲン（ＱＵＩＡＧＥ
Ｎ）社のプラスミドミディキット（Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）
を用いて行った。プローブと結合したｃＤＮＡをストレ
プトアビジンで選択し、得られたｃＤＮＡを２本鎖に修
復後、大腸菌（ＤＨ１０Ｓ）にトランスフェクトした。
大腸菌にラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡが含まれ
るかはＰＣＲにより確認した。その結果、２７４コロニ
ー中７８コロニーにおいて、ラクトシルセラミド合成酵
素特異的プライマーでＤＮＡ断片の増幅が見られた。そ
のコロニーの大腸菌を培養し、ストラテジーン社のクリ
アーカットミニプレップキットによりプラスミドを抽出
し、ＮｏｔＩ、Ｓａｌによる制限酵素処理（ダブルダイ
ジェスチョン）を行った。制限酵素切断パターンより得
られたクローンは、８種類のインサートを持つと推定さ
れた（インサート長０．８、１．４、１．５、１．８、
３．０、３．３、４．７、５．３Kbp)。これら８種類の
クローンの一部の塩基配列を決定したところ、何れもす
でに決定したラットラクトシルセラミド合成酵素の塩基
配列を含んでいた。判明した塩基配列を配列番号２に、
その推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００５６】実施例４ ヒト、マウスのラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡの
クローニング：用いたヒト、マウスｃＤＮＡライブラリ
ーは何れも脳から得られたマラソン−レディーｃＤＮＡ
（Marathon-Ready^TMｃＤＮＡｓ）をクローンテック社よ
り購入した。ラットに用いたのと同じプライマーを用い
てマウスとヒトのラクトシルセラミド合成酵素のｃＤＮ
Ａの一部をＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲは
ベーリンガーマンハイム社のエキスパンド^TMハイファイ
ＰＣＲシステムを用いた。その結果、マウスとヒト共に
ラットと同じく２０３bpの配列を得ることができた。塩
基配列の相同性はラットとマウスで９０．６％、ラット
とヒトで８７．７％であり、塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列では、ラットとマウスで９７％、ラットとヒ
トで９７％であり、非常に相同性が高かった。

【００５７】マウスとヒトのラクトシルセラミド合成酵
素のｃＤＮＡの一部の塩基配列をもとにオリゴＤＮＡプ
ローブを作成し、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ
セレクションシステムを用いてマウスラクトシルセラミ
ド合成酵素ｃＤＮＡのクローニングを行った（方法はラ
ットの場合と同様）。プローブのオリゴＤＮＡをビオチ
ン標識し、ジーンII、エクソヌクレアーゼIII により１
本鎖にしたｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズし
た。プローブと結合したｃＤＮＡをストレプトアビジン
で選択し、得られたｃＤＮＡを２本鎖に修復後、大腸菌
にトランスフェクトした。この大腸菌のコロニー中にラ
クトシルセラミド合成酵素が含まれるか、ＰＣＲで確認
した。その結果、９６コロニーに中９コロニーにおい
て、ラクトシルセラミド合成酵素特異的プライマーでＤ
ＮＡ断片の増幅が見られた。制限酵素切断パターンよ
り、得られたクローンは、４種類のインサートを持つと
推定された（インサート長０．９、２．４、３．２、
４．５kbp)。これら４種類のクローンの一部の塩基配列
を決定したところ、すべてすでに決定したマウスラクト
シルセラミド合成酵素の塩基配列を含むことが判明し
た。更にマウスラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の塩
基配列の解析を続けたところ配列番号４の塩基配列を有
することが判明した。配列番号３にその推定アミノ酸配
列を示す。一方、ヒトラクトシルセラミド合成酵素遺伝
子の塩基配列は配列番号６であることが判明した。配列
番号５にその推定アミノ酸配列を示す。

【００５８】実施例５ （１）発現用組換えバクミドの作製 配列番号６の塩基配列のうち、配列番号５に相当する部
分を含むＤＮＡ断片を両端のプライマーを用いたＰＣＲ
により増幅させた。得られた増幅ＤＮＡをＴＡクローニ
ングキット（インビトロゲン社）を用いてｐＣＲ２．１
ベクター中へクローニングした。

【００５９】（２）ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂへの挿入 得られた遺伝子をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＦａｓｔＢａ
ｃＨＴｂもまたＥｃｏＲＩで切断し、ホスファターゼ処
理後、ライゲーション反応を行った。遺伝子を挿入した
プラスミドは大腸菌中に形質転換した後、個々のクロー
ンにつていプラスミドを抽出し、挿入方向を確認した。
挿入されたプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂＧＣＳ
とする。

【００６０】（３）バクミドＤＮＡへの挿入 ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂＧＣＳは、大腸菌ＤＨ１０Ｂａ
ｃ（ギブコＢＲＬ社）へ形質転換されると、大腸菌中に
含まれるバクミドＤＮＡに挿入される。これにより得ら
れた形質転換体をαコンプリメンテーションアッセイに
より選択した。すなわち、基質としてハロゲン化インド
リル−β−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ、ギブコビ
ーアールエル社）を使用し、寒天培地にはＬＵＲＩＡ
ＡＧＡＲ（ギブコビーアールエル社）を使用した。この
寒天培地には５０μｇ／mlカナマイシン、７μｇ／mlゲ
ンタマイシン、１０μｇ／mlテトラサイクリン、１００
μｇ／mlＢｌｕｏ−Ｇａｌ、４０μｇ／mlイソプロピル
チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して使
用した。この培地に形質転換体を植菌後３７℃で２４時
間培養し、更に４℃で２日間培養した後カラーセレクシ
ョン、すなわち、出現したブルー及びホワイトコロニー
のうち、ホワイトコロニーを採取した。

【００６１】（４）組換えバクミドの採取 得られたコロニーを、５０μｇ／mlカナマイシン、７μ
ｇ／mlゲンタマイシン、１０μｇ／mlテトラサイクリン
を含む２×ＹＴ１４培地を用いて培養を行った。１．５
mlの培地から集菌を行い、３００μｌ ＳｏｌＩ（１５
mM トリス−ＨＣｌ（pH８．０）、１０mM ＥＤＴＡ、
１００μｇ／ml ＲＮａｓｅＡ）に菌体を懸濁した後、
３００μｌ／Ｓｏｌ II（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％Ｓ
ＤＳ）を加え穏やかに攪拌し５分間室温で静置した。更
に、３００μｌのＳｏｌ III（３Ｍ酢酸カルシウム）を
ゆっくり加え、穏やかに攪拌した後、氷上に１０分静置
した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の上清にイソプ
ロパノール８００μｌを加え穏やかに攪拌、−２０℃で
一晩放置した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の沈殿
物を、冷７０％エタノールでよくリンスして自然乾燥
後、穏やかに１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ
（ＴＥ）中に溶解した。

【００６２】（５）昆虫細胞の形質転換 振盪培養のＳｆ９細胞（対数増殖期のもの）９×１０⁵
（５０ｕｎｉｔ／mlペニシリン、５０μｇ／mlストレプ
トマイシンを含む２mlのＳＦ９００ II ＳＦＭ培地中）
を３５mmウエル上にまいた。１時間以上２７℃で静置
し、細胞が付着することを確認した。（４）により得た
バクミドＤＮＡ５μｌを抗生物質を含まないＳＦ９００
IIＳＦＭ培地１００μｌ中に希釈し、これをＡ液とし
た。６μｌのセルフェクチン試薬を同様に抗生物質を含
まないＳＦ９００ II ＳＦＭ培地１００μｌ中に希釈し
これをＢ液とした。２つの溶液Ａ、Ｂを穏やかに混合
し、室温で３０分放置した。この混合液全量を、８００
μｌのＳＦ９００ II ＳＦＭ培地を含むチューブ中に添
加し、Ｃ液とした。抗生物質を含まないＳＦ９００ II
ＳＦＭ培地約２mlで２回細胞を洗浄した後、Ｃ液をウエ
ル中に加え、２７℃で５時間放置した後、抗生物質を含
むＳＦ９００ II ＳＦＭ培地２mlに置換した。ＤＮＡを
接種して７２時間後、培養上清を回収しこれをウイルス
液とした。２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／mlの振盪培養細胞に
１／１００量の上記ウイルス液を加え、３日間培養した
上清を標準ウイルス液とした。以下の実験ではこの標準
ウイルス液のタイターを２×１０⁷ＰＦＵと仮定して使
用量などを計算し、順次Ｓｆ９細胞を感染させ、ラクト
シルセラミド合成酵素を発現させた。

【００６３】（６）昆虫細胞の培養法及びホモジェネー
トの作成 Ｓｆ９細胞は、１００ｕｎｉｔ／mlペニシリン、１００
μｇ／mlストレプトマイシンの抗生物質を含むＳＦ９０
０ II ＳＦＭ培地に馴化し、主に振盪培養で培養した。
振盪培養は２７℃、振盪速度１３０rpmで、２×１０⁵〜
４×１０⁷cells／mlの範囲内で行った。培養した細胞
は、２，０００rpm 、１０分間遠心して収穫し、約１０
倍量のホモジェネートバッファー（１mM ＥＤＴＡ、
０．２５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１mMフェニ
ルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含む５０mM
トリス−ＨＣｌ pH７．４）に懸濁し、更に１０mlのガ
ラスホモジェナイザーを使用して１，０００rpm 、１０
ストロークのホモジェナイズを行った。これを電気泳動
や活性測定のサンプルとした。

【００６４】（７）ヒトラクトシルセラミド合成酵素の
発現 （５）で得られた形質転換細胞をＳＦ９００II ＳＦＭ
培地で培養した後、細胞をホモジェネートした。この酵
素画分０．５〜１mg／ml、グルコシルセラミド２００μ
ｇ／ml、トリトンＸ１００ ０．６％（ｗ／ｖ）、カコ
ジル酸２００mM、ＭｎＣｌ₂ １mM、ＣＤＰコリン７５m
M、及びＵＤＰ−〔¹⁴Ｃ〕−Ｇａｌ １１．５μＭ（３
０２Ｃｉ／mol）を含む反応液１００μｌを作成し、３
７℃、１時間反応させた。メタノールを添加して反応を
停止させ、Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法にて脂質を抽出
した。この脂質画分１／５量をＨＰＴＬＣで展開（ＣＨ
Ｃｌ₃：ＭｅＯＨ：Ｈ₂Ｏ＝６５：２５：４）し、ＢＡＳ
２０００（富士写真フィルム）で画像化し、アイソトー
プ量を定量した。その結果、本形質転換細胞は、２２．
０pmol／mg／minのラクトシルセラミド合成酵素活性を
発現した。この比活性はラット脳膜画分の３８倍以上で
あった。

【００６５】実施例６ ラット、マウスについてもｐＦａｓｔＢａｃＩを用いて
同様に遺伝子を発現させた結果、それぞれ１７３pmol／
mg／min、１３pmol／mg／minのラクトシルセラミド合成
酵素活性を発現した。

【００６６】

【発明の効果】本発明によればスフィンゴ糖脂質の原料
であるラクトシルセラミドが大量に生産できる。

【００６７】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Ala Leu Lys Arg Met Met Arg Val Ser Asn Arg Ser Leu Ile 5 10 15 Ala Phe Ile Phe Phe Phe Ser Leu Ser Thr Ser Cys Leu Tyr Phe Ile 20 25 30 Tyr Val Ala Pro Gly Ile Ala Asn Thr Tyr Leu Phe Met Val Gln Ala 35 40 45 Arg Gly Ile Met Leu Arg Glu Asn Val Lys Thr Ile Gly His Met Ile 50 55 60 Arg Leu Tyr Thr Asn Lys Asn Thr Thr Leu Asn Gly Thr Asp Tyr Pro 65 70 75 80 Glu Gly Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Leu Val Gln Thr Thr Thr Tyr Leu 85 90 95 Pro Gln Asn Phe Thr Tyr Ser Pro His Leu Pro Cys Pro Glu Lys Leu 100 105 110 Pro Tyr Met Arg Gly Phe Leu Ser Val Asn Val Ser Glu Ile Ser Phe 115 120 125 Asp Glu Val His Gln Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile Glu Pro Gly 130 135 140 Gly His Trp Arg Pro Gln Asp Cys Lys Pro Arg Trp Lys Val Ala Val 145 150 155 160 Leu Ile Pro Phe Arg Asn Arg His Glu His Leu Pro Ile Phe Phe Leu 165 170 175 His Leu Ile Pro Met Leu Gln Lys Gln Arg Leu Glu Phe Ala Phe Tyr 180 185 190 Val Ile Glu Gln Thr Gly Thr Gln Pro Phe Asn Arg Ala Met Leu Phe 195 200 205 Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Met Lys Asp Arg Ala Trp Asp Cys Val 210 215 220 Ile Phe His Asp Val Asp His Leu Pro Glu Asn Asp Arg Asn Tyr Tyr 225 230 235 240 Gly Cys Gly Glu Met Pro Arg His Phe Ala Ala Lys Leu Asp Lys Tyr 245 250 255 Met Tyr Ile Leu Pro Tyr Lys Glu Phe Phe Gly Gly Val Ser Gly Leu 260 265 270 Thr Val Glu Gln Phe Arg Lys Ile Asn Gly Phe Pro Asn Ala Phe Trp 275 280 285 Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Leu Trp Asn Arg Val His Tyr Ser 290 295 300 Gly Tyr Asn Val Thr Arg Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Tyr Thr Ser 305 310 315 320 Ile Pro His His His Arg Gly Glu Val Gln Phe Leu Gly Arg Tyr Lys 325 330 335 Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Glu Arg Gln Phe Ile Asp Gly Leu Asn Asn 340 345 350 Leu Leu Tyr Thr Pro Lys Ile Leu Val Asp Arg Leu Tyr Thr Asn Ile 355 360 365 Ser Val Asn Leu Met Pro Glu Leu Ala Pro Val Glu Asp Tyr 370 375 380

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：１１４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Rattus（ラット） 系統名：Sprague-Dowley 配列 ATGTCTGCGC TCAAGCGGAT GATGCGGGTC TCCAATCGCT CCCTGATCGC CTTCATCTTC 60 TTCTTCTCCC TCTCCACGTC CTGTCTCTAT TTCATCTATG TGGCTCCAGG CATCGCCAAC 120 ACATACCTCT TTATGGTACA AGCTAGAGGC ATCATGCTGA GAGAAAATGT GAAAACAATT 180 GGACACATGA TCAGGCTGTA TACCAATAAA AACACTACGC TCAATGGGAC AGATTATCCC 240 GAAGGCAATA ATACAAGTGA CTATCTTGTT CAAACAACAA CGTATCTTCC GCAGAACTTC 300 ACGTATTCAC CGCACCTCCC CTGTCCAGAG AAGCTGCCTT ATATGCGGGG ATTCCTCAGT 360 GTCAACGTGA GTGAAATCAG CTTTGATGAA GTCCATCAGC TCTTCTCCAA GGACTCGGAG 420 ATTGAGCCGG GAGGCCACTG GAGGCCCCAG GACTGCAAGC CTAGATGGAA GGTGGCAGTT 480 CTCATCCCCT TCCGTAACCG CCATGAACAC CTCCCGATCT TTTTCCTGCA CCTGATCCCG 540 ATGCTCCAGA AACAGAGGCT GGAATTTGCC TTTTATGTCA TCGAACAGAC CGGCACACAA 600 CCGTTCAATC GTGCCATGCT CTTTAACGTG GGTTTCAAAG AGGCCATGAA GGACAGAGCC 660 TGGGACTGTG TGATCTTCCA CGACGTGGAT CATCTTCCTG AGAACGATCG GAACTATTAC 720 GGATGCGGGG AGATGCCGCG GCACTTTGCA GCGAAGCTGG ACAAGTACAT GTACATTCTT 780 CCTTATAAGG AGTTCTTTGG TGGGGTGAGT GGCCTGACAG TGGAGCAATT TAGGAAGATC 840 AATGGCTTTC CCAATGCCTT CTGGGGATGG GGAGGAGAGG ATGACGACCT TTGGAACAGA 900 GTTCACTACT CTGGATACAA TGTAACCCGG CCAGAGGGGG ACTTGGGAAA ATATACATCT 960 ATTCCCCATC ACCATCGAGG GGAAGTACAA TTTTTAGGAC GGTATAAATT ACTTCGCTAT 1020 TCTAAGGAGC GTCAGTTCAT TGATGGATTG AACAATTTAT TATACACACC CAAAATACTG 1080 GTTGACAGGC TGTATACAAA TATATCTGTA AACCTCATGC CGGAGTTAGC TCCAGTTGAA 1140 GACTAT 1146

【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：３８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Ala Leu Lys Arg Met Met Arg Val Ser Asn Arg Ser Leu Ile 5 10 15 Ala Phe Ile Phe Phe Phe Ser Leu Ser Thr Ser Cys Leu Tyr Phe Ile 20 25 30 Tyr Val Ala Pro Gly Ile Ala Asn Thr Tyr Leu Phe Met Val Gln Ala 35 40 45 Arg Gly Ile Met Leu Arg Glu Asn Val Lys Thr Ile Gly His Met Ile 50 55 60 Arg Leu Tyr Thr Asn Lys Asn Thr Thr Leu Asn Gly Thr Asp Tyr Pro 65 70 75 80 Glu Gly Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Leu Val Gln Thr Thr Thr Tyr Leu 85 90 95 Pro Gln Asn Phe Thr Tyr Leu Pro His Leu Pro Cys Pro Glu Lys Leu 100 105 110 Pro Tyr Met Arg Gly Phe Leu Ser Val Asn Val Ser Glu Ile Ser Phe 115 120 125 Asp Glu Val His Gln Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile Gly Pro Gly 130 135 140 Gly His Trp Arg Pro Lys Asp Cys Lys Pro Arg Trp Lys Val Ala Val 145 150 155 160 Leu Ile Pro Phe Arg Asn Arg His Glu His Leu Pro Ile Phe Phe Leu 165 170 175 His Leu Ile Pro Met Leu Gln Lys Gln Arg Leu Glu Phe Ala Phe Tyr 180 185 190 Val Ile Glu Gln Thr Gly Thr Gln Pro Phe Asn Arg Ala Met Leu Phe 195 200 205 Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Met Lys Asp Arg Ala Trp Asp Cys Val 210 215 220 Ile Phe His Asp Val Asp His Leu Pro Glu Asn Asp Arg Asn Tyr Tyr 225 230 235 240 Gly Cys Gly Glu Met Pro Arg His Phe Ala Ala Lys Leu Asp Lys Tyr 245 250 255 Met Tyr Ile Leu Pro Tyr Lys Glu Phe Phe Gly Gly Val Ser Gly Leu 260 265 270 Thr Val Glu Gln Phe Arg Lys Ile Asn Gly Phe Pro Asn Ala Phe Trp 275 280 285 Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Leu Trp Asn Arg Val His Tyr Ala 290 295 300 Gly Tyr Asn Val Thr Arg Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Tyr Ile Ser 305 310 315 320 Ile Pro His His His Arg Gly Glu Val Gln Phe Leu Gly Arg Tyr Lys 325 330 335 Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Glu Arg Gln Tyr Ile Asp Gly Leu Asn Asn 340 345 350 Leu Leu Tyr Thr Pro Lys Ile Leu Val Asp Arg Leu Tyr Thr Asn Ile 355 360 365 Ser Val Asn Leu Met Pro Glu Leu Ala Pro Ile Glu Asp Tyr 370 375 380

【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：１１４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Mus （マウス） 系統名：C57BL/6J 配列 ATGTCTGCGC TCAAGCGGAT GATGCGGGTC TCCAATCGCT CTCTGATTGC CTTCATCTTC 60 TTCTTCTCCC TCTCCACGTC CTGTCTCTAC TTCATCTATG TGGCTCCAGG CATCGCCAAC 120 ACGTACCTCT TTATGGTACA AGCTAGAGGT ATCATGCTGA GAGAGAATGT GAAAACAATT 180 GGACACATGA TCAGGCTGTA TACCAATAAA AACACTACGC TCAACGGAAC AGATTATCCT 240 GAAGGCAATA ATACAAGTGA CTATCTTGTT CAAACAACAA CGTATCTTCC GCAAAACTTC 300 ACGTATTTGC CACACCTCCC CTGTCCAGAG AAGCTGCCTT ACATGCGGGG ATTCCTCAGT 360 GTCAATGTGA GTGAGATCAG TTTTGATGAA GTCCATCAGC TCTTCTCCAA GGACTCAGAG 420 ATTGGGCCAG GAGGCCACTG GAGGCCCAAA GACTGCAAGC CCAGATGGAA GGTGGCAGTT 480 CTCATCCCCT TCCGTAACCG CCATGAACAT CTTCCGATTT TTTTCCTGCA CCTGATTCCG 540 ATGCTCCAGA AACAGCGGCT GGAATTTGCC TTTTATGTCA TCGAACAGAC CGGCACACAA 600 CCATTCAATC GTGCGATGCT CTTTAATGTG GGTTTCAAAG AGGCCATGAA AGACAGAGCC 660 TGGGACTGTG TGATCTTCCA TGATGTGGAT CATCTGCCTG AAAATGATCG GAACTACTAC 720 GGATGTGGAG AGATGCCGCG GCACTTTGCA GCGAAGCTGG ACAAGTACAT GTACATTCTT 780 CCCTATAAGG AGTTTTTTGG TGGGGTGAGT GGCCTGACGG TGGAGCAATT CAGGAAGATC 840 AACGGCTTTC CCAATGCCTT CTGGGGATGG GGAGGCGAGG ACGATGACCT TTGGAACAGA 900 GTTCACTACG CCGGCTACAA TGTAACCCGG CCAGAAGGGG ACTTGGGAAA ATACATATCT 960 ATTCCTCATC ACCATCGAGG GGAGGTACAG TTCCTAGGAC GGTATAAATT ACTTCGGTAT 1020 TCCAAGGAGC GGCAGTACAT CGATGGACTG AACAATTTAT TATACACACC CAAAATACTG 1080 GTTGATAGGC TGTATACAAA TATATCTGTA AACCTCATGC CAGAATTAGC TCCAATTGAA 1140 GACTAT 1146

【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：３８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Val Leu Arg Arg Met Met Arg Val Ser Asn Arg Ser Leu Leu 5 10 15 Ala Phe Ile Phe Phe Phe Ser Leu Ser Ser Ser Cys Leu Tyr Phe Ile 20 25 30 Tyr Val Ala Pro Gly Ile Ala Asn Thr Tyr Leu Phe Met Val Gln Ala 35 40 45 Arg Gly Ile Met Leu Arg Glu Asn Val Lys Thr Ile Gly His Met Ile 50 55 60 Arg Leu Tyr Thr Asn Lys Asn Ser Thr Leu Asn Gly Thr Asp Tyr Pro 65 70 75 80 Glu Gly Asn Asn Ser Ser Asp Tyr Leu Val Gln Thr Thr Thr Tyr Leu 85 90 95 Pro Glu Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Tyr Leu Pro Cys Pro Glu Lys Leu 100 105 110 Pro Tyr Met Arg Gly Phe Leu Asn Val Asn Val Ser Glu Val Ser Phe 115 120 125 Asp Glu Ile His Gln Leu Phe Ser Lys Asp Leu Asp Ile Glu Pro Gly 130 135 140 Gly His Trp Arg Pro Lys Asp Cys Lys Pro Arg Trp Lys Val Ala Val 145 150 155 160 Leu Ile Pro Phe Arg Asn Arg His Glu His Leu Pro Ile Phe Phe Leu 165 170 175 His Leu Ile Pro Met Leu Gln Lys Gln Arg Leu Glu Phe Ala Phe Tyr 180 185 190 Val Ile Glu Gln Thr Gly Thr Gln Pro Phe Asn Arg Ala Met Leu Phe 195 200 205 Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Met Lys Asp Ser Val Trp Asp Cys Val 210 215 220 Ile Phe His Asp Val Asp His Leu Pro Glu Asn Asp Arg Asn Tyr Tyr 225 230 235 240 Gly Cys Gly Glu Met Pro Arg His Phe Ala Ala Lys Leu Asp Lys Tyr 245 250 255 Met Tyr Ile Leu Pro Tyr Lys Glu Phe Phe Gly Gly Val Ser Gly Leu 260 265 270 Thr Val Glu Gln Phe Arg Lys Ile Asn Gly Phe Pro Asn Ala Phe Trp 275 280 285 Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Leu Trp Asn Arg Val His Tyr Ala 290 295 300 Gly Tyr Asn Val Thr Arg Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Ser 305 310 315 320 Ile Pro His His His Arg Gly Glu Val Gln Phe Leu Gly Arg Tyr Lys 325 330 335 Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Glu Arg Gln Tyr Ile Asp Gly Leu Asn Asn 340 345 350 Leu Ile Tyr Arg Pro Lys Ile Leu Val Asp Arg Leu Tyr Thr Asn Ile 355 360 365 Ser Val Asn Leu Met Pro Glu Leu Ala Pro Ile Glu Asp Tyr 370 375 380

【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：１１４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Homo sapiens sapiens（ヒト） 配列 ATGTCTGTGC TCAGGCGGAT GATGCGGGTT TCCAATCGCT CTCTCCTCGC CTTCATCTTC 60 TTCTTCTCCC TCTCTTCGTC CTGTCTGTAC TTCATCTATG TGGCCCCAGG CATCGCCAAC 120 ACATATCTCT TTATGGTACA AGCTCGAGGT ATAATGTTGA GAGAAAATGT GAAAACAATA 180 GGTCATATGA TCAGGCTGTA CACAAATAAA AACAGTACGC TCAACGGTAC AGATTATCCC 240 GAAGGCAATA ATTCAAGTGA TTATCTTGTT CAAACAACAA CGTATCTCCC GGAAAACTTC 300 ACATACTCAC CATACCTCCC CTGTCCAGAA AAGCTGCCTT ATATGCGAGG ATTCCTCAAT 360 GTCAATGTAA GCGAAGTCAG TTTTGATGAA ATTCATCAAC TCTTCTCCAA GGATTTAGAT 420 ATTGAGCCAG GGGGTCATTG GAGGCCAAAA GACTGTAAAC CCAGATGGAA GGTGGCAGTT 480 CTCATTCCTT TCCGTAATCG CCATGAACAT CTTCCAATTT TTTTCTTACA TCTGATTCCA 540 ATGCTCCAGA AGCAGCGGCT GGAATTTGCG TTTTATGTCA TTGAACAGAC TGGCACACAA 600 CCTTTTAACC GTGCGATGCT TTTCAATGTG GGCTTCAAAG AGGCCATGAA AGACAGTGTC 660 TGGGACTGTG TAATCTTCCA CGATGTGGAT CATCTACCTG AAAATGACCG GAACTATTAC 720 GGATGTGGAG AAATGCCACG TCATTTTGCT GCAAAGCTGG ATAAATACAT GTATATTCTT 780 CCATATAAAG AATTTTTTGG TGGTGTAAGT GGGCTGACAG TGGAACAATT TAGAAAGATC 840 AATGGTTTTC CTAATGCCTT CTGGGGATGG GGAGGAGAAG ATGATGACCT TTGGAACAGA 900 GTTCACTATG CTGGATATAA TGTAACCAGA CCAGAGGGAG ACTTAGGAAA ATACAAGTCA 960 ATTCCTCATC ACCATAGAGG TGAAGTCCAG TTTTTAGGAC GGTATAAATT ACTAAGGTAT 1020 TCCAAGGAGC GTCAGTACAT CGATGGACTG AACAATTTAA TATATAGGCC AAAAATACTG 1080 GTTGATAGGT TGTATACAAA CATATCTGTA AACCTCATGC CAGAGTTAGC TCCAATCGAA 1140 GACTAT 1146

【図面の簡単な説明】

【図１】 本酵素Ａの金属イオン要求性を示す図であ
る。

【図２】 本酵素Ａの至適pHを示す図である。

【図３】 本酵素ＡのＷＧＡ−アガロースカラムクロマ
トグラフィーの結果を示す図である。

【図４】 本酵素ＡのＵＤＰ−アガロースカラムクロマ
トグラフィーの結果を示す図である。

【図５】 本酵素ＡのミニＱカラムクロマトグラフィー
の結果を示す図である。

【図６】 ミニＱカラムクロマトグラフィーの主要フラ
クションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 脇坂 悦司 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 松尾 登 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 服部 道廣 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 井上 圭三 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学薬 学部内 (72)発明者 新井 洋由 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学薬 学部内 (72)発明者 瀧尾 擴士 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 堂前 直 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するラクトシル
   セラミド合成酵素。 （１）作用 ウリジンジホスフェート−ガラクトースからガラクトー
   スをグルコシルセラミドに転移させ、ラクトシルセラミ
   ドを合成する。 （２）基質特異性 グルコシルセラミドに強く作用し、グロボシドに弱く作
   用し、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ
   ２にほとんど作用しない。 （３）金属要求性 マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。 （４）至適pH pH６．４〜７．４付近 （５）分子量 ５４，０００〜６８，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
   る）
2. 【請求項２】 配列番号１、3 若しくは5 で示されるア
   ミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上の
   アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
   を有するラクトシルセラミド合成酵素。
3. 【請求項３】 配列番号１、３若しくは５で示されるア
   ミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上の
   アミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配
   列を有するペプチドをコードするラクトシルセラミド合
   成酵素遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号２、４若しくは６で示される塩
   基配列、又は該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠
   失、置換若しくは付加された塩基配列を有するラクトシ
   ルセラミド合成酵素遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項３又は４記載のラクトシルセラミ
   ド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３又は４記載のラクトシルセラミ
   ド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転
   換された細胞。
7. 【請求項７】 請求項３又は４記載のラクトシルセラミ
   ド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転
   換された細胞を培養し、該培養物からラクトシルセラミ
   ド合成酵素を採取することを特徴とするラクトシルセラ
   ミド合成酵素の製造法。