JP2004357635A - 糖転移酵素及びそれをコードする核酸 - Google Patents
糖転移酵素及びそれをコードする核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004357635A JP2004357635A JP2003162685A JP2003162685A JP2004357635A JP 2004357635 A JP2004357635 A JP 2004357635A JP 2003162685 A JP2003162685 A JP 2003162685A JP 2003162685 A JP2003162685 A JP 2003162685A JP 2004357635 A JP2004357635 A JP 2004357635A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- present
- nucleic acid
- polypeptide
- enzyme
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸を提供する。
【解決手段】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含む糖転移酵素、該酵素をコードする核酸。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（Ｂ）前記特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質に、N-アセチル-D-ガラクトサミン供与体基質からN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
【選択図】 なし
【解決手段】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含む糖転移酵素、該酵素をコードする核酸。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（Ｂ）前記特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つN-アセチル-D-ガラクトサミン受容体基質に、N-アセチル-D-ガラクトサミン供与体基質からN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「糖転移酵素」、より詳細にはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有する酵素及びそれをコードする「核酸」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中、糖及び糖残基は特に明記しない限り、光学異性体は全てＤ体を示す。またＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを「ＧａｌＮＡｃ」と、デオキシリボ核酸を「ＤＮＡ」と、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを「ＦＡＭ」と略記することもある。
【０００３】
近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
【０００４】
糖の中でＧａｌＮＡｃはグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、ムチン型糖鎖の様な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、ＧａｌＮＡｃを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
【０００５】
ＧａｌＮＡｃ受容体基質にＧａｌＮＡｃを転移する働きを有する酵素としては、これまでに数種類の酵素が知られており、これらは非特許文献１〜１４に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（４１）， ２４１５６−２４１６５（１９９５）
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， ８（６）， ５４７−５５５（１９９８）
【非特許文献３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（２９）， １６００６−１７０１２（１９９６）
【非特許文献４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １７３（４６）， ３０４７２−３０４８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３（４２）， ２７７４９−２７７５４（１９９８）
【非特許文献６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４（３６）， ２５３６２−２５３７０（１９９９）
【非特許文献７】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４６０（２）， ２２５−２３０（１９９９）
【非特許文献８】Ｇｅｎｅ．， ２４６（１−２）， ３４７−３５６（２０００）
【非特許文献９】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ａｃｔａ．，１４９３（１−２）， ２６４−２６８（２０００）
【非特許文献１０】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５３１（２）， １１５−１２１（２００２）
【非特許文献１１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（２５）， ２２６２３−２２６３８（２００２）
【非特許文献１２】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５２４（１−３）， ２１１−２１８（２００２）
【非特許文献１３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８（１）， ５７３−５８４（２００３）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３００， ７３８−７４４（２００３）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
糖鎖の生体内での働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。そのために従来から存在する酵素の機能を解析することはもちろんであるが、更に新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することに対する要請が高まっている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、機能タンパク質をコードする新規な核酸を見い出し、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを見い出した。
【０００９】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（２） 以下の（Ａ’）又は（Ｂ’）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（３） 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸。
（４） （１）又は（２）記載のポリペプチドをコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（５） 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（６） 配列番号１記載の塩基番号１〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（７） （３）〜（６）いずれか記載の核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
（８） ＤＮＡであることを特徴とする（３）〜（７）いずれか記載の核酸。
（９） （３）〜（８）いずれか記載の核酸を含むベクター。
（１０） （１）又は（２）記載の糖転移酵素のポリペプチドを発現する様に構築されている発現ベクターであることを特徴とする（９）記載のベクター。
（１１） （９）又は（１０）記載のベクターを含む組換体。
（１２） （１１）記載の組換体を生育させ、その生育物から糖転移酵素を単離することを特徴とする糖転移酵素の製造方法。
（１３） （１）又は（２）記載の糖転移酵素を特異的に認識する抗体。
（１４） （１）又は（２）記載の糖転移酵素の活性調節剤。
（１５） （１４）記載の活性調節剤を有効成分として含む、（１）又は（２）記載の糖転移酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明酵素
本発明酵素はＧａｌＮＡｃ受容体基質に、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ基を転移する活性を有する糖転移酵素である。
【００１１】
ここで「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」とは、ＧａｌＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。
【００１２】
「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」は本発明酵素がＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移することができる化合物である限り特に限定はされないが、配列番号７〜１４いずれか記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００１３】
これらの「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」の何れかの化合物へ「ＧａｌＮＡｃ残基」を転移する活性の確認は、例えば［１４Ｃ］又は［３Ｈ］などの放射性同位元素でＧａｌＮＡｃ残基を放射能標識した「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」と、上記例示の「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」とを混合し、そこに「本発明酵素」の存在下で酵素反応させ、「反応生成物」を「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」と分離して「反応生成物の放射能」を測定する方法で行うことができる。このような方法としては具体的には後述の実施例３記載の方法が例示される。
【００１４】
このような「本発明酵素」は、より具体的には例えば以下の（Ａ）又は（Ａ’）のポリペプチドを含む。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、それらに糖鎖が結合した糖ポリペプチドの形態の糖転移酵素も本発明酵素の一態様として挙げられる。
【００１５】
なお、一般にアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が存在していても、酵素の活性が維持されることは当業者にとっては理解されうるところであり、上記配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列に於いても１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が存在していても「糖転移酵素活性」を有する限りにおいて上記「ポリペプチド」として使用することができる。
【００１６】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、上記「ポリペプチド」に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するポリペプチド」を作成することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドがＩＬ−２の活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４（１９８４）， ｐ．１４３１）。またある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、二次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、「本発明酵素のポリペプチド」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するポリペプチド」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００１７】
なお、ここで「複数」とは、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ受容体基質にＧａｌＮＡｃ残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて「複数」とは特に限定はされないが、全アミノ酸数の１０％以下、好ましくは５％以下程度のアミノ酸数を示す。例えば５５９個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ）記載のポリペプチド）に於いては５５個以下、好ましくは２７個以下を示し、また６０１個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’）記載のポリペプチド）に於いては６０個以下、好ましくは３０個以下を示す。
【００１８】
また、本発明酵素の活性測定系を利用することで、本発明酵素の活性を促進したり阻害したりする働きを有する物質をスクリーニングして得ることが可能となる。かかる物質は、本発明酵素の活性調節剤の有効成分として利用することが可能である。更にこのような活性調節剤は本発明酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤として利用することが可能である。
【００１９】
（２）本発明核酸
「本発明核酸」は配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸である。
【００２０】
「本発明核酸」としては、例えば配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）、配列番号１記載の塩基番号１〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸２）又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。
【００２１】
上記「本発明核酸１」は、「本発明酵素のポリペプチド」のうち、「膜貫通領域（疎水性アミノ酸が１０〜２０個程度連続した領域）を欠失した態様のポリペプチド」をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドを「可溶性ポリペプチド」とすることができる。また「本発明核酸２」は、「本発明酵素のポリペプチド」の全配列をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドは生体内に存在する「本発明酵素のポリペプチド」と同一と考えられ、またこのようなポリペプチドを「本発明酵素の抗体」の調製等のために使用することも可能である。
【００２２】
特に「本発明核酸１」や「本発明核酸２」等は、タンパク質合成における終始コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ）記載のポリペプチド）や「アミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’）記載のポリペプチド）を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
【００２３】
特に配列番号１記載の塩基配列のうち、「塩基番号１２７〜１８０６からなる核酸（特にＤＮＡ）又はそれに相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）」は、例えば「本発明核酸」の生体内での発現状況などを検査するための核酸プローブとして使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬としての可能性を有する。
【００２４】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃の条件が例示される。
【００２５】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７８１４５）をクエリーとしてマウス遺伝子データベースで塩基配列を検索を行ない、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿５９８９５０を相同配列として得ることができる。この配列をもとにヒト遺伝子データベースを検索し、第四染色体のＮＴ００６１９８、ＮＴ００６２５７のゲノム配列中に予測される翻訳領域（以下「ＯＲＦ」とも記載する）を見い出すことができる。次に、予測情報に基づいて作成したプライマー（例えば５’プライマーとして配列番号３、３’プライマーとして配列番号４のプライマーが例示される）を用いポリメラーゼ チェイン リアクション法（以下「ＰＣＲ法」とも記載する）を行うことで翻訳領域を増幅し、かかる増幅産物から配列番号１に記載された全ＯＲＦ領域であり、可溶化形態のポリペプチドをコードする「本発明核酸」を得ることができる。
【００２６】
「可溶化形態のポリペプチドのアミノ酸配列」としては例えば「配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列」が挙げられ、このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリペプチドをコードする核酸としては、「配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸」が例示される。このような核酸の調製は、例えば配列番号３記載の配列を５’プライマー、配列番号４記載の配列を３’プライマーとして使用し、例えばヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーを鋳型として常法に従ってＰＣＲ法を行うことで調製することができる。
【００２７】
この場合、ＰＣＲ産物として約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００２８】
このようにして単離した「本発明核酸」は、それがコードする「本発明酵素」を発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、「本発明核酸」の両端に制限末端を常法より連結し、発現ベクターに挿入することができる（このようにして得られた発現ベクターを「本発明発現ベクター」と記載する）。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明酵素を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記「本発明核酸」が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに「本発明核酸」が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００２９】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる（このような組換体を「本発明組換体」とも記載する）。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞、植物細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００３０】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、「本発明発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００３１】
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。本発明発現ベクターはそのような「本発明酵素」の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に「本発明酵素」を「酵素活性を有するポリペプチド（例えば上述の（Ａ）又は（Ａ’）記載のポリペプチド）」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明発現ベクター」を用いて遺伝子工学的に「本発明酵素」を調製すると単離・精製が容易となるため好ましい。
【００３２】
上記「識別ペプチド」の例としては、「本発明酵素」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「識別ペプチド」と「酵素活性を有するポリペプチド」とが結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明酵素」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６〜１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明酵素の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明酵素」を得るのが、取扱面が極めて優れるため好ましい。
【００３３】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明酵素」を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（シグマ社）、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照）等が例示されるが、当業者であれば「本発明酵素」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００３４】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（実施例１）ほ乳類細胞を用いた本発明ＤＮＡ及び本発明酵素の調製方法
公知のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素遺伝子（ＧＡＬＮＴ１０）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７８１４５）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、上記塩基配列のオーソログとその下流に既存のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素で共通に一部配列が保存されている遺伝子を発見し（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００６１９８）、かかる遺伝子のエキソンを解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００６１９８とＮＴ＿００６２５７に合計１２のエキソンからなる遺伝子（配列番号１）が存在することが明かとなった。このエキソンからなる塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測され、この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製することとした。
【００３６】
培養細胞Ｌｕ−１６０（小細胞肺癌株）から調製したヒトゲノムｃＤＮＡを鋳型とし、５’プライマーとして配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、３’プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用してＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法はＤＮＡポリメラーゼとして宝酒造株式会社のＰｒｅｍｉｘ Ｅｘｔａｑを使用し、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル繰り返す条件で行なった。そしてＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行い、約１．８ｋｂのバンドをゲル切り出し法で切り出して常法により単離した。このようにして得られたＰＣＲ産物を、説明書の記載に従ってインビトロゲン社製のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入した（このベクターを「ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ／Ｏ２１」と記載する）。常法に従って塩基配列の確認を行ったところ１８０６ｂｐのＯＲＦ配列であることが明かとなった。
【００３７】
（１）発現ベクターの調製
ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに組み込んだ遺伝子がコードするタンパク質をＮ末端の４２アミノ酸残基を欠失した形態で発現させる本発明核酸を調製するために、配列番号５の５’プライマー及び配列番号６の３’プライマーを使用してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ／Ｏ２１を鋳型としてＰＣＲ法を行った。上記５’プライマーを用いて調製した増幅産物は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限末端が存在し、３’末端にはｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターの配列一部とＸｂａＩ制限末端が存在する構造を有する。
【００３８】
ＰＣＲ法は、９８℃１０秒、５３．２℃３０秒、７２℃２分を１０回繰り返した後、９８℃１０秒、５８℃３０秒、７２℃２分を１０回繰り返した。得られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製した。このように処理した増幅産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、説明書の記載に添って発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３に導入した（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３／Ｏ２１）。
【００３９】
（２）組換体の調製及び本発明酵素の精製
常法に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３／Ｏ２１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）に導入した。導入後、細胞を常法に従って培養し、４８時間経過した後に３００×ｇで１０分間遠心して培養液を回収し、適当量の抗ＦＬＡＧ Ｍ１樹脂（シグマ社製）と混合した。４℃で３時間以上混和させた後、３００×１０分間遠心し、樹脂に吸着した本発明酵素を回収した。樹脂を回収し、１ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４：５０ｍｍｏｌ／ｌ：樹脂の５〜１０倍量）で２回洗浄し、これを酵素液１とした。
【００４０】
（実施例２）昆虫細胞を用いた本発明ＤＮＡ及び本発明酵素の調製方法
インビトロジェン社製のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は宝酒造株式会社のＰｙｒｏｂｅｓｔを用いて９８℃１０秒、５３℃３０秒、７２℃２分を１０サイクル繰り返した後、９８℃１０秒、５８℃３０秒、７２℃２分を１０サイクル繰り返して行なった。添付された説明書に従ってＢＰクロナーゼ反応を行ってｐＤＯＮＯＲ２０１ベクターに増幅産物（エントリークローン）を組み込んだ。
【００４１】
このエントリークローンは、挿入部位の両端にラムダファージが大腸菌から切り出される際に組換部位として働くａｔｔＬを有するため、添付書に従ってＬＲクロナーゼ反応を行いエントリークローンの挿入配列をディスティネーションベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ由来の発現ベクターｐＦＢＩＦ−Ｃ）に移し、発現クローンを調製した。
続いてインビトロジェン社製のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて、上記発現ベクターとｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なプラスミド（バクミド）にクローンを挿入した。
【００４２】
常法に従って、目的配列がバクミドに挿入されていることを確認した後、昆虫由来の培養細胞Ｓｆ２１にバクミドを導入した。
すなわち３５ｍｍシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５個／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ培地）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着させた。精製したバクミドのＤＮＡ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えてＳｏｌｕｔｉｏｎＡを調製し、ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ溶液（インビトロジェン社製）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを添加してＳｏｌｕｔｉｏｎＢを調製した。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＢを丁寧に混合し、１５〜４５分間程度室温でインキュベートとし、これに更に抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ ８００μｌを添加して丁寧に混和した（この溶液をＳｏｌｕｔｉｏｎ混合液とも記載する）。
【００４３】
細胞が接着したことを確認し、培養液を吸引し、希釈したＳｏｌｕｔｉｏｎ混合液１ｍｌをシャーレに加え、２７℃で５時間インキュベートした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩを２ｍｌ添加して２７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後にピペッティングを行って細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した（これを「一次ウイルス液」とした）。
【００４４】
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加え、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液８００μｌを添加して、２７℃で４８時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（これを「二次ウイルス液」とした）。
【００４５】
更に、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加え、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液１ｍｌを添加して、２７℃で９６時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（これを「三次ウイルス液」とした）。
更に、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６×１０６個／ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を１００ｍｌ加え、三次ウイルス液１ｍｌを添加して、２７℃で９６時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を本発明酵素の酵素源とした。
【００４６】
常法により上記酵素源をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、ゲルを使用してウエスタンブロッティング法を行った。検出用の抗体としては抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２：シグマ社製）を使用した。その結果、分子量約７０ｋＤａのタンパク質の発現を確認し、目的タンパク質の発現がなされていることが示唆された。
【００４７】
上記酵素源を適当量の抗ＦＬＡＧ Ｍ１樹脂（シグマ社製）と混合し、４℃で３時間以上混和させた後、３００×１０分間遠心し、樹脂に吸着した本発明酵素を回収した。樹脂を回収し、１ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４：５０ｍｍｏｌ／ｌ：樹脂の５〜１０倍量）で２回洗浄し、これを酵素液２とした。
【００４８】
（実施例３）本発明酵素の酵素活性
本発明酵素のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素としての活性を測るために、供与体基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用い、受容体基質としてＣ末端あるいはＮ末端をＦＡＭで標識した配列番号９〜１６の合成ペプチド（配列番号９及び１１記載の合成ペプチドはＮ末端にＦＡＭが結合しており、他はＣ末端にＦＡＭが結合している：以下、配列番号９の受容体基質をＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ、配列番号１０の受容体基質をＭｕｃ２−ＦＡＭ、配列番号１１の受容体基質をＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ、配列番号１２の受容体基質をＭｕｃ７−ＦＡＭ、配列番号１３の受容体基質をＭｕｃ１３−５８−ＦＡＭ、配列番号１４の受容体基質をＥＡ２−ＦＡＭ、配列番号１５の受容体基質をＨＰＲ−Ｆ−ＦＡＭ、配列番号１６の受容体基質をＳＤＣ１０６−ＦＡＭと記載する）、ＧａｌＮＡｃを１つ付加した配列番号９、１０、１１、１２、１４の合成ペプチド（これらはそれぞれ以下ＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１Ｇ、Ｍｕｃ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、Ｍｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭと記載する）、及びＧａｌＮＡｃを２つ付加した配列番号１１及び１２の合成ペプチド（これらはそれぞれ以下ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇ、Ｍｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭと記載する）を使用した。ＧａｌＮＡｃを付加した基質のうち、ＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１ＧはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ６（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７４（３６）， ２５３６２−２５３７０（１９９９））により、Ｍｕｃ−１Ｇ−ＦＡＭ及びＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１ＧはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ２（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７０（４１），２４１５６−２４１６５（１９９５））により、Ｍｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇ、及びＭｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ１３（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７８（１）， ５７３−８４（２００３））によりそれぞれグリコシル化を行い、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」とも記載する）を用いて精製して得た。
【００４９】
反応液は受容体基質（最終濃度５０ｐｍｏｌ）、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（最終濃度２５ｍｍｏｌ／ｌ）、ＭｎＣｌ２（最終濃度５ｍｍｏｌ／ｌ）、供与体基質（最終濃度２００ｎｍｏｌ／ｌ）から成り、これに酵素液１を１０μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした。
【００５０】
上記反応混合液を３７℃で１６時間反応させた。反応後、９７℃で３分間加熱し、酵素を失活させて反応を終了させた。反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。得られた上清を簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ：日本ミリポア社製）を通して、２０μｌ〜４０μｌをＨＰＬＣ分析に提供した。ＨＰＬＣのカラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（商標名：ナカライテスク社製）を用いた。展開バッファーＡは０．０５％のトリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」とも記載する）を含むイオン交換水、展開バッファーＢとしては０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。分離にはバッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上がるように勾配をかけた。検出条件は励起波長を４９２ｎｍ、検出波長を５２０ｎｍとした。
【００５１】
その結果、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、ＦＡＭ−ＥＡ−２Ｇ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇを基質として用いた場合に、新たなピークが生じた（図１〜１５：中段のチャート）。よって、本発明酵素はこれらのペプチド配列及びＧａｌＮＡｃ付加ペプチドを受容体基質としＧａｌＮＡｃを転移することが示された。
【００５２】
また、反応液の組成を同様とし、酵素液１を酵素液２に代えて同様の測定を行ったところ、酵素液１よりも若干強い酵素活性が確認された（図１〜１５：最下段のチャート）。また、ＨＲＰ、ＳＤ１０６にもＧａｌＮＡｃを転移する働きを有することが明かとなった。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【発明の効果】
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図２】本発明酵素のＭｕｃ２−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図３】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図４】本発明酵素のＭｕｃ７−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図５】本発明酵素のＭｕｃ１３−５８−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図６】本発明酵素のＥＡ２−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図７】本発明酵素のＨＰＲ−Ｆ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図８】本発明酵素のＳＤＣ１０６−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図９】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１０】本発明酵素のＭｕｃ２−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１１】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１２】本発明酵素のＭｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１３】本発明酵素のＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１４】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１５】本発明酵素のＭｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「糖転移酵素」、より詳細にはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有する酵素及びそれをコードする「核酸」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中、糖及び糖残基は特に明記しない限り、光学異性体は全てＤ体を示す。またＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを「ＧａｌＮＡｃ」と、デオキシリボ核酸を「ＤＮＡ」と、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを「ＦＡＭ」と略記することもある。
【０００３】
近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
【０００４】
糖の中でＧａｌＮＡｃはグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、ムチン型糖鎖の様な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、ＧａｌＮＡｃを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
【０００５】
ＧａｌＮＡｃ受容体基質にＧａｌＮＡｃを転移する働きを有する酵素としては、これまでに数種類の酵素が知られており、これらは非特許文献１〜１４に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（４１）， ２４１５６−２４１６５（１９９５）
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， ８（６）， ５４７−５５５（１９９８）
【非特許文献３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（２９）， １６００６−１７０１２（１９９６）
【非特許文献４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １７３（４６）， ３０４７２−３０４８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３（４２）， ２７７４９−２７７５４（１９９８）
【非特許文献６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４（３６）， ２５３６２−２５３７０（１９９９）
【非特許文献７】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４６０（２）， ２２５−２３０（１９９９）
【非特許文献８】Ｇｅｎｅ．， ２４６（１−２）， ３４７−３５６（２０００）
【非特許文献９】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ａｃｔａ．，１４９３（１−２）， ２６４−２６８（２０００）
【非特許文献１０】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５３１（２）， １１５−１２１（２００２）
【非特許文献１１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（２５）， ２２６２３−２２６３８（２００２）
【非特許文献１２】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５２４（１−３）， ２１１−２１８（２００２）
【非特許文献１３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８（１）， ５７３−５８４（２００３）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３００， ７３８−７４４（２００３）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
糖鎖の生体内での働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。そのために従来から存在する酵素の機能を解析することはもちろんであるが、更に新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することに対する要請が高まっている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、機能タンパク質をコードする新規な核酸を見い出し、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを見い出した。
【０００９】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（２） 以下の（Ａ’）又は（Ｂ’）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（３） 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸。
（４） （１）又は（２）記載のポリペプチドをコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（５） 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（６） 配列番号１記載の塩基番号１〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（７） （３）〜（６）いずれか記載の核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
（８） ＤＮＡであることを特徴とする（３）〜（７）いずれか記載の核酸。
（９） （３）〜（８）いずれか記載の核酸を含むベクター。
（１０） （１）又は（２）記載の糖転移酵素のポリペプチドを発現する様に構築されている発現ベクターであることを特徴とする（９）記載のベクター。
（１１） （９）又は（１０）記載のベクターを含む組換体。
（１２） （１１）記載の組換体を生育させ、その生育物から糖転移酵素を単離することを特徴とする糖転移酵素の製造方法。
（１３） （１）又は（２）記載の糖転移酵素を特異的に認識する抗体。
（１４） （１）又は（２）記載の糖転移酵素の活性調節剤。
（１５） （１４）記載の活性調節剤を有効成分として含む、（１）又は（２）記載の糖転移酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明酵素
本発明酵素はＧａｌＮＡｃ受容体基質に、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ基を転移する活性を有する糖転移酵素である。
【００１１】
ここで「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」とは、ＧａｌＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。
【００１２】
「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」は本発明酵素がＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移することができる化合物である限り特に限定はされないが、配列番号７〜１４いずれか記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００１３】
これらの「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」の何れかの化合物へ「ＧａｌＮＡｃ残基」を転移する活性の確認は、例えば［１４Ｃ］又は［３Ｈ］などの放射性同位元素でＧａｌＮＡｃ残基を放射能標識した「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」と、上記例示の「ＧａｌＮＡｃ受容体基質」とを混合し、そこに「本発明酵素」の存在下で酵素反応させ、「反応生成物」を「ＧａｌＮＡｃ供与体基質」と分離して「反応生成物の放射能」を測定する方法で行うことができる。このような方法としては具体的には後述の実施例３記載の方法が例示される。
【００１４】
このような「本発明酵素」は、より具体的には例えば以下の（Ａ）又は（Ａ’）のポリペプチドを含む。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、それらに糖鎖が結合した糖ポリペプチドの形態の糖転移酵素も本発明酵素の一態様として挙げられる。
【００１５】
なお、一般にアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が存在していても、酵素の活性が維持されることは当業者にとっては理解されうるところであり、上記配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列に於いても１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が存在していても「糖転移酵素活性」を有する限りにおいて上記「ポリペプチド」として使用することができる。
【００１６】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、上記「ポリペプチド」に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するポリペプチド」を作成することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドがＩＬ−２の活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４（１９８４）， ｐ．１４３１）。またある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、二次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、「本発明酵素のポリペプチド」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するポリペプチド」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００１７】
なお、ここで「複数」とは、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ受容体基質にＧａｌＮＡｃ残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて「複数」とは特に限定はされないが、全アミノ酸数の１０％以下、好ましくは５％以下程度のアミノ酸数を示す。例えば５５９個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ）記載のポリペプチド）に於いては５５個以下、好ましくは２７個以下を示し、また６０１個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’）記載のポリペプチド）に於いては６０個以下、好ましくは３０個以下を示す。
【００１８】
また、本発明酵素の活性測定系を利用することで、本発明酵素の活性を促進したり阻害したりする働きを有する物質をスクリーニングして得ることが可能となる。かかる物質は、本発明酵素の活性調節剤の有効成分として利用することが可能である。更にこのような活性調節剤は本発明酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤として利用することが可能である。
【００１９】
（２）本発明核酸
「本発明核酸」は配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸である。
【００２０】
「本発明核酸」としては、例えば配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）、配列番号１記載の塩基番号１〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸２）又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。
【００２１】
上記「本発明核酸１」は、「本発明酵素のポリペプチド」のうち、「膜貫通領域（疎水性アミノ酸が１０〜２０個程度連続した領域）を欠失した態様のポリペプチド」をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドを「可溶性ポリペプチド」とすることができる。また「本発明核酸２」は、「本発明酵素のポリペプチド」の全配列をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドは生体内に存在する「本発明酵素のポリペプチド」と同一と考えられ、またこのようなポリペプチドを「本発明酵素の抗体」の調製等のために使用することも可能である。
【００２２】
特に「本発明核酸１」や「本発明核酸２」等は、タンパク質合成における終始コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ）記載のポリペプチド）や「アミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’）記載のポリペプチド）を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
【００２３】
特に配列番号１記載の塩基配列のうち、「塩基番号１２７〜１８０６からなる核酸（特にＤＮＡ）又はそれに相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）」は、例えば「本発明核酸」の生体内での発現状況などを検査するための核酸プローブとして使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬としての可能性を有する。
【００２４】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃の条件が例示される。
【００２５】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７８１４５）をクエリーとしてマウス遺伝子データベースで塩基配列を検索を行ない、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿５９８９５０を相同配列として得ることができる。この配列をもとにヒト遺伝子データベースを検索し、第四染色体のＮＴ００６１９８、ＮＴ００６２５７のゲノム配列中に予測される翻訳領域（以下「ＯＲＦ」とも記載する）を見い出すことができる。次に、予測情報に基づいて作成したプライマー（例えば５’プライマーとして配列番号３、３’プライマーとして配列番号４のプライマーが例示される）を用いポリメラーゼ チェイン リアクション法（以下「ＰＣＲ法」とも記載する）を行うことで翻訳領域を増幅し、かかる増幅産物から配列番号１に記載された全ＯＲＦ領域であり、可溶化形態のポリペプチドをコードする「本発明核酸」を得ることができる。
【００２６】
「可溶化形態のポリペプチドのアミノ酸配列」としては例えば「配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列」が挙げられ、このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリペプチドをコードする核酸としては、「配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列からなる核酸」が例示される。このような核酸の調製は、例えば配列番号３記載の配列を５’プライマー、配列番号４記載の配列を３’プライマーとして使用し、例えばヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーを鋳型として常法に従ってＰＣＲ法を行うことで調製することができる。
【００２７】
この場合、ＰＣＲ産物として約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００２８】
このようにして単離した「本発明核酸」は、それがコードする「本発明酵素」を発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、「本発明核酸」の両端に制限末端を常法より連結し、発現ベクターに挿入することができる（このようにして得られた発現ベクターを「本発明発現ベクター」と記載する）。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明酵素を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記「本発明核酸」が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに「本発明核酸」が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００２９】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる（このような組換体を「本発明組換体」とも記載する）。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞、植物細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００３０】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、「本発明発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００３１】
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。本発明発現ベクターはそのような「本発明酵素」の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に「本発明酵素」を「酵素活性を有するポリペプチド（例えば上述の（Ａ）又は（Ａ’）記載のポリペプチド）」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明発現ベクター」を用いて遺伝子工学的に「本発明酵素」を調製すると単離・精製が容易となるため好ましい。
【００３２】
上記「識別ペプチド」の例としては、「本発明酵素」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「識別ペプチド」と「酵素活性を有するポリペプチド」とが結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明酵素」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６〜１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明酵素の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明酵素」を得るのが、取扱面が極めて優れるため好ましい。
【００３３】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明酵素」を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（シグマ社）、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照）等が例示されるが、当業者であれば「本発明酵素」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００３４】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（実施例１）ほ乳類細胞を用いた本発明ＤＮＡ及び本発明酵素の調製方法
公知のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素遺伝子（ＧＡＬＮＴ１０）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７８１４５）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、上記塩基配列のオーソログとその下流に既存のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素で共通に一部配列が保存されている遺伝子を発見し（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００６１９８）、かかる遺伝子のエキソンを解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００６１９８とＮＴ＿００６２５７に合計１２のエキソンからなる遺伝子（配列番号１）が存在することが明かとなった。このエキソンからなる塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測され、この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製することとした。
【００３６】
培養細胞Ｌｕ−１６０（小細胞肺癌株）から調製したヒトゲノムｃＤＮＡを鋳型とし、５’プライマーとして配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、３’プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用してＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法はＤＮＡポリメラーゼとして宝酒造株式会社のＰｒｅｍｉｘ Ｅｘｔａｑを使用し、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル繰り返す条件で行なった。そしてＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行い、約１．８ｋｂのバンドをゲル切り出し法で切り出して常法により単離した。このようにして得られたＰＣＲ産物を、説明書の記載に従ってインビトロゲン社製のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入した（このベクターを「ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ／Ｏ２１」と記載する）。常法に従って塩基配列の確認を行ったところ１８０６ｂｐのＯＲＦ配列であることが明かとなった。
【００３７】
（１）発現ベクターの調製
ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに組み込んだ遺伝子がコードするタンパク質をＮ末端の４２アミノ酸残基を欠失した形態で発現させる本発明核酸を調製するために、配列番号５の５’プライマー及び配列番号６の３’プライマーを使用してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ／Ｏ２１を鋳型としてＰＣＲ法を行った。上記５’プライマーを用いて調製した増幅産物は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限末端が存在し、３’末端にはｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターの配列一部とＸｂａＩ制限末端が存在する構造を有する。
【００３８】
ＰＣＲ法は、９８℃１０秒、５３．２℃３０秒、７２℃２分を１０回繰り返した後、９８℃１０秒、５８℃３０秒、７２℃２分を１０回繰り返した。得られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製した。このように処理した増幅産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、説明書の記載に添って発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３に導入した（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３／Ｏ２１）。
【００３９】
（２）組換体の調製及び本発明酵素の精製
常法に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３／Ｏ２１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）に導入した。導入後、細胞を常法に従って培養し、４８時間経過した後に３００×ｇで１０分間遠心して培養液を回収し、適当量の抗ＦＬＡＧ Ｍ１樹脂（シグマ社製）と混合した。４℃で３時間以上混和させた後、３００×１０分間遠心し、樹脂に吸着した本発明酵素を回収した。樹脂を回収し、１ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４：５０ｍｍｏｌ／ｌ：樹脂の５〜１０倍量）で２回洗浄し、これを酵素液１とした。
【００４０】
（実施例２）昆虫細胞を用いた本発明ＤＮＡ及び本発明酵素の調製方法
インビトロジェン社製のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は宝酒造株式会社のＰｙｒｏｂｅｓｔを用いて９８℃１０秒、５３℃３０秒、７２℃２分を１０サイクル繰り返した後、９８℃１０秒、５８℃３０秒、７２℃２分を１０サイクル繰り返して行なった。添付された説明書に従ってＢＰクロナーゼ反応を行ってｐＤＯＮＯＲ２０１ベクターに増幅産物（エントリークローン）を組み込んだ。
【００４１】
このエントリークローンは、挿入部位の両端にラムダファージが大腸菌から切り出される際に組換部位として働くａｔｔＬを有するため、添付書に従ってＬＲクロナーゼ反応を行いエントリークローンの挿入配列をディスティネーションベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ由来の発現ベクターｐＦＢＩＦ−Ｃ）に移し、発現クローンを調製した。
続いてインビトロジェン社製のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて、上記発現ベクターとｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なプラスミド（バクミド）にクローンを挿入した。
【００４２】
常法に従って、目的配列がバクミドに挿入されていることを確認した後、昆虫由来の培養細胞Ｓｆ２１にバクミドを導入した。
すなわち３５ｍｍシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５個／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ培地）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着させた。精製したバクミドのＤＮＡ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えてＳｏｌｕｔｉｏｎＡを調製し、ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ溶液（インビトロジェン社製）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを添加してＳｏｌｕｔｉｏｎＢを調製した。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＢを丁寧に混合し、１５〜４５分間程度室温でインキュベートとし、これに更に抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ ８００μｌを添加して丁寧に混和した（この溶液をＳｏｌｕｔｉｏｎ混合液とも記載する）。
【００４３】
細胞が接着したことを確認し、培養液を吸引し、希釈したＳｏｌｕｔｉｏｎ混合液１ｍｌをシャーレに加え、２７℃で５時間インキュベートした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩを２ｍｌ添加して２７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後にピペッティングを行って細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した（これを「一次ウイルス液」とした）。
【００４４】
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加え、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液８００μｌを添加して、２７℃で４８時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（これを「二次ウイルス液」とした）。
【００４５】
更に、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加え、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液１ｍｌを添加して、２７℃で９６時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（これを「三次ウイルス液」とした）。
更に、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６×１０６個／ｍｌＳｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を１００ｍｌ加え、三次ウイルス液１ｍｌを添加して、２７℃で９６時間インキュベートした。その後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を本発明酵素の酵素源とした。
【００４６】
常法により上記酵素源をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、ゲルを使用してウエスタンブロッティング法を行った。検出用の抗体としては抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２：シグマ社製）を使用した。その結果、分子量約７０ｋＤａのタンパク質の発現を確認し、目的タンパク質の発現がなされていることが示唆された。
【００４７】
上記酵素源を適当量の抗ＦＬＡＧ Ｍ１樹脂（シグマ社製）と混合し、４℃で３時間以上混和させた後、３００×１０分間遠心し、樹脂に吸着した本発明酵素を回収した。樹脂を回収し、１ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４：５０ｍｍｏｌ／ｌ：樹脂の５〜１０倍量）で２回洗浄し、これを酵素液２とした。
【００４８】
（実施例３）本発明酵素の酵素活性
本発明酵素のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ転移酵素としての活性を測るために、供与体基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用い、受容体基質としてＣ末端あるいはＮ末端をＦＡＭで標識した配列番号９〜１６の合成ペプチド（配列番号９及び１１記載の合成ペプチドはＮ末端にＦＡＭが結合しており、他はＣ末端にＦＡＭが結合している：以下、配列番号９の受容体基質をＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ、配列番号１０の受容体基質をＭｕｃ２−ＦＡＭ、配列番号１１の受容体基質をＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ、配列番号１２の受容体基質をＭｕｃ７−ＦＡＭ、配列番号１３の受容体基質をＭｕｃ１３−５８−ＦＡＭ、配列番号１４の受容体基質をＥＡ２−ＦＡＭ、配列番号１５の受容体基質をＨＰＲ−Ｆ−ＦＡＭ、配列番号１６の受容体基質をＳＤＣ１０６−ＦＡＭと記載する）、ＧａｌＮＡｃを１つ付加した配列番号９、１０、１１、１２、１４の合成ペプチド（これらはそれぞれ以下ＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１Ｇ、Ｍｕｃ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、Ｍｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭと記載する）、及びＧａｌＮＡｃを２つ付加した配列番号１１及び１２の合成ペプチド（これらはそれぞれ以下ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇ、Ｍｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭと記載する）を使用した。ＧａｌＮＡｃを付加した基質のうち、ＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１ＧはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ６（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７４（３６）， ２５３６２−２５３７０（１９９９））により、Ｍｕｃ−１Ｇ−ＦＡＭ及びＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１ＧはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ２（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７０（４１），２４１５６−２４１６５（１９９５））により、Ｍｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇ、及びＭｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭはＧａｌＮＡｃ転移酵素Ｔ１３（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２７８（１）， ５７３−８４（２００３））によりそれぞれグリコシル化を行い、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」とも記載する）を用いて精製して得た。
【００４９】
反応液は受容体基質（最終濃度５０ｐｍｏｌ）、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（最終濃度２５ｍｍｏｌ／ｌ）、ＭｎＣｌ２（最終濃度５ｍｍｏｌ／ｌ）、供与体基質（最終濃度２００ｎｍｏｌ／ｌ）から成り、これに酵素液１を１０μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした。
【００５０】
上記反応混合液を３７℃で１６時間反応させた。反応後、９７℃で３分間加熱し、酵素を失活させて反応を終了させた。反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。得られた上清を簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ：日本ミリポア社製）を通して、２０μｌ〜４０μｌをＨＰＬＣ分析に提供した。ＨＰＬＣのカラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（商標名：ナカライテスク社製）を用いた。展開バッファーＡは０．０５％のトリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」とも記載する）を含むイオン交換水、展開バッファーＢとしては０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。分離にはバッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上がるように勾配をかけた。検出条件は励起波長を４９２ｎｍ、検出波長を５２０ｎｍとした。
【００５１】
その結果、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、ＦＡＭ−ＥＡ−２Ｇ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇ、ＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭ、ＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇを基質として用いた場合に、新たなピークが生じた（図１〜１５：中段のチャート）。よって、本発明酵素はこれらのペプチド配列及びＧａｌＮＡｃ付加ペプチドを受容体基質としＧａｌＮＡｃを転移することが示された。
【００５２】
また、反応液の組成を同様とし、酵素液１を酵素液２に代えて同様の測定を行ったところ、酵素液１よりも若干強い酵素活性が確認された（図１〜１５：最下段のチャート）。また、ＨＲＰ、ＳＤ１０６にもＧａｌＮＡｃを転移する働きを有することが明かとなった。
【００５３】
【配列表】
【発明の効果】
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図２】本発明酵素のＭｕｃ２−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図３】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図４】本発明酵素のＭｕｃ７−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図５】本発明酵素のＭｕｃ１３−５８−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図６】本発明酵素のＥＡ２−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図７】本発明酵素のＨＰＲ−Ｆ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図８】本発明酵素のＳＤＣ１０６−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図９】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ１ａ−１Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１０】本発明酵素のＭｕｃ２−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１１】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−１Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１２】本発明酵素のＭｕｃ７−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１３】本発明酵素のＥＡ２−１Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１４】本発明酵素のＦＡＭ−Ｍｕｃ５Ａｃ−２Ｇに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
【図１５】本発明酵素のＭｕｃ７−２Ｇ−ＦＡＭに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示す図である。上段は本発明酵素を添加しない場合のチャートを示し、中段はほ乳類細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示し、下段は昆虫細胞由来の本発明酵素の活性を示すチャートを示す。
Claims (15)
- 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号４３〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。 - 以下の（Ａ’）又は（Ｂ’）のポリペプチドを含む糖転移酵素。
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ’）配列番号２記載のアミノ酸番号１〜６０１からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、且つＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。 - 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸。
- 請求項１又は２記載のポリペプチドをコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 配列番号１記載の塩基番号１２７〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 配列番号１記載の塩基番号１〜１８０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 請求項３〜６いずれか一項記載の核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
- ＤＮＡであることを特徴とする請求項３〜７いずれか一項記載の核酸。
- 請求項３〜８いずれか一項記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１又は２記載の糖転移酵素のポリペプチドを発現する様に構築されている発現ベクターであることを特徴とする請求項９記載のベクター。
- 請求項９又は１０記載のベクターを含む組換体。
- 請求項１１記載の組換体を生育させ、その生育物から糖転移酵素を単離することを特徴とする糖転移酵素の製造方法。
- 請求項１又は２記載の糖転移酵素を特異的に認識する抗体。
- 請求項１又は２記載の糖転移酵素の活性調節剤。
- 請求項１４記載の活性調節剤を有効成分として含む、請求項１又は２記載の糖転移酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003162685A JP2004357635A (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | 糖転移酵素及びそれをコードする核酸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003162685A JP2004357635A (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | 糖転移酵素及びそれをコードする核酸 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004357635A true JP2004357635A (ja) | 2004-12-24 |
Family
ID=34054761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003162685A Pending JP2004357635A (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | 糖転移酵素及びそれをコードする核酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004357635A (ja) |
-
2003
- 2003-06-06 JP JP2003162685A patent/JP2004357635A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100354417C (zh) | 与dppiv相关的新丝氨酸蛋白酶基因 | |
| Mijakovic et al. | Transmembrane modulator‐dependent bacterial tyrosine kinase activates UDP‐glucose dehydrogenases | |
| CN109321480B (zh) | 用于控制重组胶原羟基化的酵母菌株和方法 | |
| JP2002526108A (ja) | スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合 | |
| TW201625665A (zh) | 具有高分泌效能之蛋白質分泌因子及包含該因子之表現載體 | |
| Persson et al. | SelD homolog from Drosophila lacking selenide-dependent monoselenophosphate synthetase activity | |
| JP4333880B2 (ja) | コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードするｄｎａ | |
| Yamamoto et al. | Alteration of the carbohydrate-binding specificity of the Bauhinia purpurea lectin through the preparation of a chimeric lectin | |
| JP4338038B2 (ja) | コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードする核酸 | |
| JP2004357635A (ja) | 糖転移酵素及びそれをコードする核酸 | |
| JP2008500824A (ja) | Ｐｄｅ５モジュレーターの同定方法 | |
| US5859222A (en) | Human phosphatidylcholine phospholipase D | |
| KR20220097504A (ko) | 투구게 유래 재조합 FactorG 및 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법 | |
| JP3578904B2 (ja) | ラクトシルセラミド合成酵素及びその遺伝子 | |
| JP4171791B2 (ja) | 糖転移作用剤 | |
| JP4884222B2 (ja) | アスパラギン結合型糖鎖修飾を受けない変異型糖タンパク質 | |
| CN113943718B (zh) | 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用 | |
| JP4517189B2 (ja) | 糖ヌクレオチド運搬作用を有するタンパク質、組織の癌化の検出方法 | |
| CN108779452B (zh) | 发光酶蛋白 | |
| Sun et al. | Breaking Barriers: pCF10 Type 4 Secretion System relies on a self-regulating muramidase to modulate the cell wall | |
| WO2003072773A1 (fr) | Proteine fusionnee ayant une activite de glucuronyltransferase | |
| JP2005323506A (ja) | ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質及びヒアルロン酸の製造方法 | |
| JP4317984B2 (ja) | 活性硫酸運搬作用を有するタンパク質、組織の癌化の検出方法 | |
| JP4604158B2 (ja) | 活性硫酸運搬作用を有するタンパク質および組織の癌化の検出方法 | |
| JP2003199573A (ja) | 新規ｕｄｐ−ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びこれをコードする核酸 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060303 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081117 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090401 |