JP2003199573A - 新規ｕｄｐ−ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びこれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 コアタンパク質やペプチド配列のセリン、ス
レオニン残基の水酸基にN−アセチルグルコサミンをα
１結合で転移する活性を有する酵素を単離して提供する
とともに、その遺伝子の構造を明らかにすること。 【解決手段】 特定なアミノ酸配列又は該アミノ配列に
おいて１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失
し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸
が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、基
質となるコアタンパク質あるいはペプチドのセリン、ス
レオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミン
（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で転移する活性を有するタ
ンパク質、及び特定な塩基配列を有する核酸とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする、前記タンパク
質をコードする核酸。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コアタンパク質、
ペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−
アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で
転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする
核酸、並びに該核酸を測定するための核酸および測定用
キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】これまでに、コアタンパク質やペプチド
配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチル
グルコサミンをα１結合で転移する活性を有するヒトの
酵素としては９種類が知られている（ｒｅｆ １−
７）。しかし、それぞれの遺伝子で発現組織や転移可能
なアミノ酸配列や周囲のアミノ酸への糖修飾のパターン
により、使用される酵素は異なっている。即ち、全ての
ヒトのタンパク質にＮ−アセチルグルコサミン修飾を施
すには、あらゆる種類のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガ
ラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミ
ン転移酵素が必要になると考えられる。さらに、コアタ
ンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水
酸基にＮ−アセチルグルコサミンをα１結合で転移する
活性を有する酵素糖鎖はＯ−結合型糖鎖の根元酵素であ
り、この酵素の変化による細胞表面やタンパク質上の糖
鎖密度の変化や糖鎖構造の欠如により、多数の疾患が引
き起こされることが知られている。一例を示すと、抗体
のＯ−結合型糖鎖修飾は、いくつかの病気において変化
する。ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）では、ＩｇＡ１の血漿中
の含量が増加する。この免疫グロブリンはＮ−結合型糖
鎖に加えて、ヒンジ領域Ｏ−結合型糖鎖を含んでいる。
正常な状態では、シアリル化されたコア１構造（Ｇａｌ
ｂ１−３ＧａｌＮＡｃａ１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）がある。
ＩｇＡＮにおいては、これらのコア１糖鎖のシアリル化
が減少しているかまたは末端Ｇａｌが存在しない（ｒｅ
ｆ ８）。つまり、ＩｇＡ１はＴｎ構造を持っている。
この結果ＩｇＡ１は腎臓に沈着し、ＩｇＡＮを引き起こ
す（ｒｅｆ ９）。この末端Ｇａｌの変化はヒンジ領域
のＧａｌＮＡｃの結合状況変化と関連していると推測さ
れている。しかし、現状では、ＩｇＡ１免疫グロブリン
のヒンジ領域へのＮ−アセチルガラクトサミン結合転移
酵素はまだ解明されていない。このように、糖転移酵素
の発現量を調べることは、疾患の診断や治療においても
重要であると考えられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】コアタンパク質やペプ
チド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にN−アセ
チルグルコサミンをα１結合で転移する活性を有する酵
素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることによ
り、該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に基づく
疾患の診断が可能になる。しかしながら、従来のＵＤＰ
−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ
−アセチルガラクトサミン転移酵素では受容体基質とし
ないにもかかわらず、生体内に存在する糖鎖構造が存在
することから、未だ分離精製もされておらず、該酵素の
単離及び遺伝子の同定の手がかりはない。そのために、
該酵素に対する抗体も作製されていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、配
列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ
配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しく
は欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のア
ミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し
コアタンパク質、ペプチド配列のセリン、スレオニン残
基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα−１結合
で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、
本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。
さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸
を発現することができる組換えベクターを提供する。さ
らに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換さ
れ、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発
明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測
定用核酸及び測定用キットを提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】下記実施例において詳述する方法
によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコー
ドする核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列
を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基
配列の下に記載されている。配列番号１には、該アミノ
酸配列のみを取り出して示す。

【０００６】下記実施例で得られた本発明のタンパク質
(「ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０」と命名）は、次の性質を有
する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記
実施例において詳述されている。作用 ： コアタンパク質とポリペプチドのセリン、スレ
オニン残基の水酸基にN-アセチルガラクトサミンをα１
結合で転移する（ＥＣ ２．４．１．４１、ＵＤＰ−Ｎ
−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ：
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、 UDP-N-acetyl-D- galactosamine＋ peptide (S/T) <=> UDP + N-acetyl-beta-D-galactosamine-1-S/T-peptide)基質特異性 : コアタンパク質のポリペプチドのセリ
ン、スレオニン残基の水酸基。

【０００７】なお、一般に、酵素のような生理活性を有
するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１
若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若し
くは該アミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入
され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が
維持されることがあることは周知である。従って、配列
番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数
のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ
酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは
付加されたアミノ酸配列を有し、コアタンパク質、ペプ
チド中のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチ
ルガラクトサミンをα１結合で活性を有するタンパク質
（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲
に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列
は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、
好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の
相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の
相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソ
フトを用いて容易に算出することができ、このようなソ
フトはインターネットによっても利用に供されている。
さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個の
アミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸
配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付
加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。

【０００８】本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸
配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ
酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮ
Ａが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があ
り、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在す
るアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩
基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願
発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際
にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２
に示されている。配列２に示す塩基配列を有する核酸と
ストリンジェントな条件下（すなわち、５ ｘ Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ'ｓ ｒｅａｇｅｎｔ， ６ｘ ＳＳＣ，
０．５％ ＳＤＳ又は０．１％ ＳＤＳといった一般的
なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で
反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上
記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に
入る。

【０００９】上記本発明の核酸を、発現ベクターのクロ
ーニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記
核酸を発現させることができる組換えベクターを得るこ
とができる。発現ベクターとしては、種々宿主細胞用の
種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知
であり、市販もされている。本発明では、このような市
販の発現ベクターを好ましく用いることができる。ま
た、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又
は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核
酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等に
より宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供
する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知
であり、上記組換えベクターを用いること等により容易
に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定され
ず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いるこ
とができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用
いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が
下記実施例に詳述されている。

【００１０】なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ
酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性
を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合してい
てもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タ
ンパク質」をも包含する。

【００１１】本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮ
Ａの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ
又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発
明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明
により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象
となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせ
ず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという
意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわ
け配列番号２に示される塩基配列を有する核酸中の部分
領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましい
が、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないこ
とが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法にお
けるプライマーとして用いることができる。特異性を確
保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さ
らに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プロー
ブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好まし
くは２０塩基以上、コード領域の全長（１６７１塩基）
以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１
５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基
以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を
有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマ
ー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法
自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発
明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチ
ューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体
的に詳述されている。なお、本明細書において、「測
定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含され
る。

【００１２】ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分
野において周知であり、そのための試薬キット及び装置
も市販されているので容易に行うことができる。上記し
た本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、
被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行なうと、被
検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含ま
れない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出す
ることにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知る
ことができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を
電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する
方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に
不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識
プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出
することにより行うことができる。また、クエンチャー
蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアル
タイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸
の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム
検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行
なうことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基
づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、
被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃ
ＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅
する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢ
Ａ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。
ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市
販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易
に実施することができる。

【００１３】プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光
標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プ
ローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物
を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄
後、固相に結合された標識を測定することにより、検体
中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。
あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリ
ダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等
で検出することも可能である。このような場合、固相に
結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。

【００１４】本発明の酵素を、セリン、スレオニン残基
を有するペプチト、コアタンパク質、糖タンパク質等に
作用させることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンを
α１結合させる。従って、本発明の酵素は、糖タンパク
質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。
さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することに
より、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗
体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可
能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする
核酸は、このような免疫原の作製に有用である。

【００１５】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１６】

【実施例１】遺伝子データベースの検索とＧａｌＮＡｃ
−Ｔ１０の塩基配列決定 既存のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポ
リペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｘ８
５０１８、Ｘ８５０１９、Ｘ９２６８９、Ｙ０８５６
４、Ｙ０８５６５、 ＡＪ００２７４４、ＡＢ０３２９
５９）と類似遺伝子の高い相同性を有するアミノ酸配列
を用いて、新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥ
ＤＯ）の委託を受けてバイオテクノロジー開発技術研究
組合が実施する「戦略的ヒトｃＤＮＡゲノム応用技術開
発」及びその後継プロジェクトである「完全長ｃＤＮＡ
構造解析」により提供されている遺伝子データベースか
ら類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はＵＤＰ−Ｎ
−アセチルカラクトサミン転移酵素遺伝子における配列
番号：Ｘ８５０１８、Ｘ８５０１９、Ｘ９２６８９、Ｙ
０８５６４、Ｙ０８５６５、 ＡＪ００２７４４、ＡＢ
０３２９５９である。その結果、平成１３年５月３０日
第３回開示したデータベースからヒトｃＤＮＡクローン
ＮＴ２ＲＩ２０００３１３はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０のＦ
ｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡクローンであることを
発見した。ＮＴ２ＲＩ２０００３１３のホストｖｅｃｔ
ｏｒはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎ
ｏ． ＡＢ００９８６４）（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎ
ｋ）である。このクローンは株式会社ヘリックス研究所
で作成されたものである。

【００１７】

【実施例２】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の発現ベクターへの
組込み ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の発現系を作成するため、まずＧ
ａｌＮＡｃ−Ｔ１０遺伝子全長あるいは遺伝子の一部を
インビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＤＯ
ＮＲ２０１に組込み、さらにインビトロジェン社のＢａ
ｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作成し
た。以下に詳細を述べる。

【００１８】（１）ｇａｔｅｗａｙシステムによるｐＦ
ａｓｔＢａｃへの組込み エントリークローンの作成 株式会社ヘリックス研究所から提供されたＮＴ２Ｒ１２
００３１３クローンを鋳型としてプライマーＦ１（ＯＯ
１７ＧＦ：５'−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡ
ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧ
ＡＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＣ
ＡＡＧ−３'）、あるいはプライマーＦ２（ＲＯ１７Ｇ
Ｆ１２０：５'−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡ
ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴ
ＧＣＣＴＧＣＡＴＴＧＡＧＧ）とプライマーＲ（ＯＯ１
７ＧＲ：５'−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡ
ＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＣＣＡＡＧ
ＧＴＣＡＴＧＴＴＣＣＴＴＡＧ）、ＤＮＡポリメラーゼ
としてＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣ
Ｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４
６ １７３）を用いて、９４℃１５秒、６８℃３分を３
０サイクルの反応条件でＤＮＡ断片を増幅した。目的の
断片をアガロースゲル電気泳動後のゲルから切りだし、
精製後ＢＰＣｌｏｎａｓｅ反応によってｐＤＯＮＯＲ２
０１へ組込んだ。ＰｒｉｍｅｒＦ１とｐｒｉｍｅｒ Ｒ
で得られたＤＮＡ断片（１６７１ｂｐｓ）はＧａｌＮＡ
ｃ−Ｔ１０の全長ＯＲＦ、ｐｒｉｍｅｒＦ２とｐｒｉｍ
ｅｒ Ｒで得られたＤＮＡ断片（１５５４ｂｐｓ）は活
性測定用トランケート型遺伝子としてｐＤＯＮＯＲ２０
１へ組込み、「エントリークローン（ｐＤＯＮＯＲ−Ｇ
ａｌＮＡｃ−Ｔ１０）」を作成した。反応は目的とする
ＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＯＲ２０１１μｌ（１５０
ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍ
ｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行っ
た。ＰｒｏｔｅｎａｓｅＫを１μｌ加えて３７℃１０分
おき反応を停止した。その後上記ｍｉｘ全量（１１μ
ｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌ
と混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含む
ＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣ
Ｒで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＯＮＯＲ−Ｇ
ａｌＮＡｃ−Ｔ１０）を抽出・精製した。 発現クローンの作成 上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファ
ージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔ
ｔＬを持つもので、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ （ラムダフ
ァージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したも
の）とデステイネーションベクターと混合することで、
挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現ク
ローンが作成される。具体的工程は以下のとおりであ
る。まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＨを０．
５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．
５μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ ２μｌを２５
℃で１時間反応させ、Ｐｒｏｔｅｎａｓｅ Ｋを１μｌ
加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させ
た（この組換え反応でｐＦＢＩＨ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１
０が生成される）。ｐＦＢＩＦ は、ｐＦａｓｔＢａｃ
１にＩｇκ（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭ
ＳＲＧ）とＨＩＳタグのシーケンスを加えたもので、Ｏ
Ｔ５（５'−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧ
ＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡ
ＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧ
ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ−３'）を鋳
型に、プライマーＯＴ２０（５'−ＣＧＧＧＡ ＴＣＣ
ＡＴ ＧＣＡＴＴ ＴＴＣＡＡ ＧＴＧＣＡ Ｇ−
３'）と、ＯＴ２２（５'−ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧ
ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ−３'）を用いてＰＣＲを行
い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍ Ｈ１ とＥｃｏ Ｒ
１ で挿入して得られたものである。Ｉｇκは発現タン
パク質を分泌型にするため、Ｈｉｓタグは精製のため挿
入した。その後上記混合液全量（１１μｌ）をコンピテ
ントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒー
トショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートに
まいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡ
を確認し、ベクター（ｐＦＢＩＨ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１
０）を抽出・精製した。またｐＦＢＩＨに変えてｐＦＢ
ＩＦでも同様に実験を行った。即ちｐＦＢＩＦはＨｉｓ
タグに変えて、精製用にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤ
ＤＤＫ）を入れたもので、ＯＴ３（５'−ＧＡＴＣＡＴ
ＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣ
ＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡ
ＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡ
ＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ−３'）を鋳型とし、プラ
イマーＯＴ２０（上記と配列同じ）と、ＯＴ２１（５'
−ＧＧＡＡＴ ＴＣＴＴＧＴ ＣＡＴＣＧ ＴＣＧＴＣ
ＣＴＴＧ−３'）によって得られたＤＮＡ断片を上記
と同様にＢａｍ Ｈ１ とＥｃｏ Ｒ１ で挿入した。

【００１９】（２）Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムによ
るＢａｃｍｉｄの作成 続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェ
ン社）を用いて上記ｐＦＢＩＨ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１０
又はｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１０とｐＦａｓｔＢ
ａｃとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢ
ａｃｍｉｄにＧａｌＮＡｃ Ｔ１０その他の配列を挿入
した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂ
ａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝
子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘ
ルパープラスミドから産生される組換タンパク質によっ
て目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへとりこまれるとい
うものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が
含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー
（挿入あり）による選択が可能である。即ち、上記精製
ベクター（ｐＦＢＩＨ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１０又はｐＦ
ＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ Ｔ１０）をコンピテントセル
（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートシ
ョック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラ
サイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬ
Ｂプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養
し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。

【００２０】

【実施例３】Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入 上記白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的配列が
挿入していることを確認した後、このＢａｃｍｉｄを昆
虫細胞Ｓｆ２１に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレに
Ｓｆ２１ ｃｅｌｌ ９ｘ１０⁵ ｃｅｌｌ／２ｍｌ
（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ）を加え、２７℃で
１時間培養して細胞を接着した。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ａ）精製した ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ５ μｌに抗生
物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌ加えた。
（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ）ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ ６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００
ＩＩ１００μｌ加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ
およびＳｏｌｕｔｉｏｎＢを丁寧に混合して１５〜４５
分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したこと
を確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ
−９００ＩＩ ２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ
とＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉ
ｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含
まないＳｆ９００ＩＩ ８００μｌを加えて丁寧に混和
した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−
ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃
で５時間インキュベートした。その後、Ｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓを除き、抗生物質を含む
Ｓｆ−９００ＩＩ培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時
間インキュベーションした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
から７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、
細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０
分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清
が一次ウイルス液となる）。Ｔ７５培養フラスコにＳｆ
２１細胞 １ｘ１０⁷ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ−９
００ＩＩ（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間ｉ
ｎｃｕｂａｔｉｏｎした。細胞が接着したら一次ウイル
スを８００μｌ添加して、２７℃で４８時間培養した。
４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞
と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間
遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二
次ウイルス液とした）。さらに、Ｔ７５培養フラスコに
Ｓｆ２１細胞 １ｘ１０⁷ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ
−９００ＩＩ（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時
間インキュベートした。細胞が接着したらニ次ウイルス
液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培
養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、
細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０
分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清
を三次ウイルス液とした）。加えて、１００ｍｌ用スピ
ナーフラスコにＳｆ２１細胞６ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添
加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及
び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間
遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四
次ウイルス液とした）。一次から三次までのセルペレッ
トをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、１ｘ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）細胞粗抽出液をＨ₂Ｏで２０
倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動に
ついてウエスタンブロッテイングを行ない、目的とする
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０タンパク質の発現を確認した。Ｆ
ＬＡＧ配列のついたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０（ＦＬＡＧ−
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０）に対する検出用抗体としては、
抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、
ＳＩＧＭＡ社）を用いた。ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ
１０は６４．４ ＫＤの位置にバンドが検出された。

【００２１】

【実施例４】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０のレジン精製 上記三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボ
トルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５００
０ｒｐｍ１０分を２回）ペレットをソニケーションした
（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ
７．５、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｘ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉ
ｌ）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量
（ＢＩＯ−ＲＡＤ社ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔ）し、タンパク量を調整の上ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、ウエスタンブロッテイングでＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０
の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相
対的発現量の多い、ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の
上清を使用することとした。四次感染のＦＬＡＧ−Ｇａ
ｌＮＡｃ−Ｔ１０上清２０ｍｌにＮａＮ₃（０．０５
％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ₂（２ｍ
Ｍ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ 社）（１００μｌ）
を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３００
０ｒｐｍ ５分４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａ
Ｃｌ₂・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０
００ｒｐｍ ５分４℃）し、ペレットを２００μｌの１
ｍＭ ＣａＣｌ₂・ＴＢＳ に浮遊させ活性測定のサン
プル（ＧａｌＮＡｃ Ｔ−１０酵素液）とした。

【００２２】

【実施例５】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の受容体基質の調製
（その１） ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０を、既知のＵＤＰ−Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラ
クトサミン転移酵素と比較して分子進化学的に解析した
結果、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポ
リペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素類に分
類された。そこで、活性特異性を調べるために受容体基
質（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を以下の
方法で調製した。ヒトの消化器官由来のムチンペプチト
配列ＭＵＣ２（ＰＴＴＴＰＩＴＴＴＴＴＶＴＰＴＰＴＰ
ＴＧＴＱＴＲ）とヒトＩｇＡ１のヒンジ領域のペプチド
配列ＨＰＲ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
Ｒ）を合成した（サワディー・テクノロジー社）。さら
に、受容体基質となるＭＵＣ２、ＨＰＲペプチドは１０
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）に溶かし
て、８０％ エタノール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ ７．４）に溶解したＦＩＴＣ（ＳＩＧＭＡ）
と １：１０のモル比となるように混合して、室温で
１．５時間ＦＩＴＣ標識反応を行った。反応液はＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−１５（Ａｍｅｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｃａｔ：１７−００２
０−０１）を充填したスピンカラムによる前処理とＨＰ
ＬＣ（カラムにはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ
Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３７８−６６、バッファーＡは０．０
５％ＴＦＡを含むイオン交換水、バッファーＢとしては
０．０５％ＴＦＡの２−ｐｒｏｐａｎｏｌ：ａｃｅｔｏ
ｎｉｔｒｉｌｅ＝７：３を用いた。分離にはバッファー
Ｂの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上がるように
勾配をかけた。検出条件は励起波長：４９２ｎｍ、蛍光
波長：５２０ｎｍとした。）による精製を行った。ＦＩ
ＴＣの蛍光を指標に、ＦＩＴＣ標識ＭＵＣ２ペプチド
（ＦＩＴＣ−ＭＵＣ２）は保持時間２０．２ 分で、Ｆ
ＩＴＣ標識ＨＰＲペプチド（ＦＩＴＣ−ＨＰＲ）は保持
時間２２．５分でのそれぞれ単一基質ピークとして基質
を分取した。分取した基質を１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１
１）で中和し、２時間冷凍乾燥した。このように調製し
た基質はＦＩＴＣ−ＭＵＣ２とＦＩＴＣ−ＨＰＲと命名
した。

【００２３】

【実施例６】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の受容体基質の調製
（その２） 上記５で調製したＦＩＴＣ−ＨＰＲを受容基質として、
下記７で述べた反応系を用いて、既知のＵＤＰ−Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチ
ルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）と反
応させた。反応液をＨＰＬＣ分析し、受容基質ＦＩＴＣ
−ＨＰＲ ピーク（保持時間２２．５分）と０．９分差
を示す単一の産物ピーク（保持時間２１．６分）を分取
し、冷凍乾燥後、ＭＡＬＤＩ−質量分析（Ｍａｓｓ）：
ＢＲＵＫＥＲ社、機種：ＲＥＦＬＥX）で分析した。質
量分析の結果、基質ＦＩＴＣ−ＨＰＲ（理論質量数：ｍ
／ｚ ２３７６．４実測質量数：ｍ／ｚ ２３７６．
１）に対して（図１参照）、ＨＰＬＣ分析で保持時間２
１．６分ピークの産物の実測質量数は３３９４．７ｍ／
ｚであり、基質との差は１０１８．６ｍ／ｚで、基質Ｆ
ＩＴＣ−ＨＰＲに５ヶ所Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン（ＧａｌＮＡｃ 理論質量数 ２０３）が結合され
ていることが確認された（図２参照）。ここでｍ／ｚ
３３９４．７３はベースピークであり、ｍ／ｚ ２９８
８．６５、ｍ／ｚ ３１９１．６４、はフラグメントイ
オンのピークである。M/z ３５９８．３７のピークは
測定サンプル中の夾雑物に起因するノイズピークであ
る。以後この産物はＦＩＴＣ−ＨＰＲ−Ａと命名し、Ｇ
ａｌＮＡｃ−Ｔ１０の受容体基質として用いた。なお、
図１はＦＩＴＣラベルしたＨＰＲサンプルをＨＰＬＣ分
析で保持時間２２．５分のピークとして分取し、凍結乾
燥後、ＭＡＬＤＩ−質量分析（Ｍａｓｓ）（ＢＲＵＫＥ
Ｒ社、機種：ＲＥＦＬＥＸ）で分析した結果を示すチャ
ートである。また、図２はＦＩＴＣ−ＨＰＲを受容基質
として、既知のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵
素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）と反応させて得られた反応液
をＨＰＬＣ分析し、受容体基質ＦＩＴＣ−ＨＰＲ ピー
ク（保持時間２２．５分）と０．９分差を示す単一の産
物ピーク（保持時間２１．６分）を分取し、凍結乾燥
後、ＭＡＬＤＩ−Ｍａｓｓで分析した結果を示すチャー
トである。

【００２４】

【実施例７】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の受容体基質へ活性
の検出 ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−
ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサ
ミン転移酵素としての活性を測るために、実施例５、６
で調製したＦＩＴＣ−ＭＵＣ２、ＦＩＴＣ−ＨＰＲ、Ｆ
ＩＴＣ−ＨＰＲ−Ａを受容体基質として、供与体基質
（ｄｏｎｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−Ｇ
ａｌＮＡｃを用いて酵素活性を検討した。反応液（カッ
コ内は最終濃度）は受容体基質（５ｎｍｏｌ）、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．４）（２５ｍＭ）、ＭｎＣ
ｌ₂（５ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２００ｎＭ）
から成り、これにＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０酵素液を５ｕｌ
加えて、さらにＨ₂Ｏを加えて全量２０μｌとした。上
記反応混合液を３７℃で６時間反応させ、反応終了後、
Ｈ₂Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。得
られた上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター
（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、４０μｌをＨ
ＰＬＣ分析に提供した（ＨＰＬＣ分析条件は実施例５と
同様である）。

【００２５】

【実施例８】ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０のＵＤＰ−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチル
ガラクトサミン転移酵素活性の確認 本明細書ではＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性を以下の定義に従い
２つに分類した。ＧａｌＮＡｃが結合してないペプチド
を受容体基質として反応し、いくつかのＧａｌＮＡｃが
ペプチドと結合させる触媒活性を「一次ＧａｌＮＡｃ-
Ｔ活性」と定義する。一方、すでに一ヶ所あるいは複数
箇所にＧａｌＮＡｃが結合しているペプチドを受容体基
質として、さらに新しいＧａｌＮＡｃを結合させる触媒
活性を「二次ＧａｌＮＡｃ-Ｔ活性」と定義する。上記
の実施例のＨＰＬＣ分析によりＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０が
ＦＩＴＣ−ＭＵＣ２基質ピーク（保持時間２０．２ｍｉ
ｎ）に対して、反応後は新たに反応産物由来の保持時間
１７．２ｍｉｎと１７．９ｍｉｎのピークが検出され
た。さらに、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０がＦＩＴＣ−ＨＰＲ
基質ピーク（保持時間２２．５ｍｉｎ）に対して、新た
に反応産物由来の保持時間２１．３ｍｉｎと２１．８ｍ
ｉｎの産物ピークが検出された。この結果により、Ｇａ
ｌＮＡｃ−Ｔ１０は一次ＧａｌＮＡｃＴ活性を有するこ
とが明らかになった。さらに、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０が
ＦＩＴＣ−ＨＰＲ−Ａ基質ピーク（保持時間２１．６
ｍｉｎ）に対して、新たに２０．９ｍｉｎの産物ピーク
が検出された。このことにより、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０
は二次ＧａｌＮＡｃ Ｔ活性があることを認めた。これ
らの結果を図３，４，５にまとめた。図３はＦＩＴＣ−
ＭＵＣ２を受容基質として用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０
酵素反応後、ＨＰＬＣで分析した結果を示すチャートで
ある。また、図４はＦＩＴＣ−ＨＰＲを受容基質として
用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０酵素反応後、ＨＰＬＣで分
析した測定の結果を示すチャートである。更に、図５は
ＦＩＴＣ−ＨＰＲ−Ａを受容基質として用いたＧａｌＮ
Ａｃ−Ｔ１０酵素反応後、ＨＰＬＣで分析した測定の結
果を示すチャートである。図３、４，５において、下段
のチャートは供与体基質であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを
添加せずに反応を行った結果である。上段のチャートは
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを含む反応液での反応結果を示し
ている。

【００２６】

【実施例９】種々株化細胞での発現 各種株化細胞より総ＲＮＡを抽出し、情報によりｃＤＮ
Ａを作製した。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより発現
を確認した。使用したプライマーはＧＰ−２７（５'−
ＧＡＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡ−
３'）、ＧＰ−２８（５'−ＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧ
ＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣ−３'）である。また、ＤＮＡ
ポリメラーゼとしてはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（ア
プライドバイオシステムズ社）を使用した。反応は、９
５℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を４５サイク
ル行い、２％ Ａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動で確認し
た。予想ＰＣＲ増幅産物は、２９０ ｂａｓｅであり、
このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、
増幅産物が認められない場合“−”で示した。増幅産物
はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物
が認められなかった。また、幾つかの増幅産物について
は、制限酵素処理を行ない、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０遺伝
子由来の増幅産物であることを確認している。結果は以
下の表１に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【実施例１０】正常組織での発現 ヒト正常組織での発現について各組織のＭａｒａｔｈｏ
ｎ ｃＤＮＡ（クロンテック社）を用いて発現を確認し
た。使用したプライマーはＧＰ−２７（５'−ＧＡＴＴ
ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡ−３'）、
ＧＰ−２８（５'−ＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＴＴＧ
ＧＧＡＴＣＴＧＣ−３'）である。また、酵素としては
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを使用した。反応は、９５
℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を４５サイクル
行い、２％ Ａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動により増幅を
確認した。１％ Ａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動で確認し
た。予想されるＰＣＲ増幅産物は、２９０ ｂａｓｅで
あり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”
とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。結
果は以下の表に示した。増幅産物はシングルバンドとし
て認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。
発現している組織は、全脳、肺、胎児肺、腎臓、脾臓、
乳腺、子宮、胃であった。

【００２９】

【表２】

【００３０】

【配列表】

【表３】 SEQUENCE LISTING <210> 1 <211> 557 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Met Arg Arg Ser Val Tyr Cys Lys Val Val Leu Ala Thr Ser Leu Met 1 5 10 15 Trp Val Leu Val Asp Val Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Ser Glu Cys Asn 20 25 30 Lys Cys Asp Asp Lys Lys Glu Arg Ser Leu Leu Pro Ala Leu Arg Ala 35 40 45 Val Ile Ser Arg Asn Gln Glu Gly Pro Gly Glu Met Gly Lys Ala Val 50 55 60 Leu Ile Pro Lys Asp Asp Gln Glu Lys Met Lys Glu Leu Phe Lys Ile 65 70 75 80 Asn Gln Phe Asn Leu Met Ala Ser Asp Leu Ile Ala Leu Asn Arg Ser 85 90 95 Leu Pro Asp Val Arg Leu Glu Gly Cys Lys Thr Lys Val Tyr Pro Asp 100 105 110 Glu Leu Pro Asn Thr Ser Val Val Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp 115 120 125 Ser Thr Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Ile Asn Arg Ser Pro His 130 135 140 Tyr Leu Leu Ser Glu Val Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser Glu Arg Asp 145 150 155 160 Phe Leu Lys Leu Thr Leu Glu Asn Tyr Val Lys Asn Leu Glu Val Pro 165 170 175 Val Lys Ile Ile Arg Met Glu Glu Arg Ser Gly Leu Ile Arg Ala Arg 180 185 190 Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ser Lys Gly Gln Val Ile Thr Phe Leu Asp 195 200 205 Ala His Cys Glu Cys Thr Leu Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg 210 215 220 Ile Lys Glu Asp Arg Lys Thr Val Val Cys Pro Ile Ile Asp Val Ile 225 230 235 240 Ser Asp Asp Thr Phe Glu Tyr Met Ala Gly Ser Asp Met Thr Tyr Gly 245 250 255 Gly Phe Asn Trp Lys Leu Asn Phe Arg Trp Tyr Pro Val Pro Gln Arg 260 265 270 Glu Met Asp Arg Arg Lys Gly Asp Arg Thr Leu Pro Val Arg Thr Pro 275 280 285 Thr Met Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Asp Arg Asn Tyr Phe Glu Glu 290 295 300 Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Gly Met Asp Ile Trp Gly Gly Glu Asn Leu 305 310 315 320 Glu Met Ser Phe Arg Ile Trp Gln Cys Gly Gly Ser Leu Glu Ile Val 325 330 335 Thr Cys Ser His Val Gly His Val Phe Arg Lys Ala Thr Pro Tyr Thr 340 345 350 Phe Pro Gly Gly Thr Gly His Val Ile Asn Lys Asn Asn Arg Arg Leu 355 360 365 Ala Glu Val Trp Met Asp Glu Phe Lys Asp Phe Phe Tyr Ile Ile Ser 370 375 380 Pro Gly Val Val Lys Val Asp Tyr Gly Asp Val Ser Val Arg Lys Thr 385 390 395 400 Leu Arg Glu Asn Leu Lys Cys Lys Pro Phe Ser Trp Tyr Leu Glu Asn 405 410 415 Ile Tyr Pro Asp Ser Gln Ile Pro Arg Arg Tyr Tyr Ser Leu Gly Glu 420 425 430 Ile Arg Asn Val Glu Thr Asn Gln Cys Leu Asp Asn Met Gly Arg Lys 435 440 445 Glu Asn Glu Lys Val Gly Ile Phe Asn Cys His Gly Met Gly Gly Asn 450 455 460 Gln Val Phe Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Glu Ile Arg Thr Asp Asp Leu 465 470 475 480 Cys Leu Asp Val Ser Arg Leu Asn Gly Pro Val Ile Met Leu Lys Cys 485 490 495 His His Met Arg Gly Asn Gln Leu Trp Glu Tyr Asp Ala Glu Arg Leu 500 505 510 Thr Leu Arg His Val Asn Ser Asn Gln Cys Leu Asp Glu Pro Ser Glu 515 520 525 Glu Asp Lys Met Val Pro Thr Met Gln Asp Cys Ser Gly Ser Arg Ser 530 535 540 Gln Gln Trp Leu Leu Arg Asn Met Thr Leu Gly Thr Xaa 545 550 555 <210> 2 <211＞ 1671 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> ATG AGG AGA TCT GTC TAC TGC AAG GTG GTT CTA GCC ACT TCG CTG ATG 48 Met Arg Arg Ser Val Tyr Cys Lys Val Val Leu Ala Thr Ser Leu Met 1 5 10 15 TGG GTT CTT GTT GAT GTC TTC TTA CTG CTG TAC TTC AGT GAA TGT AAC 96 Trp Val Leu Val Asp Val Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Ser Glu Cys Asn 20 25 30 AAA TGT GAT GAC AAG AAG GAG AGA TCT CTG CTG CCT GCA TTG AGG GCT 144 Lys Cys Asp Asp Lys Lys Glu Arg Ser Leu Leu Pro Ala Leu Arg Ala 35 40 45 GTT ATT TCA AGA AAC CAA GAA GGG CCA GGA GAA ATG GGA AAA GCC GTG 192 Val Ile Ser Arg Asn Gln Glu Gly Pro Gly Glu Met Gly Lys Ala Val 50 55 60 TTG ATT CCT AAA GAT GAC CAG GAG AAA ATG AAA GAG CTG TTT AAA ATC 240 Leu Ile Pro Lys Asp Asp Gln Glu Lys Met Lys Glu Leu Phe Lys Ile 65 70 75 80 AAT CAG TTT AAC CTT ATG GCC AGT GAT TTG ATT GCC CTT AAT AGA AGT 288 Asn Gln Phe Asn Leu Met Ala Ser Asp Leu Ile Ala Leu Asn Arg Ser 85 90 95 CTG CCA GAT GTA AGA TTA GAA GGA TGT AAG ACA AAA GTC TAC CCT GAT 336 Leu Pro Asp Val Arg Leu Glu Gly Cys Lys Thr Lys Val Tyr Pro Asp 100 105 110 GAA CTT CCA AAC ACA AGT GTA GTC ATT GTG TTT CAT AAT GAA GCT TGG 384 Glu Leu Pro Asn Thr Ser Val Val Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp 115 120 125 AGC ACT CTC CTT AGA ACT GTT TAC AGT GTG ATA AAT CGT TCC CCA CAC 432 Ser Thr Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Ile Asn Arg Ser Pro His 130 135 140 TAT CTA CTC TCA GAG GTC ATC TTG GTA GAT GAT GCC AGT GAA AGA GAT 480 Tyr Leu Leu Ser Glu Val Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser Glu Arg Asp 145 150 155 160 TTT CTC AAG TTG ACA TTA GAG AAT TAC GTG AAA AAT TTA GAA GTG CCA 528 Phe Leu Lys Leu Thr Leu Glu Asn Tyr Val Lys Asn Leu Glu Val Pro 165 170 175 GTA AAA ATT ATT AGG ATG GAA GAA CGC TCT GGG TTA ATA CGT GCC CGT 576 Val Lys Ile Ile Arg Met Glu Glu Arg Ser Gly Leu Ile Arg Ala Arg 180 185 190 CTT CGA GGA GCA GCT GCT TCA AAA GGG CAG GTC ATA ACT TTT CTT GAT 624 Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ser Lys Gly Gln Val Ile Thr Phe Leu Asp 195 200 205 GCA CAC TGT GAA TGC ACG TTA GGA TGG CTG GAG CCT TTG CTG GCA AGA 672 Ala His Cys Glu Cys Thr Leu Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg 210 215 220 ATA AAG GAA GAC AGG AAA ACG GTT GTC TGC CCT ATC ATT GAT GTG ATT 720 Ile Lys Glu Asp Arg Lys Thr Val Val Cys Pro Ile Ile Asp Val Ile 225 230 235 240 AGT GAT GAT ACT TTT GAA TAT ATG GCT GGG TCA GAC ATG ACT TAT GGG 768 Ser Asp Asp Thr Phe Glu Tyr Met Ala Gly Ser Asp Met Thr Tyr Gly 245 250 255 GGT TTT AAC TGG AAA CTG AAT TTC CGC TGG TAT CCT GTT CCC CAA AGA 816 Gly Phe Asn Trp Lys Leu Asn Phe Arg Trp Tyr Pro Val Pro Gln Arg 260 265 270 GAA ATG GAC AGG AGG AAA GGA GAC AGA ACA TTA CCT GTC AGG ACC CCT 864 Glu Met Asp Arg Arg Lys Gly Asp Arg Thr Leu Pro Val Arg Thr Pro 275 280 285 ACT ATG GCT GGT GGC CTA TTT TCT ATT GAC AGA AAC TAC TTT GAA GAG 912 Thr Met Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Asp Arg Asn Tyr Phe Glu Glu 290 295 300 ATA GGA ACT TAC GAT GCA GGA ATG GAT ATC TGG GGT GGA GAG AAT CTT 960 Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Gly Met Asp Ile Trp Gly Gly Glu Asn Leu 305 310 315 320 GAA ATG TCT TTT AGG ATT TGG CAA TGT GGA GGC TCC TTG GAG ATT GTT 1008 Glu Met Ser Phe Arg Ile Trp Gln Cys Gly Gly Ser Leu Glu Ile Val 325 330 335 ACT TGC TCC CAT GTT GGT CAT GTT TTT CGG AAG GCA ACT CCA TAC ACT 1056 Thr Cys Ser His Val Gly His Val Phe Arg Lys Ala Thr Pro Tyr Thr 340 345 350 TTT CCT GGT GGC ACT GGT CAT GTC ATC AAC AAG AAC AAC AGG AGA CTG 1104 Phe Pro Gly Gly Thr Gly His Val Ile Asn Lys Asn Asn Arg Arg Leu 355 360 365 GCA GAA GTT TGG ATG GAT GAA TTT AAA GAT TTC TTC TAC ATC ATA TCC 1152 Ala Glu Val Trp Met Asp Glu Phe Lys Asp Phe Phe Tyr Ile Ile Ser 370 375 380 CCA GGT GTT GTC AAA GTG GAT TAT GGA GAT GTG TCA GTC AGA AAA ACA 1200 Pro Gly Val Val Lys Val Asp Tyr Gly Asp Val Ser Val Arg Lys Thr 385 390 395 400 CTA AGA GAA AAT CTG AAG TGT AAG CCC TTT TCT TGG TAC CTA GAA AAC 1248 Leu Arg Glu Asn Leu Lys Cys Lys Pro Phe Ser Trp Tyr Leu Glu Asn 405 410 415 ATC TAT CCG GAC TCC CAG ATC CCA AGA CGT TAT TAC TCA CTT GGT GAG 1296 Ile Tyr Pro Asp Ser Gln Ile Pro Arg Arg Tyr Tyr Ser Leu Gly Glu 420 425 430 ATA AGA AAT GTT GAA ACC AAT CAG TGT TTA GAC AAC ATG GGC CGC AAG 1344 Ile Arg Asn Val Glu Thr Asn Gln Cys Leu Asp Asn Met Gly Arg Lys 435 440 445 GAA AAT GAA AAA GTG GGT ATA TTC AAC TGT CAT GGT ATG GGA GGA AAT 1392 Glu Asn Glu Lys Val Gly Ile Phe Asn Cys His Gly Met Gly Gly Asn 450 455 460 CAG GTA TTT TCT TAC ACT GCT GAC AAA GAA ATC CGA ACC GAT GAC TTG 1440 Gln Val Phe Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Glu Ile Arg Thr Asp Asp Leu 465 470 475 480 TGC TTG GAT GTT TCT AGA CTC AAT GGA CCT GTA ATC ATG TTA AAA TGC 1488 Cys Leu Asp Val Ser Arg Leu Asn Gly Pro Val Ile Met Leu Lys Cys 485 490 495 CAC CAT ATG AGA GGA AAT CAG TTA TGG GAA TAT GAT GCT GAG AGA CTC 1536 His His Met Arg Gly Asn Gln Leu Trp Glu Tyr Asp Ala Glu Arg Leu 500 505 510 ACG TTG CGA CAT GTT AAC AGT AAC CAA TGT CTC GAT GAA CCT TCT GAA 1584 Thr Leu Arg His Val Asn Ser Asn Gln Cys Leu Asp Glu Pro Ser Glu 515 520 525 GAA GAC AAA ATG GTG CCT ACA ATG CAG GAC TGT AGT GGA AGC AGA TCC 1632 Glu Asp Lys Met Val Pro Thr Met Gln Asp Cys Ser Gly Ser Arg Ser 530 535 540 CAA CAG TGG CTG CTA AGG AAC ATG ACC TTG GGC ACA TGA 1671 Gln Gln Trp Leu Leu Arg Asn Met Thr Leu Gly Thr Stop 545 550 555

【００３１】References（参考文献リスト） 1.Homa FL, Hollander, T., Lehman DJ, Thomsen, D.R.
Elhammer A.P, (1993) J. Biol Chem, 268, 12609-16. 2. White, T., Bennett, E. P, Takio, K., Sorensen,
T., Bonding, N., and Clausen, H., (1995) J. Bio C
hem., 270, 24156-65. 3.Wandall, H., Hassan, H., Mirgorodskaya, E., Kris
tensen, A., Roepstorff, P., Bennett, E.P., Nielse
n, P.A., Hollingsworth, M., Burchell, J., Papadimi
triou, J., and Clausen, H., (1997) J. Bio. Chem, 2
72, 23503-14. 4. Bennett, E.P., Hassan, H.,Mande, U., Mirgorodsk
aya, E., Roepstorff, P., Burchell, J., ., Papadimi
triou, J., Hollingsworth, M.,and Clausen, H., (199
8) J Bio Chem, 273, 30472-81 5. Bennett, E.P., Hassan, H., Mande, U., ., Hollin
gsworth, M., Akisawa,N., Ikematsu, Y., Merkx, G.,
Kessel, G., Olofsson, S., and Clausen, H.(1999) )
J. Bio. Chem, 274, 25362-70. 6. Hassan, H., Reis, C., Bennett, E.P., Mirgorodsk
aya, E., Roepstorff, P., Hollingsworth, M., Burche
ll, J., Papadimitriou, J., and Clausen, H.,(2000)
J. Bio. Chem, 275, 38197-205 7. Bennett, E.P., Hassan, H., Hollingsworth, M., a
nd Clausen, H.,(1999)FEBS Lett. 460, 266-230 8. Iwase, I., Tanaka, A., Hiki, Y., Kokubo, T.,Ish
ii-Karakasa, I., Kobyashi, Y., and Hotta, K. (199
6) J. Biochem. 120, 92-97 9. Allen, A.C., Harper, S.J., and Feehally, J.(19
95) Clin. Exp. Immunol. 100, 470-474

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＩＴＣ標識したＨＲＰをＨＰＬＣ（液体クロ
マトグラフィー）により２２．５分のピークとして分取
し、凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−Ｍａｓｓ（ＢＲＵＫＥＲ
社、機種：ＲＥＦＬＥX）で分析した結果を示すチャー
トである

【図２】ＦＩＴＣ−ＨＰＲを受容体基質として、既知の
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプ
チドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡ
ｃ−Ｔ２）と反応させて得られた反応液をＨＰＬＣ分析
し、受容体基質ＦＩＴＣ−ＨＰＲ ピーク（保持時間２
２．５分）と０．９分差を示す単一の産物ピーク（保持
時間２１．６分）を分取し、凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−
Ｍａｓｓ（ＢＲＵＫＥＲ社、機種：ＲＥＦＬＥX）で分
析した結果を示すチャートである。

【図３】ＦＩＴＣ標識したＭＵＣ２を受容体基質として
用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の酵素活性測定結果を示
す。上段は供与体基質であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添
加した反応液を用いた場合、下段は添加しなかった場合
の反応液を用いた。

【図４】ＦＩＴＣ標識したＨＰＲを受容体基質として用
いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の酵素活性測定結果を示す。
上段は供与体基質であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添加し
た反応液を用いた場合、下段は添加しなかった場合の反
応液を用いた。

【図５】ＦＩＴＣ標識したＭＵＣ２を受容体基質として
用いたＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０の酵素活性測定結果を示
す。上段は供与体基質であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添
加した反応液を用いた場合、下段は添加しなかった場合
の反応液を用いた。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (72)発明者 稲葉 二朗 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA04 DA02 EA02 GA11 HA12 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA18 QA19 QQ26 QQ42 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QX04 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA46

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ
   酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１
   若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された
   アミノ酸配列を有し、基質となるコアタンパク質あるい
   はペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−ア
   セチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をα１結合で転
   移する活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 前記タンパク質は、配列番号１に示され
   るアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１
   記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 前記タンパク質は、配列番号１に示され
   るアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項１
   記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 前記タンパク質は、配列番号１に示され
   るアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のア
   ミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列
   に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加さ
   れたアミノ酸配列を有する請求項１記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 前記タンパク質は、配列番号１に示され
   るアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれか１項に記載
   のタンパク質をコードする核酸。
7. 【請求項７】 配列番号２に示される塩基配列を有する
   核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
   る、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号２に示される塩基配列
   の１ｎｔ〜１６７１ｎｔまでの塩基配列を有する請求項
   ６記載の核酸。
9. 【請求項９】 請求項６ないし８のいずれか１項に記載
   の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することがで
   きる組換えベクター。
10. 【請求項１０】 請求項６ないし８のいずれか１項に記
    載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
11. 【請求項１１】 請求項６ないし８のいずれか１項に記
    載の核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定
    用核酸。
12. 【請求項１２】 請求項８記載の核酸中の部分領域と相
    補的な配列を有する請求項１１記載の測定用核酸。
13. 【請求項１３】 プローブ又はプライマーである請求項
    １１又は１２記載の測定用核酸。
14. 【請求項１４】 塩基数が１５塩基以上である請求項１
    ３記載の測定用核酸。
15. 【請求項１５】 請求項１１ないし１４のいずれか１項
    に記載の測定用核酸及び測定説明書を含む測定用キッ
    ト。