JPWO2003033710A1 - 新規ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、それをコードする核酸及びそれに対する抗体並びにこれらの癌若しくは腫瘍診断用途 - Google Patents
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Abstract
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸、並びに該酵素の遺伝子の発現量を指標とする癌及び／又は腫瘍、特に消化器の癌及び／又は腫瘍の診断方法が記載されている。ヒトの大腸及び胃細胞から、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素の遺伝子をクローニングして塩基配列を決定し、この酵素を発現し、さらにこの酵素に対するモノクローナル抗体を作製した。この酵素は、癌及び／又は腫瘍、特に消化器の癌又は腫瘍細胞中ではほとんどあるいは全く生産されないので、この酵素の遺伝子の発現を指標として癌及び／又は腫瘍を診断することができる。
Description
技術分野
本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸に関する。さらに本発明は、該酵素と抗原抗体反応する抗体、その癌又は腫瘍診断用途、並びに該酵素の遺伝子の発現量を指標とする癌又は腫瘍診断に関する。
背景技術
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する、コア３糖鎖（Ｎ−アセチルグルコサミニルβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素は、その活性自体は知られているものの、酵素は未だ単離、同定されていない。従って、コア３糖鎖構造を作製または製造するためには、化学合成するか、生体成分より分離するか、または、酵素学的に組織ホモジネートを使用して合成しなければならない。さらに、本酵素活性は、正常な消化管に存在するが、消化管由来の樹立細胞株では活性が消失していることが報告されている。このことは、正常な消化管に本酵素が存在するが、癌や消化管ポリープなどの異常な組織では本酵素活性が低下することが考えられ、本酵素の発現量の変化を調べることやコア３糖鎖の量を調べることにより、診断や治療においても重要であると考えられる。
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に基づく癌等の診断が可能になる。しかしながら、該酵素は、未だ精製分離もされておらず、該酵素の単離及び遺伝子の同定についての手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核酸および酵素タンパク質を発現する細胞を提供することである。また、発現該酵素タンパク質は、抗体作製用に利用でき、該酵素タンパク質の産生方法を提供するものである。さらに、発現該酵素タンパク質および該酵素タンパク質に対する抗体を用いたい免疫組織染色およびＲＩＡやＥＩＡなどの免疫測定法に利用できる。さらに、本発明の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することである。さらに、本発明の目的は、上記酵素と抗原抗体反応する抗体を提供することである。さらに、本発明は、癌又は腫瘍、とりわけ、消化器系の癌又は腫瘍の診断及びそれに用いられる試薬を提供することである。
上記の通り、目的とする酵素は、未だ単離されていないので、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではなく、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単離することは容易でないことが予想される。本願発明者は、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々の酵素遺伝子の塩基配列間に、もしも相同性の高い領域が存在していれば、目的とする酵素の遺伝子もその相同配列を有しているかもしれないと考えた。そして、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β１，３−ガラクトース転移酵素およびβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子等の塩基配列を検索した結果、相同な領域が見つかった。そこで、この相同領域にプライマーを設定してｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲでクローニングすることを基本として種々検討した結果、該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、本発明に至った。さらに、このクローニングした遺伝子を発現させて該酵素を得、これを抗原として該酵素に対するモノクローナル抗体を作製した。そして、このモノクローナル抗体を用いて大腸及び胃の癌並びにポリープを免疫組織染色したところ、該酵素は、正常な大腸及び胃では発現されているが、癌又は進行したポリープでは発現されていない場合が多いことを確認し、該酵素の遺伝子の発現量を指標にして癌又は腫瘍の診断が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸を提供する。さらに、本発明は、該測定用核酸の癌又は腫瘍の診断用途を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片並びにこれらの癌又は腫瘍の診断用途を提供する。さらに、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記酵素の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸と、上記本発明の核酸とをアニーリングすることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、上記本発明の核酸の測定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片と、試料細胞中及び／又は細胞上の上記本発明の酵素とを抗原抗体反応させ、結合した前記抗体若しくはその抗原結合性断片又は前記酵素を測定することを含む、癌及び／又は腫瘍の診断方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、上記本発明の核酸の測定用核酸製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用を提供する。
本発明により、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸が初めて提供された。また、本発明により、該核酸を測定するための核酸及び該酵素と抗原抗体反応する抗体がはじめて提供された。さらに、本発明により、該酵素遺伝子の発現量を指標とする、癌又は腫瘍、とりわけ消化器の癌又は腫瘍の簡便で正確な診断方法及びそれに用いられる測定用核酸及び抗体が初めて提供された。したがって、本発明は、消化器癌や腫瘍の診断に大いに貢献するものと期待される。
発明を実施するための最良の形態
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
下記実施例で得られた本発明のタンパク質（「ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用： Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する（ＥＣ ２．４．１．１４７、Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ−Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ → ＵＤＰ ＋ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ（ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ）
基質特異性： Ｎ−アセチルガラクトサミニル基、例えばＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ（Ｒは、タンパク質中のセリンやスレオニン等の側鎖の水酸基やｐ−ニトロフェノール等の水酸基とエーテル結合した残基）。
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１に示されるアミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２に示されている。配列２に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェント条件下（すなわち、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ，６×ＳＳＣ，０．５％ ＳＤＳ又は０．１％ ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
上記本発明の核酸を、発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記核酸を発現させることができる組換えベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知であり、市販もされている。本発明では、このような市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。また、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等により宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知であり、上記組換えベクターを用いること等により容易に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定されず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いることができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例に詳述されている。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとストリジェント条件下（上述）でハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわけ配列番号２に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長（１１５２塩基）以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。すなわち、例えば、鋳型となる被検核酸（例えば、本発明の酵素の遺伝子のｃＤＮＡ）と本発明の測定用核酸（プライマー）の一対とを、緩衝液中で、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。通常、変性工程は、９０〜９５℃、アニーリング工程は、鋳型とプライマーのＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）、伸長工程はＴａｑポリメラーゼの至適温度である７２℃で行われる。各工程は３０秒〜２分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば２５〜４０回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた鋳型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法はＰＣＲに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。核酸の標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。なお、核酸プローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、核酸プローブを被検核酸とＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、下記実施例に記載されるノーザンブロットやインサイチューハイブリダイゼーション、さらにはサザンブロット法等の周知の方法が包含される。
本発明の酵素を、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基を有する糖タンパク質、オリゴ糖又は多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ−１，３結合される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。また、消化器（胃や結腸等）由来細胞株では、細胞中の該酵素の活性が消失又は低下することが知られている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５，Ｎｏ３，３５１−３５７，１９９５ Ｖａｖａｓｓｅｕｒ，Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｊ−Ｍ．，Ｄｏｌｅ，Ｋ．，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．）ので、本発明の測定用核酸を用いて結腸細胞中の本発明酵素のｍＲＮＡ量を調べることにより、胃癌や結腸癌等の消化器癌の診断が可能になる。最近、正常大腸組織での糖鎖構造についての報告（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５８，６５７−６６４，２００１ Ｃａｐｏｎ，Ｃ．，Ｍａｅｓ，Ｅ．，Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ，Ｊ−Ｃ．，Ｌｅｆｆｌｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．）がなされた。この報告によると、正常大腸組織のムチンに結合しているグリカンは、ｃｏｒｅ３構造が主要産物であり、このｃｏｒｅ３構造から糖鎖が伸びてＳｄａ／Ｃａｄ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓを形成している。一方、大腸癌や大腸癌由来の細胞株では、ｃｏｒｅ１構造やｃｏｒｅ２が主であることが報告されている。すなわち、正常大腸組織ではｃｏｒｅ３構造の糖鎖が生理学的に非常に重要であると考えられ、ｃｏｒｅ３合成酵素（該酵素）およびｃｏｒｅ３構造の糖鎖の変動を調べることは非常に重要である。また、これらの診断に対して該酵素を用いて抗体を作製して免疫学的な検出が可能になる。
本願発明者らは、下記実施例に具体的に記載するように、上記した本発明の酵素を遺伝子工学的に生産し、これを抗原として用いて該酵素と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を作製した。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ＭＡ−１３６ Ｇ８ ＮＯ．１４４’０２．１０．１）は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき、２００２年１０月４日にＦＥＲＭ ＢＰ−８２００の受託番号で寄託されている。さらに、下記実施例に具体的に記載する通り、得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、胃及び大腸の正常組織では該酵素が検出されるのに対し、癌や異型度グループ４以上の腫瘍（ポリープ）ではほとんど検出されないことが確認された。したがって、本発明の酵素と抗原抗体反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、癌又は腫瘍、好ましくは消化器系の癌又は腫瘍、特に胃又は大腸の癌又は腫瘍、さらに好ましくは胃癌又は大腸癌の診断に用いることができる。抗体を癌又は腫瘍の診断に用いる場合、試料となる細胞中の上記酵素と、該抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定方法により、上記酵素を測定し、正常細胞における測定結果と比較し、酵素の測定量が正常細胞よりも少なければ、特に、酵素が検出されなければ、癌又は腫瘍の可能性が高いと診断することができる。免疫測定方法自体は、周知であり、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、測定形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法などがあり、用いる標識で分類すれば蛍光法、酵素法、放射法、ビオチン法等があるが、これらのいずれをも用いることができる。さらに、免疫組織染色によって診断することもできる。免疫測定方法に標識抗体を用いる場合、抗体の標識方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができる。また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）が得られることが知られているが、本発明の抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体と同様に用いることができる。
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を第１抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、本発明の酵素と抗原抗体反応する第２抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した第２抗体を測定する。第２抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより固相に結合した第２抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。なお、第１抗体と第２抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス等の粒子に本発明の抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。
また、各免疫測定に必要な試薬類も周知であり、用いる抗体に特徴があること以外は、通常の免疫測定キットを用いて免疫測定を行うことができる。例えば、通常、緩衝液、固相、標識第２抗体等が含まれる。
下記実施例に具体的に記載するように、本発明の酵素の発現量を指標として癌又は腫瘍の診断を行うことができることが確認されたので、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記本発明の酵素の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法をも提供するものである。なお、下記実施例に具体的に示されるように、本発明の診断方法により検出可能な腫瘍は、癌又は癌が強く疑われる腫瘍である。前記試料細胞としては、消化器系器官の細胞が好ましく、特に大腸又は胃由来の細胞が好ましく、これらの細胞を対象とすることで消化器の癌又は腫瘍、特に大腸又は胃の癌又は腫瘍の診断を行うことができる。遺伝子の発現量は、細胞中の、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡの量を調べることによって測定することができるし、試料細胞中で生産された酵素を、上記本発明の抗体を用いた免疫測定法により測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの量の測定は、上記した本発明の測定用核酸を用いて、上記のようにして行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
実施例１ 酵素遺伝子のクローニング及び塩基配列決定並びに発現
１．遺伝子データベースの検索とｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の塩基配列決定
既存のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β１，３−ガラクトース転移酵素（ＡＦ１１７２２２、Ｙ１５０６０、Ｙ１５０１４、ＡＢ０２６７３０、ＡＦ１４５７８４、ＡＦ１４５７８４）およびβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｙ１５０６２）遺伝子等の類似遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）：ＡＢ０４９５８４、ＡＢ０４９５８５、ＡＢ０４９５８６、ＡＢ０４５２７８、β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の配列番号：ＡＦ１１７２２２、Ｙ１５０６０、Ｙ１５０１４、ＡＢ０２６７３０、ＡＦ１４５７８４、ＡＦ１４５７８４、１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子の配列番号：Ｙ１５０６２である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
その結果、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｔｉｏｎ Ｎｏ．ＡＷ１８２８８９およびＮｏ．ＡＷ１９２１７２が見出された。さらに、ゲノム配列Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０００７５２．３が見出され、上記２つのＥＳＴが同一遺伝子であることを見出した。しかし、翻訳開始点は不明であったので、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社の大腸と胃のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡを用いてクローニングを行った。
具体的には、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーＧＰ６１（ｃｔｃｃａｇａｃａｃ ａｔｇｃｃｃａｔｇｔ ａｇｇｃ）でＰＣＲ（９４℃２０秒、６４℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行った。さらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−ＲＡＣＥ−０６（ｇｔｃｇｔｃｇｔｃｇ ｃｃｇｃｔｇａｇｃａ ｇａａａ）でｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ（９４℃２０秒、６６℃３０秒、７２℃２分を２５サイクル）を行なった。目的とするフラグメントをゲルから切りだし、常法により精製し、塩基配列を決定した（配列番号２）。
２．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現ベクターへの組込み
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現系を作成するため、まずｂｅｔａ３ＧｎＴ−６をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＦａｓｔＢａｃに組込み、さらにインビトロジェン社のＢａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作成した。以下に詳細を述べる。
ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＦ（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−０２：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ｃｃａｇｇａｇｇａｇ ａｃｇｃｃａｇａｇｇ ｇ−３’）とプライマーＲ（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−０３：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ｔｇｇｃｃｔｃａｇｇ ａｇａｃｃｃｇｇｔｇ−３’）によりＰＣＲ（９４℃２０秒、６６℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル）により再度ＤＮＡ断片を得た。目的の断片をゲルから切りだし、精製後ＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分おき反応を終了させた。
その後上記ｍｉｘ全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＯＮＲ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）を抽出・精製した。
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＨを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼｍｉｘ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６が生成される）。ｐＦＢＩＨは、ｐＦａｓｔＢａｃ１にＩｇκシグナル配列（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）とＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６個）のシーケンスを加えたもので、ＯＴ５（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ−３’）を鋳型に、プライマーＯＴ２０（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａｔ ｇｃａｔｔｔｔｃａａ ｇｔｇｃａｇ−３’）と、ＯＴ２２（５’−ｇｇａａｔｔｃｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇ−３’）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍ Ｈ１とＥｃｏ Ｒ１で挿入した。さらに、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Ｈｉｓタグは精製のため挿入した。
その後上記混合液全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）を抽出・精製した。
またｐＦＢＩＨに変えてｐＦＢＩＦでも同様に実験を行った。即ちｐＦＢＩＦはＨｉｓタグに変えて、精製用にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を入れたもので、ＯＴ３（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｇａｔｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇ−３’）を鋳型とし、プライマーＯＴ２０（上記と配列同じ）と、ＯＴ２１（５’−ｇｇａａｔ ｔｃｔｔｇｔ ｃａｔｃｇ ｔｃｇｔｃ ｃｔｔｇ−３’）によって得られたＤＮＡ断片を上記と同様にＢａｍ Ｈ１とＥｃｏ Ｒ１で挿入し、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。
Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作成
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６又はｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６とｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにｂｅｔａ３ＧｎＴ−６その他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへとりこまれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
即ち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６又はｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
３．Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的配列が挿入していることを確認した後、このＢａｃｍｉｄを昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５細胞／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着した。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ）精製したＢａｃｍｉｄ ＤＮＡ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ）ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＡおよびＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ ８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７細胞／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを８００μｌを添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７細胞／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６×１０５細胞／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次から三次までのセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするｂｅｔａ３ＧｎＴ−６タンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたｂｅｔａ３ＧｎＴ−６にはモノクローナル抗体６−Ｈｉｓ（ＭＭＳ−１５６Ｐ、ＣＯＶＡＮＣＥ社）、ＦＬＡＧ配列のついたｂｅｔａ３ＧｎＴ−６には抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
６Ｈｉｓ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６、ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６ともに４０Ｋ、４５Ｋの位置にバンドが検出された。
４．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６のレジン精製
上記三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボトルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５０００ｒｐｍ１０分を２回）ペレットをソニケーションした（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量（ＢＩＯ−ＲＡＤ社ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）し、タンパク量を調整の上ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッテイングでｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相対的発現量の多い、ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の上清を使用することとした。
四次感染のＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ社）（５０μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ ５分４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ ５分４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍＭ ＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液）とした。
５．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の受容体基質の探索
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素類およびβ１，３−ガラクトシル転移酵素類と比較して分子進化学的に解析した結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素類に分類された。そこで、第一に供与体基質（ｄｏｎｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて検討した。
以下の反応系を用いて、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、ｐＮｐ−α−Ｇｌｃ ｐＮｐ−β−Ｇｌｃ ｐＮｐ−α−ＧｌｃＮＡｃ ｐＮｐ−β−ＧｌｃＮＡｃ ｐＮｐ−α−Ｇａｌ ｐＮｐ−β−Ｇａｌ ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ ｐＮｐ−α−Ｘｙｌ ｐＮｐ−β−Ｘｙｌ ｐＮｐ−α−Ｆｕｃ Ｂｚ−α−Ｍａｎ Ｂｚ−α−ＭａｎＮＡｃ ＬａｃＣｅｒ ＧａｌＣｅｒｔｙｐｅｌ Ｂｚ−β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（すべてＳｉｇｍａ社）を用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（１０ｎｍｏｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（５０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡＣ（４８０μＭ）、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡＣ（１７５ｎＣｉ）、から成り、これにｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液を５μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量２５μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で一昼夜反応させ、反応終了後、Ｈ２Ｏを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨ２Ｏにて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。溶出液を４０℃のヒートブロックにて加熱しながら、窒素ガスを吹き付け蒸発乾固させた。これに、メタノール２０μｌを添加し、ＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にプロットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６５：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて生成物に取り込まれている放射線の量を測定した。
その結果、ｐＮｐ−β−Ｇａｌがごくわずかに反応し、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃには強い反応が示され、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６がＮ−アセチルグルコサミニルβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆された。
６．Ｎ−アセチルガラクトサミニル−セリン（ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒ）を受容体基質とした活性の確認
上記の実験でｂｅｔａ３ＧｎＴ−６がコア３糖鎖（Ｎ−アセチルグルコサミニルβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆されたため、ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒを受容体基質として再度上記実験を行ったところ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃに対する場合と同様の強い反応が示され、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６が新規のコア３糖鎖合成酵素であることが示された。具体的には、ＧａｌＮＡｃ α１−３ＳｅｒのＳｅｒのアミノ残基にＣｙ５標識（Ｃｙ５ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を行ない、ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム使用）にてＣｙ５の蛍光を指標にＣｙ５標識ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒを分取して凍結乾燥後、受容体基質として用いた。反応系は実施例５と同様である。反応終了後、反応液１０μｌをＨＰＬＣにて分析した。供与体基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を加えたものは、Ｃｙ５標識ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒ（受容体基質）の分のピークを検出した。これに対して、供与体基質を加えたものは、受容体基質のピークと 分に新たなピークを確認した。すなわち、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、ＧａｌＮＡｃ α１−３ＳｅｒのＧａｌＮＡｃにＧｌｃＮＡｃ転移活性を示した。
７．Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒとの結合様式の解析
反応溶液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＣＦ５４、１ｍＭ ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ、１．５ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液５μｌ加え、全量２０μｌで、３７℃で１６時間反応した。反応終了後、ＨＰＬＣにて分析を行なった。使用したカラムは、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８，２５０×４ｍｍ，溶媒はアセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝１０：９０、検出は２１０ｎｍの吸収で行なった。また、標品としてＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ（ｃｏｒｅ３構造）、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ（ｃｏｒｅ６構造）を使用した（Ｓｉｇｍａ社）。その結果、標品は、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃは２３．５分、ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐは１８．６分、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐは２０分に溶出された。ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６反応液は、２３．５分のピーク（ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ）と１８．６分のピーク（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ）が認められた。すなわち、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素であった。
８．種々株化細胞での発現
各種株化細胞より総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより発現を確認した。使用したプライマーはＧＰ−５７（５’−ｇｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃａｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｇ−３’）、ＧＰ−６０（５’−ａｇａｇｃｔｇｇｇｃ ａｇｇａｃｇｔａａｇ ｇｔａｃ−３’）である。使用した酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。反応は、９５℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を４５サイクルで行い、２％アガロースゲル電気泳動で確認した。予想ＰＣＲ増幅産物は、３２３塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。また、幾つかの増幅産物については、制限酵素処理を行ない、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６遺伝子由来の増幅産物であることを確認している。結果は以下の表１に示した。
９．正常組織での発現
ヒト正常組織での発現について各組織のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ（クロンテック社）を用いて発現を確認した。使用したプライマーはＧＰ−５７（５’−ｇｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃａｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｇ−３’）、ＧＰ−６０（５’−ａｇａｇｃｔｇｇｇｃ ａｇｇａｃｇｔａａｇ ｇｔａｃ−３’）である。使用した酵素はＬＡＴａｑ（ＴａｋａＲａ）を使用した。反応は、９５℃２０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクルで行い、１％アガロースゲル電気泳動で確認した。予想ＰＣＲ増幅産物は、３２３塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。結果は以下の表２に示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。発現している組織は、食道、胃、大腸、であった。
実施例２ 抗酵素モノクローナル抗体の作製
（１）マウスの免疫
実施例１で得られたＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をＴＡＬＯＮ（商標）ＣｅｌｌＴｈｒｕ（クロンテック社）ビーズを充填したカラムで精製して抗原として使用した。常法により調整した免疫用抗原エマルジョンをマウスに皮下注射し、その後２週間おきに３回追加免疫した。
（２）ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１を使用し、当日５−１０×１０７個の細胞が得られるように融合の１週間前に培養を開始した。当日細胞を４℃１２００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿にＲＰＭＩ１６４０を加え再度懸濁と遠心を行い、ＲＰＭＩ１６４０ ２０ｍｌを加え懸濁させ細胞数を数えた。
（３）脾細胞の調製
免疫したマウス２匹から取り出した脾臓をステンレスメッシュ上において細胞をかき出し、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）でステンレスメッシュを洗って細胞を培養皿に落とした。グラスウールで細胞懸濁液を濾過し、濾液を４℃１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、そこに４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を加え細胞数を数えた。
（４）細胞融合
ミエローマ細胞と脾細胞が１対５になるように混ぜ、４℃１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除きＰＥＧ−イーグルＭＥＭ１ｍｌを徐々に加え細胞をほぐし、その後３７℃のＲＰＭＩ１６４０ ３０ｍｌを徐々に添加した。遠心（８００ｒｐｍ、室温、５分）後上清を除き、３７℃の１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を１０ｍｌ加え、３７℃で６０分放置後蓋をしめて天地にゆっくりと振って沈殿をほぐした。１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を４０ｍｌ加え、２５ｍｌづつ分注し、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を加え５０ｍｌとした。先端をカットしたクリスタルチップで９６穴プレート１０枚に１００μｌずつまき、３７℃で一晩培養した。
（５）ＨＡＴ選択
融合の翌日、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０に５０×ＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ社）を加え２×ＨＡＴを作製し、各ウエルに１００μｌずつ加えた。その後２、３日おきに１００μｌずつ培地を交換した。
（６）スクリーニング及びクローニング
融合１０日後から実施例１で得られた発現タンパクＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６を抗原としたＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを開始した。ＥＬＩＳＡ法は具体的には次のようにして行った。ＴＡＬＯＮ（商標）ＣｅｌｌＴｈｒｕ（クロンテック社）ビーズを充填したカラムで精製したＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１μｇ／ｍｌに調整して９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で１６時間静置した。その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに精製水で４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）を２００μｌ添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに、培養上清を５０μｌ添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに、抗マウスイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体・アルカリフォスファターゼ標識（ダコ）５０μｇ／ｍｌを５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。発色は、ＡＬＰローゼ・シノテスト（シノテスト）を用い基質液５０μｌ／ｗｅｌｌ添加して室温にて２０分間静置した後、呈色液５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて、５１０−６２０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．１以上を陽性とした。
その結果、９６０ウエル中１２６ウエルに陽性が認められた。この１２６種類の培養上清を用いて、実施例１で得られたＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６を抗原に大腸の組織標本を用いて免疫染色を行い、さらに、ウエスタンブロット法を行なった。免疫染色の方法は一般的なＤＡＢ法（ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ユニバーサル（マウス）、ダコ社）を用いて次のように行った。大腸組織はホルマリンにて固定して定法に従いパラフィン切片を作製した。内因性パーオキシダーゼブロッキング試薬に浸漬、３０分間室温にて静置した。その後、ＴＢＳにて試薬を洗い流してトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に室温にて５分間浸漬した。各培養上清を１００μｌ切片に添加して４℃にて一晩インキュベーションした。その後、ＴＢＳにて培養上清を洗い流してＴＢＳに浸漬（５分間、３回）して洗浄した。続いて、ＥＶＩＳＩＯＮ＋ポリマー試薬を切片に滴下して室温にて６０分間インキュベーシンした。ＴＢＳにて試薬を洗い流してＴＢＳに浸漬（５分間、３回）して洗浄した。ジアミノベンチジン溶液に浸漬して１０分間静置した。精製水で試薬を洗い流して精製水に浸漬した。さらに、ヘマトキシリン溶液に７秒間浸漬した後、流水にて５分間洗浄した。脱水、透徹、封入後顕微鏡にて観察した。また、ウェスタンブロットは具体的に次のようにして行った。ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動してＰＶＤＦ膜に転写した後、精製水にて４倍に希釈したブロックエースにてブロッキングした。このＰＶＤＦ膜を細い短冊状に切断し、ＰＶＤＦ膜を培養液に浸漬して室温にて１時間反応した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて３回洗浄した。これに、抗マウスイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体・ハーオキシダーゼ標識（ダコ）５０μｇ／ｍｌを添加して室温にて１時間反応した。その後、５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて２回、ＰＢＳにて１回洗浄した。発色はイムノステインＨＲＰ−１０００キット（ＫＯＮＩＣＡ）を用いて行った。
その結果、３種類に陽性反応が認められた。そこで、この選択した３種類のハイブリドーマ細胞群より、限界希釈法によるクローニング操作を行なった。即ち、ウエル当たり０．３細胞になるようにハイブリドーマを希釈して１０日間培養し、顕微鏡下、１ウエルに１コロニーであることを確認して、その培養上清を再度上記ＥＬＩＳＡ法で陽性コロニーをスクリーニングした。この操作を再度行い、２個の抗ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６抗体産生クローンを得た。得られた２クローンのハイブリドーマのうちの一方をＭＡ−１３６ Ｇ８ ＮＯ．１４４’０２．１０．１と命名し、上記の通り、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき寄託した。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００である。
実施例３ モノクローナル抗体の反応性の確認
約２×１０７細胞／ｍｌの前述のモノクローナル抗体産生細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００）をＢＡＬＢ／Ｃおよびヌードマウスの腹腔内に投与した。２週間後腹水を採取し、３０％硫安沈殿及びＰＢＳによる透析を行い、実施例２と同様にして、ウエスタンブロッテイングおよび組織免疫染色法で確認した。その結果、大腸および胃の粘膜上皮細胞に強い反応性を認めた。
実施例４ モノクローナル抗体を用いた癌及び腫瘍の検出
上記モノクローナル抗体（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００）を用いて、実施例２と同様にして、胃癌、大腸癌、および家族性大腸ポリポーシスの組織の染色を行なった。その結果、胃および大腸組織の正常組織ではｂｅｔａ３Ｇ−Ｔ６のモノクローナル抗体により染色が認められ、ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は、胃の粘膜上皮細胞のゴルジ体領域が、大腸粘膜の杯細胞のゴルジ体領域発現していることが確認できた。胃癌および大腸癌の組織においてはｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は完全に消失していた。
家族性大腸ポリポーシスの組織は、異型度からグループ１〜５に分類した。グループ１〜５の分類基準は次のとおりである。
グループ１：正常組織、および異型を示さない良性（非腫瘍性）病変
グループ２：異型を示すが良性（非腫瘍性）と判定される病変
グループ３：良性（非腫瘍性）と悪性の境界領域の病変
グループ４：癌が強く疑われる病変
グループ５：癌
免疫組織染色の結果、グループ４以上の腫瘍性ポリープ部分ではｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は完全に消失していた。組織染色の結果は以下の表３に示した。
【配列表】
本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸に関する。さらに本発明は、該酵素と抗原抗体反応する抗体、その癌又は腫瘍診断用途、並びに該酵素の遺伝子の発現量を指標とする癌又は腫瘍診断に関する。
背景技術
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する、コア３糖鎖（Ｎ−アセチルグルコサミニルβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素は、その活性自体は知られているものの、酵素は未だ単離、同定されていない。従って、コア３糖鎖構造を作製または製造するためには、化学合成するか、生体成分より分離するか、または、酵素学的に組織ホモジネートを使用して合成しなければならない。さらに、本酵素活性は、正常な消化管に存在するが、消化管由来の樹立細胞株では活性が消失していることが報告されている。このことは、正常な消化管に本酵素が存在するが、癌や消化管ポリープなどの異常な組織では本酵素活性が低下することが考えられ、本酵素の発現量の変化を調べることやコア３糖鎖の量を調べることにより、診断や治療においても重要であると考えられる。
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に基づく癌等の診断が可能になる。しかしながら、該酵素は、未だ精製分離もされておらず、該酵素の単離及び遺伝子の同定についての手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核酸および酵素タンパク質を発現する細胞を提供することである。また、発現該酵素タンパク質は、抗体作製用に利用でき、該酵素タンパク質の産生方法を提供するものである。さらに、発現該酵素タンパク質および該酵素タンパク質に対する抗体を用いたい免疫組織染色およびＲＩＡやＥＩＡなどの免疫測定法に利用できる。さらに、本発明の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することである。さらに、本発明の目的は、上記酵素と抗原抗体反応する抗体を提供することである。さらに、本発明は、癌又は腫瘍、とりわけ、消化器系の癌又は腫瘍の診断及びそれに用いられる試薬を提供することである。
上記の通り、目的とする酵素は、未だ単離されていないので、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではなく、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単離することは容易でないことが予想される。本願発明者は、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々の酵素遺伝子の塩基配列間に、もしも相同性の高い領域が存在していれば、目的とする酵素の遺伝子もその相同配列を有しているかもしれないと考えた。そして、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β１，３−ガラクトース転移酵素およびβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子等の塩基配列を検索した結果、相同な領域が見つかった。そこで、この相同領域にプライマーを設定してｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲでクローニングすることを基本として種々検討した結果、該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、本発明に至った。さらに、このクローニングした遺伝子を発現させて該酵素を得、これを抗原として該酵素に対するモノクローナル抗体を作製した。そして、このモノクローナル抗体を用いて大腸及び胃の癌並びにポリープを免疫組織染色したところ、該酵素は、正常な大腸及び胃では発現されているが、癌又は進行したポリープでは発現されていない場合が多いことを確認し、該酵素の遺伝子の発現量を指標にして癌又は腫瘍の診断が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸を提供する。さらに、本発明は、該測定用核酸の癌又は腫瘍の診断用途を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片並びにこれらの癌又は腫瘍の診断用途を提供する。さらに、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記酵素の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸と、上記本発明の核酸とをアニーリングすることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、上記本発明の核酸の測定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片と、試料細胞中及び／又は細胞上の上記本発明の酵素とを抗原抗体反応させ、結合した前記抗体若しくはその抗原結合性断片又は前記酵素を測定することを含む、癌及び／又は腫瘍の診断方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、上記本発明の核酸の測定用核酸製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸測定用核酸の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用を提供する。
本発明により、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸が初めて提供された。また、本発明により、該核酸を測定するための核酸及び該酵素と抗原抗体反応する抗体がはじめて提供された。さらに、本発明により、該酵素遺伝子の発現量を指標とする、癌又は腫瘍、とりわけ消化器の癌又は腫瘍の簡便で正確な診断方法及びそれに用いられる測定用核酸及び抗体が初めて提供された。したがって、本発明は、消化器癌や腫瘍の診断に大いに貢献するものと期待される。
発明を実施するための最良の形態
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
下記実施例で得られた本発明のタンパク質（「ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用： Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する（ＥＣ ２．４．１．１４７、Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ−Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ → ＵＤＰ ＋ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ（ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ）
基質特異性： Ｎ−アセチルガラクトサミニル基、例えばＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ（Ｒは、タンパク質中のセリンやスレオニン等の側鎖の水酸基やｐ−ニトロフェノール等の水酸基とエーテル結合した残基）。
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１に示されるアミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２に示されている。配列２に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェント条件下（すなわち、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ，６×ＳＳＣ，０．５％ ＳＤＳ又は０．１％ ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
上記本発明の核酸を、発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記核酸を発現させることができる組換えベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知であり、市販もされている。本発明では、このような市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。また、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等により宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知であり、上記組換えベクターを用いること等により容易に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定されず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いることができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例に詳述されている。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとストリジェント条件下（上述）でハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわけ配列番号２に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長（１１５２塩基）以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。すなわち、例えば、鋳型となる被検核酸（例えば、本発明の酵素の遺伝子のｃＤＮＡ）と本発明の測定用核酸（プライマー）の一対とを、緩衝液中で、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。通常、変性工程は、９０〜９５℃、アニーリング工程は、鋳型とプライマーのＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）、伸長工程はＴａｑポリメラーゼの至適温度である７２℃で行われる。各工程は３０秒〜２分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば２５〜４０回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた鋳型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法はＰＣＲに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。核酸の標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。なお、核酸プローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、核酸プローブを被検核酸とＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、下記実施例に記載されるノーザンブロットやインサイチューハイブリダイゼーション、さらにはサザンブロット法等の周知の方法が包含される。
本発明の酵素を、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基を有する糖タンパク質、オリゴ糖又は多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ−１，３結合される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。また、消化器（胃や結腸等）由来細胞株では、細胞中の該酵素の活性が消失又は低下することが知られている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５，Ｎｏ３，３５１−３５７，１９９５ Ｖａｖａｓｓｅｕｒ，Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｊ−Ｍ．，Ｄｏｌｅ，Ｋ．，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．）ので、本発明の測定用核酸を用いて結腸細胞中の本発明酵素のｍＲＮＡ量を調べることにより、胃癌や結腸癌等の消化器癌の診断が可能になる。最近、正常大腸組織での糖鎖構造についての報告（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５８，６５７−６６４，２００１ Ｃａｐｏｎ，Ｃ．，Ｍａｅｓ，Ｅ．，Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ，Ｊ−Ｃ．，Ｌｅｆｆｌｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．）がなされた。この報告によると、正常大腸組織のムチンに結合しているグリカンは、ｃｏｒｅ３構造が主要産物であり、このｃｏｒｅ３構造から糖鎖が伸びてＳｄａ／Ｃａｄ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓを形成している。一方、大腸癌や大腸癌由来の細胞株では、ｃｏｒｅ１構造やｃｏｒｅ２が主であることが報告されている。すなわち、正常大腸組織ではｃｏｒｅ３構造の糖鎖が生理学的に非常に重要であると考えられ、ｃｏｒｅ３合成酵素（該酵素）およびｃｏｒｅ３構造の糖鎖の変動を調べることは非常に重要である。また、これらの診断に対して該酵素を用いて抗体を作製して免疫学的な検出が可能になる。
本願発明者らは、下記実施例に具体的に記載するように、上記した本発明の酵素を遺伝子工学的に生産し、これを抗原として用いて該酵素と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を作製した。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ＭＡ−１３６ Ｇ８ ＮＯ．１４４’０２．１０．１）は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき、２００２年１０月４日にＦＥＲＭ ＢＰ−８２００の受託番号で寄託されている。さらに、下記実施例に具体的に記載する通り、得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、胃及び大腸の正常組織では該酵素が検出されるのに対し、癌や異型度グループ４以上の腫瘍（ポリープ）ではほとんど検出されないことが確認された。したがって、本発明の酵素と抗原抗体反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、癌又は腫瘍、好ましくは消化器系の癌又は腫瘍、特に胃又は大腸の癌又は腫瘍、さらに好ましくは胃癌又は大腸癌の診断に用いることができる。抗体を癌又は腫瘍の診断に用いる場合、試料となる細胞中の上記酵素と、該抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定方法により、上記酵素を測定し、正常細胞における測定結果と比較し、酵素の測定量が正常細胞よりも少なければ、特に、酵素が検出されなければ、癌又は腫瘍の可能性が高いと診断することができる。免疫測定方法自体は、周知であり、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、測定形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法などがあり、用いる標識で分類すれば蛍光法、酵素法、放射法、ビオチン法等があるが、これらのいずれをも用いることができる。さらに、免疫組織染色によって診断することもできる。免疫測定方法に標識抗体を用いる場合、抗体の標識方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができる。また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）が得られることが知られているが、本発明の抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体と同様に用いることができる。
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を第１抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、本発明の酵素と抗原抗体反応する第２抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した第２抗体を測定する。第２抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより固相に結合した第２抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。なお、第１抗体と第２抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス等の粒子に本発明の抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。
また、各免疫測定に必要な試薬類も周知であり、用いる抗体に特徴があること以外は、通常の免疫測定キットを用いて免疫測定を行うことができる。例えば、通常、緩衝液、固相、標識第２抗体等が含まれる。
下記実施例に具体的に記載するように、本発明の酵素の発現量を指標として癌又は腫瘍の診断を行うことができることが確認されたので、本発明は、生体から分離された試料細胞中における、上記本発明の酵素の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌又は腫瘍の診断方法をも提供するものである。なお、下記実施例に具体的に示されるように、本発明の診断方法により検出可能な腫瘍は、癌又は癌が強く疑われる腫瘍である。前記試料細胞としては、消化器系器官の細胞が好ましく、特に大腸又は胃由来の細胞が好ましく、これらの細胞を対象とすることで消化器の癌又は腫瘍、特に大腸又は胃の癌又は腫瘍の診断を行うことができる。遺伝子の発現量は、細胞中の、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡの量を調べることによって測定することができるし、試料細胞中で生産された酵素を、上記本発明の抗体を用いた免疫測定法により測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの量の測定は、上記した本発明の測定用核酸を用いて、上記のようにして行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
実施例１ 酵素遺伝子のクローニング及び塩基配列決定並びに発現
１．遺伝子データベースの検索とｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の塩基配列決定
既存のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、β１，３−ガラクトース転移酵素（ＡＦ１１７２２２、Ｙ１５０６０、Ｙ１５０１４、ＡＢ０２６７３０、ＡＦ１４５７８４、ＡＦ１４５７８４）およびβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｙ１５０６２）遺伝子等の類似遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）：ＡＢ０４９５８４、ＡＢ０４９５８５、ＡＢ０４９５８６、ＡＢ０４５２７８、β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の配列番号：ＡＦ１１７２２２、Ｙ１５０６０、Ｙ１５０１４、ＡＢ０２６７３０、ＡＦ１４５７８４、ＡＦ１４５７８４、１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子の配列番号：Ｙ１５０６２である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
その結果、ＥＳＴ配列Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｔｉｏｎ Ｎｏ．ＡＷ１８２８８９およびＮｏ．ＡＷ１９２１７２が見出された。さらに、ゲノム配列Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０００７５２．３が見出され、上記２つのＥＳＴが同一遺伝子であることを見出した。しかし、翻訳開始点は不明であったので、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社の大腸と胃のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡを用いてクローニングを行った。
具体的には、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーＧＰ６１（ｃｔｃｃａｇａｃａｃ ａｔｇｃｃｃａｔｇｔ ａｇｇｃ）でＰＣＲ（９４℃２０秒、６４℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行った。さらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−ＲＡＣＥ−０６（ｇｔｃｇｔｃｇｔｃｇ ｃｃｇｃｔｇａｇｃａ ｇａａａ）でｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ（９４℃２０秒、６６℃３０秒、７２℃２分を２５サイクル）を行なった。目的とするフラグメントをゲルから切りだし、常法により精製し、塩基配列を決定した（配列番号２）。
２．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現ベクターへの組込み
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現系を作成するため、まずｂｅｔａ３ＧｎＴ−６をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＦａｓｔＢａｃに組込み、さらにインビトロジェン社のＢａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作成した。以下に詳細を述べる。
ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＦ（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−０２：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ｃｃａｇｇａｇｇａｇ ａｃｇｃｃａｇａｇｇ ｇ−３’）とプライマーＲ（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６−０３：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ｔｇｇｃｃｔｃａｇｇ ａｇａｃｃｃｇｇｔｇ−３’）によりＰＣＲ（９４℃２０秒、６６℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル）により再度ＤＮＡ断片を得た。目的の断片をゲルから切りだし、精製後ＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分おき反応を終了させた。
その後上記ｍｉｘ全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＯＮＲ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）を抽出・精製した。
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＨを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼｍｉｘ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６が生成される）。ｐＦＢＩＨは、ｐＦａｓｔＢａｃ１にＩｇκシグナル配列（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）とＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６個）のシーケンスを加えたもので、ＯＴ５（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ−３’）を鋳型に、プライマーＯＴ２０（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａｔ ｇｃａｔｔｔｔｃａａ ｇｔｇｃａｇ−３’）と、ＯＴ２２（５’−ｇｇａａｔｔｃｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇ−３’）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍ Ｈ１とＥｃｏ Ｒ１で挿入した。さらに、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Ｈｉｓタグは精製のため挿入した。
その後上記混合液全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）を抽出・精製した。
またｐＦＢＩＨに変えてｐＦＢＩＦでも同様に実験を行った。即ちｐＦＢＩＦはＨｉｓタグに変えて、精製用にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を入れたもので、ＯＴ３（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｇａｔｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇ−３’）を鋳型とし、プライマーＯＴ２０（上記と配列同じ）と、ＯＴ２１（５’−ｇｇａａｔ ｔｃｔｔｇｔ ｃａｔｃｇ ｔｃｇｔｃ ｃｔｔｇ−３’）によって得られたＤＮＡ断片を上記と同様にＢａｍ Ｈ１とＥｃｏ Ｒ１で挿入し、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。
Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作成
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６又はｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６とｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにｂｅｔａ３ＧｎＴ−６その他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへとりこまれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
即ち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＨ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６又はｐＦＢＩＦ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
３．Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的配列が挿入していることを確認した後、このＢａｃｍｉｄを昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５細胞／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着した。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ）精製したＢａｃｍｉｄ ＤＮＡ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ）ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＡおよびＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ ８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７細胞／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを８００μｌを添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７細胞／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６×１０５細胞／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次から三次までのセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするｂｅｔａ３ＧｎＴ−６タンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたｂｅｔａ３ＧｎＴ−６にはモノクローナル抗体６−Ｈｉｓ（ＭＭＳ−１５６Ｐ、ＣＯＶＡＮＣＥ社）、ＦＬＡＧ配列のついたｂｅｔａ３ＧｎＴ−６には抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
６Ｈｉｓ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６、ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６ともに４０Ｋ、４５Ｋの位置にバンドが検出された。
４．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６のレジン精製
上記三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボトルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５０００ｒｐｍ１０分を２回）ペレットをソニケーションした（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量（ＢＩＯ−ＲＡＤ社ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）し、タンパク量を調整の上ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッテイングでｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相対的発現量の多い、ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の上清を使用することとした。
四次感染のＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ社）（５０μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ ５分４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ ５分４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍＭ ＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液）とした。
５．ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の受容体基質の探索
ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素類およびβ１，３−ガラクトシル転移酵素類と比較して分子進化学的に解析した結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素類に分類された。そこで、第一に供与体基質（ｄｏｎｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて検討した。
以下の反応系を用いて、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６の受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、ｐＮｐ−α−Ｇｌｃ ｐＮｐ−β−Ｇｌｃ ｐＮｐ−α−ＧｌｃＮＡｃ ｐＮｐ−β−ＧｌｃＮＡｃ ｐＮｐ−α−Ｇａｌ ｐＮｐ−β−Ｇａｌ ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ ｐＮｐ−α−Ｘｙｌ ｐＮｐ−β−Ｘｙｌ ｐＮｐ−α−Ｆｕｃ Ｂｚ−α−Ｍａｎ Ｂｚ−α−ＭａｎＮＡｃ ＬａｃＣｅｒ ＧａｌＣｅｒｔｙｐｅｌ Ｂｚ−β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（すべてＳｉｇｍａ社）を用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（１０ｎｍｏｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（５０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡＣ（４８０μＭ）、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡＣ（１７５ｎＣｉ）、から成り、これにｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液を５μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量２５μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で一昼夜反応させ、反応終了後、Ｈ２Ｏを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨ２Ｏにて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。溶出液を４０℃のヒートブロックにて加熱しながら、窒素ガスを吹き付け蒸発乾固させた。これに、メタノール２０μｌを添加し、ＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にプロットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６５：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて生成物に取り込まれている放射線の量を測定した。
その結果、ｐＮｐ−β−Ｇａｌがごくわずかに反応し、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃには強い反応が示され、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６がＮ−アセチルグルコサミニルβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆された。
６．Ｎ−アセチルガラクトサミニル−セリン（ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒ）を受容体基質とした活性の確認
上記の実験でｂｅｔａ３ＧｎＴ−６がコア３糖鎖（Ｎ−アセチルグルコサミニルβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆されたため、ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒを受容体基質として再度上記実験を行ったところ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃに対する場合と同様の強い反応が示され、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６が新規のコア３糖鎖合成酵素であることが示された。具体的には、ＧａｌＮＡｃ α１−３ＳｅｒのＳｅｒのアミノ残基にＣｙ５標識（Ｃｙ５ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ Ｐａｃｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を行ない、ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム使用）にてＣｙ５の蛍光を指標にＣｙ５標識ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒを分取して凍結乾燥後、受容体基質として用いた。反応系は実施例５と同様である。反応終了後、反応液１０μｌをＨＰＬＣにて分析した。供与体基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を加えたものは、Ｃｙ５標識ＧａｌＮＡｃ α１−３Ｓｅｒ（受容体基質）の分のピークを検出した。これに対して、供与体基質を加えたものは、受容体基質のピークと 分に新たなピークを確認した。すなわち、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、ＧａｌＮＡｃ α１−３ＳｅｒのＧａｌＮＡｃにＧｌｃＮＡｃ転移活性を示した。
７．Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒとの結合様式の解析
反応溶液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＣＦ５４、１ｍＭ ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ、１．５ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６酵素液５μｌ加え、全量２０μｌで、３７℃で１６時間反応した。反応終了後、ＨＰＬＣにて分析を行なった。使用したカラムは、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８，２５０×４ｍｍ，溶媒はアセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝１０：９０、検出は２１０ｎｍの吸収で行なった。また、標品としてＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ（ｃｏｒｅ３構造）、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ（ｃｏｒｅ６構造）を使用した（Ｓｉｇｍａ社）。その結果、標品は、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃは２３．５分、ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐは１８．６分、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐは２０分に溶出された。ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６反応液は、２３．５分のピーク（ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ）と１８．６分のピーク（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐ）が認められた。すなわち、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有する新規な酵素であった。
８．種々株化細胞での発現
各種株化細胞より総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより発現を確認した。使用したプライマーはＧＰ−５７（５’−ｇｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃａｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｇ−３’）、ＧＰ−６０（５’−ａｇａｇｃｔｇｇｇｃ ａｇｇａｃｇｔａａｇ ｇｔａｃ−３’）である。使用した酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。反応は、９５℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を４５サイクルで行い、２％アガロースゲル電気泳動で確認した。予想ＰＣＲ増幅産物は、３２３塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。また、幾つかの増幅産物については、制限酵素処理を行ない、ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６遺伝子由来の増幅産物であることを確認している。結果は以下の表１に示した。
ヒト正常組織での発現について各組織のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ（クロンテック社）を用いて発現を確認した。使用したプライマーはＧＰ−５７（５’−ｇｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃａｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｇ−３’）、ＧＰ−６０（５’−ａｇａｇｃｔｇｇｇｃ ａｇｇａｃｇｔａａｇ ｇｔａｃ−３’）である。使用した酵素はＬＡＴａｑ（ＴａｋａＲａ）を使用した。反応は、９５℃２０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクルで行い、１％アガロースゲル電気泳動で確認した。予想ＰＣＲ増幅産物は、３２３塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。結果は以下の表２に示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。発現している組織は、食道、胃、大腸、であった。
（１）マウスの免疫
実施例１で得られたＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をＴＡＬＯＮ（商標）ＣｅｌｌＴｈｒｕ（クロンテック社）ビーズを充填したカラムで精製して抗原として使用した。常法により調整した免疫用抗原エマルジョンをマウスに皮下注射し、その後２週間おきに３回追加免疫した。
（２）ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１を使用し、当日５−１０×１０７個の細胞が得られるように融合の１週間前に培養を開始した。当日細胞を４℃１２００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿にＲＰＭＩ１６４０を加え再度懸濁と遠心を行い、ＲＰＭＩ１６４０ ２０ｍｌを加え懸濁させ細胞数を数えた。
（３）脾細胞の調製
免疫したマウス２匹から取り出した脾臓をステンレスメッシュ上において細胞をかき出し、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）でステンレスメッシュを洗って細胞を培養皿に落とした。グラスウールで細胞懸濁液を濾過し、濾液を４℃１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、そこに４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を加え細胞数を数えた。
（４）細胞融合
ミエローマ細胞と脾細胞が１対５になるように混ぜ、４℃１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除きＰＥＧ−イーグルＭＥＭ１ｍｌを徐々に加え細胞をほぐし、その後３７℃のＲＰＭＩ１６４０ ３０ｍｌを徐々に添加した。遠心（８００ｒｐｍ、室温、５分）後上清を除き、３７℃の１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を１０ｍｌ加え、３７℃で６０分放置後蓋をしめて天地にゆっくりと振って沈殿をほぐした。１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を４０ｍｌ加え、２５ｍｌづつ分注し、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０を加え５０ｍｌとした。先端をカットしたクリスタルチップで９６穴プレート１０枚に１００μｌずつまき、３７℃で一晩培養した。
（５）ＨＡＴ選択
融合の翌日、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０に５０×ＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ社）を加え２×ＨＡＴを作製し、各ウエルに１００μｌずつ加えた。その後２、３日おきに１００μｌずつ培地を交換した。
（６）スクリーニング及びクローニング
融合１０日後から実施例１で得られた発現タンパクＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６を抗原としたＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを開始した。ＥＬＩＳＡ法は具体的には次のようにして行った。ＴＡＬＯＮ（商標）ＣｅｌｌＴｈｒｕ（クロンテック社）ビーズを充填したカラムで精製したＨｉｓ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１μｇ／ｍｌに調整して９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で１６時間静置した。その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに精製水で４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）を２００μｌ添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに、培養上清を５０μｌ添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。これに、抗マウスイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体・アルカリフォスファターゼ標識（ダコ）５０μｇ／ｍｌを５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、その後、生理食塩水３００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。発色は、ＡＬＰローゼ・シノテスト（シノテスト）を用い基質液５０μｌ／ｗｅｌｌ添加して室温にて２０分間静置した後、呈色液５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて、５１０−６２０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．１以上を陽性とした。
その結果、９６０ウエル中１２６ウエルに陽性が認められた。この１２６種類の培養上清を用いて、実施例１で得られたＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３ＧｎＴ−６を抗原に大腸の組織標本を用いて免疫染色を行い、さらに、ウエスタンブロット法を行なった。免疫染色の方法は一般的なＤＡＢ法（ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ユニバーサル（マウス）、ダコ社）を用いて次のように行った。大腸組織はホルマリンにて固定して定法に従いパラフィン切片を作製した。内因性パーオキシダーゼブロッキング試薬に浸漬、３０分間室温にて静置した。その後、ＴＢＳにて試薬を洗い流してトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に室温にて５分間浸漬した。各培養上清を１００μｌ切片に添加して４℃にて一晩インキュベーションした。その後、ＴＢＳにて培養上清を洗い流してＴＢＳに浸漬（５分間、３回）して洗浄した。続いて、ＥＶＩＳＩＯＮ＋ポリマー試薬を切片に滴下して室温にて６０分間インキュベーシンした。ＴＢＳにて試薬を洗い流してＴＢＳに浸漬（５分間、３回）して洗浄した。ジアミノベンチジン溶液に浸漬して１０分間静置した。精製水で試薬を洗い流して精製水に浸漬した。さらに、ヘマトキシリン溶液に７秒間浸漬した後、流水にて５分間洗浄した。脱水、透徹、封入後顕微鏡にて観察した。また、ウェスタンブロットは具体的に次のようにして行った。ＦＬＡＧ−ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動してＰＶＤＦ膜に転写した後、精製水にて４倍に希釈したブロックエースにてブロッキングした。このＰＶＤＦ膜を細い短冊状に切断し、ＰＶＤＦ膜を培養液に浸漬して室温にて１時間反応した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて３回洗浄した。これに、抗マウスイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体・ハーオキシダーゼ標識（ダコ）５０μｇ／ｍｌを添加して室温にて１時間反応した。その後、５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにて２回、ＰＢＳにて１回洗浄した。発色はイムノステインＨＲＰ−１０００キット（ＫＯＮＩＣＡ）を用いて行った。
その結果、３種類に陽性反応が認められた。そこで、この選択した３種類のハイブリドーマ細胞群より、限界希釈法によるクローニング操作を行なった。即ち、ウエル当たり０．３細胞になるようにハイブリドーマを希釈して１０日間培養し、顕微鏡下、１ウエルに１コロニーであることを確認して、その培養上清を再度上記ＥＬＩＳＡ法で陽性コロニーをスクリーニングした。この操作を再度行い、２個の抗ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６抗体産生クローンを得た。得られた２クローンのハイブリドーマのうちの一方をＭＡ−１３６ Ｇ８ ＮＯ．１４４’０２．１０．１と命名し、上記の通り、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき寄託した。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００である。
実施例３ モノクローナル抗体の反応性の確認
約２×１０７細胞／ｍｌの前述のモノクローナル抗体産生細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００）をＢＡＬＢ／Ｃおよびヌードマウスの腹腔内に投与した。２週間後腹水を採取し、３０％硫安沈殿及びＰＢＳによる透析を行い、実施例２と同様にして、ウエスタンブロッテイングおよび組織免疫染色法で確認した。その結果、大腸および胃の粘膜上皮細胞に強い反応性を認めた。
実施例４ モノクローナル抗体を用いた癌及び腫瘍の検出
上記モノクローナル抗体（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２００）を用いて、実施例２と同様にして、胃癌、大腸癌、および家族性大腸ポリポーシスの組織の染色を行なった。その結果、胃および大腸組織の正常組織ではｂｅｔａ３Ｇ−Ｔ６のモノクローナル抗体により染色が認められ、ｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は、胃の粘膜上皮細胞のゴルジ体領域が、大腸粘膜の杯細胞のゴルジ体領域発現していることが確認できた。胃癌および大腸癌の組織においてはｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は完全に消失していた。
家族性大腸ポリポーシスの組織は、異型度からグループ１〜５に分類した。グループ１〜５の分類基準は次のとおりである。
グループ１：正常組織、および異型を示さない良性（非腫瘍性）病変
グループ２：異型を示すが良性（非腫瘍性）と判定される病変
グループ３：良性（非腫瘍性）と悪性の境界領域の病変
グループ４：癌が強く疑われる病変
グループ５：癌
免疫組織染色の結果、グループ４以上の腫瘍性ポリープ部分ではｂｅｔａ３Ｇｎ−Ｔ６は完全に消失していた。組織染色の結果は以下の表３に示した。
Claims (41)
- 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，３結合で転移する活性を有するタンパク質。
- 前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有する請求項１記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質。
- 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 配列番号２に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
- 配列表の配列番号２に示される塩基配列の１ｎｔ〜１１５２ｎｔまでの塩基配列を有する請求項６記載の核酸。
- 請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
- 請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
- 請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸。
- 請求項８記載の核酸中の部分領域と相補的な配列を有する請求項１１記載の核酸測定用核酸。
- プローブ又はプライマーである請求項１１又は１２記載の核酸測定用核酸。
- 塩基数が１５塩基以上である請求項１３記載の核酸測定用核酸。
- 癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸。
- 消化器の癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１５記載の核酸測定用核酸。
- 大腸癌及び／又は胃癌の診断に用いられる請求項１６記載の核酸測定用核酸。
- 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片。
- 請求項５記載のタンパク質と抗原抗体反応する、請求項１８記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- モノクローナル抗体である請求項１８又は１９記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 標識が結合されている請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 消化器の癌及び／又は腫瘍の診断に用いられる請求項１２記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 大腸癌及び／又は胃癌の診断に用いられる請求項２３記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 生体から分離された試料細胞中における、請求項５記載のタンパク質の遺伝子の発現量を調べることを含む、癌及び／又は腫瘍の診断方法。
- 前記試料細胞が消化器由来の細胞であり、消化器の癌及び／又は腫瘍を診断する請求項２５記載の方法。
- 前記試料細胞が、大腸又は胃由来の細胞であり、大腸癌又は胃癌を診断する請求項２６記載の方法。
- 請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸と、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸とを接触させることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
- 請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の一対をプライマーとし、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸を鋳型として核酸増幅法を行い、増幅産物を測定することを含む、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
- 請求項５記載のタンパク質の遺伝子の発現量を、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸と、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として生成されるｃＤＮＡとを接触させることによりハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を測定することを含む、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の癌及び／又は腫瘍を診断する方法。
- 請求項５記載のタンパク質の遺伝子の発現量を、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の一対をプライマーとし、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として生成されるｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅法を行い、増幅産物を測定することを含む、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の癌及び／又は腫瘍を診断する方法。
- 請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、試料細胞中及び／又は細胞上の請求項５記載のタンパク質とを抗原抗体反応させ、結合した前記抗体若しくはその抗原結合性断片又は前記タンパク質を測定することを含む、癌及び／又は腫瘍の診断方法。
- 前記試料細胞が消化器由来の細胞であり、消化器の癌及び／又は腫瘍を診断する請求項３２記載の方法。
- 前記試料細胞が、大腸又は胃由来の細胞であり、大腸癌又は胃癌を診断する請求項３３記載の方法。
- 請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸の測定用核酸製造のための使用。
- 請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の核酸測定用核酸の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用。
- 前記癌及び／又は腫瘍は、消化器の癌及び／又は腫瘍である請求項３６記載の使用。
- 前記消化器の癌及び／又は腫瘍は、胃癌又は大腸癌である請求項３７記載の使用。
- 請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片の、癌及び／又は腫瘍の診断試薬製造のための使用。
- 前記癌及び／又は腫瘍は、消化器の癌及び／又は腫瘍である請求項３９記載の使用。
- 前記消化器の癌及び／又は腫瘍は、胃癌又は大腸癌である請求項４０記載の使用。
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