JP4300250B2 - Ｉｉ血液型の判定方法 - Google Patents
Ｉｉ血液型の判定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4300250B2 JP4300250B2 JP2002338637A JP2002338637A JP4300250B2 JP 4300250 B2 JP4300250 B2 JP 4300250B2 JP 2002338637 A JP2002338637 A JP 2002338637A JP 2002338637 A JP2002338637 A JP 2002338637A JP 4300250 B2 JP4300250 B2 JP 4300250B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ignt3
- cells
- ignt2
- gene
- ignt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ii血液型の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、Ii血液型の判定方法に関する。
【０００３】
Ii血液型は、赤血球上にI（大文字のアイ)抗原及びi(小文字のアイ)抗原のいずれが表れているかに基づいて分類する血液型であり、輸血時の検査として行われている。I及びi抗原は、低温凝集自己抗体により始めて検出されたものであり、ヒトの発生において劇的に変化するものである（非特許文献１〜４)。胎児及び新生児の赤血球は、i抗原を含むがI抗原は非常に僅かであるが、生後、i抗原が減少するにつれてI抗原の発現が徐々に増大する（非特許文献３及び４)。成人及び生後１８ヶ月以降の子供の大多数は、I抗原を表し、i抗原は少ない（非特許文献３及び４)。このように、赤血球上のI抗原及びi抗原は、発生の過程において交代する。I/i抗原はまた、種々の組織及び体液の細胞表面上にも存在し（非特許文献５及び６)、組織血液型抗原であると認められている（非特許文献７)。
【０００４】
種々の研究により、I/i抗原は、糖タンパク及び糖脂質上の炭水化物構造として規定されることが明らかにされた（非特許文献８及び９)。i抗原エピトープは、Galβ1-4GlcNAcβ1-3 繰り返し単位を有する直線状ポリ-N-アセチルラクトースアミン鎖であり、一方、I抗原構造は、分枝したポリ-N-アセチルラクソースアミノグリカンを含む（図１参照）（非特許文献９及び１０)。I分枝炭水化物は、発生、分化及び発ガンの過程における細胞間の相互作用において、特に多価糖鎖末端抗原決定基を提示することにより、重要な役割を果たしているかもしれない。
【０００５】
I分枝ポリ-N-アセチルラクトースアミンがどのようにして合成されるのかを理解するために、I-分枝化酵素であるβ-1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(IGnT)を研究することは興味深いことである。IGnTをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎児ガン細胞PA-1からトランジェント発現法（非特許文献１１)により初めてクローニングされ、IGnTと命名された。もう一つのI-分枝化酵素が同定され、C2GnT-M又はC2/4GnT（後でC2GnT-2と再命名）と命名された（非特許文献１２、１３)。IGnTは、6p24染色体上に位置し、Galβ1-4GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)Galβ1-4GlcNAc構造を生産する、中心的に作用するIGnT活性をコードする。一方、C2GnT-2は、15q21-22に位置し、GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)Galβ1-4GlcNAc構造を形成する、プレディスタルに(predistally)作用するIGnT活性をコードする。
【０００６】
i表現型の成人では、赤血球がi抗原を発現し、I抗原をほとんど発現していない。成人i表現型22000人中５人であると報告され（非特許文献１)、この表現型は、常染色体性劣性形質として遺伝する。i表現型では、I抗原の欠失は、IGnT酵素の不活化の結果であると考えられている。最近、i表現型を示すヒトは、従来のIGnT遺伝子中にミスセンス突然変異を有することが報告された（非特許文献１４)。。これらの突然変異は、従来のIGnT活性を喪失させ、その結果、赤血球I抗原がない表現型をもたらすものである。もっとも、かれらは、他の組織におけるI抗原の発現については調べていない。これまでの研究により、赤血球の成人i表現型を支援すヒトにおいて、唾液、乳及び血漿では、正常な量のI抗原が検出されている（非特許文献１５及び１６)。これらの知見は、組織血液型I抗原を規定するさらなるIGnT遺伝子が存在するかもしれないことを示唆しており、血液型I遺伝子座をよりよく理解するためにこれらの遺伝子を明らかにすることが強く求められている。
【０００７】
従来、Ii血液型の判定は、抗体と血球との抗原抗体反応を用いて行われていた。しかしながら、多くの正常なヒト血清中に認められる寒冷凝集素として自己抗Ｉ抗体が知られている。室温でも反応することがあり、血液型判定や交差試験を妨げる。もし、遺伝子検査によりIi血液型を決定することができれば、このような問題が起きず、より正確に、簡便、迅速又はより微量の試料を用いてIi血液型を判定することができ、有利である。
【０００８】
【非特許文献１】
1. Wiener AS, Unger, L.H., Cohen L., Feldman, J. Type-specific cold autoantibodies as a cause of acquired hemolytic anemia and hemolytic transfusion reactions: Biologic test with bovine red cells. Ann. Intern. Med. 1956;44:221-240
【非特許文献２】
2. Marsh WL, Jenkins, W.J. Anti-i: a new cold antibody. Nature. 1960;188:753
【非特許文献３】
3. Marsh WL. Anti-I: a cold anti-body defining the Ii rerationship in human red cell. Br J Haematol. 1961;7:200-209
【非特許文献４】
4. Marsh WL, Nichols ME, Reid ME. The definition of two I antigen components. Vox Sang. 1971;20:209-217
【非特許文献５】
5. Rouger P, Juszczak G, Doinel C, Salmon C. Relationship between I and H antigens. I. A study of the plasma and saliva of a normal population. Transfusion. 1980;20:536-539
【非特許文献６】
6. Marsh WL, Nichols ME, Allen FH, Jr. Inhibition of anti-I sera by human milk. Vox Sang. 1970;18:149-154
【非特許文献７】
7. Clausen H, Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution. Vox Sang. 1989;56:1-20
【非特許文献８】
8. Fukuda M, Carlsson SR, Klock JC, Dell A. Structures of O-linked oligosaccharides isolated from normal granulocytes, chronic myelogenous leukemia cells, and acute myelogenous leukemia cells. J Biol Chem. 1986;261:12796-12806
【非特許文献９】
9. Watanabe K, Hakomori SI, Childs RA, Feizi T. Characterization of a blood group I-active ganglioside. Structural requirements for I and i specificities. J Biol Chem. 1979;254:3221-3228
【非特許文献１０】
10. Fukuda M, Fukuda MN, Hakomori S. Developmental change and genetic defect in the carbohydrate structure of band 3 glycoprotein of human erythrocyte membrane. J Biol Chem. 1979;254:3700-3703
【非特許文献１１】
11. Bierhuizen MF, Mattei MG, Fukuda M. Expression of the developmental I antigen by a cloned human cDNA encoding a member of a beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family. Genes Dev. 1993;7:468-478
【非特許文献１２】
12. Yeh JC, Ong E, Fukuda M. Molecular cloning and expression of a novel beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase that forms core 2, core 4, and I branches. J Biol Chem. 1999;274:3215-3221
【非特許文献１３】
13. Schwientek T, Nomoto M, Levery SB, Merkx G, van Kessel AG, Bennett EP, Hollingsworth MA, Clausen H. Control of O-glycan branch formation. Molecular cloning of human cDNA encoding a novel beta1,6-N-acetylglucosaminyltransferase forming core 2 and core 4. J Biol Chem. 1999;274:4504-4512
【非特許文献１４】
14. Yu LC, Twu YC, Chang CY, Lin M. Molecular basis of the adult i phenotype and the gene responsible for the expression of the human blood group I antigen. Blood. 2001;98:3840-3845
【非特許文献１５】
15. Dzierzkowa-Borodej W, Seyfried H, Nichols M, Reid M, Marsh WL. The recognition of water-soluble I blood group substance. Vox Sang. 1970;18:222-234
【非特許文献１６】
16. Marsh WL, Jensen L, Decary F, Colledge K. Water-soluble I blood group substance in the secretions of i adults. Transfusion. 1972;12:222-226
【非特許文献１７】
17. Petzer AL, Zandstra PW, Piret JM, Eaves CJ. Differential cytokine effects on primitive (CD34+CD38-) human hematopoietic cells: novel responses to Flt3-ligand and thrombopoietin. J Exp Med. 1996;183:2551-2558
【非特許文献１８】
18. Warren MK, Rose WL, Beall LD, Cone J. CD34+ cell expansion and expression of lineage markers during liquid culture of human progenitor cells. Stem Cells. 1995;13:167-174
【非特許文献１９】
19. Engelhardt M, Kumar R, Albanell J, Pettengell R, Han W, Moore MA. Telomerase regulation, cell cycle, and telomere stability in primitive hematopoietic cells. Blood. 1997;90:182-193
【非特許文献２０】
20. Brecker G SM. A time saving device for the counting of reticulocytes. Am. J. Clin. Pathol. 1950;20:1079-1083
【非特許文献２１】
21. Gibson UE, Heid CA, Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996;6:995-1001
【非特許文献２２】
22. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996;6:986-994
【非特許文献２３】
23. Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 1982;157:105-132
【非特許文献２４】
24. Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T. A novel variant form of murine beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase forming branches in poly-N-acetyllactosamines. Glycobiology. 2000;10:1001-1011
【非特許文献２５】
25. Bierhuizen MF, Fukuda M. Expression cloning of a cDNA encoding UDP-GlcNAc:Gal beta 1-3-GalNAc-R (GlcNAc to GalNAc) beta 1-6GlcNAc transferase by gene transfer into CHO cells expressing polyoma large tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:9326-9330
【非特許文献２６】
26. Narimatsu H, Sinha S, Brew K, Okayama H, Qasba PK. Cloning and sequencing of cDNA of bovine N-acetylglucosamine (beta 1-4)galactosyltransferase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:4720-4724
【非特許文献２７】
27. Lo NW, Shaper JH, Pevsner J, Shaper NL. The expanding beta 4-galactosyltransferase gene family: messages from the databanks. Glycobiology. 1998;8:517-526
【非特許文献２８】
28. Shiraishi N, Natsume A, Togayachi A, Endo T, Akashima T, Yamada Y, Imai N, Nakagawa S, Koizumi S, Sekine S, Narimatsu H, Sasaki K. Identification and characterization of three novel beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferases structurally related to the beta 1,3-galactosyltransferase family. J Biol Chem. 2001;276:3498-3507
【非特許文献２９】
29. Togayachi A, Akashima T, Ookubo R, Kudo T, Nishihara S, Iwasaki H, Natsume A, Mio H, Inokuchi J, Irimura T, Sasaki K, Narimatsu H. Molecular cloning and characterization of UDP-GlcNAc:lactosylceramide beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (beta 3Gn-T5), an essential enzyme for the expression of HNK-1 and Lewis X epitopes on glycolipids. J Biol Chem. 2001;276:22032-22040
【非特許文献３０】
30. Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T. Functional analysis of promoter activity of murine beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase. Gene. 2001;275:253-259
【非特許文献３１】
Ogata, H.、Okubo, Y.、Akabane, T., Phenotype i associated with congenital cataract in Japanese, Transfusion, 1979, 19, 166-8
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、遺伝子検査によりIi血液型を判定する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願出願人は、新規なN-アセチルグルコサミン転移酵素IGnT2及びIGnT3並びにこれらをコードする遺伝子について先に特許出願した（特願2001-401827)。本願発明者らは、さらに鋭意研究の結果、IGnT3遺伝子の特定の部位が突然変異することによりi型が生じることを見出し、これらの一塩基多型(SNP)を利用することにより、Ii血液型を遺伝子検査によって判定することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、生体から分離した試料中のIGnT3遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、1006ntがｇかａか、及び／又は1049ntがｇかａかを調べることを含む、Ii血液型の判定方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
IGnT3遺伝子は、下記実施例に詳述する方法により同定され、クローニングされたものである。その塩基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号１に示す。また、そのアミノ酸配列をIGnT1及びIGnT2と対比した図を図２のＡに示し、各エキソンの位置を図２のＢに示す。図２のＡ中、矢印がエキソン２及び３の５’末端の位置を示す。同一のアミノ酸配列を枠で囲み、保存されたシステイン残基を星印で示す。配列番号１に示す塩基配列では、エキソン２の５’末端が、９２６nt、エキソン３の５’末端が１０１８ntである。上記塩基配列を、ヒトゲノムプロジェクトの第６番染色体のゲノミック遺伝子配列(NT_007291)と対比することにより、エクソン部分を決定した。図２のＢに示されるように、IGnT1、IGnT2及びIGnT3遺伝子は、エキソン２及びエキソン３が共通であり、エキソン１のみが異なっている。なお、図２のＢは、NT_007291の219000ntから319000ntの領域を示す。
【００１３】
本発明の方法では、配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として、1006nt（1006番目の塩基という意味）がｇかａか、及び／又は1049ntがｇかａかを調べる（以下、1006ntのｇがａに変異した遺伝子を「Ii3」、1049ntのｇがａに変異した遺伝子を「Ii1」ということがある)。下記実施例に具体的に記載するように、これらの部位のいずれか一方が、ｇからａに突然変異した遺伝子が２つ揃うことによりi表現型が出現する。したがって、1006nt及び1049ntのｇがａに変異しているか否かを調べることにより、Ii血液型を判定することができる。なお、下記実施例で具体的に調べた家系では、i表現型のヒトの遺伝子型は、いずれもIi1とIi3のヘテロ接合であった。なお、下記実施例にも記載されているように、上記した２種類の変異以外にも点突然変異が存在し得る。したがって、「配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として」という文言は、変異部位の位置を特定するために用いている文言であり、被検ＤＮＡが配列番号１と完全に同一の塩基配列を有しなければならないことを意味するものではない。
【００１４】
本発明の方法に供される試料としては、特に限定されないが、赤血球系細胞（赤血球、網状赤血球、赤芽球等)を含む試料であることが好ましく、末梢血が採取が容易で好ましい。
【００１５】
上記突然変異は、常法により試料細胞中のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡ中の上記各変異を調べてもよいし、上記のように配列番号１の塩基配列中のエキソンの境界がわかっているので、ゲノミック遺伝子中の変異を直接検出してもよい。あるいは、ｍＲＮＡ中の変異や、スプライシング前の前駆ｍＲＮＡ中の変異を検出してもよい。
【００１６】
上記各突然変異の検出自体は、各変異部位の周辺の塩基配列がわかっているので、種々の周知の方法により容易に行うことができる。例えば、下記実施例に記載するように、常法により試料細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することにより行うことができる。あるいは、試料細胞中のゲノミック遺伝子を鋳型として、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。また、ｍＲＮＡをNASBA法等のＲＮＡ増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。あるいは、変異部分を含む領域に一方のプライマーを設定して核酸増幅法を行い、増幅が起きるか否かを調べることにより、変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。この場合、I型(野生型）の配列と同一又は相補的なI型プライマーと、i型(Ii3又はIi1)の配列と同一又は相補的なi型プライマーとの共存下において、増幅を行うことにより、より正確に判定することが可能である。あるいは、I型とi型で切断の有無が生じる制限酵素部位を有するプライマーを用いて増幅を行い、増幅産物をその制限酵素で処理して切断が起きるか否かを調べる(PCR-RFLP)ことによっても変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。なお、ＰＣＲ等の核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらの製品の添付文書にしたがって容易に実施することができる。あるいは、プローブを用いて調べることもできる。例えば、上記の増幅産物をサザンブロット又はノーザンブロットにかけることにより調べることができる。これらの場合、I型の配列と同一又は相補的なI型プローブと、i型の配列と同一又は相補的なi型プローブとが用いられ、I型プローブとハイブリダイズすればI型、i型プローブとハイブリダイズすればi型と判定される。あるいは、プローブをチップ上に固定したＤＮＡチップを用いて検査を行うことも可能である。なお、以上述べた種々の方法は、いずれも一塩基多型の調査方法として周知のものであり、本明細書に記載された情報があれば、当業者が容易に実施できるものである。また、突然変異の調査方法は、上記のものに限定されるものではなく、上記突然変異の有無を調べることができる方法であれば、いずれの方法を採用することもできる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
(1) ヒトIGnT cDNAのクローニング及び発現並びに特徴付け
１．遺伝子データベースの検索とIGnT２、IGｎT3の塩基配列決定
既存のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Gene Bank）：M97347, NM004751, NM001490, NM001491である。また検索は、Blast[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)]等のプログラムを利用した。
【００１９】
その結果、第六染色体のゲノム配列クローンのGene Bank Accetion No.AL139039およびNo.AL358777が見出された。さらに、この二つの配列を網羅した第六染色体のGene Bank accetion No. NT_007291が見出された。この部分配列は、既知のIGnTと相同性が高く、ゲノム上で既知のIGnTの第一エクソンを挟むように存在していた。この新規の２つの配列について遺伝子領域解析ソフトのGeneScan、HMMgene等を用いて翻訳領域を解析した。その結果、新規の２つの配列は、別々な第一エクソンであり、この独立した第一エクソンは既知のIGnTのエクソン２、エクソン３を共用している可能性が認められた。そこで、ここの第一エクソンと第三エクソンにプラマーを設計して、トランスクリプトとして存在するか調べた。また、既知のIGnTを「IGnT1」とし、新規の２つを「IGnT2」と「IGnT3」と命名した。
【００２０】
具体的には、株化細胞PA-1（奇形芽腫、ATCCより入手）より、総RNAを抽出し、常法に従ってｃDNAを合成した。このｃDNAを鋳型として使用した。用いたプライマーは、IGnT1はフォワードプライマー（5'−tgaggcatgcctttatcaatgcgttacc-3'）,リバースプライマー（5'−tgaatagctcaaaaatacctgctgggttgt-3':全て共通）、IGnT2はフォワードプライー（5'-tgaatgatgggctcttggaagcactgtc-3'）、IGnT3はフォワードプライー(5'-gtgaaaataatgaacttttggaggtactgctt-3')を用いてPCR（95℃30秒、60℃30秒、72℃2分を32サイクル）を行なった。
【００２１】
その結果、約1.2kbaseの増幅産物が得られた。このPCR増幅産物の配列を調べた。このPCR溶液をQIAquick PCR Purification kit(キアゲン)にてPCR増幅産物を精製した。この精製PCR産物を鋳型としてシークエンスを調べた。シークエンスの結果、IGnT2とIGnT3の配列（配列番号１、２）が得られた。また、IGnT1とIGnT3に関しては、pCRIIベクター（インビトロジェン社）に一般的なTAクローニング法により、サブクローニングした。
【００２２】
シーケンスの結果、エキソン２は31アミノ酸、エキソン３は62アミノ酸から成ることが判明した（図2A）。またこれらの結果をヒトゲノムプロジェクトのデータベースと比較したところ、上記予想どおりの構造で、それぞれのエキソン1は、IGnT2、IGnT1、 IGnT3の順で、エキソン２の上流に並んでいることが示された（図２B）。IGnT１エキソンから予想されるアミノ酸配列はIGnT2とIGnT3それぞれに対し、65％と66％の相同性を示した。IGnT2とIGnT3の間のエキソン１の相同性は65％であった。カイトドウリトル・ハイドロパシー（Kyte-Doolittle hydropathy）分析(23)ではIGnTは糖転移酵素に典型的な2型の膜貫通トポロジーを示した。9個のシステインが各IGnTで保存されていた。またIGnT２はマウスIGnT Bのオルソログ（機能が同一のたんぱく質）であったが、IGnT3はこれまでどの種でも報告のなかった新たな遺伝子であることがわかった。
【００２３】
２．IGnT２およびIGnT３の発現ベクターへの組込み
IGnT2およびIGnT3の発現系を作成するため、まずIGnT2およびIGnT3をインビトロジェン社のGatewayシステムのpDONR201に組込み、さらにインビトロジェン社のBac-to-BacシステムによるBacmidを作製した。さらに、陽性対照対照としてIGnT1も同様に以下に詳細を述べる。
【００２４】
GatewayシステムによるpFastBacへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
pCRIIにサブクローニングしたIGnT１およびIGnT3を鋳型にした。IGnT2はMarathon cDNAを鋳型として、IGnT1に対するプライマーF１（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTAAATATCTCAGACCCTTTGAGGCTGACT-3'）,プライマーF2(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGCACATCTTTTATCAATGGAAAAACA-3')、
IGnT2に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAGGGCAGCTCTGTCCAATGCTTCA-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTCATCAGATTTTTGAGGGGAAAG-3'）、
IGnT3に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAACAGTTCCAGTGAAAGGTATTTTAG-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTAATCACGCCTTAGAGAAAATGCCA-3'）
と共通のプライマーR（5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaAAAATACCAGCTGGGTTGTATCGCAG-3'）を用いて、PCR（98℃10秒、55℃30秒、72℃1分を30サイクル）により再度DNA断片を得た。MicroSpin S-400 HR（アマシャムファルマシアバイオテク）にてDNA断片を精製し、精製後BP クロナーゼ 反応によってpDONR201へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするDNA断片１μl、pDONR201１μl（150ng）、反応緩衝液2μｌ、BP クロナーゼ mix 2μl、TE溶液４μlを25℃で1時間インキュベートして行った。プロテイナーゼKを１μl加えて37℃10分おき反応を終了させた。
【００２５】
その後上記mix全量（1μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pDONR−IGnT1-F1、pDONR-IGnT1-F2、pDONR-IGnT2-F1、pDONR-IGnT2-F2、pDONR-IGnT3-F1、pDONR-IGnT3-F2）を抽出・精製した。
【００２６】
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
【００２７】
まずエントリークローン１μl、ｐFBIHを１μl（100ng）、LR反応緩衝液2μl、TE4μl、LR クロナーゼmix 2μlを25℃で1時間反応させ、プロテイナーゼ Kを1μl加えて37℃10分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐFBIH-IGnT1-F1、ｐFBIH-IGnT1-F2、ｐFBIH-IGnT2-F1、ｐFBIH-IGnT2-F2、ｐFBIH-IGnT3-F1、ｐFBIH-IGnT3-F2、が生成される）。ｐFBIH は、pFastBac１にIgκシグナル配列（MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG）とHisタグ(His 6個)のシーケンスを加えたもので、OT５（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggacatcaccatcaccatcac-3'）を鋳型に、プライマーOT20 (5'-cgggatccat gcattttcaa gtgcag-3')と、OT22 （5'-ggaattcgtgatggtgatggtgatg -3'）を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をBam H1 とEco R1 で挿入した。さらに、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Hisタグは精製のため挿入した。
【００２８】
その後上記混合液全量（5μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pFBIH-IGnT1-F1、pFBIH-IGnT1-F2、pFBIH-IGnT2-F1、pFBIH-IGnT2-F2、pFBIH-IGnT3-F1、pFBIH-IGnT3-F2、:同様の工程をする場合、pFBIH-IGnTsとする）を抽出・精製した。
【００２９】
またpFBIHに変えてｐFBIFでも同様に実験を行った。即ちｐFBIFはHisタグに変えて、精製用にFLAGペプチド（DYKDDDDK）を入れたもので、OT3（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggagattacaaggacgacgatgacaag-3'）を鋳型とし、プライマーOT20（上記と配列同じ）と、OT21 （5'-ggaat tcttgt catcg tcgtc cttg-3'）によって得られたDNA断片を上記と同様にBam H1 とEco R1 で挿入し、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。
【００３０】
Bac-to-BacシステムによるBacmidの作成
続いてBac-to-Bacシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐFBIH- IGnTs又はｐFBIF-IGnTsとBacmidとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なBacmidにIGnTsにその他の配列を挿入した。このシステムはTn7の組換部位を利用して、Bacmidを含む大腸菌（DH10BAC）に目的遺伝子を挿入させたpFastBac（pFBIH-IGnTsまたはpFBIF-IGnTs）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がBacmidへとりこまれるというものである。またBacmidにはlacZ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
【００３１】
即ち、上記精製ベクター（ｐFBIH-IGnTs又はｐFBIF-IGnTs）をコンピテントセル（大腸菌DH10BAC）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Bluo-gal、及びIPTGを含むLBプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Bacmidを回収した。
【００３２】
３． Bacmidの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたBacmidに目的配列が挿入していることを確認した後、このBacmidを昆虫細胞Sf21（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち35mmのシャーレにSf21 細胞9x105 細胞/2ml （抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）を加え、27℃で１時間培養して細胞を接着した。（Solution A）精製した Bacmid DNA 5 μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。（Solution B）CellFECTIN Reagent(インビトロジェン社） 6μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。その後、Solution AおよびSolution Bを丁寧に混合して15〜45分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）2mlを加えた。Solution AとSolution Bを混合して作製した溶液(lipid-DNA complexes)に抗生物質を含まないSf900II 800μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したlipid-DNA complexes溶液を細胞に加え、27℃で5時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）培養液2mlを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
【００３３】
T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml Sf-900SFM(インビトロジェン社)（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを800μｌを添加して、27℃で48〜72時間培養した。培養終了後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
【００３４】
さらに、T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml Sf-900SFM(インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したらニ次ウイルス液1000μｌを添加して、27℃で72〜96時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
【００３５】
加えて、100ml用スピナーフラスコにSf21細胞６ｘ１０５細胞/ml濃度で100mlを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
【００３６】
三次のセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：20mM HEPES pH7.5、2 % Triton X-100）細胞粗抽出液 をH2Oで20倍にし、常法によりSDS-PAGEによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするIGnT1, IGｎT2, IGｎT3（3種類同時に示す場合IGnTs）のタンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたIGnTsにはモノクローナル抗体６−His（MMS-156P、COVANCE社）、FLAG配列のついたIGnTsには抗FLAG M2-ペルオキシダーゼ（A-8592、SIGMA社）を用いた。
【００３７】
FLAG-IGnTsは、４２Kまたは４１Kの位置にバンドが検出された。
【００３８】
四次感染のFLAG-IGnTs上清10mlにNaN3（0.05 %）、NaCl (150 mM)、CaCl2 (2 mM)、抗M1レジン（Sigma 社）(50 μｌ)を混合し、4℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（3000rpm 5分4℃）ペレットを回収し、2 mMのCaCl2・TBSを900μｌ加えて再度遠心分離（2000rpm 5分4℃）し、ペレットを50μｌ の1 mM CaCl2・TBS に浮遊させ活性測定のサンプル（IGnTs酵素液）とした。
【００３９】
５． IGnT2およびIGnT3の受容体基質の探索
IGnT2およびIGnT3は、β1,６−N−アセチルグルコサミニル転移酵素である既知IGnT1と相同性が高く、IGnT1とそれぞれ73.4%、74.1%であった。そこで、第一に供与体基質（donor substrate）としてUDP-GlcNAcを用いて検討した。
【００４０】
以下の反応系を用いて、IGnTsの受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（LNnT：CALBIOCHEM）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（agalacto-LNnT）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃ（２L1:生化学工業）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（３L1：生化学工業）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（agalacto-3L1）を２−アミノベンズアミド（２AB）化したものを用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。２AB標識糖鎖は、HPLCを用いて蛍光検出器で検出した。
【００４１】
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（10 nmol）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）(50mM) 、EDTA(35 mM) 、UDP-GlcNAC (10mＭ) 、Triton-X100(0.5%)、牛血清アルブミン（2mg/ml）から成り、これにIGnTs酵素液を2.5 μｌ加えて、さらにH2Oを加えて全量10μｌとした。
【００４２】
上記反応混合液を37℃で一昼夜反応させ、反応終了後、９７℃５分間過熱して軽く遠心後上清を取得した。この反応溶液５０μlをHPLCにて分析した。HPLCの分析条件は、カラムはTSKgel ODS-80Ts QAカラム(4.6ｘ250 mm; Tosoh)、溶媒（移動相）は７％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、または受容体基質として３L1の場合のみ５％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、流速は1ml/min、励起波長：330nm、蛍光測定波長：420nmで行なった。
【００４３】
その結果、陽性対照として用いたIGnT1は、受容基質LNｎT（溶出時間１８．６分）を用いた場合、生成物は１７分にピークが認められた。すなわち、この１７分の生成物は、LNnTにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンが結合したGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。IGnT2およびIGnT3に関しても全く同様の結果が得られた。すなわち、IGnT2およびIGnT3は、ポリラクトサミン構造（Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcのような構造で基本的には「Galβ１−４GlcNAc」の繰り返し構造をポリラクトサミン構造とする）の還元末端ではないガラクトースにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンを転移する酵素であることを確認した。そこで、他の基質についても検討した。その結果を以下の表１にまとめた。agalacto-LNnTを基質とした場合の生成物はGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。2L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。agalacto-3L1を基質としたときは、生成物はGlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。３L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃ、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃである。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（２）ヒト組織におけるIGnTの転写量の定量分析
▲１▼方法
Marathon Ready cDNA をCLONETECH社から購入し、リアルタイムPCRによって組織中のIGnT量を測定した（21、22）。内部標準としてはGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）を用いることにした。そこでIGnTのcDNAとGAPDHのｃDNAの標準曲線を、IGnT遺伝子を含むpDONR201ベクターとGAPDH遺伝子を含むpCR2.1（Invitrogen 社）をそれぞれ段階的に希釈して用いて作成した。プライマーとプローブは以下のものを用いた。IGnT1のフォワードプライマーとして、5'-acaaa ctaat gatcc atgag aagtc ttc-3'、リバースプライマーとして、 5'-ccatt atata tgcca aggga aagtc-3'、またIGnT1のプローブとしては 5'-FAM-tgcaa ggaat acttg accca gagcc act-MGB-3'を用いた。IGnT2のフォワードプライマーとしては 5'-gctat gagta catgg ttcga agcc-3'を、リバースプライマーは 5'-gccga agtct ttgtg gatgg t-3'またプローブは5'-FAM-tgaag aagag gctgg gttcc cttta gctta ca-MGB-3'を用いた。さらにIGnT3のフォワードプライマーについては5'-aatgc cagtc ttttt gtggg a-3'を、リバースプライマーは5'-atgta gtgat tctgg gtcag gtaat c-3'を、そしてプローブには5'-FAM-aatat attac catca ccttt gcgaa gtgtc ccttg-MGB-3'を用いた。
【００４６】
GAPDHのプライマーとプローブについてはPre-Developed TaqMan Assay Reagents, Endogenous Human GAPDH (Applied Biosystems 社)を用いた。リアルタイムPCRは常法により行った。増幅条件としては50℃で2分と95℃で10分をそれぞれ１サイクルおよび95℃で15秒と60℃で1分を50サイクル行った。PCR産物はABI PRISM 7700（Applied Biosystem 社）でシーケンスして確認した。これにより同一cDNAにおけるGAPDHの転写量に対する IGnTの転写の相対量が得られた。
【００４７】
▲２▼結果
その結果は図3に示すとおりである。IGnT2はIGnT1やIGnT3に比較して、多くの組織でより豊富に発現していることが示された。特にIGnT2は胃と小腸で最も強く発現し、腎臓、脾臓、胎盤、膵臓、肝臓、睾丸がそれに続く発現を示した。一方、脳全体、大脳皮質、胎児脳、小脳、骨格筋ではIGnT2の発現は非常に低値であった。IGnT1の発現パターンはIGnT2と同様であったが、小脳と胎児脳でIGnT2より多くの発現が見られた。逆にIGnT3の発現はIGnT1やIGnT2と異なるもので、骨髄、心臓、胃、小腸で強く、その他の組織では非常に低値または検出限界以下であった。
【００４８】
（３）造血細胞におけるIGnTの転写量の定量分析
▲１▼造血細胞の分化
造血細胞の分化に伴うIGnT遺伝子の発現レベルの変化を調べるため、家系特異的な造血細胞（骨髄CD34＋細胞）を分化させてｃDNAを調整した。具体的には以下のとおりである。
【００４９】
骨髄球系、赤血球系、巨核球系への分化を促すため、精製したCD34＋細胞を血清なしの溶液中でいくつか組み合わせた造血成長因子で処理した（17）。その後細胞を骨髄球の分化にはstem cell factor (SCF; 50 ng/mg, Sigma社, 米国) 顆粒球−マクロファージ コロニー活性因子；granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (10 ng/ml, Genetics Institute社, 米国) を、赤芽球の分化にはSCF (50 ng/ml, Chemicon International社, 米国) とエリスロポエチン；erythropoietin (3U/ml, Chemicon International社, 米国) を、また、巨核球の分化にはSCF (50 ng/ml)とトロンボポエチン；thrombopoietin (20 ng/ml)を加えて6日間培養した（18、19）。
【００５０】
▲２▼方法
定量方法は前記（２）▲１▼と同じである。
【００５１】
▲３▼結果
造血細胞の各分化段階におけるIGnT遺伝子の発現を調べたところ、先祖であるCD34＋細胞ではIGnT2が最も多く発現し、IGnT1とIGnT3は比較的低値であった。ところが赤血球系（erythroid）に分化するとIGnT3が極端に上昇し、IGnT1とIGnT2の発現が抑制されていた。また、骨髄球系（myeloid）または巨核球系(megakaryocyte)へ分化するとIGnT全体の発現が前者では亢進し、後者では抑制されることが示された（図４）。
【００５２】
赤芽球への分化においてIGnT3の発現レベルが上昇することにより、最終的に赤血球へ分化する過程において、I血液型の合成はIGnT3によるものであることが示唆された。
【００５３】
▲４▼網状赤血球におけるIGnT発現の検証
そこでこの可能性を検証するため、網状赤血球を濃縮したフラクションを得て、IGnTの発現レベルを調べることにした。詳細は以下のとおりである。
【００５４】
Optiprep (Nycomed Amersham 社、ノルウエー)を用いて製品添付のマニュアルに従ってヒト抹消血から網状赤血球のフラクションを調整した。最終的にグラジエント遠心で得られた最上部のフラクションをニューメチレンブルー（２０）によって超生体染色し、顕微鏡下で網状赤血球を数え、全体に対する割合を得たところ、末梢血全体では1.0％のところ最上部フラクションでは12.1％に濃縮されていた。このフラクションには単球や顆粒球などが見いだされず、網状赤血球のみが見いだされた。得られた網状赤血球からIsogen（ニッポンジーン社）を用いてRNAを抽出しさらにｃDNAを合成した。このcDNAを用いてリアルタイムPCRでIGnTの発現レベルを調べたところ、IGnT3は網状赤血球において明らかに発現していたが、IGnT1またはIGnT2の発現は見られなかった（表２）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
（４）成人i表現型におけるIGnT遺伝子変異の発見
▲１▼方法
成人i家系である家系のひとつから成人i表現型である3名とI表現型である1名と、さらに4名のI表現型のボランテイアを選択した。RNase Mini Kit とQIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen社)を用いて それぞれの抹消血から総RNAとゲノムDNAを調整した。ゲノムDNAの調整はPCRでIGnT遺伝子のそれぞれ３つの第1エキソンと、共通の第2、第3エキソンを増幅して行った。第1エキソンのプライマーセットは、IGnT1用として 5'-taagg tctca tataa ctcag tggat g-3'と5'-gggtg agaac tatat atgtt ccagt t-3'、IGnT2用として5'-tgtag acaca ggttg cagct tagca-3'と5'-ctttt gtcct gtgaa cagag cggtt-3' 、さらにIGnT3として5'-ctggg cttag ctgag ccttt gcaa-3'と 5'-ctggg cttag ctgag ccttt gcaa-3' である。また共通する第2第3エキソン増幅のプライマーは、それぞれ5'-ctgaa gtgga gaaac cctgg ctta-3'と5'-aaccc tggat tccac agcta cctt-3'、及び 5'-agttg tagtt agtcg gagag tacct-3' と 5'-tataa ttacg tagcc aggtc ctgaa-3'を用いた。さらに5'-gcttt cactc tgctc agcgt ggtca t-3' と 5'-taccc agcca tcctg ttagt gtatt-3'のプライマー対を用いてRNAサンプルからIGnT3を増幅して配列を確認した。この増幅フラグメントをTOPO TA Cloning Kit によりpCRII-TOPO ベクター (Invitrogen社)にサブクローニングした。PCR産物はMinElute PCR Purification Kit (Qiagen社)により精製し、またプラスミドはQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社)により精製して、DYEnamic ET terminator cycle sequencing kit とMegaBACE 500 (AmershamBiosciences)を用いてシーケンスを行った。
【００５７】
▲２▼結果
その結果を図５に示す。図の左側のIは第1世代、IIは第２世代、IIIは第3世代を示す。図５中、正方形は男性、円は女性を示す。黒く塗りつぶしたヒトは、i表現型であり、半分だけ塗りつぶしたヒトは、I型遺伝子(野生型）とi型（Ii1又はIi3)のヘテロで、表現型はI型である。遺伝子型を調べたヒトについては遺伝子型を記載した。第１世代は、既に他界しているので、遺伝子型を調べることはできなかった。成人i表現型と一般I表現型のサンプルを用いたIGnT1、IGnT2、及びIGnT3 遺伝子のシーケンスを行ったところ、IGnT1、IGnT2のエキソン１では変異は見つからなかったが、IGnT3のエキソン1ではG816Cの置換による変異が見出された。しかしながらこの置換は成人i表現型だけではなく、一般I表現型においても4名中2名に見られ、無機能なSNP（single nucleotide polymorphism）と考えられた。一方G1006AとG1049Aの塩基置換はそれぞれ第2エキソンと第3エキソンで成人i表現型においてのみ見出された。
また、pCRII-TOPO ベクターにサブクローニングされたIGnT3のcDNA配列を検証したところ、成人i表現型である第2世代（G-II）の個人２、５、６（図５A）はIi1/Ii3アリルのヘテロであり、一般I表現型である第3世代（G-III）の個人1はI/Ii1のヘテロであることが判明した。Ii1/Ii3アリルにおけるG1049CとG1006Cの核酸置換は、アミノ酸レベルではそれぞれGly350Glu、Gly336Argとなる。G816CのSNPとG1006Aは同じIi3アリル上に存在する。
【００５８】
（４）IGnT3上のG1049AとG1006Aの変異はCHO細胞でのI-抗原の発現を抑制した
G1049Aを含むIi1アリルと、G816CとG1006A変異を含むIi3アリルのcDNAをCHO(Chinese hamster ovary)細胞に導入してIGnT遺伝子の発現を調べた。詳細は以下のとおりである。
【００５９】
▲１▼方法
CHO細胞を10％ウシ胎児血清添加α-MEM (minimal essential medium) 中で培養した。サブクローニングしたpCRII-IGnTs からオープンリーデイングフレーム全体を取り出して pcDNA3.1/Hygromycin(+)（インビロゲン社製）へ挿入し、pcDNA3.1-IGnTs とした。1049部位がAに変異した変異アリルIi1 と1006部位がAに変異した変異アリルIi3 をpcDNA3.1/Hygromycin(+)に挿入した。これらのプラスミドをLipofectamine 2000 (Invitrogen 社)を用いてCHO細胞へ導入し、0.6 mg/mLのハイグロマイシンで選択した。細胞表面のI/i抗原発現の変化はFACSCaliber (Becton Dickinson 社)を用いたフローサイトメトリーにおいて、I-抗原についてはOSK-28によって、i-抗原についてはOSK-14 によって確認した。
【００６０】
▲２▼結果
CHO細胞ではIGnT活性とI-抗原の発現が見られないが、i-抗原は発現していることが報告されている（11, 25）。上記形質転換細胞を抗I-抗体と抗i-抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行った（図6）。上記フローサイトメトリーの結果、IGnT1、IGnT2、またはIGnT3を導入したいずれのCHO細胞においてもI-抗原の発現が上昇し、同時にi-抗原の発現が低下していることが示された。
【００６１】
即ち、野生型IGnT3を導入した細胞ではI-抗原の発現とi-抗原の抑制が顕著に見られたが、そのようなi/Iの発現変化はIi1アリルまたはIi3アリルを導入したいずれのCHO細胞でも見られなかった。野生型または変異型IGnT3のCHO細胞への導入と発現はリアルタイムPCRによって確認した。これらの結果から、上記突然変異によりi表現型が表れることが明らかになった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、Ii血液型の遺伝子検査による判定方法が初めて提供された。本発明の方法は、遺伝子検査であるので、従来の免疫反応を利用する方法のように、交差反応等により判定が不正確になる恐れがなく、従来よりも正確、簡便にIi血液型を判定することが可能になる。
【００６３】
なお、日本人（またはアジア人）では、i個体の場合、遺伝性の白内障になると報告（非特許文献３１）されており、今回見つけたmutationが原因である可能性がある。今回調べたi個体は遺伝性の白内障である。また、この遺伝子と関連したものも白内障を誘発する因子になりえると考えられる。また、本研究を基にした白内障治療薬の開発や、白内障の他の原因遺伝子の特定にも役立つ可能性があると考えられる。
【００６４】
【配列表】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 I抗原及びi抗原の構造及びこれらの生合成経路を示す図である。
【図２】Ａは、IGnT3のアミノ酸配列をIGnT1及びIGnT2と対比した図を示し、Ｂは、各エキソンの位置を示す。
【図３】リアルタイムＰＣＲによる、IGnT転写物のヒト組織中の定量結果を示す図である。
【図４】 CD34陽性細胞からの造血細胞分化の過程におけるIGnT転写物の発現の変化を示す図である。
【図５】成人i型家系におけるI型（野生型)、Ii1型及びIi3型アレルの分離を示す図である。
【図６】 Ii1型及びIi3型アレルｃＤＮＡでトランスフェクションしたCHO細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ii血液型の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、Ii血液型の判定方法に関する。
【０００３】
Ii血液型は、赤血球上にI（大文字のアイ)抗原及びi(小文字のアイ)抗原のいずれが表れているかに基づいて分類する血液型であり、輸血時の検査として行われている。I及びi抗原は、低温凝集自己抗体により始めて検出されたものであり、ヒトの発生において劇的に変化するものである（非特許文献１〜４)。胎児及び新生児の赤血球は、i抗原を含むがI抗原は非常に僅かであるが、生後、i抗原が減少するにつれてI抗原の発現が徐々に増大する（非特許文献３及び４)。成人及び生後１８ヶ月以降の子供の大多数は、I抗原を表し、i抗原は少ない（非特許文献３及び４)。このように、赤血球上のI抗原及びi抗原は、発生の過程において交代する。I/i抗原はまた、種々の組織及び体液の細胞表面上にも存在し（非特許文献５及び６)、組織血液型抗原であると認められている（非特許文献７)。
【０００４】
種々の研究により、I/i抗原は、糖タンパク及び糖脂質上の炭水化物構造として規定されることが明らかにされた（非特許文献８及び９)。i抗原エピトープは、Galβ1-4GlcNAcβ1-3 繰り返し単位を有する直線状ポリ-N-アセチルラクトースアミン鎖であり、一方、I抗原構造は、分枝したポリ-N-アセチルラクソースアミノグリカンを含む（図１参照）（非特許文献９及び１０)。I分枝炭水化物は、発生、分化及び発ガンの過程における細胞間の相互作用において、特に多価糖鎖末端抗原決定基を提示することにより、重要な役割を果たしているかもしれない。
【０００５】
I分枝ポリ-N-アセチルラクトースアミンがどのようにして合成されるのかを理解するために、I-分枝化酵素であるβ-1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(IGnT)を研究することは興味深いことである。IGnTをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎児ガン細胞PA-1からトランジェント発現法（非特許文献１１)により初めてクローニングされ、IGnTと命名された。もう一つのI-分枝化酵素が同定され、C2GnT-M又はC2/4GnT（後でC2GnT-2と再命名）と命名された（非特許文献１２、１３)。IGnTは、6p24染色体上に位置し、Galβ1-4GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)Galβ1-4GlcNAc構造を生産する、中心的に作用するIGnT活性をコードする。一方、C2GnT-2は、15q21-22に位置し、GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)Galβ1-4GlcNAc構造を形成する、プレディスタルに(predistally)作用するIGnT活性をコードする。
【０００６】
i表現型の成人では、赤血球がi抗原を発現し、I抗原をほとんど発現していない。成人i表現型22000人中５人であると報告され（非特許文献１)、この表現型は、常染色体性劣性形質として遺伝する。i表現型では、I抗原の欠失は、IGnT酵素の不活化の結果であると考えられている。最近、i表現型を示すヒトは、従来のIGnT遺伝子中にミスセンス突然変異を有することが報告された（非特許文献１４)。。これらの突然変異は、従来のIGnT活性を喪失させ、その結果、赤血球I抗原がない表現型をもたらすものである。もっとも、かれらは、他の組織におけるI抗原の発現については調べていない。これまでの研究により、赤血球の成人i表現型を支援すヒトにおいて、唾液、乳及び血漿では、正常な量のI抗原が検出されている（非特許文献１５及び１６)。これらの知見は、組織血液型I抗原を規定するさらなるIGnT遺伝子が存在するかもしれないことを示唆しており、血液型I遺伝子座をよりよく理解するためにこれらの遺伝子を明らかにすることが強く求められている。
【０００７】
従来、Ii血液型の判定は、抗体と血球との抗原抗体反応を用いて行われていた。しかしながら、多くの正常なヒト血清中に認められる寒冷凝集素として自己抗Ｉ抗体が知られている。室温でも反応することがあり、血液型判定や交差試験を妨げる。もし、遺伝子検査によりIi血液型を決定することができれば、このような問題が起きず、より正確に、簡便、迅速又はより微量の試料を用いてIi血液型を判定することができ、有利である。
【０００８】
【非特許文献１】
1. Wiener AS, Unger, L.H., Cohen L., Feldman, J. Type-specific cold autoantibodies as a cause of acquired hemolytic anemia and hemolytic transfusion reactions: Biologic test with bovine red cells. Ann. Intern. Med. 1956;44:221-240
【非特許文献２】
2. Marsh WL, Jenkins, W.J. Anti-i: a new cold antibody. Nature. 1960;188:753
【非特許文献３】
3. Marsh WL. Anti-I: a cold anti-body defining the Ii rerationship in human red cell. Br J Haematol. 1961;7:200-209
【非特許文献４】
4. Marsh WL, Nichols ME, Reid ME. The definition of two I antigen components. Vox Sang. 1971;20:209-217
【非特許文献５】
5. Rouger P, Juszczak G, Doinel C, Salmon C. Relationship between I and H antigens. I. A study of the plasma and saliva of a normal population. Transfusion. 1980;20:536-539
【非特許文献６】
6. Marsh WL, Nichols ME, Allen FH, Jr. Inhibition of anti-I sera by human milk. Vox Sang. 1970;18:149-154
【非特許文献７】
7. Clausen H, Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution. Vox Sang. 1989;56:1-20
【非特許文献８】
8. Fukuda M, Carlsson SR, Klock JC, Dell A. Structures of O-linked oligosaccharides isolated from normal granulocytes, chronic myelogenous leukemia cells, and acute myelogenous leukemia cells. J Biol Chem. 1986;261:12796-12806
【非特許文献９】
9. Watanabe K, Hakomori SI, Childs RA, Feizi T. Characterization of a blood group I-active ganglioside. Structural requirements for I and i specificities. J Biol Chem. 1979;254:3221-3228
【非特許文献１０】
10. Fukuda M, Fukuda MN, Hakomori S. Developmental change and genetic defect in the carbohydrate structure of band 3 glycoprotein of human erythrocyte membrane. J Biol Chem. 1979;254:3700-3703
【非特許文献１１】
11. Bierhuizen MF, Mattei MG, Fukuda M. Expression of the developmental I antigen by a cloned human cDNA encoding a member of a beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family. Genes Dev. 1993;7:468-478
【非特許文献１２】
12. Yeh JC, Ong E, Fukuda M. Molecular cloning and expression of a novel beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase that forms core 2, core 4, and I branches. J Biol Chem. 1999;274:3215-3221
【非特許文献１３】
13. Schwientek T, Nomoto M, Levery SB, Merkx G, van Kessel AG, Bennett EP, Hollingsworth MA, Clausen H. Control of O-glycan branch formation. Molecular cloning of human cDNA encoding a novel beta1,6-N-acetylglucosaminyltransferase forming core 2 and core 4. J Biol Chem. 1999;274:4504-4512
【非特許文献１４】
14. Yu LC, Twu YC, Chang CY, Lin M. Molecular basis of the adult i phenotype and the gene responsible for the expression of the human blood group I antigen. Blood. 2001;98:3840-3845
【非特許文献１５】
15. Dzierzkowa-Borodej W, Seyfried H, Nichols M, Reid M, Marsh WL. The recognition of water-soluble I blood group substance. Vox Sang. 1970;18:222-234
【非特許文献１６】
16. Marsh WL, Jensen L, Decary F, Colledge K. Water-soluble I blood group substance in the secretions of i adults. Transfusion. 1972;12:222-226
【非特許文献１７】
17. Petzer AL, Zandstra PW, Piret JM, Eaves CJ. Differential cytokine effects on primitive (CD34+CD38-) human hematopoietic cells: novel responses to Flt3-ligand and thrombopoietin. J Exp Med. 1996;183:2551-2558
【非特許文献１８】
18. Warren MK, Rose WL, Beall LD, Cone J. CD34+ cell expansion and expression of lineage markers during liquid culture of human progenitor cells. Stem Cells. 1995;13:167-174
【非特許文献１９】
19. Engelhardt M, Kumar R, Albanell J, Pettengell R, Han W, Moore MA. Telomerase regulation, cell cycle, and telomere stability in primitive hematopoietic cells. Blood. 1997;90:182-193
【非特許文献２０】
20. Brecker G SM. A time saving device for the counting of reticulocytes. Am. J. Clin. Pathol. 1950;20:1079-1083
【非特許文献２１】
21. Gibson UE, Heid CA, Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996;6:995-1001
【非特許文献２２】
22. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996;6:986-994
【非特許文献２３】
23. Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 1982;157:105-132
【非特許文献２４】
24. Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T. A novel variant form of murine beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase forming branches in poly-N-acetyllactosamines. Glycobiology. 2000;10:1001-1011
【非特許文献２５】
25. Bierhuizen MF, Fukuda M. Expression cloning of a cDNA encoding UDP-GlcNAc:Gal beta 1-3-GalNAc-R (GlcNAc to GalNAc) beta 1-6GlcNAc transferase by gene transfer into CHO cells expressing polyoma large tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:9326-9330
【非特許文献２６】
26. Narimatsu H, Sinha S, Brew K, Okayama H, Qasba PK. Cloning and sequencing of cDNA of bovine N-acetylglucosamine (beta 1-4)galactosyltransferase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:4720-4724
【非特許文献２７】
27. Lo NW, Shaper JH, Pevsner J, Shaper NL. The expanding beta 4-galactosyltransferase gene family: messages from the databanks. Glycobiology. 1998;8:517-526
【非特許文献２８】
28. Shiraishi N, Natsume A, Togayachi A, Endo T, Akashima T, Yamada Y, Imai N, Nakagawa S, Koizumi S, Sekine S, Narimatsu H, Sasaki K. Identification and characterization of three novel beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferases structurally related to the beta 1,3-galactosyltransferase family. J Biol Chem. 2001;276:3498-3507
【非特許文献２９】
29. Togayachi A, Akashima T, Ookubo R, Kudo T, Nishihara S, Iwasaki H, Natsume A, Mio H, Inokuchi J, Irimura T, Sasaki K, Narimatsu H. Molecular cloning and characterization of UDP-GlcNAc:lactosylceramide beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (beta 3Gn-T5), an essential enzyme for the expression of HNK-1 and Lewis X epitopes on glycolipids. J Biol Chem. 2001;276:22032-22040
【非特許文献３０】
30. Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T. Functional analysis of promoter activity of murine beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase. Gene. 2001;275:253-259
【非特許文献３１】
Ogata, H.、Okubo, Y.、Akabane, T., Phenotype i associated with congenital cataract in Japanese, Transfusion, 1979, 19, 166-8
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、遺伝子検査によりIi血液型を判定する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願出願人は、新規なN-アセチルグルコサミン転移酵素IGnT2及びIGnT3並びにこれらをコードする遺伝子について先に特許出願した（特願2001-401827)。本願発明者らは、さらに鋭意研究の結果、IGnT3遺伝子の特定の部位が突然変異することによりi型が生じることを見出し、これらの一塩基多型(SNP)を利用することにより、Ii血液型を遺伝子検査によって判定することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、生体から分離した試料中のIGnT3遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、1006ntがｇかａか、及び／又は1049ntがｇかａかを調べることを含む、Ii血液型の判定方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
IGnT3遺伝子は、下記実施例に詳述する方法により同定され、クローニングされたものである。その塩基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号１に示す。また、そのアミノ酸配列をIGnT1及びIGnT2と対比した図を図２のＡに示し、各エキソンの位置を図２のＢに示す。図２のＡ中、矢印がエキソン２及び３の５’末端の位置を示す。同一のアミノ酸配列を枠で囲み、保存されたシステイン残基を星印で示す。配列番号１に示す塩基配列では、エキソン２の５’末端が、９２６nt、エキソン３の５’末端が１０１８ntである。上記塩基配列を、ヒトゲノムプロジェクトの第６番染色体のゲノミック遺伝子配列(NT_007291)と対比することにより、エクソン部分を決定した。図２のＢに示されるように、IGnT1、IGnT2及びIGnT3遺伝子は、エキソン２及びエキソン３が共通であり、エキソン１のみが異なっている。なお、図２のＢは、NT_007291の219000ntから319000ntの領域を示す。
【００１３】
本発明の方法では、配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として、1006nt（1006番目の塩基という意味）がｇかａか、及び／又は1049ntがｇかａかを調べる（以下、1006ntのｇがａに変異した遺伝子を「Ii3」、1049ntのｇがａに変異した遺伝子を「Ii1」ということがある)。下記実施例に具体的に記載するように、これらの部位のいずれか一方が、ｇからａに突然変異した遺伝子が２つ揃うことによりi表現型が出現する。したがって、1006nt及び1049ntのｇがａに変異しているか否かを調べることにより、Ii血液型を判定することができる。なお、下記実施例で具体的に調べた家系では、i表現型のヒトの遺伝子型は、いずれもIi1とIi3のヘテロ接合であった。なお、下記実施例にも記載されているように、上記した２種類の変異以外にも点突然変異が存在し得る。したがって、「配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として」という文言は、変異部位の位置を特定するために用いている文言であり、被検ＤＮＡが配列番号１と完全に同一の塩基配列を有しなければならないことを意味するものではない。
【００１４】
本発明の方法に供される試料としては、特に限定されないが、赤血球系細胞（赤血球、網状赤血球、赤芽球等)を含む試料であることが好ましく、末梢血が採取が容易で好ましい。
【００１５】
上記突然変異は、常法により試料細胞中のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡ中の上記各変異を調べてもよいし、上記のように配列番号１の塩基配列中のエキソンの境界がわかっているので、ゲノミック遺伝子中の変異を直接検出してもよい。あるいは、ｍＲＮＡ中の変異や、スプライシング前の前駆ｍＲＮＡ中の変異を検出してもよい。
【００１６】
上記各突然変異の検出自体は、各変異部位の周辺の塩基配列がわかっているので、種々の周知の方法により容易に行うことができる。例えば、下記実施例に記載するように、常法により試料細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することにより行うことができる。あるいは、試料細胞中のゲノミック遺伝子を鋳型として、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。また、ｍＲＮＡをNASBA法等のＲＮＡ増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。あるいは、変異部分を含む領域に一方のプライマーを設定して核酸増幅法を行い、増幅が起きるか否かを調べることにより、変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。この場合、I型(野生型）の配列と同一又は相補的なI型プライマーと、i型(Ii3又はIi1)の配列と同一又は相補的なi型プライマーとの共存下において、増幅を行うことにより、より正確に判定することが可能である。あるいは、I型とi型で切断の有無が生じる制限酵素部位を有するプライマーを用いて増幅を行い、増幅産物をその制限酵素で処理して切断が起きるか否かを調べる(PCR-RFLP)ことによっても変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。なお、ＰＣＲ等の核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらの製品の添付文書にしたがって容易に実施することができる。あるいは、プローブを用いて調べることもできる。例えば、上記の増幅産物をサザンブロット又はノーザンブロットにかけることにより調べることができる。これらの場合、I型の配列と同一又は相補的なI型プローブと、i型の配列と同一又は相補的なi型プローブとが用いられ、I型プローブとハイブリダイズすればI型、i型プローブとハイブリダイズすればi型と判定される。あるいは、プローブをチップ上に固定したＤＮＡチップを用いて検査を行うことも可能である。なお、以上述べた種々の方法は、いずれも一塩基多型の調査方法として周知のものであり、本明細書に記載された情報があれば、当業者が容易に実施できるものである。また、突然変異の調査方法は、上記のものに限定されるものではなく、上記突然変異の有無を調べることができる方法であれば、いずれの方法を採用することもできる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
(1) ヒトIGnT cDNAのクローニング及び発現並びに特徴付け
１．遺伝子データベースの検索とIGnT２、IGｎT3の塩基配列決定
既存のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Gene Bank）：M97347, NM004751, NM001490, NM001491である。また検索は、Blast[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)]等のプログラムを利用した。
【００１９】
その結果、第六染色体のゲノム配列クローンのGene Bank Accetion No.AL139039およびNo.AL358777が見出された。さらに、この二つの配列を網羅した第六染色体のGene Bank accetion No. NT_007291が見出された。この部分配列は、既知のIGnTと相同性が高く、ゲノム上で既知のIGnTの第一エクソンを挟むように存在していた。この新規の２つの配列について遺伝子領域解析ソフトのGeneScan、HMMgene等を用いて翻訳領域を解析した。その結果、新規の２つの配列は、別々な第一エクソンであり、この独立した第一エクソンは既知のIGnTのエクソン２、エクソン３を共用している可能性が認められた。そこで、ここの第一エクソンと第三エクソンにプラマーを設計して、トランスクリプトとして存在するか調べた。また、既知のIGnTを「IGnT1」とし、新規の２つを「IGnT2」と「IGnT3」と命名した。
【００２０】
具体的には、株化細胞PA-1（奇形芽腫、ATCCより入手）より、総RNAを抽出し、常法に従ってｃDNAを合成した。このｃDNAを鋳型として使用した。用いたプライマーは、IGnT1はフォワードプライマー（5'−tgaggcatgcctttatcaatgcgttacc-3'）,リバースプライマー（5'−tgaatagctcaaaaatacctgctgggttgt-3':全て共通）、IGnT2はフォワードプライー（5'-tgaatgatgggctcttggaagcactgtc-3'）、IGnT3はフォワードプライー(5'-gtgaaaataatgaacttttggaggtactgctt-3')を用いてPCR（95℃30秒、60℃30秒、72℃2分を32サイクル）を行なった。
【００２１】
その結果、約1.2kbaseの増幅産物が得られた。このPCR増幅産物の配列を調べた。このPCR溶液をQIAquick PCR Purification kit(キアゲン)にてPCR増幅産物を精製した。この精製PCR産物を鋳型としてシークエンスを調べた。シークエンスの結果、IGnT2とIGnT3の配列（配列番号１、２）が得られた。また、IGnT1とIGnT3に関しては、pCRIIベクター（インビトロジェン社）に一般的なTAクローニング法により、サブクローニングした。
【００２２】
シーケンスの結果、エキソン２は31アミノ酸、エキソン３は62アミノ酸から成ることが判明した（図2A）。またこれらの結果をヒトゲノムプロジェクトのデータベースと比較したところ、上記予想どおりの構造で、それぞれのエキソン1は、IGnT2、IGnT1、 IGnT3の順で、エキソン２の上流に並んでいることが示された（図２B）。IGnT１エキソンから予想されるアミノ酸配列はIGnT2とIGnT3それぞれに対し、65％と66％の相同性を示した。IGnT2とIGnT3の間のエキソン１の相同性は65％であった。カイトドウリトル・ハイドロパシー（Kyte-Doolittle hydropathy）分析(23)ではIGnTは糖転移酵素に典型的な2型の膜貫通トポロジーを示した。9個のシステインが各IGnTで保存されていた。またIGnT２はマウスIGnT Bのオルソログ（機能が同一のたんぱく質）であったが、IGnT3はこれまでどの種でも報告のなかった新たな遺伝子であることがわかった。
【００２３】
２．IGnT２およびIGnT３の発現ベクターへの組込み
IGnT2およびIGnT3の発現系を作成するため、まずIGnT2およびIGnT3をインビトロジェン社のGatewayシステムのpDONR201に組込み、さらにインビトロジェン社のBac-to-BacシステムによるBacmidを作製した。さらに、陽性対照対照としてIGnT1も同様に以下に詳細を述べる。
【００２４】
GatewayシステムによるpFastBacへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
pCRIIにサブクローニングしたIGnT１およびIGnT3を鋳型にした。IGnT2はMarathon cDNAを鋳型として、IGnT1に対するプライマーF１（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTAAATATCTCAGACCCTTTGAGGCTGACT-3'）,プライマーF2(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGCACATCTTTTATCAATGGAAAAACA-3')、
IGnT2に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAGGGCAGCTCTGTCCAATGCTTCA-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTCATCAGATTTTTGAGGGGAAAG-3'）、
IGnT3に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAACAGTTCCAGTGAAAGGTATTTTAG-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTAATCACGCCTTAGAGAAAATGCCA-3'）
と共通のプライマーR（5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaAAAATACCAGCTGGGTTGTATCGCAG-3'）を用いて、PCR（98℃10秒、55℃30秒、72℃1分を30サイクル）により再度DNA断片を得た。MicroSpin S-400 HR（アマシャムファルマシアバイオテク）にてDNA断片を精製し、精製後BP クロナーゼ 反応によってpDONR201へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするDNA断片１μl、pDONR201１μl（150ng）、反応緩衝液2μｌ、BP クロナーゼ mix 2μl、TE溶液４μlを25℃で1時間インキュベートして行った。プロテイナーゼKを１μl加えて37℃10分おき反応を終了させた。
【００２５】
その後上記mix全量（1μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pDONR−IGnT1-F1、pDONR-IGnT1-F2、pDONR-IGnT2-F1、pDONR-IGnT2-F2、pDONR-IGnT3-F1、pDONR-IGnT3-F2）を抽出・精製した。
【００２６】
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
【００２７】
まずエントリークローン１μl、ｐFBIHを１μl（100ng）、LR反応緩衝液2μl、TE4μl、LR クロナーゼmix 2μlを25℃で1時間反応させ、プロテイナーゼ Kを1μl加えて37℃10分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐFBIH-IGnT1-F1、ｐFBIH-IGnT1-F2、ｐFBIH-IGnT2-F1、ｐFBIH-IGnT2-F2、ｐFBIH-IGnT3-F1、ｐFBIH-IGnT3-F2、が生成される）。ｐFBIH は、pFastBac１にIgκシグナル配列（MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG）とHisタグ(His 6個)のシーケンスを加えたもので、OT５（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggacatcaccatcaccatcac-3'）を鋳型に、プライマーOT20 (5'-cgggatccat gcattttcaa gtgcag-3')と、OT22 （5'-ggaattcgtgatggtgatggtgatg -3'）を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をBam H1 とEco R1 で挿入した。さらに、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Hisタグは精製のため挿入した。
【００２８】
その後上記混合液全量（5μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pFBIH-IGnT1-F1、pFBIH-IGnT1-F2、pFBIH-IGnT2-F1、pFBIH-IGnT2-F2、pFBIH-IGnT3-F1、pFBIH-IGnT3-F2、:同様の工程をする場合、pFBIH-IGnTsとする）を抽出・精製した。
【００２９】
またpFBIHに変えてｐFBIFでも同様に実験を行った。即ちｐFBIFはHisタグに変えて、精製用にFLAGペプチド（DYKDDDDK）を入れたもので、OT3（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggagattacaaggacgacgatgacaag-3'）を鋳型とし、プライマーOT20（上記と配列同じ）と、OT21 （5'-ggaat tcttgt catcg tcgtc cttg-3'）によって得られたDNA断片を上記と同様にBam H1 とEco R1 で挿入し、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。
【００３０】
Bac-to-BacシステムによるBacmidの作成
続いてBac-to-Bacシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐFBIH- IGnTs又はｐFBIF-IGnTsとBacmidとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なBacmidにIGnTsにその他の配列を挿入した。このシステムはTn7の組換部位を利用して、Bacmidを含む大腸菌（DH10BAC）に目的遺伝子を挿入させたpFastBac（pFBIH-IGnTsまたはpFBIF-IGnTs）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がBacmidへとりこまれるというものである。またBacmidにはlacZ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
【００３１】
即ち、上記精製ベクター（ｐFBIH-IGnTs又はｐFBIF-IGnTs）をコンピテントセル（大腸菌DH10BAC）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Bluo-gal、及びIPTGを含むLBプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Bacmidを回収した。
【００３２】
３． Bacmidの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたBacmidに目的配列が挿入していることを確認した後、このBacmidを昆虫細胞Sf21（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち35mmのシャーレにSf21 細胞9x105 細胞/2ml （抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）を加え、27℃で１時間培養して細胞を接着した。（Solution A）精製した Bacmid DNA 5 μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。（Solution B）CellFECTIN Reagent(インビトロジェン社） 6μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。その後、Solution AおよびSolution Bを丁寧に混合して15〜45分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）2mlを加えた。Solution AとSolution Bを混合して作製した溶液(lipid-DNA complexes)に抗生物質を含まないSf900II 800μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したlipid-DNA complexes溶液を細胞に加え、27℃で5時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）培養液2mlを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
【００３３】
T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml Sf-900SFM(インビトロジェン社)（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを800μｌを添加して、27℃で48〜72時間培養した。培養終了後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
【００３４】
さらに、T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml Sf-900SFM(インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したらニ次ウイルス液1000μｌを添加して、27℃で72〜96時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
【００３５】
加えて、100ml用スピナーフラスコにSf21細胞６ｘ１０５細胞/ml濃度で100mlを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
【００３６】
三次のセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：20mM HEPES pH7.5、2 % Triton X-100）細胞粗抽出液 をH2Oで20倍にし、常法によりSDS-PAGEによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするIGnT1, IGｎT2, IGｎT3（3種類同時に示す場合IGnTs）のタンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたIGnTsにはモノクローナル抗体６−His（MMS-156P、COVANCE社）、FLAG配列のついたIGnTsには抗FLAG M2-ペルオキシダーゼ（A-8592、SIGMA社）を用いた。
【００３７】
FLAG-IGnTsは、４２Kまたは４１Kの位置にバンドが検出された。
【００３８】
四次感染のFLAG-IGnTs上清10mlにNaN3（0.05 %）、NaCl (150 mM)、CaCl2 (2 mM)、抗M1レジン（Sigma 社）(50 μｌ)を混合し、4℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（3000rpm 5分4℃）ペレットを回収し、2 mMのCaCl2・TBSを900μｌ加えて再度遠心分離（2000rpm 5分4℃）し、ペレットを50μｌ の1 mM CaCl2・TBS に浮遊させ活性測定のサンプル（IGnTs酵素液）とした。
【００３９】
５． IGnT2およびIGnT3の受容体基質の探索
IGnT2およびIGnT3は、β1,６−N−アセチルグルコサミニル転移酵素である既知IGnT1と相同性が高く、IGnT1とそれぞれ73.4%、74.1%であった。そこで、第一に供与体基質（donor substrate）としてUDP-GlcNAcを用いて検討した。
【００４０】
以下の反応系を用いて、IGnTsの受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（LNnT：CALBIOCHEM）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（agalacto-LNnT）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃ（２L1:生化学工業）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（３L1：生化学工業）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（agalacto-3L1）を２−アミノベンズアミド（２AB）化したものを用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。２AB標識糖鎖は、HPLCを用いて蛍光検出器で検出した。
【００４１】
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（10 nmol）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）(50mM) 、EDTA(35 mM) 、UDP-GlcNAC (10mＭ) 、Triton-X100(0.5%)、牛血清アルブミン（2mg/ml）から成り、これにIGnTs酵素液を2.5 μｌ加えて、さらにH2Oを加えて全量10μｌとした。
【００４２】
上記反応混合液を37℃で一昼夜反応させ、反応終了後、９７℃５分間過熱して軽く遠心後上清を取得した。この反応溶液５０μlをHPLCにて分析した。HPLCの分析条件は、カラムはTSKgel ODS-80Ts QAカラム(4.6ｘ250 mm; Tosoh)、溶媒（移動相）は７％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、または受容体基質として３L1の場合のみ５％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、流速は1ml/min、励起波長：330nm、蛍光測定波長：420nmで行なった。
【００４３】
その結果、陽性対照として用いたIGnT1は、受容基質LNｎT（溶出時間１８．６分）を用いた場合、生成物は１７分にピークが認められた。すなわち、この１７分の生成物は、LNnTにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンが結合したGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。IGnT2およびIGnT3に関しても全く同様の結果が得られた。すなわち、IGnT2およびIGnT3は、ポリラクトサミン構造（Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcのような構造で基本的には「Galβ１−４GlcNAc」の繰り返し構造をポリラクトサミン構造とする）の還元末端ではないガラクトースにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンを転移する酵素であることを確認した。そこで、他の基質についても検討した。その結果を以下の表１にまとめた。agalacto-LNnTを基質とした場合の生成物はGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。2L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。agalacto-3L1を基質としたときは、生成物はGlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。３L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃ、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃである。
【００４４】
【表１】
（２）ヒト組織におけるIGnTの転写量の定量分析
▲１▼方法
Marathon Ready cDNA をCLONETECH社から購入し、リアルタイムPCRによって組織中のIGnT量を測定した（21、22）。内部標準としてはGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）を用いることにした。そこでIGnTのcDNAとGAPDHのｃDNAの標準曲線を、IGnT遺伝子を含むpDONR201ベクターとGAPDH遺伝子を含むpCR2.1（Invitrogen 社）をそれぞれ段階的に希釈して用いて作成した。プライマーとプローブは以下のものを用いた。IGnT1のフォワードプライマーとして、5'-acaaa ctaat gatcc atgag aagtc ttc-3'、リバースプライマーとして、 5'-ccatt atata tgcca aggga aagtc-3'、またIGnT1のプローブとしては 5'-FAM-tgcaa ggaat acttg accca gagcc act-MGB-3'を用いた。IGnT2のフォワードプライマーとしては 5'-gctat gagta catgg ttcga agcc-3'を、リバースプライマーは 5'-gccga agtct ttgtg gatgg t-3'またプローブは5'-FAM-tgaag aagag gctgg gttcc cttta gctta ca-MGB-3'を用いた。さらにIGnT3のフォワードプライマーについては5'-aatgc cagtc ttttt gtggg a-3'を、リバースプライマーは5'-atgta gtgat tctgg gtcag gtaat c-3'を、そしてプローブには5'-FAM-aatat attac catca ccttt gcgaa gtgtc ccttg-MGB-3'を用いた。
【００４６】
GAPDHのプライマーとプローブについてはPre-Developed TaqMan Assay Reagents, Endogenous Human GAPDH (Applied Biosystems 社)を用いた。リアルタイムPCRは常法により行った。増幅条件としては50℃で2分と95℃で10分をそれぞれ１サイクルおよび95℃で15秒と60℃で1分を50サイクル行った。PCR産物はABI PRISM 7700（Applied Biosystem 社）でシーケンスして確認した。これにより同一cDNAにおけるGAPDHの転写量に対する IGnTの転写の相対量が得られた。
【００４７】
▲２▼結果
その結果は図3に示すとおりである。IGnT2はIGnT1やIGnT3に比較して、多くの組織でより豊富に発現していることが示された。特にIGnT2は胃と小腸で最も強く発現し、腎臓、脾臓、胎盤、膵臓、肝臓、睾丸がそれに続く発現を示した。一方、脳全体、大脳皮質、胎児脳、小脳、骨格筋ではIGnT2の発現は非常に低値であった。IGnT1の発現パターンはIGnT2と同様であったが、小脳と胎児脳でIGnT2より多くの発現が見られた。逆にIGnT3の発現はIGnT1やIGnT2と異なるもので、骨髄、心臓、胃、小腸で強く、その他の組織では非常に低値または検出限界以下であった。
【００４８】
（３）造血細胞におけるIGnTの転写量の定量分析
▲１▼造血細胞の分化
造血細胞の分化に伴うIGnT遺伝子の発現レベルの変化を調べるため、家系特異的な造血細胞（骨髄CD34＋細胞）を分化させてｃDNAを調整した。具体的には以下のとおりである。
【００４９】
骨髄球系、赤血球系、巨核球系への分化を促すため、精製したCD34＋細胞を血清なしの溶液中でいくつか組み合わせた造血成長因子で処理した（17）。その後細胞を骨髄球の分化にはstem cell factor (SCF; 50 ng/mg, Sigma社, 米国) 顆粒球−マクロファージ コロニー活性因子；granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (10 ng/ml, Genetics Institute社, 米国) を、赤芽球の分化にはSCF (50 ng/ml, Chemicon International社, 米国) とエリスロポエチン；erythropoietin (3U/ml, Chemicon International社, 米国) を、また、巨核球の分化にはSCF (50 ng/ml)とトロンボポエチン；thrombopoietin (20 ng/ml)を加えて6日間培養した（18、19）。
【００５０】
▲２▼方法
定量方法は前記（２）▲１▼と同じである。
【００５１】
▲３▼結果
造血細胞の各分化段階におけるIGnT遺伝子の発現を調べたところ、先祖であるCD34＋細胞ではIGnT2が最も多く発現し、IGnT1とIGnT3は比較的低値であった。ところが赤血球系（erythroid）に分化するとIGnT3が極端に上昇し、IGnT1とIGnT2の発現が抑制されていた。また、骨髄球系（myeloid）または巨核球系(megakaryocyte)へ分化するとIGnT全体の発現が前者では亢進し、後者では抑制されることが示された（図４）。
【００５２】
赤芽球への分化においてIGnT3の発現レベルが上昇することにより、最終的に赤血球へ分化する過程において、I血液型の合成はIGnT3によるものであることが示唆された。
【００５３】
▲４▼網状赤血球におけるIGnT発現の検証
そこでこの可能性を検証するため、網状赤血球を濃縮したフラクションを得て、IGnTの発現レベルを調べることにした。詳細は以下のとおりである。
【００５４】
Optiprep (Nycomed Amersham 社、ノルウエー)を用いて製品添付のマニュアルに従ってヒト抹消血から網状赤血球のフラクションを調整した。最終的にグラジエント遠心で得られた最上部のフラクションをニューメチレンブルー（２０）によって超生体染色し、顕微鏡下で網状赤血球を数え、全体に対する割合を得たところ、末梢血全体では1.0％のところ最上部フラクションでは12.1％に濃縮されていた。このフラクションには単球や顆粒球などが見いだされず、網状赤血球のみが見いだされた。得られた網状赤血球からIsogen（ニッポンジーン社）を用いてRNAを抽出しさらにｃDNAを合成した。このcDNAを用いてリアルタイムPCRでIGnTの発現レベルを調べたところ、IGnT3は網状赤血球において明らかに発現していたが、IGnT1またはIGnT2の発現は見られなかった（表２）。
【００５５】
【表２】
（４）成人i表現型におけるIGnT遺伝子変異の発見
▲１▼方法
成人i家系である家系のひとつから成人i表現型である3名とI表現型である1名と、さらに4名のI表現型のボランテイアを選択した。RNase Mini Kit とQIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen社)を用いて それぞれの抹消血から総RNAとゲノムDNAを調整した。ゲノムDNAの調整はPCRでIGnT遺伝子のそれぞれ３つの第1エキソンと、共通の第2、第3エキソンを増幅して行った。第1エキソンのプライマーセットは、IGnT1用として 5'-taagg tctca tataa ctcag tggat g-3'と5'-gggtg agaac tatat atgtt ccagt t-3'、IGnT2用として5'-tgtag acaca ggttg cagct tagca-3'と5'-ctttt gtcct gtgaa cagag cggtt-3' 、さらにIGnT3として5'-ctggg cttag ctgag ccttt gcaa-3'と 5'-ctggg cttag ctgag ccttt gcaa-3' である。また共通する第2第3エキソン増幅のプライマーは、それぞれ5'-ctgaa gtgga gaaac cctgg ctta-3'と5'-aaccc tggat tccac agcta cctt-3'、及び 5'-agttg tagtt agtcg gagag tacct-3' と 5'-tataa ttacg tagcc aggtc ctgaa-3'を用いた。さらに5'-gcttt cactc tgctc agcgt ggtca t-3' と 5'-taccc agcca tcctg ttagt gtatt-3'のプライマー対を用いてRNAサンプルからIGnT3を増幅して配列を確認した。この増幅フラグメントをTOPO TA Cloning Kit によりpCRII-TOPO ベクター (Invitrogen社)にサブクローニングした。PCR産物はMinElute PCR Purification Kit (Qiagen社)により精製し、またプラスミドはQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社)により精製して、DYEnamic ET terminator cycle sequencing kit とMegaBACE 500 (AmershamBiosciences)を用いてシーケンスを行った。
【００５７】
▲２▼結果
その結果を図５に示す。図の左側のIは第1世代、IIは第２世代、IIIは第3世代を示す。図５中、正方形は男性、円は女性を示す。黒く塗りつぶしたヒトは、i表現型であり、半分だけ塗りつぶしたヒトは、I型遺伝子(野生型）とi型（Ii1又はIi3)のヘテロで、表現型はI型である。遺伝子型を調べたヒトについては遺伝子型を記載した。第１世代は、既に他界しているので、遺伝子型を調べることはできなかった。成人i表現型と一般I表現型のサンプルを用いたIGnT1、IGnT2、及びIGnT3 遺伝子のシーケンスを行ったところ、IGnT1、IGnT2のエキソン１では変異は見つからなかったが、IGnT3のエキソン1ではG816Cの置換による変異が見出された。しかしながらこの置換は成人i表現型だけではなく、一般I表現型においても4名中2名に見られ、無機能なSNP（single nucleotide polymorphism）と考えられた。一方G1006AとG1049Aの塩基置換はそれぞれ第2エキソンと第3エキソンで成人i表現型においてのみ見出された。
また、pCRII-TOPO ベクターにサブクローニングされたIGnT3のcDNA配列を検証したところ、成人i表現型である第2世代（G-II）の個人２、５、６（図５A）はIi1/Ii3アリルのヘテロであり、一般I表現型である第3世代（G-III）の個人1はI/Ii1のヘテロであることが判明した。Ii1/Ii3アリルにおけるG1049CとG1006Cの核酸置換は、アミノ酸レベルではそれぞれGly350Glu、Gly336Argとなる。G816CのSNPとG1006Aは同じIi3アリル上に存在する。
【００５８】
（４）IGnT3上のG1049AとG1006Aの変異はCHO細胞でのI-抗原の発現を抑制した
G1049Aを含むIi1アリルと、G816CとG1006A変異を含むIi3アリルのcDNAをCHO(Chinese hamster ovary)細胞に導入してIGnT遺伝子の発現を調べた。詳細は以下のとおりである。
【００５９】
▲１▼方法
CHO細胞を10％ウシ胎児血清添加α-MEM (minimal essential medium) 中で培養した。サブクローニングしたpCRII-IGnTs からオープンリーデイングフレーム全体を取り出して pcDNA3.1/Hygromycin(+)（インビロゲン社製）へ挿入し、pcDNA3.1-IGnTs とした。1049部位がAに変異した変異アリルIi1 と1006部位がAに変異した変異アリルIi3 をpcDNA3.1/Hygromycin(+)に挿入した。これらのプラスミドをLipofectamine 2000 (Invitrogen 社)を用いてCHO細胞へ導入し、0.6 mg/mLのハイグロマイシンで選択した。細胞表面のI/i抗原発現の変化はFACSCaliber (Becton Dickinson 社)を用いたフローサイトメトリーにおいて、I-抗原についてはOSK-28によって、i-抗原についてはOSK-14 によって確認した。
【００６０】
▲２▼結果
CHO細胞ではIGnT活性とI-抗原の発現が見られないが、i-抗原は発現していることが報告されている（11, 25）。上記形質転換細胞を抗I-抗体と抗i-抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行った（図6）。上記フローサイトメトリーの結果、IGnT1、IGnT2、またはIGnT3を導入したいずれのCHO細胞においてもI-抗原の発現が上昇し、同時にi-抗原の発現が低下していることが示された。
【００６１】
即ち、野生型IGnT3を導入した細胞ではI-抗原の発現とi-抗原の抑制が顕著に見られたが、そのようなi/Iの発現変化はIi1アリルまたはIi3アリルを導入したいずれのCHO細胞でも見られなかった。野生型または変異型IGnT3のCHO細胞への導入と発現はリアルタイムPCRによって確認した。これらの結果から、上記突然変異によりi表現型が表れることが明らかになった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、Ii血液型の遺伝子検査による判定方法が初めて提供された。本発明の方法は、遺伝子検査であるので、従来の免疫反応を利用する方法のように、交差反応等により判定が不正確になる恐れがなく、従来よりも正確、簡便にIi血液型を判定することが可能になる。
【００６３】
なお、日本人（またはアジア人）では、i個体の場合、遺伝性の白内障になると報告（非特許文献３１）されており、今回見つけたmutationが原因である可能性がある。今回調べたi個体は遺伝性の白内障である。また、この遺伝子と関連したものも白内障を誘発する因子になりえると考えられる。また、本研究を基にした白内障治療薬の開発や、白内障の他の原因遺伝子の特定にも役立つ可能性があると考えられる。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 I抗原及びi抗原の構造及びこれらの生合成経路を示す図である。
【図２】Ａは、IGnT3のアミノ酸配列をIGnT1及びIGnT2と対比した図を示し、Ｂは、各エキソンの位置を示す。
【図３】リアルタイムＰＣＲによる、IGnT転写物のヒト組織中の定量結果を示す図である。
【図４】 CD34陽性細胞からの造血細胞分化の過程におけるIGnT転写物の発現の変化を示す図である。
【図５】成人i型家系におけるI型（野生型)、Ii1型及びIi3型アレルの分離を示す図である。
【図６】 Ii1型及びIi3型アレルｃＤＮＡでトランスフェクションしたCHO細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
Claims (5)
- 生体から分離した試料中のIGnT3遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、1006ntがｇかａか、及び／又は1049ntがｇかａかを調べることを含む、Ii血液型の判定方法。
- 前記試料が、赤血球系細胞を含む試料である請求項１記載の方法。
- 前記試料が末梢血である請求項２記載の方法。
- ｃＤＮＡを調べることにより行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記1006nt及び／又は1049ntを含む領域の塩基配列を決定することにより行う請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002338637A JP4300250B2 (ja) | 2002-11-21 | 2002-11-21 | Ｉｉ血液型の判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002338637A JP4300250B2 (ja) | 2002-11-21 | 2002-11-21 | Ｉｉ血液型の判定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004166646A JP2004166646A (ja) | 2004-06-17 |
| JP4300250B2 true JP4300250B2 (ja) | 2009-07-22 |
Family
ID=32701792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002338637A Expired - Lifetime JP4300250B2 (ja) | 2002-11-21 | 2002-11-21 | Ｉｉ血液型の判定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4300250B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110942806A (zh) * | 2018-09-25 | 2020-03-31 | 深圳华大法医科技有限公司 | 一种血型基因分型方法和装置及存储介质 |
-
2002
- 2002-11-21 JP JP2002338637A patent/JP4300250B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004166646A (ja) | 2004-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | The human UDP‐N‐Acetylglucosamine: α‐6‐d‐Mannoside‐β‐1, 2‐N‐Acetylglucosaminyltransferase II Gene (MGAT2) Cloning of Genomic DNA, Localization to Chromosome 14q21, Expression in Insect Cells and Purification of the Recombinant Protein | |
| US7166449B2 (en) | α1,3-fucosyltransferase | |
| US9458508B2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors | |
| US8722366B2 (en) | Methods for synthesizing sugar chains using β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase | |
| US7670816B2 (en) | UDP-galactose:β-D-galactose-R 4-α-D-galactosyltransferase, α4gal-T1 | |
| JP4642301B2 (ja) | ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−α−Ｒ／（ＧｌｃＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ，Ｃ２ＧｎＴ３ | |
| US20200291384A1 (en) | Humanized cell line | |
| US7374919B2 (en) | UDP-galactose: β-N-acetyl-glucosamine β-1,4-galactosyltransferase, β4Gal-T2 | |
| JP2002530071A (ja) | ＵＤＰガラクトース：β−Ｎ−アセチル−グルコサミンβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、β３Ｇａｌ−Ｔ５ | |
| WO1997043405A1 (en) | UDP-N-ACETYL-α-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGALACTOSAMINYLTRANSFERASE, GalNAc-T3 | |
| JP4300250B2 (ja) | Ｉｉ血液型の判定方法 | |
| WO2000006708A1 (fr) | Nouveau polypeptide | |
| US7348171B2 (en) | N-acetylglucosaminyltransferase Vb coding sequences, recombinant cells and methods | |
| Yamamoto | recent progress in the molecular genetic study of the histo-blood group ABO system | |
| JP4545936B2 (ja) | ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃへ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｃ２／４ＧｎＴ | |
| US7223580B2 (en) | N-acetylglucosamine transferase, nucleic acid encoding the same and use thereof in diagnosing cancer and/or tumor | |
| JP4300267B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素及びそれをコードする核酸 | |
| JPH1118778A (ja) | シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ | |
| JP4251402B2 (ja) | Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体 | |
| Patnaik | Characterization of Fut10 and Fut11, Putative Alpha-1-3/4 Fucosyltransferase Genes Important for Vertebrate Development | |
| JPWO2003083110A1 (ja) | 新規ガラクトース転移酵素、そのペプチド及びこれをコードする核酸 | |
| JP2003199573A (ja) | 新規ｕｄｐ−ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びこれをコードする核酸 | |
| JP2004033064A (ja) | 新規グルクロン酸転移酵素及びその遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051101 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060324 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080826 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080925 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080925 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080929 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090114 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120501 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4300250 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501 Year of fee payment: 4 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140501 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |