JP4545936B2 - ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃへ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｃ２／４ＧｎＴ - Google Patents
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃへ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｃ２／４ＧｎＴ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4545936B2 JP4545936B2 JP2000586883A JP2000586883A JP4545936B2 JP 4545936 B2 JP4545936 B2 JP 4545936B2 JP 2000586883 A JP2000586883 A JP 2000586883A JP 2000586883 A JP2000586883 A JP 2000586883A JP 4545936 B2 JP4545936 B2 JP 4545936B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- 4gnt
- sequence
- dna
- seq
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A22—BUTCHERING; MEAT TREATMENT; PROCESSING POULTRY OR FISH
- A22B—SLAUGHTERING
- A22B5/00—Accessories for use during or after slaughtering
- A22B5/0017—Apparatus for cutting, dividing or deboning carcasses
- A22B5/0058—Removing feet or hooves from carcasses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A22—BUTCHERING; MEAT TREATMENT; PROCESSING POULTRY OR FISH
- A22B—SLAUGHTERING
- A22B5/00—Accessories for use during or after slaughtering
- A22B5/16—Skinning instruments or knives
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、遊離オリゴ糖として見出され、またはタンパク質および糖脂質に共有結合したグリカンの生合成に関する。本発明はさらに特に、コア(core)３およびコア１タイプのＯ−グリカン類の２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）のＣ６に存在するヒドロキシ基にＮ−アセチルグルコサミンを付加するＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルガラクトサミンβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）をコードする核酸の一族に関する。本発明はさらに特に、Ｃ２／４ＧｎＴと命名したＯ−グリカン β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ一族の第三員をコードする遺伝子、Ｃ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡに対するプローブ、Ｃ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、Ｃ２／４ＧｎＴを生成するための組換えプラスミドおよび組換え方法、Ｃ２／４ＧｎＴ発現用の細胞を安定して形質転換またはトランスフェクションするための組換え方法、ならびに患者におけるＤＮＡ多型性を確認する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｏ−結合したタンパク質グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの一族がＮ−アセチルガラクトサミンのセリンまたはスレオニン残基への付加を触媒する初期段階を包含する（１）。Ｏ−グリカン鎖の引き続く集合は、次の数段階の順次的生合成反応または交互的生合成反応を包含する；ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，３Ｇａｌ−トランスフェラーゼ活性による単純ムチン型コア１構造体の形成；ｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性によるコア１の複合型コア２構造体への変換；ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃαβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性による複合ムチン型コア３の直接形成；およびｉｖ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＮＡｃβ１，３ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，６−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性によるコア３のコア４への変換。１，６−ＧｌｃＮＡｃ分枝の形成（反応ｉｉおよびｉｖ）は、分化および悪性形質転換(malignant transformation)に際して生成される構造体を導くＯ−結合したタンパク質グリコシル化の鍵となる制御現象であると考えることができる（２〜６）。一例として、Ｏ−グリカン中のＧｌｃＮＡｃβ１，６ＧａｌＮＡｃ分枝の増加した形成が、Ｔ−細胞活性化中、白血病発病中、およびヴィスコット−アルドリッチ(Wiskott-Aldrich) 症候群およびＡＩＤＳなどの免疫不全の場合に見出されている（７；８）。コア２分枝は、腫瘍進行および転移に役割を演じることがある（９）。これに対して、かなりの癌は、正常細胞型に見出される複合Ｏ−グリカンから早過ぎて生成された単純ムチン型Ｏ−グリカン、例えばＴ［トムセン−フリーデンリーチ(Thomsen-Friedenreich)抗原、Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ］、Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ）、およびシアロシル(sialosyl)−Ｔｎ（ＮｅｕＡｃ２−６ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ）への変化を示す（１０）。これにかかわる分子上の基礎は、乳癌について広く研究されており、この研究で、コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼの特異的ダウンレギュレーションがムチンＭＵＣＩにおける複合型Ｏ−グリカンの見出される欠落に対応することができることが示された。従って、Ｏ−グリカンコア集合体は、シアリル−Ｔおよびシアリル−Ｔｎを形成するシアリルトランスフェラーゼおよびＣｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの発現レベルにおける逆行変化により制御することができる。
【０００３】
興味深いことに、腫瘍の転移可能性は、コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性の増加した発現と相関関係を有している（５）。コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性の増加は、セレクチン媒介接着の変更による腫瘍転移に関与することができるシアリル−ＬｅＸ を担持するポリＮ−アセチルラクトサミンの増加したレベルを付随する（４；１１）。このＯ−グリカンコア集合の制御は、図１に概略が示されている鍵酵素の活性の発現により調整される。しかしながら、翻訳後修飾、トポロジイ、または基質に対する競合を包含する後成学的因子はまた、このプロセスで役割を演じる（１１）。
【０００４】
複合Ｏ−グリコペプチド構造のサブセットのインビトロ生合成は現在、ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにβ１−３架橋でＮ−アセチルグルコサミンを付加してコア３を形成する酵素、およびβ１−６Ｎ−アセチルグルコサミン分枝の順次的付加によるコア４の形成を触媒する酵素が入手できないことにより妨害されている。この構造体は、コア４ベースの複合型Ｏ−グリカンの引き続く形成に寄与する酵素を必要とする（図１）。分枝したＯ−グリカンの伸長に必要な多くの別の酵素は入手することができ、本明細書に記載されているコア２／４酵素は現在、コア４ベース構造体の合成を可能にしている。
【０００５】
Ｃ２／４ＧｎＴをコードする遺伝子への接近は、オリゴ糖、糖タンパク質および糖スフィンゴタン脂質に対するコア２またはコア４−ベースＯ−グリカン修飾の生成に用いられるグリコシルトランスフェラーゼの生成を可能にする。この酵素は、例えば医薬用途、もしくはこれらまたはその他に対するコア２またはコア４ベースＯ−グリカンを合成的に付加して特定の酵素としての性質、免疫原性またはその他の生物学的および／または物理的性質を有する適当にグリコシル化された糖結合体を生成させるために必要であるその他の商業的用途で使用することができる。
【０００６】
従って、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトースβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）β１−６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびこれらの酵素をコードする遺伝子の主要構造にかかわる技術の必要性が存在している。本発明は、この必要性に適合し、また別の追加の利益をさらに提供する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含する、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルガラクトサミン−β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）をコードする単離した核酸を提供する。Ｃ２／４ＧｎＴは、コア３−−Ｒサッカライド誘導体とのその活性により例示されるような、Ｃ２ＧｎＴに比較して、より広いアクセプター基質特異性を有する。Ｃ２／４ＧｎＴの完全ヌクレオチド配列は、配列番号(SEQ ID NO) ：１および図２に記載されている。
【０００８】
一面において、本発明は、配列番号：１および図２に記載されているヌクレオチド４９６−１８１２のヌクレオチド配列またはその配列保守変異体または機能保守変異体を包含する単離核酸を包含する。また、配列番号：１および図２に記載されている配列を有する核酸またはその断片、もしくはその配列保守または機能保守変異体とハイブリド形成可能な単離核酸を提供し、この核酸は、好ましくは中間緊縮条件下に、最も好ましくは高緊縮条件下に、Ｃ２／４ＧｎＴ配列とハイブリド形成することができる。一態様において、当該ＤＮＡ配列は、メチオニン（アミノ酸Ｎｏ．１）からロイシン（アミノ酸Ｎｏ．４３８）までの配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列をコードする。もう一つの態様において、当該ＤＮＡ配列は、配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列のフェニルアラニン（Ｎｏ．３１）からロイシン（Ｎｏ．４３８）までの配列を包含するアミノ酸配列をコードする。
【０００９】
関連態様において、本発明は、Ｃ２／４ＧｎＴＤＮＡ配列を包含する核酸ベクターを提供し、このベクターは、これらに制限されないものとして、Ｃ２／４ＧｎＴＤＮＡ配列が転写調節要素に、ポリアデニル化配列とともに、またはこれを伴わずに、操作可能状態で結合しているベクターを包含する。これらのベクターを含有するベクターはまた、これらに制限されないものとして、過渡的に、安定して、発現性細胞を提供する。Ｃ２／４ＧｎＴ−誘導ＤＮＡ配列を含有するウイルス（バクテリオファージを包含する）がまた、提供される。本発明はまた、Ｃ２／４ＧｎＴポリペプチドの生成方法を包含する。細胞ベースの方法には、これらに制限されないものとして、Ｃ２／４ＧｎＴをコードする単離ＤＮＡ分子、またはＣ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物のホスト細胞中への導入；Ｃ２／４ＧｎＴ発現に適する条件下におけるホスト細胞の成長；およびホスト細胞により生成されるＣ２／４ＧｎＴの単離が包含される。Ｃ２／４ＧｎＴの新しい安定な発現性を備えたホスト細胞の創造方法は、Ｃ２／４ＧｎＴをコードする単離ＤＮＡ分子またはその酵素的に活性な断片（例えば、配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列のアミノ酸３１〜４３８を含むポリペプチド等）のホスト細胞中への導入、もしくはＣ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物またはその酵素的に活性な断片のホスト細胞中への導入；適当な培地におけるホスト細胞の選別および成長；およびＣ２／４ＧｎＴを発現する安定してトランスフェクトされた細胞の確認を包含する。この安定なトランスフェクトされた細胞は、適度のガラクトシル化度を有するペプチドまたはタンパク質の組換え製造用に、およびＣ２／４ＧｎＴ酵素の製造に触媒として使用するために必要であることがある。一例として、正常または病的状態の細胞にかかわらず、トランスフェクションにより修飾されたそれらのグリコシル化パターンを有する真核細胞またはこのような細胞の一部を使用し、例えばワクチン接種の免疫原などの糖ペプチドおよび糖タンパク質の特別の炭水化物形態(glycoforms)を誘導することができる。
【００１０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、これらに制限されないものとして、配列番号：２および図２に記載の配列を有するポリペプチド、配列番号：２および図２に記載のアミノ酸３１−４３８の配列を有するポリペプチド、および第二の配列（これは融合ポリペプチド中のＣ２／４ＧｎＴ酵素活性の保守に適合するいずれかの配列であることができる）にフレームとして融合している、少なくとも配列番号：２および図２に記載のアミノ酸３１−４３８からなる融合ポリペプチドを包含する単離Ｃ２／４ＧｎＴポリペプチドを提供する。適当な第二配列には、これらに制限されないものとして、親和性リガンドまたは反応性基が包含される。
【００１１】
本発明のもう一つの態様において、例えば患者の血液細胞から分離されたゲノムＤＮＡを用いるＣ２／４ＧｎＴ遺伝子のコード領域（エクソンＩＩＩ）における変異のスクリーニング方法が開示される。一態様において、この方法は、患者からのＤＮＡの分離、コードエクソンＩＩＩのＰＣＲ増幅、増幅されたエクソンＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定、およびそこからの病気に伴うＣ２／４ＧｎＴ遺伝子の潜在的構造欠損の確認を包含する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用されている全部の特許出願、特許および参考刊行物は、その全体を引用して、ここに組み入れる。対立する場合、定義を包含する本明細書の記載は、管理しようとするものとである。
【００１３】
定義：
１．本明細書で用いられるものとして、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、いずれかの長さのプリン−およびピリミジン−含有ポリマーを表わし、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、もしくは混合ポリリボ−ポリデオキシリボ−ヌクレオチドであることができる。これには、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリド、ならびに基体(bases) をアミノ酸幹鎖に共有結合することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が包含される。この用語にはまた、修飾基体を含有する核酸が包含される（下記参照）。
【００１４】
２．本明細書で用いられるものとして、「相補ＤＮＡまたはｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に存在する配列から酵素により合成されたＤＮＡ分子または配列、もしくはこのようなＤＮＡ分子のクローンを表わす。「ＤＮ構築物」は、別段では天然に存在しない様相で組合わされ、並列されているＤＮＡの区分を含有するように修飾されている一本鎖または二本鎖であるＤＮＡ分子またはこのような分子のクローンである。非制限的例として、イントロンを有していないｃＤＮＡまたはＤＮＡは、外生ＤＮＡ配列に、またはこの配列内に隣接して挿入される。
【００１５】
３．プラスミド、またはさらに一般的に、ベクターは、ホスト細胞中に挿入された場合、その複製を提供することができる遺伝情報を含有するＤＮＡ構築物である。プラスミドは一般に、ホスト細胞で発現させる少なくとも１つの遺伝子配列、およびこのような遺伝子発現を促進する配列を含有する。これには、プロモーターおよび転写開始部位が包含される。これは、線状または閉鎖円形分子であることができる。
【００１６】
４．「核酸」は、１つのアミノ酸の少なくとも一本の鎖を、明確に緊縮条件下にもう１つの核酸にアニーリングすることができる場合、相互に「ハイブリド形成することができる」。ハイブリド形成の緊縮は、例えばａ）ハイブリド形成および／または洗浄が行われる温度、およびｂ）ハイブリド形成および洗浄溶液のイオン強度および極性（例えば、ホルムアミド）、ならびにその他のパラメーターにより決定される。ハイブリド形成は、ハイブリド形成の緊縮度に応じて、２つの核酸が実質的に相補配列を含有することを要する。しかしながら、ミスマッチは、調整することができる。代表的に、高緊縮度で２つの配列をハイブリド形成すると（例えば、０．５Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、６５℃において）、配列はそれらの全体配列に比較して、幾分高度の相補性を示す必要がある。中間緊縮度の条件（例えば、２Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、６５℃において）および低緊縮度度（例えば、２Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、５５℃において）は、相当して、ハイブリド形成配列間で総合的相補性が低いことが要求される（ＩＸ ＳＳＣは、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）。
【００１７】
５．本明細書で用いられるものとして、「単離された」核酸またはポリペプチドは、その元の環境（例えば、天然産生である場合、その天然環境）から分離された部分を表わす。単離された核酸またはポリペプチドは、これが元から付随していた細胞部分の約５０％よりも少ない部分、好ましくは約７５％よりも少ない部分、最も好ましくは約９０％よりも少ない部分を含有する。
【００１８】
６．「プローブ」は、標的領域の配列を有するプローブ中の少なくとも１つの配列の相補性度により標的領域とハイブリド構造を形成する核酸を表わす。
【００１９】
７．指定配列「から誘導される」核酸は、指定配列の領域に相当する核酸配列を表わす。この用語は、当該配列と相同性または相補性である配列、および「配列−保守変異体」(sequence-conservative variants)および「機能保守変異体」(function-conservative variants)を包含する。配列−保守変異体は、指定コドン一に存在する１つまたは２つ以上の分子の変化が当該位置にコードされたアミノ酸の未改変をもたらすものである。Ｃ２／４ＧｎＴの機能保守変異体は、ポリペプチド中の指定アミノ酸残基が、天然ポリペプチドの総合的形状および酵素活性（基質特異性を包含する）を改変することなく変更されているものである。これらの変化には、これらに制限されないものとして、類似の物理−化学的性質 （例えば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するものとのアミノ酸の置き換えが包含される。
【００２０】
８．「ドナー基質」(donor substrate) は、例えばＣｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにより認識され、また当該トランスフェラーゼにかかわるＮ−アセチルグルコサミニル部分に関与する分子を表わす。Ｃ２／４ＧｎＴの場合、ドナー基質は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。「アクセプター基質」(acceptor substrate)は、好ましくは糖類またはオリゴ糖分子であり、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにより認識され、また当該トランスフェラーゼにより触媒される修飾にかかわる標的である、すなわちＮ−アセチルグルコサミニル部分を受容する分子を表わす。Ｃ２／４ＧｎＴの場合、アクセプター基質は、これらに制限されないものとして、配列Ｇａｌ １−３ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、１−３ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃ １−３ＧａｌＮＡｃを包含するオリゴ糖、糖タンパク質、Ｏ−結合したコア１−およびコア３−グリコペプチド、およびグリコスフィンゴ脂質を包含する。
【００２１】
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｎ−アセチルグルコサミン１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む単離ＤＮＡ分子を提供する。
【００２２】
Ｃ２／４ＧｎＴは、ＥＳＴデータベース配列情報の分析により確認し、またＥＳＴおよび５´ＲＡＣＥｃＤＮＡクローンに基づきクローン形成した。このクローニング戦略は簡単に要約すると、下記のとおりである：１）ＴＳＨＣ２７（配列番号：３）およびＴＳＨＣ２８（配列番号：４）で指定されるＥＳＴ配列情報から誘導されるオリゴヌクレオチドの合成；２）５´ＲＡＣＥｃＤＮＡの市販マラトン−リーディ(Marathon-Ready)を用いるｃＤＮＡ末端（５´ＲＡＣＥ）の順次的５´−迅速増幅；３）５´ＲＡＣＥｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定；４）Ｃ２／４ＧｎＴに相当する新規ｃＤＮＡ配列の確認；５）Ｃｏｌｏ２０５ヒト細胞系ｍＲＮＡを用いる可逆性転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による発現構築物の構築；６）Ｓｆ９［スポドプテラ フラギペルダ(Spodoptera frugiperda) ］細胞におけるＣ２／４ＧｎＴをコードするｃＤＮＡの発現。さらに詳細に言えば、哺乳動物ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミンβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ一族の新規第二員をコードする代表的ＤＮＡ分子の単離は、下記の引き続く操作を包含する。
【００２３】
C2GnT に相同の DNA の同定
ヒトC2GnT配列（12）のコード配列についてのデータベース検索を、The National Center for Biotechnology Information, USAにおけるdbESTデータベースに対してBLASTnおよびtBLASTnアルゴリズムを用いて実施した。BLASTnアルゴリズムはquery遺伝子（95％の同一性）を表すESTを同定するために使用し、一方tBLASTnは同一ではないが類似のEST配列の同定に使用した。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するESTはquery配列とは異なるとみなした。数個の見かけ上短い配列モチーフを有し、システイン残基が類似のスペースで配置されている１個のESTを選択し、さらに配列を解析した。
【００２４】
ヒト C2/4GnT のクローニング
C2GnTに相同な候補に由来するESTクローン178656（5’EST GenBank 受入番号AA307800）はAmerican Type Culture Collection, USAから入手した。このクローンの配列の決定から、C2GnTと有意な配列類似性を有する部分オープンリーディングフレームが明らかになった。ヒトC2GnTおよびウシ相同体のコード領域は以前に１つのエキソン中に組織化されていることが見出されている（13および未発表の観察）。C2/4GnT ESTから得られる5’および3’配列は不完全であるが、単一のエキソン中に位置すると思われるので、オープンリーディングフレームの欠けている5’および3’部分はゲノムP1クローンの配列決定によって得られた。P1クローンはヒト包皮P1ライブラリー（DuPont Merck Pharmaceutical Co. ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）からプライマーペアTSHC27（5’-GG AAGTTCATACAGTTCCCAC-3’）（配列番号：３）およびTSHC28（5’-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3’）（配列番号：４）によるスクリーニングで得られた。２つのゲノムクローンC2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026（E）およびDPMC-HFF#1- 1091（F1）はGenome System Incから入手した。P1ファージからのDNAはGenome System Incが推薦するようにして調製した。C2/4GnT遺伝子の全コード配列は両クローン中に提示され、自動配列決定装置（ABI377, Perkin-Elmer）を用いて完全に配列を決定した。確認のための配列決定は、ヒトCOLO205癌細胞系からの総cDNAについて、センスプライマーTSHC54（5’-GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC-3’）（配列番号：７）およびアンチセンスプライマー（5’-AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG-3’）（配列番号：５）を用いたPCR（95℃15秒, 55℃20秒および68℃30秒の30サイクル）によって得られたcDNAクローンについて実施した。混成配列は438アミノ酸の候補タンパク質をコードする1314塩基ペアのオープンリーディングフレームを、Swiss Institute for Experimental Cancer Research（ISREC）（http://www.isrec.isb-sib.cn/soft ware/TMPRED.form.html）においてTmpred-アルゴリズムによって予測されるタイプIIドメイン構造とともに含有した。翻訳開始部位および5’-UTRを包含するC2/4GnT mRNAの5’末端の配列は、ヒトCOLO 205癌細胞系からの総cDNAとアンチセンスプライマーTSHC48（5’-GTGGGAACTGTATGAA-3’）（配列番号：６）（図２）を用い、cDNA末端の5’迅速増幅によって得た。
【００２５】
C2/4GnT の発現
C2/4GnTのアミノ酸残基31-438をコードするように設計された発現構築体を、P1 DNAおよびプライマーペアTSHC55（5’-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3’）（配列番号：８）およびTSHC45（配列番号：５）（図２）を用いるPCRで調製した。PCR産物をpAcGP67A（PharMingen）のEcoRI部位にクローン化し、挿入体を完全に配列決定した。pAcGP67-C2/4GnT-solはBaculo-Gold（登録商標）DNA（PharMingen）で以前に記載されたように（14）コトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスは、血清含有メジウム中で増殖させたSf9細胞中２回連続増幅後に得られ、ウイルスの力価は酵素活性をモニタリングして24-ウエルプレート中での滴定により評価した。pAcGP67-C2/4GnT-solによるSf9細胞のトランスフェクションにより、非感染細胞または対照構築体で感染させた細胞と比較してGlcNAc-トランスフェラーゼの活性に著しい上昇が生じた。C2/4 GnTはO-連結コア１（Galβ1-3GalNAcα1-R）およびコア３構造（GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R）のジサッカライド誘導体で有意な活性を示した。これに反して、アクセプター基質としてのラクト-N-ネオテトラロースならびにGlcNAcβ1-3Gal-Meでは活性は全く認められず、C2/4GnTはIgnT-活性をもたないことが指示された。さらに、α-D-GalNAc-1-para-ニトロフェニルでも活性は検出されず、C2/4GnTがコア６（GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R）（表１）を形成しないことが指示された。酵素活性の基質阻害は20mMまでのコア1-para-ニトロフェニルまたはコア3-para-ニトロフェニルの高いアクセプター濃度で観察されなかった。C2/4GnTはUDP-GlcNAcに対して厳密なドナー基質特異性を示し、UDP-GalまたはUDP-GalNAcでは活性は検出されなかった（データは示していない）。
ａ．酵素ソースは感染したHigh Five（登録商標）細胞の部分精製メジウムであ った（「実験操作」の項参照）。非感染細胞または無関係な構築体で感染さ せた細胞で得られたバックグランド値を差し引いた。
ｂ．Mc, メチル；Nph, ニトロフェニル
【００２６】
対照にはpAcGP67-GalNAc-T3-solが包含された（15）。動態論的性質はHigh Five（登録商標）細胞に発現した部分精製酵素で測定した。部分精製は（16）に本質的に記載されたようにAmberlite IRA-95, DEAE-SephacrylおよびCM- Sepharose上連続クロマトグラフィーによって行った。
【００２７】
ヒト臓器のノーザンブロット解析
健康なヒト成人臓器（Clontech）からのmRNAを含有するヒト多重組織ノーザンブロットをC2/4GnT-プローブでプロービングした。16の臓器からのmRNAでのノーザン解析は、胃腸管の臓器におけるC2/4GnTの発現を示し、結腸および腎臓では高転写レベルが、小腸および膵臓では低レベルが観察された（図4A）。正常にC2/4GnTを発現する組織に由来する癌細胞におけるC2/4GnTの発現の変化を検討するため、ヒト腺癌細胞系のパネルにおけるmRNAレベルを測定した。C2/4GnT転写レベルの解析から、膵臓細胞系における発現に差異が明らかにされた。すなわち、Capan-1およびAsPC-1は転写体を発現したが、PANC-1, Capan-2およびBxPC-3では発現されなかった（図4B）。選択された細胞中では、HT-29のみがC2/4GnTの転写体を発現した。優勢な転写体のサイズは約2.4キロベースであり、これはヒトC2GnTの３つの転写体中最も小さい転写体のサイズ（12）2.1キロベースに相当する。さらに、健康な結腸粘膜からのmRNAには約3.4キロベースおよび6キロベースの転写体が得られた（図4A）。他の２つの転写体はC2/4GnTの3.3キロベースおよび5.4キロベースの転写体に類似する可能性があるが、まだ特性は明らかにされていない。C2GnTの多重転写体は、3’UTRの長さに影響するポリアデニル化シグナルの異なる使用によって起こることが示唆される。
【００２８】
C2/4GnT 遺伝子のゲノム構成
本発明はまた、C2/4GnTをコードする単離ゲノムDNA分子を提供する。プライマーペアTSHC27（5’-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3’）（配列番号：３）およびTSHC28（5’-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3’）（配列番号：４）でのスクリーニングによりヒトゲノム包皮P1ライブラリー（DuPont Merck Pharmaceu tical Co. ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）は400 bp の産物を生じるコードエキソンに位置した。C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026（E2）およびDPMC- HFF#1- 1091（F1）のための２つのゲノムクローンはGenome System Incから入手した。P1クローンは部分配列決定し、C2/4GnT mRNAの5’-非翻訳領域におけるイントロンを図６に示すように同定した。同定されたすべてのエキソン／イントロン境界はGT-ACコンセンサス規則に合致する。
【００２９】
C2/4GnT 遺伝子の染色体位置
本発明はまた、C2/4GnT遺伝子の染色体位置を開示する。単離P1ファージクローンDPMC-HFF#1-1091（F1）を用いた中期染色体に対する蛍光インシトウハイブリダイゼーションは蛍光シグナルを15q21.3に示した（図７；20の中期を評価）。他の染色体部位には特異的なハイブリダイゼーションは観察されなかった。
【００３０】
C2/4GnT遺伝子は胃腸管の臓器において選択的に発現する。本発明のC2/4GnT酵素はO-グリコシル化能力を表すことが示され、C2/4GnT遺伝子はインビボにおける正しい／完全なO-グリコシル化に当然必須であるものと解釈される。酵素の不足または完全な酵素の欠落を生じるC2/4GnT遺伝子における構造的な欠陥は、したがって、細胞または臓器を、無傷のC2/4GnT遺伝子をもつ細胞または臓器に見られるようにO-グリコシル化によりカバーされなかったタンパク質／ペプチドに曝すことになる。構造的欠陥の可能性についてコードエキソンを走査する方法は以下の実施例６に記載する。プロモーター領域を含めてC2/4GnT遺伝子の非コード領域における欠陥の特性を類似の方法で使用することができる。
【００３１】
DNA, ベクターおよび宿主細胞
本発明の実施に際しては、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学における多くの慣用技術が使用される。このような技術は周知であり、たとえばSambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A practical Approach, IおよびII巻, 1985（D.N.Glover編）; Oligonucleotide Synthesis, 1984（M.L.Gait編）; Nucleic Acid Hybridization, 1985（Hames & Higgins）; Transcription and Translation, 1984（Hames & Higgins編）；Animal Cell Culture, 1986（R.I.Freshney編）; Immobilized Cells and Enzymes, 1986（IRL Press）; Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning, the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987（J.H.Miller & M.P.Calos編, Cold Spring Harbor Laboratory）, Methods in Enzymology, 154および155巻（Wu & Grossman, それぞれWu編）;Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology 1987（Mayer & Waler編, Academic Press, London）; Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, ２版（Springer-Verlag, NY.）およびHandbook of Experimental Immunology, 1986, I-IV巻（Weir & Black編）に完全に説明されている。
【００３２】
本発明は配列番号：１および図２に掲げたように本明細書に開示された核酸配列のすべてまたは部分からなる単離核酸フラグメントを包含する。フラグメントは長さ少なくとも約８ヌクレオチド、好ましくは長さ少なくとも約12ヌクレオチド、最も好ましくは長さ少なくとも約15〜20である。本発明はさらに、2×SSC, 50℃の緊縮条件下、配列番号：１および図２に掲げたヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な配列からなる単離核酸を包含し、好ましくは、核酸は2×SSC, 65℃ でハイブリダイズ可能であり、とくに好ましくは、0.5×SSC, 65℃でハイブリダイズ可能な単離核酸である。
【００３３】
核酸は細胞から直接単離することができる。別法として、本発明の核酸を産生させるためには、化学的に合成された鎖またはゲノム材料を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を使用することができる。PCRに使用されるプライマーは本明細書に提供された配列情報を用いて合成することが可能であり、さらに、組換え発現のために与えられたベクター中への導入を容易にするため所望により、適当な新しい制限部位が導入されるように設計することができる。
【００３４】
本発明の核酸は天然のヒト調節配列によって隣接されるかまたはプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'- および3'-非翻訳領域等を包含する異種配列を伴っていてもよい。核酸はまた、本技術分野で周知の多くの手段によって修飾されていてもよい。このような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップス」、天然に存在するヌクレオチドの１または２以上の類縁基による置換、たとえば非電荷連鎖での修飾（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）および荷電連鎖での修飾（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）での修飾のようなヌクレオチド間の修飾がある。核酸は１個または２個以上の共有結合で付加した残基たとえばタンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレン等）、キレーター（たとえば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属等）およびアルキレーターを含有することができる。核酸はメチルもしくはエチルホスホトリエステル、またはアルキルホスホロアミデート連鎖の形成によって誘導体化することもできる。さらに、本発明の核酸配列は直接または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾することもできる。標識の例には放射性同位元素、蛍光分子、ビオチン等が包含される。
【００３５】
本発明によれば、有用なプローブは図２に掲げた配列中からの配列のすべてまたは部分からなる長さ少なくとも８ヌクレオチドのプローブ配列から構成され、またはそれらの配列保存性もしくは機能保存性変異体、それらの相補体、および上述のような標識体である。
【００３６】
本発明は開示された配列またはそれらの誘導体もしくはフラグメントからなる核酸ベクターを提供する。プラスミドおよび菌ベクターが様々な真核および原核宿主における複製および／または発現のために記載され、遺伝子療法ならびに単にクローニングもしくはタンパク質発現のために使用することができる。
【００３７】
組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現のために１個または２個以上の複製系、宿主における選択のための１個または２個以上のマーカーたとえば抗生物質抵抗性、および１個または２個以上の発現カセットを包含することが多い。挿入コード配列は、標準方法による合成、天然のソースからの単離、またはハイブリドとしての調製等で得られる。コード配列の転写調節エレメントおよび／またはアミノ酸コード配列へのリゲーションは既知の方法によって達成される。適当な宿主細胞は、任意の適当な方法たとえばエレクトロポレーション、CaCl2仲介DNAの取り込み、菌の感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたは他の確立された方法によって適宜、トランスフォーム／トランスフェクト／インフェクトされる。
【００３８】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、菌とくに酵母、ならびに植物および動物細胞、とくに哺乳動物細胞が包含される。とくに興味があるのはSaccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia postoris, Hansenula poly morpha, Neurospora, SF9細胞, C129細胞, 293細胞およびCHO細胞, COS細胞, HeLa細胞, ならびに不死化哺乳動物骨髄性およびリンパ性細胞系である。好ましい複製システムには、M13, ColE1, 2, ARS, SV40, バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス等が包含される。多くの転写開始および終結調節領域が単離されていて、様々な宿主において異種タンパク質の転写および翻訳に有効であることが示されている。これらの領域の例、単離方法、操作の様式等は本技術分野において周知である。適当な発現条件下に、宿主細胞は組換えによって産生されるC2/4GnT由来ペプチドおよびポリペプチドのソースとして用いることができる。
【００３９】
ベクターにはまた、C2/4GnTコード領域に操作性に連結した転写調節エレメント（すなわち、プロモーター）が包含される。プロモーターはオペレータータンパク質および／またはリボソーム結合部位を任意に含有する。大腸菌と適合性の細菌プロモーターの非限定的な例には、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（trp）プロモーター、アラビノースBADオペロンプロモーター、ラムダ由来P1プロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位、ならびにtrpおよびlacUV5プロモーターの配列から誘導されるハイブリドtacプロモーターがある。酵母プロモーターの非限定的な例には、3-ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセロアルデヒド-3ホスフェートデヒドロキナーゼ（GAPDH）プロモーター、ガラクトキナーゼ（GAL1）プロモーター、ガラクトエピメラーゼ（GAL10）プロモーター、（CUP）銅cchおよびアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）プロモーターが包含される。哺乳動物細胞に適当なプロモーターには、ウイルスプロモーターに限定されるものではないが、シミアンウイルス40（SV40）、ルーサス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、およびウシパピローマウイルス（BPV）が包含される。哺乳動物細胞はまた、ターミネーターおよびポリA付加配列を要求し、発現を増大させるエンハンサー配列も包含される。遺伝子の増幅を生じる配列も望ましい。さらに、細胞からの組換え産物の分泌を容易にする配列も包含され、それらに限定されるものではないが、細菌、酵母、および動物細胞のたとえば分泌シグナル配列および／またはプロホルモンプロ領域配列も包含される。
【００４０】
野生型または変異体ポリペプチドをコードする核酸は組換え法によって細胞に導入することもできる。たとえば、このような配列は細胞に導入することが可能で、この場合、内因性遺伝子またはその遺伝子と実質的な相同性を有する配列の部位に相同組換えが行われる。他の組換えに基づく方法、たとえば非相同組換えまたは相同組換えによる内因性遺伝子の欠失も使用できる。
【００４１】
本発明の核酸は、たとえば他の種または関連臓器におけるC2/4GnTの検出のためのプローブとして、またペプチドまたはポリペプチドの組換え製造のための鋳型として使用することができる。本発明のこれらのおよび他の実施態様は以下にさらに詳細に説明する。
【００４２】
ポリペプチドと抗体
本発明は単離されたペプチドと開示されたゲノム配列によりコードされたポリペプチドを包含する。ペプチドは好ましくは少なくとも５つの残基の長さである。
【００４３】
タンパク質をコードする配列を含む核酸はそのままの細胞中で又は無細胞翻訳系でポリペプチドの組換発現を指示するために用いることができる。既知の遺伝子コードは、望ましくはある宿主有機体中でのより効率的な発現用に仕立てられ、望ましいアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成するために用いることができる。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５のホスホラミダイト固体支持法、Ｙｏｏら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８の方法、又は他の周知の方法をこのような合成に用いることができる。得られたオリゴヌクレオチドは適当なベクターに挿入し、適合性の宿主有機体中で発現することができる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、配列番号２に開示された配列の機能保存性の変種を包含するものであるが、生来の又は異種の有機体又は細胞（細菌、菌類、昆虫、植物及び哺乳類細胞を包含するがこれらには限定されない）から単離してもよく、その中にタンパク質をコードする配列が導入され、発現される。さらに、ポリペプチドは組換融合タンパク質の部分であってもよい。
【００４５】
ポリペプチド精製の方法は当業界において周知であり、分離用非連続ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換及び分画クロマトグラフィー、並びに向流分配を包含するが、これらに限定されない。ある目的のためには、タンパク質が精製を容易にする付加的な配列タグ（制限的な例ではないが、例えばポリヒスチジン配列のような）を含んでいる組換系においてポリペプチドを生産することが好ましいこともある。ポリペプチドは次いで適当な固相マトリクス上でクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗溶解物から精製することができる。あるいは、タンパク質又はそれに由来するペプチドに対して産生された抗体を精製試薬として用いることができる。他の精製方法も可能である。
【００４６】
本発明はまたポリペプチドの誘導体及び類縁体（ホモログ）も包含する。ある目的のためには、ペプチドをコードする核酸配列を、置換、付加又は欠失により機能的に等価な分子、すなわち機能保存性変種を与えるように変更してもよい。例えば、配列中の一つ以上のアミノ酸残基を、例えば正に荷電されたアミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）；負に荷電されたアミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；極性中性アミノ酸；及び非極性アミノ酸のような、同様の性質を持った他のアミノ酸により置換することができる。
【００４７】
単離されたポリペプチドは例えばリン酸化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アシル化、又は他のタンパク質修飾により修飾することができる。それらはまた検出可能なシグナルを発することのできる標識で直接に又は間接的に修飾することもでき、この標識には放射性同位元素や蛍光性化合物が包含されるがこれらには限定されない。
【００４８】
本発明はＣ２／４ＧｎＴ由来の免疫原性成分を特異的に認識する抗体を包含する。このような抗体はＣ２／４ＧｎＴの検出及び精製のための試薬として用いることができる。
【００４９】
本発明に係るＣ２／４ＧｎＴ特異的抗体ポリクローナル及びモノクローナル抗体を包含する。抗体はＣ２／４ＧｎＴ成分での免疫化により動物宿主内で引き出すことができ、又は免疫細胞のインビトロ免疫化により形成することができる。抗体を引き出すために用いられる免疫原性成分はヒト細胞から単離されるか、又は組換系で産生される。抗体はまた適当な抗体コードＤＮＡでプログラムされた組換系で産生することもできる。あるいは抗体は精製された重鎖及び軽鎖の生化学的再構成により構築することもできる。抗体には、ハイブリッド抗体（すなわち二つのセットの重鎖／軽鎖の組合せを含み、その各々が異なる抗原を認識する）、キメラ抗体（すなわち重鎖、軽鎖、又はその両方のいずれかが融合タンパク質である）、及び一価抗体（すなわち第二の重鎖の定常領域に結合した重鎖／軽鎖複合体からなる）が包含される。また、抗体のＦａｂ’及びＦ（ａｂ）2断片を包含するＦａｂ断片も包含される。上記のタイプの抗体及び誘導体のすべてを製造する方法は当業界で周知である。例えば、ポリクローナル血清を製造し処理する技術は、Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞分子生物学における免疫化学方法）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン）に開示されている。
【００５０】
本発明の抗体は、分離用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換及び分画クロマトグラフィー、並びに向流分配を包含するがこれらには限定されない標準的な方法により精製することができる。抗体の精製方法は例えば、Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（抗体精製の技術）、１９８９、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．に開示されている。一般的なタンパク質精製方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（タンパク質精製：原理と実際）、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ編、１９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ＮＹ。
【００５１】
抗Ｃ２／４ＧｎＴ抗体はそれが標準的方法で標識されている、いないにかかわらず、免疫アッセイの基礎として用いることができる。用いられる特定の標識は用いられる免疫アッセイのタイプに依存するであろう。用いることのできる標識の例としては、32P、125Ｉ、3Ｈ及び14Ｃのような放射性標識；フルオレセイン及びその誘導体、ロダミンおよびその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロン；ルシフェリア、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類のようなケミルミネッセント発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）；ホースラディッシュパーオキシド、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような酵素が包含されるが、これらに限定されない。
【００５２】
抗体は、そのような標識で公知の方法によりタグ付けし得る。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、サクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジン等が、蛍光、ケミルミネッセンス又は抗体標識でのタグ付けのために用いられる。包含される一般的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、チャン（Chan）（編集）、1987年、「イムノアッセイ：実践ガイド（Immunoassay：Practical Guide）」、アカデミック・プレス（Academic Press）社、オーランド、フロリダ州に記載されている。
【００５３】
コア2 O−グリカンは、セレクチン結合を通じて細胞−細胞接着現象に関与し、コア2 ベータ6GlcNAc−トランスフェラーゼ活性がセレクチンリガンドの合成のために必要とされる（11）。従って、コア2 ベータ6 GlcNAc−トランスフェラーゼ活性は、ガンの転移を包含する、セレクチン媒介の細胞運輸（trafficking）において腫瘍な役割を果たしている。少なくとも2種の異なるコア2シンターゼが存在するため、これらのうちどちらが異なる細胞種におけるO-グリカンの合成、及び疾患に関与するのか同定する必要がある。コア２シンターゼ活性の個々の又は全ての阻害剤の開発は、細胞及び組織におけるコア２ O-グリカンを減少させ又は排除するのに役立ち、従って、これらのリガンドが関与する生物学的事象を阻害するのに役立ち得る。コア2 ベータ6GlcNAc−トランスフェラーゼ遺伝子の転写及び／又は翻訳の阻害もまた同様の効果を与え得る。そのような効果を有する化合物は、抗炎症活性を有する医薬として及び／又はガンの成長及び拡散の治療のために使用し得る。
【００５４】
以下の例は、本発明の範囲を制限せずに本発明をさらに例証するように意図されている。
【００５５】
例１
A： ESTデータベースの配列情報の分析によるC2/4GnTに相同なcDNAの同定
データベース検索は、ヒトC2GnT配列のコード配列により、BLASTn及びtBLASTnアルゴリズムを用いて、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information，USA）のdbESTデータベースに対して行った。BLASTnアルゴリズムを疑わしい遺伝子（95％の同一性）を表すESTsの同定に用い、他方、tBLASTnを同一ではないが、類似のEST配列の同定に用いた。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するESTsは疑わしい配列とは異なると考えた。ESTsの各セットについての全ての配列情報の複合を編集し、ヒトC2GnTとの配列の類似性について分析した。
【００５６】
B：C2/4GnTのクローニング及び配列決定
C2GnTの推定される相同体から誘導されたESTクローン178656（5’EST GenBank受け入れ番号AA307800）が米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から得られた。当該クローンの配列決定により、C2GnTと顕著な配列類似性を有する部分的な読み取り枠が明らかにされた。ヒトC2GnTのコード領域及び、ウシ相同体は、以前、一つのエキソン（13）及び （出版されていない観察）中に組織されていることが解った。C2/4GnT ESTから得られ得る5’及び3’配列は不完全であるが、一つのエキソン中に位置する可能性が高いので、読み取り枠中の失われた5’及び3’部分はゲノムP1クローンの配列決定により得られた。P1クローンはヒト包皮ゲノムP1ライブラリー（デュポン メルク ファーマシューティカル（Dupont Merck Pharmaceutical）社 ヒト包皮繊維芽細胞P1ライブラリー）から、TSHC27（5’−GGAAGTTCATACAGTTCCCAC−3’）（配列番号3）及びTSHC28（5’−CCTCCCATTCAACATCTTGAG−3’）（配列番号4）のプライマーペアによるスクリーニングにより得られた。C2/4GnTに関する二つのゲノムクローン、DPMC−HFF＃1−1026(E2)及びDPMC−HFF＃1−1091(F1)が、ゲノム システムズ（Genome Systems）社から得られた。P1ファージからのDNAを、ゲノム システムズ社からの推奨のとおり調製した。C2/4GnT遺伝子の全コード配列は両方のクローンにおいて表され、自動化配列決定（ABI377、パーキン−エルマー（Perkin−Elmer））により全配列決定した。ヒトCOLO205ガン細胞系由来の全cDNAにおけるセンスプライマーTSHC54（5’−GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC−3’）（配列番号7）及びアンチセンスプライマーTSHC45（5’−AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG−3’）（配列番号5）を用いるPCR（95℃で15秒間；55℃で20秒間；68℃で2分30秒間の30サイクル）により得られたcDNAクローンにおいて、確認的な配列決定を行った。複合配列は、スイス・インスチチュート・フォー・エクスペリメンタル・キャンサー・リサーチ（Swiss Institute for Experimental Cancer Research（ISREC））（http://www.isrec.isb-sib.ch/software/TMPRED_form.html）のTMpred アルゴリズムにより予測されたタイプIIドメイン構造を有する438アミノ酸の推定タンパク質をコードする1314塩基対の読み取り枠を含んでいた。翻訳開始部位及び5’−UTRを包含するC2/4GnTのmRNAの5’−末端の配列が、ヒトCOLO 205ガン細胞系からの全cDNAを用いたアンチセンスプライマーTSHC48（5’−GTGGGAACTGTATGAACTTCC−3’）（配列番号6）(図2)でのcDNA末端の5’高速増幅（94℃で20秒間；52℃で15秒間；及び72℃で2分間の35サイクル）により得られた。
【００５７】
例２
Ａ：Ｓｆ９細胞におけるｃ２／４ＧｎＴの発現
Ｃ２／４ＧｎＴのアミノ酸残基３１−４３８をコードするように設計された発現構築物をＰ１ＤＮＡ、およびプライマー対ＴＳＨＣ５５ (5'-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3')（配列番号８）およびＴＳＨＣ４５（配列番号５）（図２）を用いてＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ生成物をｐＡｃＧＰ６７Ａ（ファルミンゲン、PharMingen）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、挿入物を完全にシークエンスした。プラスミドｐＡｃＧＰ６７−Ｃ２１４ＧｎＴ−ｓｏｌおよびｐＡｃＧＰ６７−Ｃ２ＧｎＴ−ｓｏｌをＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（ＴＭ、商標）ＤＮＡ（ファルミンゲン）で前記のごとく（１４）コントランスフェクションした。血清含有メジウム中で生育させたＳｆ９細胞において二回の連続増幅後に組換えバクロ−ウィルス（Baculo-virus）を得、そしてウィルスの力価を酵素活性をモニターしながら２４−ウエルプレートでの滴定により測定した。対照はｐＡｃＧＰ６７−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３−ｓｏｌを含む（１５）。
【００５８】
Ｂ：Ｃ２／４ＧｎＴ活性の分析
１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン、１８０μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕−ＧｌｃＮＡｃ（６，０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）（アマーシャム ファルマシア バイオテク、Amersham Pharmacia Biotech）および指示濃度の受容体基質（シグマ アンド トロント リサーチ ラボラトリー、Sigma and Toronto Research Laboratories Ltd.,構造については表Ｉ参照）を含む５０μｌの反応混合物中において感染細胞からの培養上清を用いて標準アッセイを行なった。１００ｍＭＭＥｓ（ｐＨ７）、５ｍＭＥＤＴＡ、９０μＭＵＤＰ−〔14Ｃ〕−ＧｌｃＮＡｃ（３，０５０ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）（アマーシャム ファルマシア バイオテク）および指示濃度の受容体基質を含む５０μｌの反応混合物中で半精製Ｃ２／４ＧｎＴをアッセイした。反応生成物をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ１−Ｘ８クロマトグラフィーで定量した。
【００５９】
例３
Ｃ２／４ＧｎＴの限られた器官の発現パターン
全ＲＮＡを本質的に記載（１７）のごとくヒト結腸および膵アデノカルチノーマセルライン ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＣＯＬＯ３５７、ＨＴ−２９およびＰＡＮＣ−１から単離した。２５μｇの全ＲＮＡを前記（１７）のごとく１％変性アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。溶性Ｃ２／４ＧｎＴのｃＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。このプローブは〔α32Ｐ〕ｄＣＴＰおよびオリゴヌクレオチド標識キット（アマーシャム ファルマシア バイオテク）を用いてランダムにプライマー標識された。膜を前記のごとく（１５）４２℃で一夜プローブで調べ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃でそれぞれ３０分間２回、および０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５２℃でそれぞれ３０分間２回洗浄した。ヒトマルチプル組織ノーザーンブロット、ＭＴＮＩおよびＭＴＮII（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、を上記のごとくブローブで調べ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温でそれぞれ１０分間２回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５５℃でそれぞれ１０分間２回、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５５℃で１０分間１回洗浄した。
【００６０】
例４
Ｃ２／４ＧｎＴのコード領域のゲノム構造
ヒトゲノムクローンを、プライマー対ＴＳＨＣ２７ (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3')（配列番号３）および TSHC28(5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3')（配列番号４）でスクリーニングすることによりヒト包皮ゲノムＰ１ライブラリー（デュポン メルク ファーマシューティカル社、Dupont Merck Pharmaceutical CO.,ヒト包皮線維芽細胞Ｐ１ライブラリー）から得た。Ｃ２／４ＧｎＴ、ＤＰＭＣ−ＨＦＦ＃１−１０２６（Ｅ２）およびＤＰＭＣ−ＨＦＦ＃１−１０９１（Ｆ１）の二つのゲノムクローンをゲノムシステムズ社（Genome Systems Inc.）から得た。Ｐ１ファージからのＤＮＡをゲノムシステムズ社の推奨のごとく調製した。Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子の全コード配列が両クローンにおいて提示され、自動配列決定装置（ＡＢＩ３７７、パーキン−エルマー）を用いて完全に配列決定された。イントロン／エクソン境界はｇｔ／ａｇルールに対して最適化したｃＤＮＡ配列と比較して決定した（ブレスナッハおよびシャンボン、Breathnach and Chambon, 1981）。
【００６１】
例５
Ｃ２／４ＧｎＴの染色体位置測定：中期染色体へのインシトウ ハイブリダイゼーション
Ｐ１ＤＮＡをバイオ−ニックシステム（bio-NICK system）（ライフテクノロジー、Life Technologies）を用いてビオチン−１４−ｄＡＴＰで標識した。標識したＤＮＡをニシン精子ＤＮＡの存在下エタノール沈殿した。沈殿したＤＮＡを溶かし、８０℃で１０分間変性し、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、熱変性染色体スプレッドに加え、３７℃で湿室中で一夜ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後洗浄（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ４２℃）および脱脂ドライミルク粉末でブロッキング後、ハイブリダイズしたプローブを、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター ラボラトリーズ、Vector Laboratories）、次いでウサギ−抗−ＦＩＴＣ（ダコ、Dako）およびマウス−抗−ウサギＦＩＴＣ（ジャクソン イミュノリサーチ、Jackson Immunoresearch）を用いる二つの増幅工程により検出した。染色体スプレッドは、青色染料ＤＡＰＩを有する色あせ防止（antifade）溶液中にマウントされた。
【００６２】
例６
Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子のＤＮＡ多型の分析
図８に記載のプライマー対をコードエクソンIIIの個々の配列のＰＣＲ増幅に用いた。各ＰＣＲ生成物をサブクローンし、適当な挿入物を含む１０クローンの配列が決定され、各個体の両対立遺伝子が特徴づけられるということを確かにする。
【００６３】
上記から、本発明の特定の態様が例示の目的で記載されているが、本発明の意図および範囲を逸脱することなく種々の修正がなされうるということは明らかであろう。
【００６４】
（参考文献）
【００６５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ムシン型Ｏ−グリカンコア構造の生合成経路を示す。以下の略号を使用する。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ：ポリペプチドαＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ； ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ：ムシンα２，６−シアリルトランスフェラーゼ； Ｃ１β３Ｇａｌ−Ｔ：コア１β１，３ガラクトシルートランスフェラーゼ； Ｃ２ＧｎＴ： コア２β１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； Ｃ２／４ＧｎＴ：コア２／コア４β１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； Ｃ３ＧｎＴ：コア３β１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； ＳＴ３ＧａｌI：ムシンα２，３シアリルトランスフェラーゼ； β４Ｇａｌ−Ｔ：β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ； β３Ｇａｌ−Ｔ：β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ； β３ＧｎＴ：エロンゲーションβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ。
【図２】 図２は、Ｃ２/４ＧｎＴ（受託番号♯ ＡＦ０３８６５０）遺伝子のＤＮＡ配列及びＣ/４ＧｎＴの予想アミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は１文字コードで示す。推定トランスメンブレン領域を表す疎水性ドメインは、二重線を下に引いた。Ｎ−グリコシレーションの２つのコンセンサスモチィ―フは、星印で示した。発現構築物の調製のために用いたプライマーの位置は一重線を下に引いた。ポテンシャルポリアデニレーションシグナルは、太い線を下に引いた。
【図３】 図３は、ヒトＣ２ＧｎＴ（受託番号♯ Ｍ９７３４７）、ヒトＣ２/４ＧｎＴ（受託番号♯ ＡＦ０３８６５０）及びヒトＩ−ＧｎＴ（受託番号♯ Ｚ１９５５０）の配列を比較したものである。導入されたギャップはハイフンで示し、同じ残基はボックスで示した（全ての配列をブラック、２つの配列をグレイで示した）。予想トランスメンブレンドメインは、一重線を下に引いた。保存システインの位置は星印で示した。一つの保存Ｎ−グリコシレーション部位は丸く囲んだ。
【図４】 図４は、健常人組織及び胃癌患者のセルラインのノーザンブロッティング分析を示す。
パネルＡ：クローンテック社のＭＴＮ Ｉ及びＭＴＮ ＩＩのマルチプルヒト組織ノーザンブロットを、Ｃ２/４ＧｎＴ（９１−１３１７ベースペア）の溶解性発現フラグメントに対応する32Ｐ−ラベル化プローブでプローブした。
パネルＢ：ヒト結腸及び膵臓癌患者セルラインの全ＲＮＡのノーザンブロットを、パネルＡと同様にプローブしたものである。
【図５】 図５は、Ｃ２／４ＧｎＴ生成物ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−１ｐＮｐｈの１−Ｄ １Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの一部を示し、全ての非交換性モノサッカライドリングメチン及びエキソサイクリックメチレン共鳴を示す。ＧｌｃＮＡｃβ１→３（β３）、ＧｌｃＮＡｃβ１→６（β６）及びＧａｌＮＡｃα１→１（α）についての残基指示は、プロトン指示（１−６）に従った。β３−５（３．４５３ｐｐｍ）を除いたこの領域のすべての共鳴は印を付けた。
【図６】 図６は、コア４β６ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ生成物の1Ｈ−検出1Ｈ−13Ｃヘテロ核マルチプル結合相関（ＨＭＢＣ）スペクトラムの一部を示し、インターグリコシルＨ１−Ｃ１−Ｏ１−ＣｘとＣ１−Ｏ１−Ｃｘ−Ｈｘの相関（楕円で印を付けた交差ピーク）を示す。印を付けない交差ピークは、全てイントラ残基相関を示す。
【図７】 図７は、Ｃ２／４ＧｎＴのメタフェーズクロモゾームへの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。Ｃ２／４ＧｎＴプローブ（クローンＤＰＭＣ−ＨＦＦ♯１−１０９［Ｆ１］からのＰ１− ＤＮＡ）はバンド１５ｑ２１．３をラベル化した。
【図８】 図８は、Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子のコードエクソンを増幅するために用いることのできる順相（ＴＳＨＣ７８）及び逆相（ＴＳＨＣ７９）ＰＣＲプライマーの模式図である。プライマーの配列も示す。ＴＳＨＣ７８はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及びＴＳＨＣ７９はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を示す。
【配列表】
（技術分野）
本発明は一般に、遊離オリゴ糖として見出され、またはタンパク質および糖脂質に共有結合したグリカンの生合成に関する。本発明はさらに特に、コア(core)３およびコア１タイプのＯ−グリカン類の２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）のＣ６に存在するヒドロキシ基にＮ−アセチルグルコサミンを付加するＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルガラクトサミンβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）をコードする核酸の一族に関する。本発明はさらに特に、Ｃ２／４ＧｎＴと命名したＯ−グリカン β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ一族の第三員をコードする遺伝子、Ｃ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡに対するプローブ、Ｃ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、Ｃ２／４ＧｎＴを生成するための組換えプラスミドおよび組換え方法、Ｃ２／４ＧｎＴ発現用の細胞を安定して形質転換またはトランスフェクションするための組換え方法、ならびに患者におけるＤＮＡ多型性を確認する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｏ−結合したタンパク質グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの一族がＮ−アセチルガラクトサミンのセリンまたはスレオニン残基への付加を触媒する初期段階を包含する（１）。Ｏ−グリカン鎖の引き続く集合は、次の数段階の順次的生合成反応または交互的生合成反応を包含する；ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，３Ｇａｌ−トランスフェラーゼ活性による単純ムチン型コア１構造体の形成；ｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性によるコア１の複合型コア２構造体への変換；ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃαβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性による複合ムチン型コア３の直接形成；およびｉｖ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＮＡｃβ１，３ＧａｌＮＡｃα−Ｒβ１，６−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性によるコア３のコア４への変換。１，６−ＧｌｃＮＡｃ分枝の形成（反応ｉｉおよびｉｖ）は、分化および悪性形質転換(malignant transformation)に際して生成される構造体を導くＯ−結合したタンパク質グリコシル化の鍵となる制御現象であると考えることができる（２〜６）。一例として、Ｏ−グリカン中のＧｌｃＮＡｃβ１，６ＧａｌＮＡｃ分枝の増加した形成が、Ｔ−細胞活性化中、白血病発病中、およびヴィスコット−アルドリッチ(Wiskott-Aldrich) 症候群およびＡＩＤＳなどの免疫不全の場合に見出されている（７；８）。コア２分枝は、腫瘍進行および転移に役割を演じることがある（９）。これに対して、かなりの癌は、正常細胞型に見出される複合Ｏ−グリカンから早過ぎて生成された単純ムチン型Ｏ−グリカン、例えばＴ［トムセン−フリーデンリーチ(Thomsen-Friedenreich)抗原、Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ］、Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ）、およびシアロシル(sialosyl)−Ｔｎ（ＮｅｕＡｃ２−６ＧａｌＮＡｃ １−Ｒ）への変化を示す（１０）。これにかかわる分子上の基礎は、乳癌について広く研究されており、この研究で、コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼの特異的ダウンレギュレーションがムチンＭＵＣＩにおける複合型Ｏ−グリカンの見出される欠落に対応することができることが示された。従って、Ｏ−グリカンコア集合体は、シアリル−Ｔおよびシアリル−Ｔｎを形成するシアリルトランスフェラーゼおよびＣｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの発現レベルにおける逆行変化により制御することができる。
【０００３】
興味深いことに、腫瘍の転移可能性は、コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性の増加した発現と相関関係を有している（５）。コア２β６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ活性の増加は、セレクチン媒介接着の変更による腫瘍転移に関与することができるシアリル−ＬｅＸ を担持するポリＮ−アセチルラクトサミンの増加したレベルを付随する（４；１１）。このＯ−グリカンコア集合の制御は、図１に概略が示されている鍵酵素の活性の発現により調整される。しかしながら、翻訳後修飾、トポロジイ、または基質に対する競合を包含する後成学的因子はまた、このプロセスで役割を演じる（１１）。
【０００４】
複合Ｏ−グリコペプチド構造のサブセットのインビトロ生合成は現在、ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにβ１−３架橋でＮ−アセチルグルコサミンを付加してコア３を形成する酵素、およびβ１−６Ｎ−アセチルグルコサミン分枝の順次的付加によるコア４の形成を触媒する酵素が入手できないことにより妨害されている。この構造体は、コア４ベースの複合型Ｏ−グリカンの引き続く形成に寄与する酵素を必要とする（図１）。分枝したＯ−グリカンの伸長に必要な多くの別の酵素は入手することができ、本明細書に記載されているコア２／４酵素は現在、コア４ベース構造体の合成を可能にしている。
【０００５】
Ｃ２／４ＧｎＴをコードする遺伝子への接近は、オリゴ糖、糖タンパク質および糖スフィンゴタン脂質に対するコア２またはコア４−ベースＯ−グリカン修飾の生成に用いられるグリコシルトランスフェラーゼの生成を可能にする。この酵素は、例えば医薬用途、もしくはこれらまたはその他に対するコア２またはコア４ベースＯ−グリカンを合成的に付加して特定の酵素としての性質、免疫原性またはその他の生物学的および／または物理的性質を有する適当にグリコシル化された糖結合体を生成させるために必要であるその他の商業的用途で使用することができる。
【０００６】
従って、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトースβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）β１−６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびこれらの酵素をコードする遺伝子の主要構造にかかわる技術の必要性が存在している。本発明は、この必要性に適合し、また別の追加の利益をさらに提供する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含する、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルガラクトサミン−β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）をコードする単離した核酸を提供する。Ｃ２／４ＧｎＴは、コア３−−Ｒサッカライド誘導体とのその活性により例示されるような、Ｃ２ＧｎＴに比較して、より広いアクセプター基質特異性を有する。Ｃ２／４ＧｎＴの完全ヌクレオチド配列は、配列番号(SEQ ID NO) ：１および図２に記載されている。
【０００８】
一面において、本発明は、配列番号：１および図２に記載されているヌクレオチド４９６−１８１２のヌクレオチド配列またはその配列保守変異体または機能保守変異体を包含する単離核酸を包含する。また、配列番号：１および図２に記載されている配列を有する核酸またはその断片、もしくはその配列保守または機能保守変異体とハイブリド形成可能な単離核酸を提供し、この核酸は、好ましくは中間緊縮条件下に、最も好ましくは高緊縮条件下に、Ｃ２／４ＧｎＴ配列とハイブリド形成することができる。一態様において、当該ＤＮＡ配列は、メチオニン（アミノ酸Ｎｏ．１）からロイシン（アミノ酸Ｎｏ．４３８）までの配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列をコードする。もう一つの態様において、当該ＤＮＡ配列は、配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列のフェニルアラニン（Ｎｏ．３１）からロイシン（Ｎｏ．４３８）までの配列を包含するアミノ酸配列をコードする。
【０００９】
関連態様において、本発明は、Ｃ２／４ＧｎＴＤＮＡ配列を包含する核酸ベクターを提供し、このベクターは、これらに制限されないものとして、Ｃ２／４ＧｎＴＤＮＡ配列が転写調節要素に、ポリアデニル化配列とともに、またはこれを伴わずに、操作可能状態で結合しているベクターを包含する。これらのベクターを含有するベクターはまた、これらに制限されないものとして、過渡的に、安定して、発現性細胞を提供する。Ｃ２／４ＧｎＴ−誘導ＤＮＡ配列を含有するウイルス（バクテリオファージを包含する）がまた、提供される。本発明はまた、Ｃ２／４ＧｎＴポリペプチドの生成方法を包含する。細胞ベースの方法には、これらに制限されないものとして、Ｃ２／４ＧｎＴをコードする単離ＤＮＡ分子、またはＣ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物のホスト細胞中への導入；Ｃ２／４ＧｎＴ発現に適する条件下におけるホスト細胞の成長；およびホスト細胞により生成されるＣ２／４ＧｎＴの単離が包含される。Ｃ２／４ＧｎＴの新しい安定な発現性を備えたホスト細胞の創造方法は、Ｃ２／４ＧｎＴをコードする単離ＤＮＡ分子またはその酵素的に活性な断片（例えば、配列番号：２および図２に示されているアミノ酸配列のアミノ酸３１〜４３８を含むポリペプチド等）のホスト細胞中への導入、もしくはＣ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物またはその酵素的に活性な断片のホスト細胞中への導入；適当な培地におけるホスト細胞の選別および成長；およびＣ２／４ＧｎＴを発現する安定してトランスフェクトされた細胞の確認を包含する。この安定なトランスフェクトされた細胞は、適度のガラクトシル化度を有するペプチドまたはタンパク質の組換え製造用に、およびＣ２／４ＧｎＴ酵素の製造に触媒として使用するために必要であることがある。一例として、正常または病的状態の細胞にかかわらず、トランスフェクションにより修飾されたそれらのグリコシル化パターンを有する真核細胞またはこのような細胞の一部を使用し、例えばワクチン接種の免疫原などの糖ペプチドおよび糖タンパク質の特別の炭水化物形態(glycoforms)を誘導することができる。
【００１０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、これらに制限されないものとして、配列番号：２および図２に記載の配列を有するポリペプチド、配列番号：２および図２に記載のアミノ酸３１−４３８の配列を有するポリペプチド、および第二の配列（これは融合ポリペプチド中のＣ２／４ＧｎＴ酵素活性の保守に適合するいずれかの配列であることができる）にフレームとして融合している、少なくとも配列番号：２および図２に記載のアミノ酸３１−４３８からなる融合ポリペプチドを包含する単離Ｃ２／４ＧｎＴポリペプチドを提供する。適当な第二配列には、これらに制限されないものとして、親和性リガンドまたは反応性基が包含される。
【００１１】
本発明のもう一つの態様において、例えば患者の血液細胞から分離されたゲノムＤＮＡを用いるＣ２／４ＧｎＴ遺伝子のコード領域（エクソンＩＩＩ）における変異のスクリーニング方法が開示される。一態様において、この方法は、患者からのＤＮＡの分離、コードエクソンＩＩＩのＰＣＲ増幅、増幅されたエクソンＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定、およびそこからの病気に伴うＣ２／４ＧｎＴ遺伝子の潜在的構造欠損の確認を包含する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用されている全部の特許出願、特許および参考刊行物は、その全体を引用して、ここに組み入れる。対立する場合、定義を包含する本明細書の記載は、管理しようとするものとである。
【００１３】
定義：
１．本明細書で用いられるものとして、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、いずれかの長さのプリン−およびピリミジン−含有ポリマーを表わし、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、もしくは混合ポリリボ−ポリデオキシリボ−ヌクレオチドであることができる。これには、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリド、ならびに基体(bases) をアミノ酸幹鎖に共有結合することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が包含される。この用語にはまた、修飾基体を含有する核酸が包含される（下記参照）。
【００１４】
２．本明細書で用いられるものとして、「相補ＤＮＡまたはｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に存在する配列から酵素により合成されたＤＮＡ分子または配列、もしくはこのようなＤＮＡ分子のクローンを表わす。「ＤＮ構築物」は、別段では天然に存在しない様相で組合わされ、並列されているＤＮＡの区分を含有するように修飾されている一本鎖または二本鎖であるＤＮＡ分子またはこのような分子のクローンである。非制限的例として、イントロンを有していないｃＤＮＡまたはＤＮＡは、外生ＤＮＡ配列に、またはこの配列内に隣接して挿入される。
【００１５】
３．プラスミド、またはさらに一般的に、ベクターは、ホスト細胞中に挿入された場合、その複製を提供することができる遺伝情報を含有するＤＮＡ構築物である。プラスミドは一般に、ホスト細胞で発現させる少なくとも１つの遺伝子配列、およびこのような遺伝子発現を促進する配列を含有する。これには、プロモーターおよび転写開始部位が包含される。これは、線状または閉鎖円形分子であることができる。
【００１６】
４．「核酸」は、１つのアミノ酸の少なくとも一本の鎖を、明確に緊縮条件下にもう１つの核酸にアニーリングすることができる場合、相互に「ハイブリド形成することができる」。ハイブリド形成の緊縮は、例えばａ）ハイブリド形成および／または洗浄が行われる温度、およびｂ）ハイブリド形成および洗浄溶液のイオン強度および極性（例えば、ホルムアミド）、ならびにその他のパラメーターにより決定される。ハイブリド形成は、ハイブリド形成の緊縮度に応じて、２つの核酸が実質的に相補配列を含有することを要する。しかしながら、ミスマッチは、調整することができる。代表的に、高緊縮度で２つの配列をハイブリド形成すると（例えば、０．５Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、６５℃において）、配列はそれらの全体配列に比較して、幾分高度の相補性を示す必要がある。中間緊縮度の条件（例えば、２Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、６５℃において）および低緊縮度度（例えば、２Ｘ ＳＳＣの水性溶液中、５５℃において）は、相当して、ハイブリド形成配列間で総合的相補性が低いことが要求される（ＩＸ ＳＳＣは、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）。
【００１７】
５．本明細書で用いられるものとして、「単離された」核酸またはポリペプチドは、その元の環境（例えば、天然産生である場合、その天然環境）から分離された部分を表わす。単離された核酸またはポリペプチドは、これが元から付随していた細胞部分の約５０％よりも少ない部分、好ましくは約７５％よりも少ない部分、最も好ましくは約９０％よりも少ない部分を含有する。
【００１８】
６．「プローブ」は、標的領域の配列を有するプローブ中の少なくとも１つの配列の相補性度により標的領域とハイブリド構造を形成する核酸を表わす。
【００１９】
７．指定配列「から誘導される」核酸は、指定配列の領域に相当する核酸配列を表わす。この用語は、当該配列と相同性または相補性である配列、および「配列−保守変異体」(sequence-conservative variants)および「機能保守変異体」(function-conservative variants)を包含する。配列−保守変異体は、指定コドン一に存在する１つまたは２つ以上の分子の変化が当該位置にコードされたアミノ酸の未改変をもたらすものである。Ｃ２／４ＧｎＴの機能保守変異体は、ポリペプチド中の指定アミノ酸残基が、天然ポリペプチドの総合的形状および酵素活性（基質特異性を包含する）を改変することなく変更されているものである。これらの変化には、これらに制限されないものとして、類似の物理−化学的性質 （例えば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するものとのアミノ酸の置き換えが包含される。
【００２０】
８．「ドナー基質」(donor substrate) は、例えばＣｏｒｅ−β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにより認識され、また当該トランスフェラーゼにかかわるＮ−アセチルグルコサミニル部分に関与する分子を表わす。Ｃ２／４ＧｎＴの場合、ドナー基質は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。「アクセプター基質」(acceptor substrate)は、好ましくは糖類またはオリゴ糖分子であり、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにより認識され、また当該トランスフェラーゼにより触媒される修飾にかかわる標的である、すなわちＮ−アセチルグルコサミニル部分を受容する分子を表わす。Ｃ２／４ＧｎＴの場合、アクセプター基質は、これらに制限されないものとして、配列Ｇａｌ １−３ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、１−３ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃ １−３ＧａｌＮＡｃを包含するオリゴ糖、糖タンパク質、Ｏ−結合したコア１−およびコア３−グリコペプチド、およびグリコスフィンゴ脂質を包含する。
【００２１】
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｎ−アセチルグルコサミン１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む単離ＤＮＡ分子を提供する。
【００２２】
Ｃ２／４ＧｎＴは、ＥＳＴデータベース配列情報の分析により確認し、またＥＳＴおよび５´ＲＡＣＥｃＤＮＡクローンに基づきクローン形成した。このクローニング戦略は簡単に要約すると、下記のとおりである：１）ＴＳＨＣ２７（配列番号：３）およびＴＳＨＣ２８（配列番号：４）で指定されるＥＳＴ配列情報から誘導されるオリゴヌクレオチドの合成；２）５´ＲＡＣＥｃＤＮＡの市販マラトン−リーディ(Marathon-Ready)を用いるｃＤＮＡ末端（５´ＲＡＣＥ）の順次的５´−迅速増幅；３）５´ＲＡＣＥｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定；４）Ｃ２／４ＧｎＴに相当する新規ｃＤＮＡ配列の確認；５）Ｃｏｌｏ２０５ヒト細胞系ｍＲＮＡを用いる可逆性転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による発現構築物の構築；６）Ｓｆ９［スポドプテラ フラギペルダ(Spodoptera frugiperda) ］細胞におけるＣ２／４ＧｎＴをコードするｃＤＮＡの発現。さらに詳細に言えば、哺乳動物ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミンβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ一族の新規第二員をコードする代表的ＤＮＡ分子の単離は、下記の引き続く操作を包含する。
【００２３】
C2GnT に相同の DNA の同定
ヒトC2GnT配列（12）のコード配列についてのデータベース検索を、The National Center for Biotechnology Information, USAにおけるdbESTデータベースに対してBLASTnおよびtBLASTnアルゴリズムを用いて実施した。BLASTnアルゴリズムはquery遺伝子（95％の同一性）を表すESTを同定するために使用し、一方tBLASTnは同一ではないが類似のEST配列の同定に使用した。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するESTはquery配列とは異なるとみなした。数個の見かけ上短い配列モチーフを有し、システイン残基が類似のスペースで配置されている１個のESTを選択し、さらに配列を解析した。
【００２４】
ヒト C2/4GnT のクローニング
C2GnTに相同な候補に由来するESTクローン178656（5’EST GenBank 受入番号AA307800）はAmerican Type Culture Collection, USAから入手した。このクローンの配列の決定から、C2GnTと有意な配列類似性を有する部分オープンリーディングフレームが明らかになった。ヒトC2GnTおよびウシ相同体のコード領域は以前に１つのエキソン中に組織化されていることが見出されている（13および未発表の観察）。C2/4GnT ESTから得られる5’および3’配列は不完全であるが、単一のエキソン中に位置すると思われるので、オープンリーディングフレームの欠けている5’および3’部分はゲノムP1クローンの配列決定によって得られた。P1クローンはヒト包皮P1ライブラリー（DuPont Merck Pharmaceutical Co. ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）からプライマーペアTSHC27（5’-GG AAGTTCATACAGTTCCCAC-3’）（配列番号：３）およびTSHC28（5’-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3’）（配列番号：４）によるスクリーニングで得られた。２つのゲノムクローンC2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026（E）およびDPMC-HFF#1- 1091（F1）はGenome System Incから入手した。P1ファージからのDNAはGenome System Incが推薦するようにして調製した。C2/4GnT遺伝子の全コード配列は両クローン中に提示され、自動配列決定装置（ABI377, Perkin-Elmer）を用いて完全に配列を決定した。確認のための配列決定は、ヒトCOLO205癌細胞系からの総cDNAについて、センスプライマーTSHC54（5’-GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC-3’）（配列番号：７）およびアンチセンスプライマー（5’-AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG-3’）（配列番号：５）を用いたPCR（95℃15秒, 55℃20秒および68℃30秒の30サイクル）によって得られたcDNAクローンについて実施した。混成配列は438アミノ酸の候補タンパク質をコードする1314塩基ペアのオープンリーディングフレームを、Swiss Institute for Experimental Cancer Research（ISREC）（http://www.isrec.isb-sib.cn/soft ware/TMPRED.form.html）においてTmpred-アルゴリズムによって予測されるタイプIIドメイン構造とともに含有した。翻訳開始部位および5’-UTRを包含するC2/4GnT mRNAの5’末端の配列は、ヒトCOLO 205癌細胞系からの総cDNAとアンチセンスプライマーTSHC48（5’-GTGGGAACTGTATGAA-3’）（配列番号：６）（図２）を用い、cDNA末端の5’迅速増幅によって得た。
【００２５】
C2/4GnT の発現
C2/4GnTのアミノ酸残基31-438をコードするように設計された発現構築体を、P1 DNAおよびプライマーペアTSHC55（5’-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3’）（配列番号：８）およびTSHC45（配列番号：５）（図２）を用いるPCRで調製した。PCR産物をpAcGP67A（PharMingen）のEcoRI部位にクローン化し、挿入体を完全に配列決定した。pAcGP67-C2/4GnT-solはBaculo-Gold（登録商標）DNA（PharMingen）で以前に記載されたように（14）コトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスは、血清含有メジウム中で増殖させたSf9細胞中２回連続増幅後に得られ、ウイルスの力価は酵素活性をモニタリングして24-ウエルプレート中での滴定により評価した。pAcGP67-C2/4GnT-solによるSf9細胞のトランスフェクションにより、非感染細胞または対照構築体で感染させた細胞と比較してGlcNAc-トランスフェラーゼの活性に著しい上昇が生じた。C2/4 GnTはO-連結コア１（Galβ1-3GalNAcα1-R）およびコア３構造（GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R）のジサッカライド誘導体で有意な活性を示した。これに反して、アクセプター基質としてのラクト-N-ネオテトラロースならびにGlcNAcβ1-3Gal-Meでは活性は全く認められず、C2/4GnTはIgnT-活性をもたないことが指示された。さらに、α-D-GalNAc-1-para-ニトロフェニルでも活性は検出されず、C2/4GnTがコア６（GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R）（表１）を形成しないことが指示された。酵素活性の基質阻害は20mMまでのコア1-para-ニトロフェニルまたはコア3-para-ニトロフェニルの高いアクセプター濃度で観察されなかった。C2/4GnTはUDP-GlcNAcに対して厳密なドナー基質特異性を示し、UDP-GalまたはUDP-GalNAcでは活性は検出されなかった（データは示していない）。
ｂ．Mc, メチル；Nph, ニトロフェニル
【００２６】
対照にはpAcGP67-GalNAc-T3-solが包含された（15）。動態論的性質はHigh Five（登録商標）細胞に発現した部分精製酵素で測定した。部分精製は（16）に本質的に記載されたようにAmberlite IRA-95, DEAE-SephacrylおよびCM- Sepharose上連続クロマトグラフィーによって行った。
【００２７】
ヒト臓器のノーザンブロット解析
健康なヒト成人臓器（Clontech）からのmRNAを含有するヒト多重組織ノーザンブロットをC2/4GnT-プローブでプロービングした。16の臓器からのmRNAでのノーザン解析は、胃腸管の臓器におけるC2/4GnTの発現を示し、結腸および腎臓では高転写レベルが、小腸および膵臓では低レベルが観察された（図4A）。正常にC2/4GnTを発現する組織に由来する癌細胞におけるC2/4GnTの発現の変化を検討するため、ヒト腺癌細胞系のパネルにおけるmRNAレベルを測定した。C2/4GnT転写レベルの解析から、膵臓細胞系における発現に差異が明らかにされた。すなわち、Capan-1およびAsPC-1は転写体を発現したが、PANC-1, Capan-2およびBxPC-3では発現されなかった（図4B）。選択された細胞中では、HT-29のみがC2/4GnTの転写体を発現した。優勢な転写体のサイズは約2.4キロベースであり、これはヒトC2GnTの３つの転写体中最も小さい転写体のサイズ（12）2.1キロベースに相当する。さらに、健康な結腸粘膜からのmRNAには約3.4キロベースおよび6キロベースの転写体が得られた（図4A）。他の２つの転写体はC2/4GnTの3.3キロベースおよび5.4キロベースの転写体に類似する可能性があるが、まだ特性は明らかにされていない。C2GnTの多重転写体は、3’UTRの長さに影響するポリアデニル化シグナルの異なる使用によって起こることが示唆される。
【００２８】
C2/4GnT 遺伝子のゲノム構成
本発明はまた、C2/4GnTをコードする単離ゲノムDNA分子を提供する。プライマーペアTSHC27（5’-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3’）（配列番号：３）およびTSHC28（5’-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3’）（配列番号：４）でのスクリーニングによりヒトゲノム包皮P1ライブラリー（DuPont Merck Pharmaceu tical Co. ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）は400 bp の産物を生じるコードエキソンに位置した。C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026（E2）およびDPMC- HFF#1- 1091（F1）のための２つのゲノムクローンはGenome System Incから入手した。P1クローンは部分配列決定し、C2/4GnT mRNAの5’-非翻訳領域におけるイントロンを図６に示すように同定した。同定されたすべてのエキソン／イントロン境界はGT-ACコンセンサス規則に合致する。
【００２９】
C2/4GnT 遺伝子の染色体位置
本発明はまた、C2/4GnT遺伝子の染色体位置を開示する。単離P1ファージクローンDPMC-HFF#1-1091（F1）を用いた中期染色体に対する蛍光インシトウハイブリダイゼーションは蛍光シグナルを15q21.3に示した（図７；20の中期を評価）。他の染色体部位には特異的なハイブリダイゼーションは観察されなかった。
【００３０】
C2/4GnT遺伝子は胃腸管の臓器において選択的に発現する。本発明のC2/4GnT酵素はO-グリコシル化能力を表すことが示され、C2/4GnT遺伝子はインビボにおける正しい／完全なO-グリコシル化に当然必須であるものと解釈される。酵素の不足または完全な酵素の欠落を生じるC2/4GnT遺伝子における構造的な欠陥は、したがって、細胞または臓器を、無傷のC2/4GnT遺伝子をもつ細胞または臓器に見られるようにO-グリコシル化によりカバーされなかったタンパク質／ペプチドに曝すことになる。構造的欠陥の可能性についてコードエキソンを走査する方法は以下の実施例６に記載する。プロモーター領域を含めてC2/4GnT遺伝子の非コード領域における欠陥の特性を類似の方法で使用することができる。
【００３１】
DNA, ベクターおよび宿主細胞
本発明の実施に際しては、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学における多くの慣用技術が使用される。このような技術は周知であり、たとえばSambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A practical Approach, IおよびII巻, 1985（D.N.Glover編）; Oligonucleotide Synthesis, 1984（M.L.Gait編）; Nucleic Acid Hybridization, 1985（Hames & Higgins）; Transcription and Translation, 1984（Hames & Higgins編）；Animal Cell Culture, 1986（R.I.Freshney編）; Immobilized Cells and Enzymes, 1986（IRL Press）; Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning, the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987（J.H.Miller & M.P.Calos編, Cold Spring Harbor Laboratory）, Methods in Enzymology, 154および155巻（Wu & Grossman, それぞれWu編）;Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology 1987（Mayer & Waler編, Academic Press, London）; Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, ２版（Springer-Verlag, NY.）およびHandbook of Experimental Immunology, 1986, I-IV巻（Weir & Black編）に完全に説明されている。
【００３２】
本発明は配列番号：１および図２に掲げたように本明細書に開示された核酸配列のすべてまたは部分からなる単離核酸フラグメントを包含する。フラグメントは長さ少なくとも約８ヌクレオチド、好ましくは長さ少なくとも約12ヌクレオチド、最も好ましくは長さ少なくとも約15〜20である。本発明はさらに、2×SSC, 50℃の緊縮条件下、配列番号：１および図２に掲げたヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な配列からなる単離核酸を包含し、好ましくは、核酸は2×SSC, 65℃ でハイブリダイズ可能であり、とくに好ましくは、0.5×SSC, 65℃でハイブリダイズ可能な単離核酸である。
【００３３】
核酸は細胞から直接単離することができる。別法として、本発明の核酸を産生させるためには、化学的に合成された鎖またはゲノム材料を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を使用することができる。PCRに使用されるプライマーは本明細書に提供された配列情報を用いて合成することが可能であり、さらに、組換え発現のために与えられたベクター中への導入を容易にするため所望により、適当な新しい制限部位が導入されるように設計することができる。
【００３４】
本発明の核酸は天然のヒト調節配列によって隣接されるかまたはプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'- および3'-非翻訳領域等を包含する異種配列を伴っていてもよい。核酸はまた、本技術分野で周知の多くの手段によって修飾されていてもよい。このような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップス」、天然に存在するヌクレオチドの１または２以上の類縁基による置換、たとえば非電荷連鎖での修飾（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）および荷電連鎖での修飾（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）での修飾のようなヌクレオチド間の修飾がある。核酸は１個または２個以上の共有結合で付加した残基たとえばタンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレン等）、キレーター（たとえば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属等）およびアルキレーターを含有することができる。核酸はメチルもしくはエチルホスホトリエステル、またはアルキルホスホロアミデート連鎖の形成によって誘導体化することもできる。さらに、本発明の核酸配列は直接または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾することもできる。標識の例には放射性同位元素、蛍光分子、ビオチン等が包含される。
【００３５】
本発明によれば、有用なプローブは図２に掲げた配列中からの配列のすべてまたは部分からなる長さ少なくとも８ヌクレオチドのプローブ配列から構成され、またはそれらの配列保存性もしくは機能保存性変異体、それらの相補体、および上述のような標識体である。
【００３６】
本発明は開示された配列またはそれらの誘導体もしくはフラグメントからなる核酸ベクターを提供する。プラスミドおよび菌ベクターが様々な真核および原核宿主における複製および／または発現のために記載され、遺伝子療法ならびに単にクローニングもしくはタンパク質発現のために使用することができる。
【００３７】
組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現のために１個または２個以上の複製系、宿主における選択のための１個または２個以上のマーカーたとえば抗生物質抵抗性、および１個または２個以上の発現カセットを包含することが多い。挿入コード配列は、標準方法による合成、天然のソースからの単離、またはハイブリドとしての調製等で得られる。コード配列の転写調節エレメントおよび／またはアミノ酸コード配列へのリゲーションは既知の方法によって達成される。適当な宿主細胞は、任意の適当な方法たとえばエレクトロポレーション、CaCl2仲介DNAの取り込み、菌の感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたは他の確立された方法によって適宜、トランスフォーム／トランスフェクト／インフェクトされる。
【００３８】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、菌とくに酵母、ならびに植物および動物細胞、とくに哺乳動物細胞が包含される。とくに興味があるのはSaccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia postoris, Hansenula poly morpha, Neurospora, SF9細胞, C129細胞, 293細胞およびCHO細胞, COS細胞, HeLa細胞, ならびに不死化哺乳動物骨髄性およびリンパ性細胞系である。好ましい複製システムには、M13, ColE1, 2, ARS, SV40, バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス等が包含される。多くの転写開始および終結調節領域が単離されていて、様々な宿主において異種タンパク質の転写および翻訳に有効であることが示されている。これらの領域の例、単離方法、操作の様式等は本技術分野において周知である。適当な発現条件下に、宿主細胞は組換えによって産生されるC2/4GnT由来ペプチドおよびポリペプチドのソースとして用いることができる。
【００３９】
ベクターにはまた、C2/4GnTコード領域に操作性に連結した転写調節エレメント（すなわち、プロモーター）が包含される。プロモーターはオペレータータンパク質および／またはリボソーム結合部位を任意に含有する。大腸菌と適合性の細菌プロモーターの非限定的な例には、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（trp）プロモーター、アラビノースBADオペロンプロモーター、ラムダ由来P1プロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位、ならびにtrpおよびlacUV5プロモーターの配列から誘導されるハイブリドtacプロモーターがある。酵母プロモーターの非限定的な例には、3-ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセロアルデヒド-3ホスフェートデヒドロキナーゼ（GAPDH）プロモーター、ガラクトキナーゼ（GAL1）プロモーター、ガラクトエピメラーゼ（GAL10）プロモーター、（CUP）銅cchおよびアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）プロモーターが包含される。哺乳動物細胞に適当なプロモーターには、ウイルスプロモーターに限定されるものではないが、シミアンウイルス40（SV40）、ルーサス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、およびウシパピローマウイルス（BPV）が包含される。哺乳動物細胞はまた、ターミネーターおよびポリA付加配列を要求し、発現を増大させるエンハンサー配列も包含される。遺伝子の増幅を生じる配列も望ましい。さらに、細胞からの組換え産物の分泌を容易にする配列も包含され、それらに限定されるものではないが、細菌、酵母、および動物細胞のたとえば分泌シグナル配列および／またはプロホルモンプロ領域配列も包含される。
【００４０】
野生型または変異体ポリペプチドをコードする核酸は組換え法によって細胞に導入することもできる。たとえば、このような配列は細胞に導入することが可能で、この場合、内因性遺伝子またはその遺伝子と実質的な相同性を有する配列の部位に相同組換えが行われる。他の組換えに基づく方法、たとえば非相同組換えまたは相同組換えによる内因性遺伝子の欠失も使用できる。
【００４１】
本発明の核酸は、たとえば他の種または関連臓器におけるC2/4GnTの検出のためのプローブとして、またペプチドまたはポリペプチドの組換え製造のための鋳型として使用することができる。本発明のこれらのおよび他の実施態様は以下にさらに詳細に説明する。
【００４２】
ポリペプチドと抗体
本発明は単離されたペプチドと開示されたゲノム配列によりコードされたポリペプチドを包含する。ペプチドは好ましくは少なくとも５つの残基の長さである。
【００４３】
タンパク質をコードする配列を含む核酸はそのままの細胞中で又は無細胞翻訳系でポリペプチドの組換発現を指示するために用いることができる。既知の遺伝子コードは、望ましくはある宿主有機体中でのより効率的な発現用に仕立てられ、望ましいアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成するために用いることができる。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５のホスホラミダイト固体支持法、Ｙｏｏら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８の方法、又は他の周知の方法をこのような合成に用いることができる。得られたオリゴヌクレオチドは適当なベクターに挿入し、適合性の宿主有機体中で発現することができる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、配列番号２に開示された配列の機能保存性の変種を包含するものであるが、生来の又は異種の有機体又は細胞（細菌、菌類、昆虫、植物及び哺乳類細胞を包含するがこれらには限定されない）から単離してもよく、その中にタンパク質をコードする配列が導入され、発現される。さらに、ポリペプチドは組換融合タンパク質の部分であってもよい。
【００４５】
ポリペプチド精製の方法は当業界において周知であり、分離用非連続ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換及び分画クロマトグラフィー、並びに向流分配を包含するが、これらに限定されない。ある目的のためには、タンパク質が精製を容易にする付加的な配列タグ（制限的な例ではないが、例えばポリヒスチジン配列のような）を含んでいる組換系においてポリペプチドを生産することが好ましいこともある。ポリペプチドは次いで適当な固相マトリクス上でクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗溶解物から精製することができる。あるいは、タンパク質又はそれに由来するペプチドに対して産生された抗体を精製試薬として用いることができる。他の精製方法も可能である。
【００４６】
本発明はまたポリペプチドの誘導体及び類縁体（ホモログ）も包含する。ある目的のためには、ペプチドをコードする核酸配列を、置換、付加又は欠失により機能的に等価な分子、すなわち機能保存性変種を与えるように変更してもよい。例えば、配列中の一つ以上のアミノ酸残基を、例えば正に荷電されたアミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）；負に荷電されたアミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；極性中性アミノ酸；及び非極性アミノ酸のような、同様の性質を持った他のアミノ酸により置換することができる。
【００４７】
単離されたポリペプチドは例えばリン酸化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アシル化、又は他のタンパク質修飾により修飾することができる。それらはまた検出可能なシグナルを発することのできる標識で直接に又は間接的に修飾することもでき、この標識には放射性同位元素や蛍光性化合物が包含されるがこれらには限定されない。
【００４８】
本発明はＣ２／４ＧｎＴ由来の免疫原性成分を特異的に認識する抗体を包含する。このような抗体はＣ２／４ＧｎＴの検出及び精製のための試薬として用いることができる。
【００４９】
本発明に係るＣ２／４ＧｎＴ特異的抗体ポリクローナル及びモノクローナル抗体を包含する。抗体はＣ２／４ＧｎＴ成分での免疫化により動物宿主内で引き出すことができ、又は免疫細胞のインビトロ免疫化により形成することができる。抗体を引き出すために用いられる免疫原性成分はヒト細胞から単離されるか、又は組換系で産生される。抗体はまた適当な抗体コードＤＮＡでプログラムされた組換系で産生することもできる。あるいは抗体は精製された重鎖及び軽鎖の生化学的再構成により構築することもできる。抗体には、ハイブリッド抗体（すなわち二つのセットの重鎖／軽鎖の組合せを含み、その各々が異なる抗原を認識する）、キメラ抗体（すなわち重鎖、軽鎖、又はその両方のいずれかが融合タンパク質である）、及び一価抗体（すなわち第二の重鎖の定常領域に結合した重鎖／軽鎖複合体からなる）が包含される。また、抗体のＦａｂ’及びＦ（ａｂ）2断片を包含するＦａｂ断片も包含される。上記のタイプの抗体及び誘導体のすべてを製造する方法は当業界で周知である。例えば、ポリクローナル血清を製造し処理する技術は、Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞分子生物学における免疫化学方法）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン）に開示されている。
【００５０】
本発明の抗体は、分離用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換及び分画クロマトグラフィー、並びに向流分配を包含するがこれらには限定されない標準的な方法により精製することができる。抗体の精製方法は例えば、Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（抗体精製の技術）、１９８９、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．に開示されている。一般的なタンパク質精製方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（タンパク質精製：原理と実際）、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ編、１９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ＮＹ。
【００５１】
抗Ｃ２／４ＧｎＴ抗体はそれが標準的方法で標識されている、いないにかかわらず、免疫アッセイの基礎として用いることができる。用いられる特定の標識は用いられる免疫アッセイのタイプに依存するであろう。用いることのできる標識の例としては、32P、125Ｉ、3Ｈ及び14Ｃのような放射性標識；フルオレセイン及びその誘導体、ロダミンおよびその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロン；ルシフェリア、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類のようなケミルミネッセント発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）；ホースラディッシュパーオキシド、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような酵素が包含されるが、これらに限定されない。
【００５２】
抗体は、そのような標識で公知の方法によりタグ付けし得る。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、サクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジン等が、蛍光、ケミルミネッセンス又は抗体標識でのタグ付けのために用いられる。包含される一般的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、チャン（Chan）（編集）、1987年、「イムノアッセイ：実践ガイド（Immunoassay：Practical Guide）」、アカデミック・プレス（Academic Press）社、オーランド、フロリダ州に記載されている。
【００５３】
コア2 O−グリカンは、セレクチン結合を通じて細胞−細胞接着現象に関与し、コア2 ベータ6GlcNAc−トランスフェラーゼ活性がセレクチンリガンドの合成のために必要とされる（11）。従って、コア2 ベータ6 GlcNAc−トランスフェラーゼ活性は、ガンの転移を包含する、セレクチン媒介の細胞運輸（trafficking）において腫瘍な役割を果たしている。少なくとも2種の異なるコア2シンターゼが存在するため、これらのうちどちらが異なる細胞種におけるO-グリカンの合成、及び疾患に関与するのか同定する必要がある。コア２シンターゼ活性の個々の又は全ての阻害剤の開発は、細胞及び組織におけるコア２ O-グリカンを減少させ又は排除するのに役立ち、従って、これらのリガンドが関与する生物学的事象を阻害するのに役立ち得る。コア2 ベータ6GlcNAc−トランスフェラーゼ遺伝子の転写及び／又は翻訳の阻害もまた同様の効果を与え得る。そのような効果を有する化合物は、抗炎症活性を有する医薬として及び／又はガンの成長及び拡散の治療のために使用し得る。
【００５４】
以下の例は、本発明の範囲を制限せずに本発明をさらに例証するように意図されている。
【００５５】
例１
A： ESTデータベースの配列情報の分析によるC2/4GnTに相同なcDNAの同定
データベース検索は、ヒトC2GnT配列のコード配列により、BLASTn及びtBLASTnアルゴリズムを用いて、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information，USA）のdbESTデータベースに対して行った。BLASTnアルゴリズムを疑わしい遺伝子（95％の同一性）を表すESTsの同定に用い、他方、tBLASTnを同一ではないが、類似のEST配列の同定に用いた。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するESTsは疑わしい配列とは異なると考えた。ESTsの各セットについての全ての配列情報の複合を編集し、ヒトC2GnTとの配列の類似性について分析した。
【００５６】
B：C2/4GnTのクローニング及び配列決定
C2GnTの推定される相同体から誘導されたESTクローン178656（5’EST GenBank受け入れ番号AA307800）が米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から得られた。当該クローンの配列決定により、C2GnTと顕著な配列類似性を有する部分的な読み取り枠が明らかにされた。ヒトC2GnTのコード領域及び、ウシ相同体は、以前、一つのエキソン（13）及び （出版されていない観察）中に組織されていることが解った。C2/4GnT ESTから得られ得る5’及び3’配列は不完全であるが、一つのエキソン中に位置する可能性が高いので、読み取り枠中の失われた5’及び3’部分はゲノムP1クローンの配列決定により得られた。P1クローンはヒト包皮ゲノムP1ライブラリー（デュポン メルク ファーマシューティカル（Dupont Merck Pharmaceutical）社 ヒト包皮繊維芽細胞P1ライブラリー）から、TSHC27（5’−GGAAGTTCATACAGTTCCCAC−3’）（配列番号3）及びTSHC28（5’−CCTCCCATTCAACATCTTGAG−3’）（配列番号4）のプライマーペアによるスクリーニングにより得られた。C2/4GnTに関する二つのゲノムクローン、DPMC−HFF＃1−1026(E2)及びDPMC−HFF＃1−1091(F1)が、ゲノム システムズ（Genome Systems）社から得られた。P1ファージからのDNAを、ゲノム システムズ社からの推奨のとおり調製した。C2/4GnT遺伝子の全コード配列は両方のクローンにおいて表され、自動化配列決定（ABI377、パーキン−エルマー（Perkin−Elmer））により全配列決定した。ヒトCOLO205ガン細胞系由来の全cDNAにおけるセンスプライマーTSHC54（5’−GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC−3’）（配列番号7）及びアンチセンスプライマーTSHC45（5’−AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG−3’）（配列番号5）を用いるPCR（95℃で15秒間；55℃で20秒間；68℃で2分30秒間の30サイクル）により得られたcDNAクローンにおいて、確認的な配列決定を行った。複合配列は、スイス・インスチチュート・フォー・エクスペリメンタル・キャンサー・リサーチ（Swiss Institute for Experimental Cancer Research（ISREC））（http://www.isrec.isb-sib.ch/software/TMPRED_form.html）のTMpred アルゴリズムにより予測されたタイプIIドメイン構造を有する438アミノ酸の推定タンパク質をコードする1314塩基対の読み取り枠を含んでいた。翻訳開始部位及び5’−UTRを包含するC2/4GnTのmRNAの5’−末端の配列が、ヒトCOLO 205ガン細胞系からの全cDNAを用いたアンチセンスプライマーTSHC48（5’−GTGGGAACTGTATGAACTTCC−3’）（配列番号6）(図2)でのcDNA末端の5’高速増幅（94℃で20秒間；52℃で15秒間；及び72℃で2分間の35サイクル）により得られた。
【００５７】
例２
Ａ：Ｓｆ９細胞におけるｃ２／４ＧｎＴの発現
Ｃ２／４ＧｎＴのアミノ酸残基３１−４３８をコードするように設計された発現構築物をＰ１ＤＮＡ、およびプライマー対ＴＳＨＣ５５ (5'-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3')（配列番号８）およびＴＳＨＣ４５（配列番号５）（図２）を用いてＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ生成物をｐＡｃＧＰ６７Ａ（ファルミンゲン、PharMingen）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、挿入物を完全にシークエンスした。プラスミドｐＡｃＧＰ６７−Ｃ２１４ＧｎＴ−ｓｏｌおよびｐＡｃＧＰ６７−Ｃ２ＧｎＴ−ｓｏｌをＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（ＴＭ、商標）ＤＮＡ（ファルミンゲン）で前記のごとく（１４）コントランスフェクションした。血清含有メジウム中で生育させたＳｆ９細胞において二回の連続増幅後に組換えバクロ−ウィルス（Baculo-virus）を得、そしてウィルスの力価を酵素活性をモニターしながら２４−ウエルプレートでの滴定により測定した。対照はｐＡｃＧＰ６７−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３−ｓｏｌを含む（１５）。
【００５８】
Ｂ：Ｃ２／４ＧｎＴ活性の分析
１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン、１８０μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕−ＧｌｃＮＡｃ（６，０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）（アマーシャム ファルマシア バイオテク、Amersham Pharmacia Biotech）および指示濃度の受容体基質（シグマ アンド トロント リサーチ ラボラトリー、Sigma and Toronto Research Laboratories Ltd.,構造については表Ｉ参照）を含む５０μｌの反応混合物中において感染細胞からの培養上清を用いて標準アッセイを行なった。１００ｍＭＭＥｓ（ｐＨ７）、５ｍＭＥＤＴＡ、９０μＭＵＤＰ−〔14Ｃ〕−ＧｌｃＮＡｃ（３，０５０ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）（アマーシャム ファルマシア バイオテク）および指示濃度の受容体基質を含む５０μｌの反応混合物中で半精製Ｃ２／４ＧｎＴをアッセイした。反応生成物をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ１−Ｘ８クロマトグラフィーで定量した。
【００５９】
例３
Ｃ２／４ＧｎＴの限られた器官の発現パターン
全ＲＮＡを本質的に記載（１７）のごとくヒト結腸および膵アデノカルチノーマセルライン ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＣＯＬＯ３５７、ＨＴ−２９およびＰＡＮＣ−１から単離した。２５μｇの全ＲＮＡを前記（１７）のごとく１％変性アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。溶性Ｃ２／４ＧｎＴのｃＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。このプローブは〔α32Ｐ〕ｄＣＴＰおよびオリゴヌクレオチド標識キット（アマーシャム ファルマシア バイオテク）を用いてランダムにプライマー標識された。膜を前記のごとく（１５）４２℃で一夜プローブで調べ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃でそれぞれ３０分間２回、および０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５２℃でそれぞれ３０分間２回洗浄した。ヒトマルチプル組織ノーザーンブロット、ＭＴＮＩおよびＭＴＮII（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、を上記のごとくブローブで調べ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温でそれぞれ１０分間２回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５５℃でそれぞれ１０分間２回、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５５℃で１０分間１回洗浄した。
【００６０】
例４
Ｃ２／４ＧｎＴのコード領域のゲノム構造
ヒトゲノムクローンを、プライマー対ＴＳＨＣ２７ (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3')（配列番号３）および TSHC28(5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3')（配列番号４）でスクリーニングすることによりヒト包皮ゲノムＰ１ライブラリー（デュポン メルク ファーマシューティカル社、Dupont Merck Pharmaceutical CO.,ヒト包皮線維芽細胞Ｐ１ライブラリー）から得た。Ｃ２／４ＧｎＴ、ＤＰＭＣ−ＨＦＦ＃１−１０２６（Ｅ２）およびＤＰＭＣ−ＨＦＦ＃１−１０９１（Ｆ１）の二つのゲノムクローンをゲノムシステムズ社（Genome Systems Inc.）から得た。Ｐ１ファージからのＤＮＡをゲノムシステムズ社の推奨のごとく調製した。Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子の全コード配列が両クローンにおいて提示され、自動配列決定装置（ＡＢＩ３７７、パーキン−エルマー）を用いて完全に配列決定された。イントロン／エクソン境界はｇｔ／ａｇルールに対して最適化したｃＤＮＡ配列と比較して決定した（ブレスナッハおよびシャンボン、Breathnach and Chambon, 1981）。
【００６１】
例５
Ｃ２／４ＧｎＴの染色体位置測定：中期染色体へのインシトウ ハイブリダイゼーション
Ｐ１ＤＮＡをバイオ−ニックシステム（bio-NICK system）（ライフテクノロジー、Life Technologies）を用いてビオチン−１４−ｄＡＴＰで標識した。標識したＤＮＡをニシン精子ＤＮＡの存在下エタノール沈殿した。沈殿したＤＮＡを溶かし、８０℃で１０分間変性し、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、熱変性染色体スプレッドに加え、３７℃で湿室中で一夜ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後洗浄（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ４２℃）および脱脂ドライミルク粉末でブロッキング後、ハイブリダイズしたプローブを、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター ラボラトリーズ、Vector Laboratories）、次いでウサギ−抗−ＦＩＴＣ（ダコ、Dako）およびマウス−抗−ウサギＦＩＴＣ（ジャクソン イミュノリサーチ、Jackson Immunoresearch）を用いる二つの増幅工程により検出した。染色体スプレッドは、青色染料ＤＡＰＩを有する色あせ防止（antifade）溶液中にマウントされた。
【００６２】
例６
Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子のＤＮＡ多型の分析
図８に記載のプライマー対をコードエクソンIIIの個々の配列のＰＣＲ増幅に用いた。各ＰＣＲ生成物をサブクローンし、適当な挿入物を含む１０クローンの配列が決定され、各個体の両対立遺伝子が特徴づけられるということを確かにする。
【００６３】
上記から、本発明の特定の態様が例示の目的で記載されているが、本発明の意図および範囲を逸脱することなく種々の修正がなされうるということは明らかであろう。
【００６４】
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ムシン型Ｏ−グリカンコア構造の生合成経路を示す。以下の略号を使用する。
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ：ポリペプチドαＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ； ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ：ムシンα２，６−シアリルトランスフェラーゼ； Ｃ１β３Ｇａｌ−Ｔ：コア１β１，３ガラクトシルートランスフェラーゼ； Ｃ２ＧｎＴ： コア２β１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； Ｃ２／４ＧｎＴ：コア２／コア４β１，６ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； Ｃ３ＧｎＴ：コア３β１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ； ＳＴ３ＧａｌI：ムシンα２，３シアリルトランスフェラーゼ； β４Ｇａｌ−Ｔ：β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ； β３Ｇａｌ−Ｔ：β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ； β３ＧｎＴ：エロンゲーションβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ。
【図２】 図２は、Ｃ２/４ＧｎＴ（受託番号♯ ＡＦ０３８６５０）遺伝子のＤＮＡ配列及びＣ/４ＧｎＴの予想アミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は１文字コードで示す。推定トランスメンブレン領域を表す疎水性ドメインは、二重線を下に引いた。Ｎ−グリコシレーションの２つのコンセンサスモチィ―フは、星印で示した。発現構築物の調製のために用いたプライマーの位置は一重線を下に引いた。ポテンシャルポリアデニレーションシグナルは、太い線を下に引いた。
【図３】 図３は、ヒトＣ２ＧｎＴ（受託番号♯ Ｍ９７３４７）、ヒトＣ２/４ＧｎＴ（受託番号♯ ＡＦ０３８６５０）及びヒトＩ−ＧｎＴ（受託番号♯ Ｚ１９５５０）の配列を比較したものである。導入されたギャップはハイフンで示し、同じ残基はボックスで示した（全ての配列をブラック、２つの配列をグレイで示した）。予想トランスメンブレンドメインは、一重線を下に引いた。保存システインの位置は星印で示した。一つの保存Ｎ−グリコシレーション部位は丸く囲んだ。
【図４】 図４は、健常人組織及び胃癌患者のセルラインのノーザンブロッティング分析を示す。
パネルＡ：クローンテック社のＭＴＮ Ｉ及びＭＴＮ ＩＩのマルチプルヒト組織ノーザンブロットを、Ｃ２/４ＧｎＴ（９１−１３１７ベースペア）の溶解性発現フラグメントに対応する32Ｐ−ラベル化プローブでプローブした。
パネルＢ：ヒト結腸及び膵臓癌患者セルラインの全ＲＮＡのノーザンブロットを、パネルＡと同様にプローブしたものである。
【図５】 図５は、Ｃ２／４ＧｎＴ生成物ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−１ｐＮｐｈの１−Ｄ １Ｈ−ＮＭＲスペクトラムの一部を示し、全ての非交換性モノサッカライドリングメチン及びエキソサイクリックメチレン共鳴を示す。ＧｌｃＮＡｃβ１→３（β３）、ＧｌｃＮＡｃβ１→６（β６）及びＧａｌＮＡｃα１→１（α）についての残基指示は、プロトン指示（１−６）に従った。β３−５（３．４５３ｐｐｍ）を除いたこの領域のすべての共鳴は印を付けた。
【図６】 図６は、コア４β６ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ生成物の1Ｈ−検出1Ｈ−13Ｃヘテロ核マルチプル結合相関（ＨＭＢＣ）スペクトラムの一部を示し、インターグリコシルＨ１−Ｃ１−Ｏ１−ＣｘとＣ１−Ｏ１−Ｃｘ−Ｈｘの相関（楕円で印を付けた交差ピーク）を示す。印を付けない交差ピークは、全てイントラ残基相関を示す。
【図７】 図７は、Ｃ２／４ＧｎＴのメタフェーズクロモゾームへの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。Ｃ２／４ＧｎＴプローブ（クローンＤＰＭＣ−ＨＦＦ♯１−１０９［Ｆ１］からのＰ１− ＤＮＡ）はバンド１５ｑ２１．３をラベル化した。
【図８】 図８は、Ｃ２／４ＧｎＴ遺伝子のコードエクソンを増幅するために用いることのできる順相（ＴＳＨＣ７８）及び逆相（ＴＳＨＣ７９）ＰＣＲプライマーの模式図である。プライマーの配列も示す。ＴＳＨＣ７８はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及びＴＳＨＣ７９はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を示す。
【配列表】
Claims (19)
- ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：配列番号２のアミノ酸配列を有するガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）又は、そのフラグメントであって配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８からなるＣ２／４ＧｎＴ活性を有するフラグメント、をコードする単離された核酸。
- 当該核酸がＤＮＡである、請求項１記載の単離された核酸。
- 当該ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２記載の単離された核酸。
- 当該核酸が、配列番号１中のヌクレオチド１〜２３１９のヌクレオチド配列；配列番号１中のヌクレオチド４９６〜１８１２のヌクレオチド配列；又は配列番号１中のヌクレオチド５８６〜１８１２のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１記載の単離された核酸。
- ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：配列番号２のアミノ酸配列を有するガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）又は、そのフラグメントであって配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８からなるＣ２／４ＧｎＴ活性を有するフラグメント、をコードする核酸配列を含む核酸ベクター。
- 当該配列が配列番号１中のヌクレオチド１〜２３１９のヌクレオチド配列を含む、請求項５記載のベクター。
- 当該Ｃ２／４ＧｎＴをコードする配列が操作によって転写制御因子に連結できる、請求項５記載のベクター。
- 請求項５記載のベクターからなる細胞。
- 請求項７記載のベクターからなる細胞。
- 当該細胞が当該ベクターで安定にトランスフェクトされている、請求項９記載の細胞。
- 当該細胞が酵素的に活性なＣ２／４ＧｎＴを生成する、請求項８記載の細胞。
- 当該細胞が菌、酵母、昆虫、トリ及び哺乳動物の細胞からなる群から選択される、請求項８記載の細胞。
- 当該細胞が菌、酵母、昆虫、トリ及び哺乳動物の細胞からなる群から選択される、請求項１１記載の細胞。
- 当該細胞がＳｆ９である、請求項１３記載の細胞。
- 当該細胞がＣＨＯである、請求項１３記載の細胞。
- ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：配列番号２のアミノ酸配列を有するガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２／４ＧｎＴ）又は、そのフラグメントであって配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８からなるＣ２／４ＧｎＴ活性を有するフラグメント。
- 少なくとも縁に第２の配列を融合させた配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８からなるＣ２／４ＧｎＴ活性を保持した融合ポリペプチド。
- 酵素的に活性なＣ２／４ＧｎＴポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）宿主細胞にヒトＣ２／４ＧｎＴをコードする単離されたＤＮＡ分子またはＣ２／４ＧｎＴをコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物を導入し、
（ｉｉ）宿主細胞をヒトＣ２／４ＧｎＴ発現に適した条件下で成長させ、及び
（ｉｉｉ）宿主細胞によって生成されたＣ２／４ＧｎＴを単離する
ことを含む方法であって、
当該Ｃ２／４ＧｎＴが、
（ｉ）配列番号２の配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８からなるポリペプチド、及び
（ｉｉｉ）少なくとも配列番号２の配列のアミノ酸３１〜４３８の縁に第２の配列を融合させたものからなる融合ポリペプチドであって、当該第２の配列はアフィニティーリガンドまたは反応性の基からなる上記ポリペプチド、
からなる群から選択されている、
上記方法。 - （ｉ）患者からＤＮＡを単離する工程、
（ｉｉ）ＤＮＡ中のＣ２／４ＧｎＴゲノムコード領域をＰＣＲによって増幅する工程、及び
（ｉｉｉ）ＤＮＡ配列変異の存在をＤＮＡシーケンシング、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）またはミスマッチ変異によって検出する工程、
を含む、配列番号１のヌクレオチド４９６〜１８１２を有するβＣ２／４ＧｎＴ遺伝子のコード領域中のＤＮＡ配列変異を同定する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK199801605 | 1998-12-04 | ||
| DKPA199801605 | 1998-12-04 | ||
| PCT/DK1999/000677 WO2000034449A2 (en) | 1998-12-04 | 1999-12-03 | UDP-N- ACETYL GLUCOSAMINE: GALACTOSE-β1, 3-N- ACETYL GALACTOSAMINE- α-R/ N- ACETYL GLUCOSAMINE -β1, 3-N- ACETYL GALACTOSAMINE- α-R (GlcNAc TO GalNAc) β1,6-N- ACETYL GLUCOSAMINYL TRANSFERASE, C2/4GnT |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002531120A JP2002531120A (ja) | 2002-09-24 |
| JP4545936B2 true JP4545936B2 (ja) | 2010-09-15 |
Family
ID=8106474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000586883A Expired - Fee Related JP4545936B2 (ja) | 1998-12-04 | 1999-12-03 | ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃへ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｃ２／４ＧｎＴ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6995004B2 (ja) |
| EP (1) | EP1135472B1 (ja) |
| JP (1) | JP4545936B2 (ja) |
| AT (1) | ATE346913T1 (ja) |
| AU (1) | AU758143C (ja) |
| CA (1) | CA2353603C (ja) |
| DE (1) | DE69934246T2 (ja) |
| WO (1) | WO2000034449A2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19919225A1 (de) * | 1999-04-28 | 2000-11-16 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorassoziiertes Antigen |
| US6593119B2 (en) | 2000-02-29 | 2003-07-15 | Glycodesign, Inc. | Core 2 β-1,6-N-acetylglycosaminyltransferase gene |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5360733A (en) | 1992-10-01 | 1994-11-01 | La Jolla Cancer Research Foundation | Human β1-6 n-acetylglucosaminyl transferase |
| US5484590A (en) * | 1993-09-09 | 1996-01-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | Expression of the developmental I antigen by a cloned human cDNA encoding a member of a β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family |
| WO1995007020A1 (en) | 1993-09-09 | 1995-03-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | EXPRESSION OF THE DEVELOPMENTAL I ANTIGEN BY A CLONED HUMAN cDNA ENCODING A BETA-1,6-N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE |
| CA2283299A1 (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-11 | Human Genome Sciences, Inc. | 186 human secreted proteins |
| US6136580A (en) | 1999-01-19 | 2000-10-24 | The Burnham Institute | β-1-6-N-acetylglucosaminyltransferase that forms core 2, core 4 and I branches |
-
1999
- 1999-12-03 DE DE69934246T patent/DE69934246T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-03 CA CA2353603A patent/CA2353603C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-03 JP JP2000586883A patent/JP4545936B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-03 WO PCT/DK1999/000677 patent/WO2000034449A2/en active IP Right Grant
- 1999-12-03 EP EP99957264A patent/EP1135472B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-03 AT AT99957264T patent/ATE346913T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-12-03 AU AU15037/00A patent/AU758143C/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-06-04 US US09/874,390 patent/US6995004B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-09 US US10/939,066 patent/US7381554B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050042727A1 (en) | 2005-02-24 |
| AU758143B2 (en) | 2003-03-13 |
| DE69934246D1 (de) | 2007-01-11 |
| US20020081656A1 (en) | 2002-06-27 |
| AU758143C (en) | 2004-05-20 |
| WO2000034449A8 (en) | 2000-08-17 |
| EP1135472B1 (en) | 2006-11-29 |
| CA2353603C (en) | 2010-08-03 |
| WO2000034449A3 (en) | 2000-10-26 |
| DE69934246T2 (de) | 2007-05-03 |
| CA2353603A1 (en) | 2000-06-15 |
| ATE346913T1 (de) | 2006-12-15 |
| WO2000034449A2 (en) | 2000-06-15 |
| US7381554B2 (en) | 2008-06-03 |
| US6995004B2 (en) | 2006-02-07 |
| EP1135472A2 (en) | 2001-09-26 |
| JP2002531120A (ja) | 2002-09-24 |
| AU1503700A (en) | 2000-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6238894B1 (en) | α1,2 fucosyltransferase | |
| JP4642301B2 (ja) | ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−α−Ｒ／（ＧｌｃＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ，Ｃ２ＧｎＴ３ | |
| AU772112B2 (en) | UDP-galactose: beta-(N)-acetyl-glucosamine beta1,3galactosyltransferases, beta3gal-t5 | |
| US5871990A (en) | UDP-N-acetyl-α-D-galactosamine: polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase, gAlnAc-T3 | |
| US7670816B2 (en) | UDP-galactose:β-D-galactose-R 4-α-D-galactosyltransferase, α4gal-T1 | |
| US7374919B2 (en) | UDP-galactose: β-N-acetyl-glucosamine β-1,4-galactosyltransferase, β4Gal-T2 | |
| AU662441B2 (en) | N-acetylglucosaminyltransferase V coding sequences | |
| JP4545936B2 (ja) | ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ガラクトース−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ／Ｎ−アセチルグルコサミン−β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃへ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｃ２／４ＧｎＴ | |
| AU2003248317B2 (en) | UDP-N-acetylglucosamine: galactose-B1, 3-N-acetylgalactosamine-a-R/N-acetylglucosamine-B1, 3-N-acetylgalactosamine-a-R (GlcNAc to GalNAc) B1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase, C2/4GnT | |
| JP4300267B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素及びそれをコードする核酸 | |
| Almeida et al. | A Family of Human/34-Galactosyltransferases | |
| US20040142363A1 (en) | N-acetylglycosaminyl transferase genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060921 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090605 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090902 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090909 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091207 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100108 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100408 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100415 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100518 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100608 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100701 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130709 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |