DE19919225A1 - Tumorassoziiertes Antigen - Google Patents

Abstract

Tumorassoziiertes Antigen, davon abgeleitete immunogene Peptide und dafür kodierende DNA-Moleküle sowie deren Verwendung in der Immuntherapie von Krebserkrankungen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Immuntherapie von Tumorerkrankungen.

Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu schützen bzw. diese aktiv zu bekämpfen. Die Bedeutung eines intakten Immunsystems zeigt sich vor allem bei vererbten oder erworbenen Immundefizienzen. Der Einsatz von prophylaktischen Vakzinprogrammen erwies sich in vielen Fällen als äußerst zielführende und erfolgreiche immunologische Intervention im Kampf gegen virale oder bakterielle Infektionserkrankungen. Weiters hat sich gezeigt, daß das Immunsystem auch an der Eliminierung von Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist. Dabei spielt die Erkennung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) durch Komponenten des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Im weitesten Sinn kann jede (peptidische oder nicht peptidische) Komponente einer Tumorzelle, die von einem Element des Immunsystems erkannt und zur Stimulation einer immunologischen Antwort führt, als immunogenes Tumorantigen fungieren. Besondere Bedeutung kommt dabei jenen Tumorantigenen zu, die nicht nur eine immunologische Reaktion hervorrufen, sondern auch eine Abstoßung des Tumors bewirken. Die Identifizierung definierter Antigene, die solch eine immunologische Reaktion bewirken können, stellt einen wichtigen Schritt für die Entwicklung einer molekular definierten Tumorvakzine dar. Obwohl noch nicht ganz geklärt ist, welche Elemente des Immunsystems für eine Abstoßung des Tumors verantwortlich sind, besteht doch ein Konsens darüber, daß dabei CD8-exprimierende zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) eine Hauptrolle spielen (Coulie, 1997). Besonders bei jenen Tumorarten (z. B. Melanom und Nierenkarzinom), die eine relativ hohe Spontanremissionsrate aufweisen, konnte eine Korrelation zwischen klinischem Verlauf und dem vermehrten Auftreten von CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen festgestellt werden (Schendel et al., 1993; Mackensen et al., 1993; Halliday et al., 1995; Kawakami et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Wang, 1997; Celluzzi und Falo, 1998). Dabei wurden spezifische CTL-Klone entweder aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nach Kokultivierung mit meist autologen Tumorzellen und Zytokinstimulierung in vitro erhalten. Sowohl in Tiermodellen als auch in in vitro kultivierten humanen Zellkultursystemen konnte die T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen durch Transfektion der Tumorzellen mit Zytokinen verstärkt werden (van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).

Aufgrund der Korrelation zwischen Remission und Beteiligung von CD8⁺-T-Zellen ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA), die durch CD8-positive CTLs erkannt werden, ein erklärtes Hauptziel auf dem Weg zur Entwicklung einer Tumorvakzine (Pardoll, 1998; Robbins und Kawakami, 1996). Ob auch andere Zelltypen des Immunsystems wie z. B. CD4⁺-T-Helferzellen eine wesentliche Rolle spielen ist noch unklar; einige Studien mit MAGE-3/HLA-A1 Peptiden in Melanompatienten deuten darauf hin (Marchand et al., 1995; Boon et al., 1998). In den vergangenen Jahren ist eine Reihe von TAAs, die durch CTLs erkannt werden, identifiziert worden (Boon et al., 1994; van den Eynde und van der Bruggen, 1997).

T-Zellen erkennen Antigene als Peptidfragmente, die an Zelloberflächen von MHC-Molekülen ("major histocompatibility complex", im Menschen "HLA" = "human leukocyte antigen") präsentiert werden. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I-Moleküle kommen auf den meisten Zellen mit Kern vor und präsentieren Peptide (üblicherweise 8-10-mere), die durch proteolytischen Abbau endogener Proteine entstehen (sog. Antigen-Verarbeitung, "antigen processing"). Peptid:MHC-I-Komplexe werden von CD8-positiven CTLs erkannt. MHC-II-Moleküle kommen nur auf sog. "professionellen antigen-präsentierenden Zellen"(APC) vor, und präsentieren Peptide exogener Proteine, die im Zuge der Endocytose von APC aufgenommen und verarbeitet werden. Peptid:MHC-II-Komplexe werden von CD4-Helfer-T- Zellen erkannt. Durch eine Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und Peptid:MHC-Komplex können verschiedene Effektormechanismen ausgelöst werden, die im Fall von CTLs zur Apoptose der Zielzelle führen. Das geschieht, wenn entweder der MHC (z. B. im Fall der Transplantatabstoßung), oder das Peptid (z. B. im Fall intrazellulärer Pathogene) als fremd erkannt wird. Allerdings erfüllen nicht alle präsentierten Peptide die strukturellen und funktionellen Anforderungen für eine effektive Interaktion mit T-Zellen (wie von Rammensee et al., 1995 und weiter unten beschrieben).

Für den Einsatz von TAAs in einer Tumorvakzine sind grundsätzlich mehrere Applikationsformen möglich: Das Antigen kann entweder als rekombinantes Protein mit geeigneten Adjuvantien bzw. Trägersystemen, oder als für das Antigen kodierende cDNA in Plasmid- (DNA- Vakzine; Tighe et al., 1998), bzw. viralen Vektoren (Restifo, 1997) appliziert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von rekombinanten Bakterien (z. B. Listeria, Salmonella), die das humane Antigen rekombinant exprimieren und durch ihre zusätzlichen Komponenten eine adjuvative Wirkung haben (Paterson, 1996; Pardoll, 1998). In allen diesen Fällen ist eine Verarbeitung und Präsentation des Antigens durch sog. "professionelle antigen-präsentierende Zellen"(APC) notwendig. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz synthetischer Peptide (Melief et al., 1996), die den korrespondierenden T-Zell-Epitopen des Antigens entsprechen und die entweder von außen auf die APC geladen (Buschle et al., 1997; Schmidt et al., 1997) oder von den APC aufgenommen und intrazellulär auf die MHC-I-Moleküle transferiert werden. Die therapeutisch effizienteste Applikationsform für ein definiertes Antigen wird im allgemeinen in klinischen Studien bestimmt.

Zu den von den tumorspezifischen CTLs erkannten Antigenen bzw. deren Epitopen zählen Moleküle, die aus sämtlichen Proteinklassen stammen können (z. B. Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren, Enzyme; zur Übersicht siehe Rammensee et al., 1995; Robbins und Kawakami, 1996). Diese Proteine müssen nicht notwendigerweise an der Zelloberfläche lokalisiert sein, wie dies bei der Erkennung durch Antikörper erforderlich ist. Um für die Erkennung durch CTLs als tumorspezifisches Antigen zu fungieren bzw. um für die Therapie eingesetzt zu werden, müssen die Proteine bestimmte Bedingungen erfüllen: erstens soll das Antigen hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert werden und in sog. "kritischen" Normalgeweben nicht oder nur in geringerer Konzentration als in Tumoren vorkommen. Kritische Normalgewebe sind essentielle Gewebe; eine gegen sie gerichtete Immunreaktion könnte unter Umständen schwerwiegende, zum Teil lethale Folgen haben. Zweitens soll das Antigen nicht nur im Primärtumor, sondern auch in den Metastasen vorhanden sein. Des weiteren ist es im Hinblick auf eine breite klinische Anwendung des Antigens erstrebenswert, wenn es in mehreren Tumorarten in hoher Konzentration vorhanden ist. Eine weitere Vorbedingung für die Eignung eines TAA als wirksamer Bestandteil einer Vakzine ist das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens; vom TAA abgeleitete Peptide sollen zu einer in-vitro/in-vivo-T-Zell-Antwort führen (" immunogenes" Peptid). Ein weiteres Selektionskriterium für ein klinisch breit anwendbares immunogenes Peptid ist die Häufigkeit, mit der das Antigen in einer gegebenen Patientenpopulation anzutreffen ist.

Die immunogenen tumorassoziierten Antigene (TAAs), von denen größtenteils bereits gezeigt wurde, daß sie T-Zell-Epitope besitzen, lassen sich in mehrere Kategorien einteilen, u. a. virale Proteine, mutierte Proteine, überexprimierte Proteine, durch chromosomale Translokation gebildete Fusionsproteine, Differenzierungsantigene, onkofötale Antigene (van den Eynde und Brichard, 1995; van den Eynde und van der Bruggen, 1997).

Die Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von TAAs, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Tumorvakzine darstellen, beruhen einerseits auf dem Einsatz von in Patienten bereits induzierten CTLs (zelluläre Immunantwort) oder Antikörpern (humorale Immunantwort), oder basieren auf der Erstellung differenzieller Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Im ersten Fall, dem immunologischen Ansatz, werden Patienten-CTLs für ein Screening eukaryotischer Tumor-cDNA-Expressionsbibliotheken, die über MHC-I-Moleküle die CTL-Epitope präsentieren, eingesetzt (Boon et al., 1994), während mittels hochaffiner Patienten-Antiseren prokaryotische-cDNA- Expressionsbibliotheken, direkt über eine Immunoblot- Analyse der einzelnen Plaques auf das Vorhandensein von TAAs untersucht werden (Sahin et al., 1995). Eine Kombination von CTL-Reaktivität und proteinchemischen Verfahren stellt die Isolierung von aus MHC-I- isolierten Peptiden von Tumorzellen dar, die über Reaktivität mit Patienten-CTLs vorselektioniert wurden. Die Peptide werden aus dem MHC-I-Komplex ausgewaschen und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert (Falk et al., 1991; Woelfel et al., 1994; Cox et al., 1994). Die Ansätze, welche CTLs zum Charakterisieren von Antigenen verwenden, sind aufgrund der erforderlichen Kultivierung und Aktivierung von CTLs mit einem erheblichen Aufwand verbunden bzw. nicht immer erfolgreich.

Methoden zur Identifizierung von TAAs, welche auf dem Vergleich des Transkriptionsprofils von Normal- mit Tumorgewebe beruhen, sind vielfältig; dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken ("representational difference analysis"; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) und der Einsatz der DNA-Chip-Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995). Im Gegensatz zur oben erwähnten immunologischen Methode mit Hilfe von Patienten-CTLs muß beim Einsatz von molekularbiologischen Methoden gezeigt werden, daß die damit gefundenen potentiellen Antigenkandidaten tumorspezifisch (tumorassoziiert) sind und tatsächlich T-Zell-Epitope besitzen, die eine zytotoxische T-Zell- Antwort auslösen können. In zumindest einem Fall (NY-ESO/LAGE-1) wurde ein Antigen sowohl durch die Verwendung von Patientenseren als auch durch RDA identifiziert (Chen et al., 1997; Lethe et al. 1998), außerdem wurden CTL-Epitope dieses Antigens und eine gleichzeitige spontane humorale und T-Zell-Antwort in einem Patienten beschrieben (Jager et al., 1998).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues tumorassoziiertes Antigen (TAA) bereitzustellen.

Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA ("representational difference analysis") zwischen einer Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie (A549) und Normallungengewebe eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden anschließend die erhaltenen cDNA-Klone sequenziert und mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 321 unbekannte, zu denen größtenteils ESTs("expressed sequence tags")- Einträge in der Datenbank existierten. Nach einer weiteren qualitativen PCR-Analyse in cDNA-Bibliotheken von kritischen Normalgeweben und immunprivilegierten Geweben sowie detaillierteren Datenbankrecherchen wurden die Anzahl der Kandidatenklone auf 56 eingeschränkt, deren ESTs nicht aus kritischen Normalgeweben stammen. Mittels RT-PCR wurde festgestellt, daß drei der 56 untersuchten Klone eine Expression hauptsächlich in verschiedenen Tumorgeweben und keine oder geringe Expression in Normalgeweben aufweisen. Der qualitative Vergleich (mittels PCR) der Expression eines der Klone (B99) zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte eine Überexpression der B99-cDNA in verschiedenen Tumoren. Das mittels Northern Blot analysierte Expressionsprofil zeigte ergänzend, daß B99 in den untersuchten Normalgeweben keine oder nur eine schwache Transkription aufwies.

Die humane B99-cDNA wurde kloniert, die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Sequenzanalyse der klonierten humanen B99-cDNA ergab, daß von Position 427 bis Position 1743 ein durchgehender offener Leserahmen vorliegt, der, auf Nukleotid- und Proteinebene, eine hohe Identität mit dem offenen Leserahmen von beta-1,3-Galaktosyl-o- Glykosyl-Glykoprotein-beta-1,6-n- Azetylglucosaminyltransferase besitzt. Aus den aus Northern Blot-Experimenten gewonnenen Daten ist zu schließen, daß das B99-Transkript eine Länge von ca. 3,0 kb hat. Der klonierte Bereich der B99-cDNA beträgt 2216 bp, wobei das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes am 3'-Ende der Sequenz für die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich spricht. Der Unterschied in der Größe der klonierten B99-cDNA im Vergleich zu der aus der Northern Blot-Analyse ableitbaren Größe läßt sich durch das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes unbekannter Länge sowie eine zusätzliche Sequenz im 5'-nicht translatierten Bereich von B99 erklären. Aufgrund der Tatsache, daß im 5'-Bereich der klonierten cDNA von Position 0 bis 427 kein durchgehender Leserahmen vorhanden ist, kann gefolgert werden, daß es sich bei dem ATG an Position 427 um das Startkodon von B99 handelt.

Zusätzliche Information über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz von B99 kann durch molekularbiologische Standardmethoden gewonnen werden, z. B. mittels 5-RACE ("rapid amplification of cDNA ends"). Bei dieser Methode wird RNA, vorzugsweise mRNA, aus Zellen oder Geweben, in denen B99 transkribiert wird (z. B. Kolonkarzinom-Gewebe oder von Lungenadenokarzinom abgeleitete Zelllinien wie A549) revers transkribiert und anschließend mit einem Adaptor bekannter Sequenz ligiert. Eine PCR mit einem Adaptorprimer (bindet spezifisch an den Adaptor am 5'- Ende der cDNA) und einem B99-spezifischen Primer (z. B. SEQ ID NO: 8, 10, 11) erlaubt die Amplifikation entsprechender B99-Fragmente. Diese PCR-Produkte können, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach Standardmethoden kloniert und, insbesondere durch DNA- Sequenzierung, charakterisiert werden.

Eine alternative Methode zur Charakterisierug des 5'-Endes ist das Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit für B99 spezifischen DNA-Sonden oder Antiseren.

Führt das Screenen von cDNA-Bibliotheken aufgrund methodisch bedingter Beschränkungen, z. B. ineffiziente reverse Transkription bedingt durch ausgeprägte Sekundärstrukturen der RNA, nicht zum gewünschten Ziel, können genomische Bibliotheken untersucht werden, indem z. B., wie beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, durch Hybridisierung mit für B99 spezifischen DNA-Sonden Klone isoliert werden können, die die stromaufwärts vom erhaltenen 5'-Ende der cDNA liegende Sequenzinformation z. B. die Promotorregion von B99 enthalten.

Die isolierte cDNA kodiert für das tumorassoziierte Antigen (TAA) der Bezeichnung B99 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz (B99-1). Die Sequenz von B99-1 wird definiert durch das Startcodon an Position 427 der isolierten B99-cDNA.

In einem weiteren Versuch zur Klonierung des kodierenden Bereichs von B99, bei dem cDNA aus der Lungenadenokarzinom-Zellinle A549 verwendet wurde, wurde eine Sequenz ermittelt, die im Vergleich zur in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz eine Insertion eines Nukleotids an Position 923 aufweist (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5). Diese Insertion führt zu einer Veränderung des offenen Leserahmens von B99 mit einer daraus resultierenden veränderten Aminosäuresequenz im C-terminalen-Bereich des B99-Proteins; die von diesem Leserahmen abgeleitete Sequenz dieses B99-Antigens (B99-2) ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt. Außer der Insertion weist die aus A549-Zellen isolierte cDNA einen Nukleotidaustausch an Position 622 im Vergleich zu Sequenz SEQ ID NO: 1 auf. Dieser Nukleotidaustausch bedingt an Position Nr. 66 einen Ersatz von Arginin (SEQ ID NO: 2, B99-1) durch Tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2). Abgesehen von diesem Aminosäureaustausch ist die Aminosäuresequenz von B99-2 bis einschließlich Position 166 identisch mit B99-1.

Die Insertion eines Nukleotids an Position 923 ergibt einen zweiten potentiellen Leserahmen von Pos. 845 bis 1744 der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz. Ein von einer cDNA mit diesem Leserahmen exprimiertes Protein weist die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz auf (B99-3). Die Sequenz von B99-3 ist von Pos. 1 bis 27 unterschiedlich zu B99-1 und ab Pos 28 identisch mit B99-1.

Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B99, ausgewählt aus der Gruppe von Polypeptiden mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegebenen Aminosäuresequenz.

Die in SEQ ID NO: 2 (B99-1), SEQ ID NO: 4 (B99-2) und SEQ ID NO: 6 (B99-3) dargestellten Aminosäuresequenzen können Abweichungen aufweisen, z. B. solche, die durch Austausch von Aminosäuren bedingt sind, sofern das B99- Derivat die für die Anwendung in einer Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften aufweist. (Ein Beispiel für einen B-99-Polymorphismus dieser Art ist der durch die Punktmutation bedingte Unterschied an Position 66 zwischen B99-1 und B99-2).

Im folgenden wird, wenn nicht anders angegeben, die Bezeichnung "B99" stellvertretend für B99-1, B99-2 und B99-3 verwendet.

Die natürliche Aminosäuresequenz von B99 (bzw. entsprechend die Sequenzen der B99-cDNA) kann gegebenenfalls modifiziert sein, indem einzelne Aminosäuren in einem B99-CTL-Epitop ausgetauscht werden, um, im Vergleich zum natürlichen B99-CTL- Epitop, eine Steigerung der Affinität von B99-Peptiden zu MHC-I-Molekülen und damit eine erhöhte Immunogenität und letztlich eine verstärkte Reaktivität gegenüber Tumoren zu bewirken. Modifikationen im Bereich der B99- Epitope können am B99-Gesamtprotein (dieses wird von den APCs zu den entsprechenden Peptiden prozessiert) bzw. an größeren B99-Proteinfragmenten oder an B99- Peptiden (vgl. unten) vorgenommen werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung immunogene Fragmente und Peptide, die von B99 abgeleitet sind. Letztere werden im folgenden als "B99-Peptide" bezeichnet. Eine erste Gruppe sind B99-Peptide, die eine humorale Immunantwort (Induktion von Antikörpern) auslösen. Derartige Peptide sind ausgewählte Abschnitte von B99 (mindestens 12 bis 15 Aminosäuren), die mittels sogenannter Vorhersage- Algorithmen ("prediction algorithms") wie z. B. dem "surface probability blot" (Emini et al., 1985), dem "hydrophobicity blot" (Kyte and Doolittle, 1982) und dem "antigenic index" (Jameson and Wolf, 1988) ermittelt werden können.

Bei der Auswahl von B99-Peptidkandidaten verdienen die Regionen von B99-2 und B99-3, die sich von B99-1 unterscheiden, besonderes Interesse. Unter der Voraussetzung, daß es sich bei der Insertion der B99- DNA, die zu diesen Unterschieden in der Aminosäuresequenz führt, um eine tumorspezifische Mutation handelt, ist nämlich zu erwarten, daß Peptide aus diesem Bereich eine verstärkte Immunogenität im Vergleich zu Peptiden aus B99-1 aufweisen. Um zu bestätigen, daß die Insertion tumorspezifisch ist, können Antikörper gegen diesen Bereich generiert und Tumorzellen auf Expression von B99-2 und B99-3 untersucht werden.

B99-Peptide werden direkt oder in modifizierter Form (z. B. an KLH = "keyhole limpet hemocyanine" gekoppelt) verabreicht und die Bildung von Antikörpern mittels gängiger immunologischer Assays, z. B. mittels ELISA, bestimmt.

Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte, B99-Peptide sind diejenigen, die durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort bewirken. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich MHC-I-Moleküle, die von CD8-positiven CTLs und MHC-II-Moleküle, die von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.

Damit ein Peptid eine zelluläre Immunantwort auslöst, muß es an ein MHC-Molekül binden, wobei der zu behandelnde Patient das MHC-Molekül in seinem Repertoire aufweisen muß. Die Bestimmung des MHC-Subtyps des Patienten stellt somit, im Hinblick auf die Auslösung einer zellulären Immunantwort, eine der wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung eines Peptids an diesem Patienten dar.

Die Sequenz eines therapeutisch einzusetzenden B99- Peptids wird durch das jeweilige MHC-Molekül hinsichtlich Ankeraminosäuren und Länge vorgegeben. Definierte Ankerpositionen und Länge gewährleisten, daß ein Peptid in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen MHC-Moleküls des Patienten paßt. Dies hat zur Folge, daß das Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet.

Immunogene B99-Peptide können nach bekannten Methoden identifiziert werden, eine der Grundlagen dafür ist die Beziehung zwischen MHC-Bindung und CTL-Induktion.

Da also die Sequenz immunogener Peptide aufgrund ihres Peptidbindungsmotivs vorherbestimmbar ist, können B99-Peptide, die CTL-Epitope darstellen, aufgrund der B99-Proteinsequenz identifiziert und synthetisiert werden. Dazu sind verschiedene Methoden geeignet, die zur Identifizierung von CTL-Epitopen von bekannten Protein-Antigenen verwendet wurden; z. B. die von Stauss et al., 1992, für die Identifizierung von T-Zell- Epitopen in humanem Papillomavirus beschriebene Methode.

Die allelspezifischen Anforderungen jedes MHC-I-Allel- Produkts an ein Peptid, das an das MHC-Molekül bindet und von diesem präsentiert wird, wurden als Motiv zusammengefaßt (z. B. Falk et al., 1991). Bisher ist eine große Anzahl sowohl von MHC-Peptid-Motiven als auch von MHC-Liganden bekannt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Suche nach Epitopen eines bekannten Proteins, das in ein bestimmtes MHC-I-Molekül paßt, wurde in einem Übersichtsartikel von Rammensee et al., 1995, beschrieben. Sie umfaßt die folgenden Schritte: zunächst wird die Protein-Sequenz auf Abschnitte untersucht, die dem Anker-Motiv entsprechen, wobei gewisse Variationen hinsichtlich Peptidlänge und Ankerbesetzung möglich sind. Wenn z. B. ein Motiv ein 9-mer mit Ile oder Leu am Ende vorschreibt, können auch 10-mere mit einem entsprechenden C-Terminus in Betracht gezogen werden, ebenso Peptide mit anderen aliphatischen Resten, wie Val oder Met am C-Terminus. Auf diese Weise wird eine Reihe von Peptid-Kandidaten erhalten. Diese werden auf das Vorhandensein möglichst vieler Ankerreste, die sie gemeinsam mit bereits bekannten Liganden haben, untersucht und/oder daraufhin, ob sie für verschiedene MHC-Moleküle "bevorzugte" Reste haben (entsprechend der Tabelle von Rammensee et al., 1995). Um schwach bindende Peptide auszuschließen, werden zweckmäßig Bindungs-Assays durchgeführt. Wenn die Anforderungen an die Peptid- Bindung für bestimmte MHC-Moleküle bekannt sind, können die Peptid-Kandidaten auch auf Nicht-Ankerreste untersucht werden, die sich negativ oder positiv auf die Bindung auswirken, oder die diese erst ermöglichen (Ruppert et al., 1993). Bei dieser Vorgangsweise ist jedoch in Betracht zu ziehen, daß das Peptid-Bindungs- Motiv für die Suche nach natürlichen Liganden nicht allein ausschlaggebend ist; auch andere Aspekte, z. B. die Enzymspezifität während der Antigenprozessierung, tragen - zusätzlich zur Spezifität der MHC-Bindung - zur Identität des Liganden bei. Eine Methode, die diese Aspekte berücksichtigt, und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von immunogenen B99-Peptiden geeignet ist, wurde u. a. von Kawakami et al., 1995, angewendet, um auf der Grundlage bekannter HLA-A*0201-Motive gp-100-Epitope zu identifizieren.

Die Peptide können auch im Hinblick auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-II-Moleküle ausgewählt werden. Das MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neun Aminosäuren erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in den Ankerpositionen auf als das MHC-I- Bindungsmotiv. Es wurden kürzlich, ausgehend von der Röntgenstrukturanalyse von MHC-II-Molekülen, Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II- Bindungsmotive, und ausgehend davon, Variationen der Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al. 1995, und die dort zitierte Originalliteratur). Peptide, die an MHC-II-Moleküle binden, werden den CD4-T-Zellen typischerweise von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen präsentiert. Die CD4-T-Zellen wiederum aktivieren dann in der Folge direkt CTLs durch z. B. Cytokin-Ausschüttung und Verstärken die Effizienz der Antigen-Präsentation durch APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen).

Seit kurzem sind Datenbanken und Vorhersage-Algorithmen verfügbar, die mit großer Verläßlichkeit die Vorhersage von Peptid-Epitopen erlauben, die an ein bestimmtes MHC-Molekül binden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden, unter Verwendung des von Parker et al., 1994 und Rammensee et al., 1995 beschriebenen Algorithmus, für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Auf ähnliche Weise können, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Algorithmen, die den unterschiedlichen Charakteristika der Peptide (Hydrophobizität, Ladung, Größe) bzw. Anforderungen an die Peptide, z. B. die 3D-Struktur des HLA-Moleküls, Rechnung tragen, weitere potentielle Peptid-Epitope ermittelt werden; dies gilt auch für Peptid-Epitope anderer HLA-Typen.

Nach Auswahl von B99-Peptid-Kandidaten mit Hilfe der angeführten Methoden wird deren MHC-Bindung mittels Peptidbindungs-Assays getestet. Als nächstes wird die Immunogenität der Peptide mit guten Bindungseigenschaften bestimmt (Stabilität der Peptid- MHC-Wechselwirkung korreliert in den meisten Fällen mit Immunogenität; von der Burg et al., 1996). Um die Immunogenität des ausgewählten Peptids oder Peptid- Äquivalents zu bestimmen, können Methoden, wie z. B. von Sette et al., 1994, beschrieben, in Kombination mit quantitativen MHC-Bindungs-Assays verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenität des ausgewählten Peptids über in-vitro-CTL-Induktion mittels bekannter Methoden (wie weiter unten für ex-vivo-CTL-Induktion beschrieben) getestet werden. Das Prinzip der in mehreren Schritten durchgeführten Methode für die Auswahl von Peptiden, die zur Auslösung einer zellulären Immunantwort fähig sind, ist in der WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. Eine allgemeine Strategie zum Erhalt effizienter immunogener Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde außerdem von Schweighoffer, 1997, beschrieben.

Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die Bindungsfurche von MHC-I- oder MHC-II-Molekülen passen, also Peptide, die unverändert von B99 abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen bezüglich Ankerpositionen und Länge Variationen vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die effektive Immunogenität des Peptids, die sich zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinität an das MHC-Molekül und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also künstliche Peptide oder Peptid-Äquivalente verwendet, die entsprechend den Anforderungen der Bindungsfähigkeit an ein MHC-Molekül entworfen sind.

Solchermaßen veränderte Peptide werden als "heteroclitische Peptide" bezeichnet. Sie können nach folgenden Methoden erhalten werden:
Zunächst werden die Epitope von MHC-I- bzw. MHC-II- Liganden bzw. deren Variation z. B. nach dem von Rammensee et al., 1995, beschriebenen Prinzip vorgenommen. Die Länge des Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I-Moleküle vorzugsweise einer Minimalsequenz von 8 bis 10 Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosäuren.

Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus verlängert sein, sofern diese Verlängerung die Bindungsfähigkeit an das MHC-Molekül nicht beeinträchtigt bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz zellulär prozessiert werden kann.

Die modifizierten Peptide werden daraufhin auf ihre Erkennung durch TILs ("tumor-infiltrating lymphocytes"), auf CTL-Induktion sowie auf verstärkte MHC-Bindung und Immunogenität geprüft, wie von Parkhurst et al., 1996, und Becker et al., 1997, beschrieben.

Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Auffindung von Peptiden mit stärkerer Immunogenität als die der natürlichen B99-Peptide besteht im Screenen von Peptid-Bibliotheken mit CTLs, die die natürlich auf Tumoren vorkommenden B99-Peptide erkennen, wie von Blake et al., 1996, beschrieben; in diesem Zusammenhang wird die Verwendung kombinatorischer Peptid-Bibliotheken vorgeschlagen, um Moleküle zu entwerfen, welche von MHC-I-restringierten CTLs erkannte Tumorepitope nachahmen.

Die B99-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder davon abgeleitete immunogene Fragmente oder Peptide können rekombinant oder mittels Peptid-Synthese hergestellt werden, wie in der WO 96/10413 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Für die rekombinante Herstellung wird das entsprechende DNA-Molekül nach Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, der Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert und das Protein gereinigt. Für die chemische Synthese von B99-Peptiden können herkömmliche Methoden verwendet werden, z. B. im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer.

Alternativ zu natürlichen B99-Peptiden oder heteroclitischen Peptiden können Substanzen, die solche Peptide vortäuschen, z. B. "Peptidomimetica" oder "retro­ inverse-Peptide", verwendet werden. Zur Testung dieser Moleküle im Hinblick auf die therapeutische Verwendbarkeit in einer Tumorvakzine werden dieselben Methoden angewendet wie oben für die natürlichen B99-Peptide oder B99-Peptidäquivalente.

Das TAA der Bezeichnung B99 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B99- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Nierenzell-, Lungen-, Kolon-, Pankreas- und Magenkarzinom.

Die Immunantwort in Form einer Induktion von CTLs kann in vivo oder ex vivo bewirkt werden.

Für die in-vivo-Induktion von CTLs wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Komponente das TAA B99 bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid(e), einem Patienten verabreicht, der an einer mit dem TAA assoziierten Tumorerkrankung leidet, wobei die Menge an TAA(Peptid) ausreichen muß, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Antigen-tragenden Tumor zu erzielen.

Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung. Vorzugsweise dient die Zusammensetzung der parenteralen Verabreichung, z. B. für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Anwendung. Die B99-TAAs/Peptide sind in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässerigen, Träger gelöst oder suspendiert. Die Zusammensetzung kann außerdem übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, etc. enthalten. Die TAAs/Peptide können allein oder in Kombination mit Adjuvantien, z. B. inkomplettem Freund's Adjuvans, Saponinen, Aluminiumsalzen oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, Polykationen wie Polyarginin oder Polylysin, verwendet werden. Die Peptide können auch an Komponenten, die die CTL-Induktion oder CTL-Aktivierung unterstützen, gebunden werden, z. B. an T-Helferpeptide, Lipide oder Liposomen, oder sie werden gemeinsam mit diesen Substanzen und/oder gemeinsam mit immunstimulierenden Substanzen, z. B. Zytokinen (IL-2, IFN-γ) verabreicht. Methoden und Formulierungen, die zur Herstellung und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, sind in der WO 95/04542 und WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.

B99(Fragmente) bzw. B99-Peptide können auch verwendet werden, um eine CTL-Antwort ex vivo auszulösen. Eine ex- vivo-CTL-Antwort auf einen Tumor, der B99 exprimiert, wird induziert, indem man die CTL-Vorläuferzellen zusammen mit APCs und B99-Peptiden bzw B99-Protein inkubiert. Dann läßt man die aktivierten CTLs expandieren, worauf sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Alternativ können APCs mit B99-Peptiden beladen werden, was zu einer effizienten Aktivierung zellulärer Immunreaktionen gegen B99 positive Tumoren führen kann (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996). Eine geeignete Methode um Peptide auf Zellen, z. B. dendritische Zellen, zu laden, wird in der WO 97/19169 geoffenbart.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Kombination mehrerer verschiedener B99-Peptide oder B99-Peptidäquivalente angewendet. In einer weiteren Ausführungsform werden B99-Peptide mit von anderen TAAs abgeleiteten Peptiden kombiniert. Die Auswahl von Peptiden für derartige Kombinationen wird im Hinblick auf die Erfassung unterschiedlicher MHC-Typen getroffen, um eine möglichst breite Patientenpopulation abzudecken, und/oder sie wird auf ein möglichst breites Indikationsspektrum abgestellt, indem Peptide mehrerer unterschiedlicher Tumorantigene kombiniert werden. Die Anzahl der Peptide in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann über einen weiten Bereich schwanken, typischerweise enthält eine klinisch anwendbare Vakzine 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10 verschiedene Peptide.

Die erfindungsgemäßen Peptide können auch als diagnostische Reagentien eingesetzt werden. Beispielsweise können die Peptide dazu benutzt werden, um das Ansprechen eines Patienten auf die durch das immunogene Peptid hervorgerufene humorale oder zelluläre Immunantwort zu testen. Dadurch besteht die Möglichkeit, ein Behandlungsprotokoll zu verbessern. Beispielsweise kann in Abhängigkeit der Darreichungsform (Peptid, Gesamtprotein oder DNA-Vakzine) des TAA die Zunahme von Vorläufer-T-Zellen in den PBLs, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptidepitop aufweisen, untersucht werden (Robbins und Kawakami, 1996 sowie darin zitierte Referenzen). Außerdem können die Peptide oder das Gesamtprotein bzw. gegen das TAA gerichtete Antikörper dazu verwendet werden, um das Risiko eines Patienten an einem B99-assoziierten Tumor zu erkranken, vorherzusagen bzw. den Krankheitsverlauf eines B99-positiven Tumors zu charakterisieren (z. B. durch immunhistochemische Analysen von Primärtumor und Metastasen). Eine derartige Strategie hat sich schon mehrfach als erfolgreich erwiesen, z. B. der Nachweis des Östrogenrezeptors als Entscheidungsgrundlage zur Endokrintherapie bei Brustkrebs; c-erbB-2 als relevanter Marker bei Prognostik und Therapieverlauf bei Brustkrebs (Ravaioli et al., 1998; Revillion et al., 1998); PSMA ("prostate specific membrane antigen") als Marker für Epithelialzellen des Prostatakarzinoms im Serum bzw. durch Einsatz eines ¹¹¹In-markierten monoklonalen Antikörpers gegen PSMA bei der Immunoscintigraphie auf Prostatakarzinom (Murphy et al., 1998 und inkludierte Referenzen); CEA ("carcinoembryonic antigen") als serologischer Marker für die Prognose und Verlauf bei Patienten des kolorektalen Karzinoms (Jessup und Loda, 1998).

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt isolierte DNA-Moleküle, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften von B99 oder für Fragmente davon.

In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle bzw. Fragmente davon kodieren für (Poly)peptide der Bezeichung B99 (B99-1, B99-2 oder B99-3) mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA-Moleküle mitumfaßt, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die durch konservativen Austausch von Aminosäuren bedingte Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz aufweisen, sofern sie für ein B99-Derivat bzw. Fragmente oder Peptide mit den für die Anwendung als Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften kodieren.

Im folgenden werden die oben definierten, gegebenenfalls modifizierten, für B99-1, B99-2 bzw. B99-3 bzw. für Fragmente davon kodierenden DNA- Moleküle, wenn nicht anderes angegeben, als "B99-DNA- Moleküle" bezeichnet.

Die B99-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden RNAs, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden, wie die davon kodierten (Poly)Peptide, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen eingesetzt.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden DNA-Moleküle, kodierend für natürliche B99-Polypeptide verwendet. Alternativ zur natürlichen B99-cDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein(fragment) bzw. Peptide mit stärkerer Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads"; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z. B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targetting sequence") die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das B99-DNA enthält.

Die B99-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf B99-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo.

Beispiele für die in-vivo-Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, daß sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben). Desweiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in- vivo-Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für B99-Peptid verwendet werden. Ähnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z. B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z. B. Elektroporation, kombiniert werden.

Ein Beispiel für die ex-vivo-Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die B99 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen B99 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.

Monoklonale anti-B99-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z. B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-B99-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) werden.

Humane monoklonale anti-B99-Antikörper(fragmente) können auch von sog. "Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen anti-B99-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von B99-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der B99 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agentien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor vor Ort zu schädigen. Aufgrund der tumorspezifischen Expression von B99 sind dabei keine oder nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von B99-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die B99 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen. Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-B99-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 für beschrieben.

Das TAA der Bezeichnung B99 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B99- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Nierenzell-, Lungen-, Kolon-, Pankreas- und Magenkarzinom.

Figurenübersicht

Fig. 1 RT-PCR-Analyse von cDNA-Pools verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99- spezifischen Primern

Fig. 2 RT-PCR-Analyse von individuellen cDNAs verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern

Fig. 3 Transkription von B99 in Normalgeweben:
Northern Blot Analyse von mRNA aus 16 Normalgeweben

Beispiel 1

RDA ("Representational Difference Analysis") von der humanen Adenokarzinomzelllinie der Lunge (A549) und normalem Lungengewebe Die von ATCC bezogene humane Lungenadenokarzinom- Zellinie A549 (CCL 185) wurde in T150 Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente MEM mit 10% hitze-inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1 : 5 bis 1 : 10 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8 g NaCl, 0, 2 g KCl, 1, 13 g Na₂HPO₄-wasserfrei, 0,2 g KH₂PO₄, 100 ml 2,5% Trypsinlösung, 1 g EDTA-Na-Salz; pH7,2-7,4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Die 4 ml wurden in ein 15-ml-Falconröhrchen transferiert, mit 8 ml PBS versetzt, bei 1200 rpm in einer Haereus-Tischzentrifuge (Megafuge 2.0R) 5 min bei 4°C zentrifugiert, das Zellpellet mit 1 ml Lysis-Puffer (10 mM TrisHCl pH8, 140mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5% NP40) versetzt, kräftig geschüttelt und in einem 2-ml-Eppendorfgefäß bei 12 000 rpm und 4°C 5 min in einer Sigma-Tischzentrifuge (Sigma 202 MK) abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und nach Zusatz von 55 µl 20% SDS-Lösung zweimal mit dem doppelten Volumen an einer CHCl₃/Phenol(1 : 1 v/v)-Mischung und einmal mit dem einfachen Volumen an CHCl₃ extrahiert. Die wässrige RNA-enthaltende Phase wurde mit 1/10 Volumen an 3M NaAc (pH5) und dem zweifachen Volumen an 96% EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C die RNA präzipitiert. Ausgehend von 1 mg total-RNA wurde für die Isolierung von poly-A(+)RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller- Protokoll vergegangen. Die Lagerung der A549 poly- A(+)RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml in DEPC- behandeltem H₂O erfolgte in Aliquots bei -80°C.

Zur Durchführung der repräsentativen Differenzanalyse (RDA; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) wurde die poly-A(+)RNA der Lungenadenokarzinom-Zellinie A549 als "tester", die von normalem Lungengewebe (1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; #6524-1) als "driver" eingesetzt. Die RDA wurde unter Verwendung des PCR- selectTM kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt mit der Ausnahme, daß ein modifiziertes Primer/Adaptor-2-Oligonukleotidsystem mit folgender Sequenz zum Einsatz kam:
5' -TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3'
(Adaptor-2-alt-1; SEQ ID NO: 19),
5-AGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3' (nested-PCR-primer-2-alt;
SEQ ID NO: 20) und 5'-GGCTCGAGCTC-3 (Adaptor-2-alt-2;
SEQ ID NO: 21). Die neu generierten Primer/Adaptor- Sequenzen ermöglichen durch die Anwesenheit von drei neuen Restriktionsenzymschnittstellen (Kpn I, Sac I und Xho I) in der Sequenz des nested-PCR-primer-2-alt nach Klonierung der subtrahierten cDNA-Fragmente in den pPCRII-Vektor ein nachträgliches Herausschneiden der jeweiligen cDNA-Fragmente. Das Designen einer Primer/Adaptorsequenz mit mehreren verfügbaren Restriktionsenzymschnittstellen war deshalb notwendig, weil besonders in den Primersequenzen - bedingt durch die PCR-Amplifikationsschritte - oft Punktmutationen zu beobachten waren.

Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde die erhaltene cDNA von "tester" und "driver" mit RsaI verdaut (RsaI ist ein 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym und liefert im statistischen Mittel 256 bp lange cDNA-Fragmente).

Gleiche Teile von "tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren 1 oder 2 ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuß an "driver-cDNA" bei 65°C hybridsiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter "driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten "tester"-spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR mit für die Adaptoren 1 bzw. 2 spezifischen Primern exponentiell amplifiziert. Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten ("nested") Primern unterworfen. Die aus dieser Reaktion resultierenden, exponentiell amplifizierten cDNA-Fragmente wurden direkt in den pCRII-Vektor (Invitrogen; "TA-cloning vector") ligiert und anschließend ein Drittel des Ligationsansatzes in kompetente E. coli (OneShot^TM, Invitrogen) transfiziert.

712 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden erhalten und in 96-Napf-Blöcken in LB-Amp Medium (1,3 ml pro Napf) für 48 h bei 37°C kultiviert. Pro Napf wurden 750 µl der E.-coli-Suspensionen für die Präparation der Plasmid-DNA eingesetzt (96-Napf- Minipräparationsmethode von QIAgen nach Vorschrift des Herstellers). Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Gycerinstammkulturen bei -80°C gelagert.

Es wurde eine aus 712 Einzelklonen bestehende cDNA- Subtraktionsbibliothek erhalten, die sowohl in Form von E.-coli-Glycerin-Stammkulturen als auch in Form gereinigter Plasmide vorlag.

Beispiel 2 DNA-Sequenzierung und Annotation von TAA-Kandidaten

Die isolierte Plasmid-DNA sämtlicher 712 Klone (siehe Beispiel 1) wurde nach der Sanger-Methode auf einem ABI-Prism-Gerät sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels der BioScout-Software (LION, Heidelberg) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Von 712 Klonen konnten 678 sequenziert und annotiert werden. Der Rest (34) wies als Insert entweder nur poly(A) Sequenzen auf oder entsprach einem religierten Vektor oder war nicht sequenzierbar. Von den 678 annotierbaren Sequenzen erwiesen sich 357 als Gene mit bekannter Funktion. Die restlichen 321 repräsentierten Klone, kodierend für Gene mit unbekannter Funktion; 59 davon wiesen nicht einmal Einträge in der humanen EST-Datenbank auf. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für jene unbekannten Gene, für die ein EST-Eintrag verfügbar war, wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurden all jene ESTs mit < 95% Identität (BLAST), die zur entsprechend experimentell ermittelten Sequenz der Subtraktionsbibliotheken gehörten, überprüft. Bei der Annotation wurde eine Unterteilung in i) kritische Normalgewebe, ii) foetale, "verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und iii) Tumore und Tumor-Zellinien vorgenommen. Auf der Basis dieses "virtuellen mRNA-Profils" wurden 200 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe i) gefunden wurden, für weitere experimentelle Analysen ausgewählt (inklusive der 59 Klone, für die keine EST-Eintragung vorlag). Zur weiteren Einengung der Kandidatenklone wurden aus den von den 200 ausgewählten Klonen ermittelten Sequenzen Oligonukleotidprimerpaare entworfen und synthetisiert. Es wurden zunächst 8 verschiedene, von humanem Gewebe abgeleitete cDNA- Bibliotheken (GibcoBRL "SUPERSCRIPT^TM"), welche direktional in pCMV-SPORT kloniert sind, mittels qualitativer PCR auf das Vorhandensein der jeweiligen Kandidaten getestet. Die dabei eingesetzten cDNA- Bibliotheken stammten aus Gewebe von Herz (#10419-018), Leber (#10422-012), Leukozyten (#10421-022), Niere (#10420-016), Lunge (#10424-018), Testis (#10426-013), Gehirn (#10418-010) und fötalem Gehirn (#10662-013). Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 20 µl Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz enthielten 1× TaqPol- Puffer(50 mN KCl, 10 mM TrisHCl pH9, 0,1% Triton X-100), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs (Promega), 0,025 U/µl Taq- DNA-Polymerase (Promega), jeweils 5 pM an spezifischen Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 und 100 ng der jeweils zu untersuchenden Plasmid-DNA. Zur Kontrolle wurden spezifische Primer für GAPDH (SEQ ID NO: 14 und 15) eingesetzt. Zur Überprüfung des selektiven Nachweises wurden die Primerpaare parallel auch auf das isolierte Plasmid hin ausgetestet. Die Nachweisbarkeit von Fragmenten der zu erwartenden Länge in einem der kritischen Normalgewebe (Herz, Leber, Lunge, Niere und Leukozyten), nicht jedoch in den cDNA- Bibliotheken aus immunprivilegierten Geweben (Gehirn, fötales Gehirn und Testis) unter diesen PCR-Bedingungen (1 Zyklus: 3' 94°C; 35 Zyklen: 1' 94°C - 1' 55°C - 1' 72°C; 1 Zyklus: 7' 72°C) wurde als Ausscheidungskriterium definiert. Mittels dieser qualitativen PCR-Analyse konnte die Zahl der Kandidaten auf 56 eingeengt werden.

Beispiel 3 Transkriptionelle Analyse der Kandidaten-Klone in verschiedenen Tumor- und Normalgeweben

Für die RT-PCR-Analyse wurden cDNA-Pools verwendet, die aus je 3 µg total-RNA von 3 verschiedenen Geweben des gleichen Typs hergestellt wurden. Die 9 µg total-RNA pro Gewebepool aus Tumor- oder Normalgeweben wurden mittels AMV-RT (Promega) entsprechend der Herstellerempfehlung revers transkribiert. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit genomischer DNA wurde die RNA vorher mit DNAse I (Boehringer Mannheim) inkubiert. Qualität und Menge der cDNAs wurde durch PCR mit GAPDH spezifischen Primern (SEQ ID NO: 14 und 15) nach 20 Zyklen (30" 95°C, 90" 60°C) überprüft. B99-cDNA wurde durch 25, 30 und 35 Zyklen des Programms 1' 95°C, 1' 55°C, 1' 72°C mit den B99-spezifischen Primern gemäß SEQ ID NO: 7 und 8 amplifiziert. Analog wurden die anderen 55 Kandidaten-Klone mit jeweils spezifischen Primern untersucht. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen. Für 3 der 56 untersuchten Klone konnte mittels RT-PCR eine vermehrte Expression in verschiedenen Tumorgeweben im Vergleich zu Normalgeweben gezeigt werden. Ein Beispiel für Kandidat 899 ist in Fig. 1 gezeigt: Die RT-PCR-Analyse von cDNA-Pools verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern ergab ein starkes Signal im Kolonkarzinom und in der Lungenadeno- Karzinomlinie A549 sowie ein schwaches Signal im Brustkarzinom und im Nierenzellkarzinom. Von allen untersuchten Normalgeweben war ein schwaches Signal nur in Kolongewebe feststellbar. Im weiteren Verlauf wurde der Kandidat B99 genauer evaluiert.

Beispiel 4 Expressionsprofil von B99 in Tumor- und Normalgeweben

Einer der 56 Kandidaten (Bezeichnung: B99) zeigte mittels RT-PCR-Transkription in 3 von 5 getesteten Tumorgewebe-Pools ein Signal. In den meisten getesteten Normalgeweben konnte hingegen keine Transkription festgestellt werden.

Für eine detaillierte Untersuchung der B99-Expression wurden im folgenden cDNAs individueller Tumor- und Normalgewebeproben mittels PCR analysiert. Dabei zeigte sich, daß die Mehrzahl aller untersuchten Kolonkarzinome (17/ 23), alle Pankreaskarzinome (3/3) und alle Magenkarzinome (4/4) B99 exprimieren. In entsprechenden Normalgeweben wurde eine Expression in 1/4, 0/3 bzw. 2/4 Fällen nachgewiesen. Alle Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, Fig. 2 zeigt exemplarische Ergebnisse für Pankreas- und Kolongewebe: Mittels RT-PCR-Analyse von individuellen cDNAs verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern konnte in 6 von 7 Tumorproben B99-cDNA nachgewiesen werden, während nur eines der untersuchten Normalgewebe (1/6) eine schwache Expression von B99 zeigte.

Tabelle 1

Für die Northern Blot-Analyse wurden Human Multiple Tissue Northern blots (Clontech, Palo Alto) mit dem [α-³²P]dCTP (NEN, Boston) markierten 271 bp B99 PCR- Produkt bei 65° für 16 h hybridisiert. Die Visualisierung erfolgte durch Standard-Autoradiografie (Xomat AR film, Kodak) und Exposition auf einen Phosphoimager (Molecular Dynamics). Fig. 3 zeigt das Ergebnis dieser Analyse von 16 Normalgeweben. Dabei zeigte sich lediglich in Kolon und deutlich schwächer in Duodenum ein Transkript von ~3,0 kb Größe. Die geringe Intensität des Signals läßt jedoch eine immunologisch relevante Expression als unwahrscheinlich erscheinen.

Das Ergebnis aller Versuche bezüglich des mRNA-Profils von B99 (kompiliert aus RT-PCR und Northern Blot- Analyse) ist in Tabelle 1 zusammengefaßt. Beispiel 4 zeigt, daß B99 in einem hohen Prozentsatz von Tumoren verschiedener Indikationen deutlich transkribiert wird, während in allen untersuchten Normalgeweben keine oder nur vereinzelte Transkription gefunden wurde.

Beispiel 5 Klonierung von B99

Klon B99 besitzt zwischen den durch die RDA eingeführten Adaptoren ein 271 bp langes Insert eines unbekannten humanen Gens. Zur vollständigen Klonierung der humanen Sequenz wurde wie folgt vorgegangen: eine UniGene-Analyse (National Center for Biotechnology Information) ergab folgende zu B99 homologe ESTs: AA315469, AA345780, AA295520. Mit Hilfe dieser ESTs konnte die B99-Sequenz auf 439 Nukleotide verlängert werden. Neue Primer innerhalb dieser Sequenz wurden synthetisiert (SEQ ID NO: 9 bis 12). Durch PCR mit verschiedenen Kombinationen dieser Primer konnten die jeweiligen theoretischen Fragmentlängen aus A549 cDNA amplifiziert werden.

Klonierung des 3'-Endes: 10 µg total-RNA aus der Nierenzellkarzinom-Zelllinie 786-0 wurden mittels Oligo-dT-Primer revers transkribiert, und ein Aliquot dieser cDNA wurde einer PCR unterzogen, deren Programm mit hohen Annealingtemperaturen beginnt, sodaß nur der genspezifische Primer an die cDNA bindet(Primer SEQ ID NO: 7 bzw. 9), während der zweite Primer (T_m~53°C, SEQ ID NO: 13) erst bei niedrigerer Temperatur an die neu synthetisierte DNA-Vorlage bindet. Diese sog. "touch-down PCR" (Mastercycler Gradient, Eppendorf) wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
20 Zyklen {15" 95°C, 30" 75°C (reduziert um 0,7°C je Zyklus)}, 1 Zyklus 7' 72°C, sowie 20 Zyklen (15" 95°C, 30" 50°C), 1 Zyklus 7' 72°C}.

Ein Aliquot des obigen Ansatzes wurde mittels einer zweiten Primerkombination (SEQ ID NO: 7 und 13 bzw. SEQ ID NO: 12 und 13) unter den gleichen Bedingungen wie vorher erneut PCR amplifiziert. Aliquots der PCR- Ansätze wurden direkt in den pGEM-T easy-Vektor (Promega) ligiert und anschließend in kompetente E. coli J109 (Promega) transformiert. Positive Klone wurden nach PCR-Selektion sequenziert. Die Sequenzierung ergab eine Übereinstimmung mit der bisherigen Sequenz ab dem für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer und darüberhinaus 1777 zusätzliche Nukleotide bis zum Beginn einer PolyA-Sequenz im 3'-Bereich der Sequenz. PCR-Amplifikation von cDNA aus Tumorzelllinien (786-0, A549) sowie Gewebeproben von Kolonkarzinomen mit den Primern gemäß SEQ ID NO: 16 bis 18 ergaben mit den ursprünglichen Primern die nach der Klonierung erwarteten Fragmente. In dem nunmehr aus 2216 bp bestehenden cDNA-Fragment konnte ein durchgehender Leserahmen von Pos. 427 bis 1743 identifiziert werden. Weiter im 5'-Bereich der Sequenz konnten keine zusätzlichen Leserahmen identifiziert werden, woraus zu schließen ist, daß der Bereich von 0 bis 427 bereits zum 5'-nicht translatierten Bereich der B99 mRNA gehört.

Mit Hilfe der Primer SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 17 wurde der gesamte kodierende Bereich von B99 aus A549-cDNA amplifiziert, kloniert und sequenziert. Bei der Sequenzierung wurden mehrere Klone mit einer Insertion von einem Nukleotid an Pos. 923 im Vergleich zu SEQ ID NO: 1 (kodiert für B99-1) erhalten (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5).

Diese Insertion führt zu einer Veränderung des offenen Leserahmens von B99 mit einer daraus resultierenden veränderten Aminosäuresequenz im C-terminalen-Bereich des B99-Proteins; die von diesem Leserahmen abgeleitete Sequenz des B99-Antigens (B99-2) ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt.

Einer der aus A549-Zellen isolierten Klone zeigte neben der genannten Insertion einen Nukleotidaustausch an Position 622 im Vergleich zu Sequenz SEQ ID NO: 1 auf. Dieser Nukleotidaustausch bedingt an Position Nr. 66 der Aminosäuresequenz einen Ersatz von Arginin (SEQ ID NO: 2, B99-1) durch Tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2). Abgesehen von diesem Aminosäureaustausch ist die Aminosäuresequenz von B99-2 bis zu Position 166 identisch mit B99-1.

Darüberhinaus bedingt die genannte Insertion einen zweiten potentiellen Leserahmen von Pos. 845 bis 1744 der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz. Ein von einer cDNA mit diesem Leserahmen exprimiertes Protein weist die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz auf (B99-3). Die Sequenz von B99-3 ist von Pos. 1 bis 27 unterschiedlich zu B99-1 und ab Pos. 28 identisch mit B99-1.

Beispiel 6 Potentielle MHC-Bindungspeptide in der kodierenden Region von B99

Potentielle Peptid-Epitope innerhalb der kodierenden Region von B99-1 gemäß SEQ ID NO: 2 (Aminosäureposition: 1-438; Tab. 2A), von B99-2 gemäß SEQ ID NO: 4 (Aminosäureposition 150-190; Tab. 2B) und von B99-3 gemäß SEQ TD NO: 6 (Aminosäureposition 1-40; Tab. 2C) wurden mittels den von Parker et. al., 1994 beschriebenen Algorithmen unter Zugrundelegung bekannter Motive (Rammensee et al. 1995) durchgeführt. Für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, wurden 9-mer- Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Durch analoges Vorgehen können weitere potentielle Peptid-Epitope für andere HLA-Typen bzw. 8- und 10-mer- Peptide ermittelt werden.

Tabelle 2A

Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-1)

Tabelle 2B

Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-2)

Tabelle 2C

Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-3)

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (20)

1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B99, ausgewählt aus der Gruppe von Polypeptiden mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegebenen Aminosäuresequenz.

2. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist.

3. Immunogenes (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, das eine humorale Immunantwort auslöst.

4. Immunogenes (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.

5. Immunogenes Peptid nach Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 22 bis 55.

6. Immunogenes (Poly)peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly)peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die B99 exprimieren.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly)peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie verschiedene von B99 abgeleitete immunogene Peptide enthält.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere von B99 abgleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthält.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.

11. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften eines in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigens oder für Fragmente davon.

12. DNA-Molekül nach Anspruch 12, kodierend für ein immunogenes Polypeptid der Bezeichung B99 mit der in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.

13. DNA-Molekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 dargestellten Sequenz ist oder mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

14. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA- Molekül gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13.

15. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 14, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen, wobei das von dem DNA-Molekül exprimierte B99- (Poly)peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die B99 exprimieren.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksamen Bestandteil ein oder mehrere der in einem der Ansprüche 11 bis 15 definierten DNA- Moleküle.

17. Verwendung von Zellen, die das in Anspruch 1 definierte tumorassoziierte Antigen exprimieren, für die Herstellung einer Krebsvakzine.

18. Antikörper gegen ein in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiertes (Poly)peptid.

19. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

20. Antikörper nach Anspruch 18 oder 19 für die Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von B99 assoziiert sind.