MXPA01010740A

MXPA01010740A - Antigeno asociado con tumores.

Info

Publication number: MXPA01010740A
Application number: MXPA01010740A
Authority: MX
Inventors: Karl-Heinz Heider
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2002-06-04
Also published as: JP2004500024A; AU4553100A; CA2365278A1; EP1177288A1; WO2000066727A9; AR023794A1; CO5300468A1; WO2000066727A1; DE19919225A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un antigeno asociado con tumores, peptidos inmunogenicos derivados de este y moleculas de ADN que lo codifican, asi como su utilizacion en la inmunoterapia de enfermedades de cancer.

Description

ANTIGENO ASOCIADO CON TUMORES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la inmunoterapia de enfermedades de tumores . El sistema inmune tiene la misión de proteger al organismo con respecto de un gran número de diferentes microorganismos o la de combatir activamente a éstos. La importancia de un sistema inmune intacto se muestra sobre todo en el caso de inmunodeficiencias heredadas o adquiridas. El empleo de programas profilácticos de vacunación se manifestó en muchos casos como una intervención inmunológica extremadamente conducente a su finalidad y con éxito en la lucha contra enfermedades infecciosas virales o bacterianas. Además, se ha mostrado que el sistema inmune participa decisivamente también en la eliminación de células de tumores. En tal caso, desempeña un papel esencial el reconocimiento de los antígenos asociados con tumores (TAAs, de TumorAssozi erten Antigene) por componentes del sistema inmune. En el sentido más amplio, cada componente (peptídico o no- peptídico) de una célula tumoral, que se reconoce por un elemento del sistema inmune y conduce a la estimulación de una respuesta inmunológica, puede funcionar como antígeno tumoral inmunogénico. Les REF: 133370 corresponde importancia especial en tal caso a los antígenos de tumores que no solamente provocan una reacción inmunológica sino que producen también un rechazo del tumor. La identificación de antígenos definidos, que pueden producir tal reacción inmunológica, constituye una etapa importante para el desarrollo de una vacuna molecularmente definida contra tumores. Aún cuando todavía no se ha puesto en claro totalmente qué elementos del sistema inmune son responsables de un rechazo del tumor, existe sin embargo un consenso acerca de que en este contexto desempeñan un papel especial los linfocitos T cítotóxicos (CTLs, de Cytotoxic T Lymphocytes) , que expresan CDB (Coulie, 1997) . Especialmente en el caso de las especies de tumores (por ejemplo, melanoma y carcinoma renal), que tienen - una tasa de remisión espontánea relativamente alta, se pudo comprobar una correlación entre la evolución clínica y la aparición aumentada de células T CD8+ y CD4+ (Schendel y colaboradores, 1993; Mackensen y colaboradores, 1993; Halliday y colaboradores, 1995; Kawakami y colaboradores, 1995; Ka akami y colaboradores, 1996; Wang, 1997; Celluzzi y Falo, 1998) . En tal caso se obtuvieron clones de CTL específicos o bien a partir de linfocitos que se infiltran en tumores (TIL, de Tumor Infil trating Lymphocytes) o células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC, de Peripheral Blood Mononuclear Celis) después de cultivación conjunta con células de tumores, que la mayor parte de las veces son autólogas, y de estimulación in vi tro de las citoquinas. Tanto en modelos de animales como también en sistemas de cultivos celulares humanos cultivados in vi tro se pudo reforzar la respuesta de las células T frente a células de tumores por transfección de las células de tumores con citoquinas (van Elsas y colaboradores, 1997; Gansbacher y colaboradores, 1990; Tepper y colaboradores, 1989; Fearon y colaboradores, 1990; Dranoff y colaboradores, 1993) . Por causa de la correlación entre la remisión y la participación de células T CD8+, la identificación de antígenos asociados con tumores (TAA), que son reconocidos por CTLs positivos para CD8, constituye una meta principal declarada en el camino para el desarrollo de una vacuna contra tumores (Pardoll 1998; Robbins y Kawakami, 1996) . Todavía no está claro si también desempeñan un papel esencial otros tipos de células del sistema inmune, tales como por ejemplo, células T cooperantes CD4+; algunos estudios con péptidos MAGE-3/HLA-A1 en pacientes de melanoma indican que esto es así (Marchand y colaboradores, 1995; Boon y colaboradores, 1998) . En los últimos años transcurridos, se ha identificado una serie de TAAs, que son reconocidos por los CTLs (Boon y colaboradores, 1994; van den Eynde y van der Bruggen, 1997) . Las células T reconocen a antígenos como fragmentos peptídicos, que son presentados junto a superficies celulares de moléculas del MHC ( "major histocompa tibili ty compl ex " = complejo de histocompatibilidad principal) en seres humanos, "HLA" = "human leukoci te antigen " = antígeno de leucocitos humanos) . Hay dos clases de moléculas de MHC: las moléculas del MHC-I aparecen en la mayor parte de las células con núcleo y presentan péptidos (usualmente 8 - 10-meros) , que se forman mediante descomposición proteolítica de proteínas endógenas (el denominado tratamiento de antígenos, "antigen processing") . Los complejos de péptidos y del MHC-I son reconocidos por CTLs positivos para CD8. Las moléculas del MHC-II aparecen sólo en las denominadas "células presentadoras de antígenos profesionales" (APC = "antigen presenting cells ") y presentan péptidos de proteínas exógenas, que en el transcurso de la endocitosis son recogidas y tratadas por las APC. Los complejos de péptidos y del MHC-II son reconocidos por células T cooperantes de CD4. Mediante una interacción entre un receptor de células T y el complejo de un péptido y del MHC se pueden provocar diferentes mecanismos efectores, que en el caso de los CTLs conducen a la apoptosis de la célula diana. Esto sucede cuando se reconoce como ajeno o bien el MHC (por ejemplo, en el caso del rechazo de un trasplante) , o del péptido (por ejemplo, en el caso de patógenos intracelulares) . No obstante, no todos los péptidos presentados cumplen los requisitos estructurales y funcionales para una interacción efectiva con células T (tal como ha sido descrito por Rammensee y colaboradores, 1995 y más adelante en esta memoria) . Para el empleo de TAAs en una vacuna contra tumores, son posibles fundamentalmente varias formas de aplicación: El antígeno puede ser aplicado o bien como proteína recombinante con apropiados adyuvantes o sistemas de soporte, o como ADNc que codifica el antígeno en vectores de plásmidos (vacunas de ADN; Tighe y colaboradores, 1998) o víricos (Restifo, 1997) . Otra posibilidad consiste en el empleo de bacterias recombinantes (por ejemplo, Listería, Salmonella) , que expresan recombinantemente el antígeno humano y mediante sus componentes adicionales tienen un efecto adyuvante (Paterson, 1996; Pardoll, 1998) . En todos estos casos, se necesitan un tratamiento y una presentación del antígeno por las denominadas "células presentadoras de antígenos profesionales" (APC) . Otra posibilidad es el empleo de péptidos sintéticos (Melief y colaboradores, 1996) , que corresponden a los epitopes para células T correspondientes al antígeno y que o bien se cargan desde el exterior en las APC (Buschle y colaboradores, 1997; Schmidt y colaboradores, 1997) o se recogen por las APC y se transfieren intracelularmente a las moléculas del MHC-I. La forma de aplicación más eficiente terapéuticamente para un antígeno definido es determinada por lo general en estudios clínicos . Entre los antígenos o sus epitopes, reconocidos por los CTLs específicos para tumores, se cuentan moléculas que pueden proceder de todas las clases de proteínas (por ejemplo, factores de transcripción, receptores, enzimas; para una visión de conjunto, véase Rammensee y colaboradores, 1995; Robbins y Kawakami, 1996) . Estas proteínas no deben estar necesariamente localizadas junto a la superficie de las células, tal como se necesita esto en el caso del reconocimiento por anticuerpos. Con el fin de funcionar para el reconocimiento por los CTLs como antígeno específico para tumores y con el fin de poderse emplear para la terapia, las proteínas deben cumplir determinadas condiciones; en primer lugar, el antígeno debe de ser expresado principalmente por células de tumores y en los denominados tejidos normales "críticos" no debe aparecer o sólo debe aparecer en una concentración menor que en tumores. Los tejidos normales críticos son tejidos esenciales; una reacción inmune dirigida contra ellos, podría tener en ciertas circunstancias secuelas graves, en parte letales. En segundo lugar, el antígeno no solamente debe estar presente en el tumor primario, sino también en las metástasis. Además, en lo que respecta a una aplicación clínica amplia del antígeno, ha de pretenderse que éste se encuentre presente en alta concentración en varias especies de tumores. Otra condición previa para la idoneidad de un TAA como constituyente eficaz de una vacuna es la presencia de epitopes para células T en la secuencia de aminoácidos del antígeno; los péptidos derivados de un TAA deben conducir a una respuesta de células T in vi tro/ in vi vo (péptido "inmunogénico") . Otro criterio de selección adicional para un péptido inmunogénico ampliamente aplicable a escala clínica es la frecuencia con la que el antígeno ha de encontrarse en una población dada de pacientes. Los antígenos asociados con tumores (TAAs) inmunogénicos, de los cuales ya se mostró en su mayor parte que poseen epitope para células T, se pueden clasificar en varias categorías, entre otras, proteínas virales, proteínas mutadas, proteínas sobreexpresadas, proteínas de 5 fusión formadas por translocación cromosomal, antígenos de diferenciación, antígenos oncofetales (Van den Eynde y Brichard, 1995; van den Eynde y van der Bruggen, 1997) . Los métodos para la identificación y la caracterización de TAAs, que constituyen el punto de partida 10 para el desarrollo de una vacuna contra tumores se basan por un lado en el empleo de CTLs (respuesta inmune celular) o de anticuerpos (respuesta inmune humoral) ya inducidos en los pacientes, o se basan en la elaboración de perfiles diferenciales de transcripción entre tumores y tejidos 15 normales. En el primero de los casos, es decir el punto de partida inmunológico, se emplean CTLs de pacientes para un escrutinio de bibliotecas de expresión de ADNc de tumores eucarióticos, que presentan los epitopes para CTL a través de moléculas del MHC-I (Boon y colaboradores, 1994), 20 mientras que por medio de antisueros muy afines de pacientes se investigan bibliotecas de expresión de ADNc procarióticos, directamente a través de un análisis por inmunotransferencia de las calvas individuales en cuanto a J??? ii^?íU la presencia de los TAAs (Sahin y colaboradores, 1995) . Una combinación entre la reactividad de los CTL y un procedimiento químico proteínico la constituye el aislamiento de péptidos aislados a partir del MHC-I de células de tumores, que se habían seleccionado previamente a través de la reactividad con CTLs de pacientes. Los péptidos son separados por lavado con respecto del complejo de MHC-I e identificados con ayuda de la espectrometría de masas (Falk y colaboradores, 1991; Woelfel y colaboradores, 1994; Cox y colaboradores, 1994). Los puntos de partida, que utilizan CTLs para la caracterización de antígenos, están vinculados con un considerable gasto o no siempre tienen éxito, por causa de la cultivación y la activación necesarias de los CTLs. Los métodos para la identificación de TAAs, que se basan en la comparación del perfil de transcripción de un tejido normal con el a un tejido tumoral, son múltiples y muy variados; entre ellos se cuentan la hibridación diferencial, el establecimiento de bancos de ADNc por substracción ( "representational difference analysis" (análisis de la diferencia representativa) ; Hubank y Schatz, 1994; Diatchenko y colaboradores, 1996) y el empleo de la tecnología de los chip de ADN o del método de SAGE ...J (Velculescu y colaboradores, 1995) . Al contrario que en el método inmunológico antes mencionado con ayuda de los CTLs de pacientes, en el caso de emplearse métodos de biología molecular debe de mostrarse que los candidatos a antígenos potenciales, encontrados de esta manera, son específicos para tumores (están asociados a tumores) y poseen realmente epitopes para células T, que pueden provocar una respuesta citotóxica de células T. En por lo menos uno de los casos (NY-ESO/LAGE-1) se identificó un antígeno tanto mediante la utilización de sueros de pacientes como también mediante un análisis RDA (Chen y colaboradores, 1997; Lethe y colaboradores, 1998), además se describieron epitopes para CTL de este antígeno y unas simultáneas respuestas humoral espontánea y de células T en un paciente (Jager y colaboradores, 1998) . Fue misión de la presente invención poner a disposición un nuevo antígeno asociado con tumores (TAA) . El problema planteado por esta misión se resolvió produciendo primeramente una biblioteca por substracción de ADNc mediante un RDA ( "representational difiference analysis " = análisis diferencial representativo) entre una línea celular de adenocarcinoma de pulmón (A549) y un tejido de pulmón normal. Para la selección de los antígenos sobreexpresados en el tumor, se secuenciaron a continuación los clones obtenidos de ADNc y se compararon con las secuencias disponibles en bancos de datos. Entre los genes anotados en tal caso se encontraban 321 desconocidos, entre las cuales existían en el banco de datos en su mayor parte incorporaciones de ESTs ( "expressed secuence tags " = marcas de secuencias expresadas) . De acuerdo con otro análisis cualitativo adicional por PCR en bibliotecas de ADNc de tejidos normales críticos y tejidos inmunemente privilegiados así como en investigaciones más detalladas de bancos de datos, el número de los clones candidatos se limitó a 56, cuyas ESTs no proceden de tejidos normales críticos. Mediante una RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reacti on = reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa) se comprobó que tres de los 56 clones investigados manifiestan una expresión principalmente en diferentes tejidos de tumores y ninguna o sólo una escasa expresión en tejidos normales. La comparación cualitativa (mediante PCR) de la expresión de uno de los clones (B99) entre un tejido normal y un tejido de tumor mostró una sobreexpresión del ADNc de B99 en diferentes tumores. El perfil de expresión analizado mediante una transferencia Northern (Northern Blot) mostró complementariamente que el ¡ ¡ B99 no presentaba en los tejidos normales investigados ninguna transcripción o presentaba solamente una débil transcripción. El ADNc de B99 humano fue clonado, la secuencia obtenida se representa en la SEC ID NO: 1. El análisis de la secuencia del ADNc de B99 humano clonado puso de manifiesto que desde la posición 427 hasta la posición 1,743 se presenta un cuadro de lectura abierto continuo, que, en el plano de los nucleótidos y las proteínas, posee una alta identidad con el cuadro de lectura abierto de la beta-1,3-galactosil-o-glicosil-glicoproteína beta-1, 6-n-acetil-glucosaminil-transferasa. A partir de los datos obtenidos a partir de experimentos por transferencias Northern ha de sacarse la conclusión de que el transcrito de B99 tiene una longitud de aproximadamente 3.0 kb. La región clonada del ADNc de B99 tiene un tamaño de 2,216 pb (pares de bases), respondiendo la presencia de una cola de poli A en el extremo 3' de la secuencia de la compleción del ADNc en esta región. La diferencia en cuanto al tamaño del ADNc clonados de B99, en comparación con el tamaño deducible del análisis por transferencia Northern, se puede explicar por la presencia de una cola de poli A con longitud desconocida así como de una secuencia adicional en la región no traducida en 5' de B99. Por causa del hecho de que en la región de 5' del ADNc clonado no se presenta ningún cuadro de lectura continuo desde la posición 0 a 427, se puede sacar la conclusión de que en el caso del ATG en posición 427 se trata del codón de iniciación de B99. Una información adicional acerca de la secuencia situada más corriente arriba de B99 se puede obtener por métodos clásicos de biología molecular, por ejemplo, mediante 5' -RACE ( "rapid amplifica ti on of cDNA ends " = amplificación rápida de extremos de ADNc) . En el caso de este método, se transcribe inversamente un ARN, preferiblemente un ARNm (mensajero), procedente de células o tejidos en los que es transcrito el B99 (por ejemplo, tejido de carcinoma de colon o líneas celulares derivadas de adenocarcinoma pulmonar, tales como A549) y a continuación se liga con un adaptador con secuencia conocida. Una PCR con un cebador de adaptador (que se fija específicamente al adaptador situado en el extremo 5' del ADNc) y un cebador específico para B99 (por ejemplo, SEC ID NO: 8, 10, 11) permite la amplificación de correspondientes fragmentos de B99. Estos fragmentos de PCR, tal como se describe en el Ejemplo 1, pueden ser donados según métodos clásicos y caracterizados, especialmente por secuenciación de ADN.

Un método alternativo para la caracterización del extremo 5' es el escrutinio de bibliotecas de ADNc por hibridación con sondas de ADN o antisueros, que son específicos para B99. Si el escrutinio de bibliotecas de ADNc por causa de limitaciones condicionadas por la metodología, por ejemplo, condicionado por una transcripción inversa ineficiente, debido a estructuras secundarias pronunciadas del ARN, no conduce a la meta deseada, se pueden investigar bibliotecas genómicas mediante el recurso de que por ejemplo,, tal como en el caso del escrutinio de bibliotecas de ADNc, mediante hibridación con sondas de ADN específicas para B99, se pueden aislar clones que contienen la información obtenida de secuencia corriente arriba del extremo 5' del ADNc, por ejemplo, la región de promotor de B99. El ADNc aislado codifica el antígeno asociado con tumores (TAA) que tiene la denominación B99 con la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO:2 (B99-1) . La secuencia de B99-1 es definida por el codón de iniciación en la posición 427 del ADNc de B99 aislado. En un experimento adicional para la donación de la región codificadora de B99, en la que se utilizó el ADNc ,-,.„?. procedente de la línea celular A549 de adenocarcinoma de pulmón, se determinó una secuencia, que en comparación con la secuencia representada en SEC ID N0:1 presenta una inserción de un nucleótido en posición 923 (SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 5). Esta inserción conduce a una modificación del cuadro de lectura abierto de B99 con una secuencia de aminoácidos modificada resultante de ello en la región terminal de C de la proteína B99; la secuencia de este antígeno de B99 (B99-2), que se deduce de este cuadro de lectura, está representada en SEC ID NO: 4. Además de la inserción, el ADNc aislado a partir de células A549 presenta un intercambio de nucleótidos en la posición 622 en comparación con la secuencia SEC ID NO:l. Este intercambio de nucleótidos da lugar en la posición N° 66 un reemplazo de arginina (SEC ID NO:2, B99-1) por triptofano (SEC ID NO: 4, B99-2) . Aparte de este intercambio de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de B99-2 hasta la posición 166 lo inclusive es idéntica a la de B99-1. La inserción de un nucleótido en la posición 923 proporciona un segundo cuadro de lectura potencial desde la posición 845 hasta la 1,744 de la secuencia representada en SEC ID NO: 3 (o en SEC ID NO: 5). Una proteína expresada por un ADNc con este cuadro de lectura tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID NO: 6 (B99-3) . La secuencia de B99-3 es diferente desde la posición 1 a la 27 de la de B99-1 y a partir de la posición 28 es idéntica a la de B99-1. La invención concierne por consiguiente en un primer aspecto a un antígeno asociado con tumores que tiene la denominación B99, seleccionado entre el grupo de polipéptidos con las secuencias de aminoácidos que se indican en SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6. Las secuencias de aminoácidos representadas en SEC ID NO:2 (B99-1), SEC ID NO:4 (B99-2) y SEC ID NO:6 (B99-3) pueden tener desviaciones, por ejemplo, las que están condicionadas por el intercambio de aminoácidos, siempre y cuando que el derivado de B99 tenga las propiedades inmunógenas deseadas para la utilización en una vacuna contra tumores. (Un ejemplo acerca de un polimorfismo de 13-99 de este tipo es la diferencia condicionada por mutación puntual en la posición 66 entre B99-1 y B99-2. En lo sucesivo, cuando no se indique otra cosa distinta, la denominación "B99" se utiliza representativamente para B99-1, B99-2 y B99-3. La secuencia natural de aminoácidos de B99 (o correspondientemente las secuencias del ADNc de B99) puede ser eventualmente modificada, intercambiando aminoácidos individuales en un epitope para CTL de B99, con el fin de producir, en comparación con el epitope natural para CTL de B99, producir un aumento de la afinidad de los péptidos de B99 para moléculas del MHC-I y con ello una inmunogenicidad y finalmente una reactividad aumentada frente a tumores. Las modificaciones en la región de los epitopes para B99 pueden ser llevadas a cabo en la proteína total de B99 (ésta es tratada por las APCs para dar los correspondientes péptidos) o en fragmentos proteínicos mayores de B99 o en péptidos de B99 (compárese más adelante) . En un aspecto adicional, la presente invención concierne a fragmentos y péptidos inmunogénicos, que se derivan de B99. Estos últimos son denominados en lo sucesivo como "péptidos de B99". Un primer grupo lo constituyen los péptidos de B99, que provocan una respuesta inmune humoral (inducción de anticuerpos) . Tales péptidos son segmentos seleccionados de B99 (por lo menos de 12 a 15 aminoácidos), que se pueden determinar mediante los denominados algoritmos de predicción ( "predi ction algori thms ") tal como por ejemplo, el " surface probabili ty blot " (borrón de probabilidad superficial) (Emini y colaboradores, 1985) el "hydrophobici ty blot " (borrón de hidrofobia) (Kyte y Doolittle, 1982) y el "antigenic index " (índice antigénico) (Jameson y Wolf, 1988) . Es conocido que los antígenos asociados con tumores pueden presentar mutaciones específicas para tumores, que contribuyen a una diferenciación inmunológica entre un tumor y un tejido normal (Mandruzzato y colaboradores, 1997; Hogan y colaboradores, 1998; Gaudi y colaboradores, 1999; Wólfel y colaboradores, 1995) . Con el fin de comprobar la presencia de mutaciones de B99 específicas para tumores, convenientemente con ayuda de sondas procedentes de sondas del ADNc aislado conforme a la invención, se clona el ADNc de B99 procedente de uno o varios tumores diferentes, y las secuencias obtenidas se comparan con el ADNc de B99 de un tejido normal. Es de esperar que los péptidos de B99 de un tumor procedentes de un segmento de secuencia mutado con respecto al de B99 de un tejido normal, presenten una inmunogenicidad aumentada en comparación con los péptidos de B99 de tejido normal procedentes del correspondiente segmento. La presente invención concierne por consiguiente en otro aspecto a péptidos de B99, que se derivan de regiones de un B99 expresado en tumor, que presentan mutaciones específicas para tumores. Al efectuar la elección de candidatos a péptidos de B99 merecen interés especial las regiones de B99-2 y B99-3, que se diferencian de las de B99-1. Con la premisa de que en el caso de la inserción del ADN de B99, que conduce a estas diferencias en la secuencia de aminoácidos, se trata de una mutación específica para tumores, hay que esperar en efecto que los péptidos procedentes de esta región presenten una inmunogenicidad aumentada en comparación con la de los péptidos procedentes de B99-1. Con el fin de confirmar que la inserción es específica para tumores, se pueden generar anticuerpos contra esta región e investigar células de tumores en cuanto a la expresión de B99-2 y B99-3. Los péptidos de B99 son administrados directamente o en una forma modificada (por ejemplo, acoplada a KLH = "keyhole limpet hemocyanine " = hemocianina de lapa de bocallave) y se determina la formación de anticuerpos mediante análisis inmunológicos corrientes, por ejemplo, mediante un ELISA. Otros péptidos de B99, preferidos dentro del marco de la presente invención, son aquellos que son presentados por moléculas del MHC y producen una respuesta inmune celular. Existen dos clases de moléculas del MHC, a saber moléculas del MHC-I, que son reconocidas por CTLs positivos para CD8, y moléculas del MHC-II que son reconocidas por células T cooperantes positivas para CD4. Para que un péptido provoque una respuesta inmune celular, éste debe de fijarse a una molécula del MHC, debiendo el paciente que ha de ser tratado tener la molécula del MHC en su repertorio. La determinación del subtipo del MHC del paciente constituye por consiguiente, en lo referente a la provocación de una respuesta inmune celular, una de las condiciones previas esenciales para la utilización eficaz de un péptido en este paciente. La secuencia de un péptido B99, que se ha de emplear terapéuticamente, es preestablecida por la respectiva molécula de MHC en lo referente a los aminoácidos de anclaje y su longitud. Posiciones de anclaje y longitudes definidas garantizan que un péptido se adapte dentro del surco de fijación de péptidos de la respectiva molécula del MHC del paciente. Esto tiene como consecuencia el hecho de que sea estimulado el sistema inmune y se produzca una reacción inmune celular, que en el caso de la utilización de un péptido derivado de un antígeno tumoral se dirija contra las células de tumores del paciente. Los péptidos de B99 inmunogénicos se pueden identificar de acuerdo con métodos conocidos, uno de los fundamentos para ello es la relación entre la fijación al MHC y la inducción de los CTL. Puesto que por lo tanto la secuencia de péptidos inmunogénicos es determinable de antemano en virtud de su motivo de fijación peptidico, se pueden identificar y sintetizar péptidos de B99, que constituyen epitopes para CTL, en base a la secuencia proteínica de B99. Para ello son apropiados diferentes métodos que se utilizaron para la identificación de epitopes para CTL de antígenos de proteínas que se conocen; por ejemplo, el método descrito por Stauss y colaboradores, 1992, para la identificación de epitopes para células T en el virus de papiloma humano. Los requisitos específicos para un alelo de cada producto de alelo del MHC-I a un péptido, que se fija a la molécula del MHC y es presentado por ésta, fueron recopilados como motivo (por ejemplo, Falk y colaboradores, 1991) . Hasta ahora se conoce un gran número tanto de motivos de péptidos del MHC como también de ligandos del MHC. Un método apropiado dentro del marco de la presente invención para la búsqueda de epitopes para una proteína conocida, que se adapta dentro de una determinada molécula del MHC-I, fue descrito en un artículo recopilativo de Rammensee y colaboradores, 1995. Éste abarca las siguientes etapas: en primer lugar se investiga la secuencia de proteínas en cuanto a segmentos que correspondan al motivo de anclaje, siendo posibles determinadas variaciones en lo referente a la longitud del péptido y a la ocupación del anclaje. Cuando por ejemplo, un motivo prescribe un 9-mero con lie o Leu en el extremo, se pueden tomar en consideración también 10-meros con un extremo terminal de C correspondiente, y asimismo péptidos con otros restos alifáticos tales como Val o Met en el extremo terminal de C. De este modo se obtienen una serie de candidatos a péptidos. Estos son investigados en cuanto a la presencia del mayor número posible de restos de anclaje, que ellos tengan en común con ligandos ya conocidos y/o para determinar si tienen restos "preferidos" para diferentes moléculas del MHC (correspondientemente a la Tabla de Rammensee y colaboradores, 1995) . Con el fin de excluir a los péptidos que se fijen débilmente, se llevan a cabo convenientemente análisis de fijación. Cuando se conocen los requisitos en cuanto a la fijación a péptidos para determinadas moléculas del MHC, los candidatos a péptidos se pueden investigar también en cuanto a restos que no sean de anclaje, que repercutan negativa o positivamente sobre la fijación, o que hagan posible ésta por primera vez .. (~uppert y colaboradores, 1993) . En el caso de este modo de proceder hay que tomar en consideración, sin embargo, que el motivo de fijación del péptido no solamente es decisivo para la búsqueda en cuanto a ligandos naturales; también otros aspectos, por ejemplo, la especificidad para enzimas durante el tratamiento del antígeno, contribuyen a la identidad del ligando - adicionalmente a la especificidad de la fijación al MHC. Un método, que toma en consideración estos aspectos y que es apropiado dentro del marco de la presente invención para la identificación de péptidos de B99 inmunogénicos, fue utilizado, entre otros autores, por Kawakami y colaboradores, 1995, a fin de identificar epitopes para gplOO basándose en motivos conocidos de HLA-A*0201. Los péptidos se pueden seleccionar también en lo referente a su capacidad para fijarse a moléculas del MHC II. El motivo de fijación al MHC-II, que se extiende a lo largo de nueve aminoácidos, presenta un grado de degeneración en las posiciones de anclaje mayor que el motivo de fijación al MHC-I. Se desarrollaron hace poco tiempo, partiendo del análisis estructural por rayos X de moléculas del MHC-II, métodos que permiten el análisis exacto de los motivos de fijación al MHC-II y partiendo de ello permiten variaciones de la secuencia de péptidos (Rammensee y colaboradores, 1995, y la bibliografía original allí citada) . Los péptidos, que se fijan a moléculas del MHC-II, son presentados a las células T de CD4 típicamente por células dendríticas, macrófagos o células 13. Las células T de CD4 a su vez activan entonces a continuación de ello directamente los CTLs, mediante por ejemplo, segregación y amplificación de citoquinas, la eficiencia de la presentación de antígenos por las APC (células dendríticas, macrófagos y células B) . Desde hace poco tiempo están a disposición bancos de datos y algoritmos de predicción, que permiten con gran seguridad la predicción de epitopes para péptidos, que se fijan a una determinada molécula del MHC. Dentro del marco de la presente invención se identificaron, mediando utilización del algoritmo descrito por Parker y colaboradores, 1994, y Rammensee y colaboradores, 1995, péptidos candidatos a los más importantes tipos de HLA, especialmente a los HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 y 3*4403, de los que se puede esperar que se fijen a las correspondientes moléculas de HLA y por lo tanto constituyan epitopes para CTL inmunogénicos; los péptidos determinados se enumeran en la Tabla 2. De manera similar, eventualmente mediando utilización de otros algoritmos, que toman en consideración las diversas características de los péptidos (hidrofobia, carga, tamaño) o los requisitos en cuando a los péptidos, por ejemplo, la estructura tridimensional de la molécula de HLA, se pueden determinar otros epitopes potenciales para péptidos; esto es válido también para los epitopes para péptidos de otros tipos de HLA. Después de la elección de candidatos a péptidos de B99 con ayuda de los métodos señalados, se ensaya su fijación al MHC mediante análisis de fijación a péptidos. Como siguiente etapa se determina la inmunogenicidad de los péptidos con buenas propiedades de fijación (la estabilidad de la interacción entre péptidos y el MHC se correlaciona en la mayor parte de los casos con la inmunogenicidad; van der Burg y colaboradores, 1996) . Con el fin de determinar la inmunogenicidad del péptido o equivalente a péptido que se selecciona, se pueden utilizar métodos, tales como por ejemplo, el descrito por Sette y colaboradores, 1994, en combinación con análisis cuantitativos de fijación al MHC. Alternativamente, la inmunogenicidad del péptido seleccionado se puede ensayar a través de inducción in vi tro de CTL mediante métodos conocidos (tal como se describen más adelante en esta memoria para la inducción ex vi vo de CTL) . El principio del método realizado en varias etapas para la elección de péptidos que son capaces de provocar una respuesta inmune celular, está descrito en el documento de solicitud de patente PCT WO 97/30721, a cuya divulgación se hace referencia expresamente por la presente. Una estrategia general para la obtención de péptidos inmunogénicos eficientes, que es apropiada dentro del marco de la presente invención, fue descrita además por Sc weighoffer, 1997. En lugar de utilizar los péptidos originales, que se adaptan dentro del surco de fijación de moléculas del MHC-I o MHC-II, es decir péptidos, que se derivan inalteradamente de B99, con ayuda de los requisitos mínimos en lo referente a las posiciones de anclaje y a la longitud, que se indican sobre la base de la secuencia original del péptido, se pueden llevar a cabo variaciones, siempre y cuando que mediante estas variaciones no sólo no se perjudique, sino que se refuerce preferiblemente, la inmunogenicidad efectiva del péptido, que se compone de su afinidad para la fijación a la molécula del MHC y su capacidad para estimular receptores de células T. En este caso se utilizan por lo tanto péptidos artificiales o equivalentes a tales péptidos, que se han desarrollado correspondientemente a los requisitos de la capacidad de fijación a una molécula de MHC. Los péptidos modificados de tal manera son designados 35 como "péptidos heteroclíticos". Éstos se pueden obtener de acuerdo con los siguientes métodos: En primer lugar se desarrollan los epitopes para ligandos del MHC-I o MHC-II o la variación de éstos, por ejemplo, de acuerdo con el principio descrito por Rammensee y colaboradores, 1995. La longitud del péptido corresponde, en el caso de su sintonización a moléculas del MHC-I, preferiblemente a una secuencia mínima de 8 a 10 aminoácidos con los necesarios aminoácidos de anclaje. Eventualmente, el péptido puede también ser prolongado en los extremos terminales de C y/o de N, siempre y cuando que esta prolongación no perjudique la capacidad de fijación a la molécula del MHC o que el péptido prolongado pueda ser tratado celularmente en cuanto a la secuencia mínima. Los péptidos modificados son comprobados después de ello en cuanto a su reconocimiento por TILs ( "tumor-infil tra ting lymphocytes " = linfocitos que se infiltran en tumores) , en cuanto a inducción de CTL así como en cuanto a fijación al MHC e inrnunogenicidad aumentadas, tal como ha sido descrito por Parkhurst y colaboradores, 1996, y por Becker y colaboradores, 1997. Otro método apropiado dentro del marco de la presente invención para el hallazgo de péptidos con inmunogenicidad más fuerte que la de los péptidos de B99 naturales, consiste en el escrutinio de bibliotecas de péptidos con CTLs, que reconocen a los péptidos de B99, que se presentan por naturaleza en tumores, tal como ha sido descrito por Blake y colaboradores, 1996; en este contexto se propone la utilización de bibliotecas combinatorias de péptidos, con el fin de desarrollar moléculas, que imiten a los epitopes para tumores reconocidos por CTLs restringidos por el MHC-I. Los polipéptidos de B99 de la presente invención o los fragmentos o péptidos inmunogénicos derivados de ellos, se pueden producir por vía recombinante o mediante síntesis de péptidos, tal como se ha descrito en el documento WO 96/10413, a cuya divulgación se hace referencia por la presente. Para la preparación por vía recombinante, la correspondiente molécula de ADN se introduce de acuerdo con métodos clásicos en un vector de expresión, se transfecta en una apropiada célula hospedante, la célula hospedante se cultiva en condiciones apropiadas de expresión y la proteína se purifica. Para la síntesis química de péptidos de B99, se pueden utilizar métodos habituales, por ejemplo, usando un sintetizador automático de péptidos adquirible en el comercio. Alternativamente a los péptidos de B99 naturales o a los péptidos heteroclíticos, se pueden utilizar sustancias que simulen a tales péptidos, por ejemplo, "miméticos de péptidos" o "péptidos retro-inversos". Para el ensayo de estas moléculas en lo referente a la utilizabilidad terapéutica en una vacuna contra tumores, se aplican los mismos métodos que anteriormente para los péptidos naturales B99 o los equivalentes a tales péptidos de B99. El TAA con la denominación B99 de acuerdo con la presente invención y los fragmentos de proteínas, péptidos o equivalentes a péptidos o bien miméticos de péptidos que se derivan de ellos, se pueden emplear en la terapia de los cánceres, por ejemplo, con el fin de inducir una respuesta inmunitana frente a células de tumores, que expresan los correspondientes determinantes de antígenos. Preferiblemente, son utilizados para la terapia de tumores positivos para B99, especialmente en los casos de carcinomas de células renales, pulmón, colon, páncreas, mama y estómago .

La respuesta inmune en forma de una inducción de CTLs puede ser producida in vi vo o ex vi vo . Para la inducción in vivo de CTLs se administra una composición farmacéutica, que como componente activo contiene el B99 de TAA o fragmentos o péptidos derivados de ellos, a un paciente que sufre de una enfermedad de tumor asociada con el TAA, debiendo la cantidad de TAA (péptido) ser suficiente para conseguir una respuesta eficaz de CTL al tumor que es portador de los antígenos. La invención concierne por consiguiente en otro aspecto adicional a una composición farmacéutica para la administración por vía parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, la composición sirve para la administración por vía parenteral, por ejemplo, para la aplicación por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. Los TAAs/péptidos de B99 son disueltos o suspendidos en un soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. La composición puede contener además de ello sustancias coadyuvantes usuales, tales como tampones, etc. Los TAAs/péptidos se pueden utilizar a solas o en combinación con adyuvantes, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund, saponinas, sales de aluminio o, en una forma preferida de ejecución, policationes, tales como poliarginina o polilisina. Los péptidos se pueden fijar también a componentes, que ayuden a la inducción de CTL o a la activación de CTL, por ejemplo, a péptidos T cooperantes, lípidos o liposomas, o se administran en común con estas sustancias y/o en común con sustancias estimuladoras de la inmunidad, por ejemplo, citoquinas (IL-2, IFN-?) . Métodos y formulaciones, que se adecúan para la preparación y administración de la composición farmacéutica conforme a la invención, se describen en los documentos WO 95/04542 y WO 97/30721, a cuya divulgación se hace referencia por la presente . Los B99 (fragmentos) o péptidos de B99 se pueden 20 utilizar también para provocar ex vi vo una respuesta de CTL. Una respuesta ex vi vo de CTL a un tumor, que expresa B99, es inducida incubando las células precursoras de CTL conjuntamente con APCs y péptidos de B99 o la proteína de B99. Luego se deja que los CTLs activados se expandan, después de lo cual son administrados de nuevo al paciente. Alternativamente, se pueden cargar las APCs con péptidos de B99, lo cual pude conducir a una activación eficiente de reacciones inmunes celulares contra tumores positivos para B99 (Mayordomo y colaboradores, 1995; Zitvogel y colaboradores, 1996) . Un método apropiado para cargar péptidos en células por ejemplo, células dendríticas, es divulgado en el documento WO 97/19169. En una forma de ejecución de la invención, se utiliza una combinación de varios diferentes péptidos de B99 o equivalentes a péptidos de B99. En una forma adicional de realización se combinan péptidos de B99 con péptidos que se derivan de otros TAAs. La elección de péptidos para tales combinaciones se efectúa en atención a la clasificación de diferentes tipos de MHC, para cubrir una población lo más amplia que sea posible de pacientes y/o se adapta a un espectro de indicaciones lo más amplio que sea posible, combinando péptidos de varios diferentes antígenos de tumores. El número de los péptidos en una composición farmacéutica puede fluctuar a lo largo de un amplio margen, típicamente contiene una vacuna aplicable químicamente de 1 a 15, preferiblemente de 3 a 10 diferentes péptidos. Los péptidos conformes a la invención se pueden emplear también como reactivos para el diagnóstico. Por ejemplo, los péptidos se pueden utilizar para ensayar la reacción de un paciente a la respuesta inmune humoral o celular provocada por el péptido inmunogénico. Con ello existe la posibilidad de mejorar un protocolo de tratamiento. Por ejemplo, dependiendo de la forma de — -" presentación (péptido, proteína total o vacuna de ADN) del TAA se puede investigar el aumento de células T precursoras en los PBLs, que presentan una reactividad contra el epitope definido para péptido (Robbins y Kawakami, 1996, así como las referencias citadas allí) . Además, los péptidos o la proteína total o los anticuerpos dirigidos contra el TAA se pueden utilizar para caracterizar la evolución de la enfermedad de un tumor positivo para B99 (por ejemplo, mediante análisis inmuno-histoquímicos de tumores primarios y metástasis) . Una estrategia de este tipo ya se ha manifestado como satisfactoria múltiples veces, por ejemplo, la detección de receptores de estrógenos como fundamento de decisión para la endocrino-terapia en el caso de un cáncer de mama; de c-rebB-2 como marcador relevante en el caso del pronóstico y la evolución de la terapia en el caso de un cáncer de mama (Ravaioli y colaboradores, 1998; Revillion y colaboradores, 1998) ; PSMA ( "prosta te specifi c membrane antigen " = antígeno membranal específico para próstata) como marcador para células epiteliales del carcinoma de próstata en el suero o mediante empleo de un anticuerpo monoclonal contra PSMA marcado con ? In en el caso de la inmuno-escintigrafíga en cuanto a carcinoma de próstata (Murphy y colaboradores, 1998 y referencias incluidas) ; de CEA ( "carcinoembryonic antigen " = antígeno carcino-embriónico) como marcador serológico para el pronóstico y la evolución en el caso de un paciente del carcinoma colorrectal (Jessup y Loda, 1998) . La presente invención concierne en otro aspecto a moléculas aisladas de ADN, que codifican una proteína con las propiedades inmunógenas de B99 o fragmentos de ésta. En un aspecto, la presente invención concierne a una lo molécula aislada de ADN que contiene un polinucleótido con la secuencia representada en SEC ID NO:l o que contiene un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido con la secuencia representada en SEC ID NO: 1. Por "condiciones rigurosas" se entiende por ejemplo: incubar durante una noche a 42°C en una solución que comprende: 50% de formamida 5xSSC (lxSSC = NaCl 150 mM, citrato de tri-sodio 15 mM) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhart 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 µg/ml de esperma de salmón desnaturalizado, a continuación de ello lavar dos veces los filtros en O.lxSSC a aproximadamente 65°C, o condiciones equivalentes equivalentes . En un aspecto adicional, la presente invención concierne 25 a una molécula aislada de ADN, que contiene un polinucleótido con la secuencia representada en SEC ID NO: 3 (o SEC ID NO: 5) o que contiene un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia representada en SEC ID NO: 3 (o SEC ID N0:5) . Las moléculas de ADN conformes a la invención o fragmentos de ellas codifican (poli) péptidos con la denominación B99 (B99-1, B99-2 ó B99-3) con la secuencia de aminoácidos que se representa en SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6 o fragmentos de proteínas o péptidos que se derivan de ella; con ello se abarcan al mismo tiempo moléculas de ADN que por causa de la degeneración del código genético presentan desviaciones con respecto de la secuencia representada en SEC ID NO:l o SEC ID NO: 3 o bien SEC ID NO: 5. La invención se refiere también a moléculas de ADN, que presentan desviaciones condicionadas por un intercambio conservativo de aminoácidos con respecto a la secuencia representada en SEC ID NO:l o SEC ID NO: 3 (o bien SEC ID NO: 5) siempre y cuando que éstas codifiquen un derivado de B99 o fragmentos o péptidos con las propiedades inmunógenas que son deseadas para la aplicación como vacuna ? * . contra tumores. En lo sucesivo, las moléculas de ADN que codifican B99-1, B99-2 o B99-3 o fragmentos de éstos, eventualmente modificadas, que antes se han definido, se designan como "moléculas de ADN de B99", cuando no se indique otra cosa distinta. Las moléculas de ADN de B99 de la presente invención o los correspondientes ARNs, que también constituyen objeto de la presente invención, se emplean, al igual que los (poli) péptidos codificados por ellos, para la inmunoterapia de enfermedades de cáncer. En una forma de realización de la invención, se utilizan moléculas de ADN que. codifican polipéptidos de B99 naturales. Alternativamente al ADNc de B99 natural o fragmentos de éste, se pueden utilizar derivados modificados. Estos comprenden secuencias con modificaciones que codifican una proteína (o fragmento) o péptidos con más fuerte inmunogenicidad, siendo válidas para las modificaciones en el plano del ADN las mismas consideraciones que para los péptidos que antes se han descrito. Otro modo de la modificación es la agrupación yuxtapuesta de numerosas secuencias, que codifican péptidos inmunológicamente relevantes, a modo de una sarta de perlas ( "string-of-beads " ; Toes y colaboradores, 1997) . Las secuencias pueden ser modificadas también por adosamiento de elementos auxiliares, por ejemplo, funciones que garantizan una entrega y un tratamiento más eficientes del inmunogénico (Wu y colaboradores, 1995) . Por ejemplo, mediante adición de una secuencia de localización en el retículo endoplasmático ( "ER targeting secuence ") se pueden aumentar el tratamiento y por consiguiente la presentación y a fin de cuentas la inmunogenicidad del antígeno. La presente invención concierne en otro aspecto a una molécula de ADN recombinante, que contiene el ADN de B99. Las moléculas de ADN de B99 de la presente invención, se pueden administrar, preferiblemente en forma recombinante como plásmidos, directamente o como constituyente de un virus, o una bacteria, recombinante. En principio, se puede aplicar cualquier método terapéutico génico para la inmunoterapia de un cáncer a base de un ADN ("vacuna de ADN") para el ADN de B99, y concretamente tanto in vi vo como también ex vi vo . Ejemplos para la administración in vivo son la inyección directa de ADN "desnudo", o bien por vía intramuscular o mediante una pistola de genes ("gene gun") de la que se ha mostrado que conduce a la formación de CTLs contra antígenos de tumores. Ejemplos de organismos recombinantes son virus de Vaccinia, adenovirus o Listeria monoci togenes (una vista de conjunto fue dada por Coulie en 1997) . Además, se pueden utilizar soportes sintéticos para ácidos nucleicos, tales como lípidos catiónicos, microesferas, microbolitas o liposomas para la administración in vivo de moléculas de ácidos nucleicos, que codifican un péptido B99. Similarmente a como para los péptidos, se pueden administrar conjuntamente diferentes sustancias coadyuvantes que refuercen la respuesta inmune, por ejemplo, citoquinas, o bien en forma de proteínas o de plásmidos que las codifican. La aplicación puede ser combinada eventualmente con métodos físicos, por ejemplo, electroporación. Un ejemplo de la administración ex vi vo es la transfección de células dendríticas, tal como ha sido descrito por Tuting, 1997, u otras APCs, que pasan a aplicarse como vacuna celular contra el cáncer. La presente invención concierne por consiguiente en otro aspecto a la utilización de células, que expresan B99, o bien de por sí mismas o en forma eventualmente modificada, después de transfección con la secuencia correspondientemente codificadora, para la preparación de una vacuna contra el cáncer. La invención concierne en un aspecto adicional a anticuerpos contra B99 o fragmentos de ellos. Los anticuerpos policlonales se pueden obtener de un modo habitual por inmunización de animales, especialmente conejos, mediante inyección del antígeno o fragmentos de ellos, y posterior purificación de la inmunoglobulina. Los anticuerpos anti-B99 monoclonales se pueden 10 obtener de acuerdo con protocolos clásicos, según el principio descrito por Kóhler y Milstein, 1975, inmunizando a animales, especialmente a ratones, a continuación inmortalizando células productoras de anticuerpos de los animales inmunizados, por ejemplo, por fusión con células de mieloma, y escrutando el material sobrenadante de los hibridomas obtenidos mediante análisis clásicos inmunológicos en cuanto a anticuerpos anti-B99 monoclonales. Para el empleo terapéutico o diagnóstico en seres humanos, estos anticuerpos animales pueden ser quimerizados (Neuberger y colaboradores, 1984, Boulianne y colaboradores, 1984) o humanizados (Riechmann y colaboradores, 1988, Graziano y colaboradores, 1995) eventualmente de un modo habitual.

Los anticuerpos anti-B99 monoclonales humanos pueden ser obtenidos también por las denominadas "bibliotecas de presentación de fagos" - "Phage Display Librarl es " (Winter y colaboradores, 1994, Griffiths y colaboradores, 1994, Kruif y colaboradores 1995, Me Guiness y colaboradores, 1996) y mediante animales transgénicos (Brüggemann y colaboradores, 1996, Jakobovits y colaboradores, 1995) . Los anticuerpos anti-B99 conformes a la invención se pueden emplear en análisis inmuno-histoquímicos para finalidades de diagnóstico. En un aspecto adicional, la invención concierne a la utilización de anticuerpos específicos para B99, a fin de llevar selectivamente a cualesquiera sustancias deseadas junto a o dentro de un tumor, que expresa B99. Ejemplos de tales sustancias son agentes citotóxicos o núclidos radiactivos, cuyo efecto consiste en dañar al tumor en sus cercanías. Por causa de la expresión de B99 específica para un tumor, no son de esperar en tales casos efectos colaterales de ningún tipo o sólo escasos efectos colaterales. En un aspecto adicional, con ayuda de anticuerpos para B99 se pueden aprovechar para la visibilización de tumores sustancias que expresan B99. Esto es útil para el diagnóstico y para la valoración de la evolución de la terapia. Aplicaciones terapéuticas y diagnósticas de anticuerpos, que entran en cuestión para anticuerpos anti-B99, están descritas en el documento WO 95/33771. El TAA con la denominación de B99 de acuerdo con la presente invención y los fragmentos de proteínas, péptidos o equivalentes a péptidos o miméticos de péptidos que se derivan de ellos, se pueden emplear en la terapia del cáncer, por ejemplo, con el fin de inducir una respuesta inmune contra células de tumores, que expresan los correspondientes determinantes de antígenos. Preferiblemente, son utilizados para la terapia de tumores positivos para B99, especialmente en los casos de carcinomas de células renales, pulmón, colon, páncreas, mama y estómago . Por causa de la expresión preferida de B99 en células de tumores se puede suponer que esta proteína tiene una función importante para el tumor, por ejemplo, para su génesis, infiltración y crecimiento. El B99 (ADN) se puede utilizar por lo tanto en análisis de escrutinio, a fin de identificar sustancias que modulen, especialmente inhiban, la actividad de esta proteína. En una forma de realización, uno de tales análisis puede consistir en incorporar la proteína de B99, o un fragmento activo de ella, en células, que reaccionan con proliferación a la actividad de B99, o llevar a expresión en la célula el correspondiente ADN de 5 B99, y determinar la proliferación de las células en presencia y en ausencia de una sustancia de ensayo. Las sustancias con un efecto inhibidor de la proliferación se pueden utilizar para el tratamiento de tumores con fuerte expresión de B99, especialmente en el caso de los carcinomas 10 de células renales, pulmón, colon y mama así como en el caso del linfoma de Hodgkin.

Breve Descripción de las Figuras: Figura 1: Análisis por RT-PCR de conjuntos de ADNc de 15 diferentes tejidos de tumores y normales humanos mediante cebadores específicos para B99. Figura 2: Análisis por RT-PCR de ADNc's individuales de diferentes tejidos de tumores y normales humanos mediante cebadores específicos para B99. 20 Figura 3: Transcripción de B99 en tejidos normales: Análisis por transferencia Northern de los ARNm procedentes de 16 tejidos normales. Figura 4: Análisis inmuno-histoquímicos de cuatro casos iiii • r??i?ilf ' rfm ^ntr diferentes de adenocarcinomas con suero de B99. Figura 5: Estabilización del MHC en células de T2 mediante diferentes concentraciones de péptidos de B99.

Ejemplo 1 RDA (análisis diferencial representativo) de la línea celular humana de adenocarcinoma de pulmón (A549) y de tejido normal de pulmón La línea celular A549 (CCL 185) de adenocarcinoma de pulmón humano, adquirida de la ATCC se cultivó en frascos para cultivo celular T150. Como medio nutricio sirvió un MEM (medio esencial mínimo) con suero de ternero fetal, desactivado por calor, al 10% y L-glutamina 2 mM. Cada 3 a 4 días las células fueron disociadas mediante tripsinación en 1:5 hasta 1:10 para propagación. Después de haberse alcanzado una confluencia de aproximadamente 80% se emplearon para cosechar las células por cada frasco de cultivo celular T150 4 ml de una solución de tripsina (datos por cada litro: 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.13 g de Na2HP04 anhidro, 0.2 g de KH2P04, 100 ml de una solución al 2.5% de tripsina, 1 g de la sal de Na de EDTA; pH 7.2-7.4) para cosechar las células. Los 4 ml se transfirieron a un tubo Falcon de 15 ml de capacidad, se mezclaron con 8 ml de PBS, se centrifugaron a 1.200 rpm en una centrífuga de mesa sde Haereus (Megafuge 2, OR) durante 5 min a 4°C, el sedimento celular se mezcló con 1 ml de tampón para lisis (Tris'HCl 10 mM de pH 8, NaCl 140 mM, MgCl2 1.5 mM, NP40 al 0.5%), se agitó enérgicamente y se separó por centrifugación en un recipiente de Eppendorf de 2 ml de capacidad a 12,000 rpm y 4°C durante 5 min en una centrífuga de mesa Sigma (Sigma 202 MK) . El material sobrenadante fue transferido a un nuevo recipiente de Eppendorf y después de haber añadido 55 µl de una solución al 20% de SDS se extrajo dos veces con el volumen doble de una mezcla de CHC13 y fenol (1:1 v/v) y una vez con el volumen simple de CHCI3. La fase acuosa que contenía ARN se mezcló con 1/10 volúmenes de NaAc 3 M (de pH 5) y el volumen doble de EtOH al 96% y se precipitó el ARN durante una noche a -20°C. Partiendo de 1 mg de ARN total se procedió de un modo correspondiente al protocolo del fabricante para realizar el aislamiento de poli-A(+) ARN mediante el estuche PolyATtract Kit (Promega) . El almacenamiento del poli-A(+) ARN de A549 con una concentración de 1 mg/ml en H20 tratada con DEPC se efectuó en partes alícuotas a -80°C. Para la realización del análisis diferencial representativo (RDA; Hubank y Schatz, 1994; Diatc enko y colaboradores, 1996) se empleó el poli-A (+) ARN de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 como "tester" (ensayador) y el de un tejido normal de pulmón (1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; N° 6524-1) como "dri ver " (conductor) . El RDA se llevó a cabo correspondientemente al protocolo del fabricante mediando utilización del estuche PCR-select® kit (Clontech, Palo Alto) , con la excepción de que pasó a emplearse un sistema modificado de cebador y adaptador de 2 oligonucleótidos con la siguiente secuencia: 5' -TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3' , (Adaptor-2-al t -l ; SEC ID NO: 19), 5'-AGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3' (nested-PCR-primer-2-alL; SEC ID NO: 20) y 5' -GGCTCGAGCTC-3' (Adaptor-2-al t -2 ; SEC ID NO: 21) . Las secuencias de cebador y adaptador generadas de nuevas hacen posible mediante la presencia de tres nuevos sitios de corte con enzimas de restricción (Kpn I, Sac I y Xho I) en la secuencia del nested-PCR-primer-2-alt después de donación de los fragmentos de ADNc substraídos en el vector de pPCRII, un posterior recorte de los respectivos fragmentos de ADNc. El diseño de una secuencia de cebador y adaptador con varios sitios de corte con enzimas de restricción disponibles era por lo tanto necesario, puesto que con frecuencia se podían observar mutaciones puntuales en las secuencias de cebadores -condicionado por las etapas de amplificación por PCR. Después de la síntesis del ADNc bicatenario mediante oligo-dT, el ADNc obtenido de ensayador y conductor se digirió con Rsal (el Rsal es una enzima de restricción reconocedora de 4 bases y proporciona fragmentos de ADNc que tienen en un promedio estadístico una longitud de 256 Pb) . Partes iguales de "ADNc de ensayador" fueron ligadas con los adaptadores 1 ó 2 y a continuación separadas e hibridadas con un exceso de "ADNc de conductor" a 65°C. Después de ello, ambas tandas fueron reunidas y sometidas a una segunda hibridación con "ADNc de conductor" desnaturalizado recientemente obtenido. Los ADNcs específicos para "ensayador" y enriquecidos fueron a continuación amplificados exponencialmente mediante PCR con cebadores específicos para los adaptadores 1 ó 2 respectivamente. Para un enriquecimiento adicional, una parte alícuota de esta reacción se sometió a una segunda PCR con cebadores específicos desplazados hacia el interior ( "nested") . Los fragmentos de ADNc amplificados exponencialmente, que resultan de esta reacción, fueron ligados directamente en el vector pCRII (Invitrogen; "TA-cloning vector" = vector de donación de TA) y a continuación un tercio de la tanda de ligación se transfectó en E. coli competentes (OneShot®, Invitrogen) . Se obtuvieron 712 Transformantes positivos (selección entre azul y blanco) y se cultivaron en bloques de 96 pocilios en un medio LB-Amp (1.3 ml por cada pocilio) durante 48 h a 37°C. Por cada pocilio se emplearon 750 µl de las suspensiones de E. coli para la preparación del ADN de plásmido (método de minipreparación de 96 pocilios de QIAgen de acuerdo con la prescripción del fabricante) . Los cultivos de bacterias remanentes se almacenaron como cultivos de reserva en glicerol a -80°C. Se obtuvo una biblioteca por substracción de ADNc que constaba de 712 clones individuales, que se presentaba tanto en forma de cultivos de reserva de E. coli en glicerol como también en forma de plásmidos purificados.

Ejemplo 2 Secuenciación y anotación de ADN candidatos a TAA El ADN de plásmido aislado de todos los 712 clones (véase el Ejemplo 1) fue secuenciado de acuerdo con el método de Sanger en un aparato ABI-Prism. Las secuencias obtenidas fueron anotadas mediante el programa lógico BioScout-Software (LION, Heidelberg) y se sometieron a comparaciones en el banco de datos (Genbank) . De 712 clones pudieron ser secuenciados y anotados 678. El resto (34) o bien tenía como inserto sólo secuencias de poli (A) o correspondía a un vector renovadamente ligado o no era secuenciable. De las 678 secuencias anotables se manifestaron 357 como genes con función conocida. Los restantes 321 representan a clones que codifican genes con función desconocida; 59 de ellos no tenían incorporaciones algunas en el banco de datos EST humano. Los genes conocidos no fueron tratados ulteriormente. Para cada uno de los genes desconocidos, para los que estaba disponible una incorporación en EST, se llevó a cabo una estimación del perfil de expresión; en tal caso se comprobaron todos aquellos ESTs que tenían una identidad ) 95% (BLAST) , que pertenecían a la secuencia correspondientemente determinada por vía experimental de las bibliotecas por substracción. Al realizar la anotación se llevó a cabo una clasificación en i) tejido normal crítico, ii) tejido fetal "prescindible" e inmunemente privilegiado y íii) tumores y líneas celulares de tumores. Sobre la base de este "perfil virtual de ARNm" se seleccionaron 200 clones, para los que no se encontraron ESTs algunos en el grupo i), para realizar otros análisis experimentales adicionales (inclusive los 59 clones, para los que no se presentaba ninguna incorporación en EST) . Para estrechar adicionalmente los clones candidatos, se desarrollaron y sintetizaron pares de cebadores de oligonucleótidos a partir de las secuencias determinadas por los 200 clones seleccionados. En primer lugar se ensayaron 8 diferentes bibliotecas de ADNc derivadas de tejido humano (GibcoBRL "SUPER-SCRIPT®") que están clonadas direccionalmente en pCMV-SPORT, mediante una PCR cualitativa en cuanto a la presencia de los respectivos candidatos. Las bibliotecas de ADNc empleadas en tal caso procedían de tejidos de corazón (N° 10419-018), hígado (N° 10422-012), leucocitos (N° 10421-022), riñon (N° 10420-016), pulmón (N° 10424-018), testículos (N° 10426-013), cerebro (N° 10418-010) y cerebro fetal (N° 10662-013) . Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 20 µl de volumen total por cada tanda de PCR contenían lx de tampón TaqPol (KCl 50 mM, Tris»HCl 10 mM, de pH 9, Tritón X-100 al 0.1%), MgCl2 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM (Promega), polimerasa de ADN-Taq 0.025 U/ml (Promega), en cada caso 5 pM de específicos cebadores de oligonucleótidos SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, y 100 ng del ADN de plásmido que en cada caso se ha de investigar. Para el testigo se emplearon cebadores específicos para GAPDH (SEC ID NO: 14 y 15). Para la comprobación de la detección selectiva, los pares de cebadores se ensayaron paralelamente también en cuanto al plásmido aislado. La detectabilidad de fragmentos con la longitud que es de esperar en uno de los tejidos normales 5 críticos (de corazón, hígado, pulmón, riñon y leucocitos) , pero no en las bibliotecas de ADNc procedentes de tejidos inmunemente privilegiados (de cerebro, cerebro fetal y testículos) en estas condiciones de la PCR (1 ciclo: 3' a 94°C; 35 ciclos: 1' a 94°C - 1' a 55°C - 1' a 72°C; 1 ciclo: 10 7' a 72°C) se definió como criterio de separación. Mediante este análisis cuantitativo por PCR se pudo estrechar a 56 el número de los candidatos.

Ejemplo 3 15 7Análisis por transcripción de los clones candidatos en diferentes tejidos de tumores y normales Para el análisis por RT-PCR se utilizaron conjuntos de ADNc que se habían preparado en cada caso a partir de 3 µg de ARN total de 3 diferentes tejidos del mismo tipo. Los 9 µg 20 de ARN total por cada conjunto de tejido procedente de tejidos de tumor o normales se transcribieron inversamente mediante AMV-RT (Promega) correspondiendo a las recomendaciones del fabricante. Con el fin de evitar gj^g^gg^^^^^^ contaminaciones con ADN genómico, el ARN fue incubado previamente con DNAse I (Boehringer Mannheim) . La calidad y la cantidad de los ADNc's se comprobó mediante una PCR con cebadores específicos para GAPDH (SEC ID NO: 14 y 15) después 5 de 20 ciclos (30" a 95°C, 90" a 60°C) . El ADNc de B99 fue amplificado mediante 25, 30 y 35 ciclos del programa consistente en: 1' a 95°C, 1' a 55°C, 1' a 72°C con los cebadores específicos para B99 conforme a SEC ID NO: 7 y 8. Análogamente, los otros 55 clones candidatos fueron 10 investigados con los cebadores en cada caso específicos. Los productos de la PCR fueron comprobados mediante electroforesis en gel de agarosa y coloración con bromuro de etidio. Para 3 de los 56 clones investigados se pudo demostrar una expresión aumentada en diferentes tejidos de 15 tumores en comparación con tejidos normales. Un ejemplo de un candidato a B99 está mostrado en la Figura 1: El análisis por RT-PCR de conjuntos de ADNc de diferentes tejidos de tumores y normales humanos mediante cebadores específicos para B99, proporcionó una fuerte señal en el carcinoma de 20 colon y en la línea de adenocarcinoma de pulmón A549, así como una débil señal en el carcinoma de mama y el carcinoma de células de riñon. De todos los tejidos normales investigados se podía comprobar una débil señal sólo en un .~m-,*¡*ii*¿^?-riíim r;:--. ,J **--.*-*, * i - . - *¡ ** *. I i*.**** , --. -*** ^M»?.-a tejido de colon. En la evolución ulterior el candidato a B99 fue evaluado con mayor exactitud.

Ejemplo 4 Perfil de expresión de B99 en tejidos de tumores y normales Uno de los 56 candidatos (denominación: B99) mostró una señal mediante Lranscripción por RT-PCR en 3 de 5 conjuntos ensayados de tejidos de tumores. En la mayor parte de los tejidos normales ensayados no se pudo comprobar por el contrario ninguna transcripción. Para una investigación detallada de B99 se analizaron mediante PCR en lo que sigue los ADNc's de muestras individuales de tejidos de tumores y normales. En tal caso se puso de manifiesto que la mayor parte de todos los carcinomas de colon (17 de 23), de todos los carcinomas de páncreas (3 de 3) y de todos los carcinomas de estómago (4 de 4) expresan B99. En correspondientes tejidos normales se comprobó una expresión en 1 de 4, 0 de 3 y respectivamente 2 de 4 casos. Todos los resultados están recopilados en la Tabla 1, la Figura 2 muestra resultados ilustrativos para tejidos de páncreas y de colon: mediante análisis por RT-PCR de ADNc's individuales de diferentes tejidos de tumores y normales humanos mediante cebadores específicos para B99 se pudo comprobar un ADNc de B99 en 6 de 7 muestras de tumores, mientras que solamente uno de los tejidos normales investigados (1 de 6) mostraba una débil expresión de B99.

Tabla 1: Para el análisis por transferencia Northern se hibridaron durante 16 h a 65°C borrones de transferencia Northern de tejidos múltiples humanos (Clontech, Palo Alto) con el producto de la PCR de B99 de 271 pb marcado con [a32P] dCTP (NEN, Boston) . La visualización se efectuó mediante autorradiografía patrón (Xomat AR film, Kodak) y exposición en un fosfovisualizador [Phosphoimager] (de Molecular Dynamics) . La Figura 3 muestra el resultado de este análisis de 16 tejidos normales. En tales casos se manifestó solamente en el colon y de modo claramente más débil en el duodeno un transcrito con un tamaño de ~3,0 kb. La pequeña intensidad de la señal permite aparecer como improbable sin embargo una expresión inmunológicamente relevante. Los resultados de todos los experimentos en lo referente al perfil de ARNm de B99 (compilados a partir de análisis por RT-PCR y por transferencia Northern) están recopilados en la Tabla 1. El Ejemplo 4 muestra que el B99 es transcrito claramente en un alto porcentaje de tumores de diferentes indicaciones, mientras que en todos los tejidos normales investigados no se encontró ninguna transcripción o se encontró solamente una transcripción aislada.

Ejemplo 5: Detección de la expresión de proteínas de B99 en tumores humanos Para la detección de la expresión de proteínas de B99 se generaron anticuerpos específicos para B99 en conejos. Para la inmunización se utilizó la proteína de fusión bacteriana PGEX-0RF2-1/1 (posiciones 1.278 hasta 1.740 en SEC ID NO:l), el suero obtenido se purificó por afinidad mediante el péptido B99-KML (SEC ID NO: 61). Para la comprobación de la reactividad específica del suero el cuadro de lectura total de B99 se expresó transitoriamente como proteína de fusión con GFP en células de COS y las células transfectadas se ensayaron en la transferencia Western con el suero B99-NKF. En tal caso se puso de manifiesto que el suero reacciona claramente con la proteína de fusión de B99 expresada. En la sucesión ulterior se analizaron por vía inmuno-histoquímica 56 muestras de diferentes tipos de tumores con el suero B99-NKF en cuanto a expresión de B99 (Tabla 2) . En tal caso, en 53 casos se manifestó una expresión de B99 en las células de tumores. Ejemplos de ello pueden verse en la Figura 4, que muestra los análisis inmuno-histoquímicos de cuatro diferentes casos de adenocarcinomas (a: colon; b: mama; c: páncreas; d: estómago) . En todos los casos puede observarse una clara coloración de las células de tumores, mientras que los tejidos conjuntivos y los vasos no muestran ninguna coloración. En la Figura 4a puede verse además que las mucosas de colon normales residuales no muestran ninguna reactividad con el anticuerpo. La coloración antagonista de las secciones se efectuó con hematoxilina. La reactividad positiva en la inmunohistoquímica se confirmó en una selección de los casos mediante RT-PCR también en el plano de la ARN. En tal contexto también los tumores de mama proporcionaban una señal positiva de PCR Este hallazgo diferente en comparación con el Ejemplo 4 se puede explicar por la utilización de otros cebadores de PCR distintos que en el Ejemplo 4.

Tabla 2 Ejemplo 6 Clonación de B99 El clon B99 posee entre los adaptadores introducidos mediante el RDA un inserto con una longitud de 271 pb de un gen humano desconocido. Para la donación completa de la secuencia humana se procedió de la siguiente manera: un análisis de UniGene (Centro Nacional para Información de Biotecnología = National Center for 5 Biotechnology Informa tion) proporcionó los siguientes ESTs homólogos para B99: AA315469, AA345780, AA295520. Con ayuda de estos ESTs se pudo prolongar la secuencia de B99 a 439 nucleótidos. Se sintetizaron nuevos cebadores dentro de esta secuencia (SEC ID NO: 9 hasta 12). Mediante PCR con 0 diferentes combinaciones de estos cebadores, se pudieron amplificar las respectivas longitudes teóricas de fragmentos a partir del ADNc de A549. Clonación del extremo de 3' : 10 µg del ARN total procedente de la línea celular 786-0 de carcinoma de células renales se transcribieron inversamente mediante un cebador de oligo-dT, y una parte alícuota de este ADNc se sometió a una PCR, cuyo programa comienza con altas temperaturas de reanillamiento (annealing) de modo que solamente el cebador específico para genes se fija al ADNc (cebador SEC ID NO: 7 ó 9 respectivamente) , mientras que el segundo cebador (Tm~53°C, SEC ID NO: 13) se fija primeramente a una temperatura más baja a la carga previa de ADN sintetizada de nuevas. Esta denominada "touch -down PCR" = PCR de toque ¿?^^ (Mastercycler Gradient, Eppendorf) se llevó a cabo en las siguientes condiciones: 20 ciclos {15" a 95°C, 30" a 75°C (reducido en 0.7°C por cada ciclo)}, 1 ciclo durante 7' a 72°C así como 20 ciclos (15" a 95°C, 30" a 50°C) 1 ciclo durante 7' a 72°C) . Una parte alícuota de la tanda anterior se amplificó de nuevo por PCR mediante una segunda combinación de cebadores (SEC ID NO: 7 y 13 o respectivamente SEC ID NO: 12 y 13) en las mismas condiciones que precedentemente. Partes alícuotas de las tandas para PCR se ligaron directamente en el vector pGEM-T easy (Promega) y a continuación se transformaron en E. col l J109 competentes (Promega) . Los clones positivos se secuenciaron después de selección por PCR. La secuenciación proporcionó una coincidencia con la secuencia actual a partir del cebador utilizado para la amplificación por PCR y además de ello 1,777 nucleótidos adicionales hasta el comienzo de una secuencia de poliA en la región de 3' de la secuencia. La amplificación por PCR de ADNc procedente de líneas celulares de tumores (786-0, A549) así como muestras de tejidos de carcinomas de colon con los cebadores según las SEC ID NO: 16 hasta 18 proporcionaron con los cebadores originales los fragmentos que se esperaban después de la donación. En el fragmento de ADNc que ahora constaba de 2,216 pb se pudo identificar un cuadro de lectura continuo desde la posición 427 hasta la 1,743. Además, en la región 5' de la secuencia no se pudieron identificar cuadros de lectura adicionales de ningún tipo, de lo cual se puede sacar la conclusión de que la región de 0 a 427 pertenece ya a la región no traducida en 3' del ARNm de B99. Con ayuda de los cebadores SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 17 se amplificó, clonó y secuenció la región codificadora total de B99 procedente de ADNc de A549. Al realizar la secuenciación se obtuvieron varios clones con una inserción de un nucleótido en la posición 923 en comparación con SEC ID NO:l (que codifica B99-1) (véanse SEC ID NO: 3 y respectivamente SEC ID NO: 5). Esta inserción conduce a una modificación del cuadro de lectura abierto de B99 con una secuencia modificada de aminoácidos resultante de ello en la región terminal de C de la proteína de B99; la secuencia del antígeno de B99 (B99-2) derivada de este cuadro de lectura está representada en SEC ID NO: 4. Uno de los clones aislados a partir de células A549 mostró, junto con la inserción mencionada, un intercambio de nucleótidos en la posición 622 en comparación con la secuencia de SEC ID NO:l. Este intercambio de nucleótidos condiciona en la posición N° 66 de la secuencia de aminoácidos un reemplazo de arginina (SEC ID NO:2, B99-1) por triptofano (SEC ID NO:4, B99-2) . Dejando aparte este intercambio de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de B99-2 hasta la posición 166 es idéntica a la de B99-1. Además de ello, la inserción mencionada condiciona un segundo cuadro de lectura potencial desde la posición 845 hasta la 1,744 de la secuencia representada en SEC ID NO: 3 (o en SEC ID NO: 5). Una proteína expresada por un ADNc que tiene este cuadro de lectura presenta la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID NO: 6 (B99-3) . La secuencia de B99-3 es diferente a la de B99-1 desde la posición 1 a la 27 e idéntica a B99-1 a partir de la posición 28.

Ejemplo 7 Péptidos potenciales de fijación al MHC en la región codificadora de B99 Epitopes potenciales para péptidos dentro de la región codificadora de B99-1 según SEC ID NO: 2 (posiciones de aminoácidos: 1-438; Tabla 3A) , la de B99-2 según SEC ID NO: 4 (posiciones de aminoácidos 150-190; Tabla 3B) y la de B99-3 según SEC ID NO: 6 (posiciones de aminoácidos 1-40; Tabla 3C) se realizaron mediante los algoritmos descritos por Parker y colaboradores, 1994, tomando como base motivos conocidos (Rammensee y colaboradores, 1995) . Para los más importantes tipos de HLA, especialmente para los HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 y B*4403, se identificaron péptidos candidatos 9-meros, de los cuales es de esperar que se fijen a las correspondientes moléculas de HLA y por lo tanto constituyan epítopes para CTL inmunogénicos; los péptidos determinados están enumerados en la Tabla 3. Mediante un modo análogo de proceder se pueden determinar otros potenciales epítopes para péptidos para otros tipos de HLA u otros péptidos 8- y 10-meros.

Tabla 3A Candidatos a péptidos de B99 inmunogénicos (B99-l¡ Tabla 3A Candidatos a péptidos de B99 inmunogénicos (B99-2) Tabla 3C Candidatos a péptidos de B99 inmunogénicos (B99-3) Ejemplo 8 Experimento de estabilización de MHC con péptidos potenciales de fijación al MHC específicos para B99 Péptídos potenciales de fijación al MHC de B99 fueron comprobados en un experimento de carga con péptidos de T2 en cuanto a su capacidad para estabilizar moléculas deHLA-A2 sobre la superficie de células T2, lo cual constituye una indicación en cuanto a su capacidad de fijación al MHC. El experimento se llevó a cabo tal como ha sido descrito por Bohm y colaboradores, 1998. La estabilización se midió mediante un análisis por FACS con anticuerpos específicos para HLA-A2 (BB7.2). Cinco péptidos mostraron un efecto de estabilización cuando se utilizaron en una concentración de 100 µg/ml, representado por un aumento de la intensidad media de fluorescencia en comparación con el testigo sin péptido o con un péptido testigo de MAGE-3 Al, que no muestra ninguna fijación (Tabla 4) : Tabla 4 Para el análisis ulterior, estos péptidos se investigaron en una serie de diluciones en el mismo sistema de ensayo, a fin de demostrar una eventual dependencia de la fijación con respecto de la concentración. La Figura 5 muestra la estabilización de MHC en células T2 mediante diferentes concentraciones de péptidos de B99. Especialmente los péptidos de B99-19, B99-187 y B99-209 demuestran una manifiesta dependencia con respecto de la concentración de la estabilización de MHC, por lo cual estos péptidos son candidatos preferidos para estrategias de inmunización. Como testigo positivo se utilizó tirosinasa y como testigo negativo el péptido MAGE-3 específico para HLA-A1.

Bibliografía Becker, D., Kuhn, U., Lempertz, U., Enk, A., Saloga, J., y Knop, J. (1997), J. 1inmuno1. Methods 203, 171-180. Blake, J., Johnston, J.V., Hellstrom, K.E., Marquardt, H., y Chen, L. (1996), J. Exp. Med. 184, 121-130. Boon, T, J. C. Cerottini, B. Van den Eynde, P. van der Bruggen, y A. Van Peí (1994), Annu. Rev. Immunol. 12 : 337-365. Boon T , (1998). Tumor antigens recognized by cytolytic T cells. Cáncer Vaccine Week - Interantional Symposium, New York, Oct 1998; abstract S01. C. M. Bohm, M. L. Hanski, S. Stefanovic, H. G. Rammensee, H. Stein, J. Taylor-Papadimitriou, E. O. Riecken, y C.

Hanski. Int . J. Cáncer 1998. Mar. 2. 75:688-693. Boulianne, G. L., et al., (1984), Nature 312: 643-646. Brüggemann, M. y Neuberger, M.S., (1996), Irnmunol. Today 17: 391-397. Buschle M, Sc midt W, Zauner W, Mechtler K, Trska B, Kirlappos H, Birnstiel M (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94:3256-3261. Celluzzi, CM y Falo, LD, Jr. (1998), J. Immunol. 160: 3081- 3085. Chen, Y.T., Scanlan, M.J., Sahin, U. , Tureci, O., Gure, A. O., Tsang, s., Williamson, B., Stockert, E., Pfreundschuh, M., y Oid, L.J. (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. U. 5. A. 94, 1914-1918. Coulie, P.G. (1997), Mol. Med. Today 3: 261-268. Cox, AL, Skipper, J, Chen, y, Henderson, RA, Darrow, TL, Shabanowitz, J, Engelhard, VH, Hunt, DF, y Slingluff, CL, Jr. (1994), Science 264: 716-719. Diatchenko, L., Lau, Y.F., Campbell, A.P., Chenchik, A., Moqadam, F., Huang, B., Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D., y Siebert, P.D. (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. U. 5. A. 93, 6025-6030. Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K., Jackson, V., Hamada, H., Pardoll, D., y Mulligan, R. (1993), Proc. Nati. Acad.

Sci. U 5. A 90: 3539-3543. Emini, EA, Hughes, J, Perlow, D, y Boger, J (1985), J. Virol. 55_ 836-839. Falk, K., Rdtzschke, O., Stevanovi'c, S., Jung, G., y Rammensee, H-G (1991), Nature 351: 290-296. Fearon, E.R., Pardoll, D.M., Itaya, T., Golumbek, P., Levitsky, H.I., Si ons, J.W., Karasuyama, H., Vogeistein, B., y Frost, P. (1990), Cell 60: 397-403. Gansbacher, B., Zier, K., Daniels, B., Cronin, K., Bannerji, R., y Gilboa, E. (1990), J. Exp. Med. 172: 1217-1224. Gaudi C, Kremer F, 7Angevin E, Scott V, Triebel F (1999), J Immunol 162:1730-1738. Graziano, R.F., etal . , (1995), J. Immunol. 155: 4996-5002. Griffiths, A.D., et al., (1994), EMBO J. 13: 3245-3260. Halliday, GM, Patel, A, Hunt, MJ, Tefany, FJ, y Barnetson RS (1995), World J. Surg. 19: 352-358. Hogan KT, Eisinger DP, Cupp SBC, Lekstrom KJ, Deacon DD, Shabanowitz J, Hunt DF, Engelhard VR, Slingluff CL, Ross MM (1998), Cáncer Res 58:5144-5150. Hubank, M. y Schatz, D.G., (1994), Nucleic. Acids. Res. 22, 5640-5648.

Jager, E., Chen, Y.T., Drijfhout, J.W., Karbach, J., Ringhoffer, M., Jager, D., Arand, M., Wada, H., Noguchi, Y., Stockert, E., Oíd, L.J., y Knuth, A. (1998), J. Exp. Med. 18^' 265-270. Jakobovits, A., (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6:561-566.

Jameson, BA y Wolf, H (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci. 4: 181-186. Jessup, JM y Loda, M (1998) Prognostic markers in rectal carcinoma. Semin. Surg. Oncol. _15: 131-140. Kawakami, Y., Eliyahu, S., Jennings, C, Sakaguchi, K., King, x., Southwood, S., Robbins, P.F., Sette, A., Appella, E., y Rosenberg, S.A. (1995), J. Immunol . 154 : 3961-3968. Kawakami, Y, Robbins, PF, y Rosenberg, SA (1996), Keio J. Med. 4j5j_ 100-108. Kohler, G. y Milstein, C. (1975), Nature 265, 495-497. Kruif, J., et al., (1995), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 3938-3942. Kyte, J y Doolittle, RF (1982), J. Mol. Biol. 157: 105-132 Lethe, B, Lucas, S, Michaux, L, De Smet, C, Godelaine, D, Serrano, A, De Plaen, E, y Boon, T (1998), Int. J. Cáncer 76: 903-908.

Mackensen A, Ferradini L, Carcelain G, Triebel F, Faure F, Viel S, y Hercend T (1993), Cáncer Res. 53:3569-3573. Mandruzzato S, Brasseur F, Andry G, Boon T, van der Bruggen P (1997) , J Exp Med 186:785-793. Marchand M, Weynants P, Rankin E et al (1995), Int. J. Cáncer 63:883-885. Mayordomo, J.I., Zorina, T., Storkus, W.j., Zitvogel, L., Celluzzi, C, Falo, L.D., Melief, C.J., Ildstad, S.T., Kast, W.M., DeLeo, AB., y Lotze, M.T. (1995), Nature Medicine 1, 1297-1302. McGuinnes, B.T., et al., (1996), Nature Biotechnol. 14, 1149 Melief CJ, Offringa R, Toes RE, Kast WM (1996), Curr. Opin.

Immunol. 8:651-657. Murphy, G.P., Elgamal, A.A., Su, S.L., Bostwick, D.G., y Holmes, E.H. (1998), Cáncer 83, 2259-2269. Neuberger, M.S., et al., (1984), Nature 312: 604-608 Pardoll, D. M. (1998) Nature Medcine. j_ 525-531. Parker, K. C, M. A. Bednarek, y J. E. Coligan. (1994), j. Immunol. 152 : 163. Parkhurst, M.R., Salgaller, M.L:, Southwood, S., Robbins, P.F., Sette, A., Rosenberg, S.A., y Kawakami, Y. (1996), J. Irnmunol. 157, 2539-2548. Paterson Y, Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 664-9. Rammensee HG, Friede T, Stevanovic S (1995), Irnmunogenetics 41:178-228. Rapellino, M, Pecchio, F, Baldi, 5, Scappaticci, E, y Cavallo, A (1995), Anticancer Res. L5: 1065-1070. Ravaioli, A., Bagli, L., Zucchini, A., y Monti, F. (1998), Cell. Prolif. 31, 113-126. Revillion, F, Bonneterre, J, y Peyrat, Eur. J. Cáncer 3 : 791-808. Restifo NP (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 658-63. Riechmann, L., et al., (1988), Nature 332: 323-327. Robbins, PF y Kawakami, Y (1996), Curr. Opin. Inmunol. 8 : 628-636. Ruppert, J., Sidney, J., Celis, E., Kubo, R.T., Grey, H.M., y Sette, A. (1993), Cell 74, 929-937. Sahin, U., Türeci, O., Schmitt, H., Cochlovius, B., Johannes, T., Schmits, R., Stenner, F., Luo, G., Schobert, I., y Pfreundschuh, M. (1995), Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 92, 11810-11813. Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989. Schendel DJ, Gansbacher B, Oberneder R, Kriegmair M, Hofstetter A, Rieth uller G, y Segurado OG (1993), J.

Immunol. 151: 4209-4220. Schmidt W, Buschle M, Zauner W, Kirlappos H, Mechtler K, Trska B, Birnstiel M (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 94:3262-3267. Schweighoffer, T. (1997), One. Res. 3, 164-176. Sette, A., Vitiello, A., Reherman, B., Fowler, P., Nayersina, R., Kast, W.M., Melief, C.J.M., Oseroff, C, Yua L., Ruppert, J., Sidney, J., del Guercio, M.-F., Southwood, S., Kubo, R.T., Chesmut, R.W., Grey, H.M., y Chisan, F.V. (1994), J. linmunol. 153' 5586-5592. Stauss, H.J., Davies, H., Sadovnikoya, E., Chain, B., Horowitz, N., y Sinclair, C. (1992), Proc. Nati. Acad.

Sci. U.S.A 89, 7871-7875. Tepper, R.I., Pattengale, P. K., y Leder, P. (1989), Cell 57: 503-512. Tighe H, Corr, M, Román M, y Raz E (1998), Immunol. Today 19:89-97 Toes, R.E., Hoeben, R. C, Van der Voort, E., Ressing, M.E., Van-der-Eb, A.J. Melief, C.J.M., y Offringa, R. (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94 (26) : 14660-14665. Tuting, T., DeLeo, A.B., Lotze, M.T., y Storkus, W.J., (1997), Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707. Van den Eynde, B. y Brichard, V.G. (1995), Curr. Opin.

Immunol. 7, 674-681. Van den Eynde, BJ, y van der Bruggen, P (1997), Curr. Opin. Immunol. 9: 684-693. van der Bruggen, P., C. Traversari, P. Chomez, C. Lurqum, E. De Plaen, B. Van den Eynde, A. Knuth, y T. Boon. (1991, Science 254:1643-1647. van der Burg, S.H., et al., (1996), J. Immunol. 156, 3308- 3314. van Elsas, A., van der Minne, CE., Borghi, M., van der Spek, C.W., Braakman, E., Osanto, S., y Schrier, P.I. (1996), CTL Recognition of an IL-2 Producing Melanoma Vaccine. In: Immunology of human melanoma. Tumor-host interaction and immunotherapy, compilado por M. Maio, Amsterdam, IOS, 1996, p. 165-173. van Elsas, A., Aarnoudse, C, van der Minne, CE., van der Spek, C.W., Brouwenstijn, N., Osanto, S., y Schrier, P.I. (1997), J. Immunother. 20: 343-353. Vaughan, T.J., et al., (1998), Nature Biotechnol. 16, 535- 539. Velculescu, VE, Zhang, L, Vogeistein, B, KW y Kinzler, KW (1995), Science 270: 484-487.

Wang, L., et al., (1997), Mol. Immunol. 34: 609-618. Wang, RF (1997), Mol. Med. 3: 716-731. Wax, S.D., Rosenfield, C.L., y Taubman, M.B., (1994), J.

Biol. Chem. 269, 13041-13047. Wax, S.D., Tsao, L., Lieb, M.E., Fallón, J.T., y Taubman, M.B. (1996), Lab. Invest. 74, 797-808. Winter, G., et al., (1994), Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455. Woelfel, T, Schneider, J, Zum Buschenfelde, Meyer, KH, Rammensee, HG, Rotzschke, O, y Falk, K (1994), Int. J. Cáncer 57j_ 413-418. Woelfel T, Hauer M, Schneider J, Serrano M, Wolfel C, Klehmann-Hieb E, De Plaen E, Hankeln T, Meyer zum Büschenfelde KH, Beach D (1995), Science 269: 1281-1284 Wu, T.C, Guarnien, F.G., Staveley-O1 Carroll, K. F., Viscidi, R.P., Levitsky, H.I., Hedrick, L., Cho, K.R.

August, J.T., y Pardoll, D.M. (1995), Proc. Nati. Acad.

Sci. U.S.A. 92(25) : 11671-11675. Zitvogel, L., Mayordomo, J.I., Tjandrawan, T., DeLeo, A.B., Clarke, M.R., Lotze, M.T., y Storkus, W.J. (1996), J. Exp. Med. 183, 87-97.

PROTOCOLO DE SECUENCIAS <110> Boehringer Ingelheim International GmbH et al. <120> Antigeno asociado a tumores <130> seqlistl2203 <140> <141> <160> 61 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2216 <212> DNA <213> Ho o sapiens <220> <221> 5'ÜTR <222> (1)..(426) <220> <221> CDS <222> (427) .. (1743) <220> <221> 3'UTR <222> (1744) .. (2216) <400> 1 GTCACGGGAA CTKXETTGC TACITGTGAC CTGOCCpTA CICftQ T?TT Vl'K? ISlXii 60 GAPßCCCTGG GATTCTGCTA ATACCTATCA CTCT?GG GC TGAAGGGAAA CAGATCAAGA 120 ACATGñCCTC AAGGAGCTTC CTGTCAATGA GAAGAOCAAG CTGAGQCCTG GCBAAGA?AT 180 TñAAGAGGAG CCTGAAACTG TTCCTTGGAC ATCTTKTGAA TGICAGAAAA TñO ITT QG 240 AGGGTTAGAA GATCAQGGGA CATG3TTGTT CACATTTG T GOCBOGGAAC ACOGOCAGTC 300 TTCACTTGGG AACAGAATCA OGCC TSTG? AGAGATCATC CCCAAGCAGG AGAGAAGCTA 360 CEAAAGGAGG GTOTACTOCT ccñccrro TGTGCGCQST CTCCACCICT CTCCCKGTCT 420 GTGAGG ATG GTT CAÁ TGG AAG AGA CTC TGC CAS CTG CAT TAC TTG TGG 468 Met Val Gln T?p Lys Arg Leu Cys Gln Leu His Tyr Leu Trp 1 5 10 GCT CTCGGC TGC lATATG CTGCTG Gs:ACT Grc GCr CTGAAACT TCT 516 ..-^.i& Ala Leu Gly Cys Tyr Met Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Lys Leu Ser 15 20 25 30 TTC AGG TTGAAGTGTGAC?CTGACCacriSGSTCTGGAG TCC AGG GAA 564 Phe Arg Leu Lys Cys Asp Ser Asp His Leu Gly Leu Glu Ser Arg Glu 35 40 45 TCT (-AA AGC CAG TAC TGT AGG AAT A?C TT3 IBT AAT TTC CTG AAA CTT 612 Ser Gln Ser Gln Tyr Cys Arg Asn lie Leu Tyr Asn Phe Leu Lys Leu 50 55 60 CCAG?AAGAGGTCTATCAACTGTTCAGQsGICArcOGAGQGGñCCAA 660 Pro Ala Lys Arg Ser lie Asn Cys Ser Gly Val Thr Arg Gly Asp Gln 65 70 75 GMsCaGTGCTTCAGGCTArrCIGAArAñCCTGGñGGrcAAGAAGAAG 708 Glu Ala Val Leu Gln Ala lie Leu Asn Asn Leu Glu Val Lys Lys Lys 80 85 90 CGAGAGCXTITCACAGACA8C^T^CTCTXCTCACCAGAGACTGT 756 Arg Glu Pro Ehe Thr Asp Thr His Tyr Leu Ser Leu Thr Arg Asp Cys 95 100 105 110 10 GAG CAC TTC AAG GCT GAA AGG AAG TTC ATA CAG TIC OCA CTG AGC AAA 804 Glu His Phe Lys Ala Glu Arg Lys Phe lie Gln Phe Pro Leu Ser Lys 115 120 125 GAA GM GTG GAG TTC CCT ATT GCA TAC TCT ATG GIG ATT CPS GAG AAG 852 Glu Glu Val Glu Phe Pro lie Ala l t Ser Mat Val lie His Glu Lys 130 135 140 ATT GAA AAC TrTGAAAQGCTACTGCGAGCTsrG,mrGOCsCTCAGAAC 900 lie Glu Asn Phe Glu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr Ala Pro Glp Asn 145 150 155 ATATACTGTGTCCMGTGGATGAGAAGTOCs?S?ACTTTC AAA GAG 948 lie Tyr Cys Val His Val Asp Glu Lys Ser Pro Glu Thr Phe Lys Glu 15 160 165 170 GCG GTC AAA GCA ATT ATT TCT TGC TTC CCA AAT GTC TTC ATA GOC AGT 996 Ala Val Lys Ala lie lie Ser Cys Phe Pro Asn Val Phe lie Ala Ser 175 180 185 190 AAG CTG GGG OGG GTC GTG TAT GOC TOC TGG TOC AGG GIG CAÁ GCT GAC 1044 Lys Leu Val Arg Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg Val Gln Ala Asp 195 200 205 OCAACTGCATGGAAGACTTGCTCCAGAír TCAGrG CCETGGAAATAC 1092 Leu Asn Cys Met Glu Asp Leu Leu Gln Ser Ser Val Pro Trp Lys Tyr 210 2.c 220 20 TTC CTG AAT ACÁ TGT GQG AOG GAC TTT -CCT ATA AAG AGC AAT GCA GAG 1140 Phe Leu Asn Thr Cys Gly Thr Asp Phe Pro lie Lys Ser Asn Ala Glu 225 230 235 ATGGTCCAG GCTCTCAAGATGTTGAATGCCAGGAATAGCATGGAGTCA 1188 Met Val Gln Ala Leu Lys Met Leu Asn Gly Arg Asn Ser Met Glu Ser 240 245 250 ^-^^^^M^^átiái^É^^i^^í^á^^?^.

GAG GTA CCT OCT AAG CAC AAA GAA ACC CQC TQG AAA IAT CP TTT GAG 1236 Glu Val Pro Pro Lys His Lys Glu Thr Arg Trp Lys Tyr His Hie Glu 255 260 265 270 GTA GTG AGA GAC ACÁ TTA CAC CTA ACC AAC AAG AAG AAG GAT CCT CCC 1284 Val Val Arg Asp Thr Leu His Leu Thr Asn Lys Lys Lys Asp Pro Pro 275 280 285 CCT TAT AAT TTA ACT ATG TTT ACÁ GGG AAT CCG TAC AGT GTG GCT TCC 1332 Pro Tyr Asn Leu Thr Met Phe Thr Gly Asn Ala Tyr lie Val Ala Ser 290 295 300 CGA GAT TTC GTC CAÁ CAT GTT TTG AAG AAC CCT AAA TCC CAÁ CAÁ CTG 1380 Arg Asp Phe Val Gln His Val Leu Lys Asn Pro Lys Ser Gln Gln Leu 305 310 315 ATT GAA TGG GTA AAA C3ACACT TATAGCOCAC3VrGAACACCTCTGGGsC 1428 He Glu Trp Val Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Leu Trp Ala 320 325 330 ACC CTT CAG CGT GCA CGG TGG ATG OCT GGC TCT GTT CCC AAC CAC CCC 1476 Thr Leu Gln Arg Ala Arg Trp Met Pro Gly Ser Val Pro Asn His Pro 335 340 345 350 10 AAGTACGACATCTCAGACAIGACT TCTAI QXAGGCTGsrcAAGTGG 1524. Lys Tyr Asp lie Ser Asp Met Thr Ser lie Ala Arg Leu Val Lys Trp 355 360 365 CAG GGT CAT CfC GGA GñC ATC GAT AAGGGT GCTCCTTATGCT CCCTGC 1572 Gln Gly His Glu Gly Asp lie Asp Lys Gly Ala Pro Tyr Ala Pro Cys 370 375 380 TCT GGA ATC CAC CAG CGG GCT ATC TGCGIT TAT GGGGCTGGGGAC TTG 1620 Ser Gly He His Gln Arg Ala He Cys Val Tyr Gly Ala Gly Asp Leu 385 390 395 15 AAT TGG ATG CIT CAÁ AAC ss sCCTGTTGGXAACAAGTTT GACCCA 1668 Asn Trp Met Leu Gln Asn His His Leu Leu Ala Asn Lys Phe Asp Pro 400 405 410 AAG GTA GAT GAT AAT GCT CTT CAG TGC TTA GAA GAA TAC CTA CGT TAT 1716 Lys Val Asp Asp Asn Ala Leu Gln Cys Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Tyr 415 420 425 430 AAG GCC ATC TAT GGG ACT GAA CTT TGA GACACACTAT GAGAGOGTTG ' 1763 Lys Ala He Tyr Gly Thr Glu Leu * 435 CTACCTGTGG GGCAAGAGCA TGTACAAACA TGCTCAGAAC TTGCTSGGAC AGTGTGGGTG 1823 20 GGAGÑCCBGG GCTTIGCAAT TCCTGGCATC CTTTAGGATA AGAGGGCTGC TATTAGAITG 1883 TGGGGAAGTA GATCT?TOC CTTGCAAATT GCTGOCTGGG TGAATGCTGC TTG?CTCCC 1943 ACÜÜC AACC OIAGTAGTTC CTOCACTAAC TTTCTCACGA AGTGAGAATG AGAACTGCTG 2003 TGATAGGGAG AGTGAAGGAG GSATATGTGG TAGAGCACTT GATTTCAGTT GAATGCCTGC 2063 ^É^^j TGGTAGCTTT TCCATTCTGT GGAGCTQOOG TTOCIAATAA TTOCRGGpT QGTAG3GTGG 2123 AGGAGAACTT TSOOGAAAG AGAACCTTCC CITCTGTACT GGIAACTTAA AAAIAAATAG 2183 CTCCTGATTC AAAGTAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2216 <210> 2 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Gln Trp Lys Arg Leu Cys Gln Leu His Tyr Leu Trp Ala Leu 1 5 10 15 Gly Cys Tyr Met Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Lys Leu Ser Phe Arg 20 25 30 Leu Lys Cys Asp Ser Asp His Leu Gly Leu Glu Ser Arg Glu Ser Gln 35 40 45 Ser Gln Tyr Cys Arg Asn He Leu Tyr Asn Phe Leu Lys Leu Pro Ala 50 55 60 Lys Arg Ser He Asn Cys Ser Gly Val Thr Arg Gly Asp Gln Glu Ala 65 70 75 80 Val Leu Gln Ala He Leu Asn Asn Leu Glu Val Lys Lys Lys Árg Glu 85 90 95 Pro Phe Thr Asp Thr His Tyr Leu Ser Leu Thr Arg Asp Cys Glu His 100 105 110 Phe Lys Ala Glu Arg Lys Phe He Gln Phe Pro Leu Ser Lys Glu Glu 115 120 125 Val Glu Phe Pro He Ala Tyr Ser Met Val lie His Glu Lys He Glu 130 135 140 Asn Phe Glu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr Ala Pro Gln Asn He Tyr 145 150 155 160 Cys Val His Val Asp Glu Lys Ser Pro Glu Thr Hie Lys Glu Ala Val 165 170 175 Lys Ala He He Ser Cys Phe Pro Asn Val Phe He Ala Ser Lys Leu 180 185 190 Val Arg Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg Val 3n Ala Asp Leu Asn 195 200 205 Cys Met Glu Asp Leu Leu Gln Ser Ser Val Pro Trp Lys Tyr Phe Xeu 210 215 220 Asn Thr Cys Gly Thr Asp Ríe Pro He Lys Ser Asn Ala Glu Met Val 225 230 235 24.0 Gln Ala Leu Lys Met Leu Asn Gly Arg Asn Ser Met Glu Ser Glu Val 245 250 255 Pro Pro Lys His Lys Glu Thr Arg Trp Lys Tyr His Phe Glu Val Val 260 265 270 Arg Asp Thr Leu His Leu Thr Asn Lys Lys Lys Asp Pro Pro Pro Tyr 275 280 285 Asn Leu Thr Met Phe Thr Gly Asn Ala Tyr He Val Ala Ser Arg Asp 290 295 300 Phe Val Gln His Val Leu Lys Asn Pro Lys 3er Gln Gln Leu He Glu 305 310 315 320 Trp Val Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Leu Trp Ala Thr Leu 325 330 335 Gln Arg Ala Arg Trp Met Pro Gly Ser Val Pro Asn His Pro Lys Tyr 340 345 350 Asp He Ser Asp Met Thr Ser He Ala Arg Leu Val Lys Trp Gln Gly 355 360 365 His Glu Gly Asp He Asp Lys Gly Ala Pro Tyr Ala Pro Cys Ser Gly 370 375 380 He His Gln Arg Ala He Cys Val Tyr Gly Ala Gly Asp Leu Asn Trp 385 390 395 400 Met Leu Gln Asn His His Leu Leu Ala Asn Lys Ríe Asp Pro Lys Val 405 410 415 Asp Asp Asn Ala Leu Gln Cys Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Tyr Lys Ala 420 425 430 He Tyr Gly Thr Glu Leu 435 <210> 3 <211> 2217 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5 ' UTR <222> ( 1 ) . . ( 426 ) <220> <221> CDS <222> (427 ) . . ( 999) <220> <221> 3'ÜTR <222> (1000).. (2217) <220> <221> 5'ÜTR <222> (1) .. (844) <220> <221> CDS <222> (845) .. (1744) <220> <221> 3'ÜTR <222> (1745) .. (2217) <400> 3 GTCñasGGAA CTGCCCTTGC TAC?CTGAC CTGOOCTTGA CGCAGCAGTT tn?ti ??. 60 GAAQOCCTGG GATTCTQCEA ATACCTATC.A CTGTAGGT C TGAAGGGAAA CAGATGAAGA 120 ACATGACCTC AAGGAGCTTC CTGTCAATGA GAAGACCAAG CTGACGOCTG GCAAAGA3AT 180 TAAAGAGGAG CCTGAAACTG TTOCTTGGAC ATCTTAJGAA TGTCSGAAAA TACC1T-TQG 240 AGGGTTAGAA GATCAGGGGA CATGSTIGTT CW3VTTTGCT GCCACGGAAC AOCGOCSGTC 300 TTCACTTGGG AACAGAATCA ÜUULTI'ÜGÜA AGAGATCATC CCEAAGCAQG AGAGAAGCTA 360 CTAAAGGATT GTOXACTCCT OCACCTTCCC TsTGCTCGsr CTCCHCTGT CTCOavriCT 420 GTGACG ATG GTT CAÁ TGG AAG AGA CTCTGCCAGCTGCATTACTTGTGG 468 Met Val Gln Trp Lys Arg Leu Cys Gln Leu His Tyr Leu Trp 1 5 10 GCT CTG QQC TO TATATCCTG CTGGOCACT GTGGCT CTG AAA CTT TCT 516 Ala Leu Gly Cys Tyr Met Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Lys Leu Ser 15 20 25 30 TTC AGG TTG AAG TCT GAC TCT GAC C-AC TGG GGT CTG GAG TOC AGG GAA 564 Phe Arg Leu Lys Cys Asp Ser Asp His Leu Gly Leu Glu Ser Arg Glu 35 40 5 TCT CA AGC CAGTAC TGTAGGAATATC TEGTATAAT TTCCTG AAA CTT 612 Ser Gln Ser Gln Tyr Cys Arg Asn He Leu Tyr Asn Ríe Leu Lys Leu 50 55 60 CCA GCA AAG TGG TCT ATC AAC TGT TCA GGG GTC ACC CGA GGG GAC CAÁ 660 Pro Ala Lys T?p Ser He Asn Cys Ser Gly Val Thr Arg Gly Asp Gln 65 70 75 GAG GCA GTG CTT CAG GCT ATT CTG AAT AAC CTG "GAG GTC AAG AAG AAG 708 Glu Ala Val Leu Gln Ala He Leu Asn Asn Leu Glu Val Lys Lys Lys 80 85 90 CGA GAG CCT TTC ACÁ GAC ACC CAC TAC CTC TOC CTC ACC AGA GAC TGT 756 Arg Glu Pro Phe Thr Asp Thr His Tyr Leu Ser Leu ?hr Arg Asp Cys 5 100 105 110 SC CAC TTC AAG GCT sA AGG AAG TTC ATA a G TTC OCA CTG ACC AAA 804 Glu His Phe Lys Ala Glu Arg Lys Phe He Gln Ríe Pro Leu Ser Lys J.15 120 125 GAA GAG GTG GAG TTC OCT ATT GCA TAC TCT ATG GTG ATT CAT GAG AAG 852 Glu Glu Val Glu Ríe Pro He Ala Tyr Ser Met Val He His Glu Lys 130 135 140 ATT GAA AAC TTT GAA AGG CTA CTG CGA GCT GTG TAT GOC OCT OG AAC 900 He Glu Asn Ríe Glu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr Ala Pro Gln Asn 145 150 155 ATA TAC TCT GTC CAT GTG GAT GAA GAA GTC CCC AGA AAC TTT CAÁ AGA 948 He Tyr Cys Val His Val Asp Glu Glu Val Pro Arg Asn Phe Gln Arg 160 165 170 GGC GGT CAÁ AGC AAT TAT TC TTG CTT CCC AAA TGT CTT CAT AGC CAG 996 Gly Gly Gln Ser Asn Tyr Phe Leu Leu Pro Lys Cys Leu His Ser Gln 175 180 185 190 TAA C TGGTTCG GTGGTTTATG CCTOCTGGTC CAGGGTGCAA GCTGACCTCA 1049 ACTGCATGGA AGACTTGCTC CAGAGCTCAG TGOOGTGGAA ATACTTCCTG AATACATGTG 1109 GGACGGACTT TCCTAXAAAG AGCAATGCAG AGATGGTCCA GGCTCTCAAG ATGTTGAATG 1169 GGAGGAATAG CATGGAGTCA GAGGTACCTC CTAAGCACAA AGAAAC00GC TGGAAATATC 1229 ACTTTGAGGT AGIGAGAGAC ACATTACACC TAACCAACAA GAAGAAGGAT CCTCCCOCTT 1289 ATAATTTAAC TATGTTTACA GGGAATGCGT ACATTGTG3C TTCCOGAGAT TTCGTCCAAC 1349 ATGTTTTGAA GAACCCTAAA TCOCAACAAC TGATTGAATG G3TAAAAGAC ACTTATAGOC 1409 CAGATGAACA C TCTGG30C ACCCTT .AGC GTQCACGG1G GATGCCTGGC TCTGTTOOCA 1469 ADCACCCCAA GIACGACATC TCAGACATGA CTTCTAT GC CAGQCTQSTC AAGTGGCAGG 1529 GTCAIGAGGG AGACATOGAT AAGGGTGCTC CTTATGCTCC CTQCTCTGGA ATCCACCAGC 1589 GGGCrATCTG CGTTTATGGS GCGGGGGACT TGAATTGGKT GCTTCAAAñC CATCACCTGT 1649 TGGCCAACAA GTTTGACCCA AAQGTAQJTG AIAATGCTCT TCAGTGCTTA GAAGAATACC 1709 TACGTTATAA GGCCATCTAT QSGACTGAAC TTTGA3ACAC ACTATGAGAG CGTTGCTACC 1769 TGTGGGGCAA GAGCATGTAC AAACATGCTC AGAACTTGCT GGGACAGTGT GGGTQGGAGA 1829 CCAGSGCG? GCAATTCGGG GCATOC?TA QGAIAAGAGG OCI?CTA?A GAGGGGQGGT 1889 AAGTAGATCT TTTQOCTTGC AAATTGCTGC CTGGGTGAAT GCTGCTTGTT C CTCACOOC 1949 TAACCC ñGT AG?CCTCCA CTAACTTTCT CACTAAGTGA GAATGAGAAC TGCTGGGATA 2009 GGGñGPCTGA AGGAGQSATA TGTGGT7V5AG CALTlüA Tl' CAGT GAATG OCTQCTQGTA 2069 GC?TGCCAT TCTGGGGAGC TGOOSTTCCT AAIAATTOCA GGG?GGGAG OGTGGRGGAG 2129 AACTTTGATG GAAAGAGAAC CTTOOCTTCT GRACTGTTAA CTTAAAAAIA AAIAGCICCT 2189 GATTCAAAGT AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2217 <210> 4 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Val Gln Trp Lys Arg Leu Cys Gln Leu His Tyr Leu Trp Ala Leu 1 5 10 15 Gly Cys Tyr Met Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Lys Leu Ser Phe Arg 20 25 30 Leu Lys Cys Asp Ser'Asp His Leu Gly Leu Glu Ser Arg Glu Ser Gln 35 40 45 Ser Gln Tyr Cys Arg Asn He Leu Tyr Asn Ríe Leu Lys Leu Ero Ala 50 55 60 Lys Trp Ser He Asn Cys Ser Gly Val Thr Arg Gly Asp Gln Glu Ala 65 70 75 80 Val Leu Gin Ala He Leu Asn Asn Leu Glu Val Lys Lys Lys Arg Glu 85 90 95 Pro Phe Thr Asp Thr His Tyr Leu Ser Leu ?hr Arg Asp Cys Glu His 100 105 110 Phe Lys Ala Glu Arg Lys Phe He Gln Phe Pro Leu Ser Lys Glu Glu 115 120 125 Val Glu Re Pro He Ala Tyr Ser Met Val He His -Glu Lys He Glu 130 135 140 Asn Ríe Glu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr Ala Pro Gln Asn He Tyr 145 150 155 160 Cys Val His Val Asp Glu Glu Val Pro Arg Asn Phe Gln Arg Gly Gly 165 170 175 Gln Ser Asn Tyr Phe Leu Leu Pro Lys Cys Leu His Ser Gln 180 185 190 <210> 5 <211> 2217 <212> DNA <213> Ho o sapiens <220> <221> 5' OTR <222> (1).. («44) <220> <221> CDS <222> (845) .. (1744) <220> <221> 3'ÜTR <222> (1745) .. (2217) <400> 5 GTCAOGGGAA CTGOCCpGC TACpGTGAC CTGÜO.T CTCAGCAGTT ri ül CTtJÜ 60 GAAGOCCTGG GATTCTGCTA ATAOCTATCA CTCTAGGTGC T3AAQGGAAA CAGATGAAGA 120 ACATGAOCTC AAGGAGCTTC CTGTCAATGA GAAGACCAAG CTGACGOCTG GCAAAGATAT 180 TAAAGAQGAG OCTGAAACTG TTOCTTOGAC ATCTTATGAA TGTCTGAAAA TAOCITGTGG 240 AGGGTTAGAA GATCAGGGGA CATGGTTGTT CACATTTGCT G0CACQ3AAC AC03CCAGTC 300 TTCACTTGGG AACAGAATCA OXXTTGTGA AGAGATCATC CCTAAGCAGG AGAGAAGCTA 360 CTAAAGGATT GTGTACTCCT O-AO-TrUJC TGTGCTOGGT CTCCACCIGT CTOOCATTCT 420 GTGACGATGG TTCAATGGAA GAGACTCTGC CAQCTGCATT ACTTGTGGGC TCTGGGCTX' 480 TAIATGCTGC TGGOCACTCT GGCICTGAAA CTTICTTTCA GGTTGAAGTG TGACTCTGAC 540 CACTTGGGTC TGGAGTCCAG GGAATCTCAA AGOCAGTACT GTAO?AATAT CTTCTATAAT 600 TTCCTGAAAC TTCCAGCAAA GTGGTCTATC AACIGTTCAG GGGTCACCCG AGGGGACCAA 660 GAGGCAGTGC TTCAGQCTAT TCTGAAIAAC CTGGAGGTCA AGAAGAAGCG AGAGOC?TC 720 ACAGACACCC ACTACCTCTC CCTCACCAGA GACTGTGAGC ACTTCAAQGC TGAAAGGAAG 780 TTCATACBGT TOOCACTGAG CAAAGAAGAG GTGGAGTIOC CTAITGCATA CTCTATQGTG 840 ATTC ATG AGA AGA TTG AAA ACT TTG AAA GGC TAC TGC GAG CTG TGT ATG 889 Met Arg Arg Leu Lys Thr Leu Lys Gly Tyr Cys Glu Leu Cys Met 1 5 10 15 CCC CTC AGA AC TAT ACT GTG TOC ATG TGG ATG AAG AAG TCC OCA GAA 937 Pro Leu Arg Thr Tyr Thr Val Ser Met Trp Met Lys Lys Ser Pro Glu 20 25 30 ACT TTC AAA GAG QCG GTC AAA GCA ATT ATT TCT TGC TTC CCA AAT GTC 985 Thr Phe Lys Glu Ala Val Lys Ala He He Ser Cys Phe Pro Asn Val 35 40 45 TTC ATA GOC AGT AAG CTG GTT CGG GTG GTT TAT GX TCC TQG TOC AGG 1033 Phe He Ala Ser Lys Leu Val Arg Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg 50 55 60 GTG CAAGCT GACCTCAAC TGCATGGAA GAC TTGClCsCAGC TCAGTG 1081 Val Gln Ala Asp Leu Asn Cys Met Glu Asp Leu Leu Gln Ser Ser Val 65 70 75 CCG TQG AAA TAC TTC CTG AAT ACÁ TGT GGG AOG GBC TTT OCT ATA AAG 1129 Pro Trp Lys Tyr Phe Leu Asn Thr Cys Gly Thr Asp Phe Pro He Lys 80 85 90 95 AGCAATGCAGAGATG GTCCAG GCTCrCAAGATGTTGAATGGGAQGAAT 1177 Ser Asn Ala Glu Mst Val Gln Ala Leu Lys Met Leu Asn Gly Arg Asn 100 105 110 AGCATGGAGTCAGAGGIACrt 3AAGCACAAAs?A0CCGCTGGAAA 1225 Ser Met Glu Ser Glu Val Pro Pro Lys His Lys Glu Thr Arg Trp Lys 115 120 125 TAT CAC TTT GAG GTA GTG AGA GAC ACÁ TTA CAC CTA ACC AAC AAG AAG 1273 Tyr His Phe Glu Val Val Arg Asp Thr Leu His Leu Thr Asn Lys Lys 130 135 140 10 AAG GAT CCT CCC CCT TAT AAT TTA ACT ATG TIT AC GSG AAT Q0G TAC 1321. Lys Asp Pro Pro Pro Tyr Asn Leu Thr Met Re Thr Gly Asn Ala Tyr 145 150 155 ATT GTG GCT TOC CGA GAT TTC GTC CAÁ CAT GTT TTG AAG AAC CCT AAA 1369 He Val Ala Ser Arg Asp Phe Val Gln His Val Leu Lys Asn Pro Lys 160 165 170 175 TCC CAÁ CA CTG ATT GAA TQG GTA AAA GAC ACT TAT AGC OCA GAT GAA 1417 Ser Gln Gln Leu He Glu Trp Val Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu 180 185 190 CAC CTC TQG GX ACC CTT CAG CGT GCA CQG TGG ATG OCT GGC TCT GTT 1465 15 His Leu Trp Ala Thr Leu Gln Arg Ala Arg Trp Met Pro Gly Ser Val 195 200 205 CCC AAC CAC CCC AAG TAC GAC ATC TCA GAC ATG ACT TCT ATT GCC AGG 1513 Pro Asn His Pro Lys Tyr Asp He Ser Asp Met Thr Ser He Ala Arg 210 215 220 CIGGTCAAG TCCCAGGCT CST GAGGGAGKATCGATAAGGCT GCT CCT 1561 Leu Val Lys Trp Gn Gly His Glu Gly Asp He Asp Lys Gly Ala Pro 225 230 235 TAT GCTOX TXTCT GGAATCC3V CAG sK CTATCTXGTT TATGGG 1609 Tyr Ala Pro Cys Ser Gly He His Gln Arg Ala He Cys Val Tyr Gly 20 240 245 250 255 GCT GGGGACTTCAAT TQGATC CTT CAAAACCAT CACCTGTTG GCC AAC 1657 Ala Gly Asp Leu Asn Trp Met Leu Gln Asn His His Leu Leu Ala Asn 260 265 270 AAG TTTG^saAAGGTAGAT GATAAT GCTCITCAGTX TTAGAAGAA 1705 ^"^^8» Lys Phe Asp Pro Lys Val Asp Asp Asn Ala Leu Gln Cys Leu Glu Glu 275 280 285 TAC CTA CGT TAT AAG GCC ATC TAT GQG ACT GAA CTT TGA GACAC-ACTAT 1754 Tyr Leu Arg Tyr Lys Ala He Tyr Gly Thr Glu Leu * 290 295 300 GAGAGOGTTG CTACCIQTGG GGCAAGAGCA TGTACAAAO. TGCTCAGAAC TTGCTGQGAC 1814 AGTGTGGGTG .GGAGACCAGG GCTTTGCAAT TCGTGGCOTC CTTTAGGAm AGAGQGCTQC 1874 TATTAGAITG TGGGTAAGTA GATCTTTTQC CITGC3VAAIT GCTOCCTOGG TGAATGCTQC 1934 TTGTTCTCTC AOCCCTAACC CTAGTAGTTC CTCOCTAAC TTTCTCACI? AGTGAGAATG 1994 AGAACTGCTG TGATAGQGAG AGTQAAQGAG GGAIATGTGG 1AGAGCACTT GATTTCAGTT > 2054 GAATGCCTGC TGGTAGC?T TCXATTCICT GGAGCTGOOG TGCCTAATAA TTOCAGGGGT 2114 GGTAGOGGGG AQGAGAACTT TGATGGAAAG AGAAOCTTOC CGTCTGTACT GTTAÍCGTAA 2174 AAAIAAATAG CTOCGGATTC AAAGTAAAAA AAAAAAAAAA AA 2217 <210> 6 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Arg Arg Leu Lys -Thr Leu Lys Gly Tyr Cys Glu Leu Cys Met Pro 1 5 10 15 Leu Arg Thr Tyr Thr Val Ser Mst Tip Met Lys Lys Ser Pro Glu Thr 20 25 30 Phe Lys Glu Ala Val Lys Ala He He Ser Cys Phe Pro Asn Val Phe 35 40 45 He Ala Ser Lys Leu Val Arg Val Val Tyr Ala Ser Trp Ser Arg Val 50 55 60 Gln Ala Asp Leu Asn Cys Met Glu Asp Leu Leu Gln Ser Ser Val Pro 65 70 75 80 Trp Lys Tyr Phe Leu Asn Thr Cys Gly Thr Asp Ríe Pro He Lys Ser 85 r 90 95 Asn Ala Glu Met Val Gln Ala Leu Lys Met Leu Asn Gly Arg Asn Ser 100 105 110 Met Glu Ser Glu Val Pro Pro Lys His Lys Glu Thr Arg Trp Lys Tyr 115 120 125 His Phe Glu Val Val Arg Asp Thr Leu His Leu Thr Asn Lys Lys Lys 130 135 140 Asp Pro Pro Pro Tyr Asn Leu Thr Met Phe Thr Gly Asn Ala Tyr He 145 150 155 160 Val Ala Ser Arg Asp Phe Val Gln His Val Leu Lys Asn Pro Lys Ser 165 170 175 Gln Gln Leu He Glu Trp Val Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His 180 185 190 Leu Trp Ala Thr Leu Gln Arg Ala Arg Trp Met Pro Gly Ser Val Pro 195 200 205 Asn His Pro Lys Tyr Asp He Ser Asp Met Thr Ser He Ala Arg Leu 210 215 220 Val Lys Trp Gln Gly His Glu Gly Asp He Asp Lys Gly Ala Pro Tyr 225 230 235 240 Ala Pro Cys Ser Gly He His Gln Arg Ala He Cys Val Tyr Gly Ala 245 250 ' 255 Gly Asp Leu Asn Trp Met Leu Gln Asn His His Leu Leu Ala Asn Lys 260 265 270 Phe Asp Pro Lys Val Asp Asp Asn Ala Leu Gn Cys Leu Glu Glu Tyr 275 280 285 Leu Arg Tyr Lys Ala He Tyr Gly Thr Glu Leu * 290 295 300 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 TCAATGAGAA GACCAAGCTG ACGCC 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artifici-al <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 8 GGGAGACAGG TGGAGACCGA GC 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : cebador <400> 9 TCACGGGAAC TGCCCTTGCT ACTTGT 26 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 10 <400> 10 GCTCCTTGAG GTCATGTTCT TCATCTG 27 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial ]_5 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 11 GGAGACCGAG CACAGGGAAG G 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA 20 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : cebador <400> 12 ^^^^M¡^g gSÍíSÍ¡ÍÍste^^^^^^^^? CCTTCCCTGT GCTCGGTCTC C 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 13 TCGAGTCGAC TATATGTACC 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 14 AAGGTGAAGG TCGGAGTCAA CG 22 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 15 GGCAGAGATG ATGACCCTTT TGGC 24 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 16 GACCAGGAGG CATAAACCAC CCGAACC 27 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 17 TTCCATCAAA GTTCTCCTCC ACGCTACC 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 18 CATCCAATTC AAGTCCCCAG CCCCATAA 28 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400 19 TGTAGCGTGA AGACGACAGA AAGGGCGTGG TACCGAGCTC GAG 43 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> «^te^^ <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 20 AGGGCGTGGT ACCGAGCTCG AG 22 <210> 21 <211> 11 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 21 GGCTCGAGCT C 11 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Arg Leu Cys Gln Leu His Tyr Leu 1 -5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Tyr Leu Trp Ala Leu Gly Cys Tyr Met 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 He Leu Asn Asn Leu Glu Val Lys Lys <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Lys Lys Lys Arg Glu Pro Phe 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Glu Pro Phe Thr Asp Thr His Tyr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Pro Phe Thr Asp Thr His Tyr Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Pro Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Phe 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Glu Val Glu Phe Pro He Ala Tyr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr Ala 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Phe He Ala Ser Lys Leu Val Arg Val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Leu Asn Cys Met Glu Asp Leu Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ser Met Glu Ser Glu Val Pro Pro Lys 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Thr Leu His Leu Thr Asn Lys Lys Lys 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Phe Val Gln His Val Leu Lys Asn Pro Lys 1 5 10 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu He Glu Trp Val Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT ' <213> Ho o sapiens <400> 37 Trp Met Leu Gln Asn His His Leu Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Leu Ala Asn Lys Phe Asp Pro Lys 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asp Pro Lys Val Asp Asp Asn Ala Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Cys Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Tyr 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Cys Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Tyr Lys 1 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 . i > -* - . * * i i - - r - • <• ^&tHfí*ii->« Ala Val Tyr Ala Pro Gln Asn He Tyr 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Tyr Ala Pro Gln Asn He Tyx Cys Val 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Tyr Cys Val His Val Asp Glu Glu Val 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 His Val Asp Glu Glu Val Pro Arg Asn 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT •<213> Homo sapiens <400> 46 Val Asp Glu Glu Val Pro Arg Asn Phe 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Phe Gln Arg Gly Gly Gln Ser Asn Tyr 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Ser Asn Tyr Phe Leu Leu Pro Lys 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Leu Leu Pro Lys Cys Leu His Ser Gln 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Arg Arg Leu Lys Thr Leu Lys Gly Tyr 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Lys Thr Leu Lys Gly Tyr Cys Glu Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Tyr Cys Glu Leu Cys Met Pro Leu Arg 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Glu Leu Cys Met Pro Leu Arg Thr Tyr 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Cys Met Pro Leu Arg Thr Tyr Thr Val 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Pro Leu Arg Thr Tyr Thr Val Ser Met 1 5 i i . <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Tyr Leu Trp Ala Leu Gly Cys Tyr Met Leu 1 5 lo <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Tyr Met Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Lys Leu 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 cys Met Qlu Asp Leu Leu Gln Ser Ser Val 1 5 10 <210> 60 <211> 9 MgteíW <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Val Asp Pro He Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 61 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asn Lys Phe Asp Pro Lys Val Asp Asp Asn Ala Leu Gln Cys Leu 1 5 10 15 10 Glu Glu Tyr 15 20 Se hace constar que con relación a eta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Antigeno asociado a tumores con la denominación de B99, caracterizado porque se selecciona entre el grupo de polipéptidos que presentan la secuencia de aminoácidos que se indica en SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6. 2.- Fragmento de proteina o péptido inmunogénico, caracterizado porque se deriva de un antigeno asociado con tumores, definido en la reivindicación 1. 3.- (Poli ) péptido inmunogénico según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque provoca una respuesta inmune humoral. 4.- (Poli) péptido inmunogénico según la reivindicación 1 ó 2, cuyo o cuyos producto (s) de degradación es (son) presentados por moléculas del MHC y provocan una respuesta inmune celular. 5.- Péptido inmunogénico según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo de péptidos según SEC ID NO: 22 hasta 55. 6.- Péptido inmunogénico según la reivindicación 5, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo de ^^¿^ péptidos conforme a SEC ID NO: 31, 57 y 59. 7.- (Poli ) péptido inmunogénico según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la inmunoterapia de enfermedades de cáncer in vivo o ex vi vo, caracterizado porque el (poli ) péptido una respuesta inmune contra células de tumores del paciente, que expresan B99. 8.- Composición farmacéutica para la administración por via parenteral, tópica, oral o local, caracterizada porque como componente activo contiene uno o varios (poli ) péptidos inmunogénicos según una de las reivindicaciones 1 a 6. 9.- Composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque contiene diferentes péptidos inmunogénicos derivados de B99. 10.- Composición farmacéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque contiene uno o varios péptidos derivados de B99 en mezcla con péptidos derivados de otros antigenos asociados con tumores. 11.- Composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque los péptidos se fijan a por lo menos dos diferentes tipos de HLA. 12.- Molécula de ADN aislada, caracterizada porque codifica una proteina con las propiedades inmunogénicas de un antigeno asociado con tumores, definido en la reivindicación 1, o fragmentos de éste. 13.- Molécula de ADN según la reivindicación 12, caracterizado porque codifica un polipéptido inmunogénico con la denominación de B99 que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID NO: 2, 4 ó 6 o fragmentos de proteinas o péptidos derivados de éste. 14.- Molécula de ADN según la reivindicación 13, caracterizada porque es un polinucleótido con la secuencia representada en SEC ID NO: 1, 3 ó 5 o se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido de la secuencia representada en SEC ID NO: 1, 3 ó 5. 15.- Molécula de ADN recombinante, caracterizada porque contiene una molécula de ADN según una de las reivindicaciones 12 a 14. 16.- Molécula de ADN según una de las reivindicaciones 12 a 15, para la inmunoterapia de enfermedades de cáncer, caracterizada porque induciendo el (poli ) pépt do de B99 expresado por la molécula de ADN una respuesta inmune contra células de tumores del paciente, que expresan el 1399. 17.- Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene como constituyente activo una o varias de . . l.i las moléculas definidas en una de las reivindicaciones 12 a 16. 18.- Utilización de células que expresan el antigeno asociado con tumores definido en la reivindicación 1, para la preparación de una vacuna contra el cáncer. 19.- Anticuerpo contra un (poli) péptido definido en una de las reivindicaciones 1 a 6. 20.- Anticuerpo según la reivindicación 19, caracterizado porque es monoclonal. 21.- Anticuerpo según la reivindicación 19 ó 20 para la terapia y el diagnóstico de enfermedades de cáncer que están asociadas con la expresión de B99.