MXPA01012012A

MXPA01012012A - Antigeno (42) asociado a tumores.

Info

Publication number: MXPA01012012A
Application number: MXPA01012012A
Authority: MX
Inventors: Karl-Heinz Heider
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2002-06-21
Also published as: UY26170A1; AU4924000A; CO5280140A1; WO2000073438A1; JP2003501025A; CA2376133A1; AR024114A1; DE19924199A1; EP1183349A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un antigeno asociado a tumores, peptidos inmunogenos derivados de este, y moleculas de ADN que lo codifican, asi como su utilizacion en la inmunoterapia de padecimientos de cancer.

Description

ANTIGENO (C42) ASOCIADO A TUMORES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la inmunoterapia de padecimientos de tumores. El sistema inmune tiene la misión de proteger al organismo con respecto de un gran número de diferentes microorganismos o la de combatir activamente a éstos. La importancia de un sistema inmune intacto se muestra sobre todo en el casó de inmunodeficiencias heredadas o adquiridas. El empleo de programas profilácticos de vacunación se manifestó en muchos cases como una intervención inmunológica extremadamente conducente a su finalidad y con éxito en la lucha contra padecimientos infecciosos virales o bacterianos. Además, se ha mostrado que el sistema inmune participa decisivamente también en la eliminación de células de tumores. En tal caso, desempeña un papel esencial el reconocimiento de los antígenos asociados con tumores (TAAs, de TumorAssozierten An tigene) por componentes del sistema inmune. En el sentido más amplio, cada componente (peptídico o no peptídico) de una célula tumoral, que se reconoce por un elemento del sistema inmune y conduce a la estimulación de una respuesta inmunológica, puede funcionar como antígeno REF. :134376 tumoral inmunógeno. Les corresponde importancia especial en tal caso a los antígenos de tumores que no solamente provocan una reacción inmunológica sino que producen también un rechazo del tumor. La identificación de antígenos definidos, que pueden producir tal reacción inmunológica, constituye una etapa importante para el desarrollo de una vacuna molecularmente definida contra tumores. Aún cuando todavía no se ha puesto en claro totalmente qué elementos del sistema inmune son responsables de un rechazo del tumor, existe sin embargo un consenso acerca de que en este contexto desempeñan un papel especial los linfocitos T citotóxicos (CTLs, de Cytotoxic T Lymphocytes) , que expresan CD8 (Coulie, 1997). Especialmente en el caso de las especies de tumores (por ejemplo melanoma y carcinoma renal) , que tienen una tasa de remisión espontánea relativamente alta, se pudo comprobar una correlación entre la evolución clínica y la aparición aumentada de células T CD8+ y CD4+ (Schendel y colaboradores, 1993; Mackensen y colaboradores, 1993; Halliday y colaboradores, 1995; Kawakami y colaboradores, 1995; Ka akami y colaboradores, 1996; Wang, 1997; Celluzzi y Falo, 1998) . En tal caso se obtuvieron clones de CTL específicos o bien a partir de linfocitos que se infiltran en tumores (TIL, de Tumor Infil tra ting Lymphocytes) o células sanguíneas mononucleares, periféricas (PBMC, de Pepphera l Blood Mononuclear Cells) después de cultivación conjunta con células de tumores, que la mayor parte de las veces son autólogas, y de estimulación in vi tro de las citocmas. Tanto en modelos de animales como también en sistemas de cultivos celulares humanos cultivados in vi tro se pudo reforzar la respuesta de las células T frente a células de tumores por transfección de las células de tumores con citocinas (van Elsas y colaboradores, 1997; Gansbacher y colaboradores, 1990; Tepper y colaboradores, 1989; Fearon y colaboradores, 1990; Dranoff y colaboradores, 1993). Por causa de la correlación entre la remisión y la participación de células T CD8+, la identificación de antígenos asociados con tumores (TAA) , que son reconocidos por CTLs positivos para CD8, constituye una meta principal declarada en el camino para el desarrollo de una vacuna contra tumores (Pardoll, 1998; Robbins y Kawakami, 1996). Todavía no está claro si también desempeñan un papel esencial otros tipos de células del sistema inmune, tales como por ejemplo células T cooperantes CD4+; algunos estudios con péptidos MAGE-3/HLA-A1 en pacientes de melanoma indican que esto es así (Marchand y colaboradores, 1995; Boon y colaboradores, 1998). En los últimos años transcurridos, se ha identificado una serie de TAAs, que son reconocidos por los CTLs (Boon y colaboradores, 1994; van den Eynde y van der Bruggen, 1997) . Las células T reconocen a antígenos como fragmentos peptídicos, que son presentados junto a superficies celulares de moléculas del MHC ("maj or his tocompa tibili ty complex " = complejo de histocompatibilidad principal en seres humanos, "HLA" = "human leukoci te antigen " = antígeno de leucocitos humanos). Hay dos clases de moléculas de MHC: las moléculas del MHC-I aparecen en la mayor parte de las células con núcleo y presentan péptidos (usualmente 8-10-meros), que se forman ediantje descomposición proteolítica de proteínas endógenas (el denominado tratamiento de antígenos, "an tigen processing") . Los complejos de péptidos, y del MHC-I son reconocidos por CTLs positivos para CD8. Las moléculas del MHC-II aparecen sólo en las denominadas "células presentadoras de antígenos profesionales" (APC presenting cells ") y presentan péptidos de proteínas exógenas, que en el transcurso de la endocitosis son recogidas y tratadas por las APC. Los complejos de péptidos y del MHC-II son reconocidos por células T cooperantes de CD4. Mediante una interacción entre un receptor de células T y el complejo de un péptido y del MHC se pueden provocar diferentes mecanismos efectores, que en el cago de los CTLs conducen a ia apoptosis de la célula objetivo. Esto sucede cuando se reconoce como ajeno o bien el MHC (por ejemplo en el caso del rechazo de un trasplante), o del péptido (por ejemplo en el caso de patógenos intracelulares). No obstante, no todos los péptidos presentados cumplen los requisitos estructurales y funcionales para una interacción efectiva con células T (tal como ha sido descrito por Ram ensee y colaboradores, 1995 y más adelante en esta memoria) . Para el empleo de TAAs en una vacuna contra tumores, son posibles fundamentalmente varias formas de aplicación: el antígeno puede ser aplicado o bien como proteína recombinante con apropiados adyuvantes o sistemas de soporte, o como ADNc que codifica el antígeno en vectores de plásmidos (vacunas de ADN; Tighe y colaboradores, 1998) o vectores virales (Restifo, 1997). Otra posibilidad consiste en el empleo de bacterias recombinantes (por ejemplo Listeria , Salmonella) , que expresan recombinantemente el antígeno humano y mediante sus componentes adicionales tienen un efecto adyuvante (Paterson, 1996; Pardoll, 1998). En todos estos casos, se necesitan un tratamiento y una presentación del antígeno por las denominadas "células presentadoras de antígenos profesionales" (APC) . Otra posibilidad es el empleo de péptidos sintéticos (Melief y colaboradores, 1996) , que corresponden a los epítopes para células T correspondientes al antígeno y que o bien se cargan desde el exterior en las APC (Buschle y colaboradores, 1997; Schmidt y colaboradores, 1997) o se absorben por las APC y se transfieren intracelularmente a las moléculas del MHC-I. El método de aplicación más eficiente terapéuticamente de un antigeno definido, es determinada por lo general en estudios clínicos. Entre los antígenos o sus epítopes, reconocidos por los CTLs específicos para tumores, se cuentan moléculas que pueden proceder de todas las clases de proteínas (por ejemplo factores de transcripción, receptores, enzimas; para una visión de conjunto, véase Rammensee y colaboradores, 1995; Robbins y Kawakami, 1996) . Estas proteínas no deben estar necesariamente localizadas junto a la superficie de las células, tal como se necesita esto en el caso del reconocimiento por anticuerpos. Con el fin de funcionar para el reconocimiento por los CTLs como antígeno especifico para tumores y con el fin de poderse emplear para la terapia, las proteínas deben de cumplir determinadas condiciones; en primer lugar, el antígeno debe de ser expresado principalmente por células de tumores y en los denominados tejidos normales "críticos" no debe aparecer o sólo debe aparecer en 'una concentración menor que en tumores. Los tejidos normales críticos son tejidos esenciales; una reacción inmunitaria dirigida contra ellos podría tener en ciertas circunstancias secuelas graves, en parte letales. En segundo lugar, el antígeno no solamente debe estar presente en el tumor primario, sino también en las metástasis. Además, en lo que respecta a una aplicación clínica amplía del antígeno, ha de pretenderse que éste se encuentre presente en alta concentración en varias especies de tumores. Otra condición previa para la idoneidad de un TAA como constituyente eficaz de una vacuna es la presencia de epítopes para células T en la secuencia de aminoácidos del antígeno; los péptidos derivados de un TAA deben conducir a una respuesta de células T in vi tro/ in vivo (péptido "inmunógeno" ) . Otro criterio de selección adicional para un péptido inmunógeno ampliamente aplicable a escala clínica es la frecuencia con la que el antígeno ha de encontrarse en una población dada de pacientes. Los antígenos asociados con tumores (TAAs) inmunógenos, de los cuales ya se mostró en su mayor parte que poseen epítopes para células T, se pueden clasificar en varias categorías, entre otras, proteínas víricas, proteínas mutadas, proteínas sobreexpresadas, proteínas de fusión formadas por translocación cromosomal, antígenos de diferenciación, antígenos oncofetales (Van den Eynde y Brichard, 1995; van den Eynde y van der Bruggen, 1997) . Los métodos para la identificación y ia caracterización de TAAs, que constituyen el punto de partida para el desarrollo de una vacuna contra tumores se basan por un lado en el empleo de CTLs (respuesta inmunitapa celular) o de anticuerpos (respuesta inmunitaria humoral) ya inducidos en los pacientes, o se basan en la elaboración de perfiles diferenciales de transcripción entre tumores y tejidos normales. En el primero de los casos, es decir el punto de partida inmunológico, se emplean CTLs de pacientes para un escrutinio de bibliotecas de expresión de ADNc de tumores eucarióticos, que presentan los epítopes para CTL a través de moléculas del MHC-I (Boon y colaboradores, 1994), mientras que por medio de antisueros muy afines de pacientes se investigan bibliotecas de expresión de ADNc procarióticos directamente a través de un análisis por inmunotransferencia de las plaquetas individuales en cuanto a la presencia de los TAAs (Sahin y colaboradores, 1995) . Una combinación entre la reactividad de los CTL y un procedimiento químico proteínico la constituye el aislamiento de péptidos aislados a partir del MHC-I de células de tumores, que se habían seleccionado previamente a través de la reactividad con CTLs de pacientes. Los péptidos son separados por lavado con respecto del complejo de |MHC-I e identificados con ayuda de la espectrometría de masas (Falk y colaboradores, 1991; Woelfel y colaboradores, 1994; Cox y colaboradores 1994). Los puntos de partida, que utilizan CTLs para la caracterización de antígenos, están vinculados con un considerable gasto o no siempre tienen éxito, por causa de la cultivación y la activación necesarias de los CTLs. Los métodos para la identificación de TAAs, que se basan en la comparación del perfil de transcripción de un tejido normal con el de un tejido tumoral, son múltiples y muy variados entre ellos se cuentan la hibridación diferencial, el establecimiento de bancos de ADNc por substracción ( "representa tional difference análisis " (análisis de la diferencia representativa) ; Huhank y Schatz, 1994; Diatchenko y colaboradores, 1996) y el empleo de la tecnología de los chip de ADN o del método de SAGE (Velculescu y colaboradores, 1995) . Al contrario que en el método inmunológico antes mencionado con ayuda de los CTLs de pacientes, en el caso de emplearse métodos de biología molecular debe de mostrarse que los candidatos a antígenos potenciales, encontrados de esta manera, son específicos para tumores (están asociados a tumores) y poseen realmente epítopes para ¡células T, que pueden provocar una respuesta citotóxica de células T. En por lo menos uno de los casos (NY-ESO/LAGE-1 ) se identificó un antígeno tanto mediante la utilización de sueros de pacientes como también mediante un análisis RDA (Chen y colaboradores, 1997; Lethe y colaboradores, 1998), además se describieron epítopes para CTL de este antígeno y unas simultáneas respuestas humorales espontáneas y de células T en un paciente (Jager y colaboradores, 1998) . Fue misión de la presente invención, poner a disposición un nuevo antígeno asociado a tumores (TAA) . El problema planteado por esta misión se resolvió produciendo una biblioteca de ADNc por substracción en primer lugar mediante RDA ( "represen ta tional difference analysis " = análisis de la diferencia representativa) en que una agrupación de diferentes carcinomas epiteliales en escamas del pulmón y una agrupación de 11 diferentes tejidos normales. Para la generación de los fragmentos de ADNc necesarios para la hibridación substractiva de "tester (ensayadores) y "driver (conductores)", a diferencia del protocolo original (Diatchenko y colaboradores, 1996) se empleó una mezcla de 6 diferentes enzimas de restricción. La i.ii& í utilización de una mezcla de diferentes enzimas de restricción, que necesitan 6 pares de bases como secuencia de reconocimiento, tiene frente al protocolo original (Diatchenko y colaboradores, 1996) las siguientes ventajas: a) por selección en cada caso de dos enzimas de restricción, cuyas secuencias de reconocimiento se representan por una combinación de 6 elementos de las bases A/T (por ejemplo Ssp I: AATATT) o C/G, (por ejemplo Nae I: GCCGGC) o A/C/G/T (por ejemplo EcoR V: GATATC) se cortan de igual manera regiones ricas tanto en GC como también en AT de un gen, con lo cual se hace posible una representación homogénea de la región total del gen en forma de fragmentos de restricción; b) por lo demás es posible con ello obtener en un promedio estadístico mayores fragmentos de ADNc del gen candidato (aproximadamente 800 pb = pares de bases), lo cual a su vez constituye una gran ventaja en el subsiguiente análisis (secuenciación y anotación) y la clonación del ADNc de "tamaño completo = full si ze " . En el protocolo original (Diatchenko y colaboradores, 1996) se empleó una enzima de restricción (Rsa I) que reconoce sólo a cuatro bases, que conduce a una longitud media de los fragmentos de 256 pb y no puede elaborar regiones específicamente ricas en CG o en AT . Con el fin de adaptarse a la cinética de hibridación modificada pof los fragmentos de ADNc de inserto más largos, se modificó el protocolo de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) tal como se describe en el Ejemplo 1. Para la selección de los antígenos sobreexpresados en el tumor se aislaron en primer lugar los clones obtenidos de ADNc y de ellos se estableció en cada caso un cultivo original en glicerol, una preparación de plásmidos y una colección de los fragmentos de la PCR que representa al inserto en el formato de placas de 96 pocilios. Los fragmentos de ADNc de los 4748 clones de la biblioteca substractiva de ADNc de carcinoma epitelial en escamas del pulmón se colocaron en triplicado sobre filtros y se hibridaron en cada caso con una biblioteca de ADNc específica de testículos, una mezcla de ADNsc de 15 tejidos normales o de muestras agrupadas de pacientes de tumores (carcinoma epitelial en escamas de los pulmones) a fin de seleccionar antígenos tumorales específicos o antígenos del tipo de tumor/testículo. Los 234 clones, que proporcionaron una señal solamente con las muestras de hibridación específicas para testículos o específicas para tumores o con ambas a la vez, pero no con la muestra de hibridación de tejido normal, se seleccionaron para el ulterior análisis. Después de secuenciación y anotación con secuencias disponibles en bancos de datos se obtuvieron 36 genes desconocidos, para los cuales existen entradas de ESTs ("expressed sequence tags " = marcas de secuencias expresadas) en el banco de datos. De estos genes se investigaron más detalladamente los 10 cuyas ESTs no proceden de tejidos normales críticos. Mediante una RT-PCR (PCR de transcriptasa inversa) semi-cuantitativa se comprobó que un clon (C42) mostró una manifiesta sobreexpresión en tumores y testículos, pero no en otros tejidos normales investigados. Un análisis por transferencia Northern, realizado seguidamente en diferentes tejidos normales y de tumores, confirmó que el C42 no presentaba ninguna transcripción en los tejidos normales investigados - con excepción de una débil bando en el esófago -, pero se podía reconocer una fuerte señal en el carcinoma epitelial en escamas del pulmón y del esófago. Por lo demás, a partir de los datos obtenidos en los experimentos de transferencia Northern se puede sacar la conclusión de que el transcripto de C42 tiene una longitud de aproximadamente 4.4 kb. El ADNc de C42 humano fue clonado, la secuencia obtenida está representada en SEQ ID NO: 1. La secuencia de C42 muestra tanto en el plano de los nucleótidos como también en el de las proteínas una inequívoca homología con una familia de genes de proteínas de canales de CT activables por Ca2+, que son qxpresadas en diferentes especies (en parte de modo muy específico para un tejido) . 5 Representantes de esta familia han sido clonados hasta el momento actual y caracterizados parcialmente; los dos genes bovinos bCLCAl ( "bovine Ca2+-activa ted Cl' channel -1 " = canal-1 de Cl" activado por Ca2+ de bovino; Cunningham y colaboradores, 1995) y Lu-ECAM-1 ( "bovine l ung-endothelial cell adhesión molecule-1 " = molécula-1 de adhesión a células epiteliales de pulmón de bovino; Elble y colaboradores, 1997), el gen de ratón mCLCAl { "murine Ca2+ -activa ted Cl ~ channel -1 " = canal-1 de Cl" activado por Ca+2 de murino; Gandhi y colaboradores, 1998) y dos genes humanos hCLCAl ( "human Ca24 -activa ted C1 ' channel -1 " = canal-1 de C1' de ser humano; Gruber y colaboradores, 1998) y hCLCA3 { "human Ca2+ a ctiva ted Cl~ channel -3 " = canal-3 de Cl" activado por Ca+ de ser humano; Gruber y colaboradores, 1999). Todos los representantes de esta familia de proteínas presentan típicas regiones transmembranales y se disocian posteriormente a la traducción según el estado actual de los conocimientos, para formar heterodímeros, siendo glicosilada la parte terminal de C (Elble y colaboradores, 1997) con excepción del hCLCA3, que constituye una forma acortada (Gruber y colaboradores, 1999) . El gen bCLCAl se detectó exclusivamente en células epiteliales de la traquea del .,^^-itfvi?? ?Ítí r. .Í animal bovino'. El Lu-ECAM-1 estrechamente emparentado, asimismo aislado del animal bovino, es expresado de modo específico para un tejido en las células endoteliales vasculares de las venas pulmonares. Zhu y colaboradores (1992) comprobaron que el Lu-ECAM-1 hace posible la fijación a células endoteliales de las metástasis en pulmones B16F10 del melanoma de ratón. En el caso de C42 se trata de un nuevo representante humano de esta familia de proteínas. El ADNc de C42, obtenido dentro del marco de la presente invención, presenta un cuadro de lectura continuo que codifica 943 aminoácidos. La secuencia de C42 presenta las cinco regiones transmembranales hidrófobas (posiciones Nos. 222-252, 416-445, 553-574, 746-766 y 900-926 en SEC ID NO: 2), que es típica para la familia de proteínas, pero a diferencia de los otros representantes posee un extremo terminal de C, que está constituido por aminoácidos fuertemente cargados. El ADNc de C42 clonado dentro del marco de la presente invenbión tiene un tamaño de 4077 pb, respondiendo de la compleción del ADNc en esta región la presencia de una cola de PoliA junto al extremo 3' de la secuencia. El ADNc aislado dentro del marco de la presente invención presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID NO: l.i éste codifica el antígeno asociado a tumores (TAA) con la denominación C42. Una proteína expresada a partir del ADNc aislado con este cuadro de lectura continuo abierto en dirección al extremo de 5' , presenta la secuencia de aminoácidos que está representada en SEC ID NO: 2. La invención concierne por consiguiente, en un primer aspecto, a un antígeno asociado a tumores que tiene la denominación C42, que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 2 La secuencia indicada en SEC ID ¡MO: 2 constituye una proteína, que es traducida por un transcripto que tiene un tamaño de aproximadamente 4.4 kb o que es traducica por un transcripto que tiene un tamaño ae aproximadamente ^.5 kb, que se deriva de una variante de empalme del transcripto de 4.4 kb o de un transcripto de un gen que es nomólogo con éste . La secuencia _" aminoácidos representada en SEC ID NO: 2 puede presentar diferencias, por ejemplo las que están condicionadas por un intercambio de aminoácidos, siempre y cuando, que el derivado de C42 presente las propiedades inmunógenas que son deseadas para la utilización en una vacuna contra tumores. iáuí-á Á „r... ,^¡i ,í Ja^???M^i — -""->->— ' — - ?¡ ¡l¿[TlÍ*^^itoÍlmfrl<»?^""* --''a**" jjrtÉtáalaitfei La Isecuencia natural de aminoácidos de C42 puede ser eventualmente modificada, intercambiando aminoácidos individuales en un epítope para CTL de C42, con el fin de producir, en comparación con el epitope natural para CTL de C42, un aumento de la afinidad de los péptidos de C42 para moléculas del MHC-I y con ello una inmunogenicidad y finalmente una reactividad aumentada frente a tumores. Las modificaciones en la reg ón de los epítopes para C42 pueden ser llevadas a cabo en la proteína total de C42 (ésta es tratada por las APCs para dar los correspondientes péptidos) o en fragmentos proteínicos mayores de C42 c en péptidos de C42 (compárese más adelante) . En un aspecto adicional, la presente invención concierne a fragmentos y péptidos inmunógenos, que se derivan de C42. Estos últimos son denominados en lo sucesivo como "péptidos de C42". Un primer grupo lo constituyen los péptidos de C42, que provocan una respuesta inmunitaria humoral (inducción de anticuerpos). Tales péptidos son segmentos seleccionados de C42 (por lo menos de 12 a 15 aminoácidos), que se pueden determinar mediante los denominados algoritmos de predicción ( "predi ction algori thms ") tal como por ejemplo el "surfa ce probabili ty blot " (borrón de probabilidad superficial) (Emini y colaboradores, 1985), el "hydrophobi ci ty blot " (borrón de hidrofobia) (Kyte y Doolittle, 1982) y el "an tigeni c índex " (índice antig^nico) (Jameson y Wolf. 1988). Se incluyen también todos los péptidos que contribuyen a una diferenciación inmunológica entre un tumor y un tejido normal. Es conocido que los antígenos asociados a tumores pueden presentar mutaciones específicas para tumores, que contribuyen a una diferenciación inmunológica entre un tumor y un tejido normal (Mandruzzato y colaboradores, 1997; Hogan y colaboradores, 1998; Gaudi y colaboradores, 1999; Wólfel y colaboradores, 1995). Con el fin de comprobar la presencia de mutaciones de C42 específicas para tumores, convenientemente con ayuda de sondas procedentes del ADNc aislado conforme a la invención, se clona el ADNc de C42 procedente de uno o varios tumores diferentes, y las secuencias obtenidas se comparan con el ADNc de C42 de un tejido normal. Es de esperar que los péptidos de C42 de un tumor procedentes de un segmento de secuencia mutado con respecto al de C42 de un tejido normal, presenten una inmunogenicidad aumentada en comparación con los péptidos de C42 de tejido normal procedentes del correspondiente segmento. Con el fin de confirmar que 1 ¿ even ales mutaciones son específicas para un tumor, se pueden generar anticuerpos contra estas regiones e investigar células de tumores en cuanto a expresión de posibles mutaciones. La presente invención concierne por consiguiente en otro aspecto a péptidos de C42, que se derivan de regiones de un C42 expresado en un tumor, que presentan mutaciones específicas pata el tumor. Para confirmar que cualesquiera mutaciones son específicas del tumor, se pueden generar anticuerpos contra estas regiones y las células tumorales se pueden investigar para la expresión de mutaciones posibles. Los péptidos de C42 son administrados directamente o en una forma modificada (por ejemplo acoplada a KLH = "keyhole limpet hemocyanine " = hemocianina de lapa de bocallave) y se determina la formación de anticuerpos mediante análisis inmunológicos corrientes, por ejemplo mediante una ELISA. Otros péptidos de C42, preferidos dentro del marco de la presente invención, son aquellos que son presentados por moléculas del MHC y producen una respuesta inmunitaria celular. Existen dos clases de moléculas del MHC, a saber moléculas del MHC-I, que son reconocidas por CTLs positivos para CD8, y moléculas del MHC-II que son reconocidas por i±Í. . ¿¡¡¡?áé 'ií Ir..,..-. ...rrj?. ? , - - .... - .rÁíZ.*.. r?i.?r .- . . mkllí,,, células T cooperantes positivas para CD . Para que un péptido provoque una respuesta inmunitaria celular, éste debe de fijarse a una molécula del MHC, debiendo el paciente que ha de ser tratado tener la molécula del MHC en su repertorio. La determinación del subtipo del MHC del paciente constituye por consiguiente, en lo referente a la provocación de una respuesta mmunitaria celular, una de las condiciones previas esenciales para la utilización eficaz de un péptido en este paciente. La secuencia de un péptido C42, que se ha de emplear terapé ticamente, es preestablecida por la respectiva molécula de MHC en lo referente a los aminoácidos de anclaje y su longitud. Posiciones de anclaje y longitudes definidas garantizan que un péptido se adapte dentro del surco de fijación de péptidos de la respectiva molécula del MHC del paciente. Esto tiene como consecuencia el hecho de que sea estimulado el sistema inmune y se produzca una reacción inmunitaria celular, que en el caso de la utilización de un péptido derivado de un antígeno tumoral se dirija contra las células de tumores del paciente. Los péptidos de C42 inmunógenos se pueden identificar de acuerdo con métodos conocidos, uno de los fundamentos para ello es la relación entre la fijación al MHC ' fcÉfJÉti .i - ' y la inducción de los CTL. Puesto que por lo tanto la secuencia de péptidos inmunógenos es determinable de antemano en virtud de su motivo de fijación peptídico, se pueden identificar y sintetizar péptidos de C42, que constituyen epítopes para CTL, en base a la secuencia proteínica de C42. Para ello son apropiados diferentes métodos, que se utilizaron para la identificación de epítopes para CTL de antígenos de proteínas que se conocen; por ejemplo el método descrito por Stauss y colaboradores. 1992, para la identificación de epítopes para células T en el virus de papiloma humano. Los requisitos específicos para un alelo de cada producto de alelo del MHC-I a un péptido, que se fija a la molécula del MHC y es presentado por ésta, fueron recopilados como motivo (por ejemplo Falk y colaboradores, 1991) . Hasta ahora se conoce un gran número tanto de motivos de péptidos del MHC como también de ligandos del MHC. Un método apropiado dentro del marco de la presente invención para la búsqueda de epítopes para una proteína conocida, que se adapta dentro de una determinada molécula del MHC-I, fue descrito en un artículo recopilativo de Rammensee y colaboradores, 1995. Éste abarca las siguientes etapas: en primer lugar se investiga la secuencia de proteínas en cuanto a segmentos que correspondan i al motivo de anclaje, siendo posibles determinadas variaciones en lo referente a la longitud del péptido ya la ocupación del anclaje. Cuando por ejemplo un motivo prescribe un 9-mero con lie o Leu en el extremo, se pueden tomar en consideración también 10-meros con un extremo terminal de C correspondiente, y asimismo péptidos con otros restos alifáticos, tales como Val o Met en el extremo terminal de C. De este modo se obtiene una serie de candidatos a péptidos. Éstos son investigados en cuanto a la presencia del mayor número posible de restos de anclaje; que ellos tengan en común con ligandos ya conocidos y/o para determinar si tienen restos "preferidos" para diferentes moléculas del MHC (correspondientemente a la Tabla de Rammensee y colaboradores, 1995). Con el fin de excluir a los péptidos que se fijen débilmente, se llevan a cabo convenientemente análisis de fijación. Cuando se conocen los requisitos en cuanto a la fijación a péptidos para determinadas moléculas del MHC, los candidatos a péptidos se pueden investigar también en cuanto a restos que no sean de anclaje, que repercutan negativa o positivamente sobre la fijación, o que hagan posible ésta por primera vez (Ruppert y colaboradores, 1993) . En el caso de este modo de proceder hay que tomar en consideración, sin embargo, que el motivo de fijación del péptido no solamente es decisivo para la búsqueda en cuanto a ligandos naturales; también otros aspectos, por ejemplo la especificidad para enzimas durante el tratamiento del antígeno, contribuyen a la identidad del ligando - adicionalmente a la especificidad de la fijación al MHC -. Un método, que toma en consideración estos aspectos y que es apropiado dentro del marco de la presente invención para la identificación de péptidos de C42 inmunógenos, fue utilizado, entre otros autores, por Kawakami y colaboradores, 1995, a fin de identificar epítopes para gp 100 basándose en motivos conocidos de HLA-A*0201. Los péptidos se pueden seleccionar también en lo referente a su capacidad para fijarse a moléculas del MHC-II. El motivo de fijación al MHC-II, que se extiende alo largo de nueve aminoácidos, presenta un grado de degeneración en las posiciones de anclaje mayor que el motivo de fijación al MHC-II. Se desarrollaron hace poco tiempo, partiendo del análisis estructural por rayos X de moléculas del MHC-II, métodos que permiten el análisis exacto de los motivos de fijación al MHC-II, y partiendo de ello, permiten variaciones de la secuencia de péptidos (Rammensee y colaboradores, 1995, y la bibliografía original allí citada) . Los péptidos, que se fijan a moléculas del MHC-II, son ..l.-í ?riii.?x.-M...-.- ir-Ar*. .- límt±? .,..?^n„.,,.m.,m„?¡M.-,Ai,fi.' m?lr,*:.?...... ,r rr,-i¡U¡rM?Xi ÚíÁ¡¿Íi st. presentados a las células T de CD4 típicamente por células dendríticas, macrófagos o células B. Las células T de CD4 a su vez activan entonces, a continuación de ello, directamente a los CTLs, mediante por ejemplo segregación de citocinas, y refuerzan la eficiencia de la presentación de antígenos por las APC (células dendríticas, macrófagos y células B) . Desde hace poco tiempo están a disposición bancos de datos y algoritmos de predicción, que permiten con gran seguridad la predicción de epítopes para péptidos, que se fijan a una determinada molécula del MHC. Dentro del marco de la presente invención se identificaron, mediando utilización del algoritmo descrito por Parker y colaboradores, 1994, y Rammensee y colaboradores, 1995, péptidos candidatos de C42 para los más importantes tipos de HLA, especialmente para los HLA-A1, A*0201, -A3, -B7, -B14 y -B*4403, de los que se puede esperar que se fijen a las correspondientes moléculas de HLA y por lo tanto constituyan epítopes para CTL inmunógenos; los péptidos determinados se enumeran en la Tabla 1. De manera similar, eventualmente mediando utilización de otros algoritmos, que toman en consideración las diversas características de los péptidos (hidrofobia, carga, tamaño) o los requisitos en cuando a los péptidos, por ejemplo la estructura tridimensional de la molécula de HLA, se pueden determinar otros epítopes potenciales para péptidos; esto es válido también para los epítopes para péptidos de otros tipos de HLA. Después de la elección de candidatos a péptidos de C42 con ayuda de los métodos señalados, se ensaya su fijación al MHC mediante análisis de fijación a péptidos. Como siguiente etapa se determina la inmunogenicidad de los péptidos con buenas propiedades de fijación (la estabilidad de la interacción entre péptidos y el MHC se correlaciona en la mayor parte de los casos con la inmunogenicidad; van der Burg y colabo'radores, 1996) . Con el fin de determinar la inmunogenicidad del péptido o equivalente a péptido que se selecciona, se pueden utilizar métodos, tales como por ejemplo el descrito por Sette y colaboradores, 1994, en combinación con análisis cuantitativos de fijación al MHC. Alternativamente, la inmunogenicidad del péptido seleccionado se puede ensayar a través de inducción in vi tro de CTL mediante métodos conocidos (tal como se describen más adelante en esta memoria para la inducción ex vivo de CTL) . El principio del método realizado en varias etapas para la elección de péptidos, que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria celular, está descrito en el documento de solicitud de patente PCT WO 97/30721, a cuya divulgación se hace referencia expresamente por la presente. Una estrategia general para la obtención de péptidos inmunógenos eficientes, que es apropiada dentro del marco de la presente invención, fue! descrita además por Schweighoffer, 1997. En lugar de utilizar los péptidos originales, que se adaptan dentro del surco de fijación de moléculas del MHC- I o MHC-II, es decir péptidos, que se derivan inalteradamente de C42, con ayuda de los requisitos mínimos en lo referente a las posiciones de anclaje y a la longitud, que se indican sobre la base de la secuencia original del péptido, se pueden llevar a cabo variaciones, siempre y cuando, que mediante estas variaciones no sólo no se perjudique, sino que se refuerce preferiblemente, la inmunogenicidad efectiva del péptido, que se compone de su afinidad para la fijación a la molécula del MHC y su capacidad para estimular receptores de células T. En este caso se utilizan por lo tanto péptidos artificiales o equivalentes a tales péptidos, que se han desarrollado correspondientemente a los requisitos de la capacidad de fijación a una molécula de MHC. Los péptidos modificados de tal manera son designados como "péptidos heterocíclicos". Éstos se pueden obtener de acuerdo con los siguientes métodos: t&iá& á ÉSsásk En primer lugar se desarrollan los epítopes para ligandos del MHC-I o MHC-II o la variación de éstos, por ejemplo de acuerdo con el principio descrito por Rammensee y colaboradores, 1995. La longitud del péptido corresponde, en el caso de su sintonización a moléculas del MHC-I, preferiblemente a una secuencie mínima de 8 a 10 aminoácidos con los necesarios aminoácidos de anclaje. Eventualmente, el péptido puede también ser prolongado en los extremos terminales de C y/o de N, siempre y cuando, que esta prolongación no perjudique a la capacidad de fijación a la molécula del MHC o que el péptido prolongado pueda ser tratado celularmente en cuanto a la secuencia mínima . Los péptidos modificados son comprobados después de ello en cuanto a su reconocimiento por TILs ( "tumor- infil tra ting lymphocytes " = linfocitos que se infiltran en tumores) , en cuanto a inducción de CTL así como en cuanto a fijación al MHC e inmunogenicidad aumentadas, tal como ha sido descrito por Parkhurst y colaboradores, 1996, y por Becker y colaboradores, 1997. Otro método apropiado dentro del marco de la presente invención para el hallazgo de péptidos con inmunogenicidad más fuerte que la de los péptidos de C42 naturales, consiste en el escrutinio de bibliotecas de péptidos con CTLs, que reconocen a los péptidos de C42 que se presentan por naturaleza en tumores, tal como ha sido descrito por Blake y colaboradores, 1996; en este contexto se propone la utilización de bibliotecas combinatorias de péptidos, con el fin de concebir moléculas, que imiten a los epítopes para tumores reconocidos por CTLs restringidos por el MHC-I. El polipéptido de C42 de la presente invención o los fragmentos o péptidos inmunógenos derivados de ellos, se pueden producir por vía recombinante o mediante síntesis de péptidos, tal como se ha descrito en el documento WO 96/10413, a cuya divulgación se hace referencia por la presente. Para la preparación por vía recombinante, la correspondiente molécula de ADN se introduce de acuerdo con métodos clásicos en un vector de expresión, se transfecta en una apropiada célula hospedante, la célula hospedante se cultiva en condiciones apropiadas de expresión y la proteína se purifica. Para la síntesis química de péptidos de C42, se pueden utilizar métodos habituales, por ejemplo usando un sintetizador automático de péptidos adquirible en el comercio . Alternativamente a los péptidos de C42 naturales ?Já..?? t¡ », ? ^ ?já m r¿lkiir!U,.¿rrí,l.. mms.Sit ¿n.* ¿M2&*»mM^* a los péptidos heterocíclicos, se pueden utilizar sustancias que simulen a tales péptidos, por ejemplo "miméticos de péptidos" o "péptidos retro-inversos". Para el ensayo de estas moléculas en lo referente a la utilización terapéutica en una vacuna contra tumores, se aplican los mismos métodos que anteriormente para los péptidos naturales C42 o los equivalentes a tales péptidos de C42. El TAA con la denominación C42 de acuerdo con La presente invención y los fragmentos de proteínas, péptidos o equivalentes a péptidos o bien miméticos de péptidos que se derivan de ellos, se pueden emplear en la terapia de los cánceres, por ejemplo con el fin de inducir una respuesta inmunitaria frente a células de tumores, que expresan los correspondientes determinantes de antígenos. Preferiblemente, son utilizados para la terapia de tumores positivos para C42, especialmente en los casos de carcinomas de pulmón, mama y esófago . La respuesta inmunitaria en forma de una inducción de CTLs puede ser producida m vivo o ex vivo . Para la inducción in vivo de CTLs se administra una composición farmacéutica, que como componente activo contiene el C42 de TAA o fragmentos o péptidos derivados de ellos, a un paciente que sufre de una enfermedad de tumor asociada con el TAA, debiendo la cantidad de TAA (péptido) ser suficiente para conseguir una respuesta eficaz de CTL al tumor que es portador de los antígenos. La invención concierne por consiguiente en otro aspecto adicional a una composición farmacéutica para la administración por vía parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, la composición sirve para la administración por vía parenteral, por ejemplo para la aplicación por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. Los TAAs/péptidos de C42 son disueltos o suspendidos en un soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. La composición puede contener además de ello sustancias coadyuvantes usuales, tales como tampones, etc. Los TAAs/péptidos de C42 se pueden utilizar a solas o en combinación con adyuvantes, por ejemplo el adyuvante incompleto de Freund, saponinas, sales de aluminio o, en una forma preferida de ejecución, policationes tales como poliarginina o polilisina. Los péptidos se pueden fijar también a componentes, que ayuden a la inducción de CTL o a la activación de CTL, por ejemplo a péptidos T cooperantes, lípidos o liposomas, o se administran en común con estas sustancias y/o en común con sustancias estimuladoras de la inmunidad, pr j s^vT o it c zir. e 't?-2, JFN-?) . Métodos y ...... ^. -- mir^.tit^ifa»..^!.A.»«ti^J^^ltfan.tÍt«¿a formulaciones,, que se adecúan para la preparación y administración de la composición farmacéutica conforme a la invención, se describen en los documentos WO 95/04542 y WO 97/30721, a cuya divulgación se hace referencia por la presente. Los fragmentos de C42 o péptidos de C42 se pueden utilizar también para provocar ex vivo una respuesta de CTL. Una respuesta ex vivo de CTL a un tumor, que expresa C42, es inducida incubando las células precursoras de CTL conjuntamente con APCs y péptidos de C42 o la proteína de C42. Luego se deja que los CTLs activados se expandan, después de lo cual son administrados de nuevo al paciente. Alternativamente, se pueden cargar las APCs con péptidos de C42, lo cual puede conducir a una activación eficiente de reacciones inmunitarias celulares contra tumores positivos para C42 (Mayordomo y colaboradores, 1995; Zitvogel y colaboradores, 1996) . Un método apropiado para cargar péptidos en células, por ejemplo células dendríticas, es divulgado en el documento WO 97/19169. En una forma de ejecución de la invención, se utiliza una combinación de varios diferentes péptidos de C42 o equivalentes a péptidos de C42. En una forma adicional de realización se combinan péptidos de C42 con péptidos que se derivan de otros TAAs. La elección de péptidos para tales combinaciones se efectúa en atención a la clasificación de diferentes tipos de MHC, para cubrir una población lo más amplia que sea posible de pacientes y/o se adapta a un espectro de indicaciones lo más amplio que sea posible, combinando péptidos de varios diferentes antígenos de tumores. El número de los péptidos en una composición farmacéutica puede fluctuar a lo largo de un amplio margen, típicamente contiene una vacuna aplicable químicamente de 1 a 15, preferible¡mente de 3 a 10 diferentes péptidos. Los péptidos conformes a la invención se pueden emplear también como reactivos para el diagnóstico. Por ejemplo, los péptidos se pueden utilizar para ensayar la reacción de un paciente a la respuesta in unitaria humoral o celular provocada por el péptido inmunógeno. Con ello existe la posibilidad de mejorar un protocolo de tratamiento. Por ejemplo, dependiendo de la forma de presentación (péptido, proteína total o vacuna de ADN) del TAA se puede investigar el aumento de células T precursoras en los PBLs, que presentan una reactividad contra el epítope definido para el péptido (Robbins y Kawakami, 1996, así como las referencias citadas allí) . Además, los péptidos o la proteína total o los anticuerpos dirigidos contra el TAA se pueden utilizar para predecir el riesgo para un paciente de enfermar con un tumor asociado a C42 o para caracterizar la evolución de la enfermedad de un tumor positivo para C42 (por ejemplo mediante análisis inmuno-histoquímicos de tumores primarios y metástasis) . Una estrategia de este tipo ya se ha manifestado como satisfactoria varias veces, por ejemplo la detección del receptor de estrógenos como fundamento de decisión para la endocrino-terapia en el caso de un cáncer de mama; de c-erbB-2 como marcador relevante en el caso del pronóstico y la evolución de la terapia en el caso de un cáncer de mama (Ravaioli colaboradores, 1998; Revillion y colaboradores, 1998); de PSMA { "prosta te specific membrane an tigen " = antígeno membranal específico para próstata) como marcador para células epiteliales del carcinoma de próstata en el suero o mediante empleo de un anticuerpo monoclonal contra PSMA marcado con ?nLn en el caso de la inmuno-escintografía en cuanto a carcinoma de próstata (Murphy y colaboradores, 1998 y referencias incluidas); de CEA ( "carcinoembryoni c an tigen " = antígeno carcino-embriónico) como marcador serológico para el pronóstico y la evolución en el caso de un paciente del carcinoma colorrectal (Jessup y Loda, 1998). La presente invención concierne en otro aspecto a moléculas aisladas de ADN, que codifican una proteína con las HAAJ-AAJ.. propiedades inmunógenas de C42 o fragmentos de ésta, En un aspecto adicional, la presente invención concierne a una molécula aislada de ADN, que contiene un polinucléotido con la secuencia representada en SEC ID NO: 1 o que contiene un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia representada en SEC ID NO: 1. Por "condiciones rigurosas" se entiende por ejemplo: incubar durante una noche a 65°C - 68°C con 6xSSC (lxSSC = NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , 5x solución de Denhardt, SDS (dodecil-sulfato de sodio) al 0.2%, ADN de esperma de salmón 50 µg/ml, a continuación de ello lavar dos veces durante 30 min con 2xSSC, SDS al 0.1% a 65°C, una vez durante 30 min con 0.2xSSC, SDS al 0.1% a 65°C y eventualmente enjuagado final con O.lxSSC, SDS al 0.1% a 65°C, o condiciones equivalentes. Las moléculas de ADN conformes a la invención o fragmentos de ellas codifican (poli) péptidos con la denominación C42 que contiene la secuencia de aminoácidos que se representa en SEC ID NO: 2, o fragmentos de proteínas o péptidos que se derivan de ella; con ello se abarcan al mismo tiempo moléculas de ADN, que por causa de la degeneración del código genético presentan desviaciones con respecto de la secuencia representada en SEC ID N0:1. La invención concierne también a moléculas de ADN, que por mutación conducen a un intercambio de aminoácidos en la secuencia de proteínas representada en SEC ID NO: 2, siempre y cuando que codifiquen un derivado de C42 o bien fragmentos o péptidos con las propiedades inmunógenas deseadas para la aplicación como vacuna de tumores. Las moléculas de ADN de C42 de la presente invención o los correspondientes ARNs, que también constituyen objeto de la presente invención, se emplean, al igual que los (poli) péptidos codificados por ellos, para la inmunoterapia de padecimientos de cáncer. En una forma de realización de la invención, se utilizan moléculas de ADN que codifican polipéptidos de C42 naturales. Alternativamente al ADNc de C42 natural o fragmentos de éste, se pueden utilizar derivados modificados. Éstos comprenden secuencias con modificaciones que codifican una proteína (o un fragmento de ella) o péptidos con más fuerte inmunogenicidad, siendo válidas para las modificaciones en el plano del ADN las mismas consideraciones que para los péptidos que antes se han descrito. Otro modo de la modificación es le agrupación yuxtapuesta de numerosas secuencias, que codifican péptidos inmunológicamente afc¿^ ...&¿ii. »^ é» »<áfc- relevantes, a modo de una sarta de perlas { "string-of -beads " ; Toes y colaboradores, 1997) . Las secuencias pueden ser modificadas también por adosamiento de elementos auxiliares, por ejemplo funciones que garantizan una entrega y un tratamiento más eficientes del inmunógeno (Wu y colaboradores, 1995). Por ejemplo, mediante adosamiento de una secuencia de localización en el retículo endoplas ático ( "ER targetting sequence ") se pueden aumentar el tratamiento y por consiguiente la presentación y a fin de cuentas la inmunogenicidad del antígeno. La presente invención concierne en otro aspecto a una molécula de ADN recombinante, que contiene el ADN de C42. Las moléculas de ADN de C42 de la presente invención, se pueden administrar, preferiblemente en forma recombinante, como plásmidos, directamente o como constituyente de un virus, o una bacteria, recombmante. En principio, se puede aplicar para el ADN de C42 cualquier método terapéutico génico para la inmunoterapia de un cáncer a base de un ADN ("vacuna de ADN"), y concretamente tanto in vivo como también ex vivo . Ejemplos para la administración in vivo son la inyección directa de ADN "desnudo", o bien por vía intramuscular o mediante una pistola de genes { "gene gun ") de Í -IÁ.J. j..l ,fct¿.fc*. . te á i . i>. ,.í.»im& j- ^^a^mjJaiiaii adkit^aaifciiaAafe amiÉ. la que se ha | mostrado que conduce a la formación de CTLs contra antígenos de tumores. Ejemplos de organismos recombinantes son virus de Vaccinia, adenovirus o Li steria monoci togenes (una visión de conjunto fue dada por Coulie en 1997). Además, se pueden utilizar soportes sintéticos para ácidos nucleicos, tales como lípidos catiónicos, microesferas, microbolitas o liposomas para la administración in vivo de moléculas de ácidos nucleicos, que codifican un péptido C42. Similarmente a como para los péptidos, se pueden administrar conjuntamente diferentes sustancias coadyuvantes que refuercen la respuesta inmunitaria, por ejemplo citocinas, o bien en forma de proteínas o de plásmidos que las codifican. La aplicación puede ser combinada eventualmente con métodos físicos, por ejemplo electroporación. Un ejemplo de la administración ex vivo es la transfección de células dendríticas, tal como ha sido descrito por Tuting, 1997, u otras APCs, que pasan a aplicarse como vacuna celular contra el cáncer. La presente invención concierne por consiguiente en otro aspecto a la utilización de células, que expresan C42, o bien de por sí mismas o en forma eventualmente modificada, después de transfección con la secuencia correspondientemente codificadora, | para la preparación de una vacuna contra el cáncer . La invención concierne en un aspecto adicional a anticuerpos contra C42 o fragmentos de ellos. Los anticuerpos policlonales se pueden obtener de un modo habitual por inmunización de animales, especialmente conejos, mediante inyección del antígeno o fragmentos de ellos, y posterior purificación de la inmunoglobulina. Los anticuerpos anti-C42 monoclonales se pueden obtener de acuerdo con protocolos clásicos, según el principio descrito por Kóhler y Milstein, 1975, inmunizando a animales, especialmente a ratones, a continuación inmortalizando células productoras de anticuerpos de los animales inmunizados, por ejemplo por fusión con células de mieloma, y escrutando el material sobrenadante de los hibridomas obtenidos mediante análisis clásicos inmunológicos en cuanto a anticuerpos anti-C42 monoclonales. Para el empleo terapéutico o diagnóstico en seres humanos, estos anticuerpos animales pueden ser quimerizados (Neuberger y colaboradores, 1984, Boulianne y colaboradores, 1984) o humanizados (Riechmann y colaboradores, 1988, Graziano y colaboradores, 1995) eventualmente de un modo habitual. Los anticuerpos anti-C42 monoclonales humanos pueden ser obtenidos también por las denominadas "bibliotecas de presentación visual de fagos" = "Phage Display Librarles " (Winter y colaboradores, 1994, Griffiths y colaboradores, 1994, Kruif y colaboradores 1995, Me Guiness y colaboradores, 1996) y mediante animales transgénicos (Brúggemann y colaboradores, 1996, Jakobovits y colaboradores, 1995) . Los anticuerpos anti-C42 conformes a la invención se pueden emplear en análisis in uno-histoquímicos para finalidades de diagnóstico. En un aspecto adicional, la invención concierne a la utilización de anticuerpos específicos para C42, a fin de llevar selectivamente a cualesquiera sustancias deseadas junto a o dentro de un tumor, que expresa C42. Ejemplos de tales sustancias son agentes citotóxicos o núclidos radiactivos, cuyo efecto consiste en dañar al tumor en sus cercanías. Por causa de la expresión de C42 específica para un tumor, no son de esperar en tales casos efectos colaterales de ningún tipo o sólo escasos efectos colaterales. En un aspecto adicional, con ayuda de anticuerpos para C42 se pueden aprovechar para la visibilización de tumores sustancias que expresan C42. Esto es útil para el diagnóstico y para la valoración de la evolución de la terapia. Aplicaciones terapéuticas y diagnósticas ¡de anticuerpos, que entran en cuestión para anticuerpos anti-C42, están descritas en el documento WO 95/33771. El TAA con la denominación de C42 de acuerdo con la presente invención y los fragmentos de proteínas, péptidos o equivalentes a péptidos o miméticos de péptidos que se derivan de ellos, se pueden emplear en la terapia del cáncer, por ejemplo con el fin de inducir una respuesta inmunitaria contra células de tumores, que expresan los correspondientes determinantes de antígenos. Preferiblemente, son utilizados para la terapia de tumores positivos para C42, especialmente en los casos de carcinomas de pulmón, mama y esófago.

Breve Descripción de las Figuras: Figura 1: Transcripción de C42 en tejidos de tumores y tejidos normales: RT-PCR semicuantitativa de ARN procedente de diferentes tejidos Figuras 2A y 2B: Análisis por transferencia Northern de C42 en tejidos de tumores y normales Figura 3: Ensayo de fijación de cinco péptidos de CTL de C42 a HLA-A*0201 .áAi tm?ilLl*-* ** *-«-**- . «a»..?.,..M,.Aa8 l J.. aAAJta&fj Ejemplo 1: Análisis de la diferencia representativa ( "Representa tional Difference Análisis " ; RDA) de una agrupación de diferentes carcinomas epiteliales en escamas de pulmones frente a una agrupación de 11 tejidos normales. Biopsias de diferentes carcinomas de pulmones humanos del tipo SCC ( "Squamous Cell Carcinoma " = carcinoma de células escamosas, carcinoma epitelial en escamas) inmediatamente después de la extracción quirúrgica se congelaron bruscamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°. Para el aislamiento del ARN se produjeron secciones en serie de 20 µm a -20° en un crio-micrótomo (Jung CM1800, Leica) y se disolvieron directamente en una mezcla de tiocianato de guanidinio 4 M y ß-mercaptoetanol al 1%, con el fin de aislar el ARN. Estas muestras se sometieron a una ultracentrifugación a través de un gradiente de CsCl (Sambrook, 1989) . Algunas secciones representativas de tejidos (de 5 µm) se fijaron sobre un portaobjetos para el hallazgo histológico y se tiñeron con hematoxilina de Harris (Sigma) y eosina. Esto sirvió para poner a disposición para la obtención del ARN un tejido de tumor lo más homogéneo que sea posible como material de partida. Sólo se elaboraron ulteriormente | las muestras que fueron clasificadas como de SCC. Procediendo de 110 µg del ARN total de 5 diferentes carcinomas epiteliales en escamas de pulmones, se aisló el ARN pol?-A(+) mediante el estuche PolyAtract Kit (Promega) de acuerdo con la prescripción del fabricante (agrupación de SCC) . Partiendo de esta agrupación de SCC y de una agrupación a base de 2.5 µg de ARN poli-A ( + ) de 11 tejidos normales (Clontech) de médula ósea, corazón, riñon, hígado, pulmón, páncreas, músculo del esqueleto, bazo, timo, intestino delgado y estómago, se llevó a cabo un RDA (Diatchenko y colaboradores; Hubank y Schatz) utilizando el estuche PCR-select™ Kit (Clontech, Palo Alto) correspondientemente al protocolo del fabricante; en este caso se utilizó el ARN de la agrupación de SCC ("tester = ensayador") y de tejido normal ( "driver = conductor") correspondientemente al protocolo del fabricante. Al contrario que el protocolo original, después de la síntesis de ADNc bicatenario mediante un oligo-dT, se cortó el ADNc con 6 enzimas de restricción EcoRV, Nael , Nrul , Seal (Promega), Sspl , Stul (TaKaRa) en el tampón A de Promega durante 2 horas a 37°C y después de haber aumentado la concentración de NaCl a 150 M durante otras 2 oiaa a _>, . E^ '^ ieo ae esta mezcla de 6 diferentes enzimas de restricción permitió la generación de fragmentos de ADNc con una longitud de aproximadamente 800 pb, que pasaron a emplearse para el análisis de la diferencia representativa . Iguales partes del "ADNc de ensayador" se ligaron con los adaptadores A o B y a continuación se hibridaron por separado a 68 °C con un exceso de "ADNc de conductor". Después de ello se reunieron las dos tandas y se sometieron a una segunda hibridación con "ADNc de conductor" desnaturalizado de nueva aportación. Los ADNsc específicos para "ensayadores" enriquecidos se amplificaron exponencialmente a 72 °C a continuación por medio de una PCR con cebadores del estuche, específicos para los adaptadores A o B, con un tiempo de elongación (alargamiento) de 2 minutos, en 27 ciclos (10'' a 94°C, 30'' a 66°C, 2' a 72°C). Para un enriquecimiento adicional, una parte alícuota de esta reacción se sometió a 72°C a una segunda PCR con cebadores específicos del estuche trasladados ( "nested") hacia dentro con un tiempo de alargamiento de 2 minutos, en 10 ciclos (10'' a 94°C, 30'' a 66°C, 2' a 72°C) . El producto resultante de esta reacción se ligó en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y a continuación se transfectó en E. coli competentes (OneShot®, Invitrogen) . Se obtuvieron 4.748 transformantes y se cultivaron a 37 °C ké i*iy ii*L durante 48 horas en bloques de 96 pocilios en el medio LB-A p. A continuación, partes alícuotas de 5 µl de las suspensiones de E. coli en 500 µl de tampón TE se calentaron a 100°C durante 10 minutos y 1.5 µl de éstas se utilizaron como carga previa para una PCR, en la que el inserto del vector se amplificó con cebadores flanqueadores (SEC ID NO: 9 y 10), en 35 ciclos (1' a 94°C, 1' a 55°C, 2' a 72°C). Los productos de PCR se detectaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. 17 µl del respectivo producto de PCR se recogieron en un volumen final de 252 µl de 6xSSC y se inmovilizaron en 3 réplicas sobre membranas de nylon equilibradas (Hybond-N, Amersham) , correspondientemente a los métodos clásicos para la producción de borrones y puntos de ADN (DNA-Dot-Blots) (Sambrook, 1989). Los cultivos de bacterias remanentes se almacenaron como cultivos originales en glicerol a -80°C. Se obtuvo una biblioteca por substracción de ADNc a base de 4748 clones individuales, que se presentaban como cultivos originales de E. coli en glicerol, cuyos productos inmovilizados de PCR se aplicaron sobre membranas de nylon y cuya longitud de inserto era conocida por la electroforesis en gel de agarosa. En tal caso se pudo comprobar, tal como se it.?Í?i-,i?Mi 'if ..*. HtLbm.. m esperaba, una| longitud media de los fragmentos insertados de ADNc de aproximadamente 800 pb.

Ejemplo 2: Selección de genes de "tumor" y de "tumor-testículo" por hibridación diferencial de la biblioteca por substracción de ADNc Una biblioteca de ADNc específica para testículo de ser humano ("Human Testis-Specific PCR-Select® cDNA"; Clontech, Palo Alto) se amplificó correspondientemente a los datos del fabricante por PCR mediante 11-ciclos (10'' a 94°C, 30'' a 66°C, 1.5' a 72°C) . Partes alícuotas se marcaron con el sistema de marcación de ADN "RTS RadPrime DNA Labeling System" (GibcoBRL) con [a-32P] -dCTP (NEN, Boston) de acuerdo con los datos del fabricante y se utilizaron de acuerdo con una prescripción clásica (Sambrook, 1989) para la hibridación en condiciones rigurosas (a 68°C) con los borrones y puntos de ADN descritos en el Ejemplo 1. Los clones que se hibridan con el ADNc "PCR-Select® específico para testículo de ser humano", se visualizaron mediante una autorradiografla (película Xomat DR, de Kodak). El segundo conjunto de borrones y puntos de ADN se híbrido como antes se ha descrito con una sonda marcada de una agrupación de ADNc de SCC. El Aái »m. r*..mí ÍI¡í--ííí&ltlz s„_„ jutUiSH?j *MM tercer conjuntjo de borrones y puntos de ADN se híbrido de igual manera con una sonda de una agrupación de ADNc de tejidos normales a base de 15 tejidos normales (médula ósea, corazón, riñon, hígado, pulmón. páncreas, músculo del esqueleto, bazo, timo, intestino delgado, estómago, ganglios linfáticos, glándula mamaria, próstata y tráquea). La comparación de las imágenes { Image) y de las autorradiografías o de los cómputos netos (Net tocoun' ts) de las motas hibridadas en cada caso diferenciadamente de un conjunto permitió la elección de clones, cuyos ARNm son sobreexpresados solamente en un tumor a diferencia de un tejido normal o por el contrario son transcriptos tanto en un tumor como también en un testículo (como representantes de un tejido inmunitariamente privilegiado). Los primeros son candidatos a la clase de los antígenos de "tumor" y los últimos lo son a la clase de los antígenos de "tumor-testículo" .

Ejemplo 3: Secuenciación de ADN y anotación de candidatos de antígenos de "tumor" y de "tumor-testículo" El ADN de plásmido de 234 clones, que se habían seleccionado basándose en los resultados obtenidos en el Ú^Mé?^i?? ..^¿imtmimWfefc.mm..^^S^ti??JuiM M. .Ír «¿¿S,, ÍJ*¿?h i.-•-*-<-<*^fcw*Aj*«¿J^i«áÍ*aé¡Í iÜ ?? Ejemplo 2, se aisló de modo correspondiente a los datos del fabricante (QIAgen) y se secuenció de acuerdo con el método de Sanger en un aparato ABI-Prism. Las secuencias así determinadas se anotaron mediante una búsqueda BLAST-Search (National Center for Biotechnology Information = Centro Nacional para Información Biotecnológica) y se sometieron a comparaciones de bancos de datos de EST. Esto permitió la identificación de 198 genes conocidos y 36 genes desconocidos. Para estos últimos existen solamente entradas de EST. Para los 36 genes desconocidos se llevó a cabo una estimación del perfil de expresión; en este caso se comprobó el tejido de partida para la correspondiente biblioteca de ADNc para todas las ESTs existentes en los bancos de datos con una identidad de > 95% (BLAST) con respecto a la secuencia determinada experimentalmente. Se llevó a cabo una clasificación en i) tejido normal crítico, ii) tejido fetal, "prescindible" y privilegiado inmunitariamente y iii) tumores y líneas de células de tumores. Sobre la base de este "perfil virtual de ARNm" se seleccionaron 10 clones para un análisis experimental adicional.

Ejemplo 4: Análisis por transcripción de los clones candidatos en tejidos de tumores y normales Entre 2 y 5 µg de ARN total procedente de tejidos de tumores y normales se transcribieron inversamente de modo correspondiente a las recomendaciones del fabricante mediante un SuperScriptll (GibcoBRL) o AMV-RT (Promega) . Para cada muestra individual de ARN se llevó a cabo una segunda tanda sin transcriptasa inversa como testigo para la contaminación por ADN cromosomal. La calidad y la cantidad de los ADNsc se comprobó mediante PCR con cebadores específicos para ß-actina (SEC ID NO: 3 y 4) y cebadores específicos para GAPDH (SEC ID NO: 5 y 6) después de 30 y 35 ciclos (1' a 95°C, 1' a 55°C, 1' a 72°C) . Los 10 genes candidatos fueron analizados de modo análogo con cebadores en cada caso específicos. Los productos de PCR se comprobaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. En tal caso un candidato, que fue designado como "C42", después de 30 ciclos con cebadores específicos para C42 (SEC ID NO: 7 y 8) mostró un perfil de transcripción de tumor/testículo relativamente específico; (la RT-PCR semicuantitativa de ARN procedente de carcinoma de mama, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epitelial en escamas de pulmón, carcinoma de riñon, carcinoma de colon, corazón, pulmón, hígado, riñon, colon, bazo y testículo se representa en la rij ra 1) . Este clon de C42, que contiene 'un inserto de 549 pb, se sometió a continuación a un análisisj detallado.

Ejemplo 5: Perfil de transcripción de C42 en tejidos de tumores y normales Para el análisis por transferencia Northern, borrones Northern de tejido múltiple humano (MTN; Clontech, Palo Alto) y (Invitrogen) se hibridaron durante 2 h a 68°C con el producto de la PCR de C42, marcado con [a-32P]dCTP (NEN, Boston) , que tenía una longitud de 549 pb. La visualización se efectuó mediante una autorradiografía clásica (Hyperfilm, Amersham) . La Figura 2 muestra el resultado de este análisis: de 20 tejidos normales (de páncreas, médula adrenal, glándula tiroides, córtex adrenal, testículo, timo, intestino delgado, estómago, cerebro, corazón, músculo del esqueleto, colon, bazo, riñon, hígado, placenta, pulmón, leucocitos, bilis, esófago) y 4 tejidos de tumores (adenocarcinoma de la bilis y del estómago así como el carcinoma epitelial en escamas de esófago y de pulmón) . Para el C42 se muestra en los tejidos de tumor del carcinoma epitelial en escamas de esófago y de pulmón un prominente transcripto con una longitud de 4.4 kb. En tejidos normales jtoj&mm. *l*liu ~l?Í .t Xr tim. ^ra?? irírmk?k'- ^e^M''^'¡tSl^ sm se muestra solamente en el esófago un débil transcripto con una longitud de 4.4 kb . La pequeña intensidad de la señal permite aparecer como improbable una expresión mmunológicamente relevante. Otro transcripto de 3.5 kb, que posiblemente constituye una variante de empalme del transcripto de 4.4 kb o que se deriva de un gen homologo, se identificó también en ambos tumores, pero no en tejidos normales (Figura 2) . La presencia del TAA "C42" en el carcinoma epitelial en escamas de pulmón y de esófago esta en buena coincidencia con el material de partida originalmente empleado para el RDA (agrupación de 55 diferentes pacientes con carcinomas epiteliales en escamas de pulmón) y apunta a un TAA que debería ser específico para este tipo de carcinomas .

Ejemplo 6: Clonación del ADNc de C42 Para la clonación del ADNc de C42 de ser humano se procedió de la siguiente manera: una búsqueda BLAST proporcionó las siguientes ESTs solapadas con el inserto de ADNc de C42 con 549 pb, obtenido en el Ejemplo 4 ("fragmento original"): AA429919; AA430055; AA446075; AA430264; AA160879. Partiendo de la secuencia AA430055 se encontró con el extractor de EST en TigemNet (http: //gcg. tigem. ít/cgi- bin/uniestasS|.pl) un grupo de contigos (secuencias clonadas de nucleótidos que son contiguas) que se solapaba con el clon C42. El solapamiento del contigo y de la secuencia del fragmento original obtenido en el Ejemplo 4 con un tamaño de 549 pb (SEC ID NO: 19) se pudo verificar mediante amplificación por PCR con un cebador específico para C42 y con un cebador situado en el extremo 3' del contigo (SEC ID NO: 11 y 12) en el ADNc del tumor de pulmón. Con ayuda de las secuencias AA430246 y AA446075 que se solapan con el fragmento original de C42 se obtuvo un alargamiento en la dirección de 5' . Mediante dos PCA realizadas una tras de otra con el par de cebadores (SEO ID NO: 13 y 14) para la primera PCR y con el par de cebadores (SEC ID NO: 15 y 16) para la PCR "nested = trasladada", se amplificaron a partir de la biblioteca de ADNc de testículos de ser humano SuperScript® (GibcoBRL) otros fragmentos pertenecientes a C42 mediando utilización del estuche para PCR de ADNc Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) y el protocolo clásico allí descrito. Partiendo de esta nueva secuencia se pudieron encontrar otras tres entradas de EST pertenecientes a C42: AI493356; AA443218; y AA443258. El conocimiento de estas nuevas secuencias hizo posible de nuevo otras dos PCR realizadas una tras de otra secuencia arriba con el par de cebadores (SEC ID NO: 13 y 17) para la primera PCA y con el par de cebadores (SEC ID NO: 15 y 18) para la PCR "nested" trasladada hacia dentro. Con ello se pudieron clonar otros fragmentos de C42. Para el análisis de las secuencias, partes alícuotas de las tandas de PCR se ligaron directamente en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y a continuación se transformaron en el seno de E. coli competentes (OneShot®, Invitrogen) y se secuenciaron tal como antes se ha descrito. Mediante dos PCR' s realizadas una tras de otra con el par de cebadores SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 20 para la primera PCR y con el par de cebadores SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 21 para la PCR "nested" se amplificaron a partir de la biblioteca de ADNc de testículos de ser humano SuperScript® (GibcoBRL) otros fragmentos que pertenecían a C42 mediando utilización del estuche Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) y el protocolo clásico allí descrito. Con otros cebadores adicionales situados secuencia arriba no se pudieron identificar nuevos fragmentos pertenecientes a C42. Por lo tanto se puede partir del hecho de que se había identificado la secuencia de ARNm de "tamaño completo" de C42 (SEC ID NO: 1) con una longitud de 4077 nt (nucleótidos). Este resultado coincide con el reconocimiento de una banda de C42 en los MTN (Figura 2) con ütj Jaí - ijih|láifc^Uttg aproximadamente 4.4 kb. Por el complemento de una cola de poli A y de una imprecisión en la separación del ARNm en el MTN se puede llegar a diferencias en la longitud de la cadena de polinucleótidos secuenciada de C42 con la reconocida en el MTN. El ARNm posee un codón de iniciación en el nucleótido 564-566, que forma el comienzo de un ORF (cuadro de lectura abierto) continuo hasta el nucleótido 3.392, que codifica una proteína con una longitud de 943 aminoácidos (SEC ID NO: 2) . La secuencia de C42 muestra tanto en el plano de los nucleótidos como también en el de las proteínas una inequívoca homología con una familia de genes de proteínas de canales de Cl" activables por Ca2+, que se expresan en diferentes especies (parcialmente de modo muy específico para un tejido), representantes de esta familia han sido hasta ahora donados y caracterizados parcialmente; los dos genes de bovino bCLCA 1 ( "bovine Ca2+ -activa ted Cl~ channel - 1 " : Cunningham y colaboradores, 1995) y Lu-ECAM-1 ( "bovine l ung- endothelíal cell adhesión mol ecule-1 " ; Elble y colaboradores, 1997), el gen de ratón mCLCAl ( "murine Ca2+ -activa ted CJ" channel -1 ; Gandhi y colaboradores, 1998) y los dos genes humanos hCLCAl ("human Ca2+ -a ctiva ted Cl' channel -1 " ; Gruber y colaboradores, 1998) y hCLCA3 ( "human Ca2+ -a ctiva ted-Cl' channel -3" ; Gruber y colaboradores, 1999) . Todos los representantes de esta familia de proteínas presentan regiones transmembranales típicas y son cortados posteriormente a la traducción de acuerdo con el actual estado de los conocimientos, con la excepción del hCLCA3, para formar heterodímeros, siendo glicosilada la parte terminal de C (Elble y colaboradores, 1997) . El Lu-ECAM-1 bovino hace posible por ejemplo la fijación de metástasis en pulmones B16F10 del melanoma de ratón a células endoteliales (Zhu y colaboradores, 1992). Para comprobar la exactitud de la secuencia de nucleótidos se amplificaron y secuenciaron fragmentos solapados de C42 procedentes de un carcinoma epitelial en escamas y de testículo con los pares de cebadores SEC ID NO: 5 y 6, SEC ID NO:7 y 8, SEC ID NO: 9 y 10, SEC ID NO: 11 y 12, SEC ID NO: 13 y 14, SEC ID NO: 15 y 16, SEC ID NO: 17 y 18, SEC ID NO: 19 y 20, y secuenciados. La alineación de ambas secuencias no muestra ninguna diferencia -con excepción de una mutación tácita en la posición 2399 G ? A. La secuencia de C42 presenta las cinco regiones transmembranales hidrófobas que son típicas para la familia de proteínas (posiciones Nos. 222-252, 416-445, 553-574, 746-766 y 900-926 en SEC ID NO: 2), pero a diferencia de los otros representantes posee un extremo terminal de C que está constituido por aminoácidos fuertemente cargados.

Ejemplo 7: Potenciales péptidos de fijación al MHC en la región que codifica la parte terminal de C de C42 Potenciales epítopes para péptidos situados dentro de la región codificadora del fragmento terminal de C de C42 según la SEC ID NO: 2 se llevaron a cabo mediante los algoritmos descritos por Parker y colaboradores, 1994, tomando como base motivos conocidos (Rammensee y colaboradores, 1995) . Para los más importantes tipos de HLA, especialmente para los HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 y B*4403. se identificaron péptidos candidatos 9-meros, de los cuales es de esperar que se fijen a las correspondientes moléculas de HLA y por lo tanto constituyan epítopes de CTL inmunógenos; los péptidos determinados están enumerados en la Tabla 1. Por un modo análogo de proceder se pudieron determinar potenciales epítopes para péptidos para otros tipos de HLA o péptidos 8- y 10-meros.

Tabla 1 Candidatos a péptidos inmunógenos del fragmento terminal de C de C42 (742 aminoácidos! 7^^^ri?líáÍ.ÜÍ.¡&,ir?^.-^í.^.mlr.¿C.im¡ÍÍ,*-- ' • «^- .-.?-10¡.-lrSítr£.......Jt, .?r.. .-^. m. . continuación de Tabla 1 Ejemplo 8 Análisis de la carga de péptidos T2-A2 Este ensayo sirve para la identificación de péptidos, que se fijan a moléculas de HLA-A2 y por consiguiente constituyen epítopes potenciales para células T. En este caso, tal como se describe en el Ejemplo 7, se identificaron con algoritmos de predicción epítopes potenciales para C42 y se sintetizaron los péptidos (SEC ID NO: 90-101). Como testigo positivo se utilizó el epítope para el péptido HLA-A2 de la tirosinasa (SEC ID NO: 102), y como testigo negativo el epítope para HLA-A1 de MAGE3 (SEC ID NO: 103) . Los péptidos se disolvieron en DMSO (Sigma) en una concentración de 40 mg/ml y se diluyeron en PBS. Células T2 (Número de ATCC: CRL-1992) se volvieron a suspender en RPMI 1640 en una concentración de 2.5xl0e6/ml y se proveyeron de 10 µg/ml ß2-microglobulina (ICN). De éstos se sembraron 200 µl/pocillo en una placa de 96 pocilios y se cargaron en una serie de diluciones con 0 - 320 µg/ml de péptido. Después de una incubación durante 16 h a 37°C se midió en FACS (Becton- Dickinson) la cantidad de complejo estable de péptido-HLA-ß2- microglobulina mediante un anticuerpo anti-HLA, que a su vez es reconocido por un segundo anticuerpo R0480 (DAKO) (Figura 3) . La magnitud del desplazamiento de la fluorescencia da información acerca de la cantidad del complejo estabilizado de péptido-HLA-ß2microglobulina sobre la superficie celular. El comportamiento de cinco péptidos C42-CTL, que se habían seleccionado entre 12 C42-CTL, conforme al ensayo antes descrito, se representa en la Figura 3. En este caso los péptidos C42-5, C42-6, C42-8 y C42-11 (SEC ID NO: 94, 95, 97 y 100), muestran fijación a HLA-A 0201. Éstos constituyen por consiguiente buenos candidatos a epítopes para péptidos específicos para células T. sÁ?M?m? .- "' •"»»•-*» "tite i?á*, Bibliografía Becker, D., K'uhn, U., Lempertz, U., Enk, A., Saloga, J. , y Knop, J. (1997), J. Immunol. Methods 203, 171-180.

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LISTADO DE SECUENCIA <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Antigqno (C42) asociado a tumores <130> 12_208pct <140> <141> <160> 103 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4077 <212> ADN <213> Heno sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(563) <220> <221> CDS <222> (564) .. (3392) <220> <221> 3'OTR <222> (3394).. (4077) <400> 1 tccgctgacc saagggctgt agggactggg ctgsagaatg gatttctaaa tcttcaaaat 60 aaacaggcaa ggaaatcttg caacaaatga aaaatgactt gagggcagta gaaagta tt 120 gtgccaactg atggaggagg ttatgaaaaa tgaggagagg aaaatcacta tagacttctg 180 tgxttctact gcaagtggat tgaacagtcc agatatactg atttccagcc catatttcct 240 gcttttaagc tcctttggtc ttatttccct cttctttctg aaaagttata aaatgaatga 300 agggcagaat gtttcttgcc caaccatgat tcaggaggca gctcagccac agaaeaggcá 360 agtgtagcat: tgcctggagg aaaaggactt gtagaggcag gtcccagatg gatccacccc 420 agact ttca aagaagacac ctccttcatc ttgtgttcta aaaccttgca agttcaggaa 480 gaaaccatct geatecatat tgaaaacctg acacaatgta tgcagcaggc tcagtgtgag 540 tgaactggag gcttctctac aac atg acc caá agg age att gea ggt ect att 593 Met Thr Gln Arg Ser lie Ala Gly Pro He 1 5 10 iß?? tiü&ttáiüMÉ ¿ .,A* tgc aac ctg aag ttt gtg act ctc ctg gtt gcc tta agt tea gaa ctc 641 Cys Asn Leu Lys Phe Val Thr Leu Leu Val Ala Leu Ser Ser Glu Leu 15 20 25 cea tte ctg gga gct gga gta cag ctt caá gac aat ggg tat aat gga 6T9 Pro Phe Leu Gly Ala Gly Val Gln Leu Gln Asp Asn Gly Tyr Asn Gly 30 35 40 ttg ctc att gea att aat ect cag gta ect gag aat cag aac ctc ate 737 Leu Leu lie Ala He Asn Pro Gln Val Pro Glu Asn Gln Asn Leu He 45 50 55 tea aac att aag gaa atg ata act gaa gct tea ttt tac cta ttt aat 785 Ser A=n He Lys Glu Met He Thr Glu Ala Ser Phe Tyr Leu Phe Asn 60 65 70 gct aec aag aga aga gta ttt tte aga aat ata aag att tta ata ect B33 Ala Thr Lys Arg Arg Val Phe Phe Arg Asn He Lys He Leu He Pro 75 80 85 90 gcc acá tgg aaa gct aat aat aac age aaa ata aaa caá gaa tea tat B81 Ala Thr Trp Lys Ala Asn Asn Asn Ser Lys He Lys Gln Glu Ser Tyr 95 100 105 gaa aag gea aat gtc ata gtg act gac tgg tat ggg gea cat gga gat 929 Glu Lys Ala Asn Val He Val Thr Asp Trp Tyr Gly Ala His Gly Asp 110 115 120 gat cea tac acc cta caá tac aga ggg tgt gga aaa gag gga aaa tac 977 Asp Pro Tyr Thr Leu Gln Tyr Arg Gly Cys Gly Lys Glu Gly Lys Tyr 125 130 135 att cat tte acá ect aat tte cta ctg aat gat aac tta acá gct ggc 1025 He His Phe Thr Pro Asn Phe Leu Leu Asn Asp Asn Leu Thr Ala Gly 140 145 150 tac gga tea cga ggc cga gtg ttt gtc cat gaa tgg gcc cae ctc cgt 1073 Tyr Gly Ser Arg Gly Arg Val Phe Val His Glu Trp Ala His Leu Arg 155 160 165 170 tgg ggt gtg tte gat gag tat aac aat gac aaa ect tte tac ata aat 1121 Trp Gly Val Phe Asp Glu Tyr Asn ñsn Asp Lys Pro Phe Tyr He Asn 175 180 185 ggg caá aat caá att aaa gtg acá agg tgt tea tet gac ate acá ggc 1169 Gly Gln Asn Gln He Lys Val Thr Arg Cys Ser Ser Asp He Thr Gly 190 195 200 att ttt gtg tgt gaa aaa ggt ect tgc ccc caá gaa aac tgt att att 1217 He Phe Val Cys Glu Lys Gly Pro Cys Pro Gln Glu Asn Cys He He 205 210 215 agt aag ctt ttt aaa gaa gga tgc acc ttt ate tac aat age acc caá 1265 Ser Lys Leu Phe Lys Glu Gly Cys Thr Phe He Tyr Asn Ser Thr Glp 220 225 230 aat gea act gea tea ata atg tte atg caá agt tta tet tet gtg gtt 1313 Asn Ala Thr Ala Ser He Met Phe Met Gln Ser Leu Ser Ser Val Val 235 240 2.45 250 gaa ttt tgt aat gea agt acc cae aac caá gaa gea cea aac cta cag 1361 Glu Phe Cys Asn Ala Ser Thr His Asn Gln Glu Ala Pro Asn Leu Gln 255 260 265 aac cag atg tgc age ctc aga agt gea tgg gat gta ate acá gac tet 1409 Asn Gln Met Cys Ser Leu Arg Ser Ala Trp Asp Val He Thr Asp Ser 270 275 280 gct gac ttt cae cae age ttt ccc atg aat ggg act gag ctt cea ect 1457 Ala Asp Phe His His Ser Phe Pro Met Asn Gly Thr Glu Leu Pro Pro 285 290 295 ect ccc acá tte teg ctt gta cag gct ggt gac aaa gtg gtc tgt tta 1505 Pro Pro Thr Phe Ser Leu Val Gln Ala Gly Asp Lys Val Val Cys Leu 300 305 310 gtg ctg gat gtg tec age aag atg gea gag gct gac aga ctc ctt caá 1553 Val Leu Asp Val Ser Ser Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Leu Leu Gln 315 320 325 330 cta caá caá gcc gea gaa ttt tat ttg atg cag att gtt gaa att cat 1601 Leu Gln Gln Ala Ala Glu Phe Tyr Leu Met Gln He Val Glu He His 335 340 345 acc tte gtg ggc att gcc agt tte gac age aaa gga gag ate aga gcc 1649 Thr Phe Val Gly He Ala Ser Phe Asp Ser Lys Gly Glu He Arg Ala 350 355 360 cag cta cae ca att aac age aat gat gat cga aag ttg ctg 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tet gga act gga gac att 2033 Ser Met He Asp Ala Phe Ser Arg He Ser Ser Gly Thr Gly Asp He 475 480 485 490 tte cag caá cat att cag ctt gaa agt acá ggt gaa aat gtc aaa ect 2081 Phe Gln Gln His He Gln Leu Glu Ser Thr Gly Glu Asn Val Lys Pro 495 500 505 cae cat ca ttg aaa aac acá gtg act gtg gat aat _act gtg ggc aac 2129 His His Gln Leu Lys Asn Thr Val Thr Val Asp Asn Thr Val Gly Asn 510 515 520 gac act atg ttt cta gtt aeg tgg cag gcc agt ggt ect ect gag att 2177 Asp Thr Met Phe Leu Val Thr Trp Gln Ala Ser Gly Pro Pro Glu He • 525 530 535 ata tta ttt gat ect gat gga cga aaa tac tac acá aat aat ttt ate 2225 He Leu Phe Asp Pro Asp Gly Arg Lys Tyr Tyr Thr Asn Asn Phe He 540 545 550 acc aat cta act ttt cgg acá gct agt ctt tgg att cea gga acá gct 2273 Thr Asn Leu Thr Phe Arg Thr Ala Ser Leu Trp He Pro Gly Thr Ala 555 560 565 570 aag ect ggg cae tgg act tac acc ctg aac aat acc cat cat tet ctg 2321 Lys Pro Gly His Trp Thr Tyr Thr Leu Asn Asn Thr His His Ser Leu 575 580 585 caá gcc ctg aaa gtg acá gtg acc tet cgt gcc tec aac tea gct gtg 2369 Gln Ala Leu Lys Val Thr Val Thr Ser Arg Ala Ser Asn Ser Ala Val 590 595 600 ccc cea gcc act gtg gaa gcc ttt gtg gag aga gac age ctc cat ttt 2417 Pro Pro Ala Thr Val Glu Ala Phe Val Glu Arg Asp Ser Leu His Phe 605 610 615 ect cat ect gtg atg att tat gcc aat gtg aaa cag gga ttt tat ccc 2465 Pro His Pro Val Met He Tyr Ala Asn Val Lys Gln Gly Phe Tyr Pro 620 • 625 630 att ctt aat gcc act gtc act gcc acá gtt gag cea gag act gga gat 2513 He Leu Asn Ala Thr Val Thr Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Gly Asp 635 640 645 650 ect gtt aeg ctg aga ctc ctt gat gat gga gea ggt gct gat gtt ata 2561 Pro Val Thr Leu Arg Leu Leu Asp Asp Gly Ala Gly Ala Asp Val He 655 660 665 aaa aat gat gga att tac teg agg tat ttt tte tec ttt gct gea aat 2609 Lys Asn Asp Gly He Tyr Ser Arg Tyr Phe Phe Ser Phe Ala Ala Asn 670 675 680 ^[ irrfitt i l lif ifí-ifii ggt aga tat age ttg aaa gtg cat gtc aat cae tet ccc age ata age 2657 Gly Arg Tyr Ser Leu Lys Val His Val Asn His Ser Pro Ser 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Lys Ser Leu Gln Asn 795 800 805 810 ate caá gat gac ttt aac aat gct att tta gta aat ac tea aag cga 3041 He Gln Asp Asp Phe Asn Asn Ala He Leu Val Asn Thr Ser Lys Arg 815 820 825 aat ect cag caá gct ggc ate agg gag ata ttt aeg tte tea ccc cag 3089 Asn Pro Gln Gln Ala Gly He Arg Glu He Phe Thr Phe Ser Pro GLn 830 835 840 att tce aeg aat gga ect gaa cat cag cea aat gga gaa acá cat gaa 3137 He Ser Thr Asn Gly Pro Glu His Gln Pro Asn Gly Glu Thr His Glu 845 850 855 age cae aga att tat gtt gea ata cga gea atg gat agg aac tec tta 3185 Ser His Arg He Tyr Val Ala He Arg Ala Met Asp Arg Asn Ser Leu 860 865 870 cag tet gct gta tet aao att gcc cag gcg ect ctg ttt att ccc ccc 3233 Gln Ser Ala Val Ser Asn He Ala filn Ala Pro Leu Phe He Pro Pro 875 880 885 890 aat tet gat ect gta ect gcc aga gat tat ctt ata ttg aaa gga gtt 3281 Asn Ser Asp Pro Val Pro Ala Arg Asp Tyr Leu He Leu Lys Gly Val 895 900 905 '.?. . ^ f.¡??^..i. l.. ^^*- ^.¿^ ^ferifa^^^f irl. ^ i^fe ^g^^ ^^^w^^4^.-^)i.^^^ tta acá gea ptg ggt ttg ata gga ate att tgc ctt att ata gtt gtg 3329 Leu Thr Ala Met Gly Leu He Gly He He Cys Leu He He Val Val 910 915 920 acá cat cat act tta age agg aaa aag aga gea gac aag aaa gag aat 3377 Thr His His Thr Leu Ser Arg Lys Lys Arg Ala Asp Lys "Lys Glu Asn 925 930 935 gga acá aaa tta tta taaataaata tccaaagtgt cttccttctt agatataaga 3432 Gly Thr Lys Leu Leu 940 cccatggcct tegactacaa aaacatacta acaaagtcaa attaacatca aaactgtatt 3492 aaaatgcatt gagtttttgt acaatacaga taagattttt acatggtaga tcaacaaatt 3552 ctttttgggg gtagattaga aaacccttac actttggcta tgaacaaata ataaaaatta 3612 ttctttaaag taatgtcttt aaaggcaaag ggaagggtaa agtcggacca gtgtcaagga 3672 aagtttgttt tattgaggtg gaaaaatagc cccaagcaga gaaaaggagg gtaggtctgc 3732 attataactg tetgtgtgaa gcaatcattt agttactttg attaattttt cttttctcct 3792 tatctgtgca gaacaggttg cttgtttaca actgaagatc atgetatatt ttatatatga 3852 agcccctaat gcaaagctct ttacctcttg ctattttgtt atatatatta cagatgaaat 3912 ctcactgcta atgctcagag atcttttttc actgtaagag gtaaccttta acaatatggg 3972 tattacettt gtctcttcat accggtttta tgacaaaggt ctattgaatt tatttgtttg 4032 taagtttcta ctcccatcaa ageagettte taagttattg cettg 4077 <210> 2 <211> 943 <212> PRT <213> Hamo sapiens <400> 2 Met Thr Gln Arg Ser He Ala Gly Pro He Cys Asn Leu Lys Phe Val 5 10 15 Thr Leu Leu Val Ala Leu Ser Ser Glu Leu Pro Phe Leu Gly Ala Gly 20 , 25 30 Val Gln Leu Gln Asp Asn Gly Tyr Asn Gly Leu Leu He Ala He Asn 35 40 45 Pro Gin Val Pro Glu Asn Gln Asn Leu He Ser Asn He Lys Glu Met 50 55 60 He Thr Glu Ala Ser Phe Tyr Leu Pne Asn Ala Thr Lys Arg Arg Val 65 70 75 80 AAAtAJ 'i*»*-*-'- mlM??.St..... ...'.

Phe Phe Arg Asn He Lys He Leu He Pro Ala Thr Trp Lys Ala Asn 85 90 95 Asn Asn Ser Lys He Lys Gln Glu Ser Tyr Glu Lys Ala Asn Val He 100 105 110 Val Thr Asp Trp Tyr Gly Ala His Gly Asp Asp Pro Tyr Thr Leu Gln 115 120 125 Tyr Arg Gly Cys Gly Lys Glu Gly Lys Tyr Ilß His Phe Thr Pro Asn 130 135 140 Phe Leu Leu Asn Asp Asn Leu Thr Ala Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Arg 145 150 155 160 "Val Phe Val His Glu Trp Ala His Leu Arg Trp Gly Val Phe Asp Glu 165 170 175 Tyr Asn Asn Asp Lys Pro Phe Tyr He Asn Gly Gln Asn Gln He Lys 180 185 190 Val Thr Arg Cys Ser Ser Asp He Thr Gly He Phe Val Cys Glu Lys 195 200 205 Gly Pro Cys Pro Gln Glu Asn Cys He He Ser Lys Leu Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Cys Thr Phe He Tyr Asn Ser Thr Gln Asn Ala Thr Ala Ser He 225 230 235 240 Met Phe Met Gln Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Phe Cys Asn Ala Ser 245 250 255 Thr His Asn Gln Glu Ala Pro Asn Leu Gln Asn Gln Met Cys Ser Leu 260 265 270 Arg Ser Ala Trp Asp Val He Thr Asp Ser Ala Asp Phe His His Ser 275 280 285 Phe Pro- Met Asn Gly Thr Glu Leu Pro Pro Pro Pro Thr Phß Ser Leu 290 295 300 Val Gln Ala Gly Asp Lys Val Val Cys Leu Val Leu Asp Val Ser Ser 305 310 315 320 .Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Leu Leu Gln Leu Gln Gln Ala Ala Glu 325 330 335 Phe Tyr Leu Met Gln He Val Glu He His Thr Phe Val Gly He Ala 340 345 350 Ser Phe Asp Ser Lys Gly Glu He Arg Ala Gln Leu His Gln He Asn 355 360 365 Ser Asn Asp Asp Arg Lys Leu Leu Val Ser Tyr Leu Pro Thr Thr Val 370 375 380 Ser Ala Lys Tlir Asp He Ser He Cys Ser Gly Leu Lys Lys Gly Phe 385 390 395 400 Glu Val Val Glu Lys Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Gly Ser Val Met He 405 410 415 Leu Val Thr Ser Gly Asp A3 Lys Leu Leu Gly Asn Cys Leu Pro Thr 420 425 430 Val Leu Ser Ser Gly Ser Thr He His Ser He Ala Leu Gly Ser Ser 435 440 445 Ala Ala Pro Asn Leu Glu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Lys 450 455 460 Phe Phe Val Pro Asp He Ser Asn Ser Asn Ser Met He Asp Ala Phe 465 470 475 480 Ser Arg He Ser Ser Gly Thr Gly Asp He Phe Gln Gln His He Gln 485 490 495 Leu Glu Ser Thr Gly Glu Asn Val Lys Pro His His Gln Leu Lys Asn 500 505 510 Thr Val Thr Val Asp Asn Thr Val Gly Asn Asp Thr Met Phe Leu Val 515 520 525 Thr Trp Gln Ala Ser Gly Pro Pro Glu He He Leu Phe Asp Pro Asp 530 535 540 Gly Arg Lys Tyr Tyr Thr Asn Asn Phe He Thr Asn Leu Thr Phe Arg 545 550 555 560 Thr Ala Ser Leu Trp He Pro Gly Thr Ala Lys Pro Gly His Trp Thr 565 570 575 Tyr Thr Leu Asn Asn Thr His His Ser Leu Gln Ala Leu Lys Val Thr 580 585 590 Val Thr Ser Arg Ala Ser Asn Ser Ala Val Pro Pro Ala Thr Val Glu 595 600 605 Ala Phe Val Glu Arg Asp Ser Leu His Phe Pro His Pro Val Met He 610 615 620 Tyr Ala Asn Val Lys Gln Gly Phe Tyr Pro He Leu Asn Ala Thr Val 625 630 635 '640 Thr Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Gly Asp Pro Val Thr Leu Arg Leu 645 650 655 Leu Asp Asp Gly Ala Gly Ala Asp Val He Lys Asn Asp Gly He Tyr 660 665 670 Ser Arg Tyr Phe Phe Ser Phe Ala Ala Asn Gly Arg Tyr Ser Leu Lys 675 680 685 íúrié-?tl?U?á, Val His Val Asn His Ser Pro Ser He Ser Thr Pro Ala His Ser He 690 695 700 Pro Gly Ser His Ala Met Tyr Val Pro Gly Tyr Thr Ala Asn Gly Asn 705 710 715 720 He Gln Mßt Asn Ala Pro Arg Lys Ser Val Gly Arg Asn Glu Glu Glu 725 730 735 Arg Lys Trp Gly Phe Ser Arg Val Ser Ser Gly Gly Ser Phe Ser Val 740 745 750 Leu Gly -Val Pro Ala Gly Pro His Pro Asp Val Phe Pro Pro Cys Lys 755 760 765 He He Asp Leu Glu Ala Val Lys Val Glu Glu Glu Leu Thr Leu Ser 770 775 780 Trp Thr Ala Pro Gly Glu Asp Phe Asp Gln Gly Gln Ala Thr Ser Tyr 785 790 795 800 Glu He Arg Met Ser Lys Ser Leu Gln -Asn He Gln Asp Asp Phe Asn 805 810 815 Asn Ala He Leu Val Asn Thr Ser Lys Arg Asn Pro Gln Gln Ala Gly 820 825 830 He Arg Glu He Phe Thr Phe Ser Pro Gln He Ser Thr Asn Gly Pro 835 840 845 Glu His Gln Pro Asn Gly Glu Thr His Glu Ser His Arg He Tyr Val 850 855 860 Ala He Arg Ala Met Asp Arg Asn Ser Leu Gln Ser Ala Val Ser Asn 865 870 875 B80 He Ala Gln Ala Pro Leu Phe He Pro Pro Asn Ser Asp Pro Val Pro 885 890 895 Ala Arg Asp Tyr Leu He Leu Lys Gly Val Leu Thr Ma Met Gly Leu 900 905 910 He Gly Ilß He Cys Leu He He Val Val Thr 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GAATTCGGC 19 <210> 11 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 11 CAGTCTGCTG TATCTAACAT TGCCCA 26 <210> 12 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 12 TTTGTTCATA GCCAAAGTGT AAGGGTTT 28 <210> 13 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 13 GGTGACACTA TAGAAGGTAC GC 22 <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 14 CACTTTCGCT CCTCCTCATT TCTGCCT 27 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador ? a.? a*?mL???t.i? *ká&¿?t <400> 15 CCTGCAGGTA CCGGTCCGGA 20 <210> 16 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 16 CTGAATATTA CCGTTTGCTG TGTAACCT 28 <210> 17 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 17 GACATTTTCA CCTGTACTTT CAAGCT 26 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 18 GTTCCAGAGG AAATTCTACT GAAGGCA 27 <210> 19 <211> 549 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> caracteristicas diversas <222> (1) .. (549) <223> fragmento de cDNA <400> 19 accaggttac acagcaaacg gtaatattca gatgaatgct ccaaggaaat cagtaggcag 60 aaatgaggag gagjcgaaagt ggggctttag ccgagtcagc tcaggaggct ccttttcagt 120 gctgggagtt ccagctggcc cccaccctga tgtgtttcca ccatgcaaaa ttattgacct 180 ggaagcgta aaagtagaag aggaattgac cctatcttgg acagcacctg gagaagactt 240 tgatcagggc caggctacaa gctatgaaat aagaatgagt aaaagtctac agaatatcca 300 agatgacttt aacaatgcta ttttagtaaa tacatcaaag cgaaatcctc agcaagctgg 360 catcagggag atatttacgt tctcacccca aatttccacg aatggacctg aacatcagcc 420 aaatggagaa acacatgaaa gccaeagaat ttatgttgca atacgagcaa tggataggaa 480 ctccttacag tctgctgtat ctaacattgc ccaggcgcct ctgtttattc cccccaattc 540 tgatcctgt 549 <210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 20 GATTACATCC CATGCACTTC TGAGGCT 27 <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 21 GGTGCTTCTT GGTTGTGGGT ACTTGCA 27 <210> 22 <211 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 22 GGGCTGCAGA ATGGATTTCT AAATCT 26 ÍtL,k¿,? i.í..h¿á.?r, iji.aáj.ttait».. r.. , Jt.iL-, i íi> <210> 23 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 23 TGAGCCTGCT GCATACATTG TGTCAGGT 28 <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 24 CCTTGCAAGT TCAGGAAGAA ACCATCT 27 <210> 25 <211> 29 <212> ADN <213 Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 25 GTTATCATTC AGTAGGAAAT TAGGTGTGA 29 <210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 26 GCACATGGAG ATGATCCATA CACCCTA 27 fc -AI»éf éffiifli J,A-ii=aÍi?ay^Éfc«"'t''lJB^i'''a'*^^ <210> 27 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 27 GATTACATCC CATGCACTTC TGAGGCT 27 <210> 28 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 28 GCACCCAAAA TGCAACTGCA TCAATAATGT 30 <210> 29 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 29 CAAAGAACTT TAAACCTCCT GTAAGACGT 29 <210> 30 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 30 GTGATGATAT TAGTGACCAG CGGAGA 26 ...^J.a^»»^Arft.aÉÍfcaLá?jlMÍ>Éa»?*afa<«A-ii»j » <H-Íti-ti»' <210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 31 CTGAGTTGGA GGCACGAGAG GTCA 24 <210> 32 <211> 27 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 32 GGAACAGCTA AGCCTGGGCA CTGGACT 27 <210> 33 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 33 CACTTTCGCT CCTCCTCATT TCTGCCT 27 <210> 34 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 34 GGTTACACAG CAAACGGTAA TATTCAGA 28 ... , .^.,^ i f , -rtifii-rf'''. ??ÍiifllSai?a?fetife*a^¡^ <210> 35 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 35 GGATCAGAAT TGGGGGGAAT AAACAGA 27 <210> 36 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 36 CAGTCTGCTG TATCTAACAT TGCCCA 26 <210> 37 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 37 TTTGTTCATA GCCAAAGTGT AAGGGTTT 28 <210> 38 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 38 GGTAGATCAA CAAATTCTTT TTGGGGGT 28 ,~ Á¡Ai?k"- a- .¿ £*?m.-it^?,-í «ife«'-^^^^»^te^^M^^^^»-^^^«^"J'^ "***" *• <210> 39 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 39 GGGGCTATAA CTATCATTCC ATAATAAC 28 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Lys Leu Phe Lys Glu Gly Cys Thr Phe 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Phe Lys Glu Gly Cys Thr Phe He Tyr 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Phe Met Gln Ser Leu Ser Ser Val Val 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Asn Leu Gln Asn Gln Met Cys Ser Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Val He Thr Asp Ser Ma Asp Phe 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr Glu Leu Pro Pro Pro Pro Thr Phe 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Pro Pro Pro Pro Thr Phe Ser Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ser Leu Val Gln Ma Gly Asp Lys Val 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4B Cys Leu Val Leu Asp Val Ser Ser Lys 1 ' 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Lys Met Ma Glu Ma Asp Arg Leu Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Arg Leu Leu Gln Leu Gln Gln Ma 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Leu Gln Gln Ma Ma Glu Phe Tyr 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Leu Gln Gln Ma Ma Glu Phe Tyr Leu 1 5 <210> 53 <211> 9 ,<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln He Val Glu He His Thr Phe Val 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ser Lys Gly Glu He Arg Ma Gln Leu 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asp Asp Arg Lys Leu Leu Val Ser Tyr 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Asp Arg Lys Leu Leu Val Ser Tyr Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Lys Leu Leu Val Ser Tyr Leu Pro Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Tyr Leu Pro Thr Thr Val Ser Ma Lys 1 . 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Val Val Glu Lys Leu Asn Gly Lys 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Glu Lys Leu Asn Gly Lys Ma Tyr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 He Leu Val Thr Ser Gly Asp Asp Lys 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu Leu Gly Asn Cys Leu Pro Thr Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 63 Glu Leu Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 A=p He Phe Gln Gln His He Gln Leu 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gln Leu Glu Ser Thr Gly Glu Asn Val 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 66 Asn Val Lys Pro His His Gln Leu Lys 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 67 He Leu Phe Asp Pro Asp Gly Arg Lys 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Leu Phe Asp Pro Asp Gly Arg Lys Tyr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ser Leu Trp He Pro Gly Thr Ma Lys 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Lys Pro Gly His Trp Thr Tyr Thr Leu 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo -sapiens <400> 71 Ser Leu Gln Ma Leu Lys Val Thr Val 1 5 <210> 72 <211> 9 ..>r..? •-"«ltóa .afc»aa** <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Ma Phe Val Gly Arg Asp Ser Leu 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Phe Val Gly Arg Asp Ser Leu His Phe 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Thr Gly Asp Pro Val Thr Leu Arg Leu 1 "5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Lys Asn Asp Gly He Tyr Ser Arg Tyr 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Arg Tyr Ser Leu Lys Val His Val 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gln Met Asn Ma Pro Arg Lys Ser Val 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7B Asn Glu Glu Glu Arg Lys Trp Gly Phe 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Phe Pro Pro Cys Lys He He Asp Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Phe Asp Gln Gly Gln Ma Thr Ser Tyr 1 5 <210> 81 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ser Leu Gln Asn He Gln Asp Asp Phe *1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Asn Gly Glu Thr His Glu Ser His Arg 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 He Arg Ma Met Asp Arg Asn Ser Leu 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Asn Ser Asp Pro Val Pro Ma Arg Asp 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Ser Asp Pro Val Pro Ma Arg Asp Tyr 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asp Pro Val Pro Ma Arg Asp Tyr Leu 1 5 agj a^i-^AÉal. <210> 87 <2 1> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> B7 Val Pro Ma Arg Asp Tyr Leu He Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> .88 Met Gly Leu He Gly He He Cys Leu 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Asp Lys Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu 1 5 <210> 9TJ <211> 9 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 90 Phe Met Gln Ser Leu Ser Sar Val Val 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asn Leu Gln Asn Gln Met Cys Ser Leu 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ser Leu Val Gln Ma Gly Asp Lys Val 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Lys Met Ma Glu Ma Asp Arg Leu Leu 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Leu Gln Gln Ma Ma Glu Phe Tyr Leu 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Gln He Val Glu He His Thr Phe Val 1 5 <210> 96 <211> 8. t<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Lys Leu Leu Val Ser Tyr Leu Pro Thr 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Leu Leu Gly Asn Cys Leu Pro Thr Val 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Glu Leu Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Gln Leu Glu Ser Thr Gly Glu Asn Val 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ser Leu Gln Ma Leu Lys Val Thr Val 1 5 'j m i ^ rÁ-i <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Gln Met Asn Ma Pro Arg Lys Ser Val 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Glu Val Asp Pro He Gly His Leu Tyr 1 5 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Antigeno asociado a un tumor con la denominación C42, caracterizado porque contiene la secuencia de aminoácidos definida en SEC ID NO: 2.

2. Fragmento proteinico o péptido inmunógeno, caracterizado porque se deriva del antigeno asociado a un tumor que se define en la reivindicación 1.

3. (Poli) péptido inmunógeno según la reivindicación 1 a 2, caracterizado porque provoca una respuesta inmunitaria humoral.

4. (Poli) péptido inmunógeno según la reivindicación 1 a 2, caracterizado porque cuyos productos de degradación es o son presentado (s) por moléculas del MHC y provocan una respuesta inmunitaria celular.

5. Péptido inmunógeno según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona entre el grupo de péptidos según las SEC ID NO: 40 hasta 89.

6. (Poli) péptido inmunógeno según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es para la .-aim .r^i±Trm.fat-ír.^^tor^^ii.^.í±-.'frti&m inmunoterapia de padecimientos de cáncer in vivo o ex vivo, induciendo el (poli) péptido una respuesta inmunitaria contra células de tumores del paciente, que expresan C42.

7. ( Poli) péptido inmunogéno derivado de secciones de un antigeno C42 asociado al tumor, expresado en el tumor, caracterizado porque muestra una o más mutaciones especificas del tumor.

8. Composición farmacéutica para la administración por via parenteral, tópica, oral o local, caracterizada porque contiene como componentes activos uno o varios (poli) péptidos inmunógenos según una de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque contiene diferentes péptidos inmunógenos derivados de C42.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque contiene uno o varios péptidos derivados de C42 en mezcla con péptidos derivados de otros antigenos asociados a tumores.

11. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque los péptidos se fijan a por lo menos dos tipos diferentes de HLA.

12. Molécula aislada de ADN, caracterizada porque i.. . ;.. -.,. . . ¡.rrí.- r. .. : a .ir¡mu. íj.^.nrm?frÍ? codifica una proteina con las propiedades inmunógenas del antigeno asociado a un tumor que se define en la reivindicación 1, o fragmentos de éste.

13. Molécula de ADN según la reivindicación 12, caracterizada porque codifica un polipéptido inmunógeno con la denominación C42, que contiene la secuencia de aminoácidos contenida en SEC ID NO: 2 o fragmentos de proteinas o péptidos derivados de ellos.

14. Molécula de ADN según la reivindicación 13, caracterizada porque es un polinucleótido con la secuencia representada en SEC ID NO: 1 o contiene a éste o porque es un polinucleótido o contiene a éste, que se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido de la secuencia representada en SEC ID NO: 1.

15. Molécula de ADN recombinante, caracterizada porque contiene una molécula de ADN según una de las reivindicaciones 12 a 14.

16. Molécula de ADN según una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizada porque la inmunoterapia de padecimientos de cáncer, induciendo el (poli) péptido C42 expresado por la molécula de ADN una respuesta inmunitaria contra células de tumores del paciente, que expresan C42.

17. Utilización de células, que expresan el antigeno definido en la reivindicación 1, para la preparación de una vacuna contra el cáncer.

18. Anticuerpo contra un (poli) péptido definido en una de las reivindicaciones 1 a 5.

19. Anticuerpo según la reivindicación 18, caracterizado porque es monoclonal.

20. Anticuerpo según la reivindicación 18 o 19 para la terapia y el diagnóstico de padecimientos de cáncer, que están asociadas con la expresión de C42. 'i??&.?.Á.J?dzi.?- , . . ??ti?<?t?m*í AiÁtlil