ES2389445T3 - Compuestos novedosos - Google Patents
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Abstract
Un kit de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico que comprende: (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento de la misma; (b) la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma; (c) un polinucleótido que se puede obtener por tamizado de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma, codificando dicho polinucleótido una proteína que tiene propiedades inmunogénicas similares a las de la proteína de SEC ID Nº: 2. (d) un polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento del mismo; o (e) un anticuerpo del polipéptido de SEC ID Nº: 2.
Description
Compuestos novedosos
Se describen en esta invención composiciones farmacéuticas y procedimientos para inducir una respuesta inmunológica contra antígenos relacionados con tumores. Más específicamente, se describen polinucleótidos, en el presente documento referidos como polinucleótidos CASB7439, polipéptidos codificados por ellos (referidos en el presente documento como polipéptidos CASB7439), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, se describen procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, que incluyen el tratamiento del cáncer, más particularmente cáncer colorrectal, y enfermedades autoinmunológicas y otras afecciones relacionadas. En otro aspecto, se describen composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos y polinucleótidos CASB7439, a procedimientos de elaboración de tales composiciones y a su uso en medicina. En un aspecto adicional, se describen procedimientos para identificar agonistas y antagonistas/inhibidores que usan los materiales descritos en este documento, y que tratan afecciones asociadas con el desequilibrio de polipéptido CASB7439 con los compuestos identificados. La invención se refiere a pruebas de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles inapropiados de polipéptido CASB7439.
Se cree que los polipéptidos y polinucleótidos descritos en este documento son inmunógenos importantes para la inmunización profiláctica o terapéutica específica contra tumores, porque se expresan específicamente o se sobreexpresan altamente en tumores en comparación con células normales y por consiguiente puede seleccionarse como objetivo por mecanismos inmunes específicos de antígeno que conducen a la destrucción de la célula tumoral. Pueden usarse también para diagnosticar la aparición de células tumorales. Además, su expresión inapropiada en algunas circunstancias puede ocasionar una inducción de respuestas inmunes inapropiadas, autoinmunes, las cuales podrían corregirse a través de vacunación apropiada usando los mismos polipéptidos o polinucleótidos. A este respecto, las actividades biológicas más importantes para nuestro propósito son las actividades antigénicas e inmunogénicas del polipéptido descritas en este documento. Un polipéptido descrito en este documento puede exhibir también al menos otra actividad biológica de un polipéptido CASB7439, que podría calificarlo como un objetivo para la intervención terapéutica o profiláctica diferente a la relacionada con la respuesta inmune.
Se describen en este documento polipéptidos CASB7439. Tales péptidos incluyen polipéptidos aislados, que comprenden una secuencia de aminoácidos la cual tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º:11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12,
o SEC ID N.º: 14 respectivamente, con la condición de que dicho polipéptido aislado no sea SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Tales polipéptidos incluyen aquellos que comprenden el aminoácido de la SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º:11.
Otros péptidos más incluyen polipéptidos aislados, en los cuales la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 respectivamente, con la condición de que dicho polipéptido no sea SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Tales polipéptidos incluyen los polipéptidos de la SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º: 11.
Preferentemente los polipéptidos anteriormente mencionados se producen de manera recombinante. Lo más preferentemente, los polipéptidos de acuerdo con la invención se purifican, y están substancialmente libres de cualesquiera otras proteínas o material contaminante de origen de huésped.
Los péptidos adicionales descritos en este documento incluyen polipéptidos aislados codificados por un polinucleótido que comprende la secuencia contenida en SEC ID N.º: 1.
También se describe en este documento un fragmento inmunogénico de un polipéptido CASB7439, que es una porción contigua del polipéptido CASB7439 que tiene las mismas propiedades inmunogénicas o similares que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un portador o como parte de una proteína de condensación más grande) es capaz de provocar una respuesta inmune que reconozca al polipéptido CASB7439. Un fragmento inmunogénico tal puede incluir, por ejemplo, el polipéptido CASB7439 que carece de una secuencia líder N-terminal, un dominio de transmembrana o un dominio de aseguramiento C-terminal. En un aspecto preferido del fragmento inmunogénico de CASB7439 de acuerdo con la invención comprende substancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo máspreferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a aquella de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 respectivamente. Preferentemente, un fragmento inmunogénico de acuerdo con la invención comprende al menos un epitope.
Los fragmentos de péptido que incorporan un epitope de CASB7439 comprenderán normalmente al menos 7, preferentemente 9 ó 10 aminoácidos contiguos derivados de la SEC ID N.º: 2. Los epitopes preferidos se muestran en las SEC ID N.º: 16 a SEC ID N.º: 33.
Los péptidos que incorporan estos epitopes forman un aspecto preferido. Los mimotopes que tienen las mismas características que estos epitopes, y los inmunógenos que comprenden tales mimotopes que generan una respuesta inmune que reacciona de forma cruzada con un epitope en el contexto de la molécula CASB7439,
Se describen en este documento péptidos aislados que abarcan estos epítopes por si mismos, y cualquier mimotope de los mismos. El significado de mimotope se define como una entidad que es lo suficientemente similar al epitope CASB7439 nativo de modo que sea capaz de reconocerse por anticuerpos que reconocen la molécula nativa; (Gheysen, H.M., y col., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, p130-149; Gheysen, H.M.. 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709-715); o son capaces de producir anticuerpos, cuando se acoplan a un portador adecuado, cuyos anticuerpos reaccionan con la molécula nativa.
Los mimotopes de péptido de los epítopes anteriormente identificados pueden diseñarse para un propósito particular por adición, eliminación o substitución de los aminoácidos elegidos. Consecuentemente, los péptídos pueden modificarse para los propósitos de facilidad de conjugación a un portador de proteína. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química el incluir una cisteina terminal al epitope. Además puede ser deseable para los péptidos conjugados a un portador de proteína incluir un extremo hidrofóbo distal del extremo conjugado del péptido, de manera tal que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína transportadora. Esto reduce los grados conformacionales de libertad del péptido, y aumenta así la probabilidad de que el péptido se presente en una conformación que se parezca estrechamente a aquella del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula completa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para tener una cisteina N-terminal y una cola anidada hidrófoba C-terminal, Alternativamente, puede realizarse la adición o substitución de una forma de estereoisómero D de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado benéfico, por ejemplo, para mejorar la estabilidad del péptido. Aquellos expertos en la técnica se darán cuenta que tales péptidos o mimotopes modificados, podrían ser un mimotope completamente o parcialmente no peptídico en el que los residuos constituyentes no se confinan necesariamente a los 20 aminoácidos que se generan naturalmente. Además, estos pueden reciclarse por técnicas conocidas en la técnica para restringir el péptido dentro de una conformación que se parece estrechamente a su forma cuando la secuencia peptídica se encuentra en el contexto de la molécula completa. Un procedimiento preferido de reciclaje de un péptido comprende la adición de un par de residuos de cisteina para permitir la formación de un puente disulfuro.
Además, aquellos expertos en la técnica se darán cuenta de que los mimotopes o inmunógenos de la presente invención pueden ser mayores que los epitopes anteriormente identificados y como tales pueden comprender las secuencias descritas en el presente documento. De acuerdo con lo anterior, los mimotopes de la presente invención pueden consistir en la adición de extensiones N-terminales y/o C-teminales de un cierto número de otros residuos naturales en uno o ambos extremos. Los mimotopes peptídicos pueden ser también retrosecuencias de las secuencias naturales, porque se invierte la orientación de secuencia; o alternativamente las secuencias pueden completamente o al menos en parte consistir en aminoácidos de estereoisómero D (secuencias inversas). También, las secuencias peptídicas pueden ser retro-inversas en carácter, porque se invierte la orientación de secuencia y los aminoácidos son de la forma del estereoisómero D. Tales péptidos retro o retro-inversos tienen la ventaja de ser noindependientes, y como tales pueden superar problemas de auto-tolerancia en el sistema inmunológico.
Alternativamente, pueden identificarse los mimotopes de péptido usando anticuerpos que son capaces por si mismos de unirse a los epitopes de la presente invención usando técnicas tales como tecnología de exhibición de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un número grande de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y, por lo tanto, son capaces de unirse a anticuerpos de péptido anti-nativos, pero pueden no necesariamente por si mismas compartir una homología de secuencia significativa al péptido nativo. Este planteamiento puede tener ventajas significativas al permitir la posibilidad de identificar un péptido con propiedades inmunogénicas mejoradas, o puede superar cualquier problema potencial de autotolerancia a antígeno que pueda estar asociado con el uso de la secuencia peptídica nativa. Adicionalmente esta técnica permite la identificación de un patrón de reconocimiento para cada péptido nativo en términos de sus propiedades químicas compartidas entre las secuencias de mimotopes reconocidas.
El acoplamiento covalente del péptido al portador inmunogénico puede llevarse a cabo de manera bien conocida en la técnica. Por consiguiente, por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo es posible usar una carbodiimida, glutaraldehído o éster de (N-[γ-maleimidobutiriloxi]succinimida, usando enlazadores heterobifuncionales comercialmente disponibles comunes tales como CDAP y SPDP (usando las instrucciones de los fabricantes). Después de la reacción de acoplamiento, puede aislarse y purificarse fácilmente el inmunógeno por medio de un procedimiento de diálisis, un procedimiento de filtración de gel, un procedimiento de fraccionamiento, etc.
Los tipos de vehículos usados en los inmunógenos de la presente invención se conocerán fácilmente por el experto en la materia. La función del vehículo es proporcionar ayuda de citoquina con objeto de ayudar a inducir una respuesta inmune contra el péptido. Una lista no exhaustiva de portadores que puede usarse en la presente invención incluye: Hemocianina de lapa de California (KLH), albúminas de suero tales como la seroalbúmina bovina (BSA), toxinas bacterianas inactivadas tales como toxinas de tétanos o difteria (TT y DT), o fragmentos recombinantes de las mismas (por ejemplo, Dominio 1 del Fragmento C de TT, o el dominio de transposición de DT),
o el derivado de la proteína purificada de tuberculina (PPD). Alternativamente los mimotopes o epítopes pueden conjugarse directamente a portadores de liposoma, los cuales pueden comprender adicionalmente inmunógenos capaces de proporcionar ayuda de células T. Preferentemente la proporción de mimotopes a portador es del orden de 1:1 a 20:1, y preferentemente cada portador debe portar entre 3-15 péptidos.
Un portador preferido es Proteína D derivada de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1). La Proteína D es una proteína de unión de Ig-D derivada de Haemophilus influenzae y se ha patentado por Forsgren (documento WO 91/18926, documento EP 0 594 610 B1 concedido). En algunas circunstancias, por ejemplo en los sistemas de expresión de inmunógeno recombinante puede ser deseable usar fragmentos de proteína D, por ejemplo, Proteína D 1/3° (que comprende los 100-110 aminoácidos N-terminales de proteína D (documento GB 9717953.5)).
Otro procedimiento preferido para presentar los péptidos se encuentra en el contexto de una molécula de condensación recombinante. Por ejemplo, el documento EP 0 421 635 B describe el uso de partículas de antígeno de núcleo de hepadnavirus quiméricos para presentar secuencias peptídicas ajenas en un partícula similar a virus. Como tales, los inmunógenos pueden comprender péptidos presentados en partículas quiméricas que consisten en antígeno de núcleo de hepatitis B. Adicionalmente, las proteínas de condensación recombinantes pueden comprender los mimotopes de la presente invención y una proteína transportadora, tal como la NS1 del virus de la influenza.
Los péptidos pueden sintetizarse fácilmente por procedimientos de fase sólida bien conocidos en la técnica. Las síntesis adecuadas pueden llevarse a cabo usando procedimientos "T-boc" o "F-moc". Los péptidos cíclicos pueden sintetizarse por el procedimiento de fase sólida que emplea el procedimiento "F-moc" bien conocido y la resina de poliamida en el aparato totalmente automatizado. Alternativamente, aquellos expertos en la técnica conocerán los procedimientos de laboratorio necesarios para llevar a cabo el proceso manualmente. Las técnicas y procedimientos para la síntesis de fase sólida se describen en 'Solid Phase Peptide Synthesís: A Practical Approach' por E. Atherton y R.C. Sheppard, publicado por IRL en la Oxford University Press (1989). Alternativamente, los péptidos pueden producirse por procedimientos recombinantes, que incluyen la expresión de moléculas de ácido nucléico que codifican los mimotopes en una línea celular bacteriana o mamífera, seguida de purificación del mimotope expresado. Se conocen en la materia las técnicas para la expresión recombinante de péptidos y proteínas, y se describen en Maniatis, T., Fritsch, E.F., y Sambrook, y col., Molecular cloning, a laboratory manual, 2a Ed ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).
Se describe en este documento un procedimiento de producir un polipéptido. El proceso puede realizarse por técnicas recombinantes convencionales tales como las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989. De acuerdo con lo anterior se proporciona un proceso para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo. En particular, el procedimiento de la invención puede comprender preferentemente los pasos de:
i) preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huésped, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma;
ii) transformar una célula huésped con dicho vector;
iii) cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y
iv) recuperar dicha proteína.
Los polipéptidos o el fragmento inmunogénico pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína más grande tal como un precursor o una proteína de condensación. Frecuentemente es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líderes, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como múltiples residuos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, se considera también la adición del polipéptido exógeno
o la cola de lípidos o las secuencias polinucleótidas para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.
En un aspecto, se describen proteínas de condensación solubles modificadas genéticamente que comprenden un polipéptido como se describe en este documento, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Preferida como inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG 1, donde la condensación toma lugar en la región de bisagra. En una realización particular, la parte de Fc puede eliminarse simplemente por la incorporación de una secuencia de escisión que puede segmentarse con factor de coagulación sanguínea Xa. Además, se describen procesos para la preparación de estas proteínas de condensación por ingeniería genética, y el uso de las mismas para rastreo de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto particularmente preferido se refiere al uso de un polipéptido o un polinucleótido en la elaboración de una vacuna para tratar de manera inmunoterapéutica a un paciente que padece de o es susceptible al carcinoma, especialmente cáncer del colon u otros tumores o enfermedades asociados con el colon. Un aspecto adicional se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de condensación. Ejemplos de la tecnología de proteínas de condensación pueden encontrarse en las Solicitudes de Patente Internacional N.ºs W094/29458 y W094/22914.
Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de condensación recombinantes que permiten niveles mejorados para producirse en un sistema de expresión en comparación con proteína no condensada. El compañero de condensación puede ayudar a proporcionar epítopes de T ayudantes (compañero de condensación inmunológico), preferentemente epítopes de T ayudantes reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (mejorador de expresión) a niveles superiores que la proteína recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de condensación será tanto un compañero de condensación inmunológica como un compañero de mejora de expresión.
Los compañeros de condensación incluyen proteína D derivada de Haemophilus influenza B y la proteína no estructural derivada del virus de la influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de condensación inmunológico es la proteína conocida como LYTA. Preferentemente, se usa la porción C-terminal de la molécula. Lyta se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una amidasa de N-acetil-L-alanina, amidasa LYTA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272} una autolisina que degrada específicamente algunos enlaces en la estructura principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína de LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos de expresión de C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de condensación. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento de C-LYTA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la porción de repetición de la molécula de Lyta encontrada en el extremo C-terminal que comienza en el residuo 178, por ejemplo, los residuos 188 - 305.
También se describen en este documento formas xenogénicas (también llamadas formas ortólogas) de los polipéptidos anteriormente mencionados, refiriéndose dichas formas xenogénicas a un antígeno que tiene identidad de secuencia substancial al antígeno humano (también llamado antígeno autólogo) que sirve como un antígeno de referencia pero que se deriva de una especie no humana diferente. En este contexto la identidad substancial se refiere a la concordancia de una secuencia de aminoácidos con otra secuencia de aminoácidos o de una secuencia polinucleotídica con otra secuencia polínucleotídica cuando tales secuencias se disponen en una mejor alineación en cualquier número de proteínas de alineación de secuencia conocidas en la materia. Por identidad substancial se entiende al menos el 70-95 % y preferentemente al menos el 85-95 %, lo más preferentemente al menos el 90-95 %, de identidad de secuencia entre las secuencias comparadas. Por lo tanto de acuerdo con la invención el polipéptido CASB7439 xenogénico será un polipéptido CASB7439 que es xenogénico con respecto al CASB7439 humano, en otras palabras que se aisla de una especie diferente a la humana. En una realización diferente, el polipéptido se aisla de ratón, rata, cerdo, o mono rhesus, lo más preferentemente de ratón o rata. De acuerdo con lo anterior se describe aquí también un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra la CASB7439 humana que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de las secuencias SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 o SEC ID N.º: 11 en un ser humano, que comprende administrar al paciente una dosis eficaz de una composición que comprende una forma xenogénica de dicha CASB7439 humana como se describe en el presente documento. Una realización preferida es un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra la CASB7439 humana usando la CASB7439 xenogénica aislada de ratón, rata, cerdo o mono rhesus. Otro procedimiento preferido para inducir una respuesta inmune de acuerdo con la presente invención es usar una composición de antigénica que incluye un sistema de expresión viral vivo que expresa dicho antigeno xenogénico. El polipéptido CASB7439 xenogénico preferido tiene la secuencia expuesta en la SEC ID N.º: 12 (ratón) o en la SEC ID N.º: 14 (rata).
El polipéptido CASB7439 xenogénico aislado compartirá generalmente afinidad de secuencia substancial, e incluirá polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos la cual tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a la SEC ID N.º: 12 o a la SEC ID N.º: 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 12 o de la SEC ID N.º: 14. De acuerdo con lo anterior el polipéptido xenogénico comprenderá un fragmento inmunogénico del polipéptido de la SEC ID N.º: 12 o de la SEC ID N.º: 14 en el que la actividad inmunogénica del fragmento inmunogénico es substancialmente igual al polipéptido de la SEC ID N.º: 12 o de la SEC ID N.º: 14. Además el polipéptido CASB7439 xenogénico puede ser un fragmento de al menos aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos, preferentemente de aproximadamente 30, más preferentemente de aproximadamente 50, aún más preferentemente de aproximadamente 100, lo más preferentemente de aproximadamente 150 aminoácidos contiguos seleccionados a partir de las secuencias de aminoácidos como se muestran en la SEC ID N.º: 12 o en la SEC ID N.º: 14. Más particularmente los fragmentos de CASB7439 xenogénicos mantendrán alguna propiedad funcional, preferentemente una actividad inmunológica, de la molécula mayor expuesta en la SEC ID N.º: 12 o en la SEC ID N.º: 14, y son útiles en los procedimientos descritos en el presente documento (p.e., en composiciones farmacéuticas y de vacunas, en diagnósticos, etc.). En particular los fragmentos serán capaces de generar una respuesta inmune contra el homólogo humano, tal como la generación de anticuerpos reactivos de forma cruzada que reaccionan con la forma humana antóloga derivada de la CASB7439 como se establece en cualquiera de la SEC ID N.º: 2. En una realización específica, el polipéptido xenogénico puede ser parte de una condensación más grande, que comprenda el polipéptido CASB7439 xenogénico o fragmento del mismo y una proteína heteróloga o parte de una proteína que actúe como un compañero de condensación como se describió con anterioridad.
También se describen en el presente documento variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir polipéptidos que varían de los referentes por substituciones de aminoácidos conservadoras, en las que se substituye un residuo por otro con características similares. Tales substituciones típicas se encuentran entre Ala, Val, Leu, e Ile; entre Ser y Thr: entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr. Las variantes particularmente preferidas son aquellas en las que se substituyen, eliminan, o agregan en cualquier combinación varios 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que se dan en la naturaleza, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se entienden bien en la materia.
En un aspecto adicional, se describen polinucleótidos de CASB7439. Tales polinucleótidos incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 o SEC ID N.º: 11, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 o SEC ID N.º: 11, respectivamente. A este respecto, los polipéptidos codificados que tienen una identidad de al menos el 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de al menos el 98-99 % son más altamente preferidos, y aquellos con identidad de al menos el 99 % son los más altamente preferidos.
Polinucleótidos adicionales incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 o SEC ID N.º: 11, a lo largo de la región codificante completa. A este respecto, los polinucleótidos que tienen una identidad de al menos el 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de al menos el 98-99 % son más altamente preferidos, y aquellos con identidad de al menos el 99 % son los más altamente preferidos.
Polinucleótidos adicionales incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, a la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, o la SEC ID N.º: 9, a lo largo de la longitud completa de dichas secuencias, o a la secuencia codificante de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, o la SEC ID N.º: 9 a lo largo de la longitud completa de dicha secuencia codificante de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, o la SEC ID N.º: 9. A este respecto, los polinucleótidos que tienen una identidad de al menos el 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de al menos el 98-99 % son más altamente preferidos, y aquellos con identidad de al menos el 99 % son los más altamente preferidos. Tales polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende el polinucleótido de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, o la SEC ID N.º: 9, así como también el polinucleótido de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 9 o la secuencia codificante de SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, o SEC ID N.º: 9.
También se describe en esta invención un ácido nucléico que codifica las proteínas xenogénicas anteriormente mencionadas y su uso en medicina. En una realización preferida, el polinucleótido CASB7439 xenogénico para uso en composiciones farmacéuticas tiene la secuencia establecida en la SEC ID N.º 13 (ratón) o en la SEC ID N.º 15 (rata). Los polinucleótidos CASB7439 xenogénicos aislados pueden ser de cadena simple (codificantes o antisentido) o de cadena doble, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, cADN o sintético) o de ARN. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no requieren, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención. En otras realizaciones relacionadas, la presente invención proporciona variantes de polinucleótidos que tienen identidad substancial con las secuencias descritas en esta invención en la SEC ID N.º 13 o en la SEC ID N.º 15, por ejemplo aquellas que comprenden una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más alta, identidad de secuencia comparada con una secuencia de polinucleótidos CASB7439 usando los procedimientos descritos en el presente documento (p.e., el análisis BLAST que usa parámetros estándar). En una realización relacionada, el polinucleótido xenogénico aislado comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 90 %, preferentemente el 95 % y superior, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 12 o de la SEC ID N.º 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º 12 o de la SEC ID N.º 14, o un secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.
También se describe en este documento polinucleótidos que son complementarios a todos los polinucleótidos descritos anteriormente.
Dichos polinucleótidos pueden insertarse en un plásmido adecuado, en vector de microorganismos recombinantes o en un microorganismo vivo recombinante adecuado y se usa para la inmunización (véase por ejemplo Wolff y col., Science 247:1465-1468 (1990); Corr y col. J. Exp. Med 184:1555-1560 (1996); Doe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8578-8583 (1996)). De acuerdo con lo anterior se proporciona un vector de expresión o microorganismo vivo recombinante que comprende dichos polinucleótidos como se definió con anterioridad.
También se describe en esta invención un fragmento de un polinucleótido CASB7439 que cuando se administra a un paciente tiene las mismas propiedades inmunogénicas que el polinucleótido de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 13 o SEC ID N.º: 15.
También se describe en esta invención un polinucleótido que codifica un fragmento inmunológico de un polipéptido CASB7439 como se definió con anterioridad.
Los fragmentos tienen un nivel de actividad inmunogénica de al menos aproximadamente el 50 %, preferentemente de al menos aproximadamente el 70 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % del nivel de actividad inmunogénica de una secuencia de polipéptidos expuesta en la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 o en la SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12 o SEC ID N.º: 14 o una secuencia de polipéptidos codificada por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 13 o la SEC ID N.º: 15.
Los fragmentos de polipéptido comprenden preferentemente al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, o 100 aminoácidos contiguos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición de polipéptidos expuesta en el presente documento, tales como aquellos expuestos en SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12 o SEC ID N.º: 14 o aquellos codificados por una secuencia de polinucleótidos expuesta en una secuencia de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 13 o SEC ID N.º: 15.
La secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º: 1 es una secuencia de cADN que comprende una secuencia que codifica polipéptidos (nucleótido 545 a 1126) que codifica un polipéptido de 193 aminoácidos, el polipéptido de SEC ID N.º: 2. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEC ID N.º: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica polipéptidos contenida en la SEC ID N.º: 1 o puede ser una secuencia diferente a la contenida en la SEC ID N.º: 1, la cual, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, codifica también el polipéptido de la SEC ID N.º: 2. El polipéptido de la SEC ID N.º: 2 se encuentra relacionado estructuralmente a otras proteínas de la familia achaete scute, y se lo llama también "homólogo 2 de Achaete Scute humano" (HASH2) (número de acceso NP_005161 y AAB86993).
El gen homólogo 2 de Achaete Scute Humano (HASH2), oficialmente designado ASCL2 humano (complejo de Achaete Scute tipo 2) es un homólogo de los genes Achaete y Scute de Drosophila. El ASCL2 humano se expresa solamente en los trofoblastos extravellosos de la placenta en desarrollo y mapea en el cromosoma 11p15 cerca de IGF2 y H 19. El gen homólogo-2 achaete-scute de ratón (MASH2) codifica un factor de transcripción que juega un papel en el desarrollo del trofoblasto. El gen Mash2 está sometido a impronta paternalmente en el ratón, y la carencia de la expresión de ASCL2 humano en los moles hidatidiformes no malignos (androgenétioos) indica que el Ascl2 humano se somete a impronta también en el ser humano.
Los genes Ascl2 son miembros de la familia hélice- lazo-hélice básica (BHLH) de factores de transcripción. Activan la transcripción uniéndose a la caja E (5'-CANNTG-3'). Se requiere la dimerización con otras proteínas de BHLH para una eficaz unión de ADN. Están involucrados en la determinación de los precursores neuronales en el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central en Drosophila melanogaster, y probablemente también en mamíferos.
La hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º: 1 es la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID N.º: 6. Esta hebra comprende también otras dos secuencias de codificación de polipéptidos. La primera secuencia de codificación de polipéptidos (nucleótido 1184 a 399 de la SEC ID N.º: 1, nucleótido 608 a 1393 de la SEC ID N.º: 6) codifica un polipéptido de 262 aminoácidos, el polipéptido de SEC ID N.º: 3. La segunda secuencia de codificación de polipéptidos (nucleótido 840 a 262 de la SEC ID N.º: 1, nucleótido 952 a 1530 de la SEC ID N.º: 6) codifica un polipéptido de 193 aminoácidos, el polipéptido de la SEC ID N.º: 11. La secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de la SEC ID N.º: 3 y de la SEC ID N.º: 11 puede ser idéntica a la secuencia de codificación de polipéptidos contenida en la SEC ID N.º: 6 o puede ser una secuencia diferente a la contenida en la SEC ID N.º: 6, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, codifica también los polipéptidos de las SEC ID N.º: 3 y 11. El polipéptido de la SEC ID N.º: 3 se encuentra estructuralmente relacionado con otras proteínas de la familia de la proteína coactivadoras de ayuste, teniendo homología y/o similitud estructural con la subunidad coactivadora de ayuste del Homo sapiens srm300 (acceso al banco genético AAF21439). El polipéptido de la SEC ID N.º: 11 no se encuentra relacionado con ninguna proteína conocida. Las secuencias polipeptídicas como se exponen en la SEC ID N.º: 3 y la SEC ID N.º: 11, y las secuencias de polinucleótidos como se exponen en la SEC ID N.º: 6 son novedosas.
Se espera que los polipéptidos y polinucleótidos preferidos tengan, entre otras cosas, funciones/propiedades biológicas similares a las de sus polipéptidos y polinucleótidos homólogos. Además, los polipéptidos preferidos, fragmentos inmunológicos y polinucleótidos de la presente invención tienen al menos una actividad bien de SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3 o bien de SEC ID N.º: 11 según sea apropiado.
También se describe en esta invención secuencias parciales u otras secuencias de polinucleótidos y polipéptidos incompletas que se identificaron primeramente antes de la determinación de las secuencias completas correspondientes de la SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3 y SEC ID N.º: 11.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, es un polinucleótido aislado que:
- (a)
- comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, incluso más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, con SEC ID N.º: 4 y 5, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 4 y 5.
- (b)
- tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, incluso más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, con la SEC ID N.º: 1 o SEC ID N.º: 6 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 4 y SEC ID N.º: 5 respectivamente;
- (c)
- el polinucleótido de SEC ID N.º: 4 y SEC ID N.º: 5; o
- (d)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, incluso más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 2 y SEC ID N.º: 7 respectivamente, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2 y 7, asi como también polinucleótidos de SEC ID N.º: 4 y 5.
También se describe en esta invención un polipéptido que:
- (a)
- comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, con la de SEC ID N.º: 2 y 7, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2 y 7.
- (b)
- tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 2 ó 7 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2 ó 7;
- (c)
- comprende el aminoácido de SEC ID N.º: 2 ó 7; y
- (d)
- es el polipéptido de SEC ID N.º: 7;
así como también polipéptidos codificados por un polinucleótido que comprende la secuencia contenida en SEC ID N.º: 4 y 5.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse usando técnicas de clonación y rastreo convencionales, a partir de una biblioteca de cADN derivado de mARN en células de cáncer de colon humano, (por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)). Los polinucleótidos pueden obtenerse también a partir de fuentes naturales tales como bibliotecas de ADN genómicas o pueden sintetizarse usando técnicas comercialmente disponibles y bien conocidas.
Cuando los polinucleótidos se usan para la producción recombinante de polipéptidos, el polinucleótido puede incluir la secuencia de codificación para el polipéptido maduro, por si mismo; o la secuencia de codificación para el polipéptido maduro en marco de lectura con otra secuencias de codificación, tales como aquellas que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o prepro-proteína, u otras porciones de péptido de condensación. Por ejemplo, una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado puede codificarse. En algunas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824, o es una etiqueta de HA. El polinucleótido puede contener también las secuencias 5' y 3' de no codificación, tal como secuencias no traducidas, transcritas, señales de ayuste y poliadenilación, sitios de unión a ribosoma y secuencias que estabilizan el mARN.
Realizaciones adicionales incluyen polinucleótidos que codifican variantes de polipéptido las cuales comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 13 o SEC ID N.º: 15 y en los que se substituyen, eliminan o agregan, en cualquier combinación varios residuos de aminoácidos, por ejemplo, de 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 1 a 2 ó 1.
Los polinucleótidos que son idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID N.º: 1 o en la SEC ID N.º: 6, pueden usarse como sondas de hibridización para cADN y ADN genómico o como cebadores para una reacción de amplificación de ácido nucléico (PCR), para aislar cADNs de longitud total y clones genómicos que codifican polipéptidos de la presente invención y para aislar cADN y clones genómicos de otros genes (que incluyen genes que codifican parálogos derivados de fuentes humanas y ortólogos y parálogos derivados de especies diferentes a la humana) que tienen una similitud de secuencia alta a SEC ID N.º: 1 o a SEC ID N.º: 6. Normalmente estas secuencias de nucleótidos son idénticas al 70 %, preferentemente idénticas al 80 %, más preferentemente idénticas al 90 %, lo más preferentemente idénticas al 95 % a la del referente. Las sondas o cebadores comprenderán generalmente al menos 15 nucleótidos, preferentemente, al menos 30 nucleótidos y pueden tener al menos 50 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Los cebadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos. En particular, podrían usarse polipéptidos o polinucleótidos derivados de secuencias de origen animal homólogo como inmunógenos para obtener una respuesta inmune reactiva al gen humano.
Un polinucleótido que codifica un polipéptido, incluyendo homólogos derivados de especies diferentes a la humana, puede obtenerse por un proceso que comprende las etapas de rastrear una biblioteca apropiada en condiciones de hibridización rigurosas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de la SEC ID N.º: 1 o SEC ID N.º: 6 o un fragmento de las mismas; y aislando el cADN de longitud completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. Tales técnicas de hibridización son bien conocidas por el experto. Las condiciones de hibridización rigurosas preferidas incluyen incubación durante toda una noche a 42 °C en una solución que comprende: formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM de NaCI, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH de 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado; seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 °C. Por tanto se describe también aquí polinucleótidos obtenibles al examinar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridización rigurosas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de la SEC ID N.º: 1 o SEC ID N.º: 6 o un fragmento de las mismas.
El experto en la materia apreciará que, en muchos casos, estará incompleta una secuencia de cADN aislada, porque la codificación de la región para el polipéptido es corta en el extremo 5' del cADN.
Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por aquellos expertos en la materia para obtener cADNs de longitud total, o que extienden cADNs cortos, por ejemplo, aquellos basados en el procedimiento de Amplificación Rápida de los extremos de cADN (RACE) (véase, por ejemplo, Forman y col., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Las
modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathón™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de cADNs más grandes. En la tecnología Marathón™, los cADNs se han preparado a partir de mARN extraído de un tejido seleccionado y una secuencia 'adaptadora' ligada a cada extremo. Después se lleva a cabo la amplificación de ácido nucléíco (PCR) para amplificar el extremo 5' “perdido” del cADN usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen y específicos de adaptador. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para fusionarse dentro del producto amplificado (normalmente un cebador específico de adaptador que fusiona el 3' adicional en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que fusiona el 5' adicional en la secuencia de genes conocida). Los productos de esta reacción pueden analizarse después secuenciando ADN y cADN de longitud completa construidos ya sea al unir el producto directamente al cADN existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador de 5'.
Los polipéptidos recombinantes pueden prepararse por procesos bien conocidos en la materia a partir de células huésped genéticamente modificadas que comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con lo anterior se describe, en un aspecto adicional, un sistema de expresión el cual comprende un polinucleótido de la presente invención, a células huésped que se diseñan genéticamente con tales sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Pueden emplearse también sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas que usan ARNs derivados de las construcciones de ADN.
Para la producción recombinante, las células huésped pueden modificarse genéticamente para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos para polinucleótidos.
La introducción de polinucleótidos en células huésped puede efectuarse por los procedimientos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Tales procedimientos preferidos incluyen, por ejemplo, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga con cucharón, introducción balística o infección.
Preferentemente las proteínas de la invención se coexpresan con tioredoxina en trans (TIT). Se prefiere la coexpresión de tioredoxina en trans frente a en cis para mantener el antígeno libre de tíoredoxina sin necesidad de proteasa. La coexpresión de tioredoxina facilita la solubilízación de las proteínas de la invención. La coexpresión de tioredoxina tiene también un impacto significativo en la producción de purificación de proteína, en la solubilidad y calidad de la proteína purificada.
Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células Aspergillus; células de insectos tales como células Sf2 de Drosophila y células Sf9 de Spodoptera; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y de melanoma de Bowles; y células vegetales.
Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episomales, y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorabia y retrovirus y vectores derivados de las combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan también la expresión de engendramiento. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector que sea capaz de mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de nucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión por cualquier variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tal como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (supra). Pueden incorporarse señales de secreción apropiadas al polipéptido deseado para permitir la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria 1 recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno e inducción de las respuestas inmunes.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunogénicos se introducen en células adecuadas de huésped mamífero para la expresión usando cualquier número de sistemas virales conocidos. En una realización ilustrada, los retrovirus proporcionan una plataforma eficaz y conveniente para sistemas de suministro genético. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polipéptido de la presente invención puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales que usan técnicas conocidas en la materia. El virus recombinante puede aislarse y suministrarse después a un paciente. Se ha descrito un cierto número de sistemas retrovirales ilustrativos {por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,219,740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5¬14; Scarpa y col. (1991) Virology 180:849852; Burns y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
Además, también se ha descrito un cierto número de sistemas ilustrativos basados en adenovirus. A diferencia de los retrovirus que se integran al genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando en consecuencia los riesgos asociados con la mutagénesis de inserción (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267274; Bett y col., (1993) J. Virol. 67:591 1-5921; 15 Mittereder y col. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth y col. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr y col. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L, (1988) BioTechniques 6:616-629; y Rich y col. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).
Se han desarrollado también diversos sistemas de vector de virus adeno-asociado (AAV) para el suministro de polinucleótidos. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas bien conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, las Patentes de E.U. Nos. 5,173,414 y 5,139,941; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski y col. (1988) Molec. Cell. Biol.. 8:3988-3996; Vincent y col. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Cárter, B. J. (1992) Current opinion ¡n Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. ' (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793¬801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou y col. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1 875.
Vectores virales adicionales útiles para suministrar moléculas de ácido nucléico que codifican los polipéptidos por transferencia genética incluyen aquellos derivados de la familia de virus de viruela, tal como los virus de vacunas y el virus de la viruela aviaria. A modo de ejemplo, los recombinantes de virus de vacunas que expresan moléculas novedosas pueden construirse como se explica a continuación. El ADN que codifica un polipéptido se inserta primeramente en un vector apropiado de manera que se encuentra adyacente a un mejorador de vacunas y flanqueando las secuencias de ADN de vacunas, tal como la secuencia que codifica la quinasa de timidina (TK).
Este vector se usa después para transfectar células que se infectan simultáneamente con las vacunas. La recombinación homóloga sirve para insertar el mejorador de vacunas más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinate TK.sup.(-) resultante puede seleccionarse al cultivar las células en presencia de 5-bromodeoxiuridina y recogiendo placas virales resistentes a la misma.
Un sistema de transfección/infección basado en vacunas puede usarse convenientemente para proporcionar la expresión o coexpresión inducible. transitoria, de uno o más polipéptidos descritos en el presente documento en las células huésped de un organismo. En este sistema particular, las células se infectan primero in vitro con un recombinante de virus de vacunas que codifica el bacteriófago de polimerasa de ARN de T7. Esta polimerasa exhibe especificidad exquisita porque transcribe solamente plantillas que soportan mejoradores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el polinucleótido o polinucleótidos de interés, accionadas por un mejorador T7. La polimerasa expresada en el citoplasma a partir del recombinante d virus de vacunas transcribe el ADN transfectado en ARN que se traduce después en polipéptido por la maquinaria de traducción de huésped. El procedimiento se proporciona para la producción citoplásmica, transitoria, de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véase, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126,
Alternativamente, los virus de la viruela aviaria, tal como los virus de viruela de aves de corral y de viruela de canario, pueden usarse también para suministrar las secuencias de codificación de interés. Los virus de viruela aviaria recombinantes, que expresan inmunógenos a partir de patógenos mamíferos, son conocidos por conferir inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviarias. El uso de un vector de viruela aviaria es particularmente deseable en la especie humana y otras especies de mamíferos dado que los miembros del género de viruela aviaria solamente pueden replicar productivamente en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infectivas en células mamíferas. Los procedimientos para producir virus de viruela aviaria recombinantes son conocidos en la materia y emplean recombinación genética, como se describe anteriormente con respecto a la producción de virus de vacunas. Véase, por ejemplo, WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545.
Puede usarse cualquiera de entre un cierto número de vectores de alfavirus para el suministro de composiciones de polinucleótido, tal como aquellos vectores descritos en las Patentes de E.E.U.U. N.ºs 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035 y 6,015,694. También pueden usarse algunos vectores basados en la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), ejemplos ilustrativos de la cual se pueden encontrar en la Patentes de E.E.U.U. N.ºs 5,505,947 y 5,643,576.
Además, los vectores conjugados moleculares, tal como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael y col. J. Biol.. Chem. (1993) 268:6866-6869 y Wagner y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103, puede usarse también para el suministro genético en la invención.
Información ilustrativa adicional sobre éstos y otros sistemas de suministro virales conocidos puede encontrarse, por ejemplo, en Fisher-Hoch y col., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner y col., Vaccine 8:17-21, 1990; las Patentes de E.E.U.U. N.ºs 4,603,112, 4,769,330, y 5,017,487; documento WO 89/01973; Patente de E.E.U.U. N.ºs 4,777,127: documentos GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 25 6:616-627, 1988; Rosenfeld y col., Science 252:431-434, 1991; Kolls et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1 1498-1 1502, 1993; Guzman y col., Circulation 88: 2838-2848, 1993; y Guzman y col., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.
Los microorganismos vivos recombinantes descritos anteriormente pueden ser virulentos, o atenuarse de diversas maneras con objeto de obtener vacunas vivas.
En algunas realizaciones, puede integrarse un polinucleótido al genoma de una célula objetivo. Esta integración puede estar en la posición y orientación específicas por medio de recombinación homóloga (reemplazo genético) o puede integrarse en una posición aleatoria, no específica (aumento genético). En realizaciones aún adicionales, el polinucleótido puede mantenerse establemente en la célula como un segmento episomal separado de ADN. Tales segmentos de polinucleótido o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y réplica independiente de o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. La manera en la que se suministra la construcción de expresión a una célula y en donde permanece el polinucleótido en la célula depende del tipo de construcción de expresión empleado.
En otra realización de la invención, se administra/suministra un polinucleótido como ADN "puro", por ejemplo, como se describe en Ulmer y col., Science 259:1745-1749, 1993 y se revisa por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La captación de ADN puro puede aumentar al recubrir el ADN en cuentas biodegradables, que se transportan eficazmente a las células.
Todavía en otra realización, puede suministrarse una composición a través de un planteamiento de bombardeo de partículas, del cual se ha descrito mucho. En un ejemplo ilustrativo, puede alcanzarse la aceleración de partículas accionada por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, RU) y Powderject Vaccines, Inc. (Madison, Wl), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de E.E.U.U. N.ºs 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; y la Patente de EP N.º 0500 799. Este planteamiento ofrece un planteamiento de suministro libre de aguja en el que una formulación seca en polvo de partículas microscópicas, tal como partículas de polinucleótido o polipéptido, se aceleran a alta velocidad en un chorro de gas helio generado por un dispositivo portátil, impulsando las partículas dentro de un tejido objetivo de interés.
En una realización relacionada, otros dispositivos y procedimientos que pueden ser útiles para la inyección sin agujas accionada por gas de composiciones de la presente invención incluyen aquellos proporcionados por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patente de E.E.U.U. N.ºs 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 y 5,993,412.
Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes por procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o de intercambio catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófobica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectína. Lo más preferentemente, se emplea la cromatografía de afinidad de metal de ión (IMAC) para purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para volver a plegar las proteínas a fin de regenerar la conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento intracelular y/o purificación intracelular.
Esta invención se refiere también con el uso de polinucleótidos, en forma de cebadores derivados de los polinucleótidos de la presente invención y de polipéptidos, en forma de anticuerpos o agentes reactivos específicos para el polipéptido de la presente invención, como agentes reactivos de diagnóstico.
La identificación de marcadores genéticos o bioquímicos en la sangre o en los tejidos que permitirán la detección de cambios muy precoces en la trayectoria de carcinogénesis ayudará a determinar el mejor tratamiento para el paciente. Los marcadores de tumor substitutos, tales como la expresión de polinucleótido, pueden usarse para diagnosticar diferentes formas y estados de cáncer. La identificación de niveles de expresión de los polinucleótidos de la invención será útil tanto en la definición de etapas del trastorno canceroso como para evaluar la naturaleza del tejido canceroso. El proceso de definición de etapas realiza un seguimiento del avance del cáncer y se determina en presencia o ausencia de tejido maligno en las áreas sometidas a biopsia. Los polinucleótidos de la invención pueden ayudar a perfeccionar los procesos de definición de etapas identificando los marcadores para la agresividad de un cáncer, por ejemplo, la presencia en áreas diferentes del cuerpo. La evaluación del cáncer describe cuán estrechamente se parece un tumor a tejido normal de su mismo tipo y se evalúa por su morfología celular y otros marcadores de diferenciación. Los polinucleótidos de la invención pueden ser útiles para determinar el grado del tumor ya que ayudan en la determinación de los diferentes estados de las células de un tumor.
Los ensayos de diagnóstico ofrecen un proceso para diagnosticar o determinar una susceptibilidad a cánceres, enfermedad autoinmune y afecciones relacionadas mediante diagnóstico por procedimientos que comprenden la determinación de una muestra derivada de un sujeto en nivel de polipéptido o mARN anormalmente reducido o elevado. Este procedimiento de diagnóstico es conocido como expresión diferencial. La expresión de un gen particular se compara entre un tejido enfermo y un tejido normal. Se compara una diferencia entre el gen relacionado con el polinucleótido, mARN, o proteína en los dos tejidos, por ejemplo, en peso molecular, secuencia de aminoácido o nucleótido, o abundancia relativa, indicando un cambio en el gen, o un gen que lo regula, en el tejido del humano que se sospecha esá enfermo.
La disminución o el aumento de la expresión puede medirse al nivel de ARN. El ARN de poliA se aísla primeramente de los dos tejidos y la detección de mARN codificada por un gen correspondiente a un polinucleótido expresado diferencialmente de la invención puede detectarse por ejemplo, por hibridización in situ en secciones de tejidos, por PCR de transcriptasa reversa, usando pruebas de bandas de Northern que contienen poli A + ARNm, o cualquier otro procedimiento de detección de ARN directo o indirecto. Una expresión en aumento o en disminución de un ARN dado en un tejido enfermo comparado con un tejido normal sugiere que la transcripción y/o la proteína expresada tiene un papel en la enfermedad. Consecuentemente la detección de un nivel superior o inferior de mARN correspondiente a la SEC ID N.º: 1 con relación al nivel normal es indicativa de la presencia de cáncer en el paciente.
Los niveles de expresión de mARN en una muestra pueden determinarse por la generación de una biblioteca de etiquetas de secuencia expresadas (EST) a partir de la muestra. La representación relativa de EST en la biblioteca puede usarse para evaluar la representación relativa de la transcripción genética en la muestra de inicio. El análisis de EST de la prueba puede compararse después con el análisis de EST de una muestra de referencia para determinar los niveles de expresión relativos del polinucleótido de interés.
Pueden llevarse a cabo otros análisis de mARN usando análisis en serie de la metodología de expresión genética (SAGE) (Velculescu y col., Science (1995) 270:484), metodología de exhibición diferencial (por ejemplo, documento US 5,776,683) o análisis de hibridización que depende de la especificidad de las interacciones de nucleótidos.
Alternativamente, la comparación podría hacerse a nivel de proteína. Los tamaños de la proteína en los dos tejidos pueden compararse usando anticuerpos para detectar polipéptidos en los análisis de bandas de Western de los extractos de proteína de los dos tejidos. Los niveles de expresión y localización subcelular pueden detectarse también inmunológicamente usando los anticuerpos para la proteína correspondiente. Las técnicas de prueba adicionales que pueden usarse para determinar los niveles de una proteína, tal como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Un nivel en aumento o en disminución de expresión de polipéptido en el tejido enfermo en comparación con el mismo nivel de expresión de proteínas en el tejido normal indica que la proteína expresada puede estar implicada en la enfermedad.
En los ensayos de la presente invención el diagnóstico se puede determinar por detección de niveles de expresión de producto génico codificado por al menos una secuencia descrita en SEC ID Nº 1. Se peude usar también una comparación de los niveles de mARN o proteína en un tejido enfermo frente a normal para seguir el progreso o remisión de una enfermedad.
Se puede ensayar un gran número de secuencias de polinucleótidos en una muestra usando haces de polinucleótidos. Estos se pueden usar para examinar la expresión diferencial de genes y para determinar la función de genes. Por ejemplo, se puede usar haces de secuencias de las secuencias de polinucleótidos SEC ID Nº: 1 para determinar si cualquiera de los polinucleótidos se expresan diferencialmente entre una célula normal y cancerígena. En una realización de la invención una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1 o fragmento de la misma se puede construir para conducir el tamizado eficiente, por ejemplo, de mutaciones genéticas. Los procedimientos por técnica de disposiciones son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión génica, ligadura genética y variabilidad genética (véase, por ejemplo, M. Chee y col., Science, vol 274, páginas 610-613 (1996)).
La "diagnosis" como se usa en el presente documento incluye la determinación de la susceptibilidad de un sujeto a una enfermedad, determinación de si un sujeto tiene actualmente la enfermedad y también la prognosis de un paciente afectado por la enfermedad.
La presente invención se refiere además a un kit de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico que comprende:
a) un polinucleótido de la presente invención, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento de la misma;
b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a), preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 6;
c) un polipéptido de la presente invención, preferentemente el polipéptido de SEC ID Nº: 2 ó 3, o un fragmento del mismo; o
d) un anticuerpo de un polipéptido de la presente invención, preferentemente con el polipéptido de SEC ID Nº: 2 ó 3.
Las secuencias de nucleótidos descritas en esta invención son también de valor para la localización cromosomal. La secuencia se dirige de forma específica a, y puede hidrolizarse con, una localización determinada en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes para los cromosomas es una primera etapa de importancia en la correlación de aquellas secuencias con la enfermedad asociada al gen. Una vez que se ha mapeado una secuencia en una localización cromosomal exacta, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (available on-line through Johns Hopkins University Welch Medical Library). La interrelación entre genes y enfermedades que se han mapeado para la misma región cromosomal se identifica luego mediante análisis de ligadura (concordancia de genes físicamente adyacentes). Se puede determinar también las diferencias en el cADN o secuencia génica entre individuos afectados y no afectados.
Los polipéptidos descritos en este documento o sus fragmentos o análogos de los mismos, o células que los expresan, también pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos descritos en esta invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen substancialmente mayor afinidad por los polipéptidos descritos en esta invención que su afinidad por otros polipéptidos relacionados con la técnica anterior.
En un aspecto adicional, se describe un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunológico del mismo como se describe con anterioridad. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos descritos en la presente invención pueden obtenerse al administrar los polipéptidos o fragmentos de soporte de epitope, análogos o células a un animal, preferentemente un animal que no es un ser humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de linea celular continua. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y col., Immunology Today (1983) 4:72) y la técnica del hibrídoma-EBV (Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla, tales como las descritas en la Patente de los EE.U.U. N.º 4,946,778, pueden adaptarse también para producir anticuerpos de cadena sencilla para polipéptidos de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos, que incluyen otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos anteriormente descritos pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar los polipéptidos por cromatografía de afinidad.
El anticuerpo descrito en esta invención puede emplearse también para evitar o tratar cáncer, particularmente cáncer colorrectal, enfermedad autoinmune y afecciones relacionadas.
"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural. Si una composición o substancia "aislada" se da en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un animal vivo no se encuentra "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural se encuentra "aislado", según se emplea el término en el presente documento.
"Polinucleótido" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, los cuales pueden ser ARN y ADN no modificados o ARN o ADN modificado que incluyen regiones de cadena simple y cadena doble.
"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que mantiene sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere de una secuencia de nucleótidos a otra, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o pueden no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado substituciones de aminoácidos, adiciones, eliminaciones, condensaciones, y truncaciones en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere de una secuencia de aminoácidos a otra, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en lo general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más substituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido substituido o insertado puede o no puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que se dé en la naturaleza tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe si se da en la naturaleza. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no se dan en la naturaleza pueden elaborarse por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.
"Identidad" como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de afinidad de secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como puede ser el caso, según se determina por el acople entre cadenas de tales secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en Computacional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Deveraux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se encuentran diseñados para dar la coincidencia más grande entre las secuencias puestas a prueba. Los procedimientos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas de computadora públicamente disponibles. Los procedimientos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG (Devereux, J y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)). El programa BLAST X se encuentra públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol., 275:403-410 (1990)). Puede usarse también el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.
El algoritmo preferido usado es FASTA. Los parámetros preferidos para la comparación de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que usan este algoritmo incluyen los siguientes:
Penalización de Hueco: 12
Penalización de extensión de Hueco: 4
Tamaño de palabra: 2, máx. 6
Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptidos con otros procedimientos incluyen los siguientes:
1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol.. 48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
Penalización de Hueco: 12
Penalización de Longitud de Hueco: 4
Un programa útil con estos parámetros se encuentra públicamente disponible como el programa de "hueco" de Genetics Computer Group, Madison Wl, Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para las comparaciones polipéptídicas (junto con ninguna penalización para los huecos de extremo).
Los parámetros preferidos para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:
1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: coincidencias = +10, no coincidencias = 0
Penalización de Hueco: 50
Penalización de Longitud de Hueco: 3
Un programa útil con estos parámetros se encuentra públicamente disponible como el programa de "hueco" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para las comparaciones de polinucleótidos.
A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia del SEC ID N.º: 1, es decir, que sea idéntica al 100 %, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Tales alteraciones se seleccionan a partir del grupo que consiste en al menos una eliminación, substitución, de nucleótido, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en el que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interdistribuidas sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina al multiplicar el número total de nucleótidos en la SEC ID N.º: 1 por el porcentaje numérico de la respectiva identidad porcentual (dividida por 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID N.º. 1, o:
en la que nn es el número de alteraciones de nucleótido, xn es el número total de nucleótidos en la SEC ID N.º: 1 e y es, por ejemplo, 0,70 para el 70 %, 0,80 para el 80 %, 0,85 para el 85 %, 0,90 para el 90 %, 0,95 para el 95 %, etc., y en la que cualquier producto no entero de xn e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restarlo de xn. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de la SEC ID N.º: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, con un sentido erróneo o con una lectura errónea, en esta secuencia de codificación y alteran de este modo el polipéptido codificado por el polinucleótido siguiendo tales alteraciones.
De forma similar, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID N.º: 2, es decir puede ser idéntica al 100 %, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera tal que el % de identidad es menor que 100 %. Tales alteraciones se seleccionan a partir del grupo que consiste en al menos una eliminación, substitución, de aminoácido, incluyendo substitución, o inserción, conservadora y no conservadora, y en el que pueden ocurrir dichas alteraciones en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interdistribuidas bien sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien sea en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones aminoacídicas para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID N.º: 2 por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido entre 100) y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID N.º: 2, o:
na ≤ xa - (xa • y),
en la que na es el número de alteraciones de aminoácido, xa es el número total de aminoácidos en la SEC ID N.º: 2, e y es, por ejemplo, 0,70 para el 70 %, 0,80 para el 80 %, 0,85 para el 85 %, etc., y en la que cualquier producto no entero de xa e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restarlo de xa.
"Homólogo" es un término genérico usado en la técnica para indicar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica que posee un alto grado de relación de secuencias con una secuencia de sujeto. Tal relación puede cuantificarse determinando el grado de identidad y/o similitud entre las secuencias que se comparan como se describió anteriormente. Dentro de este término genérico se encuentran los términos "ortólogo", que significa un polinucleótido
o polipéptido que es el equivalente funcional de un polinucleótido o polipéptido en otra especie y "parálogo" que significa una secuencia funcionalmente similar cuando se considera dentro de la misma especie.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1: muestra datos de PCR en tiempo real usando la sonda de Taqman. La leyenda es como se explica acontinuación: Glándula adrenal: Ad_GI; Vejiga: Bl; Médula Ósea: Bo_Ma, Cuello del útero: Ce; Colon: Co; Trompa de Falopio: Fa_Tu; Ileon: II; Hígado: Li; Pulmón: Lu; Nodo linfático: Ly_No; Esófago: Oe, Glándula paratiroides: Pa_Thy; Placenta: Pl; Próstata: Pr, Recto: Re; Piel: Sk; Músculo esquelético; Sk_Mu; Intestino delgado: Sm_ln; Bazo; Sp; Testículo: Te; Glándula tiroides: Thy; Tráquea: Tr.
Figura 2 muestra la expresión de PCR en tiempo real usando el protocolo de Sybr. La leyenda es como sigue:Glándula adrenal: Ad_GI; Vejiga: Bl; Médula Ósea: Bo_Ma; Cuello del útero: Ce; Nodo linfático: Ly_No; Esófago: Oe, Glándula paratiroides: Pa_Thy; Placenta: Pl; Próstata; Pr, Recto: Re; Piel: Sk; Músculo esquelético: Sk_Mu; Intestino delgado: Sm_ln; Bazo: Sp; Testículo: Te; Glándula tiroides: Thy; Tráquea: Tr, Corazón: He.
Figura 3 muestra SDS PAGE teñida con azul de Coomassie del extracto celular de la cepa que expresa CASB7439. La pista 1 muestra los marcadores moleculares, la pista 2 el extracto celular inducido 5 h a 39 °C; la pista 3 muestra el sobrenadante de extracto celular inducido; y la pista 4 muestra el sedimento de extracto celular inducido.
Figura 4 muestra un análisis de bandas de Western de la proteína expresada NS1-CASB7439. El gel se carga con el extracto celular de la cepa que expresa CASB7439 y se revela con anticuerpo monoclonal anti-NS1.
Figura 5 muestra SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie de CASB7439 después de la purificación. Las pistas 1 y 5 representan 25 los marcadores de peso molecular; las pistas 2, 3, 4 se cargan respectivamente con 2 μl, 4 μl, y6 μl de proteína purificada.
Figura 6 muestra un análisis de bandas de Western de CASB7439 después de la purificación a medida que se revela por un anticuerpo monoclonal de anti-polihistidina.
Ejemplos
Ejemplo 1
Análisis RT-PCR en tiempo real
RT-PCR en tiempo real (U, Gibson. 1996 Genome Research: 6,996) se usa para comparar la abundancia de transcripción de mARN del antigeno candidato en tejidos de colon normales y tumorales que coinciden provenientes de múltiples pacientes. Además, también se evalúan los niveles de mARN del gen candidato en un panel de tejidos normales por este planteamiento.
El ARN total derivado del colon normal y tumoral se extrae de biopsias congeladas que usan el agente reactivo TriPure (Boehringer). El ARN total derivado de los tejidos normales se adquiere a InVitrogen o se extrae de las biopsias congeladas usando el agente reactivo TriPure. Se purifica poli-A+mARN del total de mARN después del tratamiento de ADNasa usando cuentas magnéticas de oligo-dT (Dynal). La cuantificación del mARN se lleva a cabo por espectrofluorimetría (VersaFluor, BioRad) usando la tinción Sybrll {Molecular Probes). Los cebadores para la amplificación de PCR en tiempo real se encuentran diseñados con el software Primer Express de Perkin-Elmer usando las opciones por defecto para las condiciones de amplificación de Taqman.
Las reacciones en tiempo real se ensamblan de acuerdo con los protocolos de PCR convencionales usando 2 ng de mARN purificado para cada reacción. Se agrega la tinción Sybrl (Molecular Probes) en una dilución final de 1/75000 para la detección en tiempo real. La amplificación (40 ciclos) y la detección en tiempo real se lleva a cabo en un sistema Byosystems PE7700 de Perkin-Elmer usando las configuraciones convencionales del instrumento. Los valores Ct se calculan usando el software de Detector de Secuencia PE7700. Se obtienen varios valores Ct para cada muestra: para las muestras de paciente, el tumor Ct (CtT) y los valores de colon normal acoplado Ct (CtN) en el TAA candidato y para el panel de muestras de tejido normal, un CtXY para cada tejido normal XY. Se calcula también otro Ct (CtA) en el gen de Actina, como una referencia interna, para todas las muestras. Alternativamente, la amplificación de PCR en tiempo real puede someterse a seguimiento usando una sonda de Taqman. La amplificación (40 ciclos) y la detección en tiempo real se llevan a cabo en un sistema de Biosystems PE7700 de Perkin-Elmer usando las configuraciones convencionales el instrumento. Los valores de Ct se calculan usando el Software Detector de Secuencia PE7700. Los valores de Ct se obtienen de cada muestra de tejido para el mARN objetivo (CtX) y para el mARN de actina (CtA).
A medida que la eficacia de la amplificación de PCR en las condiciones experimentales prevalecientes se encuentra próxima a la eficacia de amplificación teórica, el valor 2(CtN/T/XY-CtA) es un cálculo del nivel de transcripción de TAA relativo de la muestra, estandarizado con respecto al nivel de transcripción de la Actina. Un valor de 1 sugiere en consecuencia que el antigeno candidato y la Actina tienen el mismo nivel de expresión.
Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron primeramente en colon tumoral y acoplando el colon normal
5 derivado de biopsias de 12 pacientes. Las reacciones se llevaron a cabo sobre un conjunto de datos más completos totalizando 18 pacientes (se incluyen en este conjunto de datos los primeros 12 pacientes). Los duplicados para 6 de estos 18 pacientes se realizaron en este conjunto de datos. Se probaron seis pacientes adicionales, y los resultados se guardaron con los 18 anteriores. La estadística en la el conjunto de datos guardados final se muestra en la tabla 3, y se ilustra en la figura 1.
10 Se probó también una serie de 48 muestras de tejido normal, representando 29 tejidos diferentes, mediante el mismo procedimiento (los tejidos normales analizados se dan en la Tabla 3). Los niveles de transcripción de TAA se calculan como se describió con anterioridad. La proporción de pacientes que sobre-expresan el antígeno candidato, así como también el promedio de sobre-expresión de transcripción contra tejidos normales se calcula también a partir de este conjunto de datos. Los resultados se ilustran en la figura 1.
- % de pacientes con un nivel de mARN superior en colon, tumoral acoplado (pacientes positivos)
- 92 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 3 veces superior en colon tumoral acoplado
- 92 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 10 veces superior en colon tumoral acoplado
- 92 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 3 veces inferior en colon tumoral acoplado.
- 8 %
- Nivel promedio de mARN de colon normal acoplado (Actina estandarizada)
- 0,0026
- Nivel promedio de mARN de colon tumoral acoplado en pacientes positivos (Actina estandarizada)
- 0,265
- Promedio de veces de sobre-expresión de mARN
- 2028
- Mediana de veces de sobreexpresión de mARN
- 115
- Promedio de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0079
- Mediana de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0016
- Promedio de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0064
- Mediana de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0017
- % de pacientes con un nivel de mARN superior al de los tejidos normales promedio
- 92 %
- % de pacientes con un nivel de mARN superior a 10 veces el promedio de los tejidos normales
- 75 %
- Tejidos normales no dispensables superiores a la media del nivel de mARN del tejido normal
- Ninguno
Tabla 2: Resultados de expresión de PCR en tiempo real CASB743 : conjunto de datos de 18 pacientes
- % de pacientes con un nivel de mARN superior en colon tumoral acoplado (pacientes positivos)
- 89 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 3 veces superior en colon tumoral acoplado
- 89 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 10 veces superior en colon tumoral acoplado
- 78 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 3 veces inferior en colon tumoral acoplado.
- 5 %
- Nivel promedio de mARN de colon normal acoplado (Actina estandarizada)
- 0,005
- Nivel promedio de mARN de colon tumoral acoplado en pacientes positivos (Actina estandarizada)
- 0,152
- Promedio de veces de sobre-expresión de mARN
- 1100
- Mediana de veces de sobre-expresión de mARN
- 60
- Promedio de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0065
- Mediana de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0015
- Promedio de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,005
- Mediana de nivel de mARN de tejidos normales
- 0,0015
- % de pacientes con un nivel de mARN superior al de la mediana de los tejidos normales promedio
- 94 %
- % de pacientes con un nivel de mARN superior a 10 veces la mediana de los tejidos normales
- 94 %
- Tejidos normales no dispensables superiores a la mediana del nivel de mARN del tejido normal
- Ninguno
Tabla 3: Resultados de expresión de PCR en tiempo real CASB743 : conjunto de datos de 24 pacientes
- % de pacientes con un nivel de transcripción de CASB7439 superior en colon tumoral que el colon normal adyacente (pacientes positivos)
- 92 %
- % de pacientes positivos con un nivel de transcripción de CASB7439 al menos 10 veces superior en el colon tumoral que el colon normal adyacente
- 75 %
- Promedio de veces de sobre-expresión de transcripción en tumores de pacientes positivos
- 1289
- % de pacientes con un nivel de transcripción de CASB7439 superior en el colon tumoral que el promedio de tejido normal
- 96 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 10 veces superior en colon tumoral que el promedio de tejido normal
- 62,5 %
- Tejidos normales en donde la expresión de transcripción de CASB7439 es equivalente al nivel de transcripción tumoral en tumores
- Ninguno
Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo también usando el protocolo Taqman (como se describió anteriormente) en colon tumoral y colon normal adyacente de las biopsias de 6 pacientes. Se tomaron tres mediciones duplicadas para cada uno, y se usó el promedio para cálculos posteriores. Los resultados se muestran en la Figura 1. Además, se probaron también 36 muestras de tejido normal, representando 28 tejidos diferentes (véase tabla 5) por el mismo procedimiento. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Tabla 4: Resultados de expresión de PCR en tiempo real CASB7439 usando la sonda de Taqman
- Número de muestras tumorales proveniente de diferentes pacientes
- 6
- % de pacientes positivos con un nivel de transcripción de CASB7439 superior en colon tumoral que el colon normal adyacente (pacientes positivos)
- 100 %
- % de pacientes positivos con un nivel de transcripción de CASB7439 al menos 10 veces superior en el colon tumoral que el colon normal adyacente
- 83 %
- Promedio de veces de sobre-expresión de transcripción en tumores de pacientes positivos
- 109
- % de pacientes con un nivel de transcripción de CASB7439 superior en el colon tumoral que el promedio de tejido normal
- 100 %
- % de pacientes con un nivel de mARN al menos 10 veces superior en colon tumoral que el promedio de tejido normal
- 100 %
- Tejidos normales en donde la expresión de transcripción de CASB7439 es equivalente al nivel de transcripción tumoral en tumores
- Ninguno
Los resultados sugieren claramente que la transcripción de CASB7439 se sobre-expresa en tumores colorrectales en comparación con el colon normal adyacente y con todos los tejidos normales anteriormente mencionados. Más
10 del 90 % de los pacientes sobre-expresan fuertemente la transcripción de CASB7439 en el tumor, en comparación con el colon adyacente normal. El promedio de veces de sobre-expresión en los tumores es al menos 100. Además, más del 90 % de los pacientes sobre-expresan la transcripción de CASB7439 en tumores colorrectales en comparación con otros tejidos normales, más del 60 % de ellos sobre-expresándolo al menos 10 veces.
- Tejido
- Abreviatura
- Glándula adrenal
- Ad-Gl
- Aorta
- Ao
- Vejiga
- Bl
- Médula ósea
- Bo_Ma
- Cerebro
- Bra
- Cuello de útero
- Ce
- Colon
- Co
- Trompa de Falopio
- Fa_Tu
- Corazón
- He
- Ileon
- Il
- Riñón
- Ki
- Hígado
- Li
- Pulmón
- Lu
- Nódulo linfático
- Ly_No
- Esófago
- Oe
- Glándula paratiroides
- Pa_Thy
- Recto
- Re
- Piel
- Sk
- Músculo esquelético
- Sk_Mu
- Intestino delgado
- Sm_il
- Bazo
- Sp
- Estómago
- St
- Glándula tiroides
- Thyt
- Tráquea
- Tra
- Ovario
- Ov
- Placenta
- Pl
- Próstata
- Pr
- Testículo
- Te
Rastreo diferencial de disposiciones de cADN.
La identificación de genes asociados con tumores en la biblioteca de cADN substraída se realiza por rastreo 5 diferencial.
El total de ADN bacteriano se extrae de 100 μl en cultivos que se dejan reposar toda una noche. Las bacterias se someten a lisis con isotiocianato de guanidio y el ADN bacteriano se purifica por afinidad usando un vaso magnético (Boehringer). Las inserciones de plásmido se recuperan del ADN bacteriano mediante amplificación de PCR Advantage (Clontech). Los productos de PCR se transfieren a dos membranas de nilón para producir arreglos de 10 cADN de alta densidad usando la herramienta Biomek 96 HDRT (Beekman). El cADN transferido se enlaza covalentemente a la membrana por irradiación UV. La primera membrana se hibridiza con una sonda de cADN mezclada preparada a partir del tumor de un solo paciente. La segunda membrana se hibridiza con una cantidad equivalente de sonda de cADN mezclada preparada a partir de colon normal del mismo paciente. La sonda de cADN se prepara por amplificación de PCR como se describe anteriormente y se etiqueta usando el Sistema AlkPhos 15 Direct (Amersham). Las condiciones de hibridización y los lavados en condiciones restrictivas son como se describen en el kit AlkPhos Direct. La sonda hibridizada se detecta por quimioluminiscencia. Las intensidades de hibridización para cada fragmento de cADN o para ambas bandas se miden por densitometría de película o medición directa (BioRad Fluor-S Max). La proporción de intensidades tumor a hibridización normal (T/N) se calcula para cada gen a fin de evaluar el grado de sobre-expresión en el tumor. Se siguen los genes que se sobre-expresan
20 significativamente en tumores de colon. La significación se define arbitrariamente como una desviación estándar de la distribución de frecuencia T/N. Los experimentos de rastreo diferencial se repiten usando ARN proveniente de múltiples donantes pacientes (>18) para calcular la frecuencia de tumores de sobre-expresión en la población de pacientes.
Además, se hibridizan los arreglos de ADN con sondas de cADN mezcladas provenientes de tejidos normales 25 diferentes al colon (ver la lista anterior) para determinar el nivel de expresión del gen candidato en estos tejidos.
Ejemplo 3
Micro-disposiciones de ADN
Las micro-disposiciones (micromatrices o microarrays) de ADN se usan para examinar los perfiles de expresión de mARN de grandes colecciones de genes en múltiples muestras. Esta información se usa para complementar los datos obtenidos por la PCR en tiempo real y proporciona una medición independiente de los niveles de expresión genética en tumores y tejidos normales.
Los ejemplos de tecnologías actuales para la producción de micro-disposiciones de ADN incluyen 1) las disposiciones "GeneChip" de Affymetrix en los cuales se sintetizan los oligonucleótidos sobre la superficie del chip mediante síntesis química de fase sólida usando un proceso fotolitográfico, 2) tecnología de manchado de ADN en la que pequeños volúmenes de una solución de ADN se depositan robóticamente y se inmovilizan después sobre la superficie de una fase sólida (por ejemplo, vidrio). En ambos casos, se hibridan los chips con cADN o cARN que se ha extraído del tejido de interés (por ejemplo, tejido normal, tumor, etc.) y se marcan con radiactividad o con una molécula comunicadora fluorescente. El material etiquetado se hibridiza con el chip y la cantidad de sonda unida a cada secuencia en el chip se determina usando un explorador especializado. El experimento puede configurarse con un solo comunicador fluorescente (o con radioactividad) o, alternativamente, puede realizarse usando dos comunicadores fluorescentes. En este último caso, se etiqueta cada una de las dos muestras con una de las moléculas comunicadoras. Las dos muestras etiquetadas se hibridan después completamente con las secuencias del chip de ADN, La proporción de las dos señales fluorescentes se determina para cada secuencia en el chip. Esta proporción se usa para calcular la abundancia relativa de la transcripción en las dos muestras. Los protocolos detallados se encuentran disponibles a partir de un cierto número de fuentes que incluyen "DNA: Microarrays: A
- practical approach. Scena M, Oxford University(http://cmqm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), distribuidores especializados (por ejemplo, Affymetrix).
- Press http://arra 1999" vit.com/D yNA el Microa World rrav-Prot Wide ocols/) Web y
- Ejemplo 5
- Análisis de bandas de Northern-Southern
Las cantidades limitadas de cADN de colon normal acoplado y de tumor mezclado se amplifican mediante PCR Advantage (véase anteriormente). El ARN mensajero derivado de múltiples tejidos normales se amplifica también usando el mismo procedimiento. El cADN amplificado (1 μg) se somete a electrofóresis en gel de agarosa al 1,2 % y se transfiere a una membrana de nilón. La membrana se hibridiza (Sistema AlkPhos Direct) con una sonda preparada usando un fragmento del cADN de TAA candidato. El análisis de Northern-Southern proporciona información sobre el tamaño de la transcripción, presencia de variantes de ayuste y abundancia de transcripción en tejidos tumorales y normales.
Ejemplo 6
Se producen bandas de Northern de acuerdo con los protocolos convencionales usando 1 μg de poli A + mARN. Se preparan sondas radioactivas usando el sistema Ready-to-Go (Pharmacia).
Ejemplo 7
Identificación experimental de la secuencia de cADN de tramo completo
Las bibliotecas de cADN de tumores de colon se construyen usando el sistema Lambda Zap II (Stratagene) a partir de 5 μg de poliA + mARN. El protocolo suministrado se sigue excepto en que se usa Superscriptll (Life Technologies) para el paso de transcripción inverso. Se construyen las bibliotecas cebadas con oligo dT y cebadas aleatoriamente. Aproximadamente 1,5 x 106 fagos independientes se plaquearon para cada rastreo de la biblioteca. Las placas de fagos se transfieren a filtros de nilón y se hibridizan usando una sonda de cADN etiquetada con AlkPhos Direct. Los fagos positivos se detectan por quimioluminiscencia. Los fagos positivos se excinden de la placa de agrar, se eluyen en 500 μl de regulador de SM y se confirman por PCR específica de gen. Los fagos eluidos se convierten en un solo bacteriófago de cepa M13 por excisión in vivo. El bacteriófago se convierte después en ADN de plásmido de cadena doble cepa por infección de E. coli. Las bacterias infectadas seplaquean y se envían a una segunda ronda de rastreo con la sonda de cADN. El ADN plasmídico se purifica a partir de clones bacterianos positivos y se secuencian en ambas cadenas.
Cuando el gen de longitud completa no pueda obtenerse directamente de la biblioteca de cADN, se aísla la secuencia perdida usando tecnología RACE (Kit de Marathon, ClonTech.). Este planteamiento se basa en la transcripción inversa de mARN en cADN de doble cadena, ligando enlazadores sobre los extremos del cADN y amplificando la extremidad deseada del cADN usando un cebador específico de gen y uno de los oligonucleótidos enlazadores. Los productos de PCR de Marathon se clonan en un plásmido (pCRII-TOPO, InVitrogen) y se secuencian.
El polinucleótido de la SEC ID N.º: 1 se obtuvo usando este procedimiento.
Ejemplo 8
Un planteamiento complementario para la caracterización de expresión de tejido antígeno experimental es explorar
5 la base de datos de EST humanas. Las EST (Etiquetas de Secuencia Expresadas) son pequeños fragmentos de cADN elaborados a partir de una colección de mARN extraído de un tejido o línea celular particular. Tal base de datos proporciona actualmente una cantidad masiva de EST humanas (2 x 106) provenientes de varios miles de bibliotecas tisulares de cADN, incluyendo tejidos tumorales de diversos tipos y estados de enfermedad. Por medio de herramientas informáticas (Blast), se realiza una búsqueda de comparación de la secuencia CASB7439 con
10 objeto de tener una mayor capacidad de penetración en la expresión del tejido.
Distribución de EST de CASB7439:
- Número de acceso al banco genético de EST
- Biblioteca de tejido de cADN de EST
- C00634
- Adulto humano (K. Okubo)
- AA68668
- NCI_CGAP_Co3
- AA565752
- NC l_CG AP_Co 11
- AA565766
- NC l_CG AP_Co 11
- AA565767
- NC l_CG AP_Co 11
- AI337239
- NCI_CGAP_Co16
- AI337448
- NCI_CGAP_Co16
- AI393930
- NCI_CGAP_CLL1
- AI473673
- NCI_CGAP_Co14
- AI632444
- NCI_CGAP_GC6
- A1861937
- NCI_CGAP_Co16
- AI825214
- NCI_CGAP_GC6
- AW080652
- NCI_CGAP_Co19
- AW083899
- NCI_CGAP_Co19
- AW206058
- NCI_CGAP_Sub3
- AW237006
- NCI_CGAP_GC6
- AW364626
- DT0036
- AW449612
- NCI_CGAP_Sub5
Estas EST SE acoplan perfectamente con CASB7439. La lista contiene 9 EST derivadas de 4 bibliotecas de colon tumoral, una EST de una biblioteca de colon normal, 3 EST de una biblioteca de células germinales tumorales, una
15 EST de una biblioteca de células de leucemia de linfocitos crónica, 2 EST de 2 bibliotecas de tumores mezclados, 2 EST provenientes de bibliotecas de tipo desconocido. Esto sugiere claramente, como se esperaba, que CASB7439 se sobre-expresa en tejidos tumorales, con un énfasis en los tejidos tumorales colorrectales, en comparación con los tejidos normales.
Ejemplo 9
20 9.1 Expresión y purificación de antígenos específicos de tumor
La expresión en huéspedes microbianos, o alternativamente en transcripción/traducción in vitro, se usa para producir el antígeno de la invención para propósitos de vacuna y para producir fragmentos de proteína o toda la proteína para la purificación y generación rápida de anticuerpos necesarios para la caracterización de la proteína expresada de forma natural por inmunohistoquímica o para la continuación de la purificación.
Las proteínas recombinantes pueden expresarse en dos huéspedes microbianos, E. coli y en levadura (tal como
5 Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris). Esto permite la selección del sistema de expresión con las mejores características para esta producción de antígeno particular. En general, el antígeno recombinante se expresará en E. coli y la proteína de agente reactivo se expresa en levadura.
La estrategia de expresión involucra primero el diseño de la estructura primaria del antígeno recombinante. En general, se coloca un compañero de condensación de expresión (EFP) en la extremidad de la N-terminal para
10 mejorar los niveles de expresión que podrían incluir también una región útil para modular las propiedades inmunogénicas del antígeno, un compañero de condensación inmune (IFP). Además, se incluye un compañero de condensación (AFP) de afinidad útil para facilitar la purificación adicional en el extremo C-terminal.
Como se mencionó anteriormente, varias construcciones pueden experimentar evaluación comparativa:
Para una expresión y purificación rápidas así como también para una generación de anticuerpos contra CASB7439,
15 se propone generar en E. coli una proteína CASB7439 de tramo completo con NS1 como EFP y una cola de histidina como AFP.
Por lo tanto, se proponen dos construcciones:
Construcción 1: cADN de CASB7439 de tipo silvestre de longitud completa en condensación con cADN de NS1 como EFP y con una cola de histidina que codifica el cADN como un AFP (SEC ID N.º: 8). La
20 secuencia de proteína de condensación codificada es la SEC ID N.º: 10.
Construcción 2: cADN de CASB7439 mutada de longitud completa en condensación con cADN de NS1 como EFP y con una cola de histidina que codifica cADN como un AFP (SEC ID N.º: 9). Se propone en esta construcción tener los primeros 50 codones de cADN de CASB7439 nativo por codones específicos del uso de codón de E. coli, a fin de mejorar el potencial de expresión de CASB7439 en su huésped de E. coli. La
25 secuencia de proteína de condensación codificada es el SEC ID N.º: 10.
El diseño de proteína de CASB7439 es como se muestra a continuación:
Extremo C-terminal
"NS1" es el fragmento N-terminal (80 aminoácidos) de la proteína de Influenza NS1 "HIS" es una cola de
30 polihistidina. La cepa recombinante usada es AR58: un lisógeno λ críptico derivado de N99 que es gal E::Tn 10,Δ-8(chlD-pgl), ΔH1(cro-chlA),N+ y cI857 (Proc. Natl. Acad, Sci. USA vol. 82, págs.88-92, enero de 1985 Biochemistry)
Cuando las cepas recombinantes se encuentran disponibles, el producto recombinante se caracteriza por la evaluación del nivel de expresión y la predicción de solubilidad adicional de la proteína por análisis del
35 comportamiento en el extracto en bruto. Después del crecimiento en un medio de cultivo apropiado y de la inducción de la expresión de proteína recombinante, se analizan los extractos totales por SDS-PAGE. Las proteínas recombinantes se visualizan en geles teñidos e identificados por análisis de bandas de Western usando anticuerpos específicos.
Plásmido:
40 nombre: TCM 281 pRIT.. 15143 replicón: pMB1 selección: Kan promotor: PL largo inserto: NS1-C74-39-His
45 La expresión de la proteína recombinante derivada de la construcción 1:
Las bacterias se cultivaron en medio LB + 50 µg/ml de Kan a 30 °C. Cuando el cultivo alcanzó una D.O. = 0,5 (620
nm), se calentó el cultivo hasta 39 °C, después de 5 horas de inducción, se cosecharon las células.
Preparación de extracto:
Concentración celular: 0,50X.. en regulador PBS + completo...
Desbaratamiento: French press 3X
Centrifugación: 30 min a 14000t
Comentario: >90 % en el sobrenadante del extracto celular. El extracto celular se sometió a SDS PAGE al 12,5 %, y se tiñó subsiguientemente con azul de Coomassie. Se realizó también un análisis de bandas de Western usando un anticuerpo monoclonal comercial contra la cola de polihistidina (Quiagen). Los geles resultantes (Figuras 3 y 4), muestran que la proteína se expresa, y se encuentra visible en el sobrenadante de extracto celular.
El esquema de purificación sigue un planteamiento clásico basado en la presencia de una cola de afinidad de His en la proteína recombinante. En un experimento típico las células desbaratadas se filtran y los extractos acelulares se cargan en una Cromatografía de Afinidad de Metal de Ion (IMAC, Ni++NTA de Qiagen) que retendrá específicamente la proteína recombinante. Las proteínas retenidas se eluden por 0-500 mM de gradiente de imidazola (posiblemente en presencia de un detergente) en un regulador de fosfato.
El sobrenadante proveniente del cultivo cosechado se desnaturalizó en urea 6M, NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, y se carga en una columna cromatográfica IMAC Qiagen NTA Ni++ bajo las siguientes condiciones: Regulador de equilibrio: NaH2PO4 100 mM pH 8 Tris 10 mM Urea 6 M Muestra: sobrenadante en urea 6 M, NaH2PO4 100 µM, Tris 10 mM de Tris Tampones de lavado: 1) NaH2PO4 100 mM pH 8 Tris 10mM Urea 6 M Imidazol 25 mM 2) NaH2PO4 100 mM pH 8 Tris 10 mM urea 6 M Imidazol 50mM Tampón de elución: NaH2PO4 100 mM pH 5,5 Tris 10 mM Urea 6 M Imidazol 500 mM La proteína eludida en 500 mM de imidazol + 6 M de urea se somete a diálisis bajo las condiciones siguientes:
- -
- PBS pH 7,2 + sarcosil al 0,5 % + urea 4 M
- -
- Idem a urea 2 M 2 hrs
- -
- Idem a urea 0 M 2 hrs
El material final se congela y se almacena. El contenido de proteína se cuantificó usando una prueba de proteína Lowry (0,9 mg/1,2 ml). La pureza se evalúo por una SDS PAGE al 12,5 % teñido con azul de Coomassie (figura 5), y la presencia de la proteína recombinante se verificó por análisis de bandas de Western, usando un anticuerpo monoclonal de anti-polihistidina (figura 6).
Una evaluación comparativa de las diferentes versiones del antígeno expresado permitirá la selección del candidato más prometedor que se va a usar para la purificación y evaluación inmunológica adicionales.
Pueden usarse pequeñas cantidades de proteína relativamente purificada para generar herramientas inmunológicas con objeto de a) detectar la expresión por inmunoquímica en secciones de tejido normal o canceroso; b) detectar la expresión, y seguir la proteína durante el proceso de purificación (ELISA/Análisis de bandas de Western); o c) caracterizar/cuantificar la proteína purificada (ELISA).
9.2.1 Anticuerpos policlonales:
Inmunización
Los conejos se inmunizan, intramuscularmente (I.M.), 3 veces a intervalos de 3 semanas con 100 μg de proteína, formulada en el adyuvante 3D-MPL/QS21. Tres semanas después de cada inmunización se toma una muestra sanguínea y se estima la valoración del anticuerpo en el suero por ELISA usando la proteína como antígeno de recubrimiento siguiendo un protocolo convencional.
ELISA
Se recubren microplacas de 96 pocillos (maxisorb Nunc) con 5 μg de proteína durante toda una noche a 4 °C. Después de 1 hora de saturación a 37 °C con PBS NCS al 1 %, la dilución serial de los sueros de conejo se agrega durante 1:30 horas a 37 °C (comenzando en 1/10). Después de 3 enjuagues en Tween de PBS, se agrega antisuero biotiniIado de anti-conejo (Amersham) (1/5000). Las placas se lavan y se agrega estreptavidina acoplada con peroxidasa (1/5000) durante 30 minutos a 37 °C. Después de lavar, se agregan 50 μI de TMB (BioRad) durante 7 minutos y luego se detiene la reacción con H2SO4 0,2 M. La D.O. puede medirse en 450 nm y las diluciones intermedias calcularse por SoftmaxPro.
9.2.2. Anticuerpos monoclonales:
Inmunización
Se inmunizan 5 ratones BALB/c 3 veces a intervalos de 3 semanas con 5 μg de proteína purificada. Los sangrados se realizan 14 días post II y 1 semana post 3. Los sueros se prueban por Elisa en proteína purificad usada como antígeno de recubrimiento. En base a estos resultados (dilución intermedia > 10000) se selecciona un ratón por condensación.
Condensación/selección HAT
Las células de bazo se condensan con el mieloma SP2/0 de acuerdo con un protocolo estándar usando PEG al 40 % y DMSO al 5 %. Las células se siembran después en placas de 96 pocillos 2,5 x 104 - 105 células/cavidad y los clones resistentes se seleccionarán en el medio HAT. El sobrenadante de estos hibridomas se probará para su contenido en anticuerpos específicos y cuando es positivo, se les enviará 2 ciclos de dilución limitada. Después de 2 rondas de rastreo, se seleccionarán 3 hibridomas para la producción de ascitis.
9.2.3. Inmunohistoquimica
Cuando se encuentran disponibles los anticuerpos, la inmunotinción se realiza en secciones de tejido normal o canceroso, con el fin de determinar:
- ◊
- el nivel de expresión del antígeno de la invención en cáncer con relación a tejido normal o
- ◊
- la proporción de cáncer de un cierto tipo que expresa el antígeno
- ◊
- si otros tipos de cáncer expresan también el antígeno
- ◊
- la proporción de células que expresan el antígeno en un tejido canceroso.
Preparación de muestra de tejido
Después de la disección, la muestra de tejido se instala en un disco de corcho en compuesto de OCT y se congela rápidamente en isopentano previamente superenfriado en nitrógeno líquido (-160 °C). El bloque se conservará después a -70 °C hasta su uso. Se realizarán secciones de 7-10 μm en una cámara de criostato (-20, -30 °C).
Tinción
Las secciones de tejido se secan durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT), se fijan en acetona durante 10 minutos en RT, se secan nuevamente, y se saturan con PBS, BSA al 0,5 %, suero al 5 %. Después de 30 minutos en RT se realiza bien una tinción directa o bien una ticinón indirecta usando anticuerpos específicos de antígeno. Una tinción directa conduce a una mejor especificidad pero a una tinción menos intensa mientras que una tinción indirecta conduce a una tinción más intensa pero menos específica.
La relevancia inmunológica del antígeno de la invención puede evaluarse por cebado in vitro de células T humanas. Todas las líneas linfocíticas de células T y células dendríticas se derivan de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de donadores sanos (subtipo HLA-A2 preferido). Se usa también un modelo de ratón de transgénico HLA-A2.1/Kb para rastrear los péptidos HLA-A2.1.
Se estimulan las líneas de células T de CD8+ específicas de antígeno recientemente descubiertas y se mantienen por estimulación in vitro semanalmente. La actividad lítica y la producción de γ-IFN de las líneas CD8+ en respuesta al antígeno o a los péptidos derivados de antígeno se prueba usando procedimientos estándar.
Se usan dos estrategias para estimular las líneas de células T CD8+: un planteamiento basado en péptidos y un planteamiento basado en genes completos. Ambos planteamientos requieren el cADN de longitud completa del antígeno recientemente descubierto en el marco de lectura correcto bien para clonarse en un sistema de suministro apropiado o bien para usarse para predecir la secuencia peptídica de unión de HLA.
Planteamiento basado en péptidos
Brevemente, se inmunizan los ratones transgénicos con adyuvante de péptidos HLA-A2, aquellos incapaces de inducir una respuesta de CD8+ (como se define por una lisis eficaz de células de bazo autólogas sometidas a un pulso peptídico) se analizarán adicionalmente en el sistema humano.
Las células dendríticas humanas (cultivadas de acuerdo con Romani y col.) se someterán a pulso peptídico y se usarán para estimular células T CD8+ clasificadas (por Facs). Después de varias estimulaciones semanales, las líneas celulares CD8+ se probarán primero en BLCL autólogo impulsado por péptido (líneas celulares transformadas en EBV-B). Para verificar el procesamiento in vivo apropiado del péptido, se probarán las líneas CD8+ en células tumorales transfectadas con cADN (células LnCaP transfectadas de HLA-A2, Skov3 o tumorales de CAMA).
Planteamiento basado en genes completos
Las líneas de células T CD8+ se cebarán y estimularán ya sea con células dendríticas transfectadas de pistola de genes, con fibroblastos transfectados con B7.1 transducidos retroviralmente, o con células dendríticas infectadas con virus de la viruela recombinantes o con adenovirus. Las células infectadas con virus son muy eficaces para presentar péptidos antigénicos dado que el antígeno se expresa a nivel alto pero solo puede usarse una vez para evitar el sobre-crecimiento de líneas de células T virales.
Después de estimulaciones alternas, las líneas de CD8+ se ponen a prueba en células tumorales transfectadas de cADN como se indica anteriormente. La especificidad de péptido e identidad se determina para confirmar la validación inmunológica.
Respuesta de células T de CD4+
De manera similar, también puede evaluarse la respuesta inmune de células T de CD4+. La generación de células T CD4+ específicas se elabora usando células dendríticas cargadas con proteína purificada recombinante o con péptidos para estimular las células T.
Epitopes predichos (nonámeros y decámeros) que unen alelos HLA:
Las secuencias peptídicas de unión de HLA de Clase I se predicen bien sea por el algoritmo de Parker (Parker, K. C., M. A. Bednarek, 20 y J. E. Coligan. 1994. Scheme for ranking potencial HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152:163 y http://bimas.dcrt.nih. qov/molbio/h la bind/) o el procedimiento de Rammensee (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands y peptide motifs: 1st listing, Immunogenetics 41, 178-228, 1995; Rammensee, Bachmann, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs: Landes Bioscience 1997, y http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm). Los péptidos se rastrean después en el modelo de ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb (Vitiello y col.).
Las secuencias peptídicas de unión de HLA de Clase lI se predicen usando el algoritmo de Tepitope, con un corte de puntuación establecido en 6 (Sturniolo, Hammer y col., Nature Biotechnology, 1999, 17; 555-561).
Las siguientes tablas reúnen las secuencias de epítope predichas de Clase I y II:
- HLA-A 0201: decámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Parker* SEC ID:
- 1
- 64 KLVNLGFQAL 142,060 SEC ID N.º: 16
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
- HLA-A 0201: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Parker* SEC ID:
- 1
- 182 ELLDFSSWL 507,976 SEC ID N.º: 17
- 2
- 104 RLLAEHDAV 126,098 SEC ID N.º: 18
- 3
- 64 KLVNLGFQA 100,850 SEC ID N.º: 19
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
- HLA-A 24: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Parker* SEC ID:
- 1
- 97 EYIRALQRL 360,000 SEC ID N.º: 20
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
- HLA-A 24: decámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Parker* SEC ID:
- 1
- 97 EYIRALQRL 360,000 SEC ID N.º: 21
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
- HLA-B7: decámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Parker* SEC ID:
- 1
- 111 AVRNALAGGL 600,000 SEC ID N.º: 22
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
- HLA-B 4403: decámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Puntuación de SEC ID:
- Subsecuencias
- Parker
- 1
- 156 SEPGSPRSAY 600,000 SEC ID N.º: 23
- 2
- 89 VETLRSAVEY 180,000 SEC ID N.º: 24
- HLA-DRB1*1501: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 5,6 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*1502: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 4,6 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*0402: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 120 LRPQAVRPS 5,4 SEC ID N.º: 26
- HLA-DRB1*1101: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 4,8 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*1102: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 120 LRPQAVRPS 6,2 SEC ID N.º: 26
- HLA-DRB1*1104: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 5,8 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*1106: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 5,8 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*1301: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 120 LRPQAVRPS 6,6 SEC ID N.º: 26
- 2
- 73 LRQHVPHGG 4,9 SEC ID N.º: 27
- 3
- 31 LLRCSRRRR 4,4 SEC ID N.º: 33
- HLA-DRB1*1302: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 120 LRPQAVRPS 5,6 SEC ID N.º: 26
- HLA-DRB1*1304: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 120 LRPQAVRPS 6,2 SEC ID N.º: 26
- 2
- 73 LRQHVPHGG 4,8 SEC ID N.º: 27
- 3
- 31 LLRCSRRRR 4,6 SEC ID N.º: 28
- HLA-DRB1*1305: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 99 IRALQRLLA 4,8 SEC ID N.º: 25
- HLA-DRB1*0703: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID:
- 1
- 112 VEYIRALQR 5,1 SEC ID N.º: 29
- 2
- 98 YIRALQRLL 4,8 SEC ID N.º: 30
- 3
- 65 LVNLGFQAL 4,5 SEC ID N.º: 31
- HLA-DRB5*0101: nonámeros
- Rango
- Posición inicial Listado de Residuo de Subsecuencias Puntuación de Tepitope SEC ID N.º: 32:
- 1
- 96 VEYIRALQR 4,3
- *: Estimación del Tiempo Promedio de Disociación de una Molécula Conteniendo esta subsecuencia.
SEC ID N.º: 1
SEC ID N.º: 2 SEC ID N.º: 3
SEC ID N.º: 4
SEC ID N.º: 5
SEC ID N.º: 6
SEC ID N.º: 7
SEC ID N.º: 8
SEC ID N.º: 9
SEC ID N.º: 10
SEC ID N.º: 11
SEC ID N.º: 12
SEC ID N.º: 13 SEC ID N.º: 14
SEC ID N.º: 15
10 SEC ID N.º: 16 KLVNLGFQAL
ELLDFSSWL
15 RLLAEHDAV
KLVNLGFQA
EYIRALQRL
BYIRALQRLL
AVRNALAGGL
SEPGSPRSAY
VETLRSAVEY
IRALQRLLA
LRPQAVRPS
LRQHVPHGG
LGFQALRQH
VRNALAGGL
YIRALQRLL
SEC ID N.º: 31
LVNLGFQAL
SEC ID N.º: 32
VEYIRALQR
SEC ID N.º: 33
LLRCSRRRR
<110> SmithKline Beecham Biologicals s.a.
<120> Compuestos Novedosos
<130> BC45300
<160> 32
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
<210> 1
<211> 1791
<212> ADN
<213> Ser humano
<400> 1
10 <210> 2
<211> 193
<212> Proteína
<213> Ser humano
15 <400> 2 5 <210> 3
<211> 262
<212> Proteína
<213> Ser humano
10 <400> 3
<210> 4
<211> 1830
<212> ADN
<213> Ser humano
<400> 4
<210> 5
<211> 587
<212> ADN
<213> Ser humano
<400> 5
<210> 6
<211> 1791
<212> ADN
15 <213> Ser humano <400> 6
5 <210> 7
<211> 361
<212> Proteína
<213> Ser humano
10 <400> 7
<210> 8
<211> 849
<212> ADN
<213> Virus influenza y ser humano
<400> 8
<210> 9
<211> 849
<212> ADN
<213> Virus influenza y ser humano
<400> 9
<210> 10
<211> 282
<212> Proteína 15 <213> Virus influenza y ser humano
<400> 10
<210> 11
5 <211> 193
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 11 10
<210> 12
<211> 263
<212> Proteína
<213> Ratón
<400> 12 <210> 13
<211> 1051
<212> Proteína
<213> Ratón
<400> 13 <210> 14
<211> 260
<212> Proteína
<213> Rata
<400> 14
- 10
- <210> 15
- <211> 1526
- <212> ADN
- <213> Rata
- 15
- <400> 15
- 5
- <210> 16 <211> 10 <212> Proteína <213> Ser humano
- <400> 16
- 10
- Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 1 5 10
- 15
- <210> 17 <211> 9 <212> Proteína <213> Ser humano
- <400> 17
- 20
- Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu 1 5
<210> 18
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 19
<210> 20
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 20
<210> 21
<211> 10
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 21
Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 1 5
Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala 1 5
Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 1 5
<210> 22
<211> 10
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 22
<210> 23
<211> 10
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 23
<210> 24
<211> 10
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu 1 5 10
Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr 1 5 10
Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr 15 10
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 27
<210> 28
<211> 9
<212> Proteína
<213> Ser humano
<400> 28
<210> 29
<211> 9
Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala 15
Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser 15
Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly 1 5
Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His 1 5
- <212> Proteína
- <213> Ser humano
- <400> 29
- Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu
- 1 5
- <210> 30
- <211> 9
- <212> Proteína
- <213> Ser humano
- <400> 30
- Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu
- 1 5
- <210> 31
- <211> 9
- <212> Proteína
- <213> Ser humano
- <400> 31
- Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu
- 1 5
- <210> 32
- <211> 9
- <212> Proteína
- <213> Ser humano
- <400> 32
- Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg
- 1 5
- <210> 33
- <211> 9
- <212> Proteína
- <213> Ser humano
- 5
- <400> 33
- Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg
- 1
- 5
- 10
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Un kit de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico que comprende:
- (a)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2,
o un fragmento de la misma;- (b)
- la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma;
- (c)
- un polinucleótido que se puede obtener por tamizado de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma, codificando dicho polinucleótido una proteína que tiene propiedades inmunogénicas similares a las de la proteína de SEC ID Nº: 2.
- (d)
- un polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento del mismo; o
- (e)
- un anticuerpo del polipéptido de SEC ID Nº: 2.
- 2. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto, o para diagnosticar la presencia de cáncer colorrectal o una susceptibilidad a cáncer colorrectal en un sujeto, relacionado con la expresión o la actividad de un polinucleótido en un sujeto, que comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por:
- (a)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2;
- (b)
- el polinucleótido o la región de codificación del polinucleótido de SEC ID Nº: 1; y
- (c)
- un polinucleótido que se puede obtener por tamizado de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma, codificando dicho polinucleótido una proteína que tiene propiedades inmunogénicas similares a las de la proteína de SEC ID Nº: 2.
- 3. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto, o para diagnosticar la presencia de cáncer colorrectal o una susceptibilidad a cáncer colorrectal en un sujeto, relacionado con la expresión o la actividad de un polinucleótido en un sujeto, que comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por:
- (a)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEC ID Nº: 2 en toda la longitud de la SEC ID Nº: 2;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;
- (c)
- un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico de un polipéptido de SEC ID Nº: 2 en el que la actividad inmunogénica del fragmento inmunogénico es sustancialmente la misma que el polipéptido de SEC ID Nº: 2;
- (d)
- un fragmento de péptido de SEC ID Nº: 2 en el que el fragmento comprende una secuencia de una o más de SEC ID Nº: 16 a SEC ID Nº: 33.
Figura 1: datos de PCR en tiempo real usando la sonda de TaqmanFigura 3: SDS PAGE teñida con azul de Coomasie del extracto celular de la cepa que expresa CASB7439Figura 4: prueba de bandas de Western cargada con extracto celular de la cepa que expresa CASB7439Revelado con anti NS1 monoclonalFigura 5: SDS PAGE teñida con azul de Coomasie de CASB7439 después de purificación Figura 6: prueba de bandas de Western CASB7439 después de purificación (anti-polihistidina monoclonal)
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