PL209127B1

PL209127B1 - Środek farmaceutyczny do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu raka i sposób diagnozowania u pacjenta obecności lub podatności na raka

Info

Publication number: PL209127B1
Application number: PL362698A
Authority: PL
Inventors: Teresa Elisa Virginia Cabezon-Silva; Jean-Pol Cassart; Thierry Coche; Swann Roman Jean-Thomas Gaulis; Y De Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2011-07-29
Also published as: EP1650221A3; US8535690B2; CA2400842A1; HUP0300054A3; AU2001256156B2; US20110052615A1; PT1650221E; AU2006201042A1; US20030157118A1; IL151097A; KR20090085697A; US20100291121A1; KR100919916B1; NZ520673A; CZ20022874A3; CN1254541C; HK1093513A1; BR0108654A; KR20020079887A; SI1650221T1

Description

Przedmiotem wynalazku są środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd CASB7439 lub polinukleotyd kodujący ten polipeptyd, do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, który to rak stanowi rak okrężnicy, lub na inne nowotwory związane z okrężnicą, lub inne choroby związane z okrężnicą i sposób diagnozowania u pacjenta choroby, lub podatności na chorobę, lub diagnozowania u pacjenta obecności raka okrężnicy i odbytnicy, lub podatności na raka okrężnicy i odbytnicy, związanych z ekspresją lub aktywnością polipeptydu u pacjenta.

Uważa się, że ujawnione tutaj polipeptydy i polinukleotydy są ważnymi immunogenami dla specyficznej profilaktycznej lub terapeutycznej immunizacji przeciw nowotworom, ponieważ są specyficznie eksprymowane lub w wysokim stopniu nadeksprymowane w nowotworach w porównaniu z normalnymi komórkami, a zatem mogą być adresowane przez mechanizmy immunologiczne specyficzne dla antygenu, prowadząc do zniszczenia komórki nowotworu. Mogą być też stosowane do diagnozowania występowania komórek nowotworowych. Co więcej, ich nieodpowiednia ekspresja w pewnych warunkach może powodować indukcję nieodpowiednich autoimmunizacyjnych odpowiedzi immunologicznych, co można by korygować przez odpowiednie szczepienie z użyciem tychże polipeptydów lub polinukleotydów. Pod tym względem najważniejszą aktywnością biologiczną ujawnionego tutaj polipeptydu jest aktywność antygenowa i immunogenna. Ujawniony tutaj polipeptyd może także wykazywać co najmniej jedną inną aktywność biologiczną polipeptydu CASB7439, która mogłaby go kwalifikować jako cel dla interwencji terapeutycznej lub profilaktycznej innej niż ta związana z odpowiedzią immunologiczną.

Zatem, wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego polipeptyd CASB7439, który zawiera sekwencję aminokwasową o co najmniej 70% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 10 na całej długości odpowiednio SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 10, lub immunogenny fragment CASB7439, przy czym ten fragment zawiera sekwencję aminokwasową jednej lub większej liczby z SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 33 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, który to rak stanowi rak okrężnicy, lub na inne nowotwory związane z okrężnicą, lub inne choroby związane z okrężnicą.

Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego zawierającego polinukleotyd kodujący polipeptyd CASB7439 lub jego fragment, zdefiniowane powyżej, przy czym ten polinukleotyd jest wybrany z grupy obejmują cej SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 9 oraz farmaceutycznie dopuszczalny noś nik, do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, który to rak stanowi rak okrężnicy, lub na inne nowotwory związane z okrężnicą, lub inne choroby związane z okrężnicą.

Środki farmaceutyczne korzystnie dodatkowo zawierają adiuwant indukujący TH-1, przy czym środki te jako adiuwant indukujący TH-1 zawierają adiutant, korzystnie wybrany z grupy adiuwantów obejmującej 3D-MPL, QS21, mieszaninę QS21 i cholesterolu oraz oligonukleotyd CpG lub mieszaniny dwóch lub większej liczby tych adiuwantów.

Wynalazek dotyczy również środka farmaceutycznego zawierającego komórki prezentujące antygen, zmodyfikowane przez obciążenie in vitro polipeptydem CASB7439 lub jego fragmentem, zdefiniowanymi powyżej, albo genetycznie zmodyfikowane in vitro tak, aby eksprymowały zdefiniowany powyżej polipeptyd CASB7439 oraz farmaceutycznie skuteczny nośnik.

Ponadto, wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania u pacjenta choroby lub podatności na chorobę, lub diagnozowania u pacjenta obecności raka okrężnicy i odbytnicy, lub podatności na raka okrężnicy i odbytnicy, związanych z ekspresją lub aktywnością polinukleotydu u pacjenta, który charakteryzuje się tym, że analizuje się obecność lub ilość tego polinukleotydu w próbce pobranej od tego pacjenta, przy czym ten polinukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową o co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2 na całej długości SEQ ID NO: 2;

(b) polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd SEQ ID NO: 2; oraz (c) polinukleotyd lub region kodujący ten polinukleotyd SEQ ID NO: 1.

Wynalazek dotyczy również sposobu diagnozowania u pacjenta choroby lub podatności na chorobę, lub diagnozowania u pacjenta obecności raka okrężnicy i odbytnicy, lub podatności na raka okrężnicy i odbytnicy, związanych z ekspresją lub aktywnością polipeptydu u pacjenta, który charaktePL 209 127 B1 ryzuje się tym, że analizuje się obecność lub ilość tego polipeptydu w próbce pobranej od tego pacjenta, przy czym ten polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową o co najmniej 70% identyczności z SEQ

ID NO: 2 na całej długości SEQ ID NO: 2;

(b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 ;

(c) polipeptyd zawierający fragment immunogenny polipeptydu SEQ ID NO: 2, przy czym aktywność immunogenna fragmentu immunogennego jest zasadniczo taka sama jak polipeptydu SEQ ID NO: 2;

(d) fragment immunogenny SEQ ID NO: 2, który to fragment zawiera sekwencję jednej lub większej liczby z SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 33.

W pierwszym aspekcie ujawnienie dotyczy polipeptydów CASB7439. Takie peptydy obejmują wyizolowane polipeptydy, zawierające sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 70%, korzystnie w co najmniej 80%, korzystniej w co najmniej 90%, jeszcze korzystniej w co najmniej 95%, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 na całej długości, odpowiednio SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14, z tym, że ten wyizolowany polipeptyd nie jest SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. Takie polipeptydy obejmują te zawierające sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11.

Dalsze ujawnione tutaj peptydy obejmują wyizolowane polipeptydy, w których ta sekwencja aminokwasów jest w co najmniej 70%, korzystnie w co najmniej 80%, korzystniej w co najmniej 90%, jeszcze korzystniej w co najmniej 95%, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 na całej długości, odpowiednio SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14, z tym, że ten wyizolowany polipeptyd nie jest SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. Takie polipeptydy obejmują te zawierające sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11.

Korzystnie, wyżej wspomniane polipeptydy są wytwarzane drogą rekombinacji. Najkorzystniej ujawnione tutaj polipeptydy są oczyszczone i są zasadniczo wolne od wszelkich innych białek lub zanieczyszczającego materiału gospodarza.

Dalsze ujawnione tutaj peptydy obejmują wyizolowane polipeptydy kodowane przez polinukleotyd zawierający sekwencję zawartą w SEQ ID NO: 1.

Ujawnienie dostarcza także immunogennego fragmentu polipeptydu CASB7439, który jest sąsiadującą częścią polipeptydu CASB7439 mającą te same lub podobne właściwości immunogenne jak polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. Oznacza to, że ten fragment (w razie potrzeby połączony z nośnikiem lub stanowiący część większego białka fuzyjnego) jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, która rozpoznaje polipeptyd CASB7439. Taki fragment immunogenny może obejmować np. polipeptyd CASB7439 pozbawiony N-końcowej sekwencji liderowej, domeny transbłonowej lub C-końcowej domeny kotwiczącej. W korzystnym aspekcie ujawniony tutaj immunogenny fragment CASB7439 zawiera zasadniczo całą zevmątrzkomórkową domenę polipeptydu, która jest w co najmniej 70%, korzystnie w co najmniej 80%, korzystniej w co najmniej 90%, jeszcze korzystniej w co najmniej 95%, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 na całej długości, odpowiednio SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14.

Korzystnie, ujawniony tutaj immunogenny fragment zawiera co najmniej jeden epitop.

Fragmenty peptydowe zawierające epitop CASB7439 będą zazwyczaj zawierać co najmniej 7, a korzystnie 9 lub 10 są siadują cych aminokwasów z SEQ ID NO: 2. Korzystne epitopy przedstawiono w SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 33.

Korzystnie, ujawnione tutaj peptydy zawierają te epitopy. Mimotopy, które mają taką samą charakterystykę jak te epitopy i immunogeny zawierające takie mimotopy generujące odpowiedź immunologiczną, które reagują krzyżowo z epitopem w kontekście cząsteczki CASB7439 także stanowią część ujawnienia.

Ujawnienie obejmuje więc wyizolowane peptydy obejmujące te epitopy jako takie i dowolny ich mimotop. Mimotop jest zdefiniowany jako jednostka, która jest podobna do natywnego epitopu

PL 209 127 B1

CASB7439 na tyle, by mogły ją rozpoznawać przeciwciała, które rozpoznają cząsteczkę natywną (Gheysen, H. M. i in., 1986, Syntethetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, str. 130-149; Gheysen, H.M., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709-715) lub, gdy jest sprzężona z odpowiednim nośnikiem, jest zdolna do generowania przeciwciał, które reagują krzyżowo z cząsteczką natywną.

Mimotopy peptydowe wyżej zidentyfikowanych epitopów mogą być projektowane dla danego celu przez dodanie, delecję lub substytucję wybranych aminokwasów. Tak więc, ujawnione tutaj peptydy mogą być modyfikowane dla ułatwienia sprzęgania z nośnikiem białkowym. Przykładowo, w przypadku pewnych sposobów sprzęgania chemicznego może być korzystne aby epitop zawierał końcową cysteinę. Ponadto może być korzystne, by peptydy sprzężone z nośnikiem białkowym zawierały taki koniec hydrofobowy przeciwległy sprzężonemu końcowi peptydu, aby wolny niesprzężony koniec peptydu pozostawał zasocjowany z powierzchnią białka nośnikowego. Zmniejsza to konformacyjne stopnie swobody peptydu, a zatem zwiększa prawdopodobieństwo, że peptyd będzie prezentowany w konformacji, która jest moż liwie najbliż sza konformacji peptydu występują cej w kontekś cie cał ej cząsteczki. Przykładowo, peptydy mogą być zmienione tak, by miały N-końcową cysteinę i hydrofobowy amidowany C-koniec. Alternatywnie, można przeprowadzić dodanie lub podstawienie stereoizomeru D jednego lub większej liczby aminokwasów, aby wytworzyć korzystną pochodną, np. aby zwiększyć trwałość peptydu. Fachowcy będą wiedzieć, że takie modyfikowane peptydy lub mimotopy mogą być całkowicie lub częściowo nie peptydowym mimotopem, w którym ugrupowania składowe niekoniecznie są ograniczone do 20 naturalnie występujących aminokwasów. Dodatkowo, mogą być one cyklizowane z użyciem znanych technik ograniczających peptyd do konformacji, która jest bardzo zbliżona do jego kształtu gdy sekwencja peptydu jest w kontekście całej cząsteczki. Korzystny sposób cyklizacji peptydu obejmuje dodanie pary reszt cysteinowych, co pozwala na wytworzenie mostka dwusiarczkowego.

Ponadto, fachowcy będą wiedzieć, że ujawnione tutaj mimotopy lub immunogeny mogą być większe niż epitopy zidentyfikowane powyżej i jako takie mogą zawierać ujawnione tu sekwencje. Tak więc, ujawnione tutaj mimotopy mogą mieć dodane N- i/lub C-końcowe przedłużenia z pewnej liczby innych naturalnych ugrupowań na jednym lub obu końcach. Mimotopy peptydów mogą być też sekwencjami retro naturalnych sekwencji, z odwróconą orientacją sekwencji, względnie sekwencje mogą być w całości lub częściowo złożone z D-stereoizomerycznych aminokwasów (sekwencje inwerso). Sekwencje peptydów mogą mieć także charakter sekwencji retro-inwerso, gdy odwrócona jest orientacja sekwencji, a aminokwasy są D-stereoizomeryczne. Takie peptydy retro lub retro-inwerso mają zaletę bycia nie własnymi i jako takie mogą przezwyciężyć problemy autotolerancji w układzie odpornościowym.

Alternatywnie, mimotopy peptydów mogą być zidentyfikowane z użyciem przeciwciał, które są same zdolne do wiązania ujawnionych tutaj epitopów, takimi technikami jak technologia ekspozycji na fagu (EP 0 552 267 B1). Ta technika generuje dużą ilość sekwencji peptydów, które imitują budowę natywnych peptydów, a zatem są zdolne do wiązania przeciwciał przeciw natywnemu peptydowi, lecz same w sobie niekoniecznie wykazują znaczną homologię sekwencji z peptydem natywnym. To podejście może mieć znaczące korzyści, bo umożliwia identyfikację peptydu ze zwiększonymi właściwościami immunogennymi lub może przezwyciężyć wszelkie potencjalne problemy z autotolerancją antygenu, które mogą wiązać się ze stosowaniem sekwencji natywnego peptydu. Dodatkowo ta technika pozwala na identyfikację wzoru rozpoznawania dla każdego natywnego peptydu pod kątem jego wspólnych właściwości chemicznych wśród rozpoznawanych sekwencji mimotopów.

Kowalencyjne łączenie peptydu z immunogennym nośnikiem można prowadzić znanymi sposobami. Przykładowo, w celu uzyskania bezpośredniego połączenia kowalencyjnego można użyć karbodiimidu, glutaraldehydu lub estru (N-[Y-maleimidobutyryloksy]sukcynoimidu, z użyciem powszechnie dostępnych w handlu heterodifunkcyjnych linkerów, takich jak CDAP i SPDP (stosując instrukcje producenta). Po reakcji sprzęgania immunogen można łatwo wyodrębnić i oczyścić metodą dializy, metodą filtracji żelowej, metodą frakcjonowania itd.

Typy nośników stosowanych w ujawnionych tutaj immunogenach będą dobrze znane fachowcowi. Funkcją nośnika jest zapewnienie pomocy cytokin, aby pomóc w indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowi. Nie wyczerpująca lista nośników, które mogą być stosowane zgodnie z ujawnieniem obejmuje: hemocyjaninę skałoczepu (KLH), albuminy surowicze, takie jak surowicza albumina bydlęca (BSA), inaktywowane toksyny bakterii, takie jak toksyny tężca lub błonicy (TT i DT), lub ich zrekombinowane fragmenty (np. domena 1 fragmentu C z TT lub domena translokacyjna DT),

PL 209 127 B1 lub oczyszczona pochodna białkowa tuberkuliny (PPD). Alternatywnie, mimotopy lub epitopy mogą być bezpośrednio sprzężone z nośnikami liposomowymi, które mogą dodatkowo zawierać immunogeny zdolne do dostarczania pomocy komórek T.

Korzystnie, stosunek mimotopów do nośnika wynosi od 1:1 do 20:1, przy czym korzystnie każdy nośnik powinien nieść 3-15 peptydów.

W jednej z postaci korzystnym noś nikiem jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1). Białko D jest białkiem wiążącym IgD z Haemophilus influenzae i zostało opatentowane przez Forsgrena (WO 91/18926, EP 0 594 610 B1). W pewnych warunkach, np. w układach ekspresji zrekombinowanego immunogenu, może być korzystne stosowanie fragmentów białka D, np. białka D 1/3 (zawierającego N-końcowe 100-110 aminokwasów białka D (GB 9 717 953.5)).

W innym korzystnym sposobie prezentowania ujawnionych tutaj peptydów stosuje się zrekombinowaną cząsteczkę fuzyjną. Przykładowo, EP 0 421 635 B opisuje zastosowanie chimerowych cząstek antygenu rdzeniowego wirusa hepadna do prezentowania obcych sekwencji peptydów w cząstce podobnej do wirusa. Ujawnione tutaj immunogeny jako takie mogą zawierać peptydy prezentowane w cząstkach chimerowych złożonych z antygenu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Ponadto, zrekombinowane białka fuzyjne mogą zawierać ujawnione tutaj mimotopy i białko nośnikowe, takie jak NS1 wirusa grypy. Dla dowolnego rekombinacyjnie eksprymowanego białka stanowiącego część ujawnienia, kwas nukleinowy, który koduje ten immunogen także stanowi aspekt tego ujawnienia.

Stosowane tutaj peptydy można łatwo zsyntetyzować z użyciem dobrze znanych procedur w fazie stałej. Odpowiednie syntezy można prowadzić stosując procedury „T-boc” lub „F-moc”. Cykliczne peptydy można zsyntetyzować metodą w fazie stałej z użyciem dobrze znanej procedury „F-moc” i ż ywicy poliamidowej w całkowicie zautomatyzowanym urządzeniu.

Alternatywnie, fachowcy będą znali niezbędne procedury laboratoryjne dla przeprowadzenia procesu ręcznie. Techniki i procedury syntezy w fazie stałej opisano w „Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” E. Atherton i R. C. Sheppard, publ. IRL w Oxford University Press (1989).

Alternatywnie, peptydy można wytworzyć z użyciem metod rekombinacyjnych, w tym drogą ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących mimotopy w linii komórkowej bakterii lub ssaków, a następnie oczyszczenia eksprymowanego mimotopu.

Techniki ekspresji rekombinowanych peptydów i białek są znane i opisane w Maniatis, T., Fritsch, E. F. i Sambrook i in.. Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989).

Inną postać stanowi sposób wytwarzania opisanego tutaj polipeptydu. Ujawniony tutaj sposób można zrealizować z użyciem znanych technik rekombinacji, takich jak opisane w Maniatis i in. Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989. Tak więc, sposób wytwarzania ujawnionego tutaj polipeptydu polega na tym, że hoduje się komórki gospodarza w warunkach wystarczających dla wytwarzania tego polipeptydu i wyodrębnia się polipeptyd ze środowiska hodowli. W szczególności ujawniony tutaj sposób może korzystnie obejmować etapy, w których:

i) sporządza się replikowalny lub integrujący wektor ekspresyjny zdolny do ekspresji w komórce gospodarza polimeru DNA zawierającego sekwencję nukleotydów kodującą białko lub jego immunogenną pochodną;

ii) transformuje się komórki gospodarza tym wektorem;

iii) hoduje się te stransformowane komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję tego polimeru DNA z wytworzeniem tego białka i iv) wyodrębnia się to białko.

Ujawnione tutaj polipeptydy lub fragment immunogenny mogą mieć postać „dojrzałego” białka lub mogą być częścią większego białka, takiego jak prekursor lub białko fuzyjne. Często korzystne jest włączenie dodatkowej sekwencji aminokwasów, która zawiera sekwencje sekrecyjne lub lidera, prosekwencje, sekwencje pomagające w oczyszczaniu, takie jak wielokrotne reszty histydynowe, lub dodatkową sekwencję nadającą trwałość w trakcie wytwarzania drogą rekombinacji. Ponadto można także rozważyć dodanie egzogennego polipeptydu lub ogona lipidowego, lub sekwencji polinukleotydów dla zwiększenia potencjału immunogennego końcowej cząsteczki.

W jednym ze swych aspektów ujawnienie dotyczy uzyskanych technikami inż ynierii genetycznej rozpuszczalnych białek fuzyjnych zawierających ujawniony tutaj polipeptyd lub jego fragment i różne części stałych regionów łańcuchów ciężkich lub lekkich immunoglobulin różnych podgrup (IgG, IgM, IgA, IgE).

PL 209 127 B1

Korzystna jako immunoglobulina jest część stała łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG, szczególnie IgGl, gdzie fuzja zachodzi w regionie zawiasu. W szczególnej postaci część Fc może być usunięta po prostu przez włączenie sekwencji cięcia, która może być przecięta przez czynnik krzepliwości krwi Xa. Ponadto, ujawniono sposoby wytwarzania tych białek fuzyjnych metodami inżynierii genetycznej i zastosowanie ich do poszukiwania leków, diagnostyki i terapii. Szczególnie korzystny aspekt dotyczy zastosowania polipeptydu lub polinukleotydu do wytwarzania szczepionki do immunoterapeutycznego leczenia pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, zwłaszcza raka okrężnicy lub innych nowotworów, lub chorób związanych z okrężnicą. Dalszy aspekt dotyczy polinukleotydów kodujących takie białka fuzyjne. Przykłady technologii białek fuzyjnych można znaleźć w publikacjach międzynarodowych zgłoszeń patentowym nr WO 94/29458 i WO 94/22914.

Białka mogą być chemicznie sprzężone lub eksprymowane jako zrekombinowane białka fuzyjne, co pozwala na wytwarzanie większych ilości produktu w układzie ekspresji w porównaniu z wytwarzaniem białek niefuzyjnych. Partner fuzji może pomagać w dostarczaniu epitopów T pomocniczych (immunologiczny partner fuzji), korzystnie epitopów T pomocniczych rozpoznawanych w organizmach ludzkich, lub pomagać w ekspresji białek (wzmacniacz ekspresji) z większą wydajnością niż uzyskiwana w przypadku natywnych białek rekombinowanych.

Korzystnie, partner fuzji będzie zarówno immunologicznym partnerem fuzji, jak i partnerem wzmacniającym ekspresję.

Partnerzy fuzji obejmują białko D Haemophilus influenzae B i niestrukturalne białko wirusa grypy, NS1 (hemaglutynina).

Innym immunologicznym partnerem fuzji jest białko znane jako LYTA. Korzystnie stosuje się C-końcową część cząsteczki. Lyta pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, który syntetyzuje amidazę N-acetylo-L-alaniny, amidazę LYTA (kodowaną przez gen lytA) (Gene, 43 (1986) str. 265-272), autolizynę, która specyficznie rozkłada pewne wiązania w szkielecie peptydoglikanu. C-końcowa domena białka LYTA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny lub do pewnych analogów choliny, takich jak DEAE. Tę właściwość wykorzystano dla opracowania plazmidów E. coli eksprymujących C-LYTA, użytecznych w ekspresji białek fuzyjnych. Opisano oczyszczanie białek hybrydowych zawierających fragment C-LYTA na ich N-końcu (Biotechnology: 10 (1992) str. 795-798). Jest możliwe stosowanie powtarzalnej części cząsteczki Lyta występującej na C-końcu, począwszy od reszty 178, np. reszt 188-305.

Ujawniono tutaj także postacie ksenogenne (zwane także postaciami ortologicznymi) wyżej wspomnianych polipeptydów, które to postacie ksenogenne dotyczą antygenu mającego znaczny stopień identyczności sekwencji z ludzkim antygenem (zwanym także antygenem autologicznym), który służy jako antygen odniesienia, ale pochodzi z innego gatunku niż człowiek. W tym kontekście „znaczny stopień identyczności” dotyczy zgodności sekwencji aminokwasów z inną sekwencją aminokwasów lub sekwencji polinukleotydu z inną sekwencją polinukleotydu, gdy takie sekwencje dopasowuje się jak najlepiej do dowolnego z szeregu znanych białek do porównywania sekwencji. Przez znaczny stopień identyczności rozumie się co najmniej 70-95%, korzystnie co najmniej 85-95%, a najkorzystniej co najmniej 90-95% identyczności porównywanych sekwencji. Tak więc, zgodnie z ujawnieniem ksenogennym polipeptydem CASB7439 będzie polipeptyd CASB7439, który jest ksenogenny względem ludzkiego CASB7439, czyli jest wyizolowany z gatunku nie będącego człowiekiem. W korzystnej postaci polipeptyd będzie wyizolowany z myszy, szczura, świni lub małpy rezus, najkorzystniej z myszy lub szczura. Tak więc, sposób indukcji u człowieka odpowiedzi immunologicznej przeciw ludzkiemu CASB7439 mającemu sekwencję aminokwasów jak przedstawiono w dowolnej z sekwencji SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11, polega na podawaniu temu pacjentowi skutecznej dawki środka zawierającego postać ksenogenną tego ludzkiego CASB7439, jak tu opisano. Korzystną postacią jest sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw ludzkiemu CASB7439 z użyciem ksenogennego CASB7439 wyizolowanego z myszy, szczura, świni lub małpy rezus. Inny korzystny sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej to stosowanie kompozycji antygenowej zawierającej żywy wirusowy układ ekspresji, który eksprymuje ten ksenogenny antygen.

Korzystny ksenogenny polipeptyd CASB7439 ma sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 12 (mysz) lub w SEQ ID NO: 14 (szczur).

Wyizolowany ksenogenny polipeptyd CASB7439 będzie miał na ogół znaczne podobieństwo sekwencji i będzie zawierał wyizolowane polipeptydy zawierające sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 70% identyczna, korzystnie w co najmniej 80% identyczna, korzystniej w co najmniej

PL 209 127 B1

90% identyczna, jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczna, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 na całej długości SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. Tak więc, ksenogenny polipeptyd będzie zawierał immunogenny fragment polipeptydu o SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14, w którym aktywność immunogenna fragmentu immunogennego jest zasadniczo taka sama jak polipeptydu o SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. Ponadto, ksenogenny polipeptyd CASB7439 może być fragmentem co najmniej około 20 kolejnych aminokwasów, korzystnie około 30, korzystniej około 50, jeszcze korzystniej około 100, a najkorzystniej około 150 kolejnych aminokwasów wybranych z sekwencji aminokwasów przedstawionych w SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. W szczególności fragmenty ksenogenne CASB7439 zachowają pewne właściwości funkcjonalne, korzystnie aktywność immunologiczną, większej cząsteczki przedstawionej w SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 i są one użyteczne w opisanych tu sposobach (np. w środkach farmaceutycznych i szczepionkach, w diagnostyce, itd.). W szczególności, te fragmenty będą w stanie generować odpowiedź immunologiczną przeciw ludzkiemu odpowiednikowi, taką jak wytworzenie krzyżowo reagujących przeciwciał, które reagują z autologiczną postacią ludzką CASB7439 przedstawioną w dowolnej z SEQ ID NO: 2. W szczególnej postaci ksenogenny ujawniony tutaj polipeptyd może być częścią większej fuzji obejmującej ksenogenny polipeptyd CASB7439 lub jego fragment i heterologiczne białko lub część białka działającego jako partner fuzji, jak tu opisano powyżej.

Ujawniono tutaj ponadto warianty wyżej wymienionych polipeptydów, to znaczy polipeptydy, które różnią się od polipeptydów odniesienia konserwatywnym podstawieniem aminokwasów, gdzie dana reszta jest podstawiana przez inną z podobnymi cechami. Takie typowe podstawienia następują między Ala, Val, Leu i Ile; między Ser i Thr; między kwasowymi resztami Asp i Glu; między Asn i Gln; oraz między resztami zasadowych Lys i Arg; lub aromatycznymi resztami Phe i Tyr. Szczególnie korzystne są warianty, w których kilka, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 lub 1 aminokwas jest podstawiony, wydeletowany lub dodany w dowolnej kombinacji.

Ujawnione tutaj polipeptydy można wytwarzać w dowolny odpowiedni sposób. Takie polipeptydy obejmują wyizolowane naturalnie występujące polipeptydy, polipeptydy wytworzone technikami rekombinacji, polipeptydy wytworzone syntetycznie lub polipeptydy wytworzone z użyciem połączenia tych sposobów. Sposoby wytwarzania takich polipeptydów są dobrze znane.

W innym swym aspekcie ujawnienie dotyczy polinukleotydów CASB7439. Takie polinukleotydy obejmują wyizolowane polinukleotydy zawierające sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd, który jest w co najmniej 70% identyczny, korzystnie w co najmniej 80% identyczny, korzystniej w co najmniej 90% identyczny, a jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczny z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11 na całej długości, odpowiednio SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11. Pod tym względem kodowane polipeptydy, które są w co najmniej 97% identyczne są wysoce korzystne, podczas gdy te identyczne w 98-99% są jeszcze korzystniejsze, a te w co najmniej 99% identyczne są najkorzystniejsze.

Dalsze ujawnione tutaj polinukleotydy obejmują wyizolowane polinukleotydy zawierające sekwencję nukleotydów, która jest w co najmniej 70% identyczna, korzystnie w co najmniej 80% identyczna, korzystniej w co najmniej 90% identyczna, a jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczna z sekwencją nukleotydową kodują c ą polipeptyd o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11 na całym obszarze kodującym. Pod tym względem polinukleotydy, które są w co najmniej 97% identyczne są wysoce korzystne, te w 98-99% identyczne są korzystniejsze, a te w co najmniej 99% identyczne są najkorzystniejsze.

Dalsze ujawnione tutaj polinukleotydy obejmują wyizolowane polinukleotydy zawierające sekwencję nukleotydów, która jest w co najmniej 70% identyczna, korzystnie w co najmniej 80% identyczna, korzystniej w co najmniej 90% identyczna, a jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczna z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub 5 SEQ ID NO: 9 na całej długości tych sekwencji lub z sekwencją kodującą SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9 na całej długości tej sekwencji kodującej SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9. Pod tym względem polinukleotydy, które są w co najmniej 97% identyczne są wysoce korzystne, te w 98-99% identyczne są korzystniejsze, a te w co najmniej 99% identyczne są najkorzystniejsze. Takie polinukleotydy obejmują polinukleotyd zawierający polinukleotyd SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9, jak również polinukleotyd SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ

PL 209 127 B1

ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9 lub region kodujący SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.

Ujawniono tutaj ponadto kwas nukleinowy kodujący wyżej wspomniane białka ksenogenne oraz ich zastosowania w medycynie. W korzystnej postaci ksenogenny polinukleotyd CASB7439 do stosowania w środkach farmaceutycznych ma sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 13 (mysz) lub w SEQ ID NO: 15 (szczur). Ujawnione tutaj wyizolowane ksenogenne polinukleotydy CASB7439 mogą być jednoniciowe (kodujące lub antysensowne) lub dwuniciowe i mogą być cząsteczkami DNA (genomowy, cDNA lub syntetyczny) lub RNA. W ujawnionym tutaj polinukleotydzie mogą, ale nie muszą, być obecne dodatkowe sekwencje kodujące lub niekodujące. Inne pokrewne postacie dostarczają wariantów polinukleotydu mających znaczny stopień identyczności z sekwencjami ujawnionymi tu w SEQ ID NO: 13 lub w SEQ ID NO: 15, np. maj ą cych co najmniej 70% identycznoś ci sekwencji, a korzystnie co najmniej 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99%, lub więcej identyczności sekwencji w porównaniu z sekwencją ujawnionych tutaj polinukleotydów, według opisanych tu metod (np. analiza BLAST ze standardowymi parametrami). W pokrewnej postaci ujawniony tutaj wyizolowany ksenogenny polinukleotyd będzie zawierał sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest w co najmniej 90%, korzystnie w 95% lub w większym stopniu identyczny z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 na całej długości SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14, lub sekwencję nukleotydów komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

Ujawniono tutaj ponadto polinukleotydy, które są komplementarne do wszystkich wyżej opisanych polinukleotydów.

Te polinukleotydy mogą być wstawione do odpowiedniego plazmidu, zrekombinowanego wektora mikroorganizmu lub zrekombinowanego żywego mikroorganizmu i stosowane do immunizacji (patrz np. Wolff i in., Science 247: 1465-1468 (1990); Corr i in., J. Exp. Med. 184: 1555-1560 (1996); Doe i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8578-8583 (1996)). Tak wi ę c, dostarczono wektor ekspresyjny lub zrekombinowany żywy mikroorganizm zawierający te polinukleotydy, jak to zdefiniowano powyżej.

Dostarczono tutaj ponadto fragmentu polinukleotydu CASB7439, który po podaniu pacjentowi ma takie same właściwości immunogenne jak polinukleotyd SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 lub SEQ ID NO: 15.

Dostarczono tutaj ponadto polinukleotydu kodującego immunologiczny fragment polipeptydu CASB7439 zdefiniowany jak powyżej.

Te fragmenty mają poziom aktywności immunogennej odpowładający co najmniej około 50%, korzystnie co najmniej około 70%, a korzystniej co najmniej około 90% poziomu aktywności immunogennej sekwencji polipeptydu przedstawionej w SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 lub sekwencji polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydu przedstawioną w SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 lub SEQ ID NO: 15.

Te fragmenty polipeptydu według wynalazku korzystnie zawierają co najmniej około 5, 10, 15, 20, 25, 50 lub 100 lub więcej sąsiadujących aminokwasów, w tym wszystkie długości pośrednie przedstawionej tu kompozycji polipeptydowej, tak jak te przedstawione w SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14 lub te kodowane przez sekwencję polinukleotydu przedstawioną w sekwencji SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 lub SEQ ID NO: 15.

Sekwencja nukleotydów SEQ ID NO: 1 jest sekwencją cDNA, która zawiera kodującą polipeptyd sekwencję (nukleotydy od 545 do 1126) kodującą polipeptyd z 193 aminokwasów, to jest polipeptyd SEQ ID NO: 2. Sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd SEQ ID NO: 2 może być identyczna z kodującą polipeptyd sekwencją w SEQ ID NO: 1 lub może być sekwencją inną niż ta zawarta w SEQ ID NO: 1, która, w wyniku nadmiarowości (degeneracji) kodu genetycznego także koduje polipeptyd z SEQ ID NO: 2. Polipeptyd z SEQ ID NO: 2 jest strukturalnie spokrewniony z innymi biał kami rodziny achaete scute i zwany jest także „ludzkim homologiem 2 Achaete Scute” (HASH2) (numer dostępu NP_005161 i AAB86993).

Gen ludzkiego homologu 2 Achaete Scute (HASH2), o urzędowej nazwie ludzki ASCL2 (od

Achaete Scute complex like 2) jest horaologiem genów Achaete i Scute Drosophila. Ludzki ASCL2 jest eksprymowany tylko na pozakosmkowych trofoblastach rozwijającego się łożyska i mapuje się do chromosomu 11p15 blisko IGF2 i H19. Gen mysiego homologu 2 achaete scute (MASH2) koduje czynnik transkrypcyjny odgrywający rolę w rozwoju trofoblastu. Gen Mash2 jest ojcowsko piętnowany

PL 209 127 B1 u myszy i brak ekspresji ludzkiego ASCL2 w ludzkich niezłoś liwych zaśniadach groniastych (androgenetycznych) wskazuje, że ludzki ASCL2 ulega piętnowaniu także u człowieka.

Geny ASCL2 są członkami rodziny zasadowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa (BHLH). Aktywują one transkrypcję przez wiązanie się do sekwencji E (5'-CANNTG-3') . Dimeryzacja z innymi biał kami BHLH jest wymagana dla skutecznego zwią zania DNA. Biorą one takż e udział w determinacji prekursorów neuronów w obwodowym układzie nerwowym i oś rodkowym układzie nerwowym w Drosophila melanogaster, a prawdopodobnie także i u ssaków.

Komplementarna nić sekwencji nukleotydów SEQ ID NO: 1 jest sekwencją polinukleotydu SEQ ID NO: 6. Ta nić zawiera także dwie inne sekwencje kodujące polipeptydy. Pierwsza sekwencja kodująca polipeptyd (nukleotydy od 1184 do 399 w SEQ ID NO: 1, nukleotydy od 608 do 1393 w SEQ ID NO: 6) koduje polipeptyd z 262 aminokwasów, to jest polipeptyd SEQ ID NO: 3. Druga sekwencja kodująca polipeptyd (nukleotydy od 840 do 262 w SEQ ID NO: 1, nukleotydy od 952 do 1530 w SEQ ID NO: 6) koduje polipeptyd z 193 aminokwasów, to jest polipeptyd SEQ ID NO: 11. Sekwencje nukleotydów kodujące polipeptydy SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 11 mogą być identyczne z polipeptydami kodującymi sekwencję zawartą w SEQ ID NO: 6 lub może być to sekwencja inna niż zawarta w SEQ ID NO: 6, która w wyniku nadmiarowości (degeneracji) kodu genetycznego koduje także polipeptydy SEQ ID NO: 3 i 11. Polipeptyd SEQ ID NO: 3 jest strukturalnie spokrewniony z innymi białkami rodziny koaktywatorów składania, mając homologię i/lub podobieństwo strukturalne z podjednostką koaktywatora składania homo sapiens srm300 (numer dostępu w banku genów AAF21439). Polipeptyd SEQ ID NO: 11 nie jest spokrewniony z żadnym znanym białkiem. Sekwencje polipeptydów przedstawione w SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 11 i sekwencje polinukleotydów przedstawione w SEQ ID NO: 6 są nowe i także stanowią część ujawnienia.

Oczekuje się, że ujawnione tutaj korzystne polipeptydy i polinukleotydy będą miały między innymi funkcje/właściwości biologiczne podobne do tych, które mają homologiczne polipeptydy i polinukleotydy. Ponadto, ujawnione tutaj korzystne polipeptydy, fragmenty immunologiczne i polinukleotydy mają co najmniej jedną aktywność stosownie SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 11.

Ujawniono tutaj ponadto częściowe lub inne niekompletne sekwencje polinukleotydu i polipeptydu, które były zidentyfikowane przed określeniem odpowiedniej pełnej długości sekwencji SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 11. Dostarczono tutaj ponadto polipeptyd, który:

(a) zawiera sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 70% identyczna, korzystnie w co najmniej 80% identyczna, korzystniej w co najmniej 90% identyczna, jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczna, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z SEQ ID NO: 2 na całej długości SEQ ID NO: 2;

(b) ma sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 70% identyczna, korzystnie w co najmniej 80% identyczna, korzystniej w co najmniej 90% identyczna, jeszcze korzystniej w co najmniej 95% identyczna, a najkorzystniej w co najmniej 97-99% identyczna z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO: 2 na całej długości SEQ ID NO: 2; i (c) zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2.

Ujawnione tutaj polinukleotydy można wytworzyć z użyciem standardowych technik klonowania i przeszukiwania, z biblioteki cDNA pochodzą cej z mRNA z komórek ludzkiego raka okrężnicy (np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Ujawnione tutaj polinukleotydy można także otrzymać z naturalnych źródeł, takich jak genomowe biblioteki DNA lub zsyntetyzować z użyciem technik znanych i dostępnych w handlu.

Gdy ujawnione tutaj polinukleotydy stosuje się do wytwarzania ujawnionych tutaj polipeptydów drogą rekombinacji, polinukleotyd może zawierać sekwencję kodującą dojrzały polipeptyd, jako taką, lub sekwencję kodującą dojrzały polipeptyd w ramce odczytu z innymi sekwencjami kodującymi, takimi jak te kodujące lider lub sekwencję sekrecyjną, sekwencję pre-, pro- lub prepro-białka, lub inne części peptydów fuzyjnych. Przykładowo, można kodować sekwencję markera, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu fuzyjnego.

W niektórych korzystnych postaciach tego aspektu, sekwencją markera jest peptyd heksahistydynowy, taki jak dostarczony w wektorze pQE (Quiagen, Inc.) i opisany w Gent i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989) 86: 821-824 lub znacznik HA. Polinukleotyd może również zawierać niekodujące sekwencje 5' i 3', takie jak sekwencje transkrybowane, nie ulegające translacji, sygnały składania i poliadenylacji, miejsca wi ą zania rybosomu i sekwencje stabilizują ce mRNA.

PL 209 127 B1

Dalsze postacie obejmują polinukleotydy kodujące warianty polipeptydów, które zwierają sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 lub SEQ ID NO: 15 i w których kilka reszt aminokwasów, np. 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 1 do 2 lub 1 jest podstawionych, wydeletowanych lub dodanych, w dowolnej kombinacji.

Polinukleotydy, które są identyczne lub dostatecznie identyczne z sekwencją nukleotydów zawartą w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 6, mogą być stosowane jako sondy do hybrydyzacji do cDNA i DNA genomowego lub jako startery do reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych (PCR), do izolacji klonów pełnej długości cDNA i genomowych kodujących ujawnione tutaj polipeptydy i do izolacji klonów cDNA i genomowych innych genów (w tym genów kodujących paralogi ze źródeł ludzkich oraz ortologi i paralogi z gatunków nie będących człowiekiem), które mają wysokie podobieństwo sekwencji do SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 6. Zazwyczaj, te sekwencje nukleotydów są w 70% identyczne, korzystnie w 80% identyczne, korzystniej w 90% identyczne, a najkorzystniej w 95% identyczne z sekwencją odniesienia. Sondy lub startery będą na ogół zawierały co najmniej 15 nukleotydów, a korzystnie co najmniej 30 nukleotydów, przy czym mogą one mieć co najmniej 50 nukleotydów. Szczególnie korzystne sondy będą zawierać 30-50 nukleotydów. Szczególnie korzystne startery będą zawierać 20-25 nukleotydów. W szczególności, polipeptydy i polinukleotydy pochodzące z sekwencji o pochodzeniu z homologicznego zwierzęcia mogł yby być stosowane jako immunogeny prowadzą ce do uzyskania krzyżowej odpowiedzi immunologicznej na ludzki gen.

Polinukleotyd kodujący ujawniony tutaj polipeptyd, w tym homologi z gatunków innych niż człowiek, można wytworzyć sposobem obejmującym etapy przeszukiwania odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji z użyciem znakowanej sondy mającej sekwencję SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 6 lub jej fragment i wyodrębnienie klonów cDNA pełnej długości i genomowych zawierających tę sekwencję polinukleotydową. Takie techniki hybrydyzacji są dobrze znane fachowcom. Korzystne ostre warunki hybrydyzacji obejmują inkubację przez noc w 42°C w roztworze zawierającym: 50% formamidu, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trójcytrynian sodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczanu dekstranu i 20 μ g/ml zdenaturowanego pofragmentowanego DNA ze spermy łososia; a następnie płukanie filtrów w 0,1 x SSC w około 65°C. Tak więc, ujawnienie obejmuje ponadto polinukleotydy możliwe do uzyskania przez przeszukiwanie odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji z użyciem znakowanej sondy mającej sekwencję SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 6, lub jej fragment.

Fachowiec weźmie pod uwagę, że w wielu przypadkach wyizolowana sekwencja cDNA będzie niekompletna i że region kodujący polipeptyd jest skrócony na końcu 5' cDNA.

Istnieje kilka dostępnych i dobrze znanych fachowcom sposobów otrzymywania cDNA pełnej długości lub przedłużania krótkich cDNA, np. sposoby oparte na metodzie szybkiej amplifikacji końców cDNA (RACE) (patrz np. Frohman i in., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Niedawne modyfikacje tej techniki, np. technologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), znacznie uprościły poszukiwanie dłuższych cDNA. W technologii Marathon™ cDNA otrzymuje się z mRNA wyekstrahowanego z wybranej tkanki i do każdego końca liguje się sekwencję „adaptorową”. Następnie prowadzi się amplifikację kwasów nukleinowych (PCR) w celu zamplifikowania „brakującego” końca cDNA z użyciem kombinacji starterów oligonukleotydowych specyficznych dla genu i dla adaptora. Następnie, powtarza się reakcję PCR stosując startery „zagnieżdżone”, to znaczy startery zaprojektowane tak, by hybrydyzowały ze zamplifikowanym produktem (zazwyczaj starter specyficzny dla adaptora, który hybrydyzuje dalej w stronę 3' w sekwencji adaptora i starter specyficzny dla genu, który hybrydyzuje dalej w stronę 5' w znanej sekwencji genu). Produkty tej reakcji można następnie zanalizować przez sekwencjonowanie DNA i można skonstruować cDNA pełnej długości albo przez przyłączenie produktu bezpośrednio do istniejącego cDNA z wytworzeniem pełnej sekwencji, albo przez przeprowadzenie oddzielnego procesu PCR pełnej długości z użyciem nowej informacji o sekwencji do projektowania startera 5'.

Ujawnione tutaj zrekombinowane polipeptydy można wytworzyć z użyciem dobrze znanych sposobów z komórek gospodarza uzyskanych technikami inżynierii genetycznej, zawierających układy ekspresji. Tak więc, w dalszym aspekcie ujawnienie dotyczy układu ekspresji, który zawiera ujawniony tutaj polinukleotyd, komórek gospodarza uzyskanych technikami inżynierii genetycznej z takimi układami ekspresji i sposobu wytwarzania ujawnionych tutaj polipeptydów z użyciem technik rekombinacji. Można także stosować bezkomórkowe układy translacji dla wytworzenia takich białek, z użyciem RNA uzyskanych z ujawnionych tutaj konstruktów DNA.

Dla przeprowadzenia procesu wytwarzania technikami rekombinacji, technikami inżynierii genetycznej można uzyskać komórki gospodarza zawierające układy ekspresji ujawnionych tutaj polinuklePL 209 127 B1 otydów lub ich części. Wprowadzenie polinukleotydów do komórek gospodarza można zrealizować sposobami opisanymi w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Davis i in., Basic Methods in Molecular Biology (1986) i Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harber, N.Y. (1989). Korzystne sposoby obejmują np. transfekcję z fosforanem wapnia, transfekcję z użyciem DEAE-dekstranu, transwekcję, mikroiniekcję, transfekcję z użyciem kationowych lipidów, elektroporację, transdukcję, technikę „scrape loading”, introdukcję balistyczną i infekcję.

Korzystnie, ujawnione tutaj białka są koeksprymowane z trioredoksyną w trans (TTT). Koekspresja tioredoksyny w trans w przeciwieństwie do cis jest korzystna dla utrzymania antygenu wolnego od tioredoksyny bez potrzeby stosowania proteazy. Koekspresja tioredoksyny ułatwia solubilizację ujawnionych tutaj białek. Koekspresja tioredoksyny ma także znaczny wpływ na wydajność oczyszczania białek, na rozpuszczalność oczyszczonego białka i na jakość.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują komórki bakterii, takie jak komórki Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces i Bacillus subtilis; komórki grzybów, takie jak komórki drożdży i komórki Aspergillus; komórki owadów, takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; komórki zwierząt, takie jak CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 oraz komórki czerniaka Bowesa i komórki roślinne.

Można stosować wiele różnych układów ekspresji, np. układy chromosomalne, episomalne i pochodzące z wirusów, np. wektory pochodzące od plazmidów bakterii, z bakteriofaga, z transpozonów, z episomów drożdży, z elementów insercyjnych, z elementów chromosomalnych drożdży, z wirusów, takich jak bakulowirusy, wirusy papowa, takie jak SV40, wirus krowianki, adenowirusy, wirus ospy ptasiej, wirus pseudowścieklizny i retrowiruy oraz wektory pochodzące z ich kombinacji, takie jak te pochodzące z elementów genetycznych plazmidów i bakteriofagów, takie jak kosmidy i fagemidy. Układy ekspresji mogą zawierać regiony kontrolne, które regulują, jak również wywołują ekspresję. Na ogół można stosować dowolny układ lub wektor, który jest zdolny do utrzymania, namnażania lub ekspresji polinukleotydu z wytworzeniem polipeptydu w gospodarzu. Odpowiednia sekwencja nukleotydów może być wstawiona do układu ekspresji z użyciem dowolnej z szeregu dobrze znanych i rutynowych technik, takiej jak np. techniki przedstawione w Sambrook i in., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (powyżej). Do pożądanego polipeptydu mogą być włączone odpowiednie sygnały sekrecji, co pozwala na sekrecję ulegającego translacji białka do światła reticulum endoplazmatycznego, przestrzeni peryplazmatycznej lub środowiska zewnątrzkomórkowego. Te sygnały mogą być sygnałami endogennymi dla polipeptydu lub mogą być sygnałami heterologicznymi.

Układ ekspresji może być też zrekombinowanym żywym mikroorganizmem, takim jak wirus lub bakteria. Interesujący gen można wstawić do genomu żywego rekombinowanego wirusa lub bakterii. Inokulacja i infekcja in vivo tym żywym wektorem doprowadzi do ekspresji in vivo antygenu i indukcji odpowiedzi immunologicznych.

Tak więc, w pewnych postaciach polinukleotydy kodujące ujawnione immunogenne polipeptydy są wprowadzane do odpowiednich gospodarzy ssaków dla uzyskania ekspresji, z użyciem dowolnego z szeregu znanych układów opartych na wirusach. Przykładowo, retrowirusy stanowią wygodną i skuteczną podstawę dla układów dostarczania genów. Wybrana sekwencja nukleotydów kodująca ujawniony polipeptyd może być wstawiona do wektora i pakowana do cząstek retrowirusa z użyciem znanych technik. Zrekombinowany wirus można następnie wyizolować i podać pacjentowi. Opisano szereg przykładowych układów retrowirusowych (np. US nr 5 219 740; Miller i Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa i in. (1991) Virology 180: 849-852; Burns i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; i Boris-Lawrie i Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.

Dodatkowo, opisano szereg przykładowych układów opartych na adenowirusach. W odróżnieniu od retrowirusów, które integrują do genomu gospodarza, adenowirusy pozostają poza chromosomem, co minimalizuje zagrożenia związane z mutagenezą insercyjną (Haj-Ahmad i Graham (1986) J. Virol. 57: 267-274; Bett i in. (1993) J. Virol. 67: 5911-5921; Mittereder i in. (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth i in. (1994) J. Virol. 68: 933-940; Barr i in. (1994) Gene Therapy 1: 51-58 Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6: 616-629 i Rich i in. (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476).

Opracowano także różne układy wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV). Wektory AAV można łatwo skonstruować z użyciem znanych technik, patrz np. US nr 5 173 414 i UD nr 5 139 941; WO 92/01070 i WO 93/03769; Lebkowski i in. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent i in. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current

PL 209 127 B1

Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling i Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; i Zhou i in. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875.

Dodatkowe wektory użyteczne dla wytwarzania cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących ujawnione tutaj polipeptydy drogą transferu genów obejmują te pochodzące z rodziny wirusów ospy, takie jak wirus krowianki i rodzina wirusów ospy ptasiej. Przykładowo, rekombinanty wirusa krowianki eksprymujące nowe cząsteczki można skonstruować następująco. DNA kodujący polipeptyd najpierw wstawia się do odpowiedniego wektora tak, by przylegał do promotora krowianki i flankujących sekwencji DNA krowianki, takich jak sekwencja kodująca kinazę tymidyny (TK). Ten wektor stosuje się następnie do transfekcji komórek, które są równocześnie zakażone krowianką. Rekombinacja homologiczna służy do wstawienia promotora krowianki i genu kodującego interesujący polipeptyd do genomu wirusa. Powstały rekombinant TK. sup(-) można wyselekcjonować przez hodowlę komórek w obecności 5-bromodeoksyurydyny i wybranie opornych na nią łysinek wirusa.

Układ infekcji/transfekcji oparty na krowiance można wygodnie stosować do dostarczenia indukowalnej przejściowej ekspresji lub koekspresji jednego lub większej liczby opisanych tu polipeptydów w komórkach organizmu gospodarza. W tym szczególnym układzie komórki najpierw zakaża się in vitro rekombinantem wirusa krowianki, który koduje polimerazę RNA bakteriofaga T7. Ta polimeraza wykazuje wyjątkową specyficzność, gdyż transkrybuje tylko matryce mające promotory T7. Po infekcji komórki transfekuje się interesującym polinukleotydem lub polinukleotydami, sterowanymi przez promotor T7. Polimeraza eksprymowana w cytoplazmie z rekombinanta wirusa krowianki transkrybuje transfekowany DNA do RNA, który następnie jest poddawany translacji do polipeptydu przez maszynerię translacyjną gospodarza. Sposób umożliwia wysoki poziom przejściowgo, cytoplazmatyczngo wytwarzania dużych ilości RNA i produktów jego translacji, patrz np. Elroy-Stein i Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6763-6747; Fuerst i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-8126.

Alternatywnie, wirusy ospy ptasiej, takie jak wirusy ospy drobiu i ospy kanarków można także stosować do dostarczania interesujących sekwencji kodujących. Wiadomo, że zrekombinowane wirusy ospy ptasiej eksprymujące immunogeny z patogenów ssaka nadają ochronną odporność,gdy podaje się je gatunkom nie będącym ptakami. Zastosowanie wektora ospy ptasiej jest szczególnie korzystne u człowieka i innych gatunków ssaków, jako że członkowie rodzaju Avipox mogą namnażać się produkeywnie tylko w podatnych gatunkach ptaków, a zatem nie są zakaźne w komórkach ssaków. Sposoby wytwarzania zrekombinowanych wirusów ospy ptasiej są znane i stosuje się w nich rekominację genetyczną opisaną powyżej w odniesieniu do wytwarzania wirusów krowianki, patrz np. WO 91/12882; WO 89/03429 i WO 92/03545.

Do wytwarzania ujawnionych tutaj kompozycji polinukleotydów można stosować również dowolne z szeregu wektorów alfawirusowych, np. wektory opisane w US nr 5 843 723, US nr 6 015 686, US nr 6 008 035 i US nr 6 015 694. Można też stosować pewne wektory oparte na wirusie wenezuelskiego zapalenia opon mózgowych koni (VEE), patrz np. US nr 5 505 947 i US nr 5 643 576.

Ponadto, do dostarczania genów według ujawnienia można stosować także cząsteczkowe wektory skoniugowane, takie jak chimerowe wektory adenowirusowe opisane w Michael i in. J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 i Wagner i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103.

Dodatkową informację o tych i innych układach opartych na wirusach można znaleźć np. w Fisher-Hoch i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989; Flexner i in., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner i in., Vaccine 8: 17-21, 1990; US nr 4 603 112, US nr 4 769 330 i US nr 5 017 487; WO 89/01973; US nr 4 777 127; GB nr 2 200 651; EP nr 0 345 242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Resenfeld i in., Science 252: 431-434, 1991; Kolls i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman i in., Circulation 88: 2838-2848, 1993; i Guzman i in., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993.

Opisane powyżej zrekombinowane żywe mikroorganizmy mogą być wirulentne lub można je atenuować w różny sposób dla uzysania żywych szczepionek. Takie żywe szczepionki również stanowią część ujawnienia.

W niektórych postaciach wynalazku polinukleotyd moż e być wintegrowany do genomu docelowej komórki. Tę integrację można przeprowadzić w określonej lokalizacji i orientacji drogą homologicznej rekombinacji (zastąpienia genu) lub można ją przeprowadzić w losowym, niespecyficznym miejscu (dodanie genu). W jeszcze innych postaciach wynalazku polinukleotyd może być trwale utrzymywany w komórce jako oddzielny episomalny odcinek DNA. Takie segmenty polinukleotydów lub „episomy” kodują sekwencje wystarczające dla utrzymania i replikacji niezależnej od cyklu komórPL 209 127 B1 kowego gospodarza lub zsynchronizowanej z cyklem komórkowym gospodarza. Sposób dostarczania konstruktu ekspresyjnego do komórki i miejsce w komórce, w którym polinukleotyd pozostanie są zależne od typu stosowanego konstruktu ekspresyjnego.

W innej postaci wynalazku polinukleotyd jest podawany/dostarczany jako „nagi” DNA, np. jak to opisano w Ulmer i in., Science 259: 1745-1749, 1993 i w pracy przeglądowej Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. Pobieranie nagiego DNA może być zwiększone przez powleczenie DNA biodegradowalnych perełek, które są wydajnie transportowane do komórek.

W jeszcze innej postaci wynalazku ś rodek wed ł ug wynalazku moż e być dostarczony technikami bombardowania cząstkami, z których wiele już opisano. Przykładowo, napędzane gazem przyspieszenie cząstek można uzyskać z użyciem takich urządzeń jak produkowane przez Powderjet Pharmaceuticals PLC (Oxford, Królestwo Zjednoczone) i Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), a pewne przykłady opisano w US nr 5 846 796, US nr 6 010 478, US nr 5 865 796, US nr 5 584 807 i EP nr 0 500 799. Pozwala to na podawanie bez strzykawki, gdyż preparat w postaci suchego proszku o czą stkach mikroskopowej wielkości, takich jak czą stki polinukleotydów lub polipeptydów, jest przyspieszany do dużej prędkości przez strumień gazowego helu generowanego przez trzymane w ręku urządzenie, co wprowadza cząstki do docelowej tkanki.

Zgodnie ze zbliżoną postacią wynalazku stosuje się inne urządzenia i sposoby użyteczne w przypadku sterowanej przez gaz bezigł owej iniekcji środka wedł ug wynalazku, np. dostarczane przez Bioject, Inc. (Portland, OR), a pewne przykłady opisano w US nr 4 790 824, US nr 5 064 413, US nr 5 312 335, US nr 5 383 851, US nr 5 399 163, US nr 5 520 639 i US nr 5 993 412.

Ujawnione tutaj polipeptydy można wyodrębniać ze zrekombinowanych hodowli komórek i oczyszczać znanymi sposobami, np. przez strącanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię aniono- lub kationowymienną, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyloapatycie i chromatografię na lektynie. Najkorzystniej do oczyszczania stosuje się chromatografię powinowactwa do jonów metali (IMAG). Do regenerowania konformacji aktywnych, gdy polipeptyd ulegnie denaturacji w czasie syntezy wewnątrzkomórkowej, wyodrębniania lub oczyszczania, można stosować dobrze znane techniki ponownego zwijania białek.

Inny ważny aspekt ujawnienia dotyczy sposobu indukowania, wzmacniania lub modulacji odpowiedzi immunologicznej u ssaka, która obejmuje szczepienie ssaka fragmentem lub całym ujawnionym tutaj polipeptydem lub polinukleotydem, wystarczającym do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwciał i/lub komórek T dla immunoprofilaktyki lub terapeutycznego leczenia raka, a w szczególnoś ci raka okrężnicy i odbytnicy, chorób autoimmunizacyjnych i pokrewnych stanów. Jeszcze inny aspekt dotyczy sposobu indukowania, wzmacniania lub modulacji odpowiedzi immunologicznej u ssaka, który polega na dostarczeniu ujawnionego tutaj polipeptydu poprzez wektor lub komórkę sterujące ekspresją polinukleotydu i kodujące polipeptyd in vivo, aby wywołać taką odpowiedź immunologiczną w celu wytworzenia odpowiedzi immunologicznych dla potrzeb profilaktyki lub terapii choroby u takiego ssaka.

Dalszy aspekt wynalazku dotyczy preparatu immunologicznego/szczepionki (środka) i jego zastosowania w medycynie. Te środki po ich wprowadzeniu do gospodarza ssaka indukują, wzmacniają lub modulują odpowiedź immunologiczną u tego ssaka na ujawniony tutaj polipeptyd, przy czym środek ten zawiera uprzednio zdefiniowane polipeptyd lub polinukleotyd lub jego immunologiczny fragment. W szczególności środek immunogenny według wynalazku zawiera bezpieczną i skuteczną ilość polipeptydu CASB7439 lub jego immunogennego fragmentu, gdzie polipeptyd CASB7439 jest wybrany z grupy zawierającej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 lub SEQ ID NO: 14. W innej postaci wynalazku środek immunogenny zawiera bezpieczną i skuteczną ilość polinukleotydu kodującego CASB7439 lub jego fragment, gdzie polinukleotyd kodujący CASB7439 jest wybrany z grupy zawierającej SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 lub SEQ ID NO: 15.

Preparat szczepionki według wynalazku może ponadto zawierać odpowiedni, to jest farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Ponieważ polipeptyd może ulec rozkładowi w żołądku, korzystnie podaje się go pozajelitowo (np. drogą iniekcji podskórnej, domięśniowej, dożylnej lub śródskórnej). Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do iniekcji, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, bakteriostatyki i rozpuszczone związki, które czynią preparat izotonicznym z krwią pacjenta, a także wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać substancje zawieszające lub zagęszczające. Preparaty można umieszczać w pojemnikach,

PL 209 127 B1 w postaci pojedynczych lub wielu dawek, np. w zatopionych ampu ł kach i fiolkach i moż na je przechowywać w postaci liofilizowanej wymagającej tylko dodatku sterylnego nośnika płynnego bezpośrednio przed użyciem.

Dalszy aspekt ujawnienia dotyczy indukcji in vitro odpowiedzi immunologicznych na fragment lub cały ujawniony tutaj polipeptyd lub polinukleotyd lub cząsteczkę zawierającą ujawniony tutaj polipeptyd lub polinukleotyd, z użyciem komórek z układu odpornościowego ssaka i ponownego wprowadzania tych zaktywowanych komórek odpornościowych ssaka w celu leczenia choroby. Aktywację komórek z układu odpornościowego uzyskuje się drogą inkubacji in vitro z całym ujawnionym tutaj polipeptydem lub polinukleotydem lub z cząsteczką zawierającą ujawniony tutaj polipeptyd lub polinukleotyd, w obecności lub pod nieobecność różnych cząsteczek immunomodulatorowych. Dalszy aspekt dotyczy immunizacji ssaka przez podanie komórek prezentujących antygen, zmodyfikowanych przez obciążenie in vitro częścią lub całym ujawnionym tutaj polipeptydem lub cząsteczką zawierającą ujawniony tutaj polipeptyd i podawanej in vivo w sposób immunogenny.

Alternatywnie, komórki prezentujące antygen mogą być transfekowane in vitro wektorem zawierającym fragment lub cały ujawniony tutaj polinukleotyd lub cząsteczkę zawierającą ujawniony tutaj polinukleotyd tak, by następowała ekspresja odpowiedniego polipeptydu, przy czym podaje się je in vivo w sposób immunogenny. Tak więc, środki farmaceutyczne według wynalazku będą zawierały skuteczną ilość komórek prezentujących antygen zmodyfikowanych przez obciążenie in vitro polipeptydem CASB7439 lub genetycznie zmodyfikowanych in vitro tak, by eksprymowały polipeptyd CASB7439 oraz farmaceutycznie skuteczny nośnik.

Zgodnie z inną postacią wynalazku, opisane tu środki farmaceutyczne/immunogenne będą zawierały jeden lub większą liczbę immunostymulantów obok kompozycji immunogennego polinukleotydu, polipeptydu, przeciwciała, komórek T i/lub komórek prezentujących antygen (APC) według wynalazku. Tak więc, sposób wytwarzania tego środka immunogennego obejmuje zmieszanie polipeptydu CASB7439 lub polinukleotydu kodującego CASB7439 z odpowiednim adiuwantem/immunostymulantem, rozcieńczalnikiem lub innym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Immunostymulantem jest zasadniczo dowolna substancja, która wzmaga lub umożliwia odpowiedź immunologiczną (z udziałem przeciwciał i/lub komórek) na antygen egzogenny.

Korzystny typ immunostymulanta obejmuje adiuwant. Wiele adiuwantów zawiera substancję przeznaczoną do chronienia antygenu przed szybkim katabolizmem, taką jak wodorotlenek glinu lub olej mineralny, oraz stymulator odpowiedzi immunologicznych, taki jak lipid A, białka pochodzące z Bortadella pertussis lub Mycobacterium tuberculosis. Pewne adiuwanty są dostępne w handlu, np. niekompletny adiuwant Freunda i kompletny adiuwant Freunda (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA) , sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu, sole wapnia, żelaza lub cynku, nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny, acylowane cukry, kationowe lub anionowe podstawione polisacharydy, polifosfazeny, biodegradowalne mikrosfery, monofosforylolipid A i quil A. Cytokiny, takie jak GM-CSF, interleukina-2, -7, -12 i inne czynniki wzrostowe można także stosować jako adiuwanty.

Zgodnie z pewnymi postaciami korzystnie stosuje się kompozycję adiuwantu indukującą odpowiedź immunologiczną, przede wszystkim typu Th1. Wysoki poziom cytokin typu Th1 (np. IFN-γ, TN-Fa, IL-2 i IL-12) może sprzyjać indukcji odpowiedzi immunologicznych pośredniczonych przez komórki na podany antygen. Z kolei wysoki poziom cytokin typu Th2 (np. IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10) może sprzyjać indukowaniu humoralnych odpowiedzi immunologicznych. Po podaniu szczepionki pacjent będzie podtrzymywał odpowiedź immunologiczną, która obejmuje odpowiedzi typu Th1 i Th2. Zgodnie z korzystną postacią, odpowiedź jest przede wszystkim odpowiedzią typu Th1, a poziom cytokin typu Th1 będzie wzrastał w większym stopniu niż poziom cytokin typu Th2. Poziomy tych cytokin mogą być łatwo oznaczone z użyciem standardowych testów. Przegląd rodzin cytokin zamieszczono w Mosmann i Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

Pewne adiuwanty korzystne dla wywoływania przede wszystkim odpowiedzi typu Th1 obejmują np. kombinację monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A, z solą glinu. Adiuwanty MPL^® są dostępne jako produkty Corixa Corporation (Seattle, WA; patrz np. US nr 4 436 727, US nr 4 877 611, US nr 4 866 034 i US nr 4 912 094). Oligonukleotydy zawierające CpG (w których dinukleotyd CpG nie jest metylowany) także indukują odpowiedź przede wszystkim Th1. Takie oligonukleotydy są dobrze znane i opisano je np. w WG 96/02555, WG 99/33488, US nr 6 008 200 i US nr 5 856 462. Immunostymulujące sekwencje DNA opisano np. w Sato i in., Science 273: 352,

PL 209 127 B1

1996. Inny korzystny adiuwant zawiera saponinę, taką jak Quil A lub jej pochodne, w tym QS21 i QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Farmingham, MA), escynę, digitoninę lub saponiny Gypsophila lub

Chenopodium guinoa. Inne korzystne preparaty obejmują więcej niż jedną saponinę w ujawnionych tutaj kombinacjach adiuwantu, np. kombinacje co najmniej dwóch saponin wybranych z grupy obejmującej QS21, QS7, Quil A, β-escynę i digitoninę.

Alternatywnie, preparaty saponinowe można łączyć z nośnikami szczepionki złożonymi z chitozanu lub innych polimerów polikationowych, polilaktydu i cząstek polilaktyd-ko-glikolid, matrycą polimeryczną opartą na poli-N-acetylo-glukozaminie, cząstkami złożonymi z polisacharydów lub chemicznie zmodyfikowanych polisacharydów, liposomami i cząstkami opartymi na lipidach, cząstkami złożonymi z monoestrów glicerolu itd. Saponiny mogą być także formułowane w obecności cholesterolu z wytworzeniem struktur cząstkowych, takich jak liposomy lub ISCOM. Ponadto saponiny można formułować z polioksyetylenowanym eterem lub estrem, w roztworze lub zawiesinie zawierających cząstki lub nie zawierających cząstek, lub w takiej strukturze cząstkowej jak kilkuwarstwowy liposom lub ISCOM. Saponiny można także formułować z takimi zaróbkami jak Carbopol^R, dla zwiększenia lepkości lub w postaci suchego proszku z zaróbką proszkową, taką jak laktoza.

W jednej z korzystnych postaci układ adiuwanta obejmuje połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, takie jak kompozycja QS21 i adiuwantu 3D-MPL^® opisana w WO 94/00153 lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest wygaszony cholesterolem, opisaną w WO 96/33739. Inne korzystne preparaty obejmują emulsję olej w wodzie i tokoferol. Inny szczególnie korzystny preparat adiuwanta zawierający QS21, adiuwant 3D-MPL^® i tokoferol w postaci emulsji olej w wodzie opisano w WO 95/17210.

Inny wzmocniony układ adiuwanta obejmuje połączenie oligonukleotydu zawierającego CpG i pochodnej saponiny, zwłaszcza połączenie CpG i QS21 ujawnione w WO 00/09159. Korzystny preparat dodatkowo zawiera emulsję olej w wodzie i tokoferol.

Dodatkowe przykładowe adiuwanty do stosowania w środkach farmaceutycznych według wynalazku obejmują Montanide ISA 720 (Seppic, Francja), SAF (Chiron, California, Stany Zjednoczone Ameryki), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), serię adiuwantów SBAS (np. SBAS-2 lub SBAS-4, dostępne od SmithKline Beecham, Rixensart, Belgia), Detox (Enhazyn^®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) i inne aminoalkiloglukozoaminido-4-fosforany (AGP), takie jak te opisane w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach seryjnych 08/853826 i 09/074720, których ujawnienia są tu w całości włączone jako pozycje literaturowe i adiuwanty typu polioksyetylenowanych eterów, takie jak opisane w WO 99/52549A1.

Inne korzystne adiuwanty obejmują cząsteczki adiuwantowe o ogólnym wzorze (I): HO(CH2CH2O)n-A-R w którym n oznacza 1-50, A oznacza wiązanie lub -C(O)-, a R oznacza C1-50-alkil lub fenylo-C1-50-alkil.

Jedną z postaci wynalazku stanowi preparat szczepionki zawierający polioksyetylenowany eter o ogólnym wzorze (I), w którym n oznacza 1-50, korzystnie 4-24, a najkorzystniej 9; R oznacza C1-50-alkil, korzystnie C4-20-alkil, najkorzystniej C12-alkil, a A oznacza wiązanie. Stężenie polioksyetylenowanych eterów powinno wynosić 0,1-20%, korzystnie 0,1-10%, a najkorzystniej 0,1-1%. Korzystne polioksyetylenowe etery są wybrane z grupy obejmującej eter polioksyetyleno-9-laurylowy, eter polioksetyleno-9-stearylowy, eter polioksyetyleno-8-stearylowy, eter polioksyetyleno-4-laurylowy, eter polioksyetyleno-35-laurylowy i eter polioksyetyleno-23-laurylowy. Takie polioksyetylenowe etery jak eter polioksyetylenolaurylowy opisano w Mercx Index (wyd. 12, pozycja 7717). Te cząsteczki adiuwantowe opisano w WO 99/52549.

Polioksyetylenowy eter o powyższym ogólnym wzorze (I) można w razie potrzeby łączyć z innym adiuwantem. Korzystne połączenie adiuwantów zawiera CpG, jak to opisano w będącym w trakcie badania zgłoszeniu brytyjskim nr GB 9 820 956.2.

Korzystnie, w preparacie szczepionki według wynalazku obecny jest także nośnik. Nośnikiem może być emulsja olej w wodzie lub sól glinu, taka jak fosforan glinu, lub wodorotlenek glinu.

Korzystna emulsja olej w wodzie zawiera metabolizowalny olej, taki jak skwalen, α-tokoferol i Tween 80. Szczególnie korzystnie w takiej emulsji antygeny szczepionki według wynalazku są połączone z QS21 i 3D-MPL. Ponadto emulsja olej w wodzie może zawierać Span 85 i/lub lecytynę i/lub trikaprylinę.

Zazwyczaj przy podawaniu ludziom QS21 i 3D-MPL będą obecne w szczepionce w ilości 1-200 μg, np. 10-100 μg, a korzystnie 10-50 μg na dawkę. Zwykle olej w wodzie będzie zawierał 2-10% skwale16

PL 209 127 B1 nu, 2-10% α-tokoferolu i 0,3 -3% Tween 80. Korzystnie, stosunek skwalen:a-tokoferol wynosi 1 lub jest mniejszy niż 1, co daje trwalszą emulsję. Span 85 może być też obecny w stężeniu 1%. W niektórych przypadkach może być korzystne, aby szczepionki według wynalazku zawierały także stabilizator.

Nietoksyczne emulsje olej w wodzie korzystnie zawierają nietoksyczny olej, np. skwalan lub skwalen, i emulgator, np. Tween 80, w nośniku wodnym. Nośnikiem wodnym może być np. roztwór soli buforowany fosforanami.

Szczególnie silnie działający preparat adiuwantowy, zawierający QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej w wodzie, opisano w WO 95/17210.

Dostarczono ponadto kompozycję szczepionki poliwalentnej zawierającej preparat szczepionki według wynalazku w połączeniu z innymi antygenami, zwłaszcza z antygenami użytecznymi w leczeniu raka, a szczególnie raka okrężnicy i odbytnicy, chorób autoimmunizacyjnych i związanych z nimi stanów. Taka kompozycja szczepionki poliwalentnej może zawierać adiuwant indukujący TH-1, jak to opisano uprzednio.

Według innej postaci wynalazku opisany tu środek immunogenny jest podawany gospodarzowi przez komórki prezentujące antygen (APC), takie jak komórki dendrytyczne, makrofagi, komórki B, monocyty i inne komórki, które mogą być modyfikowane tak, by były skutecznymi APC. Takie komórki mogą, lecz niekoniecznie, być genetycznie zmodyfikowane dla zwiększenia zdolność do prezentowania antygenu, dla poprawienia aktywacji i/lub utrzymywania odpowiedzi komórek T, aby miały one jako takie działanie przeciwnowotworowe i/lub były immunologicznie kompatybilne z biorcą (dopasowany haplotyp HLA). APC mogą być na ogół wyodrębniane z dowolnego z szeregu płynów biologicznych i narządów, w tym z tkanek nowotworu i okołonowotworowych i mogą być komórkami autologicznymi, alogenicznymi, syngenicznymi lub ksenogennymi.

W niektórych korzystnych postaciach stosuje się komórki dendrytyczne lub ich prekursory jako komórki prezentujące antygen. Komórki dendrytyczne są bardzo silnie działającymi APC (Banchereau i Steinman, Nature 392: 245-251, 1998) i wykazano, że są skuteczne jako fizjologiczny adiuwant do wywoływania profilaktycznej lub terapeutycznej odporności przeciw nowotworom (patrz Timmerman i Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). Na ogół komórki dendrytyczne mogą być identyfikowane w oparciu o ich typowy kształt (gwiaździsty in situ, z wyraźnymi wypustkami (dendrytami) widocznymi in vitro), o ich zdolność do pobierania, przerabiania i prezentowania antygenów z wysoką wydajnością, oraz o ich zdolność do aktywowania odpowiedzi naiwnych komórek T. Komórki dendrytyczne można oczywiście poddać modyfikacji metodami inżynierii genetycznej tak, by eksprymowały specyficzne dla komórek receptory powierzchni komórek lub ligandy, które nie występują powszechnie na komórkach dendrytycznych in vivo lub ex vivo i takie zmodyfikowane komórki dendrytyczne są objęte zakresem ujawnienia. Jako alternatywę dla komórek dendrytycznych można stosować w szczepionce wydzielone pęcherzyki z obciążonych antygenem komórek dendrytycznych (zwane egzosomami) (patrz Zitvogel i in., Nature Med. 4: 594-600, 1998).

Komórki dendtrytyczne i prekursory mogą być uzyskane z krwi obwodowej, szpiku kostnego, komórek infiltrujących nowotwór, komórek infiltrujących tkanki otaczające nowotwór, węzłów chłonnych, śledziony, skóry, krwi pępowinowej lub dowolnych innych odpowiednich tkanek lub płynów. Przykładowo komórki dendrytyczne mogą być różnicowane ex vivo przez dodanie kombinacji cytokin, takich jak GM-CSF, IL-4, IL-13 i/lub TNFa, do hodowli monocytów zebranych z krwi obwodowej. Alternatywnie, komórki CD34 dodatnie zebrane z krwi obwodowej, krwi pępowinowej lub szpiku kostnego mogą być różnicowane do komórek dendrytycznych przez dodanie do podłoża hodowli kombinacji GM-CSF, IL-3, TNFa, ligandu CD40, LPS, ligandu fit3 i/lub innego związku (innych związków), który indukuje różnicowanie, dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych.

Komórki dendrytyczne dzieli się na kategorie komórek „niedojrzałych” i „dojrzałych”, co pozwala na proste rozróżnienie między dwoma dobrze scharakteryzowanymi fenotypami. Jednak ta nomenklatura nie powinna być uważana za wykluczającą wszystkie możliwe pośrednie stany różnicowania. Niedojrzałe komórki dendrytyczne są charakteryzowane jako APC z wysoką zdolnością pobierania i obróbki antygenu, co koreluje z wysoką ekspresją receptora Fcy i receptora mannozy. Dojrzały fenotyp jest typowo charakteryzowany przez niższą ekspresję tych markerów, ale wysoką ekspresję cząsteczek z powierzchni komórki odpowiedzialnych za aktywację komórek T, takich jak MHC klasy I i II, cząsteczek adhezyjnych (np. CD54 i CD11) i cząsteczek współstymulujących (np. CD40, CD80, CD86 i 4-1BB).

APC mogą być ogólnie transfekowane ujawnionym tutaj polinukleotydem (lub jego częścią lub innym wariantem) tak, że kodowany polipeptyd lub jego immunogenna część jest eksprymowana na

PL 209 127 B1 powierzchni komórki. Taka transfekcja może się odbywać ex vivo i środek farmaceutyczny zawierający takie transfekowane komórki może być następnie stosowany do opisanych tu celów terapeutycznych. Alternatywnie, nośnik do dostarczania genów, który adresuje komórkę dendrytyczną lub inną prezentującą antygen komórkę, można podać pacjentowi dla uzyskania transfekcji in vivo. Przykładowo, transfekcję in vivo i ex vivo komórek dendrytycznych można prowadzić stosując dowolne znane sposoby, takie jak te opisane w WO 97/24447 lub metodę strzelby genowej opisaną przez Mahvi i in., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997. Obciążenie antygenem komórek dendrytycznych można uzyskać przez inkubację komórek dendrytycznych lub komórek prekursorowych z polipeptydem nowotworowym, DNA (nagim lub w obrębie wektora plazmidowego) lub RNA albo ze zrekombinowanymi bakteriami lub wirusami eksprymującymi antygen (np. wektory krowianki, wirusa ospy ptasiej, adenowirusowe lub lentiwirusowe). Przed obciążeniem polipeptyd może być konwalencyjnie sprzężony z partnerem immunologicznym, który dostarcza pomoc komórek T (np. cząsteczka nośnika). Alternatywnie, komórka dendrytyczna może być pulsowana niesprzężonym partnerem immunologicznym, oddzielnie lub w obecności polipeptydu.

W środkach farmaceutycznych według wynalazku można stosować dowolny nośnik znany fachowcom, jednak zazwyczaj typ nośnika będzie zmieniał się w zależności od sposobu podawania. Środki według wynalazku mogą być formułowane dla dowolnego odpowiedniego sposobu podawania, w tym np. do podawania miejscowego, doustnego, donosowego, dośluzówkowego, dożylnego, doczaszkowego, dootrzewnowego, podskórnego i domięśniowego.

Nośniki do stosowania w takich środkach farmaceutycznych są biokompatybilne, a ponadto mogą być biodegradowalne. W niektórych postaciach preparat korzystnie dostarcza stosunkowo stały poziom uwalniania substancji czynnej. W innych postaciach może być jednak pożądane szybsze tempo uwalniania bezpośrednio po podaniu. Formułowanie takich środków mieści się w zakresie zwykłych umiejętności i można je zrealizować z użyciem znanych technik. Do przykładowych użytecznych nośników należą mikrocząstki poli(laktydo-ko-glikolidu), poliakrylanu, lateksu, skrobi, celulozy, dekstranu itp. Inne przykładowe nośniki o opóźnionym uwalnianiu obejmują biowektory supramolekularne, które zawierają nie będący cieczą rdzeń hydrofilowy (np. usieciowany polisacharyd lub oligosacharyd) i ewentualnie zewnętrzną warstwę zawierającą związek amfifilowy, taki jak fosfolipid (patrz np. US nr 5 151 254, WO 94/20078, WO 94/23701 i WO 96/06638). Ilość substancji czynnej zawartej w preparacie o przedłużonym uwalnianiu zależy od miejsca wszczepu, szybkości i oczekiwanego trwania uwalniania oraz charakteru stanu, który ma być leczony lub któremu należy zapobiegać.

W innej przykładowej postaci jako nośniki środka według wynalazku stosuje się biodegradowalne mikrokuleczki (np. polimleczanowe lub poliglikolanowe). Odpowiednie biodegradowalne mikrokuleczki ujawniono np. w US nr 4 897 268, US nr 5 075 109, US nr 5 928 647, US nr 5 811 128, US nr 5 820 883, US nr 5 853 763, US nr 5 814 344, US nr 5 407 609 i US nr 5 942 252. Użyteczne w wielu zastosowaniach mogą być zmodyfikowane układy nośnikowe na bazie białka rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B opisane w WO/99 4 0934 i cytowanej tam literaturze. Inne przykładowe układy nośnikowe/dostarczające mają postać złożonych z cząstek kompleksów białkowych, takich jak opisane w US nr 5 928 647, które są zdolne do powodowania ograniczonej przez klasę I odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T u gospodarza.

Środki farmaceutyczne według wynalazku będą często zawierały ponadto jeden lub większą liczbę buforów (np. obojętnego buforowanego roztworu soli lub roztworu soli buforowanego fosforanami), węglowodany (np. glukozę, mannozę, sacharozę lub dekstrany), mannitol, białka, polipeptydy lub aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, bakteriostatyki, środki chelatujące, takie jak EDTA lub glutation, adiuwanty (np. wodorotlenek glinu), rozpuszczone związki, które czynią preparat izotonicznym, hipotonicznym lub słabo hipertonicznym w stosunku do krwi biorcy, środki zawieszające, środki zagęszczające i/lub konserwanty. Alternatywnie, środki według wynalazku mogą być formułowane jako liofilizat.

Opisane tutaj środki farmaceutyczne mogą być umieszczane w pojemnikach jedno- lub wielodawkowych, takich jak zatopione ampułki lub fiolki. Takie pojemniki są zazwyczaj zatapiane tak by, zachować sterylność i trwałość preparatu aż do jego użycia. Na ogół preparaty mogą być przechowywane jako zawiesiny, roztwory lub emulsje w oleistych lub wodnych nośnikach. Alternatywnie, środki farmaceutyczne mogą być przechowywane w stanie zliofilizowanym wymagającym tylko dodania sterylnego nośnika płynnego bezpośrednio przed użyciem.

Sposoby opracowywania odpowiednich schematów dawkowania i terapii dla stosowania poszczególnych opisanych tutaj środków, w tym poprzez podawanie doustne, pozajelitowe, dożylne,

PL 209 127 B1 donosowe i domięśniowe oraz sposoby formułowania są dobrze znane, przy czym niektóre z nich omówiono krótko poniżej dla ilustracji.

W niektórych zastosowaniach ujawnione tutaj środki farmaceutyczne moż na podawać istotom żywym doustnie. Jako takie te środki można formułować z obojętnym rozcieńczalnikiem lub z przyswajalnym, jadalnym nośnikiem, albo zamykać w twardej lub miękkiej kapsułce żelatynowej, albo prasować w tabletki, albo wprowadzać bezpośrednio do środków spożywczych.

Substancje czynne można łączyć z zaróbkami i stosować w postaci jadalnych tabletek, tabletek podpoliczkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków itp (patrz np. Mathiowitz i in., Nature 1997 Mar 27; 386 (6623): 410-4; Hwang i in., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998; 15 (3): 243-84; US nr 5 641 515; US nr 5 580 579 i US nr 5 792 451). Tabletki, kołaczyki, pigułki, kapsułki itp. mogą też zawierać dowolne z szeregu dodatkowych składników, np. środek wiążący, taki jak żywica tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana lub żelatyna, takie zaróbki jak fosforan dwuwapniowy, środek rozsadzający, taki jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy itp.; środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu i środek słodzący, taki jak sacharoza, laktoza lub sacharyna, lub środek smakowo-zapachowy, taki jak mięta, olejek wintergrinowy lub wiśniowy środek smakowo-zapachowy. Gdy postacią dawkowaną jest kapsułka, może ona zawierać, oprócz materiałów powyższego typu, ciekły nośnik. Można stosować różne inne materiały jako powłoki lub do innej modyfikacji formy fizycznej postaci dawkowanej. Przykładowo, tabletki, pigułki lub kapsułki mogą być powleczone szelakiem, cukrem lub obydwoma tymi substancjami. Oczywiście wszelkie materiały stosowane do wytwarzania wszelkich jednostkowych postaci dawkowanych powinny być farmaceutycznie czyste i zasadniczo nietoksyczne w stosowanych ilościach. Ponadto związki czynne można wprowadzać do preparatów o przedłużonym uwalnianiu.

Zazwyczaj te preparaty będą zawierały co najmniej około 0,1% substancji czynnej lub więcej, jakkolwiek procentowa zawartość substancji czynnej (substancji czynnych) może być oczywiście różna i wynosić od około 1-2% do około 60% lub 70%, lub więcej w przeliczeniu na całkowitą masę lub objętość preparatu. Oczywiście, ilość substancji czynnej w danym terapeutycznie użytecznym środku można dobrać tak, by w danej postaci dawkowanej była zawarta odpowiednia jej dawka. Fachowiec z dziedziny wywarzania preparatów farmaceutycznych weźmie pod uwagę takie czynniki jak rozpuszczalność, biodostępność, biologiczny okres półtrwania, droga podawania, czas trwałości produktu przy przechowywaniu i inne czynniki ważne w farmacji, przy czym mogą być pożądane różne dawki i sposoby podawania.

Środki według wynalazku do podawania doustnego mogą zawierać jedną lub większą liczbę zarobek i mieć postać płukanki do ust, środka do czyszczenia zębów, tabletki podpoliczkowej, spreju do ust lub preparatu do podawania podjęzykowo. Alternatywnie, substancję czynną można wprowadzać do roztworu do podawania doustnego, takiego jak roztwór zawierający boran sodu, glicerynę i wodorowęglan potasu, lub dyspergować w środku do czyszczenia zębów, lub dodawać w ilości terapeutycznie skutecznej do kompozycji, która może zawierać wodę, środki wiążące, środki ścierne, środki smakowo-zapachowe, środki pieniące i środki nawilżające. Alternatywnie, środek może być sformułowany w tabletkę lub roztwór do umieszczania pod językiem lub rozpuszczające się w inny sposób w jamie ustnej.

W pewnych warunkach bę dzie pożądane podawanie opisanych tutaj ś rodków farmaceutycznych pozajelitowo, dożylnie, domięśniowo lub nawet dootrzewnowo. Takie podejścia są dobrze znane fachowcom, a niektóre z nich opisane np. w US nr 5 543 158, US nr 5 641 515 i US nr 5 399 363. W niektórych postaciach roztwór substancji czynnej w postaci wolnych zasad lub farmaceutycznie dopuszczalnych soli można wytwarzać w wodzie odpowiednio zmieszanej ze związkiem powierzchniowo czynnym, takim jak hydroksypropyloceluloza. Dyspersje można także sporządzać w glicerolu, płynnych poliglikolach etylenowych i ich mieszaninach oraz w olejach. W normalnych warunkach przechowywania i stosowania te preparaty będą na ogół zawierały środek konserwujący, aby zapobiegać wzrostowi mikroorganizmów.

Przykładowe postacie farmaceutyczne odpowiednie do iniekcji obejmują sterylne roztwory wodne lub dyspersje i sterylne proszki dla przygotowywania sterylnych roztworów lub dyspersji do wstrzykiwania (patrz np. US nr 5 466 468). We wszystkich przypadkach postać musi być sterylna i musi być płynna w takim stopniu, by była łatwa do podania z użyciem strzykawki. Musi być ona trwała w warunkach wytwarzania i przechowywania i musi zawierać konserwanty przeciw skażającemu działaniu mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub ośrodek dyspersyjny zawierające np. wodę, etanol, poliol (np. glicerol, glikol propylenowy i płynny poliglikol etylePL 209 127 B1 nowy itp.), odpowiednie ich mieszaniny i/lub oleje roślinne. Odpowiednią płynność można zachować np. przez użycie środka powlekającego, takiego jak lecytyna, przez utrzymanie pożądanej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i/lub przez stosowanie związków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów może być ułatwione dzięki stosowaniu różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, takich jak parabeny, chlorobutanol, fenol, kwas sorbinowy, timerosal itp. W wielu przypadkach korzystnie dodaje się środków izotonicznych, np. cukrów lub chlorku sodu. Przedłużone wchłanianie wstrzykiwanych środków można uzyskać przez stosowanie w nich środków opóźniających wchłanianie, np. monostearynianu glinu i żelatyny.

W jednej z postaci roztwory wodne do podawania pozajelitowego powinny być odpowiednio buforowane, jeśli jest to potrzebne, a ciekły rozcieńczalnik powinien być doprowadzony do izotoniczności z użyciem dostatecznej ilości soli fizjologicznej lub glukozy. Te roztwory wodne są szczególnie odpowiednie do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego i dootrzewnowego. Odpowiednie sterylne wodne ośrodki są znane fachowcom. Przykładowo, jedna dawka może być rozpuszczona w 1 ml izotonicznego roztworu NaCl i albo dodana do 1000 ml płynu do wlewu podskórnego, albo wstrzyknięta w proponowanym miejscu wlewu (patrz np. „Remington's Pharmaceutical Sciences” wydanie 15, str. 1035-1038 i 1570-1580). Pewne zmiany dawki wystąpią z konieczności w zależności od stanu leczonego pacjenta. Co więcej, preparaty do podawania ludziom będą oczywiście spełniały normy sterylności, pirogenności i ogólnego bezpieczeństwa i czystości wymagane przez FDA Office of Biological Standards.

W innej postaci ujawnione tutaj środki mogą być formułowane w postaci obojętnej lub w postaci soli. Przykładowymi farmaceutycznie dopuszczalnymi solami są addycyjne sole z kwasami (tworzone z wolnymi grupami aminowymi białka), otrzymywane z kwasów nieorganicznych, takich jak np. kwas chlorowodorowy lub kwas fosforowy, lub z kwasów organicznych, takich jak kwasy octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy itp. Sole tworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą także pochodzić od zasad nieorganicznych, takich jak np. wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelazowy i takich zasad organicznych jak izopropyloamina, trimetyloamina, histydyna, prokaina, itp. Po sformułowaniu roztwory będą podawane w sposób zgodny z podawaną postacią i w ilości terapeutycznie skutecznej.

Nośnikami mogą być ponadto dowolne i wszelkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, podłoża, powłoczki, rozcieńczalniki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję, bufory, roztwory nośnikowe, zawiesiny, koloidy, itp. Zastosowanie takich ośrodków i środków z substancjami farmaceutycznie czynnymi jest ogólnie znane. W środkach farmaceutycznych można stosować dowolne ośrodki i środki, o ile są one zgodne z substancją czynną. Do środków można także wprowadzać dodatkowe substancje czynne. Określenie „farmaceutycznie dopuszczalne” dotyczy cząsteczek i środków, które nie wywołują reakcji alergicznej lub innej niepożądanej reakcji po podaniu człowiekowi.

W niektórych postaciach środki farmaceutyczne mogą być podawane w postaci sprejów donosowych, drogą inhalacji i/lub z użyciem innych nośników aerozoli. Metody dostarczania genów, kwasów nukleinowych i kompozycji peptydowych bezpośrednio do płuc poprzez donosowe spreje aerozolowe opisano np. w US nr 5 756 353 i US nr 5 804 212. Podobnie, dostarczanie leków z użyciem wprowadzanych do nosa żywic w postaci mikrocząstek (Takenaga i in., J. Controlled Release 1998 Mar 2: 52 (1-2): 81-7) i związków lizofosfatydylo-glicerolu (US 5725871) jest także dobrze znane w farmacji. Przykład przezśluzówkowego podawania leku z użyciem matrycy nośnikowej z politetrafluoroetylenu opisano w US nr 5 780 045.

W pewnych postaciach stosuje się liposomy, nanokapsułki, mikrocząstki, cząstki lipidów, pęcherzyki itp. do wprowadzania środka według wynalazku do odpowiednich komórek/organizmów gospodarza. W szczególności środki według wynalazku mogą być formułowane przez kapsułkowanie w cząstkach lipidowych, liposomach, pęcherzykach, nanosferach lub nanocząstkach itp. Alternatywnie, środki według wynalazku mogą być związane, kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, z powierzchnią takich podłóż nośnikowych.

Wytwarzanie i stosowanie liposomów i preparatów liposomopodobnych jako potencjalnych nośników leków jest znane fachowcom (patrz np. Lasic, Trends Biotechnol., lipiec 1998 r.; 16 (7): 307-21; Takakura, Nippon Rinsho, marzec 1998 r.; 56 (3): 691-5; Chandran i in., Indian J. Exp. Biol., sierpień 1997 r.; 35 (8): 801-9; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1995; 12 (2-3); 233-61; US nr 5 567 434; US nr 5 552 157; US nr 5 565 213; US nr 5 738 868 i US nr 5 795 587.

PL 209 127 B1

Liposomy były z powodzeniem stosowane z wieloma typami komórek, które normalnie są trudne do transfekowania z użyciem innych procedur, w tym w zawiesinach komórek T, pierwotnych hodowlach hepatocytów i z komórkami PC12 (Renneisen i in., J. Biol. Chem., 25 września 1990 r., 265 (27): 16337-42; Muller i in., DNA Cell Biol., kwiecień 1990 r.; 9 (3): 221-9). Ponadto, liposomy są wolne od ograniczeń długości DNA, które są typowe dla układów dostarczania opartych na wektorach wirusowych. Liposomy były skutecznie stosowane do dostarczania genów, różnych leków, środków radioterapeutycznych, enzymów, wirusów, czynników transkrypcyjnych, efektorów allosterycznych itp. do szeregu hodowanych linii komórkowych i zwierząt. Co więcej, wydaje się, że stosowanie liposomów nie jest związane z odpowiedziami autoimmunizacyjnymi lub niedopuszczalną toksycznością po dostarczeniu ogólnoustrojowym.

W niektórych postaciach liposomy są wytwarzane z fosfolipidów, które dysperguje się w środowisku wodnym, w którym spontanicznie tworzą one wielowarstwowe koncentryczne pęcherzyki dwuwarstwowe (zwane także pęcherzykami multilamelarnymi (MLV)).

Alternatywnie, w innych swych postaciach ujawnienie dostarcza farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów nanokapsułkowych środka według wynalazku. Ogólnie, w nanokapsułkach związki mogą zostać zamknięte w sposób stabilny i powtarzalny (patrz, np. Quintanar-Guerrero i in., Drug

Dev. Ind. Pharm., grudzień 1998 r., 24 (12): 1113-28). Aby uniknąć efektów ubocznych wynikających z nadmiernej ilości polimeru wewnątrz komórki, takie ultradrobne cząstki (wielkość około 0,1 μm) można wytworzyć z polimerów zdolnych do degradacji in vivo. Takie cząstki można wytwarzać sposobem opisanym np. w Couvreur i in., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1988; 5 (1): 1-20; zur Muhlen i in., Eur. J. Pharm. Biopharm., marzec 1998 r., 45 (2): 149-55; Zambaux i in., J. Controlled Release, styczeń 1998 r., 2: 50 (1-3): 31-40 i w US nr 5 145 684.

Polinukleotydy w postaci starterów pochodzących z ujawnionych tutaj polinukleotydów i polipeptydy w postaci przeciwciał lub reagentów specyficznych dla ujawnionego tutaj polipeptydu można także stosować jako odczynniki diagnostyczne.

Identyfikacja genetycznych lub biochemicznych markerów w krwi lub tkankach, która pozwoli na detekcję bardzo wczesnych stadiów na szlaku karcynogenezy, umożliwi określenie najlepszej terapii dla pacjenta. Zastępcze markery nowotworów, takie jak ekspresja polinukleotydu, mogą być stosowane do diagnozowania różnych form i stanów raka. Identyfikacja poziomów ekspresji ujawnionych tutaj polinukleotydów będzie pożyteczna zarówno w ustalaniu stadium zaburzenia nowotworowego, jak klasyfikacji natury tkanki rakowej. Ustalanie stadium monitoruje stopień zaawansowania raka i polega na określeniu obecności lub braku złośliwej tkanki w obszarach poddanych biopsji. Ujawnione tutaj polinukleotydy mogą ulepszyć sposób ustalania stadium przez identyfikację markerów agresywności w raku, np. obecności w różnych obszarach ciała. Klasyfikacja raka pozwala na ustalenie jak bardzo nowotwór jest podobny do normalnej tkanki tego samego typu i jest oceniana na podstawie morfologii jego komórek i innych markerów różnicowania. Ujawnione tutaj polinukleotydy mogą być użyteczne w określaniu klasy raka, jako że mogą pomóc w oznaczeniu stanu zróżnicowania komórek nowotworu.

Testy diagnostyczne stanowią sposób diagnozowania lub określania podatności na raki, choroby autoimmunizacyjne i pokrewne stany poprzez diagnostykę polegającą na określeniu w próbce pochodzącej od pacjenta nieprawidłowo zmniejszonego lub zwiększonego poziomu polipeptydu lub mRNA. Ten sposób diagnozowania zwany jest ekspresją różnicową. Ekspresję danego genu porównuje się w chorej tkance i normalnej tkance. Różnica między pokrewnym do polinukleotydu genem, mRNA lub białkiem w dwóch tkankach, porównywana, np. poprzez porównanie masy cząsteczkowej, sekwencji aminokwasów lub nukleotydów, lub względnej ilości, stanowi miarę zmian w tym genie lub genie, który go reguluje, w tkance człowieka, który był podejrzewany o bycie chorym.

Zmniejszona lub zwiększona ekspresja może być mierzona na poziomie RNA. Najpierw izoluje się poliA RNA z dwóch tkanek, a detekcję mRNA kodowanego przez gen odpowiadający różnicowo eksprymowanemu polinukleotydowi ujawnionemu tutaj można przeprowadzić np. drogą hybrydyzacji in situ w skrawkach tkankowych, drogą PCR z odwrotną transkryptazą, z użyciem blotów typu Northern zawierających poliA + mRNA albo dowolnym innym bezpośrednim lub pośrednim sposobem detekcji RNA. Zwiększona lub zmniejszona ekspresja danego RNA w chorej tkance w porównaniu z normalną tkanką sugeruje, że transkrypt i/lub eksprymowane białko odgrywają rolę w chorobie. Tak więc, detekcja wyższego lub niższego poziomu mRNA odpowiadającego SEQ ID NO: 1 względem prawidłowego poziomu jest wskazaniem obecności raka u pacjenta.

Poziomy ekspresji mRNA w próbce można określić przez generację biblioteki etykiet eksprymowanych sekwencji (EST) z próbki. Względna reprezentacja EST w bibliotece może być stosowana

PL 209 127 B1 do oceny względnej reprezentacji transkryptu genu w wyjściowej próbce. Analiza EST próbki badanej może być następnie porównywana z analizą EST próbki odniesienia w celu oznaczenia względnych poziomów ekspresji interesującego polinukleotydu.

Inne analizy mRNA można prowadzić stosując metodologię seryjnej analizy ekspresji genów (SAGE) (Velculescu i in., Science (1995) 270: 484), metodologię różnicowej ekspozycji (np. US nr 5 776 638) lub analizę hybrydyzacyjną, która jest oparta na specyficzności interakcji nukleotydowych.

Alternatywnie, porównanie można prowadzić na poziomie białka. Wielkości białek w dwóch tkankach można porównać stosując przeciwciała w celu wykrycia polipeptydów w blotach typu Western ekstraktów białkowych z dwóch tkanek. Poziomy ekspresji i lokalizacja subkomórkowa może być też wykryta immunologicznie z użyciem przeciwciał na odpowiednie białko. Dalsze techniki oznaczania, które można stosować do oznaczenia poziomów białka, takiego jak ujawniony tutaj polipeptyd, w próbce pochodzącej od gospodarza są dobrze znane fachowcom. Podwyższony lub obniżony poziom ekspresji polipeptydu w chorej tkance w porównaniu z poziomem ekspresji tego samego białka w normalnej tkance wskazuje, że eksprymowane białko może brać udział w chorobie.

W oznaczeniach według wynalazku diagnoza może być ustalona przez detekcję poziomów ekspresji produktów genu kodowanych przez co najmniej jedną sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO: 1. Porównanie poziomów mRNA lub białka w chorej tkance w stosunku do normalnej tkanki może też być stosowane do śledzenia postępu lub remisji choroby.

Znaczną ilość sekwencji polinukleotydów w próbce można oznaczyć z użyciem macierzy polinukleotydów. Mogą być one stosowane do określania różnicowej ekspresji genów i do określenia funkcji genów. Przykładowo macierze sekwencji polinukleotydowych SEQ ID NO: 1 można stosować do określenia czy którekolwiek z polinukleotydów są różnicowo eksprymowane między komórką normalną i rakową. W jednej z postaci wynalazku można skonstruować macierz sond oligonukleotydowych zawierających sekwencje nukleotydów SEQ ID NO: 1 lub ich fragmenty do przeprowadzenia skutecznego przeszukiwania np. mutacji genetycznych. Metody technologii macierzy są dobrze znane i mają szerokie zastosowanie, przy czym można je stosować do wyjaśniania szeregu problemów z dziedziny genetyki molekularnej, w tym ekspresji genów, sprzężeń genetycznych i zmienności genetycznej (patrz np. M. Chee i in., Science, tom 274, str. 610-613 (1996)).

„Diagnoza” oznacza tu określenie podatności pacjenta na chorobę, określenie, czy pacjent jest w danym momencie chory, a także prognozę dla pacjenta dotkniętego chorobą.

Ujawnione tutaj polipeptydy lub ich fragmenty albo analogi, lub eksprymujące je komórki mogą być też stosowane jako immunogeny, aby wytworzyć przeciwciała immunospecyficzne dla ujawnionych tutaj polipeptydów. Określenie „immunospecyficzny” oznacza, że przeciwciała mają znacząco wyższe powinowactwo do ujawnionych tutaj polipeptydów niż do innych pokrewnych polipeptydów znanych ze stanu techniki.

W dalszym swym aspekcie ujawnienie dostarcza przeciwciała immunospecyficznego dla ujawnionego tutaj polipeptydu lub jego immunologicznego fragmentu zdefionicwanych powyżej.

Korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Przeciwciała generowane przeciw ujawnionemu tutaj polipeptydowi można uzyskać przez podanie polipeptydów lub fragmentów niosących epitop, analogów lub komórek istocie żywej, korzystnie nie będącej człowiekiem, z użyciem rutynowych protokołów. Do otrzymania przeciwciał monoklonalnych może być stosowana dowolna technika, która dostarcza przeciwciał wytworzonych przez hodowle ciągłych linii komórkowych. Przykłady obejmują technikę hybrydomy (Kohler, G. i Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), technikę triomy, technikę ludzkiej hybrydomy komórek B (Kozbor i in., Immunology Today (1983) 4: 72) i technikę hybrydomy-EBV (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R., Liss Inc., 1985).

Techniki wytwarzania przeciwciał o pojedynczym łańcuchu, takie jak te opisane w US nr 4 946 778, mogą być także przystosowane do wytwarzania przeciwciał o pojedynczych łańcuchach wobec ujawnionych tutaj polipeptydów. Także myszy transgeniczne lub inne organizmy, w tym inne ssaki, mogą być stosowane do ekspresji humanizowanych przeciwciał.

Opisane powyżej przeciwciała mogą być stosowane do izolacji lub identyfikacji klonów eksprymujących polipeptyd lub oczyszczania polipeptydów za pomocą chromatografii powinowactwa.

Ujawnione tutaj przeciwciało może być też stosowane do zapobiegania lub leczenia raka, szczególnie raka okrężnicy i odbytnicy, chorób autoimmunizacyjnych i pokrewnych stanów.

Sposób indukcji lub modulowania i odpowiedzi immunologicznej u ssaka, polega na szczepieniu ssaka ujawnionym tutaj polipeptydem, odpowiednim do wytworzenia przeciwciała i/lub odpowiedzi

PL 209 127 B1 immunologicznej komórek T, dla ochrony przed objawami lub postępem choroby albo dla ich łagodzenia. Jeszcze inny aspekt ujawnienia dotyczy sposobu indukcji lub modulacji odpowiedzi immunologicznej u ssaka, polegającego na dostarczeniu ujawnionego tutaj polipeptydu poprzez wektor sterujący ekspresją polinukleotydu i kodujący polipeptyd in vivo, aby zaindukować odpowiedź immunologiczną i spowodować wytworzenie przeciwciała dla ochrony istoty żywej przed chorobami.

Należy wziąć pod uwagę, iż ujawnienie dostarcza sposobu leczenia nieprawidłowych stanów, takich jak np. rak i choroby autoimmunizacyjne, w szczególności rak okrężnicy i odbytnicy, związane albo z nadmiarem albo niedoborem ekspresji aktywności polipeptydu CASB7439. Inne nieprawidłowe stany związane z ekspresją CASB7439, które dzięki wynalazkowi można leczyć to przewlekłe białaczki limfocytarne i nowotwory zarodkowe.

Terapię genową można również stosować do endogennego wytwarzania polipeptydu CASB7439 z użyciem odpowiednich komórek u pacjenta. Przegląd terapii genowej zamieszczono w rodziale 20, Gene Therapy and Other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (i cytowanych tam odnośnikach) w Human Molecular Genetics, T. Strachan i A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996).

Wytwarzanie szczepionek opisano ogólnie w Pharmaceutical Biotechnology, tom 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, red. Powell i Newman, Plenum Press, 1995, New Trends and Developments in Vaccines, red. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Kapsułkowanie w liposomach opisał np. Fullerton w US nr 4 235 877. Sprzęganie białek z makrocząsteczkami opisano np. w US nr 4 372 945 (Likhite) oraz w US nr 4 474 757 (Armor i in.).

Ilość białka w każdej dawce szczepionki dobiera się tak, by indukowała odpowiedź immunoochronną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych występujących w przypadku typowych szczepionek. Taka ilość będzie się zmieniała w zależności od stosowanego specyficznego immunogenu. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 1-1000 μg białka, korzystnie 2-100 μg, a najkorzystniej 4-40 μg. Optymalną ilość dla danej szczepionki można określić drogą standardowych badań polegających na oznaczeniu mian przeciwciał i innych odpowiedzi u pacjentów. Po wstępnym zaszczepieniu pacjenci mogą otrzymać dawkę wzmacniającą po około 4 tygodniach.

„Wyizolowany” oznacza zmieniony „ręką ludzką” ze stanu naturalnego. Jeśli „wyizolowane” środek lub substancja występują w naturze, zostały zmienione lub usunięte ze swojego środowiska, albo jednocześnie zmienione i usunięte. Przykładowo, polinukleotyd lub polipeptyd występujący w przyrodzie w organizmach żyjących zwierząt nie jest „wyizolowany”, lecz ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od materiałów współistniejących z nim w jego naturalnym stanie jest „wyizolowany” w stosowanym tu rozumieniu tego określenia.

„Polinukleotyd” to ogólnie polirybonukleotyd lub polideoksyrybonukleotyd, który może być niezmodyfikowanym RNA lub DNA albo zmodyfikowanym RNA lub DNA, włącznie z jednoniciowymi i dwuniciowymi regionami.

„Wariant” dotyczy polinukleotydu lub polipeptydu, który różni się od wzorcowego polinukleotydu lub polipeptydu, ale zachowuje zasadnicze właściwości. Typowy wariant polinukleotydu różni się pod względem sekwencji nukleotydowej od polinukleotydu wzorcowego. Zmiany w sekwencji nukleotydów wariantu mogą zmienić sekwencję aminokwasów polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd wzorcowy lub nie. Zmiany nukleotydów mogą dać w efekcie substytucje aminokwasów, addycje, delecje, fuzje i obcięcia w polipeptydzie kodowanym przez sekwencję wzorcową, co omówiono poniżej. Typowy wariant polipeptydu różni się pod względem sekwencji aminokwasów od innego, polipeptydu wzorcowego. Ogólnie różnice są ograniczone, toteż sekwencje polipeptydu wzorcowego i wariantu są ogólnie bardzo podobne, a w wielu regionach identyczne. Wariant i polipeptyd wzorcowy mogą różnić się pod względem sekwencji aminokwasów jednym lub większą liczbą podstawień, addycji i delecji w dowolnej kombinacji. Podstawiona lub wstawiona reszta aminokwasu może być kodowana przez kod genetyczny lub nie. Wariant polinukleotydu lub polipeptydu może występować w naturze, tak jak wariant alleliczny, lub może być wariantem, o którym wiadomo, że nie występuje naturalnie. Niewystępujące naturalnie warianty polinukleotydów i polipeptydów mogą być wytwarzane technikami mutagenezy lub przez bezpośrednią syntezę.

Jak wiadomo, „identyczność” jest zależnością między dwiema lub większą liczbą sekwencji polipeptydów lub dwiema lub większą liczbą sekwencji polinukleotydów, określaną przez porównanie tych sekwencji. Wiadomo, że „identyczność” oznacza również stopień pokrewieństwa pomiędzy sekwencjami polipeptydów lub polinukleotydów, określaną przez dopasowywanie ciągów takich sekwencji. „Identyczność” i „podobieństwo” można łatwo obliczyć znanymi sposobami, w tym, lecz nie wyPL 209 127 B1 łącznie, opisanymi w Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., red. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. red. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, część I, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., red., Humana Press New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J. red. M Stockton Press, New York, 1991; i Carillo, H. i Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

Korzystne sposoby określenia identyczności są zaprojektowane tak, by dawały największe dopasowanie między testowanymi sekwencjami. Sposoby określenia identyczności i podobieństwa są skodyfikowane w publicznie dostępnych programach komputerowych. Korzystne programy do komputerowego określania identyczności i podobieństwa dwu sekwencji to, lecz nie wyłącznie, pakiet programów GCG (Devereux, J., i in., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN i FASTA (Atschul, S. F. i in., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)). Program BLAST X jest dostępny publicznie z NCBI i innych źródeł (BLAST Manual, Altschul S. i in. NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. i in., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Do określenia identyczności może być też stosowany dobrze określony algorytm Smitha Watermana.

Korzystny stosowany algorytm to FASTA.

Korzystne parametry dla porównania sekwencji polipeptydu lub polinukleotydu stosujące ten algorytm są następujące:

Kara za przerwę: 12.

Kara za przedłużenie przerwy: 4.

Wielkość słowa: 2, maks 6.

Korzystne parametry do porównywania sekwencji polipeptydów innymi sposobami są następujące:

1) Algorytm: Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

Macierz porównania: BLOSSUM62 od Hentikoff i Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992).

Kara za przerwę: 12.

Kara za długość przerwy: 4.

Program wykorzystujący te parametry jest publicznie dostępny jako program „gap” od Genetics Computer Group, Madison, WI. Wymienione uprzednio parametry są parametrami domyślnymi dla porównań polipeptydów (wraz z brakiem kary za końcowe przerwy).

Korzystne parametry dla porównań polinukleotydów są następujące:

1) Algorytm: Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-353 (1970).

Macierz porównania: pasuje = +10, nie pasuje = 0.

Kara za przerwę: 50.

Kara za długość przerwy: 3.

Program wykorzystujący te parametry jest publicznie dostępny jako program „gap” od Genetics Computer Group, Madison, WI. Wymienione uprzednio parametry są parametrami domyślnymi dla porównań polinukleotydów.

Dla przykładu, sekwencja ujawnionego tutaj polinukleotydu może być identyczna z sekwencją wzorcową SEQ ID NO: 1, to znaczy może być identyczna w 100% lub może zawierać pewną ilość zmian nukleotydów w porównaniu z sekwencję wzorcową. Takie zmiany są wybrane z grupy złożonej z co najmniej jednej delecji, substytucji, w tym tranzycji i transwersji nukleotydu i insercji, przy czym te zmiany mogą występować na końcach 5' lub 3' sekwencji wzorcowej nukleotydów lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami, i znajdują się pojedynczo pomiędzy nukleotydami sekwencji wzorcowej albo w jednej lub większej liczbie sąsiadujących grup w obrębie sekwencji wzorcowej. Liczba zmian nukleotydów jest określana jako różnica całkowitej liczby nukleotydów w SEQ ID NO: 1 i iloczynu całkowitej liczby nukleotydów w SEQ ID NO: 1 i procentu liczbowego odpowiedniej identyczności procentowej (podzielonego przez 100), względnie:

nn < Xn - (Xn · y), gdzie nn jest liczbą zmian nukleotydów, xn jest całkowitą liczbą nukleotydów w SEQ ID NO: 1, zaś y oznacza np. 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% i 0,90 dla 90%, 0,95 dla 95%, itd., przy czym każdy nie będący liczbą całkowitą iloczyn xn i y jest zaokrąglany do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem od xn. Zmiany sekwencji polinukleotydów kodującej polipeptyd o SEQ ID NO: 2 mogą two24

PL 209 127 B1 rzyć mutacje typu nonsens, zmiany sensu lub zmiany ramki odczytu w tej sekwencji kodującej , a zatem zmieniać polipeptyd kodowany przez polinukleotyd po takich zmianach.

Podobnie, sekwencja ujawnionego tutaj polipeptydu może być identyczna z sekwencją wzorcową SEQ ID NO: 2, to znaczy być identyczna w 100% lub może zawierać pewną liczbę całkowitą zmian aminokwasów w porównaniu z sekwencją wzorcową, takich, że identyczność procentowa wynosi mniej niż 100%. Takie zmiany są wybrane z grupy złożonej z co najmniej jednej delecji, podstawienia, w tym konserwatywnego i niekonserwatywnego oraz insereji aminokwasu, przy czym takie zmiany mogą występować na końcach aminowych lub karboksylowych wzorcowej sekwencji polipeptydowej lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami i znajdują się pojedynczo wśród aminokwasów w sekwencji wzorcowej lub w jednej lub większej liczbie sąsiadujących grup w obrębie sekwencji wzorcowej. Liczba zmian aminokwasów dla danej identyczności procentowej jest określona jako różnica całkowitej liczby aminokwasów w SEQ ID NO: 2 i iloczynu całkowitej liczby aminokwasów w SEQ ID NO: 2 i liczbowego procentu odpowiedniej identyczności procentowej (podzielonego przez 100), względnie:

n_a < Xa - (Xa · y), gdzie na jest liczbą zmian aminokwasów, xa jest całkowitą liczbą aminokwasów w SEQ ID NO: 2, zaś y oznacza np. 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% itd., przy czym każdy nie będący liczbą całkowitą iloczyn Xa i y jest zaokrąglany do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem od xa.

„Homolog” jest określeniem generycznym stosowanym do wskazania sekwencji polinukleotydu lub polipeptydu posiadającej wysoki stopień pokrewieństwa do sekwencji docelowej. Takie pokrewieństwo może być określone ilościowo przez określenie stopnia identyczności i/lub podobieństwa między porównywanymi sekwencjami, jak to opisano uprzednio. To określenie obejmuje termin „ortolog”, oznaczający polinukleotyd lub polipeptyd, który jest funkcjonalnym ekwiwalentem polinukleotydu lub polipeptydu w innym gatunku i termin „paralog”, oznaczający funkcjonalnie podobną sekwencję w obrębie tego samego gatunku.

Legenda do figur

Figura 1 przedstawia dane z PCR czasu rzeczywistego z użyciem sondy Taqman. Legenda: Gruczoł nadnercza: Ad_Gl; Pęcherz: Bl; Szpik kostny: Bo_Ma; Szyjka macicy: Ce; Okrężnica: Co; Jajowód: Fa_Tu; Krętnica: II; Wątroba: Li; Płuco: Lu; Węzeł chłonny: Ly_No; Przełyk: Oe; Gruczoł przytarczycowy: Pa_Thy; Łożysko: Pl; Prostata: Pr; Odbytnica: Re; Skóra: Sk; Mięśnie szkieletowe: Sk_Mu; Jelito cienkie: Sm_In; Śledziona: Sp; Jądro: Te; Tarczyca: Thy; Tchawica: Tr.

Figura 2 przedstawia ekspresję w PCR czasu rzeczywistego z użyciem protokołu Sybr. Legenda: Gruczoł nadnercza: Ad_Gl; Pęcherz: Bl; Szpik kostny: Bo_Ma; Szyjka macicy: Ce; Okrężnica: Co; Węzeł chłonny: Ly_No; Przełyk: Oe; Gruczoł przytarczycowy: Pa_Thy; Łożysko: PI; Prostata: Pr; Odbytnica: Re; Skóra: Sk; Mięśnie szkieletowe: Sk_Mu; Jelito cienkie: Sm_In; Śledziona: Sp; Jądro: Te; Tarczyca: Thy; Tchawica: Tr; Serce: He.

Figura 3 przedstawia barwiony błękitem Coomassie SDS PAGE ekstraktu komórkowego ze szczepu eksprymującego CASB7439. Ścieżka 1 przedstawia markery molekularne; ścieżka 2 przedstawia ekstrakt komórkowy indukowany 5 godz. w 39°C; ścieżka 3 przedstawia supernatant indukowanego ekstraktu komórkowego; a ścieżka 4 przedstawia osad indukowanego ekstraktu komórkowego.

Figura 4 przedstawia analizę typu Western eksprymowanego białka NS1-CASB7439. Na żel naniesiono ekstrakt komórkowy ze szczepu eksprymującego CASB7439 i wykrywano przeciwciałem monoklonalnym anty-NSl.

Figura 5 przedstawia barwiony błękitem Coomassie SDS PAGE CASB7439 po oczyszczeniu. Ścieżki 1 i 5 stanowią markery masy cząsteczkowej; ścieżki 2, 3, 4 są obciążone odpowiednio 2 pi, 4 pl i 6 pl oczyszczonego białka.

Figura 6 przedstawia blot typu Western CASB7439 po oczyszczeniu wykrywany z użyciem monoklonalnego przeciwciała przeciw histydynie.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Analiza RT-PCR czasu rzeczywistego

RT-PCR czasu rzeczywistego (U. Gibson, 1996. Genome Research: 6, 996) zastosowano do porównania ilości transkryptu mRNA antygenu kandydata w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy i normalnych tkankach okrężnicy od wielu pacjentów. W tej metodzie dodatkowo oceniano poziomy mRNA genu kandydata w panelu normalnych tkanek.

PL 209 127 B1

Całkowity RNA z normalnej tkanki okrężnicy i tkanki nowotworu okrężnicy ekstrahowano z błyskawicznie zamrożonych biopsji z użyciem odczynnika TriPure (Boehringer). Całkowity RNA z normalnych tkanek nabyto od InVitrogen lub ekstrahowano z błyskawicznie zamrażanych biopsji stosując odczynnik TriPure. mRNA poliA+ oczyszczano z całkowitego RNA po działaniu DNAzą z użyciem perełek magnetycznych oligo-dT (Dynal). Oznaczenie ilościowe mRNA przeprowadzono z użyciem spektrofluorymetrii (VersaFluor, BioRad) stosując barwnik SybrII (Molecular Probes). Startery do amplifikacji PGR czasu rzeczywistego zaprojektowano z użyciem oprogramowania Perkin-Elmer Primer Express, stosując opcje domyślne dla warunków amplifikacji TaqMan.

Reakcje czasu rzeczywistego montowano według standardowych protokołów PGR stosując 2 ng oczyszczonego mRNA dla każdej reakcji. Barwnik Sybrl (Molecular Probes) dodawano w końcowym rozcieńczeniu 1/75000 dla detekcji w czasie rzeczywistym. Amplifikację (40 cykli) i detekcję czasu rzeczywistego prowadzono w układzie Perkin-Elmer Biosystems PE7700 stosując zwykłe ustawienia przyrządu. Wartości Ct obliczano stosując oprogramowanie Sequence Detector PE7700. Uzyskano kilka wartości Ct dla każdej próbki: dla próbek od pacjentów, Ct nowotworu (CtT) i Ct dopasowanych normalnych tkanek okrężnicy (CtN) na kandydacie TAA oraz dla panelu próbek normalnych tkanek, CtXY dla każdej normalnej tkanki XY. Inne wartości Ct (CtA) obliczono dla wszystkich próbek wobec genu aktyny jako wzorca wewnętrznego. Alternatywnie, można monitorować amplifi-kację PCR czasu rzeczywistego stosując sondę Taqman. Amplifikację (40 cykli) i detekcję w czasie rzeczywistym prowadzono w układzie Perkin-Elmer Biosystems PE7700, stosując zwykłe ustawienia przyrządu. Wartości Ct obliczono stosując oprogramowanie Sequence Detector PE7700. Obliczono wartości Ct dla każdej próbki tkanki dla docelowego mRNA (CtX) i dla mRNA aktyny (CtA).

Ponieważ wydajność amplifikacji PCR w stosowanych warunkach doświadczalnych jest bliska teoretycznej wydajności amplifikacji, wartość 2^{(CtN/T/XY-CtA)} jest oszacowaniem względnego poziomu transkryptu TAA próbki standaryzowanego względem poziomu transkryptu aktyny. Wartość 1 sugeruje więc, że antygen kandydat i aktyna mają ten sam poziom ekspresji.

Reakcje PCR czasu rzeczywistego przeprowadzono najpierw na tkankach nowotworu okrężnicy i dobranych normalnych tkankach okrężnicy z biopsji od 12 pacjentów. Reakcje następnie prowadzono na bardziej kompletnym zestawie danych obejmującym 18 pacjentów (ten zestaw danych obejmował zestaw danych dla pierwszych 12 pacjentów). W tym zestawie danych zastosowano powtórzenia w przypadku 6 pacjentów z 18. Przebadano sześciu dalszych pacjentów i rezultaty połączono z uprzednimi 18. Dane statystyczne dla ostatecznej puli przedstawiono w tabeli 3 i zilustrowano na fig. 1.

Serię 48 próbek normalnych tkanek reprezentujących 29 różnych tkanek przetestowano z użyciem tej samej procedury (analizowane normalne tkanki podano w tabeli 3). Poziomy transkryptów TAA obliczono jak opisano powyżej. W tym zestawie danych obliczono także udział pacjentów nadeksprymujących antygen-kandydata, jak i średnią nadekspresję transkryptu w stosunku do normalnych tkanek. Wyniki zilustrowano fig. 1.

T a b e l a 1

Wyniki ekspresji CASB7439 w PCR czasu rzeczywistego: zestaw danych dla 12 pacjentów

1	2
% pacjentów z poziomem mRNA wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy (pacjenci dodatni)	92%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej 3 razy wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	92%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej 10 razy wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	92%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej 3 razy niższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	8%
Średni poziom mRNA w dopasowanych normalnych tkankach okrężnicy (standaryzacja do aktyny)	0,0026
Średni poziom mRNA w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy u pacjentów dodatnich (standaryzacja do aktyny)	0,265
Średnia krotność nadekspresji mRNA	2028
Mediana krotność nadekspresji mRNA	115

PL 209 127 B1 cd. tabeli 1

1	2
Średni poziom mRNA w normalnych tkankach	0,0079
Mediana poziomu mRNA w normalnych tkankach	0,0016
Średni poziom mRNA w normalnych tkankach	0,0064
Mediana poziomu mRNA w normalnych tkankach	0,0017
% pacjentów z poziomem mRNA wyższym niż średni dla normalnych tkanek	92%
% pacjentów z poziomem mRNA wyższym niż dziesięciokrotny średni dla normalnych tkanek	75%
Normalne nieniepotrzebne tkanki o poziomie mRNA wyższym niż mediana dla normalnych tkanek	brak

T a b e l a 2

Wyniki ekspresji CASB7439 w PCR czasu rzeczywistego: zestaw danych dla 18 pacjentów

% pacjentów z poziomem mRNA wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy (pacjenci dodatni)	89%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej trzykrotnie wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	89%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej dziesięciokrotnie wyższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	78%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej trzykrotnie niższym w dopasowanych tkankach nowotworu okrężnicy	5%
Średni poziom mRNA w dopasowanych normalnych tkankach okrężnicy (standaryzacja do aktyny)	0,005
Średni poziom mRNA w dopasowanych normalnych tkankach okrężnicy (standaryzacja do aktyny)	0,152
Średnia krotność nad ekspresji mRNA	1100
Mediana krotności nadekspresji mRNA	60
Średni poziom mRNA w normalnych tkankach	0,0065
Mediana poziomu mRNA w normalnych tkankach	0,0015
Średni poziom mRNA w normalnych tkankach	0,005
Mediana poziomu mRNA w normalnych tkankach	0,0015
% pacjentów z poziomem mRNA wyższym niż średni dla normalnych tkanek	94%
% pacjentów z poziomem mRNA wyższym niż dziesięciokrotny średni poziom dla normalnych tkanek	94%
Normalne nieniepotrzebne tkanki o poziomie mRNA wyższym niż mediana dla normalnych tkanek	brak

T a b e l a 3

Wyniki ekspresji CASB7439 w PCR czasu rzeczywistego: zestaw danych dla 24 pacjentów

% pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 wyższym w tkankach nowotworu okrężnicy niż w przylegających normalnych tkankach okrężnicy (pacjenci dodatni)	92%
% dodatnich pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 co najmniej dziesięciokrotnie wyższym w tkankach nowotworu okrężnicy niż w przylegających normalnych tkankach okrężnicy	75%
Średnia krotność nadekspresji transkryptu w nowotworach pacjentów dodatnich	1289
% pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 wyższym w nowotworze okrężnicy niż średnia w normalnej tkance	96%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej dziesięciokrotnie wyższym w nowotworze okrężnicy niż średnia w normalnej tkance	62,5%
Normalne tkanki, w których ekspresja transkryptu CASB7439 odpowiada ekspresji transkryptu nowotworowego w nowotworach	brak

PL 209 127 B1

Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono także z użyciem protokołu Taqman (jak opisano powyżej) na tkankach nowotworu okrężnicy i odbytnicy i przylegających normalnych tkankach okrężnicy z biopsji przeprowadzonej u 6 pacjentów. Dla każdego pobrano 3 powtórzenia i użyto średniej do dalszych obliczeń. Wyniki przedstawiono na fig. 1. Ponadto z użyciem tej samej procedury przetestowano także 36 próbek normalnych tkanek reprezentujących 28 różnych tkanek (patrz tabela 5). Wyniki przedstawiono na fig. 2.

T a b e l a 4

Wyniki ekspresji CASB7439 w PCR czasu rzeczywistego z użyciem sondy Taqman

Liczba próbek nowotworów od różnych pacjentów	6
% pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 wyższym w tkankach nowotworu okrężnicy niż w przylegających normalnych tkankach okrężnicy (pacjenci dodatni)	100%
% dodatnich pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 co najmniej dziesięciokrotnie wyższym w tkankach nowotworu okrężnicy niż w przylegających normalnych tkankach okrężnicy	83%
Średnia krotność nadekspresji transkryptu w nowotworach pacjentów dodatnich	109
% pacjentów z poziomem transkryptu CASB7439 wyższym w nowotworze okrężnicy niż średnia w normalnej tkance	100%
% pacjentów z poziomem mRNA co najmniej dziesięciokrotnie wyższym w nowotworze okrężnicy niż średnia w normalnej tkance	100%
Normalne tkanki, w których ekspresja transkryptu CASB7439 odpowiada ekspresji transkryptu nowotworowego w nowotworach	brak

Wyniki jasno sugerują, że transkrypt CASB7439 jest nadeksprymowany w nowotworach okrężnicy i odbytnicy w porównaniu z przylegającymi normalnymi tkankami okrężnicy i wszystkimi wyżej wymienionymi normalnymi tkankami. Ponad 90% pacjentów silnie nadeksprymuje transkrypt CASB7439 w nowotworze, w porównaniu z przylegającymi normalnymi tkankami okrężnicy. Średnia nadekspresja w nowotworach jest co najmniej stukrotna. Co więcej, ponad 90% pacjentów nadeksprymuje transkrypt CASB7439 w nowotworach okrężnicy i odbytnicy w porównaniu z innymi normalnymi tkankami, a ponad 60% z nich nadeksprymuje go co najmniej dziesięciokrotnie.

T a b e l a 5

Lista normalnych tkanek stosowanych do analizy ekspresji transkryptu CASB7439

Tkanka	Skrót
1	2
Nadnercza	Ad_Gl
Aorta	Ao
Pęcherz	BI
Szpik kostny	Bo_Ma
Mózg	Bra
Szyjka macicy	Ce
Okrężnica	Co
Jajowód	Fa_Tu
Serce	He
Krętnica	Il
Nerka	Ki
Wątroba	Li
Płuco	Lu

PL 209 127 B1 cd. tabeli 5

1	2
Węzeł chłonny	Ly_No
Przełyk	Oe
Przytarczyce	Pa_Thy
Odbyt	Re
Skóra	Sk
Mięsień szkieletowy	Sk_Mu
Jelito cienkie	Sm_In
Śledziona	Sp
Żołądek	St
Tarczyca	Thy
Tchawica	Tra
Jajnik	Ov
Łożysko	PI
Prostata	Pr
Jądro	Te

P r z y k ł a d 2. Różnicowe przeszukiwanie matryc cDNA

Identyfikację genów związanych z nowotworami w odjętej bibliotece cDNA prowadzi się metodą przeszukiwania różnicowego.

Całkowity bakteryjny DNA wyekstrahowano ze 100 μl hodowli nocnych. Bakterie lizowano izotiocyjanianem guanidyny i DNA bakteryjny oczyszczano metodą powinowactwa, stosując szkło magnetyczne (Boehringer).

Wstawki plazmidów odzyskano z bakteryjnego DNA drogą amplifikacji Advantage PCR (Clontech). Produkty PCR nakroplono na dwie membrany nylonowe, aby wyprodukować matryce cDNA o wysokiej gęstości, stosując narzędzie Biomek 96 HDRT (Beekman). Nakroplony cDNA kowalencyjnie wiązano z membraną za pomocą napromienienia UV. Pierwszą membranę hybrydyzowano z mieszaną sondą cDNA przygotowaną z nowotworu pojedynczego pacjenta. Drugą membranę hybrydyzowano z równoważną ilością mieszanej sondy cDNA przygotowanej z normalnej tkanki okrężnicy tego samego pacjenta. cDNA sondy przygotowano przez amplifikację PCR, jak opisano powyżej, z użyciem układu AlkPhos Direct (Amersham).

Warunki hybrydyzacji i płukanie w warunkach ostrych są jak opisano w zestawie AlkPhos Direct. Hybrydyzowaną sondę wykrywa się przez analizę chemiluminescencyjną. Intensywności hybrydyzacji dla każdego fragmentu cDNA na obu biotach mierzy się metodą densytometrii błony lub bezpośrednio (BioRad Fluor-S Max). Stosunek intensywności hybrydyzacji do tkanek nowotworu do intensywności hybrydyzacji do normalnych tkanek (T/N) oblicza się dla każdego genu w celu oceny ilości nadekspresji w nowotworze.

Geny, które są znacząco nadeksprymowane w nowotworach okrężnicy są dalej badane. Istotność arbitralnie definiuje się jako jedno odchylenie standardowe rozkładu częstości T/N. Doświadczenia z przeszukiwaniem różnicowym powtórzono stosując RNA z wielu dawców-pacjentów (> 18), aby ocenić częstość nadeksprymujących nowotworów w populacji pacjentów. Dodatkowo macierze DNA hybrydyzowano z mieszanymi sondami cDNA z normalnych tkanek innych niż okrężnica (patrz lista powyżej), aby określić poziom ekspresji genu-kandydata w tych tkankach.

P r z y k ł a d 3. Mikromacierze DNA

Mikromacierze DNA stosuje się do badania profili ekspresji mRNA dużych kolekcji genów w próbkach wielokrotnych. Informacja ta jest stosowana do uzupełnienia danych uzyskanych drogą

PCR czasu rzeczywistego i stanowi niezależną miarę poziomów ekspresji genów w nowotworach i normalnych tkankach.

PL 209 127 B1

Przykłady współczesnych technologii do produkcji mikromacierzy DNA obejmują 1) macierze „GeneChip” Affymetrix, w których oligonukleotydy są syntetyzowane na powierzchni chipu przez syntezę chemiczną fazy stałej z użyciem procesu fotolitograficznego; 2) technologię nakraplania DNA, gdzie małe objętości roztworu DNA są nanoszone przez robota, a następnie immobilizowane na powierzchni fazy stałej (np. szkła). W obu przypadkach chipy hybrydyzuje się z cDNA lub cRNA wyekstrahowanymi z interesującej tkanki (np. normalnej tkanki, nowotworu itd.) i znakowanymi radioaktywnie lub reporterową cząsteczką fluorescencyjną.

Znakowany materiał jest hybrydyzowany z chipem, a ilość sondy związanej z każdą sekwencją na chipie określa się stosując specjalistyczny skaner. Doświadczenie można przeprowadzić z pojedynczym reporterem fluorescencyjnym (lub radioaktywnością) lub alternatywnie z użyciem dwóch reporterów fluorescencyjnych. W tym ostatnim przypadku każda z dwóch próbek jest znakowana jedną z cząsteczek reportera. Dwie znakowane próbki hybrydyzuje się następnie współzawodnicząco z sekwencjami na chipie DNA.

Stosunek dwóch sygnałów fluorescencyjnych określa się dla każdej sekwencji na chipie. Ten stosunek stosuje się do obliczenia względnej ilości transkryptu w dwóch próbkach. Szczegółowe protokoły są dostępne od szeregu źródeł w tym „DNA Microarrays: A practical approach. Schena M., Oxford University Press 1999” i w Internecie (http://cmgm.Stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) i u wyspecjalizowanych dystrybutorów (np. Affymetrix).

P r z y k ł a d 5. Analiza Northern-Southern blot

Ograniczone ilości mieszanych cDNA z tkanek nowotworu i dopasowanych normalnych tkanek okrężnicy zamplifikowano za pomocą Advantage PCR (patrz powyżej). Matrycowy RNA z wielu normalnych tkanek także zamplifikowano, stosując tę samą procedurę. Zamplifikowany cDNA (1 μg) poddano elektroforezie na żelu 1,2% agarozy i przeniesiono na membranę nylonową. Membranę hybrydyzowano (AlkPhos Direct System) z sondą przygotowaną z użyciem fragmentu cDNA kandydata TAA. Analiza Northern-Southern dostarcza informacji o wielkości transkryptu, obecności wariantów składania i ilości transkryptów w nowotworze i normalnych tkankach.

P r z y k ł a d 6. Analiza Northern blot

Bloty typu Northern przeprowadzono według standardowych protokołów stosując 1 μg mRNA poli A+. Radioaktywne sondy przygotowano stosując układ Ready-to-Go (Pharmacia).

P r z y k ł a d 7. Doświadczalna identyfikacja sekwencji cDNA pełnej długości

Skonstruowano biblioteki cDNA raka okrężnicy stosując układ Lambda Zap II (Stratagene) z 5 μg mRNA poliA+. Stosowano dostarczony protokół, z tym jednak, że do etapu odwrotnej transkrypcji stosowano SuperscriptII (Life Technologies). Skonstruowano biblioteki ze starterem oligo dT i ze starterami losowymi.

Dla każdego przeszukiwania biblioteki wysiano na szalki około 1,5 x 10⁶ niezależnych fagów. Łysinki faga przenoszono na nylonowe filtry i hybrydyzowano stosując sondę cDNA znakowaną AlkPhos Direct. Dodatnie fagi wykrywano za pomocą chemiluminescencji. Dodatnie fagi wycięto z płytki agarowej, eluowano do 500 μl buforu SM i potwierdzono za pomocą PCR specyficznego dla genu. Wyeluowane fagi przekształcono w jednoniciowe bakteriofagi M13 za pomocą wycinania in vivo. Bakteriofagi przekształcono do dwuniciowego DNA plazmidowego za pomocą zakażenia E. coli. Zakażone bakterie wysiewano i poddawano drugiej rundzie przeszukiwania sondą cDNA. Plazmidowy DNA oczyszczano z dodatnich klonów bakteryjnych i sekwencjonowano na obu niciach.

Gdy genomu pełnej długości nie można uzyskać bezpośrednio z biblioteki cDNA, brakującą sekwencję izoluje się stosując technologię RACE (Marathon Kit, ClonTech). To podejście jest oparte na odwrotnej transkrypcji mRNA do dwuniciowego cDNA, ligacji linkerów na końcach cDNA i amplifikacji pożądanych końców cDNA z użyciem startera specyficznego wobec genów i jednego z oligonukleotydów linkerowych. Produkty Marathon PCR sklonowane do plazmidu (pCRII-TOPO, InVitrogen) i poddano sekwencjonowaniu. Stosując tę procedurę uzyskano polinukleotyd SEQ ID NO : 1.

P r z y k ł a d 8. Profile EST

Uzupełnieniem charakterystyki doświadczalnej ekspresji antygenu w tkankach jest badanie bazy danych ludzkich EST. EST (etykiety eksprymowanych sekwencji) to małe fragmenty cDNA uzyskane z kolekcji mRNA wyekstrahowanych z danej tkanki lub linii komórkowej. Taka baza danych dostarcza obecnie dużych ilości ludzkich EST (2 x 10⁶) z kilku tysięcy bibliotek tkankowych cDNA, w tym tkanek nowotworu z różnych typów i stanów choroby. Za pomocą narzędzi informatycznych (Blast) wykonano poszukiwawcze porównanie sekwencji CASB7439, aby mieć dalszy wgląd w ekspresję w tkankach.

PL 209 127 B1

Dystrybucja EST CASB7439

Numer dostępu EST GenBank	Biblioteka tkankowa cDNA EST
C00634	Człowiek dorosły (K. Okubo)
AA468668	NCI_CGAP_Co3
AA565752	NCI_CGAP_Co11
AA565766	NCI_CGAP_Co11
AA565767	NCI_CGAP_Co11
AI337239	NCI_CGAP_Co16
AI337448	NCI_CGAP_Co16
AI393930	NCI_CGAP_CLL1
AI473673	NCI_CGAP_Co14
AI632444	NCI_CGAP_GC6
AI861937	NCI_CGAP_Co16
AI825214	NCI_CGAP_GC6
AW080652	NCl_CGAP_Co19
AW083899	NCl_CGAP_Co19
AW206058	NCI_CGAP_Sub3
AW237006	NCI_CGAP_GC6
AW364626	DT0036
AW449612	NCI_CGAP_Sub5

Te EST idealnie pasują do CASB7439. Lista zawiera 9 EST z 4 różnych bibliotek raka okrężnicy, jeden EST z biblioteki normalnej tkanki okrężnicy, 3 EST z jednej biblioteki komórek nowotworów zarodkowych, jeden EST z biblioteki komórek przewlekłej białaczki limfocytowej, 2 EST z 2 mieszanych bibliotek nowotworu, 2 EST z bibliotek nieznanego typu. To jasno sugeruje, jak tego oczekiwano, że CASB7439 jest nadeksprymowany w tkankach nowotworów, zwłaszcza w tkankach nowotworu okrężnicy i odbytnicy, w porównaniu z normalnymi tkankami.

Pr z y k ł a d 9

9.1 Ekspresja i oczyszczanie antygenów specyficznych dla nowotworu

Ekspresja w gospodarzach-mikroorganizmach lub alternatywnie transkrypcja/translacja in vitro jest stosowana do wytwarzania ujawnionego tutaj antygenu dla uzyskania szczepionek i aby wytworzyć fragmenty białka lub całe białko do szybkiego oczyszczania i generacji przeciwciał potrzebnych do charakterystyki naturalnie eksprymowanego białka metodą immunohistochemii lub dla śledzenia oczyszczania.

Zrekombinowane białka mogą być eksprymowane w dwóch gospodarzach-mikroorganizmach, E. coli i drożdżach (takich jak Saccharomyces cerevisiae lub Pichia pastoris). To pozwala na dobór układu ekspresji o cechach najlepszych dla wytwarzania danego antygenu. Na ogół zrekombinowany antygen będzie eksprymowany w E. coli, a reagent białkowy będzie eksprymowany w drożdżach.

Strategia ekspresji obejmuje najpierw zaprojektowanie pierwszorzędowej struktury zrekombinowanego antygenu. Na ogół, aby poprawić poziomy ekspresji, na N-końcu umieszczany jest ekspresyjny partner fuzji (EFP), który może także obejmować region pożyteczny dla modulacji immunogennych właściwości antygenu, immunologicznego partnera fuzji (IFP). Dodatkowo na C-końcu włączany jest jeden partner powinowactwa fuzji (AFP), ułatwiający dalsze oczyszczanie.

Jak wspomniano powyżej, można porównywać kilka konstruktów. Dla szybkiej ekspresji i oczyszczania oraz generacji przeciwciał przeciw CASB7439 proponuje się tworzenie w E. coli białka

CASB7439 pełnej długości z NSl jako EFP i ogonem histydynowym jako AFP. Tak więc proponowane są dwa konstrukty:

PL 209 127 B1

Konstrukt 1: cDNA CASB7439 typu dzikiego pełnej długości w postaci fuzji z cDNA NSl jako EFP i ogonem histydynowym kodującym cDNA jako AFP (SEQ ID NO: 8). Sekwencja kodowanego białka fuzyjnego to SEQ ID NO: 10.

Konstrukt 2: zmutowany cDNA CASB7439 pełnej długości w fuzji z cDNA NSl jako EFP i ogonem histydynowym kodującym cDNA jako AFP (SEQ ID NO: 9).

Proponuje się, by w tym konstrukcie pierwszych 50 kodonów natywnego cDNA CASB7439 zastąpić kodonami specyficznymi dla stosowania kodonów E. coli, aby wzmóc potencjał ekspresji CASB7439 w gospodarzu E. coli. Sekwencja kodowanego białka fuzyjnego to SEQ ID NO: 10.

Projekt białka CASB7439 przedstawiono poniżej:

„NSl” jest N-końcowym fragmentem (80 aminokwasów) białka grypy NSl.

„HIS” jest ogonem polihistydynowym.

Stosowanym zrekombinowanym szczepem jest AR58: kryptyczny lizogen λ pochodzący z N99, gal E::Tn 10, Δ-8 (ch1D-pg1), Δ-H (ero-ch1A), N+ i cI857 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom 82, str. 88-92, styczeń 1985 Biochemistry).

Gdy są dostępne szczepy zrekombinowane, zrekombinowany produkt jest charakteryzowany przez ocenę poziomu ekspresji i przewidywanie dalszej rozpuszczalności białka przez analizę zachowania w surowym ekstrakcie.

Po wzroście na odpowiednim podłożu hodowlanym i indukcji ekspresji zrekombinowanego białka analizowano całkowite ekstrakty na SDS-PAGE.

Białka zrekombinowane są uwidaczniane w barwionych żelach i identyfikowane przez analizę Western blot z użyciem specyficznych przeciwciał.

Plazmid nazwa: TCM 281 pRIT..15143 replikon: pMB1 selekcja: Kan promotor: PL long wstawka: NSl-GT74-39-His

Ekspresja zrekombinowanego białka z konstruktu 1

Bakterie hodowano na podłożu LB + 50 μg/ml Kan w 30°C. Gdy hodowla osiągnęła OD = 0,5 (620 nm), hodowlę podgrzano do 39°C, a po 5 godzinach indukcji zebrano komórki.

Przygotowanie ekstraktu

Stężenie komórek: 50 x ... w buforze PBS + całkowity ...

Rozbijanie: prasa Frencha 3 x

Wirowanie: 30 min. przy 14000 t

Uwaga: > 90% w supernatancie z ekstraktu komórkowego

Ekstrakt komórkowy przepuszczono przez 12,5% SDS PAGE, a następnie zabarwiono błękitem Coomassie.

Sporządzono także Western blot, stosując handlowe monoklonalne przeciwciało przeciw ogonowi polihistydynowemu (Quiagen).

Powstałe żele (fig. 3 i 4) wykazują, że białko jest eksprymowane i jest widoczne w supernatancie z ekstraktu komórkowego.

Schemat oczyszczania przeprowadzono według klasycznego podejścia opartego na obecności ogona powinowactwa His w białku zrekombinowanym.

W typowym doświadczeniu rozbite komórki odsączono i ekstrakty komórkowe poddano chromatografii powinowactwa do jonu metalu (IMAC; Ni** NTA od Quiagen), który specyficznie zatrzymuje zrekombinowane białko. Zatrzymane białka eluowano 0-500 mM gradientem imidazolu (ewentualnie w obecności detergentu) w buforze fosforanowym.

PL 209 127 B1

Supernatant z zebranej hodowli zdenaturowano w 6M moczniku, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, pH 8 i wprowadzono na kolumnę chromatograficzną IMAG Quiagen NTA Ni** w następujących warunkach:

Bufor do równoważenia:	NaH2PO4 Tris Mocznik	100 mM pH 8 10 mM 6M
Próbka: supernatant w 6M moczniku:	100 mM NaH2PO4	10 mM Tris
Bufory do płukania:	1) NaH2PO4	100 mM pH 8
	Tris	10 mM
	Mocznik	6M
	Imidazol	25 mM
	2) NaH2PO4	100 mM pH 8
	Tris	10 mM
	Mocznik	6M
	Imidazol	50 mM
Bufor do elucji:	NaH2PO4	100 mM pH 5,5
	Tris	10 mM
	Mocznik	6M
	Imidazol	500 mM

Wyeluowane białko w 500 mM imidazolu + 6M mocznik dializowano w następujących warunkach:

- PBS pH 7,2 + 0,5% sarkozyl + 4M mocznik,

- to samo z użyciem 2M mocznika przez 2 godz.,

- to samo z użyciem 0M mocznika przez 2 godz.

Końcowy materiał zamrożono i przechowywano. Zawartość białka określano ilościowo stosując oznaczenie białka według Lowry'ego (0,9 mg/1,2 ml). Czystość oceniono z użyciem 12,5% SDS PAGE barwionego błękitem Coomassie (fig. 5) i obecność zrekombinowanego białka sprawdzano techniką Western blot stosując przeciwciało monoklonalne przeciw polihistydynie (fig. 6).

Porównawcza ocena różnych wersji eksprymowanego antygenu pozwoli na selekcję najbardziej obiecującego kandydata do stosowania do dalszego oczyszczania i oceny immunologicznej.

9.2 Wytwarzanie przeciwciał i immunohistochemia

Niewielkie ilości stosunkowo czystego białka mogą być stosowane do generowania immunologicznych narzędzi, aby:

a) wykryć ekspresję drogą immunohistochemii w skrawkach tkanki normalnej lub rakowej;

b) wykryć ekspresję i śledzić białko w czasie procesu oczyszczania (ELISA/Western Blot); lub

c) scharakteryzować/oznaczyć ilościowo oczyszczone białko (ELISA).

9.2.1 Przeciwciała poliklonalne

Immunizacja

Króliki immunizowano domięśniowo (I. M.) 3 razy w odstępach 3 tygodni 100 pg białka sformułowanego w adiuwancie 3D-MPL/QS21. Trzy tygodnie po każdej immunizacji pobierano próbkę krwi i oceniano miano przeciwciała w surowicy za pomocą ELISA, stosując białko jako powlekający antygen według standardowego protokołu.

ELISA

Płytki 96 studzienkowe (maxisorb Nunc) powlekano 5 pg białka przez noc w 4°C. Po 1 godzinie nasycania w 37°C PBS NCS 1% dodano seryjne rozcieńczenia surowic królika na 1 godz. 30 min. w 37°C (zaczynając od 1/10). Po 3 płukaniach w PBS Tween dodano przeciw króliczą biotynylowaną surowicę odpornościową (Amersham) (1/5000). Płytki płukano i dodawano streptawidyny połączonej z peroksydazą (1/5000) przez 30 min w 37°C. Po płukaniu dodano 50 pl TMB (BioRad) przez 7 min. i reakcję następnie zahamowano 0,2M H2SO4. OD może być mierzone przy 450 nm, a środkowe rozcieńczenia obliczyć z użyciem SoftmaxPro.

9.2.2 Przeciwciała monoklonalne

Immunizacja myszy BALB/c immunizowano 3 razy w odstępach 3 tygodni 5 pg oczyszczonego białka. Krwawienia przeprowadzono 14 dni po II i 1 tydzień po 3. Surowice badano za pomocą Elisa na

PL 209 127 B1 oczyszczonym białku stosowanym jako powlekający antygen. W oparciu o te wyniki (środkowe rozcieńczenie > 10000) wybrano jedną mysz do fuzji.

Fuzja/selekcja HAT

Komórki śledziony poddano fuzji ze szpiczakiem SP2/0 według standardowego protokołu, sto45 sując 40% PEG i 5% DMSO. Komórki następnie zaszczepiono na 96 studzienkowe płytki 2,5 x 10⁴-10⁵komórek/studzienkę i wybierano oporne klony na podłożu HAT. Supernatant tych hybrydom testowano pod kątem zawartości specyficznego przeciwciała i gdy były dodatnie były poddane 2 cyklom ograniczonego rozcieńczenia. Po 2 rundach przeszukiwania, wybrano 3 hybrydomy do wytwarzania płynu puchlinowego.

9.2.3 Immunohistochemia

Gdy są dostępne przeciwciała, przeprowadza się immunobarwienie na skrawkach tkanki normalnej lub rakowej, aby określić:

- poziom ekspresji ujawnionego tutaj antygenu w raku w stosunku do normalnej tkanki lub

- proporcję raka pewnego typu eksprymującego antygen,

- czy inne typy raka też eksprymują antygen,

- proporcję komórek eksprymujących antygen w tkance raka.

Przygotowanie próbek tkanek

Po wycięciu próbkę tkanki montowano na krążku z korka w związku OCT i szybko zamrażano w izopentanie uprzednio superschłodzonym w ciekłym azocie (-160°C). Blok następnie przechowywano w -70°C do użycia. Skrawki 7-10 μm przygotowywano w komorze kriostatowej (-20, -30°C).

Barwienie

Skrawki tkanki suszono przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), utrwalano w acetonie przez 10 min w RT, ponownie suszono i nasycano surowicą PBS 0,5% BSA 5%. Po 30 min w temperaturze pokojowej prowadzono barwienie bezpośrednie lub pośrednie, stosując przeciwciała specyficzne dla antygenu. Bezpośrednie barwienie prowadzi do lepszej specyficzności, ale mniej intensywnego barwienia, podczas gdy barwienie pośrednie daje bardziej intensywne, ale mniej specyficzne barwienie.

9.3 Analiza ludzkich komórkowych odpowiedzi immunologicznych na ujawniony tutaj antygen

Immunologiczne znaczenie ujawnionego tutaj antygenu można ocenić drogą obciążania in vitro ludzkich komórek T. Wszystkie linie limfocytowe komórek T i dendrytycznych pochodzą z PBMC (obwodowych jednojądrowych komórek krwi) zdrowych dawców (korzystnie podtyp HLA-A2). Stosuje się też model transgenicznej myszy HLA- A2.1/Kb do przeszukiwania peptydów HLA-A2.1.

Wyhodowano linie komórek T CD8⁺ specyficzne dla nowo odkrytego antygenu i utrzymywano je przez cotygodniową stymulację in vitro. Aktywność lityczna i wytwarzanie IFNy linii CD8+ w odpowiedzi na antygen lub peptydy pochodzące od antygenu testowano stosując procedury standardowe.

Stosowano dwie strategie do uzyskania linii komórek T CD8⁺: podejście oparte na peptydzie i podejście oparte na całym genie. Oba podejścia wymagają albo sklonowania cDNA pełnej długości nowo odkrytego antygenu w prawidłowej ramce odczytu w odpowiednim układzie dostarczania, albo stosowania go do przewidywania sekwencji peptydów wiążących HLA.

Podejście oparte na peptydzie

Pokrótce, myszy transgeniczne immunizowano adiuwantowanymi peptydami HLA-A2, po czym te, które nie były zdolne do indukcji odpowiedzi CD8⁺ (definiowanej przez skuteczną lizę autologicznych komórek śledziony pulsowanych białkiem) dalej analizowano w układzie ludzkim. Ludzkie komórki dendrytyczne (hodowane według Romani i in.) pulsowano peptydami i stosowano do stymulacji sortowanych na CD8⁺ komórek T (za pomocą FACS). Po kilku tygodniowych stymulacjach linie CD8⁺najpierw testowano na pulsowanych przez peptydy autologicznych BLCL (linie komórkowe transformowane EBV-B). Aby sprawdzić właściwą obróbkę in vivo peptydu linie CD8⁺ testuje się na transfekowanych cDNA komórkach nowotworowych (komórki nowotworowych LnCaP, Skov3 lub CAMA transfekowane HLA-A2).

Podejście oparte na całym genie

Linie komórkowe T CD8⁺ inicjowano i stymulowano komórkami dendrytycznymi transfekowanymi strzelbą genową, fibroblastami transdukowanymi przez retrowirusy i transfekowanymi przez

B7.1, komórkami dendrytycznymi zakażonymi zrekombinowanym wirusem ospy lub adenowirusem.

Komórki zakażone przez wirus bardziej wydajnie prezentują antygenowe peptydy, ponieważ antygen jest eksprymowany na wysokim poziomie, ale mogą być stosowane tylko raz, aby uniknąć przerostu

PL 209 127 B1 wirusowych linii T. Po zmienianych stymulacjach linie CD8⁺ testowano na komórkach nowotworu transfekowanych cDNA jak wskazano powyżej. Określano specyficzność i identyczność peptydu, aby potwierdzić poprawność immunologiczną.

Odpowiedź komórek T CD4⁺

Podobnie można także oceniać odpowiedź immunologiczną komórek T CD4⁺. Generację specyficznych komórek T CD4⁺ przeprowadza się stosując komórki dendrytyczne obciążone zrekombinowanym oczyszczonym białkiem lub peptydami, dla stymulacji komórek T.

Przewidywane epitopy (nonamery i dekamery) wiążące allele HLA

Sekwencje peptydów wiążących HLA klasy I przewiduje się albo z użyciem algorytmu Parkera (Parker, K. C., M. A. Bednarek i J. E. Coligan, 1994. Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152: 163 i http://bimas.dcrt.ni.gov/molbio/hla_bind/), albo metodą Rammensee (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands and peptide motifs: 1st listing, Immunogenetics 41, 178-228, 1995; Rammensee, Bachmann, Stevanovic: MHG ligands and peptide motifs. Landes Bioscience 1997 i http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm).

Peptydy można wówczas przeszukiwać w modelu myszy transgenicznej HLA-A2.1/Kb (Vitiello i in.). Sekwencje peptydów wiążących HLA klasy II przewiduje się stosując algorytm Tepitope, z wartością odcięcia na 6 (Sturniolo, Hammer i in., Nature Biotechnology. 1999, 17; 555-561).

W następujących tabelach zestawiono przewidywane sekwencje epitopów klasy I i II.

HLA-A0201 : dekamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	64	KLVNLGFQAL	142,060	SEQ ID NO: 16

°: Ocena okresu połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej tę podsekwencję

HLA-A 0201: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	182	ELLDFSSWL	507,976	SEQ ID NO: 17
2	104	RLLAEHDAV	126,098	SEQ ID NO: 18
3	64	KLVNLGFQA	100,850	SEQ ID NO: 19

HLA-A24: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRL	360,000	SEQ ID NO: 20

HLA-A 24: dekamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRLL	360,000	SEQ ID NO: 21

HLA-B7: dekamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	111	AVRNALAGGL	600,000	SEQ ID NO: 22

PL 209 127 B1

HLA-B 4403: dekamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Parkera°	SEQ ID:
1	156	SEPGSPRSAY	360,000	SEQ ID NO: 23
2	89	VETLRSAVEY	180,000	SEQ ID NO: 24

HLA-DRB1*1501: nonamery

Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,6	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB1*1502: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,6	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB 1*0402: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,4	SEQ ID NO: 26

HLA-DRB1*1101: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB1*1102: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID NO: 26

HLA-DRB1*1104: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB1*1106: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB1*1301: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,6	SEQ ID NO: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,9	SEQ ID NO: 27
3	31	LLRCSRRRR	4,4	SEQ ID NO: 33

PL 209 127 B1

HLA-DRB1*1302: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,6	SEQ ID NO: 26

HLA-DRB1*1304: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID NO: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,8	SEQ ID NO: 27
3	31	LGFQALRQH	4,6	SEQ ID NO: 28

HLA-DRB1*1305: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8	SEQ ID NO: 25

HLA-DRB 1*0703: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	112	VRNALAGGL	5,1	SEQ ID NO: 29
2	98	YIRALQRLL	4,8	SEQ ID NO: 30
3	65	LVNLGFQAL	4,5	SEQ ID NO: 31

HLA-DRB5*0101: nonamery
Ranga	Pozycja startu	Lista reszt podsekwencji	Punkty Tepitope	SEQ ID:
1	96	VEYIRALQR	4,3	SEQ ID NO: 32

PL 209 127 B1

INFORMACJA O SEKWENCJACH

SEQ LD NO:1 gtaccttgctttgggggcgcactaagtacctgccgggagcagggggcgcaccgggaactcgcagatttcgcc 5 agttgggcgcactggggatctgtggactgcgtccgggggatgggctagggggacatgcgcacgctttgggcc

TTACAGAATGTGATCGCGCGAGGGGGAGGGCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTGA

GAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCTGC

GGAGACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTGCC

ACCACTAGGCCTCCTATCCCCGGGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGAGTTGCCTGGCGGCGCC

GTGCCAGAAGCCCCCTTGGGGCGCCACAGTTTTCCCCGTCGCCTCCGGTTCCTCTGCCTGCACCTTCCTGCG GCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCGatggacggcggcacactgcccaggtccgcgcc ccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaaccgttgcgctgcag ccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgcga gcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggogctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccag caagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgcrgcagcgcctgctggc cgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggcrgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccg cgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcag ctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgc ggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTATGAGCCTCAGCC

CCGGAAGCCGAGCGAGCGGCCGGCGCGCTCATCGCCGGGGAGCCCGCCAGGTGGACCGGCCCGCGCTCCGCC CCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCACCACCCCCCGCACCGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGGCCCAGCCTGA CCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCTTCCTCCGACGCCGCCCCTC CCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGGCGGGGGGCACCAACACTTGGAGATTTTTCCGGAGGGGAGAGGATTT TCTAAGGGCACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACTTGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTGC-CAAACGGAG acctatttttgtacaaagaacccttgacctggggcgtaataaagatgacctggacccctgcccccactatct ggagttttccatgctggccaagatctggacacgagcagtccctgaggggcggggtccctggcgtgaggcccc cgtgacagcccaccctggggtgggtttgtgggcactgctgctctgctagggagaagcctgtgtggggcacac ctcttcaagggagcgtgaactttataaataaatcagttctgtttaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQIDNO:2 mdggtlprsappappvpvgcaarrrpaspellrcsrrrrpataetgggaaavarrnerernrvklvnlgfqa lrqhvphggaskklskvetlrsaveyiralqrllaehdavrnalagglrpqavrpsaprgppgttpvaasps

RASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY

SEQ ID NO:3

MSAPAARSASGAEAHRSRALSSPLTSWRSRVARAPQDSARLRSRCRPTSRRNAGSRAPSCPRGPGTKKRGR

ARRRPGWSLAARGAQTAARPAASALPPARCARRRARPAGAAARGCTPRLSAASPPCSASCWRRRAARAAAA

PGSPSSPASRGCARAHCAALRPLRRLRSLRWPVAAAGCSATVPGTRVSAGQRSRQGRGAQGARTWAVCRRP

SRLHPPARSRSRRAAGRCRQRNRRRRGKLWRPKGASGTAPPGNSPGHAS

PL 209 127 B1

SEQ Π) NO:4

GTACCTTGCTTTGGGGGCGCACTAAGTACCTGCCGGGAGCAGGGGGCGCACCGGGAACTCGCAGATTTCGCC

AGTTGGGCGCACTGGGGATCTGTGGACTGCGTCCGGGGGATGGGCTAGGGGGACATGCGCACGCTTTGGGCC

TTACAGAATGTGATCGCGCCGAGGGGGAGGGCCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGT GAGAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCT GCGGAGACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTG CCACCACTAGGCCTCCTATCCCCGGGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGAGTTGCCTGGCGGCG CCGTGCCAGAAGCCCCCTTGGGGCGCCACAGTTTTCCCCGTCGCCTCCGGTTCCTCTGCCTGCACCTTCCTG

CGGCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCGatggacggcggcacactgcccaggtccgcg ccccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgc agccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgc gagcgcaacegcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgcc agcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctg gccgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccc cgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggc agctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcct gcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTAATAAGCCTCA AGCCCCGGAAACCCGAGCGAACGGGCCGGCGCGCTTCATCGCCGGGGAAGCCCGCCAAGGTGGACCGGGCCC

GCGCTCCGCCCCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCACCACCCCCCGCACCGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGG CCCAGCCTGACCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCTTCCTCCGAC GCCGCCCCTCCCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGGCGGGGGGCACCAACACTTGGAGATTTTTCCGGAGGG GAGAGGATTTTCTAAGGGCACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACTTGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTG GCAAACGGAGACCTATTTTTGTACAAAGAACCCTTGACCTGGGGCGTAATAAAGATGACCTGGACCCCTGCC

CCCACTATCTGGAGTTTTCCATGCTGGCCAAGATCTGGACACGAGCAGTCCCTGAGGGGCGGGGTCCCTGGC GTGAGGCCCCCGTGACAGCCCACCCTGGGGTGGGTTTGTGGGCACTGCTGCTCTGCTAGGGAGAAGCCTGTG TGGGGCACACCTCTTCAAGGGAGCGTGAACTTTATAAATAAATCAGTTCTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAACCGAGGGGGGGCCCGGAGCCAACAAA

SEQ Π) NO:5

GGTAAACAGAACTGATTTATTTATAAAGTTCACGCTCCCTTGAAGAGGTGTGCCCCACACAGGCTTCTCCC

TAGCAGAGCAGCAGTGCCCACAAACCCACCCCAGGGTGGGCTGTCACGGGGGCCTCACGCCAGGGACCCCG

CCCCTCAGGGACTGCTCGTGTCCAGATCTTGGCCAGCATGGAAAACTCCAGATAGTGGGGGCAGGGGTCCA

GGTCATCTTTATTACGCCCCAGGTCAAGGGTTCTTTGTACAAAAATAGGTCTCCGTTTGCCAGCAGTGTCC

5 CTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAGAAAATGGATTCTCTGTGCCCTTAGAAAATCCTCTCCCCTCCGGAA AAATCTCCAAGTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTGCAGTCGAGAAGCTGTGGGGAGGGGCGGCGTCGGAGGA AGCCGCAGCCCATTATGGGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCTGGGCGGACGAA CGAGGCGGCGTCGGCGGTGCGGGGGGTGGTGGGTGGGTCCCCGGCTCGCTGGGGGCGGAGCAGCGGGCCGG TCCACCTGGCGGGCTCCCC

PL 209 127 B1

SEQ Π) NO:6 _{TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAgAACTGATTTA7TTATAAAGTTCACGCTCCCTTGAAGAGGTGTGCCCC}5 ACACAGGCTTCTCCCTAGCAGAGCAGCAGTGCCCACAAACCCACCCCAGGGTGGGCTGTCACGGGGGCCTCA

CGCCAGGGACCCCGCCCCTCAGGGACTGCTCGTGTCCAGATCTTGGCCAGCATGGAAAACTCCAGATAGTGG

GGGCAGGGGTCCAGGTCATCTTTATTACGCCCCAGGTCAAGGGTTCTTTGTACAAAAATAGGTCTCCGTTTG

CCAGCAGTGTCCCTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAGAAAATGGATTCTCTGTGCCCTTAGAAAATCCTCT

CCCCTCCGGAAAAATCTCCAAGTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTGCAGTCGAGAAGCTGTGGGGAGGGGCGG

CGTCGGAGGAAGCCGCCAGCCCTTATGGGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCTGG GCCGGACGAACGAGGCGGCGTCGGCGGTGCGGGGGGTGGTGGGTGGGTCCCCGGCTCGCTGGGGGCGGAGCG CGGGCCGGTCCACCTGGCGGGCTCCCCGGCGATGAGCGCGCCGGCCGCTCGCTCGGCTTCCGGGGCTGAGGC TCATAGGTCGAGGGCGCTCAGTAGCCCCCTAACCAGCTGGAGAAGTCGAGTAGCTCGCGCTCCGCAGGACTC AGCGCGCCTTCGCAGCCGCTGTCGTCCGACGAGTAGGCGGAACGCGGGGAGCCGGGCTCCGAGCTGCCCCCG

CGGCCCGGGGACGAAGAAGCGCGGGAGGGCGAGGCGGCGACCGGGGTGGTCCCTGGCGGCCCGCGGGGCGCA GACGGCCGCACGGCCTGCGGCCTCAGCCCTCCCGCCAGCGCGTTGCGCACGGCGTCGTGCTCGGCCAGCAGG CGCTGCAGCGCGCGGATGTACTCCACGGCTGAGCGCAGCGTCTCCACCTTGCTCAGCTTCTTGCTGGCGCCG CCGTGCGGCACGTGCTGCCGCAGCGCCTGGAAGCCCAAGTTCACCAGCTTCACGCGGTTGCGCTCGCGCTCA TTGCGCCGCGCTACGGCCGCTGCGCCGCCTCCGGTCTCTGCGGTGGCCGGTCGCCGCCGCCGGCTGCAGCGC

AACAGTTCCGGGGACGCGGGTCTCCGCCGGGCAGCGCAGCCGACAGGGACGGGGGGCGCAGGGGGCGCGGAC CTGGGCAGTGTGCCGCCGTCCATCGCGCCTGCATCCACCCGCCCGCTCCAGGTCCCGGCGCGCCGCAGGAAG GTGCAGGCAGAGGAACCGGAGGCGACGGGGAAAACTGTGGCGCCCCAAGGGGGCTTCTGGCACGGCGCCGCC AGGCAACTCCCCAGGGCACGCGTCCTAGGTCGTCTGGAGCCCGGGGATAGGAGGCCTAGTGGTGGCAGGCCG TACGCGCCAGGGAGCGTGGGACGCTCGTGTCCCGCGCGTGCGGCCGGACTCTCCCAGGTCTCCGCAGGCGCG

GCGCAGGĆGGCTGGTTTTTAAATGTATAGATAACCCTCCTCCGCGCCGCCGCCGTCGCCTTTCTCACGCCCT CCTTCCTTCGCCTCGCCCTCCCGCCACGCTTCGCCCTCCCCCTCGCGCGATCACATTCTGTAAGGCCCAAAG CGTGCGCATGTCCCCCTAGCCCATCCCCCGGACGCAGTCCACAGATCCCCAGTGCGCCCAACTGGCGAAATC TGCGAGTTCCCGGTGCGCCCCCTGCTCCCGGCAGGTACTTAGTGCGCCCCCAAAGCAAGGTAC

SEQ ID NO:7

MCRKWILCALRKSSPLRKNLQVLVPPAPLQSRSCGEGRRRRKPPALMGPAPSPFPPRHWSGWAGRTRRRRR CGGWWVGPRLAGGGARARSTLAGFPGDEARRPVRSGFRGLRLIRSRALSSPLTSWRSRVARAPQDSARLRS RCRPTSRRNAGSRAPSCPRGPGTKKRGRARRRPGWSLAARGAQTAARFAASALPPARCARRRARPAGAAAR GCTPRLSAASPPCSAS CWRRRAARAAAAPGS PSS PASRGCARAHCAALRPLRRLRS LRWPVAAAGCSATVP

GTRVSAGQRSRQGRGAQGARTWAVCRRPSRLHPPARSRSRRAAGRCRQRNRRRRGKLWRPKGASGTAPPGN SPGHAS

PL 209 127 B1

SEQ Π) NO: 8

ATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGAC

CAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGC

ACcCTcGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGtGGAGCGGAttctGAAAGAAGAA

TCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACACTGCCCAGGTCCGCGCCCCCTGCGCCCCCCGTC

CCTGTCGGCTGCGCTGCCCGGCGGAGACCCGCGTCCCCGGAACTGTTGCGCTGCAGCCGGCGGCGGCGACCG GCCACCGCAGAGACCGGAGGCGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATGAGCGCGAGCGCAACCGCGTGAAG CTGGTGAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCGCCAGCAAGAAGCTGAGCAAG GTGGAGACGCTGCGCTCAGCCGTGGAGTACATCCGCGCGCTGCAGCGCCTGCTGGCCGAGCACGACGCCGTG CGCAACGCGCTGGCGGGAGGGCTGAGGCCGCAGGCCGTGCGGCCGTCTGCGCCCCGCGGGCCGCCAGGGACC

ACCCCGGTCGCCGCCTCGCCCTCCCGCGCTTCTTCGTCCCCGGGCCGCGGGGGCAGCTCGGAGCCCGGCTCC CCGCGTTCCGCCTACTCGTCGGACGACAGCGGCTGCGAAGGCGCGCTGAGTCCTGCGGAGCGCGAGCTACTC GACTTCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACactagtggccaccatcaccatcaccattaa

SEQ Π) NO:9

ATGGATGCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGA CCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCA GCACCCTCGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAA GAATCCGATGAGGCA.CTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACCCTGCCGCGTTCCGCGCCGCCGGCGCCGCC AGTTCCGGTTGGCTGCGCTGCCCGTCGCCGTCCCGCGTCCCCGGAACTGCTGCGCTGCAGCCGTCGCCGTC

GCCCGGCCACCGCAGAGACCGGAGGCGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATGAGCGCGAGCGCAACCGC GTGAAGCTGGTGAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCGCCAGCAAGAAGCT GAGCAAGGTGGAGACGCTGCGCTCAGCCGTGGAGTACATCCGCGCGCTGCAGCGCCTGCTGGCCGAGCACG ACGCCGTGCGCAACGCGCTGGCGGGAGGGCTGAGGCCGCAGGCCGTGCGGCCGTCTGCGCCCCGCGGGCCG CCAGGGACCACCCCGGTCGCCGCCTCGCCCTCCCGCGCTTCTTCGTCCCCGGGCCGCGGGGGCAGCTCGGA

GCCCGGCTCCCCGCGTTCCGCCTACICGTCGGACGACAGCGGCTGCGAAGGCGCGCTGAGTCCTGCGGAGC GCGAGCTACTCGACTrCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACACTAGTGGCCACCATCACGATCACCATTAA

SEQIDNO:10

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIE”ATRAGKQIVERILKEE

S DEALKMTMEGGTLPRSAP PAP PVPVGCAARRRPAS PELLRCS RRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVK

LVNLGFQALRQHVPHGGAS KKLS KVETLRSAVEYI RALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRP S APRG P PGT TPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYTSGHHHHHH

SEQIDNO:11

MYSTASRSVSTLLSFLLAPPCGTCCRSAWKPKFTSFTRLRSRSLRRATAAAPPPVSAVAGRRRRLQRNSSG DAGLRRAAQPTGTGGAGGADLGSVPPSIAPASTRPLQVPARSRKVQAEEPEATGKTVAPQGGFWHGAARQL PRARVLGRLEPGDRRPSGGRPYAPGSVGRSCPARAAGLSQVSAGAAQAAGF

PL 209 127 B1

SEQ ID NO:12

MEAHLDWYGVPGLQEASDACPRESCSSALPEAREGANVHFPPHPVPREHFSCAAPELVAGAQGLNASLMDG

GALPRLMPTSSGVAGACAARRRQASPELLRCSRRRRSGATEASSSSAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALR

QHVPHGGANKKLSKVETLRSAVEYIRALQRI,LAEHDAVRAALAGGLLTPATPPSDECAQPSASPASASLSC

ASTSPSPDRLGCSEPTSPRSAYSSEESSCEGELSPMEQELLDFSSWLGGY

SEQ ID NO:13

GCCCGGAGCATGGAAGCACGTCAGCTAGGCCATGAACTGCACCCGGGAGGGGTGGGGGTGGAAGCGCACGG

TGTCAGCTTTGCAGAATGTGTACACCAAGGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTAAGAAAGGAGGCG

GGGAGCGCCTGACAGCACGCGCGGGACACGAGAGTACCACGCTTCCCTACTCTTTTCAGACCTTGACTGGT

ACGGGGTCCCAGGACTGCAGGAGGCCAGCGACGCGTGCCCTAGGGAGTCCTGCAGCAGTGCCCTGCCTGAG

GCCCGTGAAGGTGCAAACGTCCACTTCCCACCGCACCCGGTTCCTCGCGAGCACTTTTCCTGTGCCGCACC

AGAACTCGTAGCAGGGGCCCAGGGGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCGGCGCGCTGCCCAGACTCATGC

CCACCTCGTCTGGAGTCGCTGGAGCCTGCGCTGCTCGGCGGAGACAAGCGTCTCCGGAATTGCTGCGCTGC AGCCGGCGGCGGCGATCTGGAGCAACCGAGGCCAGCAGCAGCTCGGCGTCCGTGGCACGCCGCAATGAGCG CGAGCGCAACCGCGTAAAGCTGGTAAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCG CCAACAAGAAGCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATTCGTGCGCTGCAGCGGCTG CTCGCAGAGCACGACACGGTGCGGCCGGNGCTCGCTGGGGGGCTGTTAACACCCGCTACTCCGCCGTCCGA

TGAGTGCACGCAGCCCTCTGCCTCCCCTGCCAGCGGGTCTCTGTCCTGCGCCTCTACGTCTCCGTCCCGGA CCCTGGGCTGCTCTGAGCCTACCTCCCCGCGCTCCGCCTACTCGTCGGAGGAAAGCAGCTGCGAGGGAGAG CTAAGCCCGATGGAGCAGGAGCTGCTTGACTTTTCCAGTTGGTTAGGGGGCTACTGA

SEQ ID NO:14

MESHFNWYGVPRLQKASDACPRESCSSALPEAREGANVKFPPHPVPREHFSCGA?KPVAGAPALNASLMDG GALPRLVPTSSGVAGACTARRRPPSPELLRCSRRRRSGATEASSSSAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALR QHVPHGGANKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRAALSGGLLTPATRPSDVCTQPSASPASASLSC TSTSPDRLGCSEPAS PRSAYSSEDS S CEGETYPMGQMFDFSNWLGGY

SEQ Π) NO-.15

TTCACCCGGCTGCAAGCGCTAGGTGTACGGAGACCTGGCAGCTCTTGGGGCTTAAGGACTGAGCRCCAGAG

CCGGTGGAGGTTCCTGTGGAGTACATTCGGACCCTCTCACAGCCCCCGAGAGTGCGGGACGTGCGGAGCGC

AGTTCGGGATCTGCACTCGAGGACTTGTCGAGGACGCATTAAGCTAAGCATCTGCTCGGAGCATGGAATCG

CACTTTAACTGGTACGGGGTCCCAAGGCTCCAGAAGGCTAGCGACGCGTGCCCTAGGGAATCCTGCAGCAG

TGCCCTGCCTGAGGCCCGTGAAGGTGCGAACGTCCACTTCCCACCGCACCCGGTTCCTCGCGAGCACTTTT CCTGTGGCGCACCGAAACCCGTAGCGGGGGCCCCGGCGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCGGCGCGCTG CCCAGACTCGTGCCCACCTCGTCTGGAGTCGCTGGAGCCTGCACTGCTCGGCGGAGACCCCCGTCCCCGGA

PL 209 127 B1

ACTGCTTCGCTGCAGCCGACGGCGGCGATCGGGAGCAACCGAGGCCAGCAGCAGCTCGGCGGCCGTGGCAC

GCCGCAATGAGCGTGAGCGCAACCGCGTAAAGCTGGTAAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTG

CCGCACGGCGGCGCCAACAAGAAGCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATCCGTGC

GCTGCAGCGGCTGCTAGCAGAGCACGACGCGGTGCGTGCTGCGCTCTCTGGGGGTCTATTAACACCCGCTA

CTCGGCCGTCCGATGTGTGCACGCAGCCCTCCGCCTCCCCTGCCAGCGCGTCTCTGTCCTGCACCTCTACA TCCCCAGACCGCCTAGGCTGCTCCGAGCCTGCCTCTCCGCGCTCCGCCTACTCGTCGGAGGACAGCAGCTG CGAGGGAGAGACTTACCCGATGGGGCAGATGTTTGACTTTTCCAATTGGTTAGGGGGCTACTGAGCACCCC ACACCCCTAAGCTGCGTCCCTGGGTGTCCCCTGGTGGACCTACCTGCGTTTCTTGCCCAGGAAACCTGGGC CCATGCCTTACCCATGCTGTCTAGTGCAGCCTGACCAAATGCCAAGTACTGACCTCTGCTCGGCCTCCACG

CCGCGGAATGACATCTTCCATCTCCCAGTCCTTGCCGAACCAGGACTTGGAAATTTCTCAGGAGAAAGAAT TTTACAATGACAATCTGCTTTTTATCAATTAACTTGAACTGCTGGAGGACTCTGerGAAAATATGAAGAAT TATTTTTATACAAAGGATCCTTAAGCTTGGAGCACAATAAAGATGACCTCTGTCTCTCACCCCCACTGTCT AGAACTTTCCAACCTGGCCAAAGTGTGGACGGGTCGGGCCCTGAGGGCAAGATGCCTGGCTGCACCCTTCT TCCTCTTCCGAAGCCTATCCTGACGCTGATGTTTGGCCAGTGTGGGAACCCTGCTATTGCAAAGTGTACTA

TTCTATAAAAGTTGTTTTTCATTGGAAAGGAATTC

SEQ ID NO:16 KLVNlGFQAL

SEQ Π) NO:17 ELLDFSSWL

SEQ Π) NO:18 RLLAEHDAV

SEQ Π) NO:19

KLVNLGFQA

SEQIDNO:20

EYIRALQRL

SEQ Π) NO:21 EYIRALQRLL

SEQIDNO:22 AVRNALAGGL

PL 209 127 B1

SEQ ID NO:23

SEPGSPRSAY

SEQIDNO:24

VETLRSAVEY

SEQ ID NO:25

ZRALQRLLA

SEQIDNO:26

LRPQAVRPS

SEQIDNO:27

LRQHVPHGG

SEQIDNO:28

LGFQALRQH

SEQ Π) NO:29

VRNALAGGL

SEQ ID NO:30

YIRALQRLL

SEQ ID NOt31 LVNLGFQAL

SEQIDNOt32

VEYIRALQR

SEQIDNOt33

LLRCSRRRR

PL 209 127 B1

	Wykaz	sekwencji
<110>	SmithKline Beecham Biologicals s.a
<120	Nowe związki
<130	BC45300
<160	32
<170	FastSEQ dla Windows	wersja 3.0
<210	1
<211>	1791
<212>	DNA
<213>	Człowiek
<400	1

gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc 60 gcagatttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgtccgggg gatgggctag 120 ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgatcg cgcgaggggg agggcgaagc 180 gtggcgggag ggcgaggcga aggaaggagg gcgtgagaaa ggcgacggcg gcggcgcgga 240 ggagggttat ctatacattt aaaaaccagc cgcctgcgcc gcgcctgcgg agacctggga 300 gagtccggcc gcacgcgcgg gacacgagcg tcccacgctc cetggcgcgt acggcctgcc 360 accactaggc ctcctatccc cgggctccag acgacctagg acgcgtgccc tggggagttg 420 cctggcggcg ccgtgccaga agcccccttg gggcgccaca gttttccccg tcgcctccgg 480 ttcctctgcc tgcaccttcc tgcggcgcgc cgggacctgg agcgggcggg tggatgcagg 540 cgcgatggac ggcggcacac tgcccaggtc cgcgccccct gcgccccccg tccctgtcgg 600 ctgcgctgcc cggcggagac ccgcgtcccc ggaactgttg cgctgcagcc ggcggcggcg 660 accggccacc gcagagaccg gaggcggcgc agcggccgta gcgcggcgca atgagcgcga 720 gcgcaaccgc gtgaagctgg tgaacttggg cttccaggcg ctgcggcagc acgtgccgca 780 cggcggcgcc agcaagaagc tgagcaaggt ggagacgctg cgctcagccg tggagtacat 840 ccgcgcgctg cagcgcctgc tggccgagca cgacgccgtg cgcaacgcgc tggcgggagg 900 gctgaggccg caggccgtgc ggccgtctgc gccccgcggg ccgccaggga ccaccccggt 960 cgccgcctcg ccctcccgcg cttcttcgtc cccgggccgc gggggcagct cggagcccgg 1020 ctccccgcgt tccgcctact cgtcggacga cagcggctgc gaaggcgcgc tgagtcctgc 1080 ggagcgcgag ctactcgact tctccagctg gttagggggc tactgagcgc cctcgaccta 1140 tgagcctcag ccccggaagc cgagcgagcg gccggcgcgc tcatcgccgg ggagcccgcc 1200 aggtggaccg gcccgcgctc cgcccccagc gagccgggga cccacccacc accccccgca 1260 ccgccgacgc cgcctcgttc gtccggccca gcctgaccaa tgccgcggtg gaaacgggct 1320 tggagctggc cccataaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc cacagcttct 1380 cgactgcagt ggggcggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg gagaggattt 1440 tctaagggca cagagaatcc attttctaca cattaacttg agctgctgga gggacactgc 1500 tggcaaacgg agacctattt ttgtacaaag aacccttgac ctggggcgta ataaagatga 1560 cctggacccc tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct ggacacgagc 1620 agtccctgag gggcggggtc cctggcgtga ggcccccgtg acagcccacc ctggggtggg 1680 tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcctgtgtg gggcacacct cttcaaggga 1740 gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1791 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Człowiek <400> 2

Met 1

Asp

Gly

Thr 5

Leu

Pro

Arg

Ser

Ala 10

Pro

Ala

Pro

Pro 15

Val

Pro

Val

Gly

Cys 20

Ala

Arg

Arg 25

Pro

Ala

Ser

Pro

Glu 30

Leu

Arg

Cys

Ser 35

Arg

Pro 40

Ala

Thr

Ala

Glu

Thr 45

Gly

PL 209 127 B1

Ala	Ala 50	Ala	Val	Ala	Arg	Arg 55	Asn
Leu 65	Val	Asn	Leu	Gly	Phe 70	Gin	Ala
Gly	Ala	Ser	Lys	Lys 85	Leu	Ser	Lys
Glu	Tyr	Ile	Arg 100	Ala	Leu	Gin	Arg
Arg	Asn	Ala 115	Leu	Ala	Gly	Gly	Leu 120
Ala	Pro 130	Arg	Gly	Pro	Pro	Gly 135	Thr
Arg 145	Ala	Ser	Ser	Ser	Pro ISO	Gly	Arg
Pro	Arg	Ser	Ala	Tyr 165	Ser	Ser	Asp
Ser	Pro	Ala	Glu 180	Arg	Glu	Leu	Leu

Tyr

Glu	Arg	Glu	Arg 60	Asn	Arg	Val	Lys
Leu	Arg	Gin 75	His	Val	Pro	His	Gly 80
Val	Glu 90	Thr	Leu	Arg	Ser	Ala 95	Val
Leu 105	Leu	Ala	Glu	His	Asp 110	Ala	Val
Arg	Pro	Gin	Ala	Val 125	Arg	Pro	Ser
Thr	Pro	Val	Ala 140	Ala	Ser	Pro	Ser
Gly	Gly	Ser 155	Ser	Glu	Pro	Gly	Ser 160
Asp	Ser 170	Gly	Cys	Glu	Gly	Ala 175	Leu
Asp 185	Phe	Ser	Ser	Trp	Leu 190	Gly	Gly

<210> 3 <211> 2S2 <212> PRT <213> Człowiek <400> 3

Met 1

Ser

Ala

Pro

Ala 5

Ala

Arg

Ser

Ala

Ser 10

Gly

Ala

Glu

Ala

His 15

Arg

Ser

Arg

Ala

Leu 20

Ser

Pro

Leu

Thr 25

Ser

Trp

Arg

Ser

Arg 30

Val

Ala

Arg

Ala

Pro 35

Gin

Asp

Ser

Ala

Arg 40

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys 45

Arg

Pro

Thr

Ser

Arg 50

Arg

Asn

Ala

Gly

Ser 55

Arg

Ala

Pro

Ser

Cys 60

Pro

Arg

Gly

Pro

Gly 65

Thr

Lys

Arg

Gly 70

Arg

Ala

Arg

Arg 75

Pro

Gly

Trp

Ser

Ala

Arg

Gly

Ala 85

Gin

Thr

Ala

Arg 90

Pro

Ala

Ser

Ala 95

Pro

Ala

Arg 100

Cys

Ala

Arg

Arg 105

Ala

Arg

Pro

Ala

Gly 110

Ala

Arg

Gly 115

Cys

Thr

Pro

Arg

Leu 120

Ser

Ala

Ser

Pro 125

Pro

Cys

Ala

Ser 130

Cys

Trp

Arg

Arg 135

Ala

Arg

Ala

Ala 140

Ala

Pro

Ser 145

Pro

Ser

Pro

Ala 150

Ser

Arg

Gly

Cys

Ala 155

Arg

Ala

His

Cys

Ala

Leu

Arg

Pro

Leu 165

Arg

Leu

Arg

Ser 170

Leu

Arg

Trp

Pro

Val 175

Ala

Gly

Cy3 180

Ser

Ala

Thr

Val

Pro 185

Gly

Thr

Arg

Val

Ser 190

Ala

Gin

Arg

Ser 195

Arg

Gin

Gly

Arg

Gly 200

Ala

Gin

Gly

Ala

Arg 205

Thr

Trp

Val

Cys

Arg

Pro

Ser

Arg

Leu

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Arg

210 215 220

Arg Arg Ala Ala Gly Arg Cys Arg Gin Arg Asn Arg Arg Arg Arg 225 230 235

Lys Leu Trp Arg Pro Lys Gly Ala Ser Gly Thr Ala Pro Pro Gly 245 250 255

Ser Pro Gly His Ala Ser 260 <210> 4 <211> 1830 <212> DNA ^<213> Człowiek

Leu

Ala

Ser

Gly

Ala

160

Ala

Gly

Ala

Ser

Gly

240

Asn

PL 209 127 B1 <400> 4 gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc 60 gcagatttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgtccgggg gatgggctag 120 ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgatcg cgccgagggg gagggccgaa 180 gcgtggcggg agggcgaggc gaaggaagga gggcgtgaga aaggcgacgg cggcggcgcg 240 gaggagggtt atctatacat ttaaaaacca gccgcctgcg ccgcgcctgc ggagacctgg 300 gagagtccgg ccgcacgcgc gggacacgag cgtcccacgc tccctggcgc gtacggcctg 360 ccaccactag gcctcctatc cccgggctcc agacgaccta ggacgcgtgc cctggggagt 420 tgcctggcgg cgccgtgcca gaagccccct tggggcgcca cagttttccc cgtcgcctcc 480 ggttcctctg cctgcacctt cctgcggcgc gccgggacct ggagcgggcg ggtggatgca 540 ggcgcgatgg acggcggcac actgcccagg tccgcgcccc ctgcgccccc cgtccctgtc 600 ggctgcgctg cccggcggag acccgcgtcc ccggaactgt tgcgctgcag ccggcggcgg 660 cgaccggcca ccgcagagac cggaggcggc gcagcggccg tagcgcggcg caatgagcgc 720 gagcgcaacc gcgtgaagct ggtgaacttg ggcttccagg cgctgcggca gcacgtgccg 780 cacggcggcg ccagcaagaa gctgagcaag gtggagacgc tgcgctcagc cgtggagtac 840 atccgcgcgc tgcagcgcct gctggccgag cacgacgccg tgcgcaacgc gctggcggga 900 gggctgaggc cgcaggccgt gcggccgtct gcgccccgcg ggccgccagg gaccaccccg 960 gtcgccgcct cgccctcccg cgcttcttcg tccccgggcc gcgggggcag ctcggagccc 1020 ggctccccgc gttccgccta ctcgtcggac gacagcggct gcgaaggcgc gctgagtcct 1080 gcggagcgcg agctactcga cttctccagc tggttagggg gctactgagc gccctcgacc 1140 taataagcct caagccccgg aaacccgagc gaacgggccg gcgcgcttca tcgccgggga 1200 agcccgccaa ggtggaccgg gcccgcgctc cgcccccagc gagccgggga cccacccacc 1260 accccccgca ccgccgacgc cgcctcgttc gtccggccca gcctgaccaa tgccgcggtg 1320 gaaacgggct tggagctggc cccataaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc 1380 cacagcttct cgactgcagt ggggcggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg 1440 gagaggattt tctaagggca cagagaatcc attttctaca cattaacttg agctgctgga 1500 gggacactgc tggcaaacgg agacctattt ttgtacaaag aacccttgac ctggggcgta 1560 ataaagatga cctggacccc tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct 1620 ggacacgagc agtccctgag gggcggggtc cctggcgtga ggcccccgtg acagcccacc 1680 ctggggtggg tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcctgtgtg gggcacacct 1740 cttcaaggga gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaccgagg gggggcccgg agccaacaaa 1830 <210> 5 <211> 587 <212> DNA <213> Człowiek <400> 5 ggtaaacaga actgatttat ttataaagtt cacgctccct tgaagaggtg tgccccacac 60 aggcttctcc ctagcagagc agcagtgccc acaaacccac cccagggtgg gctgtcacgg 120 gggcctcacg ccagggaccc cgcccctcag ggactgctcg tgtccagatc ttggccagca 180 tggaaaactc cagatagtgg gggcaggggt ccaggtcatc tttattacgc cccaggtcaa 240 gggttctttg tacaaaaata ggtctccgtt tgccagcagt gtccctccag cagctcaagt 300 taatgtgtag aaaatggatt ctctgtgccc ttagaaaatc ctctcccctc cggaaaaatc 360 tccaagtgtt ggtgcccccc gccccactgc agtcgagaag ctgtggggag gggcggcgtc 420 ggaggaagcc gcagcccatt atggggccag ctccaagccc gtttccaccg cggcattggt 480 caggctgggc ggacgaacga ggcggcgtcg gcggtgcggg gggtggtggg tgggtccccg 540 gctcgctggg ggcggagcag cgggccggtc cacctggcgg gctcccc 537 <210> 6 <211> 1791 <212> DNA <213> Człowiek <400> 6 tttttttttt ttttttttta aacagaactg atttatttat aaagttcacg ctcccttgaa 60 gaggtgtgcc ccacacaggc ttctccctag cagagcagca gtgcccacaa acccacccca 120 gggtgggctg tcacgggggc ctcacgccag ggaccccgcc cctcagggac tgctcgtgtc 180 cagatcttgg ccagcatgga aaactccaga tagtgggggc aggggtccag gtcatcttta 240 ttacgcccca ggtcaagggt tctttgtaca aaaataggtc tccgtttgcc agcagtgtcc 300 ctccagcagc tcaagttaat gtgtagaaaa tggattctct gtgcccttag aaaatcctct 360 cccctccgga aaaatctcca agtgttggtg ccccccgccc cactgcagtc gagaagctgt 420 ggggaggggc ggcgtcggag gaagccgcca gcccttatgg ggccagctcc aagcccgttt 480 ccaccgcggc attggtcagg ctgggccgga cgaacgaggc ggcgtcggcg gtgcgggggg 540

PL 209 127 B1 tggtgggtgg gtccccggct cgctgggggc ggagcgcggg ccggtccacc tggcgggctc 600 cccggcgatg agcgcgccgg ccgctcgctc ggcttccggg gctgaggctc ataggtcgag 660 ggcgctcagt agccccctaa ccagctggag aagtcgagta gctcgcgctc cgcaggactc 720 agcgcgcctt cgcagccgct gtcgtccgac gagtaggcgg aacgcgggga gccgggctcc 730 gagctgcccc cgcggcccgg ggacgaagaa gcgcgggagg gcgaggcggc gaccggggtg 840 gtccctggcg gcccgcgggg cgcagacggc cgcacggcct gcggcctcag ccctcccgcc 900 agcgcgttgc gcacggcgtc gtgctcggcc agcaggcgct gcagcgcgcg gatgtactcc 960 acggctgagc gcagcgtctc caccttgctc agcttcttgc tggcgccgcc gtgcggcacg 1020 tgctgccgca gcgcctggaa gcccaagttc accagcttca cgcggttgcg ctcgcgctca 1080 ttgcgccgcg ctacggccgc tgcgccgcct ccggtctctg cggtggccgg tcgccgccgc 1140 cggctgcagc gcaacagttc cggggacgcg ggtctccgcc gggcagcgca gccgacaggg 1200 acggggggcg cagggggcgc ggacctgggc agtgtgccgc cgtccatcgc gcctgcatcc 1260 acccgcccgc tccaggtccc ggcgcgccgc aggaaggtgc aggcagagga accggaggcg 1320 acggggaaaa ctgtggcgcc ccaagggggc ttctggcacg gcgccgccag gcaactcccc 1380 agggcacgcg tcctaggtcg tctggagccc ggggatagga ggcctagtgg tggcaggccg 1440 tacgcgccag ggagcgtggg acgctcgtgt cccgcgcgtg cggccggact ctcccaggtc 1500 tccgcaggcg cggcgcaggc ggctggtttt taaatgtata gataaccctc ctccgcgccg 1560 ccgccgtcgc ctttctcacg ccctccttcc ttcgcctcgc cctcccgcca cgcttcgccc 1620 tccccctcgc gcgatcacat tctgtaaggc ccaaagcgtg cgcatgtccc cctagcccat 1680 cccccggacg cagtccacag atccccagtg cgcccaactg gcgaaatctg cgagttcccg 1740 gtgcgccccc tgctcccggc aggtacttag tgcgccccca aagcaaggta c 1791 <210> 7 <211> 361 <212> PRT <213> Człowiek

	<400>	7
Met 1	Cys	Arg	Lys	Trp 5	Ile
Arg	Lys	Asn	Leu 20	Gin	Val
Ser	Cys	Gly 35	Glu	Gly	Arg
Pro	Ala 50	Pro	Ser	Pro	Phe
Arg 65	Thr	Arg	Arg	Arg	Arg 70
Leu	Ala	Gly	Gly	Gly 85	Ala
Gly	Asp	Glu	Ala 100	Arg	Arg
Leu	Ile	Arg 115	Ser	Arg	Ala
Arg	Val 130	Ala	Arg	Ala	Pro
Arg 145	Pro	Thr	Ser	Arg	Arg 150
Arg	Gly	Pro	Gly	Thr 165	Lys
Trp	Ser	Leu	Ala 180	Ala	Arg
Ser	Ala	Leu 195	Pro	Pro	Ala
Gly	Ala 210	Ala	Ala	Arg	Gly
Pro 225	Cys	Ser	Ala	Ser	Cys 230
Ala	Pro	Gly	Ser	Pro 245	Ser
His	Cys	Ala	Ala 260	Leu	Arg
Pro	Val	Ala 275	Ala	Ala	Gly
Ser	Ala 290	Gly	Gin	Arg	Ser

Leu	Cys	Ala	Leu 10	Arg	Lys
Leu	val	Pro 25	Pro	Ala	Pro
Arg	Arg 40	Arg	Lys	Pro	Pro
Pro 55	Pro	Arg	His	Trp	Ser 60
Arg	Cys	Gly	Gly	Trp 75	Trp
Arg	Ala	Arg	Ser 90	Thr	Leu
Pro	Val	Arg 105	Ser	Gly	Phe
Leu	Ser 120	Ser	Pro	Leu	Thr
Gin 135	Asp	Ser	Ala	Arg	Leu 140
Asn	Ala	Gly	Ser	Arg 155	Ala
Lys	Arg	Gly	Arg 170	Ala	Arg
Gly	Ala	Gin 185	Thr	Ala	Ala
Arg	Cys 200	Ala	Arg	Arg	Arg
Cys 215	Thr	Pro	Arg	Leu	Ser 220
Trp	Arg	Arg	Arg	Ala 235	Ala
Ser	Pro	Ala	Ser 250	Arg	Gly
Pro	Leu	Arg 265	Arg	Leu	Arg
Cys	Ser 280	Ala	Thr	Val	Pro
Arg 295	Gin	Gly	Arg	Gly	Ala 300

Ser	Ser	Pro 15	Leu
Leu	Gin 30	Ser	Arg
Ala 45	Leu	Met	Gly
Gly	Trp	Ala	Gly
Val	Gly	Pro	Arg 80
Ala	Gly	Phe 95	Pro
Arg	Gly 110	Leu	Arg
Ser 125	Trp	Arg	Ser
Arg	Ser	Arg	Cys
Pro	Ser	Cys	Pro 160
Arg	Arg	Pro 175	Gly
Arg	Pro 190	Ala	Ala
Ala 205	Arg	Pro	Ala
Ala	Ala	Ser	Pro
Arg	Ala	Ala	Ala 240
Cys	Ala	Arg 255	Ala
Ser	Leu 270	Arg	Trp
Gly 285	Thr	Arg	Val
Gin	Gly	Ala	Arg

PL 209 127 B1

Thr Trp Ala Val Cys Arg Arg Pro Ser Arg Leu His Pro Pro Ala Arg

305 310 . 315 320

Ser Arg Ser Arg Arg Ala Ala Gly Arg Cys Arg Gin Arg Asn Arg Arg

32S 330 335

Arg Arg Gly Lys Leu Trp Arg Pro Lys Gly Ala Ser Gly Thr Ala Pro

340 345 350

Pro Gly Asn Ser Pro Gly His Ala Ser

355 360 <210> 8 <211> 849 <212> DNA <213> Wirusy grypy i człowiek <400> 8 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagaccag aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc atggacggcg gcacactgcc caggtccgcg ccccctgcgc cccccgtccc tgtcggctgc gctgcccggc ggagacccgc gtccccggaa ctgttgcgct gcagccggcg gcggcgaccg gccaccgcag agaccggagg cggcgcagcg gccgtagcgc ggcgcaatga gcgcgagcgc aaccgcgtga agctggtgaa cttgggcttc caggcgctgc ggcagcacgt gccgcacggc ggcgccagca agaagctgag caaggrggag acgctgcgct cagccgtgga gtacatccgc gcgctgcagc gcctgctggc cgagcacgac gccgtgcgca acgcgctggc gggagggctg aggccgcagg ccgtgcggcc gtctgcgccc cgcgggccgc cagggaccac cccggtcgcc gcctcgccct cccgcgcttc ttcgtccccg ggccgcgggg gcagctcgga gcccggctcc ccgcgttccg cctactcgtc ggacgacagc ggctgcgaag gcgcgctgag tcctgcggag cgcgagctac tcgacttctc cagctggtta gggggctaca ctagtggcca ccatcaccat caccattaa <210> 9 <211> 849 <212> DNA <213> Wirusy grypy i człowiek <400> 9 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc atggacggcg gcaccctgcc gcgttccgcg ccgccggcgc cgccagttcc ggttggctgc gctgcccgtc gccgtcccgc gtccccggaa ctgctgcgct gcagccgtcg ccgtcgcccg gccaccgcag agaccggagg cggcgcagcg gccgtagcgc ggcgcaatga gcgcgagcgc aaccgcgtga agctggtgaa cttgggcttc caggcgctgc ggcagcacgt gccgcacggc ggcgccagca agaagctgag caaggtggag acgctgcgct cagccgtgga gtacatccgc gcgctgcagc gcctgctggc cgagcacgac gccgtgcgca acgcgctggc gggagggctg aggccgcagg ccgtgcggcc gtctgcgccc cgcgggccgc cagggaccac cccggtcgcc gcctcgccct cccgcgcttc ttcgtccccg ggccgcgggg gcagctcgga gcccggctcc ccgcgttccg cctactcgtc ggacgacagc ggctgcgaag gcgcgctgag tcctgcggag cgcgagctac tcgacttctc cagctggtta gggggctaca ctagtggcca ccatcaccat caccattaa <210> 10 <211> 282 <212> PRT <213> Wirusy grypy i człowiek

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

849

120 180 240 300 360 4 20 480 540 600 660 720 780 840 849 <400> 10

Met

Asp

Pro

Asn

Thr

Val

Ser

Phe

Gin

Val

Asp

Cys

Phe

Leu

Trp

1

5

10

15

His

Val

Arg

Lys

Arg

Val

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Gły

Ser

35

40

45

Thr

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Glu

Thr

Ala

Thr

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

PL 209 127 B1

	50	55	60
Val 65	Glu Arg Ile Leu	Lys Glu 70	Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 75 80
Met	Asp Gly Gly Thr 85	Leu Pro	Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val 90 95
Pro	Val Gly Cys Ala 100	Ala Arg	Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu 105 110
Arg	Cys Ser Arg Arg 115	Arg Arg	Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 120 125
Ala	Ala Ala Val Ala 130	Arg Arg 135	Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys 140
Leu 145	Val Asn Leu Gly	Phe Gin 150	Ala Leu Arg Gin His Val Pro His Gly 155 160
Gly	Ala Ser Lys Lys 165	Leu Ser	Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val 170 175
Glu	Tyr Ile Arg Ala 180	Leu Gin	Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 185 190
Arg	Asn Ala Leu Ala 195	Gly Gly	Leu Arg Pro Gin Ala Val Arg Pro Ser 200 205
Ala	Pro Arg Gly Pro 210	Pro Gly 215	Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser 220
Arg 225	Ala Ser Ser Ser	Pro Gly 230	Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser 235 240
Pro	Arg Ser Ala Tyr 245	Ser Ser	Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu 250 255
Ser Tyr	Pro Ala Glu Arg Glu Leu 260 Thr Ser Gly His His His 275 <210> 11 <211> 193 <212> PRT <213> Człowiek <400> 11	Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly 265 270 His His His 280
Met 1	Tyr Ser Thr Ala 5	Glu Arg	Ser Val Ser Thr Leu Leu Ser Phe Leu 10 15
Leu	Ala Pro Pro Cys 20	Gly Thr	Cys Cys Arg Ser Ala Trp Lys Pro Lys 25 30
Phe	Thr Ser Phe Thr 35	Arg Leu	Arg Ser Arg Ser Leu Arg Arg Ala Thr 40 45
Ala	Ala Ala Pro Pro 50	Pro Val 55	Ser Ala Val Ala Gly Arg Arg Arg Arg 60
Leu 65	Gin Arg Asn Ser	Ser Gly 70	Asp Ala Gly Leu Arg Arg Ala Ala Gin 75 30
Pro	Thr Gly Thr Gly 85	Gly Ala	Gly Gly Ala Asp Leu Gly Ser Val Pro 90 95
Pro	Ser Ile Ala Pro 100	Ala Ser	Thr Arg Pro Leu Gin Val Pro Ala Arg 105 110
Arg	Arg Lys Val Gin 115	Ala Glu	Glu Pro Glu Ala Thr Gly Lys Thr Val 120 125
Ala	Pro Gin Gly Gly 130	Phe Trp 135	His Gly Ala Ala Arg Gin Leu Pro Arg 140
Ala 145	Arg Val Leu Gly	Arg Leu 150	Glu Pro Gly Asp Arg Arg Pro Ser Gly 155 160
Gly	Arg Pro Tyr Ala 165	Pro Gly	Ser Val Gly Arg Ser Cys Pro Ala Arg 170 175
Ala	Ala Gly Leu Ser	Gin Val	Ser Ala Gly Ala Ala Gin Ala Ala Gly

180 185 190

Phe <210> 12 <211> 263 <212> PRT

PL 209 127 B1

<213>

Mysz

<400>

12

Met

Glu

Ala

His

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gly

Val

Pro

Gly

Leu

Gin

Glu

Ala

1

5

10

15

Ser

Asp

Ala

Cys

Pro

Arg

Glu

Ser

Cys

Ser

Ala

Leu

Pro

Glu

Ala

20

25

30

Arg

Glu

Gly

Ala

Asn

Val

His

Phe

Pro

His

Pro

Val

Pro

Arg

Glu

35

40

45

His

Phe

Ser

Cys

Ala

Pro

Glu

Leu

Val

Ala

Gly

Ala

Gin

Gly

Leu

50

55

60

Asn

Ala

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Leu

Pro

Arg

Leu

Met

Pro

Thr

65

70

75

80

Ser

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

Cys

Ala

Arg

Gin

Ala

Ser

85

90

95

Pro

Glu

Leu

Arg

Cys

Ser

Arg

Ser

Gly

Ala

Thr

Glu

100

105

110

Ala

Ser

Ala

Val

Ala

Arg

Asn

Glu

Arg

Glu

Arg

115

120

125

Asn

Arg

Val

Lys

Leu

Val

Asn

Leu

Gly

Phe

Gin

Ala

Leu

Arg

Gin

His

130

135

140

Val

Pro

His

Gly

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Lys

Val

Glu

Thr

Leu

145

150

155

160

Arg

Ser

Ala

Val

Glu

Tyr

Ile

Arg

Ala

Leu

Gin

Arg

Leu

Ala

Glu

165

170

175

His

Asp

Ala

Val

Arg

Ala

Leu

Ala

Gly

Leu

Thr

Pro

Ala

180

185

190

Thr

Pro

Ser

Asp

Glu

Cys

Ala

Gin

Pro

Ser

Ala

Ser

Pro

Ala

Ser

195

200

205

Ala

Ser

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Asp

Arg

Leu

Gly

210

215

220

Cys

Ser

Glu

Pro

Thr

Ser

Pro

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ser

225

230

235

240

Ser

Cys

Glu

Gly

Glu

Leu

Ser

Pro

Met

Glu

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

245

250

255

Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 260 <210> 13 <211> 1051 <212> DNA <213> Mysz <400> 13 gcccggagca tggaagcacg tcagctaggc catgaactgc acccgggagg ggtgggggtg 60 gaagcgcacg gtgtcagctt tgcagaatgt gtacaccaag gggagggcga ggcgaaggaa 120 ggagggcgta agaaaggagg cggtggcggg gcggaggaga ttatctatac tttttaaaaa 190 aaaggagcct cttagccgcg taaaggagac ttggggagcg cctgacagca cgcgcgggac 240 acgagagtac cacgcttccc tactcttttc agaccttgac tggtacgggg tcccaggact 300 gcaggaggcc agcgacgcgt gccctaggga gtcctgcagc agtgccctgc ctgaggcccg 360 tgaaggtgca aacgtccact tcccaccgca cccggttcct cgcgagcact tttcctgtgc 420 cgcaccagaa ctcgtagcag gggcccaggg gctgaatgca agcttgatgg acggcggcgc 480 gctgcccaga ctcatgccca cctcgtctgg agtcgctgga gcctgcgctg ctcggcggag 540 acaagcgtct ccggaattgc tgcgctgcag ccggcggcgg cgatctggag caaccgaggc 600 cagcagcagc tcggcgtccg tggcacgccg caatgagcgc gagcgcaacc gcgtaaagct 660 ggtaaacttg ggcttccagg cgctgcggca gcacgtgccg cacggcggcg ccaacaagaa 720 gctgagtaag gtggagacgc tgcgctccgc ggtagagtac attcgtgcgc tgcagcggct 780 gctcgcagag cacgacacgg tgcggccggn gctcgctggg gggctgttaa cacccgctac 840 tccgccgtcc gatgagtgca cgcagccctc tgcctcccct gccagcgggt ctctgtcctg 900 cgcctctacg tctccgtccc ggaccctggg ctgctctgag cctacctccc cgcgctccgc 960 ctactcgtcg gaggaaagca gctgcgaggg agagetaagc ccgatggagc aggagctgct 1020 tgacttttcc agttggttag ggggctactg a 1051 <210> 14 <211> 260 <212> PRT

PL 209 127 B1 ^<213> Szczur

<400>

14

Met

Glu

Ser

His

Phe

Asn

Trp

Tyr

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Gin

Lys

Ala

1

5

10

15

Ser

Asp

Ala

Cys

Pro

Arg

Glu

Ser

Cys

Ser

Ala

Leu

Pro

Glu

Ala

20

25

30

Arg

Glu

Gly

Ala

Asn

Val

His

Phe

Pro

His

Pro

Val

Pro

Arg

Glu

35

40

45

His

Phe

Ser

Cys

Gly

Ala

Pro

Lys

Pro

Val

Ala

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

50

55

60

Asn

Ala

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Leu

Pro

Arg

Leu

Val

Pro

Thr

65

70

75

80

Ser

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

Cys

Thr

Ala

Arg

Pro

Ser

85

90

95

Pro

Glu

Leu

Arg

Cys

Ser

Arg

Ser

Gly

Ala

Thr

Glu

100

105

110

Ala

Ser

Ala

Val

Ala

Arg

Asn

Glu

Arg

Glu

Arg

115

120

125

Asn

Arg

Val

Lys

Leu

Val

Asn

Leu

Gly

Phe

Gin

Ala

Leu

Arg

Gin

His

130

135

140

Val

Pro

His

Gly

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Lys

Val

Glu

Thr

Leu

145

150

155

160

Arg

Ser

Ala

Val

Glu

Tyr

Ile

Arg

Ala

Leu

Gin

Arg

Leu

Ala

Glu

165

170

175

His

Asp

Ala

Val

Arg

Ala

Leu

Ser

Gly

Leu

Thr

Pro

Ala

180

185

190

Thr

Arg

Pro

Ser

Asp

Val

Cys

Thr

Gin

Pro

Ser

Ala

Ser

Pro

Ala

Ser

195

200

205

Ala

Ser

Leu

Ser

Cys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Asp

Arg

Leu

Gly

Cys

Ser

210

215

220

Glu

Pro

Ala

Ser

Pro

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Asp

Ser

Cys

225

230

235

240

Glu

Gly

Glu

Thr

Tyr

Pro

Met

Gly

Gin

Met

Phe

Asp

Phe

Ser

Asn

Trp

245

250

255

Leu

Gly Gly

Tyr

260

<210> 15 <211> 1526 <212> DNA <213> Szczur <400> 15 ttcacccggc tgcaagcgct aggtgtacgg agacctggca gctcttgggg cttaaggact 60 gagcrccaga gccggtggag gttcctgtgg agtacattcg gaccctctca cagcccccga 120 gagtgcggga cgtgcggagc gcagttcggg atctgcactc gaggacttgt cgaggacgca 180 ttaagctaag catctgctcg gagcatggaa tcgcacttta actggtacgg ggtcccaagg 240 ctccagaagg ctagcgacgc gtgccctagg gaatcctgca gcagtgccct gcctgaggcc 300 cgtgaaggtg cgaacgtcca cttcccaccg cacccggttc ctcgcgagca cttttcctgt 360 ggcgcaccga aacccgtagc gggggccccg gcgctgaatg caagcttgat ggacggcggc 420 gcgctgccca gactcgtgcc cacctcgtct ggagtcgctg gagcctgcac tgctcggcgg 480 agacccccgt ccccggaact gcttcgctgc agccgacggc ggcgatcggg agcaaccgag 540 gccagcagca gctcggcggc cgtggcacgc cgcaatgagc gtgagcgcaa ccgcgtaaag 600 ctggtaaact tgggcttcca ggcgctgcgg cagcacgtgc cgcacggcgg cgccaacaag 660 aagctgagta aggtggagac gctgcgctcc gcggtagagt acatccgtgc gctgcagcgg 720 ctgctagcag agcacgacgc ggtgcgtgct gcgctctctg ggggtctatt aacacccgct 780 actcggccgt ccgatgtgtg cacgcagccc tccgcctccc ctgccagcgc gtctctgtcc 840 tgcacctcta catccccaga ccgcctaggc tgctccgagc ctgcctctcc gcgctccgcc 900 tactcgtcgg aggacagcag ctgcgaggga gagacttacc cgatggggca gatgtttgac 960 ttttccaatt ggttaggggg ctactgagca ccccacaccc ctaagctgcg tccctgggtg 1020 tcccctggtg gacctacctg cgtttcttgc ccaggaaacc tgggcccatg ccttacccat 1080 gctgtctagt gcagcctgac caaatgccaa gtactgacct ctgctcggcc tccacgccgc 1140 ggaatgacat cttccatctc ccagtccttg ccgaaccagg acttggaaat ttctcaggag 1200 aaagaatttt acaatgacaa tctgcttttt atcaattaac ttgaactgct ggaggactct 1260 gctgaaaata tgaagaatta tttttataca aaggatcctt aagcttggag cacaataaag 1320

PL 209 127 B1 atgacctctg tctctcaccc ccactgtcta gaactttcca acctggccaa agtgtggacg 1380 ggtcgggccc tgagggcaag atgcctggct gcacccttct tcctcttccg aagcctatcc 1440 tgacgctgat gtttggccag tgtgggaacc ctgctattgc aaagtgtact attctataaa 1500 agttgttttt cattggaaag gaattc 1526 <210> 1S <211> 10 <212> PRT <213> Człowiek <400> 16

Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala Leu 1 S 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400> 17

Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400> 18

Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400> 19

Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400> 20

Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Człowiek <400> 21

Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu Leu 1 S 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Człowiek <400> 22

Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu

PL 209 127 B1

1	5	10
	<210>	23
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	23
Ser	Glu Pro	Gly Ser Pro	Arg	Ser	Ala	Tyr
1		5				10
	<210>	24
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	24
Val	Glu Thr	Leu Arg Ser	Ala	Val	Glu	Tyr
1		5				10
	<210>	25
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	25
Ile	Arg Ala	Leu Gin Arg	Leu	Leu	Ala
1		5
	<210>	26
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	26
Leu	Arg Pro	Gin Ala Val	Arg	Pro	Ser
1		5
	<210>	27
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	27
Leu	Arg Gin	His Val Pro	His	Gly	Gly
1		5
	<210>	28
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	28
Leu	Gly Phe	Gin Ala Leu	Arg	Gin	His
1		5
	<210>	29
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Człowiek
	<400>	29
Val	Arg Asn	Ala Leu Ala	Gly	Gly	Leu

5 <210> 30

PL 209 127 B1 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400> 30

Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu Leu 1 5 <210 31 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400 31

Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <40 0 32

Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Człowiek <400 33

Leu Leu Arg Cy3 Ser Arg Arg Arg Arg

Claims

1. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera polipeptyd CASB7439, który zawiera sekwencję aminokwasową o co najmniej 70% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 10 na całej długości odpowiednio SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 10, lub immunogenny fragment CASB7439, przy czym ten fragment zawiera sekwencję aminokwasową jednej lub większej liczby z SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 33 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, który to rak stanowi rak okrężnicy, lub na inne nowotwory związane z okrężnicą, lub inne choroby związane z okrężnicą.

2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera adiuwant indukujący TH-1.

3. Środek farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że jako adiuwant indukujący TH-1 zawiera adiuwant wybrany z grupy adiuwantów obejmującej 3D-MPL, QS21, mieszaninę QS21 i cholesterolu oraz oligonukleotyd CpG lub mieszaniny dwóch lub większej liczby tych adiuwantów.

4. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd kodujący polipeptyd CASB7439 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1, przy czym ten polinukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 9 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, do stosowania w immunoterapeutycznym leczeniu pacjenta cierpiącego lub podatnego na raka, który to rak stanowi rak okrężnicy, lub na inne nowotwory związane z okrężnicą lub inne choroby związane z okrężnicą.

5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że dodatkowo zawiera adiuwant indukujący TH-1.

PL 209 127 B1

6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że jako adiuwant indukujący TH-1 zawiera adiuwant wybrany z grupy adiuwantów obejmującej 3D-MPL, QS21, mieszaninę QS21 i cholesterolu oraz oligonukleotyd CpG lub mieszaniny dwóch lub większej liczby tych adiuwantów.

7. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera komórki prezentujące antygen, zmodyfikowane przez obciążenie in vitro polipeptydem CASB7439 lub jego fragmentem, zdefiniowanymi w zastrz. 1, albo genetycznie zmodyfikowane in vitro tak, aby eksprymowały polipeptyd CASB7439 zdefiniowany w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie skuteczny nośnik.

8. Sposób diagnozowania u pacjenta choroby lub podatności na chorobę lub diagnozowania u pacjenta obecności raka okrężnicy i odbytnicy lub podatności na raka okrężnicy i odbytnicy, związanych z ekspresją lub aktywnością polinukleotydu u pacjenta, znamienny tym, że analizuje się obecność lub ilość tego polinukleotydu w próbce pobranej od tego pacjenta, przy czym ten polinukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej:

9. Sposób diagnozowania u pacjenta choroby lub podatności na chorobę lub diagnozowania u pacjenta obecności raka okrężnicy i odbytnicy lub podatności na raka okrężnicy i odbytnicy, związanych z ekspresją lub aktywnością polipeptydu u pacjenta, znamienny tym, że analizuje się obecność lub ilość tego polipeptydu w próbce pobranej od tego pacjenta, przy czym ten polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową o co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2 na całej długości SEQ ID NO: 2;

(b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2;

(c) polipeptyd zawierający fragment immunogenny polipeptydu SEQ ID NO: 2, przy czym aktywność immunogenna fragmentu immunogennego jest zasadniczo taka sama jak polipeptydu SEQ

ID NO: 2;

PL 209 127 B1

Rysunki

Fis. 1 PCR czasu rzeczywistego z użyciem sondy Taqman

Dopasowane normalne tkanki okrężnicy Normalne tkanki