KR20120014054A - Ｃａｓｂ7439 작제물 - Google Patents

Ｃａｓｂ7439 작제물 Download PDF

Info

Publication number
KR20120014054A
KR20120014054A KR1020117031060A KR20117031060A KR20120014054A KR 20120014054 A KR20120014054 A KR 20120014054A KR 1020117031060 A KR1020117031060 A KR 1020117031060A KR 20117031060 A KR20117031060 A KR 20117031060A KR 20120014054 A KR20120014054 A KR 20120014054A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
arg
leu
ser
pro
Prior art date
Application number
KR1020117031060A
Other languages
English (en)
Inventor
노르만드 블라이스
마르틴 하르베이
앤써니 필로게트
클레멘트 리욱스
Original Assignee
글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. filed Critical 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Publication of KR20120014054A publication Critical patent/KR20120014054A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Abstract

본 발명은 CASB7439 폴리펩티드의 재조합 생성을 증가시키기 위한 화합물 및 방법, 및 이들을 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＣＡＳＢ7439 작제물{CASB7439 CONSTRUCTS}
포유류 아캐트-스큐트(Achaete-Scute) 상동체(homolog)는 드로소필라(Drosophila) 아캐트-스큐트 복합체의 보존된 포유류 동족체이다. 이들은 발생에 필수적인 계통 특이적 전사 인자로서 기능하는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH 또는 HLH) 유전자 패밀리의 구성원이다. 상기 패밀리의 하나의 뮤린(murine) 구성원인, MASH2는 태반의 발생에 필수적이나 적절한 배아의 발생에 중요하지 않다. MASH2 유전자의 인간 오솔로그(ortholog)인 HASH2는 알더스(Alders) 등에 의해 1997년에 클로닝되었다(저자에 의해 "ASCL2"로 명명됨)(문헌[Alders et al. (1997) Hum. Molec. Genet. 6: 859-867]).
WO01/62778호에 기재된 바와 같이, 발현 연구로, HASH2 전사체(상기 문헌에 CASB7439로 명명됨)가 인접한 정상 결장 및 다른 시험한 정상 조직에 비해 대장(colorectal) 종양에서 과발현되는 것이 드러났다. 이러한 유전자는 I기 내지 IV기 선암종 환자에서 과발현된다. 따라서, 상기 단백질은 예를 들어, 항원 특이적 암 면역치료제(ASCI)로서 재조합 CASB7439를 사용함으로써, 대상체의 암을 개선시키기 위한 면역치료 방법에 유용한 암 항원인 것으로 여겨질 수 있다.
발명의 요약
CASB7439 폴리펩티드의 재조합 생성을 증가시키기 위한 화합물 및 그 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드뿐 아니라 그러한 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물이 제공된다. 상기 변형된 CASB7439 폴리펩티드는 증가된 CASB7439의 생성을 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 또한, 본 출원인들은 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 특정 태양에서, 본 출원인들은 다음과 같이, 아미노산(aa) 서열을 갖는 단백질 작제물 및 이들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(DNA)을 개시한다:
■ LVL055[서열 번호 1(aa); 서열 번호 2(DNA)];
■ LVL111[서열 번호 3(aa); 서열 번호 4(DNA)];
■ LVL137[서열 번호 5(aa); 서열 번호 6(DNA)];
■ LVL141[서열 번호 7(aa); 서열 번호 8(DNA)];
■ LVL144[서열 번호 9(aa); 서열 번호 10(DNA)]; 및
■ LVL168[서열 번호 11(aa); 서열 번호 12(DNA)].
단백질 작제물의 생성을 위한 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 사용하는 방법 및 과정도 또한 개시된다.
또한, 본 출원인들은 면역원성(immunogenic) 조성물을 개시하며, 이들 조성물은 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 작제물 중 하나 이상, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하며, 여기서, 상기 담체 또는 부형제는 임의로 완충액을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대장암 치료용 약제의 제조에서의, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 단백질 작제물 - 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자 - 의 용도가 개시된다. 일부 실시형태에서, 치료법, 특히 대장암 치료법에서 사용하기 위한 본 명세서에서 기재된 바와 같은 단백질 작제물이 개시된다. 일부 실시형태에서, 대장암 대상체에서 CASB7439에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 개시되며, 이 방법은 (a) 대장암 대상체를 선택하는 단계; 및 (b) 본 명세서에서 기재된 바와 같은 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 작제물, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 담체 또는 부형제는 임의로 완충액을 포함할 수 있다.
도 1/35. 이 도면은 CASB7439 폴리펩티드의 다양한 영역, 특히, DNA 특이적(DNA 결합) 도메인, bHLH 도메인 및 프롤린-풍부 영역을 도시하는 개략도를 나타낸 것이다. 상세사항에 대해서는 실시예 2를 참조하길 바란다. 또한, 개략도는 다음의 영역을 나타낸다: 핵 표적화(회색 화살표); 알파 헬리컬(회색 원통형); 코일드-코일(coiled-coil)(흑색 원통형); 내재적 장애(흑색 화살표); 및 낮은 복잡성(회색 박스형).
도 2/35. 이 도면은 완전한 CASB7439 폴리펩티드와 함께 정렬된 CASB7439 폴리펩티드(흑색 화살표)의 다양한 절단형(truncate)을 도시한 개략도를 나타낸 것이다. 상세사항에 대해서는 실시예 4를 참조하길 바란다.
도 3/35. 이 도면은 프롤린 풍부 영역, 및 동정되고 예측된 에피토프의 대략의 위치를 보여주는 CASB7439의 개략도를 나타낸 것이다. 다양한 실시형태는 프롤린-풍부 영역 내의 아미노산 중 일부 또는 모두의 제거에 의해 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변형된 CASB7439 폴리펩티드는 CASB7439 폴리펩티드 내에 높은 비중의 에피토프를 보유한다.
도 4/35. 변형되지 않은 CASB7439 폴리펩티드(서열 번호 13)의 서열과 CASB7439 폴리펩티드에 대한 2개의 가능한 변형으로부터 야기된 폴리펩티드 서열 간의 정렬을 나타냈다: 제1의 변형에는 21개의 연속 아미노산 잔기(133 내지 153)가 결실되고; 제2의 변형에는 21개의 연속 아미노산 잔기(131 내지 151)가 결실됨. 추가로, 21개의 연속 아미노산 잔기(132 내지 152)가 결실된 CASB7439 폴리펩티드에 대한 제3의 변형이 계획될 수 있다. 도면에 나타낸 바와 같이, 결실 영역 내의 생성되는 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열(삽도, 원형)은 모든 3개의 변형에 대하여 동일하다. 이는 서열 번호 13의 위치 131-132 및 152-153에서 반복된 RG 아미노산 잔기 때문이다.
도 5/35. 이 도면은 실시예 6의 단백질 작제물 간의 아미노산 서열 정렬을 나타낸 것이다. CASB7439 = HASH2 아미노산 서열(서열 번호 13); LVL088(서열 번호 27); LVL111(서열 번호 3); LVL137(서열 번호 5); LVL138(서열 번호 33); LVL168(서열 번호 11).
도 6/35. 이 도면은 HASH2(CASB7439) 아미노산 서열(서열 번호 13)과 하기의 단백질 작제물 간의 정렬을 제시한 것이다: LVL168(서열 번호 11); pD1/3(서열 번호 39); 및 LVL144(서열 번호 9).
도 7/35. 정상(12) 및 대장암(83) 조직에서 CASB7439 mRNA 발현의 리얼-타임(real-time) qPCR 분석. 실시예 9를 참조하길 바란다.
도 8/35. 다양한 인간 대장(CRC) 샘플에서 CASB7439 mRNA와 단백질 발현 간의 상응성. ●(흑색 원)는 결장암 샘플에서의 CASB7439 mRNA 발현을 나타내는 한편, ○(개방 원)는 정상 인접 조직에서의 CASB7439 mRNA 발현을 나타낸다. 면역형광법에 의해 검출된 CASB7439 단백질의 상응하는 수준이 각각의 샘플 위에 나타나 있다(- 발현 없음, +/- 매우 낮은 발현, + 낮은 발현, ++ 강력한 발현 및 +++ 매우 강력한 발현). CRC: 원발성 종양, METS: 전이, NAT: 정상 인접 조직. 점액 암종(mucinous carcinoma)인 샘플 22440 및 24762를 제외하고, 모든 샘플은 결장 선암종이다. 실시예 9를 참조하길 바란다.
도 9/35: 다양한 CASB7439 작제물로의 면역화 후에, 비장세포 재자극에 사용된 전체 CASB7439 단백질 서열을 포괄하는 펩티드의 은행이 이 표에 기재되어 있다. 실시예 10을 참조하길 바란다.
도 10/35. T-세포 면역원성 조사에 사용된 CASB7439 펩티드 매트릭스가 나타나 있다. 실시예 10을 참조하길 바란다.
도 11/35. CD4 반응을 CASB7439 중첩 펩티드(풀, 매트릭스 방법)를 사용한 재자극 이후에 LVL111 + AS01B로 면역화된 근교배(inbred) 마우스의 4개의 스트레인(C57BL6, BALBC, CB6F1 및 C3H)에서 이중 양성(IFNγ/TNFα) CD4 T-세포 백분율로 나타내었다. 실시예 10, 근교배 마우스 멀티스트레인(multistrain) 비교 실험을 참조하길 바란다.
도 12/35. CASB7439 중첩 펩티드(풀, 매트릭스 방법)를 사용한 재자극 이후에 LVL111 + AS15로 면역화된 근교배 마우스의 4개의 스트레인에서의 이중 양성(IFNγ/TNFα) CD4 T-세포 백분율로 나타낸 CD4 반응. 실시예 10, 근교배 마우스 멀티스트레인 비교 실험을 참조하길 바란다.
도 13/35. 이전의 단락에서 논의된 4개의 근교배 마우스 스트레인에서의 CD4 면역원성 CASB7439 펩티드의 동정. 밝은 회색 = 0.2-0.4 % 이중 양성(IFNγ/TNFα) CD4 T-세포; 암회색 0.5% 이상의 이중 양성(IFNγ/TNFα) CD4 T-세포. 실시예 10, 근교배 마우스 멀티스트레인 비교 실험을 참조하길 바란다.
도 14/35. 이계교배(outbred) CD1 마우스에서의 CD4 면역원성 CASB7439 펩티드의 동정(AS01B 상측 패널; AS15 하측 패널). 밝은 회색 = 0.2-0.4 % 이중 양성(IFNγ/TNFα) CD4 T-세포; 암회색 0.5% 이상의 이중 양성(IFNγ/TNFα) T-CD4 세포. 실시예 10, 마우스의 CASB7439의 면역원성: 이계교배된 마우스의 CASB7439 T-세포 면역원성을 참조하길 바란다.
도 15/35. CASB7439 중첩 펩티드(면역우성(immunodominant) 펩티드의 풀)를 사용한 재자극 이후에 AS15와 함께 제형화된 LVL111, LVL168 또는 LVL144로 면역화된 개별 CD1 이계교배 마우스에서 이중 양성(IFNγ/TNFα) 백분율로 나타낸 CD4 및 CD8 T-세포 반응. 실시예 10, 이계교배된 마우스의 LVL111, LVL168 및 LVL144의 연구를 참조하길 바란다.
도 16/35. CASB7439 중첩 펩티드(7개 펩티드/풀의 7개의 풀 + 펩티드 24(서열 번호 76))로의 재자극 후에, AS15와 함께 제형화된 LVL168(서열 번호 11) 또는 LVL144(서열 번호 9) 중 어느 하나로 면역화된 HLA A2.1/DR-1 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 풀링된 말초 혈액 백혈구(PBL)에서의 CD4 T-세포 반응(이중 양성(IFNγ/TNFα) 백분율로 나타냄).
도 17/35. CASB7439 중첩 펩티드(7개 펩티드의 7개의 풀 + 펩티드 24(서열 번호 76))로의 재자극 후에, AS15와 함께 제형화된 LVL168(서열 번호 11) 또는 LVL144(서열 번호 9) 중 어느 하나로 면역화된 HLA A2.1/DR-1 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 풀링된 PBL에서의 CD8 T-세포 반응(이중 양성(IFNγ/TNFα) 백분율로 나타냄).
도 18/35. CASB7439 중첩 펩티드(7개 펩티드의 7개의 풀 + 펩티드 24(서열 번호 76))로의 재자극 후에, AS15와 함께 제형화된 LVL168(서열 번호 11) 또는 LVL144(서열 번호 9) 중 어느 하나로 면역화된 HLA A2.1/DR-1 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 비장세포에서의 CD4 T-세포 반응(이중 양성(IFNγ/TNFα) 백분율로 나타냄).
도 19/35. CASB7439 중첩 펩티드(7개 펩티드의 7개의 풀 + 펩티드 24(서열 번호 76))로의 재자극 후에, AS15와 함께 제형화된 LVL168(서열 번호 11) 또는 LVL144(서열 번호 9) 중 어느 하나로 면역화된 HLA A2.1/DR-1 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 비장세포에서의 CD8 T-세포 반응(이중 양성(IFNγ/TNFα) 백분율로 나타냄).
도 20/35. CB6f1 근교배 마우스에서 LVL111 + AS01B 또는 LVL111 + AS15 면역화 시에 촉발되는 CASB7439-특이적 항체 반응(IgG1 및 IgG2a)의 경시적 분석. 실시예 10, 마우스에서의 CASB7439의 면역원성: CASB7439-매개된 체액성 반응을 참조하길 바란다.
도 21/35. AS15 애쥬번트(adjuvant)와 함께 제형화된 LVL111, LVL168 또는 LVL144, 또는 단독의 AS15 애쥬번트로의 면역화시에, 근교배 CB6f1 마우스에서의 CASB7439-특이적 체액성 반응(IgG1 및 IgG2a). 실시예 10, 마우스에서의 CASB7439의 면역원성: CASB7439-매개된 체액성 반응을 참조하길 바란다.
도 22/35. AS15 애쥬번트와 함께 제형화된 LVL111, LVL168 또는 LVL144, 또는 단독의 AS15 애쥬번트로 면역화된 CD1 이계교배 마우스에서의 CASB7439-특이적 체액성 면역 반응(IgG 역가); 나이브(naive) 마우스를 대조군으로 사용하였다. 실시예 10, CD1 마우스 연구를 참조하길 바란다.
도 23/35. AS01B(상측) 또는 AS15(하측)와 함께 제형화한 LVL111로 면역화된 CB6f1 마우스에서의 TC1/CASB7439 #14 종양 이식. 실시예 11, 연구 #1.1을 참조하길 바란다. 상측 패널에서, 상측에서 하측으로 그래프 상의 곡선의 순서는 '완충액', LVL111(10 ㎍), LVL111(10 ㎍) + AS01B 및 LVL111(1 ㎍) + ASO1 B이다. 하측 패널에서, 하측에 있는 곡선은 LVL111(1O ㎍) + AS15이다.
도 24/35. 실시예 11, 연구 #1.2로부터의 생존 곡선은 상측, 중간 및 하측 패널에 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) 염수 완충액, 애쥬번트 없이 LVL111, 또는 단독의 애쥬번트(AS01 또는 AS15)로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14 세포를 챌린지(challenge)한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL111로 면역화된 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스가 먼저 죽었고, AS01B 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스, AS15 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스 및 완충액 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스로 이어졌다. (중간) 단독의 AS15, 또는 AS15와 함께 제형화된 지시된 용량의 LVL111로 면역화되고 TC1/CASB7439 #14 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. AS15 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스가 먼저 죽었다. 다른 그룹 중에, 30 ㎍ 그룹이 가장 적은 생존자를 가졌으며, 1 ㎍ 그룹, 그 다음 10 ㎍ 그룹으로 이어졌으며, 10 ㎍ 그룹이 가장 많은 생존자를 가졌다. (하측) 단독의 AS01B 또는 AS01B와 함께 제형화된 지정된 용량의 LVL111로 면역화되고 TC1/CASB7439 #14 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. 이 패널에서, 10 ㎍ 및 AS01B 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스가 동시에 죽었다. 1 ㎍ 및 30 ㎍ 그룹은 마지막 날에 동일한 생존 백분율을 가졌다.
도 25/35. 실시예 11, 연구 #1.3으로부터의 생존 곡선이 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 LVL111, LVL144 또는 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스에 대한 생존 곡선. (하측) AS15와 함께 제형화된 LVL111, LVL144 또는 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, MC38/CASB7439 #35 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스에 대한 생존 곡선.
도 26/35. 실시예 11, 연구 #1.4로부터의 생존 곡선이 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 LVL144 또는 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL144로 면역화된 그룹은 아주 조금 더 큰 생존 백분율을 가졌다. (중간) AS15와 함께 제형화된 LVL144 또는 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스에 대한 생존 곡선. LVL144를 접종한 마우스는 약간 더 높은 생존 백분율을 가졌다. (하측) AS15와 함께 제형화된 LVL144 또는 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, MC38/CASB7439 #35 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스에 대한 생존 곡선. LVL144를 접종한 마우스는 생존자가 없었다.
도 27/35. 실시예 11, 연구 #2.1로부터의 생존 곡선이 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 6.25 ㎍의 LVL168 및 10 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 접종한 마우스의 그룹은 약간 더 높은 생존 백분율을 가졌다. (상측 중간) AS15와 함께 제형화된 3.1 ㎍의 LVL168 및 5 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL144를 접종한 마우스의 그룹은 약간 더 높은 생존 백분율을 가졌다. (하측 중간) AS15와 함께 제형화된 1.55 ㎍의 LVL168 및 2.5 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL144를 접종한 마우스의 그룹은 가장 높은 생존 백분율을 가졌다. (하측) AS15와 함께 제형화된 0.77 ㎍의 LVL168 및 1.25 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 접종한 마우스의 그룹은 약간 더 높은 생존 백분율을 가졌다.
도 28/35. 실시예 11, 연구 #2.2로부터의 생존 곡선이 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 6.25 ㎍의 LVL168 또는 10 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 C57Bl/6 마우스의 생존 곡선. (상측 중간) AS15와 함께 제형화된 3.1 ㎍의 LVL168 또는 5 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 C57Bl/6 마우스의 생존 곡선. (하측 중간) AS15와 함께 제형화된 1.55 ㎍의 LVL168 또는 2.5 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 C57Bl/6 마우스의 생존 곡선. (하측) AS15와 함께 제형화된 0.77 ㎍의 LVL168 또는 1.25 ㎍의 LVL144, 또는 단독의 AS15로 면역화되고,TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 C57Bl/6 마우스의 생존 곡선.
도 29/35. 실시예 11, 연구 #2.3으로부터의 생존 곡선이 제시되어 있다. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 6.25 ㎍의 LVL168 또는 10 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹이 가장 높은 생존 백분율을 가졌으며, 그 다음은 LVL144를 받은 그룹이었다. AS15만을 받은 그룹에는 생존자가 없었다. (중간) AS15와 함께 제형화된 3.1 ㎍의 LVL168 및 5 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹이 가장 높은 생존 백분율을 가졌으며, 그 다음은 LVL144를 받은 그룹이었다. AS15만을 받은 그룹에는 생존자가 없었다. (하측) AS15와 함께 제형화된 1.55 ㎍의 LVL168 및 2.5 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹이 가장 높은 생존 백분율을 가졌으며, 그 다음은 LVL144를 받은 그룹이었다. AS15만을 받은 그룹에는 생존자가 없었다. 염수 완충액 또는 단독의 AS15를 대조군으로 사용하였다.
도 30/35. 실시예 11, 연구 #2.3으로부터의 생존 곡선. TF: 무-종양. (상측) AS15와 함께 제형화된 0.77 ㎍의 LVL168 또는 1.25 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹은 가장 높은 생존 백분율을 가졌으며, 그 다음은 LVL144를 받은 그룹이었다. AS15만을 받은 그룹에는 생존자가 없었다. (중간) AS15와 함께 제형화된 0.19 ㎍의 LVL168 또는 0.31 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹이 가장 높은 생존 백분율을 가졌다. LVL144를 받은 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스는 AS15 그룹 및 완충액 그룹 둘 모두로부터의 마지막 생존자보다 더 오래 살았다. (하측) AS15와 함께 제형화된 0.048 ㎍의 LVL168 또는 0.078 ㎍의 LVL144로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 CB6f1 마우스의 생존 곡선. LVL168을 받은 마우스의 그룹이 가장 높은 생존 백분율을 가졌다. LVL144를 받은 그룹으로부터의 마지막 생존 마우스는 AS15 그룹 및 완충액 그룹 둘 모두로부터의 마지막 생존자보다 더 오래 살았다. 염수 완충액 또는 단독의 AS15를 대조군으로 사용하였다.
도 31/35. AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168로 면역화된 수컷 및 암컷 CB6f1 마우스에서의 TC1/CASB7439 #14-2 종양 이식; 단독의 AS15를 대조군으로 사용하였다(상측). AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168로 면역화된 C57Bl/6 마우스에서의 TC1/CASB7439 #14-2 종양 이식; 단독의 AS15를 대조군으로 사용하였다(하측).
도 32/35. 상측 패널: AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 수컷 또는 암컷 CB6f1 마우스의 생존 곡선. 단독의 AS15를 수컷 및 암컷 CB6f1 마우스 둘 모두에서 대조군으로 사용하였다. LVL168에 더하여 AS15로 면역화된 CB6f1 마우스 중에, 7마리의 무-종양(TF) 수컷 및 3마리의 TF 암컷이 있었다. 단독의 AS15를 받은 마우스 중에는 TF가 없었다. 하측 패널: AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168로 면역화되고, TC1/CASB7439 #14-2 세포를 챌린지한 C57Bl/6 마우스의 생존 곡선. 단독의 AS15를 수컷 및 암컷 C57Bl/6 마우스 둘 모두에서 대조군으로 사용하였다. LVL168에 더하여 AS15로 면역화된 C57Bl/6 마우스 중에, 2마리의 TF 수컷 및 1마리의 TF 암컷이 있었다. 단독의 AS15만을 받은 마우스 중에 5마리의 TF 수컷 및 1마리의 TF 암컷이 있었다.
도 33/35. AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화된 수컷(흑색 원) 및 암컷(회색 원) CB6F1 마우스에서의 CASB7439-특이적 체액성 면역 반응(IgG 역가)(좌측). AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168, 또는 단독의 AS15로 면역화된 수컷(흑색 원) 및 암컷(회색 원) C57/BL6 마우스에서의 CASB7439-특이적 체액성 면역 반응(IgG 역가)(우측).
도 34/35. 전체 CASB7439 단백질 서열을 포괄하는 46개 펩티드의 은행(도 9 참조)을 사용한 재-자극 후에, AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168, 또는 단독의 AS15 중 어느 하나로 면역화된 CB6F1 마우스로부터 단리한 풀링된 PBL에서의 CD4 T-세포 반응(이중 양성 백분율(IFNγ/TNFα)로 나타냄)(상측). 전체 CASB7439 단백질 서열(왼쪽 하측); CASB7439 펩티드 39(서열 번호 91)(중간 하측); 또는 RPMI(오른쪽 하측)를 포괄하는 CASB7439 풀링한 펩티드 46개 펩티드의 은행(도 9 참조)을 사용한 재-자극 후에, AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168(서열 번호 11), 또는 단독의 AS15 중 어느 하나로 면역화된 C57/BL6 마우스로부터 단리한 풀링된 PBL에서의 CD4 T-세포 반응(이중 양성 백분율(IFNγ/TNFα)로 나타냄).
도 35/35. 전체 CASB7439 단백질 서열을 포괄하는 46개 펩티드의 은행(도 9 참조)을 사용한 재-자극 후에, AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168(서열 번호 11), 또는 단독의 AS15 중 어느 하나로 면역화된 CB6F1 마우스로부터 단리한 풀링된 PBL에서의 CD8 T-세포 반응(이중 양성 백분율(IFNγ/TNFα)로 나타냄)(상측). 전체 CASB7439 단백질 서열(왼쪽 하측); CASB7439 펩티드 39(서열 번호 91)(중간 하측); 또는 RPMI(오른쪽 하측)를 포괄하는 46개 펩티드의 은행(도 9 참조)을 사용한 재-자극 후에, AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168(서열 번호 11), 또는 단독의 AS15 중 어느 하나로 면역화된 C57/BL6 마우스로부터 단리한 풀링된 PBL에서의 CD8 T-세포 반응(이중 양성 백분율(IFNγ/TNFα)로 나타냄).
상업적으로 허용되는 면역치료제에 대한 하나의 장애물은 상업적으로 허용되는 양의 재조합 암 항원의 생성이다. 일반적으로, 그리고 제한 없이, 재조합 폴리펩티드에 대한 상업적으로 허용되는 생성 수준은 쿠마시 블루(Coomasie blue) 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 추정시, 숙주 세포에 의해 생성되는 전체 단백질의 대략 5%이다.
재조합 수단으로 생성시, 나이브 폴리펩티드 서열을 오직 소량만을 생성할 수 있는 데는 많은 이유가 있다. 폴리펩티드 생성을 증가시키는 방법은 숙주 발현 시스템 또는 코돈 최적화를 변경시키는 것을 포함한다. 그러나, 이들 표준 방법은 허용되는 폴리펩티드 생성을 항상 초래하지는 않으며, 일부 폴리펩티드에 대한 생성이 상업적으로 여전히 금지된다. 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 출원인들은 변형된 CASB7439 폴리펩티드가 재조합 수단에 의해 허용되는 단백질 수준을 생성할 것인지 여부를 조사하였다.
몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 변형은 프롤린-풍부 영역의 모두 또는 일부가 제거되도록 하는 CASB7439 폴리펩티드의 C-말단 절단으로 이루어지거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드 변형은 프롤린-풍부 영역의 모두 또는 일부의 결실로 이루어지거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 서열 번호 13의 아미노산 잔기 193을 보유하는 변형된 CASB7439 폴리펩티드가 제공되나, 여기서, 프롤린-풍부 영역의 모두 또는 일부가 결실된다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 단백질 작제물은 하나 이상의 이종 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드는 다른 곳에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 융합 파트너이다. 특히 적합한 실시형태에서, 이러한 단백질 작제물은 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 이종 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 이종 폴리펩티드가 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 H. 인플루엔자(H. influenzae) 단백질 D(하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이)의 단편인 단백질 작제물이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드가 폴리히스티딘 영역을 포함하는 단백질 작제물이 제공된다. 추가의 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 C-말단 부분에 위치한다. 다른 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 C-말단에 위치한다. 추가의 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 N-말단 부분에 위치한다. 다른 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 N-말단에 위치한다. 적합한 실시형태에서, 폴리히스티딘 영역은 10개 이상의 연속 히스티딘 잔기를 포함한다. 특히 적합한 실시형태에서, 폴리히스티딘 영역은 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 10개 이상의 연속 히스티딘 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 1개 초과의 폴리히스티딘 영역이 본 명세서에 기재된 위치 중 하나 이상의 위치에서 포함될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드가 변형된 CASB7439 폴리펩티드에 화학적으로 컨쥬게이트된(conjugated) 운반(carrier) 단백질인 단백질 작제물이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 폴리히스티딘 영역인 이종 폴리펩티드 및 운반 단백질인 이종 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리히스티딘 영역인 이종 폴리펩티드 및 융합 파트너인 이종 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리히스티딘 영역인 이종 폴리펩티드, 융합 파트너인 이종 폴리펩티드 및 운반 단백질인 이종 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물이 제공된다.
또한, 본 출원인들은 임의의 이종 폴리펩티드, 예컨대 폴리히스티딘 영역의 일부 또는 모두가 제거된 본 명세서의 단락에 기재된 작제물 각각의 실시형태를 개시한다. 엔도- 또는 엑소- 펩티다아제로의 분해, 이종 폴리펩티드와 분자의 나머지 간의 결합의 파괴 또는 화학적 변형 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 이종 폴리펩티드의 제거를 위한 조성물 및 방법이 당업계에 공지되어 있다.
또한, 본 출원인들은 면역원성 조성물을 개시하며, 이들 조성물은 임의의 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하고, 상기 담체 또는 부형제는 완충액을 임의로 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 이들 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다. 특정 태양에서, 이들 조성물은 하나 이상의 TH1 면역 반응을 유도하는 애쥬번트를 포함한다. 특정 태양에서, 본 명세서에 기재된 애쥬번트는 3D-MPL, QS21 및 CpG 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 3D-MPL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 CpG를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 QS21을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 QS21 및 콜레스테롤을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 리포솜 제형 내에 콜레스테롤, 3D-MPL 및 QS21을 포함한다.
또한, 본 출원인들은 변형된 CASB7439 폴리펩티드 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터가 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 원핵 발현 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 진핵 발현 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
또한, 본 출원인들은 (i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 (ii) 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 개시한다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태는 (i) 본 명세서에 기재된 핵산 분자 또는 (ii) 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 대장암 치료용 약제의 제조에서의 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 단백질 작제물(또는 이들을 암호화하는 핵산 분자)의 용도가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 치료법, 특히 대장암 치료법에 사용하기 위한 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 단백질 작제물(또는 이들을 암호화하는 핵산 분자)이 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 대장암이 있는 대상체에서 CASB7439에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 대장암이 있는 대상체를 선택하는 단계; 및 (ii) 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 작제물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 담체 또는 부형제는 임의로 완충액을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에서, 면역원성 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법의 몇몇 실시형태에서, 애쥬번트는 하나 이상의 TH1 면역 반응을 유도한다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에서, 애쥬번트는 3D-MPL, QS21 및 CpG 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법의 몇몇 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
단백질 작제물
CASB7439 폴리펩티드
본 명세서에서 명명된 CASB7439는 HASH2 또는 ASCL2로도 알려져 있다. HASH2는 인간 기원의 193개 아미노산 잔기 폴리펩티드(서열 번호 13)이다. 예를 들어, 수탁 번호 AAB86993호를 참조하길 바란다. 본 명세서에서, CASB7439 특징에 대한 참조는 서열 번호 13에 제공된 폴리펩티드 서열에 관하여 만들어질 것이다.
프롤린-풍부 영역
높은 프롤린-주기성의 영역이 서열 번호 13에서 아미노산 127-158의 영역에서 관찰된다. 본 출원인들은 서열 번호 13의 아미노산 133 내지 아미노산 153의 영역을 "프롤린-풍부", "폴리프롤린", "폴리프롤린-유사" 또는 "polypro" 영역 또는 도메인으로 명명하였다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 "프롤린-풍부", "폴리프롤린", "폴리프롤린-유사" 및 "polypro"는 CASB7439 단백질의 이러한 영역(또는 도메인)을 지칭한다.
변형
본 개시물은 하나 이상의 발현 증가 변형을 포함하는 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드의 일부가 제거되며, 상기 부분은 프롤린-풍부 영역의 모두 또는 일부를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드의 전체 C-말단 부분이 제거되어, 서열 번호 13의 아미노산 잔기 1-117을 포함하는 절단된 CASB7439 폴리펩티드가 야기된다. 몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드는 CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
변형된 CASB7439 폴리펩티드의 문맥에서 본 명세서에서 사용되는 "발현 증가' 또는 "증가된 발현"은 서열 번호 13의 미변형 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 그 외에는 동등한(즉, 동일한 벡터, 숙주 세포 등) 단백질 작제물의 발현에 비해 상기 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물의 발현 수준을 증가시키고자 하는 변형을 지칭한다. 단백질 양을 측정하기 위한 당업계에 공지되어 있는 방법 중 임의의 것을 적용하여 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 주어진 작제물이 미변형 CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 그 외에는 동등한 단백질 작제물에 비해 증가된 발현 수준을 갖는지를 측정할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 사용하여 생성을 평가할 수 있다.
프롤린-풍부 영역의 제거
몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드의 변형은 프롤린-풍부 영역의 일부의 결실을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드의 변형은 프롤린-풍부 영역의 모두의 결실을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CASB7439 폴리펩티드의 변형은 프롤린-풍부 영역의 결실 외에, 프롤린-풍부 영역의 외부의 아미노산의 결실을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 변형은 서열 번호 13의 C-말단 부분의 절단에 의해 달성된다. 이에 따라, 몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 13의 프롤린-풍부 영역의 N-말단에 위치한 잔기에 상응하는 단백질 작제물이 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 13의 프롤린-풍부 영역 내에 위치한 잔기에 상응하는 단백질 작제물이 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 13의 아미노산 잔기 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 또는 152에 상응한다.
몇몇 실시형태에서, 변형은 프롤린-풍부 영역의 일부 또는 모두의 결실을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열은 21개 이상의 연속 아미노산 잔기가 결실된 서열 번호 13에 상응한다. 이들 21개 이상의 연속 잔기는 잔기 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 또는 152 중 임의의 것에서 시작하는 서열 번호 13의 연속 아미노산 서열에 상응한다. 추가의 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열은 12개의 연속 아미노산 잔기가 결실된 서열 번호 13에 상응하며, 상기 21개의 연속 잔기는 잔기 131, 132 및 133 중 임의의 것에서 시작한다.
몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열은 잔기 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153 중 하나 이상이 결실된 서열 번호 13에 상응한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열은 2개 이상의 연속 아미노산 잔기가 아미노산 잔기 133-153의 영역에서 결실된 서열 번호 13에 상응한다.
몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 서열은 서열 번호 13의 잔기 133 내지 153이 결실된 서열 번호 13에 상응한다. 예시적인 비제한적인 실시형태는 하기를 포함한다:
■ LVL055, 서열 번호 1(아미노산);
■ LVL111, 서열 번호 3(아미노산);
■ LVL137, 서열 번호 5(아미노산);
■ LVL141, 서열 번호 7(아미노산);
■ LVL144, 서열 번호 9(아미노산); 및
■ LVL168, 서열 번호 11(아미노산).
이종 서열
몇몇 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드와 합해진다. 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 다른 세포 구성성분에 관한 용어 "이종"은 천연에서 보통 발견되지 않고/거나 참조 물질과 상이한 공급원 또는 종으로부터 기원하는 구성성분이 발생함을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "이종" 분자는 융합 단백질, 운반 단백질 및 정제 태그를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드, 즉 운반 단백질은 변형된 CASB7439 폴리펩티드에 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이종 폴리펩티드 및 변형된 CASB7439 폴리펩티드는 단일 재조합 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 및 이종 폴리펩티드는 단일 재조합 융합 단백질로서 발현되고 다른 이종 폴리펩티드에 화학적으로 컨쥬게이트된다.
이종 폴리펩티드는 인간에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 비롯한 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움을 줄 수 있다. CASB7439 폴리펩티드 및 융합 단백질인 이종 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물의 경우에, 이종 폴리펩티드(융합 파트너)는 이러한 에피토프를 제공하는데 도움을 주거나, 천연의 재조합 단배질보다 더 높은 수율로 단백질을 발현시키는데 도움을 줄 수 있다(발현 인핸서(enhancer)). 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증가 파트너 둘 모두일 수 있다.
운반 단백질
운반 단백질은 다른 대상 폴리펩티드에 화학적으로 컨쥬게이트된다. 폴리펩티드의 운반 단백질로의 화학적 커플링은 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 직접적 공유 커플링을 위하여, 통상적인 구매가능한 헤테로이작용성 링커, 예컨대 CDAP 및 SPDP(제조처의 지시를 사용하여)를 사용하여 카보다이이미드, 글루타르알데히드 또는 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르를 사용할 수 있다. 커플링 반응 후에, 폴리펩티드-운반 단백질 컨쥬게이트는 투석 방법, 겔 여과 방법, 분별 방법 등의 수단에 의해 용이하게 단리되고 정제될 수 있다.
몇몇 실시형태에서 사용되는 운반 단백질의 유형은 당업자가 용이하게 알 것이다. 몇몇 운반 단백질의 기능은 커플링된 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는데 도움을 주기 위한 사이토카인 도움을 제공하는 것이다. 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 운반 단백질의 불-완전한 리스트에는 다음이 포함된다: 키홀 림펫 해모시아닌(Keyhole limpet Haemocyanin, KLH), 우혈청 알부민(BSA)과 같은 혈청 알부민, 파상풍 또는 디프테리아 독소(TT 및 DT)와 같은 불활성화된 박테리아 독소, 또는 이들의 재조합 단편(예컨대, TT의 단편 C의 도메인 1, 또는 DT의 전좌(translocation) 도메인), 또는 튜버큘린의 정제된 단백질 유도체(PPD).
융합 파트너
많은 유전자 융합 시스템의 이용가능성에도 불구하고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 재조합 단백질 발현은 여전히 어렵다. 발현시키기 어려운 단백질의 발현을 최적으로 증가시키는 융합 파트너를 확립하는 것은 여전히 실증적이다. 통상적인 융합 파트너에는 말토오스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S 트랜스퍼라아제(GST), 티오레독신(TRX), NUS A, 유비퀴틴(Ub) 및 소형 유비퀴틴-유사 변경자(SUMO) 태그의 C 말단이 포함되며, 이들 각각은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Marblestone (2006) Prot. Sci. 15:182-7; Hunt (2005) Protein Exp. & Purif 40:1-22; Hammarstom et al. (2002) Protein Sci. 11:313-321]을 참조하길 바란다.
면역원성 융합 파트너는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B로부터의 단백질 D 및 인플루엔자 바이러스로부터의 비-구조 단백질, NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 다른 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 공지되어 있는 단백질이다. 상기 분자의 C 말단 부분이 사용될 수 있다. LYTA는 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제, 즉 아미다아제 LYTA(lytA 유전자에 의해 암호화)를 합성하는 스트렙토콕커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다(문헌[Garcia et al. (1986) Gene 43:265-272]). 잔기 178, 예컨대 잔기 188-305에서 시작하는 C 종말단에서 관찰되는 Lyta 분자의 반복 부분을 사용할 수 있다. 다른 적합한 융합 파트너는 아데닐레이트 사이클라아제(CyaA) 단백질 또는 이의 단편이며, 여기서, 상기 CyaA 단편은 상기 아데닐레이트 사이클라아제 단백질의 항원 제시 세포를 표적화하는 특성을 보유한다. WO2005089792호를 참조하길 바란다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이종 폴리펩티드는 헤모필러스 인플루엔자로부터의 단백질 D(EP 0 594 610 B1) 또는 이의 단편이다. 단백질 D는 헤모필러스 인플루엔자로부터의 IgD-결합 단백질이다(WO 91/18926호, 특허 등록 EP 0 594 610 B1호). 일부 환경에서, 예를 들어, 재조합 면역원 발현 시스템에서, 예를 들어, 단백질 D의 약 100 내지 약 110개 N-말단 아미노산을 포함하는, 단백질 D의 N-말단 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다(GB 9717953.5) (pD1/3, 서열 번호 39).
H. 인플루엔자 단백질 D는 18개 아미노산 신호 서열을 갖는 전구체(precursor)로서 합성된다(서열 번호 41, 또한, 수탁 번호 AAA24998호 참조). 신호 서열이 분비 동안 가공되는 경우, 전구체 분자 내의 위치 19에서 시스테인 잔기는 아미노 말단 잔기가 된다.
일 실시형태에서, 이종 폴리펩티드 서열은 가공된 H. 인플루엔자 단백질 D 분자의 처음 대략 1/3 또는 가공된 단백질 D의 N-말단 100 내지 110개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 이종 단백질은 가공된 단백질 D의 N-말단 109 아미노산에 연결된 아미노산 잔기 Met-Asp-Pro를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이종 단백질은 가공된 단백질 D의 아미노산 잔기 2 내지 109에 연결된 아미노산 잔기 Met-Asp-Pro를 포함한다(서열 번호 39).
일 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물은 CyaA 단백질 또는 이의 단편에 화학적으로 커플링된다. WO2005054851호를 참조하길 바란다. 다른 실시형태에서, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물은 시가 독소(Shiga toxin)의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물에 화학적으로 커플링된다. 미국 특허 6,613,882호; WO02060937호; WO2005112991호를 참조하길 바란다.
폴리히스티딘 태그, 비관련 아미노산.
분비 또는 리더 서열, 프로-서열(pro-sequence), 정제를 돕는 서열 예컨대, 히스티딘 태그, 예컨대 폴리히스티딘 서열(다중 히스티딘 잔기를 포함), 또는 재조합 생성 동안의 안정성을 위한 추가적인 서열을 포함하는 것이 종종 유리하다.
히스티딘 태그 벡터 및 키트는 구매가능하다. 예를 들어, 6개 히스티딘 태그를 폴리펩티드에 첨가하기 위한 벡터는 로슈(Roche)에서 입수할 수 있다. 히스티딘 태그화된(tagged) 폴리펩티드를 제조하고 사용하기 위한 키트는 퀴아젠(Qiagen), 시그마(Sigma), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 지이 헬스케어(GE Healthcare) 등에서 입수할 수 있다. 또한, 히스티딘 태그는 엔도펩티다아제를 사용한 폴리히스티딘 서열의 제거를 용이하게 하는 적합한 아미노산 서열로 이어질 수 있다. 엑소펩티다아제, 예를 들어, 퀴아젠 TAGZyme을 사용하여 추가의 서열 없이 말단 폴리히스티딘 서열을 제거할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 N-말단 영역에 위치한다. 추가의 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 단백질 작제물의 N-말단에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 연속 히스티딘을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 폴리히스티딘 서열은 10개의 연속 히스티딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이종 폴리펩티드는 폴리히스티딘 서열 및 하나 이상의 비관련 아미노산을 포함한다. "비관련 아미노산"은 폴리히스티딘 서열 또는 융합 단백질의 일부가 아니며, 천연적으로 CASB7439 폴리펩티드 서열의 일부가 아닌 하나 이상의 아미노산으로 의도된다. 예를 들어, 비관련 아미노산은 펩티다아제 부위를 제공하기 위해 포함되는 것일 수 있거나, 이들은 클로닝 인공산물(cloning artifact)과 같은 단순히 관련이 없는 서열일 수 있는 등등이다.
CASB7439 작제물을 암호화하는 핵산 분자
본 발명의 다른 실시형태는 변형된 CASB7439 폴리펩티드 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 작제물을 암호화하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 재조합 핵산은 선택된 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 복제 및 발현을 용이하게 하기 위해, 핵산을 벡터, 예를 들어 원핵 또는 진핵 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 재조합 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물-암호화 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한, 본 발명의 특징이다. 바람직한 숙주 세포에는 원핵(즉, 박테리아) 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 뿐만 아니라 많은 진핵 숙주 세포, 예를 들어 진균(예를 들어, 효모) 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포(예를 들어, HEK293, CHO 및 VERO 세포)가 포함된다.
발현 벡터
복제 및 발현을 용이하게 하기 위해, 핵산을 벡터, 예를 들어 원핵 또는 진핵 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산이 각종 벡터(이에는, 예를 들어 박테리아 플라스미드; 파지(phage) DNA; 배큘로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 바이러스 DNA, 예를 들어 백시니아, 아데노바이러스, 조류 폭스 바이러스, 슈도라비에스(pseudorabies), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 등이 포함된다) 중의 어느 하나에 포함될 수 있긴 하지만, 가장 통상적으로 벡터는 폴리펩티드 발현 생성물을 생성시키는 데 적합한 발현 벡터일 것이다. 발현 벡터에서는, 단백질 작제물을 암호화하는 핵산을 전형적으로, mRNA 합성을 지시하기에 적당한 전사 제어 서열(프로모터 및 임의로, 하나 이상의 인핸서)에 근접하고 이러한 서열을 향한 배향으로 배열한다. 즉, 대상 폴리뉴클레오티드 서열을 적당한 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 이러한 프로모터의 예에는 CMV의 즉각 초기(immediate early) 프로모터, LTR 또는 SV40 프로모터, 배큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터, 이. 콜라이 lac 또는 trp 프로모터, 파지 T7 및 람다 PL 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스에서의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 전형적으로 또한, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위와 전사 터미네이터(terminator)를 함유한다. 이러한 벡터는 임의로, 발현을 증폭시키는 데 적당한 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 임의로, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형별 특징, 예를 들어 진핵 세포 배양의 경우에는 다이하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이의 경우에는 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 제공해 주는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 포함한다.
재조합 CASB7439 핵산의 생성을 통하여 당업자를 안내하기에 충분한 예시 절차가 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2003)]; 및 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999]에서 발견될 수 있다.
단백질 작제물을 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10 및 서열 번호 12에 나타나 있다. 예시적인 핵산 분자와 서열 동일성을 공유하는 부가의 서열 변이체는 당업자에 의해 생성될 수 있다. 전형적으로, 핵산 변이체는 아미노산 잔기의 1%, 또는 2%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20% 이하가 상이한 폴리펩티드를 암호화할 것이다. 즉, 암호화된 폴리펩티드는 80% 또는 85% 이상, 보다 통상적으로 약 90% 이상, 예를 들어 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 당업자는 단백질 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 유전자 암호의 중복성으로 인해 덜한 서열 동일성을 공유할 수 있다는 것을 즉시 이해할 것이다. 몇몇 경우에, 변형된 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물은 본 명세서에 기재된 예시적인 작제물의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 전술된 변형 이외의 변형)을 갖는다. 이러한 차이는 1개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 각각의 부가, 결실 또는 치환일 수 있다. 변이체는 전형적으로, 뉴클레오티드 잔기의 약 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 이하가 상이하다. 예를 들어, 핵산을 암호화하는 변이체 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 핵산을 암호화하는 예시적인 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물에 비해 1개, 또는 2개, 또는 5개 이하, 또는 약 10개 이하, 또는 약 15개 이하, 또는 약 50개 이하, 또는 약 100개 이하의 뉴클레오티드 차이를 포함할 수 있다. 따라서, 핵산을 암호화하는 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물의 맥락에서 변이체는 전형적으로 기준 서열, 예를 들어 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10 및 서열 번호 12에 예시된 기준 서열 또는 본 명세서에 기재된 다른 예시적인 CASB7439 폴리펩티드, 단백질 작제물 암호화 핵산 중 임의의 것과 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 98% 또는 99% 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 부가의 변이체는 유전적 부동(drift)을 통하여 생성될 수 있거나, 또는 위치 지정 또는 무작위 돌연변이유발을 이용하거나 또는 기존의 둘 이상의 변이체를 재조합함으로써 인공적으로 생성될 수 있다. 이러한 부가의 변이체는 또한, 본 명세서에 기재된 CASB7439 폴리펩티드 또는 단백질 작제물의 맥락에서 적합하다.
앞서 기재된 변이체 핵산 이외에도, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10 및 서열 번호 12로 나타낸 예시적인 핵산 중의 하나 이상과 혼성화되는 핵산을 또한 사용하여 CASB7439 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 단백질 작제물을 암호화할 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 논의된 서열 동일성 백분율(%) 측정치 이외에도, 두 핵산 간의 서열 유사성의 또 다른 지표가 혼성화할 수 있는 능력이라는 것을 인지할 것이다. 두 핵산의 서열이 보다 유사할 수록, 이들을 혼성화시킬 조건이 보다 엄격해진다. 혼성화 조건의 엄격도는 서열 의존성이고, 상이한 환경적 파라미터 하에 상이하다. 따라서, 특별한 엄격도를 야기하는 혼성화 조건은 선택되는 혼성화 방법의 종류, 및 혼성화되는 핵산 서열의 조성과 길이에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충액의 이온 강도(특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정하긴 하지만, 세척 횟수 또한 엄격도에 영향을 미친다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 5℃ 내지 20℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브와 혼성화되는 온도(규정된 이온 강도 및 pH 하에)이다. 핵산 혼성화 조건 및 엄격도 계산은, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]; 문헌[Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993] 및 문헌[Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 목적상, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 표적 서열 간의 미스매치 정도가 25% 미만인 경우에만 혼성화가 일어나게 하는 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 보다 정확한 정의를 위해 특별한 수준의 엄격도로 분류할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "적당한 수준의 엄격도" 조건은 25% 초과의 서열 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않을 조건이고; "중간 수준의 엄격도" 조건은 15% 초과의 미스매치를 수반한 분자를 혼성화시키지 않을 조건이며, "고도로 엄격한" 조건은 10% 초과의 미스매치를 수반한 서열을 혼성화시키지 않을 조건이다. "극히 높은 엄격도" 조건은 6% 초과의 미스매치를 수반한 서열을 혼성화시키지 않을 조건이다. 이와는 달리, "낮은 엄격도 조건" 하에 혼성화되는 핵산에는 훨씬 덜한 서열 동일성을 나타내는 핵산, 또는 핵산의 짧은 부분서열(subsequence)에 걸쳐서만 서열 동일성을 나타내는 핵산이 포함된다. 따라서, 본 발명에 포괄되는 핵산의 각종 변이체가 엄격한 조건 하에서 실질적으로 그의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10 및 서열 번호 12 중의 하나 이상과 혼성화될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
단백질 작제물의 생성
본 명세서에 기재된 단백질 작제물은 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 널리 확립된 절차를 이용하여 생성될 수 있다. 당업자를 안내하기에 충분한 절차는 다음 문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200]; 및 문헌[Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999]. 부가의 구체적인 상세 사항은 다음에 제공된다.
단백질 작제물을 암호화하는 재조합 핵산은 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라서 널리 공지된 각종 절차, 예를 들어 전기천공, 리포솜 매개된 트랜스펙션(transfection)(예를 들어, 시판용 리포솜 트랜스펙션 시약, 예를 들면 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)™ 2000 또는 트랜스펙틴(TRANSFECTIN)™을 이용한다), 인산칼슘 침전, 감염, 트랜스펙션 등에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 데 적당한 바대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 전형적으로, 발현을 위해 선별된 숙주 세포의 경우에 앞서 사용된 것이고, 이는 당업자 및 본 명세서에 인용된 참고 문헌, 예를 들어 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York] 및 이에 인용된 참고 문헌에서 명백할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 적합한 배양 온도는 16 ℃; 다르게는 37 ℃이다. 또한, 본 발명의 핵산에 상응하는 발현 생성물은 비-동물 세포, 예컨대 식물, 효모, 진균류, 박테리아 등에서 생성될 수 있다. 샘브룩(Sambrook), 베르거(Berger) 및 오수벨(Ausubel) 외에, 세포 배양에 관한 상세 사항은 문헌[Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; 문헌[Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture]; 문헌[Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]에서 찾을 수 있다.
숙주 세포
따라서, 재조합 단백질 작제물-암호화 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한, 본 발명의 특징이다. 바람직한 숙주 세포에는 원핵(즉, 박테리아) 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 뿐만 아니라 많은 진핵 숙주 세포, 예를 들어 진균(예를 들어, 효모, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Picchia pastoris)) 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)가 포함된다. 재조합 단백질 작제물 핵산은, 예를 들어 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 통하여 숙주 세포 내로 도입된다(예를 들어, 형질도입, 형질전환 또는 트랜스펙션된다). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 벡터는 가장 전형적으로는 플라스미드이지만, 이러한 벡터는, 예를 들어 바이러스 입자, 파지 등일 수도 있다. 적당한 발현 숙주의 예에는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium); 진균 세포, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 포유류 세포, 예를 들어 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 또는 보웨스(Bowes) 흑색종; 식물 세포, 예를 들어 조류(algae) 세포 등이 포함된다.
숙주 세포는 임의로, 삽입된 서열의 발현을 조정시킬 수 있거나 또는 발현된 단백질을 목적하는 방식으로 가공할 수 있는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 단백질 변형에는 글리코실화(뿐만 아니라 예를 들어, 아세틸화, 카복실화, 인산화, 지질화 및 아실화)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 전구체 형태를 절단하여 성숙한 형태의 단백질로 만드는(예를 들어, 푸린 프로테아제에 의함) 번역후 가공을 숙주 세포의 맥락에서 임의로 수행된다. 상이한 숙주 세포, 예를 들어 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 등은 이러한 번역 후 활성에 대해 특이적인 세포 기구와 특징적 메커니즘을 가지고, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형과 가공을 보장하도록 선택될 수 있다.
본 명세서에 기재된 재조합 단백질 작제물을 장기간 고 수율로 생성하기 위해, 전형적으로 안정적인 발현 시스템을 사용한다. 예를 들어, 단백질 작제물을 안정적으로 발현하는 핵산 분자를, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포 내로 도입한다. 벡터를 도입한 후, 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 이들을 선별가능한 배지로 전환시킨다. 선별가능한 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능하게 한다. 예를 들어, 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 군 또는 콜로니는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다. 단백질 작제물을 암호화하는 핵산으로 형질전환시킨 숙주 세포는 임의로, 세포 배양물로부터 암호화된 단백질을 발현 및 회수하는 데 적합한 조건 하에 배양한다.
발현된 단백질 작제물은 당해 분야에 널리 공지된 많은 방법, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 여과, 한외여과, 원심분리, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 본 명세서에 언급된 태그화 시스템 중 임의의 것을 이용한다), 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피 중 임의의 것에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를 경우에 따라, 성숙한 단백질의 형상을 완료시키는 데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 이용할 수 있다. 본 명세서에 언급된 참고 문헌 이외에도, 각종 정제 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 이에는 예를 들어 문헌[Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.]; 및 문헌[Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY]; 문헌[Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.]; 문헌[Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY]; 문헌[Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY]; 및 문헌[Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ]에 제시된 방법이 포함된다.
특정 예에서는, 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포에서의 도입 및 발현에 적합한 벡터를 통하여 핵산을 세포 내로 도입한다. 예를 들어, 단백질 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 각종 시판용 또는 독점적 벡터, 예를 들어 pET 시리즈의 발현 벡터(예를 들어, pET9b 및 pET2d) 내로 도입할 수 있다. 암호화 서열의 발현은 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도 가능하여, 이로써 고 수준의 단백질 발현이 이루어진다. CASB7439 단백질 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 파지 T7 프로모터 하에 전사시킨다. 대안적인 벡터, 예를 들어 열-유도성 람다 pL 프로모터를 포함하는 pURV22가 또한 적합하다.
발현 벡터를 적합한 박테리아 숙주 내로 도입한다(예를 들어, 전기천공에 의해). 이. 콜라이의 많은 적합한 균주가 입수 가능하고, 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, BLR DE3, BL21 DE3 및 로제타(Rosetta) DE3 균주가 단백질 ㅈ작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 벡터의 발현에 바람직한 것으로 입증되었다).
임의로, 단백질 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포(예를 들어, 곤충 또는 포유류 세포)로의 도입 및 이러한 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터 내로 혼입시킨다. 바람직하게는, 이러한 핵산을 선별된 벡터/숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시킨다. 선택된 세포는 클론 증식될 수 있으며, 목적하는 단백질 작제물의 발현을 특징으로 할 수 있다. 코돈 최적화를 위한 기법은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 상용의 분자 생물학 서비스 제공자는 다른 통상적인 기술 서비스 중에 코돈 최적화를 제공한다.
원핵
박테리아 시스템에서는, 발현된 생성물에 대해 의도된 용도에 따라서 많은 발현 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 폴리펩티드 또는 그의 단편이 항체 생성에 필요한 경우에는, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 고 수준 발현을 지시하는 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 벡터에는 다작용성 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들어 대상 암호화 서열, 예를 들어 본 명세서에 언급된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 아미노-말단 번역 개시 메티오닌에 대한 서열 및 촉매적 활성 베타 갈락토시다아제 융합 단백질을 생성시키는 베타-갈락토시다아제의 후속 7개 잔기와의 프레임 내에서 벡터에 연결시킬 수 있는 블루스크립트(BLUESCRIPT)(Stratagene); pIN 벡터(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); 아미노-말단 메티오닌을 히스티딘 태그와 프레임 내에서 연결시키는 pET 벡터(Novagen, Madison WI) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 적합한 벡터는 pET19; 다르게는, pET24; 다르게는 pET26이다.
진핵
유사하게, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애에서는, 알파 인자, 알코올 옥시다아제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 많은 백터가 목적하는 발현 생성물의 생성을 위해 이용될 수 있다. 리뷰를 위해 베르거, 오수벨 및 예를 들어, 그랜트(Grant) 등의 문헌(1987; Methods in Enzymology 153:516-544)을 참조하길 바란다. 포유류 숙주 세포에서는, 플라스미드 기반의 시스템과 바이러스 기반의 시스템 둘 다를 포함한 많은 발현 시스템을 활용할 수 있다.
면역원성 조성물
약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제
약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 부형제는 바람직하게, 완충액을 포함할 수 있다. 임의로, 담체 또는 부형제는 용해도 및/또는 안정성을 안정화시키는 한 가지 이상 구성성분을 함유하기도 한다. 가용화제/안정화제의 예에는 세정제, 예를 들어 라우릴 사르코신 및/또는 트윈(tween)이 포함된다. 대안적인 가용화제/안정화제에는 아르기닌, 및 유리 형성 폴리올(예: 수크로오스, 트레할로스 등)이 포함된다. 많은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Remington 's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)]에 기재되어 있다.
따라서, 적합한 부형제 및 담체는 선택된 투여 경로에 의해 대상체에게 전달하기에 적합한 제형을 생성시키도록 당업자가 선택할 수 있다.
적합한 부형제에는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 소르비톨, 트레할로스, N-라우로일사르코신 나트륨 염, L-프롤린, 비 세정제 설포베타인, 구아니딘 하이드로클로라이드, 우레아, 트리메틸아민 옥사이드, KCl, Ca2 +, Mg2 +, Mn2 +, Zn2 + 및 기타 2가 양이온 관련 염, 다이티오트레이톨, 다이티오에리트롤, 및 β-머캅토에탄올이 비제한적으로 포함된다. 기타 부형제는 세정제(Tween80, Tween20, 트리톤(Triton) X-OO, NP-40, 엠피겐(Empigen) BB, 옥틸글루코시드, 라우로일 말토시드, 쯔비터젠트(Zwittergent) 3-08, 쯔비터젠트 3-0, 쯔비터젠트 3-2, 쯔비터젠트 3-4, 쯔비터젠트 3-6, CHAPS, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 설페이트, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드 포함)일 수 있다.
애쥬번트
임의로는, 면역원성 조성물이 애쥬번트를 포함하기도 한다. CASB7439에 대하여 면역 반응을 유도시킬 목적으로 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하기에 적합한 면역원성 조성물의 맥락에서는, Th1 편향된 면역 반응을 유도시키는 애쥬번트를 선택한다. 전형적으로는, 해당 조성물이 투여되는 대상체 또는 대상체 집단에서 Th1 편향된 면역 반응을 증강시켜 주는 애쥬번트가 선택된다.
Th1 면역 반응
"Th1"형 면역 반응은 IL-2 및 IFN-γ를 생성하는 CD4+ T 헬퍼 세포의 유도를 특징으로 한다. 반면, "Th2"형 면역 반응은 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하는 CD4+ 헬퍼 세포의 유도를 특징으로 한다.
3D-MPL을 포함하나 이에 한정되지 않는 TLR 작용인자(affector)
변형된 CASB7439 폴리펩티드와 병용해서 사용하기에 적합한 한 가지 애쥬번트는 TLR-4-조절제이다. 일 예는 지질 A의 비독성 유도체, 예컨대 모노포스포릴 지질 A 또는 보다 특히, 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A(3DMPL)가 있다. 3D-MPL은 MPL이란 상표명으로 시판되고 있고(시판처: GlaxoSmithKline Biologicals N.A.), 문헌 전반에 걸쳐 MPL 또는 3D-MPL로서 지칭된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호를 참조하길 바란다. 3D-MPL은 주로, IFN-γ(Th1) 표현형을 수반하는 CD4+ T 세포 반응을 증가시킨다. 3D-MPL은 GB2220211 A호에 기재된 방법에 따라서 생성시킬 수 있다. 화학적으로는, 이것이 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화 쇄의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서는 소립자 3D-MPL을 사용할 수 있다. 소립자 3D-MPL은 이것이 0.22 ㎛ 필터를 통하여 멸균-여과될 수 있게 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 WO94/21292호에 기재되어 있다.
다른 실시형태에서, 지질다당류는 미국 특허 제6,005,099호 및 EP 특허 제0 729 473 B1호에 기재된 바와 같은 β(1-6) 글루코사민 이당류일 수 있다. 당업자는 이들 참고 문헌의 교시를 기준으로 하여 각종 지질다당류, 예를 들어 3D-MPL을 용이하게 생성시킬 수 있을 것이다. 전술된 면역자극제(구조상 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL과 유사하다) 이외에도, 상기 MPL 구조에 대해 하위-부분인 아실화 단당류 및 이당류 유도체가 또한 적합한 애쥬번트이다. 다른 실시형태에서는, 애쥬번트가 지질 A의 합성 유도체인데, 이들 중의 몇몇이 TLR-4 효능제(agonist)로서 기재되고, 이에는 OM174(2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실다이하이드로겐포스페이트)(WO 95/14026호); OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-다이올,1,10-비스(다이하이드로게노포스페이트)(WO 99/64301호 및 WO 00/0462호]; 및 OM 197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-다이올,1-다이하이드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127호)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
사용될 수 있는 기타 TLR4- 리간드는 WO 98/50399호 또는 미국 특허 제6,303,347호에 기재된 것과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP)(상기 문헌에는 AGP의 제조 방법이 또한 기재되어 있다), 적합하게는 RC527 또는 RC529, 또는 미국 특허 제6,764,840에 기재된 바와 같은 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 몇몇 AGP는 TLR-4 효능제이고, 몇몇은 TLR-4 길항제이다. 둘 다 애쥬번트로서 유용한 것으로 여겨진다.
TLR-4를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는(문헌[Sabroe et al, JI 2003 p1630-5) 기타 적합한 TLR-4 리간드는, 예를 들어 그램(gram)-음성 박테리아로부터의 지질다당류 및 그의 유도체, 또는 그의 단편, 특히 LPS(예를 들어, 3D-MPL)의 비독성 유도체이다. 기타 적합한 TLR 효능제는 열 쇼크 단백질(HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고당류, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 및 무라밀 다이펩티드(MDP)이다. 일 실시형태에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 기타 적합한 TLR-4 리간드는 WO 2003/011223호 및 WO 2003/099195호에 기재된 바와 같고, 예를 들어 WO2003/011223호의 페이지 4-5 또는 WO2003/099195호의 페이지 3-4에 기재된 화합물 I, 화합물 II 및 화합물 III, 특히 WO2003/011223호에 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, 및 ER804764로서 기재된 화합물이다. 예를 들어, 한 가지 적합한 TLR-4 리간드는 ER804057이다.
사포닌 애쥬번트
CASB7439와 함께 면역원성 조성물에 예를 들어, 그 자체로서 사용되거나 또는 3D-MPL과 병용해서 사용될 수 있는 기타 애쥬번트, 또는 본 명세서에 기재된 또 다른 애쥬번트는 사포닌, 예를 들어 QS21이다.
사포닌은 다음 문헌에 교시되어 있다(문헌[Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)]). 사포닌은 식물 및 해양 동물계에 광범위하게 분포되어 있는 스테로이드 또는 트라이테르펜 글리코시드이다. 사포닌은 진탕시 발포되는 수중 콜로이드성 용액을 형성하고, 콜레스테롤을 침전시키는 것으로 언급된다. 사포닌이 세포막 근처에 있으면, 이는 막의 파열을 야기하는 막 내의 공극-유사 구조를 창출시킨다. 적혈구 용혈이 이러한 현상의 한 예이고, 이는 전부는 아니지만 특정 사포닌의 특성이다.
사포닌, 특히 면역학적 활성 사포닌 분획은 전신 투여용 백신에서의 애쥬번트로서 공지되어 있다. 이러한 애쥬번트 및 개개 사포닌의 용혈 특성은 당해 분야에서 광범위하게 연구되어 왔다(상기 문헌[Lacaille-Dubois and Wagner]). 예를 들어, 퀼(Quil) A(남아메리카산 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래됨), 및 그의 분획이 미국 특허 5,057,540호 및 문헌["Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55]; 및 EP 0 362 279 B1호에 기재되어 있다. 퀼 A의 분획을 포함하는 미립자 구조(면역 자극성 복합체(ISCOMS)로 명명됨)는 용혈성이고, 백신 제조에 사용되어 왔다(Morein, B., EP 0 109 942 B1호; WO 96/11711호; WO 96/33739호). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17(퀼 A의 HPLC 정제된 분획)이 강력한 전신 애쥬번트로서 보고되었고, 그의 생성 방법은 미국 특허 제5,057,540호 및 EP 0 362279 B1호에 기재되어 있다. 전신 백신접종 연구에 사용되어 온 기타 사포닌에는 기타 식물 종, 예를 들어 집소필라(Gypsophila) 및 사포나리아(Saponaria)로부터 유래된 것이 포함된다(문헌[Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992]).
QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 상기 제형은 해당 항원과 함께 제형화하는 경우에 성공적인 Th1 자극성 애쥬번트인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 예를 들어, CASB7439는 바람직하게, QS21과 콜레스테롤의 조합물을 포함하는 애쥬번트와 함께 면역원성 조성물에 이용할 수 있다.
면역자극성 올리고 핵산
CASB7439와 병용하여 사용하기 위한 하나의 적합한 애쥬번트는 TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 박테리아 DNA TLR 효능제, 즉 TLR-9 효능제, 더 자세하게는 비메틸화 CpG 뉴클레오티드, 특히 CpG 모티브로 알려진 서열 맥락을 함유하는 DNA이다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 주로, Th1 반응을 유도시킨다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 WO 96/02555호, WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 적합하게는, CpG 뉴클레오티드가 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기 적합한 올리고뉴클레오티드는, 3개 이상, 적합하게 6개 이상 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 다이뉴클레오티드 CpG 모티프를 임의로 함유하는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 뉴클레오티드에 이은 구아닌 뉴클레오티드이다. 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 데옥시뉴클레오티드이다. 구체적 실시형태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드 사이는 포스포로다이티오에이트, 또는 적합하게 포스포로티오에이트 결합이긴 하지만, 포스포다이에스테르 및 다른 뉴클레오티드 사이의 결합도 본 발명의 범위 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, 혼합 뉴클레오티드 사이 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드가 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로다이티오에이트를 제조하는 방법은 미국 특허 제5,666,153호, 제5,278,302호 및 WO 95/26204호에 기재되어 있다.
대안적 실시형태에서는, TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 효능제를 사용한다. 일 실시형태에서는, TLR-9를 통하여 신호 전달 반응을 유발시킬 수 있는 TLR 효능제가 HSP90이다. 본 명세서에 언급된 바와 같은, 상이한 애쥬번트의 조합물을 CASB7439와 함께 조성물에 사용할 수도 있다. 예를 들어, 앞서 언급한 바와 같이, QS21을 3D-MPL과 함께 제형화할 수 있다. QS21:3D-MPL의 비는 전형적으로, 대략 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 전형적으로, 상기 비는 2.5:1 내지 1:1 범위의 3D-MPL: QS21이다. 또 다른 조합 애쥬번트는 또한, CpG와 병용하는 리포솜 제형 중의 3D-MPL 플러스 QS21이다.
대장암이 있는 대상체
본 명세서에 기재된 방법에 참여시키기 위한 대장암이 있는 대상체의 선택은 임상적 진단, 분자적 진단 또는 이들의 조합에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체를 시험하여 그들의 암 세포가 CASB7439(HASH2)를 발현하는지를 측정한다. 대장암을 진단하기 위한 임상적 방법이 당업계에 공지되어 있다. 암 세포 또는 조직이 CASB7439(HASH2)를 발현하는지를 측정하기 위한 분자적 기법 및 방법은 WO01/62778호에 기재되어 있다.
실험예
실시예 1
CASB7439 폴리펩티드를 포함하는 단백질 작제물을 암호화하는 2개의 핵산 분자를 pET19b 벡터에서 생성하였다. 히스-태그를 CASB7439 서열의 N-종말단에 병치시켰다. 이들 클론을 각각 LVL007[서열 번호 15(아미노산); 서열 번호 16(DNA)] 및 LVL010[서열 번호 17(아미노산); 서열 번호 18(DNA)]으로 명명하였다. 프롤린의 류신으로의 하나의 아미노 치환을 야기하는 의도되지 않은 돌연변이가 LVL007 클론에서 발생하는 것이 관찰되었다(서열 번호 13을 참고로 아미노산 잔기 17). 핵산 분자를 3가지 상이한 숙주 세포 유형, 즉 이. 콜라이 균주 BLR DE3, BL21 DE3 및 로제타 DE3와 함께 사용하였다. 유도마다 2가지 온도(16 ℃ 또는 37 ℃)에서 1 mM의 IPTG를 사용하여,유도를 수행하였다. 프로토콜 상세사항에 대해서는 하기의 재료 및 방법 섹션을 참고하길 바란다.
각각의 유도에 대한 단백질을 수집하고, 웨스턴 블롯(western blot) 및 쿠마시-블루 염색을 사용하는 SDS-PAGE로 분석하였다. 이들 실험에서, 단백질의 검출은 웨스턴 블롯에서만 가시화되었다.
실시예 2
CASB7439 유전자의 생물정보 분석을 수행하여, 하기의 구조적 특징이 드러났다:
■ 서열 번호 14의 뉴클레오티드 2 내지 27에 위치한 헤어핀 RNA 구조 요소
■ 뉴클레오티드 서열의 62% GC 함량
■ 아르기닌 코돈이 풍부한 뉴클레오티드 서열(26/193개의 암호화된 아미노산)
■ 높은 수준의 염기성 아미노산 잔기가 있는 아미노산 서열
■ 높은 등전점(11.18)을 갖는 아미노산 서열
■ 아미노산 서열 내의 낮은 복잡성 영역(서열 번호 13의 잔기 7-27)
■ 아미노산 서열 내의 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 도메인(HLH)(IPR000014)(서열 번호 13의 잔기 56-108)
■ 아미노산 서열 내의 제1 내재적 장애 영역(서열 번호 13의 잔기 118-164)
■ 아미노산 서열 내의 제2 내재적 장애 영역(서열 번호 13의 잔기 118-164).
또한, 본 출원인들은 아미노산 127 내지 158의 높은 프롤린 주기성을 갖는 영역을 동정하였다. 본 출원인들은 서열 번호 133(아미노산)의 아미노산 133 내지 153을 포함하는 영역을 프롤린-풍부 영역으로 명명하였다. 본 실시예에 언급된 다른 특징 중 몇몇과 함께 프롤린-풍부 영역을 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 영역과 함께, 도 1/35에 개략도로 도시하였다.
실시예 3
미변형 CASB7439 DNA 뉴클레오티드 서열(서열 번호 14)을 상업상 DNA 합성 서비스 제공처인 진아트(Geneart)(독특한 식별자 0606597)에 의해 코돈-최적화시키고, 클로닝하였다. 진아트 아게(Geneart AG)는 독일 레겐스부르크 11D-93053 요세프-엥게르트-슈트라쎄 바이오파크에 소재한다. CASB7439 뉴클레오티드 서열을 PCR 증폭에 의해 클론으로부터 수득하고, 2개의 작제물을 생성하기 위해 사용하였다. 제1 작제물인 LVL016[서열 번호 29(아미노산), 서열 번호 30(DNA)]에서, CASB7439 서열을 CASB7439 서열의 N-종말단에 pD1/3 단백질(헤모필러스 인플루엔자로부터의)과 융합하여, pET21b (+) 벡터에 삽입하였다. 제2 작제물인 LVL018[서열 번호 31(아미노산); 서열 번호 32(DNA)]에서, CASB7439를 pET21b (+) 벡터에 삽입하였다(어떤 단백질 D 구성성분도 없이). 이들 작제물을 16 ℃ 및 37 ℃에서, 1 mM의 IPTG와 함께, BLR DE3 이. 콜라이에서의 생성에 대해 평가하였다. 생성은 주로 16 ℃에서 생성되는 불용성 단백질로서, 웨스턴 블롯에 의해 검출가능하였다.
CASB7439 도메인 중 4개를 단백질 생성을 향상시키기 위한 추가의 조사를 위해 선택하였다: 핵 표적화 도메인, 프롤린-풍부 영역, DNA 결합 도메인 및 HLH 도메인.
실시예 4
CASB7439의 핵 표적화 도메인, DNA 결합 도메인, bHLH 도메인 및 프롤린-풍부 영역을 선택하여, CASB7439 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 작제물로부터의 단백질 생성에 대해 조사하였다. CASB7439 뉴클레오티드 서열의 상이한 섹션을 본 명세서에 기재된 코돈-최적화된 진아트 클론으로부터 PCR 증폭시키고, pET19b (+) 벡터에 삽입하여, 상이한 CASB7439 서열(몇몇 방식의 절단형 또는 완전한)을 갖는 5개의 작제물을 야기하였으며; 각각의 작제물은 CASB7439 서열의 N-말단에 폴리히스티딘 테일을 갖는다. 도 2/35를 참조하길 바란다.
도 2/35에 나타낸 이들 작제물을 1 mM의 IPTG와 함께, 37 ℃ 및 16 ℃에서 BLR DE3 이. 콜라이 균주에서의 단백질 발현에 대해 평가하였다. 도 2/35에 도시된 바와 같이, 이들 작제물은 전장 CASB7439[LVL060, 서열 번호 19(아미노산), 서열 번호 20(DNA)]; 핵 표적화 도메인을 제거하도록 절단된 CASB7439[Const-1, 서열 번호 21(아미노산), 서열 번호 22(DNA)]; 프롤린-풍부 영역을 제거하도록 절단된 CASB7439[LVL055, 서열 번호 1(아미노산), 서열 번호 2(DNA)]; DNA 결합 도메인을 제거하도록 절단된 CASB7439[LVL056, 서열 번호 23(아미노산), 서열 번호 24(DNA)]; 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH) 도메인을 그대로 두도록 절단된 CASB7439[LVL057, 서열 번호 25(아미노산), 서열 번호 26(DNA)]를 포함하였다. 실험의 오류로 인해, Const-1에는 정지 코돈이 결여되어 있어, 벡터 뉴클레오티드 서열의 일부의 번역이 야기되었다(LED...로 시작하는, C-말단 영역 내의 추가의 21개 아미노산을 초래함). 16 ℃에서의 인큐베이션 후에 LVL055의 생성은 쿠마시-블루 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 명백하게 검출가능하였다.
실시예 5
실시예 4에 기재된 결과에 기초하여, (i) 프롤린-풍부 영역을 제거하면서, (ii) 펩티드의 C-말단 부분의 다른 영역이 유지되도록 새로운 작제물을 설계하였다. (i) 폴리펩티드 내의 다양한 동정되거나 예측된 에피토프 및 (ii) 프롤린-풍부 영역의 제거를 위한 대안적인 방법을 논의하는 도 3/35 및 4/35의 설명을 참조하길 바란다.
그 다음, 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 암호화하는 코돈 최적화된 합성 핵산 유전자 서열을 진아트(독특한 식별자 0706840)로부터 주문하고, 분해하고, 2가지 상이한 벡터 내에 평행하게 삽입하여, 다음의 작제물을 생성하였다:
(i) pET26b (+) 벡터 내에 C-말단에서 폴리히스티딘-테일과 융합된, 21개 아미노산 프롤린-풍부 영역이 결실된 CASB7439 유전자를 포함하는 LVL088(서열 번호 27(아미노산), 서열 번호 28(DNA)) 및
(ii) pET19b (+) 벡터 내에 N-말단- 및 C-말단-폴리히스티딘-테일 둘 모두를 가지며, 21개 아미노산 프롤린-풍부 영역이 결실된 CASB7439 유전자를 포함하는 LVL111(서열 번호 3(아미노산), 서열 번호 4(DNA)).
LVL111 작제물(서열 번호 3 참조)을 LVL055에 대해 사용된 것과 동일한 전략, 즉, 10개의 히스티딘으로 이루어진 폴리히스티딘-테일에 이어서 엔테로키나아제 부위를 포함하는 pET19 (+) 벡터를 사용하여, 클로닝하였다. 이는 N-말단에 23개 아미노산 융합 파트너(서열 번호 42)를 야기하였다.
하기를 포함하는 실시예 3에 기재된 코돈 최적화된 합성 유전자(독특한 식별자 0606597)를 사용하여 기타 작제물을 생성하였다:
■ LVL090((N-말단에서부터) pET21 벡터 내의 단백질 D, 전장 최적화된 CASB7439 및 6-His를 포함하는 단백질 작제물)(서열 번호 43(아미노산); 서열 번호 44(DNA))
■ LVL112((N-말단에서부터) pSUMO 벡터 내의 SUMO 단백질, 전장 최적화된 CASB7439를 포함하는 단백질 작제물)(서열 번호 45(아미노산); 서열 번호 46(DNA))
■ LVL113((N-말단에서부터) pSUMO 벡터 내의 SUMO 단백질, pD1/3 단백질, 전장 최적화된 CASB7439를 포함하는 단백질 작제물)(서열 번호 47(아미노산); 서열 번호 48(DNA))
■ LVL114((N-말단에서부터) pSUMO 벡터 내의 SUMO 단백질, 아미노산 117에서 절단된 CASB7439를 포함하는 단백질 작제물)(서열 번호 49(아미노산); 서열 번호 50(DNA))
■ LVL115((N-말단에서부터) pSUMO 벡터 내의 SUMO 단백질, 프롤린-풍부 영역을 제거한 변형된 CASB7439를 포함하는 단백질 작제물)(서열 번호 51(아미노산); 서열 번호 52(DNA)).
오직 1회의 반복만을 수행하였지만 생성의 향상이 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
LVL088의 생성을 37 ℃ 및 16 ℃에서 1 mM IPTG와 함께 밤샘 유도 후에 분석하였다. 전기영동으로 분석하는 경우, LVL088 생성은 웨스턴 블롯에 의해서만 가시화되었다. 4개의 800 ㎖ 배양 플라스크로부터의 하나의 정제 로트(lot)는 0.4 mg의 단백질을 초래하였다. 반면, LVL111은 쿠마시-블루 염색 후에 용이하게 검출가능하였다. 재조합 단백질 LVL111을 생성하고 8개의 로트에 걸쳐 정제하였다. LVL111의 몇몇 로트(각각 4개의 800 ㎖ 배양 플라스크로부터의)를 추산하여, 3.3 mg/로트 내지 10 mg/로트 범위의 정제된 단백질을 생성하였다. 따라서, LVL088의 생성은 LVL111에 대해 관찰된 것보다 더 낮았다. 또한, 정제된 단백질을 몇몇 항-CASB7439 모노클로널 항체와의 그의 반응성에 대해 시험하였고, 모든 경우에서 양성의 반응성을 수득하였다.
실시예 6
LVL111 작제물로부터의 C-말단 폴리히스티딘-테일의 제거를 조사하였다. C-말단 폴리히스티딘을 암호화하는 부분 없이, polypro (-) CASB7439 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 LVL111 작제물로부터 PCR에 의해 증폭시키고, pET19b 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 작제물을 LVL137로 명명하였다. LVL137 작제물은 본질적으로 C-말단 폴리히스티딘 테일을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 없는 LVL111이었다(서열 번호 5(아미노산); 서열 번호 6(DNA)). C-말단 폴리히스티딘 테일의 제거는 생성 수준에 명백한 영향을 갖지 않았다. 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석되는 바와 같이, LVL137은 LVL111과 동일한 수준의 단백질을 생성하였다.
그 다음, polypro (-) CASB7439 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 진아트(0706840) 합성 CASB7439 서열로부터 PCR에 의해 증폭시키고, N-말단에 6개의 폴리히스티딘을 갖는 pET26 벡터 내로 클로닝하였다(LVL138)(서열 번호 33(아미노산); 서열 번호 34(DNA)). 이러한 작제물은 유의미하게 감소된 단백질 생성 수준을 나타냈으며, 웨스턴 블롯에 의해 검출하기 어려웠다.
polypro (-) CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 6개의 폴리히스티딘 태그를 암호화하는 핵산 분자를 pET24 카나마이신 저항성 벡터 내에 생성하였다. 새로운 링커(linker) 설계를 사용하여, 폴리히스티딘-태그 서열과 CASB7439 유전자의 5' 말단 사이에 생성되는 헤어핀 구조를 없앴다. 구체적으로, 단백질 작제물의 처음 8개 아미노산 잔기에 대한 코돈을 하기의 뉴클레오티드 서열로 변경하였다: 5' ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT GAC... 3'(서열 번호 35)(원래 코돈은 5' ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAT... 3'(서열 번호 36)이었다). 이러한 작제물을 LVL160으로 명명하였다(서열 번호 37(아미노산); 서열 번호 38(DNA)). 겔 및 웨스턴 블롯 분석에 의해, 단백질 생성이 LVL138에서 수득되는 것만큼 약한 것으로 나타났다.
polypro (-) CASB7439 폴리펩티드의 N-말단에 10개의 폴리히스티딘 태그를 갖는 단백질 작제물을 암호화하는 핵산 분자를 pET24 카나마이신 저항성 벡터 내에 생성하였다. 이러한 작제물을 LVL168로 식별화하였다(서열 번호 11(아미노산); 서열 번호 12(DNA)). 생성 수준은 LVL111에 대해 관찰되는 수준과 유사하였다. 본 실시예에 기재된 작제물의 몇몇의 정렬을 도 5/35에 나타내었다.
본 실시예 및 실시예 1에 나타낸 작제물에 대한 결과는 하기의 표 1에 약술되어 있다.
Figure pct00001
표 1. 실시예 1, 3 및 6에 나타낸 작제물에 대한 발현 수준. "겔-/블롯+" 생성을 야기하는 작제물은 일반적으로 전체-세포 용해물을 SDS-PAGE로 처리하는 경우 웨스턴 블롯에 의해서만 가시화된다. "겔+++/블롯+++" 생성을 야기하는 작제물은 전체-세포 용해물을 SDS-PAGE로 처리하는 경우 쿠마시 블루 염색에 의해서 명백하게 가시화된다.
6His: 히스티딘 태그 = 6개 히스티딘 잔기
긴 His = 23개 아미노산(MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKH)(서열 번호 42)
Del-poly-Pro-도메인: 프롤린-풍부 영역의 결실로 변형된 CASB7439
OPT: 코돈 최적화
Hismodif: 코돈 선택을 위해 변형된 히스티딘 태그(본 명세서의 실시예 6 참조)
1/3pD: 본 명세서에 기재된 단백질 D 작제물
10His: 10개 히스티딘 잔기가 있는 히스티딘 태그
실시예 7
다른 CASB7439 작제물을 헤모필러스 인플루엔자로부터의 단백질 D의 다편과 함께 융합하여 생성하였다. 서열 번호 39(아미노산)(서열 번호 40 (DNA))에 나타낸 바와 같이, 아미노산 Met-Asp-Pro를 가공된 단백질 D의 108 N-말단 아미노산에 융합시켰다(가공된 단백질 D의 아미노산 잔기 2-109). 서열 번호 39를 본 명세서에서 1/3pD 또는 1/3 단백질 D로 언급한다. 진아트(0706840)로부터 수득된 합성 CASB7439 뉴클레오티드 서열(프롤린-풍부 영역이 결실)을 pET26-1/3pD 내에 서브클로닝하여 LVL141을 수득하였으며, 이러한 pET26-1/3pD는 1/3pD를 함유하는 카나마이신 저항성 플라스미드이다. LVL141의 서열은 서열 번호 7(아미노산) 및 서열 번호 8(DNA)에 기재되어 있다. 생성은 LVL111과 유사하였다.
그 다음, 이러한 클론을 PCR에 의해 돌연변이시켜, 1/3pD와 CASB7439 구성성분 사이의 4개의 아미노산 링커(Ala-Ala-Ala-His)를 제거하였다. LVL144로 명명된 생성된 작제물의 서열이 서열 번호 9(아미노산) 및 서열 번호 10(DNA)에 기재되어 있다. 생성은 LVL111과 유사하였다. 도 6/35는 CASB7439(서열 번호 13); LVL168(서열 번호 12), PD1/3(서열 번호 39) 및 LVL144(서열 번호 9)의 정렬을 보여주는 것이다.
실시예 8
LVL168의 용해성 시험
일반적으로, CASB7439를 포함하는 정제된 단백질 작제물을 6M 구아니딘 완충액에 용해시키고, 8M 우레아 완충액으로 옮기고, 4M 우레아, 2OmM HEPES, 1mM TCEP, 15OmM NaCl, pH7.0에서 보관하였다. 적은 부피로 수행한 예비 결과는 LVL168이 또한 우레아나 어떠한 환원제, 예컨대 EDTA 또는 TCEP 없이, 그리고 NaCl과 함께 또는 NaCl 없이, 인산염 완충액에 용해될 수 있음을 시사하였다. 이들 완충액에서의 투석 후에 침전이 관찰되지 않았다. 용해성 검정을 수행하여, 표 2에 열거된 16개 완충액에서 LVL168 단백질을 특성화하였다. 8M 우레아 완충액, 2OmM HEPES, 15OmM NaCl, 1mM TCEP, pH7.0 중의 100 ㎕의 정제된 LVL168 단백질 샘플을 이전에 2회 헹굼으로 완충액으로 컨디셔닝된 미니 다이얼리시스 유닛(mini dialysis unit) 10000 MWCO(Biolynx) 내로 넣었다. 투석을 표 2에 나열된 16개 완충액 각각의 100 ㎖ 중에서 4 ℃에서 진탕 하에 밤새 수행하였다. 그 다음, 샘플을 유닛으로부터 수집하고, 에펜도르프(eppendorf)에 넣고 20,00Og에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 가용성 단백질은 현탁액 중에 계속 남아 있었으나, 비-가용성 단백질은 침전되어, 펠렛(pellet)을 유발하였다. LVL168 단백질이 가용성이었던 완충액이 표 2에 나열되어 있다.
상층액을 겔 SDS-PAGE로 시험하고, 제조처의 지시에 따라 남아있는 가용성 단백질의 농도를 RC DC 방법에 의해 측정하였다. 변형된 로우리(Lowry) 방법의 RC DC 방법을 수행하기 위한 키트는 바이오래드 래보러터리즈(BioRad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)로부터 입수할 수 있다. 샘플을 안정성 시험을 위해 4 ℃로 유지시켰다.
LVL168 의 안정성 시험
용해성 검정으로부터의 LVL168 단백질을 4 ℃에서 7일 동안 유지시켰다. 샘플 2, 3, 5, 6, 9 내지 16 각각의 20 ㎕를 다른 튜브로 옮기고, 추가 2일 동안 4 ℃, 37 ℃ 또는 실온에서 그들의 안정성에 대하여 시험하였다. 샘플을 20,00Og에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 SDS-PAGE로 분할(resolve)하고, 정제된 원래의 단백질에 대한 비교로, 분해, 응집 또는 단백질의 소실에 대하여 프로파일을 분석하였다. 단백질은 시험한 대부분의 완충액에서 안정적이었다.
Figure pct00002
표 2. LVL168의 용해성 및 안정성 시험
읽는 이의 편의를 위하여, 본 명세서에 언급된 작제물 및 그들의 상대적 생성의 요약이 표 3에 제공되어 있다.
Figure pct00003
표 3. 표 1 약어를 참조하길 바란다. 하기의 추가의 약어를 표 3에 사용하였다:
trunc: 절단형,
const: 작제물,
mut: pD1/3과 변형된 CASB7439 폴리펩티드 사이의 비관련 아미노산을 제거하기 위해 돌연변이된 서열,
링커: 분자의 2 부분 사이의 비관련 아미노산,
DNA bind: DNA 결합 도메인,
단독의 bHLH: 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 도메인
재료 및 방법
발현-소규모 유도:
이. 콜라이 BLR(DE3) 균주를 본 명세서에 언급된 작제물로 형질전환시키고, 적절한 항생제(40 ㎍/㎖의 카나마이신 또는 100 ㎍/㎖의 카르베니실린)를 함유하는 루리아 브로쓰(Luria Broth, LB) 아가(agar) 플레이트에 두고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 박테리아 론(lawn)을 사용하여 적절한 항생제(40 ㎍/㎖의 카나마이신 또는 100 ㎍/㎖의 카르베니실린)를 함유하는 2O ㎖의 LB 대체 단백질 공급원(Alternative Protein Source, APS) 배지에 접종하고, 0.5 내지 1.0의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에 두었다.
16 ℃ 또는 37 ℃ 중 어느 하나에서 1 mM IPTG의 첨가로 유도를 행하였다. 16 ℃에서 유도시키기 위하여, 성장 중인 배양물을 재조합 단백질의 발현을 유도하기 1시간 전에 얼음 위에서 냉각시켰다. 그 다음, 배양물을 다시 16 ℃에서 성장하도록 두고, 16시간 동안 그들 조건 하에 유지시켰다. 37 ℃에서 유도시키기 위하여, IPTG의 성장 중인 배양물로의 첨가에 의해 재조합 단백질의 발현을 즉시 유도하였다. 유도를 37 ℃에서 3시간 동안 유지시켰다. 적은 1 ㎖의 분취물을 유도 전과 후에 취하였다.
그 다음, 분취물을 원심분리시키고(10 분, 4 ℃, 20000 x g), 박테리아 펠렛을 분석시까지 -20 ℃로 유지시켰다. 제조처의 권고에 따른 버그버스터(BugBuster) 단백질 추출에 따라 분석을 수행하였다. 노바젠(Novagen)에 의해 제조된 버그버스터는 VWR로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 발현 수준을 SDS-PAGE 겔의 쿠마시-블루 염색 및 웨스턴 블롯에 의하여 측정하였다. 버그버스터 추출로부터의 펠렛 또는 상층액 중의 단백질의 검출 후에 용해성을 평가하였다.
발현-대규모 유도:
이. 콜라이 BLR(DE3) 균주를 본 명세서에 언급된 작제물로 형질전환시키고, 적절한 항생제를 함유하는 LB 아가 플레이트에 두고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 박테리아 론을 사용하여 적절한 항생제(40 ㎍/㎖의 카나마이신 또는 100 ㎍/㎖의 카르베니실린)를 함유하는 원하는 수의 800 ㎖ 플라스크의 LB APS 배지에 접종하고, 0.5 내지 1.0의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에 두었다. 그 다음, 800 ㎖의 성장 중인 배양물을 함유하는 2.5 ℓ 플라스크를 얼음 위에서 1시간 냉각시킨 다음, 1mM IPTG의 첨가에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 16 ℃에서 유도시키기 위하여, 성장 중인 배양물을 유도하기 1시간 전에 얼음 위에서 냉각시켰다. 그 다음, 배양물을 다시 16 ℃에서 성장하도록 두고, 16시간 동안 그들 조건 하에 유지시켰다.
배양물을 원심분리시키고(15 분, 4 ℃, 6000 x g), 박테리아 펠렛을 정제 과정 시까지 -80 ℃로 유지시켰다. 또한, 적은 1 ㎖의 분취물을 버그버스터를 위하여 유도 전과 후에 취하고, 정제 전에, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의하여 분석하였다.
정제
박테리아 펠렛을 용해 완충액(500 mM NaCl, 1OmM TCEP를 함유하는 20 mM Tris 완충액(pH 8.0)) 및 프로테아제 억제제의 혼합물(완전히 EDTA가 없는)에 재현탁시켰다. 박테리아를 컨스턴트 셀 디스럽션 시스템(Constant Cell disruption system)(Constant System) 또는 에멀시플렉스(Emulsiflex) C3(Avestin)에 의해, 비브라(Vibra) 세포 초음파 처리기 상에서 13mm 프로브를 사용하여 초음파분해에 의해 용해시켰다. 가용성(상층액) 및 불용성(펠렛) 구성성분을 4 ℃에서 20분 동안 20 00Og에서 원심분리에 의해 분리하였다. CASB7439 재조합 단백질이 펠렛 내에 있는 것으로 예상되기 때문에, 상층액을 폐기하였다.
통상적으로, 불용성 구성성분(펠렛)을 6M 구아니딘 HCl, 50OmM NaCl, 1OmM TCEP를 함유하는 5OmM 바이신(bicine) 완충액 pH 8.0에 재용해시킨 다음, 원심분리시켰다(20 000 x g에서 20분). 상층액을 TCEP 농도를 1 mM로 낮춘 상기 완충액 중에 이미 사전평형화된 5 ㎖ 히스 트랩(His Trap) 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 동일한 완충액으로 1회 세정하였다. 6M GnHCl 무질서 유발제(chaotrope agent)를 8M 우레아(8M 우레아, 2OmM HEPES, 50OmM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)로 대체하였다. 8M 우레아, 50OmM NaCl, 1mM TCEP 및 250 mM 이미다졸을 함유하는 2OmM HEPES 완충액(pH 8.0)을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출 분획으로부터의 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고, 대상 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 필요에 따라 원심분리 장치상에서 농축시켜 제2 정제 단계를 위해 사용하였다.
마지막 탈염 단계 전에, 필요한 순도에 따라, 1 단계 또는 2 단계의 SEC(크기 배제 크로마토그래피)(슈퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 8M 우레아, 2OmM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8,0 중에서 행하였다. 탈염을 4M 우레아, 15OmM NaCl 및 1 mM TCEP를 함유하는 최종 2O mM HEPES 완충액(pH 7.0)으로 사전평형화된 G25 탈염 컬럼 상에서 행하였다.
단백질 샘플을 튜브 내에 1 ㎖로 분취하고, -80 ℃에서 보관하였다.
단백질 분석-농도 측정
단백질 농도를 RC DC 단백질 검정(바이오래드(BioRad)에 의한 변형된 로우리 방법)을 사용하여 측정하였다. 최종 완충액의 일부 구성성분과 통상적인 로우리 또는 BCA 검정의 비상용성(높은 함량의 우레아 및 환원제) 때문에, 이러한 검정을 사용하였다. 또한, 공지되어 있는 최종 단백질 제제의 양을 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯에 의해, 그리고 LAL-함량에 대해 분석하여, 응집 또는 분해, 이. 콜라이 단백질 및 LPS 오염 수준을 평가하였다.
실시예 9
정상 및 대장암( CRC ) 조직에서의 CASB7439 발현 입증
본 출원인들은 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation)으로부터 수득된 83개의 CRC 샘플 및 12개의 정상 결장 샘플에서의 CASB7439 mRNA 발현의 리얼-타임 qPCR 분석을 수행하였다. CASB7439 mRNA는 정상 조직에 비해 시험된 CRC 샘플의 63%에서, 정상 결장에 비해 CRC에서 10배 이상 과발현되었다(평균 CASB7439/β-액틴 발현 비로 기록된 데이터)(도 7/35). 또한, 본 출원인들은 토끼 항-CASB7439 모노클로널 항체(40-12)(본 명세서의 다른 곳에 기재된 항체)를 사용하여 인간 CRC 조직에서 면역형광법(IF)에 의해 CASB7439 단백질을 검출하였으며; CASB7439 단백질은 정상의 인접 조직 섹션에서는 검출되지 않았다.
CASB7439에 대한 추가의 발현 데이터를 표준 기법을 사용하여 진로직(GeneLogic)(Gene Microarray) 분석에 의해 생성하였다. CASB7439 mRNA는 모든 질환 단계로부터의 CRC 샘플에서 고도로 발현되는 것으로 관찰되었다(데이터 미도시). 본 출원인들은 코릭사 코포레이션으로부터 수득된 83개의 CRC 샘플 및 12개의 정상 결장 샘플에서의 CASB7439 mRNA 발현의 리얼-타임 qPCR 분석을 수행하였다. CASB7439 mRNA는 정상 조직에 비해 시험된 CRC 샘플의 63%에서, 정상 결장에 비해 CRC에서 10배 이상 과발현되었다(평균 CASB7439/β-액틴 발현 비로 기록된 데이터)(도 7/35).
독자적 문헌에서 결장의 움(colonic crypt)의 기저에서 매우 낮은 수준으로 인 시츄 혼성화(in situ hybridization, ISH)에 의한 CASB7439, 즉 HASH-2, mRNA 의 검출이 보고되었으나, 태반을 제외한 임의의 다른 정상 조직에서는 그렇지 않았다(문헌[Jubb et al. (2006) Oncogene 25: 3445-3457]). 대장암(CRC) 조직에서, CASB7439 mRNA가 시험한 인간 조직의 70%에서 15배 과발현되는 것으로 관찰되었다.
CRC 및 정상 인접 결장 조직에서의 CASB7439 단백질 발현
정상 및 CRC 조직에서 면역형광법에 의해 CASB7439 단백질 발현을 분석하기 위하여, 특이적 래빗 항-CASB7439 모노클로널 항체(40-12)를 개발하였다. CASB7439에 대해서 야기된 래빗 하이브리도마(hybridoma)를 상업적 제공처인 에피토믹스 인코포레이티드(Epitomics Inc.)로부터 수득하고, 본 출원인들이 스크리닝하였다. 하이브리도마에 의해 생성된 mAb를 먼저 재조합 단백질 LVL111(서열 번호 3)을 사용하여 ELISA로 스크리닝하였다. mAb의 특이성을 CASB7439를 발현하도록 엔지니어링된 재조합 세포주로부터 수득된 세포 용해물 및 LVL111을 사용하여 웨스턴 블롯으로 입증하였다(하기 참조, TC1/CASB7439). TC1/CASB7439 종양(마우스 내에서 성장), SW-620 및 SW-480 세포(CASB7439 양성 인간 대장암 세포주) 및 HCT-116 세포(CASB7439 음성 인간 대장암 세포주)에서의 CASB7439 단백질 발현을 mAb를 사용한 면역형광법에 의해 평가하였다. CASB7439 단백질 발현 입증을 위해 mAb 40-12를 선택하였다.
본 출원인들은 NDRI(National Disease Research Interchange, 8 Penn Center, 8th Floor, 1628 JFK Boulevard, Philadelphia, PA 19103)로부터 17명의 상이한 개체로부터의 CRC 및 인접한 정상 조직 둘 모두의 OCT-임베딩된(embedded) 동결된 조직 샘플을 수득하였고; 이들 개체 중 5명에 대해서는, 전이 조직도 또한 수득하였다. 본 출원인들은 17개의 원발성 종양, 17개의 인접한 정상 조직 및 5개의 전이물을 스크리닝하였다. 분석한 17개의 원발성 CRC 종양 중에, 13개가 CASB7439 단백질 발현에 대해 양성이었다(76.5%). 이들 모든 CASB7439-양성 샘플은 선암종이었다. 인접한 정상 조직 중 어느 것도 검출가능한 수준의 CASB7439 단백질을 발현하지 않았다. 전이 조직 5개 중 3개가 CASB7439 단백질 발현에 대해 양성이었다(60%).
CASB7439 단백질과 mRNA 발현 사이의 상관관계를 암 및 인접한 정상 결장 조직 둘 모두에서 통상적인 기법을 사용하여 수행하는 리얼-타임 qPCR 분석에 의해 16개 CRC 조직에서 연구하였다. Ki67 염색을 증식 마커로서 사용하였다. CASB7439 단백질과 mRNA 발현 사이의 상관관계는 도 8/35에 제시되어 있다. 또한, 면역형광법에 의해 CASB7439 단백질을 나타내는 조직 샘플은 가장 높은 CASB7439 mRNA 수준을 나타내었다.
실시예 10
마우스에서의 CASB7439 의 면역원성: 근교배 마우스에서의 CASB7439 T-세포 면역원성
마우스에서 CASB7439의 T-세포 면역원성을 연구하기 위하여, 펩티드의 은행을 CASB7439 단백질의 전체 서열을 포괄하도록 통상적인 합성 방법에 의해 생성하였다(도 9/35). 각각의 펩티드는 15-mer였으며, 다음 펩티드와 11개 아미노산이 중첩된다. 면역우성 영역을 조사하기 위하여, 임의의 2개의 풀의 펩티드가 오직 하나의 공통 펩티드만을 갖도록 하는 매트릭스에 따라 펩티드의 14개 풀을 배열하였다(도 10/35).
마우스에서의 T-세포 면역원성 연구를 위하여, 그룹당 15마리 이하의 근교배 마우스 및 10마리 이하의 이계교배 마우스를 AS01B 또는 AS15와 함께 제형화된 다양한 용량(0 내지 30 ㎍)의 다양한 재조합 CASB7439 단백질을 사용하여 2주 마다 4회 근육내 면역화시켰으며, 상기 AS01B 또는 AS15는 둘 모두 GSK 소유의 애쥬번트이다. 일단 항원과 제형화되면, AS01B는 리포솜 내의 MPL(100 ㎍/㎖) 및 QS21(100 ㎍/㎖)로 이루어진다. 일단 항원과 제형화되면, AS15는 리포솜 내의 MPL(100 ㎍/㎖), QS21(100 ㎍/㎖) 및 CpG7909(840 ㎍/㎖)로 이루어진다. 각각의 면역화는 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유한다. 이에 따라, AS01B 그룹 내의 각 마우스에 5 ㎍ MPL 및 5 ㎍ QS21를 제공하였다. AS15 그룹 내의 각 마우스에는 5 ㎍ MPL, 5 ㎍ QS21 및 5 ㎍ CpG7909를 제공하였다. 마지막 면역화 후에, 비장 또는 PBL을 마우스로부터 수득하였다. 근교배 마우스에서의 CASB7439 면역원성 분석을 위하여, 비장 또는 PBL을 개별적으로 분석하거나 풀링하였다. CD1 이계교배 마우스에서의 CASB7439 면역원성 분석을 위하여, 각 비장을 개별적으로 처리하였다.
PBL 또는 분리된 비장세포를 하기의 첨가제와 함께 RPMI 1640 배양 배지 중에 ㎖당 10x106개 세포의 최종 농도로 재현탁화시켰다: 페니실린-스트렙토마이신(1X), 비필수 아미노산(1X), 2-머캅토에탄올(55mM), 피루브산나트륨(10OmM), L-글루타민(20OmM). 세포를 CASB7439 서열로부터의 펩티드로 자극하였다(RPMI 1640 + 첨가제 + 5% 열-불활성화된 FBS 중의 1 ㎍/㎖/펩티드의 최종 농도로 사용). CD4, CD8, IL-2, IL-5, IFNγ 및 TNFα에 대한 세포내 염색(ICS)을 통상적인 절차에 따라 수행하였다. 자극 후에, 세포를 브레펠딘 A로 처리하고, 고정하였다. CD4 및 CD8의 표면 염색을 CD4 및 CD8 특이적 모노클로널 항체로 행하였다. 그 다음, 세포를 투과화시키고, IL-2, IL-5, IFNγ 및 TNFα 단백질에 대해서 야기된 특이적 모노클로널 항체로 염색하였다. 세포를 BD FACSCanto II를 사용하여 유세포분석으로 분석하였다. 데이터를 이중-양성 IFNγ+ 및 TNFα+ CD4 또는 CD8 T-세포의 백분율로 표현하였다.
근교배 마우스 멀티스트레인 T-세포 면역원성 비교 실험
본 출원인들은 찰스 리버(Charles River, Senneville, QC, Canada)로부터 구매한 C57Bl/6, Balb/C, CB6f1(Balb/C 마우스와 교배한 C57Bl/6의 제1 세대 자손) 및 C3H 근교배 마우스에서 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 CASB7439 단백질의 면역원성을 비교하였다. 그룹당 5마리의 마우스를 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 10 ㎍의 재조합 CASB7439 단백질(LVL111)로 면역화시켰다. 비장을 수집하고, 풀링하였다(그룹당 5개의 비장의 1개의 풀). 각 스트레인에 대하여, LVL111에 대한 CD4 T-세포 반응(이중-양성 IFNγ+ 및 TNFα+)은 AS01B 제형에 대해서는 도 11/35에 제시되어 있고, AS15 제형에 대해서는 도 12/35에 제시되어 있다. 4마리의 근교배 마우스 스트레인 중 어느 것에서도 CD8 T-세포(이중-양성 IFNγ+ 및 TNFα+) 반응이 관찰되지 않았다.
CASB7439+AS15로 면역화된 근교배 마우스에서 동정된 CASB7439 면역우성 펩티드는 도 13/35에 제시되어 있다. 서열 번호 13의 상응하는 영역과 함께 면역우성 펩티드는 다음과 같다:
■ C57Bl/6: 펩티드 39(서열 번호 91)(서열 번호 13의 아미노산 153 내지 167)
■ Balb/c: 펩티드 24(서열 번호 13의 아미노산 93 내지 107)
■ CB6f1 : 펩티드 7-8(서열 번호 13의 아미노산 25 내지 43) 및 23-24(서열 번호 13의 아미노산 89 내지 107)
■ C3H: 펩티드 9-11(서열 번호 13의 아미노산 33 내지 55), 16-19(서열 번호 13의 아미노산 61 내지 87) 및 41-43(서열 번호 13의 아미노산 161-183).
LVL111 , LVL168 및 LVL144 의 근교배 마우스 T-세포 면역원성 연구
LVL111, LVL168 및 LVL144의 면역원성을 근교배 CB6f1 마우스에서 연구하였다. 이러한 실험에서, 그룹당 5마리의 마우스(찰스 리버(Senneville, QC, Canada))를 AS15와 함께 제형화된 재조합 CASB7439 단백질(LVL111, LVL168 및 LVL144)를 사용하여 2주 마다 4회 면역화시켰다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. CD4 및 CD8 T-세포 반응(이중 양성 IFNγ 및 TNFα)을 비장세포의 CASB7439 펩티드 매트릭스로의 재자극 후에, 개별 근교배 CB6f1 마우스에서 세포내 염색 및 유세포 분석으로 측정하였다(데이터 미도시). 모든 3가지 작제물로의 면역화로, CB6f1 근교배 마우스에서 동일한 면역원성 영역(서열 번호 13의 아미노산 25 내지 43 및 서열 번호 13의 아미노산 89 내지 107)에 대한 CD4 T-세포 면역 반응이 촉발되었다.
마우스에서의 CASB7439 의 면역원성: 이계교배 마우스에서의 CASB7439 T-세포 면역원성
CD1 이계교배 마우스(찰스 리버(Senneville, QC, Canada))를 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 재조합 CASB7439 단백질(LVL111)로 2주 마다 4회 면역화시켰다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. CD4 및 CD8 T-세포 반응(이중 양성 IFNγ 및 TNFα)을 비장세포의 CASB7439 펩티드 매트릭스로의 재자극 후에, 개별 CD1 마우스에서 세포내 염색 및 유세포 분석으로 측정하였다.
CASB7439+AS01B 또는 CASB7439+AS15 중 어느 하나로 면역화된 이계교배 마우스에서 동정한 CASB7439 CD4-면역원성 펩티드의 표가 도 14/35 상측 및 하측에 각각 제시되어 있다. CD1 이계교배 마우스에서 동정한 CD4 T-세포 면역원성 영역은 하기의 CASB7439 영역을 포괄한다(서열 번호 13의 아미노산 위치에 관하여 표현): 펩티드 8-10(서열 번호 13의 아미노산 29 내지 51), 펩티드 16-18(서열 번호 13의 아미노산 61 내지 83) 및 펩티드 24-26(서열 번호 13의 아미노산 93 내지 115). CD1 이계교배 마우스에서 동정된 CD8 T-세포 면역우성 영역은 하기의 CASB7439 부분을 포괄한다(서열 번호 13): 펩티드 16-18(서열 번호 13의 아미노산 61 내지 83), 펩티드 24-26(서열 번호 13의 아미노산 93 내지 115) 및 펩티드 32(서열 번호 13의 아미노산 125 내지 139)(데이터 미도시).
LVL111 , LVL168 및 LVL144 의 이계교배 마우스 T-세포 면역원성 연구
LVL111, LVL168 및 LVL144에 의해 유도된 CASB7439+AS15-매개된 CD4 및 CD8-T-세포 반응을 찰스 리버(Senneville, QC, Canada)로부터 구매한 개별 이계교배 CD1 마우스에서 시험하였다. 그룹당 5마리의 마우스에 AS15와 함께 제형화된 10 ㎍의 CASB7439 재조합 단백질(LVL111, LVL168 또는 LVL144)로 이루어진 근육내 면역화를 2주 마다 4회 제공하였다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. 대조군 그룹에서 5마리의 마우스를 염수 완충액으로 면역화시켰다.
4차 면역화 2주 후에, 마우스를 희생시켰다. CD4 및 CD8 T-세포 반응(이중 양성 IFNγ 및 TNFα)을 4개의 펩티드 풀(풀 1: 펩티드 8-9-10, 풀 2: 펩티드 16-17-18, 풀 3: 펩티드 24-25-26 및 풀 4: 펩티드 30-31-32)로의 비장세포 재자극 후에 세포내 염색 및 유세포 분석으로 측정하였다. 데이터가 도 15/35에 제시되어 있다. AS15와 함께 제형화된 3개의 CASB7439 작제물 각각으로의 면역화 후에, 서열 번호 13의 동일한 CD4 T-세포 면역원성 영역, 특히 펩티드 16-18(서열 번호 13의 아미노산 61 내지 83) 및 펩티드 24-26(서열 번호 13의 아미노산 93 내지 115)을 활성화시켰다.
LVL144 및 LVL168 의 HLA A2.1/ DR1 - 트랜스제닉 마우스 T-세포 면역원성 연구
2개의 작제물(LVL168 또는 LVL144)에 의해 유도된 CASB7439+AS15-매개된 CD4 및 CD8-T-세포 반응을 파스퇴르 인스티튜트(Pasteur Institute(Paris, France))로부터 구입한 풀링된 HLA A2.1/DR1-트랜스제닉 마우스(3마리의 마우스의 3개의 풀)에서 시험하였다. 그룹당 9마리의 마우스에 AS15와 함께 제형화된 6.25 ㎍의 LVL168 또는 10 ㎍의 LVL144로 이루어진 근육내 면역화를 2주 마다 4회 제공하였다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. 대조군 그룹에서 2마리의 마우스를 애쥬번트 단독으로 면역화시켰다.
4차 면역화 2주 후에, 마우스를 희생시켰다. CD4 및 CD8 T-세포 반응(이중 양성 IFNγ 및 TNFα)을 전체 CASB7439 서열을 포괄하는 7개의 펩티드 풀[풀 1: 펩티드 1-7(서열 번호 53-59), 풀 2: 펩티드 8-14(서열 번호 60-66), 풀 3: 펩티드 15-21(서열 번호 67-73), 풀 4: 펩티드 22-28(서열 번호 74-80), 풀 5: 펩티드 29-35(서열 번호 81-87), 풀 6: 펩티드 36-42(서열 번호 88-94) 및 풀 7: 펩티드 43-46(서열 번호 95-98)]으로의 PBL 및 비장세포 재자극 후에 세포내 염색 및 유세포 분석으로 측정하였다. 더욱이, 인간 HLA DR 면역우성 펩티드 24(서열 번호 76)를 개별적으로 시험하였다. 도 16 내지 19에 제시되어 있는 결과는 동일한 CD4 및 CD8 T-세포 면역우성 영역(펩티드 22-28 + 펩티드 24)이 AS15와 함께 제형화된 2개의 CASB7439 작제물 각각으로의 면역화 후에 활성화됨을 보여준다. 따라서, 펩티드 24는 또한 인간 HLA A2.1 면역우성 펩티드이다. 이들 결과는 동일한 CASB7439 펩티드를 사용하여 AS15와 함께 제형화된 LVL168 또는 LVL144 중 어느 하나로 면역화된 그룹당 5마리의 개별 마우스로부터 수득된 비장세포를 재자극시키는 제2 실험에서 확인하였다(데이터 미도시).
마우스에서의 CASB7439 의 면역원성: CASB7439 -매개된 체액성 반응 CB6f1 마우스 연구
인간 용량의 1/10로 사용된, AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 10 ㎍의 CASB7439(LVL111)에 대한 CASB7439-매개된 체액성 반응을 근교배 CB6f1 마우스에서 평가하였다(찰스 리버(Senneville, QC, Canada)). 그룹당 19마리의 마우스에 2주 마다 근육내 면역화를 4회 제공하였다. 각각의 면역화는 25 ㎕의 애쥬번트(2X 농도)와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. 각각의 면역화 직전과 4차 면역화 2주 후에 마우스에서 채혈하였다. 다른 실험에서, LVL111, LVL168 또는 LVL144에 대한 CASB7439-매개된 체액성 반응을 근교배 CB6f1 마우스(찰스 리버, Senneville, QC, Canada)에서 평가하였다. 그룹당 50마리의 마우스에 AS15와 함께 제형화된 10 ㎍의 CASB7439 재조합 단백질(LVL111, LVL168 또는 LVL144) 또는 대조군으로서 단독의 AS15를 사용하여 2주 마다 근육내 면역화를 4회 제공하였다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다. 4차 면역화 2주 후에 마우스에서 채혈하였다.
항-CASB7439 IgG1 및 IgG2a 혈청 항체 역가를 표준 절차에 따라, ELISA로 결정하였다. 약술하면, CASB7439 재조합 단백질을 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 96-웰 플레이트에 코팅하였다. PBS-Tween(0.1 %) 중의 우혈청 알부민 1%를 사용한 블로킹(blocking) 후에, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 37 ℃에서 1시간 동안 플레이트에서 인큐베이션하였다. 플레이트 세정 후에, 특이적 염소 항-IgG1 또는 IgG2a-HRP 표지된 마우스 항체(서던 바이오테크 어소시에이츠(Southern Biotech Associates)(Birmingham, AL, USA))를 37 ℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트 세정 후에, TMB 기질 시약(비디 파민젠(BD Pharmingen), Mississauga, ON, Canada)을 15분 동안 첨가하였다. 1 M 황산을 첨가함으로써, 비색 반응을 중단시켰다. 스펙트라맥스(Spectramax) 분광광도계(몰레큘러 디바이스(Molecular Device), Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 OD를 측정하였다. 특이적 전체 IgG, IgG1 또는 IgG2a 포획(capture) 항체 및 내부 CASB7439 양성 마우스 혈청을 사용하여 항체 역가를 표준 곡선으로 측정하였다.
도 20/35는 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 CASB7439(LVL111)로 면역화된 마우스의 혈청에서의 IgG1 및 IgG2a 항체 역가의 경시적 분석을 도시한 것이다. 상기 데이터는 AS15가 AS01B에 비해 4차 면역화 후에 더 높은 Th1(대략 10배 더 높은 IgG2a/IgG1 비)을 촉발시키는 것을 증명한다(IgG2a는 1형 면역 반응의 대용 마커이다). 도 21/35에 나타낸 바와 같이, AS15와 함께 제형화된 CASB7439 단백질은 사용된 작제물(LVL111, LVL168 또는 LVL144)이 어떤 것이든 근교배 CB6f1 마우스에서 매우 강한 IgG1 및 IgG2a 항체 반응을 촉발시켰다.
마우스에서의 CASB7439 의 면역원성: CASB7439 -매개된 체액성 반응 CD1 마우스 연구
CASB7439 면역화(LVL111, LVL168 또는 LVL144) 시의 CASB7439-매개된 체액성 반응을 이계교배 CD1 마우스에서 평가하였다(찰스 리버(Senneville, QC, Canada)). 그룹당 10마리의 마우스에 AS15와 함께 제형화된(또는 대조군으로서 단독의 AS15) 10 ㎍의 CASB7439 재조합 단백질(LVL111, LVL168 또는 LVL144)을 사용하여 2주 마다 근육내 면역화를 4회 제공하였다. 각각의 면역화는 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 25 ㎕의 2X 농도 애쥬번트와 함께 혼합된 25 ㎕의 재조합 CASB7439 단백질을 함유하였다.
4차 면역화 2주 후에, 마우스에서 채혈하고, 항-CASB7439 전체 IgG 혈청 항체 역가를 이미 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 다양한 CASB7439 작제물(LVL111, LVL168 또는 LVL144)로 면역화된 CD1 마우스에는 매우 강한 CASB7439-특이적 체액성 면역 반응이 발생하였다(도 22/35). 데이터는 CD1 이계교배 마우스에서 LVL144에 의해 각각 LVL168 및 LVL111에 비해 8 내지 10배 더 높은 항-CASB7439 전체 IgG 역가가 유도되었음을 나타낸다.
실시예 11
마우스에서의 CASB7439 ASCI 의 항-종양 효능: 뮤린 종양 모델 개발
TC-1 뮤린 종양 세포 또는 MC38 뮤린 대장암 세포를 사용하여 CASB7439 단백질을 발현하는 뮤린 종양 모델을 개발하여, 마우스에서의 CASB7439-매개된 생체 내 종양 보호를 연구하였다. TC-1 종양 세포는 티. 씨. 우(T. C. Wu)(존스 홉킨스 대학(Johns Hopkins University)(Baltimore, MD))가 친절히 제공하였다. 이들은 HPV16 E6 및 E7 유전자, 및 이전에 기재된 바와 같은(문헌[Lin et al. (1996) Cancer Res. Jan 1;56(1):21-6]) 활성화된 ras 암유발유전자(oncogene)의 연속 전달에 의해 C57Bl/6 마우스의 원발성 폐 세포로부터 생성되었다. 뮤린 대장 선암종 세포주인 MC38 세포를 ATCC(Manassas, VA)로부터 구입하였다.
이들 세포를 제조처의 권고에 따라 비-리포솜 트랜스펙턴트(transfectant) 시약 퓨진(Fugene)-6(로슈(Mississauga, ON, Canada))을 사용하여 CASB7439를 암호화하는 작제물로 안정적으로 트랜스펙션시켰다. 약술하면, CASB7439 단백질의 전체 서열을 암호화하고, 제오신-저항성 유전자를 함유하는 플라스미드(pcDNA3.1/제오신(Zeocine))를 퓨진-6과 혼합하고, 무-혈청 배지에서 TC-1 또는 MC38 종양 세포의 상측에 밤새 첨가하였다. 트랜스펙션 후에, 세포가 배양 배지 + 10% 열-불활성화 FBS에서 24시간 동안 회복되게 하였다. 그 다음, 세포를 수집하고, 제한 희석을 위해 96-웰 플레이트(웰당 50 ㎕의 세포 현탁액)에 분배하였다. 세포 씨딩(seeding) 후에, 배지를 100㎍/㎖의 제오신(인비트로젠(Invitrogen)(Burlington, ON, Canada))을 함유하는 배양 배지 + 10% 열-불활성화된 FBS로 교체하였다. 선별 후에, 각각의 클론을 수집하고, 24-웰 플레이트에서 성장하도록 하고, 동결시켰다. TC1/CASB7439 및 MC38/CASB7439 세포에서의 CASB7439 mRNA의 발현을 CASB7439-특이적 TaqMan 프라이머 및 프로브를 사용하여 리얼-타임 qPCR로 입증하였다. 리얼-타임 qPCR 반응을 TaqMan 7900 장치(어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)(Foster City, CA, USA))를 사용하여 TaqMan 반응 키트로 수행하였다. CASB7439 단백질 발현을 특이적 항-CASB7439 모노클로널 항체(40-12)를 사용하여 웨스턴 블롯 및 면역형광법으로 평가하였다.
TC-1/CASB7439#14 세포 집단은 완전히 클론이 아니고, 오히려 2개 이상의 상이한 서브클론으로 이루어진다. 따라서, 추가의 제한 희석 단계를 행하여, 완전히 클론인 TC-1/CASB7439 세포 집단을 생성하였다: TC-1/CASB7439#14-2 세포.
마우스에서의 종양 챌린지에 대한 TC-1 또는 MC38 세포의 최적의 용량을 결정하기 위하여, 다양한 용량의 세포(마우스당 1x105 내지 2x106개 세포)를 CB6f1 근교배 마우스에 주사하였다. TC-1/CASB7439#14 및 TC1/CASB7439#14-2 챌린지에 대하여 최적의 용량이 마우스당 2.5 x 105개 세포인 것으로 측정되었고; 마우스당 1 x 105개 세포가 MC38/CASB7439#35 세포로의 챌린지에 대해 최적인 것으로 관찰되었다.
마우스에서의 항-종양 효능: 면역화 및 챌린지 실험
일련의 4가지 연구(1.1-1.4)를 설계하여, CASB7439-매개된 생체 내 종양 보호를 평가하였다. 일반적으로, 이들 4가지 연구 각각에서, CB6f1 마우스의 그룹에 염수 완충액과 함께, 단독의 CASB7439 단백질과 함께 또는 단독의 애쥬번트와 함께, 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 최종 농도로 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된, 연구를 위해 선택한 특정 재조합 CASB7439 단백질의 다양한 용량(0, 1, 10 또는 30 ㎍)을 사용하여 2주 간격으로 4회 근육내 면역화를 제공하였다. 4차 면역화 2주 후에, CB6f1 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439 #14, 100,000개 MC38/CASB7439#35 세포 또는 250,000개 TC-1/CASB7439 #14-2 종양 세포를 피하로 주사하여 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 프로토콜에 따라, 200 ㎟보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 그 다음, 생존 곡선을 플롯팅하였다(plotted).
추가의 3가지 연구(2.1-2.4)를 수행하여, 0, 1, 10 또는 30 ㎍의 재조합 CASB7439 단백질을 제외한 용량을 조사하였다. 연구 2.4에서 수컷 및 암컷 C57Bl/6 마우스에서의 CASB7439의 면역원성과 종양 보호 간의 상관관계를 평가하고; CB6f1 마우스를 병행하여 평가하였다. 연구 1.1-2.4는 하기에 더 상세히 기재되어 있다.
연구 #1.1
본 출원인들은 CB6f1 마우스에서의 TC1/CASB7439 #14 챌린지에 대한, AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 LVL111(1 또는 10 ㎍)을 사용한 면역화에 의해 수여되는 종양 보호를 조사하였다. 그룹당 10마리의 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 재조합 CASB7439 단백질(LVL111)을 사용하여 2주 간격으로 4회 근육내 면역화시켰다. 또한, 염수 완충액 또는 CASB7439 단백질 중 어느 하나로 단독으로 면역화시킨 2가지 대조군을 시험하였다. 4차 면역화 2주 후에, 각각의 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439#14 세포를 피하로 챌린지하였다.
종양 성장을 42일 동안 지켜보았으나, 생존 곡선을 플롯팅하지 않았는데, 이는 42일에 너무 적은 마우스가 희생되었기 때문이다. 그 다음, 종양 성장 곡선을 각 그룹에 대하여 플롯팅하였다. 도 23/35, 상측 및 하측 패널은 각각 AS01B 및 AS15 제형으로 수득된 종양 성장 곡선을 나타낸다(주의: AS15는 이 도면에서 "AS015"로서 잘못 나타나 있다). 상기 곡선은 AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 CASB7439 단백질을 제공한 CB6f1 마우스에서, TC1/CASB7439#14 종양 성장이 둔화되었음을 보여준다.
연구 #1.2
14마리의 마우스의 그룹에 상이한 용량의 LVL111(1, 10 및 30 ㎍) 또는 대조군을 제공하였다. 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS01B 또는 AS15 중 어느 하나와 함께 제형화된 상이한 용량의 LVL111을 사용하여 2주 간격으로 4회 근육내 면역화시켰다. 또한, 4개의 대조군을 오직 AS01B, 오직 AS15, 오직 염수 완충액 또는 오직 30 ㎍의 LVL111로 면역화시켰다. 4차 면역화 2주 후에, 각각의 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439#14 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 프로토콜에 따라, 200 ㎟보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 생존 곡선을 그렸다.
상기 결과는 AS01B와 함께 제형화된 LVL111로 면역화된 마우스보다 AS15와 함께 제형화된 LVL111로 면역화된 마우스가 TC1/CASB7439#14 종양 챌린지에 대하여 더 잘 보호되는 것을 나타내었다. CB6f1 마우스에서의 최적의 결과는 AS15와 함께 제형화된 10㎍의 LVL111로 수득되었다. 도 24/35를 참조하길 바란다.
연구 #1.3
그룹당 38마리의 CB6f1 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 10 ㎍의 LVL111, LVL168 또는 LVL144를 사용하여 2주 간격으로 4회 근육내 면역화시켰다. 또한, 단독의 AS15로 면역화된 대조군을 시험하였다.
4차 면역화 2주 후에, 28마리의 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439#14 세포를 피하로 챌린지하고, 남아있는 10마리의 마우스에 100,000개 MC38/CASB7439#35 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 프로토콜에 따라, 200 ㎟보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 결과는 AS15와 함께 제형화된 LVL111, LVL168 및 LVL144가 TC1/CASB7439#14 또는 MC38/CASB7439#35 챌린지에 대하여 모두 보호성임을 보여준다. 도 25/35를 참조하길 바란다.
연구 #1.4
그룹당 66마리의 CB6f1 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 10 ㎍의 LVL168 또는 LVL144를 사용하여 2주 간격으로 4회 근육내 면역화시켰다. 또한, 단독의 AS15로 면역화된 대조군을 시험하였다.
4차 면역화 2주 후에, 그룹당 22마리의 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439#14 세포(비-클론 집단), 250,000개 TC-1/CASB7439#14-2(클론 집단) 세포 또는 100,000개 MC38/CASB7439#35 세포 중 어느 하나를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 프로토콜에 따라, 200 ㎟보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. TC1/CASB7439#14-2 챌린지는 대조군 마우스의 더 이른 죽음과 이러한 특정 연구에서 구별할 수 있는 보호 효과의 부재로 나타나는 바와 같이 TC1/CASB7439#14 챌린지보다 더 공격적인 것으로 보인다. 도 26/35를 참조하길 바란다. 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 더 공격적인 TC-1/CASB7439#14-2를 사용하여 이후의 실험을 수행하였다.
연구 #2.1
그룹당 15마리의 CB6f1 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 다양한 등몰 용량의 LVL168 또는 LVL144를 사용하여 4회 근육내 면역화시켰다. LVL168에 대해서는, 하기의 항원 용량을 사용하였다: 마우스당 0.77, 1.5, 3.1 및 6.25 ㎍. LVL144에 대해서는, 하기의 항원 용량을 사용하였다: 마우스당 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍. 또한, 단독의 AS15로 면역화된 대조군도 시험하였다. 4차 면역화 2주 후에, 모든 마우스에 250.000개 TC-1/CASB7439 #14-2(클론 집단) 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 289 ㎟(17mm X 17mm)보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 각 마우스에 대한 생존 곡선을 그렸다. TC1/CASB7439 #14-2 종양 챌린지 후에 AS15와 함께 제형화된 등몰 용량의 LVL168 및 LVL144로 수득된 생존 곡선을 도시한 도 27/35를 참조하길 바란다. TF는 무-종양 마우스를 나타낸다. AS15 대조군과 비교하여, 4 세트의 등몰 용량의 LVL144 및 LVL168은 CB6f1 마우스에서 유사하게 종양 성장을 억제하는 것으로 보인다.
연구 # 2.2
그룹당 15마리의 C57Bl/6 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 다양한 등몰 용량의 LVL168 또는 LVL144를 사용하여 4회 근육내 면역화시켰다. LVL168에 대해서는, 하기의 항원 용량을 사용하였다: 마우스당 0.77, 1.5, 3.1 및 6.25 ㎍. LVL144에 대해서는, 하기의 항원 용량을 사용하였다: 마우스당 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍. 또한, 대조군으로서, 마우스를 단독의 AS15 또는 완충액으로 면역화시켰다. 4차 면역화 2주 후에, 모든 마우스에 250.000개 TC-1/CASB7439 #14-2(클론 집단) 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 289 ㎟(17mm X 17mm)보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 각 그룹에 대한 생존 곡선을 그렸다. TC1/CASB7439 #14-2 종양 챌린지 후에 AS15와 함께 제형화된 상이한 등몰 용량의 LVL168 및 LVL144로 수득된 생존 곡선을 도시한 도 28/35를 참조하길 바란다. TF는 무-종양 마우스를 나타낸다. CB6f1 마우스에서 행한 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 면역화된 그룹, AS15 그룹 또는 완충액 그룹에서 C57Bl/6 마우스의 생존 간의 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.
연구 # 2.3
그룹당 15마리의 C57Bl/6 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 다양한 등몰 용량의 LVL168 또는 LVL144를 사용하여 4회 근육내 면역화시켰다. LVL168에 대해서는, 하기의 용량을 사용하였다: 마우스당 0.04, 0.19, 0.77, 1.5, 3.1 및 6.25 ㎍. LVL144에 대해서는, 하기의 용량을 사용하였다: 마우스당 0.078, 0.31, 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍. 또한, 단독의 AS15로 면역화된 대조군도 시험하였다. 또한, 나이브 마우스를 제2 대조군으로 사용하였다. 4차 면역화 2주 후에, 모든 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439 #14-2(클론 집단) 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 289 ㎟(17mm X 17mm)보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 각 마우스에 대한 생존 곡선을 그렸다. TC1/CASB7439 #14-2 종양 챌린지 후에 AS15와 함께 제형화된 상이한 등몰 용량의 LVL168 및 LVL144로 수득된 생존 곡선을 도시한 도 29/35 및 30/35를 참조하길 바란다. TF는 무-종양 마우스를 나타낸다.
시험한 가장 낮은 2가지 등몰 용량은 종양 성장을 유의미하게 억제하는 것으로 나타나지 않았다. 가장 높은 4가지 용량에서, LVL144 + AS15에 비하여 LVL168 + AS15로 면역화된 마우스에서 더한 종양 보호가 관찰되었다.
연구 # 2.4
연구 # 2.2에서 관찰되는 바와 같이, AS15와 함께 제형화된 CASB7439로 면역화된 C57Bl/6 마우스에서 관찰되는, TC1/CASB7439 #14-2 종양 챌린지에 대한 보호의 결여를 추가로 조사하였다. 그룹당 15마리의 CB6f1 또는 C57Bl/6 마우스를 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 최종 농도로, AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168을 사용하여 4회 근육내 면역화시켰다. 1 ㎍의 LVL168 + AS15로 면역화된 마우스의 수컷 및 암컷 그룹을 따로 연구하였다. 또한, 단독의 AS15로 면역화된 개별 수컷 및 암컷 대조군을 시험하였다.
4차 면역화 7일 후에 부분 채혈을 수득하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이, 항-CASB7439 전체 IgG 혈청 항체 역가를 ELISA로 결정하였다. 유사한 CASB7439-특이적 CD4 T-세포 반응(대략 1 x 106 ng/ml(전체 IgG))을 LVL168 + AS15로 면역화된 수컷 및 암컷 CB6f1 마우스 둘 모두에서 수득하였고; 항체 반응이 C57Bl/6 마우스에서 검출되지 않았다. 도 33/35를 참조하길 바란다.
4차 면역화 14일 후에 부분 채혈을 수득하였다. CB6f1 또는 C57Bl/6 마우스(그룹당 3마리 마우스의 5개 풀) 중 어느 하나로부터의 PBL을 전체 CASB7439 서열을 포괄하는 펩티드의 풀로 재자극시킨 후, 실시예 10에 기재된 바와 같이, CD4 및 CD8 T-세포 반응(이중 양성 IFNγ 및 TNFα)을 세포내 염색 및 유세포 분석으로 측정하였다. 또한, 펩티드 39(서열 번호 91)를 C57Bl/6으로부터의 PBL을 사용하여 시험하였다. 유사한 CASB7439-특이적 CD4 T-세포 반응(대략 0.1 % 빈도)이 LVL168 + AS15로 면역화된 수컷 및 암컷 CB6f1 마우스 둘 모두에서 수득되었으며; CASB7439-특이적 CD8 T-세포 반응(0.05 % 빈도)가 오직 수컷 마우스에서만 수득되었다. 도 34/35 및 35/35, 상측 패널을 참조하길 바란다. 전체 CASB7439 서열 또는 CASB7439 펩티드 39(서열 번호 91)(서열 번호 13의 아미노산 153 내지 167)를 포괄하는 펩티드의 풀을 사용한 PBL 재자극 후에, 1 ㎍ LVL168 + AS15로 면역화된 C57Bl/6 마우스에서 CASB7439-특이적인 CD4 또는 CD8 T-세포 반응이 검출되지 않았다. 도 34/35 및 35/35(하측 패널)를 참조하길 바란다. CASB7439 펩티드 39(서열 번호 91)가 본 발명에서 독립적으로 사용되었는데, 이는 이것이 이전에 10 ㎍ LVL168 + AS15로 4회 면역화된 C57Bl/6 마우스의 비장세포에서 낮은 CD4 T 세포 면역원성 펩티드로 동정되었기 때문임을 주목하길 바란다. 실시예 10에서 도 13을 참조하길 바란다.
4차 면역화 2주 후에, 모든 마우스에 250,000개 TC-1/CASB7439#14-2 세포를 피하로 챌린지하였다. 챌린지 후에, 각 마우스에 대하여 종양의 크기를 1주에 3회 측정하였다. 289 ㎟(17mm X 17mm)보다 더 큰 종양을 갖는 마우스를 희생시켰다. 각 그룹에 대한 종양 성장 및 생존 곡선을 그렸다. 도 31/35 및 32/35는 TC1/CASB7439 #14-2 종양 챌린지 후에 AS15와 함께 제형화된 1 ㎍의 LVL168 및 LVL144로 면역화된 수컷 또는 암컷 CB6f1 또는 C57Bl/6 마우스로 수득된 종양 성장 및 생존 곡선을 도시한다. 상기 결과는 CASB7439 + AS15가 암컷 CB6f1에 비해 수컷 CB6f1 마우스에서 더 느린 종양 성장 및 더 나은 생존을 제공하는 경향이 있으나, C57Bl/6 마우스의 종양 보호에서는 효과가 없음을 나타낸다. C57Bl/6 마우스에서의 CASB7439 종양 보호의 결여는 C57Bl/6 마우스에서의 검출가능한 CASB7439-특이적 CD4 및 CD8 T-세포의 부재뿐 아니라, 검출가능한 CASB7439-특이적 항체 반응의 부재에 상응한다. 이는 사용된 실험 조건 하에서 C57Bl/6 마우스가 CASB7439에 의한 면역원성 및 종양 보호를 연구하기에 이상적인 마우스 모델이 아님을 나타낸다. 반면, CB6f1 마우스에서, 관찰된 CASB7439 종양 보호는 유의미한 CASB7439-특이적 CD4 T-세포[참조: 면역원성 펩티드 7-8(서열 번호 13의 아미노산 25 내지 43) 및 23-24(서열 번호 13의 아미노산 89 내지 107) 도 13/35, 실시예 10] 및 CASB7439-특이적 CD8 T-세포뿐 아니라 CASB7439-특이적 항체 반응의 존재에 상응한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
SEQUENCE LISTING <110> Blais, Normand Harvey, Martine <120> CASB7439 Constructs <130> VR63365P1 <140> to be assigned <141> <160> 98 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 1 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 2 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggatggtgg caccctgccg cgtagcgctc cgccggcacc gccggttccg 120 gttggttgtg cggcgcgtcg tcgtccggcg agcccggaac tgctgcgttg cagccgtcgt 180 cgccgtccgg ccaccgcgga aaccggtggt ggtgcggcag cggttgcgcg tcgtaacgaa 240 cgtgaacgta accgtgtgaa actggtgaac ctgggctttc aggcgctgcg tcagcatgtg 300 ccgcatggcg gtgcgagcaa aaaactgagc aaagtggaaa ccctgcgtag cgcggtggaa 360 tatattcgtg cgctgcaacg tctgctggcc gaacatgatg cggtgcgtaa cgcgctggcc 420 taa 423 <210> 3 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 3 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg 130 135 140 Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro 145 150 155 160 Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly 165 170 175 Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu 180 185 190 Gly Gly Tyr His His His His His His 195 200 <210> 4 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 4 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggatggtgg caccctgccg cgtagcgcac cgccggctcc gccggttccg 120 gttggttgtg cggcgcgtcg tcgtccggcg agcccggaac tgctgcgttg cagccgtcgt 180 cgccgtccgg ccaccgcgga aaccggtggt ggtgcggcag cggttgcgcg tcgtaacgaa 240 cgtgaacgta accgtgtgaa actggtgaac ctgggctttc aggcgctgcg tcagcatgtg 300 ccgcatggcg gtgcgagcaa aaaactgagc aaagtggaaa ccctgcgtag cgcggtggaa 360 tatattcgtg cgctgcaacg tctgctggcc gaacatgatg cggtgcgtaa cgcgctggcc 420 ggtggtctgc gtccgcaggc ggttcgtccg agcgcgccgc gtggtggtag cagcgaaccg 480 ggtagcccgc gtagcgccta tagcagcgat gatagcggct gcgaaggtgc cctgagcccg 540 gcggaacgtg aactgctgga ttttagcagc tggctgggcg gctatcatca tcatcaccat 600 cattaa 606 <210> 5 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 5 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg 130 135 140 Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro 145 150 155 160 Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly 165 170 175 Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu 180 185 190 Gly Gly Tyr 195 <210> 6 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 6 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggatggtgg caccctgccg cgtagcgcac cgccggctcc gccggttccg 120 gttggttgtg cggcgcgtcg tcgtccggcg agcccggaac tgctgcgttg cagccgtcgt 180 cgccgtccgg ccaccgcgga aaccggtggt ggtgcggcag cggttgcgcg tcgtaacgaa 240 cgtgaacgta accgtgtgaa actggtgaac ctgggctttc aggcgctgcg tcagcatgtg 300 ccgcatggcg gtgcgagcaa aaaactgagc aaagtggaaa ccctgcgtag cgcggtggaa 360 tatattcgtg cgctgcaacg tctgctggcc gaacatgatg cggtgcgtaa cgcgctggcc 420 ggtggtctgc gtccgcaggc ggttcgtccg agcgcgccgc gtggtggtag cagcgaaccg 480 ggtagcccgc gtagcgccta tagcagcgat gatagcggct gcgaaggtgc cctgagcccg 540 gcggaacgtg aactgctgga ttttagcagc tggctgggcg gctattaa 588 <210> 7 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 7 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Ala 100 105 110 Ala Ala His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala 115 120 125 Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn 165 170 175 Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val 180 185 190 Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg 195 200 205 Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His 210 215 220 Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val 225 230 235 240 Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg 245 250 255 Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro 260 265 270 Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr His 275 280 285 His His His His His 290 <210> 8 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 8 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accgcggccg cacatatgga tggtggcacc 360 ctgccgcgta gcgcaccgcc ggctccgccg gttccggttg gttgtgcggc gcgtcgtcgt 420 ccggcgagcc cggaactgct gcgttgcagc cgtcgtcgcc gtccggccac cgcggaaacc 480 ggtggtggtg cggcagcggt tgcgcgtcgt aacgaacgtg aacgtaaccg tgtgaaactg 540 gtgaacctgg gctttcaggc gctgcgtcag catgtgccgc atggcggtgc gagcaaaaaa 600 ctgagcaaag tggaaaccct gcgtagcgcg gtggaatata ttcgtgcgct gcaacgtctg 660 ctggccgaac atgatgcggt gcgtaacgcg ctggccggtg gtctgcgtcc gcaggcggtt 720 cgtccgagcg cgccgcgtgg tggtagcagc gaaccgggta gcccgcgtag cgcctatagc 780 agcgatgata gcggctgcga aggtgccctg agcccggcgg aacgtgaact gctggatttt 840 agcagctggc tgggcggcta tcatcatcat caccatcatt aa 882 <210> 9 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 9 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Asp 100 105 110 Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val 115 120 125 Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys 130 135 140 Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala 145 150 155 160 Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val 165 170 175 Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala 180 185 190 Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr 195 200 205 Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn 210 215 220 Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro 225 230 235 240 Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser 245 250 255 Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu 260 265 270 Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr His His His His His His 275 280 285 <210> 10 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 10 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accgatggtg gcaccctgcc gcgtagcgca 360 ccgccggctc cgccggttcc ggttggttgt gcggcgcgtc gtcgtccggc gagcccggaa 420 ctgctgcgtt gcagccgtcg tcgccgtccg gccaccgcgg aaaccggtgg tggtgcggca 480 gcggttgcgc gtcgtaacga acgtgaacgt aaccgtgtga aactggtgaa cctgggcttt 540 caggcgctgc gtcagcatgt gccgcatggc ggtgcgagca aaaaactgag caaagtggaa 600 accctgcgta gcgcggtgga atatattcgt gcgctgcaac gtctgctggc cgaacatgat 660 gcggtgcgta acgcgctggc cggtggtctg cgtccgcagg cggttcgtcc gagcgcgccg 720 cgtggtggta gcagcgaacc gggtagcccg cgtagcgcct atagcagcga tgatagcggc 780 tgcgaaggtg ccctgagccc ggcggaacgt gaactgctgg attttagcag ctggctgggc 840 ggctatcatc atcatcacca tcattaa 867 <210> 11 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 11 Met His His His His His His His His His His Asp Gly Gly Thr Leu 1 5 10 15 Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala 20 25 30 Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg 35 40 45 Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg 50 55 60 Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe 65 70 75 80 Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu 85 90 95 Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu 100 105 110 Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly 115 120 125 Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser 130 135 140 Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly 145 150 155 160 Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser 165 170 175 Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 180 <210> 12 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 12 atgcatcatc atcatcatca tcatcatcat catgacggtg gcaccctgcc gcgtagcgca 60 ccgccggctc cgccggttcc ggttggttgt gcggcgcgtc gtcgtccggc gagcccggaa 120 ctgctgcgtt gcagccgtcg tcgccgtccg gccaccgcgg aaaccggtgg tggtgcggca 180 gcggttgcgc gtcgtaacga acgtgaacgt aaccgtgtga aactggtgaa cctgggcttt 240 caggcgctgc gtcagcatgt gccgcatggc ggtgcgagca aaaaactgag caaagtggaa 300 accctgcgta gcgcggtgga atatattcgt gcgctgcaac gtctgctggc cgaacatgat 360 gcggtgcgta acgcgctggc cggtggtctg cgtccgcagg cggttcgtcc gagcgcgccg 420 cgtggtggta gcagcgaacc gggtagcccg cgtagcgcct atagcagcga tgatagcggc 480 tgcgaaggtg ccctgagccc ggcggaacgt gaactgctgg attttagcag ctggctgggc 540 ggctattaa 549 <210> 13 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 13 Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val 85 90 95 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 100 105 110 Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser 130 135 140 Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser 145 150 155 160 Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu 165 170 175 Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly 180 185 190 Tyr <210> 14 <211> 582 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 14 atggacggcg gcacactgcc caggtccgcg ccccctgcgc cccccgtccc tgtcggctgc 60 gctgcccggc ggagacccgc gtccccggaa ctgttgcgct gcagccggcg gcggcgaccg 120 gccaccgcag agaccggagg cggcgcagcg gccgtagcgc ggcgcaatga gcgcgagcgc 180 aaccgcgtga agctggtgaa cttgggcttc caggcgctgc ggcagcacgt gccgcacggc 240 ggcgccagca agaagctgag caaggtggag acgctgcgct cagccgtgga gtacatccgc 300 gcgctgcagc gcctgctggc cgagcacgac gccgtgcgca acgcgctggc gggagggctg 360 aggccgcagg ccgtgcggcc gtctgcgccc cgcgggccgc cagggaccac cccggtcgcc 420 gcctcgccct cccgcgcttc ttcgtccccg ggccgcgggg gcagctcgga gcccggctcc 480 ccgcgttccg cctactcgtc ggacgacagc ggctgcgaag gcgcgctgag tcctgcggag 540 cgcgagctac tcgacttctc cagctggtta gggggctact ga 582 <210> 15 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 15 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Leu Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg 130 135 140 Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr 145 150 155 160 Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly 165 170 175 Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp 180 185 190 Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp 195 200 205 Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 210 215 <210> 16 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 16 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggacggcgg cacactgccc aggtccgcgc cccctgcgcc ccccgtcctt 120 gtcggctgcg ctgcccggcg gagacccgcg tccccggaac tgttgcgctg cagccggcgg 180 cggcgaccgg ccaccgcaga gaccggaggc ggcgcagcgg ccgtagcgcg gcgcaatgag 240 cgcgagcgca accgcgtgaa gctggtgaac ttgggcttcc aggcgctgcg gcagcacgtg 300 ccgcacggcg gcgccagcaa gaagctgagc aaggtggaga cgctgcgctc agccgtggag 360 tacatccgcg cgctgcagcg cctgctggcc gagcacgacg ccgtgcgcaa cgcgctggcg 420 ggagggctga ggccgcaggc cgtgcggccg tctgcgcccc gcgggccgcc agggaccacc 480 ccggtcgccg cctcgccctc ccgcgcttct tcgtccccgg gccgcggggg cagctcggag 540 cccggctccc cgcgttccgc ctactcgtcg gacgacagcg gctgcgaagg cgcgctgagt 600 cctgcggagc gcgagctact cgacttctcc agctggttag ggggctactg a 651 <210> 17 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 17 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg 130 135 140 Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr 145 150 155 160 Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly 165 170 175 Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp 180 185 190 Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp 195 200 205 Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 210 215 <210> 18 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 18 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggacggcgg cacactgccc aggtccgcgc cccctgcgcc ccccgtccct 120 gtcggctgcg ctgcccggcg gagacccgcg tccccggaac tgttgcgctg cagccggcgg 180 cggcgaccgg ccaccgcaga gaccggaggc ggcgcagcgg ccgtagcgcg gcgcaatgag 240 cgcgagcgca accgcgtgaa gctggtgaac ttgggcttcc aggcgctgcg gcagcacgtg 300 ccgcacggcg gcgccagcaa gaagctgagc aaggtggaga cgctgcgctc agccgtggag 360 tacatccgcg cgctgcagcg cctgctggcc gagcacgacg ccgtgcgcaa cgcgctggcg 420 ggagggctga ggccgcaggc cgtgcggccg tctgcgcccc gcgggccgcc agggaccacc 480 ccggtcgccg cctcgccctc ccgcgcttct tcgtccccgg gccgcggggg cagctcggag 540 cccggctccc cgcgttccgc ctactcgtcg gacgacagcg gctgcgaagg cgcgctgagt 600 cctgcggagc gcgagctact cgacttctcc agctggttag ggggctactg a 651 <210> 19 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 19 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg 35 40 45 Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val 100 105 110 Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg 130 135 140 Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr 145 150 155 160 Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly 165 170 175 Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp 180 185 190 Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp 195 200 205 Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 210 215 <210> 20 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 20 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggatggtgg caccctgccg cgtagcgctc cgccggcacc gccggttccg 120 gttggttgtg cggcgcgtcg tcgtccggcg agcccggaac tgctgcgttg cagccgtcgt 180 cgccgtccgg ccaccgcgga aaccggtggt ggtgcggcag cggttgcgcg tcgtaacgaa 240 cgtgaacgta accgtgtgaa actggtgaac ctgggctttc aggcgctgcg tcagcatgtg 300 ccgcatggcg gtgcgagcaa aaaactgagc aaagtggaaa ccctgcgtag cgcggtggaa 360 tatattcgtg cgctgcaacg tctgctggcc gaacatgatg cggtgcgtaa cgcgctggcc 420 ggtggtctgc gtccgcaggc ggttcgtccg agcgcaccgc gtggtccgcc gggtacgacg 480 ccggttgcag cgagcccgag ccgtgcgagc agctctccgg gtcgtggtgg tagcagcgaa 540 ccgggtagcc cgcgtagcgc ctatagcagc gatgatagcg gctgcgaagg tgccctgtct 600 ccggcggaac gtgaactgct ggattttagc agctggctgg gcggctatta a 651 <210> 21 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 21 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys 35 40 45 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly 50 55 60 Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val 65 70 75 80 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 85 90 95 Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser 100 105 110 Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser 115 120 125 Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu 145 150 155 160 Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly 165 170 175 Tyr Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu 180 185 190 Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln 195 <210> 22 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 22 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggccaccgc ggaaaccggt ggtggtgcgg cagcggttgc gcgtcgtaac 120 gaacgtgaac gtaaccgtgt gaaactggtg aacctgggct ttcaggcgct gcgtcagcat 180 gtgccgcatg gcggtgcgag caaaaaactg agcaaagtgg aaaccctgcg tagcgcggtg 240 gaatatattc gtgcgctgca acgtctgctg gccgaacatg atgcggtgcg taacgcgctg 300 gccggtggtc tgcgtccgca ggcggttcgt ccgagcgcac cgcgtggtcc gccgggtacg 360 acgccggttg cagcgagccc gagccgtgcg agcagctctc cgggtcgtgg tggtagcagc 420 gaaccgggta gcccgcgtag cgcctatagc agcgatgata gcggctgcga aggtgccctg 480 tctccggcgg aacgtgaact gctggatttt agcagctggc tgggcggcta tctcgaggat 540 ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 600 <210> 23 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 23 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu 20 25 30 Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg 50 55 60 Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu 65 70 75 80 Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly 85 90 95 Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala 115 120 125 Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu 130 135 140 Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 145 150 155 <210> 24 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 24 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tgaaccgtgt gaaactggtg aacctgggct ttcaggcgct gcgtcagcat 120 gtgccgcatg gcggtgcgag caaaaaactg agcaaagtgg aaaccctgcg tagcgcggtg 180 gaatatattc gtgcgctgca acgtctgctg gccgaacatg atgcggtgcg taacgcgctg 240 gccggtggtc tgcgtccgca ggcggttcgt ccgagcgcac cgcgtggtcc gccgggtacg 300 acgccggttg cagcgagccc gagccgtgcg agcagctctc cgggtcgtgg tggtagcagc 360 gaaccgggta gcccgcgtag cgcctatagc agcgatgata gcggctgcga aggtgccctg 420 tctccggcgg aacgtgaact gctggatttt agcagctggc tgggcggcta ttaa 474 <210> 25 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 25 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn 20 25 30 Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala 35 40 45 Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys 50 55 60 Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg 65 70 75 80 Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala 85 90 <210> 26 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 26 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgacgacgac 60 gacaagcata tggcggcagc ggttgcgcgt cgtaacgaac gtgaacgtaa ccgtgtgaaa 120 ctggtgaacc tgggctttca ggcgctgcgt cagcatgtgc cgcatggcgg tgcgagcaaa 180 aaactgagca aagtggaaac cctgcgtagc gcggtggaat atattcgtgc gctgcaacgt 240 ctgctggccg aacatgatgc ggtgcgtaac gcgctggcct aa 282 <210> 27 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 27 Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val 85 90 95 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 100 105 110 Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg 145 150 155 160 Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr His His His His 165 170 175 His His <210> 28 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 28 atggatggtg gcaccctgcc gcgtagcgca ccgccggctc cgccggttcc ggttggttgt 60 gcggcgcgtc gtcgtccggc gagcccggaa ctgctgcgtt gcagccgtcg tcgccgtccg 120 gccaccgcgg aaaccggtgg tggtgcggca gcggttgcgc gtcgtaacga acgtgaacgt 180 aaccgtgtga aactggtgaa cctgggcttt caggcgctgc gtcagcatgt gccgcatggc 240 ggtgcgagca aaaaactgag caaagtggaa accctgcgta gcgcggtgga atatattcgt 300 gcgctgcaac gtctgctggc cgaacatgat gcggtgcgta acgcgctggc cggtggtctg 360 cgtccgcagg cggttcgtcc gagcgcgccg cgtggtggta gcagcgaacc gggtagcccg 420 cgtagcgcct atagcagcga tgatagcggc tgcgaaggtg ccctgagccc ggcggaacgt 480 gaactgctgg attttagcag ctggctgggc ggctatcatc atcatcacca tcattaa 537 <210> 29 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 29 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Ala 100 105 110 Ala Ala Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro 115 120 125 Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg 165 170 175 Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro 180 185 190 His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser 195 200 205 Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp 210 215 220 Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg 225 230 235 240 Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser 245 250 255 Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro 260 265 270 Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly 275 280 285 Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu 290 295 300 Gly Gly Tyr Leu Glu His His His His His His 305 310 315 <210> 30 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 30 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accgcggccg caatggatgg tggcaccctg 360 ccgcgtagcg ctccgccggc accgccggtt ccggttggtt gtgcggcgcg tcgtcgtccg 420 gcgagcccgg aactgctgcg ttgcagccgt cgtcgccgtc cggccaccgc ggaaaccggt 480 ggtggtgcgg cagcggttgc gcgtcgtaac gaacgtgaac gtaaccgtgt gaaactggtg 540 aacctgggct ttcaggcgct gcgtcagcat gtgccgcatg gcggtgcgag caaaaaactg 600 agcaaagtgg aaaccctgcg tagcgcggtg gaatatattc gtgcgctgca acgtctgctg 660 gccgaacatg atgcggtgcg taacgcgctg gccggtggtc tgcgtccgca ggcggttcgt 720 ccgagcgcac cgcgtggtcc gccgggtacg acgccggttg cagcgagccc gagccgtgcg 780 agcagctctc cgggtcgtgg tggtagcagc gaaccgggta gcccgcgtag cgcctatagc 840 agcgatgata gcggctgcga aggtgccctg tctccggcgg aacgtgaact gctggatttt 900 agcagctggc tgggcggcta tctcgagcac caccaccacc accactga 948 <210> 31 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 31 Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val 85 90 95 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 100 105 110 Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser 130 135 140 Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser 145 150 155 160 Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu 165 170 175 Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly 180 185 190 Tyr Leu Glu His His His His His His 195 200 <210> 32 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 32 atggatggtg gcaccctgcc gcgtagcgct ccgccggcac cgccggttcc ggttggttgt 60 gcggcgcgtc gtcgtccggc gagcccggaa ctgctgcgtt gcagccgtcg tcgccgtccg 120 gccaccgcgg aaaccggtgg tggtgcggca gcggttgcgc gtcgtaacga acgtgaacgt 180 aaccgtgtga aactggtgaa cctgggcttt caggcgctgc gtcagcatgt gccgcatggc 240 ggtgcgagca aaaaactgag caaagtggaa accctgcgta gcgcggtgga atatattcgt 300 gcgctgcaac gtctgctggc cgaacatgat gcggtgcgta acgcgctggc cggtggtctg 360 cgtccgcagg cggttcgtcc gagcgcaccg cgtggtccgc cgggtacgac gccggttgca 420 gcgagcccga gccgtgcgag cagctctccg ggtcgtggtg gtagcagcga accgggtagc 480 ccgcgtagcg cctatagcag cgatgatagc ggctgcgaag gtgccctgtc tccggcggaa 540 cgtgaactgc tggattttag cagctggctg ggcggctatc tcgagcacca ccaccaccac 600 cactga 606 <210> 33 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 33 Met His His His His His His Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro 20 25 30 Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg 50 55 60 Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg 65 70 75 80 Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu 85 90 95 Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu 100 105 110 Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro 115 120 125 Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly 130 135 140 Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly 165 170 175 Gly Tyr <210> 34 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 34 atgcaccatc accatcacca tgatggtggc accctgccgc gtagcgcacc gccggctccg 60 ccggttccgg ttggttgtgc ggcgcgtcgt cgtccggcga gcccggaact gctgcgttgc 120 agccgtcgtc gccgtccggc caccgcggaa accggtggtg gtgcggcagc ggttgcgcgt 180 cgtaacgaac gtgaacgtaa ccgtgtgaaa ctggtgaacc tgggctttca ggcgctgcgt 240 cagcatgtgc cgcatggcgg tgcgagcaaa aaactgagca aagtggaaac cctgcgtagc 300 gcggtggaat atattcgtgc gctgcaacgt ctgctggccg aacatgatgc ggtgcgtaac 360 gcgctggccg gtggtctgcg tccgcaggcg gttcgtccga gcgcgccgcg tggtggtagc 420 agcgaaccgg gtagcccgcg tagcgcctat agcagcgatg atagcggctg cgaaggtgcc 480 ctgagcccgg cggaacgtga actgctggat tttagcagct ggctgggcgg ctattaa 537 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli plasmid linker <400> 35 atgcatcatc atcatcatca tgac 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli plasmid linker <400> 36 atgcaccatc accatcacca tgat 24 <210> 37 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 37 Met His His His His His His Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro 20 25 30 Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr 35 40 45 Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg 50 55 60 Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg 65 70 75 80 Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu 85 90 95 Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu 100 105 110 Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro 115 120 125 Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly 130 135 140 Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly 165 170 175 Gly Tyr <210> 38 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 38 atgcatcatc atcatcatca tgacggtggc accctgccgc gtagcgcacc gccggctccg 60 ccggttccgg ttggttgtgc ggcgcgtcgt cgtccggcga gcccggaact gctgcgttgc 120 agccgtcgtc gccgtccggc caccgcggaa accggtggtg gtgcggcagc ggttgcgcgt 180 cgtaacgaac gtgaacgtaa ccgtgtgaaa ctggtgaacc tgggctttca ggcgctgcgt 240 cagcatgtgc cgcatggcgg tgcgagcaaa aaactgagca aagtggaaac cctgcgtagc 300 gcggtggaat atattcgtgc gctgcaacgt ctgctggccg aacatgatgc ggtgcgtaac 360 gcgctggccg gtggtctgcg tccgcaggcg gttcgtccga gcgcgccgcg tggtggtagc 420 agcgaaccgg gtagcccgcg tagcgcctat agcagcgatg atagcggctg cgaaggtgcc 480 ctgagcccgg cggaacgtga actgctggat tttagcagct ggctgggcgg ctattaa 537 <210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H. Influenzae <400> 39 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 100 105 110 <210> 40 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 40 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa acc 333 <210> 41 <211> 364 <212> PRT <213> H. Influenza Protien D <400> 41 Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys 115 120 125 Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys 130 135 140 Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln 145 150 155 160 Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile 165 170 175 Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu 180 185 190 Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met 195 200 205 Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr 210 215 220 Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile 225 230 235 240 Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr 245 250 255 Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala 260 265 270 Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu 275 280 285 Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu 290 295 300 Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val 305 310 315 320 Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr 325 330 335 Asp Ala Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe 340 345 350 Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys 355 360 <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli vector polyhistidine tag <400> 42 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Asp Asp Asp Asp Lys His 20 <210> 43 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 43 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys 100 105 110 Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys 115 120 125 Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln 130 135 140 Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu 165 170 175 Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met 180 185 190 Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr 195 200 205 Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile 210 215 220 Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr 225 230 235 240 Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala 245 250 255 Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu 260 265 270 Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu 275 280 285 Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val 290 295 300 Arg Lys Asp Ala Leu Pro Ala Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr 305 310 315 320 Asp Val Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe 325 330 335 Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Ala Ala Ala Met 340 345 350 Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro 355 360 365 Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg 370 375 380 Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala 385 390 395 400 Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu 405 410 415 Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly 420 425 430 Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu 435 440 445 Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg 450 455 460 Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala 465 470 475 480 Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg 485 490 495 Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro 500 505 510 Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser 515 520 525 Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 530 535 540 Leu Glu His His His His His His 545 550 <210> 44 <211> 1656 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 44 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga gtctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc accgtaaaga tggtcgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accaaagatg gcaaacaagc gcaagtttat 360 cctaatcgtt tcccactttg gaaatcacat tttagaattc atacctttga agatgaaatt 420 gaatttatcc aaggcttaga aaaatccact ggcaaaaaag tagggattta tccagaaatc 480 aaagcacctt ggttccacca tcaaaatggt aaagatattg ctgctgaaac gctcaaagtg 540 ttaaaaaaat atggctatga taagaaaacc gatatggttt acttacaaac tttcgatttt 600 aatgaattaa aacgtatcaa aacggaatta cttccacaaa tgggaatgga tttgaaatta 660 gttcaattaa ttgcttatac agattggaaa gaaacacaag aaaaagaccc aaagggttat 720 tgggtaaact ataattacga ttggatgttt aaacctggtg caatggcaga agtggttaaa 780 tatgccgatg gtgttggccc aggttggtat atgttagtta ataaagaaga atccaaacct 840 gataatattg tgtacactcc gttggtaaaa gaacttgcac aatataatgt ggaagtgcat 900 ccttacaccg tgcgtaaaga tgcactaccc gcgtttttca cagacgtaaa tcaaatgtat 960 gatgtcttat tgaataaatc aggggcaaca ggtgtattta ctgatttccc agatactggc 1020 gtggaattct taaaaggaat aaaagcggcc gcaatggatg gtggcaccct gccgcgtagc 1080 gctccgccgg caccgccggt tccggttggt tgtgcggcgc gtcgtcgtcc ggcgagcccg 1140 gaactgctgc gttgcagccg tcgtcgccgt ccggccaccg cggaaaccgg tggtggtgcg 1200 gcagcggttg cgcgtcgtaa cgaacgtgaa cgtaaccgtg tgaaactggt gaacctgggc 1260 tttcaggcgc tgcgtcagca tgtgccgcat ggcggtgcga gcaaaaaact gagcaaagtg 1320 gaaaccctgc gtagcgcggt ggaatatatt cgtgcgctgc aacgtctgct ggccgaacat 1380 gatgcggtgc gtaacgcgct ggccggtggt ctgcgtccgc aggcggttcg tccgagcgca 1440 ccgcgtggtc cgccgggtac gacgccggtt gcagcgagcc cgagccgtgc gagcagctct 1500 ccgggtcgtg gtggtagcag cgaaccgggt agcccgcgta gcgcctatag cagcgatgat 1560 agcggctgcg aaggtgccct gtctccggcg gaacgtgaac tgctggattt tagcagctgg 1620 ctgggcggct atctcgagca ccaccaccac caccac 1656 <210> 45 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 45 Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile 20 25 30 Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys 35 40 45 Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln 50 55 60 Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile 85 90 95 Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Gly Gly Thr Leu Pro 100 105 110 Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg 115 120 125 Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg 130 135 140 Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg 145 150 155 160 Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln 165 170 175 Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser 180 185 190 Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln 195 200 205 Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly 210 215 220 Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly 225 230 235 240 Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly 245 250 255 Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu 275 280 285 Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 290 295 <210> 46 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 46 atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60 gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120 tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180 gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240 caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300 cgcgaacaga ttggaggtga tggtggcacc ctgccgcgta gcgctccgcc ggcaccgccg 360 gttccggttg gttgtgcggc gcgtcgtcgt ccggcgagcc cggaactgct gcgttgcagc 420 cgtcgtcgcc gtccggccac cgcggaaacc ggtggtggtg cggcagcggt tgcgcgtcgt 480 aacgaacgtg aacgtaaccg tgtgaaactg gtgaacctgg gctttcaggc gctgcgtcag 540 catgtgccgc atggcggtgc gagcaaaaaa ctgagcaaag tggaaaccct gcgtagcgcg 600 gtggaatata ttcgtgcgct gcaacgtctg ctggccgaac atgatgcggt gcgtaacgcg 660 ctggccggtg gtctgcgtcc gcaggcggtt cgtccgagcg caccgcgtgg tccgccgggt 720 acgacgccgg ttgcagcgag cccgagccgt gcgagcagct ctccgggtcg tggtggtagc 780 agcgaaccgg gtagcccgcg tagcgcctat agcagcgatg atagcggctg cgaaggtgcc 840 ctgtctccgg cggaacgtga actgctggat tttagcagct ggctgggcgg ctat 894 <210> 47 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 47 Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile 20 25 30 Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys 35 40 45 Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln 50 55 60 Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile 85 90 95 Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Pro Ser Ser His Ser 100 105 110 Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala 115 120 125 His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr Leu Glu Ser Lys 130 135 140 Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala 145 150 155 160 Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp His Phe Leu Asp 165 170 175 Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg His Arg Lys Asp 180 185 190 Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu 195 200 205 Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Ala Ala Ala Met Asp Gly Gly Thr 210 215 220 Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala 225 230 235 240 Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg 245 250 255 Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala 260 265 270 Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly 275 280 285 Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys 290 295 300 Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala 305 310 315 320 Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala 325 330 335 Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro 340 345 350 Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser 355 360 365 Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr 370 375 380 Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg 385 390 395 400 Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 405 410 <210> 48 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 48 atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60 gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120 tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180 gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240 caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300 cgcgaacaga ttggaggtga tccaagcagc cattcatcaa atatggcgaa tacccaaatg 360 aaatcagaca aaatcattat tgctcaccgt ggtgctagcg gttatttacc agagcatacg 420 ttagaatcta aagcacttgc gtttgcacaa caggctgatt atttagagca agatttagca 480 atgactaagg atggtcgttt agtggttatt cacgatcact ttttagatgg cttgactgat 540 gttgcgaaaa aattcccaca tcgtcatcgt aaagatggcc gttactatgt catcgacttt 600 accttaaaag aaattcaaag tttagaaatg acagaaaact ttgaaaccgc ggccgcaatg 660 gatggtggca ccctgccgcg tagcgctccg ccggcaccgc cggttccggt tggttgtgcg 720 gcgcgtcgtc gtccggcgag cccggaactg ctgcgttgca gccgtcgtcg ccgtccggcc 780 accgcggaaa ccggtggtgg tgcggcagcg gttgcgcgtc gtaacgaacg tgaacgtaac 840 cgtgtgaaac tggtgaacct gggctttcag gcgctgcgtc agcatgtgcc gcatggcggt 900 gcgagcaaaa aactgagcaa agtggaaacc ctgcgtagcg cggtggaata tattcgtgcg 960 ctgcaacgtc tgctggccga acatgatgcg gtgcgtaacg cgctggccgg tggtctgcgt 1020 ccgcaggcgg ttcgtccgag cgcaccgcgt ggtccgccgg gtacgacgcc ggttgcagcg 1080 agcccgagcc gtgcgagcag ctctccgggt cgtggtggta gcagcgaacc gggtagcccg 1140 cgtagcgcct atagcagcga tgatagcggc tgcgaaggtg ccctgtctcc ggcggaacgt 1200 gaactgctgg attttagcag ctggctgggc ggctat 1236 <210> 49 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 49 Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile 20 25 30 Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys 35 40 45 Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln 50 55 60 Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile 85 90 95 Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Gly Gly Thr Leu Pro 100 105 110 Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg 115 120 125 Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg 130 135 140 Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg 145 150 155 160 Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln 165 170 175 Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser 180 185 190 Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln 195 200 205 Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala 210 215 220 <210> 50 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 50 atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60 gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120 tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180 gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240 caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300 cgcgaacaga ttggaggtga tggtggcacc ctgccgcgta gcgctccgcc ggcaccgccg 360 gttccggttg gttgtgcggc gcgtcgtcgt ccggcgagcc cggaactgct gcgttgcagc 420 cgtcgtcgcc gtccggccac cgcggaaacc ggtggtggtg cggcagcggt tgcgcgtcgt 480 aacgaacgtg aacgtaaccg tgtgaaactg gtgaacctgg gctttcaggc gctgcgtcag 540 catgtgccgc atggcggtgc gagcaaaaaa ctgagcaaag tggaaaccct gcgtagcgcg 600 gtggaatata ttcgtgcgct gcaacgtctg ctggccgaac atgatgcggt gcgtaacgcg 660 ctggcc 666 <210> 51 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 51 Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile 20 25 30 Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys 35 40 45 Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln 50 55 60 Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile 85 90 95 Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Gly Gly Thr Leu Pro 100 105 110 Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg 115 120 125 Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg 130 135 140 Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg 145 150 155 160 Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln 165 170 175 Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser 180 185 190 Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln 195 200 205 Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly 210 215 220 Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Gly Ser Ser 225 230 235 240 Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys 245 250 255 Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser 260 265 270 Trp Leu Gly Gly Tyr 275 <210> 52 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 52 atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60 gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120 tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180 gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240 caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300 cgcgaacaga ttggaggtga tggtggcacc ctgccgcgta gcgcaccgcc ggctccgccg 360 gttccggttg gttgtgcggc gcgtcgtcgt ccggcgagcc cggaactgct gcgttgcagc 420 cgtcgtcgcc gtccggccac cgcggaaacc ggtggtggtg cggcagcggt tgcgcgtcgt 480 aacgaacgtg aacgtaaccg tgtgaaactg gtgaacctgg gctttcaggc gctgcgtcag 540 catgtgccgc atggcggtgc gagcaaaaaa ctgagcaaag tggaaaccct gcgtagcgcg 600 gtggaatata ttcgtgcgct gcaacgtctg ctggccgaac atgatgcggt gcgtaacgcg 660 ctggccggtg gtctgcgtcc gcaggcggtt cgtccgagcg cgccgcgtgg tggtagcagc 720 gaaccgggta gcccgcgtag cgcctatagc agcgatgata gcggctgcga aggtgccctg 780 agcccggcgg aacgtgaact gctggatttt agcagctggc tgggcggcta t 831 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> HoArtificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 53 Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 54 Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 55 Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 56 Ala Pro Pro Val Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 57 Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 58 Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 59 Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 60 Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 61 Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 62 Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 63 Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 64 Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 65 Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 66 Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 67 Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 68 Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 69 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 70 Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 71 Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 72 Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 73 Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 74 Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 75 Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 76 Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 77 Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 78 Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 79 Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 80 His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 81 Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 82 Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 83 Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 84 Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 85 Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 86 Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 87 Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 88 Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 89 Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 90 Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 91 Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 92 Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 93 Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 94 Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 95 Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 96 Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 97 Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapien <400> 98 Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 1 5 10 15

Claims (21)

  1. 하나 이상의 발현 증가 변형을 포함하며, 여기서, 상기 발현 증가 변형이 적어도 서열 번호 13의 프롤린-풍부 영역의 일부 또는 모두의 결실을 포함하는, 변형된 CASB7439 폴리펩티드.
  2. 제1항의 변형된 CASB7439 폴리펩티드를 포함하고, 하나 이상의 이종 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 단백질 작제물(construct).
  3. 제3항에 있어서, 상기 단백질 작제물이 하기로부터 선택되는 작제물을 포함하는, 단백질 작제물:
    (a) LVL055(서열 번호 1);
    (b) LVL111(서열 번호 3);
    (c) LVL137(서열 번호 5);
    (d) LVL141(서열 번호 7);
    (e) LVL144(서열 번호 9); 및
    (f) LVL168(서열 번호 11).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하며, 여기서, 상기 담체 또는 부형제가 임의로 완충액을 포함할 수 있는, 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 애쥬번트가 하나 이상의 Th1 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  7. 제4항, 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 애쥬번트가 TLR-4 효능제(agonist), 면역학적 활성 사포닌 분획, TLR-9 효능제 중 하나 이상을 포함하는, 면역원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 TLR-4 효능제가 3D-MPL인, 면역원성 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 TLR-9 효능제가 CpG 올리고뉴클레오티드인, 면역원성 조성물.
  10. 제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 면역학적 활성 사포닌 분획이 QS21인, 면역원성 조성물.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 3D-MPL을 포함하는, 면역원성 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CpG를 포함하는, 면역원성 조성물.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, QS21을 포함하는, 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 콜레스테롤을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 애쥬번트 및 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물을 인간 또는 비인간 동물에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비인간 동물에서의 CASB7439에 대한 면역반응의 유도 방법:
    (a) 서열 번호 9에 나타낸 폴리펩티드 서열; 및
    (b) 서열 번호 11에 나타낸 폴리펩티드 서열.
  17. (a) CASB7439를 발현하는 암 세포를 갖는 인간 또는 비인간 동물을 선택하는 단계; 및
    (b) 애쥬번트, 및 (i) 서열 번호 9에 나타낸 작제물 및 (ii) 서열 번호 11에 나타낸 작제물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는 조성물을 상기 인간 또는 비인간 동물에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 또는 비인간 동물의 치료 방법.
  18. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비인간 동물에서의 CASB7439에 대한 면역 반응의 유도 방법에서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는, 면역원성 조성물:
    (a) 서열 번호 9에 나타낸 작제물; 및
    (b) 서열 번호 11에 나타낸 작제물.
  20. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 비인간 동물에서의 CASB7439에 대한 면역 반응의 유도 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 면역원성 조성물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는, 용도:
    (i) 서열 번호 9에 나타낸 작제물; 및
    (ii) 서열 번호 11에 나타낸 작제물.
KR1020117031060A 2009-05-27 2010-05-25 Ｃａｓｂ7439 작제물 KR20120014054A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18138009P 2009-05-27 2009-05-27
US22039609P 2009-06-25 2009-06-25
US61/220,396 2009-06-25
PCT/EP2010/057141 WO2010136443A1 (en) 2009-05-27 2010-05-25 Casb7439 constructs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120014054A true KR20120014054A (ko) 2012-02-15

Family

ID=42556967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117031060A KR20120014054A (ko) 2009-05-27 2010-05-25 Ｃａｓｂ7439 작제물

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8916514B2 (ko)
EP (1) EP2435469A1 (ko)
JP (1) JP2012528106A (ko)
KR (1) KR20120014054A (ko)
CN (1) CN102459324B (ko)
AU (1) AU2010252012A1 (ko)
BR (1) BRPI1012078A2 (ko)
CA (1) CA2763486A1 (ko)
CL (1) CL2011002994A1 (ko)
CO (1) CO6400229A2 (ko)
DO (1) DOP2011000348A (ko)
EA (1) EA020617B1 (ko)
IL (1) IL216351A0 (ko)
MA (1) MA33409B1 (ko)
MX (1) MX2011012623A (ko)
NZ (1) NZ596501A (ko)
PE (1) PE20120400A1 (ko)
SG (1) SG176220A1 (ko)
WO (1) WO2010136443A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ520673A (en) 2000-02-23 2004-09-24 Smithkline Beecham Biolog S Tumour-specific animal proteins
ATE534401T1 (de) * 2000-10-18 2011-12-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Mage antigen gekoppelt an einem protein d fragment enthaltende impfstoffe
US20140171626A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-19 Glaxosmithkline Llc Protein purification
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
GB201520592D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
MX2019002968A (es) * 2016-09-21 2019-10-15 Amal Therapeutics Sa Un complejo novedoso que comprende un peptido penetrante de celulas, una carga y un agonista de peptido de tlr para tratamiento de cancer colorrectal.

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3724093A (en) 1992-02-18 1993-09-03 Smithkline Beecham Corporation Vaccinal polypeptides
EP0679716A4 (en) 1993-11-12 1999-06-09 Kenichi Matsubara GENE SIGNATURE.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6030945A (en) * 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
WO1997028820A1 (en) 1996-02-09 1997-08-14 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines against varicella zoster virus gene 63 product
KR100633212B1 (ko) 1998-02-05 2006-10-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해사용되는 ｍａｇｅ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체및 이들을 암호화하고 있는 핵산 서열
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
ES2273482T3 (es) 1998-03-09 2007-05-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composiciones de vacunas combinadas.
US6087168A (en) 1999-01-20 2000-07-11 Cedars Sinai Medical Center Conversion of non-neuronal cells into neurons: transdifferentiation of epidermal cells
NZ513838A (en) 1999-03-11 2003-02-28 Smithkline Beecham Biolog S Novel compounds
AU5788900A (en) 1999-07-07 2001-01-22 Tularik Inc. Diagnosis of cancer by detecting ash2 polypeptides or polynucleotides
US20020081590A1 (en) 2000-02-04 2002-06-27 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
NZ520673A (en) * 2000-02-23 2004-09-24 Smithkline Beecham Biolog S Tumour-specific animal proteins
US7811574B2 (en) * 2000-02-23 2010-10-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Tumour-specific animal proteins
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
WO2002061085A2 (en) 2000-10-31 2002-08-08 Ryan James W Isolated genomic polynucleotide fragments from the p15 region of chromosome 11
GB0104259D0 (en) * 2001-02-21 2001-04-11 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB0111974D0 (en) * 2001-05-16 2001-07-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel Compounds
EP1575515A4 (en) * 2002-08-29 2007-08-08 Genentech Inc ACHAETE-SCUTE-SIMILAR 2 POLYPEPTIDES AND CODING NUCLEIC ACIDS AND METHOD FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF A TUMOR
US20080108070A1 (en) * 2006-09-08 2008-05-08 Corixa Corporation Methods, compositions, and kits for the detection and monitoring of colon cancer
GB0700284D0 (en) * 2007-01-08 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN102459324B (zh) 2014-07-09
AU2010252012A1 (en) 2011-12-22
EA020617B1 (ru) 2014-12-30
CA2763486A1 (en) 2010-12-02
WO2010136443A1 (en) 2010-12-02
US8916514B2 (en) 2014-12-23
NZ596501A (en) 2013-11-29
CN102459324A (zh) 2012-05-16
DOP2011000348A (es) 2012-01-15
MA33409B1 (fr) 2012-07-03
EA201190274A1 (ru) 2012-06-29
EP2435469A1 (en) 2012-04-04
CL2011002994A1 (es) 2012-07-20
PE20120400A1 (es) 2012-05-04
MX2011012623A (es) 2011-12-14
JP2012528106A (ja) 2012-11-12
CO6400229A2 (es) 2012-03-15
BRPI1012078A2 (pt) 2019-09-24
IL216351A0 (en) 2012-01-31
US20120070491A1 (en) 2012-03-22
SG176220A1 (en) 2011-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10166276B2 (en) Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma
EP2942355B1 (en) Non-hemolytic llo fusion proteins and uses thereof
ES2342416T3 (es) Procedimiento de purificacion o produccion de una proteina mage.
US8916514B2 (en) CASB7439 constructs
KR20090101313A (ko) 백신
US20070264279A1 (en) Compositions and methods comprising a MAGE-b antigen
KR20030081314A (ko) Ｗｔ1 특이적 면역요법용 조성물 및 방법
US6576756B2 (en) Isolated nucleic acid molecule encoding cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
EP2118128B1 (en) Fusion proteins comprising the tumor rejection antigens ny-eso-1 and lage-1
CN105085684B (zh) Pcsk9靶向重组疫苗设计及其应用
WO2002098360A2 (en) Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
US8309096B2 (en) Fusion protein
US20210236614A1 (en) Vaccine composition and uses thereof
AU2008206463B2 (en) Fusion proteins comprising the tumor rejection antigens NY-ESO-1 and LAGE-1
WO2008040759A1 (en) Method for down-regulation of cripto
MXPA00007677A (en) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid