ES2342416T3

ES2342416T3 - Procedimiento de purificacion o produccion de una proteina mage.

Info

Publication number: ES2342416T3
Application number: ES06075362T
Authority: ES
Inventors: Teresa Cabezon Silva; Joseph Cohen; Moncef Mohamed Slaoui; Carlota Vinals Bassols
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2010-07-06
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: CY1105685T1; US20100204458A1; PT1659178E; PL342852A1; HK1033838A1; HUP0102639A1; BR9907691A; NZ506086A; EP1659179A2; TR200002284T2; HUP0102639A3; CA2584482A1; DE69929310T2; CZ20002869A3; EP1659179A3; SA99200126B1; HK1083026A1; AU2722099A; CA2319309A1; DE69942214D1

Abstract

Un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE, que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en el que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un agente zwitteriónico.

Description

Procedimiento de purificación o producción de una proteína MAGE.

La presente invención se refiere a procedimientos para purificar o producir una proteína MAGE. La presente divulgación se refiere a derivados de proteína que comprenden un antígeno asociado a tumores, que encuentran utilidad en la terapia de vacunas para cánceres. En particular, los derivados de la divulgación incluyen proteínas de fusión que comprenden un antígeno codificado por la familia de genes MAGE (por ejemplo, MAGE-3, MAGE-1), unido a un compañero de fusión inmunológico que proporciona epítopes T auxiliares, tales como, por ejemplo, la forma lipidada de la proteína D de Haemophilus influenzae B; proteínas MAGE modificadas químicamente en las que los puentes disulfuro del antígeno están reducidos y los tioles resultantes bloqueados y las proteínas MAGE modificadas genéticamente proporcionadas con un marcador de afinidad y/o modificadas genéticamente para prevenir la formación de puentes disulfuro. También se describen procedimientos para formular vacunas para tratar una serie de cánceres, que incluyen, pero sin limitación Melanoma, carcinoma de mama, vejiga, pulmón, NSCLC, de cabeza y de células escamosas, carcinoma de colon y carcinoma esofágico.

Los antígenos codificados por la familia de genes MAGE se expresan predominantemente en células de melanoma (incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres que incluyen NSCLC (cáncer no microcítico de pulmón), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células transicionales de vejiga y carcinoma esofágico, pero no son detectables en tejidos normales excepto en los testículos y en la placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 se expresa en el 69% de los melanomas (Gaugler, 1994) y también puede detectarse en el 44% de NSCLC (Yoshimatsu 1988), en el 48% de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, en el 34% de carcinomas de células transicionales de vejiga, en el 57% de carcinoma esofágico, en el 32% de cánceres de colon y en el 24% de cánceres de mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Los cánceres que expresan proteína MAGE se conocen como tumores asociados a Mage.

La inmunogenicidad de células de melanoma humano se ha demostrado elegantemente en experimentos usando cultivos mixtos de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos cultivos con frecuencia generan linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos capaces de lisar exclusivamente las células de melanoma autólogas pero ni los fibroblastos autólogos ni los linfocitos B transformados por EBV autólogos (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Ahora se han identificado varios de los antígenos reconocidos en células de melanoma autólogas por estos clones de CTL, incluyendo los de la familia MAGE.

El primer antígeno que podría definirse por medio de su reconocimiento por CTL específicos en células de melanoma autólogas se denomina MZ2-E (Van den Eynde, 1989) y se codifica por el gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). Los CTL dirigidos contra MZ2-E reconocen y lisan células de melanoma positivas para MZ2-E de pacientes autólogos así como de otros pacientes siempre que estas células tengan el alelo HLA.A1.

El gen MAGE-1 pertenece a una familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados en el cromosoma X y que comparten entre sí una homología del 64 al 85% en su secuencia codificante (De Plaen, 1994). Algunas veces éstos se conocen como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12 (La familia MAGE A). También forman parte de la familia MAGE otros dos grupos de proteínas aunque están relacionados de forma más distante. Estos son los grupos MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1 y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2 y DAM 16) MAGE B3 y MAGE B4 - la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos generales, una proteína MAGE puede definirse como una proteína que contiene una firma de secuencia central localizada hacia el extremo C terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1, una proteína de 309 aminoácidos, la firma central corresponde a los aminoácidos 195-279).

Por lo tanto, el patrón consenso de la firma central se describe como se indica a continuación en el que x representa cualquier aminoácido, los restos en letra minúscula están conservados (se permiten variantes conservativas) y los restos en letras mayúsculas están perfectamente conservados. Firma de secuencia central

LixvL (2x) I (3x) g (2x) apEExiWexl (2x)m(3-4x) Gxe (3-4x) gxp (2x) llt (3x) VqexYLxYxqVPxsxP (2x)
yeFLWGprA (2x) Et (3 x) kv

Las sustituciones conservativas son bien conocidas y generalmente se establecen como las matrices de puntuación por defecto en programas informáticos de alineación de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", en "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

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En términos generales, la sustitución dentro los siguientes grupos son sustituciones conservativas, pero las sustituciones entre grupos se consideran no conservadas. Los grupos son:

i): Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina

ii): Serina/treonina

iii): Lisina/arginina

iv): Fenilalanina/tirosina/triptófano

v): Leucina/isoleucina/valina/metionina

vi): Glicina/alanina.

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En general y en el contexto de esta invención, una proteína MAGE contendrá aproximadamente una identidad del 50% en esta región central con los aminoácidos 195 a 279 de MAGE A1.

Se han identificado varios epítopes de CFT en la proteína MAGE-3. Uno de estos epítopes, MAGE-3.A1 es una secuencia nonapeptídica localizada entre los aminoácidos 168 y 176 de la proteína MAGE-3 que constituye un epítopo específico para los CTL cuando se presenta en asociación con la molécula del CMH de clase I HLA.A1. Recientemente se han identificado dos epítopes de CTL adicionales en la secuencia peptídica de la proteína MAGE-3 por su capacidad de crear una respuesta de CTL en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos dos epítopes tienen motivos de unión específicos para los alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente.

Carrel y col. (1996) International Journal of Cancer 67(3), 417-422 desvelan la identificación de un antígeno de 72 kDa de reacción cruzada que se coexpresa con la proteína MAGE-1 en células de melanoma.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE, que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en las que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un detergente zwitteriónico.

La presente divulgación proporciona derivados de la proteína MAGE. Estos derivados son adecuados para uso en formulaciones de vacuna terapéutica que son adecuadas para el tratamiento de una serie de tipos de tumores.

En una realización de la presente divulgación, el derivado es una proteína de fusión que comprende un antígeno de la familia de proteínas MAGE unido a un compañero heterólogo. Las proteínas pueden estar conjugadas químicamente, pero preferentemente se expresan como proteína de fusión recombinantes que permiten producir mayores niveles en un sistema de expresión en comparación con una proteína no fusionada. De esta manera, el compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes T auxiliares (compañero de fusión inmunológico), preferentemente epítopes T auxiliares reconocidos por seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de fusión será tanto un compañero de fusión inmunológico como un compañero de potenciación de la expresión.

En una forma preferida de la divulgación, el compañero de fusión inmunológico procede de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram negativa, Haemophilus influenza B (documento WO91/18926). Preferentemente, el derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína, en particular aproximadamente los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales. Preferentemente, el derivado de la proteína D está lipidado. Preferentemente, los primeros 109 restos del compañero de fusión de la Lipoproteína D se incluyen en el extremo N para proporcionar el antígeno candidato de vacuna con epítopes de células T exógenos adicionales y aumentar el nivel de expresión en E. coli (actuando de esta manera también como un potenciador de expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de antígeno.

Otros compañeros de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N terminales aunque pueden usarse diferentes fragmentos siempre que incluyan epítopes T auxiliares.

En otra realización, el compañero de fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA. Preferentemente se usa la parte C terminal de la molécula. Lyta procede de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272} una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en el esqueleto de péptidoglicano. El dominio C terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina tales como DEAE. Se ha sacado provecho de esta propiedad para el desarrollo de plásmidos de E. coli que expresan C-LYTA útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Como se usa en el presente documento una realización preferida utiliza la parte repetida de la molécula Lyta encontrada en el extremo C terminal que empieza en el resto 178. Una forma particularmente preferida incorpora los restos 188-305.

Los compañeros de fusión inmunológicos indicados anteriormente también son ventajosos para ayudar a la expresión. En particular, estas fusiones se expresan con mayores rendimientos que las proteínas MAGE recombinantes nativas.

Los presentes inventores han demostrado que en un entorno clínico estas construcciones pueden tratar melanoma. En un caso, en un paciente con melanoma de estadio IV se eliminó la metástasis después de dos dosis de proteína lipo D 1/3 MAGE 3 His sin adyuvante.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden un antígeno asociado a tumores de la familia MAGE unido a un compañero de fusión inmunológico. Preferentemente, el compañero de fusión inmunológico es la proteína D o un fragmento de la misma, más preferentemente la lipoproteína D. Las proteínas MAGE preferentemente son MAGE A1 o MAGE A3. La parte de lipoproteína D preferentemente comprende el primer 1/3 de Lipoproteína D.

Las proteínas de la presente divulgación preferentemente se expresan en E. coli. En una realización preferida, las proteínas se expresan con un marcador de afinidad, tal como por ejemplo, una cola de histidina que comprende entre 5 y 9 y preferentemente seis restos de histidina. Éstos son ventajosos para ayudar a la purificación.

La presente divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica las proteínas de la presente divulgación. Estas secuencias pueden insertarse en un vector de expresión adecuado y usarse para vacunación con ADN/ARN o expresarse en un huésped adecuado. Vectores microbianos que expresan el ácido nucleico pueden usarse como vacunas. Estos vectores incluyen por ejemplo, poxvirus, adenovirus, alfavirus, listeria y monófagos.

Usando técnicas de síntesis de ADN convencionales, tales como por ligamiento enzimático como se describe por D. M. Roberts y col. en Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, por síntesis química, por polimerización enzimática in vitro o por tecnología de PCR utilizando, por ejemplo, una polimerasa estable térmicamente o por combinación de estas técnicas puede sintetizarse una secuencia de ADN que codifica las proteínas de la presente divulgación.

La polimerización enzimática del ADN puede realizarse in vitro usando una ADN polimerasa tal como la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que contiene los nucleósido trifosfatos dATP, dCTP, dGTP y dTTP necesarios a una temperatura de 10º-37ºC, generalmente en un volumen de 50 \mul o menos. El ligamiento enzimático de los fragmentos de ADN puede realizarse usando una ADN ligasa tal como ADN ligasa de T4 en un tampón apropiado, tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino, a una temperatura de 4ºC a la temperatura ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o menor. La síntesis química del polímero o fragmentos de ADN puede realizarse por la química convencional de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita, usando técnicas de fase sólida tales como las descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen y A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams y col., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D. Matthes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

El procedimiento de la divulgación puede realizarse por técnicas recombinantes convencionales tales como las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

En particular, el procedimiento puede comprender las etapas de:

i): preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huésped, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma;

ii): transformar una célula huésped con dicho vector;

iii): cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y

iv): recuperar dicha proteína.

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El término "transformación" se usa en el presente documento para hacer referencia a la introducción de ADN extraño en una célula huésped. Esto puede conseguirse por ejemplo, por transformación, transfección o infección con un plásmido o vector viral apropiado usando por ejemplo, técnicas convencionales como las descritas en Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. El término "transformado" o "transformante" se aplicará en lo sucesivo a la célula huésped resultante que contiene y que expresa el gen extraño de interés.

Los vectores de expresión son nuevos y también forman parte de la divulgación.

Los vectores de expresión replicables pueden prepararse de acuerdo con la divulgación, por escisión de un vector compatible con la célula huésped para proporcionar un segmento de ADN lineal que tiene un replicón intacto, y combinación de dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la divulgación, o un derivado de la misma, en condiciones de ligamiento.

De esta manera, el polímero de ADN puede realizarse o formarse durante la construcción del vector, cuando se desee.

La elección del vector se determinará, en parte, por la célula huésped, que puede ser procariota o eucariota, pero preferentemente son células E. coli o CHO. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes.

La preparación del vector de expresión replicable puede realizarse convencionalmente con enzimas apropiadas para restricción, polimerización y ligamiento del ADN, por procedimientos descritos, por ejemplo, en Maniatis y col. citado anteriormente.

La célula huésped recombinante se prepara, de acuerdo con la divulgación, transformando una célula huésped con un vector de expresión replicable de la divulgación en condiciones de transformación. Las condiciones de transformación adecuadas son convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis y col. citado anteriormente o "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

La elección de las condiciones de transformación se determina por la célula huésped. De esta manera, un huésped bacteriano tal como E. coli puede tratarse con una solución de CaCl_{2} (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende una mezcla de RbCl MnCl_{2}, acetato potásico y glicerol, y después con ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbCl y glicerol. Las células de mamífero en cultivo pueden transformarse por coprecipitación con calcio del ADN del vector en las células. La divulgación también se extiende a una célula huésped transformada con un vector de expresión replicable de la divulgación.

El cultivo de la célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión del polímero de ADN se realiza de forma convencional, como se describe en, por ejemplo, en Maniatis y col. y "DNA Cloning" citados anteriormente. De esta manera, preferentemente, a la célula se le suministra nutriente y se cultiva a una temperatura inferior a 50ºC.

El producto se recupera por procedimientos convencionales de acuerdo con la célula huésped y de acuerdo con la localización del producto de expresión (intracelular o secretado en el medio de cultivo o en el periplasma celular). De esta manera, cuando la célula huésped es bacteriana, tal como E. coli, puede, por ejemplo, lisarse físicamente, químicamente o enzimáticamente y el producto proteico puede aislarse del lisado resultante. Cuando la célula huésped es de mamífero, el producto generalmente puede aislarse del medio nutriente o de extractos sin células. Las técnicas de aislamiento de proteína convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía de adsorción y cromatografía de afinidad incluyendo una columna de afinidad con anticuerpo monoclonal.

Las proteínas de la presente divulgación se proporcionan solubles en una forma líquida o en una forma liofilizada.

En general, es de esperar que cada dosis humana comprenda de 1 a 1000 \mug de proteína, y preferentemente de 30 a 300 \mug.

La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente divulgación en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición de vacuna preferida comprende al menos Lipoproteína D-MAGE-3. Dicha vacuna opcionalmente puede contener uno o más antígenos asociados a tumores distintos. Por ejemplo, otros miembros que pertenecen a las familias MAGE y GAGE. Otros antígenos asociados a tumores adecuados incluyen proteínas MAGE-1, GAGE-1 o Tirosinasa.

La preparación de vacunas se describe en términos generales en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877.

Las proteínas de la presente divulgación preferentemente se asocian con adyuvantes en la formulación de vacuna de la divulgación. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de Tirosina acilada o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos. Otros adyuvantes conocidos incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el dinucleótido CpG no está metilado.

Estos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en el documento WO96/02555.

En la formulación de la divulgación se prefiere que la composición adyuvante induzca una respuesta inmune preferentemente del tipo TH1. Los sistemas adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Los oligonucleótidos CpG también inducen preferentemente una respuesta TH1.

Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que el QS21 está inactivado con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739.

En el documento WO 95/17210 se describe una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua y es una formulación preferida.

Por consiguiente, en una realización de la presente divulgación, se proporciona una vacuna que comprende una proteína de la presente divulgación, más preferentemente una Lipoproteína D (o derivado de la misma)-MAGE 3 con monofosforil lípido A como adyuvante o un derivado del mismo.

Preferentemente, la vacuna comprende además una saponina, más preferentemente QS21.

Preferentemente, la formulación adicional comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente divulgación también proporciona un procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente divulgación junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL.

En una realización de la invención, se proporciona un procedimiento para purificar una proteína MAGE producida de forma recombinante. El procedimiento comprende solubilizar la proteína, por ejemplo en un agente caotrópico fuerte (tal como, por ejemplo, urea, clorhidrato de guanidinio) o en un detergente Zwiteriónico, por ejemplo (Empigen BB-n-dodecil-N,N-dimetilglicina), reduciendo los enlaces disulfuro intra e intermoleculares de la proteína, bloqueando los tioles resultantes para prevenir el reacoplamiento oxidativo y sometiendo la proteína a una o más etapas cromatográficas.

Preferentemente, el agente bloqueante es una gente alquilante. Estos agentes bloqueantes incluyen, pero sin limitación, alfa haloácidos o alfa haloamidas. Por ejemplo, acético yodoacético y yodoacetamida que tiene como resultado la carboximetilación o carboxiamidación (carbamidometilación) de la proteína. Pueden usarse otros agentes bloqueantes y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo The Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Academic Press 1976, o Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad y CM Noyes, CRC Press 1985). Los ejemplos típicos de estos otros agentes bloqueantes incluyen N-etilmaleimida, cloroacetil fosfato, O-metilisourea y acrilonitrilo. El uso del agente bloqueante es ventajoso ya que previene la agregación del producto y asegura la estabilidad para la purificación aguas abajo.

En una realización de la invención, los agentes bloqueantes se seleccionan para inducir un derivado covalente estable e irreversible (por ejemplo, alfa haloácidos o alfa haloamidas). Sin embargo, pueden seleccionarse otros agentes bloqueantes de tal forma que después de la purificación, el agente bloqueante puede retirarse para liberar la proteína no derivatizada.

Las proteínas MAGE que tienen restos de tiol libre derivatizados son nuevas y constituyen un aspecto de la divulgación. En particular, son una realización preferida de la divulgación derivados carboxiamidados o carboximetilados.

En una realización preferida de la invención, las proteínas de la presente invención se proporcionan con un marcador de afinidad, tal como CLYTA o una cola de polihistidina. En estos casos, la proteína después de la etapa de bloqueo preferentemente se somete a cromatografía de afinidad. Para las proteínas que tienen una cola de polihistidina, puede realizarse cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (CAMI). El ión metálico puede ser cualquier ión adecuado, por ejemplo cinc, níquel, hierro, magnesio o cobre, pero preferentemente es cinc o níquel. Preferentemente el tampón de CAMI contiene un detergente zwiteriónico tal como Empigen BB (en lo sucesivo Empigen) ya que tiene como resultado menores niveles de endotoxina en el producto final.

Si la proteína se produce con una parte Clyta, la proteína puede purificarse aprovechando su afinidad por colina o análogos de colina tales como DEAE. En una realización de la invención, las proteínas se proporcionan con una cola de polihistidina y una parte de Clyta. Éstas pueden purificarse en un programa de purificación cromatográfica por afinidad sencillo de dos etapas.

La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

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Ejemplo I Preparación de la cepa de E. coli recombinante que expresa la proteína de fusión Lipoproteína D-MAGE-3-His (LPD 1/3MAGE-3-His o LpD MAGE-3-His) 1. Sistema de expresión en E. Coli

Para la producción de la Lipoproteína D, el ADN que codifica la proteína D se ha clonado en el vector de expresión pMG81. Este plásmido utiliza señales de ADN del fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de genes extraños insertados. El vector contiene el promotor PL de lambda, el operador OL y dos sitios de utilización (NutL y NutR) para atenuar los efectos de polaridad transcripcional cuando se proporciona la proteína N (Gross y col., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5: 1015). Los vectores que contienen el promotor PL se introducen en un huésped lisogénico de E. coli para estabilizar el ADN plasmídico. Las cepas de huésped lisogénico contienen ADN del fago lambda con defectos en la replicación integrado en el genoma (Shatzman y col., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) págs. 1-14. Academic Press NY). El ADN del fago lambda dirige la síntesis de la proteína represora cI que se une al represor OL del vector y previene la unión de la ARN polimerasa al promotor PL y por lo tanto la transcripción del gen insertado. El gen cI de la cepa de expresión AR58 contiene una mutación sensible a la temperatura de forma que la transcripción dirigida por PL puede regularse por un cambio de temperatura, es decir, un aumento de la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la síntesis de la proteína extraña. Este sistema de expresión permite la síntesis controlada de proteínas extrañas, especialmente de las que pueden ser tóxicas para la célula (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292: 128).

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2. La cepa E. coli AR58

La cepa AR58 de E. coli lisogénica usada para la producción de la proteína LPD-MAGE-3-His es un derivado de la cepa K12 de E. coli convencional de los INS (Institutos Nacionales de la Salud), N99 (F-su-galK2, lacZ-thr-). Ésta contiene un fago lambda lisogénico defectuoso (galE:: TN10, 1 Kil-cI857 DH1). El fenotipo Kil- previene la interrupción de la síntesis macromolecular del huésped. La mutación cI857 confiere una lesión sensible a temperatura al represor cl. La deleción DH1 elimina el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3 y ch1A del huésped. La cepa AR58 se generó por transducción de N99 con una reserva del fago lambda P previamente cultivada en un derivado SA500 (galE:: TN10, 1 Kil-cI857 DH1). La introducción del lisógeno defectuoso en N99 se seleccionó con tetraciclina debido a la presencia de un transposón TN10 que codificaba resistencia a tetraciclina en el gen galE adyacente. N99 y SA500 son cepas de E. coli K12 procedentes del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg de los Institutos Nacionales de la Salud.

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3. Construcción del vector diseñado para expresar la proteína recombinante LPD-MAGE-3-His

El fundamento era expresar MAGE-3 como una proteína de fusión usando el tercio N-terminal de la proteína D lipidada como compañero de fusión conectado al extremo N de MAGE y una secuencia de varios restos de histidina (cola His) situada en su extremo C.

La proteína D es una lipoproteína (una proteína de unión a inmunoglobulina D de 42 kDa expuesta en la superficie de la bacteria gram negativa a Haemophilus influenzae). La proteína se sintetiza como un precursor con una secuencia señal de 18 restos aminoacídicos, que contiene una secuencia consenso para lipoproteínas bacterianas (documento WO 91/18926).

Cuando la secuencia señal de una lipoproteína se procesa durante la secreción, la Cys (en la posición 19 en la molécula precursora) se convierte en un resto amino terminal y se modifica concomitantemente por unión covalente de ácidos grasos unidos a éster y unidos a amida.

Los ácidos grasos unidos al resto de cisteína amino terminal entonces funcionan como anclaje a la membrana.

El plásmido que expresa la proteína de fusión se diseñó para expresar una proteína precursora que contenía la secuencia señal de 18 aminoácidos y los primeros 109 restos de la proteína D procesada, dos aminoácidos no relacionados (Met y Asp), los restos aminoacídicos 2 a 314 de MAGE-3, dos restos de Gly que funcionan como una región de bisagra para exponer los siete restos de His posteriores.

De esta manera, la cepa recombinante produce la proteína de fusión con cola His lipidada procesada de 432 restos aminoacídicos de longitud (véase la Figura 1), con la secuencia de aminoácidos descrita en la ID Nº 1 y la secuencia codificante descrita en la ID Nº 2.

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4. Estrategia de clonación para la generación de la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His (vector pRIT14477)

Se usó un plásmido de ADNc (de Dr Thierry Boon del Instituto Ludwig) que contenía la secuencia codificante del gen MAG-3 (Gaugler B y col., 1994) y el vector PRIT 14586, que contenía la parte N terminal de la secuencia codificante de Lipo-D-1/3 (preparada como se indica en la Figura 2). La estrategia de clonación incluía las siguientes etapas (Figura 3).

a): amplificación por PCR de las secuencias presentadas en el ADNc plasmídico de MAGE-3 usando el oligonucleótido con sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct y el oligonucleótido antisentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa); esta amplificación conduce a las siguientes modificaciones en el extremo N: cambio de los cinco primeros codones al uso de codones de E. coli, reemplazo del codón de Pro por un codón de Asp en la posición 1, instalación de un sitio NcoI en el extremo 5' y finalmente la adición de dos codones de 2 Gly y los 7 codones de His seguidos por un sitio XabI en el extremo C.

b): Clonación en el vector de clonación TA de Invitrogen del fragmento amplificado anterior y preparación del vector intermedio pRIT14647.

c): Escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT 14586.

d): Transformación de la cepa huésped AR58.

e): Selección y caracterización de los transformantes de la cepa de E. coli que contienen el plásmido pRIT 14477, que expresa la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His.

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Ejemplo II Preparación del antígeno LPD1/3-MAGE-3-His 1. Cultivo e inducción de una cepa bacteriana - Expresión de LPD1/3-MAGE-3-His

Se cultivaron células de AR58 transformadas con el plásmido pRIT 14477 en matraces de 2 litros, que contenían cada uno 400 ml de medio LY12 complementado con extracto de levadura (6,4 g/l) y sulfato de kanamicina (50 mg/l). Después de la incubación en una mesa de agitación a 30ºC durante 8 +/- 1 h, se retiró una muestra pequeña de cada matraz para el examen microscópico. Se reunieron los contenidos de los dos matraces para proporcionar el inóculo para el fermentador de 20 litros.

El inóculo (aproximadamente 800 ml) se añadió a un fermentador de 20 litros (volumen total) pre-esterilizado que contenía 7 litros de medio, complementado con 50 mg/l de sulfato de kanamicina. El pH se ajustó y se mantuvo a 6,8 mediante la adición periódica de NH_{4}OH (a 25% v/v) y la temperatura se ajustó y se mantuvo a 30ºC. La velocidad de aireación se ajustó y se mantuvo a 12 litros de aire/min y la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo al 50% de saturación mediante el control retroactivo de la velocidad de agitación. La sobrepresión en el fermentador se mantuvo a 500 g/cm^{2} (0,5 bar).

El cultivo semi-continuo se realizó mediante la adición controlada de una solución de alimentación de carbono. La solución de alimentación se añadió a una velocidad inicial de 0,04 ml/min y se aumentó exponencialmente durante las primeras 42 horas para mantener una velocidad de crecimiento de 0,1 h^{-1}.

Después de 42 horas, la temperatura en el fermentador se aumentó rápidamente a 39ºC y la velocidad de alimentación se mantuvo constante a 0,005 ml/g DCW/min durante la fase de inducción durante 22-23 horas más, tiempo durante el cual la expresión intracelular de LPD-MAGE-3-His alcanzó un nivel máximo.

Se tomaron alícuotas (15 ml) de caldo a intervalos regulares a lo largo de las fases de crecimiento/inducción y al final de la fermentación para seguir la cinética del crecimiento microbiano y la expresión del producto intracelular y, además, para proporcionar muestras para los ensayos de identificación microbiana/pureza.

Al final de la fermentación, la densidad óptica del cultivo estaba comprendida entre 80 y 120 (correspondiente a una concentración celular comprendida entre 48 y 72 g DCW/L) y el volumen de líquido total era de aproximadamente 12 litros. El cultivo se enfrió rápidamente a una temperatura comprendida entre 6 y 10ºC y las células de ECK2 se separaron del caldo de cultivo por centrifugación a 5000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Las células concentradas de ECK32 se almacenaron rápidamente en bolsas de plástico y se congelaron inmediatamente a -80ºC.

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2. Extracción de la proteína

Las células concentradas congeladas de ECK32 se descongelaron a 4ºC antes de resuspenderse en tampón de ruptura celular a una densidad óptica final de 60 (correspondiente a una concentración celular de aproximadamente 36 g DCW/L).

Las células se rompieron por dos pases a través de un homogeneizador de alta presión (1000 bar). La suspensión de células rotas se centrifugó (x 10.000 g a 4ºC durante 30 minutos) y la fracción del sedimento se lavó dos veces con Tritón X100 (1% p/v) + EDTA (1 mM) seguido de un lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + Tween 20 (al 0,1% v/v) y finalmente un lavado con PBS. Entre cada etapa de lavado, la suspensión se centrifugó a x 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC, el sobrenadante se desechó y se retuvo la fracción del sedimento.

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Ejemplo III Caracterización de Proteína de Fusión Lipo D-MAGE 3 1. Purificación

Se purificó LPD-MAGE-3-His a partir del homogeneizado celular usando una secuencia de etapas descritas a continuación:

a): Solubilización de la fracción de sedimento lavada procedente de la ruptura celular,

b): Reducción química de enlaces disulfuro intra e inter proteína seguido de bloqueo de grupos tiol para prevenir el reacoplamiento oxidativo,

c): Microfiltración de la mezcla de reacción para retirar las partículas y reducir las endotoxinas,

d): Captura y purificación primaria de LPD-MAGE-3-His aprovechando la interacción de afinidad entre la cola de polihistidina y Sefarosa Quelante cargada con cinc,

e): Retirada de proteínas contaminantes por cromatografía de intercambio aniónico.

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La LPD-MAGE-3-His purificada se sometió a varias etapas de pulido:

f): Intercambio de tampón/retirada de urea por cromatografía de exclusión molecular usando Superdex 75,

g): filtración en proceso,

h): intercambio de tampón/desalinización por cromatografía de exclusión molecular usando Sephadex G25.

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Cada una de estas etapas se describe con más detalle a continuación:

1.1) Solubilización de sedimento del homogeneizado celular

La fracción de sedimento de la etapa de lavado final (como se ha descrito anteriormente) se resolubilizó durante una noche en 800 ml de una solución de clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) a 4ºC.

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1.2) Reducción y carboximetilación

El material solubilizado (una suspensión turbia de color amarillo pálido) se lavó abundantemente con argón para eliminar cualquier cantidad de oxígeno que quedara, y se añadió una solución madre de 2-mercaptoetanol (14 M) para proporcionar una concentración final de 4,3 M (que correspondía a 0,44 ml de 2-mercaptoetanol por ml de solución).

La solución resultante se divide y se transfirió a dos matraces de vidrio que se calentaron a 95ºC en un baño de agua. Después de 15 minutos a 95ºC, los matraces se retiraron del baño de agua y se dejaron enfriar, después de lo cual los contenidos se reunieron en un vaso de precipitados (5 l) de cubierto de aluminio, se pusieron hielo y se añadió yodoacetamida sólida con mezcla vigorosa para proporcionar una concentración final de 6 M (que correspondía a 1,11 g de yodoacetamida por ml de solución). La mezcla se mantuvo en hielo en la oscuridad durante 1 h para asegurar la solubilización completa de la yodoacetamida, antes de neutralizarse (manteniendo mezcla vigorosa y control continuo del pH)
mediante la adición de aproximadamente 1 litro de hidróxido sódico (5 M) para proporcionar un pH final de 7,5-7,8.

La mezcla resultante se mantuvo en hielo en la oscuridad durante 30 minutos más, después de lo cual el pH se reajustó a pH 7,5-7,8.

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1.3) Microfiltración

La mezcla se microfiltró en una unidad de flujo tangencial Amicon Proflux M12 equipada con un cartucho de fibra hueca Minikros (Nº de ref. M22M-600-01N; área 5.600 cm^{2}, 0,2 \mum). El infiltrado se retuvo para una purificación cromatográfica posterior.

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1.4) Cromatografía por quelato metálico (Zn ^{2+}) (IMAC)

La cromatografía por quelato metálico se realizó con Sepharose Quelante FF (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 17-0575-01) introducida en una columna BPG 100/500 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 18-1103-01). Las dimensiones del lecho introducido fueron: diámetro 10 cm, área de sección transversal 79 cm^{2}; altura del lecho 19 cm; volumen introducido 1500 ml. La columna vacía se limpió con hidróxido sódico (0,5 M) y después se lavó con agua purificada.

El soporte (suministrado en etanol al 20% v/v) se lavó con agua purificada (8 l) en un embudo Bucchner (al vacío) y se cargó con cinc pasando al menos 15 litros de una solución ZnCl_{2} (0,1 M). El exceso de cinc se retiró lavando el soporte con 10 l de agua purificada, hasta que el pH del líquido de salida alcanzó el pH de la solución de ZnCl_{2} (pH 5,0). El soporte después se equilibró con 4 litros de una solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0).

El infiltrado de la microfiltración, que contenía LPD-MAGE-3-His se con el soporte (unión discontinua), antes de cargar y rellenar la columna BPG con la solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0).

Las siguientes etapas de la cromatografía por quelato metálico se realizaron a un caudal de eluyente de 60 ml/min. La columna se lavó, primero con la solución que contenía clorhidrato de guanidina (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) y después con la solución que contenía urea (6 M) y fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) hasta que el eluyente de la columna consiguió una absorbancia cero a DO_{280} nm (basal).

La fracción de proteína LPD-MAGE-3-His semipura se eluyó con 2 volúmenes de columna de una solución que contenía urea (6 M), fosfato sódico (0,1 M, pH 7,0) e imidazol (0,5 M). La conductancia de esta fracción fue de aproximadamente 16 mS/cm.

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1.5) Cromatografía de intercambio aniónico

Antes de continuar con la cromatografía de intercambio aniónico, la conductancia de la fracción de proteína LPD-MAGE-3-His semipura se redujo a aproximadamente 4 mS/cm por dilución con una solución que contenía urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM; pH 8,0).

La cromatografía de intercambio aniónico se realizó usando Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 17-0510-01) introducida en una columna BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 18-1103-11). Las dimensiones del lecho introducido fueron: diámetro 10 cm, área de sección transversal 314 cm^{2}; altura del lecho 9 cm; volumen introducido 2900 ml.

La columna se rellenó (con etanol al 20% v/v) y se lavó con 9 litros de agua purificada a un caudal de eluyente de 70 ml/min. La columna rellena se limpió con 3 litros de hidróxido sódico (0,5 M), se lavó con 30 l de agua purificada, y después se equilibró con 6 litros de una solución que contenía urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). La LDP-MAGE-3-His semipurificada diluida se cargó en la columna y después se lavó con 9 litros de una solución que contenía urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0,) EDTA (1 mM) y Tween (al 0,1%) hasta que la absorbancia (280 nm) del eluyente se redujo a cero.

Se realizó una etapa de lavado adicional con 6 litros de una solución que contenía urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

La LPD-MAGE-3-His purificada se eluyó de la columna con una solución que contenía urea (6 M) y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) y NaCl (0,25 M).

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1.6. Cromatografía de exclusión molecular

La retirada de la urea de LPD-MAGE-3-His purificada y el intercambio de tampón se consiguieron por cromatografía de exclusión molecular. Esto se realizó usando Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 17-1044-01) introducido en una columna XK 50/100 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat 18-8753-01). Las dimensiones del lecho introducido fueron: diámetro 5 cm, área de sección transversal 19,6 cm^{2}; altura del lecho 90 cm; volumen introducido 1800 ml.

La columna se rellenó en etanol (al 20%) y se lavó con 5 litros de agua purificada a un caudal de efluente de 20 ml/min. La columna se limpió con 2 litros de hidróxido sódico (0,5 M), se lavó con 5 litros de agua purificada y después se equilibró con 5 litros de solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 80 (al 0,1% v/v).

La fracción de LDP-MAGE-3-His purificada (máximo 500 ml/proceso de desalinización) se cargó en la columna a un caudal de eluyente de 20 ml/min. La LDP-MAGE-3-His purificada desalinizada se eluyó de la columna con 3 litros de PBS que contenía Tween 80 (al 0,1% v/v).

La fracción que contenía LDP-MAGE-3-His eluyó en el volumen inicial de la columna.

1.7) Filtración en proceso

La mayor parte de LDP-MAGE-3-His procedente de la cromatografía de exclusión molecular se filtró a través de una membrana de 0,22 \mum en una campana de flujo laminar (clase 10.000). El material filtrado se congeló a -80ºC y se almacenó hasta la etapa de desalinización.

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1.8) Cromatografía por desalinización

Como la osmolaridad del material final debe ser menor de 400 mOsM, se necesitó una etapa de intercambio de tampón adicional para reducir la concentración de sal. Esto se realizó por una etapa cromatográfica de desalinización usando Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 17-0033-02) introducida en una columna BPG 100/950 (Pharmacia Biotechnology Nº Cat. 18-1103-03). Las dimensiones del lecho introducido fueron: diámetro 10 cm, área de sección transversal 78,6 cm^{2}; altura del lecho 85 cm; volumen introducido 6500 ml.

El Sephadex G25 se hidrató con 7 litros de agua purificada y se dejó hinchar durante una noche a 4ºC. El gel después se introdujo en la columna con agua pura a un caudal de eluyente de 100 ml/min.

La columna se limpió con 6 litros de hidróxido sódico (0,5 M), y después se equilibró con 10 litros con una solución que contenía fosfato sódico (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) y Tween 80 (al 0,1% v/v).

La fracción de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo 1500 ml/proceso de desalinización) se cargó en la columna a un caudal de eluyente de 100 ml/min. La fracción de LDP-MAGE-3-His purificada desalinizada eluída en el volumen inicial de la columna, se filtró de forma estéril a través de una membrana de 0,22 \mum y se almacenó a -80ºC.

La proteína final se descongela a +4ºC antes de dividirse en alícuotas en viales y liofilizarse en un excipiente de lactosa (al 3,2%).

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2. Análisis en geles de SDS-poliacrilamida teñidos con Coomassie

El antígeno purificado de LPD-MAGE-3-His se analizó por SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12,5% en condiciones reductoras.

La carga de proteína fue de 50 \mug para la tinción con azul de Coomassie y 5 \mug para tinción con nitrato de plata. Se analizaron el lote clínico 96K19 y el lote piloto 96J22. Se visualizó una banda principal correspondiente a un peso molecular de 60 kDa. También se observaron dos bandas adicionales minoritarias de aproximadamente 45 kDa y 35 kDa.

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3. Análisis de Transferencia de Western

Los péptidos revelados por análisis de SDS-PAGE de la proteína LPD-MAGE-3-His se identificaron por transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales de ratón. Estos anticuerpos se desarrollaron internamente usando una preparación purificada de la proteína MAGE-3-His (esta proteína no contiene la parte LPD de la LPD-MAGE-3-His).

Se han seleccionado dos preparaciones de anticuerpos monoclonales (Mab 22 y Mab 54) basándose en su idoneidad para el análisis de transferencia de Western y se usaron en el ensayo de identidad para la liberación de lotes. La Figura 4 muestra los patrones de bandas obtenidos para los lotes 96K19 y 96J22 después de la tinción con los Mab 32 y 54. Seiscientos (600) ng de proteína se resolvieron en una SDS-PAGE al 12,5%, se transfirieron a una membrana de nailon, se hicieron reaccionar con los Mab 32 y 54 (60 \mug/ml) y se revelaron con anticuerpos anti-ratón acoplados a peroxidasa.

Los dos Mab revelaron los péptidos de 60 kDa y de 30 kDa detectado por SDS-PAGE.

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Ejemplo IV 1. Preparación de vacuna usando proteína LPD-MAGE-3-His

La vacuna usada en estos experimentos se produce a partir de un ADN recombinante que codifica una Lipoproteína D 1/3 MAGE-3-His expresada en E. coli a partir de la cepa AR58, con adyuvante o no. Como adyuvante, la formulación comprende una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) y QS21 en una emulsión de aceite/agua. El sistema adyuvante SBAS2 se ha descrito previamente en el documento WO 95/17210.

3D-MPL: es un inmunoestimulante derivado del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria gram negativa Salmonella minnesota. MPL se ha desacilado y carece de un grupo fosfato en el resto del lípido A. Este tratamiento químico reduce espectacularmente la toxicidad al mismo tiempo que conserva las propiedades inmunoestimulantes (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry produce y suministra MPL a SB-Biologicals. Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han demostrado que 3D-MPL junto con diversos vehículos potencia fuertemente tanto la inmunidad humoral como la inmunidad celular de tipo TH1.

QS21: es una molécula de saponina natural extraída de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Una técnica de purificación desarrollada para separar las saponinas individuales de los extractos brutos de la corteza, permitió el aislamiento de la saponina particular QS21, que es un glucósido de triterpeno que demuestra una actividad adyuvante más fuerte y menor toxicidad en comparación con el componente parental. Se ha mostrado que QS21 activa los CTL restringidos al CMH de clase I frente a varios Ag de subunidad, además de estimular la proliferación de linfocitos específicos de Ag (Kensil, 1992). Aquila (formalmente Cambridge Biotech Corporation) produce y suministra QS21 a SB-Biologicals.

Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las combinaciones de MPL y QSL21 en la inducción de respuestas inmunes tanto humorales como celulares de tipo TH1.

La emulsión de aceite/agua está compuesta por una fase orgánica formada por 2 aceites (un tocoferol y escualeno) y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía un 5% de escualeno, un 5% de tocoferol, un 0,4% de Tween 80 y tenía un tamaño medio de partículas de 180 nm y se conoce como SB62 (véase documento WO 95/17210).

Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han demostrado que la asociación de esta emulsión O/W con 3D-MPL/QS21 (SBAS2) aumenta adicionalmente las propiedades inmunoestimulantes de esta última contra diversos antígenos de subunidad.

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2. Preparación de emulsión SB62 (concentrado 2 veces)

Tween 80 se disuelve en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para dar una solución al 2% en la PBS. Para proporcionar 100 ml 5 g de una emulsión concentrada dos veces de DL alfa tocoferol y 5 ml de escualeno se someten a agitación vorticial para mezclarse minuciosamente. Se añaden 90 ml de solución de PBS/Tween y se mezclan minuciosamente. La emulsión resultante después se pasa a través de una jeringa y finalmente se somete a microfluidización usando una microfluidificadora M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.

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3. Preparación de formulación de Lipoprot. D1/3-MAGE-3-His QS21/3D MPL aceite en agua (SABS2)

El adyuvante se formula como una combinación de MPL y QS21, en una emulsión de aceite/agua. Esta preparación se suministra en viales de 0,7 ml a mezclar con el antígeno liofilizado (viales que contienen de 30 a 300 \mug de antígeno).

La composición del diluyente adyuvante para la vacuna liofilizada es la siguiente:

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La vacuna final se obtiene después de la reconstitución de la preparación de LPD-MAGE-3-His liofilizada con el adyuvante o con PBS sola.

Los controles de adyuvantes sin antígeno se prepararon reemplazando la proteína por PBS.

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4. Antígeno de vacuna: proteína de fusión Lipoproteína D1/3-MAGE-3-His

La Lipoproteína D es una lipoproteína expuesta en la superficie de la bacteria Gram negativa Haemophilus influenzae.

La inclusión de los primeros 109 restos de la proteína D procesada como compañero de fusión se incorpora para proporcionar el antígeno de la vacuna con epítopes de células T. Aparte del resto LPD, la proteína contiene dos aminoácidos no relacionados (Met y Asp), los restos aminoacídicos 2 a 314 de Mage-3, dos restos Gly que funcionan como región de bisagra para exponer los siete restos His posteriores.

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Ejemplo V 1. Inmunogenicidad de LPD-MAGE-3-His en ratones y monos

Para ensayar la antigenicidad e inmunogenicidad de la proteína MAGE-3 humana, la vacuna candidata se inyectó en 2 cepas de ratón diferentes (C57BL/6 y Balb/C), que variaban en su fondo genético y alelos de CMH. Para las dos cepas de ratón, se predijeron teóricamente motivos peptídicos potenciales del CMH de clase I y CMH de clase II para la parte MAGE de la proteína de fusión LPD-MAGE-3-His.

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a) Protocolo de inmunización

5 ratones de cada cepa se inyectaron dos veces con un intervalo de 2 semanas en la almohadilla plantar con 5 \mug de LPD-MAGE-3-His formulado o no en SBAS2 a 1/10 de la concentración usada en el caso de los seres humanos.

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b) Ensayo de proliferación

Se prepararon linfocitos triturando el bazo o los ganglios linfáticos poplíteos de los ratones, 2 semanas después de la última inyección. Se pusieron 2 x 10^{5} células por triplicado en placas de 96 pocillos y las células se re-estimularon in vitro durante 72 horas con diferentes concentraciones (1-0,1 \mug/ml) de His-Mage 3 tal cual o aplicada como un revestimiento sobre microperlas de látex.

Se observó un aumento de la actividad linfoproliferativa específica de MAGE-3 tanto con las células de bazo (véanse las Figuras 5 y 7) como las células de ganglio linfático (véanse las Figuras 6 y 8) de ratones C57BL/6 o Balb/C inyectados con la proteína LPD-MAGE-3-His en comparación con la respuesta linfoproliferativa de ratones que habían recibido la formulación de SBAS-2 sola o PBS.

Además, se obtuvo una respuesta proliferativa significativamente mayor con linfocitos de ratones inmunizados con LPD-MAGE-3-His en el adyuvante SBAS2 (véanse las Figuras 6 y 8).

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c) Conclusión

LPD-MAGE-3-his es inmunogénica en ratones y está inmunogenicidad puede aumentarse mediante el uso de la formulación del adyuvante SBAS2.

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2. Respuesta de anticuerpo a) Protocolo de inmunización

Se inmunizaron ratones Balb/c o C57BL/6 mediante 2 inyecciones dentro de la almohadilla plantar a un intervalo de 2 semanas con PBS o SBAS2, o 5 \mug de LPD-MAGE-3-His o 5 \mug de LPD-MAGE-3-His + SBAS2.

En los grupos de control y los grupos de ensayo se usaron tres y cinco animales respectivamente.

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b) ELISA indirecto

Dos semanas después de la segunda inyección, se tomaron sueros de los individuos y se sometieron a un ELISA indirecto. Como antígeno aplicado como recubrimiento se usaron 2 \mug/ml de His MAGE 3 purificada. Después de la saturación durante 1 hora a 37ºC, en PBS + suero de ternero recién nacido al 1%, los sueros se diluyeron en serie (empezando a 1/1000) en el tampón de saturación y se incubaron durante una noche a 4ºC o durante 90 minutos a 37ºC. Después de lavado en PBS/Tween 20, al 0,01%, se usaron antisueros de IgG total de cabra anti-ratón biotinilada (1/1000) o de IgG1, IgG2a, IgG2b (1/5000) de cabra anti-ratón como segundos anticuerpos. Después de 90 minutos se incubación a 37ºC, se añadió estreptavidina acoplada a peroxidasa y se usó TMB (peróxido de tetra-metil-benzidina) como sustrato. Después de 10 minutos, la reacción se bloqueó mediante la adición de H_{2}SO_{4} 0,5 M y se determinó la D.O.

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c) Resultados

La Figura 9 compara entre los diferentes grupos de ratones (N=5/grupo), el título en el punto medio de la media relativa de los sueros, que está constituido por la dilución media necesaria para alcanzar el punto medio de las
curvas.

Estos resultados demuestran que en las dos cepas de ratón ensayadas, se crea una respuesta de Ab débil después de 2 inyecciones de LPD-MAGE-3-His sola, pero que se generan mayores concentraciones de Ab anti-MAGE 3 cuando LPD-MAGE-3-His se inyecta en presencia de SBAS2. De esta manera, sólo 2 inyecciones de LPD-MAGE-3-His + SBAS2, a un intervalo de 2 semanas, son suficientes para generar la alta respuesta de Ab observada.

La mejor respuesta de Ab observada en ratones Balb/c en comparación con la respuesta obtenida en los ratones C57BL/6 puede explicarse por diferencias en haplotipos o en el efecto de fondo entre estas 2 cepas, aunque el título de Ab conseguido en ratones C57BL/6 también es mayor después de inyecciones de LPD-MAGE-3-His + SBAS2 que después de inyecciones con LPD-MAGE-3-His sola.

Las respuestas anti-MAGE-3 específicas de subclases de Ig después de las vacunaciones en los diferentes grupos de ratones pueden verse en las Figuras 10 y 11, que proporcionan una comparación de la dilución media del punto medio del suero.

Ni IgA ni IgM se detectaron en ninguna de las muestras de suero incluso procedentes de los ratones vacunados con LPD-MAGE-3-His en el adyuvante SBAS2.

Por el contrario, el nivel total de IgG fue ligeramente mayor en los sueros de ratones vacunados con LPD-MAGE-3-His sola, y aumentó significativamente en los sueros de animales inyectados con LPD-MAGE-3-His en
SBAS2.

El análisis de las diferentes concentraciones de subclases de IgG demuestra que se indujo una respuesta de Ab mixta en los ratones, ya que los niveles de todas las subclases de IgG ensayadas (IgG1, IgG2a, IgG2b) fueron mayores en ratones vacunados con el Ag asociado con adyuvantes que en ratones inyectados con el Ag o el adyuvante solo.

La naturaleza de esta respuesta de Ab mixta después de la vacunación por LipoD-MAGE 3 en presencia de SBAS2 parece depender sin embargo de la cepa del ratón, ya que IgG1 e IgG2b se encontraron predominantemente en los sueros de ratones Balb/c y C57BL/6 respectivamente.

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3. Inmunogenicidad de Lipoproteína D 1/3 MAGE-3 - His + adyuvante SBAS2 en monos Rhesus

Se seleccionaron tres grupos de cinco animales Rhesus (Macaca mulatta). Como controles positivos se usaron RTS,S y gp120.

Grupos

Grupo 1: pata derecha: RTS,S/SBAS2

\quad: pata izquierda: GP120/SBAS2

Grupo 2: pata derecha: RTS,S/SB26T

\quad: pata izquierda: GP120/SB26T

Grupo 3: pata derecha: LipoD1/3 Mage 3 His/SBAS2

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Los animales recibieron vacuna el día 0 y se sometieron al refuerzo el día 28 y 84 y se extrajo sangre para determinar su respuesta de anticuerpos tanto al componente MAGE 3 como al componente de proteína D. Las vacunas se administraron por vía intramuscular como una inyección embolada (0,5 ml) en la parte posterior de la pata derecha.

Se tomaron pequeñas muestras de sangre cada 14 días. Se recogieron muestras de sangre no heparinizada de 3 ml de la vena femoral, se dejaron coagular durante al menos 1 hora y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 minutos a 2500 rpm.

Se retiró el suero, se congeló a -20ºC y se envió para la determinación de los niveles de anticuerpo por medio de una ELISA específico.

Microplacas de 96 pocillos (maxisorb Nunc) se recubrieron con 5 \mug de His Mage 3 o Proteína D durante una noche a 4ºC. Después de 1 hora de saturación a 37ºC con PBS NCS 1%, se añadieron diluciones seriadas de suero de conejo durante 1 h 30 a 37ºC (empezando a 1/10), después de tres lavados en PBS Tween, se añadió suero biotinilado anti-conejo (Amersham ref RPN 1004 lote 88) (1/5000). Las placas se lavaron y se añadió peroxidasa acoplada con estreptavidina (1/5000) durante 30 minutos a 37ºC. Después del lavado, se añadieron 50 \mul de TMB (BioRad) durante 7 minutos y la reacción se interrumpió con H2S04 0.2 M, la DO se midió a 450 nm. Se calcularon diluciones de punto medio por Softmax Pro.

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Respuesta de anticuerpo

Se tomaron pequeñas muestras de sangre cada 14 días para seguir la cinética de la respuesta de anticuerpos a Mage 3 por ELISA. Los resultados indican que después de una inyección de LPD-MAGE-3-His + SBAS2, el título total de Ig específico de Mage 3 era bajo, se observó un claro refuerzo en 3 de 5 animales después de una segunda y tercera inyección de LipoD1/3 Mage 3 + adyuvante en los mismos monos. Los malos respondedores permanecieron negativos incluso después de 3 inyecciones. 28 días post II o post III, los títulos de anticuerpo volvieron a los niveles basales. La subclase de estos anticuerpos se determinó como predominantemente IgG y no IgM. El cambio a IgG sugiere que se ha desencadenado una respuesta T auxiliar. La respuesta de anticuerpos específicos para la proteína D, aunque es más débil, es exactamente paralela a la respuesta de anticuerpos contra Mage 3.

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Ejemplo VI 1. LPD-MAGE 1 His

De una manera análoga se preparó-LPD-MAGE 1-His. Las secuencias de aminoácidos y de ADN se representan en la SECUENCIA ID Nº 3 y 4. La proteína resultante se purificó de una manera análoga a la proteína LPD-MAGE-3-His. En resumen, el cultivo celular se homogeneizó y se trató con guanidina HCl 4 M y beta mercaptoetanol 0,5 M en presencia de detergente Empigen al 0,5%. El producto se filtró y el infiltrado se trató con yodoacetamida 0,6 M. Las fracciones carboxiamidadas se sometieron a cromatografía CAMI (Quelato de cinc-sefarosa FF). La columna primero se equilibrio y se lavó con una solución que contenía guanidina 4 M, HCl y fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) y Empigen al 0,5%, y después la columna se lavó con una solución que contenía urea 4 M en tampón fosfato sódico (20 mM, pH 7,5) y Empigen al 0,5%. La proteína se eluyó en el mismo tampón, pero con concentraciones crecientes de Imidiazol (20 mM, 400 mM y 500 mM).

El eluato se diluyó con Urea 4 M. La columna de Q-sefarosa se equilibró y se lavó con Urea 4 M en tampón fosfato 20 mM (pH 7,5) en presencia de Empigen al 0,5%. Se realizó un segundo lavado en el mismo tampón, pero sin el detergente. La proteína eluyó en el mismo tampón pero con concentraciones crecientes de Imidazol (150 mM, 400 mM, 1 M). El eluato se ultrafiltró.

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Ejemplo VII Construcción del plásmido de expresión pRIT14426 y transformación de la cepa huésped AR58 para producir NS1-MAGE-3 His: Diseño de proteína

El diseño de la proteína de fusión NS1,-MAGE-3-His para expresarse en E. coli se describe en la figura 12.

La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia expuesta en ID Nº 5.

La secuencia codificante (ID Nº 6) que corresponde al diseño de proteína anterior se puso bajo el control del promotor \lambdapL en un plásmido de expresión de E. coli.

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La estrategia de clonación para la generación de la proteína de fusión NS_{1}-MAGE-3-His

El material de partida era un plásmido de ADNc recibido de Dr. Tierry Boon del Instituto Ludwig, que contenía la secuencia codificante para el gen MAGE-3 y el vector PMG81, que contenía los 81 aa de la región codificante de NS_{1} (proteína no estructural) del virus de la gripe.

La estrategia de clonación indicada en la Figura 13 incluía las siguientes etapas:

a): Amplificación por PGR de las secuencias presentadas en el ADNc del plásmido MAGE-3 usando el oligonucleótidos con sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, y el oligonucleótido antisentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa.

\quad: Esta amplificación conduce a las siguientes modificaciones en el extremo N: cambio de los cinco primeros codones para el uso de codones de E. coli, reemplazado del codón de Pro por un codón de Asp en la posición 1, instalación de un sitio NcoI en el extremo 5' y finalmente adición de los 2 codones de Gly y los 7 codones de His seguido de un sitio XbaI en el extremo C.

b): Clonación en el vector de clonación de TA de invitrogen del fragmento amplificado anterior y preparación del vector intermedio pRIT14647.

c): Escisión del fragmento NcoI XbaI del plásmido pRIT14647 y clonación en el vector pRIT PMG81.

d): Transformación de la cepa huésped AR58.

e): selección y caracterización de los transformante de la cepa E. coli que contienen el plásmido pRIT14647 (véase la Figura 14) que expresa la proteína de fusión NS1-MAGE-3-His.

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Caracterización de la NS_{1}-MAGE-3-His recombinante (pRIT14426)

Se cultivaron bacterias en Medio LB complementado con 50 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el cultivo alcanzó una DO = 0,3 (a 620 nm), se consiguió inducción con calor elevando la temperatura a 42ºC.

Después de la inducción durante 4 horas, las células se recogieron, se resuspendieron en PBS y se lisaron (por disgregación) prensando tres veces en la prensa French. Después de la centrifugación (60 minutos hacia 100.000 g), el sobrenadante del sedimento y el extracto total se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con Coomassie B1 en los que la proteína de fusión representaba aproximadamente el 1% de las proteínas E. coli totales. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un PM aparente de 44,9 K. La proteína de fusión se identificó por análisis de Transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-NS1.

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Ejemplo VIII Purificación de NS1-MAGE 3-His (E. Coli) para Inmunización de Conejos/Ratones Esquema de purificación

Para purificar el antígeno se usó el siguiente esquema de purificación:

3

a. Lisis

Se lisaron células bacterianas (23 g) en 203 ml de un tampón PO_{4}50 mM pH 7 por Rannie (homogeneizador) y el lisado se centrifugó en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30 minutos.

El sobrenadante se desechó.

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b. Solubilización del antígeno

1/3 del sedimento se resolubilizó durante una noche a 4ºC en 34 ml de PO_{4}100 mM - GuHC1 6 M pH 7. Después de la centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 30 minutos, el sedimento se desechó y el sobrenadante se purificó adicionalmente por cromatografía CAMI.

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c. Cromatografía de afinidad: Ni^{2}+-NTA agarosa (Qiagen)

4

Elución: gradiente de imidazol (0 \rightarrow 250 mM) en tampón PO_{4} 0,1 M complementado con urea 6 M.

Caudal: 2 ml/min

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a. Concentración

Se reunieron fracciones positivas de antígeno del eluato de la CAMI (160 ml) y se concentraron a 5 ml en una celda agitada Amicon en una membrana Filtron (tipo Omega con un límite de 10.000).

La pureza en esta etapa es de aproximadamente un 70% como se estima por SDS-PAGE.

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b. Electroforesis preparativa (Prep Cell Biorad)

2,4 ml de la muestra concentrada se llevaron a ebullición en 0,8 ml de tampón de muestra de reducción y se cargaron en un gel de acrilamida al 10%. El antígeno se eluyó en un tampón de Tris-Glicina pH 8,3 complementado con SDS al 4% y se reunieron fracciones positivas para Ns_{1}-MAGE 3 His.

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a. Precipitación con TCA

El antígeno se precipitó con TCA y después de la centrifugación en un rotor JA 20 a 15.000 rpm durante 20 minutos, se desechó el sobrenadante. El sedimento se resolubilizó en tampón PBS pH 7,4.

La proteína es soluble en PBS y después de la congelación/descongelación no muestra ninguna degradación cuando se almacena durante 3 horas a 37ºC y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 50.000 Daltons como se determina por SDS (PAGE al 12,5%).

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Ejemplo IX Preparación de la cepa de E. coli que expresa una proteína de fusión CLYTA-MAGE-1-cola His 1. Construcción del plásmido de expresión pPRIT14613 y transformación de la cepa huésped AR58 Diseño de la proteína

El diseño de la proteína de fusión Clyta-Mage-1-His para expresarse en E. coli se describe en la Figura 15.

La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia expuesta en la secuencia ID Nº 7.

La secuencia codificante (véase la SECUENCIA ID Nº 8) correspondiente al diseño de la proteína anterior se puso bajo el control de un promotor pL de \lambda en un plásmido de expresión de E. coli.

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Clonación

El material de partida fue el vector PCUZ1 que contiene los 117 codones C-terminales de la región codificante Lyta de Streptococcus pneumoniae y el vector pRIT14518, en el que previamente los presentes inventores subclonaron el ADNc del gen MAGE-1 procedente de un plásmido recibido de Dr. Tierry Boon del Instituto Ludwig.

La estrategia de clonación para la expresión de la proteína CLYTA-Mage-1-His (véase lo indicado en la Figura 16) incluía las siguientes etapas:

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2. Preparación del módulo de secuencia codificante de CLYTA-Mage-1-His

a): La primera etapa fue una amplificación porque PCR, destinada a flanquear las secuencias CLYTA con los sitios de restricción NdeI-AflIII. La amplificación por PCR se realizó usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el oligonucleótido con sentido 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido antisentido: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Esto conduce a la amplificación de una secuencia CLYTA de 378 nucleótidos de longitud.

b): La segunda etapa fue el ligamento de secuencias CLYTA a las secuencias MAGE-1-His, para generar la secuencia codificante para la proteína de fusión. Esta etapa incluía la escisión de un fragmento de Clyta NdeI-AflIII y la inserción en el vector pRIT14518 previamente abierto por enzimas de restricción NdeI y NcoI (compatible con NcoI y AflIII) y dio lugar al plásmido pRIT14613.

c): Transformación de la cepa huésped AR58.

d): Selección y caracterización del transformante de E. coli (resistente a KAN) que contiene el plásmidos pRIT14613 (véase la Figura 16).

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1. Caracterización de la proteína recombinante CLYTA-MAGE-1-His (pRIT14613)

Se cultivaron bacterias en Medio LB complementado con 50 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el cultivo alcanzó una DO = 0,3 (a 620 nm), la inducción por calor se consiguió elevando la temperatura a 38ºC.

Después de 4 horas de inducción, las células se recogieron, se resuspendieron en PBS y se lisaron (por disgregación) mediante un disparo. Después de la centrifugación, el sobrenadante del sedimento y el extracto total se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con Coomassie B1, en los que la proteína de fusión representaba aproximadamente un 1% de las proteínas totales de E. coli. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un PM aparente de aproximadamente 49 kD. La proteína de fusión se identificó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti-Mage-1.

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Reconstitución de la unidad expresión compuesta por promotor pL de \lambda largo (útil para la inducción con ácido Nalidíxico) y la secuencia codificante de CLYTA-Mage-1 pRIT14614)

Se preparó un fragmento de restricción EcoRI-NCO_{1} que contenía el promotor PL largo y una parte de las secuencias CLYTA a partir del plásmido pRIT DVA6 y se insertó entre los sitios EcoRI-NCO_{1} del plásmido pRIT14613.

Se obtuvo el plásmido recombinante pRIT14614.

El plásmido recombinante pRIT14614 (véase la Figura 17) que codificaba la proteína de fusión CLYTA-MAGE-1-His se usó para transformar E. coli AR120. Se seleccionó y se caracterizó una cepa candidata resistente a Kan.

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Caracterización de la proteína recombinante

Se cultivaron bacterias en Medio LB complementado con 50 mg/ml de kanamicina a 30ºC. Cuando el cultivo alcanzó una DO = 400 (a 620 nm), se añadió ácido Nalidíxico a una concentración final de 60 mg/ml.

Después de 4 horas de inducción, las células se recogieron, se resuspendieron en PBS y se lisaron por desintegración (disgregación CLS del tipo "un disparo"). Después de la centrifugación, el sobrenadante del sedimento y el extracto total se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con azul de Coomassie, en los que la proteína de fusión representaba aproximadamente un 1% de las proteínas totales de E. coli. La proteína de fusión se identificó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales de conejo anti-Mage-1. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un PM aparente de aproximadamente 49 kD.

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Ejemplo X CLYTA-MAGE-3-His

A. Antígeno recombinante de rechazo tumoral: una proteína de fusión CLYTA-Mage-3-His en la que el compañero de fusión C-lyt A conduce a la expresión de una proteína soluble, actúa como marcador de afinidad y proporciona una respuesta T auxiliar útil.

Preparación de la cepa E. coli que expresa una proteína de fusión CLYTA-Mage-3-cola His

Construcción del plásmido de expresión pRIT14646 y transformación de la cepa huésped AR 120:

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Diseño de la proteína

El diseño de la proteína de fusión Clyta-Mage-3-His para expresarse en E. coli se describe en la Figura 18.

La estructura primaria de la proteína resultante tiene la secuencia descrita en la SECUENCIA ID Nº 9 y la secuencia codificante en la secuencia ID Nº 10.

La secuencia codificante correspondiente al diseño de la proteína anterior se puso bajo el control del promotor pL de \lambda en un plásmido de expresión de E. coli.

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Clonación

El material de partida fue el vector PCUZ1 que contiene los 117 codones C-terminales de la región codificante de Lyta de Streptococcus pneumoniae, descrita en Gene 43, (1996) págs. 265-272 y el vector pRIT14426, en el que previamente los presentes inventores subclonaron el ADNc del gen MAGE-3 procedente de un plásmido recibido de Dr. Tierry Boon del Instituto Ludwig.

La estrategia de clonación para la expresión de la proteína CLYTA-MAGE-3-His (véase el esquema en la Figura 19) incluía las siguientes etapas:

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1. Preparación del módulo de secuencia codificante de CLYTA-MAGE-3-His

1.1.: La primera etapa fue una amplificación por PCR, destinada a flanquear las secuencias CLYTA con los sitios de restricción AflII y AflIII. La amplificación por PCR se realizó usando el plásmido PCUZ1 como molde y como cebadores el oligonucleótido con sentido 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, y el oligonucleótido antisentido: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Esto conduce a la amplificación de una secuencia CLYTA de 427 nucleótidos de longitud. El fragmento amplificado anterior se clonó en el vector de clonación TA de Invitrogen para conseguir el vector intermedio pRIT14661.

1.2.: La segunda etapa fue el ligamento de secuencias CLYTA a las secuencias MAGE-3-His, para generar la secuencia codificante para la proteína de fusión. Esta etapa incluía la escisión de un fragmento de Clyta AflII-AflIII y la inserción en el vector pRIT14426 previamente abierto por enzimas de restricción AflII y NcoI (compatible con NcoI y AflII) y dio lugar al plásmido pRIT14662.

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2. Reconstitución de la unidad de expresión compuesta por el promotor pL de \lambda largo (útil para la inducción con ácido Nalidíxico) y la secuencia codificante de CLYTA-Mage-3

Se preparó un fragmento de restricción BgIII-XbaI que contenía el promotor pL corto y las secuencias codificantes de CLYTA-Mage-3-His a partir del plásmido pRIT14662 y se insertó entre los sitios BglII-XbaI del plásmido TCM67 (un derivado de pBR322 que contenía la resistencia a ampicilina y el promotor pL de \lambda largo, descrito en la Solicitud Internacional PCT/EP92/01827). Se obtuvo el plásmido pRIT14607.

El plásmido recombinante pRIT14607 que codifica la proteína de fusión Clyta-Mage-3 His se usó para transformar AR120 de E. coli (Mott y col. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, 82: 88). Se seleccionó y se caracterizó una cepa candidata resistente a ampicilina.

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3. Preparación del plásmido pRIT 14646

Finalmente, se construyó un plásmido similar a pRIT 14607 pero que tenía la selección de Kanamicina
(pRIT14646).

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Caracterización de la proteína recombinante

Después de 4 horas de inducción, las células se recogieron, se resuspendieron en PBS y se lisaron por desintegración (disgregación CLS del tipo "un disparo"). Después de la centrifugación, el sobrenadante del sedimento y el extracto total se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se visualizaron en geles teñidos con azul de Coomassie, en los que la proteína de fusión representaba aproximadamente un 1% de las proteínas totales de E. coli. La proteína de fusión se identificó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales de conejo anti-Mage-1. La proteína recombinante aparecía como una sola banda con un PM aparente de aproximadamente 58 kD.

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Ejemplo XI Purificación de la proteína recombinante CLYTA-Mage-3 His

Las bacterias recombinantes AR120 (pRIT 14646) se cultivaron en un fermentador de 20 litros en condiciones semicontinuas a 30ºC. La expresión de la proteína recombinante se indujo por la adición de ácido Nalidíxico a una concentración de 60 mg/ml. Las células se recogieron al final de la fermentación y se lisaron a 60 DO/600 por dos pases a través de un disruptor de Prensa French (20 000 psi). Las células se lisaron y se sedimentaron durante 20 min a 15 000 g a 4ºC. El sobrenadante que contenía la proteína recombinante se cargó en resina de intercambio DEAE Sefarosa CL6B (Pharmacia) pre-equilibrada en Tampón A NaCl 0,3 M, Tris HCl 20 mM pH 7,6. Después de un lavado de columna con tampón A, la proteína de fusión se eluyó por colina al 2% (en Tampón A). Se reunieron las fracciones de antígeno Positivo, como se reveló por el análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo anti Mage-3. El antígeno eluido con DEAE se llevó a Empigen BB al 0,5% (un detergente zwiteriónico) y a NaCl 0,5 M antes de cargar en una columna de cromatografía de Afinidad por Iones Metálicos preequilibrada en Empigen BB al 0,5% NaCl 0,5 M, tampón fosfato 50 mM pH 7,6 (Tampón B).

\newpage

La columna CAMI se lavó con tampón B hasta que la absorbancia de 280 nm alcanzó la línea basal. Se realizó un segundo lavado en tampón B sin Empigen BB (Tampón C) para eliminar el detergente antes de la elución del antígeno por un gradiente de Imidazol de 0-250 mM en tampón C.

Se reunieron las fracciones de Imidazol 0,090-0,250 M, se concentraron en una membrana omega Filtron de 10 kDa antes de la diálisis frente al tampón PBS.

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Conclusión

Los presentes inventores han demostrado que la proteína fusionada LPD-MAGE3-His es inmunogénica en ratones y que esta inmunogenicidad (la respuesta proliferativa y la respuesta de anticuerpos) puede aumentarse adicionalmente mediante el uso del adyuvante descrito anteriormente. La purificación puede aumentarse derivatizando los tioles que forman enlaces disulfuro.

Los presentes inventores también han demostrado que se desencadena una mejor respuesta de anticuerpo con la vacunación con el LPD-MAGE-3-His en presencia del adyuvante. El isotipo predominante encontrado en el suero de C57BL/6 era IgG2b lo que sugiere que se inducía una respuesta inmune de tipo TH 1.

En la situación clínica, en seres humanos, en un paciente tratado con LPD-MAGE3-His en una formulación con adyuvante desapareció un melanoma.

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Referencias

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- Fuijie T y col, Ann Oncol 1997 abril, 8 (4): 369-72.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: SmithKline Beecham Biologicals

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: SmithKline Beecham

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(B): CALLE: 2 New Horizons Court, Great West Road, B

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(C): CIUDAD: Middx

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(D): ESTADO:

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(E): PAÍS: RU

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(F): CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco

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(B): ORDENADOR: IBM Compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D): SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Dalton, Marcus J

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: B45126

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 0181 9756348

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 0181 9756177

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 452 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1353 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1341 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 466 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 404 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1212 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 445 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

12

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1338 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

13

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 454 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

14

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1362 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\newpage

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a.

\hskip1cm

Cabezon Silva, Tereza

\hskip1cm

Cohen, Joseph

\hskip1cm

Slaoui, Moncef Mohamed

\hskip1cm

Vinals Bassols, Carlota

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Vacuna

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> B45126 EP Div1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP05076599.9

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 13-07-2005

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP99907476.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 02-02-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB9802543.0

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 05-02-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB199802650.3

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 06-02-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para windows versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión con cola His lipidada procesada de MAGE 3 y proteína D

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión con cola His lipidada procesada de MAGE 3 y proteína D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión con cola His lipidada procesada de MAGE 1 y proteína D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 446

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión con cola His lipidada procesada de MAGE 1 y proteína D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de NS1-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

20

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de N51-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de Clyta-MAGE-1-His

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de Clyta-MAGE-1-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de Clyta-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

24

\newpage

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de Clyta-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

25

\newpage

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a.

\hskip1cm

Cabezon Silva, Tereza

\hskip1cm

Cohen, Joseph

\hskip1cm

Slaoui, Moncef Mohamed

\hskip1cm

Vinals Bassols, Carlota

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Vacuna

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> B45126 EP Div1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP05076599.9

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 13-07-2005

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP99907476.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 02-02-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB9802543.0

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 05-02-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB199802650.3

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 06-02-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para windows versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 446

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de NS1-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

30

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de N51-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de Clyta-MAGE-1-His

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de Clyta-MAGE-1-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Una proteína de fusión de Clyta-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

34

340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia codificante de una proteína de fusión de Clyta-MAGE-3-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

35

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LISTADO DE SECUENCIAS

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: SmithKline Beecham Biologicals

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: SmithKline Beecham

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 2 New Horizons Court, Great West Road, B

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Middx

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: RU

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Dalton, Marcus J

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: B45126

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 0181 9756348

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 0181 9756177

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 452 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1353 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1341 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

39

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 466 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

40

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 404 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1212 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 445 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

43

430

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1338 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

44

440

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 454 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

45

450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1362 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

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46

Claims

1. Un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE, que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en el que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un agente zwitteriónico.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente caotrópico es urea o clorhidrato de guanidinio.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el detergente zwitteriónico es Empigen BB-n-dodecil-N,N-dimetilglicina.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el agente bloqueante es un agente alquilante.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente bloqueante es un alfa haloácido y/o alfa haloamida.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que el agente bloqueante es uno o más de los siguientes: ácido yodoacético; yodoacetamida; N-etilmaleimida; cloroacetil fosfato; O-metilisourea; y acrilonitrilo.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína comprende un marcador de afinidad.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el marcador de afinidad es CLytA o una cola de polihistidina.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la proteína que comprende un marcador de afinidad, después de la etapa de bloqueo, se somete a cromatografía de afinidad.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la cromatografía de afinidad es una cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC).

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el ión metálico se selecciona entre los siguientes: cinc, níquel, hierro, magnesio o cobre.

12. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones, 9, 10 u 11, en el que la cromatografía de afinidad se realiza usando tampón que contiene el detergente zwiteriónico Empigen BB.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína es una proteína de fusión que comprende un antígeno MAGE y un compañero de fusión.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compañero de fusión es proteína D o un fragmento de la misma procedente de Haemophilus influenzae B que comprende el primer 1/3 de la proteína D, la proteína NS1 del virus de la gripe o un fragmento de la misma que comprende los 81 aminoácidos N terminales de NS1, o LytA de Streptococcus pneumonia o un fragmento de la misma que comprende los restos 188-305 de LytA.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el compañero de fusión es la forma lipidada de la proteína D.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que la proteína comprende LytA o un fragmento de la misma que comprende los restos 188-305 y en el que la proteína se purifica por cromatografía de afinidad a colina o análogos de colina tales como DEAE.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el antígeno MAGE se selecciona entre el grupo MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3 y MAGE B4, MAGE C1, MAGE C2.

18. Un procedimiento para la producción de una vacuna, que comprende las etapas de producir o purificar una proteína MAGE, por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y formular la proteína resultante como una vacuna.