CZ20002869A3 - Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinů a prostředků pro vakcinaci - Google Patents

Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinů a prostředků pro vakcinaci Download PDF

Info

Publication number
CZ20002869A3
CZ20002869A3 CZ20002869A CZ20002869A CZ20002869A3 CZ 20002869 A3 CZ20002869 A3 CZ 20002869A3 CZ 20002869 A CZ20002869 A CZ 20002869A CZ 20002869 A CZ20002869 A CZ 20002869A CZ 20002869 A3 CZ20002869 A3 CZ 20002869A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mage
protein
leu
glu
ala
Prior art date
Application number
CZ20002869A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298364B6 (cs
Inventor
Silva Teresa Cabezon
Joseph Cohen
Moncef Slaoui
Bassols Carlota Vinals
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9802543.0A external-priority patent/GB9802543D0/en
Priority claimed from GBGB9802650.3A external-priority patent/GB9802650D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ20002869A3 publication Critical patent/CZ20002869A3/cs
Publication of CZ298364B6 publication Critical patent/CZ298364B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • A61K39/001184Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186MAGE
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245Escherichia (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55572Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55577Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031Proteins
    • A61K2039/6068Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/20Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MÁGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kódující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinů a prostředků pro vakcinaci
• ·
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká proteinových derivátů obsahujících antigeny asociované s nádory, které mohu být použitelné při protinádorové vakcinaci. Přesněji, deriváty podle předkládaného vynálezu zahrnují fúsní proteiny obsahující antigen kódovaný rodinou MÁGE genů (například MAGE-3, MAGE-1) navázaný na imunologický fúsní partner, který dodává epitopy pro T-pomocné lymfocyty, jako je například lipidovaná forma proteinu D z Haemophilus influenzae B; chemicky modifikované MÁGE proteiny, ve kterých jsou disulfidové můstky redukovány a vzniklé .thioly jsou blokovány a geneticky modifikované MÁGE proteiny opatřené afinitní koncovkou a/nebo geneticky modifikované tak, aby bylo zabráněno tvorbě disulfidových můstků. Také jsou popsány způsoby pro přečištění MÁGE proteinů a pro přípravu vakcín. pro léčbu různých zhoubných nádorů, včetně například melanomu, karcinomu prsu, plic, NSCLC, spinocelulárních karcinomů hlavy a krku, karcinomu tlustého střeva a karcinomu jícnu.
Dosavadní stav techniky
Antigeny kódované rodinou MÁGE genů jsou exprimovány především na melanomových buňkách (včetně buněk maligního melanomu) a na buňkách některých jiných nádorů včetně·.NSCLC (nemalobuněčného karcinomu plic), spinocelulárního karcinomu hlavy a krku, uroteliálního karcinomu močového měchýře a karcinomu jícnu, ale nejsou detekovatelné na normálních tkáních s výjimkou varlat a placenty (Gaugler, 1994; Weynants, 1994, Patard, 1995) . MAGE-3 je exprimován v 69% melanomů (Gaugler, 1994) a může být také detekován ve 44% případů NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% případů spinocelulárního karcinomu hlavy a krku, 34% případů uroteliálního karcinomu močového měchýře, 57% případů karcinomu jícnu, 32% případů karcinomu tlustého střeva a 24% případů karcinomu prsu (Van Pel, 1995; Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Nádory exprimující MÁGE proteiny jsou známé jako nádory asociované s MÁGE.
Imunogenicita lidských melanomových buněk byla elegantně prokázána v pokusech využívajících smíšených kultur melanomových buněk a autologních lymfocytů. Tyto kultury často vytvářejí specifické cytotoxické T-lymfocyty (CTL) schopné lyžovat výlučně autologní melanomové buňky, ale ne autologní fibroblasty ani autologní lymfocyty transformované EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Nyní bylo identifikován několik antigenů rozpoznávaných na autologních melanomových buňkách těmito CTL klony, včetně antigenů MÁGE rodiny.
První antigen, který mohl být definován pomocí rozpoznávání specifickými CTL na autologních melanomových buňkách, je označen MZ2-E (Van den Eynde, 1989) a je kódován genem MAGE-1 (Van der Bruggne, 1991). CTL namířené proti MZ2-E rozpoznávají a lyžují MZ2-E pozitivní autologní melanomové buňky, stejně jako buňky od jiných pacientů, pokud mají tyto buňky HLA.A1 alelu.
MAGE-1 gen náleží do rodiny 12 blízce příbuzných genů, MAGE1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12, umístěných na chromosomu X a majících 64-85% vzájemnou homologii v kódujících sekvencích (De Plaen, 1994). Tyto jsou někdy označovány jako MAGE-A1, MAGE-A2,
MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-All, MAGE-A12 (MÁGE A rodina). Dvě další skupiny proteinů také náleží do MÁGE rodiny, ačkoliv jsou příbuzné o něco méně. Tyto patří do MÁGE B a MÁGE C rodiny. MÁGE B rodina zahrnuje MÁGE Bl (též známý jako MÁGE Xpl a DAM 10), MÁGE B2 (též známý jako MÁGE Xp2 a DAM 6), MÁGE B3 a MÁGE B4 - MÁGE C rodina v současnosti zahrnuje MÁGE Cl a MÁGE C2. Obecně může být MÁGE protein definován jako protein obsahující specifickou jadernou sekvenci umístěnou v oblasti C-konce proteinu (například pro MÁGE Al protein o 309 aminokyselinách odpovídá specifická jaderná sekvence aminokyselinám 195-279).
Společná specifická jaderná sekvence může být zapsána následujícím způsobem, kde x představuje jakoukoliv aminokyselinu, zbytky uvedené malými písmeny jsou konzervované (konzervativní varianty jsou možné) a zbytky uvedené velkými písmeny jsou zcela konzervované.
Specifická jaderná sekvence:
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(34x)gxp(2x)lit(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
Konzervativní substituce jsou dobře známé a obyčejně jsou zadávány jako chybové skorovací matrice v počítačových programech pro seřazování sekvencí. Mezi tyto programy patří PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978) A model of evolutionary changes in proteins, v Atlas of Protein sequence and structure, 5(3) M.O.Dayhoft (ed.) 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, a Blosum 6,2 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.
Obecně, substituce v následujících skupinách jsou konzervativní substituce, ale substituce mezi skupinami jsou považovány za nekonzervativní substituce. Těmito skupinami jsou:
(i) aspartat/asparagin/glutamat/glutamin;
(ii) serin/threonin;
(iii) lysin/arginin;
(iv) fenylalanin/tyrosin/tryptofan;
(v) leucin/isoleucin/valin/methionin;
(vi) glycin/alanin.
Obecně a v kontextu předkládaného vynálezu bude MÁGE protein přibližně z 50% identický v tomto jaderném regionu s aminokyselinami 195-279 MÁGE Al.
Na MAGE-3 proteinu bylo identifikováno několik CTL epitopů. Jeden takový epitop, MAGE-3.Al, je nepeptidová sekvence umístěná mezi aminokyselinami 168 a 176 MAGE-3 proteinu, která tvoří epitop specifický pro CTL, pokud je presentována společně s MHC molekulou třídy I HLA.A1. Nově byly identifikována další CTL epitopy na peptidové sekvenci MAGE-3 proteinu podle své schopnosti vyvolat CTL odpověď ve smíšené kultuře melanomových buněk a autologních lymfocytů. Tyto dva epitopy mají specifické vazebné motivy pro HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) a HLA.B44 (Herman, 1996) alely, v příslušném pořadí.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje deriváty MÁGE proteinu. Takové deriváty jsou vhodné pro použití v terapeutických vakcinačních prostředcích, které jsou vhodné pro léčbu různých typů nádorů.
99 9
V jednom provedení předkládaného vynálezu je derivátem fúsní protein obsahující antigen z MÁGE proteinové rodiny navázaný na heterologní fúsní partner. Proteiny mohou být chemicky konjugované, ale výhodněji jsou exprimovány jako rekombinantní fúsní proteiny umožňující vyšší úroveň produkce v expresním systému ve srovnání s non-fúzními proteiny. Fúsní partner může napomáhat dodáním epitopů pro T-pomocné lymfocyty (imunologický fúsní partner), výhodně epitopy pro T-pomocné lymfocyty rozpoznávané člověkem, nebo může napomáhat v expresi proteinu (zesilovač exprese) ve vyšším množství ve srovnání s přirozeným rekombinantním proteinem. Výhodně je fúsní partner jak imunologickým fúzním partnerem, tak zesilovačem exprese.
Ve výhodném provedení vynálezu je imunologický fúsní partner odvozen od proteinu D, povrchového proteinu gram-negativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). Výhodně obsahuje derivát proteinu D přibližně první 1/3 proteinu, přesněji ppřibližně prvních 100-110 N-koncových aminokyselin. Výhodně je derivát proteinu D lipidovaný. Výhodně je prvních 109 zbytků fúsního partnera tvořeného lipoproteinem D obsaženo na N-konci pro dodání potenciálního vakcinačního antigenu s dalšími exogenními epitopy pro T-lymfocyty a tento fúsní partner zvyšuje expresi v E. coli (takže působí jako zesilovač exprese). Lipidový konec zajišťuje optimální presentaci antigenu buňkám presentujícím antigen.
Mezi další fúsní partnery patří nestrukturální protein z chřipkového viru, NS1 (hemagglutinin). Obvykle je použito 81 Nterminální aminokyselin, ačkoliv mohou být použity jiné fragmenty, pokud obsahují epitopy pro T-lymfocyty.
V jiném provedení je imunologickým fúzním partnerem protein známý jako LYTA. Výhodně je použita C-koncová část molekuly.
LYTA je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alanin amidasu, amidasu LYTA (kodovanou lytA genem (Gene, 43 (1986) str. 265-272), což je autolysin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanovém skeletu. C-koncová doména LYTA proteinu je odpovědná za afinitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využita pro vývoj E.colí C-LYTA expresních plasmidů použitelných pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících G-LYTA fragment na amino-konci bylo popsáno (Biotechnology, 10, (1986), str. 795-798). Výhodná provedení vynálezu využívají repetitivní část Lyta molekuly na C-konci začínající zbytkem 178. Zejména výhodná provedení obsahují zbytky 188-305.
Imunologické fúsní partnery uvedené výše jsou také výhodné v tom, že napomáhají expresi. Konkrétně, takové fúsní proteiny jsou exprimovány s vyšším výtěžkem než přirozené rekombinantní MÁGE proteiny.
Vynálezci demonstrovali, že při klinickém použití jsou takové konstrukty schopné léčit melanom. V jednom případě byl pacient s melanomem ve stadiu IV zbaven metastas po dvou dávkách lípo D 1/3 MÁGE 3 His proteinu bez adjuvans.
V jednom provedení předkládaný vynález proto obsahuje fúsní proteiny obsahující antigen asociovaný s nádory z MÁGE rodiny navázaný na imunologický fúsní partner. Výhodně je imunologický fúsní partner protein D nebo jeho fragment, nejlépe lipoprotein D. MÁGE proteiny jsou výhodně MÁGE Al nebo MÁGE A3. Složka lipoproteinu D je výhodně tvořena první 1/3 lipoproteinu D.
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou přednostně exprimovány v E. coli. Ve výhodném provedení jsou proteiny
Ί • · exprimovány s afinitní koncovkou, jako je například histidinová koncovka složená z 5 až 9, výhodně ze 6 histidinových zbytků. Tyto koncovky jsou výhodné v tom, že napomáhají při přečištění.
Předkládaný vynález také poskytuje nukleové kyseliny kódující proteiny podle předkládaného vynálezu. Takové sekvence mohou být insertovány do vhodného expresního vektoru a použity v DNA/RNA vakcinaci, nebo mohou být exprimovány ve vhodném hostiteli. Mikrobiální vektory exprimující nukleové kyseliny mohou být použity jako vakciny. Mezi takové vektory patří například poxvirus, adenovirus, alfavirus, listería a monarfág.
DNA sekvence kódující proteiny podle předkládaného vynálezu může být syntetizována za použití standardních technik syntézy DNA, jako je enzymatická ligace popsaná v D.M. Roberts et al. v Biochemistry. 1985., 24.: 5090-5098, chemická syntéza, enzymatická polymerizace in vitro nebo PCR technologie využívající například termostabilní polymerasu, nebo pomocí kombinace těchto technik.
Enzymatická polymerizace DNA může být provedena in vitro za použití DNA polymeras jako je DNA polymerasa I (Klenow fragment) ve vhodném pufru obsahujícím nukleosid-trifosfaty dATP, dCTP, dGTP a dTTP podle potřeb při teplotě 10-37 °C, obyčejně v objemu 50 μΐ nebo menším. Enzymatická ligace DNA fragmentů může být provedena za použití DNA ligasy, jako je T4 DNA ligasa, ve vhodném pufru, jako je 0,05 M Tris (pH 7,4),
0,01 M MgCl2, 0,01M dithiothreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP a 0,1 mg/ml hovězí sérový albumin, při teplotě od 4 °C do teploty okolí, obyčejně v objemu 50 ml nebo menším. Chemická syntéza DNA polymeru nebo fragmentu může být provedena běžnou fosfotriesterovou, fosfitovou nebo fosforoamiditovou metodou, za použití techniky syntézy na pevné fázi, jak je popsána v ·· *···
Chemical and Enzymatic Synthesis ofo Gene Fragments - A Laboratory Manual (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, jako je například M.J. Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.
Sproat a R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10: 6243; B.S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24:
5771; M.D. Matteucci a M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21: 719; M.D. Matteuci a M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103: S.P. Adams et al.,
Journal of the American Chemical Society, 1983, 105: 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McManus a H. Koester, Nucleic Acids Research 1984, 12: 4539; a H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3:801.
Způsob podle předkládaného vynálezu může být proveden za použití jakékoliv rekombinantní techniky, jako jsou například techniky popsané v Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Přesněji, způsob může obsahovat kroky:
(i) přípravu replikovatelného nebo integrovatelného expresního vektoru, který je schopen exprimovat v hostitelské buňce DNA polymer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo jeho ímunogenní derivát;
(ii) transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem;
(iii) kultivaci uvedené transformované hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi uvedeného DNA polymeru pro produkci uvedeného proteinu; a (iv) získání uvedeného proteinu.
Termín transformování, jak je zde použit, označuje vložení cizorodé DNA do hostitelské buňky. Toto může být provedeno pomocí transformace, transfekce nebo infekce vhodného plasmidu
0000
0 0 0 0 0000 00 0 000 000 0 0 00 nebo virového vektoru za použití běžných technik popsaných například v Genetics Engeneeríng, ed. S.M. Kingsman a A.J. Kingsman; Blackwell Scienptific Publications, Oxford, England, 1988. Termíny transformovaná nebo transformant jsou zde použity na výslednou hostitelskou buňku obsahující a exprimující vybraný cizorodý gen.
Expresní vektory jsou nové a tvoří také část předkládaného vynálezu.
Replikovatelné expresní vektory mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu, štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za zisku lineárního DNA segmentu majícího intaktní replikon a kombinováním uvedeného lineárního segmentu s jednou nebo více molekulami DNA, které spolu s uvedeným lineárním segmentem kódují požadovaný produkt, jako je například DNA polymer kódující protein podle předkládaného vynálezu nebo derivát, za vhodných ligačních podmínek.
Tak může být DNA polymer vytvořen před nebo během konstrukce vektoru.
Volba vektoru bude provedena podle hostitelské buňky, která může být prokaryotická nebo eukaryotická, ale výhodně se jedná o E. coli nebo CHO buňky. Mezi vhodné vektory patří plasmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry.
Příprava replikovatelných expresních vektorů může být provedena běžnými způsoby za použití vhodných enzymů pro restrikci, polymerizaci a ligaci DNA, podle způsobů popsaných například v Maniatis et al., výše.
•99999 9 9 99 99
9 99 99 9999
999 9 9 9999
999 9 9 999999
999 9 9 9999
9 999 999 99 99
Rekombinantní hostitelská buňka je připravena ve způsobu podle předkládaného vynálezu transformováním hostitelské buňky replikovatelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu za transformačních podmínek. Výhodnými transformačními podmínkami jsou běžné podmínky a jsou popsány například v Maniatis et al., výše, nebo v DNA Cloning, svazek II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985.
Volba transformačních podmínek závisí na hostitelské buňce. Bakteriální buňka, jako je E. coli, může být ošetřena roztokem CaCl2 (Cohen et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 1973, 69:2110) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCÍ2ř octanu draselného a glycerolu, a potom kyselinou 3-[N-morfolino]-propansulfonovou, RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře mohou být transformovány vápníkovým vysrážením vektorové DNA do buněk. Vynález také zahrnuje hostitelské buňky transformovaná replikovatelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu.
Kultivace transformovaných hostitelských buněk za podmínek umožňujících expresi DNA polymeru je provedena běžným způsobem, jak je popsáno například v Maniatis et al. a v DNA Cloning, výše. Výhodně jsou buňkám dodávány živiny a kultivace probíhá při teplotách nižších než 50 °C.
Výsledný materiál může být získán za použití běžných metod vybraných podle hostitelských buněk a podle lokalizace exprímovaného materiálu (intracelulární nebo secernovaný do kultivačního media nebo do buněčné periplasmy). Když je hostitelská buňka bakteriální, jako je například E. coli, tak může být například provedena fyzikální, chemická nebo enzymatická lýza buňky a proteinový produkt může být izolován z výsledného lyzátu. Když je hostitelskou buňkou savčí buňka, tak fefe fefefefe · fe fefe fefe fe · « fefefefe fe fefe fe • ♦ » · fe fefefe* • fefe » fe fe fefefe fefe fe fefefefe·· fefe fefe může být produkt obvykle izolován z živného media nebo z bezbuněčných extraktů. Mezi běžné techniky pro izolaci proteinů patři selektivní srážení, adsorpční chromatografie a afinitní chromatografie včetně afinitní kolony s monoklonální protilátkou.
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou poskytnuty buď jako rozpuštěný materiál v kapalné formě nebo v lyofilizované formě.
Obecně se předpokládá, že každá dávka pro člověka bude obsahovat 1 až 1000 gg proteinu, výhodně 30-300 gg.
Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující protein podle předkládaného vynálezu ve farmaceuticky přijatelných přísadách. Výhodný vakcinační prostředek obsahuje alespoň lipoprotein D - MAGE-3. Taková vakcína může volitelně obsahovat jeden nebo více jiných antígenů asociovaných s nádory, například jiné antigeny náležící do MÁGE nebo GAGE rodiny. Mezi vhodné další antigeny asociované s nádory patří MAGE-1, GAGE-1 nebo tyrosinasa.
Příprava vakcín je obecně popsána v Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (ed. Powell M.F. and Newman, M.J.) (1995) Plenům Press New York). Obalení do liposomů je popsáno ve Fuilerton, U.S. patent č. 4235877.
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně obsaženy ve vakcinačních prostředcích podle předkládaného vynálezu společně s adjuvans. Mezi vhodná adjuvans patří soli hliníku, jako je hydroxid hlinitý ve formě gelu (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý, ale patří mezi ně také soli vápníku, železa nebo zinku, nebo nerozpustné suspenze acylovaného •9 9*9·
9 9
9 9
9 9 9
9 9
9 • 99
999 *9 *· t * 9 • 9 9 »
9 9 9 • 9 9 *
9« 99 tyrosinu nebo acylované cukry, kationtové nebo aniontově derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny. Mezi další známá adjuvans patří oligonukleotidy obsahující CpG. Oligonukleotidy se vyznačují tím, že CpG dinukleotid je nemethylovaný. Takové oligonukleotidy jsou dobře známé a jsou popsány například ve WO 96/02555.
V prostředcích podle předkládaného vynálezu je výhodné, aby adjuvans přednostně vyvolávalo imunitní odpověď Thl typu. Mezi vhodné adjuvantní systémy patří, například, kombinace monofosforyl-lipidu A, výhodně 3-de-O-acylovaného monofosforyl lipidu A (3D-MPL) se solí hliníku. CpG oligonukleotidy také přednostně vyvolávají Thl odpověď.
Zesílený systém obsahuje kombinaci monofosforyl-lipidu A a saponinového derivátu, přesněji kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak j popsána ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, ve kterém je QS21 utlumen cholesterolem, jak je popsáno ve WO 96/33739.
Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahuje QS21 3D-MPL a tokoferol v olejové nebo vodní emulsy, jak je popsáno ve WO 95/17210, který je také přednostně použitým prostředkem.
V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek obsahující protein podle předkládaného vynálezu, nejlépe lipoprotein D (nebo jeho derivát) - MAGE-3 s adjuvans, kterým je monofosforyl-lipid A nebo jeho derivát.
Výhodně obsahuje vakcína dále saponin, nejlépe QS21.
Výhodný prostředek dále obsahuje emulsy olej ve vodě a tokoferol. Předkládaný vynález také obsahuje způsob přípravy • ·
vakcinačního prostředku obsahující smísení proteinu podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky přijatelnou přísadou, jako je 3D-MPL.
V jednom aspektu vynález obsahuje způsob pro přečištění rekombinantně připraveného MAGE-proteinu. Tento způsob obsahuje solublizaci proteinu, například v silném chaotropním činidle (jako je například močovina, guanidiniumhydrochlorid) nebo v obojetném detergenčním činidle, jako je například Empigen BB n-dodecyl-N,N-dimethylglycin), redukci intra- a intermolekulových disulfidových můstků proteinu, blokování vzniklých thiolů pro prevenci oxidačního obnovení vazeb a zpracování proteinu v jednom nebo ve více chromatografických stupních.
Výhodně je blokovacím činidlem alkylační činidlo. Mezi taková blokovací činidla patří, například, alfa halogenkyseliny nebo alfa halogenamidy, například kyselina jodoctová a jodacetamid, které způsobují karboxymethylaci nebo karboxyamidaci (karbamidomethylaci) proteinu. Další blokovací činidla, která mohou být použita, jsou popsána v literatuře (viz například The Proteins, svazek II, ed. H. Neurath, R.L. Hill, a C.L. Boeder, Academie Press, 1976, a Chemical Reagents for Protein Modificaton, svazek , ed., R.L. Lunblad a C.M. Noyes, CRC Press, 1985). Mezi typické příklady takových dalších blokovacích činidel patří N-ethylmaleimid, chloracetylfosfat, O-methylisomočovina a akrylonitril. Použití blokovacích činidel je výhodné, protože brání agregaci vzniklého materiálu a zajišťuje stabilitu při dalším přečištění.
V provedení vynálezu jsou blokovací činidla vybrána tak, aby indukovala vznik stabilního kovalentního a ireversibilního derivátu (například je použito alfa-halogenky.seliny nebo alfa14 halogenamidu). Nicméně, mohou být použita i jiná blokovací činidla, která mohou být po přečištění odstraněna za uvolnění nederivatizovaného proteinu.
MÁGE proteiny mající derivatizované volné thiolové zbytky jsou nové a tvoří aspekt předkládaného vynálezu. Výhodným provedením vynálezu jsou karboxyamidované nebo karboxymethylované deriváty.
Ve výhodném provedení jsou proteiny podle předkládaného vynálezu opatřeny afinitní koncovkou, jako je CLYTA nebo polyhistidinová sekvence. V takových případech je protein po stupni blokování výhodně zpracován afinitní chromatografií. Pro proteiny s polyhistidinovou koncovkou může být použita afinitní chromatografíe s imobilizovaným iontem kovu (IMAC). Iontem kovu může být jakýkoliv vhodný iont, jako je například zinek, nikl, železo, hořčík nebo měď, ale výhodně je použít zinek nebo nikl. Výhodně obsahuje IMAC pufr obojetné detergenční činidlo, jako je Empigen BB (dále pouze Empigen), protože snižuje koncentrace endotoxinu v konečném materiálu.
Pokud je připraven protein s Clyta částí, tak může být přečištěn za využití své afinity k cholinu nebo k analogům cholinu, jako je DEAE. V jednom provedení vynálezu jsou proteiny připraveny s polyhistidinovou koncovkou a Clyta částí. Tyto proteiny mohou být přečištěny za použití jednoduchého dvoustupňového protokolu afinitní chromatografíe.
Vynález bude dále popsán v následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava rekombinantního kmene E. coli
exprimujícího fúsní protein lipoprotein D-MAGE-3His (LPD 1/3MAGE-3-His nebo LpD MAGE-3-His)
1. Expresní systém E. coli
Pro produkci lipoproteinu D byla DNA kódující protein D klonována do expresního vektoru pMG 814. Tento plasmid využívá signály z DNA lambda fágu pro řízení transkripce a translace insertovaných cizorodých genů. Vektor obsahuje lambda PL promotor PL, operátor OL a dvě využitelná místa (NutL a NutR) pro odstranění efektů transkripční polarity při použití N proteinu (Gross et al., 1985, Mol. and Cell Biol. 5: 1015). Vektory obsahující PL promotor jsou vloženy do E. coli lysogenního hostitele pro stabilizaci plasmidové DNA. Lysogenní hostitelské kmeny obsahují replikon-deficientní lambda fágovou DNA integrovanou do genomu (Shatzman et al., 1983; v
Experimetal Manipulation of Gene Expression, Inouya (ed.), str. 1-14, Academie Press, NY). DNA lambda fágu řídí syntézu cl represorového proteinu, který se váže ná OL represor vektoru a brání vazbě RNA polymerasy na PL promotor a tak transkripci insertovaného genu. cl gen expresního kmene AR58 obsahuje teplotně sensitivní mutaci, takže transkripce řízená PL může být regulována teplotním posunem, to znamená, že zvýšení kultivační teploty inaktivuje represor a je zahájena syntéza cizorodého proteinu. Expresní systém umožňuje kontrolovanou syntézu cizorodých proteinů, zejména těch, které mohou být toxické pro buňku (Shimataka and Rosenberg, 1981, Nátuře 292; 128) .
2. E. coli, kmen AR58:
Lysogenní kmen Ε. coli AR58 použitý pro produkci LPD-MAGE-3His proteinu je derivát standardního NIH E.coli K12 kmene N99 (F-su-galK2, lacZ-, thr-). Obsahuje defektní lysogenní lambda fág (galE::TN10, 1 Kil- cl857 DH1). Kil- fenotyp brání ukončení makromolekulové syntézy hostitele. cI857 mutace způsobuje teplotní sensitivitu cl represoru. DH1 mutace odstraňuje pravý operon lambda fágu a bio, uvr3 a chlA lokusy hostitele. Kmen AR58 byl připraven transdukcí N99 P lambda fágem předem kultivovaným na SA500 derivátu (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1) . Vložení defektního lysogenu do N99 buněk bylo selektováno tetracyklinem, protože TN10 transposon kódující resistenci na tetracyklin je umístěn v sousedství galE genu. N99 a SA500 jsou K12 kmeny E.coli získané od Dr. Martin Rosenberg's laboratoře v National Institute of Health.
3. Konstrukce vektoru navrženého pro expresi rekombínantního proteinu LPD-MAGE-3HÍS:
Cílem bylo exprimovat MÁGE 3 jako fúsní protein za použití N-koncové třetiny lipidovaného proteinu D jako fúzního partnera navázaného na N-konec MAGE-3 a sekvence několika histidinových zbytků (His koncovky) umístěné na jeho C-konci.
Protein D je lipoprotein (42 kDa vazebný protein pro imunoglobulin D umístěný na povrchu gram-negativní bakterie Haemophilus influenzae). Protein je syntetizován jako prekursor s 18 aminokyselinovou signální sekvencí, která obsahuje konvenční sekvenci pro bakteriální lipoprotein (WO 91/18926).
Po odstranění signální sekvence lipoproteinu během,sekrece se stává Cys (v pozici 19 molekuly prekursoru) amino-koncovým zbytkem a současně je modifikován kovalentním navázáním jak
esterovou vazbou vázaných, tak amidovou vazbou vázaných mastných kyselin.
Mastné kyseliny navázané na amino-koncový cysteinový zbytek potom působí jako membránové ukotvení.
Plasmid exprimující fúsní protein byl navržen tak, aby exprimoval prekursorový protein obsahující 18 aminokyselinovou signální sekvenci a prvních 109 zbytků zpracovaného proteinu D, dvě nepříbuzné aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.
Takto připravený rekombinantní kmen produkoval lipidovaný fúsní protein s His koncovkou o 432 aminokyselinách (viz obr.
1) , s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 1 a kódující sekvencí SEQ ID NO: 2.
4. Klonovací strategie pro přípravu LDP-MAGE-3-His fúzního proteinu (vektor pRITl4477).
Byly použity cDNA plasmid (od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute) obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen (Gaugler, B. et al., 1994) a vektor pRIT 14586, obsahující Nkoncovou část Lipo-D-1/3 kódující sekvence (připravený podle obr. 2). Klonovací strategie obsahovala následující kroky:
(a) PCR amplifikaci sekvencí přítomných v plasmidové cDNA pro MAGE-3 za použití kódujícího oligonukleotidu: 5’ gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tet caa; tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N-konci: změnu prvních pěti kodonů • · ·· * • · · »»» β» 9 9 na kodony používané v E.coli; nahrazení Pro kodonu v pozici 1 Asp kodonem, vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci;
(b) klonování výše uvedeného amplifikovaného fragmentu do TA klonovacího véktoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRIT14647;
(c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plasmidu pRIT14647 a klonování do vektoru pRIT 14586;
(d) transformaci hostitelského kmene AR58;
(e) selekci a charakterizaci transformantů E. coli obsahujících plasmid pRIT 14477 exprimujících LPD-MAGE-3-His fúsní protein.
Příklad 2: Příprava LPD1/3-MAGE-3-HÍS antigenu
1. Kultivace a indukce bakteriálního kmene - exprese LPDl/3-MAGE-3-His
Buňky AR5-8 transformované plasmidem pRIT14477 byly kultivovány ve 2 litrových nádobách obsahujících 400 ml LY12 media doplněného kvasinkovým extraktem (6,4 g/l) a kanamycinsulfatem (50 mg/1). Po inkubaci za třepání při 30 °C po dobu 8 ± 1 hodiny se z každé nádoby odebral malý vzorek pro mikroskopické vyšetření. Obsah dvou nádob se potom smísil za vzniku inokula pro 20 litrovou fermentační nádobu.
Inokulum (přibližně 800 ml) bylo přidáno do předem sterilizované 20 litrové (celkový objem) fermentační nádoby obsahující 7 litrů media doplněného 50 mg/1 kanamycin-sulfatem. pH bylo upraveno a udržováno na 6,8 pravidelným přidáváním NH4OH (25% obj./obj.) a teplota byla upravena a udržována na 30 °C. Provzdušňování bylo prováděno rychlostí 12 1/mín. a tlak rozpuštěného kyslíku byl udržován na 50% saturaci pomocí
zpětnovazebně kontroly rychlosti třepání. Přetlak ve fermentačním tanku byl udržován na 500 g/cm2 (0,5 baru).
Kultivace za přísunu živin byla provedena za kontrolovaného přidávání uhlíkového živného roztoku. Živný roztok byl přidáván počáteční rychlostí 0,04 ml/min a rychlost se exponenciálně zvyšovala během prvních 42 hodin pro dosažení rychlosti růstu 0,1 h1.
Po 42 hodinách byla teplota ve fermentačním tanku rychle zvýšena na 39 °C a rychlost podávání živného roztoku byla udržována na 0,005 ml/g DCW/min. během indukční fáze po dobu dalších 22-23 hodin, během kterých dosáhla intracelulární exprese LPD1/3-MAGE-3-HÍS maximální úrovně.
Alikvoty (15 ml) media byly odebírány v pravidelných intervalech během růstové/indukční fáze a na konci f-ermentace, aby bylo možno sledovat kinetiku růstu bakterií a intracelulární exprese produktu a dále pro získání vzorků pro identifikaci mikrobů/testy čistoty.
Na konci fermentace byla optická hustota kultury mezi 80 a 120 (což odpovídá koncentraci buněk mezi 48 a 72 g DCW/1) a celkový objem kapaliny byl přibližně 12 litrů. Kultury byly rychle ochlazeny na teplotu 6-10 °C a buňky ECK32 byly separovány z kultivačního media odstředěním při 5000 x g při 4 °C během 30 minut. Koncentrované buňky ECK32 byly rychle uskladněny v plastových vacích a ihned zmrazený při -80 °C.
2. Extrakce proteinu
Zmrazené koncentrované buňky ECK32 se nechaly roztát při 4 °C a potom byly resuspendovány v pufru pro rozrušení buněk v konečné optické hustotě 60 (která odpovídá koncentraci buněk přibližně 36 g DCW/1).
Buňky byly rozrušeny dvěma průchody přes vysokotlaký homogenizační přístroj (1000 barů). Suspenze rozrušených buněk byla odstředěna (10000 x g při 4 °C, 30 minut) a peletová frakce byla promyta dvakrát Triton X100 (1% hmot./obj.) + EDTA (1 mM) a potom fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) + Tween 20 (0,1% obj./obj.) a nakonec PBS. Před každým stadiem promývání byla suspenze odstředěna při 10000 x g podobu 30 minut při 4 °C, supernatant byl odstraněn a peleta byla použita v dalším promývání.
Příklad 3: Charakterizace fúzního proteinu lípo D - MAGE-3
1. Přečištění:
LPD-MAGE-3-His byl přečištěn z buněčného homogenátu za použití následující sekvence kroků:
(a) solubilizace promyté peletové frakce z procesu destrukce buněk;
(b) chemická redukce intra- a inter-proteinových disulfidových můstků, po které následovalo blokování thiolových skupin pro zabránění oxidativnímu obnovení vazeb;
(c) mikrofiltrace reakční směsí pro odstranění částic a snížení obsahu endotoxinů;
i (d) zachycení a primární přečištění LPD-MAGE-3-His pomocí využití afinitní interakce mezi polyhistidinovou koncovkou a chelatační sepharosou obsahující zinek;
(e) odstranění kontaminujících proteinů aniontovou iontoměničovou chromatografií.
Přečištěný LPD-MAGE-3-His byl zpracován v několika dalších krocích:
(f) výměna pufru/odstranění močoviny pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Superdex 75;
(g) filtrací během procesu;
(h) výměnou pufru/odsolením pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti za použití Sephadex G25.
Každý z těchto kroků bude nyní popsán podrobněji.
1.1) Solubilizace pelety buněčného homogenátu
Peleta z posledního promytí (jak je popsáno výše) byla resolubilizována přes noc v 800 ml roztoku guanidinhydrochloridu (6M) a fosforečnanu sodného (0,1 M, pH 7,0) při 4 °C.
1.2) Redukce a karboxymethylace
Solubilizovaný materiál (světle žlutá, kalná suspenze) se probublala argonem pro odstranění jakéhokoliv zbývajícího kyslíku a přidal se zásobní roztok 2-merkaptoethanolu (14 M) na konečnou koncentraci 4,3 M (která odpovídá 0,44 ml 2merkaptoethanolu na ml roztoku).
Vzniklý roztok se rozdělil a přenesl se do dvou skleněných zkumavek, které se zahřály na 95 °C ve vodní lázni. Po 15 minutách při 95 °C se zkumavky odstranily z vodní lázně a nechaly se vychladnout a potom se jejich obsah slil do folií pokryté kádinky (5 1), která se umístila na led a za důkladného míchání se přidal jodacetamid v pevném stavu v množství nutném pro dosažení konečné koncentrace 6 M (která odpovídá 1,11 g jodacetamídu na ml roztoku). Směs se ponechala na ledu ve tmě po dobu 1 hodiny pro zajištění úplné solubilizace jodacetamídu a potom byla neutralizována (za stálého důkladného třepání a •9 ·#*· * * » « M • 9 · »· 9 9 · * · · • 9 9 9 · 9 9 9 9 • 9 9 9 · ♦····· ·♦· 9 9 9 9 9 9 • · · ··9 99 9 ·· ·· kontinuálního sledování pH) přidáním přibližně 1 litru hydroxidu sodného (5 M) za dosažení konečného pH 7,5-7,8.
Získané směs se ponechala na ledu ve tmě po dobu dalších 30 minuta potom se pH opět upravilo na pH 7,5-7,8.
1.3) Mikrofiltrace
Směs se mikrofiltrovala na Amicon Proflux M12 jednotce s tangenciálním průtokem vybavené Minikos náplní z dutého vlákna (ref. č. M22M-600-01N; plocha 5600 cm2, 0,2 μπι). Filtrát byl použit v následném chromatografickém přečištění.
1.4) Chelatační chromatografie za použití kovu (Zn2+) (IMAC)
Chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za použití Chelating Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology kat. č. 17-0575-01) naplněné do BPG 100/500 kolony (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-01). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 79 cm2; délka náplně 19 cm; objem 1500 ml. Prázdná kolona byla ošetřena hydroxidem sodným (0,5 M) a potom byla promyta přečištěnou vodou.
Nosič (aplikovaný ve 20% obj./obj. ethanolu) byl promyt přečištěnou vodou (8 litrů) na Buchnerově nálevce (ve vakuu) a byl naplněn zinkem pomocí průchodu alespoň 15 1 roztoku ZnCl2 (0,1 M). Nadbytek zinku byl odstraněn promýváním nosiče 10 1 přečištěné vody, dokud pH kapaliny na výstupu nedosáhlo pH roztoku ZnCl2 (pH 5,0). Nosič byl potom uveden do rovnováhy 4 1 roztoku obsahujícího guanidin hydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0).
Filtrát z mikrofiltrace obsahující LPD-MAGE-3-His byl smísen s nosičem (vazba ve vsádce) před naplněním BPG kolony roztokem ·· ·« » » ♦ 4 > · · 4 obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0).
Další stadia chelatační chromatografie za použití kovu byla provedena za průtoku eluens 60 ml/min. Kolona byla promývána nejprve roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid (6M) a fosforečnan sodný (0,1 M, pH 7,0), potom roztokem obsahujícím močovinu (6M) a fosforečnan sodný (0,lM, pH 7,0), dokud nedosáhl eluens kolony nulové absorbance při OD280 nm (základní hodnota).
Semi-přečištěná LPD-MAGE-3-His proteinová frakce byla eluována 2 objemy kolony roztoku obsahujícího močovinu (6M), fosforečnan sodný (0,lM, pH 7,0) a imidazol (0,5M). Vodivost této frakce byla přibližně 16 mS/cm.
1·. 5) Aniontová iontoměničová chromatograf ie
Před prove^gním aniontové iontoměničové chromatografie se vodivost semi-přečištěné LPD-MAGE-3-His proteinové-frakce snížila na přibližně 4 mS/cm pomocí naředění roztokem obsahujícím močovinu (6M) a Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).
Aniontová iontoměničová chromatografie byla provedena za použití Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, kat. č. 170510-01) naplněné v BPG 200/500 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-11). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 314 cm2; délka náplně 9 cm; objem náplně 3900 ml.
Kolona byla naplněna (20% obj./obj. ethanolem) a byla promyta 9 1 přečištěné vody při průtoku eluens 70 ml/min. Naplněná kolona byla ošetřena 3 litry hydroxidu sodného (0,5 Μ) , byla promyta 30 litry přečištěné vody a potom byla uvedena • 9 9 9 9 9
9 *
99 ♦ · 9 9 «9 ♦
9 9 9
9 9 9
9 99 do rovnováhy 6 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M) a TrisHC1 (20 mM, pH 8,0). Ředěný, semi-přečištěný LPD-MAGE-3-His byl vnesen do kolony a potom byl promýván 9 litry roztoku obsahujícího močovinu (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) a Tween (0,1%), dokud absorbance (280 nm) eluens neklesla na nulu.
Další promytí bylo provedeno za použití roztoku obsahujícího močovinu (6M) a Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).
Přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován z kolony roztokem obsahujícím močovinu (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) a NaCl (0,25M).
1.6) Chromatografie s vylučováním podle velikosti
Odstranění močoviny z přečištěného LPD-MAGE-3-His a výměna pufru byly provedeny za použití chromatografie s vylučováním podle velikosti. Tato byla provedena za použití Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology, kat. č. 17-1044-01) naplněné v XK 50/100 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č.'18-8753-01). Rozměry náplně byly: průměr 5 cm; plocha na příčném řezu 19,6 cm2; objem 18 00 ml.
Kolona byla naplněna ethandlem (20%) a byla promyta 5 litry přečištěné vody při průtoku 20 ml/min. Kolona byla ošetřena 2 litry hydroxidu sodného (0,5 Μ), byla promyta 5 litry i přečištěné vody a potom byla uvedena do rovnováhy 5 litry fosfátem pufrovaného salinického roztoku obsahujícího Tween 80 (0,1% obj./obj.).
Přečištěná LPD-MAGE-3-His frakce (maximum 500 ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 20 • * 9 9 9 9
9
0
9
9 ml/min. Odsolený přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován z kolony 3 litry PBS obsahujícího Tween 80 (0,1% obj./obj.) .
Frakce obsahující LPD-MAGE-3-His eluovala při volném objemu kolony.
1.7) Filtrace během procesu
LPD-MAGE-3-His z chromatografie s vylučováním podle velikosti se filtruje přes 0,22 pm membránu v digestoři s laminárním prouděním (třída 10000). Filtrovaný materiál se zmrazí při -80 °C a uskladní se do kroku odsolení.
1.8) Odsolovací chromatografie
Protože osmolalita konečného materiálu by měla být nižší než 400 mOsM, je nutný pro snížení koncentrací solí další výměna pufru. Tato výměna pufru se provede odsolovací chromatografií za použití Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology, kat. č. 170033-02) naplněné v BPG 100/950 koloně (Pharmacia Biotechnology kat. č. 18-1103-03). Rozměry náplně byly: průměr 10 cm; plocha na příčném řezu 78,6 cm ; délka náplně 85 cm ; objem 6500 ml.
Sephadex G25 se hydratovala 7 litry přečištěné vody a nechala se bobtnat přes noc při 4 °C. Gel byl potom naplněn do kolony s čistou vodou při průtoku eluens 100 ml/mín.
Kolona byla ošetřena 6 litry hydroxidu sodného (0,5 M) a potom byla uvedena do rovnováhy 10 litry roztoku obsahujícího fosforečnan sodný (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) a Tween 80 (0,1% obj./obj.).
Přečištěná LPD-MAGE-3-His frakce (maximum 1500 ml/jedno odsolování) byla vnesena do kolony při průtoku eluens 100 ml/min. Odsolený přečištěný LPD-MAGE-3-His byl eluován při ♦ ·· ·
99
9 9 9
9 9 9
9 9 · • 9 9 9
99 volném objemu kolony, byl sterilně filtrován přes 0,22 pm membránu a byl uskladněn při -80 °C. Výsledný proteinový materiál se nechal roztát při 4 °C před rozdělením do zkumavek a lyofilizací s laktosou (3,2%).
2. Analýza SDS-polyakrylamidových gelů barvených Coomasie modří
Přečištěný LPD-MAGE-3-His antigen byl analyzován SDS-PAGE na 12,5% akrylamidovém gelu za redukčních podmínek.
Pro barvení Coomasie modří byl obsah proteinu 50 pg a pro barvení dusičnanem stříbrným byl obsah proteinu 5 pg. Byla analyzována klinická šarže 96K19 a pilotní šarže 96J22. Byl vizualizován jeden hlavní proužek odpovídající molekulové hmotnosti 60 kDa. Také byly pozorovány dva vedlejší proužky odpovídající přibližně 45 kDa a 35 kDa.
3. Analýza westernovým přenosem
Peptidy získané při SDS-PAGE analýze LPD-MAGE-3-His proteinu byly identifikovány westernovým přenosem za použití myších monoklonálních protilátek. Tyto protilátky byly připraveny v myších za použití přečištěného přípravku MAGE-3-His proteinu (tento protein neobsahuje LPD část LPD-MAGE-3-His).
Podle vhodnosti pro analýzu westernovým přenosem byly vybrány dva přípravky monoklonálních protilátek (MAb 22 a MAb 54) a byly použity testy identifikace. Obr. 4 ukazuje charakter proužků získaných pro šarže 96K19 a 96J22 po barvení MAb 32 a 54. 600 ng proteinu bylo izolováno na 12,5% SDS-PAGE, tento materiál byl přenesen na nylonovou membránu, reagoval s MAb 32 a 54 (60 gg/ml) a tyto byly detekovány pomocí anti-myších protilátek navázaných na peroxidasu.
• ••«fefe · · fefe fe· ·· fe · fe fefe « fe · · • fefe fe fe fefe·· • fefe · fe fefefe··· • fefe · · fefe·· • fe · fefefe fefefe fefe fefe kDa a 30 kDa peptid detekovaný SDS-PAGE byl detekován oběma mAb.
Příklad 4
1. Příprava vakciny za použití LPD-MAGE-3-His proteinu
Vakcína použitá v těchto pokusech byla připravena z rekombinantní DNA kódující lipoprotein D 1/3-MAGE-3-HÍS, exprimované v E. coli kmene AR58, a obsahovala nebo neobsahovala adjuvans. Jako adjuvans prostředek obsahoval směs
3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL) a QS21 v emulsi olej ve vodě. Adjuvantní systém SBAS2 byl popsán dříve ve WO 95/17210.
3D-MPL je imunostimulační činidlo odvozené od lipopolysacharidu (LPS) gram-negativní bakterie Salmonella minnesota. MPL byl deacylován a postrádá fosfátovou skupinu na skupině lipidu A. Toto chemické zpracování dramaticky snižuje toxicitu za zachování imunostimulačních vlastností (Ribi,
1986) . Ribi Immunochemistry vyrábí a dodává MPL do SBBiologicals. Pokusy provedené ve Smith Kline Beecham Biologicals ukázaly, že 3D-MPL v kombinaci s různými vehikuly významně zvyšuje jak protilátkovou imunitu, tak Thl typ imunitní reakce.
QS21 je přirozená saponinová molekula extrahovaná z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria Molina. Technika přečištění vyvinutá pro separaci jednotlivých saponinů ze surových extraktů z kůry umožňuje izolaci saponinů QS21, který je triterpenovým glykosidem vykazujícím silnou adjuvantní aktivitu a nízkou toxicitu ve srovnání s původním materiálem.
4
4
4
Bylo prokázáno, že QS21 aktivuje CTL restrihované MHC třídy I k několika podjednotkovým Ag, stejně jako bylo prokázáno, že stimuluje Ag specifickou proliferaci lymfocytů (Kensil, 1992). Aquila (formálně Cambridge Biotech Corporation) vyrábí a dodává QS21 do SB Biologicals.
Pokusy provedené ve SmithKline Beecham Biologicals prokázaly jasný synergní efekt kombinace MPL a QS21 v indukci jak protilátkové imunity, tak Thi typu imunitní reakce.
Emulse olej/voda je složena z organické fáze tvořené 2 oleji (tokoferolem a skvalenem) a vodné fáze tvořené PBS obsahující Tween 8 0 j*apfe®^semulgační činidlo. Emulse obsahuje 5% skvalenu,
5% tokoferolu, 0,4% Tween 80 a má průměrnou velikost částic 180 nm a je známá jako SB62 (viz WO 95/17210).
Pokusy provedené ve SmithKline Beecham Biologicals prokázaly, že přidání této emulse olej/voda k 3D-MPL/QS21 (SBAS2) dále zvyšuje imunostimulační vlastnosti 3D-MPL/QS21 pro různé podjednotkové antigeny.
2. Příprava emulse SB62 (2-násobný koncentrát)
Tween 80 se rozpustí ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) za zisku 2% roztoku v PBS. Pro získání 100 ml 2krát koncentrované emulse se 5 g DL alfa tokoferolu a 5 ml skvalenu důkladně promísí. Přidá se 90 ml roztoku PBS/Tween a směs se důkladně promísí. Vzniklá emulse se potom protlačí stříkačkou a nakonec se mikrofluidizuje za použití M110S mikrofluidizačního přístroje. Výsledné olejové kapičky mají velikost přibližně 180 nm.
3. Příprava lipoprot. Dl/3-MAGE-3-His QS21/3D MPL emulze olej «··*
0 0
0t ve vodě (SBAS2)
Adjuvans je připraveno jako kombinace MPL a QS21, v emulsi olej ve vodě. Tento prostředek je aplikován do fiol o objemu 0,7 ml, ve kterých je smísen s lyofilizovaným antigenem (fiolly obsahují od 30 do 300 μg antigenu).
Složení ředidla obsahujícího adjuvans pro lyofilizovanou vakcinu je následující:
Složka Množství (na dávku)
Adjuvans
Emulse SB62 250 μΐ
- skvalen 10,7 mg
- DL a-tokoferol 11,9 mg
- Tween 80 4,8 mg
Monofosforyl lipid A 100 μg
QS21 100 μς
Konzervační činidlo
Thiomersal
25 μg
Pufr
q.s. 0,5 ml
Voda pro injekce
- hydrogenfosforečnan sodný 57 5 μg
- dihydrogenfosforečnan sodný 100 μg
- chlorid draselný 100 μg
- chlorid sodný 4,0 mg
Konečný vakcinační prostředek je získán po rekonstituci lyofilizovaného LPD-MAGE-3-His přípravku pomocí adjuvans nebo PBS samotným.
φφ φφφφ » φ φ φ « · ♦ * · φφ · φφ φφ ► φ φ φ φφφ φφφ
Kontroly obsahující adjuvans bez antigenu byly připraveny nahrazením proteinu PBS.
4. Vakcinační antigen: fúsní protein lipoprotein D1/3-MAGE-3-His
Lipoprotein D je lipoprotein přítomný na povrchu gramnegativní bakterie Haemophilus influenzae.
Použití prvních 109 zbytků zpracovaného proteinu D jako fúzního partnera poskytuje vakcinačnímu antigenu epitopy pro Tlymfocyty. Kromě LPD skupiny obsahuje protein dvě nepříbuzné aminokyseliny (Met a Asp), aminokyselinové zbytky 2 až 314 MAGE-3 a dva Gly zbytky působící jako pantový region pro navázání dalších sedmi His zbytků.
Příklad 5
1. Imunogenicita LPD-MAGE-3-His u myší a opic
Pro testování antigenicity a imunogenicity lidského MAGE-3 proteinu byla připravená vakcína injikována 2 různým kmenům myší (C57BL/6 a Balb/C), které se liší svým genetickým základem a MHC alelami. Pro oba kmeny myší byly teoreticky stanoveny peptidové motivy MHC-třídy I a MHC-třídy II pro MÁGE část LPDMAGE-3-His fúzního proteinu.
(a) Imunizační protokol myším každého kmene bylo injekčně podáno 2-krát ve 2týdenních intervalech do nohy 5 gg LPD-MAGE-3-His připraveného nebo nepřipraveného v SBAS2 v koncentraci rovné 1/10 koncentrace použité u člověka.
• tt ·*· · • · · • · tt • tttt • tt · ·· · ··· ··· ♦ tt tttt tt tttt · tt tttt tt • tttt · • tttt « • tt tttt (b) Proliferační test
Lymfocyty byly připraveny rozdrcením sleziny nebo popliteálních lymfatických uzlin od myší, 2 týdny po poslední injekci. 2 x 105 buněk bylo umístěno trojmo jamek 96-jamkové plotny a buňky byly restimulovány in vitro po dobu 72 hodin různými koncentracemi (1-0,1 Hg/ml) His-MAGE-3, který byl použit samotný nebo potažený na latexové mikrokorálky.
Zvýšená MAGE-3 specifická lymfoproliferativní aktivita byla pozorována jak u buněk sleziny (viz obr. 5 a 7), tak u buněk lymfatických uzlin (viz obr. 6 a 8) jak od C57BL/6 myší, tak od Balb/C myší, kterým byl injekčně podán LPD-MAGE-3-His protein, ve srovnání s lymfoproliferativní odpovědí myší, kterým byl podán přípravek SBAS2 samotný nebo PBS.
Kromě toho, významně vyšší proliferativní odpověď byla získána pro lymfocyty od myší imunizovaných LPD-MAGE-3-His v adjuvantním SBAS2 (viz obr. 6 a 8).
(c) Závěr
LPD-MAGE-3-His je imunogenní u myší a tato imunogenicita může být zvýšena použitím SBAS2 jako adjuvans.
2. Protilátková odpověď (a) Imunizační protokol:
Balb/C nebo C57BL/6 myši byly imunizovány 2 injekcemi do nohy ve 2-týdenních intervalech za použití buď PBS, nebo SBAS2, nebo 5 pg LPD-MAGE-3-His, nebo 5 gg LPD-MAGE-3-His + SBAS2. Tři zvířata byla použita v kontrolní skupině a pět zvířat bylo použito v testovací skupině.
(b) Nepřímá ELISA ·· »···
• · · • · « • · · · • · · • 0 ·
Dva týdny po druhé injekci byla zvířatům odebrána séra a byla analyzována v nepřímém ELISA testu. 2 Hg/ml přečištěného His MÁGE 3 byly použity jako potahový antigen. Po saturaci po dobu 1 hodiny při 37 °C v PBS + 1% fetální telecím séru byla séra sériově ředěna (od 1/1000) v saturačním pufru a byla inkubována přes noc při 4 °C nebo po dobu 90 minut při 37 °C.
Po promytí PBS/Tween 20,01% byla biotinylovaná kozí protilátka proti celkovému myšímu IgG (1/1000) nebo kozí protilátky proti myšímu IgGl, IgG2a, IgG2b (1/5000) použity jako sekundární protilátky. Po 90 minutové inkubaci při 37 °C byl přidán streptavidin navázaný na peroxidasu a TMB (tetra-methylbenzidin-peroxid) byl použit jako substrát. Po 10 minutách byla reakce blokována přidáním 0,5 M H2SO4 a byla stanovena OD.
(c) Výsledky
Obr. 9 srovnává různé skupiny myší (n = 5/skupinu), relativní průměrný střední titr séra, který je průměrným ředěním nutným pro dosažení středního bodu křivky.
Tyto výsledky ukazují, že u obou testovaných kmenů myší je přítomná slabá Ab odpověď po 2 injekcích LPD-MAGE-3-His samotného, ale že vyšší koncentrace protilátek proti MAGE-3 je přítomná v případě, že LPD-MAGE-3-His je injikován společně s SBAS2. Pouze 2 injekce LPD-MAGE-3-His + SBAS2 ve 2-týdenních intervalech, jsou dostatečné pro dosažení pozorované vysoké protilátkové odpovědi.
Lepší protilátková odpověď pozorovaná u Balc/c myší ve srovnání s odpovědí pozorovanou u C57BL/6 myší může být vysvětlena rozdíly v haplotypu nebo v genetickém základu mezi těmito dvěma kmeny, i když protilátkový titr dosažený u C57BL/6 myší je také vyšší po injekcích LPD-MAGE-3-His + SBAS2 než po injekcích LPD-MAGE-3-His samotného.
Anti-MAGE-3 odpovědi ve specifických podtřídách Ig po vakcinaci v různých skupinách myší jsou uvedeny na obr. 10 a 11, které uvádějí srovnání průměrných středních ředění séra.
Ani IgA, ani IgM nebyly detekovány v žádném vzorku séra, ani u myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His + SBAS2.
Naopak, celkové koncentrace IgG byly o něco vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His samotným a významně vyšší v séru myší vakcinovaných LPD-MAGE-3-His v SBAS2.
Analýza koncentrací různých podtříd IgG ukázala, že u myší byla indukována smíšená protilátková odpověď, protože koncentrace všech testovaných podtříd IgG (IgGl, IgG2a, IgG2b) byly vyšší u myší vakcinovaných antigenem s adjuvans než u myší vakcinovaných antigenem samotným nebo adjuvans samotným.
Nicméně se zdá, že charakter této smíšené protilátkové odpovědi po vakcinaci LipoD-MAGE-3 za přítomnosti SBAS2 závisí na myším kmenu, protože v séru myší Balb/C převládal IgGl a v séru myší C57BL/6 převládal IgG2b.
3. Imunogenicita lipoprotein D 1/3-MAGE-3 + SBAS2 adjuvans u, opic makak
Byly vybrány tři skupiny opic makak (Macaca Mulatta). RTS,S a gpl20 byly použity jako pozitivní kontroly.
Skupiny
Skupina 1 levá noha: RTS,S/SBAS2 pravá noha: GP120/SBAS2
• · · • · · • · · ·
Skupina 2 levá noha: RTS,S/SB26T pravá noha: GP120/SB26T
Skupina 3 pravá noha: LipoDl/3 MÁGE 3 His/SBAS2
Zvířatům byla podána vakcína v den 0 a dosycovací dávka v den 28 a 84 den a byla jim odebírána krev pro stanovení jejich protílátkové odpovědi na MAGE-3 a protein D. Vakcíny byly podávány intramuskulárně jako bolusové injekce (0,5 ml) do zadní části pravé nohy.
Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dní. Neheparizované vzorky krve objemu 3 ml byly odebírány z véna femoralis, krev se nechala srážet po dobu nejméně 1 hodiny a odstředila se při teplotě okolí během 10 minut při 2500 rpm.
Sérum se odebralo, zmrazilo se při -20 °C a odeslalo se pro stanovení koncentrace protilátek pomocí specifické ELISA.
96-jamkové mikroplotny (Maxisorb Nunc) se potáhly přes noc při 4 °C bud' 5 μς His MAGE-3 nebo Proteinem D. Po 1 hodině saturace při 37 °C s PBS NCS 1% se přidalo sériové ředění králičího séra na dobu 1,5 hodiny při 37 °C (počáteční ředění 1/10) a po 3 promytích v PBS Tween se přidalo anti-králičí biotynylované sérum (1/5000, Amersham, ref. RPN 1004, šarže 88). Plotny se promyly a na dobu 30 minut při 37 °C se přidala peroxidasa navázaná na streptavidin (1/5000) . Po promytí se na dobu 7 minut přidalo 50 μΐ TMB (BioRad) a reakce se ukončila 0,2 M H2SO4. OD se měřila při 450 nm. Střední ředění byla vypočítána za použití SoftmaxPro.
Protilátková odpověď
Malé vzorky krve byly odebírány každých 14 dnů pro stanovení kinetiky protilátkové odpovědi na MAGE-3 pomocí ELISA. Výsledky ukazují, že po 1 injekci LPD-MAGE-3-His + SBAS2 byl titr celkových Ig specifických pro MAGE3 nízký a jasné zvýšení bylo pozorováno u 3 z 5 zvířat po druhé a třetí injekci LipoDl/3 MÁGE - 3 + adjuvans u stejných opic. Zvířata vykazující špatnou odpověď zůstávala negativní i po 3 injekcích. 28 dnů po II nebo po III dávce se titry protilátek navrátily na základní hodnoty. Mezi těmito protilátkami převládaly podtřídy IgG a nikoliv IgM. Přesmyk na IgG ukazuje na spuštění odpovědi T-lymfocytů. Specifická odpověď pro protein D, ačkoliv byla slabá, měla paralelní průběh s protilátkovou odpovědí k MAGE-3.
Příklad 6
1. LPD-MAGE-1 His
Analogickým způsobem byl připraven LPD-MAGE-l-His. Aminokyselinová sekvence a DNA sekvence jsou uvedeny na SEQ ID NO; 3 a 4. Získaný protein byl přečištěn stejně jako LPD-MAGE3-His protein. Stručně, buněčná kultura byla homogenizována a zpracována 4M guanidin HC1 a 0,5 M β-merkaptoethanolem za přítomnosti 0,5% Empigen detergenčního činidla. Materiál byl filtrován a filtrát byl zpracován 0,6 M jodacetamidem. Karboxyamidovaná frakce byla zpracována IMAC (zinková chelatační sepharosa FF) chromatografií. Kolona byla nejprve uvedena do rovnováhy a promyta roztokem obsahujícím 4M guanidin HC1 a fosforečnan sodný (20 mM, pH 7,5) a 0,5% Empigen, potom byla kolona promyta roztokem obsahujícím 4M močovinu ve fosforečnanu sodném (20 mM, pH 7,5) za přítomnosti 0,5%
Empigen. Protein byl eluován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolu (20 mM, 400 mM a 500 mM).
• 4 4 • · · • · 4 · ·
Eluat byl ředěn 4M močovinou. Q-sepharosová kolona byla uvedena do rovnováhy a byla promyta 4M močovinou ve 20 mM fosfátovém pufru (pH 7,5) za přítomnosti 0,5% Empigen. Druhý výplach byl proveden ve stejném pufru, ale bez detergenčního činidla. Protein byl eluován ve stejném pufru, ale se stoupající koncentrací imidazolů (150 mM, 400 mM, 1M). Eluát byl potom ultra-filtrován.
Příklad 7: Konstrukce expresního plasmidu pRIT14426 a transformace hostitelského kmene AR58 pro produkci NSl-MAGE-3-His
Složení proteinu
Složení fúzního proteinu NS-l-MAGE-3-His, který je exprimován v E.coli, je uvedeno na obr. 12.
Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5.
Kódující sekvence (SEQ ID NO: 6) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-coli expresním plasmidu.
Klonovací strategie pro výrobu NSl-MAGE-3-His fúsního proteinu
Výchozím materiálem byl cDNA plasmid získaný od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute obsahující kódující sekvenci pro MAGE-3 gen a vektor pMG81 obsahující kódující region pro 81 aminokyselinový NS1 (nestrukturální protein) z Influenza.
Klonovací strategie obsahovala následující kroky:
(a) PCR amplifikaci sekvencí přítomných v plasmidové cDNA pro MAGE-3 za použití kódujícího oligonukleotidu: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct, a protismyslného oligonukleotidu 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tet caa; tato amplifikace vedla k následujícím modifikacím na N-konci: změnu prvních pěti kodonů na kodony používané v E.coli; nahrazení Pro kodonu v pozici 1 Asp kodonem, vložení Ncol místa na 5' konci a adici 2 Gly kodonů a 7 His kodonů následovaných Xbal místem na C-konci;
(b) klonování výše uvedeného amplifikovaného fragmentu do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) a přípravu pracovního vektoru pRIT14647;
(c) vystřižení Ncol-Xbal fragmentu z plasmidu pRIT14647 a klonování do vektoru pRIT PMG81;
(d) transformaci hostitelského kmene AR58;
(e) selekci a charakterizaci transformantů E. coli obsahujících plasmid pRIT 14426 exprimujících NSl-MAGE-3-His fúsní protein.
Charakterizace rekombinantního NSl-MAGE-3-His (pRIT14426)
Bakterie byly kultivovány na LB mediu doplněném 50 gg/ml kanamycinem při 30 °C. Poté, co kultura dosáhla OD = 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 42 °C.
Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací) trojím stlačením na French lisu. Po odstředění (60 minut, 100000 x g) byly supernatant pelety a celkový extrakt analyzovány ..SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúsní protein představuje přibližně 1% celkových proteinů E. coli. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 44,9 kD. Fúsní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-NSl monoklonální protilátky.
Příklad 8: Přečištění NSl-MAGE-3-His (E. coli) pro imunizaci králíků/myší
Schéma přečištění
Následující přečišťovací schéma bylo použito pro přečištění antigenu:
Lýza buněk + odstředění
4Solubilizace antigenu + odstředění
4Ni2+ + NTA agarosa
Φ koncentrování
Φ
Preparativní elektroforesa
Srážení TCA a solubilizace v PBS (a) Lýza buněk
Bakteriální buňky byly lyžovány ve 203 ml 50 mM PO4 pufru (pH 7,0) za použití homogenizačního přístroje (Rannie) a lyzát byl odstředěn na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 30 minut. Supernatant byl odstraněn.
(b) Solubilizace antigenu
·· 9
1/3 pelety byla resolubilizována 0/N při 4 °C ev 34 ml 100 mM PO4 - 6M GuHCl, pH 1. Po odstředění na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 30 minut byla peleta odstraněna a supernatant byl dále přečištěn IMAC.
(c) Afinitní chromatografie: Ni2+ + -NTA agarosa (Qiagen)
Objem kolony: 15 ml (16 mm x 7,5 cm)
Plnící pufr: 0,1 Μ PO4 - 6M GuHCl, pH 7 Vzorkový pufr: idem
Promývací pufr: 0,1 Μ PO4 - 6M GuHCl, pH 7
0,1 Μ PO4 - 6M močovina, pH 7
Eluce: imidazolový gradient (0 -> 250 mM) v 0,1 M PO4 pufru, pH 7, doplněném 6M močovinou.
Průtok: 2 ml/min
a. Koncentrování
Antigen-pozitivní frakce IMAC eluatu (160 ml) byly odebrány a koncentrovány na 5 ml v Amicon míchací kyvetě na Filtron membráně (typ Omega s limitem 10000). Čistota v tomto stadiu byla přibližně 70% podle SDS-PAGE.
b. Preparativní elektroforesa (Prep Cell BioRad)
2,4 koncentrovaného vzorku byla zahříváno při teplotě varu v 0,8 ml redukčního vzorkového pufru a tento materiál byl vnesen na 10% akrylamidový gel. Antigen byl eluován v Tris-Glycinovém pufru , pH 8,3, doplněném 4% SDS a NS1-MAGE 3 His-pozitivní frakce byly odebrány.
c. TCA srážení
Antigen byl srážen TCA a po odstředění na JA20 odstředivce při 15000 rpm po dobu 20 minut byl supernatant odstraněn. Peleta byla resolubilizována v PBS pufru, pH 7,4.
Protein je solubilní v PBS a po zmrazení/rozmražení nevykazuje známky jakékoliv degradace při skladování po dobu 3 hodin při 37 °C a má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 50000 Daltonů, jak je určeno SDS (12,5% PAGE).
Příklad 9: Příprava kmene E. coli exprimujícího fúsní protein CLYTA-MAGE-l-His koncovka
1. Konstrukce expresního plasmidu pRIT14426 a transformace hostitelského kmene AR58 pro produkci NSl-MAGE-3-His
Složení proteinu
Složení fúsního proteinu Clyta-MAGE-l-His, který je exprimován v E.coli, je uvedeno na obr. 15.
Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 7.
Kódující sekvence (SEQ ID NO: 8) odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-colí expresním plasmidu.
Klonování:
Výchozím materiálem byl vektor PCUZ1, který obsahuje 117 Ckoncových kodonů LytA kódujícího regionu ze Streptococcus pneumoniae a vektor pRIT14518, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-1 genovou cDNA z plasmidu získaného od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute.
Klonovací strategie pro expresi CLYTA-Mage-l-His proteinu (viz schéma na obr. 16) obsahovala následující kroky:
2. Příprava modulu CLYTA-Mage-l-His kódující sekvence (a) Prvním krokem byla PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci Ndel-AflIII restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plasmidu PCUZ1 jako templátu a kódujícího oligonukleotidového primeru 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac; a protismyslného oligonukleotidového primeru 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Tato amplifikace vedla k zisku 378 nukleotidů dlouhé CLYTA sekvence.
(b) Druhým krokem bylo navázání CLYTA sekvence na MAGE-l-His sekvenci za získání kódující sekvence pro fúsní protein. Tento krok obsahoval excisí Ndel-AflIII Clyta fragmentu a jeho inserci do vektoru pRIT14518, který byl předem natráven Ndel a Ncol (Ncol a AflIII kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plasmidu pRITl4613.
(c) Transformace hostitelského kmene AR58.
(d) Selekce a charakterizace transformantů E.colí (KAN resistentních) obsahujících plasmid pRIT14613 (viz obr. 16) .
1. Charakterizace rekombinantního proteinu CLYTA-MAGE-l-His (pRIT14613)
Bakterie byly kultivovány na LB mediu doplněném 50 .pg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 0,3 (při 620 nm), byla provedena teplotní indukce zvýšením teploty na 38 °C.
• · « · • · » · • · · « « • · · · • ·· ·♦
Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegraci) jedním stlačením. Po odstředění byly supernatant pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúsní protein představuje přibližně 1% celkových proteinů E. coli. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD. Fúsní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití anti-Mage-1 monoklonální protilátky.
Obnovení expresní jednotky složené z dlouhého λ pL promotoru (použitelného pro indukci kyselinou nalidixovou) a CLYTA-Magel-His kódující sekvence pRIT14614
EcoRI-NCOl restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a část CLYTA sekvence byl připraven z plasmidu pRIT DVA6 a byl insertován mezi ECORI-NCO1 místa plasmidu pRIT14613.
Byl ziskán rekombinantní plasmid pRIT14614.
Rekombinantní plasmid pRIT14614 (viz obr. 17) kódující fúsní protein CLYTA-Mage-l-His byl použit pro transformaci E.coli AR120. Byl selektován a charakterizován Kan resistentní kmen.
Charakterizace rekombinantního proteinu
Bakterie byly kultivovány na LB mediu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (při 620 nm) , byla přidána kyselina nalidixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.
Po 4 hodinové indukci byly buňky sklizeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegraci jedním nárazem). Po odstředění byly supernatant pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Bl, kde fúsní protein představuje přibližně 1% celkových proteinů E. coli. Fúsní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití králičích antiMage-1 polyklonálních protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 49 kD.
Příklad 10: CLYTA-Mage-3-His
A. Rekombinantní antigen způsobující rejekci nádoru: fúsní protein CLYTA-Mage-3-His, kde je fúsním partnerem C-lyt A, který způsobuje expresi solubilního proteinu, působí jako afinitní koncovka a je epitopem pro T-pomocné lymfocyty.
Příprava kmene E.coli exprimujícího fúsní protein CLYTA-Mage-3His
Konstrukce expresního plasmidu pRIT14646 a transformace hostitelského kmene AR120.:
Složení proteinu
Složení fúsního proteinu Clyta-MAGE-3-His, který je exprimován v E.coli, je uvedeno na obr. 18.
Primární struktura výsledného proteinu má sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9 a kódující sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 10.
Kódující sekvence odpovídající výše uvedenému proteinu byla umístěna pod kontrolu XpL promotoru v E-coli expresním plasmidu.
Klonování :
Výchozím materiálem byl vektor PCUZ1, který obsahuje 117 Ckoncových kodonů LytA kódujícího regionu ze Streptococcus pneumoniae (Gene 43, (1986), str. 265-272) a vektor pRITl4426, do kterého jsme předtím klonovali MAGE-3 genovou cDNA z plasmidu získaného od Dr. Thierry Boon z Ludwig Institute.
Klonovací strategie pro expresi CLYTA-Mage-3-His proteinu (viz schéma na obr. 19) obsahovala následující kroky:
1. Příprava modulu CLYTA-Mage-3-His kódující sekvence
1.1 Prvním krokem byla PCR amplifikace, která přidávala ke CLYTA sekvenci AflII a AflIII restrikční místa na obou stranách. PCR amplifikace byla provedena za použití plasmidu PCUZ1 jako templátu a kódujícího oligonukleotidového primeru 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac; a protismyslného oligonukleotidového primeru 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Tato amplifikace vedla k zisku 472 nukleotidů dlouhé CLYTA sekvence. Tento amplifikovaný fragment byl klonován do TA klonovacího vektoru (Invitrogen) za vzniku pracovního vektoru pRIT14661.
1.2 Druhým krokem bylo navázání CLYTA sekvence na MAGE-3-His sekvenci za získání kódující sekvence pro fúsní protein. Tento krok obsahoval excisí AflII-AflIII Clyta fragmentu á jeho inserci do vektoru pRITl4426, který byl předem natráven AflII a Ncol (Ncol a AflII kompatibilními) restrikčními enzymy a tento postup vedl k zisku plasmidu pRIT14662.
2. Obnovení expresní jednotky složené z dlouhého λ pL promotoru • · » * ©
• 9 9 9 9 9
9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 • · · 9 9
99 99 99 (použitelného pro indukci kyselinou nalidixovou) a CLYTA-Mage3-His kódující sekvence
BglII-Xbal restrikční fragment obsahující dlouhý pL promotor a CLYTA-Mage-3-His kódující sekvenci byl připraven z plasmidu pRIT14662 a byl insertován mezi BglII-Xbal místa plasmidu TCM67 (derivát pBR322 obsahující gen pro resistenci na ampicilin a dlouhý λ pL promotor, popsaný v mezinárodní přihlášce PCT/EP 92/01827). Byl získán plasmid pRIT14607.
Rekombinantní plasmid pRIT146607 kódující fúsní protein CLYTA-Mage-3-His byl použit pro transformaci E.coli AR120 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 88). Byl selektován a charakterizován kmen resistentní na ampicilin.
3. Příprava plasmidu pRIT14646
Nakonec byl připraven plasmid podobný pRIT14607, ale obsahující resistenci na kanamycin (pRIT 14646).
Charakterizace rekombinantního proteinu
Bakterie byly kultivovány na LB mediu doplněném 50 mg/ml kanamycinu při 30 °C. Když dosáhla kultura OD = 400 (při 620 nm), byla přidána kyselina nalidixová v konečné koncentraci 60 mg/ml.
Po 4 hodinové indukci byly buňky sklízeny, byly resuspendovány v PBS a byly lyžovány (desintegrací jedním nárazem). Po odstředění byly supernatant pelety a celkový extrakt analyzovány SDS-PAGE. Proteiny byly vizualizovány v gelech barvených Coomasie Blue, kde fúsní protein představuje
9999 *
»« • 9 9 9 • 9 9 9
9 9 9
99 přibližně 1% celkových proteinů E. coli. Fúsní protein byl identifikován westernovou analýzou za použití králičích antiMage-3 polyklonálních protilátek. Rekombinantní protein se objevil jako jediný proužek s molekulovou hmotností 58 kD.
Příklad 11: Přečištění rekombinantního proteinu CLYTA-Mage-3-His
Rekombinantní bakterie AR120 (pRIT14646) byly kultivovány ve 20 litrovém fermentačním tanku za doplňování živin při 30 °C. Exprese rekombinantního proteinu byla indukována přidáním kyseliny nalidixové v konečné koncentraci 60 mg/ml. Buňky byly sklízeny na konci fermentace a byly lyžovány při 60 OD./6Q® pomocí dvou průchodů French lisem (20000 psi) . Lyžované buňky byly peletovány během 20 minut při 15000 g při 4 °C.
Suepernatant obsahující rekombinantní prtoein byl vnesen do iontoměničové DEAE Sepharose CL6B pryskyřice (Pharmacia) předem uvedené do rovnováhy v pufru A (0,3 M NaCl, 2 0 mM Tris HCI, pH 7,6) . Po promytí kolony pufrem A byl fúsní protein eluován 2% cholinem v pufru A. Byly odebrány frakce pozitivní na antigen, jak byly stanoveny westernovým přenosem za použití anti-Mage-3 protilátky. Antigen eluovaný z DEAE byl přenesen do 0,5%
Empigen BB (obojetné detergenční činidlo) a do 0,5 M NaCl před tím, než byl vnesen do afinitní chromatografické kolony využívající iont kovu, která byla předem uvedena do rovnováhy v pufru B (0,5% Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM fosfátový pufr, i pH 7,6) .
IMAC kolona byla promývána pufrem B do té doby, než dosáhla absorbance při 280 nm základní hodnoty. Druhé promytí pufrem B bez Empigen BB (pufr C) pro eliminaci detergenčního činidla byl proveden před elucí antigenu imidazolovým gradientem 0-250 mM imidazolů v pufru C.
·· 44 • · 9 9
9 9 4 • «,
0,090 - 0,250 M imidazolové frakce byly shromážděny a byly koncentrovány na 10 kDa Filtrom omega membráně před dialýzou proti PBS pufru.
Závěr
Prokázali jsme, že fúsní protein LPD-MAGE-3-His je imunogenní. u myší a že tato imunogenicita (proliferativní odpověď a protilátková odpověď) může být dále zvýšena použitím adjuvans popsaného výše. Přečištění může být zlepšeno derivatizací thiolů, které tvoří disulfidové můstky.
Také jsme prokázali, že lepší protilátková odpověď je spouštěna vakcinací LPD-MAGE-3-His za přítomnosti adjuvans. Převládající izotyp nacházený v séru C57BL/6 je IgG2b, což naznačuje, že byla vyvolána imunitní odpověď Thi typu.
U člověka byl popsán případ pacienta léčeného LPD-MAGE-3-His v prostředku bez adjuvans, který byl vyléčen z maligního melanomu.
·« ··»· • · · • · · • · · • » · ·· · *«· • 0 ·· • 9 · · • ·· >
· · · · ♦ e · ·
99
Odkazy:
- Anichini A., Fossati G., Parmiani G. ImmunoL Today, 8: 385 (1987).
- De Plaen E., Arden K., Traversari C., et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994).
- Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., et al. J. Exp. Med.,
179: 921 (1994).
- Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F., et al. Immunogenetics,
43: 377 (1996).
- Inoue H., Moři M., Li J., etai. Int. J. Cancer, 63: 523 (1995).
- Kensil C.R., Soltysik S., Patel U., et al. in: Channock R.M. , Ginsburg H.S., Brown F., et al., (eds.), Vaccines 92, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),
36-40: (1992).
- Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA,
81: 3511 (1984).
- Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez S., et al. Int. J. Cancer, 64: 60 (1995).
- Ribi E., et al. in: Levine L., Bonventre P.F., Morello J., et al. (eds)., American Society for Microbioiogy, Washington DC, Microbiology 1986, 9-13; (1986).
- Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al. Int. J. Cancer, 44: 634 (1989).
- Van der Bruggen P., Traversari C., Chomez P., et al. Science, 254: 1643 (1991).
- Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. Immunol.,
24: 3038 (1994).
- Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G. , et al., Immunol. Rev.,
145: 229 (1995).
- Weynants P., Léthé B., Brasseur F., et al. Int. J. Cancer, 56: 826 (1994).
- Nishimura S, Fujita M, Terata N, Táni T, Kodama M, Itoh K, Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997, Apr, 20 (2): 95-101.
Fuijie T et al, Ann Oncol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: SmitKline Beecham Biologicals (ii) Název vynálezu: Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MÁGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kódující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúsních proteinů a prostředků pro vakcinaci (iii) Počet sekvencí: 10 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Adresa: SmithKline Beecham (B) Ulice: 2 New Horizons Court, Great West Road, B (C) Město: Middx (D) Země (E) Stát: UK (F( ZIP: TW8 9EP (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: disketa (B) Počítač: IBM kompatibilní (C) Operační systém: DOS (D) Software: FastSEQ pro Windows verze 2.0 (vi) Data současné přihlášky:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(vii) Data předchozí přihlášky:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání:
(viii) Zástupce/Agent - informace (A) Jméno: Dalton, Marcus J (B) Registrační číslo:
(C) Reference/č. rejstříku: B45126 (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: 0181 9756348 (B) Telefax: 0181 9756177 (C) Telex:
(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 452 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ·· ·· • · · « • * · · • · · · • · · · • · · · (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(xi! l Popis sekvence: SE( ) ID NO: 1:
Met Asp Pro Lys Thr ' Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40. 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lvs Ala Leu Ala Phe Aia Gin Gin Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Aso Gly Arg Leu Val Val
65 70 75‘ 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Are Tyr Tyr Val Ile Aso Phe Thr
100 105 lib’
Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
115 120 125
Asp Leu Glu Gin Arg Ser Gin His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu
130 135 140
Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gin Ala Pro Ala Thr
145 150 155 160
Glu Glu Gin Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr
165 170 175
Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gin Ser Pro
180 185 190
Gin Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Prc Leu Trp Ser
195 200 205
Gin Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gin Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr
210 215 220
Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gin Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val
225 230 235 240
Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro
245 250 255
Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Tro Gin Tyr
260 265 270
Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gin Leu Val
275 280 285
Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr „Ile
290 295 300
Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Glv Leu Leu Gly Asp Asn
305 310 315 320
Gin Ile Met Pro Lvs Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile
325 330 335
Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys X 1.3 Trp Glu Glu Leu
340 345 350
Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp
355 360 365
Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gin His Phe Val Gin Glu Asn Tyr Leu Glu
370 375 380
Tyr Arg Gin Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Tro
385 390 395 4 00
Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His
405 410 415
« ·
Met Val Lys Ile 420 Ser GLy Gly Pro His 425 Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 430 His
Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His
435 440 445
His His His
4 50
(2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1353 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
ATGGATCCAA AAACTTTAGC CC7TTCTTTA AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT CGTAAAG.ATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGATCTG GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG AGAGGCCCTG GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CTCCTCTTCT CCTGCTGCCG AGTCACCAGA TCCTCCCCAG ACCATGAACT ACCCTCTCTG GAGCCAATCC GGGCCAAGCA CCTTCCCTGA CCTGGAGTCC GCCGAATTGG TTCA7TTTCT GCTC.CTCAAG GAAATGCTGG GGAGTGTCGT CGGAAATTGG GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC CACTTG7ACA TCTTTGCCAC CTGCCTGGGC CAGATCATGC CCAAGGCAGG CCTCCTGATA GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AATCTGGGAG AGGGAAGACA GTATCTTGGG GGATCCCAAG AACTACCTGG AGTACCGGCA GGTCCCCGGC GGTCCAAGGG CCCTCGTTGA AACCAGCTAT agtggaggac ctcacatttc ctacccaccc GAGGGCGGTC ATCACCATCA CCATCACCAT
TTAGCAGGTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA ISO GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240 GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 TTTACCTTAA. AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 3 60 GAACAGCGTA. GTCAGCACTG CAAGCCTGAA 420 GGCCTGGTGG GTGCGCAGGC TCCTGCTACT 430 ACTCTAGTTG AAGTCACCCT GGGGGAGG7G 54 0 AGTCCTCAGG GAGCCTCCAG CCTCCCCACT 600 TATGAGGACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG 660 GAG7TCCAAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG 720 TATCGAGCCA GGGAGCCGGT CACAAAGGCA 780 CAGTATTTCT TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA 840 ATCGAGCTGA TGGAAGTGGA CCGCATCGGC 900 CTC7CCTACG ATGGCCTGCT GGGTGACAAT 960 ATCGTCC7GG CCATAATCGC AAGAGAGGGC 1020 GAGCTGAGTG TGTTAGAGGT G7TTGAGGGG 1080 AAGCTGCTCA CCCAACATTT CGTGCAGGAA 1140 AGTGATCCTG CATGTTATGA ATTCCTGTGG. 1200 .GTGAAAGTCG TGCACCATAT GGTAAAGATC 1260 CTGCATGAGT GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 1320 TAÁ 1353 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1341 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
ATGGÁTČCAA AAACTŤTÁGC 'CCTTTCTTTA TTAGČAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAA7CAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAA7 CTAAAGCACT TGCGTTTGGA 180 CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGG7T ‘24 0 ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360 ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGCTCT CTGGAACAGC GTAGTCTGCA CTGCAAGCCT 420 GAGGAAGCCC TTGAGGCCCA ACAAGAGGCC CTGGGCCTGG TGTGTGTGCA GGCTGCCACC 480 TCCTCCTCCT CTCCTCTGGT CCTGGGCACC CTGGAGGAGG TGCCCACTGC TGGGTCAACA 540 GATCCTCCCC AGAGTCGTCA GGGAGCCTCC GCCTTTCCCA CTACCATCAA CTTCACTCGA 600 CAGAGGCAAC CCAGTGAGGG TTCCAGCAGC CGTGAAGAGG AGGGGCCAAG CACCTC7TGT 660 ATCCTGGAGT CCTTGTTCCG AGCAGTAATC ACTAAGAAGG TGGCTGATTT GG7TGGTTTT 720 CTGCTCCTCA AATATCGAGC CAGGGAGCCA GTCACAAAGG CAGAAATGCT GGAGAGTGTC 780 ATCAAAAATT ACAAGCACTG TTTTCCTGAG ATCTTCGGCA AAGCCTCTGA GTCCTTGCAG 840 CTGGTCTTTG GCATTGACGT GAAGGAAGCA GACCCCACCG GCCACTCCTA TGTCCTTGTC 900 ACCTGCCTAG GTCTCTCCTA TGATGGCCTG CTGGGTGATA ATCAGATCAT GCCCAAGACA 960 GGCTTCCTGA TAATTGTCCT GGTCATGATT GCAATGGAGG GCGGCCATGC TCCTGAGGAG 1020 GAAATCTGGG AGGAGCTGAG TGTGATGGAG GTGTATGATG GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT 1080 GGGGAGCCCA GGAAGCTGCT CACCCAAGAT TTGGTGCAGG AAAAGTACCT GGAGTACCGG 1140 CAGGTGCCGG ACAGTGATCC CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG GGCCCTCGCT 1200 GAAACCAGCT ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGA7CAAGG TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1260 TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT CGGCGGTCAT 1320 CACCATCACC ATCACCATTA A 1341 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 466 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
( xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4 :
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr C-ln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lvs Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp
50 55 60
Tvr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lvs Phe
85 90 95
Pro His Arg His 100 Arg Lys Asp Gly Arg 105 Tyr Tyr Val Ile A.SO 110 Phe Thr
Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
115 120 125
Gly Ser Leu Glu Gin Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu
130 135 140
Glu Ala Gin Gin Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gin Ala Ala Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr
165 170 175
Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gin Ser Pro Gin Gly Ala Ser Ala Phe
180 185 190
Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gin Arg Gin Pro Ser Glu Gly Ser
195 200 205
Ser Ser Arg Glu Glu Glu C-iv Pro Ser Thr Ser Cvs Ile Leu Glu Ser
210 215 220
Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Ph.e
225 230 235 240
Leu Leu Leu Lys Tvr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met
245 250 255
Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe
260 265 270
Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gin Leu Val Phe Gly Ile' Asp Val Lys
275 280 285
Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly
290 295 300
Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gin Ile Met Pro Lys Thr
305 310 315 320
Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Glv His
325 330 335
Ala Pro Glu Glu Glu Ile Tr? Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr
340 345 350
Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lvs Leu Leu Thr
355 360 3 65
Gin Asp Leu Val Gin Glu Lvs Tyr Leu Glu Tyr Arg Gin Val Pro Asp
370 375 380
Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala
385 390 395 400
Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala
405 410 415
Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu
420 425 430
Glu Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His
435 440 445 -
(2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 404 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý • * (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
( Xi) Popis sek- vence: SEQ ID NO: 5:
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gin Val Asp Cys Phe Leu Trp
1 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gin Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe
20 25 30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gin Lys Ser Leu Arg Glv Arg Gly Ser
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Asp T ' a Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gin Ile
50 55 60
Val Glu Arg Ile Leu Lvs Giu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Met Asp Leu Glu Gin Arg Ser Gin His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu
85 90 95
Giu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gin Ala Pro Ala
100 105 110
Thr Glu Glu Gin Glu Ai-O. Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
115 120 125
Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asd Pro Pro Gin Ser
130 135 140
Pro Gin Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Tro
145 150 155 160
Ser Gin Ser Tyr Glu As? Ser Ser Asn Gin Glu Glu Glu Glv Pro Ser
165 170 175
Thr Phe Pro Asd Leu Glu Ser Glu Phe Gin Ala Ala Leu Ser Arg Lys
180 185 190
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ala Giu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gin
210 215 220
Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gin Leu
225 230 235 240
Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Giu Val As o Pro Ile Gly His Leu Tyr
245 250 255
Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp
260 265 270
Asn Gin Ile Met Pro Lys Ala Glv Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile
275 28C 285
Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cvs Ala Pro Glu Glu Lvs Ile Trp Glu Glu
290 295 300
Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser lie Leu Gly
305 310 315 320
Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gin His Phe Val Gin Glu Asn Tyr Leu
325 330 335
Glu Tyr Arg Gin Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Giu Phe Leu
340 345 350
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His
355 360 365
His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Le'u
370 375 380
His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His
385 390 395 400
His His His ···♦·· ♦ tt ·· ·· ·* · ·« · · «««« • •tt · tt ·««« • tt · · tt · · · ♦ ··· tt·· ·· tttt (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1212 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
ATGGATCCAA ACACTGTGTC AAGCTTTCAG GTAGATTGGT TTGTTTGGCA TGTCCGCAAA 60 CGAGTTGCAG ACCAAGAACT AGGTGATGCC CCATTCCTTG ATCGGCTTCG CCGAGATCAG 120 AAATCCCTAA GAGGAAGGGG CAGCACTCTT GGTCTGGACA TCGAGACAGC CACACGTGCT 180 GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG GATTCTGAAA GAAGAATCGG ATGAGGCACT TAAAATGACC 2 40 ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA 300 GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT CCTGCTACCG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC 3 60 TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT 4 20 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG 4 80 AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC 5 40 CTGGAGTCCG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT AGGAAGGTGG CCGAATTGGT TCATTTTCTG 600 CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC 660 GGAAATTGGC AGTATTTCTT TCCTGTGATC TTCAGCAAAG CTTCCAGTTC CTTGCAGCTG 720 GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC CCCATCGGCC ACTTGTACAT CTTTGCCACC 7 80 TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGGCAGGC 840 CTCCTGATAA TCGTCCTGGC CATAATCGCA AGAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA 900 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTGGGG 960 GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAAČATTTC GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG 1020 GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGTTATGAA TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGTTGAA 1080 ACCAGCTATG' TGAAAGTCCT GCACCATATG GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCACATTTCC 1140 TACCCACCCC TGCATGAGTG GGTTTTGAGA GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC 1200 CATCACCATT AA 1212 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 445 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Met Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Aso Lys
1 5 10 15'
Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tvr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lvs Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Lvs Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Mor Lys Thr Gly Trp Val
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu As o Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90' 95
Val Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr
100 105 110
• * * · · · · · * ♦ · · « • · « » · ··«· ¢-7 ·»····♦««··
0/ · · · «·····
Leu Lys Pro Asp 115 Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Asp Met Gly
120 125
Ser Leu Glu Gin Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu Glu
130 135 140
Ala Gin Gin Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gin Ala Ala Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Ala
165 170 175
Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gin Ser Pro Gin Gly Ala Ser Ala Phe Pro
180 185 190
Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gin Arg Gin Pro Ser Glu Gly Ser Ser
195 200 205
Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu
210 215 220
Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Leu
225 230 235 240
Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu
245 250 255
Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe Gly
260 265 270
Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gin Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu
275 280 285
Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu
290 295 300
Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gin Ile Met Pro Lys Thr Gly
305 310 315 320
Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His Ala
325 330 335
Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr Asp
340 345 350
Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gin
355 360 365
Asp Leu Val Gin Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gin Val Pro Asp Ser
370 375 380
Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu
385 390 395 400
Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg
405 410 415
Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Ara Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu
420 425 430
Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His
435 440 445
(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1338 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ··«»
120
180
240
300 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC
AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG
CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG
AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC
AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC
TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360
GACAGGCCAG AATTGGACAT GGGCTCTCTG GAACAGCGTA GTCTGCACTG CAAGCCTGAG 420
GAAGCCCTTG AGGCCCAACA AGAGGCCCTG GGCCTGGTGT GTGTGCAGGC TGCCACCTCC 480
TCCTCCTCTC CTCTGGTCCT GGGCACCCTG GAGGAGGTGC CCACTGCTGG GTCAACAGAT 540
CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC TTTCCCACTA CCATCAACTT CACTCGACAG 600
AGGCAACCCA GTGAGGGTTC CAGCAGCCGT GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC 660
CTGGAGTCCT TGTTCCGAGC AGTAATCACT AAGAAGGTGG CTGATTTGGT TGGTTTTCTG 720
CTCCTCAAAT A.TCGAGCCAG GGAGCCAGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGA GAGTGTCATC 780
AAAAATTACA AGCACTGTTT TCCTGAGATC TTCGGCAAAG CCTCTGAGTC CTTGCAGCTG 840
GTCTTTGGCA TTGACGTGAA GGAAGCAGAC CCCACCGGCC ACTCCTATGT CCTTGTCACC 900
TGCCTAGGTC TCTCCTATGA TGGCCTGCTG GGTGATAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC 960
TTCCTGATAA TTGTCCTGGT CATGATTGCA ATGGAGGGCG GCCATGCTCC TGAGGAGGAA 1020
ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATGGAGGTG TATGATGGGA GGGAGCACAG TGCCTATGGG 1080
GAGCCCAGGA AGCTGCTCAC CCAAGATTTG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG 114 0
GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CČTCGCTGAA 1200
ACCAGCTATG TGAAAG-TCCT TGAGTATGTG ATCAAGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTT7C 1260
TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA GAGGAGGAAG AGGGAGTCGG CGGTCATCAC 1320 ČATCACCATC ACCATTAA 1338 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 454 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Met tys 1 Gly Gly Ile 5 Val His Ser Asp Gly 10 Ser T vx Pro Lys Asp 15 Lys
Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90 95
Val Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr
100 105 110
'Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Ala Ser Met
115 120 125
Leu Asp Met Asp Leu Glu Gin Arg Ser Gin His Cvs Lys Pro Glu Glu
130 135 140
Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gin Ala
145 150 155 160
Pro Ala Thr Glu Glu Gin Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val
165 170 175
Glu Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asd Pro Pro
180 185 19*0
Gin Ser Pro Gin Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro
195 200 205
Leu Trp Ser Gin Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gin Glu Glu Glu Gly
210 215 220
Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gin Ala Ala Leu Ser
225 230 235 240
Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala
245 250 255
Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn
260 265 270
Trp Gin Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu
275 280 285
Gin Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His
290 295 300
Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu
305 310 315 320
Gly Asp Asn Gin Ile Met Pro Lys Ala Giv Leu Leu Ile Ile Val Leu
325 330 335
Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cvs Ala Pro Glu Glu Lvs Ile Ty-r-v
340 345 350
Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile
355 360 365
Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gin His Phe Val Gin Glu Asn
370 375 380
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gin Val Pro Giv Ser Asp Pro Ala Cys T vr Glu
385 390 395 400
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val
405 410 415
Leu His His Met Val Lys Ile Ser Giv Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro
420 425 430
Pro Leu His Glu Trp. Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His
435 440 445
His His His His His
450
fe · fefefefe fe fe · fefefe • fefe (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1362 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
ATGAAAGGGG GAATTGTACA AATGGCACTT GGTACTACTT CACACAGACG GCAACTGGTA AAAATCGCTG ATAAGTGGTA AAGTACAAGG ACACTTGGTA TTTATCCAGT CAGCGGACGG GACAGGCCAG AATTGGCCAG AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA CTCCCCACTA CCATGAACTA GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC AGGAAGGTGG CCAAGTTGGT ACAAAGGCAG AAATGCTGGG TTCAGCAAAG CTTCCGATTC CCCATCGGCC ACGTGTACAT GGTGACAATC AGATCATGCC .AAAGAGGGCG ACTGTGCCCC TTTGAGGGGA GGGAAGACAG GTGCAGGAAA ACTACCTGGA TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC GTAAAGATCA GTGGAGGACC GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA
TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA. 360 CATGCTGGAC ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC 420 GGCCCGAGGA GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT 480 GGCTGCCTCC TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG 540 GTCACCAGAT CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC 600 CCCTCTCTGG AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA 660 CTTCCCTGAC CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT 720 TCATTTTCTG CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC 780 GAGTGTCGTC GGAAATTGGC AGTACTTCTT TCCTGTGATC 840 CTTGCAGCTG GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC 900 CTTTGCCACC TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 960 CAAGACAGGC TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA 1020 TGAGGAGAAA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG 1080 TATCTTCGGG GATCCCAAGA AGCTGCTCÁC CGAATATTTC 114 0 GTACCGGCAG GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGCTATGAG 1200 CCTCATTGAA ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCÁCCATATG 1260 TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1320 TCACCATCAC CATCACCATT AA 1362

Claims (16)

1. Derivát antigenu asociovaného s nádory z MÁGE rodiny vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny zahrnuj ící:
- MÁGE antigen obsahující derivatizované thiolové zbytky;
- rekombinantně exprimovaný MÁGE fúzní protein, ve kterém je partner pro fúzi vybrán ze skupiny zahrnující: protein D nebo jeho fragment, NS1 protein z influenzy nebo jeho fragment a C-lyta ze Streptococcus pneumoniae nebo jeho fragment.
2. Antigen podle nároku lvyznačující se tím, že derivatizované volné thioly jsou karboxyamidované nebo karboxymethylované.
3. Antigen podle nároků 1 nebo 2 vyznačující se tím, že antigen obsahuje afinitní koncovku.
4. Antigen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že protein D nebo jeho fragment je lipidovaný.
5. Antigen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4
v y z n a č u j í c i s e t i m, že MÁGE protein je vybrán ze skupiny: MÁGE Al, MÁGE A2, MÁGE A3, MÁGE A4, MÁGE A6, MÁGE A6, MÁGE A7, MÁGE A8, MÁGE A9, MÁGE A10, MÁGE All, MÁGE A12, MÁGE Bl, MÁGE B2, MÁGE B3, MÁGE B4, ! MÁGE Cl a MÁGE C2.
6. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúsní protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5.
·«*·«· · · *· ·» * * · * · ♦ · 9 9 9 9
9 9 9 · · 9 9 9 9
9 9 9 · · 9 9 9 9 9 9
ΟΖ 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 999 999 ·« 99
Ί. Vektor obsahující nukleovou kyselinú podle nároku 6.
8. Hostitelská buňka transformovaná nukleovou kyselinou podle nároku 6 nebo vektorem podle nároku 7.
9. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5.
10. Vakcína podle nároku 9vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans a/nebo imunostimulační cytokin nebo chemokin.
11. Vakcína podle nároku 9 nebo 10 vyznačuj ící se tím, že protein je připraven ve vehikulu, kterým je emulze olej ve vodě.
12. Vakcína podle nároku 10 nebo 11 v y z n a č u j 1 c 1 se tím, že adjuvans obsahuje 3D-MPL, QS21 nebo CpG oligonukleotid.
13. Vakcína podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje jeden nebo více dalších antigenu.
14. Vakcína podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že je určena pro použití v medicíně.
15. Použití proteinu nebo nukleové kyseliny podle předcházejících nároků pro výrobu vakcíny pro imunoterapeutickou léčbu pacientů trpících melanomem nebo jinými nádory asociovanými s MÁGE.
φφ φφφφ
16. Způsob přečištění MÁGE proteinu nebo jeho derivátu vyznačující se tím, že obsahuje redukci disulfidových vazeb, blokování vzniklých volných thiolových skupin blokovací skupinou a zpracování získaného derivátu v jednom nebo více stupních chromatografického přečištění.
17. Způsob přípravy vakcíny vyznačující se tím, že obsahuje stupně přečištění MÁGE proteinu nebo jeho derivátu způsobem podle nároku 19 a zpracování získaného proteinu jako vakcíny.
CZ20002869A 1998-02-05 1999-02-02 Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci CZ298364B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9802543.0A GB9802543D0 (en) 1998-02-05 1998-02-05 Vaccine
GBGB9802650.3A GB9802650D0 (en) 1998-02-06 1998-02-06 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002869A3 true CZ20002869A3 (cs) 2001-01-17
CZ298364B6 CZ298364B6 (cs) 2007-09-05

Family

ID=26313069

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002869A CZ298364B6 (cs) 1998-02-05 1999-02-02 Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci
CZ20060442A CZ298347B6 (cs) 1998-02-05 1999-02-02 Fúzní protein z rodiny MAGE, kódová sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská bunka, vakcina a použití fúzního proteinu pro výrobu vakciny

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060442A CZ298347B6 (cs) 1998-02-05 1999-02-02 Fúzní protein z rodiny MAGE, kódová sekvence nukleové kyseliny, vektor, hostitelská bunka, vakcina a použití fúzního proteinu pro výrobu vakciny

Country Status (25)

Country Link
US (3) US8097257B2 (cs)
EP (4) EP1659178B1 (cs)
JP (2) JP4768121B2 (cs)
KR (2) KR100633212B1 (cs)
CN (1) CN1227360C (cs)
AR (1) AR018064A1 (cs)
AT (4) ATE315088T1 (cs)
AU (1) AU737337B2 (cs)
BR (1) BR9907691B1 (cs)
CA (2) CA2584482C (cs)
CY (4) CY1105685T1 (cs)
CZ (2) CZ298364B6 (cs)
DE (3) DE69943359D1 (cs)
DK (4) DK1659178T3 (cs)
ES (2) ES2342416T3 (cs)
HU (1) HU228467B1 (cs)
IL (4) IL137442A0 (cs)
NO (2) NO328507B1 (cs)
NZ (1) NZ506086A (cs)
PT (4) PT1053325E (cs)
SA (1) SA99200126B1 (cs)
SI (4) SI1053325T1 (cs)
TR (1) TR200002284T2 (cs)
TW (1) TWI238853B (cs)
WO (1) WO1999040188A2 (cs)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ298364B6 (cs) 1998-02-05 2007-09-05 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci
JP2002526419A (ja) 1998-10-05 2002-08-20 ファーメクサ エイ/エス 治療上のワクチン注射のための新規な方法
ID28387A (id) * 1998-10-05 2001-05-17 M & E Biotech As Metoda baru untuk vaksinasi terapeutik
GB9908885D0 (en) * 1999-04-19 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Vccine
DK1650221T3 (da) 2000-02-23 2012-09-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Nye forbindelser
EP1385541B1 (en) * 2000-04-13 2008-06-18 Corixa Corporation Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21
DK1282702T3 (da) * 2000-05-10 2007-04-02 Sanofi Pasteur Ltd Immunogene polypeptider, som er kodet af KAGE-minigener, og anvendelser deraf
AUPQ761200A0 (en) 2000-05-19 2000-06-15 Hunter Immunology Limited Compositions and methods for treatment of mucosal infections
ATE452909T1 (de) * 2000-06-05 2010-01-15 Brigham & Womens Hospital Für ein homologes des humanen, für mehrfachresistenz verantwortlichen, p- glykoproteins auf chromosom 7p15-21 kodierendes gen sowie verwendungen dafür
AU2001268678B2 (en) 2000-06-20 2006-11-16 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US20050019340A1 (en) * 2000-10-18 2005-01-27 Nathalie Garcon Vaccines
MXPA03003408A (es) * 2000-10-18 2005-06-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacunas.
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2002364161A1 (en) 2001-12-12 2003-06-23 Aventis Pasteur Limited Enhancement of the immune response using cd36-binding domain
ES2359473T3 (es) 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
CA2537140A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 The Nottingham Trent University Gastric and prostate cancer associated antigens
WO2005037190A2 (en) * 2003-09-03 2005-04-28 Dendritherapeutics, Inc. Multiplex vaccines
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
GB0409940D0 (en) * 2004-05-04 2004-06-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US20090022755A1 (en) 2005-03-31 2009-01-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines against chlamydial infection
SI2457926T1 (sl) 2005-04-29 2015-01-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nov postopek za preprečevanje ali zdravljenje infekcije z M. tuberculosis
ATE515566T1 (de) * 2005-05-26 2011-07-15 Cytos Biotechnology Ag Skalierbares fermentationsverfahren
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
ATE545708T1 (de) * 2005-11-14 2012-03-15 Univ Laval Krebsantigen mage-a9 und verwendungen davon
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
JP5170976B2 (ja) * 2006-04-11 2013-03-27 株式会社イミュノフロンティア タンパク質複合体およびその製造方法
CL2007001571A1 (es) 2006-06-02 2008-05-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Perfil genico indicativo de probabilidad aumentada de que un paciente responda o no a una inmunoterapia; uso de dicho perfil; procedimiento de identificacion del perfil; uso de sonda para identificar la expresion diferencial de al menos un gen de act
GB0612342D0 (en) * 2006-06-21 2006-08-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
AU2007354917B2 (en) 2006-09-26 2013-06-06 Access To Advanced Health Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
GB0700284D0 (en) * 2007-01-08 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination therapy
JP5391080B2 (ja) 2007-01-15 2014-01-15 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
WO2009039985A2 (en) * 2007-09-11 2009-04-02 Mondobiotech Laboratories Ag Therapeutic uses of urocortin ii
EP2188017A2 (en) * 2007-09-11 2010-05-26 Mondobiotech Laboratories AG Use of glucagon (1-29) alone or in combination with neuropeptide w30 as a therapeutic agent
CN101932723B (zh) 2007-09-17 2014-09-10 肿瘤甲基化科学公司 改进的对mage-a表达的检测
US20100285069A1 (en) * 2007-10-19 2010-11-11 Mario Contorni Meningococcal vaccine formulations
WO2010105815A2 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Oncomethylome Sciences S.A. Improved detection of gene expression
NZ596501A (en) 2009-05-27 2013-11-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Casb7439 constructs
TWI494125B (zh) 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
GB0910046D0 (en) 2009-06-10 2009-07-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
GB0917457D0 (en) 2009-10-06 2009-11-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
BR112012018669A2 (pt) 2010-01-27 2017-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteína rv3616c modificada, uso de uma proteína rv3616c modificada, polinucleotídeo, uso de um polinucleotídeo, composição farmacêutica, composição imunogênica, proteína de fusão, e, polipeptídeo.
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
SG192759A1 (en) 2011-02-15 2013-09-30 Immune Design Corp Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
BRPI1100857A2 (pt) * 2011-03-18 2013-05-21 Alexandre Eduardo Nowill agente imunomodulador e suas combinaÇÕes, seu uso e mÉtodo imunoterÁpico para a recontextualizaÇço, reprogramaÇço e reconduÇço do sistema imune em tempo real
NZ616304A (en) 2011-04-08 2016-01-29 Immune Design Corp Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
CN102251034B (zh) * 2011-07-05 2012-11-21 北京大学人民医院 基于mage-c2/ct10基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒
EP2750768B1 (en) 2011-08-30 2018-10-03 Astex Pharmaceuticals, Inc. Decitabine derivative formulations
GB201116248D0 (en) 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
JP2015503503A (ja) * 2011-12-22 2015-02-02 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーGlaxoSmithKline LLC Braf阻害剤および/またはmek阻害剤とともにmagea3免疫療法薬を用いた癌の治療方法
WO2013119856A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Infectious Disease Research Institute Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same
MX350274B (es) 2012-05-16 2017-08-31 Immune Design Corp Vacunas para hsv-2.
EP2912069B1 (en) 2012-10-23 2019-07-31 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
CN105025884B (zh) 2013-03-01 2019-08-20 阿斯泰克斯制药公司 药物组合
HK1214510A1 (zh) 2013-04-18 2016-07-29 Immune Design Corp. 用於癌症治疗的gla单一疗法
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
BR112016015422A2 (pt) 2013-12-31 2017-10-24 Infectious Disease Res Inst formulações de vacina de frasco único
SG11201606625RA (en) 2014-02-14 2016-09-29 Immune Design Corp Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
CA2955015A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
WO2017004538A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Lyophilized pharmaceutical compositions
CN105181966B (zh) * 2015-09-02 2017-08-11 南通大学附属医院 一种mage‑a9的用途
KR102566134B1 (ko) 2015-12-07 2023-08-10 삼성전자주식회사 반도체 소자의 3d 프로파일링 시스템 및 이의 동작 방법
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
US11162945B2 (en) 2016-04-11 2021-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for detecting single T cell receptor affinity and sequence
IL319503A (en) 2016-05-16 2025-05-01 Access To Advanced Health Inst PEGylated liposomes and methods of use
EP4112638A1 (en) 2016-05-16 2023-01-04 Access to Advanced Health Institute Formulation containing tlr agonist and methods of use
MX393217B (es) 2016-06-01 2025-03-11 Infectious Disease Res Inst Particulas de nanoalumbre que contienen un agente de dimensionamiento
ES3003260T3 (en) 2017-06-15 2025-03-10 Access To Advanced Health Inst Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
SG11202000932XA (en) 2017-08-03 2020-02-27 Otsuka Pharma Co Ltd Drug compound and purification methods thereof
JP7339942B2 (ja) 2017-09-08 2023-09-06 アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法
CA3097396A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Baylor College Of Medicine Reprogramming cd4 t cells into cytotoxic cd8 cells by forced expression of cd8ab and class 1 restricted t cell receptors
EP3883955A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
AU2019386140A1 (en) 2018-11-28 2021-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
MX2021006393A (es) 2018-11-29 2021-10-13 Univ Texas Metodos para expansion ex vivo de celulas exterminadoras naturales y uso de las mismas.
EP3976092A1 (en) 2019-05-25 2022-04-06 Infectious Disease Research Institute Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion
WO2021167908A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
CN116057067A (zh) * 2020-04-17 2023-05-02 弗朗西斯·克里克研究所有限公司 用于治疗黑素瘤的ctl抗原的融合蛋白
US20230310323A1 (en) 2020-09-04 2023-10-05 Access To Advanced Health Institute Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
CA3173951A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Emily VOIGT Genetically-adjuvanted rna vaccines
AU2021377699A1 (en) 2020-11-13 2023-06-15 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
AU2021406131A1 (en) 2020-12-23 2023-08-03 Access To Advanced Health Institute Solanesol vaccine adjuvants and methods of preparing same
WO2022226522A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Baylor College Of Medicine Methods of engineering immune cells having reduced fratricidal activity
EP4169513A1 (en) 2021-10-19 2023-04-26 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising sting agonists
EP4436595A1 (en) 2021-11-22 2024-10-02 Pfizer Inc. Reducing risk of antigen mimicry in immunogenic medicaments
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
IL319329A (en) 2022-09-09 2025-05-01 Access To Advanced Health Inst Immunogenic vaccine composition incorporating saponin

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4302386A (en) 1978-08-25 1981-11-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4526716A (en) 1981-11-20 1985-07-02 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4384995A (en) 1980-01-16 1983-05-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
AR241713A1 (es) 1984-08-30 1992-11-30 Smithkline Beckman Corp Molecula de dna con una secuencia de bases que codifica la proteina c13 y preparacion de vacunas contra la gripe.
ZA896627B (en) * 1988-08-31 1991-03-27 Smithkline Beecham Corp Vaccinal polypeptides
GB8824496D0 (en) 1988-10-19 1988-11-23 Beecham Group Plc Process
US6780407B1 (en) 1989-03-08 2004-08-24 Aventis Pasteur Pox virus comprising DNA sequences encoding CEA and B7 antigen
CA2022752C (en) 1989-08-11 1998-07-07 Naomi Kitamura Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor
GB8927546D0 (en) 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0547064B1 (en) 1990-07-23 1994-06-22 ZymoGenetics, Inc. Protease resistant pdgf and methods of use
US5925729A (en) 1991-05-23 1999-07-20 Ludwig Institute For Cancer Research Tumor rejection antigen precursors, tumor rejection antigens and uses thereof
US5541104A (en) 1991-05-23 1996-07-30 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies which bind to tumor rejection antigen precursor mage-1
US5342774A (en) 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
DK1023900T3 (da) 1991-11-14 2005-06-06 Brigham & Womens Hospital Farmaceutisk præparat indeholdende S-nitroso-lipoproteiner og anvendelse deraf
ATE156710T1 (de) 1992-06-25 1997-08-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
GB9213559D0 (en) 1992-06-25 1992-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2143335C (en) 1992-08-31 2000-03-14 Thierry Boon-Falleur Isolated nonapeptide derived from mage-3 gene and presented by hla-a1, and uses thereof
CA2168582A1 (en) * 1993-08-06 1995-02-16 John D. Fikes Cloning and characterization of the complete mage-1 gene
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
KR100316209B1 (ko) 1994-03-01 2002-06-26 에드워드 에이. 맥더모 2세, 로이드 제이. 오울드 Mage유전자발현에의한암상태의결정
US5879687A (en) * 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
DE69535036T3 (de) 1994-07-15 2011-07-07 The University of Iowa Research Foundation, IA Immunomodulatorische oligonukleotide
CN1159759A (zh) * 1994-09-30 1997-09-17 路德维格癌症研究所 含有肿瘤排斥抗原前体或肿瘤排斥抗原以及佐剂和/或生长因子的组合物
US5612030A (en) * 1995-01-17 1997-03-18 University Of Kentucky Research Foundation Anti-idiotype monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
US6017705A (en) 1995-03-14 2000-01-25 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which are members of the MAGE-B family and uses thereof
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
JPH11508767A (ja) 1995-06-29 1999-08-03 ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ マウス腫瘍拒絶抗原前駆体smage−3をコードする単離核酸分子
WO1997013858A2 (en) 1995-10-12 1997-04-17 Chiron Corporation Baboon mage-3 homologs, dna encoding the homologs, and a process for their use
US6265215B1 (en) 1996-09-13 2001-07-24 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated peptides which complex with HLA-Cw16 and uses thereof
US5908778A (en) 1996-10-03 1999-06-01 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-10 encoding cDNA, the tumor rejection antigen precursor mage-10, antibodies specific to the molecule, and uses thereof
CA2218456A1 (en) 1996-10-15 1998-04-15 The Rockefeller University Purified stat proteins and methods of purifying thereof
WO1998020165A2 (en) 1996-11-06 1998-05-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Biallelic markers
US7157089B1 (en) 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
US6340461B1 (en) 1996-12-17 2002-01-22 David Stephen Terman Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6287569B1 (en) 1997-04-10 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccines with enhanced intracellular processing
US6027924A (en) 1997-04-25 2000-02-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-C1 and uses thereof
US20020176865A1 (en) 1997-04-25 2002-11-28 Sophie Lucas Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursors of members of the MAGE-C and MAGE-B families and uses thereof
US6680191B1 (en) 1997-04-25 2004-01-20 Ludwig Institute For Cancer Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursors of members of the MAGE-C and MAGE-B FAMILIES and uses thereof
US6043084A (en) 1997-10-10 2000-03-28 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules associated with colon cancer and methods for diagnosing and treating colon cancer
US5965535A (en) 1997-09-12 1999-10-12 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
US6291430B1 (en) 1997-09-12 2001-09-18 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
US6716809B1 (en) 1997-09-12 2004-04-06 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-A3 peptides presented by HLA class molecules
CZ298364B6 (cs) 1998-02-05 2007-09-05 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci
EP1068354A2 (en) 1998-04-09 2001-01-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Biallelic markers
US6686147B1 (en) 1998-07-15 2004-02-03 Ludwig Institute For Cancer Research Cancer associated antigens and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
ES2255248T3 (es) 2006-06-16
PT1659178E (pt) 2010-06-28
PT1584685E (pt) 2011-06-17
CA2584482A1 (en) 1999-08-12
HK1083026A1 (en) 2006-06-23
ATE462788T1 (de) 2010-04-15
CA2319309C (en) 2010-08-10
HUP0102639A1 (hu) 2001-11-28
AR018064A1 (es) 2001-10-31
CN1227360C (zh) 2005-11-16
US8597656B2 (en) 2013-12-03
EP1659179B1 (en) 2011-06-15
DE69942214D1 (de) 2010-05-12
KR20060067977A (ko) 2006-06-20
IL188875A (en) 2011-08-31
EP1584685B1 (en) 2011-04-13
EP1659178B1 (en) 2010-03-31
US8044183B2 (en) 2011-10-25
JP4768121B2 (ja) 2011-09-07
WO1999040188A3 (en) 1999-10-14
DK1659179T3 (da) 2011-10-10
BR9907691B1 (pt) 2011-05-31
AU737337B2 (en) 2001-08-16
CY1105685T1 (el) 2010-12-22
NO20003958L (no) 2000-10-04
SI1659179T1 (sl) 2011-10-28
DE69929310T2 (de) 2006-08-03
PL342852A1 (en) 2001-07-16
CA2584482C (en) 2012-03-27
PT1053325E (pt) 2006-05-31
HK1093522A1 (en) 2007-03-02
KR100633212B1 (ko) 2006-10-11
EP1584685A2 (en) 2005-10-12
CY1111831T1 (el) 2015-10-07
IL137442A (en) 2008-04-13
EP1584685A3 (en) 2005-12-07
BR9907691A (pt) 2000-11-14
HK1033838A1 (en) 2001-09-28
CY1111672T1 (el) 2015-10-07
EP1659179A3 (en) 2007-01-17
CY1110180T1 (el) 2015-01-14
DE69943359D1 (de) 2011-05-26
EP1659178A2 (en) 2006-05-24
NO328507B1 (no) 2010-03-08
DK1584685T3 (da) 2011-07-11
CZ298364B6 (cs) 2007-09-05
TWI238853B (en) 2005-09-01
US8097257B2 (en) 2012-01-17
HU228467B1 (en) 2013-03-28
JP2002502604A (ja) 2002-01-29
NO20003958D0 (no) 2000-08-04
DK1053325T3 (da) 2006-05-22
NO20091665L (no) 2000-10-04
CN1295616A (zh) 2001-05-16
EP1659179A2 (en) 2006-05-24
DK1659178T3 (da) 2010-07-12
US20120269835A1 (en) 2012-10-25
HK1093521A1 (en) 2007-03-02
IL179010A0 (en) 2007-03-08
WO1999040188A2 (en) 1999-08-12
NZ506086A (en) 2003-01-31
CZ298347B6 (cs) 2007-09-05
DE69929310D1 (de) 2006-03-30
SI1053325T1 (sl) 2006-06-30
PT1659179E (pt) 2011-09-16
TR200002284T2 (tr) 2000-11-21
EP1053325B1 (en) 2006-01-04
CA2319309A1 (en) 1999-08-12
ES2342416T3 (es) 2010-07-06
AU2722099A (en) 1999-08-23
ATE315088T1 (de) 2006-02-15
EP1659178A3 (en) 2007-01-17
JP2009201510A (ja) 2009-09-10
HUP0102639A3 (en) 2004-04-28
EP1053325A2 (en) 2000-11-22
SI1659178T1 (sl) 2010-07-30
NO331719B1 (no) 2012-03-05
ATE505542T1 (de) 2011-04-15
ATE513042T1 (de) 2011-07-15
SA99200126B1 (ar) 2006-08-20
US20100209444A1 (en) 2010-08-19
KR100824105B1 (ko) 2008-04-21
IL188875A0 (en) 2009-02-11
KR20010040675A (ko) 2001-05-15
US20100204458A1 (en) 2010-08-12
SI1584685T1 (sl) 2011-07-29
IL137442A0 (en) 2001-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20002869A3 (cs) Deriváty antigenů asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro přípravu fúzních proteinů a prostředků pro vakcinaci
ES2367998T3 (es) Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación.
MXPA00007677A (en) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
HK1093521B (en) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
HK1033838B (en) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
HK1083026B (en) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, used for the preparation of fusion proteins with t-helper epitopes and of compositions for vaccination
HK1093522B (en) A process for the purification or production of a mage protein
PL203658B1 (pl) Bia lko fuzyjne zawieraj ace antygen kodowany przez rodzin e genów MAGE oraz jego zastosowanie, sekwencja kwasu nukleinowego i jego zastosowanie, wektor, komórka gospodarza i szczepionka
PL203645B1 (pl) Pochodna antygenu zwi azanego z nowotworem z rodziny MAGE i jej zastosowanie, sekwencja kwasu nukleinowego i jego zastosowanie, wektor, komórka gospodarza, szczepionka, sposób oczyszczania bia lka MAGE albo jego pochodnej, oraz sposób wytwarzania szczepionki

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20150202