SA99200126B1 - لقاحـات - Google Patents

Abstract

الملخص: يتعلق هذا الاختراع ببيروتينات جديدة - بإنتاجها ، من فصيلة MAGE المندمج بشريك اندماج مناعي مثل البروتين الشحمي D Lipoprotein ، ويمكن صياغة مولدات المضادات المذكورة لتقديم لقاحات لعلاج مجموعة من الأورام tumours ، وأيضا تقدم طرق جديدة لتنقية بروتينات MAGE .

Description

لقاحات الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق هذا الاختراع بمشتقات بروتينية ؛ تشتمل على مولد مضاد مصاحب لورم ‎«tumour‏ يُستخدم في العلاج اللقاحي للسرطان ‎٠ cancer‏ وبالتحديد ؛ تتضمن مشتقات الاختراع بروتينات إندماج تشتمل على مولد مضاد يشفر له بواسطة عائلة مورثات ‎MAGE‏ © ( مثلاًء؛ 3- ‎MAGE‏ ؛ 1 - ‎(MAGE‏ يرتبط بشريك إندماج مناعي يقدم ابيتوبات ‎Mie ةدعاسم epitopes T‏ الشكل المدهن من البروتين ‎protein D‏ من الهيموفيلاس إنفلونزي ‎haemophilus influenzae B‏ لبروتينات ‎MAGE‏ المحورة كيميائياً ‎Cua‏ يجرى إختزال جسور ثنائي الكبريتيد بمولد المضاد وإعاقة مركبات الثيول وتزويد بروتينات ‎MAGE‏ المحورة ‎Ws‏ ببطاقة ألفة و / أو تحويرها وراثياً لمنع تكون جسر ثائي الكبريتيد٠‏ وتوصف أيضاً ‎٠‏ طرق لتنقية بروتينات ‎y MAGE‏ ولصياغة لقاحات لعلاج مجموعة من أمراض السرطان ؛ ‎(Jods‏ على سبيل المثال لاالحصر ؛ الورم القتاميني ‎Melanoma‏ ؛ سرطان القدي 41+ المثانة ‎bladder‏ ؛ الرئة ‎oil i NSCLC « lung‏ وسرطان الخلايا الحرشفية ‎Spuamous cell carcinoma‏ ؛ سرطان القولون ‎colon carcinoma‏ وسرطان المرئ ‎. oesophagus carcinoma ‏على‎ MAGE ‏غالباً يعبر عن مولدات المضاد التي يشفر لها بواسطة عائلة المورثات‎ vo ‏وبعض‎ malignant melanoma ‏خلايا الورم القتاميني ( ويتضمن الورم القتاميني الخبيث‎ ‏سرطان الرئة غير صغير الخلايا ) وسرطان‎ NSCLC ‏أنواع السرطان الأخرى وتتضمن‎ ‏؛ سرطان الخلايا الانتقالية‎ Spuamous cell carcinoma ‏الخلايا الحرشفية بالرأس والعنق‎ ‏؛ ولكنه‎ oesphagus carcinoma ‏وسرطان المرئ‎ transitional cel carcinoma ‏بالمثانة‎ ‎¢ ‏جوجلر‎ ( placenta ‏والمشيمة‎ testis ‏للكشف في الأنسجة السليمة خلاف الحضية‎ JE ‏غير‎ ٠ ‏من‎ 96 14 MAGE -3 ‏ويعبر عن‎ ١) 1390 ‏؛ وينانتس ¢ 13435 ؛ باتارد ؛‎ ٠54

NSCLC ‏؛ ويمكن أيضاً الكشف عنه في ££ % من‎ ) ١9945 ‏الأورام القنامينية ( جوجلر ؛‎ ‏)؛ 48 96 من سرطان الخلايا الحرشفية بالرأس والعنق + 4 96 من‎ ١94848 + ‏يوشيماتسو‎ ( ‏من سرطان القولون‎ 96 YY ‏من سرطان المرئ ؛‎ 96 OY ‏سرطان الخلايا الإنتقالية بالمثانة ؛‎ v

¢ ‏اينوي‎ « ) ١94526 « ‏فان بل‎ ( breast cancer ‏من حالات سرطان الثدي‎ % YE ‏و‎ colon ‏وتعرف أنواع السرطان التي تعبر عن‎ ١) 1997 ‏؛ فوجي 19397 ؛ نيشيمورا ؛‎ ١105

بروتينات ‎MAGE‏ بالأورام المصاحبة ل ‎٠ MAGE‏ لقد جرى بصورة رائعة توضيح التوليد المناعي لخلايا الورم القتاميني البشسري ‎melanoma ©‏ في تجارب باستخدام مستنبتات مختلطة من خلايا الورم القتاميني والخاديا الليمفاوية الذاتية ‎٠‏ وتقوم هذه المستنبتات ‎We‏ بتوليج خلايا ليمفاوية '1 نوعية سامة خلوياً ‎(CTLs )‏ قادرة على تفكيك خلايا الورم القتاميني الذاتي حصرياً ولكنها لا تفكك الجذعات الليفية الذاتية أو الخلايا اللمفاوية 3 الذاتية المحمولة بواسطة ‎EBV‏ ( كنوث ؛ ‎١984‏ ؛ أنيشيني ‎١ ) ١97 ٠‏ وقد تم الآن تحديد العديد من مولدات المضاد المتعرف عليها على خلايا الورم

٠ MAGE ‏المذكورة ؛ متضمنة تلك التي لعائلة‎ CTL ‏القتاميني الذاتي بواسطة مجموعات‎ ٠

ويسمى مولد المضاد الأول الذي أمكن تحديده بواسطة التعرف عليه عن طريق ‎CTLs‏ ‏معنية على خلايا الورم القتاميني الذاتي » ‎MZ 2-E‏ ( فان دن ‎١949 cad‏ ) ويشسفر له بواسطة المورثة 1- ‎MAGE‏ ( فاددن بروجين ‎١99١‏ )؛ وتقوم 01,18 الموجهة ضد ‎MZ2-E‏ بتعريف وتفكيك خلايا الورم القتاميني إيجابية ‎MZ 2 - BE‏ الذاتية وأيضاً من مرضى

٠ HLA.

A2 ‏آخرين بشرط أن يكون لتلك الخلايا سلالة‎ oe « MAGE 1 ¢ ‏مورثة وثيقة الترابط‎ ١١ ‏إلى عائلة من‎ MAGE 1 ‏تنتمي مورثة‎ « MAGE 7 « MAGE 6 « MAGE 5 «MAGE 4 « MAGE 3 « MAGE 2 ‏تقع على‎ « MAGE 12 ‏رو‎ MAGE 11 « MAGE 10 « MAGE 9 « MAGE 8 ‏إلى 85 96 في تتابع تشفيرها ( دي بلاين ؛‎ TE ‏وتشترك مع بعضها في تماثئل من‎ X ‏الصيغي‎ ‎« MAGEA 3 « MAGEA 2 « MAGEA 1 ‏وهي تعرف أحيانا ب‎ + ) 1995400٠ « MAGEA 8 «MAGEA 7 MAGEA 6¢MAGEA : MAGEA 4 ٠ (MAGEA ‏عائلة‎ ( MAGEA 12 « MAGEA 11 « MAGEA 10 « MAGEA 9 ٠ ‏رغم ترابطها الأبعد‎ JMAGE ‏وتشكل مجموعتان أخريان من البروتينات جزءٌ من عائلة‎ ( MAGE Bl « MAGE B ‏رتتضمن عائلة‎ ٠ MAGE C ‏ر‎ MAGE B Ue sane ‏وهما‎ ‎MAGE ‏ب‎ Lad ‏يعرف‎ ( MAGE B2 « (DAM 10 ‏و‎ MAGE Xpl ‏يعرف أيضا ب‎ Yo « MAGEC ‏وحالياً تتضمن عائلية‎ - MAGE B4 ‏و‎ MAGE B3 « ( DAMS ‏و‎ XP2 ‏بإحتوائه على‎ MAGE ‏وبصفة عامة ؛ يمكن تعريف البروتين‎ ٠ MAGEC2 ‏و‎ MAGECI

¢ رمز تتابع مركزي يقع نحو النهاية الطرفية - © للبروتين ( مثلاً « بالنسبة ل ‎MAGE Al‏ بروتين به 709 حمض أميني ؛ يتفق الرمز المركزي مع الحمض الأميني 1455 - 779 ‎١)‏ ‏وهكذا © يوصف النمط المركزي كما يلي حيث ‎X Jas‏ على أي حمض أميني ويجرى فقط البقيات غير الإستهلالية ( يسمح بأشكال مغايرة تقليدية ) ويجرى حُفظ البقيات ‎٠‏ الإستهلالية؛ رمز التتابع المركزي ‎LuxvL (2x) I g (2x) apEExiWexl (2x) m (3-4x) Gxe (3- 4x) gxp (2x)‏ ‎11١ (3x) Vex YLxYxqVpxsxP (2x) yeFLWGprA (2x) Et (3x) Kv‏ البدائل التقليدية معروفة جيداً وتعد بصفة عامة كقوالب الإحراز المفترضة في برامج بن تراصف التتابعات بالحاسب ‎٠ SY‏ وتتضمن هذه البرامج ‎PAM250‏ ) دايهوفت ‎٠ ol‏ أوه ‎٠‏ ‏وأخرون ) ‎YAVA‏ ( م" نموذج لتغيرات نشوئية في البروتينات + في " أطلس تتابع وتر 2 كيب البروتين " © (©) ؛ إم١٠‏ أوه٠‏ دايخوفيت ( المحرر ) » 45 - ‎«(YOY‏ المؤسسة القومية للأبحاث الطبية الحيوية ؛ واشنطن ؛ وبلوسوم 17 ( ستيفن هنيكوفت وجورجا جي ‎٠‏ هنيكوفت ‎"i ( ١7 )‏ قوالب استبدال الحمض الأميني من كتل بروتينية ! ( محاضر الأكاديمية القومية ‎٠‏ ._للعلوم - الولايات المتحدة الأمريكية ‎AS‏ ( الكيمياء الحيوية ) : 10416 = ‎٠٠0414‏ ‏وبصفة عام ‎٠‏ الاستبدالات داخل المجموعات ‎aul)‏ هي استبدالات تقليدية ¢ ولكن الإستبدالات بين المجموعات تعتبر غير تقليدية ‎٠‏ المجموعات هي : ‎glutamnine / glutamate | asparagine/ Asparate )١‏ ؟) ‎threonine Serine‏ ‎Agrinine | Lysine (¥ Ya‏ ‎tryptophane / tyrosine / Phenylalanine (¢‏ ‎methionine / valine / isoleucine / Leucine (©‏ ‎alanine / Glycine (1‏ وعموماً ؛ في سياق هذا الاختراع يكون بروتين ‎MAGE‏ متماثلاً ‎5٠‏ % تقريباً في ‎Yo‏ هذه المنطقة امركزية مع الأحماض الأمينية ‎١95‏ إلى 74" في ‎٠ MAGE Al‏

وقد جرى تحديد عدة إبيتوبات ‎CTL‏ على البروتين 3- ‎٠ MAGE‏ أحد تلك الإبيتوبات ؛ 1- ‎MAGE‏ ؛ هو تتابع ببتيدي تساعي يقع بين الأحماض الأمينية متاو ‎١7١‏ ‏في البروتين 3- ‎MAGE‏ الذي يشكل ابيتوباً نوعياً ل ‎CTLs‏ عند التقديم بمصاحبة الجزيئ ‎HLA Al‏ في الفئة ‎١‏ من ‎٠ MHC‏ وجرى حديثاً تحديد إبيتوبين ‎CTL‏ إضافيين على التتابع ° الببتيدي للبروتين 3- ‎MAGE‏ بواسطة قدرتهما على تركيب استجابة ‎CTL‏ في مشتت مختلط من خلايا الورم القتاميني والخلايا الليمفاوية الذاتية ‎٠‏ هذان الأبيتوبان لهما موتيفات إرتباط نوعية لسلالتي ‎HLA.

A2‏ (فان ون بروجين + ‎٠146‏ و ) 4 . ‎HLA‏ هيرمان ¢ ‎١ 441‏ ( ¢ على التوالي ‎٠‏ ‏الوصف العام للإختراع ‎٠١‏ يقدم هذا الاختراع مشتقات البروتين ‎٠ MAGE‏ تلك المشتقات مناسبة للإستخدام في صياغات اللقاحات العلاجية المناسبة لعلاج ‎Ae gana‏ من أنواع الأورام ‎tumours‏ . ‎١‏ لوصف التفصيلي في أحد تجسيدات هذا الاختراع ‘ المشتق هو بروتينات إندماج تشتمل على مولد مضاد من عائلة البروتين ‎MAGE‏ مرتبط بشريك متخالف ‎heterologus partner‏ + ويمكن أن ‎٠‏ تكون البروتينات مقترنة كيميائيا ؛ ولكن يُفضل التعبير عنها كبروتينات إندماج معاد تكوينها مما يسمح بإنتاج مستويات أعلى في منظومة تعبير بالمقارنة ببروتين غير مندمج ‎٠‏ وهكذا ؛ يمكن لشريك الإندماج أن يساعد في توفير إبيتوبات 1 مساعدة ( شريك إندماج مناعي ) ؛ ‎Jats‏ ‏إيبيتوبات ‎T‏ مساعدة يتعرف عليها البشر ؛ أو يساعد في التعبير عن البروتين ( معزز تعبير ) بإنتاجيات أعلى من البروتين الأصلي المعاد تكوينه ‎duals ٠‏ أن يكون شريك الإندماج كل من ‎Ye‏ شريك إندماج ‎elie‏ وشريك تعزيز للتعبير ‎٠‏ ‏وفي شكل مفضل للإختراع ¢ يُشتقء شريك الإندماج المناعي من البروتين ‎D‏ »وهو بروتين سطحي للبكتير سالب - جرام ؛ الهيموفيلاس إننفلونزي ‎haemphilus influenzae B‏ ( براءة الإختراع الدولية رقم 18973 ( )4( ‎٠‏ وَيُفضل أن يشتمل مشتق البروتين ‎D‏ على الثلث الأول تقريباً من البروتين ؛ وبالتحديد الأحماض الأمينية ‎١١١ = ٠٠١‏ الأولى تقريباً ‎Yo‏ بالطرف - ]1 ‎٠‏ وِيُفضل تدهن مشتق البروتين ‎٠ D‏ ويُفضل إدماج البقيات ‎٠١5‏ الأولى بشريك إندماج البروتين الدهني ‎D‏ على الطرف - ‎N‏ لتوفير مولد المضاد المرشح للقاح مع إبيتوبات خلية ‎T‏ خارجية إضافية وزيادة مستوى التعبير في ي - كولاي ( وبذلك يعمل أيضاً

< كمعزز للتعبير ) ‎٠‏ ويضمن الذيل الدهني أمثل تقديم لمولد المضاد إلى خلايا تقديم مولد المضاد ‎v‏ ‏ويتضمن شركاء الإندماج الآخرون البروتين غير التركيبي من فيروس الإنفلونزي ؛ ‎NS 1‏ ( المخثر الدموي ) ‎٠‏ ونموذجياً ؛ تستخدم الأحماض الأمينية ‎AY‏ الطرفية ‎eyo N=‏ © أنه يمكن استخدام قطع مختلفة بشرط أن تتضمن إبيتوبات ‎epitopes T‏ المساعدة؛ وفي تجسيد آخر ؛ شريك الإندماج المناعي هو البروتين المعروف ب- 17718 ‎٠‏ ‏ويُفضل استخدام الجزء الطرفي ‎C=‏ من الجزيئ ‎٠‏ ويُشتقء ‎LYTA‏ من المكور السبحي للإلتهاب 555( ‎streptococcus pneumoniae‏ الذي يقوم بإصطناع أميداز ‎N amidasee‏ - اسيتيل - ,1 - ألانين ؛ أميداز ‎DYTA‏ المشفر عنه بواسطة المورثة ‎LytA‏ } المورثة ؛ 7 ‎)١1453( ٠‏ صفحات ‎YVY - Yo‏ )مفكك ذاتي يقوم بالتحديد بتفكيك روابط معينة في هيكل الببتيدوجليكان ‎٠ peptidoglycan‏ المنطقة الطرفية - © بالبروتين ‎LYTA‏ مسئولة عن الألفة بالكولين أو ببعض أشباه الكولين ‎DEAE (ie‏ + وقد جرى إستغلال هذه الخصيصة لتطوير بلازميدات تعبر عن ‎LYTA‏ - © بائي + كولاي ‎Coli‏ .15 مفيدة للتعبير عن بروتينات إندماج٠‏ وقد وصفت تنقية البروتينات الهجينية التي تحتوي على القطعة 1.71/8 - 0 عند ‎٠‏ طرفها الأميني ( التقنية الحيوية : ‎)١997( © ٠١‏ صفحات 795 - 798 ) ‎٠١‏ وكما أستخدم هنا يُستخدم تجسيد مفضل الجزء التكراري من جزئ ‎Lyta‏ الموجود في النهاية الطرفية - 0 بدءاً بالبقية ‎٠ ١١74‏ ويتضمن شكل مفضل بصفة خاصة البقيات ‎١8‏ - 6م . شركاء الإندماج المناعي المذكور أعلاه لهم فائدة أيضاً للمساعدة في التعبير ‎٠‏ ‏وبالتحديد ؛ يعبر عن تلك الأندماجات بإنتاجية أعلى من بروتينات ‎La MAGE‏ المعاد ‎Ye‏ تكوينهاء وقد ظهر في جلسة سريرية ؛ بواسطة أصحاب هذا الاختراع ؛ أن تلك التركيبات قادرة على علاج الورم القتاميني ‎٠‏ وفي ‎aa]‏ الحالات ؛ إختفت الإنبثاثات من مريض ورم قتاميني - المرحلة ؛ بعد جرعتين من البروتين ‎Y/Y MAGE 3 His‏ (1 الدهني غير المساعد ‎+unadjuvanted‏ ‎Yo‏ ووفقاً لذلك ؛ يقدم هذا الاختراع في تجسيد بروتينات إندماج تشتمل على مولد مضاد مصاحب للورم من عائلة ‎MAGE‏ مرتبط بشريك إندماج مناعي ‎٠‏ ويُفضل أن يكون شريك الإندماج المناعي هو البروتين ‎D‏ أو قطعة منه ؛ والأفضل البروتين الدهني ‎dally ٠ D‏ أن

تكون بروتينات ‎MAGE‏ هي ‎MAGE Al‏ أر ‎dually + MAGE A3‏ أن يشتمل جزء البروتين الدهني (1 على الثلث الأول من البروتين الدهني 1 ‎٠‏ ‏يفضل التعبير عن بروتينات هذا الاختراع في ئي ‎٠‏ كولاي ‎٠١ 18. Coli‏ وفي تجسيد مفضل ؛ يعبر عن البروتينات مع رقعة ألفة ؛ مثلاً ؛ ذيل هيستيدين يشمل بين # إلى 4 ؛ 0 ويفضل ‎١‏ بقيات هيستيدين ‎٠‏ وهي مفيدة في مساعدة التنقية ؛ يقدم هذا الاختراع أيضاً حمض نووي يشفر لبروتينات هذا الاختراع ‎٠‏ ويمكن أقحمام تلك التتابعات ناقل تعبير مناسب واستخدامها لتلقيح ‎DNA / RNA‏ أو التعبير في عائل مناسب ‎٠‏ ‏ويمكن استخدام الناقلات الميكروبية المعبرة عن الحمض النووي كلقاحات ‎٠‏ وتتضمن ‎٠‏ تلك الناقلات ؛ ‎Mie‏ « فيروس الجدري ‎poxvirus‏ ؛ الفيروس الغدي ‎adenovirus‏ ؛ الفيروس ‎alphavirus Ll‏ ؛ الليستيريا ‎listeria‏ والبلعم الأحادي 1202002011886 . يمكن إصطناع تتابع ‎DNA‏ يشفر لبروتينات هذا الاختراع باستخدام أساليب اصطناع ‎DNA‏ التقليدية ؛ ‎Se‏ بالربط الإنزيمي كما وصفه دي٠‏ إم ‎٠‏ روبرتس وأخرون ف الكيمياء الحيوية مفكن ‎(YE‏ لكر حلحى. مف بالإصطناع الكيمياتي ‘ بالبلمرة | لإنزيمية خارج الجسم ؛ أو بتقنية ‎PCR‏ بإستخدام ؛ ‎Sa‏ ؛ بوليمراز مستقر بالحرارة ؛ أو بواسطة مجموعة من هذه الأساليب ‎٠‏ ‏ويمكن إجراء البلمرة الإنزيمية ل ‎DNA‏ خارج الجسم باستخدام بوليمراز ‎٠- DNA‏ ( قطعة كليناو ) في منظم ملام يحتوي على ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيدية ‎dCTP « dATP‏ ‎dGTP ٠‏ ؛ 2111 كما هو مطلوب في درجة حرارة ‎ca TY = ٠١‏ عموماً في حجم ‎ov‏ ‎٠‏ ميكرولتر أو أقل ‎٠‏ ويمكن إجراء الربط الإنزيمي لقطع ‎DNA‏ بإستخدام ليجاز ‎Jie DNA‏ ليجاز ‎DNA‏ 14 في منظم ملاثم ¢ ‎Sia‏ 00 + مولاري تريس ) الرقم الهيدروجيني رلا ( ¢ ١١ر٠‏ مولاري ‎MgCl‏ « ٠١ر١‏ مولاري ثنائي ‎Jad‏ ثيول ؛ ‎١‏ مل مولاري سبيرميدين ؛ ‎١‏ ‏مل مولاري ‎ATP‏ و ١ر١‏ مجم / مل ألبومين مصل بقري ؛ في درجة حرارة من 4 أم إلى درجة الحرارة المحيطة ؛ بصفة عامة في حجم ‎٠٠‏ مل أو أقل ‎٠‏ ويمكن إجراء الاصطناع ‎Yo‏ الكيميائي لبوليمر أو قطع ‎DNA‏ بواسطة الكيمياء التقليدية ‎OE‏ إستر الفوسفات ؛ الفوسفين أو الفوسفوراميديث ؛ باستخدام أساليب الطور الصلب مثل تلك الموصوفة في " الاصطناع الكيميائي والإنزيمي لقطع المورثات - ‎dda‏ معملي ' ( المحرر إتش ‎٠‏ جي ‎٠‏ جاسين وليه ‎٠‏

A

٠ ‏نشرات غلمية أخرى ؛ مثلاً ؛ إم جي‎ lc (VAAY) ‏فيرلاج كيمي ؛ فينيا‎ ١ ) ‏لاتج‎ ‏سي؛‎ ٠ ‏سينج ؛ بي إس٠ سبروت ؛ و آر‎ ٠ ‏ماثيين ؛ إم‎ ٠ يد٠ ‏جايت ؛ إتش - دبليو‎ ٠ ‏إس سروت ودبليو‎ ٠ ‏تيتماس ؛ أبحاث الأحماض النووية ؛ 1447 10 1749 ؛ بي‎ ٠ ‏إتش‎ ٠ ‏ماتو شي وإم‎ ٠ ‏جي‎ ٠ al ¢ OYYY «YE ‏امكل‎ ٠ ‏بانورث ؛ الرسائل الرباعية‎ ٠ oa ٠ als ‏ماتوشقي‎ ٠ ‏دي‎ ٠ ‏كاروثرز ¢ الرسائل الرباعية مفخحقل لكت حخكا3ك م‎ 8 ‏أوامز‎ ٠ ‏بي‎ ٠ ‏؛ إس‎ 2١85 CNY 1441 ‏كاروثرز ؛ مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية ؛‎ ‘ ‏سنيها‎ ٠ ‏صنل لتك إن دي‎ VAAY ‏مجلة الجمعية الكيميائيمة الأمريكية‎ CsA

YY ¢ YAAE ‏كولستير ¢ أبحاث الأحماض النووية »م‎ ٠ ‏ماك مانوس وإتش‎ ٠ ‏بيرنات ¢ جي‎ ٠ ‏جى‎ ‏مجلة المنظمة الأوربية لعلم الأحيا ع‎ Osa ‏ماتس‎ ٠ ‏دي‎ ٠ ‏دبليو‎ ٠ UA) ¢ ¢ 2 q 4

CAYO CYAN « EMBO ‏الجزيئي‎ Ve ‏ويمكن إجراء طريقة الإختراع بواسطة أساليب إعادة التكوين التقليدية مثلاً . كما وصف‎ ‏دليل معملي ؛‎ - molecular cloning ‏في مانيايتس وآخرون » الاستنساخ الجزيئي‎ ٠ ١484 = 1487 ‏كولدسبرتج هاربور ؛‎ : ‏وبالتحديد ؛ يمكن أن تشتمل الطريقة على خطوات‎ ‏تحضير ناقل تعبير متكامل أو يمكن نسخة قادر ¢ في خلية عائلة ¢ على التعبير عن بوليمر‎ ١ yo ‏يشفر للبروتين أو مشتق‎ nucleotide sequence ‏يشتمل على تتابع نيوكليوتيدي‎ DNA ¢ Ala ‏مناعي‎ ‏تحويل خلية عائلة بواسطة الناقل المذكور‎ (Y

DNA ‏استنبات الخلية العائلة المحمولة المذكورة تحت ظروف تسمح بالتعبير عن بوليمر‎ (v ‏لإنتاج البروتين المذكور ؛ و‎ Sys Te ٠. ‏استرداد البروتين المذكور‎ (€ ‏ويمكن تحقيق‎ ٠ Alle ‏غريب إلى خلية‎ DNA ‏تقديم‎ ind ‏يُستخدم المصطلح " تحويل ' هنا‎ ‏ذلك ؛ مثلاً ؛ بالتحويل أو الإصابة بواسطة ناقل بلازميدي أو فيروسي ملائم بإستخدام ؛ مكلا ؛‎ ‏كينجسمان وإيه؛ جي؛‎ ٠ ‏إم‎ + od ‏أساليب تقليدية كما وصف في الهندسة الوراثية ؛ المحرران‎ ‏ويُستخدم لاحقاً‎ « YAAA ‏كينجسمان ¢ نشرات بلادكويل العلمية ¢ أوكسفورد ¢ إنجلتر‎ Yo ‏المصطلحان " محول " أو " متحول " للخلية العائلة الناتجة المحتوية على ‘ والمعبرة عن ؛‎ ‏المورثة الغريبة المعنية؛‎

ناقلات التعبير جديدة وتشكل أيضاً جزءً من الاختراع؛ ويمكن تحضير ناقلات التعبير القابلة للنسخ وفقاً للإختراع ؛ بإنشقاق ناقل متوافق مع الخلية العائلة لتوفير قطعة ‎DNA‏ خطية لها ناسخ سليم ¢ وجمع القطعة الخطية المذكورة مع واحد أو أكثر من جزئيات ‎DNA‏ التي تشفر ؛ مع القطعة الخطية المذكورة ؛ للمنتج المرغوب؛ © مثل بوليمر ‎DNA‏ المشفر لبروتين الاختراع ؛ أو مشتقاته . تحت ظروف الربط؛ وهكذا ؛ يمكن التكوين المسبق لبوليمر ‎DNA‏ أو تكوينه خلال تركيب الناقل ‏ حسب الرغبة؛ ويتحدد اختيار الناقل ؛ جزئياً ؛ بواسطة الخلية العائلة ؛ التي يمكن أن تكون مبكرة التنوي أو سليمة التفوي ؛ ولكن تفضل خلايا ني + كولاي ‎E.Coli‏ أو ‎٠ CHO‏ وتتضمن الناقلات المناسبة ؛ البلازميدات ‎٠‏ البلاعم البكتيرية ‎bacteriophages‏ ؛ الكوزميدات ‎٠‏ والفيروسات المعاد تكوينها ‎recombinant viruses‏ + ويمكن إجراء تحضير ناقل التعبير القابل للنسخ ؛ تقليدياً ¢ بواسطة الإنزيمات الملائمة لتقييد وبلمرة وربط ‎DNA‏ « بواسطة إجراءات موصوفة ¢ ‎Mia‏ ‘ في مانياتيس وأخرون ¢ المذكور أعلاه ‎٠‏ ‏يتم تحضير الخلية العائلة المعاد تكوينها ؛ وفقاً للإختراع ؛ بتحويل خلية ‎Alle‏ بواسطة ‎Ve‏ ناقل تعبير قابل للنسخ لهذا الاختراع تحت ظروف التحويل ‎٠‏ ظروف التحويل المناسبة تقليدية وتوصفاء ‎Sie‏ ¢ في مانياتيس وآخرون ¢ المذكور أعلاه ¢ أو إستتساخ ‎"DNA‏ ¢ الجز ع ¥ ¢ دي ‎٠ al ٠‏ جلوفر ¢ المحرر ¢ مطبعة ‎IRL‏ المحدودة » مك ويتحدد اختيار ظروف التحويل بواسطة الخلية العائلة ‎٠‏ وهكذا ؛ يمكن معالجة خلية بكتيرية ‎Jie‏ ئي ‎٠‏ كولاي ‎BE.

Coli‏ بواسطة محلول من ‎CaCly‏ ( كوهين وآخرون ؛ محاضر ‎٠‏ الأكاديمية القومية للعلوم ؛ 601977 18 0 ‎7١٠١‏ ) أو محلول يشتمل على خليط من ‎ROCI‏ ¢ 21002 ؛ خلات البوتاسيوم والجليسيرول ؛ ثم بواسطة حمض * -[ ]1 - مورفولينو ] - بروبان = السلفونيك ؛ ‎RDC‏ والجليسيرول ‎٠‏ ويمكن تحويل الخلايا الثديية في المستنبت بواسطة ترسيب الكالسيوم المشترك ل ‎DNA‏ للناقل على الخلايا ‎٠‏ ويمتد الاختراع ‎Lad‏ إلى خلية عائلة محولة بواسطة ناقل تعبير قابل للنسخ لهذا الاختراع؛ ‎Yo‏ ويجرى استنبات الخلية العائلة المحولة تحت ظروف تسمح با ‎A‏ لتعبير عن بوليمر ‎DNA‏ « تقليدياً كما وصف مثلاً في مانياتيس وآخرون و " استتساخ ‎"DNA‏ المذكور أعلاه ؛ وهكذا ؛ يُفضل تزويد الخلية بمادة مغذية واستنباتها في درجة حرارة أقل من 0 # ‎va‏

Yo ‏ويجرى إسترداد المنتج بواسطة طرق تقليدية وفقاً للخلية العائلة ووققاً لموقع منتج‎ ‏وهكذا ¢ عندما‎ ١) ‏التعبير ( داخل الخلايا أو يتم إفرازه في وسط الإستنبات أو في جبلة الخلية‎ ‏كولاي ؛ يمكن مثلا تفكيكها فيزيائياً أو كيميائياً أو‎ ٠ ‏تكون الخلية العائلة بكتيرية ؛ مثل ني‎ ‏وعندما تكون الخلية العائلة ثدية ؛ يمكن‎ ٠ ‏إنزيمياً وعزل المنتج البروتيني من ناتج التفكك‎ ‏وتتضمن‎ ٠ ‏بصفة عامة عزل المنتج من الوسط التغذوي أو من المستخرجات الخالية من الخلايا‎ ٠ ‏الأساليب التقليدية لعزل البروتين الترسيب الإنتقائي ؛ التحليل الكروماتوجرافي الإمتزازي ؛‎ ٠ ‏والتحليل الكروماتوجرافي بالالفة المتضمن عمود ألفة جسم مضاد وأحادي النسخ‎ ‏وتقدم بروتينات هذا الاختراع إما قابلة للذوبان في صورة سائلة أو في صورة مجنفة‎ ٠ ‏بالتجميد‎ ‏ميكروجرام مسن‎ ١ «١ ٠ ‏إلى‎ ١ ‏ويتوقع بصفة عامة أن تشمل كل جرعة بشرية من‎ ye. ٠ ‏ميكروجرام‎ y ve — ‏و لإ‎ 1 Lia & 4 4 ‏البروتين‎ ‏ويقدم هذا الاختراع أيضا مستحضر صيدلي يشتمل على بروتين لهذا الاختراع في‎ ‏ويشتمل مستحضر لقاحي مفضل على البروتين الدهني‎ ٠ ‏مقبول صيدليا‎ gsm ‏ويمكن إختياريا أن يحتوي ذلك اللقاح على واحد 0 أكثر من‎ ٠ ‏على الأقل‎ ‘ MAGE-3-D ‏و‎ MAGE ‏مثلاً ؛ أعضاء أخرى تنتمي لعائلات‎ ٠ ‏المضاد الأخرى المصاحبة للورم‎ clipe 10 ‏أو‎ GAGE-1 « MAGE-1 ‏وتتضمن مولدات المضاد الأخرى المصاحبة للورم‎ + GAGE . tyrosinase ‏بروتينات التيروسيناز‎ ‏ويوصف تحضير اللقاح بصفة عامة ؛ في تصميم اللقاح ) 8 طريقة الوحدة الفرعية‎ ‏مطبعة بلينيوم ؛‎ (1490) ) ٠يج‎ val ‏إف و نيومان‎ val ‏وأعادة المساعدة " ( المحرران باول‎ ‏نيويورك )؛ ويوصف التغليف داخل الليبوسومات بواسطة فوللرتون ؛ براءة الاختراع الأمريكية‎ ٠ “١ OY Yo AVY ‏رقم‎ ‏وتتضمن المواد‎ vg SAY ‏ويُفضل إلحاق بروتينات هذا الاختراع في صياغة لقاح هذا‎ aluminium hyroxide ‏المساعدة المناسبة ملح ألومينيوم مثل هلام هيدروكسيد الألوميتيوم‎ ‏ولكن يمكن أيضاً أن يكون ملح‎ « aluminium phosphate ‏الشب ) أو فوسفات الألومينيوم‎ ( tyrosine ‏كالسيوم ؛ حديد ؛ أو زنك أو يمكن أن يكون معلقاً غير قابل للذوبان من التيروسين‎ YO ‏المؤسيل ؛ أو السكريات المؤسيلة ؛ السكريات العدادية المشتقة كاثيونياً أو أنيونياً ؛ أو عديبدات‎ oligonucleotides ‏وتتضمن مواد مساعدة معروفة أخرى الأوليجونيو كليوتيدات‎ ٠ ‏الفوسفازين‎

١١ ‏غير مميثل‎ CpG ‏وتتميز الأوليجونيوكليوتيدات بأن ثنائي النيوكليوتيد‎ ٠ CpG ‏المحتوية على‎ ‏لاختراع الدولية رقم‎ ١ ‏في براءة‎ Sia ‏تلك الأوليجونيوكليوتيدات معروفة جيداً وتوصف‎ ٠ ١ / +Yooo ‏وفي صياغة هذا الاختراع ؛ يُفضل أن يقوم المستحضر الملحق بحث استجابة مناعية‎

A ‏وتتضمن الأنظمة المساعدة المناسبة ؛ مثلاً ؛ مجموعة من الدهن‎ ٠ THI ‏تفضيلية للنوع‎ © ‏أحادي‎ A ‏الدهمن‎ Jails ‏؛‎ monophosphoryl lipid A ‏أحادي الفوسفوريل‎ ‏مع ملح ألومينيوم ؛ وتقوم‎ ) 31 - MPL ) ‏أسيل‎ = O ‏المنزوع‎ =F ‏الفوسفوريل‎ ‎٠ 111 1 ‏تفصيليا بحث استجابة‎ CpG ‏الأوليجونيوكليوتيدات‎ ‏أحادي الفوسفوريل ومشتق صابونين‎ A ‏ويتضمن نظام معزز مجموعة من الدهن‎ ‏كما شرح في براءة الاختراع‎ 3D - MPL ‏؛ بالتحديد مجموعة من 21 05 و‎ 5800010 ٠ ‏بواسطة‎ QS 21 ‏؛ أو مستحضر أقل تفاعلاً حيث يتم إخماد‎ 94 / 0٠67 ‏الدولية رقم‎ ٠ 36/770774 ‏الكوليستيرول كما شرح في براءة الإختراع الدولية رقم‎ 3D - MPL QS 21 ‏خاصة تتضمن‎ Gi ray ‏وتوصف صياغة مساعدة فعالة‎ ‏من مستحلب زيت في ماء في براءة الاختراع الدولية رقم‎ tocopherol ‏والتوكوفيرول‎ ‏وهي صياغة مفضلة؛‎ qe / ٠ ١ ‏وتبعاً لذلك ؛ يقدم في أحد تجسيدات هذا الاختراع لقاح يشتمل على بروتين لهذا‎ ‏الملحق بواسطة‎ MAGE -3 - ) ‏أو مشتق منه‎ ( D ‏الاختراع ؛ والأفضل البروتين الدهني‎ vie ‏أحادي الفوسفوريل أو مشتق‎ A ‏الدهن‎ ‎٠ 058 21 ‏ويُفضل أن يشتمل اللقاح إضافياً على صابونين ؛ والأفضل‎ ‏أ ويُفضل أن تشتمل الصياغة إضافياً على مستحلب زيت في ماء والتوكوفيرول٠ ويقدم‎ ‏طريقة لإنتاج صياغة لقاح تشتمل على خليط بروتين لهذا الاختراع مع‎ Lad ‏هذا الاختراع‎ ٠ 3D - MPL Jie ‏سواخ مقبول صيدليا ؛‎ ‏منتج بإعادة‎ MAGE ‏بروتين‎ dil ‏في أحد جوانب هذا الاختراع ؛ تقدم طريقة‎ ‏في عامل مشوش قوي ( مثلا البولينا ؛‎ Dia ‏وتشتمل الطريقة على تذويب البروتين ؛‎ ٠نيوكتلا‎ ‏البروديسيل‎ = BB ‏إمبيلجين‎ ie ( ‏الشحنة‎ ima ‏هيدروكلوريد الجوانيدين ) أو في منظف‎ Yo ‏ثنائي ميثيل جليسين ) ؛ إختزال روابط ثنائي الكبريتيد داخل وبين جزئيات‎ - N ‏العادي - 14 ؛‎

١ ‏الاقتران المؤكسدة وتعريض البروتين‎ Bale] ‏البروتين ؛ إعاقة مركبات الثيول الناتجة لمنع‎ ٠ ‏من خطوات التحليل الكروماتوجرافي‎ ST ‏لواحدة أو‎ ‏وتتضمن تلك العوامل المعيقة ؛‎ ٠ ‏ويُفضل أن يكون العامل المعيق هو عامل مؤلكل‎ ‏حمض‎ Sie ٠ ‏الهاليدية‎ ٠ ‏على سبيل المثال لاالحصر ؛ الأحماض ألفا - الهاليدية أو أميدات ألفا‎ ( ‏د يودو الخليك واليودو أسيتاميد ؛ الذي ينتج في معالجة الكربوكسي ميثيل أو الكربوكسي أميد‎ ‏ويمكن استخدام عوامل معيقة أخرى وتوصف في‎ ٠ ‏معالجة الكرباميدو ميثتيل ) للبروتين‎ ‏نيوراث ؛ أزال ؛ هيل‎ ٠ ‏مثلاً ؛ البروتينات ؛ الجزء 7 ؛ المحررون ؛ إتش‎ Shi) ‏النشرات‎ ‏؛ أو الكوائف الكيميائية لتحوير البروتين ؛‎ ٠5776 ‏بويدر ؛ المطبعة الأكاديمية ؛‎ ٠ ‏وسي - إل‎ ١) ١85 « CRC ‏نويز ؛ مطبعة‎ - al ٠ ‏لوندبلاد وسي‎ ٠ ‏إل‎ ٠ ‏؛ المحررات أر‎ ١ ‏المحرر‎ ‏إيثيل ماليميد ؛ فوسفات كلورو‎ - N ‏وتتضمن الأمثلة النموذجية لتلك العوامل المعيقة الأخرى‎ ٠ ‏المعيق مفيد لأنه يمنع تكتل‎ Jalal) ‏إستخدم‎ ٠ ‏ميثيل أيزويوريا والأكريلو نيتريل‎ - O ‏الأسيتيل ؛‎ ‏المنتج ¢ ويضمن الثبات للتنقية اللاحقة ؛‎ ‏وفي تجسيد للإختراع ؛ تنتقى العوامل المعيقة لحث مشتق تساهمي غير عكسي ثابت‎ ‏ومع ذلك ؛ يمكن انتقاء عوامل معيقة‎ ٠) ‏هاليدية أو أميدات ألفا هاليدية‎ WE ‏(مثلاً ؛ أحماض‎ ‏أخرى بحيث يمكن ؛ بعد التنقية ؛ إزالة العامل المعيق لتحرير البروتين غير المشتق ؛ بروتينات‎ ٠ ‏وبصفة خاصة ؛‎ ٠ ‏من الاختراع‎ Lila ‏التي بها بقيات ثيول حرة مشتقة جديدة وتشكل‎ 08 ‏فإن المشتقات المعالجة بالكربوكسي أميد اوالكربوكسي ميثيل هي تجسيد مفضل للإختراع؛‎ ‏وفي تجسيد مفضل للإختراع ؛ يتم تزويد بروتينات هذا الاختراع برقعة ألفة ؛ مثل‎ ‏وفي تلك الحالات ؛ يُفضل تعرض البروتين ؛ بعد خطوة‎ ٠ ‏أو ذيل عديد هيستيدين‎ CLYTA ‏وبالنسبة لتلك البروتينات ذات زيل عديد‎ ٠ ‏الإعاقة ؛ إلى التحليل الكروماتوجرافي بالألفة‎ Ye ‏؛‎ (IMAC ( ‏الهيستيدين ؛ يمكن إجراء التحليل الكروماتوجرافي بألفة الأيون الفلزي المتبت‎ ‏؛ الحديد ؛ المغنسيوم أو‎ JS ‏ويمكن أن يكون الأيون الفلزي أي أيون مناسب ؛ مثلاً الزنك ؛‎ ‏على‎ IMAC ‏وِيُفضل أن يحتوي منظم‎ ٠ ‏النحاس ؛ ولكن يُفضل أن يكون الزنك أو النيكل‎ ‏ينتج عن ذلك مستويات‎ AN ١ ) ‏لاحقاً ؛ إمبيجين‎ ( BB ‏إمبيجين‎ Jie ‏منظف هجيني الشحنة‎ ٠ ‏منخفضة من الذيفان الداخلي في المنتج النهائي‎ Yo ‏إلى‎ Al ‏؛ يمكن تنقية البروتين بإستغلال‎ CLYTA ‏وإذا جرى إنتاج البروتين بجزء‎ ‏للإختراع ؛ تزود البروتينات بذيل عديد‎ aad ‏وفي‎ ٠ DEAE die ‏الكولين أو أشباه الكولين‎

VY

‏ويمكن تنقيتها بجدول تنقية بسيط بالتحليل‎ ٠ CLYTA ‏وجزء‎ polyhistidine tail ‏هيستيدين‎ ‎٠ ‏الكروماتوجرافي بالألفة في خطوتين‎ : ‏يلي وصف للإختراع بالإشارة إلى الأمثلة التالي‎ Lad : ١ ‏مثال‎ ‏معاد تكوينها تعبر عن بروتين الإندماج - البروتين‎ E.Coli يالوك٠‎ (JAD ‏تحضير‎ 0

MAGE -3- ) LPD 1/3 - MAGE -3- His or LpD MAGE -3- His ( - D ‏الدهني‎ ‎His ‎: ‏كولاي‎ ٠ ‏منظومة التعبير عن ني‎ -١ ‏المشفر‎ DNA ‏؛ يجرى استنساخ‎ lipoprotein D ‏من أجل إنتاج البروتين الدهني‎ ‏ويُستخدم هذا البلازميد إشارات من 1138 للبلعم‎ + pMG 81 ‏ناقل التعبير‎ JID ‏للبروتين‎ ٠ (PL ‏يحتوي الناقل على معزز لامدا‎ ٠ ‏لامدا لدفع نسخ وترجمة المورثات الغريبة المقحمة‎ ‏لتخفيف تأثيرات قطبية النسخ عند توفير‎ (NutR ‏و‎ Natl ( ‏وموؤضعي استخدام‎ OL ‏المشغل‎ ‏يتم‎ ٠ ) ٠١٠٠ : © ‏؛ علم الأحياء الجزيئي والخلوي ؛‎ ١1985 ‏البروتين ]1 (جروس وآخرون ؛‎

DNA ‏إلى عائل مولد لتفكيك ني + كولاي لتثشيت‎ PL ‏تقديم الناقلات التي تحتوي على المعزز‎ ‏لبلعم لامدا ناقص النسخ متكامل‎ DNA ‏للمفكك على‎ al gal) ‏تحتوي سلالات العائل‎ ٠يديمزالبلا‎ ١ ‏؛ في المعالجة التجريبية للتعبير عن المورثات ؛‎ ٠١587 ‏في الجينوم ( شاتزمان وآخرون ؛‎ ‏يقوم 018 لبلعم‎ ٠ ) ‏؛ المطبعة الأكادمية ؛ نيويورك‎ VE - ١ ‏إنيويا (المحرر) ؛ صفحات‎ ‏للناقل ويمنع ارتباط بوليمراز‎ OL ‏لامدا بتوجيه إصطناع البروتين القامع ]© الذي يرتبط بالقامع‎

ARS8 ‏بسلالة التعبير‎ Cl ‏بالمعزز ,آ1 ومن ثم نسخ المورثة المقحمة + تحتوي مورثة‎ RNA ‏بواسطة إزاحة درجة‎ PL ‏على طفرة حساسة للحرارة بحيث يمكن تنظيم النسخ الموجه بواسطة‎ ٠ ‏الحرارة ؛ أي تعمل الزيادة في درجة حرارة المستنبت على تثبيط القامع ويبداً إصطناع‎ ‏ويسمح نظام التعبير المذكور بالإصطناع الخاضع للتحكم للبروتينات الغريبة‎ ٠ ‏البروتين الغريب‎ : 797 ‏؛ الطبعة‎ ١981 ‏وبخاصة تلك التي يمكن أن تكون سامة للخلية ( شيماتاكا وروزنبرج ؛‎ ٠ ( ‏ا‎ ‎: AR58 E.Coli ‏؟-سلالة ني - كولاي‎ Yo ‏سلالة ني + كولاي 21858 المكونة للحوال والمستخدمة لإنتاج البروتين‎ (F-su-galk2 — LacZ —thu-) ‏هي مشتق من سلالة ئي + كولاي‎ LPD-MAGE-3-His

+" ‎—K 12 -NIH‏ 1100 وهي تحتوي على بلعم لامدا ناقص مكون للحوال ( ,11110 :: ‎galE‏ ‎IkiL- cI857 1‏ ) + يقوم النمط الظاهري - ‎Kil‏ بمنع إغلاق الاصطناع الجزيئي العياني للعائل + وتقوم طفرة 857 ]م بتقديم إصابة حساسة للحرارة إلى قامع ‎٠ Cl‏ ويعمل حذف ‎DH 1‏ على إزالة المشغل الصحيح للبلعم لامدا ومواضع العوائل ‎bio‏ « 13ت ‎٠ chIA‏ ثم © توليد السلالة 58 ‎AR‏ بتحويل 99 ]1 بواسطة كتلة بلعم لامدا أ النامية من قبل على مشتق ‎Kil - cI 857 DHI ( SA500‏ 1 , 11410 :: لقع ) جرة إنتقاء تقديم مكون الحوال الناقص إلى 99 ‎N‏ بواسطة التتراسيكلين بفضل وجود ترانسبوسون 0 111 يشفر لمقاومة التزاسيكلين في مورثة ]881 المجاورة + 1499 و 58500 هما سلالتا ني كولاي = 1612 مشتقتان من مختبر دكتور روزنبرج في المعاهد القومية الصحية ‎٠‏ ‎٠‏ *#- تكوين الناقل المصمم للتعبير عن البروتين المعاد تكوينه ‎LPD-MAGE -3- His‏ : كان الأساس المنطقي هوالتعبير عن 3 ‎MAGE‏ كبروتين إندماج باستخدام الث الطرفي ‎N‏ من البروتين المدهن (1 كشريك إندماج متصل عند الطرف آ1 من 3- ‎MAGE‏ ‏وتتابع من عدة بقيات هبستيدين (ذيل ‎(His‏ يوؤضع عند طرفه ‎٠ C=‏ البروتين ‎D‏ هو بروتين دهني ( بروتين إرتباط جلوبيولين مناعي ([ 47 كيلو دالتون ¢ ‎No‏ مكشوف على سطح البكتير هيموفيلاس إنفلونزي ‎haemophilus influenzae‏ سالب - جرام ) ‎٠‏ يتم إصطناع البروتين كتمهيد بتتابع إشارة بقية ‎VA‏ حمض أميني ؛ يحتوي على تتابع إجماع للبروتين الدهني البكتيري ) براءة الاختراع الدولية رقم ‎٠ 41١ / YAAYT‏ وعند معالجة تتابع إشارة بروتين دهني خلال الإفراز يصبح ل ‎Cy‏ ) عند الموؤضع ‎٠‏ في جزئ التمهيد ) البقية الطرفية الأمينية ويتحور بالتالي بواسطة الإرتباط التساهمي بكل ©» .من الأحماض الدهنية المرتبطة بالأستر والمرتبطة بالأميد . ثم تعمل الأحماض الدهنية المرتبطة إلى بقية السيستيين الطرفية الأمينية ‎fie‏ غشائي ‎٠‏ ‏وتم تعميم البلازميد المعبر عن بروتين الإندماج للتعبير عن بروتين تمهيدي يحتوي على تتابع الإشارة ‎VA‏ حمض أميني والبقيات ‎٠١9‏ الأولى بالبروتين 2 المعالج ؛ حمضين أمينيين غير متصلين ( ‎Met‏ و ‎(Asp‏ ؛ بقيات الأحماض الأمينية ؟ إلى ‎١٠6‏ في 3- ‎MAGE‏ ؛ بقيتين ‎Gly Yo‏ تعملان كمنطقة مفصلية للتعبير عن بقيات ‎His‏ السبع التالية ‎٠‏

١ ‏المدهن المعالج‎ His ‏وهكذا تقوم السلالة المعاد تكوينها بإنتاج بروتين الإندماج بالذيل‎ ‏؛ مع تتابع الحمض الأمين الموصوف في‎ ) ١ ‏بقية حمض أميني ( أنظر الشكل‎ €FY ‏وطوله‎ ‎CY ‏وتتابع التشفير الموصوف في التعريف رقم‎ ١ ‏التعريف رقم‎ ‏الناقل‎ ( LPD - MAGE -3- His ‏؛- خطة الاستنساخ لتوليد بروتين الإندماج‎ : ( pRIT144 77 ° ‏من دكتور ثييري بون من معهد لورفيج ) يحتوي‎ ( © DNA ‏جرى استخدام بلازميد‎ ‏والناقل‎ ١ 5 5 ¢ ¢ ‏جوجلر بسي وأخرون‎ ) MAGE -3 ‏على تتابع التشفير لمورثة‎ ‏محضر‎ ( Lipo - [( - 1/3 ils ‏المحتوي على الجزء الطرفي تتابع‎ .+. 6 ١) 9 ‏وتضمن خطة الاستنساخ الخطوات التالية ( الشكل‎ ٠ (Y ‏كما هو موضح في الشكل‎ ‏البلادزميدي باستخدام المنطقي‎ MAGE 3 - cDNA ‏للتتابعات المقدمة في‎ PCR ‏تضخيم‎ ) To : ‏النيوكليوتيدي‎ ‎5 ‏عع‎ gee ‏عاد‎ gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct ‏واللامنطقي النيوكليوتيدي‎ 5' ‏عع‎ tet aga tta ‏عاد‎ gtg atg gtg ‏علد‎ gtg atg acc gee ctc tte cee cte tet caa ‏ويؤدي هذا التضخيم إلى التحورات التالية عند الطرف الل تغيير الروامسز الخمس‎ Vo ١ ‏عند الموضع‎ Asp ‏برامز‎ Pro ‏كولاي ؛ استبدال الرامز‎ ٠ ‏الأولى إلى استخدام رامز ئي‎ ‏متبوعاً‎ His V ‏والرامز‎ Gly ‏تثبيت موؤضع 11601 عند النهاية © وأخيراً إضافة رامزي‎ ٠ C= ‏عند الطرف‎ Xbal ‏بموؤضع‎ ‏للأنفيتروجين من القطعة المضخمة أعلاه وتحضير‎ TA ‏ب) الاستنساخ إلى ناقل الاستنساخ‎ ٠ pRIT 14647 ‏الناقل الوسيط‎ XY. ‏والاستنساخ إلى الناقل‎ pRIT 14647 ‏من البلازميد‎ Nol Xbal ‏ج) إزالة القطعة‎ + pRIT 14586 ٠ ARS8 ‏د ) تحويل السلالة العائلة‎ ¢PrIT 14477 ‏كولاي المحتوية على البلازميد‎ ٠ ‏ئي‎ AD ‏ه) إنتقاء وتمييز متحولات‎ + LPD - MAGE -3- His ‏المعبر عن بروتين الإندماج‎ Yo : ‏؟‎ Jue

تحضير ‎alga‏ المضاد ‎LPD 1/3 - AAGE -3- His‏ ‎-١‏ نمو وحث السلالة البكتيرية - التعبير عن ‎LPD 1/3 - MAGE -3- His‏ جرى إنماء ‎AR 58 WIA‏ المتحولة بواسطة البلازميد 14477 ‎PRIT‏ في دوارق ؟ لتر ؛ يحتوي كل منها على 40860 مل من وسط 12 ‎LY‏ المزود بمستخرج خميري ‎Not)‏ جم / ‎١‏ لتر ) وكبريتات الكاناميسين ( 50 مجم / لتر ) ‎٠‏ بعد الاحتضان على منضدة هزازة في ٠م‏ ‎١ - / + Asad‏ ساعة ؛ أزيلت ‎die‏ صغيرة من كل دورق للفحص المجهري ‎٠‏ جُمعت محتويات الدورقين لتقديم اللقاح للمخمر ‎7١‏ لتر ‎٠‏ ‏أضيف اللقاح ( حوالي ‎(ALA‏ إلى مخمر ‎7١‏ لتر ( مجم إجمالي ) سابق التعقيم يحتوي على 7 لترات من الوسط ؛ مزود ب ‎٠٠‏ مجم / لتر من كبريتات الكاناميسين ؛ غدل ‎٠‏ الرقم الهيدروجيني إلى ؛ وحفظ عند « ‎TA‏ بالإضافة الدورية ل ‎Yo ( NHA OH‏ 96 حجم / حجم ) ‎٠‏ وغُدلت درجة الحرارة إلى ؛ وحفظت عند ؛ ‎٠ 4 Fe‏ غدل معدل التهوية إلى ؛ وحفظ عند © ‎١7‏ لثراً من الهواء / دقيقة وحُفظ ضغط الأكسجين الذائب عند ‎٠٠‏ 96 من التشبع بالتحكم الرجعي لسرعة الرج ‎Lads ٠‏ الضغط الزائد في المخمر عند 0860© جم / سم ( درء بار)؛ أجري استنبات لرقعة التغذية بالإضافة الخاضعة للتحكم لمحلول تغذية الكربون٠‏ أضيف ‎٠‏ محلول التغذية بمعُدل أولي ‎vet‏ مل / دقيقة ؛ وزاد أسياً خلال ال ‎£Y‏ ساعة الأولى للحفاظ على معدل نمو ‎VO)‏ / ساعة؛ بعد ‎£Y‏ ساعة ؛ زيدت درجة الحرارة في المخمر سريعاً إلى 79م ؛ وحفظت سرعة التغذية ثابتة عند 0٠ر١‏ مل / ‎DCW aa‏ / دقيقة خلال طور الحث ‎YF - YY sad‏ ساعة إضافية ؛ ‎Play‏ ذلك الوقت خفق التعبير داخل الخلوي ل ‎LPD -MAGE 3- His‏ أقصسى ‎Te‏ ل أخذت قواسم ( ‎٠١‏ مل ) من الحرق على فترات زمنية منتظمة خلال طوري النمو / الحث وعند نهاية التخمر لمتابعة حركيات النمو الميكروبي والتعبير داخل الخلوي عند المنتج ‎Lead‏ توفير عينات للتعريف الميكروبي / اختبارات النقاوة. بنهاية التخمر ؛ كانت الكثافة البصرية للمستنبت بين ‎As‏ و ‎١١١‏ ( تقابل تركيزاً خلوياً ‎Yo‏ بين ‎8A‏ و ‎VY‏ جم ‎DCW‏ ( لتر ) ؛ وكان حجم السائل الإجمالي ‎١١‏ لتراً تقريباً ‎٠‏ جرى تبريد المستنبت سريعاً إلى بين ‎١‏ و ١٠م‏ ؛ فصلت ‎BOK 32 WIA‏ من حرق الاستنبات بالطرد

VY

ELK 32 ‏جرى سريعاً تخزين خلايا‎ ٠ ‏دقيقة‎ ٠ ‏المركزي عند 3650806 ع .في م لمدة‎

Co Av - ‏المركزة في أكياس لدائنية وتجميدها فوراً في‎ : ‏استخراج البروتين‎ -7 ‏المركزة المجمدة إلى 4 م قبل إعادة تعليقها في منظم‎ ECK32 WIA ‏جرى تذويب‎

J DOW ‏تقابل تركيزاً خلوياً حوالي 6 جم‎ ( ٠٠ ‏تشتت خلوي إلى كثافة بصرية نهائية‎ 0 ٠) ‏لتر‎ ‎٠ ‏بار‎ Yoru ) ‏جرة تشتيت الخلايا بواسطة إمرارين خلال مجاس مرتفع الضسغط‎ ‏ع في ؟م لمدة 0“ دقيقة ) ثم‎ ٠٠٠٠١ ‏خضع المعلق الخلوي المتفتت للطرد المركزي ( 6ل‎

VJ EDTA + ) ‏وزن / حجم‎ 96 ١ ( 76100 ‏غسل الجزء الكروي مرتين بواسطة ترايتون‎ ‏مجم‎ 96 ١ر١‎ ) ٠١ ‏توين‎ + (PBS) ‏.مل مولاري ) ؛ متبوعاً بمحلول ملحي منظم بالفوسفات‎ ٠ ‏وبين كل مرحلة غسل ¢ خضع المعلق للطرد المركزي‎ ٠ PBS ‏حجم ( وغسل أخيرا بواسطة‎ / ‏نبذت المادة الطافية وجرى احتجاز الجزء‎ ٠ ( at ٠ ‏دقيقة في‎ ٠ ‏لمدة‎ ghee * ‏عند‎ ‎٠ ‏الكروي‎ ‏مثال ؟:‎ : Lopo 1 - MAGE 3 ‏تمييز بروتين الإندماج‎ 05 : ‏التنقية‎ -١ ‏من ناتج التجانس الخلوي باستخدام تتابع‎ LPD ‏نااطا/[-‎ -3- His ‏تمت تنقية‎ volial ‏الخطوات الموصوف‎ ‏أ ) تذويب الجزء الكروي المغسول من التشتت الخلوي ؛‎ ‏آب) الاختزال الكيميائي لروابط ثنائي الكبريتيد داخل البروتين وبين البروتين متبوعاً بإعاقة‎ ٠ ‏مجموعات الثيول لمنع إعادة الاقتران المؤكسدة؛‎ ‏ج) الترشيح الدقيق لخليط التفاعل لإزالة الدقائق واختزال الذيفانات الداخلية ؛‎ ‏والتتقية الأولية بإستغلال تفاعل الألفة البيني بين ذيل‎ LPD -MAGE -3- His ‏د ) إقتناص‎ ‏المشحون‎ chelating sepharose ‏والسيفاروز الكلابي‎ polyhistidine tail ‏عديد الهستيدين‎ ¢ ‏بالزنك‎ Yo

YA

٠ ‏ه) إزالة البروتينات الملوثة بواسطة التحليل الكروماتوجرافي بالتبادل الأيوني‎ : ‏المُنقى لعدد من مراحل الصقل‎ LPD -MAGE -3- His ‏وضع‎ ‏و ) تبادل المنظم / إزالة البولينا بواسطة التحليل الكروماتوجرافي بالإستبعاد الحجمي باستخدام‎ ‏؛‎ VO ‏سوبردكس‎ ‏ز ) الترشيح أثناء العملية ؛‎ ٠ ‏ح ) تبادل المنظم / إزالة أعلى بواسطة التحليل الكروماتوجرافي بالاستبعاد الحجمي باستخدام‎ 0 25 ‏سيفادس‎ ‎: ‏وتوصف كل من هذه الخطوات بمزيد من التفصيل أدناه‎ ٠ ‏تذويب الكرية المتجانسة الخلوية‎ ) ٠-١ (Del ‏جرت إعادة تذويب الجزء الكروي من مرحلة الغسل النهائية ( كما وصفت‎ Ve ) ‏مولاري‎ 1) guanidine ‏طوال الليل في 80609 مل من محلول من هيدروكلوريد الجوانيدين‎ va 4 ‏را ) في‎ ٠١ ‏وفوسفات الصوديوم ( ١ر١ مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني‎ ‏الاختزال والكربوكسي مثيلة‎ -”-١ ‏غسلت المادة المذوبة ) معلق أصفر شاحب بواسطة الارجون لتنظيف أي أكسجين‎ ‏مولاري ) لتقديم تركيز نهائي “*رء؛‎ VE) ‏متبق ؛ واضيف محلول خام من 7- مركابتو ايثاول‎ Ve ٠) ‏مركابتو ايثانول لكل مل من المحلول‎ =Y ‏مل من‎ EE ‏مولاري ( يقابل‎ ‏قسم المحلول الناتج ونقل إلى دورقين زجاجيين جرى تسخينهما إلى 15م في حمام مائي‎ ‏يبردا ؛ ثم سكبت‎ ob ‏بعد ذه دقيقة في * م ؛ أزيل الدورقين من الحمام المائي وسُمح لهما‎ ‏المحتويات في كأس ) 2 لتر مغلق برقائق ¢ موضوع على الثلج واضيف يودريو أسيتاميد‎ ‏جم من يودو أسيتاميج‎ ١ ‏ار‎ ١ ‏صلب مع الخلط العنيف لتقديم تركيز نهائي 1 مولاري ) يقابل‎ Ye ‏ساعة لمضان الإذابة الكاملة‎ sad ‏لكل مللتر من المحلول + ضغط الخليط على الثلج في الظلام‎ ‏لليودو اسيتاميد قبل المعادلة ) مع الاحتفاظ بالتحريك العنيف والمراقبة المستمرة للرقم‎ © ( sodium hydroxide ‏لتر تقريباً في هيدروكسيد الصوديوم‎ ١ ‏الهيدروجيني ) بإضافة‎

CYA ‏مولاري لتقديم رقم هيدروجيني نهائي در ح‎ ‏دقيقة أخرى ؛ وبعد أعيد تعديل الرقم‎ Yo ‏حفظ الخليط الناتج على الثلج في الظلام لمدة‎ Yo ٠ ‏هرلا‎ = Ve ‏الهيدروجيني إلى‎

‎7-١‏ ) الترشيح الدقيق خضع الخليط للترشيح الدقيق في وحدة أميكون بروفلوكس 1/112 حماسي التدفق مزودة بخرطوش مينيكروس بألياف مجوفة ( الرقم المرجعي 0137 - 600 - 1/2214 المساحة 000 سم" ؛ ‎OY‏ + ميكرومتر ) ‎٠‏ أحتجز ناتج النفاذ للتنقية اللاحقة بالتحليل الكروماتوجرافي ‎٠‏ ‏١-؛)‏ التحليل الكروماتوجرافي الكلابي الفلزي ‎(IMAC ) (Zn?)‏ أجري التحليل الكروماتوجرافي الكلابي الفلزي بواسطة سيفاروز ‎FF‏ كلابي ( فارماسيا للتفنية الحيوية ؛ رقم الدليل ‎١7-٠5975-01‏ ) معباً في عمود ‎ovr /٠٠١ BPG‏ (فارماسيا للتقنية الحيوية ؛ رقم الدليل ‎(VAS OF)‏ وكانت أبعاد القاعدة المعبأة : القطر ‎٠١‏ سم ¢ ‎٠‏ مساحة المقطع المستعرض ‎VA‏ سم ' ؛ إرتفاع القاعدة ‎١9‏ سم ؛ الحجم المعباً 1585 مل؛ جرى تعقيم العمود الفارغ بواسطة هيدروكسيد الصوديوم ( 2ر١٠‏ مولاري ) وثم غسل بماء منقى ‎٠‏ ‏غسلت الدعامة ( المقدمة في ‎7١0‏ 96 حجم / جم إيثانول ) بالماء المنقى ( + لتر ) على قمع يوشنر ( تحت التفريغ ) وشحنت بواسطة الزنك بإمرار ‎١١‏ لتر على الأقل من محلول ‎Znel, Ve‏ ( ١ر١‏ مولاري ‎١)‏ أزيل الزنك الزائد بواسطة غسل الدعامة ب ‎٠١‏ لتر من الماء المتقى ؛ حتى أصبح الرقم الهيدروجيني لسائل المخرج مثل الرقم الهيدروجيني لمحلول ‎ZnCl‏ ‏( ٠ره‏ ) ‎١‏ ثم جرى إتزان الدعامة بواسطة ؛ لتر من محلول يحتوي على هيدروكلوريد الجوانيدين ( 76 مولاري ) وفوسفات الصوديوم (١ر١‏ مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ٠ر7‏ )؛ خلط ناتج النفاذ من الترشيح الدقيق ؛ المحتوي على ‎LPD -MAGE -3- His‏ « مع ‎٠‏ الدعامة ( إرتباط دفعي ) ‎١‏ قبل شحن وتعبة عمود ‎BPG‏ بالمحلول المحتوي على هيدروكلوريد الجوانيدين ( > مولاري ) وفوسفات الصوديوم ( ١ر١‏ مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Vor‏ ‏أجريت المراحل التالية في التحليل الكروماتوجرافي الكلابي الفلزي ‎Jay‏ تدفق مذيب التصفية 60 مل / دقيقة ‎٠‏ غسل العمود أولاً بمحلول يحتوي على هيدروكلوريد الجوانيدين ( 6 مولاري ) وفوسفات الصوديوم ( ١ر١‏ مولاري ؛ الرقم الهميدروجيني ‎(Vor‏ ؛ ثم بمحلول ‎Yo‏ يحتوي على البولينا ( ‎7١‏ مولاري ) وفوسفات الصوديوم ( ١ر١‏ مولاري ؛ الرقم الهميدروجيني ٠رلا‏ ) ؛حتى جفف مذيب تصفيةالعمود صفراً في الامتصاص عند كثافة بصرية ‎YAY‏ نانومتر ( خط قاعدي )؛

جرى فصل البروتين ‎LPD -MAGE -3- His‏ شبه النقي بالتصفية بواسطة حجمي عمود من محلول يحتوي على البولينا ( 7 مولاري ) ؛ فوسفات الصوديوم ( ١ر١‏ مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Vor‏ والإيميدازول ( 2ر١‏ مولاري ) ‎٠‏ وكانت موصلية هذا الجزء حوالي ‎١١‏ مل ثانية / سم ‎٠‏ ‎٠‏ ١-ه‏ ) التحليل الكروماتوجرافي بالتبادل الأنيوني قبل الإستمرار في التحليل الكروماتوجرافي بالتبادل الأنيوني ¢ جرى خفض موصلة جزء البروتين ‎LPD -MAGE -3- His‏ شبه النقي ‎١‏ إلى حوالي 4 مل ثانية / سم بواسطة محلول يحتوي على البولينا ( 7 مولاري ) وتريس = ‎٠١ ( HCl‏ مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(AD‏ ‎Ve‏ أجري التحليل الكروماتوجرافي بالتبادل الأنيوني باستخدام © - سيفاروز ‎FF‏ (فارماسيا للتقنية الحيوية ؛ رقم الدليل ‎(YY=roV emo)‏ المشحون في عمود ‎ove [Yur BPG‏ (فارماسيا للتقنية الحيوية ؛ رقم الدليل ‎٠ (VAS FY‏ وكانت أبعاد التقاعدة المشحونة هي : القطر ‎٠١‏ سم ؛ مساحة المقطع المستعرض ‎٠١4‏ سم إرتفاع القاعدة 4 سم ؛ الحجم المشحون 7900 ‎calle‏ ‎Vo‏ شحن العمود ( بواسطة ‎Yo‏ 96 حجم / حجم إيثانول ) وغسل بواسطة 9 لتر من الماء المتقى ‎Janay‏ تدفق لمذيب التصفية ‎7١‏ مل / دقيقة ‎٠‏ طهر العمود المشحون ‎AY Aad‏ من هيدروكسيد الصوديوم ( در١‏ مولاري ) ؛ وغسل بواسطة ‎"١‏ لتر من الماء المنقى ؛ ثم جرى إتزانه بواسطة + لتر من محلول يحتوي على البولينا ( 7 مولاري ) وتريس - 1101 ( ‎٠١‏ مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Ar‏ + شحن ‎LPD MAGE -3- His‏ شبه المنقى على © العمود ثم غسل بواسطة 9 لتر من محلول يحتوي على البولينا ( 7 مولاري ) ؛ تريس - 1101 ‎٠١ (‏ مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Ar‏ ؛ ‎١ ( EDTA‏ مل مولاري ) وتوين ( ١ر٠‏ 6 ) حتى إنخفض إمتصاص ( 780 نانومتر ) مذيب التصفية إلى صفر ‎٠‏ ‏أجريت خطوة غسل إضافية بواسطة + لتر من محلول يحتوي على البولينا ( + مولاري ) وتريس = ‎٠١ ( HCL‏ مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Ar‏ ‏خضع ‎LPD ~MAGE -3- His‏ المنقى للفصل بالتصفية التتابعية من العمود بواسطة محلول يحتوي على البولينا ( 7 مولاري ) ؛ تريس - 1101( 70 مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ‎(Ayr‏ و ‎(ser Yo ( NaCl‏

‏التحليل الكروماتوجرافي بالإستبعاد الحجمي‎ ) 1-١ ‏وتبادل المنظم‎ iid LPD -MAGE -3- His ‏تحقق كل من إزالة البولينا من‎

VO ‏أجري ذلك باستخدام سوبرس‎ ٠ ‏بواسطة التحليل الكروماتوجرافي بالإستبعاد الحجمي‎

You / On XK ‏في عمود‎ na ( YY=Y eg g— ‏فارماسيا للثقنية الحيوية ¢ رقم الدليل أن‎ ) ‏وكانت أبعاد القاعدة المشحونة هي‎ ٠ ( YA—AYOY—1 ‏(فارماسيا للقتنية الحيوية ¢ رقم الدليل‎ ° ‏القطر © سم ؛ مساحة المقطع المستعرض ١ر5١ سم ؛ إرتفاع القاعدة 90 سم ؛ الحجم‎ ٠ Je YA ‏المشحون‎ ‎Jes ‏شحن العمود في الإيثانول ( 70 96 ) وغسل بواسطة © لتر من الماء المنقى‎ ‏لتر من هيدروكسيد الصوديوم‎ Y ‏ظهر العمود بواسطة‎ ٠ ‏تدفق لمذيب التصفية أ مل / دقيقة‎ ‏جرى إتزانه بواسطة 2 لتر من‎ a ¢ ‏ا مولاري) وغسل بواسطة ° لتر من الماء المنقى‎ ) ٠٠١ ٠ ( ‏ار ف 96 حجم / حجم‎ ) Av ‏محلول ملحي منظم بالفوسفات يحتوي على توين‎ ‏مل / دورة إزالة الملح على‎ or ( ‏المنقى‎ LPD “MAGE -3- His ‏تحن جزء‎

LPD ~MAGE - ‏خُضع‎ ٠ ‏مل / دقيقة‎ 7١ ‏تدفق لمذيب التصفية‎ Janay ‏الأقصى ) إلى العمود‎ ‏المحتوي‎ BPS ‏المنقى المزال ملحه للتصفية التتابعية من المحلول بواسطة ¥ لتر من‎ 3- His 08 ‏حجم / حجم‎ % ء٠را‎ ) As ‏على توين‎ Vo ‏عند الحجم الخالي في العمود ؛‎ LPD “MAGE -3- His ‏فصل الجزء المحتوي على‎ ‏الترشيح خلال العملية‎ ) 7-١ ‏من التحليل الكروماتوجرافي بالإستبعاد‎ LPD -MAGE -3- His ‏جرى ترشيح كتلة‎ ‏جرى‎ ٠ ( ‏ميكرومتر في غطا ع تدفق صفحي ) الفكة تير يل‎ ٠ OY A Lie ‏الحجمي خلال‎ ٠ ‏وخزنت حتى خطوة إزالة الملح‎ phe - ‏تجميد الكتلة المرشحة عن‎ © ‏التحليل الكروماتوجرافي لإزالة الملح‎ ) 8-١ ‏مل أوزمولار ؛ يتطلب‎ fer ‏نظراً لأن ثمالية الكتلة النهائية يجب أن تكون أقل من‎ ‏أجري ذلك بواسطة خطوة تحليل‎ ٠ ‏الأمر خطوة تبادل منظم إضافية لخفض تركيز الملح‎ ‏فارماسيا للتقنية الحيوية ¢ رقم الدليل‎ ) G 25 ‏كروماتوجرافي لإزالة الملح باستخدام سيفادكس‎ ‏الحيورية ¢ رقم‎ dl) ‏فارماسيا‎ ) 40. / ٠٠١ BPG J gas ‏حلت يحلا ( مشحون في‎ Yo ‏سم » مساحة المقطع‎ ٠١ ‏وكانت أبعاد القاعدة المشحونة هي : القطر‎ ٠ ( ‏الدليل اا أحلا‎ ٠ ‏مللتر‎ Ov ‏سم ¢ الحجم المشحون‎ Ao ‏إرتفاع القاعدة‎ ‘ "ans YA ‏المستعرض‎

YY

‏له بالإنتفاح طوال‎ may al) ‏بواسطة 7 لتر من الماء‎ G25 ‏جرى تمييئ السيفادكس‎ ‏مل / دقيقة؛‎ ٠٠١ ‏ثم شحن الهلام في العمود بالماء النقي بمعدل تدفق للمذيب‎ ٠ ‏الليل في 5ه م‎ ‏لتر من هيدروكسيد الصوديوم ( 5ر١ مولاري ) ثم‎ ١ ‏جرى تطهير العمود بواسطة‎ ‏مل مولاري ؛‎ ٠١ ( ‏لتر من محلول يحتوي على فوسفات الصوديوم‎ ٠١ ‏خضع للإتزان بواسطة‎ ‏مل مولاري ) وتوين 80 ( ارء 96 حجم / حجم‎ ٠١ ( NaCl ‏؛‎ (1A ‏الرقم الهيدروجيني‎ © 0 ‏مل / دورة إزالة الملح ) إلسى‎ ١٠٠١ ‏المنقى ( أقصى‎ LPD “MAGE -3- His ‏شحن‎ ‎c Sal ‏جرى الترشيح المثعم‎ ٠ ‏مل / دقيقة‎ Yeo ‏تدفق مذيب التصفية‎ Ue ‏العمود‎ ‏المتقى المزال ملحه المستخرج عند الحجم الفارغ بالعمود ¢ خلال‎ LPD MAGE -3- His ‏ميكرومتر وخزن في - 80م‎ TY le ٠ ‏دفئ البوتين الخام النهائي إلى + 4 م قبل تقسيمه إلى قنينات وتجفيفه بالتجميد في سواغ‎ ٠ ( % ‏لاكتوز ) را‎ : ‏عديد أكريلاميد بصيغة كوماسي‎ - SDS ‏التحليل على هلامات‎ -"

Aas LPD —MAGE -3- His ‏جرى تحليل مولد المضاد المنقى ل‎ ‏في ظروف إختزالية؛‎ 96 Ye ‏على هلام أكريلاميد‎ SDS-PAGE to ‏ميكروجرام لصيغة أزرة كوماسي و © ميكروجرام لصيغة‎ 5٠ ‏كانت شحنة البروتين‎ ‏لوحظ نطاق رئيسي‎ ٠ 96122 ‏نترات الفضة + جرى تحليل الدفعة السريرية 961619 والدفعة‎ ‏كيلو‎ to ‏نطاقان إضافيان ثانويان حوالي‎ Lad ‏كيلو دالتون٠ ولوحظ‎ ٠١ ‏يتفق مع وزن جزيئي‎ ٠ ‏كيلو دالتون‎ Yo ‏دالتون و‎ ‏تحليل التخطيط الغربي‎ -# © ‏جسرى‎ ٠ ‏باستخدام أجسام مضادة أحادية النسخ‎ LPD -MAGE -3- His ‏للبروتين‎ PAGE

LPD ~MAGE -3- ‏تطوير هذه الأجسام المضادة داخلياً باستخدام تحضير متقى من البروتين‎ + LPD ‏[1غا<-‎ -3- His ‏من‎ LPD ‏لا يحتوي هذا البروتين على جزء‎ His ‏على أساس‎ ( Mab54 ‏و‎ Mab22 ) ‏جرى إنتقاء تحضيري أجسام مضادة أحادية النسخ‎ Yo

Aled ‏ملائمتهما لتحليل التخطيط الغربي واستخدما في اختبار التمييز لإطلاق‎ ‏اا‎ yy

يوضح شكل ¢ أنماط النطاق الناتجة للتشغيلتين 961619 و 96122 بعد الاصطباغ

بواسطة 854 ‎٠ Mab32‏ جرى تذويب ‎Tee‏ نانوجرام من ‎Op gall‏ على مر ‎VY‏ % ‎SDS - PAGE‏ ونقل إلى غشاء من النايولن » وتفاعل مع 54 & 32 ‎١ ( Mabs‏

نانوجرام / مل ) وظهر مع أجسام مضادة فأرية مقترنة بالبيروكسيداز ‏ ° يظهر الببتيد ‎٠١‏ كيلو دالتون و ‎٠0‏ كيلو دالتون الذي كشف عنه بواسطة ‎SDS-PAGE‏ بواسطة ‎Mabs‏ كليهما ‎٠‏ ‏مثال 6: ‎-١‏ تحضير اللقاح باستخدام البروتين ‎LPD -MAGE -3- His‏ :

يتم إنتاج اللقاح المستخدم في هذه التجارب من ‎DNA‏ معاد تكوينه ‘ يشفر للبروتين

‎٠‏ الدهني ‎“MAGE -3- His‏ 01/3 ؛ المعبر ‎die‏ في ي٠‏ كولاي ‎E.Coli‏ من السلالة 8ه ؛ إما ‎ale‏ أو لا وكمادة مساعدة ؛ تشتمل الصياغة على خليط من الدهن ‎A‏ أحادي الفوسفوريل المنزول ¥ = ‎O‏ - أسيل ( ,317-101 ) و 0521 في مستحلب زيت /ماء ‎٠‏

‏وقد وصفت المنظومة المساعدة ‎SBAS?2‏ من قبل في براءة الاختراع الدولية رقم

‎«9 of IVY YS

‎3D -- MPL Vo‏ : منبه مناعي مشتق من السكر العدادي الدهني ) ‎LPS‏ ( للبكتير سالمو نيللامينيسوتا سالب جرام٠‏ وجرى نزع الآسيل من ‎MPL‏ ويفتقر لمجموعة فوسفات على شق

‏الدهن ‎vA‏ وتعمل هذه المعالجة الكيميائية على الخفض الشديد للسمية مع الحفاظ على خصائص التنبيه المناعي ) رايبي ‎٠ ( YAAR‏ وتقوم شركة رايبي للكيمياء المناعيسة بإنتاج وتوفير ‎MPL‏ لمختبرات ‎SB‏ الحيوية ‎٠‏ وأظهرت التجارب التي أجريت في مختبرات

‎٠‏ سميثكلاين بيتشام الحيوية أن ‎BP - MPL‏ المتحد مع مواد ناقلة مختلفة يعزز بشدة كل من

‏المناعة الخلطية والمناعة الخلوية من النوع ‎THI‏ «

‎QS21‏ 2 هو جزيئ صابونين طبيعي مستخرج من لحاد شجرة كيللاجا سابونا ريامولينا

‏بأمريكا الجنوبية ‎٠‏ وسْمح أسلوب تنقية طور ‎Jail‏ مركبات الصابونين المختلفة من

‏المستخرجات الخام للماء ¢ بعزل صابونين معين ¢ 1 052 » وهو جليكوسيد ثلارني ‎Cod yd‏

‎Yo‏ يوضح فعالية مساعدة أقوى وسمية أقل بالمقارنة بالمكون الأصلي ‎٠‏ وظهر أن 21 ‎QS‏ ينشط

‎CTLs‏ المقيدة ‎MHC‏ الفئة 1 إلى ‎Ags‏ لوحدات فرعية متعددة ؛ وينبه أيضاً تكاثر الخلايا اا

ل

اللمفاوية التوعي ل ‎Ag‏ (كينسيسل ؛ ‎١ ) ١547‏ وتقوم أكيلا ( سابقاً ‎٠‏ شركة كامريدج للتقنية الحيوية ( بإنتاج وتوفير 1 052 لمختبرات ‎SB‏ للتقنية الحيوية ‎٠‏

وأوضحت التجارب التي أجريت في مختبرات سمثيكلاين بيتشام الحيوية تأثيراً تداؤبياً واضحاً لمجموعات من ‎MPL‏ و 21 05 في حث كل من الاستجابة المناعية الخلطية والخلوية من نوع 1111 ‎٠‏

مستحلب الزيت / الماء يتكون من من طور عطري من زيتين ( توكوفيرول وسكوالين ( ¢ وطور ماني من ‎PBS‏ يحتوي على توين ‎A‏ كمادة مستحلبة ‎٠‏ يشتمل المستحلب على 2 6 سكوالين ؛ © % توكوفيرول ؛ ؛كر١؛‏ % توين ‎Av‏ وله متوسط حجم دقائق 1880 نانومتر ويعرف بالأسم 5362 ( أنظر براءة الاختراع الدولية رقم ‎1771١‏ / 30(

‎٠١‏ وأظهرت التجارب التي أجريت في مختبرات سميثكازين بتشام الحيوية أن إلحاق هذا المستحلب الزيت / الماء إلى 90521 / ‎MPL‏ - 30 ( 5352 ) يزيد أيضا خصائص التتبيه المناعي للأخير ضد مولدات مضاد لوحدات فرعية متعددة ‎٠‏ ‏"- تحضير المستحلب 62 ‎SB‏ ( مركز مضاعف )

‏يذاب توين 80 في محلول ملحث منظم بالفوسفات ( ‎(PBS‏ لتقديم محلول ‎١‏ 96 من

‎١٠ 285 | ١‏ ولتوفير مستحلب مركز مضاعف ‎٠٠١‏ مل ؛ يتم تدويم © جم من ‎DL‏ ألفاتوكونيرول و © مل من سكوالين ليختلطا جيداً + يضاف 90 مل من محلول ‎PBS‏ / توين ويخلط ‎las‏ ثم يمرر المستحلب الناتج خلال محقنة ويسيل في النهاية بدقة باستخدام آلة إسالة دقيقة ‎M1108‏ ‏قطيرات الزيت الناتجة لها حجم حوالي ‎YA.‏ نانو مثر ‎٠‏ ‏“- تحضير صياغة مستحلب الزيت في الماء ‎(SBAS2) 11/3 - MAGE -3- His‏

‎0821/30 MPL ٠

‏تصاغ المادة المساعدة كمجموعة من ‎MPL‏ و 21 ‎QS‏ ؛ في مستحلب زيت /ماء ‎٠‏ ‏يقدم هذا التحضير في قنينات كار ‎٠‏ مل ليتم خلطه مع مولد المضاد المجفف بالتجميد ) قنينات تحوي 7 إلى ‎Yeo‏ ميكروجرام من المولد المضاد ‎٠‏ ‏تركيب المادة المخففة المساعدة للقاح المجفف بالتجميد كما يلي : ‎Yo‏ ‏لكمية لكل جرعة )

Yo ‏المواد المساعدة‎ ‏ميكرولتر‎ You : SB 62 ‏مستحلب‎ ‏مجم‎ Ye ‏سكوالين كار‎ - ‏ألفا توكوفيرول 4ر١١ مجم‎ - 121, - ‏مجم‎ ¢ A Aw ‏توين‎ - ‏ميكروجرام‎ ٠ ‏الدهن .هر أحادي الفوسفوريل‎ ‏ميكروجرام‎ ٠ 0521 ‏المادة الحافظة‎ ‏سس سا‎ ‏ميكروجرام‎ YO ‏ثيوميرسال‎ ‎Jo ٠ 1) ‏مل‎ ١ ‏ماء للحن مقدار كاف إلى در‎ ‏ميكروجراء‎ OV ‏فوسفات صوديوم ثناني القاعدية‎ - ‏ميكروجرام‎ ٠ ‏فوسفات صوديوم أحادث القاعدية‎ - {he — ‏ميكروجرام‎ ٠ ‏كلوريد بوئاسيوم‎ ‏بد د‎ - ‏كلوري صوديوم فر ملجرام‎

LPD —-MAGE -3- His ‏يتم الحصول على اللفاح النهائي بعد إعادة تكوين التحفيز‎ ٠هدحو‎ PBS ‏المساعدة أو مع‎ sald ‏المخفف بالتجميد مع‎ ٠ ‏ويتم تحضير حواكم المادة المساعدة بدون مولد مضاد باستبدال 5 بالبروتي‎ : 11/3 - MAGE -3- His ‏؛- مولد المضاد اللقاحي : بروتين الإندماج البروتين الدهني‎ ‏الهيموفيلاس إنفلونزي‎ HES ‏البروتين الدهني (1 هو بروتين دهني مكشوف على سطح‎ + ‏سالب - جرام‎ haemophilus influenzae ‏المعالج كشريك إندماج لتزويد مولد‎ D ‏الأولى بالبروتين‎ ٠١6 ‏ويعمل إدماج البقيات‎ ‏يحتوي البروتين على حمضين‎ « LPD ‏وبجانب شق‎ ٠ T= ‏المضاد اللقاحي بإبينوبات الخلية‎ ‏؛‎ MAGE-3 ‏في‎ ٠ ‏؛ بقيات حمض أميني ؟ إلى‎ (Asp ‏و‎ Met ( ‏أمينيين غير متصلبين‎ ‏السبع اللاحقة؛‎ His ‏تعملان كمنطقة مفصلية للكشف بقيات‎ Gly ‏بقيتي‎ ٠

مثال ه: ‎-١‏ التوليد المناعي ل ‎LPD -MAGE -3- His‏ في الفئران والقرود : من أجل اختبار التوليد المضاد والتوليد المناعي لبروتين ‎MAGE-3‏ البشري ؛ تم حقن اللقاح المرشح إلى سلالتي فئران مختلفتين ( 0571/6 و 3810/0 ) ؛ تختلفان في خلفيتهما د الوراثية وسلالات ‎٠ MHC‏ ولكل من سلالتي ‎gill‏ ؛ جرى نظرياً توقع موتيفات ببتيد ‎MHC‏ الفئة ‎١‏ و ‎MHC‏ ‏الفئة ‎Y‏ المحتملة لجزء ‎MAGE‏ من بروتين الإندماج ‎٠ LPD -MAGE -3- His‏ أ ( خطة التحصين : جرى حقن 0 فئران من كل سلالة مرتين بفاصل أسبوعين في بطن القدم بواسطة 0 ‎٠‏ ميكروجرام من ‎LPD -MAGE -3- His‏ « مُصاغ في 58852 أو ‎oY‏ بعشر التركيز ‎J‏ 3 لمستخدم في الإنسان ‎٠‏ ‏ب) إختبار التكاثر : جرى تحضير الخلايا الليمفاوية بسحق الطحال أو العقد الليمفاوية المأبضية في الفئران ؛ بعد أسبوعين من ‎AT‏ حقن ‎٠‏ وضع ؟ ‎TAX‏ خلية بتضاعف ثلاثي في أطباق 936 عين ‎Yo‏ وأعيد تنبيه الخلايا خارج الجسم لمدة ‎VY‏ ساعة بواسطة تركيزات مخثافة ) ‎١‏ = إرء ميكروجرام / مل ) من 1180123 - ‎His‏ كما هي أو مغلقة على كريات دقيقة من اللاتكس ‎٠‏ ‏لوحظ نشاط تكاثر لميفاوي متزايد نوعي ل ‎MAGES‏ مع كل من خلايا الطحال / أنظر شكلي م لا ( وخلايا العقد الليمفاوية ) أنظر شكلي 1 و ‎A‏ ( من أي من ‎Ob yd‏ 6 أو 3810/0 المحقونة بواسطة البروتين ‎LPD ~MAGE -3- His‏ بالمقارنة ‎Ye‏ باستجابة التكاثر الليمفاوي للفئران التي تلقت صياغة 2- ‎SBAS‏ وحده أو ‎PBS‏ + وبالإضافة إلى ذلك ؛ تم الحصول على استجابة تكاثر أعلى ملحوظة مع الخلايا الليمفاوية من ‎Osa)‏ التي حصن بواسطة ‎LPD -MAGE -3- His‏ في المادة المساعدة 2 ( أنظر أشكال حر ‎(A‏ ‏ج) الاستنتاج : ‎LPD ~-MAGE -3- His Yo‏ مولد مناعي في الفثران ؛ ويمكن زيادة هذا التوليد المناعي باستخدام صياغة 55/52 المساعدة ‎٠‏

بال "- استجابة الجسم المضاد : ‎j‏ ) التحصين : جرى تحصين فئران ‎Balb/c‏ أو 05781/6 بالحقن مرتين في باطن القدم بفاصسل أسبوعين بواسطة إما ‎PBS‏ ؛ أو ‎SBAS2‏ من ‎LPD MAGE -3- His‏ أو © ميكروجرام ‎٠‏ من ‎٠ LPD -MAGE -3- His + SBA2S‏ جرى استخدام ‎y‏ 3 © حيوانات في المجموعات الحاكمة وفي المجموعات المختبرة على التوالي ‎٠‏ ‏ب) إليزا ‎ELISA‏ غير المباشر : بعد أسبوعين منالحقن الثاني ؛ أخذت أمصال فردية وحُضعت لإختبار إليزا ‎ELISA‏ ‎٠‏ غير المباشر؛ جرى استخدام ¥ ميكروجرام / مل من ‎His - MAGE3‏ المنقى كمولد مضاد مغلف ‎٠‏ بعد التشبع خلال ساعة في 7م ؛ في ‎٠١ + PBS‏ % مصل عجل ‎addy‏ جرى تخفيف الأمصال تسلسلياً ( بدءً من ‎٠٠٠١/١‏ ) في منظم التشبع وجرت الحضانة طوال الليل في ‎٠ 0 4 at‏ 45 دقيقة في لالم ‎٠‏ بعد الغسل في ‎PBS‏ / توين ‎A ٠‏ جسرى استخدام ‎IgG‏ ‏إجمالي ماعزي معالج بالبيوتين مضاد للفأر ) ‎١‏ / ند ف ‎١‏ ( أو جرى امستخدام أمصار مضادة ‎\o‏ ماعزية مضادة للفأر ‎veo / \ ) IgG2b ¢ IgG2a ¢ JgGl‏ م( كأجسام مضادة ثانية ‎٠‏ بعد .9 دقيقة من الاحتضان في لالم أضيف الستربتافيدين المقترن إلى البيروكسيداز ؛ استخدم 8 (فوق أكسيد رباعي ميثيل البنزيدين ) كطبقة تحتية ‎٠‏ بعد ‎٠١‏ دقائق ؛ أعيق التفاعل بإضافة ,11,50 در + مولاري وجرى تقدير الكثافة الضوئية ‎٠‏ ‏ج) النتائج : أ يقارن ‎J Ji‏ بين مجموعات مختلفة من الفثران ) ن - م ‎ic gana‏ ( ¢ عيار النقطة المتوسطة النسبي للأمصال ؛ الذي يشكل التخفيف المتوسط المطلوب لتحقيق النقطة المتوسطة للمنحنيات ‎٠‏ ‏توضح هذه النتائج أنه في كل من سلالتي الفئران المختبرتين ؛ تظهر استجابة ‎Ab‏ ‏ضعيفة بعد ¥ حقنين من ‎LPD “MAGE -3- His‏ وحده - ولكن تتولد تركيزات ‎Ab‏ أعلى ‎Yo‏ لمضاد 3- ‎MAGE‏ عند حقن ‎LPD -MAGE -3- His‏ في وجود ‎٠ SBAS2‏ وهكذا ؛ ‎oli‏ ‏" حقنين فقط من ‎SBAS2 + LPD -1/8615 -3- His‏ ؛ بناصل أسبوعين ؛ كاف لتوليد استجابة ‎Ab‏ الأعلى الملحوظة؛

YA

‏بالمقارنة مع‎ Balb/c ‏الأفضل التي لوحظت في فئران‎ Ab ‏ويمكن تفسير استجابة‎ ‏الإستجابة الناتجة في فئران 0571/6 بالإختلافات في الأنماط الفردية أو في الخلفية بين‎ ‏المتحقق في فئران 0571/6 أعلى أيضاً بعد حقن‎ Ab ‏السلالتين ؛ حتى رغم أن عيار‎ + ‏وحده‎ LPD -MAGE -3- His ‏النوعية للفئة‎ MAGe -3 ‏ملاحظة استجابات مضاد‎ ١١ ‏و‎ ٠١ ‏ويمكن في الشكلين‎ > ‏الفرعية ع1 بعد التلقيح في مجموعات مختلفة من الفثران + مما يقدم مقارنة لتخفيف النقطة‎ ٠ ‏المتوسطة للأمصال‎ ‏في أي من عينات الأمصال حتى من الفئران الملقحة‎ 184 [A ‏ولم يُكشف عن‎ + 553/52 ‏في المادة المساعدة‎ LPD -MAGE -3- His dail ‏الإجمالي أعلى قليلاً في الأمصال في الفئران الملقحة‎ TG ‏وفي المقابل ؛ كان مستوى‎ ١ ‏الحيوانات‎ Jad ‏وحده ن وزادت بدرجة ملحوظة في‎ LPD MAGE -3- His aul ٠ SBAS2 ‏في‎ LPD -MAGE -3- His ‏التي حقنت بواسطة‎ ‏مختلطة‎ Ab ‏الفرعية المختلفة أنه قد تم حث إستجابة‎ [gG ‏وأظهر تحليل تركيزات فئات‎ ) 15020 « IgG2a « IgG 1 ( ‏مستويات كل فئات 156 الفرعية المختبرة‎ oY ‏في الفئران ؛‎ ‏المزود بالمادة المساعدة عن الفئران التي حضنت‎ Ag ‏كانت أعلى في الفئران الملقحة بواسطة‎ ٠ ٠ ‏أوالمادة المساعدة فقط‎ Ag ‏بواسطة‎ ‎LipoD ‏المختلطة المذكورة بعد التقلقيح بواسطة‎ Ab ‏ومع ذلك يبدو أن طبيعة استجابة‎

IgG 2b ‏تتوقف على سلالة الفأر ؛ نظراً لوجود 1 186و‎ SBAS2 ‏في وجود‎ MAGES - ‏و 05781/6 على التوالي ؛‎ Balb/c ‏بصورة غالبة في أمصال فئران‎ ‏المساعدة‎ SBAS2 ‏مادة‎ + His — MAGE3- 1/3 D ‏التوليد المناعي للبروتين الدهني‎ -# ٠ ‏في قرود ريزس‎ ‏حرى استخدام‎ ٠ ( ‏جرى إنتقاء 7 مجموعات من 0 حيوانات ريزس ) ماكاكا مولاتا‎ ٠ ‏كحاكم إيجابي‎ gpl20 5S 15 : ‏المجموعات‎ ‎RTS,S/SBAS2 : ىنميلا ‏الساق‎ ١ ‏المجموعة‎ YO

GP120/SBAS2 : ‏الساق اليسرى‎

المجموعة ؟ الساق اليمنى ‏ : ‎RTS, S/SB26T‏ الساق اليسرى : ‎GP120/SB26T‏ ‏المجموعة + الساق اليمنى : 2 / ‎LPD -MAGE -3- His‏ تلقت الحيوانات اللقاح في اليوم صفر وجرى تعزيزه في اليوم ‎YA‏ و كم وجرى © إدماؤها لتقدير استجابتها للأجسام المضادة لكل من ‎MAGES‏ ومكون البروتين 0 ‎٠‏ ‏قدمت اللقاحات بالعضل كحقن سريع ) مر ‎٠‏ مل في الجزء الخلفي من الساق اليمنى ‎٠‏ ‏أخذت عينات دم صغيرة كل ‎VE‏ يوماً ‎٠‏ جمعت عينات * مل من الدم غير المعالج بالهيبارين من الوريد الفخذي ؛ وسُْمح لها بالتخثر لمدة ساعة على الأقل وخضعت للطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة ‎٠١‏ دقائق ‎You.

Jara,‏ دورة في الدقيقة ‎٠‏ ‎Ve‏ أزيل المصل © وجهد في ‎١.‏ .5 وأرسل لتقدير مستويات الأجسام المضادة بواسطة إختبار إليزا ‎ELISA‏ النوعي ؛ غطيت ‎Gl‏ دقيقة ‎AT‏ عين ( ماكسيسورب نوتك ) إما بواسطة © ميكروجرام من ‎His - 3‏ أو البروتين ‎D‏ طوال الليل في ؛م ) ‎٠‏ بعد ساعة من التشضبع في لام بواسطة ‎١ NCS - PBS‏ 96 ؛ اضيف تخفيف متسلسل من أمصال الأرنب لمدة ساعة و١؟*‏ ‎YY SHEE ٠‏ م ( بدءاً من ‎٠١/١‏ ) ؛ بعد ؟ غسلات في ‎PBS‏ توين ؛ أضيف مصل مضاد الأرنب المعالج بالبروتين ( أميرشام - 1004 ‎RPN‏ ؛ الدقعة ‎١) 000/١ ( (AA‏ غسلت الأطباق واضيف السترتبافيدين المقترن بالبيروكسيداز ) 00( لمدة ‎TV AGE Ye‏ م ‎٠‏ ‏بعد الغسل ¢ ‎Caudal‏ 560 ميكرولتر ‎T™B‏ ) بيوراد ( لمدة ‎Y‏ دقائق وأوقف التفاعل بواسطة ‎cud IH, SO,‏ الكثافة الضوئية عند £00 نانومتر» جرى حساب تخفيفات النقطة المتوسطة ‎٠‏ - بواسطة سوف ماكس برو ‎٠ SoftmaxPro‏ إستجابة الجسم المضاد : أخذت عينات صغيرة من ‎pal‏ كل ‎١6‏ يوماً لمتابعة حركية استجابة الأجسام المضادة إلى ‎Mage 3‏ بواسطة إختبار إليزات ‎٠‏ وتشير النتائج إلى أنه بعد حتن ‎mea alg‏ ‎LPD 1/3 — Mage 3 - His + 2‏ « كان عيار ‎Ig‏ الإجمالي النوعي ل 3 ‎Mage‏ ‎Yo‏ منخفضاً « ولوحظ تعزيز واضح في * من © حيوانات بعد ‎gia‏ ثان وثالث من 1/3 ‎Lopo D‏ ‎Moge 3‏ + المادة المساعدة في نفس القرود ‎٠‏ وظل أصحاب الاستجابة الضعيفة سلبيين حتى بعد ‎١‏ حقنات ‎٠‏ وبعد ‎Log YA‏ من التعزيز ¥ أو التعزيز ؟ » عادة عيارات الأجسام المضادة v. ‏وجرى تقدير الفئة الفرعية لهذه الأجسام المضادة ل 180 بصورة غالبة‎ ٠ ‏إلى القيم القاعدية‎ ‏وتتوازى استجابة الجسم‎ ٠ةدعاسم‎ T ‏حدوث استجابة‎ IgG ‏ويقترح التحول إلى‎ ٠ IgM ‏وليس‎ ‎٠ Mage 3 ‏تماماً مع استجابة الجسم المضاد ل‎ D ‏المضاد النوعي للبروتين‎ : ١ ‏مثال‎ ‎: LPD -MAGE -3-His -١ ‏تمثل تتابعات الأحماض‎ ٠ LPD -MAGE -3- His ‏ثم تحضير‎ ‘ alia ‏بأسلوب‎ ‏تمت تنقية البروتين الناتج بأسلوب مشابه‎ ١ ‏في تعريض التتابع رقمي ؟ و ؛‎ DNA ‏الأمينية و‎ ‏جرى تجانس المستنبت الخلوي وعولج‎ ٠» ‏بإيجاز‎ + LPD -MAGE -3- His ‏للبروتين‎ ‏مولاري وبيتا - وكابتوإيتانول 0 + مولاري في وجود منظف‎ ¢ HCI ‏بواسطة جوانيدين‎ ‏مولاري‎ Ol ‏رشح المنتج وعولجت المادة النافذة بواسطة يودو أسيتاميد‎ ٠ 96 ٠١ ‏إيمبيجين #ر‎ Ye ‏كلاب الزنك‎ ( IMAC ‏خضعت الأجزاء المعالجة بالكربوكسي أميد للتحليل الكروماتوجرافي‎ ٠ ‏جرى أولا إتزان العمود وغسل بواسطة محلول يحتوي على جوانيدين‎ (FF ‏سيفاروز‎ - ( Y ‏مل مولاري ¢ الرقم الهميدروجيني مر‎ Y ٠ ) ‏ع مولاري وفوسفات الصوديوم‎ 110 ‏لاري في‎ a t ‏ثم غسل العمود بواسطة محلول يحتوي علىالبولينا‎ ¢ 96 ٠ ‏وايمبجبين در‎ ٠ 96 ‏ومنظم إيمبيجين در‎ (V0 ‏مل مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني‎ ٠١ ( ‏فوسفات الصوديوم‎ ٠ ‏مل‎ ٠0 ( ‏فصل البروتين بالتصفية التتابعية في نفس المنظم ؛ ولكن مع زيادة تركيز الإيميدازول‎ ١) ‏مل مولاري‎ 5٠60 ‏مل مولاري و‎ ter ‏مولاري ؛‎ ‏سيكاروز للإتزان‎ - Q ‏حُضع عمود‎ ٠ ‏خفف ناتج التصفية بواسطة البولينا ؛ مولاري‎ ‏ملل مولاري ) الرقم الهميدروجيني‎ Yo ‏وغسل بواسطةالبولينا ¢ مولاري في منظم فوسفات‎ sale) ‏أجري غسل ثان في نفس المنظم ولكن بدون‎ ٠ % ٠ ‏في وجود | لإيمبيجين مر‎ ( Y ‏ص مر‎ ‘ ‏مل مولاري‎ ٠ ) ‏فصل البروتين في نفس المنظم ولكن مع زيادة الإيميدازول‎ ٠ةقطنملا‎ ٠ ‏وخضع ناتح الفصل للترشيح الفائق‎ ٠ ‏مولاري‎ ١٠ ‏مل مولاري‎ 6

CV Jee ‏تكوين بلازميد التعبير 0141114426 وتحويل السلالة العانلة 8 تلتنتسج‎ : NS1-MAGE-3 His + : ‏تصميم البروتين‎

ص يوصف في الشكل ‎VY‏ تصميم بروتين الإندماج ‎His‏ -3- [6خا/- 1151 المراد التعبير عنه في شي ‎٠‏ كولاي ‎'E.Colt‏ ‏التركيب الأولي للبروتين الناتج له التتابع المذكور في تعريف التتابع رقم # ‎٠‏ ‏وضع تتابع التشفير ) تعريف التتاب 1 ( المقابل لتعميم البروتين أعلاه تحث تحكم ‎٠‏ المعزز لامدا ‎APL‏ بلازميد تعبير عن ئي٠‏ كولاي؛ خطة الاستنساخ لتوليد بروتين الاندماج ‎—-MAGE -3- His‏ 1151 : كانت المادة البادئة هي بلازميد ‎CDNA‏ قادم من دكتور تيري بون في معهد لودفيج ؛ يحتوي على التتابع المشفر لمورثة ‎MAGE-3‏ والناقل 01/1081 ؛ المحتوي على ‎AM‏ حمض أميني لمنطقة تشفير ‎NST‏ ( بروتين غير تركيبي ) من الإنفلونزا ‎٠‏ ‎Ve‏ وتتضمن خطة الاستنساخ المحددة في الشكل ‎VY‏ الخطوات التالية : أ ( تضخيم ‎PCR.‏ للتتابعات المقدة في ‎cDNA MAGE-3‏ البلازميدي باستخدام الأوليجبو نيوكليوتيد المنطقي : ‎gc gee atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct‏ '5 والأوليجونيوكليوتيد اللا منطقي : ‎gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gee 1616 cece cte tet caa.

Vo‏ 5 يؤدي التضخيم إلى التحويرات التالية عند الطرف ]1 : تغير الروامز الخمس الأولى إلى استخدام رامز تي ‎٠‏ كو لاي ‎E.Coli‏ « استبدال الرامز [وخهبالرامز ‎Pro‏ عند الموقع 1 تركيب موٌضع 1 ‎Noo‏ عند الطرف ‎te‏ وأخيراً إضافة الرامزين ‎Gly‏ والرامز 7 ‎His‏ متبوعاً بموؤضع ‎Xbal‏ عند الطرف — ‎+C‏ ‎٠‏ آب) الاستنساخ إلى ناقل الاستنساخ ‎TA‏ للإنفيتروجين ؛ القطعة المضخمة أعلاه وتحضير الناقل الوسيط 14647 ‎٠ pRIT‏ ج) استئصال القطعة ‎Neo 1 Xbal‏ من 14647 ‎pRIT‏ البلازميدي والاستتساخ إلى ‎pRITPMG 1‏ للناقل + د ) تحويل سلالة العائل 58 ‎٠ AR‏ ‎Yo‏ ه) إنتقاء وتمييز متحولات سلالة تي ‎٠‏ كولاري المحتوية على 14426 ‎pRIT‏ البلازميدي (أنظر الشمل 4 ‎)١‏ المعبرة عن بروتين الإندماج ‎‘NS1 -MAGE -3- His‏

YY

: ‏المعاده تكوينه‎ ) pRIT 14426 ( NS1 -MAGE -3- His ‏تمييز‎ ‏في‎ lle / ‏مزود بالكاناميسين 00 ميكروجرام‎ LB ‏جرى إنماء البكتيريا على وسط‎ ‏عند 170 نانومتر ) ؛ تحقق الحث‎ ( + Y= ‏عند حقق المستنتبت كثافة ضوئية‎ + م٠‎ ٠م‎ 47 ‏الحراري برفع درجة الحرارة إلى‎ (coil) ‏وفككت‎ PBS ‏تعليقها في‎ sels ‏بعد ؛ ساعات من الحث ؛ جُمعت الخلايا ؛‎ cg ٠٠٠٠٠١ ‏دقيقة عند‎ ٠ ( ‏بالضغط * مرات في مكبس فرنش٠ بعد الطرد المركزي‎ ‏أظهرت‎ ٠ SDS - PAGE ‏حللت المادة الطافية الكروية والمستخرج الإجمالي بواسطة‎ ‏حيث مثل بروتين الإندماج حوالي \ % مسن‎ B 1 ‏البروتينات في هلامات مصيو غة بكوماسي‎ > ‏كولاي ؛ ظهر البروتين المعاد تكوينه كنتطاق واحد بوزن‎ ٠ ‏إجمالي بروتينات ئي‎ ‏ستخدام‎ A ‏وجرى تمييز بروتين الإندماج بواسطة 3 تحليا الْنخ لتخطيط الغربي با‎ ٠ K ¢¢ OA ‏ظاهري‎ Vo ٠ NS 1 ‏أحادي النسخ مضاد‎ : ‏مثال م‎ : ‏لتحصين الأرنب / الفئران‎ (E.Coli ‏كولاي‎ ٠ ‏ني‎ ( 2151 -MAGE -3- His ‏تنقية‎ ‎: ‏خطة التنقية‎ ٠ ‏جرى استخدام خطة التنقية التالية من أجل تنقية مولد المضاد‎ yo ‏تفكيك الخلايا + الطرد المركزي‎ ‏تذويب مولد المضاد + الطرد المركزي‎ ‏أجاروز‎ NTA + 7 ‏التركيز‎ ‏الخلية التحضيرية‎ Ye ‏وتذويب835ط‎ TCA ‏ترسيب‎ ‎lysis ‏أ ) التفكيك‎ ‏مل مولاري‎ ٠١ PO, alia ‏مل من‎ 7١7 ‏جم ) في‎ YF) ‏جرى تفكيك الخلايا البكتيرية‎ ‏بواسطة راني ( مجانس ) وخضع ناتج التفكك للطرد المركسزي في‎ V ‏الرقم الهيدروجيني‎ - ٠ ‏دورةٌ في الدقيقة خلال و9 دقيقة‎ ٠ Java GA 20 ‏دوار‎ Yo ry

جرى نبذ المادة الطافية ‎٠‏ ‏@( تذويب مولد المضاد :

أعيد تذويب ‎©/١‏ الكرية 14 / 0 في 4 أم في ‎TE‏ مل من ,20 ‎٠٠١‏ مل مولاري - ‎١ ©0110‏ مولاري - الرقم الهيدروجيني ‎٠ ١‏ بعد الطرد المركزي في دوار 20 ‎Jara JA‏

‎١90000‏ دورة في الدقيقة ؛ نبذت الكرية وجرت تنقية المادة الطافية بواسطة ‎IMAC‏ أيضاً ؛ ج) التحليل الكروماتوجرافي بالألفة : * ‎NTA + Ni‏ أجاروز ( كيماجين ) ‎٠‏ ‏حجم العمود : ‎١5‏ مل ( ‎١١‏ مليمتر ‎X‏ درا سم ‎٠١)‏ ‏منظم التعبئة : ‎PO‏ ١ر١٠‏ مولاري = 01101 +“ مولاري - الرقم الهيدروجيني ‎V‏ ‏منظم العينة : ‎idem‏ ‎٠‏ منظم الغسل : ‎PO‏ ١ر١‏ مولاري = ‎GUHC‏ مولاري - الرقم الهيدروجيني 7 ‎POy‏ ١ر١‏ مولاري - بولينا ‎٠‏ مولاري - الرقم الهيدروجيني ‎١7‏ ‎Jul‏ بالتصفية التتابعية : تدرح ايميدازول ( صفر ‎Your‏ مل مولاري ) في منظم ‎PO;‏ ‏١ر١‏ مولاري ؛الرقم الهيدروجيني 7 ؛ مكمل بواسطة اليوريا 7 مولاري٠‏ معدل التدفق : ؟ مللتر / دقيقة ؛ أ ) التركيسز :

‏جمعت أجزاء ناتج الفصل ‎IMAC‏ موجبة مولد المضاد ( ‎١٠١‏ مل ) وركزت إلى ه مل في خلية محركة بواسطة أميكورن على غشاء ترشيح ( نوع أوميجا الفاصل ‎٠ ) ٠٠٠٠١‏ وتبلغ النقاوة في هذه المرحلة حوالي ‎7١0‏ 96 كما تقدر بواسطة ‎٠ SDS - PAGE‏ ب) الاستشراد الكهربي التحضيري ( بيوراد الخلوي التحضيري ) :

‎"٠‏ تم غلي ‎YE‏ مل من العينة المركزة في 4ر١‏ مل من منظم عينة مختزل وسخنت على هلام أكريلاميد ‎٠ 96 ٠١‏ فصل مولد المضاد بالتصفية في منظم تريس - جليسين؛ الرقم الهيدروجيني ‎AY‏ مكمل بواسطة ‎SDS‏ ؛ 96 ؛ وجُمعت الأجزاء الموجبة ‎NS1 -MAGE -3- His‏ + ‎i‏ ( ترسيب ‎TCA‏ :

Ye

JA 20 ‏وبعد الطرد المركزي في دوار‎ TCA ‏جرىترسيب مولد المضاد بواسطة‎ ‏ايميد تذويب الكرية‎ ٠ ‏الطافية‎ sald) ‏دقيقة 6 نبذت‎ ٠١ ‏دورة في الدقيقة لمدة‎ YO 8 Jara ٠ VO ‏الرقم الهيدروجيني‎ - PBS ‏في منظم‎ ‏بعد التجميد : الإذابة ؛ أي تفكك عند تخزينه‎ PBS ‏لم يظهر البروتين القابل للذوبان في‎ ‏دالتون كما يقدر بواسطة‎ Ov van ‏ظاهري حوالي‎ SH ‏لمدة ؟ ساعات في بي 5 وله وزن‎ o ١) % ١١ ‏مر‎ PAGE ) SDS : 4 ‏مثال‎ ‎CLY TA —- ‏اتعفآا‎ - His Tail ‏تحضير سلالة ئي٠كولاي المعبرة عن بروتين إندماج‎ : ARS8 ‏وتحويل السلالةالعائلة‎ pRIT 14613 ‏تكوين بلازميدا التعبير‎ -١ : ‏تصميم البروتين‎ ٠ ‏المراد‎ Clyta — Mage -1- His ‏تصميم بروتين الإندماج‎ Yo ‏يوصف في الشكل‎ ٠ E.Coli يالوك٠‎ A ‏التعبير عنه في‎ ٠ 7 ‏التركيب الأولي للبروتين الناتج له التتابع المذكور في تعريف التتابع رقم‎ ‏المقابل لتصميم البروتين أعلاه تحت‎ ( A ‏وضع تتابع التشفير ) أنظر تعريف التتابع رقم‎ ‏كولاي؛‎ ٠ ‏تحكم المعزز لامدا 1 في بلازميد تعبير عن ئي‎ ١ : ‏الاستنساخ‎ ‎C= ‏الطرفية‎ ١١١7 ‏الذي يحتوي عى الروامز‎ PCUZL ‏كانت المادة الناقلة هي الناقل‎ streptococcus pneumoniae ‏من المكور السبحي للإلتهاب الرئوي‎ LytA ‏بمنطقة تشفير‎

MAGE! ‏لمورثتة‎ cDNA ‏؛ الذي قمنا فيه بالإستنساخ الفرعي ل‎ pRIT 14518 ‏والناقل‎ ‎٠ ‏.من قبل من بلازميد من دكتور ثيري موون من معهد لورفيج‎ ٠ ‏(أنظر‎ CLYTA - MAGE -1- His ‏وتضمنت خطة الاستنساخ للتعبير عن البروتين‎ : ‏الخطوات التالية‎ ) ١١ ‏التخطي في الشكل‎ + CLYTA - MAGE -1- His ‏تحضير نموذج تتابع تشفر‎ -7 ‏اا‎

Yo

CLYTA ‏الذي يهدف إلى تطويق تتابعات‎ « PCR ‏أ ( الخطوة الأولى هي تضخيم‎ ‏كقاعدة‎ PCUZI ‏باستخدام البلازميد‎ PCR ‏أجري تضخيم‎ ٠ Ndel -- ASIII ‏برافع التقييد‎ : ‏وكأوليات الأوليجويوكليوتيد المنطقي‎ 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca 6 : ‏والأوليجوبيوكليوتيد اللا منطقي‎ 0

GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. ٠ ‏نيوكليوتيد‎ PVA ‏الذي طوله‎ CLYTA ‏ويؤدي ذلك إلى تضخيم تتابع‎ ‏لتوليد‎ « MAGE -1- His ‏بتتابعات‎ CLYTA ‏ب) الخطوة اثانية هي ربط تتابعات‎

Ndel - Clyta ‏وتضمنت هذه الخطوة استئتصال القطعة‎ ٠ ‏التتابع المشفر لبروتين الإندماج‎ ‏و‎ Ndel ‏وأقحامها إلى التفاعل 0181114518 المقترح من قبل بواسطة إنزمي التقييد‎ ALITY ٠ pRIT 14613 ‏ليظهر البلازميد‎ ) 2 TIT ‏و‎ Neco 1 ‏متوافقات مع‎ ( Neol ٠ AR 58 ‏ج) تحول السلالة العائلة‎ ‏المحتوي على البلازميد‎ (KINA ‏كولاي ( مقاوم ل‎ ٠ (JS ‏د ) إنتقاء وتمييز متحول‎ ‏)؛‎ ٠١ ‏أنظر الشكل‎ ( pRIT 14613 : ) pRIT 14613 ) CLYTA - MAGE -1- His ‏تمييز البروتين المعاد تكوينه‎ -١ Vo ‏مزود ب 00 ميكروجرام / ملتر كاناميسين في‎ LB ‏جرى إنماء البكتيريا على وسط‎ ‏نانو متر ) ؛ تحقق الحث‎ +7١ ‏وعندما حقق المستنبت كثافة ضوئية *ر١؛ ( عند‎ . © co YA ‏الحراري برفع درجة الحرارة إلى‎ ) ‏وفككت ( بالتشتت‎ PBS ‏بعد ؛ ساعات من الحث ؛ جُمعت الخلايا وأعيد تعليقها في‎ ‏الطافية الكروية والمستخرج الإجمالي‎ sald) ‏بعد الطرد المركزي ؛ جرى تحليل‎ ٠ ‏دفعة واحدة‎ TY ‏؛ حيث‎ Bl ‏أظهرت البروتينات في هلامات مصبوغة بكوماسي‎ ٠ SDS - PAGE ‏بواسطة‎ ‏وظهر البروتين المعاد‎ ٠ ‏من إجمالي بروتينات ي٠ كولاي‎ 906 ١ ‏مثل بروتين الإندماج حوالي‎ ‏وجرى تمييز بروتين‎ ٠ ‏تكوينه كنطاق واحد له وزن جزيئي ظاهري حوالي 9؟ كيلو دالتون‎ ‏الاندماج بواسطة تحليل التخطيط الغربي لاستخدام أجسام مضادة عديدة النسخ لمضاد‎ ٠ Mage -1 Ye

اط ‎Bale)‏ تكوين وحدة التعبير المكونة من معزز لامدا ‎pL‏ الطويل ( المفيد ‎dal‏ حمض الناليديكسيك ) وتتابع تشفير ( ‎(pRIT 14614( CLYTA — Mag‏ : تم تحضير جزء تقييد ‎ECORI - NCO;‏ يحتوي على المعزز ‎pL‏ الطويل وجزء من تتابعات ‎CLYTA‏ من البلازميد 10/6 ‎pRIT‏ وإقحامه بين مواقع ‎EcoRI - NCO;‏ في 0 البلازميد ‎٠ pRIT1463‏ تم الحصول على البلازميد المعاد تكوينه 15614 01811 ‎٠‏ ‏إستخدم البلازميد المعاد تكوينه 0181114614 ( أنظر الشكل ‎١7‏ ) المشفر لبروتين الاندماج ‎CLYTA - MAGE -1- His‏ لتحويل ئي ‎٠‏ كولاي 120 ‎٠ AR‏ تم إنتقاء وتمييز سلالة مرسخة مقاومة للكاناميسين ‎٠‏ ‎٠‏ > تمييز البروتين المعاد تكوينه : تم إنماء البكتيريا على وسط ‎LB‏ مكمل بالكناميسين ‎5٠‏ ملجرام / مللتر في ١م‏ عندما حقق المستنبت كثافة ضوئية 50860 ( عند ‎7١‏ نانومتر ) أضيف حمض الناليديكسيك إلى تركيز نهائي ‎٠١0‏ مجم / مللتر ‎٠‏ ‏بعد ؛ ساعات من الحث ؛ ‎Cad‏ الخلايا وأعيد تعليقها في ‎PBS‏ وفككت بالتشتت (نوع ‎١‏ التشتت ‎CLS‏ دفعة واحدة ) ‎٠‏ بعد الطرد المركزي ؛ جرى تحليل المادة الطافية الكروية والمستخرج الإجمالي بواسطة ‎SDS - PAGE‏ + أظهرت البروتينات في هلامات مصبوغة بأزرق كوماسي ؛ حيث ‎die‏ بروتين الاندماج حوالي ‎١‏ 96 من إجمالي بروتينات ني ‎٠‏ كولاي ؛ جرى تمييز بروثين ا لاندماج بواسطة تحليل التخطيط الغربي باستخدام أجسام مضادة عديد النسيخ لمضاد 1 ‎Mage‏ للأرنب ؛ ظهر البروتين المعاد تكوينه كنطاق واحد له وزن جزيئشي ‎Ye.‏ ظاهري حوالي £9 كيلو دالتون ‎٠‏ ‏مثال ‎Aa‏ ‎CLYTA - MAGE -3- His‏ ‎i‏ : مولد مضاد معاد تكطوينه لنبذ الورم : بروين إندماج ‎CLYTA - MAGE -3- His‏ « حيث يؤدي شريك الاندماج ‎C—Lyt A‏ إلى التعبير عن بروتين قابل للذوبان ؛ يعمل كرقعة ‎Yo‏ ألفة ويوفر مساعد 1 مفيد ؛ تحضير سلالة ئي ‎٠‏ كولاي المعبرة عن بروتين إندماج ‎CLYTA - MAGE -3- His tail‏ + اا vy تكوين بلازميد التعبير ‎pRIT14646‏ وتحويل السلالة العائلة 120 ‎AR‏ : تصميم البروتين : يوصف في الشكل ‎VA‏ تصميم بروتين الاندماج ‎CLYTA — MAGE -3- His‏ المراد التعيير عنه في ي ‎٠‏ كولاي؛ التركيب الأولي للبروتين الناتج له التتابع الموصوف في تعريف التتابع رقم 9 : وتتابع التشفير في تعريف التتابع رقم ‎٠ ٠١‏ وضع تتابع التشفير المقابل لتعميم البروتين أعلاه تحت تحكم المعزز لامدا ‎PL‏ في بلازميد التعبير عن ي ‎٠‏ كولاي٠‏ الاستنساخ : ‎٠١‏ كانت المادة البادئة هي الناقل ‎PCUZT‏ الذي يحتوي على الروامز ‎١١١7‏ 0 الطرفية بمنطقة تشفر غالر.آ من المكور السبحي للإلتهاب الرئوي ‎streptococcus pneumoniae‏ « الموصوف في المورثة 47 ؛ ‎(VAAN)‏ ¢ صفحة 165 - ‎YVY‏ والناقل 0181114426 ؛ الذي قمنا فيه من قبل بالاستنساخ الغربي ل ‎cDNA‏ للمورثة ‎MAGE-3‏ في بلازميد من دكتور ثيري يون من معهد لورفيج ‎٠‏ ‎yo‏ وتضمنت خطة الاستنساخ للتعبير عن البروتين ‎CLYTA - MAGE -3- His‏ (أنظر المخطط في الشكل ‎١9‏ ) الخطوات التالية : ‎: CLYTA — MAGE -3- His ‏تحضير نموذج تتابع تشفير‎ -١

CLYTA ‏؛ الذي يهدف إلى تطويق تتابعات‎ PCR ‏الخطوة الأولى هي تضخيم‎ =) - ١

PCUZI ‏باستخدام البلازميد‎ PCR ‏أجري تضخيم‎ ٠ ‏و 111 1ك‎ Afl IT ‏بواسطة مواضع تقييد‎ : ‏كقاعدة وكأوليات الأوليجونيوكليوتيد المنطقي‎ | ٠ 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac : ‏والأوليجونيوكلوتيد اللا منطقي‎ 5' ccc aca tgt cca gac tge tgg cea att ctg gee tgt ctg cca gtg. ‏جرى استنساخ الجزء‎ ٠ ‏الذي طوله 77؛ نيوكليوتيداً‎ CLYTA ‏ويؤدي ذلك إلى تضخم تتابع‎ ‏5 المضخم أعلاه إلى ناقل الاستتنساخ ‎TA‏ بالأنفيثروجين للحصول على الناقل الوسيط ‎٠ pRIT14661

A

‏لتوليد‎ « MAGE -1- Hise ‏بتتابعات‎ CLY TA ‏؟ - الخطوة الثانية هي ربط تتابعات‎ — ١

ClytA Afl IT - Afl TIT ‏وتضمنت هذه الخطوة استئصال‎ ٠ ‏التتابع المشفر لبروتين الاندماج‎

Neo 1 ‏و‎ Afl 11 ‏وإقحامه في الناقل 0181114426 المفتوح من قبل بواسطة إنزيمي التقييد‎ ٠ pRIT 14662 ‏وظهور البلازميد‎ ) AI 1] ‏و‎ Neo 1 ‏متوافقان مع‎ ( ‏لحث حمض‎ dal) ( ‏الطويل‎ pL ‏؟- إعادة تكوين وحدة التعبير المكونة من المعزز لامدا‎ - ١

CLYTA - MAGE -3- His ‏الناليديكسيك ) وتتابع تشفر‎ ‏القصير وتتابعات‎ pL ‏المحتوي على المعزز‎ 38111 - Xba 1 ‏تقييد‎ ja ‏جرى تحضير‎

Bgl ‏من البلازميد 0181114662 وأقحامه بين مراجع‎ CLYTA - MAGE -3- His ‏تشفير‎ ‏كمشتق 0312322 يحتوي على مقاومة الأمبيسيللين؛‎ ( TCM 67 ‏بالبلازميد‎ 11 - 1

AX / 1877 ‏والمعز لامدا بآ الطويل ؛ الموصوف في طلب براءة الاختراع الدولية رقم‎ ٠ ٠ PRIT14607 ‏وتم الحصول على البلازميد‎ ١ ) 201/8 ‏جرى استخدام البلازميد المعاد تكوينه 0121114607 المشسفر لبروتين الاندماج‎ (VANS ‏موت وآخرون ؛‎ ( ARI20 ‏كولاي‎ ٠ ‏لتحول ني‎ CLYTA - MAGE -3- His ‏ثم إنتقاء وتمييز سلالة مرشحة مقاومة‎ ٠ (AA : 87 + ‏محاضر الأكاديمية القومية للعلوم‎ ‎٠‏ للأمبيسيللين ؛ ‏*- تحضير البلازميد 0181114646 : تم في النهاية تكوين بلازميد مشابه ل 0181114607 ولكن له إنتقاء للكاناميسين ‎(PRIT14646)‏ + تمييز البروتين المعاد تكوينه : ‏أ جرة إنماء البكتيريا على وسط ‎LB‏ مزود بالكاناميسين ‎5٠‏ مجم / مل في ‎WA‏ م وعندما حقق المستنبت كثافة ضوئية = 506 ( عند 100 نانو متر ) أضيف حمض الناليديكسيك إلى تركيز نهائي ‎٠١‏ مجم / مل ‎٠»‏ ‏بعد ؛ ساعات من الحث ؛ جُمعت الخلايا وأعيد تعليقها في ‎PBS‏ وفككت بالتشفتت ‏(عولج التشتت ‎CLS‏ دفعة واحدة ) ‎٠‏ بعد الطرد المركزى ‎٠‏ حللت المادة الطافية الكروية ‎To‏ والمستخرج الإجمالي بواسطة ‎٠ SDS - PAGE‏ أظهر البروتينات في هلامات مصبوغة ‏بأزرة كوماسي حيث ‎Jie‏ بروتين الاندماج حوالي 961 من بروتينات ي ‎٠‏ كولاي الإجمالية ‎٠‏ vq ‏جرى تمييز بروتين الاندماج بواسطة تحليل التخطيط الغربي باستخدام أجسام مضادة عديد‎ ‏ظهر البروتين المعاد تكوينه كنطاق واحد له وزن جزيئي‎ ٠؛‎ <i pW Mage-3 ‏النسخ لمضاد‎ ٠ ‏كيلودالتون‎ oA ‏ظاهري حوالي‎

CY ‏مالف‎ ‎: CLYTA — MAGE -3- His ‏تنقية البروتين العاد تكوينه‎ © ‏لتراً‎ Ys ‏في مخمر‎ ) 01811 14646 ) AR 120 ‏جرى إنماء البكتيريا المعاد تكوينها‎ ‏جرى حيث التعبير عن البروتين المعاد تكوينه بإضافة‎ ٠ ‏تحت ظروف تغذية بالدفعة في 70م‎ ‏جُمعت الخلايا بنهاية التخمر وفككت عند‎ ٠ ‏مجم / مل‎ Te ‏حمض الناليديكسيك بتركيز نهائي‎ ‏بواسطة إمرارين خلال مشتت مكبس فرنش ( 70000 باوند على‎ ٠٠0١ / 6١ ‏كثافة ضوئية‎ ‏ع في أم١ تم‎ 15006 Joe ‏دقيقة‎ 1١ ‏جرى تكوير الخلايا المفككة لمدة‎ ٠ ) ‏البوصة المربعة‎ ٠ ‏سيفاروز‎ DEAE ‏شحن المادة الطافية المحتوية على البروتين المعاد تكوينه على راتنج تبادل‎ ‏مل‎ 7١ HCl - ‏مولاري ؛ تريس‎ + OF NaCl ‏فارماسيا ) سابق الاتزان في‎ CLOB ‏بعد غسل العمود بواسطة المنظم أ ؛ جرى‎ ٠ ‏مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني ١7ر7 ؛ المنظم أ‎ ‏تم جمع أجزاء‎ ٠ ) ‏فصل بروتين الاندماج بالتصفية التتابعة بواسطة 7 96 كولين ( المنظم أ‎ ‏مولد المضاد الموجبة كما تظهر بواسطة تحليل التخطيط الغربي باستخدام جسم مضاد ل‎ 00 ‏در 96 (منظف‎ BB ‏إلى ايميجين‎ DEAE ‏مولد المضاد المصفى بواسطة‎ Ji ٠ Mage -3 ‏هجيني الشحنة) وإلى 1)201*ر٠ مولاري قبل التعبئة إلى عمود تحليل كروماتوجرافي بالألفة‎ ‏مولاري ؛ منظم فوسفات 50 مل‎ ١ ‏در‎ NaCl ‏؛‎ 96 + 50 BB ‏الفلزية الأيونية من ايميجين‎ ٠ ) ‏مولاري ؛ الرقم الهيدروجيني 7ر7 ( المنظم ب‎ ‏نانومتر الخط‎ YA ‏ب حتى حقق الامتصاص‎ plaid) ‏بواسطة‎ IMAC ‏عمود‎ Jud ‏المنظم ج) من أجل‎ ( BB ‏جرى تنفيذ عسل ثان في المنظم ب بدون الامييجين‎ ٠ ‏القاعدي‎ ‏مل مولاري ايميدازول‎ You = ‏إزالة المنظف قبل فصل مولد المضاد بتدرج ايميدازول صفر‎ a ‏في المنظم‎ ‏مولاري ؛ وركزت على غشاء أوميجا‎ YO = ١ر٠8 ‏تم جمع أجزاء ايميدازول‎

PBS ‏كيلودالتون قبل الفصل الغشائي مقابل منظم‎ ٠١ gos YO

$e : ‏الاستنتاج‎ ‏مولد مناعي في الفئران ؛‎ LPD - MAGE3 - His ‏أوضحنا أن البروتين المندمج‎ ‏وأن هذا التوليد المناعي ( استجابة التكاثر واستجابة الجسم المضاد ) يمكن زيادته أيضاً‎ ‏ويمكن تعزيز التكاثر باشتقاق مركبات الثيول التي‎ ٠ ‏باستخدام المادة المساعدة الموصوفة أعلاه‎ ٠ ‏تشكل روابط ثنائي الكبريتيد‎ oo

LPD- ‏وأوضحنا أيضاً أنه يمكن إطلاق استجابة جسم مضاد أفضل بالتلقيح بواسطة‎ ‏ويقترح النمط المتماقل السائد في مصسل‎ ٠ ‏في وجود مادة مساعدة‎ MAGE3- 5 ٠ 111 1 ‏وهو 18025 مع الاستجابة المناعية من نوع‎ 76 ‏في‎ LPD-Mage3-His ‏وفي البشر ؛ أظهرت دراسة إكلينيكية لمريض عولج بواسطة‎ ٠ ‏صياغة بدون مادة مساعدة إختفاء الورم القتاميني‎ 0 ٠ ‏قائمة التتابعات‎ dle ‏معلومات‎ )١( ‏الطالب : شركة سمتكلاين بيتشام بيولوجيكالز‎ )١( ‏عنوان الاختراع : لقاح‎ (Y) Vo ٠١ : ‏رقم التسلسل‎ (7) ‏(؛) عنوان المراسلة‎ ‏المرسل إليه : سميثكلاين بيتشام‎ (1) ‏(ب) الشارع : ؟ نيو هورازونز كورت ؛ جريت ويست رود ؛ بي‎ ‏ميدكس‎ : Lindl ‏(ج)‎ Y. : ‏(د ) الولابة‎ ‏(ه) الدولة : المملكة المتحدة‎

TWS 9EP ‏(و ) المنطقة‎ : ‏النموذج المقروء بالحاسب الآلي‎ (0) gat : طيسولا ‏(أ) نوع‎ Yo ‏متفق مع أبام‎ 1 GW ‏(ب) الحاسب‎ opr : 0 ‏(ج) نظام التشغيل‎

١

FastSEQ for Windows Version 2.0 : ‏(د ) البرنامج‎ : ‏بيانات الطلب الحالي‎ (1) : hall ‏رقم‎ ( i ) : ميدقتلا ‏(ب) تاريخ‎ po ‏(ج) التصنيف‎ : ‏بيانات الطلب السابق‎ (VY) : بلطلا ‏أ ) رقم‎ ( : ‏(ب)_تاريخ التقديم‎ : ‏معلومات المحامي ؛ الوكيل‎ (A) ‏الأسم : ماركوس جي دالتون‎ ( i ) Yo : ‏(ب) رقم التسجيل‎ 07 ‏رقم المرجع / الحافظة : بي‎ (z) : ‏معلومات الاتصالات‎ (3) ‏الهاتف 8 تلاح الغ‎ (1) ‏اخ‎ AVeIYY : ‏(ب) الفاكس‎ yo : سكلتلا ‏(ج)‎ ‎Yo: ‏معلومات تعريف التسلسل رقم‎ ) : ‏خواص التسلسل‎ (1) ‏"؛ حمض أميني‎ : لوطلا‎ (1) ‏أميني‎ Jae : g sil ‏(ب)‎ Ye ap: ‏(ج) الجديلة‎ ‏خطية‎ : ‏(د) الطوبولوجية‎ ‏بروتين‎ |: wales )"( ١ : ‏وصف التسلسل : تعريف التسلسل‎ (VY)

Xo

Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu

Ma Gly Cys Ser ser His Ser Ser Asn rat Ala Asn Thr Gln mid Lys

£y

Te Yo Ye

Jer Asp Lys lle (le 1le Ala lis Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro

Te £- fo

Glu 1115 Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu ‏مقلم‎ Phe Ala Gln &ln Ala Asp oe oo 9٠

Tyr Leu Glu ‏ع1‎ Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Mhrg Leu Val Val 2 ‏م‎ xe he

Tre 1118 Asp (liz Phe Leu Asp Gly Lau Thr » Val Ala Lye Lys Phe

Ad qe qe

Pro His nrg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr yore ro 11 +

Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn ‏قاط‎ Glu The Met ١١ 17- 1¥e ‏صعم‎ Len Glu Gin Arg Ser Gln His Cys Lys Frn Glu Glu Gly Leu Glu

Ye. 1Yo 1.

Ala Arg Gly Glu Ala Ten Gly Len Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Tha 1{o Yor 100 ‏ا‎ ‎Glu Glu Gin Glu Ala Ala Ser Sey Sex Ser Thr Leu Val Glu Vel ‏ما‎ ‎oe 197 2

Leu GLy GEu Val Pro Ala Ada i3Llu Ser Pro Asp fio Pro 01: Ser ‏ممت‎ ‎1A 1Ae 14.

Gln Gly Ala Ser Scr Lew Pro Thr Thr Met Aan Tyr Pro Leu Trp Hes 142 Yee Yep

Glu Sor tyr Glu Asp Sur Ser Asn Gla Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr

Phe 1 Asp Leu Glu Hex 519 Phe Gln Ala Ala Yin Ser Arg Lys Val

Ye 11 َ

Ala Glu Lew Val His the leu Tea Len Lys 2 Arg Ala Arg Giu Hoo

Yeo Yor Yao val Thr Lys Ala Gla Meat Len ‏بل‎ Ser Val Val Gly ‏يرجم‎ lip Gla Tyr 1١ Tle TY.

Phe Phe Pras Val Ile Fhe Ser Lvs Ala Ser der Ser Leu Gin Leu Val

Tyo i YA» YAO

Pne Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp 1:0 tle Gly His Leu Tyr Ile

Yq- Yao Teo fhe ‏ملظ‎ Thr Cys Lea Gly Lew Her Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn

Teo 1 fe TY.

Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala ‏م11‎ ilu

Yie Te 7

Ala Arg Glu GLy Asp Cws Ala Pro 512 €lu Lys 1le Trp Glu Glu Leu

Ye Yio Yor

Ser Val Leu Clu Val Pos Glu Glv Arg Glu Asp Ser Tle Leu Gly Asp

Too 1 - ro

Pro Lys Lys Lua Lew 1: 2:10 His Phe Val Gin Glu Asn Tyr Leu Glu ey. ¥ve TA

Tyr Arg Gln Val tro Uly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Tip

TAS vq. q ‏في‎ ‎Gly Fro Arg Ala Leu Val Glu Tnr Ser ‏رود‎ VEL Lys Val Leu His he ] fra . ١ Elo

Met Vai Lys 126 Ser Sly ly Pic His lle Ser Tyr Pro Fra Leu lis 7 ‏لد‎ ir.

Glu Trp Val Leu Arg Glu Sly Glu Glu Thr ‏عع‎ Gly Gly His His His iva 11. to

His Hiz His for

Tr py ‏معلومات تعريف التبلسل‎ ) 3 ( ‏خواص التكسلسمل ؛‎ )]١( ‏زوج اهدي‎ ret 1 ‏الطول‎ (1) ‏نووري‎ Frat 4 ‏لنوغ‎ I ‏ب‎

ا (د) ‎ag lg gb‏ خطيبسة (؟) نوع الجريبيبي : ‎CDNA‏ ‏)14( وصف التسلسل » تعريف التسلسل رقم ‎Vou‏ ‏.1 مم7 17و20 ‎TTALCAGCTS CUGTAUTAGS‏ ممت وما حدم قم 1ر20 ‎ATGAAATCAC NCAABATCAT 127113072 ive‏ ممعملممه ‎AGCCATTCAT CAMTATGG‏ ‎CCGETTATIT ACCAGAGCAT ACCTTAARAT CTAAASCALT I'GCGTTTGUA YA‏ 5100146017 ‎LMALAGGCTG RTYATTTACA GCAAGATTTA GUAATGRCTA AGGATGGTCE TTTAGTCSI Yio‏ ‎ATTCACGATC AUTTTTTAGA TGECTTCACT GATGTTECGA AARRRTTCCC ACATCCTCAT ee‏ ‎Ye‏ يتمع م 5771م ‎CGTAAAGATS GCCGTTACTA I'GTCATCEAC 'TTACCTTAA AAGIAAATTCR‏ ‎ATGACAGAAR ACTTTGANAC CATGEATETG GAACRGOUTA GTCAGCACTS CANICCTGAL gy.‏ م ‎GAAGSCCTTG 24001020356 AGAGSCCUTE GECCTOL GE GTGCGCAGEE TCCTGU TACT‏ عع 60176 ‎GAGGAGCACG 66022602110 CTCCTCTTOT 010 AAGTUACCCT‏ ‎Tse‏ مجع !"اس ‎CAGCCTUCAG‏ وجم: امعدمم ‎COTSETUCCE AGTCALUAGE TTCTCGOOAG‏ ‎ACCATGAACT 202-01070176 GAGUCARTCC TATGAGGACT CCRGUAARCCA AGAAGAGOAL 11.‏ ل ‎COOCCAAGLA 0117000157 UCTGGALTON LAGTTCCAAG CAGCANTCOAG TAGRAAGGTG‏ ‎Yar‏ مهت06ف0277م: ‎GGGAGCCGGT‏ مددجموعو 50100 10201011107 ‎GCLGAATTGS‏ ‎CARATGCTGGE CUAGTGTCCT CGHAANTTGG CAGTATTTUT TTOCTGTCAT CTTCAGCAAR, Age‏ ‎GCTILCAGTT CUTTECAGUT GGTCTTTGSE ATCCAGCTGA TGGAAUIGGA CCCCATOGGE Qre‏ ف ‎CACTTSTACA 07110036 CTGCCTGERC 0700-6 ATGGCCTGET CUGTGACAAT‏ «ء؟ءل ‎CCATAATCGC AAGAGRGGHEC‏ موجن كم ‎CCAAGGUAGG CCTUUTGATA‏ اكه لاطا ءا 51175586600 ‎FACTLUTGONE CTGAGGAGAA AATCTGHGAB GAGCTGAGTS TCTTAGACCT‏ ‎COCAACATTT COTGCAGGAA ne‏ موده وحم ‎NGLUAAGACA GTATUTTAEGE GGATLOCAAG‏ ‎Teo‏ موي اعد ‎ANUTACCTGG NGTANCGGCA GOTUCCCAGS AGIGATICTG CATHTTATGA‏ .71" جمد ‎CGTCCAAGGG 12016537767 AACCRGOTAT CTRAANCTCC TECACCATAT‏ ‎CTCACATTTY UTACCCACCS 077 GGGTTTTGAL AGAGGGGEAA TY.‏ غ60 اطغطنثاناامكة ‎GAGEGLGUTC ATCACCATCA CUATCACCAT TAA 7‏ () معلومات تعريف التسلسل رقم ‎Yo‏ ‏(١)خواض ‎Leeda‏ ‏(أ) الطضول 4 13200 زوج قاعدي (ب) ‎pel‏ ؛ حمض نووي )2( الجديلة. قردية (د] الطوبولوجية . خطيسة (»أنوع ‎CDNA + eon)‏ 1 صف التسلسل ‎i . 8 Sov‏ . ‎hoki vip pai JL CCOTACTAGE rma 1,‏ ل كور ددم ‎ATECATCCAA‏ ‎ATCARATIAG ACAAAATCAT TATTGOTCAC iy.‏ قم ممحطمظة ‎AGCCATICAT CAAATATGGE‏ ‎CGTCUTGETA 60601151711 ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTARAGCALT 2001:1775 YA+‏ ‎CAACASGCTG ATTATITAGA GCAAGATTTA GUAATGACTA AGGATHITCG TP PAGTESTT TEs‏ ‎ATTCACGATC ACITTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTCLGA ARAAATTCCC ACAPCGTCAT Too‏ ‎CHTAARGATG GCUGTTACTA TGTCATCCAC TTTACCTTAA ARGANATTCA AAGTTTAGAR 1.‏ ‎٠‏ وى ‎ATGACNCGAAR AUTTTGARAC CATGGECICT CTHGANAGE GTAGTCTCUA‏ عا 560100 211151510112 ‎ACANGAGGCC CTGGCOUIGE‏ 7756-0002 2835000 مم ‎CCTEOGCALL CUGCAGGAGH 620162 TGGGTUAACA‏ 10097010071 1007:0001 ‎Tee‏ همعن 117-71 ‎CTACCATUAA‏ امعموذجج5 9626001700 ‎AGAGTCCTUA‏ 010070 ما ‎CETGAACAGE AGSCGCCAMG CACCTCTTGY 11.‏ لمحم" ‎CAGAGGCARC CCAGTGAGGEG‏ ‎ATCCTGCAGY 0110117070 ASCAGTARTC ACTAAGAAGG TGGCTGATTT GGTTGEI TTT 71+‏ ‎AATATCUAGE CAGGGAGLCA CTCACARAAGG CAGAAATGCT GCAGAGTGTC YA‏ 1521153 ‎ATCAAAAATT RACAAGCUACTS TTTTCGTSEAS 2010111185507 AAGUCTU IGA CTUUTTGCAS Af»‏ ‎CUALTGACET GAANGGARGCA GACOCCATES 50020100127 TGTCCITRLTC Qe‏ 6611116 ‎ACCTGCOTAG 02610110177 1006060076 CTUGGTGATA ATCAGETCAT GCCCAAGACA 11‏ ‎COUITCCTGA TAATTETCCT CGTCATGATT GUAATGEAGG CLGGCCATGE TCLTGAGGAS y+‏ ‎GAAATCTGGE AGGAGCTGAG TUTHATGGAG GTGTATGATS GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT bra‏ ا و1700 ‎GHEGAGCCCA GGAAGCTGCT CACCCAAGAT 163766 AARAGTACUT‏ +11 ججي0001 ‎GAGTTCOTET GGGGTCCARG‏ االموووعقعق 7020 م0 5761524-66 te

GAAACCAECT ATGTEARAGT LCTTGRGTAT CTGATCAAGG 'ICAGTCCARG AGTTCGTTTT 177.

TICTTCCCAT CCUITGECETOA AGCAGCTTTS AGAGALGGMCG AAGAGGGALT 05000021322 ITY

CACTATCACC ATCACCATTA A ve)

EL ‏معلومات تعريف التسلسل رقم‎ (7)

Ln ‏خواص‎ (1) ‏الطول .1 £11 حمض اميني‎ (1) ‏حمض اميني‎ pl ‏(ب)‎ ‏(ج) الجديلة . فردية‎ ‏(د) الطلوبولوجية ؛ خطية‎ ‏بونيبلن‎ Cod ١ ‏نوع‎ (1)

Eon ‏تمريف التسلسل رقم‎ ١ ‏وصف التسلسل‎ (11)

Mes Asp Cro Lys The Leu Ala Leu Ser Leu leu Ala Ala Gly Yai Leu } o . 0

Ala Gly Cys Sev Sor His Ser der Aon Met Ala Asn Ter Slo Met Lys 9 Yo Ld fer ‏عع‎ Lys Ile Ile Ile Ale His Reg ‏انا‎ Ala Ser aly Tyr Leu Pro ve ٠ fa lu His Thr Leu Glu Ser Lvs Ala Lea Ala Ye Ariz lo Alin Als asp 5+ ‏5ه‎ 1.

Tyr Leu Clu Gln Asp Lou Ala Met ‘thr Lys Asp Cly Arg Zea val val le : ve : vo oo. Ae «te Mis Asp lis Phe Leu Asp Cly Tew Thr Asp Val ‏فلم‎ Lys [ys Phe

A © 9 + 1 a ‏معط‎ his Arg His Arg Lys Asp Gly Ary Tyr Tyr val IL. Asp Fhe Thr re. 1+0 } } ٠

Leu Lys Glu He Gln Ser Leu Glu Mel Thr Glu Asa Zhe Gln Tite Met

Jie iv. ١.

Gly Yer Leu Giu Gln Arg Ser Leu His (ys Lys Pre Glu Git Als leu 17. Yo 1g.

Siu Ala Gln ‏ج51‎ 610 Ala Leu Gly ‏انها‎ Val tyes Val 837 Ale Ala Thr

Yio \o- ١ ١

Ser Ser Ser Ser Pro Led val Lou Gly Thr Leu €lu ‏نسل‎ Val Pra Tig le ١7 ١1

Ala Gly Ser The Asp ro Pre Gln Ser Pzo Gln Cly Ala Sur Als phe 1A ‏م‎ 19.

Pre The Thr lle Aun Fhe Thr arg Gln Arg Gln Pro Sor Glu Gly Ser 140 Y “a Tea .

Ger Ser Arg Glu Glu Glu Gly Bro Ser Thr Sur Cye Ile Leu Glu fer

Yi. Yie 77

Luu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lyz Lys Val Ala Asp Leu val Gly The

Yo 1 Te Te

Leu Lew leu Lys Tyx Arg Ala Arg Gly ‏ة‎ Val Tha Lys Ala 111 Mot ‏مع‎ Yor Yoo het Clu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Pha Pro 1133 Ile Pl 1. Yo Y¥- ]

Gly Lys Ala Scr Glu Ser Luu Gln Lou val She Gly Ile &=p Val Lys

Yo IA. ‏مذ‎ ‎Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr val Tew Val Thr Cys Leu ly 9: Yio Vos

Leu Ser Tyr Asp Gly Lew Leu Cly Asp Asn Gln Ile Met Zio Lys Thy

Yeo I) Yio 1.

Gly The Leu Tle Ile Val Leu Val Met Ile Ala Mut Gla Gly Giy Hig ‏لل ه17‎ ro

Ala Fro Glu Glu Glu ‏و11‎ Trp Glu Glu Leu Ser val Met ‏ربدي‎ Val Tyr

YE Yio Yoo

Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu ‏مط‎ Arg Lys len Lug Thr

Yoo Ye le

GLh Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pru Asb 7 veo TA

Ser Asp Pre Ala Arg Tyr Glu Fhe Tew Trp Gly ‏وص‎ Arg Ala Leu Als

YAe + Yio £e- lu Thr Ser Tyr Val Lys val Tau Glu Tyr val Ile Lys val Ser Ala £8 1 ٍ ie

Arg Yal Arg Phe I'he Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ata Ala Leu Arg Glu 1%. £1 gy.

Glu Glu Glu Gly val Cly Gly His His His Hie His His Eis {Yeo $f 8 an ‏معلوها ت تعريف التسلسل رقع‎ )7( ِ ‏م ل لتسلسل‎ 1 o> { 1 ] ‏امبيبي_سسي‎ Rox ‏(آ) الول 6ع‎ ‏حمض امهنم‎ pat (oo) erg 3 ‘ land 1 | zr) ‏خطية‎ Rm ad seat (V)

Ee low ‏(؟‎ ‎ay ‏تعريف التسلسل رقم‎ Jit ‏وصف‎ )(

Mal, Asp Pro Asn ‘Phr Val Scr Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp ‏ا‎ & ٠. Vo

His Val Arg ws Arg ‏1د‎ Ala Asp Gin Glu Leu Gly Asp Ala Fro Phe ‏ا بل‎ v.

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Lau Arg Gly Arg tly Ser

Ts ‏م م‎

Thr Leu Ly Leu Asp Ile ‏يله‎ Thr ‏فلم‎ Thr Arg Ala Gly Lys Glp lle

Q- aa >“ val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Scr Asp Glu Ala Leow Lvs Met The 1s 7 ‏ب‎ As

Met Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gin Mls Cys bys Ure Glee GIn Gly leu ho q- Aa

Gln Ala Arg Gly lu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Glo Ale Fru Ala

IBS ‏وي‎ ١٠٠

Thr @lu ‏حصا سل‎ Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val io IRR ‘Ya

Thr Leu €ly Glu Val Fro Ala Ada Glu 3er Pro ‏ضعت‎ Pro Pro Gln Ser

Ye Ive 14. tre Gln Gly Ala Scr Sci Leu Pee The The Met Asn Tyr Pra Leu Trp tte Va tea 11٠

Sar ‏علي‎ Ser ‏عي‎ Glu Asp Ser Ser Asn Clo Cle Glu Glu ‏برل‎ Fra Se ta 17 175

Thr Phe Pra Asp Leu Glu Ser Glu Phe Glo Ala Ala ] der Arg Lys

YA. ‏د‎ 19.

Val Ala Glu Leu Val Bis Phe Leu Tew lea Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 140 Ver {+0 ‏موعن‎ Val Thr Lys Ada Glu Met Leu Gly Jer Val Val Gly Asn Trp Gln

Ty Tio AR

Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe der Lys Ala Ser Sex Ser Leu Glin Lew

Yye Te Ya Yi

Val Pha Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly Ilis Leu Tyr

Yo Yor Yoo

ILe Phe Ala Thr Cys Leu Gly Lea Ges Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 1. Ylo TY.

Asp Gon Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu lew Tle Ile Val Luu Ala Ile {Yeo TAs YAS

Tle Ata Arg Glu Gly Asp Cys Ald ‏وعم‎ Glu Glu Lys Ile Trp Glu Gla

Ya- Ys Yoo

Leu Ser Val Leu Glu val Phe (lu tsly Arg Glu ‏يعم‎ timr ‏م11‎ Len Gly

7 Tye i Yip Te

Nip Pro Lys Lys Lew Leu Thr Gln His Phe Val Gin Glu Asn Tyr Liu 2 14 ‏م‎ ‏يدق‎ Tyr Arg Gln val Fro Gly Sar Asp Pro Ara Cys Tyr 3ln Phe he ¥ 4 . ‏ن‎ { eo Yo .

Trp Gly Pro Arg dla Leu Val Glu Ther Ser yc val Lvs val Leu Ilis

Yoo 7>, Ye lis Met Val Lys Ile Jer Gly Gly ‏ص‎ nig [le Ser Ty: Pro Zro Leu 7 Yye TAs

His fla ‏ب‎ Val Lew Arg Gla Sly Glu Glu Gly Gly His Hie His His

YAO 85 Yio $e

Els His 58 , “ . . +1 ‏معلومات تعريف التسلسل رقم‎ )( . ‏خواص التسلسل‎ )١( ‏زوج قاعدي‎ 1١ J pb tt 1 ‏حمض نووي‎ ged ‏(ب)‎ ‏(ج الجديلة . فردية‎ ‏(د) الطوبولوجية + خطية‎ cba . "gt ‏نوع الج‎ 7)

Mn ‏وصف التسلسل . تعريف التسلسل رقم‎ )١١( ‏مح ارد(‎ ACACTGTAETE BAGCTTTOAG ‏اانا جا" مقا "لقنم وجا‎ TETCCGCARS 1

CEA TGCAL ACCAAGARALT ‏نانانا المئرجااة‎ CCATTCCTITG ATTGGCTTCC CCLAGNTCAS 17-١

AALTCCCTAR GRCCIAGGGE ‏حكن قوعي‎ GEITTGGACA TUGAGALAGC CACACCTICT YAY

COAAAGUAGA TAGTGGAGCE GATTCIGAAA GAAGAATCCG ATGAGGCACT ‏خض ممم‎ YE

PTEGATOTGE AACAGCGTAG TCAGCACTHC ARGCOTGRAAG ‏حجان ممعي‎ GHUULGAGGR ٠ 52076 2616 ‏تعقوو و تعوعيه و1760‎ AGGAGRCAGGA ‏21010و‎ Tie

TUCTCTTCTA CTCTAGLLGA ‏انا ريام‎ BREGAGSTEC 16-16-65 FITACCAGAT iY ‏رعرع ما‎ GTULTCAGEG ‏عمقو تعمد‎ CTCCCCACTA CCATGAACTA 01:10) ‏ار و‎ ‏واه ورد جوح‎ ATGRGGACTC CAGCAAUCARA CAAGACCALG ‏الم ممعم‎ 1210207058656 af» ‏وو يقتت‎ ACTTCCAAGC AGCAULTCALT AGCANCCTCG CUGAATTSGT 2011112626 ee

CTOUTEAAGT ATCGAGCCAG GGAGLUCGGETE ACAAALGUAL ‏دان "مم‎ 1 000 02613102614: 11

GAMAATTGRGEC AULATTTCTT 140705 TLICRGCABAL CTTCCAGTTC 100560-15 YY»

GTOCTTTGGGA TUGAGCTCAT GGAETGGAL ‏يي )ا‎ ACT IG TACAT CTTTSCCACT YA: ‏مجع وم‎ TC TCCTACGA TEOCCTICTE GETOGACANTC ‏تج تمق دعي‎ CAAULCACIC Af.

STCOTGATAN ‏انان نان اي‎ CATAATCGEA ‏ووو و مقع‎ 2016160006 THAGHAGAAA 9.

ATCTGAGASS AGOTGAGTUT CTTNAGAGGTG ‏مرج ووم‎ GERARGACAS 12061100060 ٠

CRTCCCARSR ‏عق سعد‎ CCARCATTTC 20026077 0170-1 ‏تالقانانان افاي‎ +٠9 0100 ‏تناو اطي‎ GTHBATCCTGL ATGTTATGAA 270012-6-061 775362 COTOGTTEAR 1 ‏عر‎ ‎ACUASITATS TERAAGTCCT GUACCATATG GTAAAGATCA GTGCAGIACC TCACATTICO ١١ ~ACGUALGCG TGCATGAGTS GGTTUTGAGA CAGUGGGARL ACCGCLETCA TCACCATCAL 1*٠

CATCACCALT ‏عد‎ - . , 11

Vou ‏(؟) معلومات تعريف التسلسل رضم‎ . ‏خواص التسلسل‎ )1( ‏ميلنشسي‎ ًٌ bs {40 ‏لللول ل‎ 1 { 1 J ‏لنوع + حمض | مينسي‎ ١ {=) ah ‏(ج) الجديلة‎ ‏(د) الطوبولوجية + خطيسة‎ ‏نبمبسوع الجزبسي - بروتيمن‎ { Y ) you ‏التسلسل رقم‎ dio pals ‏وصف التسلسل‎ (Y)

Mat Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Ly= i ‏ب ل‎ Vo

ا ‎Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr‏ ‎Ye ‘Yo Xe‏ ‎Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp‏ ‎Yo . €- . 5‏ ‎Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp‏ ‎oe 00 Te‏ ‎Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val‏ ‎Ye i Yo As‏ 15 ‎Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met‏ 95 ب ‎Ao‏ ‎Val Ser Asn Ala Phe.

Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr‏ ‎Yeo Yeo ٠١‏ ‎Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Asp Met Gly‏ ‎Yio ٠ 1Yo‏ ‎Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu Glu‏ ‎ito 1 VE.‏ 19 ‎Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr Ser‏ ‎‘eo . 10» 100 1.‏ ‎Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Ala‏ ‎Se : 17 : {Yo‏ ‎Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe Pro‏ ‎YA.

Ae : 14 :‏ . ‎Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser‏ ‎Yoo . 7.‏ 40{ ‎Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu‏ ‎7٠٠ : Tie Tv.‏ ‎Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Leu‏ ‎Yo : we Yo 1.‏ ‎Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu‏ وج ‎Leu Leu Lys Tyr‏ ‎Yeo Yoo Yoo‏ ‎Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu.

Ile Phe Gly‏ ‎Ye : TY.‏ م 2 ‎Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu‏ ‎Tyo TA.

YAo :‏ ‎Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu‏ ‎Yio Yoo .‏ 19 ‎Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly‏ ‎Yeo ١ Yio ry.‏ ‎Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His Ala‏ ‎Yo . PY. . +‏ ‎Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr Asp‏ ‎rE.

Yio .. Yoo‏ ‎Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln‏ مد ‎Yoo re‏ ‎Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp Ser‏ وعد ‎Ye. to TYo . oC CYA.‏ ‎Asp Pro! Ala Arg Tyr Glu.

Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu‏ ‎TAo : 71. : Yo . Eee‏ ‎Thr Sex Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg‏ ‎tio :‏ ب" . 3[ . ‎Lo £0 oo‏ ‎Val Arg Phe Phe Phe Pro: Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu‏ .£0 : 31 برق : ‎Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His‏ ‎١ CEE CL tke‏ 5 )1( معلومات تعزريف التسلسل ‎py‏ 4 ‎)١(‏ خواض التسلسل . :ْ ْ : ) 1 ) الطسسول ) م١‏ زوج قشاعسدي ا ‎pid (2)‏ حمض نبووي (ج) الجديلسة ؛ فرديسة ْ [د) الطوبولؤجية ؛ خطيبة َ tA le . Ya

Glu Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala IAS Glu Ser Pro Asp be Pro

VA: ‏م‎ 4:

Gln Sér Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro 140 Yoo : ; Teo

Leu Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly 1٠ ١٠٠ 719 .

Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser

Yo ME “Yo ‏:ص‎ ‎pos Lys. Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala

Yeo Yoo Yoo

Arg Glu Pro Val Thr Lys. Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn me. ie YY.

Trp Gln Tyr Pne Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu

Y¥o 1A . YAO © Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His 7١ 116 ‏ا‎ : Yoo .

Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu ‏و‎ : Tie | . Yio YY. i

Giy Asp Asn Gln: Ile Met Pro Lys Ala 619 leu Leu Ile Tle Val Leu

YYo rye. © ¥Ye

Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ald Pro Glu Glu Lys Ile Trp veo 7] Yoo

Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile

Yoo i. To

Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn

YY Yo TA

Tyr leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu

YAO Yq. Yio Ee

Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val feo : £1. 1

Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro £7. Yo 5

Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His £vo ££ 6

His His His His His : ‏+ع‎ Veo ‏تعريف التسلسل رقم‎ (Y) . ‏خلو اص التسلسئل 2؟‎ ( 1 } . ‏الطصول 102 1317 زوج تاعدي‎ ( 1) :

I ‏الندسوع حمض‎ (=)

Bo + ‏الجدذيلة‎ (2) ’ ‏الطوبولوجية. خطية‎ (9) : 0 : : vo eto ee ‏(؟)‎ ‎Vet ‏التسلسل رقم‎ dad + ‏وضف التسلسل‎ (11) ٍ : ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAARATC ٠

AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA .GGCTATATGC PTGCAGACCG CTGGAGGAAG ٠٠

CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG 'AAATGGCTAC AGGCTGGAAG ٠

AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTE YE

AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCE ٠٠٠

TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 1

GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC £Y+

AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT fA

CCTGCTACTG AGGAGCAGGA' GGCTGCCTCC TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG of 5666260160 CTGCTGCCGA GTCACCAGAT CCTCCCCAGA GTCCTCAGGGS AGCCTCCAGC: ٠٠

CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG AGCCAATCCT ATGAGGACTC .CAGCAACCAA ٠

GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT ١

CDNA: ‏ل (7) نوع : الجريبي*‎

Ay ‏وصف التسلسسل. ) تعريف التسلطسل رقم‎ (13)

ATGAAAGGGG GAATTGTACK TTCAGACGGC: TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC Te

AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 1,

CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 1A

AARATCGCTG ATRAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC Te.

AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCARATGCC Teo

TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA ٠

GACAGGCCAG AATTGGACAT GGGCTCTCTG GAACAGCGTA GTCTGCACTG CAAGCCTGAG [Ad

GAAGCCCTTG AGGCCCAACA ‘AGAGGCCCTG GGCCTGGTGT GTGTGCAGGC TGCCACCTLC tA.

TCCTCCTCTC CTCTGGTCCT GGGCACCCTG GAGGAGGTGC CCAETGCTGG GTCAACAGAT of. © CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC TTTCCCACTA CCATCAACTT -CACTCGACAG ee

AGGCAACCCA GTGAGGGTTC CAGCAGCCGT GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC Me.

CTGGAGTCCT TGTTCCGAGC AGTAATCACT AAGAAGGTGG: CTGATTTGGT TGGTTTTCTG 7,

CTCCTCAAAT - ATCGAGCCAG 6626002612 ACAAAGGCAG AAATGCTGGA GAGTGTCATC YA

AAAAATTACA 6020120111 TCCTGAGATC TTCGGCAAAG CCTETGAGTC CTTGCAGCTS + © GTCTTTGGCA TTGACGTGAA GGAAGCAGAC CCCACCGGCC ACTCCTATGT 0027 LE

TGCCTAGGTC TCTCCTATGA TGGCCTGCTG GGTGATAATC AGATCATGCC CAAGACAG-C 1:

TTCCTGATAA TTGTCCTGGT CATGATTGCA ATGGAGGGCG GCCATGCTCC TGAGGAGUAAR - ٠8 27017666806 AGCTGAGTGT GATGGAGGTG TATGATGGGA GGGAGCACAG 21600121556 - ١

GAGCCCAGGA AGCTGETCAC CCAAGATTTG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG 11¢°

GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGCTGAA - ٠٠

ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TGAGTATGTG ATCAAMGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTTTC ١١٠

TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA GAGGAGGARG AGGGAGTCGG CGGTCATCAC . ٠8

CRTCACCATC ACCATTAA 8 1 4 ‏معلومات تعريف التسلسل رقم‎ )١( : : : Cn ‏خواص: التسلل‎ (1) gmt! ‏الطبول 26600 حمض‎ (1) 0 ‏(ب) النوع ؛ حمض اميني‎ a ‏(ج) الجديلة ؛‎ ‏(د) الطوبولوجية ؛ خطية‎ eta ‏نوع. الجريسي”‎ (TY) 04 ‏تعريف التسلسل رقم‎ Je Las) فصو)١١(‎ ٍْ

Met Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys ١ : ٠ ‏ص‎ te : phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr

SY, : Te 0 : Ye ‘Met Leu Ala Asp ‏وعم‎ Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp

Te £ fo ‘Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 0° oo “qe ‏غم‎ ‎Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val ye. Yo As

Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys 6lu Gly Ala Met : “Ao i : AU

Val ‘Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr yoo : © Yeo : 1" k © Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Ala Ser Met - . . Vie - 1, 178.

Leu Asp Met Asp Leu Glu Gln ‏وعم‎ Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu

CAT 1Yo VE : : 0

Gly Leu -Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala 6 ‏ل"‎ Yor Veo Ate . Pro Ala Thr Glu Glu Gln Glu) Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val

Ow

AGGAAGGTGG 'CCAAGTTGGT TCATTTTCTG CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC ٠

ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC GGAAATTGGC AGTACTTCTT TCCTGTGATC Age

TTCAGCAAAG CTTCCGATTC CTTGCAGCTG GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC ٠

CCCATCGGCC ACGTIGTACAT CTTTGCCACC TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 41+

GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA ٠١

ARAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG ٠١

TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTCGGG GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAATATTTC ©

GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGCTATGAG ٠

TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCATTGAA ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG 1٠

GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1٠

GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC CATCACCATT AA ry

: ‏المراجبع‎ ‏علم المناعة ؛ اليوم ا َي مم‎ Anichini A. Fossati G., Parmiani G. - ) ١897 ( ‏.ىم‎ - 0 cad ‏المناعة‎ De Plaen E., Arden ‏,كا‎ Traversari C., Et al. - ٠ ( ١5 ) ° ‏مجلة الطب‎ Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., etal. - (VRE) AY) - 19794 © ‏التجريبي‎ ‏علم المناعة الوراثية ؛‎ Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F, et al. - ‏لال ( 19956 )؛‎

OYY ‏المجلة الدولية للسرطان أ‎ Inoue ]1., Mori 1/1., ‏,.ل11‎ etal. - ٠١ ٠ ( ١6 )

Kensil CR., Soltysik S. Patel U,, et al. In : Channock RM.,, - ٠ 57 ‏اللقاحات‎ Ginsburg H.S., Brown F, et al, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), - ‏)ء‎ 3957 ( 6-7 Yo ‏محاضر الأكاديمية القومية‎ —Knuth A, Danowski B.,Oettgen HEF, etal. - ‏)؛‎ 1484 ( 611 : AY ‏للعلوم ¢ الولايات المتحدة الأمريكية‎

TE ‏المجلة الدولية للسرطان ؛‎ - Patard J.J, Brasseur F., Gil-Diez 5., et ‏.له‎ - ٠ ( ١٠86 ) “١

JRibi E., et alin : Levine L., Bonventre P.F,, Morello J, et al. - Ye ale « Washingtor DC ‏المحررون ) ؛ الجمعية الأمريكية لعلم الميكروبات ؛‎ ) ١145 ( NY - - AAT ‏الميكروبات‎ ‎¢ ‏المجلة الدولية للسرطان‎ Van den Eynde B., Hainaut P., Herin 11. ‏.لو ا‎ - ٠ ( YAA4 ) ve — te : Yot « ‏العلوم‎ Van der Bruggen P., Traversari C., Chomez P., et al. - Yo ٠ ( 144) ) yey ‏مجلة المناعة الأوربية‎ Van der Bruggen P., Bastin H., Gajewski 1. etal. - ٠ ( ١5 ) ٠١ 5 oY

‎Van Pel A, van der Bruggen P., Coulie P.G., et al., -‏ _نشرات المناعة ؛ ‎H(V430) 77:5‏

‎0% ‏الدولية للسرطان ؛‎ Aad Weynants P., Lethe B., Brasseure F., etal. - ٠ ( 144¢ ) AYR —

‎Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Itoh K, Nihon - °

‎+ V+) — 40: )1(٠١ Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997 , Apr

‎+ VY - ‏حت‎ : ) A Fuijie T et al , Ann Oncol 1997 Apr -

Claims (1)

1. oy ‏عناصر_ الحماية‎ Goa ‏؛‎ MAGE family ‏مصاحب للورم من الفصيلة ماجي‎ antigen ‏مشتق لمولد مضاد‎ -١ ١ : ‏يُنتقى من المجموعة‎ ¢ Gide 01101 ‏مولد مضاد يتضمن بقايا فيول‎ - Y fusion ‏بروتين اندماج ماجي مُعبر عنه بالإتحاد الجيني حيث يُنتقى شريك الإندماج‎ - ‏من الأنفلونزا أو جزء منه ؛‎ ١ ‏من بروتين دي أو جزء منه ؛ بروتين إن إس‎ partner ° ‏أو‎ streptococcus pneumoniae ‏من الستربتوكوكسي نيمونيا‎ C-lyta ‏أو سي - ليتا‎ 1 ٠ ‏لا جزء منه‎ ‏الطليقة المشتقة تكون‎ thiols ‏؛ حيث أن الثيولات‎ ١ ‏؟- مولد مضاد كما في عنصر الحماية‎ ١ ٠ ‏معالجة بالكربوكسي أميد أو الكربوكسي ميثيل‎ 1 ‏يشتمل مولد المضاد على علامة‎ Cua ¢ Y ‏أو‎ ١ ‏مولد مضاد كما في عنصر الحماية‎ - ١ . ‏للألفة‎ Y ‏حيث يكون البروتين دي 0 أو‎ oF ‏إلى‎ ١ ‏مضاد كما في أي من عناصر الحماية من‎ alge -4 ١ ‏جزء منه معالج الدهن ؛‎ Y ‏إلى £ حيث يُنتقى البروتين ماجي من‎ ١ ‏مولد مضاد كما في أي من عناصر الحماية من‎ —0 ١ ‏؛ ماجي‎ 04) abe ¢ 4 Ale Vad ‏؛ ماجي‎ Y 4) ‏مجموعة ؛ ماجي 4 \ ماجي‎ 0 A) ala Ye ‏إيه 48 ؛ ماجي إيه 9 ؛ ماجي إيه‎ al Val ‏؛ ماجي‎ ١ ‏ليه‎ 7 2 ‏ماجي بي ؟ ؛ ماجي بي ¢ ؛ ماجي سي‎ Y ‏ماجي بي‎ ٠ ١ ‏ماجي بي‎ ٠ VY 4 ‏ماجي‎ ¢ « MAGEA 4 « MAGEA 3 <MAGEA 2 MAGEA 1 ١ ‏سي‎ al o « MAGEA 9 « MAGEA 8 « MAGEA 7 « MAGEA 6 « MAGEA 5 1 ٠ MAGE B2 « MAGE Bl « MAGEA 12 « MAGEA 11 « MAGEA 10 ‏لا‎ ‎+ MAGE C2 ‏ر‎ MAGE C1 « MAGE ‏4م‎ « MAGE B3 « A ١ ‏حمض نووي يشفر لبروتين كما في أي من عناصسر الحماية من‎ Sequence ‏تتابع‎ -+ 0١ od ٠ 6 ‏يشتمل على حمض نووي لعنصر الحماية‎ vector ‏ناقل‎ -V ١ of v Y ‏نووي لعنصر الحماية 1 أو ناقل لعنصر الحماية‎ aan aul J sna host Sle —A ١

   ٠ 5 ‏إلى‎ ١ ‏يحتوي على بروتين كما في أي من عناصر الحماية من‎ vaccine ‏لقاح‎ -+ ١ ‏و/أو‎ adjuvant ‏لقاح كما في عنصر الحماية 9 يشتمل إضافياً على مادة مساعدة‎ Ye) ٠ ‏منبه للمناعة‎ kemokine ‏أو كيموكين‎ cytokine ‏سيتوكين‎ Y

   ‎NY‏ لقاح كما في عنصر الحماية 9 أو ‎٠١‏ ؛ حيث يُقدم البروتين في ناقل مستحلب زيت في ‎vela Y‏

   ‎3ID-MPL ‏أو ا حيث تشتمل المادةٌ المساعدة على‎ Yo ‏كما في عنصر الحماية‎ cd —\Y ١ oligonucleotide CPG ‏أوليجونيوكليوتيد سي بي جي‎ 51 QS21 ٠ Y

   ‎santigen ‏هنا يشتمل إضافياً على واحد أو أكثر من مولدات المضادات‎ a ‏_لقاح كما‎ YY) is ‏لأخر‎ J Y

   ‎ve‏ لقاح كما حمي هنا للإستعمال في الطب ؛

   ‎dla -١٠١ ١‏ بروتين أو حمض نووي كما حْمي هنا لتصنيع لقاح للعلاج المناعي لمريض يعاني من ‎J‏ لأورام القتامينئيمة ‎melanoma‏ أو أورام أخرى مصاحبة ‎A ail)‏ ماجي ‎+MAGE family ¥‏

   ‎-١١ ١‏ طريقة لتنقية بروتين ماجي ‎MAGE protein‏ أو مشتق منه ؛ تشتمل على اختزال ‎Y‏ روابط ثنائي الكبريتيد ‘ اعتراض مجموعة الثبول الطليقة بواسطة مجموعة إعتراضية ‘ 7 وتعريض المشتق الناتج لخطوة أو أكثر من خطوات التنقية بالتحليل الكروماتوجرافي ‎٠‏

   ‎١١7 ١‏ طريقة لإنتاج لقاح ‎Jali‏ على خطوات تنقية بروتين ‎MAGE protein ale‏ أر ¥ مشتق ‎Ada‏ ¢ بواسطة طريقة عنصر الحماية 7 وصياغة البروتين الناتج كلقاح ‎٠‏

   ‎Gide =A)‏ لمولد مضاد مصاحب للورم ‎tumour‏ وفق عنصر الحماية ‎١‏ ؛ أساساً كما ؤصف هنا بالإشارة إلى أي من الأمثلة؛ ‎-١ 9 ١‏ طريقة وفق عنصر الحماية ‎»٠‏ اساسا كما ‎Chay‏ هنا بالاشارة الي اي من الامثلة.