JP4837219B2 - 融合タンパク質に対する免疫応答に関する物質および方法 - Google Patents
融合タンパク質に対する免疫応答に関する物質および方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、個体の免疫応答の誘導に関連する物質および方法に関する。本発明は、特に病原性ペプチド抗原に対して細胞障害性T細胞(CTL)を産生させるためのアジュバントとして、フラグメントC(FrC)ドメインを含むDNAワクチンに関するものであるが、このDNAワクチンだけに限るものではない。
【０００２】
【従来の技術】
非細胞性ワクチンは、生物全体に基づくワクチンよりも当然ながら安全であるが、完全に効果のあるワクチンは、微生物の1つの単離成分からは通常は作成することはできず、これは、免疫応答を開始するには、2つ以上の細胞タイプを活性化する必要があるからであることが現在明らかになっている。この洞察の一結果が、コンジュゲート・ワクチン(conjugate vaccine)の開発である。
【０００３】
しかしながら、コンジュゲート・ワクチンでさえも、通常はそれ自体が強く免疫原性であるわけではない。その大部分は、アジュバント:抗原の免疫原性を高める物質の添加を必要とする。すべてではないとしても、大部分のアジュバントは、抗原提示細胞(APC)に作用し、免疫応答を開始させる際のこれらの細胞の重要性を反映すると考えられている。たとえば、H.インフルエンザ多糖類は破傷風トキソイドに複合化された。なぜなら幼児はこのタンパク質を日常的に予防接種され、そのT細胞は既にそれに対して初回抗原刺激を受けているからである。
【０００４】
破傷風毒素は詳細に研究されている。たとえば、Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997を参照のこと。輸送メカニズムは、その毒素によって中枢神経系中の細胞毒の標的に送達するために、利用される。破傷風毒素の受容体結合サブユニットは、この送達プロセスにおいて主な役割を果たす。この受容体結合サブユニットはHCとして知られており、破傷風毒素の重鎖のC末端部からの、50,000Mrフラグメント(fragment)から構成される。歴史的に50,000Mrフラグメントは、フラグメントC(FrC)と名付けられている。単離されたFrcは、完全な破傷風毒素の運搬と同じ方法で、CNSに運ばれる可能性がある。
【０００５】
破傷風トキソイドは、ペプチドに対する免疫応答を誘導するための担体タンパク質として使用されている(Herrington他、1992、J.Immunol.149:717)。破傷風トキソイドに対する免疫応答、ヒトCD4+T細胞によって認識されるエピトープ(Valmori他、1992、J.Immunol.149:717)、および加えられるペプチドに対する免疫性を高めることに関するメカニズム(Panina-Bordignon他、1989、Eur.J.Immunol.19:2237;Kumar、1992、J.Immunol.148:1499)に関する、利用可能な多大な情報が存在する。破傷風毒素の重鎖の50kDのカルボキシ末端部分である、フラグメントC(FrC)は、主に抗体によって仲介される、破傷風毒素に対する防御免疫を誘導することが分かっている(Anderson他、1996、Infect.and Immunn.64:3168)。
【０００６】
本発明の共同発明者らと共に発表した以前の研究(King,C.A.他、Nature Medicine、1998、Vol.4、p.1281)には、哺乳動物中の悪性B細胞上に存在する病原性抗原に対する免疫応答を哺乳動物中において誘導するための、核酸構築体の使用および生成が記載されている。DNA構築体は、腫瘍抗原および破傷風毒素フラグメントC(FrC)を含む融合タンパク質の発現を指示する。したがって、所与の抗原に対する免疫応答は、FrCそのものの存在によって高めることができることが既に示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
(発明の概要)
破傷風毒素由来のフラグメントCのT細胞ヘルパー配列p30は、CD4+T細胞を活性化する能力を有しており、抗原に対する免疫応答の開始を助けるために構築体中で使用されてきた。しかしながら、DNAレベル、たとえばDNAワクチンでは、単離されたヘルパー配列は望むほど有効ではないことが分かっている。これはおそらく、単離されたヘルパー配列は、免疫系の初回抗原刺激にはあるいはそれによる認識さえも充分なものではないためであろう。したがって本発明者らは、有効なDNAワクチンはヘルパー配列だけではなく、免疫系の初回抗原刺激をし得る配列も含まなければならないことを理解している。前述のように、完全なフラグメントCに連結した腫瘍抗原を含む有効なDNAワクチンは提供されている。しかしながら本発明者らは、病原性ペプチド抗原への免疫応答の誘導は、フラグメント全体ではなくフラグメントCのある成分を使用して、改良あるいは簡潔化することができることを、現在驚くべきことに発見している。
【０００８】
本発明者らは、ヘルパー配列(たとえばp30)を含む、FrCの第1ドメインをエンコードしている核酸配列を組み立て、細胞障害性T細胞(CTL)応答を誘導する能力を有するペプチドエンコード配列にそれを連結させた。本発明者らがベクターをマウスに注入すると、CTLの非常に迅速な誘導が見られた。ペプチドをその元来の周囲配列から加工しなければならない場合よりも、この誘導は相当速かった。実際、本発明者らは、(i)内因性腫瘍抗原に連結した完全長FrC(2ドメイン)を含むDNAワクチンと(ii)腫瘍抗原から取った特異的なCTLエピトープに連結したシングル・ドメインFrCフォーマットを比較した。後者のワクチン(ii)は、より高レベルのCTLを誘導した。これらのレベルは、2ドメインのワクチンと比較して、予防接種後55日後でも依然として高いままだった。
【０００９】
したがって本発明者らは、免疫性を誘導するためのあらゆる成分、すなわちヘルパー配列、プライミング・プロセスを開始させるFrCの第1ドメイン中の活性化配列を含むワクチンの設計体を最初に決定した。フラグメントCの第2ドメインは多くの細胞障害性T細胞モチーフを含み、融合タンパク質中に存在する病原性抗原中に存在するモチーフと、これらのモチーフとが競合する可能性もあると本発明者らは考えている。これらのモチーフが不在であると、DNAワクチンは免疫の誘導において改善された効率を有する。
【００１０】
したがって広く考えると、本発明は、融合ポリペプチドをエンコードしており病原性抗原も含む核酸構築体中において、FrCの第1ドメインをエンコードしているが、FrCの第2ドメインの1つまたは複数のT細胞エピトープをエンコードしている核酸配列が欠けている、核酸を使用するための概念に属する。第2ドメインが欠けることによって、融合ポリペプチドが病原性抗原に対するT細胞応答を誘導する能力が向上する。しかしながら核酸は、第2ドメイン全体をエンコードしている配列を欠いている必要は必ずしもない。たとえば、融合ポリペプチドがT細胞応答を誘導する能力に悪影響を与えることなく、第2ドメインのいくらかの部分が存在する可能性があることが企図される。本明細書で同定するペプチド1および/またはペプチド2をエンコードする核酸は、少なくとも不在であることが好ましい。他のT細胞エピトープが天然に存在する第2ドメイン中に存在する可能性があるので、第2ドメインのわずかな非実質的部分が核酸によってエンコードされていることがより好ましい。非実質的部分は、天然に存在するフラグメントCの第2ドメインの、50%未満、40%未満、30%未満、25%、20%、15%、10%または5%未満のアミノ酸を含んでいてよい。
【００１１】
以下ではイディオタイプ抗原についてしばしば述べるが、本発明はこのような抗原に限られるわけではなく、任意の適切な病原性抗原、特に腫瘍抗原(CEAのフラグメントなど)、しばしばT細胞誘導用の小さな抗原を使用することができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
したがってより具体的には、本発明の第1の態様では、病原性ペプチド抗原に対する患者の免疫応答を誘導するために、in vivoで生きている細胞中に送達するための核酸構築体を提供し、この構築体は融合タンパク質の発現を指示し、前記融合タンパク質は病原性ペプチド/ポリペプチド抗原およびFrCの第1ドメインを含む。
【００１３】
FrCフラグメントの第1ドメインは、ヘルパー配列(特にp30)を含む。そのFrCドメインは、免疫系を助け、増強し、あるいは初回抗原刺激し、CTLを誘導することによって、免疫系を病原性抗原に応答させることのできるアジュバントとして作用する。本明細書で使用するように、「第1ドメイン」とは、天然に存在する完全なFrCの第1ドメインのことであることが好ましい。しかしながら、融合タンパク質がT細胞応答を誘導する能力に大幅に影響を与えることなく、微量の配列変異体を導入することができ、このような変異体を含むFrCの第1ドメインを有する融合タンパク質も、本発明の範囲中に含まれることが企図される。本発明の核酸によってエンコードされているFrCの第1ドメインは、天然に存在するFrCの第1ドメインと、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のアミノ酸配列同一性(デフォルト・パラメータを使用する、Altschul他のNucleic Acid Res.25:3389-3402(1997)のNCBI-BLAST2アルゴリズムによって決定される同一性)を有することが好ましい。FrCの第1ドメインは、p30ヘルパー配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【００１４】
シングル・ドメインFrCワクチン・フォーマットは、選択した抗原をエンコードするDNAがFrCの1つのドメインの3'末端(結果として生じるタンパク質のカルボキシ端)に融合されるとき、2ドメイン・フォーマットと比べてより多数のCTLを誘導することができると、本発明者らは最初は仮定していた。しかしながら、いくつかの実験に従って、抗原/エピトープがワクチンの他端、FrCドメインの開始点(DNAの5'末端、または結果として生じるタンパク質のアミノ末端)に連結する場合、強烈なCTL応答が観察されることも、本発明者らは現在決定している。したがってこれによって、抗原/エピトープを結合させるために、FrCドメインのいずれかの端または両端を使用する可能性が高まる。
【００１５】
Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997に記載されるように、FrCは2つの主要なドメインを有する。この2つのドメインは、連結アミノ酸配列によってFrC内で本来的に分離されている。この連結アミノ酸配列がDNAレベルで切断される場合、選択したペプチド(たとえば、腫瘍または病原体の抗原)をエンコードするDNA配列は、ヘルパー配列(たとえばp30)およびプライミング配列を含む第1ドメインのC末端またはN末端のいずれかに加えることができることを、本発明者らは発見している。この2つのドメインはUmland他に同定されており、図1中に再度示す。p30ヘルパー配列は、アミノ酸位置947-967において発見することができる。
【００１６】
病原性ペプチド抗原は、その疾患に特徴的な1つのまたは複数のエピトープを含む、任意のペプチド配列であってよい。たとえばペプチドは、特定の感染症、病原体またはガン(腫瘍抗原)に特徴的なエピトープを含んでよい。「ペプチド」という語は、いずれか特定のサイズの制限を意味するわけではなく、MUC-1およびgp70などの、アミノ酸が少なくとも数百個までの大きなポリペプチドおよびタンパク質を含んでよい。しかしながらペプチドは、5〜40個の間のアミノ酸、より好ましくは5〜30個の間の、さらに好ましくは7〜25個の間のアミノ酸(7〜10個の間のアミノ酸が望ましい)、さらに好ましくは8〜25個の間のアミノ酸を有することが好ましい。多くの癌ペプチドが知られており、発表されている。MAGEなどのメラノーマ、およびチロシナーゼ抗原、またはRasなどの変異プロトオンコジーンからの候補がある。これらの配列はいずれも発表されており、これらの配列を得て、それらを本発明のFrCドメイン含有ベクター中に配置することは、充分に当業者の能力内のことであろう。CTLによって標的にされる可能性がある、いくつかの候補腫瘍配列を記載している1つの有用な概説は、Henderson R.A.およびFinn O.J.(1996)「Human tumor antigens are ready to fly」Adv.in Immunology 62:217である。
【００１７】
ペプチドはイディオタイプ決定基であってもよく、これは悪性B細胞の表面上で決定基がとっているのとほぼ同じ形状で融合タンパク質中に存在することが好ましく、これによって融合タンパク質によって誘導される抗イディオタイプ免疫応答の効率が最適化される。イディオタイプ決定基に関しては、免疫グロブリン(Ig)分子、または単鎖Fv(scFv)フラグメントなどの免疫グロブリン様分子の一部の範囲内で、イディオタイプ決定基を発現させることによって、免疫応答の効率の最適化を行うことができる。scFvフラグメントは非常に便利であり、外性アミノ酸残基を殆どもたないイディオタイプ決定基の必要な構造的特徴を提供する。しかしながら、望むならば、追加のアミノ酸残基を融合タンパク質中、1つまたは複数の定常ドメインなどに加えることができる(たとえば、Syrengelas他、1996、Nature Medicine 2、1038)。したがって、たとえば、免疫グロブリン分子全体において、イディオタイプ決定基を発現させることができると思われる。
【００１８】
好ましい実施形態では、融合タンパク質を小胞体に向けるリーダー配列(ヒト細胞中で認識される)と共に融合タンパク質が発現され、そこでリーダー配列は融合タンパク質から切断される。このようにして、細胞から離れる前に、融合タンパク質が適切に折りたたまれる。融合タンパク質が適切に折りたたまれることは重要である。なぜならこのことによって、問題の疾患に特徴的なエピトープが免疫系に対して適切に提示されることが保証されるからである。たとえばヒトV遺伝子の5'端で見られるリーダー配列(以下に記載するVHlのリーダー配列など)を含めて、多数の適切なリーダー配列が知られている。本発明者らによって、このようなリーダー配列が、融合タンパク質の免疫原性を高めることが分かっている。原則として任意の他のリーダー配列が、均等な有利な効果を発揮する可能性があるが、元来の免疫グロブリンタイプのリーダー配列に最も類似するリーダー配列がおそらく最適であろう。
【００１９】
便宜上、核酸構築体はいくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。詳細には、構築体が病原性CTLエピトープ配列の上流に連結したFrCドメインを用いて設計される場合、1つまたは複数のこのような認識部位を、FrCの第1ドメインをエンコードしている配列の5'に置くことができ(おそらく任意選択のリーダー配列とFrCドメインをエンコードしている配列の間に)、1つまたは複数の部位を、病原性抗原をエンコードしている配列の3'に置くことができる。このようにして、異なる融合タンパク質を発現するように同様の基本構築体を容易に適合させることができ、病原性抗原が変わってもよい。したがって、異なる患者からのイディオタイプ決定基などの病原性抗原をエンコードしている配列は、容易に構築体中に導入することができる。
【００２０】
病原性抗原(特に小さな抗原)とFrCドメインを結合させるための代替法を、以下に記載する図3、パート3中に示す。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明はワクチン核酸を提供し、この核酸を使用して、イディオタイプ・マーカーを示す形質転換されたヒトリンパ球に対する免疫応答を誘導することができ、この核酸は悪性ヒトB細胞またはT細胞の表面上に示される抗イディオタイプ抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むタンパク質をエンコードしている。
【００２２】
第2の態様では本発明は、患者の免疫応答を誘導するための核酸構築体を作成する方法を提供し、この方法は以下のことを含む。
(a)前記疾患に特徴的なエピトープを含む病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列を同定すること、
(b)病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列をクローン化すること、および
(c)破傷風毒素からのFrCの第1ドメインを有する融合タンパク質として病原性ペプチド抗原を発現させることができるベクターに、クローン化した核酸を導入すること。
【００２３】
FrCの第1ドメインを含むベクターは、融合タンパク質、たとえばFrCドメインの5'と結合させるためのリーダー配列も、好都合には含むことができる。本発明の方法の一部としてベクターを調製することができるか、あるいはベクターを事前に生成させ、望ましい病原性ペプチド抗原を取り込む準備をさせることができる。このようにして、PCR技法中に病原性抗原をエンコードしている核酸をベクター内に導入することができる、核酸プライマーを設計することができる。このことは、詳細な説明中に記載する。FrCの第1ドメインおよびリーダー配列を含むベクターは、本発明の他の態様を形成し、キットの一部としてこれを提供することができる。病原性抗原をエンコードしている核酸をベクター内に容易に挿入することができるように、ベクターは制限部位を含むことが好ましい。他の代替的な例では、リーダー配列、FrCドメイン、および病原性抗原をエンコードしている核酸を作製し(たとえばPCRによって)、1つの融合体として(適切な制限部位を使用して)適切な調節領域を含むベクター内に挿入することができる。
【００２４】
前述のように病原性抗原は、特定の疾患に特徴的なエピトープ、たとえば腫瘍抗原、病原体およびイディオタイプ決定基を含む任意のペプチドであってよい。便宜のために、以下のテキストでは、病原性抗原がイディオタイプ決定基である場合を記載する。しかしながら当業者は、この教示を他の病原性抗原の使用に適合させる際に苦労することはないであろうし、本発明はイディオタイプ決定基の使用に限られない。
【００２５】
したがって、たとえばイディオタイプ決定基をエンコードしている核酸は、PCRによって患者の細胞を含むサンプルからクローン化することができる。ほぼあらゆるB細胞のイディオタイプ決定基をエンコードしている核酸配列を回収することができる、適切で一般的なPCRプライマーの大きなファミリーが、現在利用可能である(Hawkins and Winter、1992、Eur.J.Immunol.22、876)。悪性B細胞は、典型的にはリンパ腫である。一般に、前に定義した方法によって作成される核酸構築体は、本発明の第1の態様に従うものである。
【００２６】
第1ドメインおよび第2ドメインは、連結アミノ酸配列によってFrC中で本来的に分離されている。この連結アミノ酸配列はDNAレベルで切断することができ、その結果病原性抗原を含むペプチドをエンコードしている核酸配列を、第1ドメインのC末端に連結させることができ、第2ドメインは捨てられる。病原性抗原はDNAレベルで加えられ、FrCの第1ドメインのC末端またはN末端のいずれかに効率よく連結される。このようにして形成された核酸構築体は、次いでDNAベクター中に置かれる。ベクターのバックボーンは、遺伝子発現を指示するための適切な調節配列を含む細菌性DNAであることが好ましい。したがって、当業者に知られる標準的なPCRおよび連結ステップを使用して、DNA構築体をベクター内に導入することができる。次いでDNAベクターを、たとえば筋肉細胞を介して患者に注射することができる。このDNAが筋肉細胞に入り、FrCの第1ドメインおよび病原性抗原を含む融合タンパク質をエンコードしている核酸構築体が、そこで読み取られる。転写および翻訳に次いで、融合タンパク質が発現される。タンパク質はその環境には外来性のものであるとみなされるので、したがってそれは免疫系に提示される。ベクターの細菌性DNAバックボーン中の「免疫刺激配列」の存在によって、免疫の活性化がアシストされる。したがってこの結果、エンコードされているタンパク質が宿主の免疫細胞に提示される。
【００２７】
第3の態様では本発明は、疾患に苦しむ患者を治療するための方法を提供し、この方法は疾患に対する免疫応答を誘導するために、前に定義した本発明の第1の態様である核酸構築体を患者に投与することを含む。さらに本発明は、感染症またはガンなどの疾患を治療するための薬剤の調製における、本発明の第1の態様である核酸構築体の使用を提供する。
【００２８】
イディオタイプ決定基の場合、イディオタイプ決定基をエンコードしている核酸配列は、それが送達される個体から得られるサンプルからクローン化されることが好ましい。核酸配列は、包まれていない形で(すなわち、ウイルス粒子または他のパッケージ中で囲まれていない)送達されるのが好都合である。しかしながら核酸は、パッケージまたは粒子(たとえば、リポソームまたはウイルス粒子)の外側表面と結合してもよく、これによって核酸の受容体仲介型の送達の可能性が与えられる。
【００２９】
融合タンパク質は、病原性抗原およびFrCの第1ドメイン単独の発現を指示することができる。あるいは融合タンパク質は、他の外来性免疫原タンパク質またはサイトカインなどの、他の免疫調節ポリペプチド配列をさらに含んでよい。融合タンパク質の免疫原性が高い部分に対する免疫応答は、比較的弱い免疫原病原性抗原に対するいかなる応答をも最終的には圧倒する可能性があるという理論上の問題を防ぐのを、いくつかの抗原性融合体パートナーを使用して助けることは実際有益であろう(ただし、シングル・ドメインFrC-抗原融合体フォーマットは、これを軽減させるように設計されている)。エンベロープを有するウイルスおよび免疫原細胞表面のコート・タンパク質、あるいは任意の病原性生物またはヒト以外の種から誘導される分泌タンパク質は、融合タンパク質中に封入するのに適しているであろう。代わりの一改変法は、病原性抗原/FrC第1ドメインを有する融合体ではなく、別々の存在として、他の免疫調節ポリペプチドの同時発現が可能なように核酸構築体を設計することである。本発明の方法を別の核酸構築体の使用に用いて、他の免疫調節ポリペプチドを発現させることはあまり好ましくない。
【００３０】
いくつかのサイトカインは、抗原提示の態様を改善することが知られており、サイトカイン遺伝子を含む発現ベクターの直接的な送達によってワクチン効率が高まる可能性がある。インターフェロンγは、MHC発現をアップレギュレート(upregulate)する性質のために、有用であろう1例である(Gaczynska他、1993、Nature 365、264-267)。ワクチン核酸によって発現される可能性がある他のポリペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。関連遺伝子が、同じベクターまたは別のベクター上にエンコードされている可能性があり、ベクターおよび発現されるポリペプチドの量は、それぞれ独立に変わる。
【００３１】
予防接種するための遺伝学的手法の1つの利点は、それによって抗原を提示する元来の方法を効率良く使用できる可能性があることであり、したがってこの利点は広範囲のエフェクター系にかかわるはずである。さらに、得られる応答性の操作および改善は比較的容易であるはずである。たとえば、同時刺激活性を有する分子および免疫原を発現させることによって、T細胞に抗原を提示する効率を改善することが可能であろう。同時刺激に関する1つの重要な分子はB7であり、この分子はT細胞によって発現されるCD28と相互作用し、これによってT細胞活性化に関するアクセサリ・シグナルが提供される(Galvin他、1992、J.Immunol.12、3802-3808)。B7とシングル・ドメイン・フラグメントC融合体の両方を発現する、ベクターを構築することができる。マウスおよびヒトB7の両方の配列が発表されており(Freeman他、1989、J.Immunol.8、2714-2722)、これらの遺伝子はPCRによって容易にクローン化することができる。
【００３２】
したがって、本発明の方法が、病原性抗原に対する免疫応答をさらに調節するために、他の免疫調節ポリペプチドの発現を指示する第2の核酸配列を個体に送達することをさらに含むことは、本発明の任意選択の特徴である。この第2の核酸配列は第1の核酸配列と同じ核酸分子上に含まれてよく、あるいは第2の核酸分子上に存在してもよい。
【００３３】
核酸構築体をin vivoで生きている細胞中に導入するための方法は、現在当業者によく知られている。裸のDNAとして、食塩水溶液などの生理学的に許容される希釈剤との混合物として、核酸を患者に(典型的には筋肉内に)シンプルに注射することが好都合である。いくつかの適切な方法、および核酸構築体の患者への投与の好ましい実施形態の詳細は、米国特許第5,580,859号および第5,589,466号に記載されている。遺伝子の輸送により関係がある方法には、ウイルス・ベクターを使用すること、DNAをリポソーム中に包み込ませること、カチオン・リポソームまたはウイルスの外側にDNAを結合させることがある(Miller、1992、Nature 357、45-46を参照のこと)。これらの方法には、輸送の効率を高めるという利点があるが、精製したプラスミドDNAを直接的に注射することと比べると、これらの代替的な手法は幾分複雑であり、安全上の問題を提起する。
【００３４】
したがって第4の態様では、本発明は、疾患に苦しむ患者の免疫応答を誘導する方法(前に定義した本発明の第3の態様)において使用するための組成物を提供し、この組成物は融合タンパク質の発現を指示する核酸構築体を含み、前記融合タンパク質は前記疾患に特徴的なエピトープを含む病原性抗原、および破傷風毒素からのFrCのヘルパー配列(好ましくはp30ヘルパー配列)、および生理学的に許容される希釈剤または担体を含む。FrCドメインのヘルパー配列は、融合タンパク質が問題の病原性抗原と連結したFrCの第1ドメインを含むように、FrCの第1ドメイン中に含まれることが好ましい。実際、FrCの第1ドメイン(p30ヘルパー配列を含む)は、病原性抗原と融合すると、p30ヘルパー配列単独よりも、T細胞応答(特に細胞障害性T細胞)を生み出すことにおいてより一層効果的であることが分かっている。
【００３５】
理想的にはワクチンは、抗原特異的B細胞、細胞障害性T細胞(CTL)およびヘルパーT細胞を刺激することができるべきである。B細胞の刺激には、標的抗原が特異的抗原受容体(表面Ig)と、B細胞表面上において充分に高い親和性で結合することが必要である。いくつかの多価抗原はB細胞の増殖を直接刺激することができるが、有効な既往性応答を提供するために、ヘルパーT細胞によって提供される追加的なシグナルが必要とされることがより多い(以下参照)。本発明では、好ましくは第1ドメイン内に破傷風毒素からのFrCを含むヘルパー配列を有する融合タンパク質として、病原性抗原を発現させることによって、T細胞の助けを回復させる。
【００３６】
CTLのT細胞受容体(TCR)は、標的細胞表面上に示される特異的なMHCクラスI結合型ペプチドを認識する。一般にこのようなペプチドは、標的細胞中で産生されるより大きなポリペプチドまたはタンパク質を加工することによって誘導される。したがって、効率の良いCTL刺激のためには、CTLを活性化することができるMHCクラスI発現型細胞の細胞中で、標的抗原が合成または加工されなければならない。発現のレベルは、正常では(おそらく高い親和性で)MHCペプチドの結合溝において結合される自己ペプチドに取って代わるほど、充分なペプチドを生成するのに充分に高くなければならない(Ohno、1992、PNAS 89、4643-4647)。抗原特異的B細胞と同様に、増殖および細胞障害能力の向上のためには、CTLは抗原認識後の追加的なシグナル(サイトカインの形)を必要とし、これらはヘルパーT細胞によって提供される。
【００３７】
CD4-ポジティブ(positive)ヘルパーT細胞は、(その独特のTCRを介して)特異的細胞表面MHCクラスII結合型ペプチドと相互作用し、一般にこのようなペプチドは、特化した抗原提示細胞(APC)によって内面化されたタンパク質抗原の、タンパク質分解切断によって誘導される。マクロファージ、樹状細胞およびBリンパ球は、このようにして抗原を提示することができる細胞である。したがってBリンパ球は、その表面Igに結合した抗原を内面化および加工し、その後MHCクラスII結合型誘導体ペプチドを提示する(Bリンパ球はクラスIを提示することもできる)。したがって表面ペプチドを認識するCD4-ポジティブ・ヘルパーT細胞は、さまざまな免疫刺激性サイトカインを放出し、B細胞の活性化、増殖および抗体産生をさらに刺激することができる。同様に、局所的な炎症反応の部位に存在にするマクロファージは、食作用を受けた抗原を加工し、Tヘルパー細胞によるサイトカイン放出を刺激することができ、局所的に存在するCTLのさらなる活性化、増殖および細胞毒性をもたらす。
【００３８】
したがって、ワクチン抗原は理想的には、1)MHCクラスIポジティブ宿主細胞によって細胞内で合成され、2)宿主細胞クラスI MHCによって示されると、そのTCRを介して宿主CTLのサブセットを刺激することができるペプチドを生じさせ、3)宿主細胞クラスII MHCによって示されると、そのTCRを介して宿主ヘルパーT細胞のサブセットを刺激することができるペプチドを生じさせ、4)マクロファージと抗原特異的B細胞の両方を含む宿主APCによって内面化および加工され、5)宿主Bリンパ球と相互作用するために、その元の形で利用可能であるべきである。
【００３９】
ここで本発明の態様および実施形態を、たとえば添付の図面を参照することによって例示する。当業者には、他の態様および実施形態が明らかであろう。本明細書中に挙げる書物はすべて、参照によって本明細書に組み込んである。
【００４０】
表１は、本発明の基本を成す実験作業において使用される、DNAワクチンを構築するために使用する、PCRプライマー配列を示す表である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
ガンに対する免疫を活性化するための戦略は、現在集中的に調査されている。DNAの予防接種によって、腫瘍細胞の遺伝的変化の同定と試験用ワクチンの作製の間に比較的シンプルなルートが与えられる。しかしながら、エンコードされたタンパク質が抗原提示の機構にアクセスして、有効な免疫を活性化させる方法は、いまだに完全に明らかではない。注射を受けた筋肉細胞は、T細胞(1、2)に対して直接抗原を提示することはないようであるが、間接的提示のための抗原の貯蔵体として働きそうである(2)。抗原提示細胞(APC)の直接的なトランスフェクションが筋肉部位から起こる可能性があるが(3)、ただし非常に低レベルである(4、5)。腫瘍細胞を攻撃する際にどのエフェクター経路が最も効率が良いかという問題も存在し、これは発現される抗原の性質に明らかに依存する。
【００４２】
本発明に先立って、可変部の遺伝子VHおよびVLによってエンコードされている、クロノタイプIgのイディオタイプ(Id)決定基を標的抗原として使用して、B細胞の悪性を治療するためのDNAワクチンが開発された(6、7)。リンパ腫については、腫瘍細胞を殺傷する際に抗Id抗体が有効であり(6、8、9)、したがって、抗体を誘導するためにDNAワクチンが設計された。当初は、VHおよびVL遺伝子を含むワクチンが作製された。なぜなら単鎖FV(10)のみでは、マウス・モデル(11)において抗Idを誘導する際に効率が悪いことが分かっていたからである。破傷風毒素のフラグメントC(FrC)をエンコードする遺伝子を、scFV配列に融合させることによって、リンパ腫のチャレンジ(12、13)に対して保護しながら、抗体産生を強く促進する結果となった。現在この設計体が、濾胞性リンパ腫のグレードが低い患者の、パイロット臨床試験において試験されている。免疫応答をId抗原に関与させるために、異種タンパク質(14)またはケモカイン(15)などの追加のタンパク質をエンコードする遺伝子を融合させることに関する必要性が、一般的に見出されている。本発明の場合、融合が絶対的な要件であり、分離プラスミドに促進効果がないという事実によって、FrC特異的T細胞を提供して、B細胞が抗Id(12)を分泌するのを助けることができるという概念が支持された。しかしながら興味深いことに、同じscFV-FrC設計体は、Ig分泌、表面Ig-ネガティブ骨髄腫モデルに対する防御免疫を誘導することができ、これがおそらくはCD4+サブセット(16)である、エフェクターT細胞(13)によって仲介されることは明らかであった。
【００４３】
この設計体は表面または分泌される標的抗原に適している可能性はあるが、多くの候補腫瘍抗原は細胞内性のものであり、MHCクラスI分子と結合したペプチドとしてのみ提示されるはずである(17に概説)。したがって問題は、FrC配列との融合が必要であるのかどうか、あるいはこれが候補となる腫瘍由来のペプチドに対するCTL仲介型免疫を誘導するのに有用であるのかどうかということである。DNAワクチンとして送達されるとき、FrCそのものがCTL応答を誘導することができるということを、本発明者らは既に発見しており、H2-Kb-制限ペプチドのモチーフをFrC配列中の位置1287-94において同定した(13、18)。CD8+T細胞がただ1個または数個のペプチドのモチーフに焦点を合わせる、免疫優性の現象は、ウイルス感染に対する応答において明白である(19)。実際、CD8+T細胞応答の主な特徴として、免疫優性化が記載されている(20に概説)。このことがDNAワクチンに当てはまる場合、FrC配列と腫瘍ペプチド配列を競合させる可能性がある融合について議論されるであろう。
【００４４】
FrCは2つのドメイン、ゼリー・ロールN末端ドメインおよび第2のβ-トレフォイル・ドメイン(21)から構成される。第1ドメインは充分に記載「共通の」ヘルパー・エピトープ、p30(22、23)を含み、これは一定範囲のマウスおよびヒトMHCクラスII対立遺伝子に結合し、CD4+T細胞(24)によって認識される。本発明者らは以前に、第2ドメイン中のCD8+T細胞の誘導に関するエピトープを同定した(18)。本発明者らは、このドメイン中でCD8+T細胞応答を誘導するための同様の能力を有する、他のエピトープを同定した。現在、本発明者らは、DNAを介して提示される候補エピトープに対するCTL応答の誘導にとって重要である可能性がある、2つの要因を調査している。第1の要因はDNA配列中のペプチド・エピトープの位置であり、第2の要因は、CTL活性を促進させる際のヘルパー・エピトープを含むドメインの役割である。
【００４５】
ガン細胞を攻撃することについての、誘導されたCTLの関連性を試験するために、本発明者らは完全長のFrCをEL-4細胞にトランスフェクトし、この場合加工されたペプチドは代理の標的抗原として作用することができる。ガンにより近づけるために、ガン胎児抗原からの公知のエピトープを取り込ませた類似の設計のワクチンが、高レベルの特異的CTLを誘導することも、本発明者らは実証した。このモデルを使用して、アジュバントFrC配列からの、競合する可能性があるエピトープを除去するための必要性を確認した。
【００４６】
(結果)
ΔFrCの生成
FrCの第1ドメインをエンコードしている第1の部分、および細胞障害性T細胞応答を誘導することが知られているペプチドをエンコードしている第2の部分を含む、核酸配列を組み立てた。この具体例では、FrCの第2ドメイン内にペプチドが含まれる。しかしながら、これは細胞障害性T細胞モチーフを含むペプチドの例示的なものである。
【００４７】
核酸構築体の組み立ては、pcDNA3(Invitrogen7)などのプラスミド・バックボーンを使用して図3に概略するように行う(図3)。簡潔には、出発プラスミドはFrC全体とリーダー配列を含む(FrC+L)。5'リーダー配列は腫瘍から誘導される(BCL1)。この出発プラスミドをp FrC+Lと呼ぶ。
【００４８】
次いでプライマーを使用して、図3のパート2に示すようにFrCの第1ドメイン(ΔFrC)を単離する。次いでPCR産物を清掃、消化して、たとえばプライマーから導入された望ましくない核酸配列を除去し、HindIIIおよびNotI部位を使用してpcDNA3に再びクローン化する。したがって結果として生じるプラスミドは、リーダー配列(BCL1)にのみ融合したFrCの第1ドメイン、およびこのFrCの第1ドメインの端に加えられたストップ・コドンを含む。
【００４９】
ΔFrCおよびペプチド抗原の生成
病原性抗原をプラスミド中に導入するために、問題の病原性抗原もコードしているΔFrCの3'端の逆方向プライマーを使用して、この配列をΔFrC配列に加える。図3のパート3に、これを図式的に示す。
【００５０】
より長いペプチド配列上に含まれる病原性抗原については、重複プライマーを使用するPCR Soeing技法を使用する。
【００５１】
図2および4から6は、この種のベクターの例であるベクターpcDNA3およびpVAC1の詳細を示すものであり、これらを本発明に従って使用して核酸構築体を保有することができる。RSVLTRをサイトメガロウイルスからのプロモーター配列(pCMV)で置き換えることが好ましいことを、本発明者らは発見している。
【００５２】
FrC中のCTL誘導MHCクラスI結合モチーフの同定
FrCのアミノ酸配列を、ペプチド8量体モチーフおよびH2-KbまたはH2-Db(31)に結合する可能性について調べた。この配列を含む分子の解離の推定半減期に基づいてスコアを割り当てるためのアルゴリズムを使用して(31)、H2-Kbへの結合に関して13を超える値を有する8個のペプチドを同定し、合成した。トップ20の予想した結合配列は、86.4から1.32の範囲の値を与えた。知られている免疫優性Kb-制限CTLエピトープは、132(RGYVYQGL)と17(SIINFEKL)の間のスコアである。Kb-結合センダイウイルス核タンパク質由来の配列FAGNYPAL(SEV)はスコア60であり、一方コントロール、Db-制限エピトープ(ASNENMDAM)は、スコア1であった。唯一のH2-Db結合候補を含めた、8未満のスコアであったFrC配列をさらに調べることはしなかった。
【００５３】
次いでマウスに、完全長FrC(p.FrC)をエンコードしている遺伝子を含むDNAワクチンを予防接種した。1回の予防接種の14日後、in vitroで1回再刺激した後にペプチド装入EL4細胞に対するCTL応答を、8個のペプチドのうちの2個を使用して、検出することができた(図8a)。他の注射、または追加的なin vitroでの再刺激は、残りの6個の候補ペプチドに対するCTL応答を誘導するのに失敗した。本発明者らがペプチド1およびペプチド2と名付けた、2つのポジティブ・ペプチドはFrCの第2ドメインから誘導され、1287-94および1162-69にそれぞれ位置していた。
【００５４】
残りのペプチドは、検出可能ないかなるCTL活性も刺激することができなかった。興味深いことに、2つの免疫刺激ペプチドのうち、ペプチド1(SNWYFNHL)が最も低いスコア(13.2)であり、ペプチド2(LNIYYRRL)は26.4のスコアで3番目にランクされた。in vitroでの結合アッセイでは、ペプチド1およびペプチド2の両方が、H2-Kbに充分等しく結合することができ、大幅には異ならずにポジティブ・コントロールのペプチドSEVに結合することができた(図8b)。したがって予想アルゴリズムは、両方の免疫刺激配列の同定においては成功したが、以前に述べたように(32)、予想した結合とクラスIに結合しCTL応答を刺激する実際の能力の間には、それほど相関関係がない可能性がある。
【００５５】
第1ドメインのC末端にペプチド配列の位置を移すことの影響
完全長FrC配列を予防接種することによって、ペプチド1および2はCTL応答を誘導することができたが、この応答は比較的弱く、高レベルの51Cr放出を生み出すためには2回の再刺激が必要であった。腫瘍抗原は免疫原性が低い可能性もあるので、本発明者らはこれらのペプチドを、DNA送達を介して免疫原活性を増大させるためのモデルとして使用した。本発明者らは最初に、ペプチド配列をFrCバックボーンから除去し、第1ドメイン(p.DOM)のC末端にその配列の位置を移すことの影響を調べた。p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2を用いた1回の筋肉内注射によって、in vitroでの1回の刺激の後に検出可能な、迅速な高レベルのCTL応答が生まれた。元のp.FrCワクチンとの比較を図9に示し、多数の実験で同様の結果を得た。
【００５６】
細胞溶解活性は、CD8+T細胞群中で見られる細胞内IFNγのレベルと平行しており(図10aおよびb)、p.DOM-ペプチド・ワクチンはp.FrCワクチンと比べて、IFNγポジティブCD8+細胞のパーセンテージの2-3倍の増加を通常は誘導する。CTLは、リーダーレスp.FrCでトランスフェクトされたEL4細胞を溶かすこともでき(図11)、ペプチド1に特異的なものがより有効であった。これによって、ペプチド1によって誘導されるCTLは、ペプチド2によって誘導されるそれよりも標的トランスフェクタントを殺傷することができることが示される。この理由は現在明らかではないが、すべての候補ペプチドが標的として有用なわけではないことを意味する可能性がある。
【００５７】
ペプチド2に対するCTLについてはごく低レベルの特異的溶解が観察されたが、これらは繰り返しの実験で一貫していた。対照的に、エンプティ・ベクターでトランスフェクトされたEL4細胞に顕著な溶解は観察されなかった。ペプチドを標的細胞に加えることによって特異的溶解は明らかに増大し、トランスフェクタントは内因的経路によって、低レベルの両ペプチドのみを加工および提示できることが示された(図11)。しかしながら発現のレベルは、ペプチド1または2に特異的なエフェクターCTLが、in vivoでトランスフェクタントを攻撃するほど充分であった(以下参照)。
【００５８】
DNAワクチンを介したCTL誘導に対するドメイン1(p.DOM)の貢献
ドメイン1は、位置947-967に1つの同定された「共通の」ペプチドを含み、多数のMHCクラスII分子と結合するヒトT細胞(24)またはマウスT細胞(33)によって、これを認識することができる。このペプチドはT細胞の助け(34)を提供するためのp.DOMの重要な成分なので、本発明者らはCTL誘導におけるその役割を調べた。本発明者らは、それぞれのCTLペプチド配列に連結したp30配列のみを含むDNAワクチンの能力を、p.DOM-ペプチド・ワクチンのそれと比較した。図9は、p.p-30-ペプチド1はCTL応答をあまり誘導せず;p.p-30-ペプチド2はより有効であったが、p.DOM-ペプチド2よりも大幅に低く働き、実際は元のp.FrCワクチンよりも効果が低かったことを示す。細胞内IFNγを生成するCD8+T細胞の数を比較することによって、同じ傾向が示された(図10c)。p.p-30-ペプチド・ワクチンを用いた繰り返しの予防接種および再刺激によって、CTLを生成させることができる可能性があり(データは示さない)、これによって構築体の無欠性が確認されるが、良いパフォーマンスは示されない。結論はp.DOMが、結合したペプチドに対する効果的なCTL応答を誘導するのに必要な、追加的な配列情報を含むということである。
【００５９】
ペプチド予防接種を介したCTL誘導に対するp.DOMの貢献
次いで本発明者らは、DNA送達を介したCTL誘導に対するp.DOMのアジュバント効果が、合成ペプチドと共に投与されるとき、明らかであるかどうかを調べた。ペプチド1をp.DOMと混合させ、筋肉内に注射した。
【００６０】
しかしながら、0、21および42日目における3回の注射、および4回までの週に1度のin vitroでの再刺激の後でも、CTL活性は誘導されなかった(データは示さない)。同じ細胞への送達のために、あるいは第1ドメインの合成とペプチドの存在が一致することを保証するために、p.DOMがペプチド配列に融合することが必要であるようである。
【００６１】
保護
0日目および21日目のp.DOM-ペプチド1を用いた予防接種によって、28日目のEL4-FrCトランスフェクタントによるチャレンジに対する相当な保護がもたらされ(図12)、エンプティ・ベクター(pcDNA3)でトランスフェクトされたEL4細胞の成長に対する影響はなかった(データは示さない)。この比較的初期のチャレンジ(28日目)では、p.DOM-ペプチド1は完全長p.FrCプラスミドよりも優れており、CTLの迅速な誘導と一致した。しかしながら、p.FrCワクチンは14日目までに充分なCTLを生成して、1度の再刺激後in vitroでトランスフェクタントを殺傷することはできなかったが、おそらくは第2の注射によるCTLの広がりのために、いくらかの保護は明らかであった(図12)。CTLがin vitroでトランスフェクタントを殺傷し、チャレンジに対して保護することができたことは、第3のワクチン注射の後に2ドメインp.FrCによって誘導された可能性がある(データは示さない)。ペプチド1または2配列のいずれかに融合したp30ヘルパー・エピトープのみを含むプラスミドを用いた予防接種は、CTLを誘導する能力が低いことから予想されたように(データは示さない)、保護をもたらすには全く効果がなかった(図12)。消耗実験によって、CD8+T細胞が消耗したことにより、保護はすべて無くなったことが示された(データは示さない)。EL4細胞によるCD4の発現のために、CD4+T細胞を消耗させることはできなかった。これらの結果によって、位置を移したペプチド1によって誘導されるCTLは、腫瘍に対する保護に貢献していることが示される。
【００６２】
ガン胎児抗原からのペプチドに対してCTLを誘導するためのp.DOM-ペプチド設計体
p.DOM-ペプチド設計体が候補腫瘍結合抗原に対してCTLを誘導する能力を試験するために、ガン胎児抗原(CEA)から誘導したペプチドを選択した。ペプチドEAQNTTYLは、B6マウスに組み換えワクチニア・ウイルス(35)を予防接種することによって誘導されるCTLの標的として、作用することが知られている。エンコード配列を第1ドメインの3'端に配置して、p.DOM-CEAペプチド・ワクチンを作成した(図7)。これをマウスに注射し、in vitroで1度再刺激した後14日目にCTL活性を測定した。高レベルのCTL活性が誘導され(図13a)、IFNγ含有CD8+T細胞は〜20%であった(図13b)。コントロールp.DOMプラスミドのみが低レベルのCTL活性を生み出し、IFNγポジティブCD8+T細胞はわずか(2.4%)であった(図13b)。
【００６３】
エピトープ競合の実証
CEAモデルを使用して、FrCの第2ドメイン中のエピトープは結合した腫瘍由来のエピトープと競合するという仮説を調査した。CEAペプチド配列を2ドメイン(完全長)FrC配列のカルボキシル端に配置して、p.FrC-CEA526-533を生成させた(図7)。次いでこの構築体がCEA特異的CTLを誘導する能力を、1回の注射およびin vitroでの1度の再刺激を使用して、シングル・ドメインp.DOM-CEA526-533設計体のそれと比較した。繰り返しの実験において、シングル・ドメインのワクチンは、2ドメインFrCを含む構築体(p.FrC-CEA526-533)(図14c)と比較して、CEAエピトープ(図14a)に対して2-3倍高いレベルのCTL活性を誘導した。しかしながら2ドメイン構築体は、FrCペプチド1に対して高レベルのCTL活性を誘導することができた(図14d)。これによって、競合する可能性のあるエピトープをFrCの第2ドメイン中に含むことにより、CEA特異的CTL活性の誘導の抑制がもたらされることが強く示唆される。
【００６４】
CEAペプチドに対する細胞溶解活性は、CD8+T細胞群中で見られる細胞内IFNγのレベルと平行しており、p.DOM-CEA526-533ワクチンは2ドメイン・ワクチン(図15aおよび15c)と比べて、2-3倍高レベルのIFNγポジティブ細胞を誘導する。予想したように、高レベルのIFNγポジティブCD8+T細胞(図15d)によって、FrCの第2ドメインのペプチド1に対して高レベルのCTL活性が誘導されたことが反映された。コントロールp.DOMワクチンは著しいCTL活性(図14b)は生み出さず、IFNγポジティブCD8+T細胞(図15b)のレベルは非常に低かった。
【００６５】
これらの結果によって、CEAエピトープに対する応答の誘導においてFrCの第2ドメインを除去することの予想された利点が確認され、p.DOMペプチド設計体は腫瘍抗原に一般的に適用できる可能性があることが示唆される。
【００６６】
(考察)
ガンに対する首尾の良い予防接種には、CTLを含めた免疫の多数の経路を活性化することが必要であるようである。DNAワクチンはCTL応答の誘導においては効率がよいが(36)、腫瘍抗原は弱いことが多く(12)、親和性の高いCD8+T細胞の欠失が起こる可能性がある(37)。CTLを生成するために、候補ペプチドは、好ましくは応答に優先する可能性がある競合ペプチドの不在下で、APCによって効率よく加工および提示されなければならない(20に概説)。本発明者らは、破傷風毒素のFrC配列に対するCTL応答を調べた。これは第一に、アジュバント「外来」配列としてFrCを使用して、結合したscFV配列に対する免疫を活性化することに本発明者らが関心を持っていたからである(12)。
【００６７】
マウスB細胞のリンパ腫および骨髄腫に対してそれらのDNA scFV-FrCワクチンを使用することによって、抗体およびCD4+T細胞に関する、保護性抗Id免疫をそれぞれ促進する(13)。scFVに対するCTL応答は検出されず、これはおそらくV遺伝子中にMHCクラスI結合モチーフが欠けていたためであろう。しかしながら、FrCの第2ドメイン中の2つのペプチド・モチーフに対しては、CTLが誘導された(13、18)。応答は比較的弱かったが、これらは結合した腫瘍配列からのCTLモチーフと競合する可能性がある(38)。候補ペプチドに対してCTLを誘導することについての、FrC配列のアジュバント可能性を調べるために、本発明者らは第2ドメインを除去し、第1ドメインを残して、「共通の」ペプチドp30を介してT細胞の助けをもたらした(24、34)。
【００６８】
次いで、アジュバントとしての第1ドメイン(p.DOM)の作用を、捨てた第2ドメインからの2つのペプチド・モチーフを使用して試験した。p.DOMをC末端に位置を移すことによって、それぞれのペプチドに対するCTLの顕著な増大がもたらされた。以前に本発明者らは、リーダー配列が存在する場合、FrCに対するCTLがより効率よく誘導されることを発見しており(18)、したがって本発明者らは、ここに記載したすべての構築体にリーダー配列を含ませた。リーダー配列を含ませることによって、アミノ酸約60個より長い構築体はすべて、同時翻訳的にERに運ばれる。したがって、位置を移したことの効果は「C末端の原則」を反映している可能性があり、前駆体ペプチドのC末端またはER部位中のタンパク質から抗原性ペプチドが優先的に生成される(39)。このことは、正常ではER中に存在する、gp96またはカルレチクリンなどの熱ショック・タンパク質を介した、筋肉からAPCへのペプチドの間接的な移動とも関連がある可能性がある(40)。
【００６９】
第2の調査は、結合したペプチド配列に対してCTLを誘導することに対する、p.DOMの貢献を評価することであった。モデル系では、隣接I-Ab-制限ヘルパーペプチド配列に融合した、OVA(SIINFEKL)の免疫原Kb-制限エピトープをエンコードしているDNAワクチンは、CTLを誘導することができた(34)。ヘルパー・エピトープおよびCTLエピトープが唯一の要件かもしれないことが、これによって示される。この特定の場合では、この設計体は不充分であった。なぜなら、CTLエピトープのいずれかに融合した「共通の」ヘルパーペプチド配列をエンコードしている融合遺伝子は、低レベルのCTL活性しか生み出さなかったからである。このことは、OVAペプチドと比べて、FrC由来のペプチドが比較的弱いことによるものである可能性があるが、このことは腫瘍抗原に関する問題を示している可能性がある。他の可能性は、これらのDNAワクチンの免疫効能に対するリーダー配列の重要な貢献に関するものである。ERへの短い構築体の供給は、不十分なことがある。なぜならこれらの構築体は、より効率が悪く、したがってより効率の悪いプライミングが生じる、同時翻訳による運搬(41)というよりはむしろ翻訳後の運搬に依存するからである。それにもかかわらず、p.DOM中の追加的な配列が、より一層のT細胞の助けをもたらすか、あるいはこれが他のメカニズムによるペプチドの提示に貢献している可能性がある。1つの可能性は25KDのドメインが、ペプチドをシトソル中での分解から保護することによって、結合ペプチドのレベルを上げていることである。他の可能性は、ER中のいくつかの誤って折りたたまれたFrCドメインの存在が、クロス・プライミング用の熱ショック・タンパク質への結合ペプチドの装入に影響を与えている可能性があることである(42)。
【００７０】
p.DOM-ペプチド1はEL4-FrC腫瘍に対する迅速なCD8+T細胞仲介の防御免疫を活性化し、完全長FrC(p.FrC)を含むワクチンよりも効率がよいようであるという発見によって、ガン治療に関連する2つの特徴が示される。第1の特徴は、位置を移すことによって、ペプチド特異的CTLを誘導することを目的とするワクチンの有効性を増大させることができることである。選択するペプチドは腫瘍細胞によって提示もされなければならないことは明らかであるが、エフェクター細胞の認識に必要とされるレベルは低い可能性がある(20)。第2の特徴は、弱いペプチド抗原に対するDNAワクチンに必要とされる活性化シグナルを、p.DOMが提供することができることである。興味深いことに、候補HLA-A2-結合モチーフの6個のうちの4個も、FrCの第2ドメイン中にあり、初期の研究は、その配列中においても機能レベルが高いことを示している(観察は未発表)。知られているCEA由来のペプチド配列を使用する本発明者らのデータは、p.DOM-ペプチド設計体を他のガン抗原に適用することができることを示す。このモデルを使用して、FrCの第2ドメインを除去する利点を実証することもできた。なぜなら、そのドメイン内の潜在的な競合エピトープは、CEA特異的CTLの誘導を抑制することができたからである。この発見によって、設計体の裏の原理が確認される。CEAからの第1の候補ペプチドによって、このフォーマットから迅速で高レベルのCTLが生み出されるという事実は有望であり、この結果によって、p.DOM戦略はヒト・ワクチンと関連性があることが示される。
【００７１】
(物質および方法)
DNAワクチンの構築
FrCの完全長2ドメイン配列(破傷風毒素のアミノ酸865-1316(TT865-1316))、およびBCL1腫瘍のIgMのVH由来のリーダー配列をエンコードしている遺伝子を含む、DNAワクチン(p.FrC)の構築が記載されている(25、26)。第1ドメイン(21)(p.DOM)をエンコードしている遺伝子を含むDNAワクチンを、pcDNA3にクローン化する前に、正方向および逆方向プライマーFrCf1およびFrCr1をそれぞれ使用して、p.FrCからのアミノ末端ドメイン配列(TT865-1120)のPCR増幅によって構築した(表1)。次いでこのプラスミドを、それぞれ第1ドメインは含むがカルボキシル末端に融合した異なるCTLエピトープ配列を有する、3つの類似なワクチンを構築するために鋳型として使用した。TT1287-1294ペプチドをエンコードしているp.DOM-ペプチド1、TT1162-1169ペプチドをエンコードしているp.DOM-ペプチド2、またはCEA526-533ペプチドをエンコードしているp.DOM-CEAの作製は、p.DOM単独のそれと同一であった。ただし、それぞれの場合異なる逆方向プライマーを使用し(それぞれFrCr2、FrCr3およびFrCr4)、これらはp.DOMカルボキシル配列と重複し、興味のあるCTLエピトープ配列を取り込んだ。DNAワクチンp.-FrC-CEA526-533を、正方向プライマーFGf1、およびFrCの3'配列と重複しCEA CTLエピトープ(CEA526-533)をエンコードしているプライマーFCr5を使用して、完全長FrC配列のPCR増幅によって構築し、これをFrCのカルボキシル端に融合させた。次いでPCR産物をpcDNA3にクローン化した。
【００７２】
CTLエピトープTT1287-1294をエンコードしているDNA配列を、FrCの第1ドメイン(24)中に位置する「共通の」Tヘルパー・エピトープ、p30(TT947-967)をエンコードしているDNA配列に連結させることによって、p.p30-ペプチド1を作製した。3ステップのPCRアセンブリ手順を使用した。最初に、BCL1リーダー配列を、正方向プライマーPCMVf1、およびp30重複配列を含む逆方向プライマーBCL1r1を使用して、p.FrCから増幅した。第2に、正方向プライマーp30f1およびCTLエピトープTT1287-1294をエンコードしている突出部を含む逆方向プライマーp30r1を用いて、p30をp.FrCから増幅した。第3に、これら2つのゲル精製PCR産物を組み合わせ、プライマーPCMVf1およびp30r1を使用して、PCR-SOeingによって組み立てた。ワクチンp.p30-ペプチド2を、CTLエピトープTT1162-1169をエンコードしている突出部を含む逆方向プライマーp30r2を使用して、同様の方法で作製した。作製したすべてのワクチンPCR産物を、HindIIIおよびNotI制限部位を使用して、発現ベクターpcDNA3(Invitrogen Corp.、San Diego、CA)に連結させた。プライマー配列を表1に示す。
【００７３】
DNAワクチンの構造を図7に示す。DNAの配列決定によって、構築体すべての無欠性を確認した。TNTR T7 Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega Corp.、Madison、WI)を使用して、発現およびサイズをin vitroにおいて調べた。哺乳動物の細胞中の発現を、COS細胞をトランスフェクトし、ELISAによって上澄み中のFrC含有タンパク質を測定することによって試験した(12)。
【００７４】
ペプチド
室内においてShimadzu PSSM8ペプチド・シンセサイザーでFmoc化学を使用して、フラグメントC(FrC)ペプチドを合成し、HPLCによって純度を調べた。
【００７５】
比色定量アッセイ(BCA;Pierce、Rockford、IL)によって、濃度を測定した。H-2b-制限FrC CTLエピトープ配列TT1287-1294(SNWYFNHL:ペプチド1)およびTT1162-1169(LNIYYRRL:ペプチド2)の同等物は、完全な破傷風毒素(TT)配列に対応する。CEA526-533ペプチド(EAQNTTYL)は、前に記載されている(27、28)。これは商業的に合成され、95%を超える純度で提供された(Peptide Protein Research Ltd.、Southampton、UK)。
【００７６】
ペプチド結合アッセイ
それぞれのペプチドのH2-Kbへの結合は、記載されているようにアセンブリ・アッセイを使用して行った(29)。このアッセイは、RMA-S細胞の洗浄溶解物中では、安定した(Kb結合)ペプチドを溶解時に加えない限り、Kb分子は不安定であり一晩4℃でインキュベーションした後に解離するという観察に基づくものである。したがって安定化したKb分子のみを、一晩インキュベーションした後にmAb Y3を用いた免疫沈降によって回収することができる。回収されるKbの量はペプチド結合の量に正比例し、50%最大回収を行うのに必要とされるペプチドの濃度が、およその結合親和性を表す(29)。H2-Kb重鎖(HC)の回収を、免疫沈降およびAIDA(Fuji)を使用するSDS PAGEの後で定量化した。
【００７７】
予防接種プロトコルおよびCTLアッセイ
室内で飼育したC57BL/6マウスに、6-10週間の年齢において、50μgのDNAを正常な食塩水中に溶かしたものを用いて、大腿四頭筋の2個所の部位に注射して予防接種した。CTL応答を測定するために、14日目にマウスを殺傷した。予防接種したマウスから脾臓をプールし、10%熱不活性化FCS(Life Technologies、Paisley、UK)、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、非必須アミノ酸(100倍ストックの1%)、25mM HEPESバッファーおよび50μM 2-メルカプトエタノールを補充したRPMI培地中で、1つの細胞懸濁液を調製した。3×106細胞/mlで、脾細胞を40ml培地中に再懸濁させ、これを80cm2フラスコに、組み替えヒトIL-2(20U/ml、Perkin-Elmer、Foster City、CA)およびペプチド(5-20μM)と共に加えた。T細胞培養物を、7日後に24ウエルのプレートにおいて再び刺激した。T細胞(5×105/ウエル)を、照射した同系の「フィーダー」脾細胞(5×106/ウエル)、rIL-2(20U/ml)、およびペプチド(5-20μM)と混合させた。前に記載したように(18)、T細胞培養物の細胞溶解活性を、1回in vitroで刺激した6日後に、標準的な4-5時間の51Cr放出アッセイによって評価した。示した実験については、さらなるin vitroでの刺激を与えた。標的細胞は、試験用またはコントロール・ペプチドと共にインキュベートしたEL4細胞(ATCC;TIB39)であり、EL4細胞のみか、あるいはトランスフェクトされたEL4細胞であった(以下参照)。標準式([CTLによる放出-標的のみによる放出]/[4%NP40による放出-標的のみによる放出]×100%)によって、特異的溶解を計算した。標的のみによる自発的な放出は常に、4%NP40による放出の20%未満であった。
【００７８】
細胞内γ-IFNアッセイ
生存能力のある細胞を、密度遠心分離によって選択した(Lymphoprep、Nycomed Pharma As、Oslo、Norway)。細胞が5×105/ウエルであり、rIL-2、ペプチド1μMが10U/ウエルであり、さらにゴルジプラグ(PharMingen)が1μl/ウエルである96Uウエルのプレートにおいて、37℃で4時間、T細胞をインキュベートした。1μg/ウエルのFITC抗マウスCD8b.2(Ly-3.2、クローン53-5.8、PharMingen)またはイソタイプ・コントロールで標識化(20分、4℃)する前に、2%非働化マウス血清で細胞をブロックした(15分、4℃)。表面標識化の後に、細胞を1%ホルムアルデヒドで固定し(20分、4℃)、次いで0.5μg/ウエルのPEラット抗マウスγ-IFN(クローンXMG1.2、PharMingen)を用いて4℃で20分間細胞内標識する前に、0.5%サポニンで浸した(10分、4℃)。最後の洗浄の後に、細胞をPBS中に再懸濁させ、CELLQUESTソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して、FACScaliburによってすぐに分析した。
【００７９】
腫瘍標的
本発明者らは、FrC(18)の非分泌(リーダー配列なし)形をエンコードしているプラスミドがトランスフェクトされた、EL4腫瘍細胞からなる腫瘍モデルを生成した。簡潔には、400μl培地中の2×106個の細胞を10μgのDNAプラスミドと混合させ、300V、975μF(Gene Pulser Cuvette、電極ギャップ0.4cm、Biorad)で電気穿孔した。選択的抗生物質(Geneticin、2mg/ml、Life Technologies Ltd.)の存在下で細胞を成長させ、安定した群を復元させた後、これらの細胞をクローン化し、FrC特異的CTLによる溶解しやすさについて試験した。これによって、腫瘍細胞株EL4-FrCの生成がもたらされた。
【００８０】
腫瘍のチャレンジ
1×105のEL4-FrCトランスフェクタントまたはエンプティ・ベクター(pcDNA3)でトランスフェクトしたEL4細胞を、右脚に皮下注射することによって、C57BL/6マウスをチャレンジした。その結果生じた腫瘍が直径1.5cmに達したとき、ヒト終点ガイドライン(UK Coordinating Committee for Cancer Research、London、UK)に従ってマウスを殺傷し、死んだ日を記録した。100μgのIg(Dr.S.Cobbold(30)によって親切にも供給されたラット抗マウスCD8,YTS169.4.2.1、またはイソタイプ・コントロール)を、14日間中2-3日毎に腹腔内注射することによってin vivoで、細胞消耗実験を行い、腫瘍のチャレンジの1週間前にこれを始めた。
【００８１】
本明細書に記載する実験作業は、他種のマウス(Balb/C)にも行い、結果は同じであった。
【００８２】
「参考文献」
【００８３】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 FrCのトポロジー(Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997)を示す図である。この図は、FrCの第1ドメインのN末端、および第2ドメインのC末端を示す。ヘルパー・アミノ酸配列は、第1ドメイン中のアミノ酸位置947-967で見られる。
【図２】 プラスミドpcDNA3(Invitrogen)の詳細な地図を示す図である。
【図３】 FrCの第1ドメインおよび病原性抗原を含むベクターを生成するための方法の概略を示す図である。
【図４ａ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図４ｂ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図４ｃ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図５】 pVAC1制限地図を示す図である。
【図６】 pVAC1の主な特徴の概略を示す図である。
【図７】 DNAワクチンの設計を示す概略図である。Hind IIIおよびNot I制限酵素部位を使用してワクチン配列を組み立て、pcDNA3に挿入した。DNA配列は、完全長FrCの2つのドメイン
【外１】
、またはアミノ末端ドメインのみ
【外２】
、p30
【外３】
、BCL1リーダー
【外４】
、TT1287-1294
【外５】
、TT1162-1169
【外６】
、およびCEA526-533
【外７】
をエンコードしているものを含んでいた。Tヘルパー・エピトープ、p30をエンコードしているDNA配列はp.DOM配列
【外８】
中にあり、H-2Kb-制限CTLエピトープ配列TT1287-1294(ペプチド1)およびTT1162-1169(ペプチド2)は、第2ドメイン
【外９】
中にある。
【図８】 完全長FrC配列(p.FrC)をエンコードしているDNAを用いた予防接種によって誘導されるCTL応答は、2つのH-2Kb-結合八量体に特異的であることを示す図である。p.FrCによる予防接種の後に、14日目に採取した脾細胞を、有意なH-2Kb-結合活性が予想される8個のペプチドそれぞれで再刺激した。わずかに2つのペプチドが、51Cr放出アッセイによって測定される、測定可能なCTL活性を誘導した。a).ペプチド装入EL4細胞に対するCTL活性を、ペプチド1(SNWYFNHL)およびペプチド2(LNIYYRRL)に対して検出した。それぞれのペプチドは、試験用またはコントロールのいずれかとして相互的に使用した。b).安定化アッセイによるH-2Kbへの結合活性によって、ペプチド1および2はSendaiウイルス核タンパク質(SEV)からのポジティブ・コントロールに匹敵し、インフルエンザ・ウイルス(ASN)からのコントロールのH-2Db-結合ペプチドとは明らかに異なることが示された。
【図９】 第2ドメイン中の埋め込み部位から、FrCの第1ドメインのC末端にペプチド1または2の位置を移すことによって、特異的な抗ペプチドCTL応答が増幅されることを示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド)、またはペプチド1または2配列に融合したFrCのp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド)、または挿入物のないコントロール・プラスミド(p.φ)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、ペプチド装入EL4標的細胞を使用し51Cr放出アッセイによってCTL活性を測定する前に、ペプチド1(左側)またはペプチド2(右側)を用いて脾細胞を再刺激した。コントロール・ペプチドが装入された標的細胞の溶解は、いずれの場合もごくわずかであった(2.2%未満)。
【図１０】 埋め込まれたペプチドまたは位置を移されたペプチドを含むDNAワクチンが、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド)、またはペプチド1または2配列に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、示したようにペプチド1またはペプチド2を用いて脾細胞を再刺激し、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞のパーセンテージを示す。構築体の相対的な効率は、51Cr放出アッセイと平行した(図9)。
【図１１】 p.DOM-ペプチド配列を含むDNAワクチンによって誘導されたCTLが、標的トランスフェクタントを殺傷する能力を示す図である。p.DOM-ペプチド1(aおよびb)またはp.DOM-ペプチド2(cおよびd)を用いた予防接種の後に、14日目に脾細胞を採取し、51Cr標識した標的細胞に対する活性を試験する前に、in vitroで6日間ペプチドを用いて再刺激した。標的細胞は、リーダー配列のないFrC(□)またはエンプティ・ベクター(■)でトランスフェクトしたEL4細胞、EL4細胞単独(▲)、またはペプチド1が装入されたEL4細胞(◇)、またはペプチド2が装入されたEL4細胞(○)を含んでいた。
【図１２ａ】 埋め込まれたペプチド1または位置を移されたペプチド1を含むDNAワクチンが、EL4-FrCでトランスフェクトした腫瘍細胞を用いたチャレンジに対する防御免疫を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2)、またはペプチド1に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド1)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を、グループ当たり8匹のマウスを使用して、0日目と21日目に行った。28日目に、105個の腫瘍細胞をscで注射し、腫瘍サイズが直径1.5cmに達したときに、マウスを殺傷した。
【図１２ｂ】 埋め込まれたペプチド1または位置を移されたペプチド1を含むDNAワクチンが、EL4-FrCでトランスフェクトした腫瘍細胞を用いたチャレンジに対する防御免疫を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2)、またはペプチド1に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド1)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を、グループ当たり8匹のマウスを使用して、0日目と21日目に行った。28日目に、105個の腫瘍細胞をscで注射し、腫瘍サイズが直径1.5cmに達したときに、マウスを殺傷した。
【図１３】 p.DOM-ペプチド設計体がガン胎児抗原(CEA)からの候補ペプチドに対するCTL応答を誘導する能力を示す図である。C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するp.DOMをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、ペプチドを用いて脾細胞を再刺激し、a)特異的ペプチド(●)またはコントロール・ペプチド(○)を装入した標的EL4細胞を使用して51Cr放出アッセイにおいて試験した。p.DOMのみを予防接種したマウスは、特異的ペプチド(▲)またはコントロール・ペプチド(△)に対する応答についても試験した。b)では、細胞内IFNγを有する応答CD8+T細胞のパーセンテージの平行アッセイを示す。
【図１４】 p.DOM-ペプチド設計体を使用することによって、2ドメインFrC-ペプチド設計体を使用するガン胎児抗原(CEA)からの候補ペプチドに対するCTL応答の抑制が、圧倒されることを示す図である。(a)C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するFrCの第1ドメインをエンコードしているDNA(p.DOM-CEA526-533)、(b)FrCの第1ドメインのみをエンコードしているDNA(p.DOM)、(c、d)C末端で融合したEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有する完全長FrCをエンコードしているDNA(p.FrC-CEA526-533)を用いた予防接種を行った。14日目に、CEA526-533ペプチド(▲)またはペプチド1(■)のいずれかを装入した標的EL4細胞を使用して、51Cr放出アッセイによってCTL活性を測定する前に、in vitroで6日間CEA526-533(aからc)またはペプチド1(d)を用いて脾細胞を再刺激した。
【図１５】 2つのドメインFrC-ペプチド設計体およびp.DOM-ペプチド設計体の、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞を誘導する能力を比較する図である。(a)C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するFrCの第1ドメインをエンコードしているDNA(p.DOM-CEA526-533)、(b)FrCの第1ドメインのみをエンコードしているDNA(p.DOM)、(cおよびd)C末端で融合したEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有する完全長FrCをエンコードしているDNA(p.FrC-CEA526-533)を用いた予防接種を行った。14日目に、FACS分析の前に、in vitroで6日間CEA526-533(aからc)またはペプチド1(d)を用いて脾細胞を再刺激した。細胞内IFNγを含むCD8+T細胞のパーセンテージを示す。構築体の相対的な効率は、51Cr放出アッセイと平行した(図14)。
【発明の属する技術分野】
本発明は、個体の免疫応答の誘導に関連する物質および方法に関する。本発明は、特に病原性ペプチド抗原に対して細胞障害性T細胞(CTL)を産生させるためのアジュバントとして、フラグメントC(FrC)ドメインを含むDNAワクチンに関するものであるが、このDNAワクチンだけに限るものではない。
【０００２】
【従来の技術】
非細胞性ワクチンは、生物全体に基づくワクチンよりも当然ながら安全であるが、完全に効果のあるワクチンは、微生物の1つの単離成分からは通常は作成することはできず、これは、免疫応答を開始するには、2つ以上の細胞タイプを活性化する必要があるからであることが現在明らかになっている。この洞察の一結果が、コンジュゲート・ワクチン(conjugate vaccine)の開発である。
【０００３】
しかしながら、コンジュゲート・ワクチンでさえも、通常はそれ自体が強く免疫原性であるわけではない。その大部分は、アジュバント:抗原の免疫原性を高める物質の添加を必要とする。すべてではないとしても、大部分のアジュバントは、抗原提示細胞(APC)に作用し、免疫応答を開始させる際のこれらの細胞の重要性を反映すると考えられている。たとえば、H.インフルエンザ多糖類は破傷風トキソイドに複合化された。なぜなら幼児はこのタンパク質を日常的に予防接種され、そのT細胞は既にそれに対して初回抗原刺激を受けているからである。
【０００４】
破傷風毒素は詳細に研究されている。たとえば、Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997を参照のこと。輸送メカニズムは、その毒素によって中枢神経系中の細胞毒の標的に送達するために、利用される。破傷風毒素の受容体結合サブユニットは、この送達プロセスにおいて主な役割を果たす。この受容体結合サブユニットはHCとして知られており、破傷風毒素の重鎖のC末端部からの、50,000Mrフラグメント(fragment)から構成される。歴史的に50,000Mrフラグメントは、フラグメントC(FrC)と名付けられている。単離されたFrcは、完全な破傷風毒素の運搬と同じ方法で、CNSに運ばれる可能性がある。
【０００５】
破傷風トキソイドは、ペプチドに対する免疫応答を誘導するための担体タンパク質として使用されている(Herrington他、1992、J.Immunol.149:717)。破傷風トキソイドに対する免疫応答、ヒトCD4+T細胞によって認識されるエピトープ(Valmori他、1992、J.Immunol.149:717)、および加えられるペプチドに対する免疫性を高めることに関するメカニズム(Panina-Bordignon他、1989、Eur.J.Immunol.19:2237;Kumar、1992、J.Immunol.148:1499)に関する、利用可能な多大な情報が存在する。破傷風毒素の重鎖の50kDのカルボキシ末端部分である、フラグメントC(FrC)は、主に抗体によって仲介される、破傷風毒素に対する防御免疫を誘導することが分かっている(Anderson他、1996、Infect.and Immunn.64:3168)。
【０００６】
本発明の共同発明者らと共に発表した以前の研究(King,C.A.他、Nature Medicine、1998、Vol.4、p.1281)には、哺乳動物中の悪性B細胞上に存在する病原性抗原に対する免疫応答を哺乳動物中において誘導するための、核酸構築体の使用および生成が記載されている。DNA構築体は、腫瘍抗原および破傷風毒素フラグメントC(FrC)を含む融合タンパク質の発現を指示する。したがって、所与の抗原に対する免疫応答は、FrCそのものの存在によって高めることができることが既に示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
(発明の概要)
破傷風毒素由来のフラグメントCのT細胞ヘルパー配列p30は、CD4+T細胞を活性化する能力を有しており、抗原に対する免疫応答の開始を助けるために構築体中で使用されてきた。しかしながら、DNAレベル、たとえばDNAワクチンでは、単離されたヘルパー配列は望むほど有効ではないことが分かっている。これはおそらく、単離されたヘルパー配列は、免疫系の初回抗原刺激にはあるいはそれによる認識さえも充分なものではないためであろう。したがって本発明者らは、有効なDNAワクチンはヘルパー配列だけではなく、免疫系の初回抗原刺激をし得る配列も含まなければならないことを理解している。前述のように、完全なフラグメントCに連結した腫瘍抗原を含む有効なDNAワクチンは提供されている。しかしながら本発明者らは、病原性ペプチド抗原への免疫応答の誘導は、フラグメント全体ではなくフラグメントCのある成分を使用して、改良あるいは簡潔化することができることを、現在驚くべきことに発見している。
【０００８】
本発明者らは、ヘルパー配列(たとえばp30)を含む、FrCの第1ドメインをエンコードしている核酸配列を組み立て、細胞障害性T細胞(CTL)応答を誘導する能力を有するペプチドエンコード配列にそれを連結させた。本発明者らがベクターをマウスに注入すると、CTLの非常に迅速な誘導が見られた。ペプチドをその元来の周囲配列から加工しなければならない場合よりも、この誘導は相当速かった。実際、本発明者らは、(i)内因性腫瘍抗原に連結した完全長FrC(2ドメイン)を含むDNAワクチンと(ii)腫瘍抗原から取った特異的なCTLエピトープに連結したシングル・ドメインFrCフォーマットを比較した。後者のワクチン(ii)は、より高レベルのCTLを誘導した。これらのレベルは、2ドメインのワクチンと比較して、予防接種後55日後でも依然として高いままだった。
【０００９】
したがって本発明者らは、免疫性を誘導するためのあらゆる成分、すなわちヘルパー配列、プライミング・プロセスを開始させるFrCの第1ドメイン中の活性化配列を含むワクチンの設計体を最初に決定した。フラグメントCの第2ドメインは多くの細胞障害性T細胞モチーフを含み、融合タンパク質中に存在する病原性抗原中に存在するモチーフと、これらのモチーフとが競合する可能性もあると本発明者らは考えている。これらのモチーフが不在であると、DNAワクチンは免疫の誘導において改善された効率を有する。
【００１０】
したがって広く考えると、本発明は、融合ポリペプチドをエンコードしており病原性抗原も含む核酸構築体中において、FrCの第1ドメインをエンコードしているが、FrCの第2ドメインの1つまたは複数のT細胞エピトープをエンコードしている核酸配列が欠けている、核酸を使用するための概念に属する。第2ドメインが欠けることによって、融合ポリペプチドが病原性抗原に対するT細胞応答を誘導する能力が向上する。しかしながら核酸は、第2ドメイン全体をエンコードしている配列を欠いている必要は必ずしもない。たとえば、融合ポリペプチドがT細胞応答を誘導する能力に悪影響を与えることなく、第2ドメインのいくらかの部分が存在する可能性があることが企図される。本明細書で同定するペプチド1および/またはペプチド2をエンコードする核酸は、少なくとも不在であることが好ましい。他のT細胞エピトープが天然に存在する第2ドメイン中に存在する可能性があるので、第2ドメインのわずかな非実質的部分が核酸によってエンコードされていることがより好ましい。非実質的部分は、天然に存在するフラグメントCの第2ドメインの、50%未満、40%未満、30%未満、25%、20%、15%、10%または5%未満のアミノ酸を含んでいてよい。
【００１１】
以下ではイディオタイプ抗原についてしばしば述べるが、本発明はこのような抗原に限られるわけではなく、任意の適切な病原性抗原、特に腫瘍抗原(CEAのフラグメントなど)、しばしばT細胞誘導用の小さな抗原を使用することができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
したがってより具体的には、本発明の第1の態様では、病原性ペプチド抗原に対する患者の免疫応答を誘導するために、in vivoで生きている細胞中に送達するための核酸構築体を提供し、この構築体は融合タンパク質の発現を指示し、前記融合タンパク質は病原性ペプチド/ポリペプチド抗原およびFrCの第1ドメインを含む。
【００１３】
FrCフラグメントの第1ドメインは、ヘルパー配列(特にp30)を含む。そのFrCドメインは、免疫系を助け、増強し、あるいは初回抗原刺激し、CTLを誘導することによって、免疫系を病原性抗原に応答させることのできるアジュバントとして作用する。本明細書で使用するように、「第1ドメイン」とは、天然に存在する完全なFrCの第1ドメインのことであることが好ましい。しかしながら、融合タンパク質がT細胞応答を誘導する能力に大幅に影響を与えることなく、微量の配列変異体を導入することができ、このような変異体を含むFrCの第1ドメインを有する融合タンパク質も、本発明の範囲中に含まれることが企図される。本発明の核酸によってエンコードされているFrCの第1ドメインは、天然に存在するFrCの第1ドメインと、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のアミノ酸配列同一性(デフォルト・パラメータを使用する、Altschul他のNucleic Acid Res.25:3389-3402(1997)のNCBI-BLAST2アルゴリズムによって決定される同一性)を有することが好ましい。FrCの第1ドメインは、p30ヘルパー配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【００１４】
シングル・ドメインFrCワクチン・フォーマットは、選択した抗原をエンコードするDNAがFrCの1つのドメインの3'末端(結果として生じるタンパク質のカルボキシ端)に融合されるとき、2ドメイン・フォーマットと比べてより多数のCTLを誘導することができると、本発明者らは最初は仮定していた。しかしながら、いくつかの実験に従って、抗原/エピトープがワクチンの他端、FrCドメインの開始点(DNAの5'末端、または結果として生じるタンパク質のアミノ末端)に連結する場合、強烈なCTL応答が観察されることも、本発明者らは現在決定している。したがってこれによって、抗原/エピトープを結合させるために、FrCドメインのいずれかの端または両端を使用する可能性が高まる。
【００１５】
Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997に記載されるように、FrCは2つの主要なドメインを有する。この2つのドメインは、連結アミノ酸配列によってFrC内で本来的に分離されている。この連結アミノ酸配列がDNAレベルで切断される場合、選択したペプチド(たとえば、腫瘍または病原体の抗原)をエンコードするDNA配列は、ヘルパー配列(たとえばp30)およびプライミング配列を含む第1ドメインのC末端またはN末端のいずれかに加えることができることを、本発明者らは発見している。この2つのドメインはUmland他に同定されており、図1中に再度示す。p30ヘルパー配列は、アミノ酸位置947-967において発見することができる。
【００１６】
病原性ペプチド抗原は、その疾患に特徴的な1つのまたは複数のエピトープを含む、任意のペプチド配列であってよい。たとえばペプチドは、特定の感染症、病原体またはガン(腫瘍抗原)に特徴的なエピトープを含んでよい。「ペプチド」という語は、いずれか特定のサイズの制限を意味するわけではなく、MUC-1およびgp70などの、アミノ酸が少なくとも数百個までの大きなポリペプチドおよびタンパク質を含んでよい。しかしながらペプチドは、5〜40個の間のアミノ酸、より好ましくは5〜30個の間の、さらに好ましくは7〜25個の間のアミノ酸(7〜10個の間のアミノ酸が望ましい)、さらに好ましくは8〜25個の間のアミノ酸を有することが好ましい。多くの癌ペプチドが知られており、発表されている。MAGEなどのメラノーマ、およびチロシナーゼ抗原、またはRasなどの変異プロトオンコジーンからの候補がある。これらの配列はいずれも発表されており、これらの配列を得て、それらを本発明のFrCドメイン含有ベクター中に配置することは、充分に当業者の能力内のことであろう。CTLによって標的にされる可能性がある、いくつかの候補腫瘍配列を記載している1つの有用な概説は、Henderson R.A.およびFinn O.J.(1996)「Human tumor antigens are ready to fly」Adv.in Immunology 62:217である。
【００１７】
ペプチドはイディオタイプ決定基であってもよく、これは悪性B細胞の表面上で決定基がとっているのとほぼ同じ形状で融合タンパク質中に存在することが好ましく、これによって融合タンパク質によって誘導される抗イディオタイプ免疫応答の効率が最適化される。イディオタイプ決定基に関しては、免疫グロブリン(Ig)分子、または単鎖Fv(scFv)フラグメントなどの免疫グロブリン様分子の一部の範囲内で、イディオタイプ決定基を発現させることによって、免疫応答の効率の最適化を行うことができる。scFvフラグメントは非常に便利であり、外性アミノ酸残基を殆どもたないイディオタイプ決定基の必要な構造的特徴を提供する。しかしながら、望むならば、追加のアミノ酸残基を融合タンパク質中、1つまたは複数の定常ドメインなどに加えることができる(たとえば、Syrengelas他、1996、Nature Medicine 2、1038)。したがって、たとえば、免疫グロブリン分子全体において、イディオタイプ決定基を発現させることができると思われる。
【００１８】
好ましい実施形態では、融合タンパク質を小胞体に向けるリーダー配列(ヒト細胞中で認識される)と共に融合タンパク質が発現され、そこでリーダー配列は融合タンパク質から切断される。このようにして、細胞から離れる前に、融合タンパク質が適切に折りたたまれる。融合タンパク質が適切に折りたたまれることは重要である。なぜならこのことによって、問題の疾患に特徴的なエピトープが免疫系に対して適切に提示されることが保証されるからである。たとえばヒトV遺伝子の5'端で見られるリーダー配列(以下に記載するVHlのリーダー配列など)を含めて、多数の適切なリーダー配列が知られている。本発明者らによって、このようなリーダー配列が、融合タンパク質の免疫原性を高めることが分かっている。原則として任意の他のリーダー配列が、均等な有利な効果を発揮する可能性があるが、元来の免疫グロブリンタイプのリーダー配列に最も類似するリーダー配列がおそらく最適であろう。
【００１９】
便宜上、核酸構築体はいくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。詳細には、構築体が病原性CTLエピトープ配列の上流に連結したFrCドメインを用いて設計される場合、1つまたは複数のこのような認識部位を、FrCの第1ドメインをエンコードしている配列の5'に置くことができ(おそらく任意選択のリーダー配列とFrCドメインをエンコードしている配列の間に)、1つまたは複数の部位を、病原性抗原をエンコードしている配列の3'に置くことができる。このようにして、異なる融合タンパク質を発現するように同様の基本構築体を容易に適合させることができ、病原性抗原が変わってもよい。したがって、異なる患者からのイディオタイプ決定基などの病原性抗原をエンコードしている配列は、容易に構築体中に導入することができる。
【００２０】
病原性抗原(特に小さな抗原)とFrCドメインを結合させるための代替法を、以下に記載する図3、パート3中に示す。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明はワクチン核酸を提供し、この核酸を使用して、イディオタイプ・マーカーを示す形質転換されたヒトリンパ球に対する免疫応答を誘導することができ、この核酸は悪性ヒトB細胞またはT細胞の表面上に示される抗イディオタイプ抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むタンパク質をエンコードしている。
【００２２】
第2の態様では本発明は、患者の免疫応答を誘導するための核酸構築体を作成する方法を提供し、この方法は以下のことを含む。
(a)前記疾患に特徴的なエピトープを含む病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列を同定すること、
(b)病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列をクローン化すること、および
(c)破傷風毒素からのFrCの第1ドメインを有する融合タンパク質として病原性ペプチド抗原を発現させることができるベクターに、クローン化した核酸を導入すること。
【００２３】
FrCの第1ドメインを含むベクターは、融合タンパク質、たとえばFrCドメインの5'と結合させるためのリーダー配列も、好都合には含むことができる。本発明の方法の一部としてベクターを調製することができるか、あるいはベクターを事前に生成させ、望ましい病原性ペプチド抗原を取り込む準備をさせることができる。このようにして、PCR技法中に病原性抗原をエンコードしている核酸をベクター内に導入することができる、核酸プライマーを設計することができる。このことは、詳細な説明中に記載する。FrCの第1ドメインおよびリーダー配列を含むベクターは、本発明の他の態様を形成し、キットの一部としてこれを提供することができる。病原性抗原をエンコードしている核酸をベクター内に容易に挿入することができるように、ベクターは制限部位を含むことが好ましい。他の代替的な例では、リーダー配列、FrCドメイン、および病原性抗原をエンコードしている核酸を作製し(たとえばPCRによって)、1つの融合体として(適切な制限部位を使用して)適切な調節領域を含むベクター内に挿入することができる。
【００２４】
前述のように病原性抗原は、特定の疾患に特徴的なエピトープ、たとえば腫瘍抗原、病原体およびイディオタイプ決定基を含む任意のペプチドであってよい。便宜のために、以下のテキストでは、病原性抗原がイディオタイプ決定基である場合を記載する。しかしながら当業者は、この教示を他の病原性抗原の使用に適合させる際に苦労することはないであろうし、本発明はイディオタイプ決定基の使用に限られない。
【００２５】
したがって、たとえばイディオタイプ決定基をエンコードしている核酸は、PCRによって患者の細胞を含むサンプルからクローン化することができる。ほぼあらゆるB細胞のイディオタイプ決定基をエンコードしている核酸配列を回収することができる、適切で一般的なPCRプライマーの大きなファミリーが、現在利用可能である(Hawkins and Winter、1992、Eur.J.Immunol.22、876)。悪性B細胞は、典型的にはリンパ腫である。一般に、前に定義した方法によって作成される核酸構築体は、本発明の第1の態様に従うものである。
【００２６】
第1ドメインおよび第2ドメインは、連結アミノ酸配列によってFrC中で本来的に分離されている。この連結アミノ酸配列はDNAレベルで切断することができ、その結果病原性抗原を含むペプチドをエンコードしている核酸配列を、第1ドメインのC末端に連結させることができ、第2ドメインは捨てられる。病原性抗原はDNAレベルで加えられ、FrCの第1ドメインのC末端またはN末端のいずれかに効率よく連結される。このようにして形成された核酸構築体は、次いでDNAベクター中に置かれる。ベクターのバックボーンは、遺伝子発現を指示するための適切な調節配列を含む細菌性DNAであることが好ましい。したがって、当業者に知られる標準的なPCRおよび連結ステップを使用して、DNA構築体をベクター内に導入することができる。次いでDNAベクターを、たとえば筋肉細胞を介して患者に注射することができる。このDNAが筋肉細胞に入り、FrCの第1ドメインおよび病原性抗原を含む融合タンパク質をエンコードしている核酸構築体が、そこで読み取られる。転写および翻訳に次いで、融合タンパク質が発現される。タンパク質はその環境には外来性のものであるとみなされるので、したがってそれは免疫系に提示される。ベクターの細菌性DNAバックボーン中の「免疫刺激配列」の存在によって、免疫の活性化がアシストされる。したがってこの結果、エンコードされているタンパク質が宿主の免疫細胞に提示される。
【００２７】
第3の態様では本発明は、疾患に苦しむ患者を治療するための方法を提供し、この方法は疾患に対する免疫応答を誘導するために、前に定義した本発明の第1の態様である核酸構築体を患者に投与することを含む。さらに本発明は、感染症またはガンなどの疾患を治療するための薬剤の調製における、本発明の第1の態様である核酸構築体の使用を提供する。
【００２８】
イディオタイプ決定基の場合、イディオタイプ決定基をエンコードしている核酸配列は、それが送達される個体から得られるサンプルからクローン化されることが好ましい。核酸配列は、包まれていない形で(すなわち、ウイルス粒子または他のパッケージ中で囲まれていない)送達されるのが好都合である。しかしながら核酸は、パッケージまたは粒子(たとえば、リポソームまたはウイルス粒子)の外側表面と結合してもよく、これによって核酸の受容体仲介型の送達の可能性が与えられる。
【００２９】
融合タンパク質は、病原性抗原およびFrCの第1ドメイン単独の発現を指示することができる。あるいは融合タンパク質は、他の外来性免疫原タンパク質またはサイトカインなどの、他の免疫調節ポリペプチド配列をさらに含んでよい。融合タンパク質の免疫原性が高い部分に対する免疫応答は、比較的弱い免疫原病原性抗原に対するいかなる応答をも最終的には圧倒する可能性があるという理論上の問題を防ぐのを、いくつかの抗原性融合体パートナーを使用して助けることは実際有益であろう(ただし、シングル・ドメインFrC-抗原融合体フォーマットは、これを軽減させるように設計されている)。エンベロープを有するウイルスおよび免疫原細胞表面のコート・タンパク質、あるいは任意の病原性生物またはヒト以外の種から誘導される分泌タンパク質は、融合タンパク質中に封入するのに適しているであろう。代わりの一改変法は、病原性抗原/FrC第1ドメインを有する融合体ではなく、別々の存在として、他の免疫調節ポリペプチドの同時発現が可能なように核酸構築体を設計することである。本発明の方法を別の核酸構築体の使用に用いて、他の免疫調節ポリペプチドを発現させることはあまり好ましくない。
【００３０】
いくつかのサイトカインは、抗原提示の態様を改善することが知られており、サイトカイン遺伝子を含む発現ベクターの直接的な送達によってワクチン効率が高まる可能性がある。インターフェロンγは、MHC発現をアップレギュレート(upregulate)する性質のために、有用であろう1例である(Gaczynska他、1993、Nature 365、264-267)。ワクチン核酸によって発現される可能性がある他のポリペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。関連遺伝子が、同じベクターまたは別のベクター上にエンコードされている可能性があり、ベクターおよび発現されるポリペプチドの量は、それぞれ独立に変わる。
【００３１】
予防接種するための遺伝学的手法の1つの利点は、それによって抗原を提示する元来の方法を効率良く使用できる可能性があることであり、したがってこの利点は広範囲のエフェクター系にかかわるはずである。さらに、得られる応答性の操作および改善は比較的容易であるはずである。たとえば、同時刺激活性を有する分子および免疫原を発現させることによって、T細胞に抗原を提示する効率を改善することが可能であろう。同時刺激に関する1つの重要な分子はB7であり、この分子はT細胞によって発現されるCD28と相互作用し、これによってT細胞活性化に関するアクセサリ・シグナルが提供される(Galvin他、1992、J.Immunol.12、3802-3808)。B7とシングル・ドメイン・フラグメントC融合体の両方を発現する、ベクターを構築することができる。マウスおよびヒトB7の両方の配列が発表されており(Freeman他、1989、J.Immunol.8、2714-2722)、これらの遺伝子はPCRによって容易にクローン化することができる。
【００３２】
したがって、本発明の方法が、病原性抗原に対する免疫応答をさらに調節するために、他の免疫調節ポリペプチドの発現を指示する第2の核酸配列を個体に送達することをさらに含むことは、本発明の任意選択の特徴である。この第2の核酸配列は第1の核酸配列と同じ核酸分子上に含まれてよく、あるいは第2の核酸分子上に存在してもよい。
【００３３】
核酸構築体をin vivoで生きている細胞中に導入するための方法は、現在当業者によく知られている。裸のDNAとして、食塩水溶液などの生理学的に許容される希釈剤との混合物として、核酸を患者に(典型的には筋肉内に)シンプルに注射することが好都合である。いくつかの適切な方法、および核酸構築体の患者への投与の好ましい実施形態の詳細は、米国特許第5,580,859号および第5,589,466号に記載されている。遺伝子の輸送により関係がある方法には、ウイルス・ベクターを使用すること、DNAをリポソーム中に包み込ませること、カチオン・リポソームまたはウイルスの外側にDNAを結合させることがある(Miller、1992、Nature 357、45-46を参照のこと)。これらの方法には、輸送の効率を高めるという利点があるが、精製したプラスミドDNAを直接的に注射することと比べると、これらの代替的な手法は幾分複雑であり、安全上の問題を提起する。
【００３４】
したがって第4の態様では、本発明は、疾患に苦しむ患者の免疫応答を誘導する方法(前に定義した本発明の第3の態様)において使用するための組成物を提供し、この組成物は融合タンパク質の発現を指示する核酸構築体を含み、前記融合タンパク質は前記疾患に特徴的なエピトープを含む病原性抗原、および破傷風毒素からのFrCのヘルパー配列(好ましくはp30ヘルパー配列)、および生理学的に許容される希釈剤または担体を含む。FrCドメインのヘルパー配列は、融合タンパク質が問題の病原性抗原と連結したFrCの第1ドメインを含むように、FrCの第1ドメイン中に含まれることが好ましい。実際、FrCの第1ドメイン(p30ヘルパー配列を含む)は、病原性抗原と融合すると、p30ヘルパー配列単独よりも、T細胞応答(特に細胞障害性T細胞)を生み出すことにおいてより一層効果的であることが分かっている。
【００３５】
理想的にはワクチンは、抗原特異的B細胞、細胞障害性T細胞(CTL)およびヘルパーT細胞を刺激することができるべきである。B細胞の刺激には、標的抗原が特異的抗原受容体(表面Ig)と、B細胞表面上において充分に高い親和性で結合することが必要である。いくつかの多価抗原はB細胞の増殖を直接刺激することができるが、有効な既往性応答を提供するために、ヘルパーT細胞によって提供される追加的なシグナルが必要とされることがより多い(以下参照)。本発明では、好ましくは第1ドメイン内に破傷風毒素からのFrCを含むヘルパー配列を有する融合タンパク質として、病原性抗原を発現させることによって、T細胞の助けを回復させる。
【００３６】
CTLのT細胞受容体(TCR)は、標的細胞表面上に示される特異的なMHCクラスI結合型ペプチドを認識する。一般にこのようなペプチドは、標的細胞中で産生されるより大きなポリペプチドまたはタンパク質を加工することによって誘導される。したがって、効率の良いCTL刺激のためには、CTLを活性化することができるMHCクラスI発現型細胞の細胞中で、標的抗原が合成または加工されなければならない。発現のレベルは、正常では(おそらく高い親和性で)MHCペプチドの結合溝において結合される自己ペプチドに取って代わるほど、充分なペプチドを生成するのに充分に高くなければならない(Ohno、1992、PNAS 89、4643-4647)。抗原特異的B細胞と同様に、増殖および細胞障害能力の向上のためには、CTLは抗原認識後の追加的なシグナル(サイトカインの形)を必要とし、これらはヘルパーT細胞によって提供される。
【００３７】
CD4-ポジティブ(positive)ヘルパーT細胞は、(その独特のTCRを介して)特異的細胞表面MHCクラスII結合型ペプチドと相互作用し、一般にこのようなペプチドは、特化した抗原提示細胞(APC)によって内面化されたタンパク質抗原の、タンパク質分解切断によって誘導される。マクロファージ、樹状細胞およびBリンパ球は、このようにして抗原を提示することができる細胞である。したがってBリンパ球は、その表面Igに結合した抗原を内面化および加工し、その後MHCクラスII結合型誘導体ペプチドを提示する(Bリンパ球はクラスIを提示することもできる)。したがって表面ペプチドを認識するCD4-ポジティブ・ヘルパーT細胞は、さまざまな免疫刺激性サイトカインを放出し、B細胞の活性化、増殖および抗体産生をさらに刺激することができる。同様に、局所的な炎症反応の部位に存在にするマクロファージは、食作用を受けた抗原を加工し、Tヘルパー細胞によるサイトカイン放出を刺激することができ、局所的に存在するCTLのさらなる活性化、増殖および細胞毒性をもたらす。
【００３８】
したがって、ワクチン抗原は理想的には、1)MHCクラスIポジティブ宿主細胞によって細胞内で合成され、2)宿主細胞クラスI MHCによって示されると、そのTCRを介して宿主CTLのサブセットを刺激することができるペプチドを生じさせ、3)宿主細胞クラスII MHCによって示されると、そのTCRを介して宿主ヘルパーT細胞のサブセットを刺激することができるペプチドを生じさせ、4)マクロファージと抗原特異的B細胞の両方を含む宿主APCによって内面化および加工され、5)宿主Bリンパ球と相互作用するために、その元の形で利用可能であるべきである。
【００３９】
ここで本発明の態様および実施形態を、たとえば添付の図面を参照することによって例示する。当業者には、他の態様および実施形態が明らかであろう。本明細書中に挙げる書物はすべて、参照によって本明細書に組み込んである。
【００４０】
表１は、本発明の基本を成す実験作業において使用される、DNAワクチンを構築するために使用する、PCRプライマー配列を示す表である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
ガンに対する免疫を活性化するための戦略は、現在集中的に調査されている。DNAの予防接種によって、腫瘍細胞の遺伝的変化の同定と試験用ワクチンの作製の間に比較的シンプルなルートが与えられる。しかしながら、エンコードされたタンパク質が抗原提示の機構にアクセスして、有効な免疫を活性化させる方法は、いまだに完全に明らかではない。注射を受けた筋肉細胞は、T細胞(1、2)に対して直接抗原を提示することはないようであるが、間接的提示のための抗原の貯蔵体として働きそうである(2)。抗原提示細胞(APC)の直接的なトランスフェクションが筋肉部位から起こる可能性があるが(3)、ただし非常に低レベルである(4、5)。腫瘍細胞を攻撃する際にどのエフェクター経路が最も効率が良いかという問題も存在し、これは発現される抗原の性質に明らかに依存する。
【００４２】
本発明に先立って、可変部の遺伝子VHおよびVLによってエンコードされている、クロノタイプIgのイディオタイプ(Id)決定基を標的抗原として使用して、B細胞の悪性を治療するためのDNAワクチンが開発された(6、7)。リンパ腫については、腫瘍細胞を殺傷する際に抗Id抗体が有効であり(6、8、9)、したがって、抗体を誘導するためにDNAワクチンが設計された。当初は、VHおよびVL遺伝子を含むワクチンが作製された。なぜなら単鎖FV(10)のみでは、マウス・モデル(11)において抗Idを誘導する際に効率が悪いことが分かっていたからである。破傷風毒素のフラグメントC(FrC)をエンコードする遺伝子を、scFV配列に融合させることによって、リンパ腫のチャレンジ(12、13)に対して保護しながら、抗体産生を強く促進する結果となった。現在この設計体が、濾胞性リンパ腫のグレードが低い患者の、パイロット臨床試験において試験されている。免疫応答をId抗原に関与させるために、異種タンパク質(14)またはケモカイン(15)などの追加のタンパク質をエンコードする遺伝子を融合させることに関する必要性が、一般的に見出されている。本発明の場合、融合が絶対的な要件であり、分離プラスミドに促進効果がないという事実によって、FrC特異的T細胞を提供して、B細胞が抗Id(12)を分泌するのを助けることができるという概念が支持された。しかしながら興味深いことに、同じscFV-FrC設計体は、Ig分泌、表面Ig-ネガティブ骨髄腫モデルに対する防御免疫を誘導することができ、これがおそらくはCD4+サブセット(16)である、エフェクターT細胞(13)によって仲介されることは明らかであった。
【００４３】
この設計体は表面または分泌される標的抗原に適している可能性はあるが、多くの候補腫瘍抗原は細胞内性のものであり、MHCクラスI分子と結合したペプチドとしてのみ提示されるはずである(17に概説)。したがって問題は、FrC配列との融合が必要であるのかどうか、あるいはこれが候補となる腫瘍由来のペプチドに対するCTL仲介型免疫を誘導するのに有用であるのかどうかということである。DNAワクチンとして送達されるとき、FrCそのものがCTL応答を誘導することができるということを、本発明者らは既に発見しており、H2-Kb-制限ペプチドのモチーフをFrC配列中の位置1287-94において同定した(13、18)。CD8+T細胞がただ1個または数個のペプチドのモチーフに焦点を合わせる、免疫優性の現象は、ウイルス感染に対する応答において明白である(19)。実際、CD8+T細胞応答の主な特徴として、免疫優性化が記載されている(20に概説)。このことがDNAワクチンに当てはまる場合、FrC配列と腫瘍ペプチド配列を競合させる可能性がある融合について議論されるであろう。
【００４４】
FrCは2つのドメイン、ゼリー・ロールN末端ドメインおよび第2のβ-トレフォイル・ドメイン(21)から構成される。第1ドメインは充分に記載「共通の」ヘルパー・エピトープ、p30(22、23)を含み、これは一定範囲のマウスおよびヒトMHCクラスII対立遺伝子に結合し、CD4+T細胞(24)によって認識される。本発明者らは以前に、第2ドメイン中のCD8+T細胞の誘導に関するエピトープを同定した(18)。本発明者らは、このドメイン中でCD8+T細胞応答を誘導するための同様の能力を有する、他のエピトープを同定した。現在、本発明者らは、DNAを介して提示される候補エピトープに対するCTL応答の誘導にとって重要である可能性がある、2つの要因を調査している。第1の要因はDNA配列中のペプチド・エピトープの位置であり、第2の要因は、CTL活性を促進させる際のヘルパー・エピトープを含むドメインの役割である。
【００４５】
ガン細胞を攻撃することについての、誘導されたCTLの関連性を試験するために、本発明者らは完全長のFrCをEL-4細胞にトランスフェクトし、この場合加工されたペプチドは代理の標的抗原として作用することができる。ガンにより近づけるために、ガン胎児抗原からの公知のエピトープを取り込ませた類似の設計のワクチンが、高レベルの特異的CTLを誘導することも、本発明者らは実証した。このモデルを使用して、アジュバントFrC配列からの、競合する可能性があるエピトープを除去するための必要性を確認した。
【００４６】
(結果)
ΔFrCの生成
FrCの第1ドメインをエンコードしている第1の部分、および細胞障害性T細胞応答を誘導することが知られているペプチドをエンコードしている第2の部分を含む、核酸配列を組み立てた。この具体例では、FrCの第2ドメイン内にペプチドが含まれる。しかしながら、これは細胞障害性T細胞モチーフを含むペプチドの例示的なものである。
【００４７】
核酸構築体の組み立ては、pcDNA3(Invitrogen7)などのプラスミド・バックボーンを使用して図3に概略するように行う(図3)。簡潔には、出発プラスミドはFrC全体とリーダー配列を含む(FrC+L)。5'リーダー配列は腫瘍から誘導される(BCL1)。この出発プラスミドをp FrC+Lと呼ぶ。
【００４８】
次いでプライマーを使用して、図3のパート2に示すようにFrCの第1ドメイン(ΔFrC)を単離する。次いでPCR産物を清掃、消化して、たとえばプライマーから導入された望ましくない核酸配列を除去し、HindIIIおよびNotI部位を使用してpcDNA3に再びクローン化する。したがって結果として生じるプラスミドは、リーダー配列(BCL1)にのみ融合したFrCの第1ドメイン、およびこのFrCの第1ドメインの端に加えられたストップ・コドンを含む。
【００４９】
ΔFrCおよびペプチド抗原の生成
病原性抗原をプラスミド中に導入するために、問題の病原性抗原もコードしているΔFrCの3'端の逆方向プライマーを使用して、この配列をΔFrC配列に加える。図3のパート3に、これを図式的に示す。
【００５０】
より長いペプチド配列上に含まれる病原性抗原については、重複プライマーを使用するPCR Soeing技法を使用する。
【００５１】
図2および4から6は、この種のベクターの例であるベクターpcDNA3およびpVAC1の詳細を示すものであり、これらを本発明に従って使用して核酸構築体を保有することができる。RSVLTRをサイトメガロウイルスからのプロモーター配列(pCMV)で置き換えることが好ましいことを、本発明者らは発見している。
【００５２】
FrC中のCTL誘導MHCクラスI結合モチーフの同定
FrCのアミノ酸配列を、ペプチド8量体モチーフおよびH2-KbまたはH2-Db(31)に結合する可能性について調べた。この配列を含む分子の解離の推定半減期に基づいてスコアを割り当てるためのアルゴリズムを使用して(31)、H2-Kbへの結合に関して13を超える値を有する8個のペプチドを同定し、合成した。トップ20の予想した結合配列は、86.4から1.32の範囲の値を与えた。知られている免疫優性Kb-制限CTLエピトープは、132(RGYVYQGL)と17(SIINFEKL)の間のスコアである。Kb-結合センダイウイルス核タンパク質由来の配列FAGNYPAL(SEV)はスコア60であり、一方コントロール、Db-制限エピトープ(ASNENMDAM)は、スコア1であった。唯一のH2-Db結合候補を含めた、8未満のスコアであったFrC配列をさらに調べることはしなかった。
【００５３】
次いでマウスに、完全長FrC(p.FrC)をエンコードしている遺伝子を含むDNAワクチンを予防接種した。1回の予防接種の14日後、in vitroで1回再刺激した後にペプチド装入EL4細胞に対するCTL応答を、8個のペプチドのうちの2個を使用して、検出することができた(図8a)。他の注射、または追加的なin vitroでの再刺激は、残りの6個の候補ペプチドに対するCTL応答を誘導するのに失敗した。本発明者らがペプチド1およびペプチド2と名付けた、2つのポジティブ・ペプチドはFrCの第2ドメインから誘導され、1287-94および1162-69にそれぞれ位置していた。
【００５４】
残りのペプチドは、検出可能ないかなるCTL活性も刺激することができなかった。興味深いことに、2つの免疫刺激ペプチドのうち、ペプチド1(SNWYFNHL)が最も低いスコア(13.2)であり、ペプチド2(LNIYYRRL)は26.4のスコアで3番目にランクされた。in vitroでの結合アッセイでは、ペプチド1およびペプチド2の両方が、H2-Kbに充分等しく結合することができ、大幅には異ならずにポジティブ・コントロールのペプチドSEVに結合することができた(図8b)。したがって予想アルゴリズムは、両方の免疫刺激配列の同定においては成功したが、以前に述べたように(32)、予想した結合とクラスIに結合しCTL応答を刺激する実際の能力の間には、それほど相関関係がない可能性がある。
【００５５】
第1ドメインのC末端にペプチド配列の位置を移すことの影響
完全長FrC配列を予防接種することによって、ペプチド1および2はCTL応答を誘導することができたが、この応答は比較的弱く、高レベルの51Cr放出を生み出すためには2回の再刺激が必要であった。腫瘍抗原は免疫原性が低い可能性もあるので、本発明者らはこれらのペプチドを、DNA送達を介して免疫原活性を増大させるためのモデルとして使用した。本発明者らは最初に、ペプチド配列をFrCバックボーンから除去し、第1ドメイン(p.DOM)のC末端にその配列の位置を移すことの影響を調べた。p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2を用いた1回の筋肉内注射によって、in vitroでの1回の刺激の後に検出可能な、迅速な高レベルのCTL応答が生まれた。元のp.FrCワクチンとの比較を図9に示し、多数の実験で同様の結果を得た。
【００５６】
細胞溶解活性は、CD8+T細胞群中で見られる細胞内IFNγのレベルと平行しており(図10aおよびb)、p.DOM-ペプチド・ワクチンはp.FrCワクチンと比べて、IFNγポジティブCD8+細胞のパーセンテージの2-3倍の増加を通常は誘導する。CTLは、リーダーレスp.FrCでトランスフェクトされたEL4細胞を溶かすこともでき(図11)、ペプチド1に特異的なものがより有効であった。これによって、ペプチド1によって誘導されるCTLは、ペプチド2によって誘導されるそれよりも標的トランスフェクタントを殺傷することができることが示される。この理由は現在明らかではないが、すべての候補ペプチドが標的として有用なわけではないことを意味する可能性がある。
【００５７】
ペプチド2に対するCTLについてはごく低レベルの特異的溶解が観察されたが、これらは繰り返しの実験で一貫していた。対照的に、エンプティ・ベクターでトランスフェクトされたEL4細胞に顕著な溶解は観察されなかった。ペプチドを標的細胞に加えることによって特異的溶解は明らかに増大し、トランスフェクタントは内因的経路によって、低レベルの両ペプチドのみを加工および提示できることが示された(図11)。しかしながら発現のレベルは、ペプチド1または2に特異的なエフェクターCTLが、in vivoでトランスフェクタントを攻撃するほど充分であった(以下参照)。
【００５８】
DNAワクチンを介したCTL誘導に対するドメイン1(p.DOM)の貢献
ドメイン1は、位置947-967に1つの同定された「共通の」ペプチドを含み、多数のMHCクラスII分子と結合するヒトT細胞(24)またはマウスT細胞(33)によって、これを認識することができる。このペプチドはT細胞の助け(34)を提供するためのp.DOMの重要な成分なので、本発明者らはCTL誘導におけるその役割を調べた。本発明者らは、それぞれのCTLペプチド配列に連結したp30配列のみを含むDNAワクチンの能力を、p.DOM-ペプチド・ワクチンのそれと比較した。図9は、p.p-30-ペプチド1はCTL応答をあまり誘導せず;p.p-30-ペプチド2はより有効であったが、p.DOM-ペプチド2よりも大幅に低く働き、実際は元のp.FrCワクチンよりも効果が低かったことを示す。細胞内IFNγを生成するCD8+T細胞の数を比較することによって、同じ傾向が示された(図10c)。p.p-30-ペプチド・ワクチンを用いた繰り返しの予防接種および再刺激によって、CTLを生成させることができる可能性があり(データは示さない)、これによって構築体の無欠性が確認されるが、良いパフォーマンスは示されない。結論はp.DOMが、結合したペプチドに対する効果的なCTL応答を誘導するのに必要な、追加的な配列情報を含むということである。
【００５９】
ペプチド予防接種を介したCTL誘導に対するp.DOMの貢献
次いで本発明者らは、DNA送達を介したCTL誘導に対するp.DOMのアジュバント効果が、合成ペプチドと共に投与されるとき、明らかであるかどうかを調べた。ペプチド1をp.DOMと混合させ、筋肉内に注射した。
【００６０】
しかしながら、0、21および42日目における3回の注射、および4回までの週に1度のin vitroでの再刺激の後でも、CTL活性は誘導されなかった(データは示さない)。同じ細胞への送達のために、あるいは第1ドメインの合成とペプチドの存在が一致することを保証するために、p.DOMがペプチド配列に融合することが必要であるようである。
【００６１】
保護
0日目および21日目のp.DOM-ペプチド1を用いた予防接種によって、28日目のEL4-FrCトランスフェクタントによるチャレンジに対する相当な保護がもたらされ(図12)、エンプティ・ベクター(pcDNA3)でトランスフェクトされたEL4細胞の成長に対する影響はなかった(データは示さない)。この比較的初期のチャレンジ(28日目)では、p.DOM-ペプチド1は完全長p.FrCプラスミドよりも優れており、CTLの迅速な誘導と一致した。しかしながら、p.FrCワクチンは14日目までに充分なCTLを生成して、1度の再刺激後in vitroでトランスフェクタントを殺傷することはできなかったが、おそらくは第2の注射によるCTLの広がりのために、いくらかの保護は明らかであった(図12)。CTLがin vitroでトランスフェクタントを殺傷し、チャレンジに対して保護することができたことは、第3のワクチン注射の後に2ドメインp.FrCによって誘導された可能性がある(データは示さない)。ペプチド1または2配列のいずれかに融合したp30ヘルパー・エピトープのみを含むプラスミドを用いた予防接種は、CTLを誘導する能力が低いことから予想されたように(データは示さない)、保護をもたらすには全く効果がなかった(図12)。消耗実験によって、CD8+T細胞が消耗したことにより、保護はすべて無くなったことが示された(データは示さない)。EL4細胞によるCD4の発現のために、CD4+T細胞を消耗させることはできなかった。これらの結果によって、位置を移したペプチド1によって誘導されるCTLは、腫瘍に対する保護に貢献していることが示される。
【００６２】
ガン胎児抗原からのペプチドに対してCTLを誘導するためのp.DOM-ペプチド設計体
p.DOM-ペプチド設計体が候補腫瘍結合抗原に対してCTLを誘導する能力を試験するために、ガン胎児抗原(CEA)から誘導したペプチドを選択した。ペプチドEAQNTTYLは、B6マウスに組み換えワクチニア・ウイルス(35)を予防接種することによって誘導されるCTLの標的として、作用することが知られている。エンコード配列を第1ドメインの3'端に配置して、p.DOM-CEAペプチド・ワクチンを作成した(図7)。これをマウスに注射し、in vitroで1度再刺激した後14日目にCTL活性を測定した。高レベルのCTL活性が誘導され(図13a)、IFNγ含有CD8+T細胞は〜20%であった(図13b)。コントロールp.DOMプラスミドのみが低レベルのCTL活性を生み出し、IFNγポジティブCD8+T細胞はわずか(2.4%)であった(図13b)。
【００６３】
エピトープ競合の実証
CEAモデルを使用して、FrCの第2ドメイン中のエピトープは結合した腫瘍由来のエピトープと競合するという仮説を調査した。CEAペプチド配列を2ドメイン(完全長)FrC配列のカルボキシル端に配置して、p.FrC-CEA526-533を生成させた(図7)。次いでこの構築体がCEA特異的CTLを誘導する能力を、1回の注射およびin vitroでの1度の再刺激を使用して、シングル・ドメインp.DOM-CEA526-533設計体のそれと比較した。繰り返しの実験において、シングル・ドメインのワクチンは、2ドメインFrCを含む構築体(p.FrC-CEA526-533)(図14c)と比較して、CEAエピトープ(図14a)に対して2-3倍高いレベルのCTL活性を誘導した。しかしながら2ドメイン構築体は、FrCペプチド1に対して高レベルのCTL活性を誘導することができた(図14d)。これによって、競合する可能性のあるエピトープをFrCの第2ドメイン中に含むことにより、CEA特異的CTL活性の誘導の抑制がもたらされることが強く示唆される。
【００６４】
CEAペプチドに対する細胞溶解活性は、CD8+T細胞群中で見られる細胞内IFNγのレベルと平行しており、p.DOM-CEA526-533ワクチンは2ドメイン・ワクチン(図15aおよび15c)と比べて、2-3倍高レベルのIFNγポジティブ細胞を誘導する。予想したように、高レベルのIFNγポジティブCD8+T細胞(図15d)によって、FrCの第2ドメインのペプチド1に対して高レベルのCTL活性が誘導されたことが反映された。コントロールp.DOMワクチンは著しいCTL活性(図14b)は生み出さず、IFNγポジティブCD8+T細胞(図15b)のレベルは非常に低かった。
【００６５】
これらの結果によって、CEAエピトープに対する応答の誘導においてFrCの第2ドメインを除去することの予想された利点が確認され、p.DOMペプチド設計体は腫瘍抗原に一般的に適用できる可能性があることが示唆される。
【００６６】
(考察)
ガンに対する首尾の良い予防接種には、CTLを含めた免疫の多数の経路を活性化することが必要であるようである。DNAワクチンはCTL応答の誘導においては効率がよいが(36)、腫瘍抗原は弱いことが多く(12)、親和性の高いCD8+T細胞の欠失が起こる可能性がある(37)。CTLを生成するために、候補ペプチドは、好ましくは応答に優先する可能性がある競合ペプチドの不在下で、APCによって効率よく加工および提示されなければならない(20に概説)。本発明者らは、破傷風毒素のFrC配列に対するCTL応答を調べた。これは第一に、アジュバント「外来」配列としてFrCを使用して、結合したscFV配列に対する免疫を活性化することに本発明者らが関心を持っていたからである(12)。
【００６７】
マウスB細胞のリンパ腫および骨髄腫に対してそれらのDNA scFV-FrCワクチンを使用することによって、抗体およびCD4+T細胞に関する、保護性抗Id免疫をそれぞれ促進する(13)。scFVに対するCTL応答は検出されず、これはおそらくV遺伝子中にMHCクラスI結合モチーフが欠けていたためであろう。しかしながら、FrCの第2ドメイン中の2つのペプチド・モチーフに対しては、CTLが誘導された(13、18)。応答は比較的弱かったが、これらは結合した腫瘍配列からのCTLモチーフと競合する可能性がある(38)。候補ペプチドに対してCTLを誘導することについての、FrC配列のアジュバント可能性を調べるために、本発明者らは第2ドメインを除去し、第1ドメインを残して、「共通の」ペプチドp30を介してT細胞の助けをもたらした(24、34)。
【００６８】
次いで、アジュバントとしての第1ドメイン(p.DOM)の作用を、捨てた第2ドメインからの2つのペプチド・モチーフを使用して試験した。p.DOMをC末端に位置を移すことによって、それぞれのペプチドに対するCTLの顕著な増大がもたらされた。以前に本発明者らは、リーダー配列が存在する場合、FrCに対するCTLがより効率よく誘導されることを発見しており(18)、したがって本発明者らは、ここに記載したすべての構築体にリーダー配列を含ませた。リーダー配列を含ませることによって、アミノ酸約60個より長い構築体はすべて、同時翻訳的にERに運ばれる。したがって、位置を移したことの効果は「C末端の原則」を反映している可能性があり、前駆体ペプチドのC末端またはER部位中のタンパク質から抗原性ペプチドが優先的に生成される(39)。このことは、正常ではER中に存在する、gp96またはカルレチクリンなどの熱ショック・タンパク質を介した、筋肉からAPCへのペプチドの間接的な移動とも関連がある可能性がある(40)。
【００６９】
第2の調査は、結合したペプチド配列に対してCTLを誘導することに対する、p.DOMの貢献を評価することであった。モデル系では、隣接I-Ab-制限ヘルパーペプチド配列に融合した、OVA(SIINFEKL)の免疫原Kb-制限エピトープをエンコードしているDNAワクチンは、CTLを誘導することができた(34)。ヘルパー・エピトープおよびCTLエピトープが唯一の要件かもしれないことが、これによって示される。この特定の場合では、この設計体は不充分であった。なぜなら、CTLエピトープのいずれかに融合した「共通の」ヘルパーペプチド配列をエンコードしている融合遺伝子は、低レベルのCTL活性しか生み出さなかったからである。このことは、OVAペプチドと比べて、FrC由来のペプチドが比較的弱いことによるものである可能性があるが、このことは腫瘍抗原に関する問題を示している可能性がある。他の可能性は、これらのDNAワクチンの免疫効能に対するリーダー配列の重要な貢献に関するものである。ERへの短い構築体の供給は、不十分なことがある。なぜならこれらの構築体は、より効率が悪く、したがってより効率の悪いプライミングが生じる、同時翻訳による運搬(41)というよりはむしろ翻訳後の運搬に依存するからである。それにもかかわらず、p.DOM中の追加的な配列が、より一層のT細胞の助けをもたらすか、あるいはこれが他のメカニズムによるペプチドの提示に貢献している可能性がある。1つの可能性は25KDのドメインが、ペプチドをシトソル中での分解から保護することによって、結合ペプチドのレベルを上げていることである。他の可能性は、ER中のいくつかの誤って折りたたまれたFrCドメインの存在が、クロス・プライミング用の熱ショック・タンパク質への結合ペプチドの装入に影響を与えている可能性があることである(42)。
【００７０】
p.DOM-ペプチド1はEL4-FrC腫瘍に対する迅速なCD8+T細胞仲介の防御免疫を活性化し、完全長FrC(p.FrC)を含むワクチンよりも効率がよいようであるという発見によって、ガン治療に関連する2つの特徴が示される。第1の特徴は、位置を移すことによって、ペプチド特異的CTLを誘導することを目的とするワクチンの有効性を増大させることができることである。選択するペプチドは腫瘍細胞によって提示もされなければならないことは明らかであるが、エフェクター細胞の認識に必要とされるレベルは低い可能性がある(20)。第2の特徴は、弱いペプチド抗原に対するDNAワクチンに必要とされる活性化シグナルを、p.DOMが提供することができることである。興味深いことに、候補HLA-A2-結合モチーフの6個のうちの4個も、FrCの第2ドメイン中にあり、初期の研究は、その配列中においても機能レベルが高いことを示している(観察は未発表)。知られているCEA由来のペプチド配列を使用する本発明者らのデータは、p.DOM-ペプチド設計体を他のガン抗原に適用することができることを示す。このモデルを使用して、FrCの第2ドメインを除去する利点を実証することもできた。なぜなら、そのドメイン内の潜在的な競合エピトープは、CEA特異的CTLの誘導を抑制することができたからである。この発見によって、設計体の裏の原理が確認される。CEAからの第1の候補ペプチドによって、このフォーマットから迅速で高レベルのCTLが生み出されるという事実は有望であり、この結果によって、p.DOM戦略はヒト・ワクチンと関連性があることが示される。
【００７１】
(物質および方法)
DNAワクチンの構築
FrCの完全長2ドメイン配列(破傷風毒素のアミノ酸865-1316(TT865-1316))、およびBCL1腫瘍のIgMのVH由来のリーダー配列をエンコードしている遺伝子を含む、DNAワクチン(p.FrC)の構築が記載されている(25、26)。第1ドメイン(21)(p.DOM)をエンコードしている遺伝子を含むDNAワクチンを、pcDNA3にクローン化する前に、正方向および逆方向プライマーFrCf1およびFrCr1をそれぞれ使用して、p.FrCからのアミノ末端ドメイン配列(TT865-1120)のPCR増幅によって構築した(表1)。次いでこのプラスミドを、それぞれ第1ドメインは含むがカルボキシル末端に融合した異なるCTLエピトープ配列を有する、3つの類似なワクチンを構築するために鋳型として使用した。TT1287-1294ペプチドをエンコードしているp.DOM-ペプチド1、TT1162-1169ペプチドをエンコードしているp.DOM-ペプチド2、またはCEA526-533ペプチドをエンコードしているp.DOM-CEAの作製は、p.DOM単独のそれと同一であった。ただし、それぞれの場合異なる逆方向プライマーを使用し(それぞれFrCr2、FrCr3およびFrCr4)、これらはp.DOMカルボキシル配列と重複し、興味のあるCTLエピトープ配列を取り込んだ。DNAワクチンp.-FrC-CEA526-533を、正方向プライマーFGf1、およびFrCの3'配列と重複しCEA CTLエピトープ(CEA526-533)をエンコードしているプライマーFCr5を使用して、完全長FrC配列のPCR増幅によって構築し、これをFrCのカルボキシル端に融合させた。次いでPCR産物をpcDNA3にクローン化した。
【００７２】
CTLエピトープTT1287-1294をエンコードしているDNA配列を、FrCの第1ドメイン(24)中に位置する「共通の」Tヘルパー・エピトープ、p30(TT947-967)をエンコードしているDNA配列に連結させることによって、p.p30-ペプチド1を作製した。3ステップのPCRアセンブリ手順を使用した。最初に、BCL1リーダー配列を、正方向プライマーPCMVf1、およびp30重複配列を含む逆方向プライマーBCL1r1を使用して、p.FrCから増幅した。第2に、正方向プライマーp30f1およびCTLエピトープTT1287-1294をエンコードしている突出部を含む逆方向プライマーp30r1を用いて、p30をp.FrCから増幅した。第3に、これら2つのゲル精製PCR産物を組み合わせ、プライマーPCMVf1およびp30r1を使用して、PCR-SOeingによって組み立てた。ワクチンp.p30-ペプチド2を、CTLエピトープTT1162-1169をエンコードしている突出部を含む逆方向プライマーp30r2を使用して、同様の方法で作製した。作製したすべてのワクチンPCR産物を、HindIIIおよびNotI制限部位を使用して、発現ベクターpcDNA3(Invitrogen Corp.、San Diego、CA)に連結させた。プライマー配列を表1に示す。
【００７３】
DNAワクチンの構造を図7に示す。DNAの配列決定によって、構築体すべての無欠性を確認した。TNTR T7 Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega Corp.、Madison、WI)を使用して、発現およびサイズをin vitroにおいて調べた。哺乳動物の細胞中の発現を、COS細胞をトランスフェクトし、ELISAによって上澄み中のFrC含有タンパク質を測定することによって試験した(12)。
【００７４】
ペプチド
室内においてShimadzu PSSM8ペプチド・シンセサイザーでFmoc化学を使用して、フラグメントC(FrC)ペプチドを合成し、HPLCによって純度を調べた。
【００７５】
比色定量アッセイ(BCA;Pierce、Rockford、IL)によって、濃度を測定した。H-2b-制限FrC CTLエピトープ配列TT1287-1294(SNWYFNHL:ペプチド1)およびTT1162-1169(LNIYYRRL:ペプチド2)の同等物は、完全な破傷風毒素(TT)配列に対応する。CEA526-533ペプチド(EAQNTTYL)は、前に記載されている(27、28)。これは商業的に合成され、95%を超える純度で提供された(Peptide Protein Research Ltd.、Southampton、UK)。
【００７６】
ペプチド結合アッセイ
それぞれのペプチドのH2-Kbへの結合は、記載されているようにアセンブリ・アッセイを使用して行った(29)。このアッセイは、RMA-S細胞の洗浄溶解物中では、安定した(Kb結合)ペプチドを溶解時に加えない限り、Kb分子は不安定であり一晩4℃でインキュベーションした後に解離するという観察に基づくものである。したがって安定化したKb分子のみを、一晩インキュベーションした後にmAb Y3を用いた免疫沈降によって回収することができる。回収されるKbの量はペプチド結合の量に正比例し、50%最大回収を行うのに必要とされるペプチドの濃度が、およその結合親和性を表す(29)。H2-Kb重鎖(HC)の回収を、免疫沈降およびAIDA(Fuji)を使用するSDS PAGEの後で定量化した。
【００７７】
予防接種プロトコルおよびCTLアッセイ
室内で飼育したC57BL/6マウスに、6-10週間の年齢において、50μgのDNAを正常な食塩水中に溶かしたものを用いて、大腿四頭筋の2個所の部位に注射して予防接種した。CTL応答を測定するために、14日目にマウスを殺傷した。予防接種したマウスから脾臓をプールし、10%熱不活性化FCS(Life Technologies、Paisley、UK)、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、非必須アミノ酸(100倍ストックの1%)、25mM HEPESバッファーおよび50μM 2-メルカプトエタノールを補充したRPMI培地中で、1つの細胞懸濁液を調製した。3×106細胞/mlで、脾細胞を40ml培地中に再懸濁させ、これを80cm2フラスコに、組み替えヒトIL-2(20U/ml、Perkin-Elmer、Foster City、CA)およびペプチド(5-20μM)と共に加えた。T細胞培養物を、7日後に24ウエルのプレートにおいて再び刺激した。T細胞(5×105/ウエル)を、照射した同系の「フィーダー」脾細胞(5×106/ウエル)、rIL-2(20U/ml)、およびペプチド(5-20μM)と混合させた。前に記載したように(18)、T細胞培養物の細胞溶解活性を、1回in vitroで刺激した6日後に、標準的な4-5時間の51Cr放出アッセイによって評価した。示した実験については、さらなるin vitroでの刺激を与えた。標的細胞は、試験用またはコントロール・ペプチドと共にインキュベートしたEL4細胞(ATCC;TIB39)であり、EL4細胞のみか、あるいはトランスフェクトされたEL4細胞であった(以下参照)。標準式([CTLによる放出-標的のみによる放出]/[4%NP40による放出-標的のみによる放出]×100%)によって、特異的溶解を計算した。標的のみによる自発的な放出は常に、4%NP40による放出の20%未満であった。
【００７８】
細胞内γ-IFNアッセイ
生存能力のある細胞を、密度遠心分離によって選択した(Lymphoprep、Nycomed Pharma As、Oslo、Norway)。細胞が5×105/ウエルであり、rIL-2、ペプチド1μMが10U/ウエルであり、さらにゴルジプラグ(PharMingen)が1μl/ウエルである96Uウエルのプレートにおいて、37℃で4時間、T細胞をインキュベートした。1μg/ウエルのFITC抗マウスCD8b.2(Ly-3.2、クローン53-5.8、PharMingen)またはイソタイプ・コントロールで標識化(20分、4℃)する前に、2%非働化マウス血清で細胞をブロックした(15分、4℃)。表面標識化の後に、細胞を1%ホルムアルデヒドで固定し(20分、4℃)、次いで0.5μg/ウエルのPEラット抗マウスγ-IFN(クローンXMG1.2、PharMingen)を用いて4℃で20分間細胞内標識する前に、0.5%サポニンで浸した(10分、4℃)。最後の洗浄の後に、細胞をPBS中に再懸濁させ、CELLQUESTソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して、FACScaliburによってすぐに分析した。
【００７９】
腫瘍標的
本発明者らは、FrC(18)の非分泌(リーダー配列なし)形をエンコードしているプラスミドがトランスフェクトされた、EL4腫瘍細胞からなる腫瘍モデルを生成した。簡潔には、400μl培地中の2×106個の細胞を10μgのDNAプラスミドと混合させ、300V、975μF(Gene Pulser Cuvette、電極ギャップ0.4cm、Biorad)で電気穿孔した。選択的抗生物質(Geneticin、2mg/ml、Life Technologies Ltd.)の存在下で細胞を成長させ、安定した群を復元させた後、これらの細胞をクローン化し、FrC特異的CTLによる溶解しやすさについて試験した。これによって、腫瘍細胞株EL4-FrCの生成がもたらされた。
【００８０】
腫瘍のチャレンジ
1×105のEL4-FrCトランスフェクタントまたはエンプティ・ベクター(pcDNA3)でトランスフェクトしたEL4細胞を、右脚に皮下注射することによって、C57BL/6マウスをチャレンジした。その結果生じた腫瘍が直径1.5cmに達したとき、ヒト終点ガイドライン(UK Coordinating Committee for Cancer Research、London、UK)に従ってマウスを殺傷し、死んだ日を記録した。100μgのIg(Dr.S.Cobbold(30)によって親切にも供給されたラット抗マウスCD8,YTS169.4.2.1、またはイソタイプ・コントロール)を、14日間中2-3日毎に腹腔内注射することによってin vivoで、細胞消耗実験を行い、腫瘍のチャレンジの1週間前にこれを始めた。
【００８１】
本明細書に記載する実験作業は、他種のマウス(Balb/C)にも行い、結果は同じであった。
【００８２】
「参考文献」
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 FrCのトポロジー(Umland T.C.他のNature Structural Biology、Vol.4、No.10、1997)を示す図である。この図は、FrCの第1ドメインのN末端、および第2ドメインのC末端を示す。ヘルパー・アミノ酸配列は、第1ドメイン中のアミノ酸位置947-967で見られる。
【図２】 プラスミドpcDNA3(Invitrogen)の詳細な地図を示す図である。
【図３】 FrCの第1ドメインおよび病原性抗原を含むベクターを生成するための方法の概略を示す図である。
【図４ａ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図４ｂ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図４ｃ】 ベクターpVAC1の配列全体を示す図である。
【図５】 pVAC1制限地図を示す図である。
【図６】 pVAC1の主な特徴の概略を示す図である。
【図７】 DNAワクチンの設計を示す概略図である。Hind IIIおよびNot I制限酵素部位を使用してワクチン配列を組み立て、pcDNA3に挿入した。DNA配列は、完全長FrCの2つのドメイン
【外１】
【外２】
【外３】
【外４】
【外５】
【外６】
【外７】
【外８】
【外９】
【図８】 完全長FrC配列(p.FrC)をエンコードしているDNAを用いた予防接種によって誘導されるCTL応答は、2つのH-2Kb-結合八量体に特異的であることを示す図である。p.FrCによる予防接種の後に、14日目に採取した脾細胞を、有意なH-2Kb-結合活性が予想される8個のペプチドそれぞれで再刺激した。わずかに2つのペプチドが、51Cr放出アッセイによって測定される、測定可能なCTL活性を誘導した。a).ペプチド装入EL4細胞に対するCTL活性を、ペプチド1(SNWYFNHL)およびペプチド2(LNIYYRRL)に対して検出した。それぞれのペプチドは、試験用またはコントロールのいずれかとして相互的に使用した。b).安定化アッセイによるH-2Kbへの結合活性によって、ペプチド1および2はSendaiウイルス核タンパク質(SEV)からのポジティブ・コントロールに匹敵し、インフルエンザ・ウイルス(ASN)からのコントロールのH-2Db-結合ペプチドとは明らかに異なることが示された。
【図９】 第2ドメイン中の埋め込み部位から、FrCの第1ドメインのC末端にペプチド1または2の位置を移すことによって、特異的な抗ペプチドCTL応答が増幅されることを示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド)、またはペプチド1または2配列に融合したFrCのp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド)、または挿入物のないコントロール・プラスミド(p.φ)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、ペプチド装入EL4標的細胞を使用し51Cr放出アッセイによってCTL活性を測定する前に、ペプチド1(左側)またはペプチド2(右側)を用いて脾細胞を再刺激した。コントロール・ペプチドが装入された標的細胞の溶解は、いずれの場合もごくわずかであった(2.2%未満)。
【図１０】 埋め込まれたペプチドまたは位置を移されたペプチドを含むDNAワクチンが、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド)、またはペプチド1または2配列に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、示したようにペプチド1またはペプチド2を用いて脾細胞を再刺激し、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞のパーセンテージを示す。構築体の相対的な効率は、51Cr放出アッセイと平行した(図9)。
【図１１】 p.DOM-ペプチド配列を含むDNAワクチンによって誘導されたCTLが、標的トランスフェクタントを殺傷する能力を示す図である。p.DOM-ペプチド1(aおよびb)またはp.DOM-ペプチド2(cおよびd)を用いた予防接種の後に、14日目に脾細胞を採取し、51Cr標識した標的細胞に対する活性を試験する前に、in vitroで6日間ペプチドを用いて再刺激した。標的細胞は、リーダー配列のないFrC(□)またはエンプティ・ベクター(■)でトランスフェクトしたEL4細胞、EL4細胞単独(▲)、またはペプチド1が装入されたEL4細胞(◇)、またはペプチド2が装入されたEL4細胞(○)を含んでいた。
【図１２ａ】 埋め込まれたペプチド1または位置を移されたペプチド1を含むDNAワクチンが、EL4-FrCでトランスフェクトした腫瘍細胞を用いたチャレンジに対する防御免疫を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2)、またはペプチド1に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド1)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を、グループ当たり8匹のマウスを使用して、0日目と21日目に行った。28日目に、105個の腫瘍細胞をscで注射し、腫瘍サイズが直径1.5cmに達したときに、マウスを殺傷した。
【図１２ｂ】 埋め込まれたペプチド1または位置を移されたペプチド1を含むDNAワクチンが、EL4-FrCでトランスフェクトした腫瘍細胞を用いたチャレンジに対する防御免疫を誘導する能力の比較を示す図である。完全長FrC(p.FrC)、または位置を移されたペプチド1または2にC末端で融合した第1ドメイン(p.DOM-ペプチド1またはp.DOM-ペプチド2)、またはペプチド1に融合したp30ヘルパー・エピトープ(p.p30-ペプチド1)のいずれかをエンコードしているDNAを用いた予防接種を、グループ当たり8匹のマウスを使用して、0日目と21日目に行った。28日目に、105個の腫瘍細胞をscで注射し、腫瘍サイズが直径1.5cmに達したときに、マウスを殺傷した。
【図１３】 p.DOM-ペプチド設計体がガン胎児抗原(CEA)からの候補ペプチドに対するCTL応答を誘導する能力を示す図である。C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するp.DOMをエンコードしているDNAを用いた予防接種を行った。14日目に、ペプチドを用いて脾細胞を再刺激し、a)特異的ペプチド(●)またはコントロール・ペプチド(○)を装入した標的EL4細胞を使用して51Cr放出アッセイにおいて試験した。p.DOMのみを予防接種したマウスは、特異的ペプチド(▲)またはコントロール・ペプチド(△)に対する応答についても試験した。b)では、細胞内IFNγを有する応答CD8+T細胞のパーセンテージの平行アッセイを示す。
【図１４】 p.DOM-ペプチド設計体を使用することによって、2ドメインFrC-ペプチド設計体を使用するガン胎児抗原(CEA)からの候補ペプチドに対するCTL応答の抑制が、圧倒されることを示す図である。(a)C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するFrCの第1ドメインをエンコードしているDNA(p.DOM-CEA526-533)、(b)FrCの第1ドメインのみをエンコードしているDNA(p.DOM)、(c、d)C末端で融合したEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有する完全長FrCをエンコードしているDNA(p.FrC-CEA526-533)を用いた予防接種を行った。14日目に、CEA526-533ペプチド(▲)またはペプチド1(■)のいずれかを装入した標的EL4細胞を使用して、51Cr放出アッセイによってCTL活性を測定する前に、in vitroで6日間CEA526-533(aからc)またはペプチド1(d)を用いて脾細胞を再刺激した。
【図１５】 2つのドメインFrC-ペプチド設計体およびp.DOM-ペプチド設計体の、細胞内IFNγを含むCD8+T細胞を誘導する能力を比較する図である。(a)C末端で融合したCEAからのEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有するFrCの第1ドメインをエンコードしているDNA(p.DOM-CEA526-533)、(b)FrCの第1ドメインのみをエンコードしているDNA(p.DOM)、(cおよびd)C末端で融合したEAQNTTYLペプチドをエンコードしている配列を有する完全長FrCをエンコードしているDNA(p.FrC-CEA526-533)を用いた予防接種を行った。14日目に、FACS分析の前に、in vitroで6日間CEA526-533(aからc)またはペプチド1(d)を用いて脾細胞を再刺激した。細胞内IFNγを含むCD8+T細胞のパーセンテージを示す。構築体の相対的な効率は、51Cr放出アッセイと平行した(図14)。
Claims (20)
- 病原性ペプチド抗原に対する患者の免疫応答を誘導するために、生細胞中にin vivoで送達するための核酸構築体であって、病原性ペプチド抗原並びに破傷風毒素のフラグメントＣ(FrC)の天然に存在する第1ドメイン若しくは前記第1ドメインに対して少なくとも90%の同一性を有しかつ免疫応答を誘導する能力を保持するペプチドからなる融合タンパク質の発現を指示する核酸構築体であって、前記第1ドメインは、FrCを連結アミノ酸配列内で切断した時に生じるN末端側の断片であり、前記連結アミノ酸配列は、天然に存在するFrCの残基1107から1127である、核酸構築体。
- 病原性ペプチド抗原が腫瘍抗原である、請求項1に記載の核酸構築体。
- 前記病原性ペプチド抗原がイディオタイプ決定基である、請求項1または請求項2に記載の核酸構築体。
- イディオタイプ決定基が単鎖可変フラグメント(scFvフラグメント)である、請求項3に記載の核酸構築体。
- 病原性ペプチド抗原が5から30の間のアミノ酸を有する、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の核酸構築体。
- 前記病原性ペプチド抗原が8から25の間のアミノ酸を有する、請求項5に記載の核酸構築体。
- 融合タンパク質を小胞体に誘導することができるリーダー配列に融合タンパク質が連結している、請求項1ないし6のいずれか一項に記載の核酸構築体。
- 請求項1ないし7のいずれか一項に記載の核酸構築体を含む、核酸発現ベクター。
- 請求項8に記載の核酸発現ベクターまたは請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築体を含む宿主細胞。
- 患者の免疫応答を誘導するための核酸ワクチンであって、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築体または請求項8に記載の核酸発現ベクターを含む核酸ワクチン。
- 患者の免疫応答を誘導するための核酸構築体を生成する方法であって、
(a)疾患に特徴的なエピトープを含む病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列を同定すること、
(b)病原性ペプチド抗原をエンコードしている核酸配列をクローン化すること、および
(c)破傷風毒素由来のFrCの天然に存在する第1ドメインとの融合体、または前記第1ドメインに対して少なくとも90%の同一性を有しかつ免疫応答を誘導する能力を保持するペプチドとの融合体として病原性ペプチド抗原を発現させることができるベクターに、クローン化した核酸を導入することを含み、
前記第1ドメインは、FrCを連結アミノ酸配列内で切断した時に生じるN末端側の断片であり、前記連結アミノ酸配列は、天然に存在するFrCの残基1107から1127である、
方法。 - 融合タンパク質と結合させるためのリーダー配列をベクターがさらに含む、請求項11に記載の方法。
- ベクターから核酸構築体を単離するステップをさらに含み、前記核酸構築体が破傷風毒素由来のFrCの第1ドメインおよび病原性ペプチド抗原からなる融合タンパク質の発現を指示する、請求項11または請求項12に記載の方法。
- 核酸構築体を含むワクチン組成物を作製するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 患者の免疫応答を誘導するための薬剤の調製における、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築体または請求項8に記載の核酸発現ベクターの使用。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築体または請求項8に記載の核酸発現ベクターを含む、患者の免疫応答誘導剤。
- 患者の筋肉細胞に直接投与される、請求項16に記載の免疫応答誘導剤。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築体、および生理学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物。
- 請求項8に記載の核酸発現ベクター、および生理学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物。
- ベクターが免疫調節ポリペプチドの発現をさらに指示する、請求項19に記載の組成物。
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