ES2267812T3 - Materiales y metodos que relacionan respuestas inmunes con proteinas de fusion. - Google Patents
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Abstract
Una construcción de ácido nucleico para introducirse en células vivas in vivo, para inducir una respuesta inmune en un paciente frente a un antígeno peptídico de una enfermedad; la construcción que dirigiendo la expresión de una proteína de fusión que consiste en el antígeno peptídico de una enfermedad y el dominio N-terminal del fragmento C (FrC) de la toxina del tétanos.
Description
Materiales y métodos que relacionan respuestas
inmunes con proteínas de fusión.
La presente invención se refiere a materiales y
métodos implicados en inducir una respuesta inmune en un individuo.
En particular, pero no de manera exclusiva, la presente invención se
refiere a vacunas de ADN que comprenden dominios de Fragmentos C
(FrC) como adyuvantes para aumentar el número de linfocitos T
citotóxicos (CTL) frente a antígenos peptídicos de una
enfermedad.
Aunque las vacunas no celulares son
inevitablemente más seguras que las vacunas basadas en organismos
enteros, una vacuna totalmente eficaz normalmente no se puede
elaborar a partir de un único constituyente aislado de un
microorganismo y actualmente está claro que esto se debe a la
necesidad de activar más de un tipo celular para iniciar una
respuesta inmune. Una consecuencia de este hecho ha sido el
desarrollo de vacunas conjugadas.
Sin embargo, incluso las vacunas conjugadas no
son habitualmente muy inmunogénicas por ellas mismas. La mayoría de
ellas necesitan la adición de adyuvantes: sustancias que aumenten la
inmunogenicidad de los antígenos. Se cree que la mayoría, si no
todos, los adyuvantes actúan en células presentadoras de antígeno
(abreviado en inglés como APC) y reflejan la importancia de estas
células para iniciar las respuestas inmunes. Por ejemplo, se han
conjugado los polisacáridos de H. influenzae con el toxoide
tetánico debido a que los niños son vacunados de manera rutinaria
con esta proteína y sus células T ya están estimuladas contra
ello.
La toxina del tétanos ha sido estudiada en
detalle. Por ejemplo, véase Umlad T.C. et al, Nature
Structural Biology, Vol. 4 No. 10 1997. La toxina se aprovecha de un
mecanismo de transporte para introducirse en su diana citotóxica
dentro del sistema nervioso central. La subunidad de unión al
receptor de la toxina del tétanos juega un papel fundamental en este
proceso de introducción. Esta subunidad de unión al receptor es
conocida como H_{c} y está compuesta por el fragmento Mr de 50,000
procedente del extremo C-terminal de la cadena
pesada de la toxina del tétanos. Históricamente, el fragmento Mr de
50,000 se ha llamado Fragmento C (FrC). El FrC aislado conserva la
capacidad de ser transportado al SNC de manera muy similar a la de
la toxina del tétanos intacta.
El toxoide del tétanos se ha utilizado como
proteína transportadora para inducir respuestas inmunes contra
péptidos (Herrington et al., 1992 J. Immunol. 149:717). Hay
disponible una información considerable sobre respuestas inmunes
contra el toxoide del tétanos y los epítopos reconocidos por células
T CD4+ humanas (Valmori et al, 1992 J. Immunol. 149:717), así
como sobre los mecanismos implicados en aumentar la inmunidad frente
a péptidos añadidos (Panina-Bordignon et al,
1989 Eur. J. Immunol. 19: 2237; Kumar 1992 J. Immunol, 148:1499). Se
ha encontrado que el fragmento C (FrC), porción
carboxi-terminal de 50kD de la cadena pesada de la
toxina del tétanos, induce inmunidad protectora contra la toxina del
tétanos, la cual es mediada principalmente por anticuerpos (Anderson
et al, 1996. Infect. and Immun. 64:3168).
La solicitud WO99/15671 describe la vacunación
contra la hepatitis B mediante una proteína de fusión que comprende
el Fragmento C, o fragmentos del mismo, unidos a la región
pre-S2 del virus.
En un estudio anterior (King, C. A. et
al, Nature Medicine, 1998, Vol. 4 p.1281), un autor del cual es
coinventor de la presente invención, se describe el uso y la
producción de construcciones de ácido nucleico para inducir una
respuesta inmune en un mamífero frente a un antígeno de una
enfermedad presente en una célula B maligna en el mamífero. La
construcción de ADN dirige la expresión de una proteína de fusión
que comprende el antígeno tumoral y el Fragmento C (FrC) de la
toxina del tétanos. De esta manera, ya se ha demostrado que una
respuesta inmune a un antígeno determinado puede ser potenciada por
la sola presencia de FrC.
La secuencia de cooperación (en inglés
"helper") p30 del Fragmento C de la célula T, procedente
de la toxina del tétanos, tiene la capacidad de activar las células
T CD4+ y se ha utilizado en construcciones para ayudar a iniciar una
respuesta inmune frente a un antígeno. Sin embargo, se ha visto que
a nivel de ADN, por ejemplo las vacunas de ADN, la secuencia de
cooperación aislada no es tan efectiva como se esperaba. Esto se
puede deber a que la secuencia de cooperación aislada no es
suficiente para estimular o incluso para ser reconocida por el
sistema inmune. Así, los presentes inventores han estimado que una
vacuna de ADN efectiva no debe comprender únicamente la secuencia
de cooperación sino también una secuencia capaz de estimular el
sistema inmune. Como se ha mencionado más arriba, se han
proporcionado vacunas de ADN efectivas que comprenden antígenos
tumorales unidos al Fragmento C completo. Sorprendentemente, sin
embargo, los presentes inventores han encontrado que la inducción de
una respuesta inmune a un antígeno peptídico de una enfermedad puede
mejorarse y simplificarse utilizando un determinado componente del
Fragmento C y no el fragmento entero.
Los inventores han ensamblado una secuencia de
ácido nucleico que codifica para el primer dominio
(N-terminal) de FrC, que contiene la(s)
secuencia(s) de cooperación (e.g. p30) y la han unido a una
secuencia que codifica para un péptido que tiene la capacidad de
inducir respuestas de células T citotóxicas (abreviado en inglés
como CTL). Cuando los inventores inyectaron el vector en los
ratones, observaron una inducción muy rápida de las CTL. Esta
inducción fue considerablemente más rápida que si el péptido tuviera
que ser procesado a partir de su secuencia natural circundante. De
hecho, los inventores han comparado (i) una vacuna de ADN que
contiene el FrC de longitud completa (2 dominios) unidos a un
antígeno tumoral endógeno, con (ii) el formato de un único dominio
de FrC unido a un epítopo específico de CTL procedente de un
antígeno tumoral. La última vacuna (ii) indujo niveles superiores de
CTL. Estos niveles se mantuvieron altos incluso en el día 55 después
de la vacunación, tras compararse con la vacuna de dos dominios.
Así, los presentes inventores han determinado
por primera vez un diseño de vacuna que contiene todos los
ingredientes para inducir inmunidad, es decir, una secuencia de
cooperación y una secuencia de activación dentro del primer dominio
de FrC el cual inicia el proceso de estimulación. El segundo dominio
del Fragmento C comprende un número de motivos de células T
citotóxicas y los inventores creen que estos motivos pueden competir
correctamente con los motivos presentes en el antígeno de la
enfermedad presente en la proteína de fusión. Con estos motivos
ausentes, la vacuna de ADN ha mejorado la eficacia al inducir
inmunidad.
De forma general, por lo tanto, la invención es
basa en la idea de utilizar ácido nucleico que codifica para el
primer dominio de FrC, pero que carece de secuencia(s) que
codifica(n) para uno o más epítopos de células T del segundo
dominio de FrC, en una construcción de ácido nucleico que codifica
para un polipéptido de fusión que también comprende un antígeno de
una enfermedad. La ausencia del segundo dominio mejora la capacidad
del polipéptido de fusión para inducir una respuesta de células T al
antígeno de una enfermedad. Sin embargo, el ácido nucleico no
requiere necesariamente carecer de una secuencia que codifique para
el segundo dominio completo. Por ejemplo, se observa que puede estar
presente alguna región del segundo dominio sin que se vea afectada
desfavorablemente la capacidad del polipéptido de fusión para
inducir una respuesta de células T. Preferiblemente, por lo menos el
ácido nucleico que codifica para el péptido 1 y/o el péptido 2 como
se ha(n) identificado en el presente documento, está(n)
ausente(s). Más preferiblemente, no más de una parte
insustancial del segundo dominio está codificado por el ácido
nucleico ya que otros epítopos de células T pueden estar presentes
en el segundo dominio que se encuentra de manera natural. Una parte
insustancial puede comprender menos del 50%, menos del 40%, menos
del 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o menos de un 5% de los aminoácidos que
forman parte natural del segundo dominio del Fragmento C.
Aunque lo siguiente se refiera con frecuencia a
antígenos idiotípicos, la invención no se limita a tales antígenos,
sino que podría utilizarse cualquier antígeno adecuado de una
enfermedad, particularmente antígenos tumorales (tales como un
fragmento de CEA), normalmente antígenos pequeños para la inducción
de células T.
Más específicamente, por lo tanto, en un primer
aspecto de la presente invención se proporciona una construcción de
ácido nucleico que se introduce en células vivas in vivo para
inducir una respuesta inmune en un paciente frente a un antígeno
peptídico de una enfermedad; la construcción dirigiendo la expresión
de una proteína de fusión, dicha proteína de fusión comprendiendo el
antígeno peptídico/polipeptídico de una enfermedad y el primer
dominio de FrC.
El primer dominio del fragmento FrC comprende
secuencia(s) de cooperación (particularmente p30). El dominio
de FrC actúa como adyuvante, ayudando, incrementando o estimulando
el sistema inmune y le permite responder al antígeno de la
enfermedad induciendo a los CTL. Tal y como se utiliza en la
presente invención, el término "primer dominio" se refiere,
preferiblemente, al primer dominio de FrC completo que se encuentra
de manera natural. Sin embargo, se contempla que se puedan
introducir pequeñas variaciones de la secuencia sin que se vea
afectada de manera significativa la capacidad de la proteína de
fusión para inducir respuestas de células T, y también están
incluidas dentro del ámbito de la invención las proteínas de fusión
que tengan un primer dominio de FrC que incluya dichas variaciones.
Los términos "primer dominio" y "dominio
N-terminal" se utilizan de manera intercambiable
a lo largo de esta descripción. Preferiblemente el primer dominio de
FrC codificado por el ácido nucleico de la invención tiene por lo
menos el 50%, más preferiblemente por lo menos cerca del 60%, 70%,
80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia aminoacídica con
el primer dominio de FrC que se encuentra de manera natural
(identidad determinada mediante el algoritmo BLAST2 (NCBI) de
Altschul et al. Nucleic Acid Res.
25:3389-3402 (1997) utilizando los parámetros por
defecto). Más preferiblemente contiene una secuencia de aminoácidos
que tiene por lo menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de
identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia de cooperación
p30.
Inicialmente, los inventores supusieron que el
formato de la vacuna del único dominio de FrC era capaz de inducir
elevados números de CTL, tras compararse con el formato de dos
dominios cuando el ADN que codifica el antígeno de elección se
fusionaba al extremo 3' (extremo carboxilo de la proteína
resultante) del único dominio de FrC. Sin embargo, siguiendo varios
experimentos, los inventores han determinado que la impresionante
respuesta de CTL también se observa si el antígeno/epítopo se une al
otro extremo de la vacuna, al principio del dominio FrC (extremo 5'
terminal del ADN, o el extremo amino terminal de la proteína
resultante). Esto, por lo tanto, aumenta la posibilidad de utilizar
tanto uno como los dos extremos terminales del dominio de FrC para
unirse al antígeno/epítopo.
Como se describe en Umland T. C. et al,
Nature Structural Biology, Vol. 4 No. 10 1997, FrC tiene dos
dominios principales. Los dos dominios están separados de manera
natural en FrC por una secuencia aminoacídica de unión. Los
inventores han encontrado que si esta secuencia aminoacídica de
unión se corta a nivel de ADN, se puede añadir una secuencia de ADN
que codifique un péptido de elección (p.e., un antígeno tumoral o
patogénico) al extremo C-terminal o al
N-terminal del primer dominio que comprende
la(s) secuencia(s) de cooperación (p. e. p30) y la
secuencia de estimulación. Los dos dominios se identifican en Umland
et al y se muestran otra vez en la Fig. 1. La secuencia de
cooperación p30 se puede encontrar en las posiciones de los
aminoácidos 947 a 967.
El antígeno peptídico de la enfermedad puede ser
cualquier secuencia peptídica que comprenda uno o más epítopos
característicos de esa enfermedad. Por ejemplo, el péptido puede
comprender epítopos característicos de una determinada enfermedad
infecciosa, un patógeno o cáncer (antígeno tumoral). No se pretende
que el término "péptido" implique una restricción de tamaño
particular y puede abarcar grandes polipéptidos y proteínas de hasta
por lo menos varios cientos de aminoácidos, como
MUC-1 o gp70. Preferiblemente, sin embargo, el
péptido tiene entre 5 y 40 aminoácidos, más preferiblemente entre 5
y 30, y todavía más preferiblemente entre 7 y 25 aminoácidos
(deseosamente entre 7 y 10 aminoácidos), más preferiblemente entre 8
y 25 aminoácidos. Se conocen y están publicados varios péptidos
cancerosos. Candidatos del melanoma como antígenos de MAGE y
tirosinasa o los proto-oncogenes mutados como Ras.
Estas secuencias están todas publicadas así que obtenerlas y
situarlas en el vector que contiene el dominio FrC de acuerdo con la
presente invención se encontraría dentro de las habilidades del
experto en la materia. Una revisión práctica que describe algunas de
las secuencias tumorales candidatas que podrían ser objeto de CTL es
la de Henderson R.A. y Finn O.J. (1996) "Human tumor antigens are
ready to fly" Adv. en Immunology 62:217.
El péptido puede ser también un determinante
idiotípico que está presente, preferiblemente, en la proteína de
fusión, esencialmente en la misma conformación que la que adopta en
la superficie de células B malignas, optimizando de ese modo la
eficacia de la respuesta inmune anti-idiotípica
inducida por la proteína de fusión. En base a los determinantes
idiotípicos, se puede conseguir optimizar la eficacia de la
respuesta inmune mediante la expresión del determinante idiotípico
dentro del contexto de una región de una molécula de inmunoglobulina
(Ig) o de una molécula similar a inmunoglobulina, tal como un
fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). El fragmento scFv es
particularmente adecuado, aportando los elementos estructurales
necesarios del determinante idiotípico con pocos residuos
aminoacídicos superfluos. Sin embargo, si se desea se pueden añadir
a la proteína de fusión residuos de aminoácidos adicionales, tal
como uno o más dominios constantes (p. e. Syrengelas et al,
1996 Nature Medicine 2, 1038). Así, por ejemplo, se podría expresar
el determinante idiotípico en el contexto de la molécula completa de
inmunoglobulina.
En una realización preferida, la proteína de
fusión se expresa con una secuencia líder (en inglés "leader
sequence") (reconocida en células humanas) que dirige la
proteína de fusión al retículo endoplasmático, donde la secuencia
señal se disocia de la proteína de fusión. De esta manera, la
proteína de fusión se plegará correctamente antes de abandonar la
célula. El correcto plegamiento de la proteína de fusión es
importante porque asegurará que los epítopos característicos de la
enfermedad en cuestión sean exhibidos adecuadamente al sistema
inmune. Se conoce un gran número de secuencias líder adecuadas
incluyendo, por ejemplo, las secuencias líder que se encuentran en
el extremo 5' de los genes V humanos (tal como la de V_{H}I
descrita abajo). Los presentes inventores han descubierto que dichas
secuencias líder aumentan la inmunogenicidad de la proteína de
fusión. En principio, cualquier otra secuencia líder seguramente
ejerza un efecto equivalente ventajoso, pero es probable que
aquellas más similares a la secuencia líder del tipo inmunoglobulina
natural sean las óptimas.
Por conveniencia, la construcción de ácido
nucleico comprenderá, preferiblemente, un número de puntos de
reconocimiento para endonucleasas de restricción. En particular, si
la construcción está diseñada con el dominio FrC unido por el
extremo 5' (en inglés "upstream") de la secuencia del
epítopo de un CTL de una enfermedad, se pueden localizar uno o más
de dichos puntos de reconocimiento en el extremo 5' de la secuencia
que codifica para el primer dominio de FrC (posiblemente entre la
secuencia líder óptima y la secuencia que codifica el dominio de
FrC), y uno o más puntos pueden localizarse en el extremo 3' de la
secuencia que codifica para el antígeno de la enfermedad. De esta
manera, la misma construcción básica puede adaptarse fácilmente para
expresar diferentes proteínas de fusión en las que el antígeno de
una enfermedad puede ser alterado. Así, se pueden introducir
fácilmente en la construcción las secuencias que codifican antígenos
de una enfermedad tales como los determinantes idiotípicos
procedentes de diferentes pacientes.
Un método alternativo para asociar un antígeno
de una enfermedad (especialmente un antígeno pequeño) con el dominio
de FrC se muestra en la Figura 3, parte 3, y se describe más
abajo.
En una realización particular, esta invención
proporciona una vacuna de ácido nucleico que puede utilizarse para
obtener una respuesta inmune contra linfocitos humanos transformados
que exhiben un marcador idiotípico, codificando el ácido nucleico
para proteínas que comprenden las regiones variables de cadena
pesada y ligera de un anticuerpo anti-idiotípico que
se exhibe en la superficie de una célula B o célula T humana
maligna.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método de producción de una construcción de ácido nucleico para
inducir una respuesta en un paciente, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- identificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un antígeno peptídico de una enfermedad;
- (b)
- clonar la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno peptídico de la enfermedad; y
- (c)
- introducir el ácido nucleico en un vector, permitiendo el vector que el antígeno peptídico de la enfermedad se exprese como una proteína de fusión con el primer dominio de FrC procedente de la toxina del tétanos.
El vector que comprende el primer dominio de FrC
puede también comprender preferiblemente una secuencia líder que se
asocie con la proteína de fusión, p. e. al extremo 5' del dominio de
FrC. El vector puede prepararse como parte del método, o puede
producirse anteriormente para incorporar el antígeno peptídico
deseado de la enfermedad. De esta manera, se pueden diseñar
cebadores de ácido nucleico que sean capaces de introducir el ácido
nucleico que codifique para el antígeno de la enfermedad en el
vector durante una técnica de PCR. Esto se describe en la
descripción detallada. Constituye un aspecto adicional de la
presente invención un vector que comprenda el primer dominio de FrC
y una secuencia líder, y puede proporcionarse como parte de un kit.
Preferiblemente, el vector comprende puntos de restricción, de tal
manera que el ácido nucleico que codifica para el antígeno de la
enfermedad puede insertarse en el vector con facilidad. En un
ejemplo alternativo se puede preparar un ácido nucleico que
codifique para la secuencia líder, el dominio de FrC y el antígeno
de una enfermedad (p. e. PCR) e insertarlo como una única fusión
(utilizando puntos de restricción adecuados) en un vector que
comprenda regiones de regulación adecuadas.
Como se ha mencionado anteriormente, el antígeno
de una enfermedad puede ser cualquier péptido que comprenda epítopos
característicos de una enfermedad determinada, p.e. antígenos
tumorales, patógenos y determinantes idiotípicos. Por conveniencia,
el siguiente texto describe el caso donde el antígeno de una
enfermedad es un determinante idiotípico. Sin embargo, el experto en
la materia no tendría dificultad en adaptar esta enseñanza al uso de
otros antígenos de otras enfermedades y la presente invención no se
limita al uso de determinantes idiotípicos.
Por consiguiente, a modo de ejemplo, el ácido
nucleico que codifica para el determinante idiotípico puede clonarse
por PCR a partir de una muestra que comprenda células del paciente.
Hay disponible una gran familia de cebadores de PCR genéricos,
capaces de recuperar secuencias de ácido nucleico que codifican
esencialmente para cualquier determinante idiotípico de célula B
(Hawkins & Winter, 1992 Eur. J. Immunol. 22, 876). Típicamente
la malignidad de una célula B es un linfoma. Generalmente, la
construcción de ácido nucleico producida por el método definido más
arriba estará en consonancia con el primer aspecto de la
invención.
Los dominios primero y segundo están separados
por naturaleza en FrC por una secuencia aminoacídica de unión. Esta
secuencia aminoacídica de unión se puede cortar a nivel del ADN, de
manera que la secuencia de ácido nucleico que codifica para el
péptido que comprende el antígeno de la enfermedad pueda unirse al
extremo C-terminal del primer dominio y descartar el
segundo dominio. El antígeno de la enfermedad se añade a nivel de
ADN y se une eficazmente bien al extremo C-terminal
o al N-terminal del primer dominio de FrC. La
construcción de ácido nucleico así formada se coloca, después, en un
vector de ADN. El esqueleto del vector es preferiblemente un ADN
bacteriano que comprende las secuencias control apropiadas para
dirigir la expresión del gen. Para introducir la construcción de
ADN en el vector se pueden utilizar, entonces, etapas estándar de
PCR y de unión conocidas por el experto en la materia. El vector de
ADN puede inyectarse al paciente, a continuación, vía, por ejemplo,
células musculares. El ADN entra en la célula muscular, donde se lee
la construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión
que comprende el primer dominio de FrC y el antígeno de una
enfermedad. Después de la transcripción y traducción se expresa la
proteína. Al reconocerse la proteína como extraña en sus
alrededores, es entonces presentada al sistema inmune. La activación
del sistema inmune se refuerza por la presencia de "secuencias
inmunoestimuladoras" en el esqueleto del ADN bacteriano del
vector. Así, el resultado es la presentación de la proteína
codificada a las células del sistema inmune del hospedador.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
el uso de la construcción de ácido nucleico de acuerdo con el primer
aspecto de la presente invención para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad, tal como una
enfermedad infecciosa o un cáncer.
En el caso de determinantes idiotípicos, la
secuencia de ácido nucleico que codifica para el determinante
idiotípico preferiblemente se clona a partir de las muestras
obtenidas de un individuo a quien se le ha introducido la misma.
Convenientemente, la secuencia de ácido nucleico se introduce de una
forma no encapsidada (es decir, no encerrada dentro de una partícula
vírica u otro empaquetado). El ácido nucleico puede, sin embargo,
asociarse a la superficie externa de una envoltura o partícula (p.
e. un liposoma o una partícula vírica), que da la posibilidad de una
introducción del ácido nucleico mediada por receptor.
La proteína de fusión puede dirigir la expresión
de un único antígeno de una enfermedad y el primer dominio de FrC.
Como alternativa, la proteína de fusión puede comprender
adicionalmente otras secuencias polipeptídicas inmunomoduladoras,
tales como otras proteínas inmunogénicas foráneas. De hecho, puede
ser valioso utilizar diversas parejas antigénicas de fusión para
ayudar a prevenir el problema teórico de que la respuesta inmune en
la región altamente inmunogénica de la proteína de fusión pudiera
finalmente dominar cualquier respuesta al antígeno de la enfermedad
inmunogénicamente débil (aunque el formato de fusión del único
dominio de FrC-antígeno se ha diseñado para reducir
esto). Las proteínas de cubierta de los virus con envoltura y con
superficie celular inmunogénica o proteínas secretadas derivadas de
cualquier organismo patogénico o especies no humanas, pueden ser
adecuadas para la inclusión en una proteína de fusión. Una
modificación alternativa es diseñar la construcción de ácido
nucleico para permitir la coexpresión de polipéptidos
inmunomoduladores adicionales como entidades separadas más que como
fusiones con el antígeno de una enfermedad/primer dominio de FrC.
Menos preferiblemente, el método de la invención podría emplear el
uso de una construcción de ácido nucleico aparte para expresar el
resto de polipéptidos.
Se conocen varias citoquinas que mejoran
aspectos de la presentación del antígeno y la introducción directa
de vectores de expresión que contienen genes de citoquina podrían
aumentar la eficacia de la vacuna. El interferón gamma es un ejemplo
que podría ser útil debido a la propiedad de regular positivamente
la expresión de CMH (Gaczynska et al. 1993 Nature 365,
264-267). Otro polipéptido que podría ser expresado
por la vacuna de ácido nucleico es el factor estimulante de colonias
de granulocitos/macrófagos (GM-CSF). El gen
relevante podría codificarse en el mismo vector, o en uno distinto,
y la cantidad de polipéptido expresado variaría
independientemente.
Una ventaja de la aproximación genética a la
vacunación es que permite el uso potencialmente eficaz del método
natural de presentación del antígeno, que debería activar, por
consiguiente, un amplio rango de sistemas efectores. Además, la
manipulación y la mejora de la respuesta obtenida deberían ser
relativamente sencillas; por ejemplo, puede ser posible mejorar la
eficacia de la presentación del antígeno a las células T expresando
moléculas con actividad coestimuladora junto con el inmunógeno. Una
molécula importante implicada en la coestimulación es B7, la cual
interacciona con CD28, expresado por las células T, y de ese modo se
proporcionan señales accesorias para la activación de las células T
(Galvin et al., 1992 J. Immunol. 12,
3802-3808). Se pueden construir vectores que
expresen tanto B7 como la fusión del dominio sencillo del Fragmento
C. Las secuencias de B7 tanto humana como de ratón están publicadas
(Freeman et al., 1989 J. Immunol. 8,
2714-2722) y los genes pueden clonarse fácilmente
por PCR.
Es de esta manera un aspecto opcional de la
presente invención que el método comprenda además la introducción de
una segunda secuencia de ácido nucleico al individuo que dirija la
expresión de un polipéptido inmunomodulador más con el fin de
regular la respuesta inmune al antígeno de una enfermedad. Esta
segunda secuencia de ácido nucleico puede estar comprendida en la
misma molécula de ácido nucleico como la primera secuencia de ácido
nucleico, o puede presentarse en una segunda molécula de ácido
nucleico.
Los métodos para introducir la construcción de
ácido nucleico en células vivas in vivo son bien conocidos
para los expertos en la materia. Preferiblemente, el ácido nucleico
se inyecta simplemente como ADN desnudo al paciente (típicamente de
manera intramuscular) como una mezcla con un diluyente
fisiológicamente aceptable, tal como una solución salina. Los
detalles de algunos métodos apropiados y realizaciones preferidas de
la administración de la construcción de ácido nucleico en el
paciente están descritos en las patentes US 5,580,859 y 5,589,466.
Más métodos implicados en la transferencia génica incluyen el uso de
vectores virales, el empaquetamiento de ADN dentro de liposomas, la
unión de ADN a liposomas catiónicos o al exterior de virus (para una
revisión ver Miller, 1992 Nature 357, 45-46).
Estas tienen la ventaja de haber aumentado la eficacia de la
transferencia pero, en comparación con la inyección directa de un
plásmido de ADN purificado, estas aproximaciones alternativas están
de alguna manera implicadas y desarrollan más aspectos de
seguridad.
En un cuarto aspecto la invención proporciona,
por lo tanto, una composición para usar en un método para inducir
una respuesta inmune en un paciente que sufre una enfermedad (de
acuerdo con el tercer aspecto de la invención definida más arriba),
comprendiendo la composición una construcción de ácido nucleico que
dirige la expresión de una proteína de fusión, dicha proteína de
fusión comprendiendo un antígeno de una enfermedad que comprende
epítopos característicos de dicha enfermedad y una secuencia de
cooperación de FrC procedente de la toxina del tétanos
(preferiblemente la secuencia de cooperación p30), junto con un
diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable. Preferiblemente, la
secuencia de cooperación del dominio de FrC está comprendida dentro
del primer dominio de FrC de manera que la proteína de fusión
comprenda el primer dominio de FrC unido al antígeno de una
enfermedad en cuestión. De hecho, se ha descubierto que el primer
dominio de FrC (que incluye la secuencia de cooperación p30) es
mucho más efectivo cuando está unido al antígeno de una enfermedad,
produciendo una respuesta de células T (especialmente células T
citotóxicas) que la secuencia de cooperación p30 sola.
Idealmente una vacuna debería ser capaz de
estimular células B específicas de antígeno, linfocitos T
citotóxicos (abreviado en inglés como CTL) y células T auxiliares
(en inglés "helper T cells"). La estimulación de células
B requiere que el antígeno diana debería de unirse con una afinidad
suficientemente alta a los receptores específicos de antígeno (Ig de
superficie) en la superficie de la célula B. Ciertos antígenos
polivalentes pueden estimular directamente la proliferación de
células B pero más frecuentemente, y para proporcionar una
respuesta anamnésica efectiva, existe la necesidad de señales
adicionales proporcionadas por las células T auxiliares (ver abajo).
En la presente invención, la célula T auxiliar es generada por la
expresión del antígeno de la enfermedad como una proteína de fusión
con la secuencia de cooperación, comprendida, preferiblemente,
dentro del primer dominio de FrC procedente de la toxina del
tétanos.
Los receptores de las células T (abreviado en
inglés como TCR) de los CTL reconocen los péptidos asociados al CMH
de clase I específico exhibidos en la superficie de la célula diana.
Tales péptidos se derivan generalmente del procesamiento de grandes
polipéptidos o proteínas fabricados dentro de la célula diana. Así,
para una estimulación eficaz de CTL el antígeno diana se debería
sintetizar o procesar intracelularmente en células que expresen CMH
de clase I capaces de activar CTL. El nivel de expresión debería ser
suficientemente alto para generar péptido suficiente para sustituir
los péptidos propios que normalmente están unidos (posiblemente con
mayor afinidad) en el surco de unión a péptido de CMH (Ohno, 1992
PNAS 89, 4643-4647). Parecido a las células
B específicas de antígeno, para una proliferación y capacidad
citotóxica elevadas, los CTL requieren señales adicionales (en la
forma de citoquinas) seguido del reconocimiento de antígeno y estos
son proporcionados por las células T auxiliares.
Las células T auxiliares CD4 positivas
interaccionan (mediante sus TCR únicos) con los péptidos asociados
al CMH de clase II específico de la superficie celular y dichos
péptidos se derivan generalmente del corte proteolítico de antígenos
proteicos internalizados por células presentadoras de antígeno (en
inglés abreviado como APC) especializadas. Los macrófagos, las
células dendríticas y los linfocitos B están entre las células que
pueden presentar antígeno de esta manera. Así, los linfocitos B
internalizan y procesan el antígeno unido a su Ig de superficie y a
continuación presentan los péptidos derivados asociados al CMH de
clase II (también pueden presentar a las de clase I). Las células T
auxiliares CD4 positivas que reconocen el péptido de superficie
puede entonces liberar varias citoquinas inmunomoduladoras y
estimular más la activación de otras células B, la proliferación y
la producción de anticuerpos. Asimismo, los macrófagos presentes en
el lugar de una respuesta inflamatoria local pueden procesar un
antígeno fagocitado y estimular la liberación de citoquinas por
parte de las células T auxiliares, conduciendo a un aumento de la
activación, proliferación y citotoxicidad de los CTL residentes
locales.
Idealmente el antígeno de la vacuna debería por
consiguiente 1) ser sintetizado intracelularmente por las células
hospedadoras positivas de CMH de clase I, 2) originar péptidos que,
cuando son exhibidos por el CMH de clase I de las células
hospedadoras pueden estimular un subconjunto de CTL hospedador
mediante sus TCR, 3) originar péptidos que, cuando son exhibidos por
el CMH de clase II de células hospedadoras, pueden estimular un
subconjunto de células T auxiliares hospedadoras mediante sus TCR,
4) ser internalizado y procesado por APC hospedadores incluyendo
tanto a macrófagos como a las células B específicas de antígeno, 5)
estar disponible en su forma nativa para su interacción con los
linfocitos B hospedadores.
Los aspectos y realizaciones de la presente
invención se ilustrarán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a
las figuras que se acompañan. Otros aspectos y realizaciones serán
evidentes para los expertos en la materia.
La figura 1 muestra la topología de FrC (Umland
T. C. et al, Nature Structural Biology, Vol. 4 No. 10 1997).
Esta figura muestra el extremo N-terminal o primer
dominio y el extremo C-terminal o segundo dominio de
FrC. La secuencia aminoacídica de cooperación se encuentra en las
posiciones aminoacídicas 947 a 967 en el primer dominio.
La figura 2 muestra un mapa detallado de un
plásmido pcDNA3 (Invitrogen).
La figura 3 muestra una representación
esquemática del método para producir un vector que comprende el
primer dominio de FrC y el antígeno de una enfermedad.
La figura 4 muestra la secuencia entera del
vector pVAC1.
La figura 5 muestra un mapa de restricción de
pVAC1.
La figura 6 muestra una representación
esquemática de las principales características de VAC1.
La figura 7 muestra un diagrama esquemático en
el que se indica el diseño de la vacuna de ADN. Se ensamblaron las
secuencias de la vacuna y se insertaron en el pcDNA3 utilizando las
dianas para los enzimas de restricción Hind III y Not I. Las
secuencias de ADN, incluyeron aquellas que codifican para los dos
dominios de longitud entera de FrC (1 y
2 ) o únicamente el dominio amino terminal
(1 ), p30 ( 3 ), BCL_{1} líder
(4 ), TT_{1287-1294} (péptido 1,
5 ), TT_{1162-1169} (péptido 2,
6 ) y CEA_{526-533}
(7 ). La secuencia que codifica para el epítopo T de
cooperación, p30, está en la secuencia p.DOM (1 );
los epítopos de CTL restringidos de H-2Kb,
TT_{1287-1294} (péptido 1) y
TT1162-1169 (péptido 2) están en el dominio segundo
(2 ).
La figura 8 muestra que las respuestas de CTL
inducidas por la vacunación con ADN que codifica para la secuencia
FrC de longitud completa (p.FrC) son específicas para dos octámeros
de unión de H2-K^{b}. Después de la vacunación con
p.FrC, los esplenocitos tomados en el día 14 fueron reestimulados
con cada uno de los 8 péptidos con una predicción de actividad de
unión de H-2K^{b} significativa. Sólo dos péptidos
indujeron una actividad de CTL medible cuando se determinó con un
ensayo de liberación de ^{51}Cr. a) Se detectó la actividad de CTL
contra las células EL4 cargadas con péptidos contra el péptido 1
(SNWYFNHL) y el péptido 2 (LNIYYRRL). Cada péptido se utilizó
recíprocamente como prueba o control. b). La actividad de unión a
H-2K^{b} mediante un estudio de estabilización
mostró que los péptidos 1 y 2 eran comparables al control positivo
de la proteína del virus Sendai (SEV), y claramente distinto del
péptido de unión H-2D^{b} control del virus de la
influenza (ASN).
La figura 9 muestra que reubicando los péptidos
1 ó 2 de la zona insertada en el segundo dominio al extremo
C-terminal al primer dominio de FrC se amplificaban
las respuestas CTL de antipéptido específico. Se llevó a cabo la
vacunación con ADN que codificaba para bien FrC de longitud completa
(p.FrC); o el primer dominio fusionado al péptido 1 ó 2 reubicado en
el extremo C-terminal
(p.DOM-péptido); o el epítopo de cooperación p30 de
FrC fusionado a la secuencia del péptido 1 ó 2
(p.p30-péptido); o el plásmido control sin inserción
(p.\phi). En el día 14, los esplenocitos se reestimularon con el
péptido 1 (izquierda) o el péptido 2 (derecha), antes de medir la
actividad de CTL mediante un ensayo de liberación de ^{51}Cr
utilizando células diana EL4 cargadas con los péptidos. La lisis de
las células diana cargadas con el péptido control fue insignificante
en cada caso (menos del 2.2%).
La figura 10 muestra la comparación de la
capacidad de las vacunas de ADN que contienen péptidos integrados o
reubicados para inducir a las células T CD8+ que contienen
IFN\gamma intracelular. Se llevó a cabo la vacunación con ADN que
codifica bien para FrC de longitud completa (p.FrC); o el primer
dominio fusionado a los péptidos 1 y 2 reubicados en el extremo
C-terminal (p.DOM-péptido); o el
epítopo de cooperación p30 fusionado a la secuencia del péptido 1 ó
2 (p.p30-péptido). En el día 14, los esplenocitos se
reestimularon con el péptido 1 o el péptido 2 como se ha mencionado,
y se indican los porcentajes de células T CD8+ que contienen
IFN\gamma. Las eficacias relativas de las construcciones fueron
análogas a la de los ensayos de liberación de ^{51}Cr.
La figura 11 muestra la capacidad de los CTL
inducidos por las vacunas de ADN que contienen las secuencias de
p.DOM-péptido para eliminar los transfectantes
diana. Después de la vacunación con p.DOM-péptido 1
(a y b) o con p.DOM-péptido 2 (c y d), se tomaron
esplenocitos en el día 14 y se reestimularon con péptido, durante 6
días in vitro, antes de determinar la actividad contra las
células diana marcadas con ^{51}Cr. Las células diana incluyeron:
células EL4 transfectadas sin secuencia líder FrC (\boxempty) o
con un vector vacío (\blacksquare); las células EL4 solas
(\ding{115}) o cargadas con péptido 1 (\Diamond) o péptido 2
(\medcirc).
La figura 12 a y b muestra una comparación de la
capacidad de las vacunas de ADN que contienen el péptido integrado o
reubicado para inducir inmunidad protectora al desafío con células
tumorales transfectadas de EL4-FrC. Se llevó a cabo
la vacunación con ADN que codificaba bien para FrC de longitud
completa (p.FrC); o el primer dominio fusionado a los péptidos 1 y 2
reubicados en el extremo C-terminal
(p.DOM-péptido); o el epítopo de cooperación p30
fusionado a la secuencia del péptido 1
(p.p30-péptido), en los días 0 y 21, utilizando 8
ratones por grupo. En el día 28, se inyectaron subcutáneamente
10^{5} células tumorales, y los ratones se sacrificaron cuando el
tumor alcanzó un tamaño de 1.5 cm de diámetro.
La figura 13 muestra la capacidad del diseño
p.DOM-péptido para inducir una respuesta de CTL
contra un péptido candidato procedente de un antígeno
carcinoembrionario (abreviado en inglés como CEA). La vacunación con
ADN que codifica para p.DOM con una secuencia que codifica para el
péptido EAQNTTYL de CEA fusionado al extremo
C-terminal. En el día 14, los esplenocitos se
reestimularon con péptido y se analizó: a) en un ensayo de
liberación de ^{51}Cr utilizando células EL4 diana cargadas con
péptido específico (\medbullet) o péptido control (\medcirc).
Los ratones vacunados sólo con p.DOM fueron también analizados para
observar las respuestas contra el péptido específico (A) o el
péptido control (\Delta). En b), se muestra un ensayo paralelo del
porcentaje de células T CD8+ que responden al IFN\gamma
intracelular.
La figura 14 muestra que la supresión de la
respuesta de CTL frente a un péptido candidato procedente del
antígeno carcinoembrionario (CEA) utilizando el diseño de dos
dominios FrC-péptido se supera utilizando el diseño
p.DOM-péptido. La vacunación con ADN que codifica
para (a) el primer dominio de FrC con una secuencia que codifica el
péptido EAQNTTYL de CEA fusionado al extremo
C-terminal
(p.DOM-CEA_{526-533}), (b) el ADN
que codifica para el primer dominio de FrC únicamente (p.DOM), (c,
d) el ADN que codifica para el FrC de longitud completa con la
secuencia que codifica para el péptido EAQNTTYL fusionado al extremo
C-terminal
(p.FrC-CEA_{526-533}. En el día
14, los esplenocitos se reestimularon con
CEA_{526-533} (a-c) o péptido 1
(d), durante 6 días in vitro, antes de determinar la
actividad de CTL con un ensayo de liberación de ^{51}Cr utilizando
células diana EL4 cargadas con el péptido
CEA_{526-533} (\ding{115}) o el péptido 1
(\blacksquare).
La figura 15 compara la capacidad del diseño en
dos dominios FrC-péptido y el diseño
p.DOM-péptido para inducir las células T CD8+ que
contienen IFN\gamma intracelular. La vacunación con ADN que
codifica para (a) el primer dominio de FrC con una secuencia que
codifica el péptido EAQNTTYL de CEA fusionado al extremo
C-terminal
(p.DOM-CEA_{526-533}), (b) el ADN
que codifica para el primer dominio de FrC únicamente (p.DOM), (c,
d) el ADN que codifica el FrC de longitud completa con la secuencia
que codifica para el péptido EAQNTTYL fusionado al extremo
C-terminal
(p.FrC-CEA_{526-533}). En el día
14, los esplenocitos se reestimularon con
CEA_{526-533} (a-c) o péptido 1
(d), durante 6 días in vitro, antes del análisis FACS: se
indican los porcentajes de células T CD8+ que contenían IFN\gamma
intracelular. Las eficacias relativas de las construcciones fueron
análogas a la de los ensayos de liberación de ^{51}Cr (Fig.
14).
La tabla 1 muestra las secuencias de los
cebadores de la PCR utilizadas para construir las vacunas de ADN
utilizadas en el trabajo experimental subyacente a la invención.
Las estrategias para activar la inmunidad contra
el cáncer están actualmente en continua investigación. La vacuna de
ADN ofrece una ruta relativamente sencilla entre la identificación
de cambios genéticos en células tumorales y la preparación de una
vacuna prueba. Sin embargo, la manera en la que la proteína
codificada consigue acceder a la maquinaria de la presentación del
antígeno y a la activación de una inmunidad efectiva no está
totalmente claras todavía. Las células musculares que han sido
inyectadas no parecen presentar el antígeno directamente a las
células T (1,2), pero posiblemente actúen como reservorio del
antígeno para una presentación indirecta. (2).
La transfección directa de las células
presentadoras de antígeno (en inglés abreviado como APC) puede tener
lugar desde la zona muscular (3), pero sólo a niveles muy bajos
(4,5). También está la cuestión de qué vía efectora será más
efectiva para atacar la célula tumoral, y esto depende obviamente de
la naturaleza del antígeno expresado.
Antes de esta invención, las vacunas de ADN se
estaban desarrollando para tratar la malignidad de las células B,
usando como antígeno diana los determinantes idiotípicos (Id) de la
Ig clonotípica, codificada por los genes de la región variable
V_{H} y V_{L} (6,7). Para el linfoma, el anticuerpo
anti-Id es efectivo matando células tumorales
(6,8,9), por lo tanto, la vacuna de ADN se diseñó para inducir
anticuerpos. Al principio, una vacuna que contenía los genes V_{H}
y V_{L} ensamblados como Fv de cadena sencilla (10) mostró ser
ineficiente para inducir anti-Id en modelos de ratón
(11). La fusión de un gen que codifica para el Fragmento C (FrC) de
la toxina del tétanos con la secuencia scFv condujo a una fuerte
promoción de la producción de anticuerpos, con protección frente al
desafío de un linfoma (12,13). Este diseño está siendo probado
actualmente en ensayos clínicos piloto con pacientes que presenten
un linfoma folicular de grado bajo. Ha sido un descubrimiento
general la necesidad de fusión de genes que codifican para proteínas
adicionales, como la proteína xenogeneica (14) o quimiocinas (15),
para provocar una respuesta inmune contra los antígenos Id. En el
presente caso, el hecho de que la fusión sea una necesidad
fundamental, con plásmidos separados sin un efecto de promoción
respaldó el concepto de que las células T específicas de FrC pueden
proporcionar ayuda a las células B que secretan
anti-Id(12). Curiosamente, sin embargo, el
mismo diseño Fvcs-FrC fue capaz de inducir una
inmunidad protectora contra una secreción de Ig, un modelo de
mieloma Ig-negativo de superficie, aparentemente
mediado por las células T efectoras (13) que es probablemente un
subconjunto de CD4+ (16).
Aunque este diseño puede ser adecuado para los
antígenos de superficie o secretados, muchos de los antígenos
tumorales candidatos son intracelulares, y se presentarán sólo como
péptidos asociados a moléculas CMH de clase I (revisión en 17). La
cuestión entonces, es si la fusión con la secuencia de FrC sería
necesaria o útil para la inducción de inmunidad mediada por CTL
contra los péptidos derivados de tumores candidatos. Los inventores
ya habían descubierto que FrC por sí mismo, cuando se introducía
como vacuna de ADN, era capaz de inducir una respuesta de CTL, y se
había identificado un péptido restringido a
H2-K^{b} en la posición 1287-94 de
la secuencia FrC (13,18). El fenómeno de la inmunodominancia, donde
las células T CD8+ se centran sólo en uno o unos pocos motivos
peptídicos, es claramente evidente en respuestas a infecciones
víricas (19). De hecho, la inmunodominancia se ha descrito como una
característica central de las respuestas de las células T CD8+
(revisión en 20). Si éste es el caso para vacunas de ADN, se
debatiría en contra de fusionar la secuencia de FrC potencialmente
competitiva con la secuencia peptídica tumoral.
FrC está compuesto por dos dominios, un dominio
N-terminal con estructura de tipo Jelly Roll
y un segundo dominio de trébol-\beta (21). El
primer dominio contiene un epítopo de cooperación "universal"
bien descrito, p30 (22,23), que se une a un rango de alelos del CMH
de clase II en humanos y ratones y es reconocido por las células T
CD4+ (24). Anteriormente, los inventores identificaron un epítopo
implicado en la inducción de células T CD8+ en el segundo dominio
(18). Han identificado un epítopo más con una capacidad parecida
para inducir respuestas de células T CD8+, también en este dominio.
Los inventores han investigado ahora dos factores que pueden ser
importantes para la inducción de repuestas de CTL contra epítopos
candidatos presentados mediante ADN: primero la posición del
epítopo peptídico en la secuencia de ADN; segundo el papel del
dominio que contiene el epítopo de cooperación en la potenciación de
la actividad de CTL.
Para determinar la importancia de los CTL
inducidos para atacar células cancerosas, los inventores han
transfectado células EL-4 con FrC de longitud
completa, donde los péptidos procesados pueden actuar como antígenos
diana sustitutivos. Para acercarse más al cáncer, los inventores
también han demostrado que una vacuna de diseño parecido, que
incorpore un epítopo conocido de un antígeno carcinoembrionario,
induce niveles elevados de CTL específicos. Utilizando este modelo,
se confirmó la necesidad de eliminar los epítopos que compiten
potencialmente con la secuencia de FrC adyuvante.
Se ensambló una secuencia de ácido nucleico que
comprendía una primera parte que codifica el primer dominio de FrC y
una segunda parte que codifica para un péptido conocido que induce
las respuestas de células T citotóxicas. En este ejemplo particular,
el péptido está contenido dentro del segundo dominio de FrC. Sin
embargo, esto es representativo de un péptido que comprende motivos
de células T citotóxicas.
El ensamblaje de la construcción de ácido
nucleico se lleva a cabo según se indica en la Fig. 3 utilizando un
esqueleto de un plásmido como el pcDNA3 (Invitrogen7) (Fig. 3). En
resumen, el plásmido de partida comprende el FrC entero y una
secuencia líder (FrC + L). La secuencia líder 5' se deriva de un
tumor (BCL1). Este plásmido de partida se llama pFrC+L.
Los cebadores se utilizan, a continuación, para
aislar el primer dominio de FrC (\DeltaFrC) como se muestra en la
parte 2 de la Fig. 3. El producto de PCR, a continuación, se lava,
se digiere para eliminar la secuencia nucleica no deseada, por
ejemplo la introducida por los cebadores, y se vuelve a clonar en
pcDNA3 utilizando puntos Hind III y NotI. El plásmido resultante
contiene así el primer dominio de FrC fusionado, únicamente, a una
secuencia líder (BCL1), con un codón de parada añadido al final de
este primer dominio de FrC.
Para introducir un antígeno de una enfermedad en
un plásmido, se utiliza un cebador inverso al extremo 3' de
\DeltaFrC que también codifica para el antígeno de una enfermedad
en cuestión, con el fin de añadir esta secuencia a la secuencia
\DeltaFrC. Esto se muestra en el diagrama de la parte 3 de la Fig.
3.
Para antígenos de una enfermedad que están
contenidos en secuencias peptídicas más largas, se utiliza la
técnica de PCR de empalme por extensiones de solapamiento (en inglés
"PCR splycing by overlap extension", abreviado en inglés como
PCR Soeing) con cebadores que se solapen.
Las figuras 2 y de la 4 a la 6 muestran detalles
de los vectores pcDNA3 y pVAC1 que son ejemplos del tipo de vectores
que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para
llevar a cabo la construcción de ácido nucleico. Los presentes
inventores han descubierto que es preferible sustituir el RSVLTR con
una secuencia promotora procedente de citomegalovirus (pCMV).
Se buscó la secuencia de aminoácidos por motivos
peptídicos de 8 aminoácidos con potencial para unirse a
H2-K^{b} o H2-D^{b} (31).
Utilizando un algoritmo para asignar una puntuación basada en el
tiempo medio estimado de disociación de una molécula que contuviera
esta secuencia (31), se identificaron y se sintetizaron 8 péptidos
con valores >13 para la unión a H2-K^{b}. Las
20 mejores secuencias de unión predichas dieron valores en el rango
de 86.4 a 1.32. Los epítopos inmunodominantes de CTL restringidos a
K^{b} dieron puntuaciones entre 132 (RGYVYQGL) y 17 (SIINFEKL). La
nucleoproteína del virus Sendai de unión a K^{b} derivada de la
secuencia FAGNYPAL (SEV) dio una puntuación de 60, mientras un
control, el epítopo restringido a D^{b} (ASNENMDAM) puntuó 1. No
se analizaron las secuencias de FrC con puntuaciones <8,
incluyendo el único candidato de unión a
H2-D^{b}.
Los ratones se vacunaron, a continuación, con
una vacuna de ADN que contenía el gen que codificaba para todo el
FrC de longitud completa (p.FrC). En el día 14 después de una
vacunación, se pudieron detectar utilizando 2 de los 8 péptidos las
respuestas de CTL contra las células EL4 cargadas con péptido
después de una reestimulación in vitro (Fig. 8a). Infecciones
o reestimulaciones adicionales in vitro, fallaron al promover
respuestas de CTL a los 6 péptidos candidatos que quedaban. Los dos
péptidos positivos, los cuales han sido denominados por los
inventores péptido 1 y péptido 2, procedían del segundo dominio de
FrC, situado en las posiciones 1287-94 y
1162-69 respectivamente.
El resto de péptidos fueron incapaces de
estimular una actividad de CTL detectable. Sorprendentemente, de los
dos péptidos inmunoestimuladores, el péptido 1 (SNWYFNHL) tenía la
puntuación más baja (13.2) y el péptido 2 (LNIYYRRL) se situó en
tercera posición, con una puntuación de 26.4. En un análisis de
unión in vitro, tanto el péptido 1 como el péptido 2 fueron
capaces de unir H2-K^{b} igualmente bien, y no
significativamente diferentes del péptido control positivo SEV (Fig.
8b). Así, aunque el algoritmo predictivo fuera acertado al
identificar ambas secuencias inmunoestimuladoras, puede que hubiera
una correspondencia pobre entre la unión predicha y la capacidad
actual de unirse a la clase I y estimular una respuesta de CTL como
se ha mencionado antes.
Los péptidos 1 y 2 fueron capaces de inducir
respuestas de CTL después de la vacunación con la secuencia de FrC
de longitud completa, pero la respuesta fue relativamente débil,
siendo necesarias dos reestimulaciones para la producción de niveles
elevados de liberación de ^{51}Cr. Los inventores utilizaron estos
péptidos como modelos para mejorar la actividad inmunogénica
mediante la introducción de ADN, ya que los antígenos tumorales
pueden tener también baja inmunogenicidad. Investigaron primero el
efecto de suprimir las secuencias peptídicas del esqueleto de FrC y
reubicarlas en el extremo C-terminal del primer
dominio (p.DOM). Una única inyección intramuscular con
p.DOM-péptido 1 o con p.DOM-péptido
2 generó niveles altos y rápidos de respuestas de CTL detectables
después de una estimulación in vitro. La comparación con la
vacuna que contenía el p.FrC original se muestra en la Fig. 9 y se
obtuvieron resultados similares en múltiples experimentos.
La actividad citolítica fue análoga por los
niveles encontrados de IFN\gamma intracelular en la población de
células T CD8+ (Fig. 10a y b), con las vacunas de
p.DOM-péptido que inducían regularmente el
incremento de 2-3 veces en los porcentajes de
células CD8+ que expresaban IFN\gamma, tras compararse con la
vacuna p.FrC. Los CTL fueron también capaces de lisar las células
EL4 transfectadas con p.FrC no líder (Fig. 11), siendo más eficaces
aquellos específicos para el péptido 1. Esto indica que los CTL
inducidos por el péptido 1 son más capaces de matar transfectantes
diana que aquellos inducidos por el péptido 2. Actualmente, no está
clara la razón de esto pero puede significar que no todos los
péptidos candidatos son útiles como dianas.
Aunque sólo se observaron niveles bajos de lisis
específica para los CTL contra el péptido 2, estos fueron
consistentes en experimentos repetidos. Por el contrario, no se
observó ninguna lisis significativa de células EL4 transfectadas con
un vector vacío. La adición de un péptido a células diana
incrementaba claramente la lisis específica, indicando que el
transfectante era capaz de procesar y presentar únicamente niveles
de ambos péptidos por la ruta endógena (Fig. 11). Sin embargo, los
niveles de expresión fueron suficientes para CTL efectores
específicos del péptido 1 ó 2 para atacar el transfectante in
vivo (ver abajo).
El dominio 1 contiene un péptido
"universal" identificado en la posición 947-967
que puede ser reconocido por las células T humanas o por las células
T de ratón (33) asociadas a un gran número de moléculas del CMH de
clase II. Puesto que esto puede ser un aspecto crítico de p.DOM para
el suministro de ayuda de células T (34), los inventores
investigaron su papel en la inducción de CTL. Compararon la
capacidad de una vacuna de ADN que contiene sólo la secuencia p30
unida a cada una de las secuencias peptídicas de CTL con la de
vacunas de p.DOM-péptido. La Fig. 9 muestra que
p.p30-péptido 1 inducía muy poco una respuesta de
CTL; p.p30-péptido 2 fue más efectivo, pero se
realizó considerablemente no tan bien como
p.DOM-péptido 2, y de hecho este fue menos efectivo
que la vacuna original con p.FrC. Comparando los números de células
T CD8+ que producían IFN\gamma intracelular se observó la misma
tendencia (Fig. 10C). La vacunación y las reestimulaciones repetidas
con vacunas de p.p30-péptido podrían generar CTL
(datos no presentados) que confirmaran la integridad de las
construcciones, pero indicando su inferior ejecución. La conclusión
es que p.DOM contiene información de secuencias adicionales
necesaria para la inducción de una respuesta de CTL eficaz contra
los péptidos adjuntos.
Los inventores investigaron, a continuación, si
el efecto adyuvante de p.DOM en la inducción de CTL mediante la
introducción de ADN era o no aparente cuando se administraba con
péptidos sintéticos. El péptido 1 se mezcló con p.DOM y se inyectó
en el músculo.
Sin embargo, no se indujo ninguna actividad de
CTL, ni siquiera después de tres inyecciones en los días 0, 21 y 42
y hasta 4 reestimulaciones semanales in vitro (datos no
presentados). Parece que la fusión de p.DOM a la secuencia peptídica
es necesaria, bien para la introducción en la misma célula, o para
asegurar la coincidencia de la síntesis del primer dominio y la
presencia del péptido.
La vacunación en el día 0 y el día 21 con
p.DOM-péptido 1 llevó a una protección significativa
frente a la infección con el transfectante EL4-FrC
en el día 28 (Fig. 12) sin afectar el crecimiento de las células EL4
transfectadas con un vector vacío (pcDNA3) (datos no presentados).
En este momento, relativamente temprano del desafío (en inglés
"challenge") (día 28), el plásmido con
p.DOM-péptido 1 fue superior al plásmido con p.FrC
de longitud completa, de acuerdo con la inducción rápida de CTL. Sin
embargo, aunque la vacuna de p. FrC fracasó al no generar CTL
suficiente el día 14 para matar los transfectantes in vitro
después de una reestimulación, fue evidente algo de protección
(Fig. 12), probablemente debido a la expansión de CTL en la segunda
inyección. Los CTL capaces de tanto matar al transfectante in
vitro como de proteger contra la infección podrían ser inducidos
por el p.FrC de 2 dominios después de una tercera inyección de
vacuna (datos no presentados). La vacunación con los plásmidos que
contenían sólo el epítopo de cooperación p30 fusionado a la
secuencia del péptido 1 ó 2 fue totalmente ineficaz ofreciendo
protección (Fig. 12), tal y como se esperaba a partir de la escasa
capacidad para inducir CTL (datos no presentados). Los experimentos
de depleción (en inglés "depletion") mostraron que toda
la protección se aportó por la depleción de células T CD8+ (datos no
presentados). La depleción de las células T CD4+ no pudo llevarse a
cabo debido a la expresión de CD4 por parte de las células EL4.
Estos resultados indican que los CTL inducidos por el péptido 1
reubicado contribuyen a la protección contra el tumor.
Para determinar la capacidad del diseño de
p.DOM-péptido para inducir CTL contra un antígeno
asociado a un tumor candidato, se escogió un péptido derivado de un
antígeno carcinoembrionario (CEA). Es conocido que el péptido
EAQNTTYL actúa como diana para los CTL inducidos por la vacunación
de ratones B6 con el virus de la vacuna recombinante (35). La
secuencia codificante se colocó en el extremo 3' del primer dominio
para hacer la vacuna de p.DOM-péptido CEA. Éste se
inyectó en los ratones y la actividad de CTL se midió en el día 14
después de una reestimulación in vitro. Se indujo un nivel
elevado de actividad CTL (Fig. 13a) con \sim20% de células T CD8+
que contenían IFN\gamma (Fig. 13b). El plásmido control p.DOM
produjo un nivel bajo de actividad de CTL y un poco (2.4%) de
células T CD8+ positivas que contienen IFN\gamma (Fig. 13b).
El modelo CEA se utilizó para investigar la
suposición de que los epítopos en el segundo dominio de FrC
competirían con los epítopos unidos derivados de tumores adjuntos.
La secuencia del péptido CEA se colocó en el extremo carboxilo de la
secuencia de FrC de 2 dominios (longitud completa) para producir
p.FrC-CEA_{526-533} (Fig. 7). La
capacidad de esta construcción de inducir CTL específicos de CEA fue
entonces comparada con el diseño
p.DOM-CEA_{526-533} de un solo
dominio, utilizando una inyección y una reestimulación in
vitro. En experimentos repetidos, la vacuna de un solo dominio
indujo niveles de 2-3 veces superiores de actividad
de CTL contra el epítopo CEA (Fig. 14a) en comparación con la
construcción que contenía el FrC de 2 dominios
(p.FrC-CEA_{526-533}) (Fig. 14c).
Sin embargo, la construcción de 2 dominios fue capaz de inducir
niveles elevados de actividad CTL contra el péptido 1 de FrC (Fig.
14d). Esto sugiere totalmente que la inclusión de epítopos
potencialmente competitivos dentro del segundo dominio de FrC
conduce a la supresión de la inducción de la actividad de CTL
específica de CEA.
La actividad citolítica contra el péptido CEA
fue análoga a los niveles de IFN\gamma intracelular encontrados en
la poblaciones de células T CD8+, con la vacuna
p.DOM-CEA_{526-533} induciendo
niveles de 2-3 veces superiores de células positivas
con IFN\gamma, en comparación con la vacuna de 2 dominios (Figs.
15a y 15c). Como era de esperar, la inducción de altos niveles de
actividad de CTL contra el péptido 1 del segundo dominio de FrC se
reflejó en lo sucedido por los altos niveles de células T CD8+
positivas que contenían IFN\gamma (Fig. 15d). La vacuna control
con p.DOM produjo actividad
CTL insignificante (Fig. 14b) y niveles muy bajos de células T CD8+ positivas que contenían IFN\gamma (Fig. 15b).
CTL insignificante (Fig. 14b) y niveles muy bajos de células T CD8+ positivas que contenían IFN\gamma (Fig. 15b).
Estos resultados confirman la ventaja anticipada
de eliminar el segundo dominio de FrC bajo inducción de la respuesta
al epítopo de CEA, y sugiere que el diseño de
p.DOM-péptido puede tener una aplicación general
para antígenos tumorales.
Una vacunación exitosa contra el cáncer es
probable que requiera de la activación de múltiples vías de la
inmunidad, incluyendo a los CTL. Aunque las vacunas de ADN son
eficaces en la inducción de respuestas de CTL (36), los antígenos
tumorales son frecuentemente débiles (12), y puede tener lugar la
eliminación de las células T CD8+ con elevada afinidad (37). Para
generar CTL, los péptidos candidatos deberían ser procesados y
presentados eficazmente por las APC, en ausencia preferiblemente de
péptidos competidores que pudieran anular la respuesta (revisado en
20). Los inventores han investigado las respuestas de CTL contra la
secuencia de FrC de la toxina del tétanos, en primer lugar por su
interés en utilizar FrC como secuencia adyuvante "extraña"
para activar la inmunidad contra la secuencia Fvcs adjunta.
(12).
Utilizando sus vacunas de
scFv-FrC contra un linfoma y mieloma de células B de
ratón, se promueve una inmunidad anti-Id protectora,
que implica anticuerpos y células T CD4+ respectivamente (13). No se
detectaron las respuestas de LCTs a scFv, debido posiblemente a una
falta de motivos de unión a CMH de clase I en los genes V. Sin
embargo, se indujeron CTL contra dos motivos peptídicos en el
segundo dominio de FrC (13, 18). Si bien las respuestas eran
relativamente débiles, tenían el potencial de competir con los
motivos de CTL procedentes de secuencias tumorales adjuntas (38).
Con el fin de investigar el potencial adyuvante de la secuencia de
FrC para inducir CTL contra los péptidos candidatos, los inventores
eliminaron el segundo dominio, dejando el primer dominio para
proporcionar ayuda a las células T mediante el péptido
"universal" p30 (24, 34).
La intervención del primer dominio (p.DOM) como
adyuvante se determinó entonces utilizando los dos motivos
peptídicos procedentes del segundo dominio descartado. La
reubicación de p.DOM en el extremo C-terminal
condujo a un espectacular incremento de CTL contra cada péptido. Los
inventores encontraron anteriormente que se inducen más eficazmente
los CTL contra FrC si está presente la secuencia líder (18), y
consecuentemente han incluido la líder en todas las construcciones
descritas. La inclusión de una secuencia líder debería asegurar que
todas las construcciones más largas de aproximadamente 60
aminoácidos sean transportadas co-traduccionalmente
al RE. El efecto de la reubicación podría reflejar entonces la
"regla del extremo C-terminal" a través de la
cual los péptidos antigénicos son producidos preferentemente a
partir del extremo C-terminal de péptidos
precursores o proteínas en la zona del RE (39). Esto podría también
ser relevante para la transferencia indirecta de péptidos desde el
músculo a las APC mediante proteínas de choque térmico como la gp96
o calreticulina, que normalmente residen en el RE (40).
La segunda investigación fue evaluar la
contribución de p.DOM a la inducción de CTL contra la secuencia
peptídica adjunta. En un sistema modelo, una vacuna de ADN que
codifica para el epítopo restringido a K^{b} de OVA (SIINFEKL),
fusionado a la secuencia peptídica de cooperación restringida a
I-A^{B} adyacente fue capaz de inducir CTL (34).
Esto indica que un epítopo de cooperación y un epítopo de CTL
podrían ser los únicos requerimientos. En este caso particular, este
diseño fue insuficiente, ya que un gen de fusión que codificaba para
la secuencia del péptido de cooperación "universal" unido a
cualquiera de los epítopos generados, generó únicamente bajos
niveles de actividad de CTL. Esto puede ser debido a la relativa
debilidad de los péptidos derivados de FrC, tras compararse con el
péptido OVA, pero esto podría indicar un problema para los antígenos
tumorales. Otra posibilidad relaciona la importante contribución de
la secuencia líder a la potencia inmunológica de estas vacunas de
ADN. La administración de construcciones más cortas al RE puede ser
pobre ya que estas dependerán del transporte
post-traduccional, más que del transporte
co-traduccional (41) que es menos eficaz y puede
además originar una estimulación menos eficaz. Es probable sin
embargo, que las secuencias adicionales en p.DOM bien proporcionen
ayuda de las células T, o contribuyan a la presentación del péptido
por otros mecanismos. Una posibilidad es que el dominio de 25kD
aumente el nivel de péptidos adjuntos protegiéndolo de la
degradación en el citosol. Otra posibilidad es que la presencia de
algún dominio de FrC plegado erróneamente en el RE pueda influir en
la carga de los péptidos adjuntos en las proteínas de choque térmico
durante una estimulación cruzada.
El descubrimiento de que
p.DOM-péptido 1 activa una rápida inmunidad
protectora mediada por células T CD8+ contra los tumores de
EL4-FrC y parece más eficiente que la vacuna que
contiene el FrC de longitud completa (p.FrC), indica dos aspectos de
relevancia para la terapia del cáncer. El primero es que la
reubicación puede aumentar la eficacia de una vacuna dirigida a
inducir CTL específicos de péptido. Obviamente el péptido elegido
debe también ser presentado por una célula tumoral, pero los niveles
requeridos para el reconocimiento de la célula efectora pueden ser
bajos (20). El segundo es que p.DOM puede proporcionar señales de
activación necesarias para las vacunas de ADN contra antígenos
peptídicos débiles. Sorprendentemente, 4/6 de los motivos de unión
HLA-A2 candidatos están también en el segundo
dominio de FrC, y estudios recientes han demostrado que los niveles
funcionales más altos están también en esa secuencia (observaciones
no publicadas). Los datos de los inventores que utilizan la
secuencia peptídica conocida derivada de CEA, indican que el diseño
p.DOM-péptido puede ser aplicable a otros antígenos
cancerosos. Utilizando este modelo, fue también posible demostrar la
ventaja de eliminar el segundo dominio de FrC, ya que los epítopos
potencialmente competitivos dentro de este dominio eran capaces de
suprimir la inducción de CTL específicos de CEA. Este descubrimiento
confirma el principio detrás del diseño. El hecho de que el primer
péptido candidato procedente de CEA genere un rápido y elevado nivel
de CTL a partir de este formato es prometedor y los resultados
muestran que la estrategia con p.DOM tiene importancia en las
vacunas humanas.
Se ha descrito la construcción de la vacuna de
ADN (p.FrC) que contiene el gen que codifica para la secuencia de
longitud completa de 2 dominios (aminoácidos
865-1316 de la toxina del tétanos
(TT_{865-1316})), con una secuencia líder derivada
de V_{H} de la IgM del tumor BCL1 (25,26). La vacuna de ADN que
contiene el gen que codifica para el primer dominio (21) (p.DOM) se
construyó mediante amplificación por PCR de la secuencia del dominio
amino terminal (TT_{865-1120}) procedente de
p.FrC utilizando cebadores directos (en inglés
"forward") e inversos FrCf1 y FrCr1 respectivamente
(Tabla 1), antes de clonarla en pcDNA3. Este plásmido se utilizó, a
continuación, como plantilla para la construcción de tres vacunas
parecidas, cada una incluyendo el primer dominio pero con una
secuencia del epítopo de CTL distinta fusionada al extremo carboxilo
terminal. El ensamblaje de p.DOM-péptido 1, que
codifica para el péptido TT_{1287-1294};
p.DOM-péptido 2, que codifica para el péptido
TT_{1162-1169}; o p.DOM-CEA, que
codifica para el péptido CEA_{526-533}, fue
idéntico al de p.DOM sólo, excepto en que se utilizó un cebador
inverso diferente en cada caso (FrCr2, FrCr3 y FrCr4
respectivamente) que se solapaba con la secuencia carboxílica p.DOM
e incorporó la secuencia del epítopo de CTL de interés. La vacuna
de ADN p.FrC-CEA_{526-533} se
construyó mediante amplificación por PCR de la secuencia completa de
FrC utilizando un cebador directo FGf1 junto con el cebador FCr5 el
cual se solapa a la secuencia 3' de FrC y que codifica para el
epítopo de CTL CEA (CEA_{526-533}), fusionándolo
al extremo carboxilo terminal de FrC. El producto de la PCR fue
entonces clonado en pcDNA3.
p.30-péptido 1 se ensambló
uniendo la secuencia de ADN que codifica para el epítopo de CTL
TT1287-1294 a la que codifica para un epítopo de
cooperación T "universal", p30 (TT947-967),
localizado en el primer dominio de FrC (24). Se utilizó un proceso
de ensamblaje por PCR de 3 etapas: primero, se amplificó la
secuencia líder BCL_{1} a partir de p.FrC utilizando el cebador
directo PCMVf1, junto con el cebador inverso BCL_{1}r1 que
contenía la secuencia de solapamiento de p30. Segundo, se amplificó
p30 a partir de p.FrC con el cebador directo p30f1 y el cebador
inverso p30r1 que contenía una protuberancia (en inglés
"overhang") que codificaba para el epítopo de CTL
TT_{1287-1294}. Tercero, estos dos productos de
PCR purificados en gel se combinaron y se ensamblaron mediante PCR
Soeing. La vacuna p.p30-péptido 2 se
construyó de manera similar utilizando el cebador inverso p30r2 que
contenía una protuberancia que codificaba para el epítopo de CTL
TT_{1162-1169}. Todos los productos de PCR de la
vacuna ensamblados se ligaron en el vector de expresión pcDNA3
(Invitrogen Corp., San Diego, CA) utilizando los puntos de
restricción Hind III y Not I. Las secuencias de los cebadores se
muestran en la Tabla 1.
Las estructuras de las vacunas de ADN se indican
en la Fig. 7. La integridad de todas las construcciones se confirmó
mediante secuenciación de ADN. La expresión y el tamaño se
comprobaron in vitro utilizando el TNT^{R}T7 Coupled
Reticulocyte Lysate System (Promega Corp., Madison, WI). La
expresión en células de mamífero se analizó transfectando células
COS y midiendo mediante ELISA las proteínas que contenían el FrC en
el sobrenadante
(12).
(12).
Los péptidos del Fragmento C (FrC) se
sintetizaron en casa con un sintetizador de péptido PSSM8 Shimadzu
utilizando química Fmoc, y se comprobó la pureza mediante HPLC.
Las concentraciones se midieron mediante un
ensayo colorimétrico (BCA; Pierce, Rockford, IL). Las coordenadas
para las secuencias de los epítopos de CTL FrC restringidas a
H-2^{b} TT_{1287-1294}
(SNWYFNHL:péptido 1) y TT_{1162-1169}
(LNIYYRRL:péptido 2) corresponden a la secuencia completa de la
Toxina del Tétanos (TT). Se ha descrito previamente el péptido
ACE_{526-533} (EAQNTTYL) (27,28). Se sintetizó
comercialmente y se suministró con una pureza >95% (Peptide
Protein Research Ltd., Southampton, UK).
La unión de cada péptido a
H2-K^{b} se elaboró utilizando el ensayo de
ensamblaje según se ha descrito (29). Este ensayo está basado en la
observación de que en un lisado con detergente de células
RMA-S, las moléculas K^{b} son inestables y se
disocian después de incubar durante toda la noche a 4ºC a no ser que
se añada un péptido estabilizador (que se une a K^{b}) en el
momento de la lisis. Únicamente las moléculas K^{b} estabilizadas
pueden recuperarse además mediante inmunoprecipitación con mAb Y3
después de incubar durante toda la noche. La cantidad de K^{b}
recuperada es directamente proporcional a la cantidad de péptido
unido, y la concentración de péptido requerida para provocar una
recuperación máxima del 50% representa una afinidad de unión
aproximada (29). La recuperación de las cadenas pesadas
H2-K^{b} (HC) se cuantificó después de la
inmunoprecipitación y SDS PAGE utilizando AIDA
(Fuji).
(Fuji).
Los ratones C57BL/6, criados en nuestro
laboratorio, fueron vacunados a las 6-10 semanas de
edad con 50 \mug de ADN en solución salina normal inyectado en dos
sitios del músculo cuadriceps. Para analizar las respuestas de CTL,
los ratones se sacrificaros en el día 14. Se recogieron los bazos de
los ratones vacunados y se prepararon las suspensiones celulares con
un medio RPMI suplementado con un 10% de FCS inactivado térmicamente
(Life Technologies, Paisley, UK), piruvato sódico 1 mM,
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales (1% del
stock X100), tampón HEPES 25 mM y 2-mercaptoetanol
50 \muM. Los esplenocitos se resuspendieron en 40ml de medio, a
3x10^{6} células/ml, y se añadieron a matraces de 80 cm^{2}
junto con IL-2 recombinante humana (20 U/ml,
Perkin-Elmer, Foster City, CA) y péptido
(5-20 \muM). Los cultivos de células T se
reestimularon 7 días más tarde en 24 pocillos. Las células T
(5x10^{5}/pocillo) se mezclaron con esplenocitos
"alimentadores" singeneicos irradiados (5x10^{6}/pocillo),
junto con rIL-2 (20 U/ml) y péptido
(5-20 \muM). Se analizó la actividad citolítica de
los cultivos de células T 6 días después de una estimulación in
vitro estándar mediante ensayos de liberación de ^{51}Cr de
4-5 horas, como se ha descrito previamente (18).
Para los experimentos indicados, tuvo lugar otra estimulación in
vitro. Las células diana eran células EL4 (ATCC; TIB 39)
incubadas con un péptido de prueba o péptido control, células EL4
solamente o células EL4 transfectadas (ver abajo). Se calculó la
lisis específica con la fórmula estándar ([liberación por
CTL-liberación por dianas solas]/[liberación por el
4% de NP40 - liberación por dianas solas] x 100%). La liberación
espontánea por las dianas solas fue siempre inferior al 20% de la
liberación por el 4% de NP40.
Las células viables se seleccionaron por
centrifugación de densidad (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo,
Noruega). Se incubaron las células T durante 4 horas a 37ºC en
placas de 96U pocillos, con 5x10^{5} células/pocillo, junto con
10U/pocillo de rIL-2, 1 \muM de péptido y 1
\muM/pocillo de golgiplug (PharMingen). Las células se
bloquearon con suero de ratón descomplementado al 2% (15 minutos,
4ºC) antes de marcarlas con 1 \mug/pozuelo de CD8b.2
anti-ratón conjugado a FITC (Ly-3.2,
clon 53-5.8, PharMingen) o un control de isotipo (20
minutos, 4ºC). Tras el marcaje de superficie, las células se fijaron
con formaldehído al 1% (20 minutos, 4ºC) y luego se permeabilizaron
con 0.5% de saponina (10 minutos, 4ºC) antes del marcaje
intracelular con 0.5 \mug/pozuelo de IFN\gamma de rata
anti-ratón marcada con PE (clon XMG1.2, PharMingen)
durante 20 minutos a 4ºC. Después de un lavado final las células se
resuspendieron en PBS y se analizaron inmediatamente con
FACScalibur utilizando un software CELLQUEST (Becton
Dickinson).
Dickinson).
Los inventores han generado un modelo tumoral
que consiste en células tumorales de EL4 en las que se ha
transfectado un plásmido que codifica para una forma no secretada
(no líder) de FrC (18).Brevemente, 2x10^{6} células, en 400 \muL
de medio fueron mezcladas con 10 \mug de ADN plasmídico y se
electroporó a 300V, 975 \muF (Gene Pulser Cuvette, hueco del
electrodo de 0.4 cm, Biorad). Las células crecieron en presencia de
un antibiótico selectivo (Geneticina, 2 mg/ml, Life Technologies
Ltd.) y, después de la restauración de una población estable, se
clonaron y se analizó la susceptibilidad a lisis con CTL específicos
de FrC. Esto condujo a la generación de la línea celular
tumoral
EL4-FrC.
EL4-FrC.
Los ratones C57BL/6 fueron desafiados con una
inyección subcutánea de 1x10^{5} de transfectantes
EL4-FrC o células transfectadas EL4 con un vector
vacío (pcDNA3) en el lado derecho. Los ratones se sacrificaron
cuando el tumor resultante alcanzó 1.5 cm de diámetro, de acuerdo
con las Human Endpoints Guidelines (UK Coordinating Committee
for Cancer Research, Londres, UK), y se registró el día de la
muerte. Los experimentos de depleción celular se elaboraron in
vivo con una inyección intraperitoneal de 100 \mug de Ig (CD8
de rata anti-ratón, YTS 169.4.2.1, cortésmente
proporcionado por Dr. S. Cobbold (30), o un isotipo control), cada
2-3 días durante 14 días, empezando una semana antes
de la administración del tumor.
El trabajo experimental descrito aquí ha sido
elaborado también en otra línea de ratones (Balb/C), con los mismos
resultados.
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Claims (19)
1. Una construcción de ácido nucleico para
introducirse en células vivas in vivo, para inducir una
respuesta inmune en un paciente frente a un antígeno peptídico de
una enfermedad; la construcción que dirigiendo la expresión de una
proteína de fusión que consiste en el antígeno peptídico de una
enfermedad y el dominio N-terminal del fragmento C
(FrC) de la toxina del tétanos.
2. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 1, en la que el antígeno peptídico de la
enfermedad es un antígeno tumoral.
3. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que el antígeno
peptídico de la enfermedad es un determinante idiotípico.
4. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 3, en la que el determinante idiotípico es un
fragmento variable de cadena sencilla (fragmento scFv).
5. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el
antígeno peptídico de la enfermedad tiene entre 5 y 30
aminoácidos.
6. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 5, en la que dicho antígeno peptídico de la
enfermedad tiene entre 8 y 25 aminoácidos.
7. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la
proteína de fusión está unida a una secuencia líder que es capaz de
dirigir la proteína de fusión al retículo endoplasmático.
8. Un vector de expresión de ácido nucleico que
comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Una célula hospedadora que comprende un
vector de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 8 o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una vacuna de ácido nucleico para inducir
una respuesta inmune en un paciente que comprende una construcción
de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7 o un vector de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 8.
11. Un método de producción de una construcción
de ácido nucleico para inducir una respuesta en un paciente,
comprendiendo dicho método
- (a)
- identificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un antígeno peptídico de una enfermedad;
- (b)
- clonar la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno peptídico de la enfermedad; y
- (c)
- introducir el ácido nucleico en un vector, permitiendo el vector que el antígeno peptídico de la enfermedad se exprese como una fusión con el dominio primero de FrC procedente de la toxina del tétanos.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el vector comprende además una secuencia líder para la
asociación con la proteína de fusión.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
11 o la reivindicación 12 que además comprende la etapa de aislar
una construcción de ácido nucleico del vector, dicha construcción de
ácido nucleico dirigiendo la expresión de la proteína de fusión que
consiste en el primer dominio de FrC procedente de la toxina del
tétanos y el antígeno peptídico de una enfermedad.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13 que además comprende la etapa de preparar una composición de una
vacuna que comprende la construcción de ácido nucleico.
15. Uso de una construcción de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un vector de
expresión de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 en la
preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en
un paciente.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en
el que el medicamento está formulado para la administración
directamente a células musculares del paciente.
17. Una composición que comprende una
construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y un diluyente o vehículo fisiológicamente
aceptable.
18. Una composición que comprende un vector de
expresión de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 y un
diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable.
19. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 18, en la que además el vector dirige la expresión de
polipéptidos inmunomoduladores.
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