ES2292457T3

ES2292457T3 - Proteinas de fusion de fc para potenciar la inmunogenicidad de antigenos proteinicos y peptidicos.

Info

Publication number: ES2292457T3
Application number: ES00950483T
Authority: ES
Inventors: Stephen D. Gillies; Kin Ming Lo; John S. Wesolowski, Jr.
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: NO20020255L; ATE374042T1; DE60036552T2; CZ2002182A3; EP1198250B1; CN1374871A; DE60036552D1; KR100689739B1; PL201664B1; EP1198250A1; NO20020255D0; US20100068175A1; CZ304884B6; KR20020020794A; CN1308037C; US7955590B2; JP2003505431A; US20050261229A1; CA2378866C; SK782002A3

Abstract

Una composición para provocar una respuesta inmunitaria potenciada contra un antígeno peptídico o proteínico en un mamífero, comprendiendo la composición (i) una proteína de fusión que carece del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, enlazada mediante un enlace polipeptídico al antígeno, y (ii) una proteína de fusión que carece del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, enlazada mediante un enlace polipeptídico a una proteína adyuvante; en donde dichas regiones constantes de inmunoglobulina derivan de la misma especie y tienen la capacidad para unirse a un receptor de Fc.

Description

Proteínas de fusión de Fc para potenciar la inmunogenicidad de antígenos proteínicos y peptídicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a composiciones para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno proteínico o peptídico preseleccionado en un mamífero. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones que incluyen ácidos nucleicos que codifican, y secuencias de aminoácidos que definen, proteínas de fusión que contienen una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y un antígeno preseleccionado, en donde el antígeno preseleccionado en la proteína de fusión es capaz de provocar una respuesta inmunitaria más fuerte en el mamífero con relación al antígeno preseleccionado solo.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de vacunas se ha enfocado tradicionalmente a la generación de anticuerpos protectores capaces de neutralizar agentes infecciosos. Hasta la fecha, los agentes usados como vacunas incluyen típicamente microorganismos inactivados o atenuados (por ejemplo, bacterias o virus), sus productos (por ejemplo, toxinas) o antígenos purificados. Con la llegada de la moderna biología molecular y las metodologías de clonación de genes, ha sido posible comercializar vacunas más puras y aparentemente más específicas. Por otra parte, el conocimiento del sistema inmunitario a nivel molecular ha permitido el aislamiento y la caracterización de respuestas inmunitarias estimuladas por agentes infecciosos. Dos componentes del sistema inmunitario que se cree que son importantes para la generación satisfactoria de respuestas inmunitarias incluyen: los papeles básicos de células T reguladoras y citotóxicas y la manera mediante la cual un antígeno es presentado a estas células por una célula presentadora de antígeno (APC). Véase, por ejemplo, W. E. Paul, ed. (1993) FUNDAMENTALS OF IMMUNOLOGY, Raven Press, Ltd.,
Nueva York.

Típicamente, un antígeno proteínico o peptídico recibido desde el exterior de una APC (antígeno exógeno) se degrada dentro de una vesícula endocítica o endosoma de la APC, con lo que los fragmentos peptídicos resultantes forman un complejo con proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II. El complejo resultante se mueve hacia la superficie celular donde se exhibe a células inmunitarias vecinas a la APC. El fragmento peptídico se adapta en una hendidura definida por la molécula del MHC y el complejo puede ser reconocido por una célula T que expresa un receptor de células T que tiene especificidad de unión para el complejo. La interacción entre una molécula del MHC clase II cargada con péptido y una célula T cooperadora, denominada en la técnica una célula T CD4, se estabiliza adicionalmente mediante otra interacción entre la propia molécula del MHC clase II y el receptor CD4^{+} sobre la superficie de la célula T. Así, antígeno exógeno que es procesado dentro de células APC se presenta sobre la superficie celular a través de una molécula del MHC clase II. El complejo del MHC clase II, cuando se presenta a células T CD4^{+}, da como resultado que la célula cooperadora CD4^{+} secrete citoquinas que estimulan células T para producir anticuerpos contra el péptido. Véase Paul, anteriormente.

La vacunación con antígeno exógeno típicamente da como resultado una respuesta de células T mediada por células CD4 que generalmente da como resultado la producción de anticuerpos. Las células T citotóxicas (CTL) típicamente no son estimuladas mediante tal ruta. Aparentemente, las CTL son estimuladas en situaciones en las que el antígeno se origina desde dentro de la propia APC (antígeno endógeno), por ejemplo, a través de la producción de proteínas virales en una célula viralmente infectada o proteínas específicas del cáncer en una célula cancerosa. De hecho, en muchas enfermedades virales, se cree que la generación de CTL es crítica para eliminar células infectadas por virus y así para la recuperación de la infección.

Los estudios indican que los antígenos endógenos y exógenos son procesados de forma diferente. Durante la síntesis de polipéptidos nacientes, una porción del polipéptido es degradada por una estructura intracelular llamada proteosoma. Los fragmentos procedentes de este proceso se complejan con moléculas del MHC clase I recientemente sintetizadas en vez de con moléculas del MHC clase II, con lo que el antígeno resultante que contiene complejos del MHC clase I es transportado a la superficie celular. De nuevo, las células T con especificidad para el fragmento peptídico específico se unen a células T, pero, en este caso, la interacción correceptora requerida se produce entre la molécula del MHC clase I y una molécula CD8. De acuerdo con esto, el antígeno endógeno sobre la superficie de la APC es presentado a células T CD8^{+}. Aunque existen algunos tipos de células T CD8^{+} que no son citotóxicas, las células T CD8^{+} constituyen la mayoría de las CTL.

De acuerdo con esto, parece que el diseño de una vacuna capaz de inducir respuestas fuertes de CTL requiere que la molécula antigénica (generalmente una proteína) bien pueda elaborarse dentro de la célula o bien aportarse al compartimento celular apropiado de modo que pueda entrar en la ruta de procesamiento del MHC clase I. Una estrategia es incorporar un gen que codifica una proteína o péptido de interés en un virus, y a continuación usar el virus sometido a ingeniería como una vacuna (Lorenz y otros, (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631). Otra estrategia es inyectar un vector de DNA que codifica proteína en una célula y a continuación administrar la célula al animal o el paciente donde se expresa desde dentro de la célula y a continuación se presenta sobre la superficie celular a través de moléculas del MHC clase I (Donnelly y otros, (1997) ANNU. REV. IMMUNOL. 15:617). Se ha mostrado que una técnica más simple para inyectar vectores de DNA directamente en músculo o piel induce respuestas de CTL y/o anticuerpos a varios antígenos (Lai y otros, (1988) CRIT. REV. IMMUNOL. 18:449-84 y Patente de EE.UU. Nº 5.589.466). Los estudios han mostrado que el antígeno es recogido y procesado por APC, donde se presenta al sistema inmunitario (Lai y otros, anteriormente).

El aporte de péptidos o proteínas exógenos a la ruta del MHC clase I ha sido parcialmente satisfactorio a través del uso de adyuvantes químicos tales como adyuvante de Freund y mezclas de escualeno y detergentes (Hilgers y otros, (1999) VACCINE 17:219-228), y más recientemente a través del uso de pequeñas cuentas revestidas con antígeno que son fagocitadas por macrófagos que inducen respuestas de CTL a través de una ruta del MHC clase I alternativa (De Bruijn y otros, (1995) EUR. J. IMMUNOL. 25:1274-1285). Por otra parte, otros métodos para potenciar respuestas inmunitarias a un antígeno pueden incluir el uso de adyuvantes químicos en combinación con citoquinas inmunoestimulantes recombinantes, por ejemplo IL-2, IL-12, GM-CSF y otras. Por ejemplo, un método emplea un anticuerpo antihapténico fusionado a IL-2 como un modo de conectar esta citoquina a un antígeno proteínico que se ha hecho reaccionar químicamente con el hapteno (Harvill y otros, (1996) J. IMMUNOL. 157: 3165).

Otra técnica explota la "antigenización" de anticuerpos por la que una porción de una región variable de inmunoglobulina se reemplaza por un antígeno peptídico. El antígeno peptídico de la molécula híbrida se presenta a una APC una vez que el anticuerpo recombinante se une a la APC a través de la interacción con receptores de Fc sobre la superficie de la APC (Lanza y otros, (1993) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 90:11683-11687). Una extensión de este sistema utiliza la inyección esplénica de DNA plasmídico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina "antigenizada", después de lo cual células B derivadas del bazo secretan el anticuerpo recombinante una vez que se proporciona un socio de la cadena ligera de inmunoglobulina.

Sin embargo, la inmunogenicidad del sistema de aporte de antígenos es uno de los principales obstáculos técnicos en el desarrollo de vacunas modernas. El objetivo de la vacunación es provocar una respuesta inmunitaria fuerte. Sin embargo, debido a que el sistema inmunitario del huésped ha evolucionado para luchar contra bacterias y virus, cuando se usan bacterias o virus como vectores, el mensajero típicamente es destruido junto con el mensaje. Por otra parte, las respuestas inmunitarias fuertes a ciertos vectores virales, por ejemplo, vaccinia y adenovirus, limitan su utilidad, y se contempla que pueden surgir problemas similares durante el uso de toxinas bacterianas como vectores proteínicos. Asimismo, "vectores proteínicos" basados en anticuerpos que utilizan regiones variables que, por su propia naturaleza, no son consideradas como "propias" por el sistema inmunitario son potencialmente inmunogénicos. Se contempla que múltiples usos de estas moléculas portadoras pueden inducir respuestas antiidiotípicas impidiendo de ese modo su uso eficaz. De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna que produzca una inmunidad fuerte y de larga duración contra un antígeno proteínico o peptídico preseleccio-
nado.

Lo y otros (Protein Engineering 1998, 4, 495 - 500) describen una proteína de fusión que consiste en una porción Fc de una inmunoglobulina y una proteína diana (PSMA). Esta proteína de fusión se usó junto con un adyuvante en un sistema de inmunización estándar no especificado.

Sumario de la invención

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que es posible potenciar la inmunogenicidad de un antígeno peptídico o proteínico preseleccionado en un mamífero, fusionando el antígeno preseleccionado a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante (también denominada en la presente memoria una "proteína de fusión de Fc-antígeno" o una "proteína de fusión antigénica") puede administrarse a continuación al mamífero en la forma de una vacuna para provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno preseleccionado, en donde la fuerza y el tipo de respuesta inmunitaria provocada contra el antígeno preseleccionado puede modularse administrando adyuvantes específicos junto con la proteína de fusión de Fc-antígeno.

De acuerdo con esto, la invención proporciona composiciones para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno preseleccionado en un mamífero. En un aspecto, la composición comprende una proteína de fusión de Fc-antígeno que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina conectada mediante un enlace polipeptídico al antígeno preseleccionado en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. El antígeno preseleccionado, cuando es parte de una proteína de fusión de Fc-antígeno, se caracteriza por ser capaz de estimular una respuesta inmunitaria en el mamífero que es más fuerte que una cantidad comparable (por ejemplo, en peso o en número de moléculas) de antígeno preseleccionado solo, es decir, antígeno preseleccionado no fusionado a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

Por otra parte, las respuestas inmunitarias provocadas contra el antígeno preseleccionado de la proteína de fusión de Fc-antígeno son potenciadas o moduladas administrando la proteína de fusión de Fc-antígeno junto con un adyuvante. En la práctica de la invención, adyuvantes que han de usarse con proteínas de fusión de Fc-antígeno comprenden una segunda proteína de fusión de Fc (denominada en la presente memoria una "proteína de fusión de Fc-adyuvante" o una "proteína de fusión adyuvante"). Proteínas de fusión de Fc-adyuvante preferidas comprenden una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina conectada mediante un enlace polipeptídico a una proteína adyuvante, por ejemplo una citoquina. Citoquinas preferidas útiles en la construcción de proteínas de fusión de Fc-adyuvante incluyen, por ejemplo, interferón-y (IFN-y), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-12 (IL-12), IL-18, factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF). Otra clase de proteína de fusión de Fc-adyuvante comprende una región de la cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a un resto adyuvante correspondiente a un dominio extracelular de una proteína que habitualmente está parcialmente o exclusivamente unida a la membrana. Por ejemplo, el ligando de CD40 se fusiona a un resto Fc que ha de usarse como una proteína adyuvante potenciada.

La coadministración de las proteínas de fusión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante, bien simultáneamente o bien una después de la otra (por ejemplo, Fc-antígeno seguida por Fc-adyuvante o Fc-adyuvante seguida por Fc-antígeno), puede usarse para modular el tipo de respuesta inmunitaria que se estimula contra el antígeno preseleccionado. Dos clases de respuesta inmunitaria, denominadas Th1 y Th2, se inician en respuesta a diferentes estímulos e implican diferentes citoquinas. Las respuestas inmunitarias mediadas por Th1 son típicamente de naturaleza celular, mientras que las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 típicamente son de naturaleza humoral. De acuerdo con esto, una respuesta Th1 puede ser útil para atacar células alteradas, tales como células cancerosas o células infectadas con virus, mientras que una respuesta Th2 puede ser útil para atacar agentes extracelulares tales como parásitos. A menudo es útil administrar citoquinas, fusionadas a regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina, para estimular bien una respuesta inmunitaria o bien para iniciar o modular respuestas Th1 o Th2 específicas.

Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc-adyuvante que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina conectada mediante un enlace peptídico a GMCSF es un potente estimulador general de respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas tanto Th1 como Th2. Una proteína de fusión de Fc-adyuvante que comprende IL-12 o IFN-\gamma puede coadministrarse para estimular una respuesta inmunitaria principalmente celular o mediada por Th1. Alternativamente, una proteína de fusión de Fc-adyuvante que comprende Il-4 puede administrarse para estimular una respuesta inmunitaria principalmente humoral o mediada por Th2.

Por otra parte, la elección de una citoquina particular presente en una proteína de fusión de Fc-adyuvante puede influir en la clase de anticuerpo producido contra el antígeno preseleccionado de la proteína de fusión de Fc-antígeno. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc-adyuvante que contiene IL-12 puede estimular células T cooperadoras y la producción de la clase IgG2a de anticuerpo. Alternativamente, una proteína de fusión adyuvante que contiene IL-4 puede estimular la producción de la clase IgE de anticuerpo.

Según se analiza previamente, las composiciones de la invención comprenden la proteína de fusión de Fc-antígeno en combinación con una proteína de fusión de Fc-adyuvante. Usando dos proteínas de fusión, conteniendo cada una una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, es posible colocalizar tanto el antígeno preseleccionado como la proteína adyuvante (por ejemplo, una citoquina) en tipos de células iguales o similares del mamífero. Por ejemplo, los macrófagos, las células B, los granulocitos y las células dendríticas expresan receptores de Fc sobre su superficie celular. De acuerdo con esto, coadministrando proteínas de fusión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante capaces de unirse a receptores de Fc, es posible colocalizar el antígeno de la proteína de fusión antigénica y el adyuvante de la proteína de fusión adyuvante en los mismos tipos de células. El adyuvante puede a continuación estimular, potenciar o modular de otro modo la respuesta inmunitaria en la vecindad del antígeno preseleccionado.

La invención usa dos formas distintas de localización o concentración. En primer lugar, la invención usa un resto común que está fusionado tanto al antígeno como al adyuvante, que se concentra en ciertas regiones del cuerpo. De este modo, la concentración local eficaz del antígeno en la vecindad del adyuvante se incrementa. En segundo lugar, la invención orienta el antígeno hacia la maquinaria de procesamiento y presentación del antígeno del sistema inmunitario. La primera etapa de concentración puede llevarse a cabo fusionando las proteínas antigénica y adyuvante a un resto, lo que da como resultado la concentración en alguna parte del cuerpo que es accesible al sistema inmunitario. La segunda etapa de orientación puede llevarse a cabo fusionando la proteína antigénica a cualquier resto que potencia el aporte a, o el procesamiento por, el sistema de presentación de antígeno.

De acuerdo con esto, la invención alcanza estos efectos de concentración mediante dos métodos alternativos. Un método es construir y administrar dos proteínas de fusión diferentes, una fusión de proteína localizadora antigénica y una fusión de proteína localizadora adyuvante. Un segundo método es construir y administrar una fusión que contiene el antígeno, el adyuvante y la proteína localizadora. Un resto Fc es un ejemplo de una proteína localizadora.

Una característica importante de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es que, a diferencia del antígeno preseleccionado en la proteína de fusión de Fc-antígeno, preferiblemente no es inmunogénica o solo es débilmente inmunogénica en el receptor pretendido. En otras palabras, en la proteína de fusión de Fc-antígeno el antígeno preseleccionado se diseña para ser más inmunogénico en el receptor que la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. De forma similar, se contempla que la proteína de fusión de Fc-antígeno también deber ser no inmunogénica o débilmente inmunogénica en el receptor pretendido. La inmunogenicidad de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina puede reducirse y, en ciertos casos, eliminarse usando secuencias de región constante de inmunoglobulina derivadas de, o similares a, las presentes en la misma especie que el receptor pretendido. Por ejemplo, regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano, se usan para generar proteínas de fusión que han de administrarse a seres humanos. De forma similar, cuando el receptor pretendido es un ser humano, la proteína adyuvante en la proteína de fusión de Fc-adyuvante también es preferiblemente de origen humano. Mediante la elección de secuencias de aminoácidos adecuadas que definen regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina y proteínas adyuvantes, es posible optimizar una respuesta inmunitaria directamente principalmente contra el antígeno preseleccionado.

En una modalidad preferida, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de la proteína de fusión de Fc-antígeno comprende una región de bisagra de inmunoglobulina y opcionalmente un dominio de región constante de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, o una de sus combinaciones. Sin embargo, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina preferiblemente carece de al menos un dominio CH1. Por otra parte, las proteínas de fusión de Fc de la invención carecen del dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V_{H}). Cuando la proteína de fusión ha de administrarse a un ser humano, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende preferiblemente una región de bisagra y un dominio CH2 o un dominio CH3, y lo más preferiblemente comprende una región de bisagra y tanto un dominio CH2 como un dominio CH3. Se contempla que regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina útiles en la práctica de la invención pueden derivarse de inmunoglobulinas pertenecientes a cualquiera de las cinco clases de inmunoglobulinas mencionadas en la técnica como IgA (Ig\alpha), IgD (Ig\delta), IgE (Ig\varepsilon), IgG (Ig\gamma) e IgM (Ig\mu). Sin embargo, se prefieren regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de la clase IgG.

Se contempla que cualquier antígeno preseleccionado de interés pueda incluirse en la proteína de fusión de Fc-antígeno de la invención. En una modalidad preferida, el antígeno preseleccionado se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de membrana específico de la próstata, un ectodominio de un receptor de citoquina, una proteína viral y un antígeno específico de cáncer o tumor.

Proteínas de fusión de Fc-antígeno que tienen una variedad de configuraciones pueden ser útiles en la práctica de la invención. Por ejemplo, el extremo N del antígeno preseleccionado puede conectarse mediante un enlace polipeptídico al extremo C de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Alternativamente, el extremo C del antígeno preseleccionado puede conectarse mediante un enlace polipeptídico al extremo N de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por otra parte, se contempla que las proteínas de fusión de Fc-antígeno pueden comprender una pluralidad de uno o más antígenos preseleccionados, uno o más de los cuales pueden conectarse directamente o a través de un conectador polipeptídico entre sí o a la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por otra parte, dos o más proteínas de fusión de Fc-antígeno pueden asociarse entre sí bien no covalentemente o bien covalentemente, por ejemplo, a través de uno o más enlaces de disulfuro, para producir composiciones dímeras o multímeras. Se contempla que las proteínas de fusión de Fc-antígeno en los constructos dímeros pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, aunque ambas proteínas de fusión de Fc-antígeno pueden comprender la misma región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, los antígenos preseleccionados pueden diferir. Se contempla que también pueden emplearse configuraciones similares con las proteínas de fusión de Fc-adyuvante.

Por otra parte, una variedad de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de Fc puede ser útil en la práctica de la invención. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico pueden codificar en una dirección 5' a 3' bien la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y el antígeno preseleccionado o bien el antígeno preseleccionado y la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por otra parte, las secuencias de ácido nucleico opcionalmente también pueden incluir una secuencia "líder" o "de señal" basada en, por ejemplo, una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina fusionada directamente a una región de bisagra de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad preferida, cuando la región Fc se basa en secuencias de IgG, la región Fc codifica en una dirección 5' a 3' al menos una región de bisagra de inmunoglobulina (es decir, una región de bisagra que contiene al menos un aminoácido cisteína capaz de formar un enlace de disulfuro con una segunda secuencia de región de bisagra de inmunoglobulina), un dominio CH2 de inmunoglobulina y un dominio CH3. Por otra parte, una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión de Fc-antígeno también puede integrarse dentro de un vector de expresión replicable que puede expresar la proteína de fusión de Fc bien en, por ejemplo, un huésped bacteriano, bien en el receptor pretendido o bien en ambos.

Se contempla que la inyección de secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fusión de Fc-antígeno, bien solas o bien en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fusión de Fc-adyuvante, puede dar como resultado la generación de una respuesta inmunitaria celular, una respuesta inmunitaria humoral o ambas. Las combinaciones de inmunizaciones basadas en ácidos nucleicos y proteínas (por ejemplo, la administración de una proteína de fusión de Fc-antígeno antes, durante o después de la administración de un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de Fc-antígeno) pueden actuar sinérgicamente entre sí para provocar respuestas inmunitarias más fuertes contra el antígeno preseleccionado con relación a la inmunización bien con el ácido nucleico o bien con la proteína solos.

Los objetivos, las características y las ventajas precedentes y otros de la presente invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones que siguen.

Breve descripción de los dibujos

Los precedentes y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención así como la propia invención pueden entenderse más a fondo a partir de la siguiente descripción de modalidades preferidas, cuando se leen junto con los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figuras 1A-1G son ilustraciones esquemáticas de proteínas de fusión de Fc ejemplares útiles en la práctica de la invención. La Figura 1A representa una proteína de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante en la que la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está enlazada al extremo N-terminal del antígeno o el adyuvante 2. La Figura 1B representa una proteína de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante en la que la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está enlazada al extremo C-terminal del antígeno o el adyuvante 2. Las Figuras 1C y 1D representan una proteína dímera en la que cualquiera o ambas de las cadenas polipeptídicas comprenden una proteína de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante. En la Figura 1C, en al menos una cadena polipeptídica, la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está enlazada al extremo N-terminal del antígeno o el adyuvante 2, y en la Figura 1D, la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está enlazada al extremo C-terminal del antígeno o el adyuvante 2. La Figura 1E representa una proteína dímera en la que cualquiera o ambas de las cadenas polipeptídicas comprenden una proteína de fusión de Fc-antígeno-antígeno, Fc-adyuvante-adyuvante, Fc-adyuvante-antígeno o Fc-antígeno-adyuvante. La Figura 1F representa una proteína de fusión dímera, en la que cualquiera o ambas de las cadenas polipeptídicas comprenden una proteína de fusión de antígeno-Fc-adyuvante o adyuvante-Fc-antígeno. La Figura 1G representa una proteína de fusión dímera, en la que cualquiera o ambas de las cadenas polipeptídicas comprenden una proteína de fusión de antígeno-adyuvante-Fc o adyuvante-antígeno-Fc.

Las Figuras 2A-2B son representaciones esquemáticas de secuencias de DNA útiles en la práctica de la invención. La Figura 2A representa un vector de expresión de proteína de fusión de Fc de ser humano. La Figura 2B representa una fusión génica para la expresión de una proteína de fusión de Fc de IgG2a de ratón.

Las Figuras 3A-3F son gráficas que muestran el efecto de adyuvantes químicos y de Fc-citoquina sobre la producción de anticuerpos en ratones inmunizados con la proteína de fusión de Fc-antígeno, proteína de fusión de Fc de ratón-ectodominio del receptor de IL-4 humano (Fc-IL-4R). En la Figura 3A, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R y Fc-IL-2 en adyuvante completo de Freund (CFA). En la Figura 3B, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En la Figura 3C, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R en CFA. En la Figura 3D, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R y Fc-IL-2 en PBS. En la Figura 3E, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R y Fc-GMCSF en CFA. En la Figura 3F, los ratones fueron inmunizados con Fc-IL-4R y Fc-GMCSF en PBS. En las Figuras 3A-3F, los cuadrados, los rombos y los triángulos representan datos derivados de tres ratones separados. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

Las Figuras 4A-4D son gráficas que muestran el efecto de inmunizar ratones con un antígeno de cáncer humano, PMSA, en la forma de una proteína de fusión de Fc-antígeno usando cantidades variables de Fc-GMCSF como un adyuvante. En la Figura 4A, los ratones se inmunizaron con 50 \mug de proteína de fusión de Fc-PSMA sola. En la Figura 4B, los ratones se inmunizaron con 50 \mug de Fc-PSMA y 0,05 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. En la Figura 4C, los ratones se inmunizaron con 50 \mug de Fc-PSMA y 0,5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. En la Figura 3, los ratones se inmunizaron con 50 \mug de Fc-PSMA y 5 \mug de Fc-GMCSF. En las Figuras 4A-4D, los cuadrados, los rombos y los triángulos representan datos derivados de tres ratones separados.

Las Figuras 5A-5F son gráficas que comparan las respuestas de anticuerpo específicas para el antígeno PSMA administrado bien como una proteína natural (5A-5C) o como una proteína de fusión de Fc de ratón-PSMA (5D-5F). En la Figura 5A, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de PSMA como un antígeno. En la Figura 5B, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de PSMA como un antígeno y 0,2 \mug de GMCSF como un adyuvante. En la Figura 5C, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de PSMA como un antígeno y 0,5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. En la Figura 5D, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de Fc-PSMA como un antígeno. En la Figura 5E, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de Fc-PSMA como un antígeno y 0,2 \mug de GMCSF como un adyuvante. En la Figura 5F, los ratones fueron inmunizados con 50 \mug de Fc-PSMA como un antígeno y 0,5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. En las Figuras 5A-5F, los cuadrados, los rombos y los triángulos representan datos derivados de tres ratones separados. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

La Figura 6 es un diagrama que compara los efectos adyuvantes de Fc-GMCSF o Fc-F3L coadministrados con Fc-PSMA sobre la producción de anticuerpos contra PSMA humano. Todos los animales recibían 50 \mug de Fc-PSMA bien sola o bien en combinación con la Fc-citoquina indicada como un adyuvante. Se probaron tres ratones por experimento.

Las Figuras 7A-7B son gráficas que muestran la inmunogenicidad en ratones individuales de la proteína de fusión Fc-EpCAM, bien sola o bien en combinación con un adyuvante de Fc-GMCSF. Las Figuras 7A y 7B representan concentraciones de anticuerpo medidas 7 y 14 días después del refuerzo, respectivamente. El refuerzo se administró tres semanas después de la inmunización principal. En ambas Figuras, los rombos abiertos representan ratones inmunizados subcutáneamente con 10 \mug de Fc-EpCAM sola y los triángulos sólidos representan ratones inmunizados subcutáneamente con 10 \mug de Fc-EpCAM y 1 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. Los niveles de anticuerpo para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

Las Figuras 8A-8B son gráficas que muestran la inmunogenicidad en ratones de la EpCAM-Fc (orientación inversa de la región Fc y el antígeno), bien sola o bien en combinación con una proteína de fusión adyuvante de Fc-GMCSF. Las Figuras 8A y 8B representan concentraciones de anticuerpo medidas 14 días y 21 días (es decir, 7 días después del refuerzo) después de la inmunización, respectivamente. En ambas Figuras, los rombos abiertos representan concentraciones medias de tres ratones inmunizados con 25 \mug de proteínas de fusión de EpCAM-Fc y los triángulos sólidos representan ratones inmunizados con 25 \mug de EpCAM-Fc y 2,5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de
ELISA.

La Figura 9 muestra un diagrama para construir un vector plasmídico que codifica una proteína de fusión de EpCAM-Fc-GMCSF. En este caso, el antígeno EpCAM se fusiona al extremo aminoterminal de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (región Fc) y al adyuvante. GMCSF se fusiona al extremo carboxiterminal de la región Fc.

Las Figuras 10A-10D son gráficas que muestran concentraciones de anticuerpo en ratones inyectados con vectores plasmídicos que codifican la proteína de fusión de Fc-EpCAM usando bien PBS o bien una solución de sacarosa al 25% (p/v) como un vehículo portador. Las Figuras 10A-10B representan concentraciones de anticuerpo registradas 14 días, 27 días, 55 días y 69 días después de la inyección inicial, respectivamente. En cualquier parte de las Figuras, los rombos abiertos representan concentraciones para ratones individuales inyectados con el plásmido que codifica Fc-EpCAM en PBS, y los triángulos sólidos representan concentraciones para ratones individuales inyectados con plásmido que codifica Fc-EpCAM en sacarosa. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

Las Figuras 11A-11B son gráficas que muestran la estimulación de la incorporación de ^{3}H-timidina en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno de esplenocitos aislados de ratones inmunizados mediante vacunación con DNA o mediante inyección de proteína. La Figura 11B muestra una vista expandida de los datos en la porción inferior de la Figura 11A. En cualquier parte de las Figuras, los rombos sólidos representan esplenocitos recogidos de ratones inmunizados con 100 \mug de DNA plasmídico que codifica la proteína de fusión de CMV-Fc-EpCAM, los círculos abiertos representan esplenocitos recogidos de ratones inmunizados con 100 \mug de DNA plasmídico que codifica la proteína de fusión de CMV-EpCAM-Fc y las cruces representan esplenocitos recogidos de ratones inmunizados con 10 \mug de proteína de Fc-EpCAM. Los bazos se extirparon de los ratones el día 70 después de la primera inyección de DNA plasmídico o proteína y dos inyecciones de refuerzo a intervalos de 3 semanas.

Las Figuras 12A-B son gráficas que muestran un ensayo de muerte de linfocitos T citotóxicos (CTL) usando esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con DNA plasmídico o proteína de Fc-EpCAM. La Figura 12A muestra la actividad de esplenocitos contra células tumorales CT26 de ratón que expresan la proteína EpCAM humana. La Figura 12B muestra la actividad de esplenocitos contra las células tumorales CT26 de ratón parentales. Para ambas Figuras, los rombos abiertos representan esplenocitos inmunizados con DNA que tiene un constructo (promotor de CMV)-EpCAM, los cuadrados abiertos representan esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con DNA que tiene un constructo de fusión de (promotor de CMV)-Fc-EpCAM, los triángulos abiertos representan esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con DNA que tiene un constructo de fusión de (promotor de CMV)-EpCAM-Fc y las cruces representan esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con proteína de fusión de Fc-EpCAM. El ensayo de CTL usaba esplenocitos procedentes de los ratones inmunizados cultivados durante cinco días con 10 U/ml de IL-2. Células diana marcadas se mezclaron con los efectores indicados y se incubaron durante cuatro horas. La liberación de radiactividad se usó para calcular el porcentaje de lisis específica.

La Figura 13 es una gráfica que muestra concentraciones de anticuerpo en ratones inmunizados subcutáneamente con 50 \mug de proteína de fusión de Fc-MCSP en PBS bien sola o bien en combinación con 5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. Los rombos sólidos representan concentraciones de anticuerpo en suero normal, los cuadrados abiertos representan concentraciones de anticuerpo en suero de ratones inmunizados con proteína de fusión de Fc-MCSP sola y los triángulos sólidos representan concentraciones de anticuerpo en suero de ratones inmunizados con proteína de fusión de Fc-MCSP en combinación con un adyuvante de Fc-GMCSF. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

Las Figuras 14A-B son gráficas que muestran concentraciones de anticuerpo en ratones inmunizados con proteína de fusión de Fc-pep 626 de gp41, sola o en combinación con un adyuvante de Fc-citoquina. Las Figuras 14A y 14B representan concentraciones de anticuerpo alcanzadas 7 y 33 días después de un segundo refuerzo, respectivamente. En cualquier parte de las Figuras, los rombos abiertos representan concentraciones de anticuerpo en ratones inmunizados mediante inyección intradérmica con 25 \mug de Fc-antígeno de pep 626 de gp41 sola, los cuadrados abiertos representan concentraciones en ratones inmunizados mediante inyección intradérmica con 25 \mug de Fc-antígeno de pep 626 de gp41 en combinación con 2,5 \mug de adyuvante de Fc-GMCSF y los triángulos sólidos representan concentraciones de anticuerpo en ratones inmunizados mediante inyección intradérmica con 25 \mug de Fc-antígeno de pep 626 de gp41 en combinación con 2,5 \mug de adyuvante de Fc-IL2. Los niveles de anticuerpos para un antígeno se midieron mediante ELISA; el eje Y indica la densidad óptica de la lectura de ELISA.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción se refiere al aporte eficaz de antígenos proteínicos o peptídicos in vivo para inducir respuestas inmunitarias humorales (es decir, basadas en anticuerpos) o mediadas por células Th2, respuestas inmunitarias celulares o mediadas por células Th1 y, en algunos casos, ambos tipos de respuestas inmunitarias en un mamífero. Se ha descubierto ahora que es posible potenciar la inmunogenicidad de un antígeno proteínico o peptídico preseleccionado en un mamífero fusionando el antígeno preseleccionado a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina para producir una proteína de fusión de Fc-antígeno. La proteína de fusión de Fc-antígeno resultante o la secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de Fc-antígeno pueden administrarse a continuación al mamífero, por ejemplo un ser humano, en la forma de una vacuna para producir una respuesta inmunitaria contra el antígeno preseleccionado.

La proteína de fusión de Fc-antígeno orienta selectivamente el antígeno a células que presentan antígeno (APCs). Sin querer limitarse por una teoría, se cree que la unión de la proteína de fusión de Fc-antígeno a las APCs está mediada a través de receptores de Fc expresados sobre numerosos tipos de células inmunitarias, incluyendo, por ejemplo: células dendríticas; macrófagos; células B y granulocitos. La proteína de fusión de Fc-antígeno, cuando se administra al mamífero, se une a receptores de Fc, después de lo cual la proteína de fusión de Fc-antígeno es sometida a endocitosis por las APCs. Se cree que a continuación la proteína de fusión sometida a endocitosis, que incluye el antígeno preseleccionado, se degrada en péptidos pequeños que a continuación son presentados sobre la superficie celular. Los péptidos presentados median a continuación en una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. El tipo particular de respuesta inmunitaria estimulada puede modularse coadministrando la proteína de fusión de Fc-antígeno con un adyuvante, por ejemplo una proteína de fusión adyuvante.

En un modo de administración, una proteína de fusión de Fc-antígeno se administra al receptor. En otro modo de administración, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de Fc-antígeno se administra al receptor. El antígeno preseleccionado, bien en la proteína de Fc-antígeno administrada o bien según se expresa a partir del ácido nucleico administrado, es más inmunogénico que el antígeno solo, es decir, el antígeno no fusionado mediante un enlace polipeptídico a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por otra parte, en ciertas circunstancias, la administración secuencial de proteína de fusión seguida por la administración de ácido nucleico que codifica la misma proteína de fusión o, alternativamente, la administración de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión seguida por la administración de la misma proteína de fusión puede usarse para maximizar la inmunogenicidad del antígeno preseleccionado. Se entiende que una respuesta inmunitaria óptima se provoca cuando ambos componentes de las proteínas de fusión de Fc-antígeno son activos. En otras palabras, el antígeno preseleccionado en la proteína de fusión de Fc-antígeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria y la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es capaz de unirse a un receptor de Fc sobre la superficie de APCs.

Por otra parte, según se analiza, la fuerza y el tipo de la respuesta inmunitaria provocada contra el antígeno preseleccionado pueden modularse coadministrando adyuvantes específicos con la proteína de fusión de Fc-antígeno. En la práctica de la invención, los adyuvantes comprenden una segunda proteína de fusión de Fc, en la que una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina está fusionada a una proteína adyuvante para producir una proteína de fusión de Fc-adyuvante. Como con las proteínas de fusión de Fc-antígeno, se entiende que se provoca una respuesta inmunitaria óptima cuando ambos componentes de una proteína de fusión de Fc-adyuvante son activos. En otras palabras, el adyuvante en la proteína de fusión de Fc-adyuvante es capaz de modular una respuesta inmunitaria y la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es capaz de unirse a un receptor de Fc sobre la superficie de APCs.

De acuerdo con la invención, tanto el antígeno como el adyuvante se administran como proteínas de fusión de Fc. En otras palabras, el antígeno se administra como una proteína de fusión de Fc-antígeno y el adyuvante se administra como una proteína de fusión de Fc-adyuvante. Ciertas modalidades de proteínas de fusión de Fc útiles en la práctica de la invención se ilustran en las Figuras 1A-1G.

La Figura 1A ilustra una proteína de fusión de Fc ejemplar en la que el extremo C de la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está empalmado, bien directamente o bien por medio de un conectador polipeptídico, al extremo N-terminal del antígeno o adyuvante 2 preseleccionado. Según se usa aquí, se entiende que el término "conectador polipeptídico" significa una secuencia de uno o más residuos de aminoácido que acoplan dos proteínas entre sí. El conectador polipeptídico a menudo es una serie de aminoácidos de aproximadamente 10-15 residuos de longitud, que comprende, por ejemplo, residuos de glicina y/o serina repetitivos. La Figura 1B ilustra una proteína de fusión de Fc ejemplar en la que el extremo C del antígeno o adyuvante 2 preseleccionado está empalmado, bien directamente o bien por medio de un conectador polipeptídico, al extremo N de la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 1C representa un constructo dímero que contiene dos proteínas de fusión de Fc conectadas covalentemente por medio de dos enlaces de disulfuro. El constructo dímero comprende dos proteínas de fusión de Fc en las que el extremo C de cada región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está conectado al extremo N de un antígeno o adyuvante 2 preseleccionado. De forma similar, la Figura 1D representa un constructo dímero que contiene dos proteínas de fusión de Fc conectadas covalentemente por medio de dos enlaces de disulfuro. El constructo dímero comprende dos proteínas de fusión de Fc en las que el extremo C de cada antígeno o adyuvante 2 preseleccionado está conectado al extremo N de la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

La Figura 1E representa un constructo dímero que contiene dos proteínas de fusión de Fc conectadas por medio de dos enlaces de disulfuro. El constructo dímero comprende dos proteínas de fusión de Fc en las que el extremo C de cada región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina está conectado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, al extremo N de un antígeno o adyuvante 2 preseleccionado, cuyo término C está enlazado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, a un segundo antígeno o adyuvante 2'.

La Figura 1F representa un constructo dímero que contiene dos proteínas de fusión de Fc también conectadas por medio de dos enlaces de disulfuro. El constructo dímero comprende dos proteínas de fusión de Fc en las que el extremo C del antígeno o adyuvante 2 está conectado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, al extremo N de la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina, cuyo extremo C está conectado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, al extremo N de un adyuvante o antígeno 2' diferente. Por ejemplo, tales proteínas de fusión pueden incluir, en una dirección N- a C-terminal, antígeno-región constante de cadena pesada de inmunoglobulina-adyuvante.

La Figura 1G representa un constructo dímero que contiene dos proteínas de fusión de Fc también conectadas por medio de dos enlaces de disulfuro. El constructo dímero comprende dos proteínas de fusión de Fc en las que el extremo C del antígeno o adyuvante 2 está conectado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, al extremo N de un adyuvante o antígeno 2' diferente, cuyo extremo C está conectado, bien directamente o bien a través de un conectador polipeptídico, al extremo N de la región 1 constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, tales proteínas de fusión pueden incluir, en una dirección N- a C-terminal, antígeno preseleccionado-adyuvante-región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

En la práctica de la invención, se prefiere generalmente situar el resto Fc en una posición N-terminal con relación al resto adyuvante. Si el resto adyuvante se sitúa N-terminal con respecto al resto Fc, entonces la proteína de fusión de adyuvante-Fc puede unirse a un receptor de adyuvante o una célula inmunitaria y el resto Fc estará en la misma orientación que se adopta cuando un anticuerpo se une a una superficie celular. Puede resultar ADCC o fijación del complemento. Sin embargo, cuando el resto Fc se sitúa N-terminal al resto adyuvante, no parecen resultar ADCC ni fijación del complemento.

Los constructos representados en las Figuras 1C-1G se ilustran como dímeros reticulados mediante un par de enlaces disulfuro entre cisteínas en regiones de bisagra adyacentes. En los dibujos, se representa que los puentes de disulfuro conectan entre sí las porciones de dos regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina a través de la región de bisagra característica de formas naturales de estas moléculas. Aunque se prefieren constructos que incluyen regiones de bisagra de inmunoglobulina, la invención contempla que la reticulación en otras posiciones puede elegirse según se desee. Por otra parte, en algunos casos, dos o más monómeros pueden asociarse no covalentemente para producir dímeros o multímeros útiles en la práctica de la invención.

Según se usa aquí, el término "región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" se usa intercambiablemente con el término "región Fc" y se entiende que significa la porción carboxiloterminal de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, o uno de sus análogos o porciones capaces de unirse a un receptor de Fc. Como se sabe, cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios se nombran secuencialmente como sigue: CH1-bisagra-CH2-CH3(-CH4). CH4 está presente en IgM, que no tiene región de bisagra. La región constante de cadena pesada de inmunoglobulina útil en la práctica de la invención comprende preferiblemente una región de bisagra de inmunoglobulina y preferiblemente también incluye un dominio CH3. La región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende lo más preferiblemente una región de bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3. Según se usa aquí, se entiende que el término "región de bisagra" de inmunoglobulina significa una región de bisagra de inmunoglobulina entera o al menos una porción de la región de bisagra de inmunoglobulina suficiente para formar uno o más enlaces de disulfuro con una segunda región de bisagra de inmunoglobulina.

Se contempla que regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina adecuadas pueden derivarse de anticuerpos pertenecientes a cada una de las clases de inmunoglobulina denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, sin embargo, se prefieren las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina procedentes de la clase IgG. Por otra parte, se contempla que las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina pueden derivarse de cualquiera de las subclases de anticuerpos de IgG mencionadas en la técnica como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los dominios de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de IgA e IgD y al dominio CH3 de IgM e IgE. Regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina preferidas incluyen dominios proteínicos correspondientes a una región CH2 y a una región CH3 de IgG, o sus porciones funcionales o derivadas. Sin embargo, las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina carecen preferiblemente de al menos el dominio CH1. Por otra parte, las proteínas de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante carecen de una región variable de inmunoglobulina. En una modalidad más preferida, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende, en una dirección N- a C-terminal, una región de bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3, todos los cuales se basan en secuencias procedentes de una molécula de IgG. La elección de regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina apropiadas se analiza con detalle en las Patentes de EE.UU. Nº 5.541.087 y 5.826.044. Se considera que la elección de secuencias de regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulinas particulares de ciertas clases y subclases de inmunoglobulinas para alcanzar un resultado particular está dentro del nivel de experiencia en la técnica.

Puede ser útil, en algunas circunstancias, modificar la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante mutación, deleción u otros cambios mediados por ingeniería genética u otros sistemas, de modo que ciertas actividades, tales como la fijación del complemento o la estimulación de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), se reduzcan o eliminen. Sin embargo, se considera necesario que se mantenga la capacidad de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina para unirse a un receptor de Fc.

En la práctica de esta invención, el componente de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de las proteínas de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante preferiblemente es no inmunogénico o es débilmente inmunogénico en el receptor pretendido. Se considera que la región Fc es no inmunogénica o débilmente inmunogénica si la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no genera una respuesta de anticuerpo detectable dirigida contra la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. De acuerdo con esto, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina debe derivarse de inmunoglobulinas presentes o basadas en secuencias de aminoácidos correspondientes a inmunoglobulinas presentes en la misma especie que el receptor pretendido de la proteína de fusión. En otras palabras, deben usarse secuencias de regiones pesadas constantes de inmunoglobulina humana cuando el constructo de fusión de Fc (la proteína de fusión de Fc-antígeno y/o Fc-adyuvante) haya de administrarse a un ser humano. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Fc de IgG humana se describen, por ejemplo, en Ellison y otros (1982) NUCLEIC ACIDS RES. 10:4071-4079. Asimismo, deben usarse secuencias de Fc múrida cuando la proteína de fusión de Fc haya de administrarse a ratones. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Fc de IgG2a múrida se describen, por ejemplo, en Bourgois y otros (1974) EUR. J. BIOCHEM. 43:423-435. La misma lógica se aplicaría si las proteínas de fusión de Fc fueran a administrarse a otros animales, incluyendo mascotas, por ejemplo gatos y perros, y animales de granja, por ejemplo vacas y caballos.

Según se usa aquí, se entiende que el término "antígeno preseleccionado" significa cualquier proteína o su fragmento o polipéptido que, bien solo o bien en combinación con otros reactivos, sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. Se contempla que cualquier antígeno preseleccionado de interés puede incluirse en la proteína de fusión de Fc-antígeno de la invención. En una modalidad preferida, el antígeno preseleccionado se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); un ectodominio de un receptor de citoquina, por ejemplo, un ectodominio del receptor de IL-4 humano; un antígeno específico de tumor (por ejemplo, un antígeno que es regulado al alza o está presente de otro modo a niveles elevados en una célula tumoral con relación a una célula normal); y una proteína viral, por ejemplo una proteína codificada por el genoma del virus de inmunodeficiencia humana (HIV).

Según se usa aquí, se entiende que el término "adyuvante" significa cualquier substancia que sea capaz de actuar como un inmunomodulador, por ejemplo, potenciando una respuesta inmunitaria (bien humoral o bien celular) contra el antígeno preseleccionado. Según se usa aquí, se entiende que el término inmunidad "humoral" significa inmunidad mediada por anticuerpos dispuestos en fluidos corporales, por ejemplo plasma o linfa, mientras que se entiende que el término inmunidad "celular", también mencionado en la técnica como "inmunidad mediada por células", significa reacciones inmunológicas iniciadas por linfocitos T y mediadas por linfocitos T y/o macrófagos efectores.

Según se analiza previamente, una variedad de adyuvantes químicos, por ejemplo adyuvante completo de Freund, pueden ser útiles para inmunizar mamíferos no humanos. Aunque ampliamente usado en animales para generar altas concentraciones de anticuerpo o respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) significativas, sus efectos secundarios, por ejemplo cicatrización de tejidos, lo hacen inaceptable para uso en seres humanos. Por lo tanto, existe una necesidad de inducir respuestas inmunitarias fuertes sin la inflamación conjunta en la zona de inyección. Una ventaja clara de usar proteínas de fusión de Fc-adyuvante de la invención es la capacidad para provocar una respuesta inmunitaria fuerte sin la necesidad de adyuvantes químicos tales como adyuvante de Freund.

Adyuvantes preferidos útiles en la práctica de la invención comprenden una proteína de fusión de Fc-adyuvante o un ácido nucleico que codifica la misma. Proteínas adyuvantes preferidas para la inclusión en las proteínas de fusión de Fc incluyen citoquinas. Según se usa aquí, se entiende que el término "citoquina" significa cualquiera de sus análogos proteínicos o peptídicos o fragmentos funcionales, que sea capaz de modular la actividad de células inmunitarias, por ejemplo: células T; células B; macrófagos; neutrófilos; eosinófilos; basófilos; células dendríticas; y sus precursores, en un mamífero. Citoquinas preferidas incluyen, por ejemplo, IFN-\gamma, IN-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF y GMCSF. El dominio extracelular del ligando de CD40 también es una proteína preferida para fusionarse a Fc para formar una Fc-adyuvante. Cuando se administra con Fc-adyuvante, el antígeno de la proteína de fusión de Fc-antígeno puede provocar una respuesta inmunitaria que es más fuerte que cuando la proteína de fusión de Fc-antígeno se administra sin la proteína de fusión de Fc-adyuvante. En algunos casos, el nivel de anticuerpo alcanzado después de solo dos inmunizaciones de Fc-antígeno con Fc-adyuvante es exactamente tan alto o superior que el alcanzado con adyuvante de Freund, y sin reacciones cutáneas detectables.

Como con las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de las proteínas de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante, la proteína adyuvante preferiblemente no es inmunogénica o solo es débilmente inmunogénica en el receptor pretendido. Esto puede efectuarse incorporando en la proteína de fusión de Fc-adyuvante citoquinas definidas con secuencias de aminoácidos correspondientes a citoquinas aislables de la misma especie del receptor pretendido. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión de Fc-adyuvante ha de administrarse a un ser humano, la proteína adyuvante (por ejemplo, citoquina) preferiblemente es de origen humano.

La coadministración de las proteínas de fusión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante, bien simultáneamente o bien una después de otra, puede usarse para modular el tipo de respuesta inmunitaria que se estimula contra el antígeno preseleccionado. Dos clases de respuesta inmunitaria, denominadas Th1 y Th2, son estimuladas en respuesta a diferentes tipos de infección e implican diferentes citoquinas. Las respuestas inmunitarias mediadas por Th1 típicamente son de naturaleza celular, mientras que las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 típicamente son de naturaleza humoral. De acuerdo con esto, una respuesta Th1 puede ser útil para atacar células alteradas, tales como células tumorales o células infectadas con virus, mientras que una respuesta Th2 puede ser útil para atacar agentes extracelulares tales como parásitos. A menudo es útil administrar citoquinas, fusionadas a regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, para estimular bien una respuesta inmunitaria general o bien para iniciar o modular respuestas Th1 o Th2 específicas.

Por otra parte, la elección de una citoquina particular presente en una proteína de fusión de Fc-adyuvante puede influir en la clase de anticuerpo producido contra el antígeno preseleccionado de la proteína de fusión de Fc-antígeno. Por ejemplo, Fc-IL12 estimula la respuesta de células T cooperadoras estimulando la producción de lo que se conoce como citoquinas Th1, por ejemplo IFN-\gamma, IL-2 y TNF, que promueven una potente inmunidad celular y la producción de la clase IgG2a de anticuerpo. A la inversa, Fc-IL-4 estimula la producción de citoquinas Th2, por ejemplo IL-5, IL-6, IL-10 e IL-4, que promueven inmunidad humoral.

Según se analiza previamente, la composición de la invención comprende la proteína de fusión de Fc-antígeno en combinación con una proteína de fusión de Fc-adyuvante. Usando dos proteínas de fusión, que contienen cada una una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, es posible colocalizar tanto el antígeno preseleccionado como la proteína adyuvante (por ejemplo, una citoquina) en tipos de células iguales o similares en el mamífero. Por ejemplo, los macrófagos, las células B, los granulocitos y las células dendríticas expresan receptores de Fc sobre su superficie celular. De acuerdo con esto, coadministrando proteínas de fusión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante capaces de unirse a receptores de Fc, es posible colocalizar el antígeno de la proteína de fusión antigénica y el adyuvante de la proteína de fusión adyuvante en el mismo compartimento celular de APCs. El adyuvante puede a continuación potenciar o modular de otro modo la respuesta inmunitaria en la vecindad del antígeno preseleccionado.

Las combinaciones de Fc-citoquinas también pueden usarse de una manera sinérgica para estimular una respuesta general, y a continuación influyen en si se produce una respuesta celular (Th1) o humoral (Th2). Por ejemplo, Fc-GMCSF es un potente estimulador general de respuestas inmunitarias. Sin embargo, para modular la respuesta más hacia la inmunidad celular o mediada por Th1, una proteína adyuvante de Fc-IL12 o Fc-IFN\gamma, por ejemplo, puede coadministrarse con Fc-GMCSF. Para promover una respuesta más humoral o mediada por Th2, una proteína adyuvante de Fc-IL4, por ejemplo, puede coadministrarse con Fc-GMCSF para modular la respuesta hacia la generación de células Th2. Otras citoquinas que promueven Th1 o Th2, usadas como fusiones a Fc, también pueden emplearse dependiendo de la naturaleza precisa de la respuesta fisiológica deseada. Se contempla que este sistema general también puede usarse para modular respuestas patógenas existentes tales como autoinmunidad (una enfermedad mediada por Th1) y alergia (una enfermedad mediada por Th2) empujando la respuesta hacia un antígeno particular y lejos de una perjudicial al inmunizar para una nueva respuesta del tipo de Th opuesto.

En algunas circunstancias, cuando se inmuniza un animal con una proteína de fusión de Fc-antígeno, es útil usar ácidos nucleicos como adyuvantes. Los ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos que contienen una secuencia enriquecida en citosina-enlace fosfodiéster-guanosina (CpG), pueden desviar una respuesta inmunitaria hacia una respuesta Th1, y opcionalmente pueden usarse en combinación con otros adyuvantes tales como citoquina (véanse, por ejemplo, Brazolot y otros (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 95:15553-8; Liu y otros (1998) BLOOD 92:3730-6; y Klinman y otros (1997) IMMUNOL. 158:3635-3639). De acuerdo con esto, se contempla que los oligonucleótidos que contienen CpG pueden coadministrarse con una fusión de Fc-antígeno para alcanzar una respuesta inmunitaria potenciada y apropiadamente modulada. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser de cualquier longitud. Sin embargo, se prefieren nucleótidos de más de 8 nucleótidos de longitud. Las secuencias de ácido nucleico comprenden preferiblemente la secuencia CpG y más preferiblemente la secuencia purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina, donde las citosinas del CpG central están desmetiladas. La frecuencia de dinucleótidos de CpG en el DNA del adyuvante es preferiblemente al menos aproximadamente 5% y más preferiblemente aproximadamente 10%. Por ejemplo, una forma de doble hebra del oligonucleótido TCCATGACGTTCCTGACGTT (Nº ID SEC. 22) puede usarse como un adyuvante. Dependiendo del tipo de respuesta inmunitaria que se busque, puede ser útil combinar el ácido nucleico con alumbre.

La presente invención explota metodologías de DNA recombinante convencionales para generar las proteínas de fusión de Fc útiles en la práctica de la invención. Los constructos de fusión de Fc preferiblemente se generan a nivel del DNA y los DNAs resultantes se integran en vectores de expresión que se expresan para producir las proteínas de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante de la invención. Según se usa aquí, se entiende que el término "vector" significa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos competente para ser incorporada en una célula huésped y para recombinarse con e integrarse en el genoma de la célula huésped, o para replicarse autónomamente como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de RNA, vectores virales y similares. Ejemplos no limitativos de un vector viral incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adenoasociado. Según se usa aquí, se entiende que el término "expresión génica" o "expresión" de una proteína de fusión de Fc significa la transcripción de una secuencia de DNA, la traducción del transcrito de mRNA y la secreción de un producto de proteína de fusión de Fc. Las proteínas de fusión de Fc que comprenden cada una IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, blG-H3, receptor de IgE, PSMA o gp 120 se han expresado usando sistemas de expresión del tipo analizado en la presente memoria. Constructos de expresión iguales o similares se describen en las Patentes de EE.UU. Nº 5.541.087 y 5.726.044.

Como una alternativa a la fusión de proteínas mediante técnicas de ingeniería genética, puede usarse la conjugación química usando reticuladores químicos convencionales para fusionar restos proteínicos.

Vectores básicos útiles en la práctica de la invención incluyen un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), conducido por secuencias reguladoras de la transcripción, derivado, por ejemplo, del virus SV40, y secuencias de plásmidos bacterianos para la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. La expresión de las secuencias de proteínas de fusión de Fc se conduce mediante secuencias promotoras y opcionalmente potenciadoras, por ejemplo, las secuencias promotora y secuenciadora de citomegalovirus
(CMV).

Si la proteína de fusión de Fc ha de administrarse a seres humanos, las secuencias que codifican la proteína de fusión de Fc empiezan preferiblemente en una dirección 5' a 3' con una "secuencia líder" derivada, por ejemplo, de una cadena ligera (L) de anticuerpo, fusionada en el marco con al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina o una de sus formas mutantes, preferiblemente procedente de la región Fcyl del gen g1 de inmunoglobulina humana. La región Fcyl del gen Fcyl de inmunoglobulina incluye preferiblemente al menos una porción del dominio de bisagra y un dominio CH3, y más preferiblemente incluye al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Si la proteína de fusión de Fc ha de administrarse a ratones, secuencias de ácido nucleico preferidas que codifican la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica en una dirección 5' a 3', una región de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 procedente de un anticuerpo IgG2a de ratón. El extremo carboxilo de la región de cadena pesada de inmunoglobulina, si es necesario, se modifica a nivel de ácido nucleico para la ligación, en el marco, con secuencias que codifican bien el antígeno preseleccionado (en el caso de Fc-antígeno) o bien una citoquina inmunoestimulante (en el caso de una Fc-citoquina adyuvante). El DNA que codifica el casete de secreción puede estar en su configuración genómica o en su configuración de cDNA.

La porción del DNA que codifica la secuencia de señal preferiblemente codifica un segmento peptídico que dirige la secreción de la proteína de fusión de Fc y posteriormente se separa por segmentación del resto de la proteína de fusión de Fc. La secuencia de señal de la invención es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico. Secuencias de señal que son útiles en la invención incluyen secuencias de señal de cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo anticuerpo 14.18 (Gillies y otros (1989) J. OF IMMUNOL. METH., 125:191), secuencias de señal de cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo las secuencias de señal de cadena pesada de anticuerpo MOPC 141 (Sakano y otros (1980) NATURE 286:5774), y cualesquiera otras secuencias de señal que sean conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Watson (1984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:5145).

Las secuencias de señal se han caracterizado bien en la técnica y se sabe típicamente que contienen de 16 a 30 residuos de aminoácido, y pueden contener más o menos residuos de aminoácido. Un péptido de señal típico consiste en tres regiones: una región N-terminal básica, una región hidrófoba central y una región C-terminal más polar. La región hidrófoba central contiene de 4 a 12 residuos hidrófobos que anclan el péptido de señal a través de la bicapa lipídica de la membrana durante el transporte del polipéptido naciente. Después de la iniciación, el péptido de señal habitualmente se segmenta dentro de la luz del retículo endoplásmico mediante enzimas celulares conocidas como peptidasas de señal. Los sitios de segmentación potenciales del péptido de señal generalmente siguen la "regla (-3, -1)". Así, un péptido de señal típico tiene pequeños residuos de aminoácido neutros en las posiciones -1 y -3 y carece de residuos de prolina en esta región. La peptidasa de señal segmentará tal péptido de señal entre los aminoácidos -1 y +1. Así, la secuencia de señal puede segmentarse del extremo amino de la proteína de fusión durante la secreción. Esto da como resultado la secreción de una proteína de fusión de Fc. Secuencias de péptido de señal útiles en la práctica de la invención son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14:4683.

Como se hará evidente para un experto en la técnica, la idoneidad de una secuencia de señal particular para el uso en el casete de secreción puede requerir alguna experimentación habitual. Tal experimentación puede incluir determinar la capacidad de la secuencia de señal para dirigir la secreción de una proteína de fusión de Fc y/o determinar la configuración óptima, genómica o cDNA, de la secuencia que ha de usarse para alcanzar una secreción eficaz de proteínas de fusión de Fc. Adicionalmente, un experto en la técnica es capaz de crear un péptido de señal sintético siguiendo las reglas presentadas por Von Heijne, mencionado anteriormente, y probando la eficacia de tal secuencia de señal sintética mediante experimentación habitual. Los términos "secuencia de señal", "péptido de señal", "secuencia líder" o "péptidos líderes" se usan intercambiablemente en la presente memoria.

Se contempla que puede usarse un número de diferentes modos de administración de las proteínas de fusión de Fc para inmunizar a un receptor contra un antígeno preseleccionado. Pueden usarse dos aplicaciones diferentes de la presente descripción para generar respuesta de CTL, una basada en la inyección de DNA que codifica una proteína de fusión de Fc-antígeno y una segunda basada en la administración de proteína de fusión de Fc-antígeno capaz de aportar la proteína a la ruta del MHC clase I.

La inyección de antígenos proteínicos se usa típicamente para provocar respuestas inmunitarias en mamíferos. Sin embargo, también pueden usarse métodos para aportar antígeno a APCs mediante inyección de DNA. Una técnica comúnmente usada es inyectar vectores de expresión de DNA, que codifican una proteína antigénica, en músculo. Los informes sugieren que el antígeno proteínico es expresado por células musculares pero que el antígeno no es presentado al sistema inmunitario por estas células. Por el contrario, se cree que APCs especializadas, por ejemplo macrófagos y células dendríticas, migran a la zona de inyección, recogen y presentan el antígeno a través de un proceso que no se ha explicado todavía. El uso de vectores de expresión de proteínas de fusión de Fc-antígeno hace a este procedimiento más eficaz debido a que la proteína de fusión secretada se une más eficazmente a APCs que la proteína antigénica natural.

Una consecuencia del sistema de inyección de DNA es que a menudo puede dar como resultado la generación de respuestas tanto humoral como celular. Típicamente, las proteínas administradas exógenamente tienen una oportunidad más difícil de entrada en la ruta para la presentación en moléculas del MHC clase I. Sin embargo, la administración de las proteínas de fusión de Fc de la invención potencia la generación de células citotóxicas, probablemente a través de la presentación al MHC clase I del antígeno exógeno preseleccionado. Las combinaciones de inmunización con DNA e inmunización con proteína también pueden funcionar sinérgicamente para cebar en primer lugar el sistema inmunitario y a continuación reforzar el nivel de respuesta en forma tanto de producción de anticuerpos como de respuestas celulares citotóxicas. La coadministración de proteínas de fusión de Fc-adyuvante, por ejemplo, Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 y Fc-ligando Flt3, junto con la proteína de fusión de Fc-antígeno asegura la colocalización de las proteínas de fusión en el mismo compartimento celular de las APCs, estimulando de ese modo una respuesta inmunitaria más potente contra el antígeno preseleccionado.

Las composiciones de la presente invención (es decir, proteínas de fusión de Fc-antígeno y/o Fc-adyuvante) pueden proporcionarse a un animal mediante cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, como mediante inyección, implantación o administración tópica a un lugar del tejido) o sistémicamente (por ejemplo, parenteralmente u oralmente). Cuando la composición ha de proporcionarse parenteralmente, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, transdérmica, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o mediante aerosol, la composición comprende preferiblemente parte de una suspensión de fluido acuoso o fisiológicamente compatible. Así, el portador o vehículo es fisiológicamente aceptable de modo que, además del aporte de la composición deseada al paciente, no afecta adversamente de otro modo al equilibrio electrolítico y/o volumétrico del paciente. El medio fluido para el agente puede comprender así solución salina fisiológica normal (por ejemplo, NaCl acuoso al 9,85%, 0,15M, pH 7-7,4).

Dosificaciones preferidas de la proteína de fusión de Fc-antígeno para la administración están dentro del intervalo de 50 ng/m^{2} a 1 g/m^{2}, más preferiblemente de 5 \mug/m^{2} a 200 mg/m^{2} y lo más preferiblemente de 0,1 mg/m^{2} a 50 mg/m^{2}. Dosificaciones preferidas de la proteína de fusión de Fc-adyuvante por administración están dentro del intervalo de 1 ng/m^{2} a 0,1 g/m^{2}, más preferiblemente de 0,5 \mug/m^{2} a 20 mg/m^{2} y lo más preferiblemente de 100 \mug/m^{2} a 5 mg/m^{2}. Dosificaciones preferidas de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de Fc-antígeno o Fc-adyuvante por administración están dentro del intervalo de 1 \mug/m^{2} a 100 mg/m^{2}, más preferiblemente de 20 \mug/m^{2} a 10 mg/m^{2} y lo más preferiblemente de 400 \mug/m^{2} a 4 mg/m^{2}.

Se contempla que la inmunización máxima puede alcanzarse realizando numerosas inmunizaciones separadas, por ejemplo, de 1 a 3 inoculaciones separadas de aproximadamente 3 semanas a 6 meses. Por otra parte, según se analiza anteriormente, pueden alcanzarse respuestas inmunitarias máximas bajo ciertas circunstancias alternando entre la administración de proteínas de fusión de Fc y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de fusión de Fc. Se contempla que la proteína de fusión de Fc-antígeno puede administrarse antes, simultáneamente con o después de que la proteína de fusión de Fc-adyuvante o el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de Fc-adyuvante se administre al mamífero. Sin embargo, se contempla que los modos de administración, las dosificaciones y los regímenes de refuerzo óptimos pueden determinarse mediante experimentación habitual dentro del nivel de experiencia en la técnica.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de Vectores de Expresión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante

Para probar apropiadamente la inmunogenicidad de las proteínas de fusión de Fc en un modelo de ratón, se construyeron vectores de expresión usando secuencias de ácido nucleico que codifican regiones Fc de IgG2a de ratón. Esto reduce el riesgo de que la región Fc de cada proteína de fusión induzca una respuesta inmunitaria en el mamífero. Por otra parte, se usaron citoquinas de ratón como socios de fusión en constructos de fusión de Fc-adyuvante debido a que sus actividades biológicas pueden ser altamente específicas de la especie. Así, vectores presentados previamente (Lo y otros (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500) se modificaron (véase la Figura 2) reemplazando la secuencia de Fc de IgG1 humana por secuencias de cDNA que codifica la Fc de IgG2a de ratón (Patente de EE.UU. Nº
5.726.044).

La secuencia de Fc de IgG2a de ratón se clonó a partir de una biblioteca de células de bazo de ratón mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores de PCR contenían secuencias adaptadoras para ensamblar una secuencia líder en el extremo 5' y un sitio de restricción Sma I/Xma I único en el extremo 3' para la ligación con secuencias que codifican bien antígenos o bien citoquinas adyuvantes. Las secuencias del antígeno y el adyuvante (citoquina) se prepararon con un sitio Sma I 5' y manteniendo los marcos de lectura entre Fc y proteínas de antígeno o adyuvante, y un sitio Xho I único se situó justo después de la señal de parada de la traducción.

El constructo de DNA resultante codificaba una secuencia líder de cadena ligera fusionada directamente a la región de bisagra de la cadena H de IgG2a de ratón y que continuando a través de los exones CH2 y CH3 de IgG2a de ratón y el socio de fusión (bien el antígeno o bien la citoquina adyuvante). La transcripción se condujo mediante el promotor/potenciador de CMV, que se ha encontrado que es útil para la expresión en la mayoría de los tipos de células en cultivo, así como para la expresión en músculo y otros tipos celulares después de la inyección de DNA in vivo. Un gen marcador de dihidrofolato reductasa (DHFR) seleccionable se incluyó en cada vector para facilitar la selección de clones establemente transfectados, como también secuencias necesarias para el mantenimiento del DNA plasmídico en E. coli.

Los siguientes constructos de Fc-antígeno ejemplares se crearon insertando secuencias apropiadamente adaptadas entre los sitios Sma I a Xho I únicos en el vector denominado pdCs-muFc, donde "mu" indica que la Fc es de origen de ratón:

El ectodominio (la porción extracelular) del receptor de IL4 (IL-4R) humano se clonó a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a través de amplificación por PCR. Los cebadores usados eran 5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC (Nº ID SEC: 1) y 5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGGT
CCCTG (Nº ID SEC: 2), que contenían los sitios Sma I y Xho I, respectivamente, para la inserción en el vector pdCs-muFc. Las condiciones de reacción de PCR usadas para esto, y las clonaciones siguientes, eran como sigue. Se usaron Advantage KlenTaq y Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA), y cebadores específicos para amplificar el gen o los genes de interés. Las mezclas de reacción contenían Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01% (p/v), 0,2 mM de cada uno de los dNTPs y 1,25 unidades de Klen Taq en un volumen total de 100 ml. Se realizaron 30 ciclos de PCR, consistiendo cada ciclo en desnaturalización térmica a 94ºC durante 1 min, reasociación a 42ºC durante 45 s y extensión con cebador a 72ºC durante 1 min. El producto amplificado se subclonó a continuación en un vector SK (Stratagene, San Diego, CA) y su secuencia de DNA ser verificó mediante metodologías de secuenciación estándar.

El ectodominio de antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) humano se clonó a partir de la línea celular de carcinoma de próstata LnCAP (ATCC CRL1740) a través de PCR usando los cebadores 5' AAGCT
TAAATCCTCCAATGAAGC (Nº ID SEC: 3) y 5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG (Nº ID SEC: 4), para las hebras de sentido y antisentido, respectivamente. La secuencia de DNA se replicó y el fragmento de PCR se insertó en el vector dpCS-muFc para producir el constructo de fusión dpCs-muFc-PSMA.

El ectodominio de EpCAM humano (también conocido como antígeno KS), una proteína de la superficie celular epitelial regulada al alza en la mayoría de las células de carcinoma, se clonó a partir de células LnCAP a través de PCR usando los cebadores 5' CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (Nº ID SEC: 5) y 5' CTCGAGTCATTT
TAGACCCTGCATTGAG (Nº ID SEC: 6) para las hebras de sentido y antisentido, respectivamente. La secuencia de DNA se verificó mediante metodologías de secuenciación estándar y el fragmento de PCR se insertó en el vector pdCs-muFc para producir el constructo de fusión pdCs-muFc-EpCAM. Se construyó otro vector usando el ectodominio de EpCAM como el socio de fusión N-terminal y en este caso el producto de PCR incluía el líder natural del cDNA de EpCAM y la secuencia de ectodominio madura hacia el límite del dominio que abarca la membrana. El extremo 3' de este producto de PCR contenía un sitio Afl II tratado mediante ingeniería para la ligación al sitio Afl II 5' del fragmento Fc múrido. Los cebadores de PCR usados incluían 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (Nº ID SEC: 7) y 5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG (Nº ID SEC: 8). En este caso, la Fc múrida carecía de un sitio de inserción 3' para insertar una proteína de fusión, pero contenía una señal de terminación de la traducción en el extremo de la secuencia de codificación de Fc.

Una porción relativamente conservada de la región proximal a la membrana de gp41 de HIV, que se extiende desde un sitio Hind III hasta el residuo de lisina adyacente a la región que abarca la membrana, se expresó como una proteína de fusión de Fc como un ejemplo de una secuencia antigénica polipeptídica corta. Aunque se usaba la secuencia proteínica procedente de la hebra IIIB de HIV, la secuencia de codificación se optimizó para la expresión de células eucarióticas óptimas usando una tendencia codónica de alto contenido de GC. Una secuencia de DNA que codifica los residuos de aminoácido 626 a 669 que tiene la siguiente secuencia: C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTCGAG (Nº ID SEC: 9) se sintetizó químicamente y se ligó en el vector pdCs-muFc. La secuencia de aminoácidos del polipéptido fusionado era: SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (Nº ID SEC: 10).

Otras secuencias que codifican proteínas de HIV se usaron para construir proteínas de fusión de Fc-antígeno como las descritas previamente (Patentes de EE.UU. Nº 5.541.087 y 5.726.044) usando la Fc de IgG2a de ratón en vez de la Fc de IgG1 humana original. Estos constructos representan modalidades adicionales de la invención.

Una serie de proteínas de fusión de Fc-adyuvante (citoquina) que comprenden la Fc de IgG2a de ratón y varias citoquinas de ratón se construyó de la misma manera que para las proteínas de fusión de Fc-antígeno. Las citoquinas específicas y los cebadores de clonación se analizan posteriormente.

IL-2 de ratón se clonó a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) múridas a través de PCR usando los cebadores de PCR (sentido) 5' GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (Nº ID SEC: 11) y (antisentido) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (Nº ID SEC: 12).

GMCSF de ratón se clonó a partir de PBMCs múridas a través de PCR usando los cebadores de PCR (sentido) 5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC (Nº ID SEC: 13) y (antisentido) 5'CTCGAGTCATTTTTGGCTTGG
TTTTTTGC (Nº ID SEC: 14).

Ligando Flt3 de ratón se clonó a partir de timo múrido a través de PCR usando los cebadores de PCR (sentido) 5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC (Nº ID SEC: 15) y (antisentido) 5' CTCGAGTCAAGGCTCTGG
GAGCTCCGTGGC (Nº ID SEC: 16).

p35 de IL-12 de ratón se clonó a partir de PBMCs múridas a través de PCR usando los cebadores de PCR (sentido) 5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (Nº ID SEC: 17) y (antisentido) 5' CTCGAGTCAGGCGGAGCT
CAGATAGC (Nº ID SEC: 18).

p40 de IL12 de ratón se clonó a partir de PBMCs múridas a través de PCR usando los cebadores de PCR (sentido) 5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (Nº ID SEC: 19) y (antisentido) 5' CTCGAGCTAGGATCG
GACCCTGCAG (Nº ID SEC: 20).

Todos los productos de PCR, excepto para el p40 de IL-12 de ratón, se clonaron como fragmentos Sma I a Xho I, se analizaron mediante metodologías de secuenciación de DNA estándar y se ligaron en el vector pdCs-muFc que contenía Fc múrida de IgG2a como su región Fc. El producto de PCR de p40 de IL-12 de ratón se expresó separadamente (no como una proteína de fusión de Fc) en un vector que contenía el mismo promotor-potenciador de CMV, una secuencia líder de cadena ligera fusionada directamente a la subunidad p40 de ratón madura de IL-12 y un gen de resistencia a neomicina en lugar del gen marcador seleccionable de DHFR en el vector pdCS-muFc. El vector resultante se denominó pNC-mp40, donde la "N" indica un gen de selección de neomicina.

Todos los constructos plasmídicos inducían la síntesis y la secreción de las proteínas de fusión específicas mediante la expresión transitoria en células 293 de riñón humanas. Brevemente, los plásmidos se introdujeron en células de monocapa renales humanas 293 a través de coprecipitación con fosfato cálcico (Sambrook y otros (1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N.Y.). Las células se dejaron durante la noche (16 h), se enjuagaron con PBS y se alimentaron con medio de cultivo celular 200 (DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS)). Después de 2-3 días adicionales, el medio de cultivo se probó con respecto a proteínas de fusión secretadas mediante un ELISA específico para Fc (Gillies y otros (1989) J. IMMUNOL. METHODS 125:191) usando anticuerpos específicos para proteína de Fc de IgG de ratón. En el caso de la Fc-IL 12 de ratón, ambos DNAs de los plásmidos de expresión de p35 y p40 de Fc se expresaron transitoriamente en el mismo cultivo celular de modo que la proteína de fusión de citoquina heterodímera se montaba antes de la secreción fuera de la célula (Gillies y otros (1998) J. IMMUNOL. 160:6195).

Posteriormente, células establemente transfectadas que expresan las diversas proteínas de fusión de Fc se generaron introduciendo DNA linealizado en células de mieloma NS/0 de ratón mediante técnicas de electroporación estándar. Brevemente, las células se suspendieron en una Gene Pulser Cuvette (BioRad) a 10^{7} células/ml y 0,5 ml de la suspensión se mezclaron con 10 \mug de DNA y la mezcla se refrigeró sobre hielo durante 10 minutos. La electroporación se realizó usando un Gene Pulser (BioRad) con graduaciones de 0,25 V y 500 \muF. Se dejó que las células se recuperaran sobre hielo durante 10 minutos, después de lo cual se resuspendieron en medio de crecimiento y se transfirieron a placas de 96 pocillos. Las células se alimentaron cada 2-3 días con medio de selección que contenía metotrexato 0,1 \muM empezando 2 días después de la electroporación. Colonias resistentes a fármaco que crecían en las placas de 96 pocillos se probaron con respecto a la expresión mediante el procedimiento de ELISA de Fc.

Para la expresión de la proteína de fusión de Fc-IL12 de ratón, una línea celular transfectada de NS/0 que ya expresaba la subunidad p40 de IL-12 de ratón se transfectó, según se describe anteriormente, con el vector de expresión de Fc-subunidad p35 de ratón. La línea que expresa p40 se obtuvo mediante electroporación de células NS/0 con el vector pNC-mp40, descrito anteriormente, y selección en medio que contenía el análogo de neomicina G418 (Life Sciences Technologies). Después de la segunda transfección, los clones celulares sobrevivientes se rastrearon mediante un ELISA de Fc y un ELISA de IL-12 de ratón (Genzyme, Cambridge, MA).

La integridad estructural de las proteínas de fusión resultantes se probó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Inicialmente, las proteínas de fusión se unieron a un pequeño volumen (10-20 \mul por ml de medio) de proteína A-Sepharose (Repligen, Needham, MA). El material unido se lavó con PBS que contenía Tween-20 (0,01%), a continuación se eluyó en tampón de gel que contenía SDS y a continuación ebullición durante 2 minutos en presencia de 2-mercaptoetanol al 5%. Las proteínas reducidas se hicieron pasar a continuación sobre geles de SDS-PAGE precolados y se tiñeron con azul de Coomassie. Las purificaciones a gran escala a partir de clones celulares estables se realizaron usando columnas de proteína A-Sepharose (Repligen, Needham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2

Inmunogenicidad de una Fc-antígeno y el Efecto de Adyuvantes Químicos o de Fc-citoquina sobre la Producción de Anticuerpos

El constructo de Fc de ratón-subunidad alfa de huIL-4R preparado en el Ejemplo 1 se usó como un antígeno para probar el efecto de orientación a APC potencial de estas proteínas en un modelo animal. El ectodominio de la subunidad alfa de IL-4R representa una molécula bastante conservada entre especies, teniendo más de 50% de identidad de secuencia entre seres humanos y ratones.

Grupos de ratones fueron inyectados subcutáneamente con 50 \mug de la proteína de fusión Fc-antígeno (Fc-IL-4R) bien en PBS o bien emulsionados en adyuvante completo de Freund (CFA). Algunos grupos también recibían una dosis de 5 \mug (mezclada con la Fc-IL-4R) de una proteína de Fc-adyuvante bien de Fc-IL2 o bien de Fc-GMCSF. Dos semanas más tarde, los ratones fueron inyectados con la misma mezcla pero administrada a la cavidad peritoneal. La formulación de CFA crea micelas que sirven para formar una fuente de antígeno liberado lentamente, permitiendo la estimulación continua del sistema inmunitario. Proteínas micobacterianas en el CFA también inducen una respuesta inflamatoria fuerte a través de estimulación con citoquina, potenciando adicionalmente de ese modo una respuesta inmunitaria. Sin embargo, el CFA provoca varios efectos secundarios incluyendo daño cutáneo, haciéndolo inutilizable en seres humanos. La mezcla con las proteínas de fusión de Fc-adyuvante en PBS, sin embargo, no parecía provocar ninguna reacción cutánea visible o ningún otro signo evidente de toxicidad en ninguno de los
animales.

Dos semanas después del refuerzo (es decir, 28 días después de la primera inyección) los animales fueron sangrados y los sueros se prepararon dejando que la sangre entera se coagulara en tubos de microcentrífuga, centrifugando las células y el material coagulado a alta velocidad, 12.000 RPM, durante 5 minutos y recuperando el sobrenadante. Los sueros resultantes se diluyeron con tampón de ensayo (PBS que contenía 0,01% de Tween-20) y se probaron con respecto a anticuerpos reactivos con IL-4R humano. Se realizó un ELISA específico de antígeno usando placas de 96 pocillos revestidas con Fc humana-hulL-4R (100 \mul de 5 \mug/ml en PBS se añadieron a cada pocillo y se incubaron a 4ºC (durante la noche)). Las placas revestidas con antígeno se lavaron a continuación y se bloquearon con tampón de bloqueo (BSA al 1%, Tween-20 al 0,01% en PBS) antes de usar. Diluciones de los sueros de prueba se incubaron en los pocillos durante 2 horas a temperatura ambiente y a continuación los pocillos se lavaron ocho veces con tampón de ensayo. Se añadió anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano picante específico de Fc anti-ratón secundario (dilución 1:2000, Jackson ImmunoResearch) y las placas se incubaron durante otra hora. Después de ocho lavados adicionales con tampón de ensayo, se añadió una solución de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) que contenía ácido cítrico 25 mM, Na_{2}HPO_{4} 50 mM, pH 5, y 0,03% de H_{2}O_{2} recientemente añadido. La reacción se detuvo después de aproximadamente 30 minutos mediante la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 4N. Las placas resultantes se leyeron a 490 nm en un lector de placas que automáticamente substraía la lectura de fondo a 650 nm. Los resultados se representaron como densidad óptica frente a dilución de antisuero. Las concentraciones de anticuerpo relativas se determinaron mediante la cantidad de suero que tenía que diluirse antes de que la densidad óptica cayera por debajo de un valor arbitrario de, por ejemplo, 1 unidad de D.O.

Los resultados de los protocolos de inmunización se muestran en la Figura 3. La inyección de la proteína de fusión de Fc de ratón-IL-4R sola en PBS mediante este protocolo inducía una respuesta de anticuerpo solo en un ratón (Figura 3B). Sin embargo, la adición de CFA daba como resultado más ratones sensibles, pero las concentraciones eran básicamente las mismas que en el ratón sensible inyectado con proteína de fusión de Fc-IL4R sola en PBS (Figura 3C). La coadministración del adyuvante de Fc de ratón-IL2 con Fc-IL4R en PBS inducía respuestas en todos los animales, sin embargo, la cantidad de anticuerpo producida en cada caso variaba (Figura 3D). La combinación de CFA y el adyuvante de Fc de ratón-IL2 conjuntos (Figura 3A) daba como resultado concentraciones de anticuerpo superiores que cualquier agente solo (Figuras 3C y 3D). La coadministración del adyuvante de Fc de ratón-GMCSF en PBS inducía la respuesta inmunitaria más fuerte de todos los grupos (Figura 3E), incluyendo el grupo que era inmunizado con la combinación tanto de adyuvante de Fc-GMCSF como CFA (Figura 3F). En otras palabras, el adyuvante de Fc de ratón-GMCSF en PBS, cuando se coadministraba con el antígeno de Fc de ratón-IL4R, obviaba la necesidad de usar CFA. Se contempla que tal método sería más apropiado para el uso en seres humanos.

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Ejemplo 3

Efecto de Dosis de Adyuvante de Fc-GMCSF sobre Anticuerpo Producido contra el Antígeno de Cáncer, PSMA, en la Proteína de Fusión Fc-PSMA

El PSMA representa actualmente un antígeno diana asociado con tumores humanos atractivo debido a su distribución restringida en tejidos normales. El PMSA se está probando actualmente en experimentos clínicos como un candidato para vacunas para tumores. En este ejemplo, se evaluó la inmunogenicidad del antígeno PMSA en una proteína de fusión de Fc-PMSA.

La proteína de fusión de Fc de ratón-PSMA se preparó como se analiza en el Ejemplo 1. Grupos de ratones fueron inyectados subcutáneamente con 50 \mug de Fc de ratón-PSMA en PBS, junto con concentraciones variables de la proteína de fusión de Fc-adyuvante, Fc-GMCSF, y a continuación se reforzaron mediante inyección intraperitoneal 14 días más tarde. Las concentraciones de anticuerpo se midieron a través de ELISA de captura de Fc-antígeno PSMA, según se describe en el Ejemplo 2 para la proteína de fusión de Fc-IL4R. Los resultados se representaron en la Figura 4 como concentración de anticuerpo (dilución a la cual la DO se reduce hasta 1) frente al tiempo después de la primera inyección.

En ausencia de Fc-GMCSF, los ratones tenían concentraciones de anticuerpo contra PSMA que variaban de 1000 a aproximadamente 20.000 (Figura 4A). La coadministración de tan poco como 0,05 \mug de Fc-GMCSF, sin embargo, daba como resultado concentraciones que variaban de 30.000 a 140.000 (Figura 4B). Incrementos de diez veces de Fc-GMCSF estimulaban adicionalmente las concentraciones de anticuerpo para este antígeno de cáncer (Figuras 4C y 4D). La dosis más alta administrada (5 \mug de la proteína de fusión Fc-GMCSF por ratón) todavía solo representa aproximadamente 2 \mug de GMCSF por inyección - una dosis sin efecto aparente sobre la piel del ratón o cualquier signo sistémico de que el animal se ha inmunizado (véase la Figura 4D). Por otra parte, a diferencia con el CFA, no hay un agrandamiento evidente del bazo.

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Ejemplo 4

Efecto del Aporte mediado por Fc de PSMA sobre la Respuesta de Anticuerpo a la Inmunización

Los efectos específicos del componente de Fc de las proteínas de fusión de Fc-antígeno y Fc-adyuvante se probaron comparando las respuestas inmunitarias inducidas en ratones inyectados con las proteínas de fusión, las proteínas de antígeno o adyuvante no fusionadas o con mezclas de los precedentes. El sistema de PSMA humano se usó para este propósito.

Se preparó PSMA no fusionado mediante digestión proteolítica de proteína de fusión de Fc humana-PSMA (Lo y otros (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500) con plasmina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Fc liberada y Fc-PSMA no digerida se retiraron mediante absorción a proteína A-Sepharose (Repligen, Needham, MA).

Grupos de ratones (n=3) fueron inyectados con una sola dosis subcutánea de 50 \mug de PSMA solo (Figura 5A) o en combinación con 0,2 \mug de GMCSF libre (Figura 5B) o con 0,5 \mug de Fc-GMCSF (Figura 5C) (0,5 \mug de Fc-GMCSF que contienen aproximadamente 0,2 \mug de GMCSF). En otro grupo de ratones cada ratón fue inyectado con una dosis subcutánea de 50 \mug de proteína de fusión de Fc de ratón-PSMA sola (Figura 5D) o junto con 0,2 \mug de GMCSF libre (Figura 5E) o 0,5 \mug de Fc-GMCSF (Figura 5F). Todas las formulaciones de inyección estaban en PBS sin adyuvante químico. Los anticuerpos reactivos con Fc de ratón-PSMA se midieron el día 14 después de la inmunización.

La importancia del componente de Fc de la proteína de fusión de Fc-antígeno en la proteína de fusión de Fc-PSMA para la inmunogenicidad de PSMA era sorprendente cuando los animales se inyectaban con formulaciones de PBS sin adyuvantes químicos. Esencialmente no existía respuesta inmunitaria primaria al PSMA administrado en PBS (Figura 5A). La adición de GMCSF o Fc-GMCSF a la inmunización tenía muy poco efecto (Figuras 5B y 5C), excepto por una respuesta débil en un animal (Figura 5B). En contraste, los animales inyectados con Fc-PSMA sola mostraban respuestas inmunitarias primarias fuertes en todos los casos (Figura 5D). La adición de GMCSF libre a Fc-PSMA reforzaba el efecto ligeramente (Figura 5E), pero la coadministración tanto de antígeno como de citoquina como proteínas de fusión de Fc daba el nivel más alto de respuesta (Figura 5E).

Estos resultados indican que la combinación de Fc-antígeno y Fc-adyuvante es particularmente útil para generar una respuesta inmunitaria y muestran el beneficio evidente de colocalizar el antígeno y la citoquina estimulante in vivo, presumiblemente hacia las APCs.

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Ejemplo 5

Comparación de los Efectos Adyuvantes de las Proteínas de Fusión Fc-GMCSF o Fc-Flt3L

Se mostrado que el ligando para Flt3, también denominado en la técnica ligando de Flt3 (Flt3L), representa un papel crítico en la generación y la maduración de células dendríticas (Soligo y otros (1998) BR. J. HAEMATOL. 101:352-63). Se cree que las células dendríticas, junto con células macrófagas tisulares, son las APC más importantes. Estudios en ratones han mostrado que inyecciones durante 10 días incrementan el número de actividad de APC de células dendríticas recuperables de tejido linfático y bazo, y que estas células son extremadamente potentes al presentar antígeno a células T tanto CD4^{+} como CD8^{+}. Se cree que las células de Langerhans de la piel representan un tipo de célula dendrítica capaz de presentar antígeno después de la captación y la migración a nódulos linfáticos locales. Debido a que se cree que la mayoría de las células dendríticas no expresan la serie de receptores de Fc típicamente encontrados en macrófagos (por ejemplo, Fc\gammaRI), no podría predecirse si el efecto de colocalización de las proteínas de fusión de Fc implicaría a este linaje de APC.

Para probar si Flt-3L podría funcionar como un adyuvante, grupos de ratones fueron inyectados con Fc de ratón-PSMA y Fc de ratón-Flt3L, en vez de usar la proteína de fusión de Fc de ratón-GMCSF (un potente estimulante de macrófagos y granulocitos). En este caso, se esperaba que cualquier efecto adyuvante estuviera mediado a través de la activación y la captación por células dendríticas, que finalmente darían como resultado una respuesta de anticuerpo a PMSA. Los resultados se resumen en la Figura 6.

Este estudio indica que Fc de ratón-Flt3L es un poderoso adyuvante que estimula anticuerpos anti-PSMA tan bien como, si no mejor que, la misma dosis de Fc-GMCSF. Los resultados apoyan la observación de que una combinación de una Fc-antígeno y una Fc-adyuvante puede ser particularmente potente para inducir una respuesta inmunitaria. Los resultados también muestran que las APC dendríticas aparentemente pueden ser orientadas con Fc-antígeno y Fc-citoquina así como APC macrófagas, sugiriendo que al menos una forma de receptor de Fc está presente sobre estas células.

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Ejemplo 6

Respuestas Inmunitarias a Proteínas de Fusión de Fc-EpCAM y EpCAM-Fc

Otro antígeno canceroso humano potencialmente importante, EpCAM (también llamado KSA y antígeno 17-1A), se produjo como una proteína de fusión con una región Fc de IgG2a de ratón usando los plásmidos y los métodos que se describen en el Ejemplo 1, y se administró solo o en combinación con Fc-GMCSF como un adyuvante. Los ratones fueron inyectados subcutáneamente y reforzados después de 3 semanas con 10 \mug de Fc-EpCAM y 1 \mug de Fc-GMCSF en PBS. Los ratones de control no recibían Fc-GMCSF. Las concentraciones de anticuerpos dirigidos contra EpCAM se midieron 7 días (Figura 7A) y 14 días (Figura 7B) después del refuerzo. Los resultados indican que Fc-EpCAM, cuando se administraba sola, es un potente inmunógeno (rombos abiertos) y que Fc-GMCSF puede reforzar adicionalmente la respuesta a este antígeno (triángulos cerrados).

Además, el antígeno EpCAM se expresó en la orientación inversa con respecto al fragmento Fc como EpCAM-muFc (véase el Ejemplo 1, Figura 1B). Esta molécula se usó para inmunizar ratones Balb/c mediante inyección subcutánea. Se usaron dosis superiores de proteína de fusión de EpCAM-Fc (25 \mug por dosis) y la cantidad de adyuvante (2,5 \mug de Fc-GMCSF) también se incrementó. Las concentraciones de anticuerpo dirigidos contra EpCAM se midieron 14 días (Figura 8A) y 21 días (Figura 8B) después de la inmunización. La proteína de fusión de EpCAM-Fc sola era bastante inmunogénica en ausencia de Fc-GMCSF (Figuras 8A y 8B, (rombos abiertos)). La adición de la Fc-citoquina mejoraba las concentraciones de anticuerpo en aproximadamente 3 veces (Figura 8A y 8B, (triángulos sólidos)).

Para probar si la respuesta inmunitaria contra EpCAM podía proteger a los animales de células tumorales que expresan este antígeno, ratones no imunizados o aquellos inmunizados con proteína de fusión de EpCAM-Fc (y en algunos casos Fc-citoquinas) se inyectaron en la vena de la cola con 10^{5} células cancerosas de colon de ratón CT26 transfectadas con EpCAM humano (Gillies y otros (1998) J. IMMUNOL. 160:6195). Veintiún días más tarde, los animales fueron sacrificados y la extensión de las metástasis pulmonares se estimó (1) graduando en términos de la cobertura de la superficie pulmonar y (2) pesando los pulmones y comparándolos con pulmones de animales normales para determinar el incremento de peso diferencial atribuible a la masa de tumor. Los resultados resumidos en la Tabla 1 muestran que todos los ratones inmunizados mostraban reducciones estadísticamente significativas en las metástasis tumorales en comparación con los ratones de control, incluyendo animales inmunizados con la proteína de fusión de EpCAM-Fc sola. Se alcanzaron resultados similares usando la proteína de fusión Fc-EpCAM como el antígeno.

TABLA 1

1

Las evaluaciones metastáticas se basaban en la cobertura superficial de los pulmones usando las siguientes valoraciones: 1 = 1-25% de cobertura; 2 = 26-50% de cobertura; 3 = 51-75% de cobertura; y 4 = 76-100% de cobertura.

Ejemplo 7

Combinación de Antígeno-Fc y Adyuvante de Citoquina en una sola Proteína de Fusión

La proteína descrita en el Ejemplo 6, EpCAM-Fc, ejemplifica un antígeno N-terminal, enlazada a una región Fc de inmunoglobulina como el dominio de proteína carboxílico. Esta proteína, y otras como ella, puede coadministrarse con proteínas de fusión de Fc-adyuvante, por ejemplo, Fc-citoquinas, para reforzar la respuesta inmunitaria al antígeno. Alternativamente, el antígeno, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y la proteína adyuvante (por ejemplo, citoquina) pueden producirse como una sola proteína de fusión, por ejemplo, como una proteína de fusión EpCAM-Fc-GMCSF.

El plásmido de expresión para esta proteína se construyó usando las secuencias de Fc de IgG2a múrida y GMCSF de modo que el constructo pudiera evaluarse en un modelo de ratón. Un pequeño fragmento Xba I a Sma I que contiene las secuencias de codificación de líder-EpCAM-Fc se obtuvo a partir del vector de expresión de EpCAM-Fc original (Ejemplo 1) y se ligó en el fragmento grande Sma I a Xba I del vector de expresión de Fc-GMCSF (Figura 9).

El vector resultante, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF, se introdujo en células 293 usando el método de precipitación con fosfato cálcico, para la expresión transitoria, y en células NS/0 mediante electroporación para la expresión estable. Se seleccionaron transfectantes estables cultivando las células en medio que contiene metotrexato (0,1 \muM). Se identificaron clones de expresión mediante ELISA de Fc (véase el Ejemplo 1) y se expandieron en el cultivo productores de alto nivel. La proteína de EpCAM-Fc-GMCSF se purificó a partir de medios acondicionados mediante unión a y elución de proteína A-Sepharose (Repligen, Needham, MA), y la integridad estructural se analizó mediante SDS-PAGE después de reducción con 2-mercaptoetanol. Los resultados indicaban que la proteína tenía una peso molecular de aproximadamente 90 kD, según se esperaba a partir de una fusión monocatenaria de EpCAM, Fc y GMCSF.

Para comparar la inmunogenicidad relativa de la proteína de fusión combinada, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con dosis equivalentes de EpCAM-Fc-GMCSF y las proteínas de fusión individuales en combinación: EpCAM-Fc y Fc-GMCSF. Las mismas inyecciones se administran 14 días más tarde y las muestras de suero se prueban con respecto a la reactividad de anticuerpo específica para EpCAM humano 7 días después del refuerzo. El mismo sistema puede usarse para otros antígenos proteínicos o peptídicos así como para otras citoquinas estimulantes, tales como IL-2, IL-12 y Flt3L.

Ejemplo 8

Inmunización con Fc-antígeno mediante Inyección de DNA

Los mismos vectores de expresión usados para la transfección y producción de Fc-EpCAM y EpCAM-Fc de ratón en células mamíferas (véase el Ejemplo 1) se inyectaron como DNA plasmídico (desnudo) en el músculo de la pata trasera de grupos de ratones Balb/c. El DNA se inyectó a una concentración de 0,5 mg/ml y una cantidad total de 100 \mug se administraron bien en BPS o bien en una solución de sacarosa al 25% (p/v). Las inyecciones se repitieron cada 3 horas para un total de 3 inyecciones. Se midieron las respuestas de anticuerpo en momentos variables y se cuantificaron mediante ELISA usando placas de 96 pocillos revestidas con Fc-EpCAM humano para la captura, y usando un anticuerpo policlonal específico anti-Fc de ratón conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch) para la detección. Los datos presentados en la Figura 10 representan concentraciones de anticuerpo registradas 14 días (Figura 10A), 27 días (Figura 10B), 55 días (Figura 10C) y 69 días (Figura 10D) después de la inyección.

Los resultados presentados en la Figura 10 indican que se inducían bajas concentraciones de anticuerpo anti-EpCAM específico durante el primer mes usando ambas formulaciones (Figuras 10A y 10B). Se obtenían concentraciones muy superiores para el día 55 (Figura 10C) y niveles incluso superiores para el día 69 (Figura 10D). Se obtuvieron resultados similares usando inyección de DNA de un vector que expresa EpCAM-Fc, aunque las concentraciones eran inferiores. Estos datos muestran que un antígeno expresado como una molécula de fusión que comprende un antígeno proteínico y una región Fc de inmunoglobulina puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se introduce mediante inyección de DNA desnudo, y que la exposición persistente a antígeno conduce a respuestas retardadas en la mayoría de los animales.

Se probaron respuestas inmunitarias celulares cultivando esplenocitos de ratones vacunados con DNA o inmunizados con proteína (70 días después de la inyección) estimulados con diferentes concentraciones de proteína de Fc-EpCAM in vitro. Los datos presentes en la Figura 11 (cuadro superior) indican una respuesta proliferativa (según se mide mediante incorporación de ^{3}H-timidina a antígeno en animales inmunizados bien con proteína de Fc-EpCAM (cruces) o bien vacunación de DNA con promotor de CMV-EpCAM-Fc (círculos abiertos) o bien vectores de expresión de promotor de CMV-Fc-EpCAM (rombos cerrados). Los animales inmunizados con proteína mostraban respuestas mucho mayores a antígeno, incluso a dosis muy bajas. Las respuestas procedentes de animales vacunados con DNA (también mostrada a una escala diferente en el cuadro inferior de la Figura 11) dependían de la dosis pero eran de magnitud inferior que en los ratones inyectados con proteína. Estas respuestas eran características de respuestas de células T CD4^{+} restringidas al MHC clase II.

Para probar con respecto a la actividad citotóxica (generalmente indicativa de respuestas de células T restringidas al MHC clase I), cultivos de esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con DNA o proteína se cultivaron durante 5 días en presencia de aproximadamente 10 U/ml de IL-2. Las células efectoras eran los esplenocitos cultivados y las células diana eran bien células de carcinoma de colon CT26 que expresan EpCAM humano marcadas (singeneicas para ratones Balb/c) o bien parentales marcadas (células CT26 no transfectadas). Las células efectoras y diana se mezclaron a diferentes relaciones y se determinó la extensión de la lisis. El valor de 100% de lisis se alcanzaba incubando las células diana marcadas en presencia de detergente y la cantidad de marcador liberado se midió.

Los resultados se presentan en la Figura 12, donde la Figura 12A muestra la actividad de esplenocitos contra células CT26 que expresan EpCAM humano, mientras que la Figura 12B muestra la actividad de esplenocitos contra células CT26 parentales. Para ambas figuras, los rombos abiertos representan esplenocitos aislados de ratones inmunizados con DNA que tiene un constructo de EpCAM, los cuadrados abiertos representan esplenocitos aislados de ratones inmunizados con DNA que tiene un constructo de fusión de Fc-EpCAM, los triángulos abiertos representan esplenocitos aislados de ratones inmunizados con DNA que tiene un constructo de fusión de EpCAM-Fc y las cruces representan esplenocitos aislados de ratones inmunizados con proteínas de fusión de Fc-EpCAM.

La Figura 12 muestra que, aunque la vacunación con DNA generaba respuestas citotóxicas débiles contra ambas células diana, se observaba una citotoxicidad significativamente superior en los ratones inmunizados con proteína. Tanto las células tumorales CT26 parentales como las células tumorales CT26 que expresan EpCAM se describían en el ensayo. La citotoxicidad observada contra células CT26 parentales puede deberse a que estas células pueden expresar altos niveles del homólogo de EpCAM de ratón que es aproximadamente 81% idéntico a la proteína humana a nivel de aminoácidos. Sin embargo, la inmunización con la proteína de Fc-EpCAM generaba actividad citotóxica significativa contra células tumorales CT26 que expresan EpCAM humano, explicando de ese modo la potente actividad protectora frente a tumores descrita en el Ejemplo 6.

Ejemplo 9

Inmunización con una Proteína de Fusión de Fc que Contiene una Subregión de un Antígeno de Cáncer Proteínico

Aunque algunas de las proteínas enteras pueden no ser útiles como antígenos para terapia inmunitaria, subregiones más pequeñas de las proteínas pueden ser bastante más eficaces. Por ejemplo, las proteínas pueden contener dominios que se modifican postraduccionalmente para hacerlas menos inmunogénicas, reduciendo de ese modo la actividad inmunitaria para los componentes polipeptídicos reales. Las proteínas grandes pueden inducir anticuerpos que reaccionan solo con porciones no polipeptídicas del antígeno que no median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), un componente potencialmente importante de las respuestas inmunitarias antitumorales. Un buen ejemplo de esta situación se ejemplifica por el antígeno de proteoglicano sulfato de condroitina específico de melanoma humano (MCSP), que se expresa virtualmente en todos los melanomas así como varios tipos de cáncer cerebral. Esta proteína está fuertemente glicosilada y se modifica adicionalmente mediante el enlace de varias cadenas de glicosaminoglicano. Un anticuerpo conocido como 9.2.27 (Bumol y otros (1982) PROC. NATL. ACAD. SCI. 79:1245-1249) se une a esta proteína con alta afinidad, pero no media en ninguna función efectora, bien ADCC o bien citotoxicidad mediada por el complemento (CDC). Ni siquiera las formas parcialmente humanizadas (quiméricas) de este anticuerpo median en tales actividades.

Para provocar respuestas más enfocadas a regiones diana más óptimas de esta molécula grande, se identificaron los sitios de enlace a glicano putativos en la secuencia proteínica (Pluske y otros (1996) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 93:9710-9715). Se seleccionó una subregión no lejana a la secuencia que abarca la membrana de la superficie celular y alguna secuencia más allá de los sitios de enlace a glicano.

La secuencia peptídica: QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQ
FTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD (Nº ID SEC: 21) se tradujo inversamente, la secuencia de DNA resultante se esterilizó químicamente y se ligó en el vector de expresión de pdCs-Fc-X usando los mismos sitios de restricción usados en los Ejemplos previos. Un sitio de terminación de la traducción se añadió al extremo 3' justo después de la secuencia que codifica el último aminoácido, seguido por un sitio Xho I único. El plásmido de expresión final se sometió a electroporación en células de mieloma NS/0 y transfectantes estables que expresan la proteína deseada se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 1.

Se purificó proteína de Fc-MCSP de sobrenadantes de cultivo usando cromatografía con proteína A-Sepharose (Repligen, Needham, MA). Las concentraciones de anticuerpo se midieron en ratones Balb/c inmunizados subcutáneamente con 50 \mug de proteína de fusión de Fc-MCSP en PBS bien sola o bien en combinación con 5 \mug de Fc-GMCSF como un adyuvante. Los resultados se muestran en la Figura 13. Los rombos sólidos representan concentraciones de anticuerpo en un suero normal, los cuadrados abiertos representan concentraciones de anticuerpo en suero de ratones inmunizados con Fc-MCSP y los triángulos sólidos representan concentraciones de anticuerpo en un suero de ratones inmunizados con Fc-MCSP y un adyuvante de Fc-GMCSF.

Se detectaron respuestas inmunitarias específicas a esta subregión de MCSP para el día 14, e incrementaban significativamente después de la inmunización de refuerzo. Los resultados indican que los ratones inmunizados tanto con Fc-GMCSF como con Fc-MCSP estimulaban concentraciones de anticuerpo superiores contra MCSP (triángulos sólidos) que los ratones inmunizados con Fc-MCSP sola (cuadrados abiertos).

Ejemplo 10

Inmunización con una Proteína de Fusión de Fc que Contiene un Antígeno Viral

El desarrollo de una vacuna eficaz contra el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus que provoca el SIDA, es uno de los objetivos más importantes en la investigación sobre las vacunas. Recientemente, varios informes han indicado que ciertas propiedades de la envuelta del virus sirven para trucar la respuesta inmunitaria de epítopos sensibles a irrelevantes, enmascarando de ese modo regiones importantes y potencialmente neutralizantes de la partícula de virus. Estos incluyen la presencia de regiones antigénicas altamente inmunodominantes que sirven como señuelos, y glicosilación extensiva que enmascara físicamente y reduce la inmunogenicidad de epítopos importantes (Wyatt y otros (1998) NATURE 393:705-11).

Un modo posible de obviar el mecanismo del señuelo es expresar pequeñas regiones del gen de la envuelta del virus para evitar respuestas inmunodominantes que no son protectoras, y para inducir una respuesta neutralizadora. Un problema con las vacunas de subunidades pequeñas es la inmunogenicidad reducida bien como un péptido sintético o bien como una proteína pequeña. Un sistema ha sido acoplar las proteínas o los péptidos a proteínas portadoras inmunogénicas tales como hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH). Esto induce una respuesta fuerte a KLH también debida a la proteína o el péptido. Otro sistema es elaborar una proteína de fusión con Fc según se describe en el Ejemplo 1 para una subregión de, por ejemplo, el ectodominio de gp41 (el dominio de anclaje de la envuelta viral, gp160). A diferencia de otros portadores, la región de inmunoglobulina se observa como "propia", minimizando de ese modo cualquier efecto de inmunodominancia.

El constructo de fusión de Fc-pep626 de gp41 contenía un polipéptido de 44 aminoácidos fusionado al extremo carboxílico de una región Fc de inmunoglobulina de ratón. La secuencia de HIV cepa IIIB en esta región contiene una señal para glicosilación enlazada en N, de modo que la proteína de fusión de Fc-pep626 de gp41, producida en células 293 mediante expresión transitoria o bien en células de mieloma NS/0 mediante transfección estable, mostraba un alto grado de variación en la movilidad durante el análisis por SDS-PAGE indicando de ese modo heterogeneidad en la extensión de la glicosilación.

A pesar del hecho de que este antígeno viral era bastante pequeño (44 residuos de aminoácido de longitud) y estaba glicosilado heterogéneamente, era posible provocar una respuesta inmunitaria en ratones Balb/c (véase la Figura 14). En este caso, grupos de 5 ratones fueron inyectados intradérmicamente con 25 \mug de Fc-pep626 de gp41 el día 1 y dos veces más a intervalos de dos semanas, bien solos (rombos abiertos) o bien en combinación con 2,5 \mug de las proteínas de fusión de Fc-adyuvante, Fc-GMCSF (cuadrados abiertos) o Fc-IL2 (triángulos sólidos). Las Figuras 14A y 14B representan concentraciones de anticuerpo alcanzadas 7 y 33 días después de un segundo refuerzo, respectivamente.

Las respuestas inmunitarias eran más dependientes de la coadministración de Fc-citoquinas, y empleaban más tiempo para alcanzar una concentración alta. Se contempla que pueden provocarse respuestas inmunitarias superiores usando modificaciones de esta secuencia que no contienen la señal de glicosilación (de hecho, muchas cepas no codifican este sitio) o retirando enzimáticamente las cadenas laterales de carbohidrato in vitro.

Ejemplo 11

Actividad Adyuvante de una Proteína de Fusión de Fc que Contiene el Dominio Extracelular de una Molécula de la Superficie Celular

Para construir proteínas de fusión de Fc-adyuvante, a veces es útil fusionar a Fc el dominio extracelular de una proteína que puede estar unida a la membrana. Por ejemplo, el ligando de CD40 (CD40L) se fusiona en el extremo N o el extremo C a Fc. Se usa opcionalmente un conectador.

CD40L es útil debido a que su receptor, CD40, se expresa sobre la superficie de células B y está implicado en la estimulación de células B por células T. Como el factor de necrosis tumoral, CD40L es un trímero que provoca la dimerización o trimerización de su receptor sobre una superficie celular. Como resultado, los dominios de receptor intracelulares se ponen en contacto y dan como resultado la traducción de señal. También como el TNF, CD40L puede unirse a la membrana pero también puede segmentarse de la superficie celular y funcionar como una citoquina.

Una proteína de fusión de Fc-CD40L se coadministra a animales con una proteína de fusión de Fc-antígeno. En experimentos de control, la proteína de Fc-CD40L y la proteína de Fc-antígeno se administran a diferentes grupos de animales. Se contempla que los animales inyectados con ambas proteínas de fusión producen una concentración superior de anticuerpos que los animales inyectados con cada proteína de fusión individualmente.

Alternativamente, se usa una sola proteína de fusión de Fc que contiene tanto un antígeno como un resto CD40L, con conectadores (L) opcionales entre los restos de Fc, CD40L y antígeno. La proteína de fusión puede estar en el orden N-terminal a C-terminal Fc-(L)-antígeno-(L)-CD40L, FC-(L)-CD40L-(L)-antígeno, antígeno-(L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)-antígeno-(L)-Fc, antígeno-(L)-Fc-(L)-CD40L o CD40L-Fc-(L)-antígeno-(L). La proteína de fusión que comprende Fc, el antígeno y CD40L se inyecta a animales y las concentraciones de anticuerpo se miden a continuación. Se contempla que las concentraciones de anticuerpo generadas mediante la inyección de la proteína de fusión tanto con CD40L como con antígeno son superiores que las concentraciones obtenidas mediante la inyección de proteínas de fusión que contienen solo Fc y antígeno o Fc y CD40L.

En las administraciones anteriores de proteínas de fusión, los animales fueron inyectados intravenosamente, subcutáneamente o mediante otros modos de administración apropiados. Los tiempos entre la administración primaria y de refuerzo de antígenos y/o adyuvantes y la medida de concentraciones de anticuerpo son como se describen en los ejemplos previos. Alternativamente, se usan regímenes de dosificación y ensayo estándar.

<110> Gillies, Stephen D.

\hskip1cm

Lo, Kin-Ming

\hskip1cm

Wesolowski, John

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Lexigen Pharmaceuticals Corp.

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<120> Proteínas de Fusión de Fc Para Potenciar la Inmunogenicidad de Antígenos Proteínicos y Peptídicos

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<130> LEX-007PC

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<140>

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<141>

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<150> US 60/144,965

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<151> 1999-07-21

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<160> 22

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de IL-4R

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<400> 1

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gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc

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<210> 2

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de IL-4R

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<400> 2

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cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg

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34

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<210> 3

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<211> 23

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PSMA

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<400> 3

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aagcttaaat cctccaatga agc

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23

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<210> 4

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PSMA

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<400> 4

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ctcgagttag gctacttcac tcaaag

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de EpCAM

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<400> 5

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ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de EpCAM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagtcat tttagaccct gcattgag

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de EpCAM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagagcag catggcgccc ccgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de EpCAM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaagcac cctgcattga gaattcag

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA que codifica residuos de aminoácido 626-669 de gp41 de HIV IIIB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Polipéptido fusionado procedente del vector pdC-muFC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebadores para IL2 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para IL2 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcgagtt attgagggct tgttg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para GCSF de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para GMCSF de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para ligando Flt3 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagcttaca cctgactgtt acttcagc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para IL-12p35 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para IL-12p35 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagtcag gcggagctca gatagc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para p40 de IL12 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaccat gtgtcctcag aagctaac

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagctag gatcggaccc tgcag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido MSCP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligodesoxinucleótido que puede usarse como un adyuvante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccatgacgt tcctgacgtt

\hfill

20

Claims

1. Una composición para provocar una respuesta inmunitaria potenciada contra un antígeno peptídico o proteínico en un mamífero, comprendiendo la composición

(i): una proteína de fusión que carece del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, enlazada mediante un enlace polipeptídico al antígeno, y

(ii): una proteína de fusión que carece del dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, enlazada mediante un enlace polipeptídico a una proteína adyuvante;

en donde dichas regiones constantes de inmunoglobulina derivan de la misma especie y tienen la capacidad para unirse a un receptor de Fc.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende secuencias de regiones pesadas constantes de inmunoglobulina humana.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el adyuvante es una citoquina.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF y GMCSF.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la citoquina es GMCSF.

6. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), un ectodominio de un receptor de citoquina, una proteína viral y un antígeno específico para el cáncer.

7. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de dichas proteínas de fusión comprende una región de bisagra.

8. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de dichas proteínas de fusión comprende un dominio CH2 y uno CH3.

9. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la porción de inmunoglobulina de cada proteína de fusión es Fc.

10. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para la fabricación de una vacuna para provocar una respuesta inmunitaria potenciada en un mamífero contra un antígeno preseleccionado usado en la forma de la proteína de fusión antigénica de la composición.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha respuesta inmunitaria es más fuerte que cuando la proteína de fusión antigénica se administra sin la proteína de fusión adyuvante de la composición.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que las proteínas de fusión se administran simultáneamente.