JP5669732B2 - 抗axl抗体 - Google Patents
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Description
〔1〕 以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識する抗体;
(1)配列番号:33〜37に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38〜48に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体、
(2)配列番号:2(H0)に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
(3)配列番号:84〜89に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
(4)配列番号:65(L0)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
(5)(1)の重鎖可変領域および(3)の軽鎖可変領域を有する抗体、
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
〔2〕 以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識するヒト化抗体;
(1)配列番号:33〜37に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38〜48に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号:51に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号:109、58に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するFR3、配列番号:61に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む重鎖可変領域を有する抗体、
(2)配列番号:2(H0)に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
(3)配列番号:84〜89に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するFR3、配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
(4)配列番号:65(L0)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
(5)(1)の重鎖可変領域および(3)の軽鎖可変領域を有する抗体、
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
〔3〕 重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシンである、〔1〕又は〔2〕に記載の抗体。
〔4〕 重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔1〕〜〔3〕に記載のいずれかの抗体。
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(6)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
(7)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
(8)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(9)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
(10)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
(11)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
(12)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
〔5〕 重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔1〕〜〔3〕に記載のいずれかの抗体。
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がアルギニン
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
〔6〕 軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗体。
(1)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(4)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(5)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
(6)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(7)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(8)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(9)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
〔7〕 軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗体。
(1)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(5)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(6)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(7)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(8)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
〔8〕 少なくとも以下のいずれかの重鎖可変領域を有する、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(2)配列番号:34に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(3)配列番号:35に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(4)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:39に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(5)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:40に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(6)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:41に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(7)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:42に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(8)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:43に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(9)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:44に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(10)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:45に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(11)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:46に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(12)配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(13)配列番号:37に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(14)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:47に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
(15)配列番号:33に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:48に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
〔9〕 以下の(1)〜(25)からなる群より選択される〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体。
(1)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号:86,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:88,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6)それぞれ配列番号:34,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7)それぞれ配列番号:35,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8)それぞれ配列番号:33,39および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9)それぞれ配列番号:33,40および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10)それぞれ配列番号:33,41および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11)それぞれ配列番号:33,42および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12)それぞれ配列番号:33,43および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(13)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(15)それぞれ配列番号:33,45および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(16)それぞれ配列番号:33,46および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(17)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:89,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(18)それぞれ配列番号:36,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(19)それぞれ配列番号:37,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(20)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(21)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(22)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(23)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(24)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(25)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔10〕 配列番号:2〜32のいずれかに記載の重鎖可変領域と配列番号:65〜83のいずれかに記載の軽鎖可変領域を有する〔1〕又は〔2〕に記載の抗体。
〔11〕配列番号:1に記載の重鎖可変領域と配列番号:64に記載の軽鎖可変領域を有し、ヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、或いは当該キメラ抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、当該キメラ抗体と同等の活性を有する〔1〕に記載の抗体。
〔12〕軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジンである、〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の抗体。
〔13〕 〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
〔14〕 〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
〔15〕 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である〔14〕に記載の抗癌剤。
〔16〕 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である〔14〕に記載の抗癌剤。
〔17〕 癌が膵臓腺癌または乳癌である〔14〕に記載の抗癌剤。
〔18〕 〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体を対象(例えば、ヒト等の哺乳動物)へ投与する工程を含む、癌の治療方法。
〔19〕 〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体の、抗癌剤の製造における使用。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)
(b)受託日(寄託日):2007年7月5日
(c)受託番号:
AXL No.225 #070402 (Ax225)(受託番号 FERM BP-10854)
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、AXLに結合するヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化(humanized)抗体は既知の方法を用いて製造することができる。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される。
パパイン消化:F(ab)2またはFab
ペプシン消化:F(ab')2またはFab'
プラスミン消化:Facb
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列
[VH]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:110)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:111)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:112)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:113)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:114)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:115)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:116)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:117)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:112))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:113))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。
グリコシル化が修飾された抗体(WO99/54342など)、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140など))、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)など。
本発明はさらに抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤を提供する。AXL発現量低下剤は、AXLを発現する細胞内のAXL発現量を減少させるものである。AXLを発現する細胞は特に限定されないが、例えば癌細胞(Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など)などを挙げることができる。
本発明の細胞増殖抑制剤またはAXL発現量低下剤の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
1―1.抗原の調製
ハムスター卵巣細胞(CHO(dhfr-) cells)にヒトAXL細胞外領域とマウスIgG2aのFc領域を融合したFusion protein(hAXL-ECD-mIgG2aFc)発現ベクターを遺伝子導入し、G418 selection法により、hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質産生CHO細胞株をクローニングした。無血清培地(CHO-S-SFM II, GIBCO)を用いて回収したhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白産生CHO細胞株の培養上清を、結合緩衝液(20 mM リン酸緩衝液, pH7.0)で平衡化したProtein Gカラム(HiTrap Protein G HP, GE Healthcare)に添加した。結合緩衝液で非結合蛋白を洗浄した後、溶出緩衝液(100 mM Glycine-HCl, pH2.7)を用いて、中和緩衝液(1 M Tris-HCl, pH9.0)を分注したチューブにhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質の画分を回収し、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット(Centricon(登録商標), Millipore)を用いて、精製蛋白質の緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(pH7.35-7.65, タカラバイオ)に緩衝液置換し、精製蛋白質を濃縮した。C.N. Pace et al., Prof. Sci. 4:2411-2423, (1995)の計算式に従い算出したモル吸光係数を用いて、280 nmの吸光度から精製蛋白質の濃度を算出した。
BALB/cマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールズ・リバー)4匹およびMRL/lprマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールズ・リバー)2匹に、前項で作製した抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質)を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA(フロイント完全アジュバントH37 Ra(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA(フロイント不完全アジュバント(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、次項に示したELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)で確認後、最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないphosphate buffered saline(PBS(-))、日水製薬)に希釈した抗原を10μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1(P3U1と称す、ATCC CRL-1597)を、PEG1500(Roche Diagnostics)を用いた常法に従い細胞融合した。10%FBS(Invitrogen)を含むRPMI1640培地(Invitrogen)(以下、10%FBS/RPMI1640と称す)にて融合細胞を培養した。融合の翌日に、融合細胞を半流動培地(StemCells)に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。融合後9日目または10日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地(10%FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate(大日本製薬), 5 vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))の入った96-ウェルプレートに、1ウェル当り1コロニーを播種した。3〜4日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、次項に示したELISAにより、上記抗原、及びマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白に対する結合活性を測定することにより、ヒトAXL細胞外領域に結合活性を有するハイブリドーマを選択した。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番1 中央第6(郵便番号305-8566)
(b)受託日(寄託日):2007年7月5日
(c)受託番号:
AXL No.225 #070402 (Ax225)(受託番号 FERM BP-10854)
Coating Buffer(100 mM sodium bicarbonate, pH9.6, 0.02% sodium azide)で1μg/mLに希釈した抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質)、またはマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白を、96-ウェルプレート(Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))に、80μL/wellで分注後、4℃で一晩以上インキュベーションした。0.05 vol%のTween(登録商標)20を含むリン酸緩衝生理食塩水(tPBS(-))で3回洗浄後、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)の1/5希釈液)にて、該プレートを、4℃で一晩以上ブロッキングした。緩衝液を除去後、該プレートに、Diluent Bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて3回洗浄後、Diluent Bufferで1/5000に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Stressgen)を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて5回洗浄後、発色基質Peroxidase Substrate(Kirkegaad & Perry Laboratories)を80μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Peroxidase Stop Solution(Kirkegaad & Perry Laboratories)を80μL/well添加した後、405 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories)で測定した。
上記で得られたハイブリドーマを、FBSとしてlow IgG FBS(Invitrogen)を用いたHAT選択培地で培養した。該培養上清20 - 50 mLに、溶媒をWash Buffer (20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0) に置換したProtein Gビーズ(Pharmacia)を、該培養上清10 mL当たり50μL加え、4℃で一晩転倒混和した。Protein Gビーズを回収した後、Wash Bufferで洗浄後、溶出 Buffer (50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH3.3)にて抗体を溶出し、直ちに中和Buffer (トリス塩酸緩衝液、pH7.8)で中和した。精製抗体は、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット(Amicon(登録商標), Millipore)を用いて、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.35-7.65, 日水製薬)への緩衝液置換及び濃縮を行い、0.22μmの滅菌フィルター(Millipore GV Millipore)にて滅菌した。
2−1.ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
抗AXLモノクローナル抗体のAXL-Fibronectin type 3 domain 1(AXL-FND1)、AXL Immunoglobulin family domain 2 (AXL-IgD2)への結合能力を試験した。
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA(O'Bryanら,Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031)(GenBank#NM_021913)から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)(Novagen)にクローニングし、pET-AXL-FND1を構築した。その他のドメインについては、137番から224番目のアミノ酸に相当する領域AXL-IgD2をPCRにて増幅し、GSTタグとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)にクローニングした。
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む20 mLのLB培地に終夜37度で前培養し、500 mLの培地に移し、A600=0.5±0.05まで培養しIPTGを0.5 mMとなるように添加した。37度で1時間培養後集菌し、Buffer A(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT)にて懸濁後、液体窒素を用いて凍結融解を2回繰り返した。NP-40を0.5%となるように加え、超音波破砕機で破砕(30秒x5)後、244,000xG、30分遠心し、上清を回収した。
グルタチオンセファロースTM4 Fast Flowから分離・溶出したヒト組み換えAXL-FND1をはじめ、AXL-IgD1、AXL-IgD2、AXL-FND2、AXL-IgD1+IgD2、AXL-IgD2+FND1、AXL-FND1+FND2はBIO-RAD Dc Protein Assayでタンパク定量し、1μgをNuPAGE(登録商標) Sample buffer(Invitrogen)と混合し、NuPAGE(登録商標) 10% Bis-Tris Gelで電気泳動を行った。電気泳動したGelはImmobilonTM-FL(Millipore)PVDF膜に転写した。転写したタンパク質を含むPVDF膜は、Odyssey(登録商標) Blocking Buffer(LI-COR)でブロッキング後、抗AXL抗体を5μg/mLとなるように希釈した一次抗体溶液に浸し、終夜4度でインキュベートした。一次抗体溶液に浸した転写したタンパク質を含むPVDF膜は、0.1% TBS-T [0.1% Tween-20を含むTBS(Tris-buffered Saline, TaKaRa)]で5分4回洗浄した。抗AXL抗体に浸したPVDF膜は、80 ng/mLに希釈したAlexa Fluor(登録商標) 680 goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)二次抗体溶液に浸し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体溶液に浸したPVDF膜は0.1% TBS-Tで5分3回洗浄後、0.01% SDSを含むTBS-Tで5分洗浄後、TBSで5分洗浄した。洗浄したPVDF膜は遠赤外線イメージングシステムOdyssey(登録商標)でスキャンして結合性を評価した。
評価結果を図1に記載した。
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax225)は、AXLのFND1を認識することが明らかとなった(図1)。受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax284)は、AXLのFND1およびIgD2を認識すると考えられた(図1)。受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax7)、および受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax51) は、AXLのIgD2を認識することが明らかとなった(図1)。
抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLの分解を誘導する能力を試験した。ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1を6-ウェルプレートに4 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し(serum starved)、一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6(R&D)を添加し、37℃で24時間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体(SantaCruzTM)で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE(Invitrogen)を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。
1.ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(1×107個/マウス)を移植した。腫瘍容積(体積)の平均値がおよそ210 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
Ax225抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール(日本イーライリリー株式会社)は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より4日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した(図3)。
腫瘍容積(体積)は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(*;p<0.05)をもって有意とした。
Ax225抗体は腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた(図3)。
1.ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(1×107個/マウス)を移植した。腫瘍容積(体積)の平均値がおよそ270 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
Ax225抗体並びにAx225抗体と同様に取得しAx225抗体とエピトープが異なる抗AXL抗体をPBSで2 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール(日本イーライリリー株式会社)は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より4日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍増殖抑制効果を図1に示した。腫瘍増殖抑制効果(%)が30%より低い場合を"−"、30%以上を"+"、60%以上を"++"とした。
この結果から、FND-1に結合する抗体は、腫瘍容積(体積)の平均値がおよそ270 mm3となった時点で投与を開始しても、60%以上のTGI活性を示した。FND-1に結合する抗AXL抗体が、in vivoでこのような顕著な抗腫瘍効果を有することは、本検討で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。
キメラ抗体発現ベクターの作製
ヒトIgG1定常領域とAx225抗体可変領域を融合させたキメラAx225抗体を作製するため、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNA(H鎖:ヒトγ1、L鎖:ヒトκ)の5'末端とAx225抗体の可変領域をコードするcDNAの3'末端を融合するように合成オリゴDNAをH鎖、L鎖それぞれにつき、センス鎖、アンチセンス鎖の各2種類ずつを設計した。以下、H鎖センス融合プライマー(A)、H鎖アンチセンス融合プライマー(B)、L鎖センス融合プライマー(C)、L鎖アンチセンス融合プライマー(D)とする。各合成オリゴDNAを混和し、アッセンブルPCRによりキメラAx225抗体をコードする遺伝子を作製した。アッセンブルPCRによるキメラ抗体を発現する1段階目はAx225 cDNAのH鎖5'末端に制限酵素サイトとKozak配列を付加したセンス鎖(E)と上述(B)、Ax225 cDNAのH鎖3'末端の領域に制限酵素サイトを付加したアンチセンス鎖(F)と上述(A)、Ax225 cDNAのL鎖5'末端の領域に制限酵素サイトとKozak配列を付加したセンス鎖(G)と上述(D), Ax225 cDNAのL鎖3'末端の領域に制限酵素サイトを付加したアンチセンス鎖(H)と上述(C)、の4種類の組み合わせで以下の条件に従ってPCR法によって実施した。添付のPCR Buffer, dNTPs, PrimeSTAR, Ax225 H鎖、あるいはL鎖をコードする cDNAおよび1合成オリゴDNAからなる反応混合物を、98℃にて1分加熱した後、98℃にて10秒、55℃にて10秒、72℃にて1分から構成されるPCR反応サイクルを30回実施した。2回目のPCRは1回目のPCR反応で増幅された遺伝子断片、H鎖に関しては(E)(B)と(F)(A)のコンビネーションで増幅された断片を混合したもの、L鎖に関しては、(G)(D)と(H)(C)のコンビネーションで増幅された断片を混合したものを鋳型にして行われた。プライマーはH鎖は(E)と(F)、L鎖は(G)と(H)を用いた。98℃にて1分加熱した後、98℃にて10秒、55℃にて10秒、72℃にて1分30秒から構成されるPCR反応サイクルを30回実施した。
ヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyleTM 293-F細胞(Invitrogen)をFreeStyleTM 293 Expression Medium(Invitrogen)へ懸濁し、1 × 106個 /mLの細胞密度で125 mL Flask(CORNING)へ30 mLずつ蒔きこんだ。調製したプラスミドDNA混合液(合計30μg)にOpti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)を加え1 mLとした。また、293fectin(Invitrogen) 60 μLに、Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)を加え1 mLとし、プラスミドDNA混合液と混合した。混合液を室温にて20分静置し、細胞懸濁液に添加した。CO2インキュベーター(37℃、8% CO2)内で3〜6日培養した。培養上清を回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(登録商標)-GV(Millipore)を通した。各サンプルは使用するまで4℃で保存した。この上清からProtein A Sepharose(GE Healthcare)を用いて抗体を精製した。280 nmの吸光度をND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop)で測定し、Paceらの方法(Protein Science (1995) 4: 2411-2423)にて濃度を算出した。
BiacoreによるAffinity測定
ヒト化Ax225抗体のスクリーニングを行うため、AXL-FND1への結合活性評価を、Biacoreを用いて下記の方法により実施した。
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA(O'Bryanら,Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031)(GenBank#NM_021913)から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41b (+)(Novagen)にクローニングし、pET-AXL-FND1を構築した。
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む3 mLのMagicMedia (Invitrogen)培地に3時間、37度で前培養し、500 mLの培地に移し、25度、overnightで培養後集菌し、Buffer A(20 mM Tris-HCl(pH8),10 mM EDTA,30 mM NaCl, Protease inhibitor mixture (complete Mini, EDTA-free(Roche)にて懸濁後、終濃度2 mg/mLになるようにLysozyme溶液を加え、on iceで1時間incubation後、終濃度0.5%Triton-X100および、終濃度100 mMになるようにNaClを加えて、on iceで10min incubationした。超音波破砕機で破砕(30秒x5)後、244,000 x G、20分遠心し、上清を回収した。
Biacore T100 (BIACORE) を用いて、ヒト化AXL抗体の抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にrec-Protein A (Zymed) (以下、Protein A) を固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整したヒト組み換えAXL-FND1(2-2において調製。以下、GST-FND1)を用いた。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms) 、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE) を用いた。
Ax225抗体のヒト化を行うため、Ax225抗体の可変領域配列とヒトのgermline配列を比較した。その中で、ヒト化のテンプレートとなるFR配列を表4にまとめた。ヒト化した可変領域として、H鎖は表4に記載されているFR1、FR2、FR3(2)、FR4からなる配列をH0(配列番号:2)とした。また、L鎖はFR1、FR2、FR3、FR4からなる配列をL0(配列番号:65)とした。なお、CDR、FRの決定はKabat numberingに従って行われた。
ヒト化テンプレート配列のFR領域にAx225抗体のCDR領域を移植したヒト化Ax225抗体の可変領域を作製するため、合成オリゴDNAをH鎖、L鎖それぞれ設計した。各合成オリゴDNAを混和し、アッセンブルPCRによりヒト化Ax225の可変領域をコードする遺伝子を作成し、H鎖をH0、L鎖をL0とした。アッセンブルPCRはKOD-Plus(TOYOBO)を用いて行い、以下の条件に従ってPCR法によって実施した。添付のPCR Buffer,dNTPs,MgSO4, KOD-Plusおよび10 pmolの合成オリゴDNAからなる反応混合物を、94℃にて5分加熱した後、94℃にて2分、55℃にて2分、68℃にて2分から構成されるPCR反応サイクルを2回実施した後、可変領域の5'末端に制限酵素サイトとKozak配列を付加したプライマー、及び3'末端に制限酵素サイトを付加したプライマーをそれぞれ10 pmol添加し、94℃にて30秒、55℃にて30秒、68℃にて1分から構成されるPCR反応サイクルを35回実施し増幅断片を得た。得られた増幅断片を動物細胞発現ベクターによりクローニングし、定常領域と連結した。
先述のとおり、Ax225のH鎖に存在するKabat numbering 94番目のグリシンは、AXLとの結合に重要な役割を果たしていることが予想された。
H0/L0のH鎖であるH0(配列番号:2)は、Kabat numbering 73番目のアミノ酸残基がスレオニン(T)であるが、立体構造モデルを基に考察したところ、この残基をAx225抗体の配列であるアスパラギン(N)に置換することにより、Affinityの向上が可能であると期待された。
変異箇所の同定
抗体の血漿中半減期を制御する方法の一つとして、抗体分子表面に露出するアミノ酸残基を改変し、抗体分子表面電荷をコントロールする方法が知られている(特許文献2および特許文献3)。具体的には、抗体が有する等電点(pI)の値を低下させることにより、抗体の血漿中半減期を伸長させることが可能であることが知られている。それとは逆に抗体の等電点が上昇することにより、血漿中半減期が短縮し、抗体の組織移行性が向上することが知られている(非特許文献28および29)。
医薬品に使用する抗体は、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られるモノクローナル抗体であるにも関わらず、ヘテロジェニティーが存在する。そのような抗体のヘテロジェニティーは酸化、脱アミド化などの修飾により起こり、長期間の保存中や熱ストレス、光ストレスといったストレス条件下にさらされることで増加することが知られている(参考文献:Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol.97,No.7,2426-2447)。しかしながら、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、目的物質のヘテロジェニティーを低減し、可能な限り単一物質であることが望まれる。
作製した改変体のAffinity測定を実施例2に記載の方法で実施した。結果を表16に示す。いずれの改変体も、H9/L0に比べて顕著なaffinityの低下はなく、脱アミド化反応の抑制が可能であると考えられた。
抗体医薬品を製造する方法としては、哺乳動物細胞を用いて目的の抗体を産生する安定発現株を構築する方法が一般的に用いられている。ここで、安定発現株による抗体の発現量は、抗体医薬品の生産コストに結びつく重要な要素であることから、抗体の発現量は十分に高いことが望ましい。
Biacore-Q (BIACORE) を用いた培養上清中の抗体濃度の定量を、以下の方法で行った。
センサーチップは、アミンカップリング法により recombinant Protein AをCM5 (GE Healthcare) に約5000 RU 固定化することで作製した。ランニングバッファーとしてHBS-EP、再生用バッファーとして10 mM glycine-HCl (pH1.5)を用い、流速は5μL/min とした。また、検量線作成のため、実施例1の方法により発現、精製したキメラ抗体あるいはヒト化抗体を、2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 ng/mLの各濃度に調製した。
結果、L鎖をヒト化したことにより、Ax225抗体の発現量が2〜3倍向上することが見出された(図4)。
立体構造モデルから、L鎖FR2に存在する、Kabat numbering 42番の残基が発現量に大きく寄与することが推察された。具体的には、Kabat numbering 42番の残基をリジン(K)に置換することにより、発現量を向上させることが可能であると推察された。なお、この推察はキメラ抗体のL鎖(chL/配列番号:64)のKabat numbering 42番の残基がグルタミン(Q)であるのに対し、ヒト化抗体のL鎖(L0/配列番号:65)の当該残基はリジン(K)であることとも矛盾しないものである。
6−1.ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて2.5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu (BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL (5×106個/マウス)を接種した。腫瘍体積がおよそ240mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
抗体はPBSで1 mg/mLになるように調製し、週1回、2週間、10 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より7日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion 5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(*;p<0.05)をもって有意とした。
図6に示すように、ヒト化Ax225抗体(H9/L0)は、マウス抗体およびキメラ抗体と同様に、PBS投与群と比較して、有意な腫瘍の増殖抑制効果を示した。
7−1.ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC−1は、HBSSにて2.5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg−Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB−nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(5×106個/マウス)を接種した。腫瘍体積がおよそ200mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
抗体はヒスチジン緩衝液(20 mM Histidine-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0)で1 mg/mLになるように調製し、週1回、2週間、10 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの尾静脈内へ投与した。陰性対照として、ヒスチジン緩衝液を同様に投与した。
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より7日後における各抗体投与群の腫瘍体積と陰性対照群の腫瘍体積との比較により腫瘍増殖抑制効果を比較した。
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(*;p<0.05)をもって有意とした。
図7に示すように、抗体投与群は、ヒスチジン緩衝液投与群と比較して、有意な腫瘍の増殖抑制効果を示した。
Claims (16)
- 以下の(A)または(B)に記載の、AXLのFND1ドメインを認識するヒト化抗体;
(A)配列番号:33〜37に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38〜48に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号:84〜89に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体であって、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、抗体:
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
(6)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(7)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
(8)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
(9)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(10)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
(11)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
(12)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
(13)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(14)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(15)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(16)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(17)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(18)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
(19)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(20)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(21)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(22)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(23)軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジン;
(B)配列番号:2(H0)に記載の重鎖可変領域および配列番号:65(L0)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体。 - 以下の(A)〜(C)のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識するヒト化抗体;
(A)配列番号:33〜37に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:38〜48に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号:51に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号:109、58に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するFR3、配列番号:61に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む重鎖可変領域、および配列番号:84〜89に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するFR3、配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
(B)配列番号:2(H0)に記載の重鎖可変領域および配列番号:65(L0)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
(C)(A)または(B)に記載の抗体において以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有するように1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(A)または(B)の抗体と同等の活性を有する抗体:
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
(6)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(7)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
(8)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
(9)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(10)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
(11)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
(12)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
(13)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(14)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(15)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(16)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(17)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(18)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
(19)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(20)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(21)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(22)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(23)軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジン。 - 重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシンである、請求項1又は2に記載の抗体。
- 重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体。
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(6)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
(7)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
(8)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
(9)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
(10)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
(11)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
(12)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン - 重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体。
(1)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がアルギニン
(5)重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン - 軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体。
(1)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
(4)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(5)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
(6)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(7)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(8)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(9)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸 - 軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体。
(1)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
(2)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
(3)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がアルギニン
(4)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
(5)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
(6)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
(7)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
(8)軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸 - 以下の(1)〜(25)からなる群より選択される請求項1〜7のいずれかに記載の抗体。
(1)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(2)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(3)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域,およびそれぞれ配列番号:86,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(4)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(5)それぞれ配列番号:33,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:88,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(6)それぞれ配列番号:34,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(7)それぞれ配列番号:35,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(8)それぞれ配列番号:33,39および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(9)それぞれ配列番号:33,40および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(10)それぞれ配列番号:33,41および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(11)それぞれ配列番号:33,42および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(12)それぞれ配列番号:33,43および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(13)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(14)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(15)それぞれ配列番号:33,45および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(16)それぞれ配列番号:33,46および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(17)それぞれ配列番号:33,44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:89,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(18)それぞれ配列番号:36,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(19)それぞれ配列番号:37,38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(20)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(21)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:84,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(22)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(23)それぞれ配列番号:33,48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(24)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:85,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体;
(25)それぞれ配列番号:33,47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号:87,90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。 - 配列番号:2〜32のいずれかに記載の重鎖可変領域と配列番号:65〜83のいずれかに記載の軽鎖可変領域を有する請求項1又は2に記載の抗体。
- 配列番号:1に記載の重鎖可変領域と配列番号:64に記載の軽鎖可変領域を有し、ヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、或いは当該キメラ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジンである抗体。
- 軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジンである、請求項1〜10のいずれかに記載の抗体。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
- 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である請求項13に記載の抗癌剤。
- 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である請求項13に記載の抗癌剤。
- 癌が膵臓腺癌または乳癌である請求項13に記載の抗癌剤。
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