TW201041595A - Anti-axl antibody - Google Patents

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201041595 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗Anexelekto(AXL)抗體及以上述抗體 為有效成分之抗癌劑。 【先前技術】

Anexelekto(亦稱之為 aXL、UFO、ARK 或 TYR07。以下 〇 稱之為AXL)係為存在於細胞膜上的受體酪胺酸激酶 (receptor tyrosine kinase)(非專利文獻 1)，藉由和配 位體 Gas6 (growth arrest specific gene 6)結合後造 成其本身的磷酸化，而發揮向下游分子傳遞訊息的作用（非 專利文獻2)。 一般認為AXL的分子功能為，有助於細胞增生促進、 細胞凋亡抑制、細胞遊走、細胞接著。作為這些功能推定 之根據的實驗事實為已有下列實驗結果報告：施以Gas6蛋 ❹自質處理後的細胞中所發生的現象。直到目前為止，大鼠 血管平滑肌的細胞死抑制及增生亢進（非專利文獻3、， J、鼠N1H3T3細胞的血清飢餓後的細胞增生亢進及細胞死 抑制（非專利文獻5、6)小鼠心臟纖維芽細胞的增生促進（非 獻7)人類岫列腺癌由來細胞的增生促進（非專利 文獻8)、人類胃癌由來細胞的增生促進、細胞浸潤促進、 細胞死抑制（非專利文獻9)、人類及大鼠血管平滑肌細胞 的細胞遊走能宄進(非專利文獻1〇)、小氣神經細胞的細胞 遊走能尤進（非專利文獻⑴、小鼠AXL高發現細胞的細胞 3 201041595 凝集（非專利文獻1 2)。 依據同樣施以Gas6處理後的細胞内訊息傳遞分子解 析，PI 3K-Akt途徑及MAPK途徑被視為具有藉由之訊 息傳遞之下游途徑的功能（非專利文獻2)。對這些下游途 徑確認直接的分子間相互作用之存在的實驗為，進行採用 以AXL的細胞内領域為餌的酵母菌雙雜合（ two-hybrid ) 法 之解析 ，確 認 出

GrbB2/P13K/p55Y/S0CS-l/NcK2/RanBP2/Cl-TEN(非專利文 獻13)。和這些蛋白質的相互作用，表明上述細胞内訊息 傳遞途徑存在於AXL訊息傳遞下游中，並且，亦支持axl 的預設分子功能之細胞增生促進、細胞凋亡抑制、細胞遊 走、細胞接著。再者，AXL被確認為是在IL_15之小鼠纖 維芽細胞的TNF α誘導細胞死抑制時高度表現的基因，依 據抑制AXL的表現使得TNFa誘導細胞死抑制解除、由 IL-15處理而造成IL_15受體及Au的磷酸化亢進的實驗 事實，可知藉由和IL—15受體的協同作用之訊息傳遞的存 在（非專利文獻14)。 σ '^不，在使AXL的顯性抑制體過度表現的乂 類神經膠瘤細胞株中，w ^ 、 甲u Gas6抑制AXL的磷酸化，使得名 裸鼠的致腫瘤性消失（非直女丨I私 ▲ 天、非專利文獻15)。但是，關於以抗Αχ] 抗體阻礙碟酸化之物异丕右Α 物疋否存在’則未見報告或教示而益法 明知。 起 AXL係為單次貫通膜型的受體路胺酸激酶，從ν末側 其細胞外區域由下而丨娃# · J構成· 2個類免疫球蛋白區（分 201041595 別稱之為I gD 1、I gD2 )和2個纖維連結蛋白第3型區（分 別稱之為FND1、FND2 )(非專利文獻1)。雖然已知在有關 細胞間接著的神經細胞接著分子（Neurai cell adhesion moducule )或腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白（Nephrin) 等的分子中發現FND，不過’關於在AXL中FND的功能之 細節仍不明（非專利文獻16)。 被認為是具有本來的細胞形質轉換能的致癌基因的 〇 AXL ’作為癌化關聯分子而成為解析對象，多數表現解析係 以蛋白質mRNA量來報告。在作為人類癌組織或人類癌細胞 中的表現確認事例的肺癌（非專利文獻1 7 )、乳癌（非專利 文獻18)、卵巢癌（非專利文獻i 9)、甲狀腺癌（非專利文獻 2〇)、黑色素瘤（非專利文獻20)、腎癌（非專利文獻21)、 胃癌（非專利文獻9)、神經膠瘤（非專利文獻22)之癌症種 類中，已確認有AXL蛋白質的高度表現，在食道癌（非專利 文獻23)、大腸癌（非專利文獻24)、急性骨髓性白血病（非 〇 專利文獻25)中存在有高量的AXL mRNA，由此表示有AXL 蛋白質的大量表現。除了上述事實之外，已有下列報告： 在HUVEC細胞中透過RNAi造成之AXL抑制之管腔形成阻礙 (非專利文獻26)，恆常的AXL抑制而造成之人類乳癌由來 細胞的小鼠内腫瘤形成能低下（非專利文獻26)、恆常的顯 性抑制變異體高表現造成的人類神經膠瘤細胞的小鼠内腫 瘤形成能低下（非專利文獻22)，而強烈表示了在腫瘤增生 中AXL的分子功能關聯。 已有報告指出對於AXL的細胞外區域的多株抗體具有 5 201041595 用（專利文獻1)。但是，

但是，在臨床上尚未被確認有抗腫瘤效果（非專利文獻27)。 因此，和AXL的特定區域結合的抗體，尤其是關於在 活體内（invivo)是否有抗腫瘤效果，或者該抗體是否有 AXL表現量降低作用，或者，該抗體是否有癌抑制作用， 既無報告又無教示，而處於不明的狀況。 【先前技術文獻】 【專利文獻】 高浸潤性乳癌細胞系的遊走抑制作 已知在非r · 表現抗腫# metal 1 opr 遊走，由jtl 素抑制劑 為可能的 Marimasta 【專利文獻1】W02004/008147 【專利文獻2】W02007/1 1431 9 【專利文獻3】W02009/041643 【非專利文獻】 【非專利文獻 1】0’Bryan 等 Mol Cell Biol 1991;11:5016-5031. 【非專利文獻 2】Varnum 等 Nature 1995; 373:623-626. 【非專利文獻 3】Nakano 等 FEBS Lett 1996;387:78-80. 【非專利文獻 4】Nakano 等 J Biol Chem 201041595 1995;270:5702-5705. 【非專利文獻 5】Goruppi 等 Mol Cell Biol 1997;17:4442-4453. 【非專利文獻 6】Bellosta 等 Oncogene 1997;15:2387-2397. 【非專利文獻 7 】Stenhof f 等 Biochem Biophys Res Commun 2004;319:871-878. • 【非專利文獻 8】Sainaghi等 J Cell Physiol ❹ 2005;204:36-44. 【非專利文獻 9】Sawabu 等 Mol Carcinog 2007;46:155-164 【非專利文獻 10】Fridell 等 J Biol Chem 1998;273:7123-7126 【非專利文獻 11】Allen 等 Mol Cell Biol 2002;22:599-613. Q 【非專利文獻 12 】McCloskey 等 J Biol Chem 1997; 272:23285-23291. 【非專利文獻 13】Haf izi 等 Biochem Biophys Res Commun 2002;299:793-800. 【非專利文獻 14】 Budagian 等 Embo J 2005;24:4260-4270. 【非專利文獻 15】VajkoczyP 等 Proc Natl Acad Sci USA 2〇〇6； i〇3： 5799-5804. 【非專利文獻 16】Yamagata 等 Curr. Opin. Cell Biol 7 201041595 2003； 15:621-632. 【非專利文獻 17】Shieh 等 Neoplasia 2005 ; 7 : 1 058-1 064 【非專利文獻 18】Meric 等 Clin Cancer Res 2002;8:361-367 【非專利文獻 19】Sun 等 Oncology 2004;66:450-457 【非專利文獻 20】Ito 等 Thyroid 2002; 1 2:971-975 【非專利文獻 21】Chung 等 DNA Cell Biol 2003;22:533-540 【非專利文獻 22】Vajkoczy 等 Proc Natl Acad Sci USA 2〇〇6；1〇3：5799-5804 【非專利文獻 23】Nemoto 等 Pathobiology 1997;65:195-203 【非專利文獻 24】Craven等 Int J Cancer 1 995; 60:791-797 【非專利文獻 25】Neubauer 等 Blood 1994;84:1931-1941 【非專利文獻 26】Holland 等 Cancer Res 2005;65:9294-9303 【非專利文獻 27】Pavlaki 等 Cancer Metastasis Rev. 2003;22:177-203 【非專利文獻 28 】Vai si tt i 等 J Biol Regul Homeost Agents. 2005;19: 105-12 【非專利文獻 29】Pardridge 等 JPharmacolExpTher. 1998;286:548-54 201041595 【發明内容】 【發明欲解決的課題】 本發明之課題為提供抗Anexelekt〇(AXL)抗體及以上 述抗體為有效成分之抗癌劑。詳言之，本發明之目的在於 藉由將小鼠來源的抗AXL抗體人型化，以降低在人體中的 免疫原性。 【用以解決課題之手段】 ❹ 本發明人等發現：和AXL結合之某種抗體，在活體外 (in vitro)具有AXL表現量降低作用，在活體内具有抗腫 瘤活H。並且發現：相較於和Axl其他區域結合的抗體， 和AXL的FND1區域結合的抗體具有更強的抗腫瘤活性。 再者’本發明人等藉由將上述取得之AXL抗體人型 化’而成功取得人型化抗AXL抗體。 相較小鼠來源的抗AXL抗體，可以預期這些人型化的 抗體在人體中的免疫原性更低。 〇 亦即’本發明下關於下述： [1]下述（1)〜（6)中任一項所記載的辨識AXL的 FND1區域的抗體： (1 )抗體，其所具有之重鏈可變區包含：具有序列識別號： 33〜37中記載的任一種胺基酸序列的CDR卜具有序列識別 號：38〜48中記載的任一種胺基酸序列的CDR2、具有序列 識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的CDR3 ; (2 )抗體’其具有序列識別號：2 ( H0)所記載之重鏈可 變區； 9 201041595 (3 )抗體’其所具有之輕鏈可變區包含：具有序列識別號： 84〜89中記載的任一種胺基酸序列的CDR1、具有序列識別 5虎.9 0 S己載的胺基酸序列的C D R 2、具有序列識別號 : g 1 中記載的任一種胺基酸序列的CDR3 ; (4) 抗體，其具有序列識別號：65 (L0)所記載之輕鏈可 變區； (5) 具有（1)的重鏈可變區及（3)的輕鏈可變區之抗體； (6 )在（1 )〜（5 )中任一項所記載的抗體中，有1或複 數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插入的抗體，且和（i ) 〜（5 )中任一項所記載的抗體有同等活性的抗體。 [2]為下述（1)〜（6)中任一項所記載的辨識axl 的FND1區域的人型化抗體： (1 )抗體，其所具有之重鏈可變區包含：具有序列識別號： 33〜37中記载的任一種胺基酸序列的CDR卜具有序列識別 號：38〜48中記載的任一種胺基酸序列的CDR2、具有序列 識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的CDR3，以及具有 序列識別號：51中記載的胺基酸序列的FR1、具有序列識 別號：53中記載的胺基酸序列的FR2、具有序列識別號： 109及58中記載的任—種胺基酸序列的FR3、具有序列識 別號：61中記載的胺基酸序列的FR4 ; (2 )抗體’其具有序列識別號：2 ( H0)所記載之重鏈可 變區； (3 )抗體’其所具有之輕鏈可變區包含：具有序列識別號： 84〜8 9中s己載的任一種胺基酸序列的cdr 1、具有序列識別 10 201041595 號：90記載的胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：91 中記載的任一種胺基酸序列的CDR3，以及具有序列識別 號.9 3中記載的胺基酸序列的f R1、具有序列識別號：9 6 中記載的胺基酸序列的FR2、具有序列識別號：1 〇丨中記載 的胺基酸序列的FR3、具有序列識別號：丨03中記載的胺基 酸序列的FR4 ; (4 )抗體，其具有序列識別號：65 ( LO)所記載之輕鏈可 變區， 〇 (5) 具有（1)的重鏈可變區及（3)的輕鏈可變區之抗體； (6) 在（1)〜（5)中任一項所記載的抗體中，有1或複 數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插入的抗體，且和（i ) 〜（5 )中任一項所記載的抗體有同等活性的抗體。 [3] 如[1]或[2]所述之抗體，重鏈可變區中Kabat編 號第94號的胺基酸殘基為甘胺酸（giyCine)。 [4] 如[1]-[3]任一者所述之抗體，重鏈可變區的胺基 〇 酸序列中’包含以下的胺基酸殘基中至少一者： (1 )重鏈可變區中Kabat編號第31號的胺基酸殘基為天 門冬胺酸（asparaginic acid)、麵胺酸（glutaminic acid)、離胺酸（lysine)、精胺酸（arginine); (2 )重鏈可變區中Kabat編號第40號的胺基酸殘基為脯 胺酸（prol ine); (3 )重鏈可變區中Kabat編號第41號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4)重鏈可變區中Kabat編號第43號的胺基酸殘基為麩 11 201041595 醯胺酸（glutamine)或麵胺酸； (5 )重鏈可變區中Kabat編號第44號的胺基酸殘基為精 胺酸； (6 )重鏈可變區中Kabat編號第48號的胺基酸殘基為異 白胺酸（isoleucine ); (7) 重鏈可變區中Kabat編號第61號的胺基酸殘基為麵 胺酸、離胺酸、或精胺酸； (8) 重鏈可變區中Kabat編號第62號的胺基酸殘基為麵 胺酸； (9) 重鏈可變區中Kabat編號第64號的胺基酸殘基為麩 醯胺酸； (10 )重鏈可變區中Kabat編號第65號的胺基酸殘基為天 門冬胺酸； (11 )重鏈可變區中Kabat編號第73號的胺基酸殘基為天 門冬醯胺酸（asparagine) (12)重鏈可變區中Kabat編號第1〇5號的胺基酸殘基為 楚胺酸或精胺酸 [5 ]如申請專利範圍第[1 ] - [ 3 ]項任一項所述之抗 體，重鏈可變區的胺基酸序列中，包含以下的胺基酸殘基 中至少一者： (1 )重鏈可變區中Kabat編號第41號的胺基酸殘基為精 胺酸； (2 )重鍵可變區中Kabat編號第43號的胺基酸殘基為麵 醯胺酸； 12 201041595 (3)重鏈可變區中Kabat編號第44號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4 )重鏈可變區中Kabat編號第61號的胺基酸殘基為精 胺酸； (5)重鏈可變區中Kabat編號第73號的胺基酸殘基 為天門冬醯胺酸。 [6]如[1]-[5]項任一項所述之抗體，其輕鏈可變區的胺基 酸序列包含以下的胺基酸殘基中至少一者： 〇 (1 )輕鏈可變區中Kabat編號第17號的胺基酸殘基為精 胺酸； (2 )輕鏈可變區中Kabat編號第24號的胺基酸殘基為麵 醯胺酸； (3 )輕鏈可變區中Kabat編號第27號的胺基酸殘基為麩 胺酸或精胺酸； (4 )輕鏈可變區中Kabat編號第29號的胺基酸殘基為丙 〇 胺酸（alanine); (5 )輕鏈可變區中Kabat編號第42號的胺基酸殘基為麩 胺酸或麩醯胺酸； (6 )輕鏈可變區中Kabat編號第45號的胺基酸殘基為離 胺酸； (7)輕鏈可變區中Kabat編號第1〇〇號的胺基酸殘基為精 胺酸； (8 )輕鏈可變區中Kabat編號第1〇4號的胺基酸殘基為纈 胺酸（val ine ); 201041595 (9)輕鏈可變區中Kabat編號第i〇7號的胺基酸殘基為麩 胺酸。 [7]如[1]-[5]項任一項所述之抗體’輕鏈可變區的胺基酸 序列中’包含以下的胺基酸殘基中至少一者： (1 )輕鏈可變區中Kabat編號第1 7號的胺基酸殘基為精 胺酸； (2 )輕鏈可變區中Kabat編號第24號的胺基酸殘基為麩 醢胺酸； (3) 輕鏈可變區中Kabat編號第27號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4) 輕鏈可變區中Kabat編號第29號的胺基酸殘基為丙 胺酸； (5) 輕鏈可變區中Kabat編號第45號的胺基酸殘基為離 胺酸； (6 )輕鏈可變區中Kabat編號第100號的胺基酸殘基為精 胺酸； (7 )輕鏈可變區中Kabat編號第1 04號的胺基酸殘基為類 胺酸； (8 )輕鏈可變區中Kabat編號第1 07號的胺基酸殘基為麵 胺酸。 [8 ]如[1 ] - [ 5 ]項任一項所述之抗體，至少包含以下任一個 重鏈可變區： (1 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記载的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 201041595 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (2) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：34記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (3) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：35記載的胺基 ❹ 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (4) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：39記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ; (5 )重鍵可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 〇 酸序列的CDR1、具有序列識別號：40記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (6)重鍵可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR 1、具有序列識別號：41記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (7 )重鍵可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR 1、具有序列識別號：42記載的胺基酸序列的 15 201041595 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (8 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：43記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (9 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：44記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ; (1 0 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：45記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ; (11 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號；46記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (12 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：36記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號· 38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ; (1 3 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：37記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 16 201041595 謹、具有序列識別號：49中記载的任—種胺基酸序列的 CDR3 ； (14) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的am、具有序列識別號：47記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (15) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：48記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3。 [9]如[1]-[7]項所述之抗體，其係由下列（1)〜（25) 構成之群中選出： (1 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (2 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：85、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (3 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：86、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 201041595 (4 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：87、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (5 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 8、9 0及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (6 )包含下列之抗體··包含分別由序列識別號：34、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號.8 4、9 0及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (7 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：35、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (8 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、39 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (9 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、4〇 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 18 201041595 (1 0 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、41 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鍵可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (11 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、42 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； ❹ （12 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、43 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (13 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、44 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 q 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (14 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、44 及49所記載的胺基酸序列的CDR丨、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號.8 5、9 0及91所δ己載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (15 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：3 3、4 5 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 19 201041595 (1 6 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：3 3、4 6 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (17 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：3 3、4 4 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：89、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (18 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：36、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (19 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：37、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及9丨所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (2 0 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：3 3、4 7 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、9〇及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (21 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR 1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 4、9 〇及91所記载的胺基 酸序列的CDR 1、2及3的輕鏈可變區； 20 201041595 (22 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：85、及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (23 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號.8 7、9 0及91所記載的胺基 ▲ 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 〇 (24 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、47 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (25 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、47 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：87、90及91所記載的胺基 ◎ 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區。 [10 ]如[1 ]或[2 ]所述之抗體，其包含：序列識別號： 2〜32中任一者所記載的重鏈可變區及序列識別號：65〜 83中任一者所記載的輕鏈可變區。 [11 ]如[1 ]所述之抗體，其係為包含序列識別號：1所記 載的重鏈可變區及序列識別號：64所記載的輕鏈可變區， 並具有人型抗體來源的恆定區之嵌合抗體，或者該嵌合抗 體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插 入，並和該嵌合抗體有同等的活性的抗體。 21 201041595 [12]如[1]-[11]項任一項所述之抗體，輕鏈可變區的 胺基酸序列中，Kabat編號第42號的胺基酸殘基為離胺酸。 [13 ] —種醫藥組成物，其係以如[1 ] - [ 12 ]項中任一項所述 之抗體為有效成分。 [14 ] 一種抗癌劑，其係以如[1 ] - [ 12 ]項中任一項所述之抗 體為有效成分。 [1 5 ]如[14 ]項所述之抗癌劑，其中該癌係為胰臟癌、胃 癌、肺癌、骨肉瘤、大腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宮 内膜癌、卵巢癌、子宮平滑肌瘤、曱狀腺癌、幹細胞癌、 乳癌、膀胱癌、腎臟癌、神經膠瘤、神經芽腫、或食道癌。 [16]如[14]項所述之抗癌劑，其中該癌係為神經膠瘤、胃 癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、胰腺癌或乳癌。 [1 7 ]如[14 ]項所述之抗癌劑，其中該癌係為胰腺癌或 乳癌。 [18 ] —種癌症治療方法，其係包含將如[丨]〜[12 ]中任 一項所記載的抗體投予對象（例如人類等哺乳動物）的步 驟。 造中的使用。 本發明人所選擇之融合瘤（受託號碼晒肝—觸 係寄存於日本獨立行政法人產#技術總合研究所特許生 寄存中心。以下記载界定寄存的内容。 (a)寄存機關的名稱地址 名稱：獨立行政法人產業技術 σ研究所特許生物寄存 22 201041595 地址：曰本茨城県茨城市東i丁目1#1中央 便番号305-8566 ) (b) 受託曰（寄存曰）：2〇〇7年了月5曰 (c) 受託號碼：

FERM AXL No.225 #070402 (Ax225)(受託番号 BP-10854) 〇 再者、該融合瘤亦已於台灣寄存。以下 的寄存内容。 5己載在台灣 (〇寄存機関名稱：財團法人食品工業發展研究所 (ii) 寄託機関地址：台灣新竹市食品路3 3 1号 (iii) 寄存微生物：融合瘤 BP— 10854 (iv) 寄存號碼：BCRC 960390 (v) 寄存曰：2009年2月5曰 該融合瘤所產生抗體的重鏈可變區的胺基酸序列表示 Ο 於序列識別號：1，輕鏈可變區的胺基酸序列表示於序列識 別號：64。該重鏈可變區的CDR卜CDR2、CDR3、FR1、FR2、 FR3及FR4的胺基酸序列則表示於序列識別號：33、序列 識別號：38、序列識別號：49、序列識別號：50、序列識 別號：52、序列識別號：57及序列識別號：60。另外’該 輕鏈可變區的 CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3 及 FR4 的胺基酸序列則表示於序列識別號：8 4、序列識別號：9 0、 序列識別號：91、序列識別號：92、序列識別號：95、序 列識別號：1 〇〇及序列識別號：1 02。 23 201041595 本發明之較佳抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區，以及 此等 CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3 及 FR4 的胺基酸 序列及序列識別號的對應如下表1及表2所示。 【表1】 重鏈 可變區全長 CDR1 CDR2 CDR3 FR1 FR2 FR3 FR4 chH 1 33 38 49 50 52 57 60 HO 2 33 38 49 51 53 58 61 H9 3 33 38 49 51 53 59 61 H17 4 34 38 49 51 53 59 61 H18 5 35 38 49 51 53 59 61 H19 6 33 38 49 51 54 59 61 H20 7 33 38 49 51 55 59 61 H21 8 33 39 49 51 53 59 61 H22 9 33 40 49 51 53 59 61 H23 10 33 41 49 51 53 59 61 H24 11 33 42 49 51 53 59 61 H25 12 33 43 49 51 53 59 61 H26 13 33 44 49 51 53 59 61 H26 13 33 44 49 51 53 59 61 H26 13 33 44 49 51 53 59 61 H26 13 33 44 49 51 53 59 61 H26 13 33 44 49 51 53 59 61 H27 14 33 45 49 51 53 59 61 H28 15 33 46 49 51 53 59 61 H30 16 33 38 49 51 53 59 62 H31 17 33 44 49 51 54 59 61 H32 18 33 44 49 51 53 59 62 H33 19 33 44 49 51 54 59 62 H34 20 36 38 49 51 53 59 61 H35 21 37 38 49 51 53 59 61 H36 22 33 38 49 51 56 59 61 H37 23 33 47 49 51 53 59 61 H38 24 33 48 49 51 53 59 61 H39 25 33 38 49 51 53 59 63 H40 26 36 38 49 51 56 59 61 H41 27 37 38 49 51 56 59 61 H46 28 33 48 49 51 56 59 61 H47 29 33 47 49 51 56 59 61 H48 30 33 38 49 51 56 59 63 H49 31 33 48 49 51 56 59 63 H50 32 33 47 49 51 56 59 63 201041595 【表

Ο 再者，上述任一者所記載的抗體的胺基酸序列中有1 個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插 Ο 且和該 抗體有同等活性的抗體，亦包含於本發明範圍中。 在本發明中所謂之「有同等活性的抗體」係為，例如 「至少具有同等的結合活性或活體内（invivo)活性的抗 體」。具體言之’「HG及/或L0的胺基酸序列中有i個或 複數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插人，且相較於 H0/L0抗體’至少具有同等的抗原結合活性或活體内活性 的抗體」亦為本發明範圍。在此，活體内（—“。)活性 包含在活體試驗中的抗腫瘤活性，具體言之，包含本案實 25 201041595 施例6中採用之異種移植小鼠模型試驗。 以此為佳：本發明的抗體為和AXL的FNM區域結合的 人型化抗體。亦即，在另一例中，本發明提供和結合 的人型化抗體。 於另一例中，本發明提供，包含上述之本發明的任一 抗體的醫藥組成物。醫藥組成物為抗癌劑更佳。 在另一例中，本發明提供包含之本發明的任一抗體的 的A XL表現量抑制劑、診斷藥。 【發明效果】 可預期這些人型化抗體，其在人體中的免疫原性低於 小鼠來源的抗AXL抗體。 【實施方式】 人型化抗體 本發明中抗體的較佳樣之一為，和Axl結合人型化 抗體。人型化（humanized)抗體可以使用已知的方法製造。 人型化抗體亦稱之為重塑（reshaped )人型抗體。 在本發明中，人型化抗體係由下列構成：人類以外的 動物來源抗體的互補決定區（c〇mplementaHty determining region，CDR)、和人型抗體來源的骨幹區域 (framework reagion，FR)及人型抗體來源的固定區域 (constant region)。人類以外的動物來源抗體係由，以 受託號碼FERM BP-1 0854寄存之融合瘤（獨立行政法人產 201041595 業技術總合研究所特許生物寄存中心，a去—^ n 口令次城県〇〈试、 市東1 丁目1番1中央第6,受託日（寄存日）：2〇〇7年 7月5日）所產生之Αχ225抗體（申請號石馬. PCT/JP2008/070739 )。Αχ225抗體的取得方法記載於參考 例1中。Αχ225抗體和AXL之FND1區域之結合則記載於參 考例2。Ax225抗體具有AXL表現量降低活性之事則記載於 參考例3。 ' 〇 帛以製造人型化抗體之—般的基因重組方法亦為已知 (參見歐洲專利申請公開號：EP 125023號公報，恥 96/02576號公報）。將所得到的DNA和錄有人型抗體固定 區域或人型抗體固定區域改變體之DNA連結，繼之再嵌入 表現載體，將其導入宿主以使其產生，藉此得到人型化抗 體（參見歐洲專利申請公開號：Ep 2394〇〇號公報，國際 專利申請公開號碼：W0 96/02576號公報）。 將Ax225抗體的CDR區域和人型抗體的骨幹區域連接 〇 的人型化Ax225抗體可以如下述製造。首先，分別設計人 型化Αχ225抗體的重鏈（η鏈）、輕鏈（L鏈）的可變區序 列，並設計載有這些區域的複數條合成寡MR片段。藉由 組合式聚合酶連鎖反應將這些募DNR片段接合，以製造載 有可變區全長的基因。（參見w〇〇98/〇3388號公報記載的 方法） 和CDR連接的人型抗體的骨幹區域，可選擇cdr形成 良好的抗原結合部位者。可因應需要，在抗體的可變區中 將骨幹區域的胺基酸進行取代、缺失、附加及/或插入等。 27 201041595 另外，也可以在上述的CDR中將i個或複數個胺基酸 取代、缺失、附加及/或插入。丨個或複數個胺基酸被取代、 缺失、附加及/或插入後的CDR序列，其結合活性、中和活 性、穩定性、免疫原性及/或藥物動態和改變前的序列 有同等以上的性質為佳。被取代、缺失、附加及/或插入的 胺基酸個數並未特別限定，不過，在i個CDR中有3個以 下的胺基酸較佳、2個胺基酸以下更佳、丨個胺基酸更佳。 胺基酸的取代、缺失、附加及/或插入等可以用上述方 法進行。 另外，本發明的抗體所使用的固定區域並未特別限 定，可以使用任何的固定區域。本發明的抗體所使用之固 定區域的較佳例為，人型抗體來源的固定區域（例如在Η 鍵為 〇1、（^2、（：丫3、〇4、4、（：5、仏1、（^2、及（^;在 L鏈為Ck、（：λ等）。天然的人型抗體固定區域之較佳例為， IgGl、IgG2或IgG4來源的固定區域。 若本發明的抗體之固定區域為I gG 1來源，則可望因為 其ADCC活性或CDC活性而增強後述的本發明之抗體的抗腫 瘤活性。 若本發明的抗體之固定區域為I gG4來源，則渴望能夠 降低本發明抗體的副作用。 另外’基於降低異質性、增強aDCC活性、延長血漿中 半衰期等的目# ’可在人型抗體來源的固定區域中取代、 缺失附加及/或插入1個或複數個胺基酸。在此之i個或 複數個胺基酸為，例如30個以下的胺基酸、（5個以下的 28 201041595 個以下的胺基酸更 胺基酸為佳、l 〇以下的胺基酸較佳 佳。 本發明的抗體，只要具有和AXL (FND1區域較佳）的 結合活性及/或中和活性，並不只是以IgG為代表之二價抗 體，亦包含-價抗體或以IgM為代表之多價抗體。本發明 的多價抗體包含，均具有相同抗原結合部位的多價抗體、 或者具有一部份或全部不同的抗原結合部位的多價抗體。 〇 本發明的抗體並不限於抗體的全長分子，只要和AXL結 合，低分子化抗體或其修飾物亦可。 低分子化抗體係為包含全長抗體（wh〇le antib〇dy， 例如whole IgG等）的一部份缺損之抗體片段的抗體，只 要具有和AXL的結合活性及/或中和活性即可，並不特別限 定。本發明中的低分子化抗體係為只要包含全長抗體的一 部份即可，並未特別限定，不過，包含VH或VL較佳，包 含VH和VL兩者的低分子化抗體更佳。另外，本發明的低 〇 分子化抗體之其他較佳例為，包含抗體CDR的低分子化抗 體。低分子化抗體包含的CDR可以為抗體的6個CDR均包 含’或者也可以包含一部份的CDR。 本發明之低分子化抗體，其分子量小於全長抗體較 佳’不過’也有形成例如雙體、三體、四體等的多量體， 而比全長抗體的分子量還大的。 抗體片段的具體例為，Fab、Fab， 、F(ab，）2、Fv等。 另外’低分子化抗體的具體例為，Fab、Fab’ 、F(ab，）2、

Fv、scFv( single-chain Fv)、雙功能抗體（diabody)、 29 201041595 sc(Fv)2( single-chain (Fv)2)等。這些抗體的多量體（例 如雙體、三體、四體 '多體）亦包含於本發明的低分子化 抗體中。 例如’抗體片段可以藉由以酵素處理抗體以產生抗體 片段。例如，已知木瓜酵素（papain)、胃蛋白酶（pepsin)、 或纖維蛋白溶酶（piasmin)可作為產生抗體片段的酵素。或 者，建構載有這些抗體片段的基因，並將其導入表現載體 之後’再於適當的宿主細胞中使其表現（例如參見C〇，μ. S. et al. , J. Immunol. ( 1994 ) 152, 2968-2976 ' Better, M. and Horwitz, A. H. Methods in Enzymology ( 1 989 ) 1 78, 476-496 ' Plueckthun, A. and Skerra, A. Methods in Enzymology ( 1 989 ) 1 78, 476-496 ^ Lamoyi, E., Methods in Enzymology ( 1 989 ) 1 21, 652-663 ^ Rousseaux, J. et al.，Methods in Enzymology ( 1 989 ) 1 21，663-669、Bird, R. E. et al·， TIBTECH(1991) 9， 132-137)。 /肖化酵素切斷抗體片段的特定位置，得到如下述之特 定構造的抗體片段。對於此種以酵素得到的抗體片段，利 用基因工程的手段’可以使抗體的任意部分缺失。 使用上述的消化酵素而得到的抗體片段如下。 木瓜酵素消化：F(ab)2或Fab 胃蛋白酶消化：F(ab，）2或Fab， 纖維蛋白溶酶消化：Facb 本發明中的低分子化抗體，只要具有和AXL的結合活 性及/或中和活性，可以包含缺失了任何區域的抗體片段。 30 201041595 雙功能抗體（diabody )係指，藉由基因融合而建構之 二價的低分子化抗體（H〇1Hger p et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993) EP404, 097號、W093/1 1 1 61號等）。雙功能抗體係為2條 多胜肽鏈構成之雙體。通常構成雙體的多胜肽鏈為，在各 鏈中’同鏈中VL及VH藉由連結體（linker)結合。一般 而言，雙功能抗體中，在VL·及VU無法互相結合的位置該 ❹多胜肽鏈的連結體是短的。具體言之，構成連結體的胺基 酸殘基為2〜12殘基較佳，以3〜1〇殘基更佳，尤其是5 個殘基左右。因此’同一個多胜肽鏈上所載之VL及VJJ， 無法形成單鏈可變區片段，而和其他的單鏈可變區形成二 量體。其結果為，雙功能抗體有2個抗原結合部位。 scFv抗體為，以連結體等將vl及VH結合成為一條鏈 多胜肽的抗體（Huston, J. S. etal., Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883 、Plickthun「 The 〇 Pharmacol〇gy of Monoclonal Antibodies 」Vol.113,

Resenburg 及 ζλ Moore 編，Springer Verlag, New York, PP.269-31 5’ （ 1 994)) °scFv 中的 H鏈 V 區域及 L鏈 V 區 域可以為本說明書中所記載的任一種抗體來源。連接v區 域的胜肽連結體並未特別限制。例如可以3到25殘基左右 構成的任意的一條鏈胜肽使用作為連結體。具體言之，例 如可以使用如後述的胜肽連結體等。 兩鏈的V區域，可以藉由如上述的PCR法連接。為了 藉由PCR法連接V區域’首先在下列dna中，以載有全部 31 201041595 或所欲部分的胺基酸序列的dna做為模版 載有抗體的Η鏈或Η鏈v區域的DNA序列，以及 抗體的L鏈或L鏈V區域的DNA序列。 藉由使用具有欲增幅的])NA的+ μ , 」υΐΝΛ的兩端序列所對應之序列 的-對引子的PCR &，分別將載有Η鏈和L鏈的ν區域的 ΜΑ增幅。繼之’準備載有胜肽連結體部分的腿。載有胜 肽連結體的DNA也可以利用pcr八士 . , J用ακ σ成。此時在所利用的引 子的5’ #，附加可以和另外合成的各ν區域的增幅產物 連接的鹼基序列。繼之，利用〔Η鏈V區域DNA〕—〔胜肽 連結體DNA〕一〔L鍵V領域Ι)Ναί τ\χτ 只场則幻的各DNA及聚合PCR用 的引子，以進行PCR反應。 聚合PCR用的引子传由>5^「u 17 丨卞1乐由和〔H鏈V區域DNA〕的5，端 練合（a·31)的引子、和〔L鏈V領域DM〕之3,端煉 合的引子組合而成。亦即，聚合pcR的引子為，可以將載 有欲合成的ScFv的全長序列之DNA增幅的引子組。另一方 面，在〔胜肽連結體難〕上附加可以和各v區域謝連 接的驗基序列。其結果為’這些舰被連接，再藉由聚合 PCR用的引子’最後產生seFv全長作為增幅產物。當作為 載有SCFV的職之後，則依據-般方法取得包含這些的表 現載體、以及用該表現載體而轉型之重組細胞。另外，培 養取得的重組細胎，祐梯恭古兮 已亚便戰有該scFv的DNA被表現，從而 取得該s c F v。 被結合的VL及VH的順序並不特別限定，以何種順序 排列均可’例如下述之配置。 201041595 〔VH〕連結體〔vl〕 〔VL〕連結體〔μ〕

Vfl及2個VL結合成 et al 、 J Immunol. sc(Fv)2為，以連結體等將2個 為一條鏈的低分子化抗體（Huds〇n sc(Fv)2可以藉由連結

Methods 1999 ; 231 : 177-189) 體將scFv連接而成。 Ο ❹ 另外^⑽及^几為^ —條鏈多胜肽㈣端為 基點並依據VHm( m〕連結體連㈣ 〔VH〕連結體〔VL〕）的順序依序排列之抗體為佳，但是， 2個VH及2個VL的順序並不限於上述配置，以何種順序 排列均可。例如也可以使用如下配置。 〔几〕連結體〔VH〕連結體〔VH〕連結體〔几〕 〔VH〕連結體〔VL〕連結體〔几〕連結體〔傾〕 〔VH〕連結體〔VH〕連結體〔VL〕連結體〔η〕 〔VL〕連結體〔VL〕連結體〔V{{〕連結體〔μ〕 〔VL〕連結體〔VH〕連結體〔VL〕連結體〔VH〕 低分子抗體中的VH或VL的胺基酸序列可以被取代、 缺失新增及/或插入。再者，若使VH和VL會合，則只要 有抗原結合活性’就算一部份缺損也沒關係、，附加其他多 胜肽亦可。另外，可變區為嵌合化或人型化亦可。 .在本發明中，用於將抗體的可變區接合的連結體可以 :、、钍 '基因工程V入之任意的胜肽連結體、或合成化合物 體例如 Protein Engineering，9(3)，299_3〇5，1996 中記載的連結體。 33 201041595 在本發明中較佳的連結體為胜肽連結體。胜肽連社體 的長度並未特別限定，可以由使用者依據其目的而適當地 選擇，不過，通常為1〜100胺基酸、3〜5〇胺基酸較佳、 5〜30胺基酸尤佳、12〜18胺基酸特佳（例如15胺基酸）。 胜肽連結體的胺基酸序列可以下列為例。

Ser

Gly · Ser G1y · G1y · Ser Ser · Gly · Gly

Gly · Gly · Gly · Ser (序列識別號：11〇 )

Ser · G1 y · G1 y · G1 y (序列識別號：111 )

Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (序列識別號：112 )

Ser · G1 y · G1 y · G1 y · G1 y (序列識別號：11 3 )

Gly· Gly· Gly· Gly. Gly· Ser (序列識別號：114) Ser· Gly. Gly· Gly· Gly· Gly (序列識別號：ι15) Gly. Gly. Gly· Gly· Gly. Gly· Ser (序列識別號： 116)

Ser · G1 y · G1 y . G1 y · G1 y · G 1 y · G1 y (序列識別號： 117) (G1 y · G1 y · G1 y · G1 y · Ser (序列識別號：112 ) )η (Ser . Gly · Gly · Gly · Gly (序列識別號：113) )n [n為1以上之整數] 胜肽連結體的胺基酸序列可以由使用者依據其目的而 適當地選擇。例如，決定上述胜肽連結體長度的η通常為 34 201041595 1〜5、以1〜3為佳、以1或2更佳。

合成化合物連結體（化學聯結劑）為，通常用於胜肽 聯結之聯結劑，例如：NHS ( N-hydroxysuccinimide) ' DSS (Disuccinimidy 1 Suberate ) 、 BS3 ( bis-

sulfosuccinimidy1 suberate ) 、 DSP Ο Ο (DithiobisCsuccinimidy1-propionate) ) 、 DTSSP (Dithiobis(su1fosuccinimidy1 propionate) ) ' EGS (Ethylene glycol bis [succinimidylsuccinate])、 sulfo-EGS ( Ethylene glycol bis

[sulfo-succinimidylsuccinate]) 'DST( DiSuccinimidyl Tartarate ) 、 sulfo- DST ( DiSulfoSuccinimidy1 Tartarate ) 、 BS0C0ES ( Dithio-bis(Succinimidyl Propionate ) 、 su1fo-BSOCOES (Bis(2-(3-sulfo-N-succinimidy1-oxycarbonylosy)eth yl)sulfone)等，這些聯結劑均在市面上有售。 若要將4個抗體可變區結合’則通常需要3個連結體。 複數個連結體可以使用相同的或不同的連結體。 本發明的抗體亦包含，在本發明的抗體的胺基酸序列 中附加1個或複數個胺基酸殘基的抗體。另外，也包含這 些抗體和其他的胜肽或蛋白 造融合蛋白質的方法為，將 載有其他的胜肽或多胜肽的 質融合而成的融合蛋白質。製 載有本發明抗體的多核苷酸和 多核苷酸連接使其框架一致， 並將其導入表現載體’使其在宿主中表現即可，可以使用 本領域已知的手法。和本發明的抗體融合的其他的胜肽或 35 201041595 多胜肽可以使用’例如FLAG ( Hopp, T. P. et al.,

BioTechnology ( 1 988) 6，1 204-1 21 0 ) 、6 個 His (組織 胺 ’ histamine)殘基構成的 6xHis、lOxHis、HA( inf luenza virus hemagglutinin)、人類 c-myc 片段、VSV-GP 片段、 pl8HIV 片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T 抗原片段、 lck tag、a -tubulin 片段、B-tag、Protein C 片段等的 已知胜肽。 另外，和本發明的抗體融合的其他的多胜肽可以為， 縠胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase，GST)、 HA ( influenza virus hemagglutinin )、免疫球蛋白恆常 區域、冷-半乳糖苷酶（/3-〇318(：1：031(13 36)、麥芽糖結合蛋 白（maltose binding protein，MBP)。將市面上賣的載 有這些胜肽或多胜肽的多核苷酸，和載有本發明抗體的多 核苷酸融合’使如此製造出的融合多核苷酸表現，而能夠 製造出融合多胜肽。 再者，本發明的抗體亦可為，和聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)或玻尿酸（hyaluronic acid) 等的高分子物質、放射性物質、螢光物質 '發光物質、酵 素、毒素等的各種分子結合的複合抗體。此種複合抗體， 係可以藉由將得到的抗體施以化學修飾而得。再者，抗體 的修飾方法在本領域已被確立（例如US5057313、 US5156840 )。在本發明中的「抗體」亦包含這些複合抗體。 另外’在本發明的抗體中亦包含醣鏈被改變的抗體。 已知可以藉由改變抗體的醣鏈而增強抗體的細胞傷害活 36 201041595 r 性。例如’醣鏈被改變的抗體已知有後述之抗體。 醣基化被修飾的抗體（W099/54342等）、附加於醣鏈 的海藻糖（fucose)缺損之抗體（WOOO/61739、W002/31140 等））' 具有等分（bisecting ) GlcNAc的醣鏈之抗體 (WO02/79255 等）等。 再者，本發明中使用的抗體亦可為雙重特異性抗體 (bispecific antibody)。所謂的雙重特異性抗體係為， ❹ 在同一個抗體分子内具有辨識不同的抗原決定基 (epitope)的可變區之抗體。在本發明中，雙重特異性抗 體可以為.辨識AXL分子上的不同抗原決定基的雙重特異 性抗體；亦可以為一邊的抗原結合部位辨識AXL，另一邊 的抗原結合部位辨識其他物質之雙重特異性抗體。再者， 就其他例觀之，亦可以為一邊的抗原結合部位辨識AXL， 另一邊的抗原結合部位辨識人類效應細胞的抗體之雙重特 異性抗體。辨識AXL之本發明的抗體構成的雙重特異性抗 〇 體的另一邊的抗原結合部位結合的抗原可以為：CD2，CD3, CD16, CD19, CD20, CD25, CD28, CD33, CD30, CD44, CD44v6, CD52, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, EGFRvIII, HER-2 neu, HER-3, HER-4, cMET, EpCAM, IGF-1R, TRAIL-R2, Tie-1, PDGFR-alpha, NKG2D, CCR5, Gas6, Mer, Tyro3, NCAM, Transferin receptor, Folate binding protein, IL-15, IL一 15R, CEA, CA125, MUC-1,力· > / ” 才シ F GD3, Glypican-3， GM2, Sonic Hedgehog(Shh)。 辨識AXL之本發明的抗體構成的雙重特異性抗體的另 37 201041595 一邊的抗原結合部位結合的AXL分子上的不同抗原決定基 可以為：IgDl，IgD2, FND2。 用以製造雙重特異性抗體的方法為已知。例如，可以 將不同辨識抗原的2種抗體結合，以製造雙重特異性抗 體。被結合的抗體可以為分別有Η鏈和l鏈的1 /2分子， 也可以為僅由Η鏈構成的i/4分子。或者，將產生不同的 單株抗體之融合瘤（hybridoma)融合，以製造產生雙重特異 性抗體的融合細胞。再者，也可以藉由基因工程的方法來 製造雙重特異性抗體。 本發明的抗體，由於後述的產生抗體的細胞或宿主或 純化方法，其胺基酸序列、分子量、等電點或醣鏈的有無 或型態等會有不同。但是，所得到的抗體，只要和本發明 抗體有同樣的機能，即包含於本發明中。本發明記載之胺 基酸序列所含之胺基酸，在經過轉譯後修飾（例如n端㈣ 醯胺酸經焦㈣氨化㈣視為焦麵氨酸（咖giutamic acid)，為該技術領域中已知之修飾)時，該胺基酸雖經過 轉譯後修飾，A包含於本發明記载之胺基酸序列。再者， 以原核細胞來表現本發明抗料，在原本的抗體的胺基酸 序力的N端附加甲硫胺酸（methi〇nine)殘基。 本發明的抗AXL抗體算的容M 1 寺的夕胜肽可以用本領域業者公 知的方法製造。 例如，可以用得到的抗AXL抗體的序列為基礎，使 本領域業者公知的的基因重組技術來製造抗m抗體。 體言之，以辨識m的抗體的序列為基礎，建構載有抗 38 201041595

的多核普酸，並將之導入表現載體之後，在適當的宿主細 胞表現即可（例如，參見（^〇，^|.8.6士&1.，>1.11111111111〇1· 0994) 152, 2968-2976 ; Better, M. andHorwitz, A. Η., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E. , Methods Enzymol. ( 1 986) 1 21, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends

Biotechnol. (1991) 9， 132-137)。 載體之例子為：M13系載體、pUC系載體、PBR322、 pBluescript、PCR-Script。另外，cmA 的次選殖 (Subcloning)，在以切出為目的時’除了上述載體之外， 還可使用例如PGEM-T、PDIRECT、PT7等。以生產本發明的 抗體為目的使用載體時，《其適用表現載體。例如，表現 載體為’以在大腸桿菌中表現為目的時，❺了載體具有在 大腸桿菌中增幅的特徵之外，以JM1〇9、Μ5α ' Ηβ1〇ι、 XL1-Blue等大腸桿菌為宿主時，必須具有可以在大腸桿菌 中有效表現的啟動子，例如：hcZ啟動子（Ward等，Nature (1989)341, 544-546 ； FASEB J. (1992)6, 2422-2427) > aW 啟動子（Better 等，Science (1988) 24〇, 1041 1043 )、或T7啟動子等。此種載體，除了上述載體 之外至可以為pGL1(Pharmacia製）、「心卿⑽ smem」（Qlagen製）、pEGFp、或ρΕτ(在此情況下，宿 主為表現Τ7 RNA聚合酶的BL21為佳）等。 39 201041595 再者，表現質體的載體中，可以包含用於抗體分泌之 訊息序列。產生於大腸桿菌的胞外質（per i P 1 asm )時，用 於抗體分泌之訊息序列可以使用pelB訊息序列（Lei, s. P. et al·，J· Bacteriol. ( 1 987) 1 69，4379 )。將載體導 入宿主細胞，可以使用例如磷酸鈣沉澱法、電穿孔法等。 f) 除了大腸桿菌以外，也可以使用下列作為用以製造本 發明抗體之載體：哺乳動物來源的表現載體（例如，pcDNA3 (Invitr〇gen 公司製）或、pEF-BOS (Nucleic Acids.

Res. 1 990’ 18(17)，p5322)、PEF、pCM8)、昆蟲細胞來源 的表現載體（例如「Bac-to-BACbaculovairus expression system」（BIBC0BRL 製）、pBacPAK8)、植物來源的表 現載體（例如pMHl、PMH2 )、動物病毒來源表現載體（例 如、PHSV、PMV、pAdexLcw )、反轉錄病毒來源的表現載體 (例如、PZIPneo)、酵母來源的表現載體（例如、「^以“

Expression Kit」（lnvitr〇gen 公司製）、pNVU、sp_Q〇i )、 y 栝草菌來源的表現载體（例如、PPL608、pKTH50)。 以在CH0細胞、C0S細胞、NIH3T3細胞等的動物細胞 中的表現為目的時’為了使表現質體的載體在細胞内表現 必須具有類似如下列啟動子：難啟動子（Mulllgan等， （1 979) 277，108)、MMLV-LTR 啟動子、EFlfl：啟 動子（M1Zushlma i ―心 Acids (19叫18, Z)、⑽啟動子等，若具有可以篩選出轉型細胞的基 、/列如·可藉由藥劑（新黴素（neomycin)、G418等） 而判定之藥劑而f净其s 土因）更佺。例如，具有此種特性之載 40 201041595 / 體為：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。 再者，以穩定地表現基因以及細胞内基因的複製量的 增幅為目的時，可以使用在核酸合成路徑有缺失的CH0細 胞中導入具有與此互補之DHFR基因的載體（例如， pSV2-dhfr (「 Molecular Cloning 2nd edition」Cold

Spring Harbor Laboratory Press, (1989))等），藉由 Methotrexate ( MTX )使其增幅的方法。再者，以基因的暫 〇 B寺性表現(transient expression )為目的時，可以使用 染色體上具有表現SV40T抗原的基因之C0S細胞，以具有 SV40複製起點的載體（pcD等）進行轉型的方法。另外， 可以使用 Polyomavirus ' adenovirus ' bovine papi 1 lomavirus ( BPV )等來源的作為複製起點。再者，為 了在宿主細胞株中基因複數量的增幅，表現載體可以包含 下列作為篩選標記：ΑΡΗ基因、TK基因、Ecogpt基因、 ❹ dhfr基因等。

如此得到的本發明之抗體，可以從宿主細胞内或細胞 外（培養基等）分離出來’純化為實質上單純均勻的抗原 結合分子。抗體的分離、純化，使用通常的抗體純化所使 用之分離、純化方法即可，並無任何限定。例如，可以選 擇或組合下列方法，以將抗體分離及純化：層析柱、過滤 法、超滤法（ultrafiltration)、鹽析、溶劑沈澱、溶劑 抽出、蒸餾、免疫沈澱、SDS-聚丙醯醯胺膠電泳（SDS pAGE (polyacrylamide gel electrophoresis))、等電點電、永、 41 201041595 透析、再結晶等。 層析法例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性 層析法、膠過it、逆相層析法、吸附層析法等 for Protem PurHicat^n and Character:zatxon · A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory Press，1 996)。此種層 析法可使用液相層析法，例如航、舰等液相層析法3。 親和性層析法所使用的柱，例如蛋白A柱、蛋白q。例 如使用蛋白A柱，例如Hyper D，p_s，獅㈣“ ff ( ^

Healthcare Bi〇sciences)等。本發明亦包含使用這些純 化方法而高度純化的抗體。 得到的抗體對AXL的結合活性的測定，係可以由本領 域業者公知的方法進行。例如，可以採用Biac〇re、酵素 結合免疫吸附分析（ELISA)、酵素免疫測定法（eia)、放 射免疫分析⑻A)或者螢光抗體法，以作為測定抗體的抗原 結合活性的方法。例如，使用酵素結合免疫吸附分析時， 在披覆了抗原的盤中，加入含有抗體的試料，例如，抗體 產生細胞的培養上清液或純化抗體。再加入用鹼性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase)等的酵素標記的二次抗體，將免 疫盤靜置並洗淨後，加入磷酸酶 (P-nitrophenylphosphatase )等的酵素基質並測定吸光 度’並能夠據以評估抗原結合活性。 AXL表現量抑制劑 本發明更提供包含抗AXL抗體的AXL表現量抑制劑。 42 201041595 AXL表現量抑制劑係為使得表現AU的細胞内的AXL表現 虿減少之物。表現AXL的細胞並未特別限定，其可以為癌 細胞（Calu-1、MDA-MB-231、DU-145 等）。 AXL表現$之減少可以為，藉由AXL的分解等而使得 已存在的AXL之量減少’也可以藉由抑制ML的表現而使 得新表現的AXL的量減少。 含有本發明的抗AXL抗體的axl表現量抑制劑，也可 〇以表現為使用抗AXL抗體而使得AU表現量降低的方法。 再者，含有本發明的抗AXL抗體的AXL表現量抑制劑，也 可以表現為為了製造AXL表現量抑制劑的抗AXL抗體的使 用。 而 本發明的抗AXL抗體， 達到血管新生阻礙效果、腫 醫樂組成物 可望藉由降低AXL表現量， 瘤増殖抑制效果等的效果。 〇 本發明的細胞增殖抑制劑或AXL表現量抑制劑的投藥 t法可以為口服或非口服。尤其以非口服的投藥方法為 L，上述投藥方法之具體例為，注射投予、經鼻投予、經 肺投予、經皮投予等。注射投予之例為：藉由靜脈内注射、 =内注射、或皮下注射等來進行本發明之醫藥組成物的 王身性或局部性投予。可根據患者年齡、症狀選擇適當投 :的方法。投予量可選擇例如每次每1kg體重： ·〇〇〇¥__的範圍的投予量。或者例如投予人患者 可選擇每位患者投^ UGHG_GlDg/個體之投予量。 …、而’本發明之醫藥組成物不限於上述之投予量。 43 201041595 本發明的細胞增殖抑制南丨七Λ ν τ * 4或AXL表現篁抑制劑可以依 據一般方法將其製劑彳 辰 4 化（例如，Remingt〇n，s

Pharmaceutical Science ,

Clence， latest edition, Mark

Publishing Company, Easton tt c * λ ^ dSt〇n，U S A)。可包含醫藥容許 載劑或添加劑。例如可包含界面活性劑、賦形劑、著色料、 香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張劑、結合 劑、崩壞劑、潤滑劑、流動促進劑、料㈣，但並不以 此為限’也可以使用其他適合的載劑。具體言<，例如輕 質無水石夕酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇 '殿粉、羧甲基 纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、㈣基曱基 纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酯、聚乙烯吡咯酮、明 膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻油6〇、白糖、 緩曱基纖維素、玉米殺粉、無機鹽類等。 本說明書中引用的所有先前技術參照併入本說明書 中。 [實施例] 下文更具體說明本發明實施例，但本發明並不限定於 這些實施例。 [參考例1 ] Ax225抗體的取得方法 1-1 ·抗原的製備 將人類AXL細胞外區域及小鼠igG2a的Fc區域與倉鼠 卵巣細胞（CHO(dhfr-)細胞）融合之融合蛋白質（Fusi〇n protein) (hAXL_ECD-mIgG2aFc)表現載體進行基因導入， 藉由G418筛選法’選殖出hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質産生 44 201041595 * CH0細胞株。將使用無血清培養基（CHO-S-SFM II, GIBCO) 回収之hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白産生CH0細胞株的培養上 清液注入以結合緩衝液（20mM磷酸緩衝液，ρΗ7·0)平衡

之後的蛋白質G管柱（HiTrap Protein G HP, GE

Healthcare)。以結合緩衝液洗去非結合蛋白之後，再使 用溶出緩衝液（100 mM Glycine-HC1， pH2. 7 )，將 hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質分層分別回收到分注中和緩衝 液（1肘1']^3-11(：1，？119.0)的試管中，使用分層分子量1〇1^1) ❹ 的超濾過套組（Centricon (登録商標），Millipore)， 將純化蛋白質的緩衝液置換為麟酸緩衝生理食鹽水 (pH7. 35-7· 65’ takarabio )、濃縮純化蛋白質。使用依 據 C.N. Pace et al·， Prof. Sci. 4:241卜2423， （1995) 的計算式算出莫耳吸光係数’從2 8 0 nm的吸光度算出純化 蛋白質的濃度。 1-2 .以受託號碼FERM BP-10854寄存之抗AXL抗體産 Q 生融合瘤（hybridoma)之製備 依下述方法’使用前項製造之抗原，使4隻BALB/c小 鼠（雄、免疫開始時6週齢、日本Charles River)及2 隻MRL/lpr小鼠（雄、免疫開始時6週齢、日本Charles

River) (hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質）進行免疫。初次免 疫，將以 FCA (佐劑（comple1:e Freund，s Adjuvant)H37 Ra (Difco laboratories))乳化之抗原以4〇#g/隻的量皮 下投予。2週間後，以FIA (佐劑（Inc〇mplete化抑以，s Adjuvant) (Dlfcolab〇rat〇ries))乳化之抗原以 4〇#g/ 45 201041595 隻的量皮下投予。以後α i週的間隔進行3次追加免疫。 以次項所示之酵素結合免疫吸附分析（Enzyine unked immunosorbent assay * ELISA)確認對抗原之血清抗體力 價上昇後’最終免疫為靜脈内投予的稀釋於鱗酸 緩衝生理食鹽纟（不含有齊離子、鎮離子之 buffered Saline (PBW — ))，日水製薬）的抗原。最後免 疫的3日後，使用PEG1500(R〇che 常法使

小鼠脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞p3X63Ag8u·丨（稱為ρ3υι， ATCC CRL-1 597)細胞融合。將融合細胞培養於含有l〇%FBS 的 RPMI 1 640 培養基（invitrogen)(以下稱為 1〇%FBS/RpMI 1 640)。融合的次曰，將融合細胞懸浮於半流動的培養基， 進行融合瘤的篩選培養及實施融合瘤的群落化（c〇1〇ny)。 融合後第9日或第10日，採取融合瘤的群落，以每孔1群 落播種於添加HAT篩選培養基（10%的FBS/RpMU64〇,2v〇1% 的HAT 50x濃度（大日本製藥），5v〇1%的βΜ —c〇ndimed

Hl(Roche Diagnostics))的96孔盤。培養3〜4天後，回收 各孔的培養上清液，藉由次項所示之ELISA，測定上述抗 原、及和小鼠IgG2a的Fc區域融合的對照蛋白的結合活 性’藉此篩選出具有與人類AXL細胞外區域結合活性的融 合瘤。 篩選出的融合瘤上清液的結合活性如表3所示。 【表3】 AXL 2ndSC Abs 2ndSC Abs 2ndSC Abs 2ndSC Abs IgG 殖株號碼 AXL-mFc FGFR2~mFc Abs △ AXL-His Bingding 225 0.629 0.055 0.574 0. 642 0.859 46 201041595 由本發明人篩選出的融合瘤，已寄存於日本獨立行政 法人產業技術總合研究所特許生物寄存中心。以下記載界 定寄存的内容。 (a)寄存機關的名稱.地址 名稱’獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄 存中心 地址：曰本茨城県〇〈比市東i 丁目i番i中央第6 (郵便番号305-8566 ) (b) 受託曰（寄存曰）：2〇〇7年7月5曰 (c) 受託號碼： AXL No. 225 #070402 Ux225)(受託 # 号 FERM BP-10854) 1 - 3 ·對人類AXL的結合活性 將以塗布緩衝液（Coating Buffer) (1〇〇 mM碳酸氫 鈉（sodiumbicarbonate)，ρΗ9·6, 〇.〇2%疊氮化鈉（s〇dium

azide))稀釋為 l"g/mL 的抗原（hAXL_ECDiIgG2aFc 蛋 白質）’或者和小鼠IgG2a的Fc區域融合的對照蛋白，以 80"L/孔（well)的量分別注入 96_孔盤（Nunc_immun〇TM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM ( Nalge Nunc International)) ’於4°C中靜置一晚以上。以含有〇 〇5 vol%①Tween (登録商標）20的磷酸緩衝生理食鹽水 (tPBS(-))洗淨3次後，於稀釋緩衝液（ (BlockingOne，nacalai)的 1/5 稀釋液）中，將該盤於 4〇c 中靜置-晚以上。除去緩衝液後，將以稀釋緩衝液稀釋後 47 201041595 的小鼠抗血清或融合瘤的培養上清液以8〇 μ L/孔的量注入 該盤中，於室溫中靜置1小時。將該盤於tPBS(-)中洗淨3 測後’將以稀釋緩衝液稀釋為1 /5000的HRP標識抗小鼠 IgG抗体（Stressgen)以80 # L/孔的量注入，於室溫中靜 置1小時。將該盤以t P B S (-)洗淨5次後，將呈色基質（過 氧化酶基貝（Peroxidase Substrate) (Kirkegaad& Perry Laboratories)以80/zL/孔的量注入，於室温中靜置20 为鐘。以80/zL/孔的量注入停止過氧化酶液（per〇xjdase

Stop Solution) (KirkegaadS Perry Laboratories)後， 以 Microplate Reader Model 3550( Bio-Rad Laboratories) 測定於405 nm中的吸光度。 1 -4 .從融合瘤培養上清液純化抗體 將上述得到的融合瘤，於使用i〇w IgG FBS (Invitrogen)作為FBS的HAT篩選培養基中培養。在該 培養上清液20 - 50 mL中，以每10 mL培養上清液加入 50//L的量，加入溶劑置換為清洗緩衝液（Wash Buffer) (20 ιηΜ醋酸鈉緩衝液、pH5_ 0)的蛋白質G ( Pr〇tein g) 珠（Pharmacia)，於4°C中倒轉混合一夜。回收蛋白質g 珠後，以清洗緩衝液（Wash Buffer)洗淨後，在溶出緩衝 液（50 mM醋酸鈉緩衝液、pH3. 3)中將抗體溶出，並立刻 以中和緩衝液（Tris-HCl缓衝液、邱7.8)將之甲和。純化 抗體係使用分層分子量l〇kDa超濾套組（Amic〇n (登録商 &)，Mi 11 ipore )，進行置換為碌酸緩衝生理食鹽水 (pH7.35-7.65，日水製薬）的緩衝液置換及濃縮，並於、 48 201041595 0.22#m 的滅菌過濾（Millip〇re Gv Minip〇re)將其滅 菌。 〔参考例2〕對人類AXL-FNDl、人類AxL-igD2的結合 活性 2-1 .對人類AXL-FND1、人類AXL-IgD2的結合活性 測試對抗AXL單株抗體的AXL —纖維結合素種類3區域 1 (AXL-Fibronectin type 3 domain 1 ， AXL-FNDl) > AXL 免疫球蛋白族區域 2 ( AXL I_unQgi〇bulin family d〇main 2 ’ AXL-IgD2)的結合能力。 2-2.人類重組AXL_FND1、人類重組之AXLigD2的表 現載體之製備 人類重組AXL-FNDl係為，利用PCR，將全長人類Αη cDNA(〇’Bryan 等，Mol. Cell. Bi〇1. 1991; ιι: 5〇i65〇3i) (GenBank#NM_021913 )中相當於第225個到第331個胺基 酸的區域增幅，為了表現和GST_tag的融合蛋白質，於

PET-41a( + )(Novagen)中選殖，建構 pn一Au—FN])i。其 他的區域，利用PCR，將相當於帛137個到第224個的胺 基酸的區域AXL-IgD2增幅，為了表現和Γςτ π』衣現和GST-tag的融合蛋 白質，在pET-41a( + )中選殖。 (東洋紡，Cat# 將製造出來的各載體（5/zL)於dh5q： DNA-903 )中以熱處理（heat sh〇ck)法進行轉型於胤 培養基培養後，在含有康黴素（kanamycin)的lb盤上以 3 7度下終夜培養後，篩選出殖株。 2-3 ·人類重組AXL-FNDl、人類重組 AXL-IgD2的純化 49 201041595 製仏出的各群洛(C〇1〇ny)、在含有康黴素(kanamycin) 的20 mL之LB培養基中於37度中進行一整夜的前培養， 再移到500 mL的i立表a由 ^ ^ 。養基中’培養直到A600 = 0.5±0.05為 止並加入IPTG使其漠度為〇· 5 _。於37度中培養丄小 時後收集痛體’懸浮於绣種f、'虑V L f K 硬衡液 A( Buffer A)( 50 mM Tris-HCl: pH8.0’ 1 mM EDTA，0.5 mM PMSF，1 福 DTT)中後，使用 液態氮反覆進行2次凍結融解。加入Np_4〇使其濃度達 0.5%，以超音波破碎機破碎（3〇秒χ5)後，以244,〇〇〇xG 離心30分後’回収上清液。 使用得到的上清液，以如下之方法純化人類重組 AXL-FND1 。將可溶化的大腸菌上清液和 Glutathione-Sepharose ™ 4B Fast Flow ( GE healthcare) 混合’於4度中以攪拌子攪拌i小時。以5〇〇xG離心5分 以分離之，丟棄上清液並加入缓衝液A ( Buffer A)以清 洗Glutathione-Sepharose TM 4B。重複進行此洗淨操作3 次。人類重組 AXL-FND1 係從洗淨後的 Glutathione-SepharoseTM 4 Fast Flow 移到微管柱，再用 50 mM Tris-HCl，pH7. 5，25 mM 麩胺硫（Glutathione) 將之從 Glutathione-SepharoseTM 4 Fast Flow 分離並溶 出。其他的AXL的各區域亦使用同様的方法表現·分離· 溶出。 2-4 .以西方點潰法（Western Blot)評估抗AXL抗体對 A X L - F N D1的結合活性 利用 BIO-RAD Dc Protein Assay ，對於從^ 50 201041595

Glutathione-SepharoseTM 4 Fast Flow 分離•溶出的人類 重組 AXL-FND1 、 AXL-IgDl 、 AXL-IgD2 、 AXL-FND2 、 AXL-IgDl + IgD2、AXL-IgD2 + FNDl、AXL-FND1+FND2 進行蛋 白質定量’將l//g樣本與NuPAGE(登録商標）樣本緩衝液 (Sample buffer) ( Invitrogen)混合，以 NuPAGE(登録 商標）10% Bis-Tris Gel進行電泳。電泳後的膠體（Gel) 轉印到 ImmobilonTM-FL (Mill ipore) PVDF 膜上。含有轉 Q 印後蛋白質的PVDF膜，以Odyssey(登録商標）塗蓋緩衝液 (Blocking Buffer) ( LI-C0R)進行塗蓋（blocking)後， 將其浸於稀釋為抗AXL抗體濃度為5//g/mL的一次抗體溶 液中’於4度中靜置一整晚。浸於一次抗體溶液中包含轉 印蛋白質的PVDF膜，以包含0. 1% TBS-T [0. 1% TweenlO 的 TBS (Tris-buffered Saline, TaKaRa)]清洗 4 次，每 次5分鐘。浸於抗AXL抗體中的PVDF膜，再浸於稀釋為 ng/mL 的 Alexa Fluor(登録商標）680 goat anti-mouse 〇 丨邱（H + L ) ( Invitrogen )二次抗體溶液，在室温下靜置 1小時。以〇. 1% TBS-T，將浸於二次抗體溶液中的pvj)F膜 清洗3次，每次5分鐘’再以含有〇. 〇1% SDS的TBS-T清 洗5分鐘後，再以TBS清洗5分鐘。洗淨後的pvdf膜以遠 紅外線影像系統Odyssey (登録商標）掃瞄以評估其結合性。 2-5 .結果 評估結果記載於第1圖中。 可以清楚看到以受託號碼FERM BP-1 0854寄存之融合 瘤而產生的抗AXL抗體（Ax225)能夠辨識AXL的FND1(第1 51 201041595 圖）。受託號碼FERM BP-10857寄存之融合瘤産生的抗axl 抗體（Ax284)則可辨識ML的FND1及igD2 (第1圖）。 以受託號碼FERM BP-1 0850寄存之融合瘤所產生的抗axl 抗體（Ax7)，以及以受託號碼FERMBP-10851寄存的融合瘤 所産生的抗AXL抗體（Ax51)，則辨識AXL的IgD2 (第1 圖）。 〔参考例3〕由Ax225抗體造成之AXL帶白質分解誘 導測試 測試抗AXL單株抗體誘導癌細胞内axl的分解能力。 將人類非小細胞肺癌細胞株Ca 1 u-1以4 X 1 〇5細胞/孔的 密度播入6-孔盤中，在24小時後換到未加血清（serum starved)的培養基中，並培養一晚。繼之，加入上述製造 出的抗AXL單株抗體使其濃度為2#g/mL，另一方面加入 200 ng/mL的重组體GAS6 (R&D)作為正對照組，在37它 中靜置24小時。繼之，以PBS(_)清洗細胞，使用上記細 胞溶解緩衝液將蛋白質從細胞抽出。將以市售的抗axl抗 體（SantaCruf )進行免疫沈澱之細胞溶解産物以 NUPAGE(InVitrogen)分離之，以上記之西方點潰法及酪 胺酸磷酸化測試法進行免疫點潰。 將25#g的各蛋白質溶液懸浮於NuPAGE-LDS樣本緩衝 液（Invitrogen)中，以 7〇t 加熱 10 分’使用 7%NuPage (InvHrogen)及150 V電泳i小時。電泳後的膠體以 NuPAGE-轉移緩衝液（Invitr〇gen)及含有2〇 ν〇ι%曱醇之 該緩衝液中以電流30 mA/1小時轉移到〇45^的漁織 52 201041595

PVDF 膜（Immobilon-FL，Millip0re)上。將濾紙以 TBS (50mMTris-HCl，pH7.6，150mMNaCl)洗淨，使用 ODYSSEY 塗蓋緩衝液（Li-COR )靜置一晚以進行塗蓋（blocking)。 將濾紙以TBST清洗’每次5分間，洗4次，以抗AXL抗體 (在TBST中以1:15,000稀釋、SantaCruz)和抗肌動蛋白 抗體（在TBST中以1:5,000稀釋）在室温中靜置2小時。 將濾紙在TBST中洗淨，每次5分，洗4次，以在TBST中 以1 :10, 000稀釋的Alexa680標記抗兔子第二抗體 〇 (Invitrogen)及、在 TBST 中以 1:10, 〇〇〇 稀釋之 iRDye800 標έ己抗山羊弟一抗體（Rockland)，靜置（incubate) 1 小時。以TBST清洗，每次5分，洗3次，再以TBS洗5分， 洗1次之後，以紅外線影像系統ODYSSEY ( Li-COR)掃瞄 濾紙。 可以觀察到，在經過Ax225抗體處理後的AXL的點潰 有減弱的現象（第2圖）。亦即，這些Αχ 225抗體能夠誘 Q 導AXL蛋白質的分解。 〔参考例4〕抗AXL抗體對於人類胰腺癌異種移植小 鼠模型的抗腫瘤効果的測定 1 .人類胰腺癌異種移植小鼠模型之製備 由大日本製藥公司（現為大日本住友製藥公司）取得 之人類胰腺癌細胞株PANC-1，在HBSS中調製為5χ107個 /mL。將上記細胞懸浮液2 0 0 /z L ( 1X1 07個/小鼠）接種於 由日本 Charles River 公司 購入之 CAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu ( BALB-nu/nu )小鼠 53 201041595 的鼠溪部皮下。賭、成々士 腫瘤谷積（體積）的平均値約為21〇 mm3 時’將小鼠用於該實驗。 2 .抗體調製及投予

Ax225抗體以PBS調製為2 mg/mL，一週2次、於2週 内以20 mg/k§的量投予人類胰腺癌異種移植小鼠的腹腔 内。負對照組則以同樣方式投予PBS。正對照組，則將

Gemzar (曰太 Ρι; τ ·,, + m Lilly公司）以生理食鹽水調製為12 瓜 S / ID L、一 週 2 :女、9、田 γ5π λ 2週内、以120 mg/kg的量投予腹腔内。 3 ·抗腫瘤効果的評估 =人類胰腺癌異種移植小鼠模型中的抗腫瘤効果，係於 最、’、杈予後4天時，由相對於負對照組的腫瘤增殖量之比 較來算出腫瘤增殖抑制効果（第3圖）。 腫瘤增殖抑制効果（％) = ( i —抗體処理群之腫瘤 増殖量/對照組的腫瘤增殖量）χ1 〇〇 4 ·統計處理 腫瘤容積（體積）係以平均値±標準偏差來表示。統計

解析係為使用SAS前臨床package Version 5· 0，依據LSD 去之對照組和實驗組之比較。另外，具有95%之信賴度 (* ; P < 0. 05)視為有意義。 5 ·結果

Ax225抗體抑制腫瘤增殖，具有抗腫瘤効果（第3圖）。 〔参考例5〕抗AXL抗體之對人類胰腺癌異種移植小 鼠模型的抗腫瘤効果之測定（2 ) 54 201041595 ι .人類胰腺癌異種移植小鼠模型之製備 由大日本1藥公司（現為大日本住友製藥公司）取得 之人類胰腺癌細胞株PANC-1，在HBSS中調製為5χ1〇7個 /mL。將上記細胞懸浮液200 /zL (1x1 〇7個/小鼠）置入由 日 本 Charles River 公司 講入之 CAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu ( BALB —nu/nu )小鼠 Ο Ο 的鼠蹊部皮下。腫瘤容積（體積）的平均値約為27〇随3 時’將小鼠用於該實驗。 2 ·抗體調製及投予 將Ax225抗體及和Ax225抗体同様方法取得之抗原決 定位和AX225抗體相異的抗饥抗體卩⑽調製為^ :g/mL ’ 一週2次、於2週内、以2〇的量投予人類 予2異種移植小鼠的腹腔内。負對照組則以同樣方式投 BS。正對照組，則將―咖（日本⑴u…公 以生理食鹽水調製為12_、一週2次、2週内、以 mg/kg的量投予腹腔内。 3 .抗腫瘤効果的評估 人類胰腺癌異種移植小鼠模型 最、終投予換Λ妥歧 、主中的抗腫瘤効果，係於 于後4天時’由相對於負對昭 較H φ « 、卞…、組的腫瘤增殖量之tb 果算出腫瘤增殖抑制効果。 比 腫瘤增殖抑制効果（％) = f 增殖量/對昭έ 抗體処理群之腫瘤 對…組的腫瘤增殖量）χΐ 〇〇 4 .結果 腫瘤增殖抑制効果如第i 禾如弟1圖所不。腫瘤增殖抑制効果 55 201041595 (%)低於3n的情況表示為"―，，、3〇%以上表示為 6 0 %以上表示為"+ +，，。 由此、果，和FND-1結合的抗體，即使在腫瘤容積（體 積）的平均値約A 270随3時才開始投予，亦表現了 6〇% 以上的TGI活性。和FNH結合的抗AXL抗體，在活體（ιη vi vo) 中具有如此顯著的抗腫瘤効果，係為本研究中新發 現之意料外的現象。 〔實施例1〕嵌合（chimera)抗體之製備 嵌合抗體表現載體之製備 為了製作將人類IgGl固定區域和Αχ225抗體可變區融 合的嵌合Ax225抗體，將載有人類_固定區域的cMa (Η鏈.人類rl、L鏈.人類的5’端和載有Αχ225抗 體的可變區之cDNA的3端融合而成之合成募謝分別附 於Η鏈L鍵，分別设計出轉譯股（咖的）及反義股 (anti sense) 2種。以下，分別稱為H鏈轉譯融合引子 (A)、H鏈反義融合引子（B)、L鏈轉譯融合引子（c)、匕 鏈反義融合引子（D)。將各合成寡DNA混和，藉由聚合pcR 製造出載有嵌合Ax225抗體的基因。藉由聚合pCR，將下 列4者組合，並依據後述條件以pcR法實施：表現嵌合抗 體的第1 h奴為在Ax225 cDNA的Η鏈5,端上附加限制酶 位置及Kozak序列轉譯鏈（Ε)及上述（Β)、Αχ225⑼“的Η 鏈3’端的區域上附加制限制酶位置的反義鏈（f)及上述 (A)、Ax225 cDNA的L鏈5’端的區域附加限制酶位置及 Kozak序列的轉譯鏈（G)及上述（D)，Αχ225 cDna的1鏈3, 201041595 r 端的區域中附加限制酶位置的反義鏈（J{)及上述（C)。將添 加的 PCR 緩衝液、dNTPs、PrimeSTAR、Ax225 Η 鏈、或者 載有L鏈的cDNA及1合成募DNA構成之反應混合物，執行 30次的PCR反應循環’該PCR反應循環為：於98°C中加熱 1分鐘後，於98°C中加熱10秒，55°C中加熱10秒，72°C 中加熱1分鐘。第2次的PCR係以第1次PCR反應中被增 幅的基因片段為鑄模，其中Η鏈的是（E)(B)及（F)(A)之組 合所增幅的片段的混合物，L鏈的是（G)(D)及（H)(C)之组 〇 合所增幅的片段的混合物。所使用的引子為，Η鏈的是（E) 及（F)、L鏈的是（G)及（Η)。執行30次如後所述之PCR反 應：在9 8 °C中加熱1分鐘後、在9 8 °C中加熱10秒、在5 5 °C中加熱10秒、在72°C中加熱1分30秒。 使用動物細胞表現載體選殖得到的增幅片段。各DNA 片段的驗基序列之決定’係使用B i gDye終止子循環定序套 組（BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ， Applied ◎ Biosystems)，於 DNA 定序器 ABI PRISM 3730xL DNA 定 序器或 ABI PRISM 3700 DNA 定序器（Applied Biosystems) 中，依據所附説明書記載的方法而決定。 嵌合抗體的表現、純化 將來自人胎兒腎癌細胞的的FreeStyleTM 293-F細胞 (Invitrogen )懸浮於 FreeStyleTM 293 Expression Medium ( Invitrogen)中，以1x106個/mL的細胞密度對 125 1111^1331^((：01^1那）每盤播下3〇11^。調製好的質體0龍 混合液（總計30 " g)中加入lmL的Opt i-MEM I Reduced 57 201041595

Serum Medium(Invitrogen) ° 另外 ，在

293fectin(Invitrogen) 60 //L 中加入 〇pti_MEM I

Reduced Serum Medium(Invitrogen)使其成為 i mL，再和 質體D N A混合液混合。將混合液於室温静置2 〇分鐘，加入 細胞懸浮液。在C〇2培養箱（37。(：、8% C〇2)内中培養3〜6 日。回收培養上清液後，離心（約2 0 0 〇 g，5分鐘，室溫）去 除細胞’再通入〇.22以m濾器MILLEX (登録商標）-GV (Mi 11 ipore)。各樣本直到使用時保存在rc。使用蛋白 A Sepharose ( GE Healthcare)從此上清液中純化抗體。 以ND-1 000分光光譜儀（NanoDrop)測定280nm吸光度，依 Pace 等人的方法（pr〇tein Science ( 1 995) 4:241 1-2423) 計算濃度。 〔實施例2〕 Αχ2 2 5抗體的人型化 由 Biacore ic 測定親和性（Affinity) 為了進行人型化Ax225抗體的篩選，使用Biacore依 據下述的方法進行對AXL-FND1的結合活性評估。 2-1 .人類重組AXL-FND1的表現載體之調製 人類重組AXL-FND1係為’利用PCR，將全長人類axl cDNA( O’Bryan 等，Mol. Cell. Biol· 1991; 1 1: 501 6-5031 ) (GenBank#NM_021913 )中相當於第225個到第331個胺基 酸的區域增幅，為了表現和GST —tag的融合蛋白質，於 pET-41b ( + ) ( Novagen)中選殖，建構 PET-AXL-FND1。 將製作出的各載體（5#L)於 BL21-CodonPlus(DE3)RIPL ( Strategene ? Cat# 230280) 58 201041595 ’於S0C培養基培 中以熱處理（heat shock)法進行轉型 養後’在含有康黴素（kanamycin)的LB盤上以37度終夜 培養後’筛選出殖株。 2-2 ·人類重組AXL-FND1的純化 製造出的各群落（colony)、在含有康黴素（hnaMcin) 的 3 mL 之 MagicMedia (Invitrogen)培養基中，於 37 度 Ο 中進行3小時的前培養’移到5 0 〇 mL培養基中，於2 5产 中培養一夜（overnight)收集菌體，懸浮於緩衝液a ( 2〇 mM Tris-HCl(pH8)，10 mM EDTA’30 mM NaCl，蛋白酶抑制 劑混合物（Protease inhibitor mixture) (c〇mplete Mini， EDTA-free(Roche))後，加入Lysozyme溶液使其終濃度為 2 mg/mL，在冰上靜置1小時後、加入氣化鈉使其為終濃度 0.5%Triton-X100及終濃度1〇〇 mM，在冰上靜置1〇分鐘 超音波破碎機破碎（30秒x5)後，以244,000 X G離心 20分’並回收上清液。 Q 使用得到的上清液，以如下之方法純化人類重組

AXL-FND1。將 Glutathione-Sepharose TM 4B Fast Flow ( GE healthcare)以PBS洗淨後，與可溶化的大腸菌上清液混 合，於 4C 中使其結合一整晚。回收 Glutathione-Sepharose TM 4B Fast Flow，以 30 mL 之洗 淨緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH8)，500 mM NaCl， 1% Triton-XlOO, protease inhibitor mixture)洗浄，重複 洗淨操作 4 次。將 Glutathione-SepharoseTM4BFastFlow 移到管柱，再用5 mL的洗淨緩衝液進行洗淨操作。使用5 59 201041595 此的溶出緩衝液（100 mM Tris —Hcl(pH8)，2〇 _麩胺硫 (Glutathione)，120 mM NaC1)進行溶出操作，反覆進行 此操作3次，取得人類重組AXL_FND1 ，從

Glutathione-Sepharose Til 4B Fast Flow 分離·溶出。 2-3 .使用蛋白a以Biacore進行親合性解析 使用Biacore T100 (BIAC0RE)，進行人型化抗體 的抗原抗體反應速度的解析。將rec_pr〇tein A (Zymed) (以下、蛋白A)固定在感應晶片上，在其上使各種抗體結 合，將抗原作為檢出對象分子流過其上，以測定抗體和抗 原的相互作用。使用調整為各種濃度的人型重組Ml —fndI (在2-2中調製。以下、GST_FND1)為抗為。從測定取得 感應圖，算出動態參數之結合速度係數ka(1 /Ms )，以及解 離速度係數kd(l/s)’並以此値為基礎，算出kd(m)。各參 數的計算，係使用 Biacore Tl〇〇 Evaluation Software(BIACORE) ° 感應晶片之製作’係藉由胺偶合（amine C〇Upl ing) 法，將蛋白A約3000 RU固定在CM5 (BIACORE)上。使用 製成的感應晶片’進行結合於蛋白A之抗體」和GST-FND1 的相互作用之速度解析。電泳緩衝液（runn ing buffer)中 使用HBS-EP+ ’其流速為30 # L/m i η。將各抗體在電泳緩衝 液中調製為1/zg/mL’使其和蛋白Α結合2分鐘。使用作 為分析物的GST-FND1係用HBS-EP+調製為0. 5、 2. 0 // g/mL。測定首先係將作為目標的各種人型化AXL抗體 或嵌合AXL抗體或小鼠AXL抗體和蛋白A結合、並將分析 60 201041595 物溶液與其相互作用 2分鐘，之後切換為 UBS-EP+(BIAC0RE)2分鐘，測定解離相。解離相的測定結 束後’以 30//L 的 10 mM 甘胺酸（glycine)-HCl(pH2.0)洗 淨，使感應晶片再生。將此結合•解離•再生作為分析i 循環（cycle)。實驗均在25°C中進行。 各框架（f ramework)序列的選定 為了執行Ax225抗體的人型化，比較Ax225抗體的可 ❹ 變區序列和人生殖細胞（germ 1 ine)序列。其中，作為人型 化的模版之FR序列如表4所示。人型化之可變區，其η鏈 係以表4中記载的FR1、FR2、FR3(2)、FR4所構成之序列 為H0 (序列識別號：2)。另外，[鏈係以fri、FR2、FR3、 FR4構成之序列為L〇 (序列識別號：65 )。再者，CDR、FR 之決定係依據Kabat編號而進行。 再者’有報告指出，Η鏈FR3的序列中，Kabat編號第 94唬的殘基對於CDR3的立體構造有重大影響（M〇rea等， 〇 J- Mol. Biol. 1 998； 275:269-294 )。Ax225 的該殘基 為甘胺酸（G)(序列識別號：57)，但在進行人型化時選 擇之生殖細胞（germline)序列如表4的FR3(l)(序列識別 號：109)所示’該殘基為精胺酸⑴，因此，透過人型 化置換為精胺酸，可預期其活性降低。所以，Η鏈第94號 處’讓Αχ225的序列務左, . 幻殘存，使用為甘胺酸的FR3(2)序列（序 列識別號：58)。 61 201041595 【表4】 H0 種系 序列 FR1 種系：hVH_2_26 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS (序列識別號51) FR2 種系：hVH_l_24 WVRQAPGKGLEWMG (序列識別號53) FR3C1) 種系：hVH_2_26 RLTISKDTSKSQVVLTMT画DPVDTATYYCAR (序列識別號109) FR3(2) 種系：hVH 2 26 (但第Μ掄4換為G) RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAG (序列識別號巧） FR4 種系：hJHl WGQGTLVTVSS (序列識別號61) L0 種系 FR1 種系：hVK_2_30 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (序列識別號93) FR2 種系：hVK_lD_8 WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號96) FR3 種系：hVK_2_40 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (序列識別號101) FR4 種系：hJK2 FGQGTKLEIK (序列識別號103) 人型化Ax225可變區HO及L0的製作 為了製作將Ax225抗體的CDR區移植到人型化模版序 列的FR區之人型化Ax225抗體的可變區，分別設計合成的 寡DNA之Η鏈、L鏈。混合各合成的寡DNA，經過聚合PCR 製作載有人型化Αχ2 25的可變區之基因，Η鏈為H0、L鏈 為L0。聚合PCR使用KOD-Plus(TOYOBO)進行，根據以下條 件實施PCR法。由附帶的PCR緩衝液、dNTPs、MgS〇4、 KOD-P1 us及1 Opmo 1的合成寡DNA形成的反應混合物，在 94t加熱5分鐘之後、由94°C 2分鐘、55°C 2分鐘、68°C 2 分鐘構成的PCR反應循環，進行2次循環之後，在可變區 5’端增加限制酶位及Kozac序列的引子，及在3’端增加 62 201041595 限制酶位的引子，分別添加丨〇pm〇l，經由料。〇 秒、 C 30秒、68°C 1分鐘構成的PCR反應循環，進行35次循環， 獲得擴增片知_。所知的擴增片段於動物細胞表現載體選殖 (cloning) ’並和恆定區連結。 在此’IgG抗體的η鏈C端序列的異質性已知來自c 端胺基酸的離胺酸（lySine)殘基缺少及c端的2個胺基酸 甘胺酸（glycine)及離胺酸（lysine)缺少所造成的C端胺 0 基酸酿胺（amide)化（Anal Biochem, 2007 Jan 1 ; 360( 1 ) :75-83.)。用以減少此異質性的方法已知有，使 Η鍵C端的2個胺基酸，亦即eu編號第446號的甘胺酸及 第447號的離胺酸缺損的方法（專利文献4 ; W02009/041613)。在人型化Αχ225抗體中，也希望不要有 Η鍵C端的異質性，因此’使用使人IgG1的ElJ編號第446 號的甘胺酸及第447號的離胺酸缺損的IgG1序列（序列識 別號：106 )作為恆定區序列。另一方面，[鏈則使用天然 〇 型人K鏈（序列識別號：10 7 )作為恆定區序列。 活性維持所不可少的胺基酸殘基之發現 如上所述，存在於Ax225的Η鏈中的Kabat編號第94 號的甘胺酸’應該在和AXL的結合中扮演重要的角色。 因此’為了評估該殘基對於活性的影響，製作將嵌合 抗體的Η鏈（chH :序列識別號：1 )的Kabat編號第94號 的殘基置換為人生殖細胞的精胺酸之突變體（H6:序列識 別號：1 08 )。突變體的製作係使用pCR的聚合pcR來進行。 具體言之’執行依據包含突變部位的胺基酸序列所設計之 63 201041595 順向鏈及反向鏈的s DNA的合成。含有突變部位的順向鍵 的寡DNA與插入進行突變的基因之載體結合的反向鏈寡 DNA、含有突變部位的反向鏈的寡dna與插入進行突變的基 因之載體結合的順向鏈寡DNA，各自組合，使用

PnmeSTAR(TAKARA)進行PCR，製作含有突變部位的片段之 5端及3端兩個。此兩個片段經聚合PCR組合製作各突 變體。將製作的突變體插入可能在動物細胞中表現插入基 因的表現載體，得到的表現載體的鹼基序列以該技術領域 中公知方法確認。 〇 chH/LO ( Η鏈chH/序列識別號：1、l鏈L0/序列識別 號.6 5 )及H6/L0 ( Η鏈H6/序列識別號：1 〇 8、L鏈 L〇/序列識別號：6 5 )的發現及純化係如實施例1的方法 進订。再者，chH及Η6的Kabat編號第94號以外的序列 在這兩者中係為完全相同’所以可以僅評估該殘基的影響。

由Biacore所測定chH/LO及H6/L0的親合性評估的結 果如表5所示。可以確認，相較於chH/LO，H6/L0的親合 性大幅下降。由此可知，為了使Ax225抗體及人型化Ax225 抗體與AXL-FND1結合，Η鏈之Kabat編號第94號的殘基 為甘胺酸較佳，而不適宜為精胺酸。 【表5】 Η L KD(M) chH LO 1.59E-09 H6 LO 1.23E-08 親合性提高之Η鏈可變區H9的製作 H〇/LO的Η鏈之Η0 (序列識別號：2 )為，Kabat編號 64 201041595 第73號的胺基酸殘基為蘇胺酸（thre〇nine，τ)，不過， 基於立體結構模型而言，藉由將此殘基置換為Αχ225抗體 的序列之天門冬醯胺酸（aSparagine，ν)，應該可以提高其 親合性。 因此，將存在於H0 (序列識別號：2)的FR3的Kabat 編號第73號蘇胺酸（threonine，T)置換為天門冬醯胺酸 (asparagine，N) ’以製作H9 (序列識別號：3 )。突變體 ❹ 的製作係使用PCR的聚合PCR來進行。具體言之，首先執 行依據包含突變部位的胺基酸序列所設計之順向鏈及反向 鏈的养DNA的合成。含有突變部位的順向鏈的募dna與插 入進行突變的基因之載體結合的反向鏈寡DNA，含有突變 部位的反向鏈的募DNA與插入進行突變的基因之載體結合 的順向鏈寡DNA，各自組合，使用pr imeSTAR(TAKARA)進行 PCR ’製作含有突變部位的片段之5’端及3，端兩個。此 兩個片段經聚合PCR組合製作各突變體。將製作的突變體 〇 插入可能在動物細胞中表現插入基因的表現載體，得到的 表現載體的驗基序列以該技術領域中公知方法確認。抗體 的製作及純化如實施例1之方法進行。 H9/L0的親合性測定則依實施例2所記載的方法進 行’其結果如表6所示。可以確認’相較於H0/L0，H9/L0 親和力較高。 【表6】 65 201041595 _KD(M) H0/L0 444E-09"""" H9/L0 3.58E-Q9 〔実施例3〕使等電點改變之突變位置的確認 突變位置的確認 抑制抗體的血漿中半衰期的方法之一已知有，改變於 抗體分子表面露出的胺基酸殘基，以控制抗體分子表面電 荷的方法（專利文# 2及專利文献3)。具體言之，已知 可以藉由使抗體具有之等電，點（p 〇的値降低，而延長抗 體的血漿中半衰期。相反地，已知可以藉由提高抗體的等 電點，可以縮短血漿中半衰期，而提高抗體的組織移行性 (非專利文献2 8及2 9 )。 紅上所述，改變等電點的人型化Ax225抗體，藉由延 長血漿中半衰期或提高組織移行性，而可以有更強的抗腫 瘤活性。在此，確認出不影響人型化Αχ225抗體的對抗原 二〇活性、或其立體構造，而是藉由調節抗體分子表面的 電荷可以控制抗體的藥物動態的胺基酸殘基。具體言之， 子找對於H9/L0 ( η鏈Η9/序列識別號：3、l鏈L0/序列識 65 )的可變區，不大幅降低由Biac〇re測得的親合 吐’而可以改變等電點的突變位置。 使用人型化Ax225抗提的立體結構模型，篩選出不會 使知·對AXL的結合大幅降低，且可以改變可變區的等電點 的大變位置的結果’可以找出數個突變位置。纟Η鏈、l 鍵中’等電點降低之改變分別如表7及表8 (為了使η鏈 .201041595 的專電點降低的突變位置）、表9 (為了ί吏L鏈的等電，點 降低的突變位置）所示’ Η鍵吖鏈中使等電點上昇的改變 ^如表10及表11(為了使Η鏈料電點上昇的突_置）、 Μ及表12(為了使[鏈的等電點上昇的突變 變夕制 J ^ ^ I作、純化係如實施例i所記載的方法進行。 栽的方法進：如 6之親合性評估係如實施例2所記 Ο 變體的親合：並：：13〜表15所示，相較於H9/L0,各突 及匕鏈的序列識別下m卜各突變體的請 識別相如表13〜表15所示。

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瀋4樊 潜^樊 ^(6H)fe畹 ^:^6H 戥令 DFGVD (序列識別號：34) EFGVD (序列識別號：35) WVRQAPGQGLEWMG (序列識別號：54) WVRQPPGEGLEWIG (序列識別號：55) VIWGGGSTNYNEALKS (序列識別號：39) VIWGGGSTNYNSELKS (序列識別號：40) VIWGGGSTNYNSALQS (序列識別號：41) VIWGGGSTNYNSALKD (序列識別號：42) Q Μ 〇· Oh W ·—1 ω ω Ο* 00 00 ^ ^ s C^i to τ—Η CO CO cr> co oo 1寸寸 Ξ CNl CO 寸 CO LO CO SFGVD (序列識別號：33) SFGVD (序列識別號：33) WVRQAPGKGLEWMG (序列識別號：53) WVRQAPGKGLEWMG (序列識別號：53) VIWGGGSTNYNSALKS (序列識別號：38) VIWGGGSTNYNSALKS (序列識別號：38) VIWGGGSTNYNSALKS (序列識別號：38) VIWGGGSTNYNSALKS (序列識別號：38) CDR1 CDR1 oa CXI b CDR2 CDR2 CDR2 CDR2 卜 r—Η Μ 〇〇 ι··Η cn> K CD OO 1 ^ Κ oa 03 DI： CO οα ΓΧ： 寸 S9 寸9 Ϊ9 99 寸9 (笑：^运篛^:畋) S5HVSNANXS33iMIA sao9ZH (ooe : 癍 f-ϋο S^HVSNANlsogMIA Sa3 SH

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(19 : _ fw?wf-iio SSAImoSM (8CO:餒菡铤瓦处) s}HVSMNXSOooMIA (s :龥英癍瓦欢) OMSSlodvgM (19 :^英癍^处) SSAE105M (800:^菡癍瓦昤) SMlvsNANlsgoMIA (s 菡鴒瓦欢) OMSS^dvlgM (19 : ¥HW?癍 f_iio SSASlo· (s:餒菡篛ίϋο loMsgsdvlgAM (8CO: _ 虿篛^:处) s}HVSNANisg3MA (es:餒苌篛€处) oMso^dvgM 。01 < 憋璁唬 11—I< si io E iios i SJ s i io E s 【II<】 201041595 宕(s)fe蜱¾鲥钽邮翱 ^^3 s 讓^ 【21<】o ❹ 齧砩 (.g-Meqeio DVVMTQSPLSLPVTLGRPASISC (序列識別號：94) RSSRNIVHTNGNTYLE (序列識別號：87) WYQQKPGKAPKLLIY (序列識別號：99) FGRGTKLEIK (序列識別號：105) RSSRNIVHTNGNTYLE (序列識別號：87) WYQQKPGKAPKLLIY (序列識別號：99) DVVMTQSPLSLPVTLGRPASISC (序列識別號：94) RSSRNIVHTNGNTYLE (序列識別號：87) WYQQKPGKAPKLLIY (序列識別號：99) RSSRNIVHTNGNTYLE (序列識別號：87) WYQQKPGKAPKLLIY (序列識別號：99) FGRGTKLEIK (序列識別號：105) DVVMTQSPLSLPVTLGRPASISC (序列識別號：94) RSSRNIVHTNGNTYLE (序列識別號：87) WYQQKPGKAPKLLIY (序列識別號：99) FGRGTKLEIK (序列識別號：105) 〇£： Cei Cd Ctt Ce； Ce； ^ 0^ ο* 〇* ω ο* ο* ω O* O* M O* Ο1 ο* ο* ω 〇* 卜 ι—Η -° 卜 LO (Nl 寸 卜卜 LO 卜 LO 三 — (Νϊ 却 （Νϊ 寸 2 17 27 45 100 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (序列識別號：93) RSSQNIVHTNGNTYLE (序列識別號：84) WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號：96) FGQGTKLEIK (序列識別號：103) RSSQNIVHTNGNTYLE (序列識別號：84) WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號：96) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (序列識別號：93) RSSQNIVHTNGNTYLE (序列識別號：84) WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號：96) RSSQNIVHTNGNTYLE (序列識別號：84) WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號：96) FGQGTKLEIK (序列識別號：103) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC (序列識別號：93) RSSQNIVHTNGNTYLE (序列識別號：84) WYQQKPGKAPELLIY (序列識別號：96) FGQGTKLEIK (序列識別號：103) 产 1 〇£： CDR1 FR2 FR4 CDR1 FR2 FR1 CDR1 FR2 CDR1 FR2 FR4 FR1 CDR1 FR2 FR4 L25 L27 L28 L29 1—^ CO L34 L35 L37 εζ. 201041595 表 .&二 鏈 U&ul ί I輕 重鏈序列識別號 輕鏈序列識別號 KD(M) 3U33UL10L11L12L133333S33333L10L11L12L133333L10L11L123L10L11L12L133L11L12L13 _ )1))))))78901234566666780111.—-222223333 H9H9H9H9H9H9H9H9H9Hl[Il[I1[i2[i2H2[i2H2[i2H2H2H2H2H2H2H2H3H3H3H3H3H3H3H3H3H3H3H3H3H3 3 65 3. 58E-09 3 66 2. 49E-09 3 67 2. 97E-09 3 68 2. 64E-09 3 69 2.53E-09 3 70 2. 92E-09 3 71 2.40E-09 3 72 2. 55E-09 3 73 2. 45E-09 4 65 3. 46E-09 5 65 4. 31E-09 6 65 2.63E-09 7 65 3. 21E-09 8 65 2.35E-09 9 65 3.14E-09 10 65 2. 39E-09 11 65 2. 56E-09 12 65 2. 50E-09 13 65 2. 50E-09 13 70 2. 38E-09 13 71 2. 71E-09 13 72 2. 79E-09 13 73 2.50E-09 14 65 3.03E-09 15 65 2. 94E-09 16 65 2. 70E-09 17 65 2.54E-09 17 70 3. 03E-09 17 71 3.05E-09 17 72 3.14E-09 18 65 2.82E-09 18 70 2.80E-09 18 71 2. 74E-09 18 72 2. 64E-09 18 73 2. 74E-09 19 65 3. 04E-09 19 71 3. 06E-09 19 72 3. 06E-09 19 73 3. 02E-09 201041595 【表14】 重鏈 輕鏈 重鏈序列識別號輕鏈序列識別號 KD(M)

H9 H9 H9 H9 H9 L25 L27 L28 L29 L31 3 3 3 3 H9 L34 3 H9 L35 3 H9 L37 3 H34 L0 20 H35 L0 21 H36 L0 22 H36 L1 22 H36 L10 22 H36 L11 22 H36 L27 22 H36 L28 22 H36 L31 22 H36 L34 22 H36 L35 22 H36 L37 22 H37 L0 23 H38 L0 24 H39 L0 25 H40 L0 26 H41 L0 27 H46 L0 28 H46 L1 28 H46 L10 28 H46 L11 28 H46 L27 28 H46 L28 28 H46 L31 28 H46 L34 28 H46 L35 28 H46 L37 28 KD(M) 3.54E-09 3. 07E-09 3. 06E-09 3. 49E-09 2. 46E-09 2. 80E-09 2. 37E-09 2.69E-09 5. 94E-09 3. 65E-09 1.96E-09 2. 03E-09 1.87E-09 2. 08E-09 1.94E-09 1.95E-09 1.67E-09 2. 01E-09 1.94E-09 2. 20E-09 2. 92E-09 2. 92E-09 3.43E-09 3. 51E-09 2. 35E-09 1.87E-09 1.84E-09 1.88E-09 1.80E-09 1.90E-09 1.86E-09 1.90E-09 2. 22E-09 2.04E-09 82 2.30E-09 74 75 76 77 78 79 80 82 65 65 65 66 70 71 75 76 78 79 80 82 65 65 65 65 65 65 66 70 71 75 76 78 79 80 75 201041595 【表15】 重鏈 輕鏈 重鏈序列識別號 輕鏈序列識別號 KD(M) H47 L0 29 65 1.84E-09 H47 L1 29 66 1.89E-09 H47 L10 29 70 1.89E-09 H47 L11 29 71 1.83E-09 H47 L27 29 75 1.60E-09 H47 L28 29 76 1.52E-09 H47 L31 29 78 1.83E-09 H47 L34 29 79 2.20E-09 H47 L35 29 80 1.68E-09 H47 L37 29 82 2. 38E-09 H48 L0 30 65 2. 09E-09 H48 L1 30 66 2. 09E-09 H48 L10 30 70 2.06E-09 H48 L11 30 71 2. 00E-09 H48 L27 30 75 1.99E-09 H48 L28 30 76 2. 07E-09 H48 L31 30 78 1.98E-09 H48 L34 30 79 2.27E-09 H48 L35 30 80 2. 07E-09 H48 L37 30 82 2.19E-09 H49 L0 31 65 2.06E-09 H49 L1 31 66 1.91E-09 H49 L10 31 70 2. 05E-09 H49 L11 31 71 1.92E-09 H49 L27 31 75 2.08E-09 H49 L28 31 76 2.11E-09 H49 L31 31 78 1.94E-09 H49 L34 31 79 2. 21E-09 H49 L35 31 80 2.08E-09 H49 L37 31 82 2. 43E-09 H50 L0 32 65 1.89E-09 H59 L1 32 66 1.86E-09 H50 L10 32 70 1.90E-09 H50 L11 32 71 1.82E-09 H50 L27 32 75 1.95E-09 H50 L28 32 76 1.97E-09 H50 L31 32 78 1.93E-09 H50 L34 32 79 2. 36E-09 H50 L35 32 80 2.24E-09 H50 L37 32 82 2. 72E-09 201041595 〔実施例4〕導入抑制脫醯胺化反應的突變 醫藥品使用的抗體，即使是來自單一抗體產生細胞的 選殖株（clone)所得的單株抗體，都存在異質性 (heterogeneity)。這種抗體的異質性已知會因為氧化、脫 醯胺化等的修飾而引起、或在長時間保存中及所謂熱、光 的壓力條件下暴露而增加（參考文獻：Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol. 9 7, No_ 7, 2426-2447)。然而，在將抗體開 ❹ 發為醫藥品時，其蛋白質的物性，特別是均一性及安定性 極為重要，希望降低目標物質/關聯物質的異質性，儘可能 為單一物質。 脫醯胺化反應為，天門冬醯胺酸（asparagine，N)及麩 酿胺酸（glutamine，Q)的側鏈中非酵素地發生之反應， 使天門冬醯胺酸及麩醯胺酸的側鏈中存在的醯胺變成妒羧 酸。保存中發生的脫醯胺化反應係為上述之異質性的原 ❹因，因此希望盡可能地將其抑制。另外，已有報告指出， 脫酿胺化反應在和天門冬醢胺酸（asparagine，n)甘胺酸 (G)相隣的位置（· · · NG · · ·)特別容易發生（Geiger J. Biol. Chem. 1987; 262:785-794 ) °L0(序列識 別滅；· 65)的CDRl中存在在和天門冬醯胺酸（N)及甘胺酸 (G )相隣的序列，因此，可能可以藉由將該位置的胺基酸 置換而抑制脫醯胺化反應。 藉由胺基酸置換而抑制脫醯胺化反應，具體言之，係 如下述進订。把存在於L0 (序列識別號：65)的Kabat編 77 201041595 號第29號存在的甘胺酸（G)置換為丙胺酸（alanine，A)， 藉此，能夠抑制脫醯胺化反應。因此，製作把存在於L0 (序 列識別號：65)的Kabat編號第29號的甘胺酸（G)置換 為丙胺酸（A)的L36 (序列識別號：81 )。同様地，也可 以把存在於LI 1 (序列識別號：71)的Kabat編號第29號 存在的甘胺酸（G)置換為丙胺酸（A)，而抑制脫醢胺 化反應。因此’製作把存在於L1丨（序列識別號：71 )的 Kabat編號第29號的甘胺酸（G)置換為丙胺酸（A)的ί21 (序列識別號.83)。使用這些來製作H9/l36 ( η鏈：jj9/ 序列識別號：3、L鏈：L36/序列識別號：81) 、H36/L36 (Η鏈136/序列識別號：2 2、以：u6/序列識別號： 81) H32/L21 (H 鏈：H32/序列識別號：18、l 鏈：Μ"序 列識別唬.83)。另外’這些突變體的製作、純化係依實 施例1所記載的方法進行。 製作㈣的突變體之親合性測定則依實施例2所記載 法進订。其結果如表16所示。相較於H9/LG，任何-個突變體都沒有顯著的親合性 胺化反應。 _ 可視為能抑制脫醯 表JL6】 R5- H9 H36 H32

KD(M) 3.58E-09 3.60E-09 2.59E-09 3.81 E-Q9 〔実施例5〕接古μ * TH a , 剩 N抗體表現量的突變位置之發現 1造抗體醫藥品的方法，一 Μ使用建構以哺乳動物 78 201041595 細胞產生目的抗體的穩定表現株的方法。因此，穩定表現 株的抗體表現量係為攸關抗體醫藥品的生産成本的重要因 素，希望能達到夠高的抗體表現量。 在此’為了評估Ax225抗體的人型化對抗體表現量造 成的影響’依據實施例1的方法表現下列4種抗體：欲合 抗體chH/chL ( Η鏈chH/序列識別號：1、l鏈chL/序列 識別號：64)、僅有Η鏈進行人型化的H〇/chL ( Η鏈H0/ 序列識別號：2、L鏈chL/序列識別號：64 )、僅有L鏈進 ❹ 行人型化的chH/LO ( Η鏈chH/序列識別號：1、l鏈L0/ 序列識別號：65 )、兩條鏈都進行人型化的h〇/l〇 ( Η鏈 Η0/序列識別號：2、L鏈L0/序列識別號：65)。 用Biacore-Q進行的培養上清液中的抗體濃度定量 使用Biacore-Q (BIAC0RE)進行之培養上清液中的抗 體濃度定量係以下述方法進行。 感應日日片之製作’係藉由胺偶合（am^ ne c〇Up 1 i ng) 〇 法’把重組蛋白A約5〇〇〇 RU固定在CM5 (GE Healthcare) 上。電泳緩衝液（running buffer)使用HBS-EP，再生用緩 衝液則使用10 mM glyCine-HCl (pHl. 5)，流速為 5 L/min。另外，為了作成檢量線，將依據實施例1的方 法而表現、純化的嵌合抗體或人型化抗體調製為2000, 1 000，500，250，125，62.5 ng/mL 各濃度。

回收的培養上清液用HBS-EP適當地稀釋，以調製為在 檢置線上正確倍數抗體濃度。將調製的培養上清液及用以 製作檢量線的樣本提供至Biacore-Q，以BIACORE Q 79 201041595

Control Software on C0M1進行測定及解析，藉此算出培 養上清液中的抗體濃度。 結果’可以看出藉由將L鏈人型化，使Αχ225抗體的 表現量提高2〜3倍（第4圖）。 提高抗體表現量的突變位置的確認 從立體結構模型可以推測出，存在於L鏈FR2的Kabat 編號第42號的殘基對表現量有相當大的貢獻。具體言之， 推測可以藉由將Kabat編號第42號的殘基置換為離胺酸 (K)，而提高表現量。再者，此推測嵌合抗體的[鏈（chL/ Ο 序列識別號：64)的Kabat編號第42號的殘基為麩醯胺酸 (glutamine，Q)，相對於此之人型化抗體的[鏈“… 序列識別號：65 )的該殘基為離胺酸（κ)亦無矛盾。 在此，為了評估L鏈的Kabat編號第42號的殘基對表 現里的影響’依實施例1記載的方法進行H32/L11 ( Η鏈 Η32/序列識別號.18、L鏈L11/序列識別號：71 )及H32/L12 (Η鍵Η32/序列識別號：18、匕鏈U2/序列識別號：72) “ 的表現，並進行培養上清液中的抗體濃度的測定。在此， 使用之2種的L鏈（L11&L12)的差異為’上述的Kabat 編號第42號的殘基在LI 1為離胺酸（κ)，而在U2則置換 為麵胺酸（Ε) °再者’兩者中之Kabat編號第42號以外 的序列是完全一樣的，而可以單純評估該殘基的影響。 結果如第5圖所示。可以確認出，Kabat編號第42號 為離胺酸的H32/L11 ’相較於該殘基為麩胺酸之H32/L1 2， /、有、、句3乜的表現量的提高。由此可知，藉由Kabat編號 80 s 201041595 第42號的殘基置換為離胺酸，就可以大幅提高表現量（第 5圖）。 〔實施例6〕人型化Ax225抗體對人胰腺癌異種移植 小鼠模型之抗腫瘤効果的測定（1 ) 6-1 ·胰腺癌異種移植小鼠模型的製作 由大曰本製薬株式会社（現為大曰本住友製藥公司） 取得之人類胰腺癌細胞株PANC-1，在HBSS中調製為2.5x 107個/mL。將上記細胞懸浮液200 /Z L ( 5xl06個/小鼠）接 種於由日本 Charles River 公司購入的 CAnN. Cg-Foxnl<nu>/CrlCrl j nu/nu (BALB-nu/nu)小鼠的 鼠蹲部皮下。腫瘤容積（體積）的平均値約為24〇mm3時， 將小鼠用於該實驗。 .抗體調製及投予 抗體以PBS調製為1 mg/mL，一週1次，於2週内、 ❹ X 1 0 mg/kg的量投予人類胰腺癌異種移植小鼠的腹腔内。 負對照組則以同樣方式投予PBS。 6.抗腫瘤効果的評估 最终人類胰腺癌異種移植小鼠模型中的抗腫瘤効果，係於 =予後7日後，由相對於負對照組的腫瘤增殖量之比 鼻出腫瘤增殖抑制効果。 腫瘤增殖抑制効果（％ ) = f ] 増 (1—抗體処理群之腫瘤 /對照組的腫瘤增殖量）χ丨〇 〇 .統計處理 M瘤體積係 以平均値±標準偏差來表示 統計解析係為 81 201041595 使用SAS前臨床package Version 5. 0，依據LSD法之對 照組和實驗組之比較。另外，具有9 5 %之信賴度（* ; p < 〇· 05)視為有意義。 6- 5 ·結果 如第6圖所示，人型化Αχ225抗體（H9/L0)，和小鼠抗 體及嵌合抗體一様’相較於pBS投予組，其顯示了有意義 的腫瘤增殖抑制効果。 〔実施例7〕人型化抗a X L抗體對人胰腺癌異種移 植小鼠模型之抗腫瘤効果的測定（2 ) 7- 1 .胰腺癌異種移植小鼠模型的製作 由大曰本製薬株式会社（現為大日本住友製藥公司） 取得之人類胰腺癌細胞株PANC—i，在HBSS中調製為2 5χ 1〇個/mL。將上記細胞懸浮液2〇〇 M l ( 5xl〇6個/小鼠）接 種於由日本Charles River公司購入的 CAnN. Cg-F〇xnl<nu>/CrlCrl 〗nu/nu (MLB —nu/nu)小鼠的 鼠螇部皮下。腫瘤容積（體積）的平均値約為2〇〇ffiffl3時， 將小鼠用於該實驗。 7-2 .抗體調製及投予 抗體以組胺酸（histidine)緩衝液（2〇 Histidine-ΗΠ，150mMNaC1，pH6 〇)調製為 -週1次，於2週内、以10 mg/kg的量投予人類胰腺癌異 種移植小鼠的尾静脈内。負對照組則以同樣方式投予組胺 酸緩衝液。 7-3 .抗腫瘤効果的評估 82 201041595 人' _姨膝癌異種銘# ,丨、q &说丨+ i & 兴種移植小鼠楔型中的抗腫瘤効果，係# 最終投予後7日接 保於 麦，由各抗體投予組的腫瘤體積和負 組的腫瘤體藉Φ + ±#_ # 、野照 積來比較腫瘤增殖抑制効果。 7 - 4 .統計處理 腫瘤體積係以平均値±標準偏差來表統計解析係為 使用SAS前臨床package Versi〇n 5. 〇，依據⑽法之對 照組和實驗組之比較。另外，具有95%之信賴度（* ; p ❹ < 0. 〇5)視為有意義。 7~5 ♦結果 如第7圖所示’相較於組胺酸緩衝液投予組，抗體投 予組表現出有意義的腫瘤增殖抑制効果。 【產業上利用性】 本考χ明人成功取付人型化抗AXL抗體。本發明的抗axl 抗體具有高度抗腫瘤活性，可以作為抗癌劑以及癌診斷藥。 〇 【圖式簡單說明】 第1圖為顯示抗AXL抗體的抗腫瘤活性及結合區域之 圖。一:TGI (%) < 30、+ : TGI ( % ) < 60、+ + : 60= < TGI ( % )。 第2圖為表示Αχ225抗體於癌細胞内AXL的分解誘導 活性之評估實驗的結果之照片。顯示出該抗體誘導AXL蛋 白質之分解。 第3圖為表示抗AXL抗體對人類肤腺癌異種移植小鼠 83 201041595 模型之抗腫癍& ,,, 哩腐政果的測定結果之圖。 第4圖為表示人型化Ax225抗體之表現量之圖。 第5圖為表示人型化Ax225抗體之表現量之圖。 第6圖為表示人型化Ax225抗體（H9/L0)的腫瘤增生抑 制効果之圖。*符號表示p<0_05。 第7圖為表示人型化抗AXL抗體（H47/L0、H47/L11、 Η5()/1^'ϋ50/111)對人類胰腺癌異種移植小鼠模型之抗腫 瘤效果的測定結果之圖。*符號表示p< 〇. 05。 【主要元件符號說明】 無。 84 201041595 序列表 <110> CHU6AI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Ant i-AXL ant i body

<130> C1-A0906-TW 〈150〉 JP 2009-118725 <151〉 2009-05-15 <160> 117

<170> Patent In version 3.4 <210> 1 〈211〉 119 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 1

Gin Val 6ln Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu 65 70 75 80 i 201041595

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 6ly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu VaI Thr VaI Ser Ala 115 <210> 2 <211> 119 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 2

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80 2 201041595

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210〉 3 <211〉 119 <212> PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 3

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30 ❹

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 3 201041595 61y 6lu 61y Ser Lys Tyr 6ly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 4 <211> 119 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 4

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 4 .201041595

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 5 〈211〉 119 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉

<223> an artificially synthesized sequence <400> 5

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Glu Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 〇

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asrt Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 5 201041595

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 6 <211〉 119 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 6

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 6 .201041595

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 7 <211〉 119 <212> PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 7

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 〇

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 7 201041595 <210〉 8 <211〉 119 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 8

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Thr Leu Thr Leu Thr Gys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val Me Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Glu Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 10 〈211〉 119 9 201041595 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 10

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Gin 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Asp Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

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Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Gin 50 55 60

Asp Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Gin 50 55 60

Asp Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 〇

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 14 〈211〉 119 <212> PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 14 13 201041595

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Glu Leu Gin 50 55 60

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Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15 14 201041595

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Glu Leu Gin 50 55 60

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Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 ❹ <210> 16 〈211〉 119 〈212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 16

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

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Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30 16 201041595

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Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Gin 50 55 60

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Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

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Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Gin 50 55 60

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Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

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Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

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Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 18 201041595

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Gin 50 55 60

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Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 20 〈211〉 119 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 20

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 19 201041595

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

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Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 21 <211> 119 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220>

<223> an artificially synthesized sequence <400〉 21

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 20 201041595

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210〉 22 〈211〉 119 〈212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 22

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val Me Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 21 201041595

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

〈210〉 23 <211〉 119 <212> PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 23

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Arg Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80 22 201041595

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

〈210〉 24 <211〉 119 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 24

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80 23 201041595

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 6ln Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

〈210〉 25 <211〉 119 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 25

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

f I

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 24 201041595

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 26 <211> 119 <212〉 PRT <213〉 Artificial

<223> an artificially synthesized sequence <400> 26

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser 6ln Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 25 201041595

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 27 <211> 119 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉

<223> an artificially synthesized sequence <400> 27

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 c

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 26 201041595

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 28 〈211〉 119 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉

<223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 28

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 27 201041595

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 29 <211> 119 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 29

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Arg Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 28 201041595 <210> 30 <211〉 119 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 30

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 29 201041595 <210> 31 <211> 119 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 31 6ln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 32 〈211〉 119 30 201041595 <212> PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 32

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe 20 25 30 o

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Arg Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu 65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211〉 5 <212〉 PRT <213> Artificial 31 201041595 <220> <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 33

Ser Phe Gly Val Asp 1 5 <210> 34 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 34

Asp Phe Gly Val Asp 1 5 〈210〉 35 <211〉 5 <212〉 PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400〉 35

Glu Phe Gly Val Asp 1 5 <210〉 36 <211> 5 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 32 201041595 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 36

Lys Phe Gly Val Asp 1 5 <210〉 37 〈211〉 5 <212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉

<223> an artificially synthesized sequence <400> 37

Arg Phe Gly Val Asp 1 5 〈210〉 38 〈211〉 16 〈212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 38

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 10 15 〈210〉 39 <211〉 16 <212> PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 33 201041595 <400> 39

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Lys Ser 15 10 15 <210〉 40 〈211〉 16 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 40

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Glu Leu Lys Ser 15 10 15 〈210〉 41 <211〉 16 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 41

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Gin Ser 15 10 15 〈210〉 42 〈211〉 16 〈212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 42 34 201041595

Val MeTrpGIyGlyGly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp 15 10 15 <210〉 43 <211〉 16 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 43

Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Gin Asp 15 10 15 <210> 44 <211> 16 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 44

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Leu Gin Asp 15 10 15 〈210〉 45 <211> 16 〈212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 45

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Glu Leu Gin Asp 15 10 15 35 201041595 <210〉 46 <211〉 16 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 46

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Glu Leu Gin Asp 15 10 15

<210〉 47 <211〉 16 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 47

Val I le Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Arg Ala Leu Lys Ser 15 10 15

<210〉 48 <211> 16 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 48

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Ser 15 10 15 36 201041595 <210〉 49 <211> 11 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 49

Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10

<210> 50 <211〉 30 <212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 50

Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr 20 25 30 <210〉 51 <211〉 30 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 51

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 15 10 15 37 201041595

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30 <210〉 52 〈211〉 14 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 52

Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 〈210〉 53 <211〉 14 <212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 53

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210〉 54 <211〉 14 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 54 38 201041595

Trp Val Arg Gin Ala Pro 6ly Gin Gly Leu 6lu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 55 〈211〉 14 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400〉 55

Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp lie Gly 1 5 10 <210> 56 〈211〉 14 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 56

Trp Val Arg Gin Ala Arg Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210〉 57 <211〉 32 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 57

Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu Lys 15 10 15 39 201041595

Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 58 〈211〉 32 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 58

Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Val Leu Thr 15 10 15

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 〈210〉 59 <211〉 32 〈212〉 PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 59

Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Val Leu Thr 15 10 15

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210〉 60 <211〉 11 40 201041595 * <212> PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 60

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10

<210> 61 〈211〉 11 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 61

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 62

Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210〉 63 <211> 11 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 41 201041595 <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 63

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210〉 64 <211> 112 <212〉 PRT <213> Artificial

〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 64

Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 42 201041595

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 65 〈211〉 112 <212> PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 65 _ Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 〇 1 5 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr 6ln Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 ❹

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 66 <211〉 112 43 201041595 <212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 66

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 6ly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 67 <211〉 112 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 44 201041595 <400〉 67

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Glu Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 ❹ <210> 68 〈211〉 112 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 68

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 45 201041595

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 6ln Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 69 <211〉 112 <212> PRT <213> Artificial

<220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 69

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 35 40 45 4 6 201041595

Pro 6lu Leu Leu Me Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 6ly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 〈210〉 70 〈211〉 112 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 70

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 47 201041595

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 100 105 110

〈210〉 71 <211〉 112 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 71

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Gys Phe Gin Gly 85 90 95 48 201041595

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 100 105 110 <210> 72 〈211〉 112 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 72

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 100 105 110 49 201041595 <210> 73 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 73

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 35 40 45

Pro Giu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 100 105 110 <210> 74 <211> 112 <212〉 PRT <213> Artificial 50 <220〉 201041595 <223> an artificially synthesized sequence <400> 74

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Arg Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 o

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 〈210〉 75 〈211〉 112 〈212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 75

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 51 201041595

Gin Pro Ala Ser lie Ser Gys Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 76 <211〉 112 <212> PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 76

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30 52 201041595

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 o

Ser His Me Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 77 〈211〉 112 〈212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence Q <400> 77

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 53 201041595

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210〉 78 <211> 112 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 78

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 54 201041595

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 〈210〉 79 <211> 112 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉

<223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 79

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Arg Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 ❹

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 55 201041595 <210〉 80 <211> 112 <212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 80

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 81 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉 Artificial 56 201041595 <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 81

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 ❹

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 82 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 82 57 201041595

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Arg Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Me Lys 100 105 110

<210> 83 <211> 112 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 83

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr 20 25 30 58 201041595

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 100 105 110 〈210〉 84 〈211〉 16 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 84

Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 〈210〉 85 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 59 201041595 <400〉 85

Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213〉 Artificial 〈220〉

<223> an artificially synthesized sequence <400〉 86

Gin Ser Ser Glu Asn lie Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210〉 87 <211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220>

<223> an artificially synthesized sequence <400〉 87

Arg Ser Ser Arg Asn lie Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 88 60 201041595

Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210〉 89 〈211〉 16 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 89

Gin Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210〉 90 <211〉 7 〈212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 90

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210〉 91 <211> 9 〈212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 91

Phe Gin Gly Ser His lie Pro Phe Thr 1 5 61 201041595 <210〉 92 <211> 23 <212〉 PRT <213> Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 92

Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser I le Ser Cys 20 <210> 93 <211〉 23 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 93

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 94 <211〉 23 <212> PRT <213〉 Artificial 62 <220> 201041595 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 94

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Arg Pro Ala Ser lie Ser Cys 20

<210> 95 〈211〉 15 <212〉 PRT 〇 <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 95

Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Glu Leu Leu Me Tyr 15 10 15

<210> 96 <211> 15 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 96

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie Tyr 15 10 15 〈210〉 97 <211〉 15 〈212〉 PRT <213> Artificial 63 201041595 <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 97

Trp Tyr 6ln Gin Lys Pro Gly Glu Ala Pro Glu Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210〉 98 <211> 15 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 98

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Glu Leu Leu lie Tyr 15 10 15 〈210〉 99 <211> 15 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 99

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 100 〈211〉 32 <212〉 PRT <213〉 Artificial 64 〈220〉 .201041595 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 100

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 6ly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 101 <211> 32 <212〉 PRT <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 101 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 〇 <210> 102 <211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 102

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 65 201041595 <210> 103 <211〉 10 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 103

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210〉 104 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 104

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu 1 5 10 <210〉 105 <211〉 10 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 105

Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210〉 106 〈211〉 328 .201041595 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 106

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 o

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 6ln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 67 201041595

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 68 201041595

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210〉 107 〈211〉 107 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400〉 107

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210〉 108 <211〉 119 <212〉 PRT <213〉 Artificial 69 201041595 <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 108

Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Phe 20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 〈210〉 109 <211〉 32 <212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 70 201041595 〈400> 109

Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Val Leu Thr 15 10 15

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210〉 110 <211〉 4 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 110

Gly Gly Gly Ser 1 〈210〉 111 <211〉 4 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400> 111

Ser Gly Gly Gly 1 <210〉 112 〈211〉 5 <212〉 PRT <213〉 Artificial 71 201041595 <220> <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 112

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 113 <211> 5 <212〉 PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400〉 113

Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210〉 114 <211〉 6 <212〉 PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence <400〉 114

Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210〉 115 <211〉 6 <212> PRT <213> Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized sequence 72 201041595 <400> 115

Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 〈210〉 116 <211〉 7 〈212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉

<223> an artificially synthesized sequence <400> 116

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 117 <211〉 7 <212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized sequence 〈400〉 117

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 73

Claims (1)

1. 201041595 七、申請專利範圍： 丄· 一種抗體，其係為下述（1)〜（6)中任一項所記 載的辨識AXL的FND1區域的抗體： (1)抗體，其所具有之重鏈可變區包含：具有序列識別號： 33〜37中記載的任一種胺基酸序列的CDIn、具有序列識別 號· 38〜48中記載的任一種胺基酸序列的CDR2、具有序列 識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的CDR3 ; (2 )抗體’其具有序列識別號：2 ( H〇)所記載之重鏈可 變區； (3 )抗體，其所具有之輕鏈可變區包含：具有序列識別號： 84〜89中記載的任一種胺基酸序列的CDR1、具有序列識別 號：90記載的胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：91 中記載的任一種胺基酸序列的CDR3 ; (4 )抗體，其具有序列識別號：65 ( LO)所記載之輕鏈可 變區； (5) 具有（1)的重鏈可變區及（3)的輕鏈可變區之抗體； (6) 在（1)〜（5)中任一項所記載的抗體中，有丨或複 數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插入的抗體，且和（！） 〜（5 )中任一項所記載的抗體有同等活性的抗體。 2.種抗體’其係為下述（1)〜（6)中任一項所記 載的辨識AXL的FND1區域的人型化抗體： (1)抗體’其所具有之重鏈可變區包含：具有序列識別號： 33〜37中記載的任一種胺基酸序列的CDin、具有序列識別 號.38〜48中§己載的任一種胺基酸序列的CDR2、具有序列 201041595 識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的CDR3 ,以及具有 序列識別號：51中記載的胺基酸序列的FR1、具有序列識 別號：53中記載的胺基酸序列的FR2、具有序列識別號： 109及58中記載的任一種胺基酸序列的FR3、具有序列識 別號：61中記載的胺基酸序列的FR4 ; (2 )抗體，其具有序列識別號：2 ( H0)所記載之重鏈可 變區， (3 )抗體，其所具有之輕鏈可變區包含：具有序列識別號： ® 84〜89中記載的任一種胺基酸序列的CDR1、具有序列識別 號：90記載的胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：9工 中記載的任一種胺基酸序列的CDR3，以及具有序列識別 號：93中記載的胺基酸序列的FR1、具有序列識別號：96 中記載的胺基酸序列的FR2、具有序列識別號：1 〇 1中記載 的胺基酸序列的FR3、具有序列識別號：103中記載的胺基 酸序列的FR4 ; q ( 4 )抗體，其具有序列識別號：65 ( LO)所記載之輕鏈可 變區， (5) 具有（1)的重鏈可變區及（3)的輕鏈可變區之抗體； (6) 在（1)〜（5)中任一項所記載的抗體中，有1或複 數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或插入的抗體，且和（1) 〜（5 )中任一項所記載的抗體有同等活性的抗體。 3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體，重鏈可變 區中Kabat編號第94號的胺基酸殘基為甘胺酸（glycine)。 4. 如申請專利範圍第卜3項任一項所述之抗體，重鏈 2 201041595 可變區的胺基酸序列中’包含以下的胺基酸殘基中至少一 者： (1 )重鏈可變區中Kabat編號第31號的胺基酸殘基為天 門冬胺酸（asparaginic acid )、麵胺酸（glutaminic acid)、離胺酸（lysine)、精胺酸（arginine); (2 )重鏈可變區中Kabat編號第40號的胺基酸殘基為脯 胺酸（prol ine); (3) 重鏈可變區中Kabat編號第41號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4) 重鏈可變區中Kabat編號第43號的胺基酸殘基為麩 醢胺酸（glutamine)或麵胺酸； (5) 重鏈可變區中Kabat編號第44號的胺基酸殘基為精 胺酸； (6) 重鏈可變區中Kabat編號第48號的胺基酸殘基為異 白胺酸（isoleucine); (7) 重鏈可變區中Kabat編號第61號的胺基酸殘基為麩 胺酸、離胺酸、或精胺酸； (8) 重鏈可變區中Kabat編號第62號的胺基酸殘基為麩 胺酸； (9) 重鏈可變區中Kabat編號第64號的胺基酸殘基為麩 醯胺酸； (10) 重鏈可變區中Kabat編號第65號的胺基酸殘基為天 門冬胺酸； (11 )重鏈可變區中Kabat編號第73號的胺基酸殘基為天 201041595 門冬醯胺酸（asparagine) (12 )重鏈可變區中Kabat編號第105號的胺基酸殘基為 麩胺酸或精胺酸。 5·如申請專利範圍第1-3項任一項所述之抗體，重鏈 可變區的胺基酸序列中，包含以下的胺基酸殘基中至少一 者： (1 )重鏈可變區中Kabat編號第41號的胺基酸殘基為精 胺酸； 〇 (2 )重鏈可變區中Kabat編號第43號的胺基酸殘基為麩 醯胺酸； (3) 重鏈可變區中Kabat編號第44號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4) 重鏈可變區中Kabat編號第61號的胺基酸殘基為精 胺酸； (5) 重鏈可變區中Kabat編號第73號的胺基酸殘基為天 Q 門冬醯胺酸。 6·如申請專利範圍第1-5項任一項所述之抗體，其輕 鏈可變區的胺基酸序列包含以下的胺基酸殘基中至少一 者： (1)輕鏈可變區中Kabat編號第17號的胺基酸殘基為精 胺酸； (2 )輕鏈可變區中Kabat編號第24號的胺基酸殘基為麩 醯胺酸； (3)輕鏈可變區中Kabat編號第27號的胺基酸殘基為麩 4 201041595 胺酸或精胺酸； (4) 輕鏈可變區中Kabat編號第29號的胺基酸殘基為丙 胺酸（alanine ); (5) 輕鏈可變區中Kabat編號第42號的胺基酸殘基為麩 胺酸或麩醯胺酸； (6 )輕鏈可變區中Kabat編號第45號的胺基酸殘基為離 胺酸； (7) 輕鏈可變區中Kabat編號第100號的胺基酸殘基為精 胺酸； (8) 輕鏈可變區中Kabat編號第104號的胺基酸殘基為纈 胺酸（val ine ); (9) 輕鏈可變區中Kabat編號第107號的胺基酸殘基為麩 胺酸。 7.如申清專利範圍第1 _ 5項任一項所述之抗體，輕鏈 可變區的胺基酸序列中，包含以下的胺基酸殘基中至少一 者： (1 )輕鏈可變區中Kabat編號第丨7號的胺基酸殘基為精 胺酸； (2)輕鏈可變區中Kabat編號第24號的胺基酸殘基為麩 醯胺酸； (3 )輕鏈可變區中Kabat編號第27號的胺基酸殘基為精 胺酸； (4)輕鏈可變區中Kabat編號第29號的胺基酸殘基為丙 胺酸； 201041595 (5 )輕鏈可變區中Kabat編號第45號的胺基酸殘基為離 胺酸； (6) 輕鏈可變區中Kabat編號第1〇〇號的胺基酸殘基為精 胺酸； (7) 輕鏈可變區中Kabat編號第1〇4號的胺基酸殘基為绳 胺酸； (8) 輕鏈可變區中Kabat編號第1〇7號的胺基酸殘基為麵 胺酸。 ® 8.如申請專利範圍第1-5項任一項所述之抗體，至少 包含以下任一個重鏈可變區： (1 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號·· 49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (2)重鏈可變區包含：具有序列識別號：34記載的胺基 0 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (3 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：35記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：3 8記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號·· 49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (4)重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1 '具有序列識別號：39記載的胺基酸序列的 6 201041595 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (5)重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：4〇記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (6 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：41記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (7) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：42記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (8) 重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：43記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (9 )重鍵可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：44記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (W)重鍵可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：45記載的胺基酸序列的 201041595 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (11 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：46記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (12)重鏈可變區包含：具有序列識別號：36記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 ◎ CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (13 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：37記載的胺基 酸序列的CDin、具有序列識別號：38記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ; (i4 )重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 0 酸序列的CDR1、具有序列識別號：47記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 ； (15)重鏈可變區包含：具有序列識別號：33記載的胺基 酸序列的CDR1、具有序列識別號：48記載的胺基酸序列的 CDR2、具有序列識別號：49中記載的任一種胺基酸序列的 CDR3 0 9.如申請專利範圍第1 -7項所述之抗體，其係由下列 ~ (25)構成之群中選出： 201041595

   以及包含分別由序列識別號：85、90 及3的重鏈可變區、 及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (3 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：86、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (4 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 7、9 0及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (5 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 8、9 0及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (6 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：34、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 201041595 (7 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：35、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、9〇及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (8 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、39 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 4、9 〇及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； ® ( 9 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、40 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (1 0 )包含下列之抗體··包含分別由序列識別號：33、41 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 0 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (11 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、42 及49所記載的胺基酸序列的CDR 1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記栽的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (12 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、43 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR 1、2及3的輕鍵可變區； 10 201041595 (13 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、44 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記栽的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (14 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、44 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：85、90及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (1 5 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、45 ❹ 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記载的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (i 6 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、46 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 、 (17 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、44 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：89、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (18 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：3 6、3 8 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 11 201041595 (1 9 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：37、38 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (20 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、47 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； J ( 21 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：84、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (22 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：85、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (23 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、48 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：87、90及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； (24 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、47 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：8 4、9 0及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區； 201041595 (25 )包含下列之抗體：包含分別由序列識別號：33、47 及49所記載的胺基酸序列的CDR1、2及3的重鏈可變區、 以及包含分別由序列識別號：87、9〇及91所記載的胺基 酸序列的CDR1、2及3的輕鏈可變區。 10.如申請專利範圍第1或2項所述之抗體，其包含： 序列識別號：2〜32中任一者所記載的重鏈可變區及序列 識別號：65〜83中任一者所記載的輕鏈可變區。 11·如申請專利範圍第1項所述之抗體，其係為包含 序列識別號：1所記載的重鏈可變區及序列識別號：64所 記載的輕鏈可變區’並具有人型抗體來源的恆定區之嵌合 抗體’或者該欲合抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、 缺失、附加及/或插入’並和該嵌合抗體有同等的活性的抗 體。 12. 如申請專利範圍第i_u項任一項所述之抗體，輕 鍵可變區的胺基酸序列中’ Kabat編號第42號的胺基酸殘 基為離胺酸。 13. —種醫藥組成物，其係以如申請專利範圍第卜12 項中任一項所述之抗體為有效成分。 14. 一種抗癌劑’其係以如申請專利範圍第1 _丨2項中 任一項所述之抗體為有效成分。 15. 如申請專利範圍第14項所述之抗癌劑，其中該癌 係為胰臟癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、大腸癌、前列腺癌、 黑色素瘤、子宮内膜癌、卵巢癌、子宮平滑肌瘤、曱狀腺 癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臟癌、神經膠瘤、神經 13 201041595 芽腫、或食道癌。 16.如申請專利範圍第14項所述之抗癌劑，其 係為神經膠瘤、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌 癌或乳癌。 1 7.如申請專利範圍第14項所述之抗癌劑，其 係為胰腺癌或乳癌。 中該癌 、胰腺 中該癌

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