CN117924510B - 靶向egfr和axl的双特异性抗体及其药物偶联物与应用 - Google Patents

靶向egfr和axl的双特异性抗体及其药物偶联物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了靶向EGFR和AXL的双特异性抗体及其药物偶联物与应用。本发明提供的双特异性抗体含有EGFR抗原结合结构域（VH的三个CDR为SEQ ID No.1的270‑277、295‑305和340‑352位；VL的三个CDR为SEQ ID No.1的27‑32、50‑51和89‑97位）和AXL抗原结合结构域（VH的三个CDR为SEQ ID No.3的275‑282、300‑307和346‑352位，VL的三个CDR为SEQ ID No.3的27‑37、55‑56和94‑102位）。本发明所提供的双特异性抗体能介导比亲本更强的内吞活性和ADCC活性，利用其构建的抗体偶联药物可用于抗肿瘤。

Description

靶向EGFR和AXL的双特异性抗体及其药物偶联物与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向EGFR和AXL的双特异性抗体及其药物偶联物与应用。
背景技术
人表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Recptor，EGFR）的异常高表达或者突变是多种器官和组织癌变的驱动因素。靶向EGFR的药物有多种。从机制和类型上讲，有的是共价结合或者非共价结合的小分子，阻断EGFR的磷酸化，从而阻断细胞增殖信号向下游传递，诱导肿瘤细胞的凋亡；有的是靶向EGFR分子的大分子，如单克隆抗体类，结合EGFR分子的胞外结构域，一方面阻断配体EGF与EGFR的结合，一方面介导了效应细胞对目标肿瘤细胞的杀伤，从而抑制肿瘤增殖。
靶向EGFR的药物，特别是抑制其酪氨酸蛋白激酶活性的替尼类药物是肺癌治疗的一线药物，然而，这些药物带给患者的无进展生存期往往小于2年，即病人很快产生耐药。耐药机制多种多样。首先，EGFR受体自身往往通过扩增产生新突变，从而对替尼类药物耐受；此外，不依赖EGFR的耐药机制更加多种多样，其中，AXL受体扩增介导内生性替尼药物耐药或不敏感。肿瘤细胞高表达AXL（AXL源于希腊语“Anexelekto (AXL)”，意为“不受控制的”，AXL于1988年首次分离，并被鉴定为致癌基因），与肿瘤治疗预后不良高度相关。有研究证据表明，AXL还通过增加特殊的转录因子翻译后修饰，促进EGFR激酶结构域的突变，更快的产生EGFR on-target耐药（指EGFR分子本身突变导致的耐药；即药物中靶，但仍耐药）。
开发同时靶向EGFR和AXL的双特异性药物，如双特异性抗体和/或抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC），可以更加有效的抑制肿瘤生长，且能够延长现有药物的用药周期，具有极大的临床应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向EGFR和AXL的双特异性抗体及其药物偶联物与应用。
第一方面，本发明要求保护靶向EGFR和AXL的双特异性抗体。
本发明要求保护的靶向EGFR和AXL的双特异性抗体，含有EGFR抗原结合结构域和AXL抗原结合结构域。
所述EGFR抗原结合结构域可为如下（A1）或（A2）：
（A1）EGFR抗原结合结构域1；所述EGFR抗原结合结构域1中包含抗EGFR抗体的重链可变区1和抗EGFR抗体的轻链可变区1；所述抗EGFR抗体的重链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第270-277位、第295-305位和第340-352位所示；所述抗EGFR抗体的轻链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第27-32位、第50-51位和第89-97位所示。
（A2）EGFR抗原结合结构域2；所述EGFR抗原结合结构域2中包含抗EGFR抗体的重链可变区2和抗EGFR抗体的轻链可变区2；所述抗EGFR抗体的重链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第270-279位、第297-303位和第342-352位所示；所述抗EGFR抗体的轻链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第27-32位、第50-51位和第89-97位所示。
所述AXL抗原结合结构域可包含抗AXL抗体的重链可变区和抗AXL抗体的轻链可变区；所述抗AXL抗体的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.3的第275-282位、第300-307位和第346-352位所示；所述抗AXL抗体的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.3的第27-37位、第55-56位和第94-102位所示。
其中，本发明所述CDR为“互补决定区”，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的“超变环”和/或含有抗原接触残基“抗原接触点”的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。一个可变区通常包含3个CDR区，从N端起依次为CDR1、CDR2和CDR3。
在本发明中，所述双特异性抗体为由第一肽链和第二肽链组成的异源二聚体。
其中，所述第一肽链自N端到C端可依次包括抗EGFR抗体的轻链可变区、轻链恒定区、连接肽、抗EGFR抗体的重链可变区、重链恒定区CH1、铰链区（junction）、重链恒定区CH2和重链恒定区CH3。所述第二肽链自N端到C端可依次包括抗AXL抗体的轻链可变区、轻链恒定区、连接肽、抗AXL抗体的重链可变区、重链恒定区CH1、铰链区（junction）、重链恒定区CH2和重链恒定区CH3。
在本发明的具体实施方式中，所述第一肽链和所述第二肽链的两个重链恒定区CH3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。
进一步地，在所述第一肽链和所述第二肽链中，所述轻链恒定区的类别可为κ链或λ链。所述重链恒定区的类别可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD；如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任一种。
在本发明的一个实施案例中，所述轻链恒定区为人Kappa恒定区，所述重链恒定区为人IgG1恒定区(CH1+junction+CH2+CH3)。
在所述第一肽链中，所述抗EGFR抗体的轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ IDNo.1的第1-107位或SEQ ID No.2的第1-107位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。和/或，所述轻链恒定区的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第108-214位或SEQ ID No.2的第108-214位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述连接肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第215-244位或SEQID No.2的第215-244位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述抗EGFR抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第245-363位或SEQ ID No.2的第245-363位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。和/或，所述重链恒定区CH1的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第364-461位或SEQ IDNo.2的第364-461位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第462-476位或SEQ ID No.2的第462-476位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述重链恒定区CH2的氨基酸序列可如SEQID No.1的第477-586位或SEQ ID No.2的第477-586位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述重链恒定区CH3的氨基酸序列可如SEQ ID No.1的第587-693位或SEQ ID No.2的第587-693位所示。
在所述第二肽链中，所述抗AXL抗体的轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第1-112位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。和/或，所述轻链恒定区的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第113-219位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述连接肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第220-249位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述抗AXL抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第250-363位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。和/或，所述重链恒定区CH1的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第364-461位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第462-476位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述重链恒定区CH2的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第477-586位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，所述重链恒定区CH3的氨基酸序列可如SEQ ID No.3的第587-693位所示。
进一步地，所述第一肽链的氨基酸序列可如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；所述第二肽链的氨基酸序列可如SEQ ID No.3所示。
在本发明的一个实施案例中，所述双特异性抗体由SEQ ID No.1所示的第一肽链和SEQ ID No.3所示第二肽链依靠Knob-into-Hole方式自动异二聚化而成（对应实施例中的BSG04）。
在本发明的另一个实施案例中，所述双特异性抗体由SEQ ID No.2所示的第一肽链和SEQ ID No.3所示第二肽链依靠Knob-into-Hole方式自动异二聚化而成（对应实施例中的BSG0402）。
第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
（B1）编码前文第一方面中所述双特异性抗体的核酸分子；
（B2）含有（B1）中所述核酸分子的表达盒；
（B3）含有（B1）中所述核酸分子的重组载体；
（B4）含有（B1）中所述核酸分子的重组菌；
（B5）含有（B1）中所述核酸分子的转基因细胞系。
在所述核酸分子中，编码所述EGFR抗原结合结构域1中所述抗EGFR抗体的重链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4的第808-831位、第883-915位和第1018-1056位所示。和/或，编码所述抗EGFR抗体的轻链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4的第79-96位、第148-153位和第265-291位所示。
在所述核酸分子中，编码所述EGFR抗原结合结构域2中所述抗EGFR抗体的重链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5的第808-837位、第889-909位和第1024-1056位所示。和/或，编码所述抗EGFR抗体的轻链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5的第79-96位、第148-153位和第265-291位所示。
在所述核酸分子中，编码所述AXL抗原结合结构域中所述抗AXL抗体的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.6的第823-846位、第898-921位和第1036-1056位所示。和/或，编码所述抗AXL抗体的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.6的第79-111位、第163-168位和280-306位所示。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述第一肽链中所述抗EGFR抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1-321或SEQ ID No.5的第1-321位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第322-642位或SEQ ID No.5的第322-642位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第643-732位或SEQ ID No.5的第643-732位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述抗EGFR抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.4的第733-1089位或SEQ ID No.5的第733-1089位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH1的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1090-1383位或SEQ ID No.5的第1090-1383位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1384-1428位或SEQ ID No.5的第1384-1428位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH2的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1429-1758位或SEQ ID No.5的第1429-1758位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH3的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第1759-2079位或SEQ ID No.5的第1759-2079位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述第二肽链中所述抗AXL抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1-336位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第337-657位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.6的第658-747位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述抗AXL抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.6的第748-1089位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH1的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1090-1383位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1384-1428位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH2的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1429-1758位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述重链恒定区CH3的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1759-2079位所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述第一肽链的核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性；编码所述第二肽链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。
SEQ ID No.4编码SEQ ID No.1所示肽链；SEQ ID No.5编码SEQ ID No.2所示肽链；SEQ ID No.6编码SEQ ID No.3所示肽链。
在本发明的一个实施案例中，所述重组载体由重组载体1和重组载体2组成。所述重组载体1用于表达所述第一肽链；所述重组载体2用于表达所述第二肽链。所述重组载体1为将含有所述双特异性抗体中所述第一肽链的编码基因（如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5）的片段替换pHr-IgG1载体的酶切位点KpnI和Not I之间的小片段后得到的重组载体。所述重组载体2为将含有所述双特异性抗体中所述第二肽链的编码基因（如SEQ ID No.6）的片段替换pHr-IgG1载体的酶切位点KpnI和Not I之间的小片段后得到的重组载体。其中，所述载体pHr-IgG1参见后文。
在本发明的一个实施案例中，所述转基因细胞系为将所述重组载体1和所述重组载体2同时导入到293F细胞中后得到的重组细胞。
第三方面， 本发明要求保护一种抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐。
本发明要求保护的抗体药物偶联物包含前文第一方面中所述双特异性抗体以及与所述双特异性抗体相偶联的药物部分；所述药物部分中含有一种、两种或两种以上药物。
其中，所述药物可选自如下：第一类，细胞毒类药物。(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂，如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物，如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂，如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂，如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂，如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂，如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶，主要抑制蛋白质的合成。第二类，激素类。抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等。第三类，生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类。第四类，其他一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂，如维甲类；细胞凋亡诱导剂。
进一步地，所述药物通常为小分子药物，比如破坏细胞微管蛋白的MMAE或抑制拓扑异构酶I的Deruxtecan等。
在本发明的一个实施案例中，所述药物为Dxd（DX-8951衍生物），其分子式为C26H24FN3O6，结构式如下：
。
第四方面，本发明要求保护所述抗体药物偶联物的制备方法。
将所述药物偶联到所述双特异性抗体上得到所述抗体药物偶联物。这种偶联的方式多种多样，可以是随机偶联至抗体分子的自由巯基SH，也可以是定点偶联。
在本发明的一个实施案例中，采用TCEP还原前文第一方面中所述双特异性抗体，从而使所述双特异型抗体中的半胱氨酸生成巯基，然后将马来酰胺-GGFG-Dxd分子偶联至抗体分子上（马来酰胺和巯基生成硫醚键，通过硫醚键实现偶联），得到所述抗体药物偶联物；其中，所述马来酰胺-GGFG-Dxd分子为Deruxtecan，其分子式为C52H56FN9O13，结构式如下：
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在本发明的一个实施案例中，药物（Dxd）-抗体偶联比例（drug-antibody ratio，DAR）为8。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
（C1）前文第二方面中所述的生物材料在制备前文第一方面中所述的双特异性抗体或前文第三方面中所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐中的应用；
（C2）前文第一方面中所述的双特异性抗体在制备前文第三方面中所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐中的应用；
（C3）前文第一方面中所述的双特异性抗体或前文第二方面中所述的生物材料或前文第三方面中所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤包括但不限于肺癌、胶质瘤、头颈部肿瘤、结直肠癌等。
进一步地，所述肿瘤可为不耐药肿瘤也可为耐药肿瘤。在本发明的一个实施案例中，所述耐药肿瘤具体为第三代EGFR靶向的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine protein kinaseinhibitor，TKI）耐药肿瘤。
第六方面，本发明还要求保护一种抗AXL的抗体及其相关生物材料与应用。
本发明所要求保护的抗AXL的抗体，包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.7的第26-33位、第51-58位和第97-103位所示；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.8的第27-37位、第55-56位和第94-102位所示。
进一步地，所述抗AXL的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。
进一步地，所述抗AXL的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性（不一致处优选在骨架区(FR)）。
进一步地，在所述抗AXL的抗体中，轻链恒定区的类别可为κ链或λ链；重链恒定区的类别可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD；如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任一种。
在本发明的一个实施案例中，所述轻链恒定区为人Kappa恒定区，所述重链恒定区为人IgG1恒定区(CH1+junction+CH2+CH3)。
本发明所要求保护的抗AXL的抗体的相关生物材料具体可为如下任一：
（D1）编码前文所述抗AXL的抗体的核酸分子；
（D2）含有（D1）中所述核酸分子的表达盒；
（D3）含有（D1）中所述核酸分子的重组载体；
（D4）含有（D1）中所述核酸分子的重组菌；
（D5）含有（D1）中所述核酸分子的转基因细胞系。
在所述核酸分子中，编码所述抗AXL的抗体中所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.9的第76-99位、第151-174位和第289-309位所示。和/或，编码所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.10的第79-111位、第163-168位和第280-306位所示。
在所述核酸分子中，编码所述抗AXL的抗体中所述重链可变区的核苷酸序列如SEQID No.9所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。和/或，编码所述抗AXL的抗体中所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，或者与上述序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的一致性。
在本发明的一个实施案例中，将编码所述抗AXL的抗体的所述重链可变区的核苷酸序列替换载体pHr-IgG1的两个BsmBI酶切识别位点之间的小片段后得到表达所述抗AXL的抗体的重链的重组表达载体。将编码所述抗AXL的抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列替换载体pHr-Kappa的两个BsmBI酶切识别位点之间的小片段后得到表达所述抗AXL的抗体的轻链的重组表达载体。
其中，所述载体pHr-IgG1是用核酸序列如SEQ ID No.63所示的目的DNA分子替换载体pHR'CMV GFP的KpnI和Not I酶切识别位点之间的小片段，保持载体pHR'CMV GFP上其他核苷酸序列不变所得重组载体。SEQ ID No.63的第19-75位为信号肽基因，第76-123位为缓冲序列（缓冲序列的两端带有BsmBI酶切识别位点），第124-1116位为人IgG1恒定区(CH1+junction+CH2+CH3)。所述载体pHr-Kappa是用核酸序列如SEQ ID No.64所示的目的DNA分子替换载体pHR'CMV GFP的KpnI和Not I酶切识别位点之间的小片段，保持载体pHR'CMVGFP上其他核苷酸序列不变所得重组载体。SEQ ID No.64的第19-84位为信号肽基因，第85-132位为缓冲序列（缓冲序列的两端为BsmBI酶切识别位点），第133-456位为人Kappa恒定区(Constant Kappa)。
所述重组细胞为将上述分别表达所述抗AXL的抗体重链和轻链的两个重组表达载体共转染293F细胞后得到的重组细胞。
本发明所要求保护的抗AXL的抗体的应用具体可为如下任一：
（E1）前文（D1）所述的核酸分子或前文（D2）所述表达盒或前文（D3）所述重组载体或前文（D4）所述重组菌或前文（D5）所述转基因细胞系在制备前文所述抗AXL的抗体中的应用；
（E2）前文所述抗AXL的抗体或前文（D1）所述的核酸分子或前文（D2）所述表达盒或前文（D3）所述重组载体或前文（D4）所述重组菌或前文（D5）所述转基因细胞系在制备用于预防和/或治疗AXL高表达相关疾病的产品中的应用；
（E3）前文所述抗AXL的抗体或前文（D1）所述的核酸分子或前文（D2）所述表达盒或前文（D3）所述重组载体或前文（D4）所述重组菌或前文（D5）所述转基因细胞系在制备用于检测AXL的产品中的应用；
（E4）前文所述抗AXL的抗体或前文（D1）所述的核酸分子或前文（D2）所述表达盒或前文（D3）所述重组载体或前文（D4）所述重组菌或前文（D5）所述转基因细胞系在制备用于结合AXL的产品中的应用；
（E5）前文所述抗AXL的抗体或前文（D1）所述的核酸分子或前文（D2）所述表达盒或前文（D3）所述重组载体或前文（D4）所述重组菌或前文（D5）所述转基因细胞系在制备用于阻断CAS6与AXL结合活性的产品中的应用。
在本发明中，所述双特异性抗体既可以为正常糖基化修饰形式，也可以为无岩藻糖形式。
实验证明：本发明所提供的靶向EGFR和AXL的双特异性抗体能够介导比亲本更强的内吞活性和ADCC活性。利用10C1-34构建的双特异性抗体及抗体偶联药物具有良好的抗肿瘤活性，值得一提的是其对于耐药肿瘤也具有很好的疗效。本发明在肿瘤治疗领域有极大的临床应用潜力。
附图说明
图1为酶联免疫吸附（ELISA）法鉴定自制的cetu抗体和pani抗体的活性。
图2为酶联免疫吸附（ELISA）法检测嵌合抗体10C1与AXL-his的结合。
图3为酶联免疫吸附（ELISA）法检测嵌合抗体10C1阻断配体GAS6与AXL结合的活性。
图4为流式细胞术（FACS）检测不同浓度嵌合抗体10C1与肿瘤细胞系Calu-1的结合。
图5为流式细胞术（FACS）检测嵌合抗体10C1阻断配体GAS6与肿瘤细胞Calu-1（表面的AXL）结合的活性。
图6为酶联免疫吸附（ELISA）法检测嵌合抗体10C1与不同种属（人、猴及鼠）AXL结合的活性。
图7为酶联免疫吸附（ELISA）法筛选10C1人源化候选分子。Xi表示10C1嵌合抗体，34、35、44、45、54、55为6个10C1人源化候选分子。
图8为以流式细胞术（FACS）比较优选的人源化分子10C1-34与其母本抗体10C1结合肿瘤细胞U251的活性。
图9为以流式细胞术（FACS）检测双特异性抗体分子BSG04、BSG0402以及单特异性抗体10C1-34和cetuximab、panitumumab结合U251细胞的活性。A为10C1-34、panitumumab（图中简写为Pani）和BSG0402分子在同一次实验中的检测结果；B为10C1-34、cetuximab（图中简写为cetu）和BSG04在同一次实验中的检测结果。
图10为以流式细胞术（FACS）检测10C1-34、BSG0402、panitumumab（图中简写为Pani）被U251细胞内吞的活性。
图11为检测各种双特异性抗体分子介导细胞毒杀伤（ADCC）的活性。
图12为高效液相色谱（HPLC）检测ADC药物BSG04D偶联后的纯度。
图13为质谱分析BSG04D的DAR值。
图14为小鼠体内肺癌移植瘤模型H1975中检测BSG04D的药效结果。
图15为小鼠体内三代酪氨酸蛋白激酶抑制剂耐药性肺癌移植瘤模型中检测BSG0402AF和BSG04D的药效结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、AXL胞外段融合蛋白的制备
参考NCBI数据库，序列号NP_068713.2（2023-12-4版），AXL蛋白全长包含894个氨基酸，成熟后的功能蛋白不包含第1-25位氨基酸，其作为信号肽被切割去除；第26-451位氨基酸形成胞外段（extracellular domain，ECD），即AXL-ECD序列如NP_068713.2（2023-12-4版）的第26-451位氨基酸序列所示。
从供应商北京义翘神州科技股份有限公司获得包含人AXL全长基因（NM_021913.3）的质粒，货号HG10279-UT。
设计寡核苷酸引物如表1所示。
为了扩增获得编码AXL-hFc、AXL-mFc和AXL-His融合蛋白（其中AXL为其胞外段部分）的基因，分别采用相应的引物对（表1），以包含人AXL全长基因（NM_021913.3）的质粒（北京义翘神州科技股份有限公司，货号HG10279-UT）为模板，使用PCR试剂盒2×Hieff Canace® PCR Master Mix高保真酶预混液（翌圣生物，10136ES），按说明书进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段（即编码基因）进行琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖为北京索莱宝生物科技有限公司产品），用1×TAE缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司产品）按重量体积比，配制成1%（即1g/100ml）浓度的琼脂糖，融化，在胶盒上凝固后，在电泳槽内上样，通电（恒定电压，140V），跑胶。收取正确大小的DNA片段，并用胶回收试剂盒（OMEGA）回收纯化DNA。
载体pHr-hG1Fc（也称pHr-Fc载体）和pHr-mG2aFc（也称pHr-mFc载体）是在载体pHR'CMV GFP（来源于Addgene, Plasmid#14858）基础上改造获得的。载体pHr-Fc，具体为：用核酸序列是SEQ ID No.17所示的目的DNA分子替换载体pHR'CMV GFP的KpnI和Not I酶切识别位点之间的小片段，保持载体pHR'CMV GFP上其他核苷酸序列不变即获得重组载体pHr-Fc。其中SEQ ID No.17的第19-75位为信号肽基因，第76-123位为缓冲序列（缓冲序列的两端带有BsmBI酶切识别位点），第124-819位为人IgG1恒定区(CH2+CH3)。载体pHr-mFc的改造与之类似，用核酸序列是SEQ ID No.18所示的目的DNA分子替换载体pHR'CMV GFP的KpnI和Not I酶切识别位点之间的小片段，保持载体pHR'CMV GFP上其他核苷酸序列不变即获得重组载体pHr-mFc。SEQ ID No.18的第19-75位为信号肽基因，第76-123位为缓冲序列（缓冲序列的两端带有BsmBI酶切识别位点），第124-822位为鼠IgG2a恒定区(CH2+CH3)。
为了将经上述PCR获得的AXL-hFc、AXL-mFc和AXL-His编码基因（其中AXL为其胞外段部分）片段分别克隆到pHr-Fc和pHr-mFc载体，则需以BsmBI限制性内切酶在pHr-Fc载体和pHr-mFc载体的多克隆位点进行消化，从而获得线性载体。目的DNA片段（AXL-hFc或AXL-mFc或AXL-His编码基因）两端带有与载体同源的一段（约30个nt）核苷酸序列，将此延长的基因与线性载体一起转化Transblue（全式金）DH5α细胞（索莱宝生物产品），挑取转化子菌落，进行培养和质粒提取并测序，就可以获得正确连接入载体的表达质粒，命名为pHr-AXL-Fc、pHr-AXL-mFc和pHr-AXL-His。
重组载体pHr-AXL-Fc的结构描述：将pHr-Fc载体的两个BsmBI酶切位点之间的小片段替换为SEQ ID No.19所示DNA片段后得到的重组质粒。表达获得的蛋白融合了人IgG1的Fc区段，其全长序列如SEQ ID No.20所示。其中，第1-424位氨基酸代表AXL的胞外区段，第425-656位氨基酸代表了人Fc区段。
重组载体pHr-AXL-mFc的结构描述：将pHr-mFc载体的两个BsmBI酶切位点之间的小片段替换为SEQ ID No.19所示DNA片段后得到的重组质粒。表达获得的蛋白融合了鼠IgG2a（mG2a）的Fc区段，其全长序列如SEQ ID No.21所示。其中，第1-424位氨基酸代表AXL的胞外区段，第425-657位氨基酸代表了鼠Fc区段。
重组载体pHr-AXL-His的结构描述：将pHr-Fc载体的两个BsmBI酶切位点之间的小片段替换为SEQ ID No.22所示DNA片段后得到的重组质粒。该序列的第1-1272位为AXL胞外段编码序列，第1273-1296位编码了9个组氨酸，便于使用镍螯合凝胶纯化蛋白，最后的三联体密码子TAA为终止密码子。所获得AXL-His的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。
用制备好的pHr-AXL-Fc、pHr-AXL-mFc和pHr-AXL-His表达质粒分别转染293F细胞，进行目的蛋白的生产和纯化。具体地，以100μg pHR表达质粒（即pHr-AXL-Fc、pHr-AXL-mFc或pHr-AXL-His载体）与转染试剂PEI混合后静置30min，加入到293F细胞培养基中。37℃，5%二氧化碳震荡培养24小时，加入补料A（珠海凯瑞，货号K40001），继续震荡培养3天。12000rpm离心培养液30分钟，收集上清待用。对于连接Fc或mFc标签的融合蛋白，加入1mlProteinA凝胶填料（博格隆，AA402305），室温下震荡（145rpm）孵育1-3小时后，使其流过重力层析柱，收集流出液冻存以备复测。以5ml PBS淋洗柱料，让洗液缓慢流过凝胶柱。加入3ml甘氨酸洗脱液（pH3.2），洗脱捕获的蛋白。对于连接His标签的融合蛋白，加入到PBS平衡后的HIS-excel预装柱（GE，17-3712-05）中过柱，用PBS-10咪唑（配方：137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，10mM咪唑）清洗杂蛋白后用PBS-250咪唑缓冲液（配方：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，250mM咪唑）洗脱并收集目的蛋白。
所有的洗脱物均以超滤浓缩离心管（Millipore）离心（3800×g，离心时间一般为20分钟），置换到无菌无热源的PBS中。然后用Nanodrop检测其在280nm波长的紫外光吸收，并除以其消光系数，得到浓度值。
实施例2、脾细胞融合制备杂交瘤并筛选抗AXL单克隆抗体
一、小鼠免疫
选取6-8周龄、20克左右的雌性BALB/c、SJL小鼠各10只。第一次免疫时采用弗氏完全佐剂，采用AXL-mFc与AXL-His抗原（实施例1制备）分别各免疫5只BALB/c、SJL小鼠。抗原与免疫佐剂等体积混合，用5mL注射器通过三通旋塞（艾贝尔，PS-3002）反复推注混匀，50μg（以抗原量计，下同）/只皮下多点注射。间隔两周后采用弗氏不完全佐剂，30μg/只，连续免疫两次。最后一次免疫7天后剪尾采全血20μl， 12000g离心2分钟，吸取上清转移至PCR管中用于效价检测。
二、ELISA法检测小鼠免疫效价
以1% BSA（w/v，溶于PBST(0.05% 吐温20)，以下同））稀释血清，最大浓度为1:500，以5倍倍比稀释，得到7个不同稀释度的步骤一采集的小鼠血清溶液。将稀释完毕的血清溶液加入到AXL-His蛋白（实施例1制备所得，2μg/ml，50μl/孔）包被的ELISA板孔内，50μl/孔。37℃孵育1h。弃上清，清洗板孔，300μl/孔PBST，洗5次。拍干ELISA板，加入二抗。二抗为HRP-山羊抗鼠IgG（Jackson immunoresearch，货号#115-035-062）。以1% BSA稀释20000倍。37℃孵育1h。弃上清，清洗板孔，300μl/孔PBST，洗5次。在吸水纸上拍干ELISA板，加入50μl显色液，在37℃或室温显色2min。加入50μl/孔终止液（即用型，solarbio），读取OD450。以每孔信号值除以0浓度点的信号背景，得到因子F，F大于2.1则该孔视为显著阳性。阳性孔稀释倍数最大者记为该动物的血清效价。
三、细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化
1、杂交瘤制备
收集对数生长的丰度为85% sp2/0细胞于50ml PBS中，1000rpm离心5min，用20mlBTX融合缓冲液（BTX，货号47-0001）重悬细胞，1700rpm离心7min，弃上清后再用20ml BTX融合缓冲液重悬细胞，计数后1700rpm离心7min，弃上清，用2ml BTX融合缓冲液重悬细胞待用。脱颈处死AXL抗原免疫的小鼠（步骤一），75%酒精浸泡5min，用无菌眼科剪和镊子分别取出小鼠脾脏，去除脾脏周边结缔组织。在200目不锈钢细胞筛上（PBS浸没滤网）用5ml注射器推头研磨脾脏，并用PBS冲洗掉残留在滤网和注射器推头上的脾细胞，过40μm细胞筛至50ml刻度离心管中，1700rpm，离心7min。用20ml BTX融合缓冲液重悬细胞，计数后1700rpm离心7min，弃上清后再用20ml BTX融合缓冲液重悬细胞，1700rpm离心7min，弃上清，用2ml BTX融合缓冲液重悬脾细胞待用。sp2/0细胞与脾细胞按1：2比例混合，按2×107个细胞/ml浓度重悬细胞于BTX融合缓冲液中。取1mL混合细胞悬液于3mm融合电极中，使用BEX电融合仪按Start健开始融合。融合结束30s后即可转入完全培养基中（配方：PRIM1640培养基、Gibco10% FBS、1×PS、1×HAT），静置10min后分装至96孔细胞培养板，放置于5% CO2、37℃孵育箱中培养。
BEX融合仪的融合参数设置如下：
AC:50V；AC Time:30S；DC:800V
DC on time:20μS；DC off time:0.5S；DC cycle:1
Post time:7S；Fade:on；Decay:0%
2、AXL结合阳性杂交瘤的筛选
用PBS稀释AXL-His蛋白（实施例1制备）至2μg/ml，以50μl/孔加入ELISA板中，于37℃孵育箱中孵育2小时或4℃冰箱孵育过夜。把经Axl-His蛋白包被的ELISA板取出，逐板放入型号为PW960的96孔洗板机，调整洗板机参数：清洗次数1次，洗液体积300μl/孔，单板依次清洗。用0.05% PBST（PBS为北京索莱宝生物科技有限公司产品，货号P1010，每包装干粉溶于2L纯水后，加入1ml吐温20，即为PBST）溶解的5%（w/v）脱脂奶粉以200μl/孔封闭ELISA板，于37℃孵育箱中孵育2小时或4℃冰箱过夜。将封闭完成的蛋白ELISA板中的封闭液倒掉。向汇松PW960型号的96孔洗板机洗液瓶中加入适量PBST缓冲液，调整洗板机参数：清洗次数1次，洗液体积300μl/孔，单板依次清洗。把制备好的Axl-His蛋白包被的96孔ELISA板放置于-80℃冰箱中保存。
待杂交瘤（步骤1制得）培养至第七天，将冻存于-80℃冰箱中的经Axl-His蛋白包被的96孔ELISA板取出，于37℃孵育箱中预热10min，使用300μl的12通道移液器吸取50μl的96孔细胞培养板中的杂交瘤上清，加入经Axl-His蛋白包被的96孔ELISA板中，H11孔位加入1% BSA作为阴性对照，H12孔位中加入50μl的浓度为0.5μg/ml的10G5-mIgG2a抗体（专利申请公布号：CN 109311997 A，参考该专利中公开的10G5抗体的序列，重组制备了嵌合抗体，重链可变区+鼠IgG2a铰链区恒定区，轻链可变区+鼠kappa恒定区）作为阳性对照，共转移40块细胞培养板杂交瘤细胞上清于经Axl-His蛋白包被的ELISA板中，放置ELISA板于37℃孵育1h。弃掉ELISA中的杂交瘤上清，设置洗板机参数：清洗次数5次，洗液体积300μl/孔，单板依次清洗。清洗完毕后加入HRP偶联的1：10000稀释的兔抗鼠二抗（JacksonimmunoResearch，货号#115-035-062）50μl，37℃孵育1h。使用汇松PW960型号的96孔洗板机进行清洗，设置洗板机参数：清洗次数5次，洗液体积300μl/孔，单板依次清洗。将洗完的ELISA板于硬纸巾上拍干，以50μl/孔加入TMB单组份显色液，放置37℃孵育箱中3-10min，注意不要过度显色。以50μl/孔向显色完成的ELISA板中加入ELISA终止液。把ELISA板放入thermo scientific酶标仪（Multiskan）中，读取450nm光吸收值，
以5μg/mL的浓度包被GAS6-His（北京百普赛斯，GA6-H5246 ）50μl，然后加入50μl待检杂交瘤细胞培养上清和50μl AXL-mFc（实施例1制备所得，2μg/ml）并吹打混匀，同时设立阴性（PBS）、阳性对照孔（10G5-mIgG2a，浓度为20μg/mL）。37℃孵育1h；洗涤后加anti-mouse-IgG-HRP酶标二抗，每孔50μl，37℃孵育1h；洗涤后加底物液TMB 50μl，37℃显色2-15min，50μl浓度为2mol/L的H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450nm值。筛得一个阻断效率较高的杂交瘤细胞株：10C1。采用有限稀释法对10C1进行亚克隆，最终获得单克隆化的具备结合和阻断活性的克隆株10C1。
3、10C1亚克隆及测序
把初筛阳性的10C1杂交瘤以有限稀释法进行亚克隆，以便获得阳性单克隆细胞株。具体的做法是，吸取阳性板孔内的细胞，并以完全培养基稀释至150个细胞/20ml，然后将此细胞悬液分装至96孔培养板，每孔200μl，则平均每孔有1.5个细胞，在培养箱内培养7天后，进行细胞ELISA筛选，获得具有结合活性的单克隆化的10C1克隆，挑选阳性孔进行扩大培养，扩大至T75瓶后，收获1×107个细胞，进行裂解和RNA提取（按试剂盒说明进行，天根生物，货号DP430）。以RNA为模板，按试剂盒说明书（赛默飞世尔，货号4387406）进行cDNA合成，合成体系为20μl。然后以cDNA为模板，扩增抗体可变区编码DNA。扩增抗体编码DNA所用的引物如表2所示。反应体系如表3和表4所示。
注：表中简并碱基为本领域公知通用含义，I为次黄嘌呤。
扩增程序是：98℃ 3min；98℃ 10s，55℃ 20s，72℃ 30s，20个循环。
测序结果使用在线工具IMGT-V-QUEST分析，确定其克隆号为10C1的阳性单克隆抗体可变区编码序列如下：
10C1 VH（重链可变区核苷酸序列）
CAAGTCCAGTTGCAGCAATCCGGCGCCGAACTCGCTAGACCGGGAGCTTCTGTGAAGCTGAGCTGTAAGGCATCCGGCTACACATTCACATCTTACGGCATCTCATGGGTAAAGCAGAGAACAGGACAAGGACTCGAGTGGATTGGTGAGATATATCCGAGGTCCGGAAACGCCTACTACAACGAAAAGTTCAAGGGAAAAGCCACATTGACGGCCGACAAATCCAGTTCCACCGCATATATGGAGCTGAGGTCACTGACTAGTGAAGATTCAGCTGTCTACTTTTGCGCTAGTCCACTGTTCGACTATTGGGGGCAAGGCACCACCCTGACAGTCTCCAGT（SEQ ID No.57）
10C1 VL（轻链可变区核苷酸序列）
GACGTCGTTATGACTCAAACCCCTCTTACCCTGTCTGTAACCATTGGACAGCCGGCTTCCATCTCATGTAAAAGCTCACAATCACTCTTGGACAGCGACGGAAAGACCTATCTGAACTGGCTTTTGCAGCGCCCAGGACAAAGCCCCAAGAGACTCATCTACCTGGTGTCTAAGCTTGACAGTGGAGTGCCTGACAGATTCACCGGTTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTGAAGATTTCCCGGGTTGAAGCAGAAGACCTGGGTGTTTACTACTGCTGGCAAGGTACCCACTTTCCGCAGACTTTTGGTGGAGGAACAAAGCTGGAGATAAAG（SEQ ID No.58）
翻译为氨基酸序列即：
10C1
>VH（重链可变区氨基酸序列）
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGNAYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCASPLFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID No.59）
>VL（轻链可变区氨基酸序列）
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK（SEQ ID No.60）
实施例3、嵌合抗体的制备及其活性分析
一、嵌合抗体的制备
根据实施例2中的鼠单克隆抗体10C1的重链可变区的氨基酸序列，设计了核苷酸序列为SEQ ID No.61的DNA分子（进行了密码子优化，采用宿主细胞293F偏好的密码子）替换载体pHr-IgG1的BsmBI酶切识别位点之间的片段（包含BsmBI酶切识别位点在内的小片段）获得重组表达载体pHr-IgG1-10C1，重组表达载体pHr-IgG1-10C1可表达嵌合抗体10C1的重链。
根据实施例2中的鼠单克隆抗体10C1的轻链可变区的氨基酸序列，设计了编码核苷酸序列，该核苷酸序列即是SEQ ID No.62的DNA分子（进行了密码子优化，采用宿主细胞293F偏好的密码子），用此DNA序列替换载体pHr-Kappa的BsmBI酶切识别位点之间的片段（包含BsmBI酶切识别位点在内的小片段）获得重组表达载体pHr -Kappa-10C1，重组表达载体pHr-Kappa-10C1可表达嵌合抗体10C1的轻链。
载体pHr-IgG1和pHr-Kappa是在载体pHR'CMV GFP（来源于Addgene, Plasmid#14858）基础上改造获得的，以载体pHr-IgG1为例，具体为：用核酸序列是SEQ ID No.63所示的目的DNA分子替换载体pHR'CMV GFP的KpnI和Not I酶切识别位点之间的小片段，保持载体pHR'CMV GFP上其他核苷酸序列不变即获得重组载体pHr-IgG1。其中SEQ ID No.63第19-75位为信号肽基因，第76-123位为缓冲序列（缓冲序列的两端带有BsmBI酶切识别位点），第124-1116位为人IgG1恒定区(CH1+junction+CH2+CH3)。
载体pHr-Kappa的构建参照pHr-IgG1，其区别仅在于将目的DNA替换为SEQ ID No.64所示的DNA片段。其中SEQ ID No.64第19-84位为信号肽基因，第85-132位为缓冲序列（缓冲序列的两端为BsmBI酶切识别位点），第133-456位为人Kappa恒定区(Constant Kappa)。
将嵌合抗体的重链表达质粒pHr-IgG1-10C1和轻链表达质粒pHr-Kappa-10C1以1.5:1的比例，共同转染293F细胞。
经转染293F细胞，进行目的蛋白的生产，亲和纯化后获得10C1嵌合抗体蛋白。
为了方便构建双特异性抗体，并与EGFR单克隆抗体进行比较，参考临床应用的抗体cetuximab和panitumumab，进行了分子构建和重组抗体的表达。根据PDB数据库记载，二者的可变区序列分别如下：
Cetuximab（PDB accession no. 5T1M）：
>重链可变区：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID No.65）
>轻链可变区：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK（SEQ ID No.66）
Panitumumab（PDB accession no. 5SX5 ）：
>重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS（SEQ ID No.67）
>轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK（SEQ ID No.68）
按照以上可变区的氨基酸序列，合成了其编码DNA序列如下：
cetuximab
>重链可变区编码DNA
CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGTCCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCTCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGTCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACACCTTTCACCAGCAGGCTGTCCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCC（SEQ ID No.69）
>轻链可变区编码DNA
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCAGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGGGTGAGCTTCTCCTGTCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACAAACGGCTCCCCAAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCTAGCAGGTTCTCCGGCAGCGGCAGCGGCACTGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG（SEQ ID No.70）
panitumumab：
>重链可变区编码DNA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCGACTACTACTGGACCTGGATCAGGCAGAGCCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCACATCTACTACTCCGGCAACACCAACTACAACCCCTCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCAGCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCATCTACTACTGCGTGAGAGACAGAGTGACAGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGTCCAGC（SEQ ID No.71）
>轻链可变区编码DNA
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGAGACCGGCGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCTCTCTGCAGCCTGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCACTTCGATCACCTGCCTCTGGCCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG（SEQ ID No.72）
按照本实施例前文所述嵌合抗体构建的方法，将cetuximab和panitumumab的重、轻链可变区编码DNA分别克隆构建到pHr-IgG1和pHr-Kappa载体上，并按照所述的转染方法转染293F细胞，获得重组的抗体，则这两种抗体分别为cetuximab和panitumumab类似物（biosimilar），为了方便表述，在本案中称之为cetuximab、panitumumab或cetu（cetuximab-biosimilar的简写）、pani（panitumumab-biosimilar的简写）。
采用ELISA法鉴定自制的cetu和pani抗体的活性。具体操作如下：
用包被液（即PBS）把EGFR-His（近岸蛋白，货号CI61）和AXL-His蛋白（实施例1制备）分别稀释到2μg/mL，50μL/孔分别加入到酶标板孔中，37℃孵育2小时。弃去孔内的液体，用洗板机，PBST洗涤液洗1次（300μl/次）。每孔加200μL封闭液4℃过夜。弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液洗2次（300μl/次）。每孔加入50μL的自制的cetu或pani抗体，初始浓度为20μg/mL，连续5倍倍比稀释7个梯度，同时设置空白对照；37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液洗5次（200μl/次）。每孔加入50μL的Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody（1:10000稀释）的第二抗体，37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液洗5次（200μl/次）。加显色液50μL/孔，37℃孵育15min。加入50μL/孔浓度为2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值。用GraphPad Prism 8 软件作图，结果如图1所示。由图可见cetu和pani抗体均可以很好的结合EGFR-His包被的板孔，且其结合曲线呈现浓度依赖性，但这两个抗体不结合AXL-His，证实自制cetu和pani抗体特异结合EGFR。
二、ELISA-结合活性分析
用包被液把AXL-His蛋白（实施例1制备）稀释到2μg/mL，50μL/孔加入到酶标板孔中，37℃孵育2小时。弃去孔内的液体，用洗板机，PBST洗涤液300μl/次洗1次。每孔加200μL封闭液4℃过夜。弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液300μl/次洗2次。每孔加入50μL的步骤一制备的10C1嵌合抗体，初始浓度为20μg/mL，连续5倍倍比稀释7个梯度，同时设置空白对照；37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。每孔加入50μL的Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody（1:10000稀释）的第二抗体，37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。加显色液50μL/孔，37℃孵育15min。加入50μL/孔浓度为2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值。用GraphPadPrism 8软件作图，结果如图2所示。由图可见10C1嵌合抗体可以较好的结合包被的AXL-His抗原，极低的EC50值表明其活性高。
三、ELISA-阻断活性分析
用50μl浓度为2μg/ml的AXL-hFc（实施例1制备）包被ELISA板，37℃，孵育1h。弃上清，清洗板孔，300μl/孔PBST洗1次。加入300μl的5%脱脂牛奶，37℃孵育1h。弃上清，300μl/孔PBST洗1次。以1% BSA（v/w，溶于PBST(0.05% TW20)）稀释步骤一制备的10C1嵌合抗体，最大浓度为20μg/ml，以5倍倍比稀释，连续稀释7次。将稀释完毕的抗体工作液加入ELISA板孔内，25μl/孔。取2μg/ml的GAS6-his 25μl加入板孔中，轻拍混匀，37℃孵育2h。弃上清，用200μl/孔PBST清洗板孔5次。加入1：5000稀释的Anti-his二抗，50μl/孔，37℃孵育1h。弃上清，用200μl/孔PBST清洗板孔5次。加入50μl显色液，在37℃或室温显色6min，加入50μL/孔浓度为2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值。用GraphPad Prism8软件作图，结果如图3所示。由图可见10C1嵌合抗体可以较好的阻断AXL与其配体GAS6的结合。
四、FACS-结合活性比较
以1% BSA（v/w，溶于PBST(0.05% TW20)）稀释步骤一制备的10C1嵌合抗体，最大浓度为20μg/ml，以5倍倍比稀释，连续稀释7次。Calu-1细胞（人肺癌细胞，公共数据库显示该细胞株是AXL高表达细胞株。链接：https://www.proteinatlas.org/ENSG00000167601-AXL/cell+line）计数，每孔加入3×105细胞，PBS洗两次，弃掉上清后加入50μl倍比稀释的抗体，4℃孵育1h；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，用PBS洗液200μl/孔洗2次。每孔加入50μL的FITC-anti-Human-IgG-Fc-Secondary-Antibody（1:200稀释）的第二抗体，4℃孵育60min；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，PBS洗液，用PBS洗液200μl/孔洗2次，加入PBS洗液200μL/孔，重悬细胞，流式细胞仪读数。用Graph Pad Prism 8 分析软件作图，结果如图4所示。由图可见10C1嵌合抗体可以较好的结合AXL高表达的Calu-1细胞。
五、FACS阻断活性比较
以1% BSA（v/w，溶于PBST(0.05% TW20)）稀释步骤一制备的10C1嵌合抗体，最大浓度为40μg/ml，以5倍倍比稀释，连续稀释7次。Calu-1细胞计数，每孔加入3×105细胞，PBS洗两次后加入25μL GAS6-his（浓度为2μg/mL）、加入25μL倍比稀释的10C1嵌合抗体。4℃孵育60min；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，PBS洗液，200μl/次洗2次。每孔加入50μL的6×His-Monoclonal-Antibody FITC（1:100稀释）的第二抗体，4℃孵育60min；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，PBS洗液，200μl/次洗2次，1000rpm离心2min；加入200μL/孔PBS液，重悬细胞，流式细胞仪读数。以平均荧光信号强度为纵坐标，抗体浓度（ng/ml数值的log10）为横坐标，分析结果如图5所示。可以看出10C1嵌合抗体可以有效阻断GAS6与Calu-1细胞的结合，而Calu-1细胞是高表达AXL受体的细胞株。10C1-34阻断活性以IC50表征，其数值为38.57ng/ml。
六、物种交叉实验
小鼠AXL，即mAXL-His（义翘神州，50126-M08H）、猴AXL即cynoAXL-His（ACRO，AXL-C52H3）和人AXL-His蛋白（实施例1制备）分别用包被液稀释到2μg/mL，包被50μL/孔量加入酶标板孔中，37℃孵育2小时。弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。每孔加200μL封闭液4℃过夜。弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。每孔加入50μL的步骤一制备的10C1嵌合抗体稀释液（以1% BSA稀释），浓度为20μg/mL，5倍稀释，7个梯度的抗体，同时设置空白对照；37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。每孔加入辣根过氧化物标记的抗人IgG二抗（Jackson immunoresearch，货号#109-035-190）工作液（即以1% BSA溶液将抗体稀释20000倍）50μL，37℃孵育60min；弃去孔内的液体，用洗板机，洗涤液200μl/次洗5次。加显色液50μL/孔，37℃孵育15min。加入50μL/孔浓度为2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值。以OD450值为纵坐标，浓度值（ng/ml）的Log10为横坐标，制作曲线，如图6所示。由图可知，10C1嵌合抗体可以较好的识别人和猴AXL蛋白，且亲和力相当，其EC50值无差异，但10C1嵌合抗体不结合鼠AXL。
实施例4、10C1单抗人源化改造和筛选
一、10C1单抗人源化改造
采用CDR移植的方法，设计了如表5中所示的候选序列，其中10C1的重链可变区人源化候选序列有3种，分别命名为H3、H4和H5；轻链可变区人源化的序列有2种，分别命名为L4和L5。两种人源化两两组合，获得6种人源化抗体，其组合和相应的命名如表6所示。
由供应商上海生工合成以下DNA作为10C1人源化重链和轻链可变区编码基因：
10C1-H3可变区编码基因
CAGGTGCAGCTCGTACAATCAGGCGCAGAGGTAAAAAAACCAGGAGCGAGCGTTAAAGTTTCCTGTAAAGCCAGCGGGTACACCTTTACTTCTTACGGGATAAGCTGGGTAAAGCAGGCACCAGGGCAAGGCCTCGAATGGATAGGGGAAATTTACCCACGGAGTGGAAACGCATATTACAATGAGAAGTTCAAGGGGAAGGCAACCTTGACCGCAGACAAGTCCACCTCTACGGCTTACATGGAGCTCAGATCTCTGAGGAGTGATGACACCGCGGTGTACTTCTGCGCGTCACCACTTTTTGACTACTGGGGGCAAGGCACTTTGGTTACTGTCAGCTCA（SEQ ID No.9）
10C1-H4可变区编码基因
CAGGTGCAGCTCGTACAATCAGGCGCAGAGGTAAAAAAACCAGGAGCGAGCGTTAAAGTTTCCTGTAAAGCCAGCGGGTACACCTTTACTTCTTACGGGATAAGCTGGGTAAAGCAGGCACCAGGGCAAGGCCTCGAATGGATAGGGGAAATTTACCCACGGAGTGGAAACGCATATTACAATGAGAAGTTCAAGGGGAAGGCAACCTTGACCGCAGACACTTCCACCTCTACGGCTTACATGGAGCTCAGATCTCTGAGGAGTGATGACACCGCGGTGTACTACTGCGCGTCACCACTTTTTGACTACTGGGGGCAAGGCACTTTGGTTACTGTCAGCTCA（SEQ ID No.76）
10C1-H5可变区编码基因
CAAGTCCAATTGGTTCAATCCGGTGCAGAAGTCAAAAAACCAGGGGCCAGCGTGAAAGTGAGTTGCAAGGCATCCGGGTACACATTTACCAGCTATGGGATTAGTTGGGTGCGGCAGGCACCTGGTCAGGGACTGGAATGGATGGGAGAGATCTACCCCCGGAGTGGCAATGCCTATTACAACGAGAAGTTTAAGGGTCGCGTGACGATGACCACTGATACCTCAACGAGCACCGCATATATGGAGCTGAGGAGCCTCAGATCCGACGATACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGCCCCCTGTTTGACTACTGGGGACAGGGCACACTGGTAACCGTTTCCAGT（SEQ ID No.77）
10C1-L4可变区编码基因
GACGTTGTTATGACACAAAGCCCCCTTTCCCTCCCTGTCACCCTTGGCCAGCCAGCCAGTATTTCTTGCAAGAGCAGCCAGAGTCTGCTTGACTCCGATGGAAAAACATACCTGAACTGGCTGCAGCAACGACCTGGTCAAAGTCCCAAGCGGCTCATATATCTCGTGTCTAAGCTGGACTCCGGTGTTCCTGATAGATTTTCCGGCTCTGGTTCCGGCACCGACTTTACACTCAAAATCTCCCGGGTCGAAGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTGGCAGGGGACTCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGAGGCACTAAAGTCGAGATCAAA（SEQ ID No.10）
10C1-L5可变区编码基因
GACGTTGTTATGACACAAAGCCCCCTTTCCCTCCCTGTCACCCTTGGCCAGCCAGCCAGTATTTCTTGCAAGAGCAGCCAGAGTCTGCTTGACTCCGATGGAAAAACATACCTGAACTGGTTCCAGCAACGACCTGGTCAAAGTCCCCGACGGCTCATATATCTCGTGTCTAAGCTGGACTCCGGTGTTCCTGATAGATTTTCCGGCTCTGGTTCCGGCACCGACTTTACACTCAAAATCTCCCGGGTCGAAGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTGGCAGGGGACTCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGAGGCACTAAAGTCGAGATCAAA（SEQ ID No.78）
按实施例3所述，将人源化的重链和轻链可变区基因分别连接构建至pHr-IgG1载体和pHr-Kappa载体，获得pHr-IgG1-H3/4/5，pHr-Kappa-L4/5重组质粒。同样如实施例3所述，将重链和轻链质粒两两组合共同转染293F细胞进行目的蛋白的生产，亲和纯化后获得10C1人源化抗体蛋白：10C1-34/35/44/45/54/55（重链编号+轻链编号）。
依实施例3所述，制备AXL-His蛋白（实施例1制备所得）包被的酶联免疫吸附（ELISA）检测板，并按实施例3所述的方法，稀释6种人源化抗体，并与此AXL-His蛋白ELISA板进行反应。在酶标仪上读取450nm波长的光吸收值，即OD450值，以纵坐标标示OD450值，用横坐标标示抗体浓度（Log10，ng/ml），则可以表征抗体结合抗原AXL-His蛋白的强弱，用GraphPad Prism8软件作图，结果如图7。可以看到10C1-34其结合AXL-His蛋白的EC50值最小，活性最优。
二、FACS检测人源化抗体10C1-34的结合活性
以1% BSA（v/w，溶于PBST(0.05% TW20)）分别稀释人源化抗体10C1-34（步骤一）、10C1嵌合抗体（实施例3），最大浓度为20μg/ml，以5倍倍比稀释，连续稀释7次。U251细胞（人胶质瘤细胞，已知U251是AXL高表达细胞株(doi: 10.1007/s43188-023-00195-z.eCollection 2023 Oct)）计数，每孔加入3×105个细胞，PBS洗两次，弃掉上清后加入50μl倍比稀释的抗体，4℃孵育1h；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，用PBS洗液200μl/孔洗2次。每孔加入50μL的FITC-anti-Human-IgG-Fc-Secondary-Antibody（1:200稀释）的第二抗体，4℃孵育60min；1000rpm离心2min,弃去孔内的液体，PBS洗液，用PBS洗液200μl/孔洗2次，加入PBS洗液200μL/孔，重悬细胞，流式细胞仪读数。用GraphPad Prism8软件作图，如图8所示。由图可见人源化10C1-34抗体分子与结合AXL高表达细胞株U251的活性与母本抗体10C1相比，没有变化，很好的保持了活性。
实施例5、EGFR/AXL双特异抗体的构建、表达和纯化
采用抗EGFR单抗Cetuximab（简称cetu，参见实施例3）、Panitumumab（简称pani，参见实施例3）及抗AXL单抗10C1-34的可变区序列，构建scFab形式的双抗，针对不同靶点的抗体臂（arm）采用Knob-into-Hole方式自动异二聚化，形成的抗体包含两条肽链，能够同时结合EGFR和AXL。在上海生工合成Cetuximab、Panitumumab抗体可变区编码基因，编码基因的上下游分别包含KpnI和Not I酶切位点。使用翌圣生物的内切酶，按说明书，对pHr-IgG1载体（参见实施例3）进行KpnI（识别序列GGTACC，上海翌圣生物，货号15015ES70）和Not I（识别序列GCGGCCGC，上海翌圣生物，货号15021ES50）双酶切制备带有相应末端的线性载体。使用T4连接酶（上海翌圣生物，货号10300ES80），按说明书连接基因和载体，获得scFab形式的双抗表达载体pHr-IgG1-cetu-knob、pHr-IgG1-pani-knob，pHr-IgG1-10C1-34-Hole，测序验证后提取质粒。
组成双抗的scFab-hG1的全序列如下：
scFab-cetu-hG1：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID No.1）
SEQ ID No.1的第1-107位为EGFR单抗cetu的轻链可变区，第108-214位为轻链恒定区（人Kappa恒定区），第215-244位为linker，第245-363位为EGFR单抗cetu的重链可变区，第364-461为重链恒定区CH1，第462-476位为铰链区，第477-586位为重链恒定区CH2，第587-693位为重链恒定区CH3。
scFab-pani-hG1：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID No.2）
SEQ ID No.2的第1-107位为EGFR单抗pani的轻链可变区，第108-214位为轻链恒定区（人Kappa恒定区），第215-244位为linker，第245-363位为EGFR单抗pani的重链可变区，第364-461为重链恒定区CH1，第462-476位为铰链区，第477-586位为重链恒定区CH2，第587-693位为重链恒定区CH3。
ScFab-10C1-34-hG1：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVKQAPGQGLEWIGEIYPRSGNAYYNEKFKGKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCASPLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID No.3）
SEQ ID No.3的第1-112位为抗AXL的人源化抗体10C1-34的轻链可变区，第113-219位为轻链恒定区（人Kappa恒定区），第220-249位为linker，第250-363位为抗AXL的人源化抗体10C1-34的重链可变区，第364-461为重链恒定区CH1，第462-476位为铰链区，第477-586位为重链恒定区CH2，第587-693位为重链恒定区CH3。
组成双抗的scFab-hG1的编码基因序列如下：
scFab-cetu-hG1：
GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCAGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGGGTGAGCTTCTCCTGTCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACAAACGGCTCCCCAAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCTAGCAGGTTCTCCGGCAGCGGCAGCGGCACTGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGAGGACAGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCAAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACTAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGCGGCGGCGGGGGCTCTGGCGGCGGCGGGAGCGGCGGCGGGGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGGGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGTCCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCTCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGTCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACACCTTTCACCAGCAGGCTGTCCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA（SEQ ID No.4）
scFab-pani-hG1：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGAGACCGGCGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCTCTCTGCAGCCTGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCACTTCGATCACCTGCCTCTGGCCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACTCCCTGAGCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCTGACTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACAAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGCGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCGGAGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGGGGCAGCGGCGGGGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCGACTACTACTGGACCTGGATCAGGCAGAGCCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCACATCTACTACTCCGGCAACACCAACTACAACCCCTCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCAGCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCATCTACTACTGCGTGAGAGACAGAGTGACAGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA（SEQ ID No.5）
scFab-10C1-34-hG1：
GACGTTGTTATGACACAAAGCCCCCTTTCCCTCCCTGTCACCCTTGGCCAGCCAGCCAGTATTTCTTGCAAGAGCAGCCAGAGTCTGCTTGACTCCGATGGAAAAACATACCTGAACTGGCTGCAGCAACGACCTGGTCAAAGTCCCAAGCGGCTCATATATCTCGTGTCTAAGCTGGACTCCGGTGTTCCTGATAGATTTTCCGGCTCTGGTTCCGGCACCGACTTTACACTCAAAATCTCCCGGGTCGAAGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTGGCAGGGGACTCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGAGGCACTAAAGTCGAGATCAAAAGGACAGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCAAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACTAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGCGGCGGCGGGGGCTCTGGCGGCGGCGGGAGCGGCGGCGGGGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGGGGCGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTCGTACAATCAGGCGCAGAGGTAAAAAAACCAGGAGCGAGCGTTAAAGTTTCCTGTAAAGCCAGCGGGTACACCTTTACTTCTTACGGGATAAGCTGGGTAAAGCAGGCACCAGGGCAAGGCCTCGAATGGATAGGGGAAATTTACCCACGGAGTGGAAACGCATATTACAATGAGAAGTTCAAGGGGAAGGCAACCTTGACCGCAGACAAGTCCACCTCTACGGCTTACATGGAGCTCAGATCTCTGAGGAGTGATGACACCGCGGTGTACTTCTGCGCGTCACCACTTTTTGACTACTGGGGGCAAGGCACTTTGGTTACTGTCAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA（SEQ ID No.6）
构建双抗所用载体组合及相应命名如表7所示。
重组载体pHr-IgG1-cetu-knob的结构描述为：将“SEQ ID No.79（自5’端到3’端依次为Kpn I识别序列、Kozak序列、信号肽序列）+SEQ ID No.4+GCGGCCGC”所示DNA片段经KpnI和Not I双酶切后与同样经过Kpn I和Not I双酶消化的pHr-IgG1载体大片段连接后所得重组质粒。
重组载体pHr-IgG1-pani-knob的结构描述为：将“SEQ ID No.79+SEQ ID No.5+GCGGCCGC”所示DNA片段经Kpn I和Not I双酶切后与同样经过Kpn I和Not I双酶消化的pHr-IgG1载体大片段连接后所得重组质粒。
重组载体pHr-IgG1-10C1-34-Hole的结构描述为：将“SEQ ID No.80（自5’端到3’端依次为Kpn I识别序列、Kozak序列、信号肽序列）+SEQ ID No.6+GCGGCCGC”所示DNA片段经Kpn I和Not I双酶切后与同样经过Kpn I和Not I双酶消化的pHr-IgG1载体大片段连接后所得重组质粒。
用制备好的双抗表达载体按照如表7所示进行两两配对共同转染293F细胞，进行目的蛋白的表达和纯化。具体的，以100μg/种双抗表达载体与转染试剂PEI混合后静置30min，加入到293F细胞培养基中。37℃，5%二氧化碳震荡培养24小时，加入补料A（珠海凯瑞，货号K40001），继续震荡培养3天。12000rpm离心培养液30分钟，收集上清加入1mlProteinA凝胶填料（博格隆AA402305），室温下震荡（145rpm）孵育1-3小时后，使其流过重力层析柱，收集流出液冻存以备复测。以PBS 5ml淋洗柱料，让洗液缓慢流过凝胶柱。加入3ml甘氨酸洗脱液（pH3.2），洗脱捕获的蛋白。所有的洗脱物均以超滤浓缩离心管（Millipore）离心，置换到无菌无热源的PBS中。然后用Nanodrop检测其在280nm波长的紫外光吸收，并除以其消光系数，得到浓度值。
实施例6、EGFR/AXL双靶点抗体活性检测
一、FACS检测EGFR/AXL双抗结合活性
以1% BSA（v/w，溶于PBST(0.05% TW20)）分别稀释抗体cetuximab（实施例3制备）、panitumumab（实施例3制备）、10C1-34、BSG04和BSG0402，最大浓度为20μg/ml，以5倍倍比稀释，连续稀释7次。U251细胞（人胶质瘤细胞）计数，每孔加入3×105个细胞，PBS洗两次，弃掉上清后加入50μl倍比稀释的抗体，4℃孵育1h；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，用PBS洗液200μl/孔洗2次。每孔加入50μL的FITC-anti-Human-IgG-Fc-Secondary-Antibody（1:200稀释）的第二抗体，4℃孵育60min；1000rpm离心2min，弃去孔内的液体，用PBS洗液200μl/孔洗2次，加入PBS洗液200μL/孔，重悬细胞，流式细胞仪读数。用GraphPad Prism8软件作图，结果如图9所示。由分析结果可知，分别与其母本单抗相比较，双抗分子BSG0402（来自单抗序列pani和10C1-34）和BSG04（来自单抗序列cetu和10C1-34）结合U251细胞（同时表达EGFR和AXL的肿瘤细胞株）的荧光信号值较高，结合反应的最大值显著较高，显示结合更优。
二、EGFR/AXL双抗内吞活性的检测
用DMEM完全培养基调整U251细胞密度为3×106个/ml。用多道移液器取100μl加入96孔PCR板孔中。1500rpm离心5min，弃上清。用含1%FBS的DMEM培养基分别连续倍比稀释抗体BSG0402、Panitumumab（实施例3制备）、和10C1-34，抗体起始浓度为20μg/ml，连续稀释7次。取50μl倍比稀释的抗体加入96孔PCR板的孔中，4℃孵育1h。1500rpm 4℃离心5min，弃去上清，取120μl含1%FBS的DMEM培养基重悬细胞，1500rpm再次离心5min，弃去上清。加入CypHer5E (Amersham Biosciences, 货号：PA15401) 标记的1：200稀释的Fab fragmentsof goat anti–human IgG (H+L) 二抗（Jackson Immunoresearch，109-007-003）。放置于4℃冰箱避光孵育1h。4℃ 1500rpm离心5min，弃去上清，取120μl洗液重悬细胞，再次离心后用100μl DMEM培养基混匀，放置于37℃避光孵育4h，通过流式细胞仪APC-H通道上机检测。以获取的平均荧光信号强度（MFI）为纵坐标，以抗体浓度（ng/ml）值的Log10值为横坐标做图分析结果如图10所示。由分析可知，与单抗相比，双抗分子BSG0402内吞最大值（top值）显著大于单抗，效率较优。
三、报告基因法检测EGFR/AXL双抗介导的细胞毒杀伤（ADCC）活性
双特异性抗体同时靶向EGFR和AXL，并由其Fc区结合效应细胞（如NK细胞），从而介导效应细胞对靶细胞的杀伤。已知JNJ-372是靶向EGFR和MET的双抗药物（参考doi:10.1016/j.jbc.2021.100641. Epub 2021 Apr 8.），将本发明中的候选分子与之比活性，可以一定程度的表征本发明分子的ADCC效率。JNJ-372抗体（MCE，HY-P9977）的糖基化修饰是低岩藻糖形式，为了与之比较，本发明将BSG0402交由义翘神州在特殊的293F细胞中生产，获得无岩藻糖形式（afucosylation，AF）的双抗分子，即BSG0402AF。
方案：收集靶细胞U251（培养条件与同上），Calcein AM标记，96孔板中加入靶细胞及梯度浓度待测抗体，CO2培养箱内共孵育20min；收集效应细胞（NK92细胞），以10:1的效靶比加入96孔板中CO2培养箱内孵育4h后，酶标仪检测488（EX）/515(EM)荧光值，计算靶细胞杀伤率。应用Graphpad prism非线性S曲线回归拟合数据得出剂量-效应曲线，并计算EC50（抗体浓度设置8个点，3个复孔，另加无抗体对照，5倍稀释）。
实验步骤：
1）复苏NK92、U251细胞，传代2-3次，恢复状态后可用于实验；
2）收集U251细胞，离心，弃上清后加PBS重悬；
3）Calcein AM标记靶细胞（U251细胞），完全培养液重悬成2×105个/mL；
4）靶细胞加入96孔板中，50μL/孔；
5）配制3×待测抗体，抗体浓度8个点：100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、0.0064nM、0.00128nM。
6）加入梯度浓度待测抗体50μL/孔，同时设置无抗体对照，靶细胞最大释放阳性对照及靶细胞自发释放阴性对照，3个复孔，CO2培养箱内共孵育20min；
7）加入效应细胞（NK92细胞）各50μL/孔，各对照孔加培养液补齐体积到150μL，二氧化碳培养箱内共孵育4h；
8）靶细胞最大释放孔加100μL裂解液，其余孔加100μL PBS，震荡3min，2000rpm，离心5min；
9）取上清，酶标仪检测488（EX）/515(EM)荧光值。
检测指标和数据分析：
检测488（EX）/515(EM)荧光值，计算靶细胞杀伤率，应用Graphpad prism非线性S曲线回归拟合数据得出剂量-效应曲线，并计算EC50。
结果如图11所示。可知，BSG0402AF介导ADCC的活性最优，以EC50值计算，其ADCC活性是JNJ-372的7倍。
实施例7、双抗药物偶联分子（ADC）的制备及活性鉴定
一、双抗药物偶联分子（ADC）的制备
抗体药物偶联分子（ADC）是将小分子药物，比如破坏细胞微管蛋白的MMAE或抑制拓扑异构酶I的Deruxtecan，偶联到抗体分子上，这种偶联的方式多种多样，有的是随机偶联至抗体分子的自由巯基SH，有的是定点偶联。本发明采用TCEP还原抗体分子，从而是抗体分子中的半胱氨酸生成巯基，从而可以将马来酰胺-GGFG-Dxd分子偶联至抗体分子上（马来酰胺和巯基生成硫醚键，通过硫醚键实现偶联）。其中，所述马来酰胺-GGFG-Dxd分子即为Deruxtecan，分子式和结构式参见前文。
偶联步骤如下：
1、在1.7ml反应体系中，加入40mg BSG04双抗、24.78μl TCEP，37℃孵育2小时。
2、加入1.3ml浓度为2mM的马来酰胺-GGFG-Dxd，37℃继续反应1小时。
3、用PD10脱盐柱进行层析，并用PBS洗脱ADC分子。
4、利用HPLC检测抗体和ADC分子，确认是否偶联成功。
检测结果如图12所示。由图可见标记后的抗体纯度符合要求，标记有效。
本发明还使用质谱技术对基于BSG04的ADC分子（以下称之为BSG04D）进行了分析，确认其药物（Dxd）-抗体偶联比例（drug-antibody ratio，DAR）为8。如图13所示。
二、肿瘤细胞移植瘤模型小鼠体内药效检测
为了检测BSG04D的药效，构建了小鼠移植瘤模型（cell-derived xenograftmodel，CDX）。实验由亦康医药完成。具体的，用含有灭活的10%胎牛血清，100U/ml 的青霉素和100µg/ml的链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2 的培养箱中培养肿瘤细胞H1975（人肺腺癌细胞），每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。PBS重悬的肿瘤细胞接种于Balb/c nude裸鼠（维通利华，货号401）的右侧胁肋部皮下，在肿瘤生长至150-200mm3左右时分组给药，共3组，具体给药方案见表8。
从第一次给药开始，记录每只动物荷瘤的体积，以时间为横坐标，绘制各组动物移植瘤生长曲线图如图14所示。可知，BSG04D 5mg/kg剂量组有效抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）多次录得>90%（具体为：每周两次量瘤体积，计算肿瘤生长抑制率，实验结束前的最后6次统计，TGI都大于90%）。
为了测试BSG0402AF和BSG04D对第三代EGFR靶向的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosineprotein kinase inhibitor，TKI）耐药肿瘤的药效，构建了耐药H1975（带有C797S突变(亦康医药)，具体是采用基因编辑技术，以EGFR激酶结构域三重突变(exon 19 del/exon 21L858R/exon20 C797S)替代原EGFR二重突变(exon 19 del/exon 21 L858R)基因(双等位替代)。小鼠采用NOG品系。以下称H1975 3M）的小鼠移植瘤模型。实验方法参见前述H1975模型相关方法。接种及给药后的移植瘤生长曲线如图15所示。由生长曲线可知，BSG04D 5mg/kg剂量组每周给药一次，共给药两次后可以有效抑制H1975 3M移植瘤的生长，在第25天观察到移植瘤消失。双抗药物BSG0402AF 10mg/kg剂量组每周2次给药，共给药6次后，亦可在第25天观察到移植瘤消失。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.靶向EGFR和AXL的双特异性抗体，含有EGFR抗原结合结构域和AXL抗原结合结构域；
所述EGFR抗原结合结构域为如下（A1）或（A2）：
（A1）EGFR抗原结合结构域1；所述EGFR抗原结合结构域1中包含抗EGFR抗体的重链可变区1和抗EGFR抗体的轻链可变区1；所述抗EGFR抗体的重链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第270-277位、第295-305位和第340-352位所示；所述抗EGFR抗体的轻链可变区1中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第27-32位、第50-51位和第89-97位所示；
（A2）EGFR抗原结合结构域2；所述EGFR抗原结合结构域2中包含抗EGFR抗体的重链可变区2和抗EGFR抗体的轻链可变区2；所述抗EGFR抗体的重链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第270-279位、第297-303位和第342-352位所示；所述抗EGFR抗体的轻链可变区2中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第27-32位、第50-51位和第89-97位所示；
所述AXL抗原结合结构域包含抗AXL抗体的重链可变区和抗AXL抗体的轻链可变区；所述抗AXL抗体的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.3的第275-282位、第300-307位和第346-352位所示；所述抗AXL抗体的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.3的第27-37位、第55-56位和第94-102位所示。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述双特异性抗体为由第一肽链和第二肽链组成的异源二聚体；
所述第一肽链自N端到C端依次包括抗EGFR抗体的轻链可变区、轻链恒定区、连接肽、抗EGFR抗体的重链可变区、重链恒定区CH1、铰链区、重链恒定区CH2和重链恒定区CH3；
所述第二肽链自N端到C端依次包括抗AXL抗体的轻链可变区、轻链恒定区、连接肽、抗AXL抗体的重链可变区、重链恒定区CH1、铰链区、重链恒定区CH2和重链恒定区CH3；
并且，所述第一肽链和所述第二肽链的两个重链恒定区CH3分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。
3. 根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于：在所述第一肽链中，所述抗EGFR抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-107位或SEQ ID No.2的第1-107位所示；所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第108-214位或SEQ ID No.2的第108-214位所示；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第215-244位或SEQ ID No.2的第215-244位所示；所述抗EGFR抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第245-363位或SEQ ID No.2的第245-363位所示；所述重链恒定区CH1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第364-461位或SEQ ID No.2的第364-461位所示；所述铰链区的氨基酸序列如SEQID No.1的第462-476位或SEQ ID No.2的第462-476位所示；所述重链恒定区CH2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第477-586位或SEQ ID No.2的第477-586位所示；所述重链恒定区CH3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第587-693位或SEQ ID No.2的第587-693位所示；
在所述第二肽链中，所述抗AXL抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-112位所示；所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第113-219位所示；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第220-249位所示；所述抗AXL抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第250-363位所示；所述重链恒定区CH1的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第364-461位所示；所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第462-476位所示；所述重链恒定区CH2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第477-586位所示；所述重链恒定区CH3的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第587-693位所示。
4. 根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于：所述第一肽链的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；
所述第二肽链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.如下任一生物材料：
（B1）编码权利要求1-4中任一所述双特异性抗体的核酸分子；
（B2）含有（B1）中所述核酸分子的表达盒；
（B3）含有（B1）中所述核酸分子的重组载体；
（B4）含有（B1）中所述核酸分子的重组菌；
（B5）含有（B1）中所述核酸分子的转基因细胞系。
6.一种抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述抗体药物偶联物包含权利要求1-4中任一所述双特异性抗体以及与所述双特异性抗体相偶联的药物部分；所述药物部分中含有一种、两种或两种以上药物。
7.根据权利要求6所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述药物为Dxd。
8.权利要求7所述抗体药物偶联物的制备方法，包括如下步骤：采用TCEP还原权利要求1-4中任一所述双特异性抗体，从而使所述双特异型抗体中的半胱氨酸生成巯基，然后将马来酰胺-GGFG-Dxd分子偶联至抗体分子上，得到所述抗体药物偶联物；
所述马来酰胺-GGFG-Dxd分子为Deruxtecan。
9.如下任一应用：
（C1）权利要求5所述的生物材料在制备权利要求1-4中任一所述的双特异性抗体或权利要求6或7所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐中的应用；
（C2）权利要求1-4中任一所述的双特异性抗体在制备权利要求6或7所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐中的应用；
（C3）权利要求1-4中任一所述的双特异性抗体或权利要求5所述的生物材料或权利要求6或7所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为肺腺癌或胶质瘤。
10. 一种抗AXL的抗体，包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.7的第26-33位、第51-58位和第97-103位所示；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.8的第27-37位、第55-56位和第94-102位所示。
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