CN104341505A

CN104341505A - 对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗egfr的人鼠嵌合抗体

Info

Publication number: CN104341505A
Application number: CN201410003690.6A
Authority: CN
Inventors: 于鹏展; 吴伟
Original assignee: Tibet Haisco Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tibet Haisco Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明公开了一对蒙古人种及高加索人种低免疫原性的，抗EGFR的人鼠嵌合抗体，还公开了该抗体的制备方法以及利用该抗体制备抗肿瘤药物的应用。在该发明中，我们主要针对临床安全性进行如下的优化：1）西妥昔单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得西妥昔单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生治疗性抵制。因此在该发明中突变其恒定区部分氨基酸使其适于蒙古人种及高加索人种；2）将NS0表达系统更换为CHO表达系统，降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明单抗具有更低的免疫原性。

Description

对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗EGFR的人鼠嵌合抗体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个与EGFR特异性结合，但对蒙古人种及高加索人种适用的、低免疫原性的人鼠嵌合抗体分子实体及其应用。

本发明主要涉及通过基因工程手段将已经上市的西妥昔单抗（Cetuximab，Erbitux）进行基因工程改造，突变其恒定区对蒙古人种产生高免疫原性的氨基酸，使得改造后的人鼠嵌合性抗体更适用于蒙古人种、高加索人种的基因表型。本发明还涵盖了该抗体在治疗肿瘤，尤其是EGFR高表达的头颈癌、结直肠癌和胃癌中的应用。

背景技术

研究发现，表皮生长因子受体（EGFR）信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。更进一步研究发现，EGFR高表达的头颈癌患者及转移性结直肠癌患者对EGFR抑制剂治疗反应敏感。这种良好的敏感性在EGFR基因未突变但KRAS基因突变的上述患者中更为显著。

西妥昔单抗（中文商品名：爱必妥，英文商品名：Erbitux）由英克隆公司（目前是礼来的全资子公司）研发，并于2004年在美国、欧洲上市，2006年中国上市。西妥昔单抗可与表达于肿瘤细胞表面的EGFR特异性结合，通过3大机理杀死转移性结直肠癌细胞和头颈癌细胞:(1)与内源性配体竞争结合EGFR，阻断肿瘤细胞增殖的信号通路；其亲和力高于内源性配体如EGF及TGF-α；（2）Erbitux引发了了抗体介导的EGFR受体二聚、内吞及降解，下调了EGFR受体的表达，增强了肿瘤细胞对放化疗的敏感性；（3）Erbitux具有ADCC效应，对肿瘤细胞进行杀伤（Mitchell,Nature Biotechnology,2004,V22:363-364.）。自西妥昔单抗上市以来，很快在临床上得到广泛应用并跨入重磅炸弹药物行列，其2012年全球销售已达11.5亿美元（彭博社消息，2013年6月1号消息）。

尽管西妥昔单抗的上市给EGFR高表达肿瘤患者带来巨大的福音，随着科学研究的进展及临床观察及荟萃分析，西妥昔单抗在临床上也存在下述潜在问题：（1）西妥昔单抗治疗效果在不同患者个体之间差异较大，即使针对EGFR未变异、KRAS基因变异的高有效群体患者也是如此（Misale et al.,Nature,2012，V486:532-536.）；（2）患者经西妥昔单抗治疗一段时间后，患者会发生获得性抵制（Montagut et al.,Nature Medicine,2012,V18:221-223;）,从而影响了西妥昔单抗的治疗效果。这种获得性抵制主要由在患者机体能随着西妥昔单抗给药次数的增加而产生了针对西妥昔单抗的抗体。患者机体产生针对西妥昔单抗的抗体，会由下述3种原因引起：（1）西妥昔单抗是人鼠嵌合性抗体，其中鼠源的区序列会引起机体的免疫反应；（2）西妥昔单抗由鼠杂交瘤NS0细胞生产，产品中含有约30%Di-α1,3GalGal修饰的组分，这种组分在人体内会引起比较强的免疫原性（Jefferis.Nature Reviews Drug Discovery,2009,V8:226-234.）；（3）由患者基因多态性引起的免疫原性（Jefferis et al.,mAbs，2009，V1：1-7；P.Pandey.mAbs,2012,V4:553-554.）其中不同人种间基因多态性决定了西妥昔单抗的治疗性抵制与不同患者个体间治疗效果的差异。

西妥昔单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得西妥昔单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生西妥昔单抗的治疗性抵制。因此，针对一个很好靶点及已取得很好疗效的西妥昔单抗，在蒙古人种的治疗上仍存在进一步改良的、迫切的需要，以在临床上发挥更佳的临床效果，用于头颈癌、结直肠癌及胃癌的治疗。

发明内容

针对上述西妥昔单抗在临床应用中的限制，本发明通过突变西妥昔单抗重链恒定区的氨基酸，获得更适于蒙古人种和高加索人种的、抗EGFR的单克隆抗体，其结构式见SEQ ID：1（发明所述抗体的重链）与SEQ ID：2（发明所述抗体使用与西妥昔单抗相同的轻链）。含轻、重链基因的载体经真核细胞分泌表达，形成由16对2硫键连接的本发明所述的完整抗体：

本发明的目的是进一步提升西妥昔单抗在临床上的普适性及安全性，提供一种更适于蒙古人种和高加索人种的、抗EGFR的、提升其临床安全性的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供上述单抗在制备肿瘤药物中的应用。

本发明是通过下列技术措施实现的：

一种抗EGFR的、人鼠嵌合的单克隆抗体，所述抗体：

(i)所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球蛋白同种异型氨基酸；

(ii)所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(iii)所述重链与西妥昔单抗（Cetuximab）轻链（SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列）结合成完整的单克隆抗体。

上述的抗体，其特征在于：突变西妥昔单抗重链恒定区的氨基酸，使西妥昔单抗

重链恒定区免疫球蛋白G1m3同种异型转为G1m17同种异型。

上述抗体，其特征在于：将西妥昔单抗重链中（SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列）DKRV序列突变为DKKV序列。

一种编码上述抗体的核苷酸序列。

一种包含上述抗体表达载体的宿主细胞。

上述的宿主细胞，其特征在于宿主细胞为真核细胞。

上述的宿主细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。

上述的宿主细胞，优选CHO细胞系。

一种组合物，上述组合物包含权利要求1所述抗体。

上述的抗体在制备抗肿瘤药物的应用。

上述的抗肿瘤药物，优选头颈癌，结直肠癌和胃癌。

本发明中所用术语“西妥昔单抗”，由Lilly旗下的Imclone公司开发，其CAS号为：205923-56-4。

本发明中所用术语“免疫球蛋白同种异型”（IgG allotype）是一种遗传标志，指同一种属不同个体间的免疫球蛋白分子抗原性的不同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。同种异型抗原性的差别往往只有一个或几个氨基酸残基的不同，可能是由于编码免疫球蛋白的结构基因发生点突变所致，并被稳定地遗传下来，因此免疫球蛋白同种异型可作为一种遗传标记（genetic markers），这种标记主要分布在抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区上（http://www.wiki8.com/mianyiqiudanbai_28442/）。

IgG1重链恒定区上的同种异型γ1、γ2、γ3重链上均存在有同种异型标记。目前已发现：Glm1、2、3、17；G2m23;G3m21、28、11、5、13、14、10、6、24、15、16、26、27，共20种左右。其中G1m、G2m、G3m分别表示亚类IgG1,IgG2和IgG3，m代表标记（Jefferis et al.,mAbs，2009，V1：1-7；）。

西妥昔单抗为IgG1型单抗，因此其同种异型主要有Glm1、2、3、17共计4种。除Glm3和G1m17位于IgG1分子的Cγ1区外，其余的Gm均位于Fc部位。一条γ链可能同时具有一个以上的Gm标志。由于人第14号染色体编码四种IgG亚类的C区基因Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4是密切连锁的，因此IgG重链各亚类Gm标记可作为间倍体（haplotype）遗传给子代。

以下主要提供本发明的主要步骤：

突变并构建发明所述单抗轻链（SEQ ID NO:2）和重链（SEQ ID NO:1）氨基酸基因序列的质粒，将该质粒克隆进pCHO1.0载体制备pCHO1.0.HSK-III-005（L+H），使用转染试剂FreeStyle^TMMAX Reagent（Life Technologies），将本项目所述抗体的表达载体“pCHO1.0.HSK-III-001（L+H）”转染于CHO-S细胞（Life Technologies）中。利用本领域人所熟知的各种筛选技术获得高表达细胞株，基于该细胞株表达的抗体经分离纯化后用于质量比较分析及动物体内活性实验验证。

本发明的有益效果

本发明主要的优点：（1）在保持西妥昔单抗针对EGFR靶点特异性和亲和力不变的情况下，通过突变其重链恒定区氨基酸，获得的新分子实体较西妥昔单抗更适用于蒙古人种和高加索人种的临床给药，降低药物的获得性抵制；（2）该分子实体改由CHO系统表达（替代西妥昔单抗的NS0表达系统），产品中不再含有Di-α1,3GalGal修饰的组分，更进一步降低了患者机体的免疫反应。因此，基于本发明所制备的单抗，在临床的药效及安全性方面都潜在的显著高于现有的西妥昔单抗，具有显著的先进性，也符合我国生物医药开发方面的引进、消化再吸收的开发理念，降低了药物开发的风险。

附图说明

图1pHSK.hCg1,G1m17质粒图谱。

图2pCHO1.0.HSK-III-005（H+L）质粒图谱。

图3是发明所述抗体HSK-III-005的表达曲线。

图4是发明所述抗体HSK-III-005与西妥昔单抗还原性SDS-PAGE对比图谱。

图5是发明所述抗体HSK-III-005与西妥昔单抗非还原性SDS-PAGE对比图谱。

图6是发明所述抗体HSK-III-005电荷异质性图谱。

图7是西妥昔单抗电荷异质性图谱。

图8是发明所述抗体HSK-III-005糖分析质谱。

图9是发明所述抗体HSK-III-005的体内活性比较分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。在此，我们证明了本发明中制备的抗体与西妥昔单抗相比：（1）不含有强免疫性Di-α1,3GalGal修饰的组分；（2）其针对蒙古人种的第免疫原性由于种属原因需要在临床上进行反映，但目前众多临床研究已证实：不同人种间对不同药物的敏感程度与人种间免疫球蛋白的不同同种异型分布相关。

实施例本发明所述抗体的制备

实施例1IgGγ1恒定区同种异型突变

通过对IgGγ1恒定区CH1的DNA序列（SEQ ID NO:4）进行点突变，使其由Glm3亚型突变为G1m17亚型（SEQ ID NO:5）。合成覆盖欲突变位点的反向互补引物G1M17a和G1M17b，以及IgGγ1恒定区的正反向引物HCG1F（含AfeI酶切位点）和HCG1R（含NotI酶切位点）。使用HCG1F和G1M17b作为一对正反向引物，以及使用G1M17a和HCG1R作为一对正反向引物，对含IgGγ1恒定区的质粒pHSK.hCg1.G1m3分两段PCR反应，得到两个片段。回收纯化这两个PCR产物片段作为模版，使用HCG1F和HCG1R作为正反向引物，通过重叠PCR把两个片段拼接，得到完整突变了的产物hCg1.G1m17（在两端带有AfeI和NotI酶切位点），克隆到pHSK.hCg1.G1m3的AfeI和NotI酶切位点中，得到“pHSK.hCg1.G1m17”质粒（见图1）。

表1IgGγ1恒定区同种异型突变使用的引物

名称	特征	序列(5’→3’)
			HCG1F	sense hCg1.AfeI	GCTTCGACCAAGGGCCCATC
HCG1R1	antisense hIgG1.NotI	GTCTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG
			G1M17a	sense HSK hCg1.G1m17mut site	GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA
G1M17b	antisense HSK hCg1.G1m17mut site	GTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC

实施例2本发明所述抗体表达载体的构建

人工合成本发明所述单抗重链可变区（SEQ ID NO:6）和轻链可变区（SEQ ID NO:7）DNA片段，在其5’端依次引入Kozak序列和信号肽序列，克隆进pUC57载体，获得“pUC57.HSK-III-005.VH”和“pUC57.HSK-III-005.VL”质粒。

合成引物HSK005VHLF（含AvrII酶切位点）和HSK005VHHCG1R，以及HCG1F和HCG1R2（含AvrII酶切位点），分别以“pUC57.HSK-III-005.VH”和“pHSK.hCg1.G1m17”为模板，通过重叠PCR把HSK-III-005.VH和hCg1.G1m17拼接成完整的重链读码框片段，此片段包括两段的AvrII酶切位点、kozak序列、重链信号肽序列和HSK-III-005重链序列，将此片段克隆进Freedom^TM pCHO1.0载体（LifeTechnologies）的AvrII位点，得到“pCHO1.0.HSK-III-005.H”质粒。

合成引物HSK005VKLF（含EcoRV酶切位点）和HSK005VKHCG1R，以及HCKF和HCKR（含PacI酶切位点），分别以“pUC57.HSK-III-005.VL”和“pHSK.hCK”（含轻链恒定区序列SEQ ID NO:8）为模板，通过重叠PCR把HSK-III-005.VL和hCK拼接成完整的轻链读码框片段，此片段包括EcoRV酶切位点、kozak序列、轻链信号肽序列、HSK-III-005轻链序列和PacI酶切位点，将此片段克隆进“pCHO1.0.HSK-III-005.H”载体的EcoRV和PacI位点，得到本发明所述抗体表达载体“pCHO1.0.HSK-III-005（H+L）”（见图2）。

表2构建本发明所述抗体表达载体使用的引物

名称	特征	序列(5’→3’)
			HSK005VHLF	sense kozak-VHL.AvrII	GAATCCTAGGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAG
HSK005VHHCG1R	antisense HSK-VH-hCg1	GATGGGCCCTTGGTCGAAGCGGCTGACACGGTGACCAGAGTTCCCTG
			HCG1F	sense hCg1.AfeI	GCTTCGACCAAGGGCCCATC
HCG1R2	antisense hCg1.AvrII	CAATCCTAGGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC
			HSK005VKLF	sense VKL.kozak.EcoRV	CACTGATATCGCCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAG
HSK005VKHCKR	antisense HSK VK-hCK	GAAGACAGATGGTGCAGCCACCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTGCCAGC
			HCKF	sense hCK	CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTC
HCKR	antisense hCk.PacI	GACTTTAATTAATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC

实施例3本发明所述抗体稳定细胞株的构建

使用转染试剂FreeStyle^TMMAX Reagent（Life Technologies），将50μg本项目所述抗体的表达载体“pCHO1.0.HSK-III-005（H+L）”转染于3*10^7个CHO-S细胞（LifeTechnologies）中。转染48小时后，在含20μg/mL嘌呤霉素（Puromycin）和200nM氨甲蝶呤（MTX）的条件下进行筛选，待细胞活率恢复至90%以上后加压至50μg/mL嘌呤霉素和1000nM氨甲蝶呤，待细胞活率恢复至90%以上后在96孔板进行有限稀释单克隆，筛选获得稳定表达的、质量合乎要求的目标抗体的单克隆细胞株，该细胞株在化学成分明确的无血清无蛋白培养基中培养，目标抗体的产量在流加培养中达到1g/L以上（见图3）。

实施例4本发明所述抗体的纯化

表达的抗体经Protein A、阴离子、阳离子三步层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度>98%（见图4，图5），IEC分析其电荷异质体分布合理且两种单抗的色谱行为一致（图6、图7）。

实施例5本发明所述抗体的糖型分析

糖型的解析主要基于ESI-QTOF对完整抗体以结合形式存在的糖链进行分析，图8是基于QSTAR XL(AB Sciex)质谱仪对CHO系统生产HSK-III-005抗体检测的糖谱。从图8分析可知，本发明所述化合物HSK-III-001采用CHO系统表达，产品检测未发现含有Di-α1,3GalGal修饰的组分。

实施例6本发明所述抗体体内活性的比较分析

以BALB/cA-nude裸小鼠为受试动物，评价腹腔注射受试化合物（HSK-III-005）及阳性化合物（西妥昔单抗）对荷人表皮瘤细胞A431移植瘤裸小鼠的疗效。

30只裸小鼠实验室环境适应四天，裸小鼠右肋部皮下接种A431细胞，接种密度为5×106/100ul/只。肿瘤生长13天后，荷瘤小鼠肿瘤长至273±59mm3，将动物随机分3组（空白组、受试组、及同剂量的阳性对照组），每组10只(D0)。

腹腔注射给药受试化合物与阳性化合物（各1mg/只），每周给药2次，连续给药5次。每周测2次瘤体积，记录数据。

使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。

肿瘤体积（V）计算公式为：V＝1/2×L长×L短2

相对体积（RTV）=VT/V0

抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积。

实验结果见图9。同剂量条件下，西妥昔单抗与受试化合物HSK-III-005具有相似的抑制肿瘤生长的作用。

Claims

1.一种抗EGFR的、人鼠嵌合的单克隆抗体，所述抗体：

(i) 所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球蛋白同种异型氨基酸；

(ii) 所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(iii) 所述重链与西妥昔单抗（Cetuximab）轻链（SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列）结合成完整的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：突变西妥昔单抗重链恒定区的氨基酸，使西妥昔单抗重链恒定区免疫球蛋白G1m3同种异型转为G1m17同种异型。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：将西妥昔单抗重链中（SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列）DKRV序列突变为DKKV序列。

4.一种编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列。

5.一种包含权利要求4的表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于宿主细胞为真核细胞。

7.根据权利要求5-6所述的宿主细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。

8.根据权利要求5-6所述的宿主细胞，优选CHO细胞系。

9.一种组合物，所述组合物包含权利要求1所述抗体。

10.权利要求1-9任意一项所述的抗体在制备抗肿瘤药物的应用。

11.权利要求10所述的抗肿瘤药物，优选头颈癌，结直肠癌和胃癌。