CN116710480A - 抗egfr的纳米抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种EGFR的纳米抗体及其制备方法和应用。所述EGFR纳米抗体，与野生型EGFR蛋白具有高度亲和力，同时识别EGFRvⅢ蛋白。

Description

抗EGFR的纳米抗体及其用途
本公开要求于2020年12月9日提交中国专利局、申请号为202011425866.9、发明名称为“抗EGFR的纳米抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明涉及生物工程、生物医药领域，主要涉及一种靶向EGFR的纳米抗体或其抗原结合片段，其编码核酸、表达载体和表达细胞、制备方法、药物组合物、以及它们用于治疗疾病的用途，例如治疗肿瘤的用途。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒(avian erythroblastic leukemia viral,v-erb-b)致癌基因的同源体，为HER/ErbB家族的四个成员之一，故又名HER1或ErbB-1。在多种肿瘤中发现了EGFR的过度表达，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、和肾癌等(Atalay et al.,Novel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor(EGFR)family and its down stream effectors in breast cancer.Ann.Oncology,2003,14:1346-1363；Herbst and Shin,Monoclone antibodies target epidermal growth factor receptor positive cancer therapy.American Cancer Society,2000,1593-1611)。因此，EGFR是治疗肿瘤的一个很有前景的靶分子。
EGFR由三部分组成：(1)胞外区(ECD)：在NH2端，为配体结合区，共621个氨基酸残基，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚区(或相应称为L1、S1/CR1、L2、S2/CR2亚区)构成(Bishayee S.,Role of conformational alteration in the epidermal growth factor receptor(EGFR)function.BiochemPharmacol,2000,60(8):1217-1223)。结构域Ⅱ和Ⅳ同源性较高，为二聚化结合区。结构域Ⅱ中有β-发夹或二聚臂的特征。通常，受体胞外区在其平衡状态时为闭合的非活化构象，结构域Ⅱ中的β-发夹与结构域Ⅳ中的保守残基在分子内接触，阻止二聚化形成。配体与相应受体结合后，结构域Ⅰ和Ⅲ的方向发生改变，导致暴露出二聚臂，使其可与其他受体发生二聚化。(2)跨膜(TM)区：由23个氨基酸残基构成的疏水区，为单链α螺旋(Abe Y,Odaka M,Inagaki F,et al.,Disulfide bond structure of human epidermal growth factor receptor.J Biol Chem,1998,273(18):11150-11157)。(3)胞内区(ICD)：共542个氨基酸残基，ICD又可分为酪氨酸激酶结构域和C端结构域两部分，前者有腺苷三磷酸(ATP)结合位点，ATP结合后可将磷酸基团转移；后者有多个酪氨酸残基，可被磷酸化并直接参与细胞内信号转导(Nam Y.Lee,Structure and dynamics of the epidermal growth factor receptor C-terminal phosphorylation domain.Protein Sci.2006,15(5):1142–1152)。
EGFR的配体包括EGF，TGFA/TGF-alpha，amphiregulin，epigen/EPGN，BTC/betacellulin，epiregulin/EREG和HBEGF/heparin-binding EGF。受体配体结合后会触发 EGFR形成同源或者异源二聚体，从而使胞内区发生自身磷酸化，进一步激活复杂的下游信号级联反应，主要包括下列几条信号通路：RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路，PLC gamma-PKC信号通路和STATs modules信号通路。EGFR通过这些酪氨酸激酶介导的信号转导通路可调节多种细胞生理过程，主要包括细胞增殖及分化、细胞存活及凋亡、血管生成、以及细胞的有丝分裂和细胞转移(Atalay et al.,Novel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor(EGFR)family and its downstream effectors in breast cancer.Ann.Oncology,2003,14:1346-1363；Herbst and Shin,Monoclone antibodies target epidermal growth factor receptor positive cancer therapy.American Cancer Society,2000,1593-1611；Modjtahedi et al.,Phase I trial and tumor localisation of the anti-EGFR monoclonal antibody ICR62in head and neck or lung cancer Br.J.Cancer,1996,73:228-235，)。
研究表明，EGFR过度表达，能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。过度表达往往与基因扩增相关(Towia A.Libermann et al.,Amplification,enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumors of glial origin,1985,Nature 313:144-147)。EGFR基因的重排在许多具有基因扩增的肿瘤中较为明显，同时引起EGFR变体产生(Maiden et al,Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme,1988,Cancer Research 4:2711-2714)。目前主要存在八种突变型：(1)EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域；(2)EGFRvII由EGFR的细胞外结构域中的83个氨基酸框内缺失组成；(3)EGFRvⅢ由EGFR的细胞外结构域中的267个氨基酸框内缺失组成；(4)EGFRvIV具有EGFR的细胞质结构域中的缺失；(5)EGFRvV存在EGFR的细胞质结构域中的缺失；(6)EGFR.TDM/2-7具有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复；(7)EGFR.TDM/18-25含有EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复；(8)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复(Kuan et al.,EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy,Endocr relat cancer 8-96,2001；王承兴,等,以EGFR及其突变体为靶点的肿瘤治疗,国外医学生理病理与临床分册.2000,20(2):137-140)。其中EGFRvⅢ这种突变型，是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体，也称作de2-7 EGFR、ΔEGFR、或Δ2-7(Olapade-Olaopa EO,Moscatello DK,et al.,Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer,Br.J.,2000 Cancer.82(1):86-94)。成熟的EGFRvⅢmRNA中缺失了外显子2-7的801个核苷酸，相应的EGFR蛋白缺失了267个氨基酸(6-273)，同时插入了一个甘氨酸残基，形成了一个独特的连接肽(A J Wong et al.,Structural Alterations of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma.Proc Natl Acad Sci U S A1992,89(7):2965-9；Yamazaki et al.,mutation within the ligand binding domain is responsible for activiation of epidermeral growth factor receptor gene in human brain tumors,Jpn.J.Cancer Res.,1990,81:773-9；Yamazaki et al.,Amplification of the structurally and functionally altered epidermal groth factor receptor gene(c-erbB)in human brain tumor,Mol.Cell.Biol，1988,8(4):1816-20；Sugawa et al.Identical Splicing of Aberrant Epidermal Growth Factor Receptor Transcripts From Amplified Rearranged Genes in Human Glioblastomas，Proc Natl Acad Sci U S A 1990 Nov；87(21):8602-6)。
多种肿瘤类型中报道了EGFRvⅢ的表达，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrand et al.，cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor,EGFRvⅢ,Cancer Res.57,4130-40，1997；Olapade-Olaopa et al.，Evidence for the differential expression of the variant EGF receptor protein in human prostate cancer,Br.J.Cancer.82,86-94，2000；C J Wikstrand et al.,Monoclonal Antibodies Against EGFRvⅢ Are Tumor Specific and React With Breast and Lung Carcinomas and Malignant Gliomas,Cancer Res,1995,55(14):3140-3148；Garcia de Palazzo et al.,Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.Cancer Res,1993,53:3217-3220)。EGFRvⅢ不能与配体结合，但是它处于一种持续的低激活状态。EGFRvⅢ在神经胶质瘤中的作用机制并没有完全清楚，但是根据已有的报道，EGFRvⅢ可以降低神经胶质瘤细胞的凋亡，并能小幅度提高神经胶质瘤细胞的增殖(M Nagane et al.A Common Mutant Epidermal Growth Factor Receptor Confers Enhanced Tumorigenicity on Human Glioblastoma Cells by Increasing Proliferation and Reducing Apoptosis.Cancer Res 1996,56(21):5079-5086.)。EGFRvⅢ特异性的表达于肿瘤组织中，在正常组织中不表达，因此在抗体治疗中是一个高度特异性的靶点(Henriqueta A C Silva et al.Molecular Detection of EGFRvⅢ-positive Cells in the Peripheral Blood of Breast Cancer Patients,Eur J Cancer.2006,42(15):2617-2622)。
纳米抗体(Nanobody，Nb)是一种只含有单个结构域的基因工程抗体。1993年比利时科学家Hamers-Casterman C在骆驼血液中发现一种只含重链不含轻链的天然重链抗体(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature.363(6428):446–8(1993).)，重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力。克隆骆驼体内重链抗体的可变区后,得到的仅由一个重链可变区组成的单域抗体(single domain antibody，sdAb),称为纳米抗体或VHH抗体(variable heavy chain domain of a heavy chain antibody)。纳米抗体不仅分子量只是普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易，肿瘤组织穿透性高，且容易偶联其它分子。因此应用纳米抗体技术研发EGFR及EGFRvⅢ的治疗性抗体具有广阔的前景。
发明内容
本发明提供特异性结合EGFR及EGFRvⅢ的纳米抗体或抗原结合片段，编码这些抗体及抗原结合片段的核酸，包含所述抗体及抗原结合片段的药物组合物和试剂盒，以及它能够用于治疗肿瘤等药物的制备。
在一些实施方案中，特异性结合EGFR及EGFRvⅢ的纳米抗体或抗原结合片段，所述纳米抗体或抗原结合片段包含CDRs组合，所述CDRs组合包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
各个CDR1、CDR2和CDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
特别地，例如本发明的纳米抗体或抗原结合片段，其中：
(1)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.63、64、65所示序列；
(2)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.66、67、68所示序列；
(3)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.69、70、71所示序列；
(4)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.72、73、74所示序列；
(5)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.75、76、77所示序列；
(6)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.78、79、80所示序列；
(7)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.81、82、83所示序列；
(8)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.84、85、86所示序列；
(9)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.87、88、89所示序列；
(10)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.90、91、92所示序列；
(11)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.93、94、95所示序列；
(12)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.96、97、98所示序列；
(13)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.99、100、101所示序列；
(14)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.102、103、104所示序列；
(15)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.105、106、107所示序列；
(16)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.108、109、110所示序列；
(17)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.111、112、113所示序列；
(18)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.114、115、116所示序列；
(19)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.117、118、119所示序列；
(20)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.120、121、122所示序列；
(21)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.123、124、125所示序列；
(22)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.126、127、128所示序列；
(23)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.129、130、131所示序列；
(24)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.132、133、134所示序列；
(25)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.135、136、137所示序列；
(26)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.138、139、140所示序列；
(27)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.141、142、143所示序列；
(28)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.144、145、146所示序列；
(29)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.147、148、149所示序列；
(30)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.150、151、152所示序列；
(31)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.153、154、155所示序列；
(32)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.156、157、158所示序列；
(33)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.159、160、161所示序列；
(34)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.162、163、164所示序列；
(35)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.165、166、167所示序列；
(36)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.168、169、170所示序列；
(37)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.171、172、173所示序列；
(38)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.174、175、176所示序列；
(39)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.177、178、179所示序列；
(40)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.180、181、182所示序列；
(41)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.183、184、185所示序列；
(42)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.186、187、188所示序列；
(43)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.189、190、191所示序列；
(44)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.192、193、194所示序列；
(45)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.195、196、197所示序列；
(46)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.198、199、200所示序列；
(47)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.201、202、203所示序列；
(48)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.204、205、206所示序列；
(49)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.207、208、209所示序列；
(50)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.210、211、212所示序列；
(51)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.213、214、215所示序列；
(52)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.216、217、218所示序列；
(53)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.219、220、221所示序列；
(54)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.222、223、224所示序列；
(55)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.225、226、227所示序列；
(56)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.228、229、230所示序列；
(57)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.231、232、233所示序列；
(58)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.234、235、236所示序列；
(59)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.237、238、239所示序列；
(60)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.240、241、242所示序列；
(61)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.243、244、245所示序列；
(62)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.246、247、248所示序列；
(63)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.249、250、251所示序列；
(64)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.252、253、254所示序列；
(65)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.255、256、257所示序列；
(66)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.258、259、260所示序列；或，所述CDR1、CDR2和CDR3为具有与上述(1)—(66)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选为替换，更优选为保守氨基酸残基的替换。
在另一个具体实施方案中，本发明提供这样的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)可变区具有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示序列；
(2)与上述(1)所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；或，
(3)所述纳米抗体或抗原结合片段的框架区与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示氨基酸序列的框架区具有至少90％同一性，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与人EGFR及EGFRvⅢ结合的解离常数(KD)不大于10 -7nM，与食蟹猴EGFR结合的解离常数(KD)不大于10 -8nM；
可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与猴EGFR蛋白结合或不结合；
可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与鼠EGFR蛋白结合或不结合；
可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与C225或7D12抗体不竞争。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列；优选包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含不存在CH1片段的重链恒定区序列。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含具有CH2和CH3片段的重链恒定区序列，或，所述抗体或抗原结合片段进一步包含抗体Fc区；
所述抗体恒定区或抗体Fc区通过或不通过连接肽连接所述抗体或抗原结合片段；
可选地，所述抗体恒定区或抗体Fc区来自骆驼科、小鼠、大鼠、兔、羊或人；
可选地，所述抗体恒定区或抗体Fc区来自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是嵌合的或人源化的或全人源的；优选地，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
在一个优选实施方案中，本发明还提供一种多特异性抗原结合分子；优选地，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含上述任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合EGFR以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的EGFR抗原表位；
优选地，所述其他抗原选自CD3、PD-1、PD-L1、Her2、EpCAM、CD16、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD64、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL或FAP；
优选地，所述多特异性抗体为“双特异性”、“三特异性”或“四特异性”。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)；优选地，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含上述任一项所述EGFR抗体或抗原结合片段。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞；优选地，所述免疫效应细胞包含上述所述嵌合抗原受体或包含上述所述嵌合抗原受体的核酸片段；
优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；
优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明上述任一项所述的纳米抗体、抗原结合片段、或其任意组合，上述所述的多特异性抗原结合分子或上述所述的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含本发明上述所述分离的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明上述所述分离的核酸分子或表达载体。
在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌；更优选，所述宿主细胞选自HEK293E或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的制备方法，在适当的条件下培养本发明上述所述的宿主细胞，并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在一些实施方案中，本发明提供一种免疫效应细胞的制备方法，将上述所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，优选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达上述所述的CAR。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，组合物包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞，或本发明上述所述方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)，以及药学上可接受的载体。
在一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；更优选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在一些实施方案中，本发明提供一种预防和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品、或本发明上述所述的药物组合物；所述肿瘤疾病或炎性疾病为EGFR过度表达的肿瘤疾病或炎性疾病；所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细 胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
在一些实施方案中，本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物在在制备预防和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病的药物中的用途，所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
在一些实施方案中，本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物用于预防和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病；所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、或本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述的药物组合物，以及使用说明。
术语定义和说明
除非另外说明，本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语，则该术语的含义以所述定义为准。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗 体，人源化抗体，全人源抗体，异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体)，抗体缀合物以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够特异性结合靶蛋白的完整抗体分子以及不完整的抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段，它们缺少完整抗体的Fc片段(从动物循环中更快地清除)，因此缺乏Fc介导的效应功能(effector function)(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；其内容援引加入本文)。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“天然抗体”是指通过多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。本文术语“工程化抗体”的抗体是指通过基因工程、抗体工程等技术获得的非天然抗体，示例性地，“工程化抗体”包括人源化抗体、小分子抗体(例如scFv等)、双特异性抗体等等。
本文术语“单特异性”是指具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”可互换使用，是指其具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这 些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用，术语“EGFR”是指表皮生长因子受体家族(EGFRs)的成员，EGFR家族成员包括：EGFR(ErbB1),HER2(ErbB2),HER3(ErbB3)and HER4(ErbB4)。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是跨膜酪氨酸激酶(transmembrane tyrosine kinase receptors)ErbB家族成员之一，EGFR的配体是EGF和转化生长因子-α(transforming growth factor-alpha，TGF-α)。配体与EGFR结合，诱导EGFR的构象变化和形成二聚体，导致细胞内酪氨酸激酶(TKs)的活化，后续酶促级联反应的结果导致肿瘤细胞的增值、侵袭、转移、新血管生成和程序化死亡降低。
如本文所用，术语“EGFRvⅢ”是指Ⅲ型EGF缺失突变受体，特征在于EGFRmRNA中外显子2-7的缺失。这些缺失相应于cDNA核苷酸275-1075(编码氨基酸6-276)，推测由可变剪接或重排引起。EGFR基因的胞外域中801bp的缺失造成正常EGFR蛋白的读框内截短，导致145kDa受体，由此形成肿瘤特异的免疫原性表位。EGFRvIII表达已经在许多肿瘤类型中被观察到，包括多形性成胶质细胞瘤(GBM)，但在正常组织中罕见。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体，其通常是人或人源化的抗体。在本发明中，结合特异性之一可以针对EGFR的抗原表位而被检测，另一个可以针对EGFR的另一个抗原表位或除EGFR任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
如本文所用，术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
如本文所用，术语“纳米抗体”是指骆驼体内存在天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原结合片段。关于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(2001，Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302)，以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请：布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO03/050531；加拿大国家研究理事会的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及 Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，和Ablynx N.V.的进一步公开的专利申请。还参考了这些申请中提及的另外的现有技术，特别是国际申请WO 06/040153第41-43页上提及的参考文献列表，所述列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)尤其可以通过在一个或更多个框架序列中存在一个或更多个“特征残基”来表征。可在例如WO 08/101985和WO 08/142164中发现纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他的修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体及其制剂的半衰期的不同修饰。对于纳米抗体的进一步的一般描述，参考本文引用的现有技术，例如WO 08/020079(第16页)中所述。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的，表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的高变区之内，而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区，其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接，这三个CDR形成连接片层结构的环，并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含以下之一：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3 结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不意图包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“裸抗体”是指不与另一种作用剂或分子(例如标记或药物)、肽或多肽连接、融合或缀合的抗体。在具体的实施方案中，由哺乳动物宿主细胞表达的裸抗体可被宿主细胞的糖基化机器(例如糖基化酶)糖基化。在某些实施方案，当通过不具有其自身糖基化机器(例如糖基化酶)的宿主细胞表达时，裸抗体不被糖基化。在某些实施方案中，裸抗体是完整抗体，而在其它实施方案中，裸抗体是完整抗体的抗原结合片段，例如Fab抗体。
本文术语“缀合抗体”是指可与药学上可接受的载体或稀释剂缔合的抗体，其可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本文术语“双抗体”是指二价的双特异性抗体，可以与相同或不同抗原上的不同表位结合。
如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的 连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸彼此属于保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
(1)酸性氨基酸：Asp(D)和Glu(E)；
(2)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)和His(H)；
(3)亲水性不带电荷氨基酸：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；
(4)脂肪族不带电荷氨基酸：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；
(5)非极性不带电荷的氨基酸：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；
(6)芳香族氨基酸：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
如本文所用，术语“特异性结合”是指一种结合反应，其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况，所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD与抗原结合。例如，与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nM((例如，1pM至100nM之间)的KD与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nM(例如，大于500nM、1μM、100μΜ、500μΜ或1mM)的KD。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见，Harlow & Lane，Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow & Lane,Using Antibodies，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999)，其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC)，其中药物分子就是所述的另一个分子。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指这样的重组蛋白，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包含scFv。scFv可以源自融合抗体的可变重和轻区。替代地或另外，scFv可以衍生自Fab’s(而不是抗体，例如获自Fab文库)。在某些实施方式中，将scFv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外 的成分。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、绵羊和马等。
如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“适当的条件”指适合培养各种宿主细胞的条件，其中宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。
本文术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“抗肿瘤剂”指抗肿瘤药物，其为治疗肿瘤疾病的一类药物，有化疗药物、生物制剂等。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
本文术语“EC80”是指能引起80％最大效应的抗体浓度。
附图说明
图1为免疫后羊驼血清抗体效价情况。图1A为ELISA检测人EGFR-ECD蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；图1B为FACS检测人EGFR-ECD蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况。
图2为EGFRvⅢ蛋白SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测结果。M:marker；R(2μg)： 上样量2μg，还原电泳；NR(2μg):上样量2μg，非还原电泳。
图3为ELISA检测对照抗体与人EGFRvⅢ蛋白的结合反应。其中抗EGFR vⅢ阳性对照抗体为：C225，7D12和30D8，阴性对照为hIgG1。
图4为ELISA检测对照抗体与人pepvⅢ蛋白的结合反应。抗pepvⅢ蛋白阳性对照抗体为30D8，阴性对照为hIgG1。
图5为A431细胞的FACS检测结果；图5A为C225抗体检测A431细胞EGFR表达量的FACS结果；图5B为30D8抗体检测A431细胞EGFRvⅢ表达量的FACS结果。其中阴性对照为hIgG1。
图6为MCF-7细胞的FACS结果；图6A为C225抗体检测MCF-7细胞EGFR表达量的FACS结果；图6B为30D8抗体检测MCF-7细胞EGFRvⅢ表达量的FACS结果。其中阴性对照为hIgG1。
图7为C225抗体检测CHO-K1人EGFR的FACS结果。其中阴性对照为hIgG1。
图8为C225抗体检测HEK293T猴EGFR的FACS结果。其中阴性对照为hIgG1。
图9为30D8抗体检测CHO-K1人EGFRvⅢ的FACS结果。其中阴性对照为hIgG1。
图10为ELISA检测本发明VHH-Fc抗体与人EGFR蛋白的结合反应。其中抗EGFR阳性对照抗体为：C225，7D12，阴性对照为hIgG1。
图11为本发明VHH-Fc抗体的与细胞表面EGFR蛋白结合的FACS检测结果；图11A为FACS检测本发明VHH-Fc与人A431细胞的结合反应；图11B为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与CHO-K1人EGFR 1D4细胞的结合反应。其中抗EGFR阳性对照抗体为：C225，7D12，阴性对照为hIgG1。
图12为ELISA检测本发明VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ蛋白的结合反应。其中抗人EGFR vⅢ阳性对照抗体为：C225，7D12，30D8，阴性对照为hIgG1。
图13为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与CHO-K1人EGFRvⅢ1C6细胞的结合反应。其中抗人EGFR vⅢ阳性对照抗体为：C225，7D12，30D8，阴性对照为hIgG1。
图14为ELISA检测本发明VHH-Fc抗体与鼠EGFR蛋白的结合反应。其中阴性对照为hIgG1。
图15为ELISA检测本发明VHH-Fc抗体与猴EGFR蛋白的结合反应。其中抗猴EGFR阳性对照抗体为：C225，7D12，阴性对照为hIgG1。
图16为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与HEK293T猴EGFR细胞的结合反应。其中抗EGFR阳性对照抗体为：C225，7D12，阴性对照为hIgG1。
图17为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与细胞表面人EGFR蛋白特异性结合反应。图17A为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与A431细胞的结合反应；图17B为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与MCF-7细胞的结合反应；图17C为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与CHO-K1-人EGFR 1D4细胞的结合反应；图17D为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与CHO-K1空细胞的结合反应。其中抗EGFR阳性对照抗体为：C225，7D12，阴性对照为hIgG1。
图18为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与细胞表面猴EGFR蛋白特异性结合反应。图18A为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与HEK293T-猴EGFR细胞的结合反应；图18B为FACS检测本发明VHH-Fc抗体与293空细胞的结合反应。其中抗EGFR阳性对照抗体为：C225， 7D12，阴性对照为hIgG1。
图19为ELISA检测本发明VHH-Fc抗体与Her2蛋白的结合反应。
图20为ELISA方法检测本发明VHH-Fc抗体与pepvⅢ之间的结合情况。其中抗pepvⅢ阳性对照抗体为：30D8，阴性对照为hIgG1。
图21为竞争性ELISA方法检测本发明VHH抗体之间的抑制率。
图22为本发明VHH抗体的抗原表位分类。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案或看作对本发明范围的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：针对人EGFR的纳米抗体的筛选
1.1羊驼的免疫和血清效价检测
免疫用的人EGFR蛋白购自ACRO Biosystems(货号：EGR-H5222)。选取两只羊驼(Llama)进行免疫，每只羊驼免疫四次，每次间隔3周，第三次免疫(TB2)后和第四次免疫(TB3)后采集外周血并分离血清，用酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞实验(FACS)检测血清中针对人EGFR的抗体效价和特异性，结果如图1A-1B和表1所示。表1说明，第三次免疫(TB2)血清效价已上升，且第四次免疫(TB3)血清效价保持稳定，羊驼可用于VHH抗体文库构建。
表1.ELISA检测人EGFR蛋白免疫后羊驼血清抗体效价
1.2文库的构建
采集三次免疫后和四次免疫后的羊驼外周血共100mL,使用淋巴细胞分离液分离PBMC，并使用RNAiso Plus试剂(Takara，货号：#9108/9109)提取总RNA，使用PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，货号：6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR 扩增编码重链抗体的可变区核酸片段：
第一轮PCR：
上游引物：CTTGGTGGTCCTGGCTGC(SEQ ID NO.1)
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO.2)
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作为模板，
上游引物：CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC(SEQ ID NO.3)
下游引物-1：
下游引物-2：
回收目标纳米抗体核酸片段，并使用限制性内切酶SfiI(NEB，货号：R0123S)将其克隆进入噬菌体展示用载体pcomb3XSS(来自四川阿帕克生物科技有限公司)中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中，构建针对EGFR的纳米抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为2.0×10 9。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR，结果显示插入率达到100％。
1.3针对EGFR的纳米抗体的淘选
用人EGFR-His标签的融合蛋白(ACRO Biosystems，货号：EGR-H5222)0.5μg/孔包被平板，4℃放置过夜；第二天用3％BSA-PBS 37℃封闭1h后，加入100μl噬菌体展示文库，37℃孵育1h；之后用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次，以洗掉不结合的噬菌体。最后加入100μL Gly-HCl洗脱液，洗脱下来特异性结合EGFR的噬菌体从而富集阳性的克隆。
1.4噬菌体酶联免疫方法筛选特异性单个阳性克隆
淘选后，将获得的人EGFR结合阳性的噬菌体感染空白大肠杆菌并铺板。随后挑选96个单菌落分别扩增培养。用人EGFR-His蛋白分别包被平板4℃过夜，将噬菌体培养上清加入，37℃孵育1小时。加1:1000稀释的用辣根过氧化氢酶标记的M13抗体anti-M13-HRP(NBbiolab，货号：S004H)洗涤之后加入TMB显色液显色，于450nm波长测光密度。挑选人EGFR阳性克隆进行测序。对测序结果使用MOE软件进行分析，根据VHH编码蛋白氨基酸序列构建进化树，根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列后，获得22个克隆，其序列的CDRs分别用KABAT、Chothia或IMGT软件分析，对应的序列信息如下表2-4所示，其中表2示出22个纳米抗体分子氨基酸表示的抗体序列，表3示出22个纳米抗体分子核苷酸表示的抗体序列，表4示出22个纳米抗体分子CDRs的IMGT、Kabat和Chothia分析结果。随后进行VHH纳米抗体Fc融合蛋白的生产鉴定。
表2.抗EGFR抗体重链可变区的氨基酸具体序列信息
表3.抗EGFR抗体重链可变区的核苷酸具体序列信息
表4.IMGT、KABAT和Chothia软件分析EGFR纳米抗体的CDRs具体序列信息
实施例2：纳米抗体、对照抗体、EGFRvⅢ蛋白和pepvⅢ多肽的制备
2.1 VHH-Fc抗体的表达纯化
由泰州市百英生物科技有限公司将VHH可变区序列重组到包含信号肽和人IgG1Fc(人IgG1 Fc序列如SEQ ID NO：6，铰链区序列如SEQ ID NO：7)的表达载体BI3.4-huIgG1(来自Biointron)中，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含VHH-Fc抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB，1M NaCl(pH 7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层 析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。
2.2对照抗体的制备
C225和7D12克隆是识别人EGFR的抗体；30D8克隆仅识别人EGFRvⅢ的抗体；4D5克隆是识别人Her2的抗体。C225克隆的重链可变区(氨基酸序列SEQ ID NO.8)和轻链可变区序列(氨基酸序列SEQ ID NO.9)根据上市药物西妥昔单抗(Cetuximab)获得；7D12克隆的重链可变区(氨基酸序列SEQ ID NO.10)根据专利US10035856B2(其通过援引加入并入本文)获得，30D8克隆的重链可变区(氨基酸序列SEQ ID NO.11)和轻链可变区(氨基酸序列SEQ ID NO.12)序列根据专利US10221242B2(其通过援引加入并入本文)获得；4D5克隆的重链可变区(氨基酸序列SEQ ID NO.13)和轻链可变区序列(SEQ ID NO.14)根据上市药物赫赛汀(Herceptin)获得。由泰州市百英生物科技有限公司完成质粒构建及抗体生产纯化工作。将C225重链可变区和轻链可变区之间通过3个GGGGS连接子连接，克隆到BI3.4-huIgG1载体中，形成C225-scFv-hFc的形式，以下简称C225；分别将30D8和4D5克隆的轻链可变区序列克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HH1中，重链可变区序列分别克隆到包含信号肽和人源抗体IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1HLK中，获得30D8-hIgG1和4D5-hIgG1的序列，以下简称30D8和4D5；将重链抗体7D12可变区序列克隆到含信号肽及人源IgG1抗体Fc区的表达载体BI3.4-huIgG1中，形成7D12-VHH-Fc的形式，以下简称7D12。按照实施例2.1的方法构建质粒，并在HEK293E细胞中进行表达并纯化，所用到的上述抗体的氨基酸序列信息如下表5所示：
阴性对照抗体hIgG1为针对Hen Egg Lysozyme鸡卵溶菌酶的抗体anti-hel-hIgG1(购自百英，货号：B117901)，以下简称hIgG1。
表5.抗人EGFR的抗体C225、7D12、30D8、抗Her2抗体4D5及与人IgG1Fc的具体序列信息
2.3人EGFRvⅢ-His标签蛋白的制备
将含有编码人EGFRvⅢ蛋白(NCBI：NP_001333870.1，SEQ ID NO:15)胞外区(ECD)氨基酸序列Leu25-Ser378(SEQ ID NO：16)的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(购自通用生物系统(安徽)有限公司)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，对应的氨基酸序列信息如下表6所示，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人EGFRvⅢ蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap TM Excel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人EGFRvⅢ蛋白，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的EGFRvⅢ蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图2所示。对制备的上述EGFRvⅢ蛋白用阳性对照抗体C225，7D12，30D8进行ELISA检测，检测结果如图3所示，C225，7D12和30D8均能结合人EGFRvⅢ蛋白，检测结果与文献报道的一致，说明已经制备获得具有结合活性的上述蛋白。
表6.人EGFRvIII蛋白及胞外区氨基酸序列
2.4 pepvⅢ多肽的制备
委托吉尔生化生产人源EGFRvⅢ(NCBI：NP_001333870.1，SEQ ID NO:15)的Leu25-His37多肽pepvⅢ(LEEKKGNYVVTDH)。对制备的上述pepvⅢ多肽用识别不同表位的阳性对照抗体进行ELISA检测，检测结果如图4所示，C225、7D12不能结合pepvⅢ多肽，30D8能结合pepvⅢ多肽，检测结果与文献报道的一致，说明已经制备获得具有结合活性的上述多肽。
实施例3 内源表达细胞株的鉴定和过表达细胞株的制备
3.1内源性表达EGFR细胞株的鉴定
将A431细胞(采购于中国科学院细胞库，货号：TCHu188)在T-175细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用C225，30D8抗体作为一抗，Alexa488标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A11013)，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。分析结果如表7以及图5A-5B所示。结果表明：A431细胞可与C225结合，与30D8不结合，A431细胞作为EGFR抗体筛选的阳性细胞。
表7.内源细胞系A431细胞的FACS检测结果
3.2内源性不表达EGFR细胞株的鉴定
将MCF-7细胞(采购于中国科学院细胞库，货号：TCHu 74)在T-175细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用C225和30D8抗体作为一抗，Alexa488标记的二抗，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。分析结果如表8以及图6A-6B所示。结果表明：MCF-7细胞与C225不结合，与30D8不结合，MCF-7细胞作为EGFR抗体筛选的阴性细胞。
表8.内源细胞系MCF-7细胞的FACS检测结果
3.3 CHO-K1细胞稳转人EGFR单克隆细胞株的制备
编码人EGFR(NCBI：NP_005219，SEQ ID NO：17)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并制备质粒。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行质粒转染( 3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用抗EGFR抗体C225在流式细胞仪FACS AriaII(BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2细胞培养箱中培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆用C225抗体作为一抗，经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高的单克隆细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表9和图7所示，IgG亚型阴性对照为hIgG1对照。表9以及图7中结果说明，已经制得一系列EGFR阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系，CHO-K1-人EGFR 1F2、CHO-K1-人EGFR 1E9以及CHO-K1-人EGFR 1D4为EGFR高水平表达单克隆细胞株。
表9.人EGFR蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
3.4猴EGFR稳转HEK293T细胞株的制备
编码食蟹猴EGFR(以下简称为猴EGFR)全长氨基酸序列(NCBI：XP_005549616.1,SEQ ID NO:18)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成，货号：GNHa 7)并制备质粒。对HEK293T细胞系用 HD(Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/ml嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO 2细胞培养箱中培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用具有猴交叉活性的EGFR抗体C225经流式细胞分析法进行筛选，选择长势较好、荧光强度较高的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，图8为C225抗体检测HEK293T细胞株经流式细胞分析结果，结果显示经过嘌呤霉素筛选后呈现过表达猴EGFR的单一阳性细胞峰的细胞系，可用于检测抗体的交叉活性。
3.5人EGFRvⅢ稳转CHO-K1细胞株的制备
编码人EGFRvⅢ(NCBI：NP_001333870.1，SEQ ID NO：15)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并制备质粒。根据3.3描述方法完成CHO-K1-EGFRvⅢ细胞系单克隆的扩增，对扩增后的克隆用30D8作为一抗，经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高的单克隆细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表10和图9所示，IgG亚型对照为hIgG1对照。表10以及图9的结果说明，已经制得一系列人EGFRvⅢ阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系，CHO-K1-EGFRvⅢ 1C6、CHO-K1-EGFRvⅢ 2G3为EGFRvⅢ高水平表达单克隆细胞株。
表10.人EGFRvⅢ蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
实施例4 VHH-Fc抗体的与人EGFR结合能力鉴定
4.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-Fc抗体与EGFR蛋白的结合
为了检测VHH-Fc与EGFR蛋白的结合活性，将人EGFR蛋白(购买自Acro，货号EGR-H5222)用PBS稀释到终浓度1μg/mL，然后以50μl/孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入100nM梯度稀释的VHH-Fc抗体或阴性对照抗体50μl/孔。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma，货号：A0170)，37℃孵育2小时后，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl/孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)50μl/孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，VHH-Fc与人EGFR的ELISA结果如图10和表11所示，其中IgG对照为hIgG1；7D12，C225为EGFR蛋白阳性对照。结果说明，所有VHH-Fc抗体与人EGFR蛋白在ELISA水平有结合。
表11.ELISA检测VHH-Fc抗体与人EGFR蛋白的结合反应
4.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与不同EGFR表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，对于贴壁细胞A431，MCF-7，CHO-K1，HEK293T吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用胰酶消化细胞，终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次。对上一步的细胞进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2％(w/w)FBS]封闭液重悬至4x10 6个细胞/毫升，按50μl/孔加入到96孔FACS反应板中，加入VHH-Fc抗体待测样品每孔50μl，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入50μl/孔Alexa Flour 488标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A-11013)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光强度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50值。分析结果如表12以及图11A-11B所示，其中IgG对照为hIgG1；7D12，C225为EGFR蛋白阳性对照。结果表明，所有VHH-Fc抗体均可结合A431细胞和CHO-K1-人EGFR 1D4细胞表面的人EGFR蛋白。
表12.FACS检测VHH-Fc抗体与A431细胞、CHO-K1-人EGFR 1D4细胞的结合反应
备注：“拟合差”表示无法计算出EC50值。
实施例5：VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ结合能力鉴定
5.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-Fc抗体与EGFRvⅢ蛋白的结合
为了检测VHH-Fc与EGFRvⅢ蛋白的结合活性，将实施例2获得的纯化的人EGFRvⅢ蛋白用PBS稀释到终浓度1μg/mL，然后以50μl/孔加到96孔ELISA板，根据4.1描述实验方法检测VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ蛋白的结合活性。实验结果如图12和表13所示。其中IgG对照为hIgG1；30D8，7D12，C225为EGFRvⅢ蛋白阳性对照。表中的数据为OD450nm值。结果说明，抗体S008-NB149-64与EGFRvⅢ蛋白在ELISA实验中无结合活性，抗体S008-NB149-1和S008-NB149-9与EGFRvⅢ蛋白在ELISA上有较弱的结合，其余VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ在ELISA水平的结合活性较好。
表13.ELISA检测VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ蛋白的结合反应
5.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与EGFRvⅢ表达细胞的结合
根据4.2所述流式细胞实验的实验及分析方法，分析VHH-Fc抗体与CHO-K1细胞系表面EGFRvⅢ蛋白的结合能力。分析结果如表14以及图13所示，其中IgG对照为hIgG1；30D8，7D12，C225为EGFRvⅢ蛋白阳性对照。结果表明，抗体S008-NB149-64与CHO-K1-EGFRvⅢ1C6表面的EGFRvⅢ蛋白无结合活性，其余VHH-Fc抗体均与CHO-K1-EGFRvⅢ1C6细胞表面的人EGFRvⅢ蛋白结合。
表14.FACS检测VHH-Fc抗体与CHO-K1-EGFRvⅢ1C6细胞的结合反应
备注：“拟合差”表示无法计算出EC50值。
实施例6：VHH-Fc抗体的交叉结合活性检测
6.1 ELISA检测VHH-Fc抗体与不同种属EGFR蛋白的结合
为检测VHH-Fc抗体的种属交叉活性，将商品化的鼠EGFR(SB，货号：51091-M08H)和猴EGFR(SB，货号：90285-C08H)分别包被ELISA板，按照实施例4.1的方法进行ELISA检测。VHH-Fc与鼠EGFR的ELISA结果如图14和表13所示，其中IgG对照为hIgG1；抗鼠EGFR抗体，clone#004(购自SB，货号51091-R004)为鼠EGFR蛋白阳性对照。表15说明，22条纯化后的VHH-Fc抗体，其中9条抗体S008-NB148-25，S008-NB148-5，S008-NB148-69，S008-NB149-1，S008-NB149-12，S008-NB149-15，S008-NB149-20，S008-NB149-22，S008-NB149-60与鼠EGFR蛋白在ELISA水平无结合，其余抗体在ELISA水平上均能与鼠EGFR蛋白有结合。
表15.ELISA检测VHH-Fc抗体与鼠EGFR蛋白的结合反应
*抗鼠EGFR抗体#004稀释倍数为1:10000，OD450为1.72。
VHH-Fc抗体与猴EGFR的ELISA结果如图15和表16所示，其中IgG对照为hIgG1；抗C225，7D12为猴EGFR蛋白阳性对照。结果说明，S008-NB148-2与猴EGFR蛋白在ELISA水平上无结合活性，其余VHH-Fc抗体与猴EGFR蛋白有结合活性。
表16.ELISA检测VHH-Fc抗体与猴EGFR蛋白的结合反应
6.2 FACS检测VHH-Fc抗体与猴EGFR表达细胞的结合
将HEK293T-猴EGFR细胞按照实施例4.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如图16以及表17所示，其中IgG对照为hIgG1；抗C225，7D12为猴EGFR蛋白阳性对照。结果表明，S008-NB148-2与HEK293T细胞表面的猴EGFR蛋白无结合活性，其余VHH-Fc抗体与293细胞表面的猴EGFR蛋白有结合活性。
表17.FACS检测VHH-Fc抗体与HEK293T-猴EGFR细胞的结合反应
抗体名称 最大平均荧光强度 EC50
Max MFI nM
S008-NB148-10 18561 11.69
S008-NB148-13 18508 1.31
S008-NB148-2 88 阴性
S008-NB148-25 19578 3.08
S008-NB148-30 2476 31.91
S008-NB148-48 4749 47.61
S008-NB148-5 16156 27.63
S008-NB148-52 9574 123.4
S008-NB148-69 17575 15.87
S008-NB148-70 11983 2.13
S008-NB148-77 12653 2.18
S008-NB148-8 12922 2.18
S008-NB148-9 2901 20.12
S008-NB149-1 16491 1.10
S008-NB149-12 18880 8.87
S008-NB149-15 19163 3.89
S008-NB149-2 1373 174.4
S008-NB149-20 16979 27.95
S008-NB149-22 9273 拟合差
S008-NB149-60 14118 2.68
S008-NB149-64 18730 1.17
S008-NB149-9 8957 0.57
30D8 77 阴性
7D12 18711 0.70
C225 21057 ～0.85
hIgG1 240 阴性
备注：“拟合差”表示无法计算出EC50值。
实施例7：EGFR抗体特异性测定
7.1 VHH-Fc与人EGFR蛋白特异性测定
将表达人EGFR的内源性细胞A431，转染细胞系CHO-K1-人EGFR 1D4细胞与不表达人EGFR的细胞系MCF-7，CHO-K1空细胞按照实施例4.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表18以及图17A-17D所示，其中IgG对照为hIgG1；抗C225，7D12为猴EGFR蛋白阳性对照。结果表明，所有VHH-Fc抗体与细胞表面的人EGFR蛋白均有特异性结合活性。
表18.FACS检测VHH-Fc抗体与表达人EGFR细胞的结合反应
7.2 VHH-Fc与猴EGFR蛋白特异性测定
将表达猴EGFR的转染细胞系HEK293T-猴EGFR细胞与不表达猴EGFR的细胞系293空细胞按照实施例4.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表19以及图18A-18B所示，其中IgG对照为hIgG1；抗C225，7D12为猴EGFR蛋白阳性对照。结果表明，除S008-NB148-2与HEK293T细胞表面的猴EGFR蛋白无结合活性外，其余VHH-Fc抗体与HEK293T细胞表面的猴EGFR蛋白有特异性结合活性。
表19.FACS检测VHH-Fc抗体与表达猴EGFR细胞的结合反应
7.3 VHH-Fc与人EGFR家族蛋白特异性测定
为检测VHH-Fc抗体与EGFR家族蛋白结合的特异性，将商品化的Her2蛋白(购自Acro，货号HE2-H5225)包被ELISA板，按照实施例4.1的方法进行ELISA检测。VHH-Fc与Her2蛋白的ELISA结果如图19和表20所示，其中IgG对照为hIgG1；4D5为Her2蛋白的阳性对照，检测时仅设置一个浓度10nM，检测结果OD450为4.00，与hIgG1相同浓度下的检测结果差别大于10倍，说明该实验可用于判断VHH-Fc抗体与EGFR家族蛋白Her2的结合反应。结果表明，所有纯化的VHH-Fc抗体与人Her2蛋白在ELISA水平均无结合。
表20.ELISA检测VHH-Fc抗体与Her2的结合反应
实施例8：EGFR抗体亲和力测定
8.1 VHH-Fc与人EGFR蛋白亲和力测定
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人EGFR VHH-Fc抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的EGFR抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的重组人EGFR持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异，同时减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD值和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。VHH-Fc抗体与人EGFR蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kd)及结合亲和力(KD)如表21所示，其中抗体C225，7D12作为阳性对照。如表21所示，所有VHH-Fc抗体与人EGFR蛋白都有结合，亲和力优于5.21E-07M。
表21.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与人EGFR的亲和力
8.2 VHH-Fc与人EGFRvⅢ蛋白亲和力测定
按照实施例8.1的方法对VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ蛋白进行亲和力测定，其中抗体7D12，C225，30D8作为阳性对照。如表22所示，VHH-Fc抗体S008-NB148-2，S008-NB149-64与人EGFRvⅢ未检测出结合信号，其余抗体与人EGFRvⅢ蛋白有结合，亲和力优于5.64E-08M。
表22.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与人EGFRvⅢ的亲和力
8.3 VHH-Fc与猴EGFR蛋白亲和力测定
按照实施例8.1的方法对VHH-Fc抗体与上述猴EGFR蛋白进行亲和力测定，其中抗体7D12，C225作为阳性对照，30D8作为阴性对照。如表23所示，S008-NB148-2抗体与猴EGFR蛋白未检测出结合信号，其余抗体与猴EGFR蛋白均有结合，亲和力优于2.44E-08M。
表23.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与猴EGFR的亲和力
8.4 VHH-Fc与鼠EGFR蛋白亲和力测定
按照实施例8.1的方法对VHH-Fc抗体与上述鼠EGFR蛋白进行亲和力测定。如表24所示，抗体S008-NB148-77，S008-NB148-8，S008-NB149-64与鼠EGFR有结合，亲和力优于5.30E-08M，其余抗体未检测出结合信号。
表24.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与鼠EGFR的亲和力
实施例9 抗体抗原结合表位(epitope)分析
9.1抗体抗原结合区域的鉴定
为了鉴定针对EGFR的VHH抗体的抗原结合表位分布，按照实施例4.1中ELISA方法，包被实施例2.4获得的pepvⅢ多肽。如图20所示，其中抗体30D8作为阳性对照，所有VHH-Fc抗体均不与多肽pepvⅢ结合。除S008-NB149-64不与EGFRvⅢ蛋白结合外，其余抗体结合位点不在EGFRvⅢ蛋白N端多肽pepvⅢ上。
9.2抗体抗原结合表位竞争实验(epitope binning)
采用竞争性ELISA方法对VHH抗体与已知表位的对照抗体进行表位分类。按照实施例4.2的方法将1μg/mL的抗体包被ELISA板，人EGFR蛋白从30μg/mL开始进行梯度稀释，计算出EC80值(表25)。将1μg/mL的抗体包被ELISA板，加入25μg/mL待检测的抗体后，再加入每个包被抗体对应的EC80浓度的人EGFR蛋白，孵育2h，用PBS洗5次后加入HRP标记的anti-His抗体(购买于GenScrip，货号：A00612)检测。若包被抗体与溶液中的待检抗体不存在竞争关系，则该抗体能够与溶液中的待检抗体-人EGFR抗原复合物结合，而检测到OD450nm吸收，根据OD450nm吸光值计算出每对抗体之间的抑制率(图21)。根据抑制率将各抗体表位进行如图22的分类，包括阳性抗体在内的24个抗体可以分为6组，S008-NB149-2，S008-NB148-69，S008-NB148-52为第一组；S008-NB149-20，S008-NB148-13，S008-NB148-77，S008-NB148-8，S008-NB148-9，S008-NB149-60，S008-NB148-2，S008-NB148-70，S008-NB149-15为第二组；S008-NB148-5，S008-NB148-25，S008-NB148-10，S008-NB149-12，S008-NB149-22抗体既与第一组抗体存在竞争关系，又与第二组抗体存在竞争关系；S008-NB148-30为第三组；S008-NB148-48既与第二组抗体存在竞争关系，又与第 三组抗体存在竞争关系；S008-NB149-1，S008-NB149-9为第四组；C225，7D12为第五组，所有抗体与阳性抗体C225，7D12均不存在竞争关系；S008-NB149-64为第六组。
表25.VHH抗体对应的人EGFR蛋白EC80值
EGFR_ EC80μg/mL
hIgG1 阴性
S008-NB148-10 10.5
S008-NB148-13 1.1
S008-NB148-2 15.2
S008-NB148-25 8.3
S008-NB148-30 21.1
S008-NB148-48 64.2
S008-NB148-5 20.1
S008-NB148-52 2.9
S008-NB148-69 3.3
S008-NB148-70 37.4
S008-NB148-77 46.2
S008-NB148-8 76.0
S008-NB148-9 7.9
S008-NB149-1 3.0
S008-NB149-12 2.2
S008-NB149-15 2.4
S008-NB149-2 2.9
S008-NB149-20 2.6
S008-NB149-22 4.6
S008-NB149-60 5.4
S008-NB149-64 0.1
S008-NB149-9 24.5
30D8 阴性
7D12 138.9
C225 862

Claims (22)

  1. 特异性结合EGFR及EGFRvⅢ的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体或抗原结合片段包含CDRs组合，所述CDRs组合包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
    各个CDR1、CDR2和CDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
  2. 权利要求1所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，
    (1)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.63、64、65所示序列；
    (2)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.66、67、68所示序列；
    (3)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.69、70、71所示序列；
    (4)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.72、73、74所示序列；
    (5)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.75、76、77所示序列；
    (6)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.78、79、80所示序列；
    (7)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.81、82、83所示序列；
    (8)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.84、85、86所示序列；
    (9)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.87、88、89所示序列；
    (10)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.90、91、92所示序列；
    (11)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.93、94、95所示序列；
    (12)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.96、97、98所示序列；
    (13)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.99、100、101所示序列；
    (14)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.102、103、104所示序列；
    (15)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.105、106、107所示序列；
    (16)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.108、109、110所示序列；
    (17)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.111、112、113所示序列；
    (18)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.114、115、116所示序列；
    (19)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.117、118、119所示序列；
    (20)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.120、121、122所示序列；
    (21)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.123、124、125所示序列；
    (22)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.126、127、128所示序列；
    (23)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.129、130、131所示序列；
    (24)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.132、133、134所示序列；
    (25)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.135、136、137所示序列；
    (26)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.138、139、140所示序列；
    (27)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.141、142、143所示序列；
    (28)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.144、145、146所示序列；
    (29)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.147、148、149所示序列；
    (30)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.150、151、152所示序列；
    (31)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.153、154、155所示序列；
    (32)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.156、157、158所示序列；
    (33)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.159、160、161所示序列；
    (34)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.162、163、164所示序列；
    (35)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.165、166、167所示序列；
    (36)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.168、169、170所示序列；
    (37)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.171、172、173所示序列；
    (38)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.174、175、176所示序列；
    (39)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.177、178、179所示序列；
    (40)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.180、181、182所示序列；
    (41)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.183、184、185所示序列；
    (42)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.186、187、188所示序列；
    (43)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.189、190、191所示序列；
    (44)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.192、193、194所示序列；
    (45)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.195、196、197所示序列；
    (46)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.198、199、200所示序列；
    (47)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.201、202、203所示序列；
    (48)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.204、205、206所示序列；
    (49)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.207、208、209所示序列；
    (50)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.210、211、212所示序列；
    (51)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.213、214、215所示序列；
    (52)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.216、217、218所示序列；
    (53)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.219、220、221所示序列；
    (54)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.222、223、224所示序列；
    (55)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.225、226、227所示序列；
    (56)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.228、229、230所示序列；
    (57)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.231、232、233所示序列；
    (58)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.234、235、236所示序列；
    (59)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.237、238、239所示序列；
    (60)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.240、241、242所示序列；
    (61)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.243、244、245所示序列；
    (62)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.246、247、248所示序列；
    (63)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.249、250、251所示序列；
    (64)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.252、253、254所示序列；
    (65)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.255、256、257所示序列；
    (66)所述CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.258、259、260所示序列；或，
    (67)所述CDR1、CDR2和CDR3为具有与上述(1)-(66)序列组合相比具有1、2、 3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选为替换，更优选为保守氨基酸残基的替换。
  3. 权利要求1-2任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的纳米抗体或抗原结合片段包含：
    (1)可变区具有SEQ ID NO:19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示序列；
    (2)与上述(1)所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；或，
    (3)所述纳米抗体或抗原结合片段的框架区与SEQ ID NO:19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61所示氨基酸序列的框架区具有至少90％同一性，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
  4. 权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，其与人EGFR及EGFRvⅢ结合的解离常数(KD)不大于10 -7nM，与食蟹猴EGFR结合的解离常数(KD)不大于10 -8nM；
    可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与猴EGFR蛋白结合或不结合；
    可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与鼠EGFR蛋白结合或不结合；
    可选地，所述纳米抗体或抗原结合片段与C225或7D12抗体不竞争。
  5. 权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列；优选包含抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
  6. 权利要求1-5任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段进一步包含不存在CH1片段的抗体恒定区序列。
  7. 权利要求1-5任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段进一步包含具有CH2和CH3片段的抗体恒定区序列，或，所述抗体或抗原结合片段进一步包含抗体Fc区；
    所述抗体恒定区或抗体Fc区通过或不通过连接肽连接所述抗体或抗原结合片段；
    可选地，所述抗体恒定区或抗体Fc区来自骆驼科、小鼠、大鼠、兔、羊或人；
    可选地，所述抗体恒定区或抗体Fc区来自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。
  8. 权利要求1-7任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为：
    (1)嵌合抗体或其片段；
    (2)人源化抗体或其片段；或，
    (3)全人源抗体或其片段；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
  9. 根据权利要求1～8任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体或抗原结合片段进一步还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
  10. 一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含权利要求1～9任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合模块特异性结合EGFR以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的EGFR抗原表位；
    优选地，所述其他抗原选自CD3、PD-1、PD-L1、Her2、EpCAM、CD16、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD64、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL或FAP；
    优选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
  11. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～9任一项所述纳米抗体或抗原结合片段。
  12. 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包含权利要求11所述嵌合抗原受体或包含编码权利要求11所述嵌合抗原受体的核酸片段；
    优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞；
    优选地，所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
  13. 一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-9任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段、或其任意组合，权利要求10所述的多特异性抗原结合分子或权利 要求11所述的嵌合抗原受体。
  14. 包含权利要求13所述分离的核酸分子的表达载体。
  15. 包含权利要求13所述的分离的核酸分子、或权利要求14所述的表达载体的分离的宿主细胞；优选，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌；更优选，所述宿主细胞选自HEK293E或CHO细胞。
  16. 一种制备权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求10所述多特异性抗原结合分子的方法，其特征在于，在适当的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞，并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
  17. 一种制备权利要求12所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求11所述的嵌合抗原受体的核酸片段导入免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求11所述的嵌合抗原受体。
  18. 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的分离的核酸分子、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞，或权利要求16或17所述方法制备的产品；优选，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；优选，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
  19. 权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的分离的核酸分子、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞，或权利要求16或17所述方法制备的产品、或权利要求18所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病的药物中的用途；
    优选地，所述肿瘤疾病或炎性疾病为EGFR过度表达的肿瘤疾病或炎性疾病；更优选地，所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
  20. 一种预防和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的分离的核酸分子、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞，或权利要求16或17所述方法制备的产品、或权利要求18所述的药物组合物；
    优选地，所述肿瘤疾病或炎性疾病为EGFR过度表达的肿瘤疾病或炎性疾病；更优选地，所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
  21. 权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的分离的核酸分子、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞，或权利要求16或17所述方法制备的产品、或权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，用于和/或治疗肿瘤疾病或炎性疾病；
    优选地，所述肿瘤疾病或炎性疾病为EGFR过度表达的肿瘤疾病或炎性疾病；更优选地，所述肿瘤疾病优选神经胶质瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、脑癌、喉癌、直肠癌、胰腺癌、头颈癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、鼻咽癌、食道癌或皮肤癌；所述炎性疾病优选炎症性关节炎、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎、椎关节病变、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、湿疹、皮肤炎、神经发炎、肝病及肾炎、肠胃疾病、发炎性肠病、克隆氏病或胃炎。
  22. 一种试剂盒，其包含权利要求1-9任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的多特异性抗原结合分子、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的免疫效应细胞、权利要求13所述的分离的核酸分子、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞，或权利要求16或17所述方法制备的产品、或权利要求18所述的药物组合物；任选地，还包含使用说明。
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