CN104341503A - 对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗cd20的人抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对蒙古人种及高加索人种低免疫原性的，抗CD20的人抗体分子实体，还公开了该抗体的制备方法以及利用该抗体制备抗肿瘤药物的应用。在该发明中，我们主要针对临床安全性进行如下的优化：1）奥法木单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得奥法木单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生治疗性抵制。因此在该发明中突变其恒定区部分氨基酸使其适于蒙古人种及高加索人种；2）将NS0表达系统更换为CHO表达系统，降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明单抗具有更低的免疫原性；3）在筛选细胞株时，筛选较奥法木单抗CDC活性略低的细胞株，从而使患者在临床上具有更好的适用性。

Description

对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗CD20的人抗体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个与CD20特异性结合，但对蒙古人种及高加索人种适用的、低免疫原性的人抗体分子实体及其应用。

本发明主要涉及通过基因工程手段将已经上市的奥法木单抗（Ofatumumab，Arzerra）进行基因工程改造，突变其恒定区会对蒙古人种产生高免疫原性的氨基酸，使得改造后的人抗体更适用于蒙古人种、高加索人种的基因表型。本发明还基于目前报道的奥法木单抗临床实验效果，优化了其CDC活性，更换其表达系统，使之该发明抗体较奥法木单抗在临床上具有更高的安全性。本发明还涵盖了该抗体在治疗肿瘤，尤其是CD20高表达的慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤中的应用。

背景技术

CD20（亦称为人B淋巴细胞限制性分化抗原）是前B细胞核成熟的B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白（Valentine et al.,J.Bio.Chem.,1989,V264:11282-11287.）。CD20在早期前B细胞发育过程中表达并且持续表达至浆细胞分化时。研究发现，超过90%的非霍奇金氏淋巴瘤患者、慢性淋巴瘤患者及大B细胞淋巴瘤患者B细胞表面高表达CD20分子（Anderson et al.,Blood,1984,V63:1424-1433）,但造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞及其它组织中并未发现前述特征（Tedder et al.,Immunology,1985,V135:973-979.）。基于此特征，Biogen公司于1997年上市了特异性针对CD20的人鼠嵌合型抗体利妥昔单抗（Rituximab，Rituxan），用于治疗慢性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤等，并在临床上给患者带来了巨大的受益。Genmab公司随后在2009年上市了针对CD20其它区域的全人抗体奥法木单抗（ofatumumab），其第一个适应症批准用于氟达拉滨及阿伦珠单抗（alemtuzumab）治疗抵制的慢性B细胞淋巴瘤，目前该品种正在进行慢性淋巴瘤的一线治疗、非霍奇金氏淋巴瘤的一线治疗。

奥法木单抗与利妥昔单抗（Rituximab）的区别主要在于：1）尽管前述两抗体都特异性结合CD20，但两者结合CD20的位点不同；2）奥法木单抗较利妥昔单抗有更高的亲和力及CDC效应；3）奥法木单抗对某些基因如11q缺失的慢性淋巴瘤患者有效，而利妥昔单抗无效。因此奥法木单抗的上市将对利妥昔单抗在临床治疗上形成非常有效的补充。随着科学研究的进展，临床观察及荟萃分析，奥法木单抗在临床上也存在潜在的免疫原性问题，患者会发生获得性抵制,从而影响了奥法木单抗的治疗效果。这种获得性抵制主要是能随着奥法木单抗给药次数的增加患者机体产生了针对奥法木单抗的抗体。患者机体产生针对奥法木单抗的抗体，会由下述3种原因引起：（1）奥法木单抗由鼠杂交瘤NS0细胞生产，产品中含有Di-α1,3GalGal修饰的组分，这种组分在人体内会引起比较强的免疫原性（Jefferis.Nature Reviews Drug Discovery,2009,V8:226-234.）；（2）由患者基因多态性引起的免疫原性（Jefferis et al.,mAbs，2009，V1：1-7；P.Pandey.mAbs,2012,V4:553-554.），其中不同人种间基因多态性决定了奥法木单抗的治疗性抵制与不同患者个体间治疗效果的差异。另，由于奥法木单抗具有非常强的CDC效应，也在一定程度上影响了患者在临床上的适应性。

因此，针对一个很好靶点且已取得良好疗效的奥法木单抗，在临床治疗上仍存在进一步改良的、迫切的需要，以在临床上发挥更佳的临床效果，用于B细胞淋巴瘤治疗。

在该发明中，我们主要针对临床安全性进行如下的优化：1）奥法木单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得奥法木单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生针对奥法木单抗的治疗性抵制。因此在该发明中突变其恒定区部分氨基酸使其适于蒙古人种及高加索人种；2）将NS0表达系统更换为CHO表达系统，降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明单抗具有更低的免疫原性；3）在筛选细胞株时，筛选较奥法木单抗CDC活性略低的细胞株，从而使患者在临床上具有更好的适用性。

发明内容

针对上述奥法木单抗在临床应用中的限制，本发明通过突变奥法木单抗重链恒定区的氨基酸，获得更适于蒙古人种和高加索人种的、抗CD20的单克隆抗体，其结构式见SEQ ID：1（发明所述抗体的重链）与SEQ ID：2（发明所述抗体使用与奥法木单抗相同的轻链）。含轻、重链基因的载体经真核细胞分泌表达，形成由16对2硫键连接的本发明所述的完整抗体：

同时，选择CHO表达系统替代NS0表达系统，从而降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明单抗具有更低的免疫原性；

继而，在开发过程中筛选细胞株时，筛选CDC活性较降奥法木单抗CDC活性略低的细胞株，从而使患者在临床上具有更好的适用性。

本发明的目的是进一步提升奥法木单抗在临床上的普适性及安全性，提供一种更适于蒙古人种和高加索人种的、抗CD20的、提升其临床安全性的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供上述单抗在制备肿瘤药物中的应用。

本发明是通过下列技术措施实现的：

一种抗CD20的人单克隆抗体，所述抗体：

(i)所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球蛋白同种异型氨基酸；

(ii)所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(iii)所述重链与奥法木单抗（Ofatumumab）轻链（SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列）结合成完整的单克隆抗体。

上述的抗体，其特征在于：突变奥法木单抗重链恒定区的氨基酸，使奥法木单抗重链恒定区免疫球蛋白G1m3同种异型转为G1m17同种异型。

上述抗体，其特征在于：将奥法木单抗重链中（SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列）DKRV序列突变为DKKV序列。

一种编码上述抗体的核苷酸序列。

一种包含上述抗体表达载体的宿主细胞。

上述的宿主细胞，其特征在于宿主细胞为真核细胞。

上述的宿主细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。

上述的宿主细胞，优选CHO细胞系。

一种组合物，上述组合物包含权利要求1所述抗体。

上述的抗体在制备抗肿瘤药物的应用。

上述的抗肿瘤药物，优选慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤。

本发明中所用术语“奥法木单抗”，由Genmab公司开发，其CAS号为：679818-59-8，分子式为：C₆₄₈₀H₁₀₀₂₂N₁₇₄₂O₂₀₂₀S₄₄。

本发明中所用术语“免疫球蛋白同种异型”（IgG allotype）是一种遗传标志，指同一种属不同个体间的免疫球蛋白分子抗原性的不同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。同种异型抗原性的差别往往只有一个或几个氨基酸残基的不同，可能是由于编码免疫球蛋白的结构基因发生点突变所致，并被稳定地遗传下来，因此免疫球蛋白同种异型可作为一种遗传标记（genetic markers），这种标记主要分布在抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区上（http://www.wiki8.com/mianyiqiudanbai_28442/）。

IgG1重链恒定区上的同种异型γ1、γ2、γ3重链上均存在有同种异型标记。目前已发现：Glm1、2、3、17；G2m23;G3m21、28、11、5、13、14、10、6、24、15、16、26、27，共20种左右。其中G1m、G2m、G3m分别表示亚类IgG1,IgG2和IgG3，m代表标记（Jefferis et al.,mAbs，2009，V1：1-7；）。

奥法木单抗为IgG1型单抗，因此其同种异型主要有Glm1、2、3、17共计4种。除Glm3和G1m17位于IgG1分子的Cγ1区外，其余的Gm均位于Fc部位。由于人第14号染色体编码四种IgG亚类的C区基因Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4是密切连锁的，因此IgG重链各亚类Gm标记可作为间倍体（haplotype）遗传给子代。

以下主要提供本发明的主要步骤：

突变并构建发明所述单抗轻链（SEQ ID NO:2）和重链（SEQ ID NO:1）氨基酸基因序列的质粒，将该质粒克隆进pCHO1.0载体制备pCHO1.0.HSK-III-001（L+H），使用转染试剂FreeStyle^TM MAX Reagent（Life Technologies），将本项目所述抗体的表达载体“pCHO1.0.HSK-III-001（L+H）”转染于CHO-S细胞（Life Technologies）中。利用本领域人所熟知的各种筛选技术获得高表达细胞株，基于该细胞株表达的抗体经分离纯化后用于质量比较分析及动物体内活性实验验证。

本发明的有益效果

本发明主要的优点：1）奥法木单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得奥法木单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生治疗性抵制。因此在该发明中突变奥法木单抗恒定区部分氨基酸使其更适于蒙古人种及高加索人种；2）将NS0表达系统更换为CHO表达系统，降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明单抗具有更低的免疫原性；3）在筛选细胞株时，筛选较奥法木单抗CDC活性略低的细胞株，从而使患者在临床上具有更好的适用性。因此，基于本发明所制备的单抗，在临床的药效及安全性方面都潜在的显著高于现有的奥法木单抗，具有显著的先进性，也符合我国生物医药开发方面的引进、消化再吸收的开发理念，降低了药物开发的风险。

附图说明

图1pHSK.hCg1,G1m17质粒图谱。

图2pCHO1.0.HSK-III-001（L+H）质粒图谱。

图3是发明所述抗体HSK-III-001的表达曲线。

图4奥法木单抗（批号c546178）与HSK-III-001样品非还原SDS-PAGE电泳图谱。

图5奥法木单抗（批号c546178）与HSK-III-001样品还原SDS-PAGE电泳图谱。

图6HSK-III-001样品与奥法木样品电荷异质性比较。

图7奥法木的糖谱解析。

图8HSK-III-001的糖谱解析。

图9各给药化合物对Ramos裸小鼠移植瘤的疗效--肿瘤重量。

图10各给药化合物对Raji裸小鼠移植瘤的疗效--肿瘤重量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。在此，我们证明了本发明中制备的抗体与奥法木单抗相比：（1）不含有强免疫性Di-α1,3GalGal修饰的组分；（2）较奥法木单抗具有略低的CDC活性；（3）尽管其针对蒙古人种的低免疫原性由于种属原因需要在临床上进行反映，但目前基于众多其它抗体的基础研究及临床研究均已证实：不同人种间对不同药物的敏感程度与人种间免疫球蛋白的不同同种异型分布相关。

实施例本发明所述抗体的制备

实施例1IgGγ1恒定区同种异型突变

通过对IgGγ1恒定区CH1的DNA序列（SEQ ID NO:4）进行点突变，使其由Glm3亚型突变为G1m17亚型（SEQ ID NO:5）。合成覆盖欲突变位点的反向互补引物G1M17a和G1M17b，以及IgGγ1恒定区的正反向引物HCG1F（含AfeI酶切位点）和HCG1R（含NotI酶切位点）。使用HCG1F和G1M17b作为一对正反向引物，以及使用G1M17a和HCG1R作为一对正反向引物，对含IgGγ1恒定区的质粒pHSK.hCg1.G1m3分两段PCR反应，得到两个片段。回收纯化这两个PCR产物片段作为模版，使用HCG1F和HCG1R作为正反向引物，通过重叠PCR把两个片段拼接，得到完整突变了的产物hCg1.G1m17（在两端带有AfeI和NotI酶切位点），克隆到pHSK.hCg1.G1m3的AfeI和NotI酶切位点中，得到“pHSK.hCg1.G1m17”质粒（见图1）。

表1IgGγ1恒定区同种异型突变使用的引物

名称	特征	序列(5’→3’)
			HCG1F	sense hCg1.AfeI	GCTTCGACCAAGGGCCCATC
HCG1R1	antisense hIgG1.NotI	GTCTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG
			G1M17a	sense HSK hCg1.G1m17mut site	GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA
G1M17b	antisense HSK hCg1.G1m17mut site	GTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC

实施例2本发明所述抗体表达载体的构建

人工合成本发明所述单抗重链可变区（SEQ ID NO:6）和轻链可变区（SEQ ID NO:7）DNA片段，在其5’端依次引入Kozak序列和信号肽序列，克隆进pUC57载体，获得“pUC57.HSK-III-001.VH”和“pUC57.HSK-III-001.VL”质粒。

合成引物HSK001VHLF（含EcoRV酶切位点）和HSK001VHHCG1R，以及HCG1F和HCG1R2（含PacI酶切位点），分别以“pUC57.HSK-III-001.VH”和“pHSK.hCg1.G1m17”为模板，通过重叠PCR把HSK-III-001.VH和hCg1.G1m17拼接成完整的重链读码框片段，此片段包括EcoRV酶切位点、kozak序列、重链信号肽序列、HSK-III-001重链序列和PacI酶切位点，将此片段克隆进Freedom^TM pCHO1.0载体（Life Technologies）的EcoRV和PacI位点，得到“pCHO1.0.HSK-III-001.H”质粒。

合成引物HSK001VKLF（含AvrII酶切位点）和HSK001VKHCG1R，以及HCKF和HCKR（含AvrII酶切位点），分别以“pUC57.HSK-III-001.VL”和“pHSK.hCK”（含轻链恒定区序列SEQ ID NO:8）为模板，通过重叠PCR把HSK-III-001.VL和hCK拼接成完整的轻链读码框片段，此片段包括两段的AvrII酶切位点、kozak序列、轻链信号肽序列和HSK-III-001轻链序列，将此片段克隆进“pCHO1.0.HSK-III-001.H”载体的AvrII位点，得到本发明所述抗体表达载体“pCHO1.0.HSK-III-001（L+H）”（见图2）。

表2构建本发明所述抗体表达载体使用的引物

名称	特征	序列(5’→3’)
			HSK001VHLF	sense kozak-HSK001VHL.EcoRV	CACTGATATCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAG
HSK001VHHCG1R	antisense HSK001-VH-hCg1	GATGGGCCCTTGGTCGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTG
			HCG1F	sense hCg1.AfeI	GCTTCGACCAAGGGCCCATC
HCG1R2	antisense hCg1.PacI	GACTTTAATTAATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC
			HSK001VKLF	sense kozak.HSK001VKL.AvrII	GAATCCTAGGCCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAG
HSK001VKHCKR	antisense HSK001-VK-hCK	GAAGACAGATGGTGCAGCCACCGTACGTTTAATCTCCAGT

HCKF	sense hCK	CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTC
			HCKR	antisense hCk.AvrII	CAATCCTAGGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC

实施例3本发明所述抗体稳定细胞株的构建

使用转染试剂FreeStyle^TM MAX Reagent（Life Technologies），将50μg本项目所述抗体的表达载体“pCHO1.0.HSK-III-001（L+H）”转染于3*10^7个CHO-S细胞（LifeTechnologies）中。转染48小时后，在含10μg/mL嘌呤霉素（Puromycin）和100nM氨甲蝶呤（MTX）的条件下进行筛选，待细胞活率恢复至90%以上后加压至30μg/mL嘌呤霉素和500nM氨甲蝶呤，待细胞活率恢复至90%以上后在96孔板进行有限稀释单克隆，筛选获得稳定表达的、质量合乎要求的目标抗体的单克隆细胞株，该细胞株在化学成分明确的无血清无蛋白培养基中培养，目标抗体的产量在流加培养中达到1g/L以上（见图3）。

实施例4本发明所述抗体的纯化

表达的抗体经Protein A、阴离子、阳离子三步层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度>98%（见图4，图5），IEC分析其电荷异质体分布合理且两种单抗的色谱行为一致（图6）。

实施例5本发明所述抗体的糖型分析

糖型的解析主要基于ESI-QTOF对抗体重链以结合形式存在的糖链进行分析，图7是基于QSTAR XL(AB Sciex)质谱仪对NS0系统生产的原研品奥法木单抗的糖谱。图8是对本发明抗体检测的糖谱。从图7和图8比较分析可知，奥法木单抗使用的是NS0表达系统，其产品中含有Di-α1,3GalGal修饰的组分，而本发明所述化合物HSK-III-001采用CHO系统表达，产品检测未发现含有Di-α1,3GalGal修饰的组分。

实施例6本发明所述抗体CDC活性的比较分析

把人血清用RPMI1640做1:2稀释，96孔白色底透assay plate每孔加入50ul。用RPMI1640将HSK-III-001-ref.C545350或其他待检测样品稀释至100μg/ml，然后做三倍梯度稀释，稀释9个点，另外增加一个不含抗体的空白点；96孔板每孔加入10ul，每个浓度做三个复孔。取对数生长期的Raji或者Daudi细胞，1000rpm离心5分钟，用RPMI1640洗涤一次，调整细胞密度为5×105/ml，96孔板每孔加入40ul。对照孔每孔加入50ul RPMI1640和50ul1:2稀释的人血清。把加好细胞和试剂的96孔板在37℃，5%CO2条件下分别孵育1小时。每孔加入100ul CellTiter-Glo Luminescent buffer，在摇床上混合2分钟，然后静置10分钟，记录luminescence信号。

数据处理:

%cytotoxicity=100×(E-S)/(M-S)

其中：E：experimental well的信号

S：细胞+media+补体（不加抗体）的信号

M：media+补体（无细胞和抗体）的信号

以抗体浓度取对数作为X轴，以细胞杀伤率为Y轴，用GraphPad Prisim5作非线性回归。

从表1可以看出，我们筛选的HSK-III-001细胞株表达的产品在Raji细胞和Daudi细胞上都显示较奥法木单抗略低的CDC活性。这可以潜在的受益于临床方案的调整。

实施例7本发明所述抗体体内活性的评价

以BALB/cA-nude裸小鼠为受试动物，评价腹腔注射受试化合物（HSK-III-001）及阳性化合物（奥法木单抗）对荷人淋巴瘤细胞Ramos及Raji移植瘤裸小鼠的疗效。

裸小鼠实验室环境适应四天，60只裸小鼠右肋部皮下接种Ramos细胞；60只裸小鼠右肋部皮下接种Raji细胞：细胞密度均为1×107/100ul/只(含50%matrigel)。肿瘤生长17天后，Ramos荷瘤小鼠肿瘤长至305±63mm3、Raji荷瘤小鼠肿瘤长至262±40mm3，将动物随机分组，每组9/10只(D0)。

腹腔注射给药受试化合物3mg/kg；阳性化合物为1、3、10mg/kg。具体给药方案见表1、表2。每周测2次瘤体积，称体重，记录数据。

使用Excel统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。

肿瘤体积（V）计算公式为：V＝1/2×L长×L短2

相对体积（RTV）=VT/V0

抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积，实验终止时取各组动物解剖取肿瘤块称重（见图9和图10）。

实验结果见表4与表5。对于Ramos荷瘤裸小鼠，3mg剂量下，奥法木单抗与受试化合物HSK-III-001具有相似的抑制肿瘤生长的作用。对于Raji荷瘤裸小鼠，奥法木单抗3mg组与受试化合物HSK-III-001的3mg组及10mg组具有相似的抑制肿瘤生长的作用，三者间均无统计差异。

表3奥法木单抗与HSK-III-001基于Raji细胞和Daudi细胞CDC活性的比较

表4给药化合物对Ramos裸小鼠移植瘤的疗效

表5给药化合物对Raji裸小鼠移植瘤的疗效

Claims (11)

1.一种抗CD20的人单克隆抗体，所述抗体：

       (i) 所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球蛋白同种异型氨基酸；

     (ii) 所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

       (iii) 所述重链与奥法木单抗（Ofatumumab）轻链（SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列）在细胞内自发组装成完整的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于： 突变奥法木单抗重链恒定区的氨基酸，使奥法木单抗重链恒定区免疫球蛋白G1m3同种异型转为G1m17同种异型。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：将奥法木单抗重链中（SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列）DKRV序列突变为DKKV序列。

4.一种编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列。

5.一种包含权利要求4的表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于宿主细胞为真核细胞。

7.根据权利要求5-6所述的宿主细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。

8.根据权利要求5-6所述的宿主细胞，优选CHO细胞系。

9.一种组合物，所述组合物包含权利要求1所述抗体。

10.权利要求1-9任意一项所述的抗体在制备抗肿瘤药物的应用。

11.权利要求10所述的抗肿瘤药物，优选慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤。