MX2010008578A - Anticuerpos anti-receptor 1 de interferon alfa con afinidad reducida al ligando fc. - Google Patents

Anticuerpos anti-receptor 1 de interferon alfa con afinidad reducida al ligando fc.

Info

Publication number
MX2010008578A
MX2010008578A MX2010008578A MX2010008578A MX2010008578A MX 2010008578 A MX2010008578 A MX 2010008578A MX 2010008578 A MX2010008578 A MX 2010008578A MX 2010008578 A MX2010008578 A MX 2010008578A MX 2010008578 A MX2010008578 A MX 2010008578A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
antibodies
seq
disease
human
Prior art date
Application number
MX2010008578A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Kiener
Herren Wu
Anthony Coyle
Ricardo Cibotti
Original Assignee
Medimmune Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medimmune Llc filed Critical Medimmune Llc
Publication of MX2010008578A publication Critical patent/MX2010008578A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-IFNAR1 con afinidad reducida para los receptores Fc y/o ligandos y métodos para hacer y utilizar tales anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTI -RECEPTOR 1 DE INTERFERON ALFA CON AFINIDAD REDUCIDA AL LIGANDO FC Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos aislados y composiciones específicas para el receptor 1 de interferón alfa (IFNAR1) , con afinidad reducida para ligandos Fe. La invención también comprende ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospederas, y métodos para hacerlos y utilizarlos, incluyendo composiciones terapéuticas, formulaciones, administraciones y dispositivos.
Antecedentes de la Invención Interferones : Los interferones de tipo I (IFN) (IFNa, IFNS, IFNco, IFNT) son una familia de citocinas estructuralmente relacionadas que tienen efectos antivirales, antitumorales e inmunomoduladores (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone y Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140). El sitio IFNa humano incluye dos subfamilias. La primera subfamilia consiste de 14 genes no alélicos y 4 pseudogenes que tienen por lo menos 80% de homología. La segunda subfamilia, ocll u omega (?) , contiene 5 pseudogenes y 1 gen funcional que tiene 70% de homología con los genes IFNa ( eissmann y Weber (1986) Prog. Nucí. Acid Res. Mol. Biol, 33:251-300). Los subtipos de Ref. 212886 IFNOÍ tienen diferentes actividades específicas, pero poseen el mismo espectro biológico (Streuli et al. (1981) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 78:2848) y tienen el mismo receptor celular (Agnet M. et al. in "Interferón 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, Londres 1983) . Los subtipos del interferón alfa han sido identificados con la siguiente nomenclatura: IFNOÍ 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 y 21.
El interferón ß (IFN ) se codificada por un solo gen, que tiene aproximadamente 50% de homología con los genes IFNa .
El interferón ?, que se produce a través de linfocitos activados, no posee ninguna homología con los interferones alfa/beta y no reacciona con su receptor.
Receptores de interferón: Todos los interferones de tipo I humano se unen al receptor de la superficie celular (receptor alfa IFN, IFNAR) que consiste de dos proteínas de transmembrana, IFNAR1 y IFNAR2 (Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391). IFNAR1 es esencial para una alta afinidad de unión y una especificidad diferencial del complejo IFNAR (Cutrone et al. 2001 J. Bio Chem 276 (20) : 17140-8) . Ya que las diferencias funcionales para cada tipo de los subtipos de IFN del tipo I no han sido identificados, se cree que cada uno puede exhibir diferentes interacciones con los componentes receptores IFNAR que conducen a resultados de señalización potencialmente diversos (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448). En particular, los estudios que utilizan formas mutantes de IFNAR1 y IFNAR2 sugieren que los interferones alfa y beta llevan a cabo la señalización de manera diferente a través del receptor mediante la interacción diferencial con las cadenas respectivas (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585).
Función de los interferones: Los estudios anteriores funcionales de los IFN del tipo I se enfocaron en una defensa innata contra infecciones virales (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol . 78:181). Los estudios más recientes, sin embargo, implican los IFN de tipo I como citocinas inmunomoduladoras potentes en la respuesta inmunitaria adaptativa. Específicamente, los IFN de tipo I han demostrado que facilitan la diferenciación de células T inexpertas a lo largo de la trayectoria Thl (Brinkmann et al . (1993) J. Exp. Med. 178:1655), para mejorar la producción del anticuerpo (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1179) y dar soporte a la actividad funcional y supervivencia de las células T de memoria (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191: 1777; resistente et al. (1996) Science 272:1947).
Los recientes trabajos de varios grupos sugieren que IFNa puede mejorar la maduración o la activación de las células dendríticas (DC) (Santini et al. (2000) J. Ex . Med. 191:1777; Luft et al. (1998) J. Immunol . 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499). Además, la expresión aumentada de los interferones de tipo I ha sido descrita en numerosas enfermedades autoinmunitarias (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol . 48:192; Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin and Mi11er (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Los ejemplos más estudiados de esto son diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM, por sus siglas en inglés) (Foulis (1987) ) y lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) (Hooks (1982)), que están asociados con niveles elevados de IFN , y artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) (Hertzog (1988) , Hopkins and Meager (1988), Arvin and Miller (1984)), en donde IFNfé puede jugar un papel más significativo.
Además, se ha reportado que la administración de interferón a exacerba la enfermedad subyacente en pacientes con psoriasis y esclerosis múltiple y para inducir un síndrome de tipo SLE en pacientes sin un historial previo de enfermedad autoinmunitaria . El interferón también ha demostrado que induce la glomerulonefritis en ratones normales y acelera el inicio de la enfermedad autoinmunitaria espontánea de ratones NZB/W. Además, la terapia IFNa ha demostrado en algunos casos que conduce a efectos secundarios indeseados, incluyendo fiebre y trastornos neurológicos . Por lo tanto, existen situaciones patológicas en donde la inhibición de la actividad de IFN de tipo I puede ser benéfica para el paciente y existe la necesidad de agentes efectivos en la inhibición de la actividad de IFN de tipo I.
Funciones efectoras del anticuerpo: La región Fe de un anticuerpo interactúa con un número de ligandos (también referidos en la presente como "ligandos Fe") que incluyen pero no se limitan a agentes que se unen específicamente a la región Fe de los anticuerpos, tales como los receptores Fe y Clq) incluyendo los receptores Fe y Clq, que imparten un arreglo de capacidades funcionales importantes referidas como funciones efectoras. Los receptores Fe median la comunicación entre los anticuerpos y el brazo celular del sistema inmunitario (Raghavan et al, 1996, Annu Rev célula Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En humanos esta familia de proteínas incluye FcyRI (CD64) , incluyendo las isoformas FcYRIA, FcyRIB y FcyRIC; FcyRI I (CD32) , incluyendo las formas FcyRI IA, FcyRI IB y FcyRIIC; y FcyRIII (CD 16) , incluyendo las isoformas FcyRIIIA y FcyRIIB (Jefferis et al., 2002, 82:57-65 Immunol Lett) . Estos receptores típicamente tienen un dominio extracelular que media la unión a Fe, una región de propagación de membrana, y un dominio intracelular que puede incluir algún evento de señalización dentro de la célula. Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunitarias que incluyen monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, grandes linfocitos granulares, células de Langerhans, células aniquiladoras naturales (NK, por sus siglas en inglés), y células T. La formación del complejo Fe/FcR recluta estas células efectoras en sitios de unión a ántígeno, típicamente dando como resultado eventos de señalización dentro de las células y respuestas inmunitarias posteriores importantes tales como la liberación de mediadores de la inflamación, activación de la célula B, endocitosis, fagocitosis, y un ataque citotóxico. La habilidad de mediar las funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial a través del cual los anticuerpos destruyen las células objetivo. La reacción mediada por las células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan FcRs reconocen el anticuerpo de unión, en una célula objetivo y subsiguientemente causan la lisis de la célula objetivo es referido como una citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) (Raghavan et al, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290) . La reacción mediada por la célula en donde las células citotóxicas no específicas que expresan Fc/Rs reconocen el anticuerpo unido en la célula objetivo y posteriormente causan la fagocitosis de la célula objetivo es referida como la fagocitosis mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCP) . Además, un sitio de traslape en la región Fe de las moléculas también controla la activación de la función citotóxica independiente de la célula mediada por el complemento, por el contrario, conocida como citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) .
Diferentes tipos de FcyR humanos: Los FcyRs humanos se dividen en tres diferentes clases: FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD 16) . Fcy I es un receptor de alta afinidad (K: 10"8-10"9 M"1) y se une tanto a los complejos inmunitarios como a las moléculas IgG monoméricas, mientras los receptores Fe Fc/RII y FcyRIII exhiben afinidades inferiores (<10~7 M"1 y 2-3xl0"7 respectivamente) (Gessner J.E. et al., 1998, Annn Hematology 76:231-48). La señalización a través de FcY s es ya sea a través de un motivo de activación con base en un inmunoreceptor de tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) o un motivo inhibidor con base en un immunoreceptor de tirosina (ITIM, por sus siglas en inglés) para todos los receptores de transmembrana (Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656) .
El FcyRI de glicoproteína extracelular de 72 kDa principalmente se expresa en células mieloides tales como monocitos, células progenitoras CD4+ de macrófagos y puede provocar la ADCC, endocitosis, y respuestas de la fagocitosis (Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118).
El grupo de FcyRII de 40 kDa de receptores (isoformas A, B y C) exhibe dominios extracelulares , pero no contienen dominios de transducción de señal activos. Estos receptores propagan señales a través de la fosforilación de un dominio de cola citoplasmático (Amigorena S. et al., 1992 Science. 256:1808-12). El FcyRIIA principalmente se expresa en monocitos, macrófagos, neutrófilos y plaquetas, mientras el receptor Fc/ IIC solamente se ha identificado en células NK. Estos dos receptores han demostrado que inician la ADCC, endocitosis, fagocitosis y la liberación del mediador inflamatorio (Cassel et al. 1993. Mol Immunol 30:451-60). En contraste, los receptores Fc/RIIB (tipos Bl y B2) se expresan en células B, mastocitos, basófilos, monocitos, macrófagos y células dendríticas y ha demostrado que regulan de manera descendente la respuesta inmunitaria activada para isoformas A y C.
El FcyRIIIA de 50 kDa, se expresa en células NK, monocitos, macrófagos y un subgrupo de linfocitos T en donde activa ADCC, fagocitosis, endocitosis y la liberación de la citocina (Gessner et al) . Las isoformas Fc/RIIIB son una proteína de membrana periférica anclada de glicosil- fosfatidilinositol (GPI, por sus siglas en inglés) involucrado en la desgranulación y la producción de intermediarios del oxígeno reactivo (Salmón JE. et al 1995 J Clin Inves 95:2877-85).
Las moléculas IgG también exhiben diferente especificidad de isotipo para FcyRs . Las moléculas IgG3 se unen fuertemente a todas las isoformas FcTR. IgGl, la más prevalente de las isoformas en la sangre se une a todos los Fc/R aunque con una afinidad inferior para las isoformas FCRIIA/B. IgG4 es un aglutinante intermedio para FC/RI y un aglutinante débil para FcyRIIB. Finalmente, IgG2 se une solo débilmente a una forma alélica de FcyRIIA (FeyRlIA-Hl3l) (Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118) .
Complemento La cascada inflamatoria del complemento es una parte de la respuesta inmunitaria innata y es crucial para la habilidad de un individuo para evitar la infección. Otro ligando Fe importante es la proteína de complemento Clq. la unión de Fe a Clq media un proceso denominado ci totoxicidad dependiente del complemento (CDC) (revisada en Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77- 94) . Clq es capaz de unirse a seis anticuerpos, aunque la 'unión a dos IgG es suficiente para activar la cascada de complemento. Clq forma un complejo con las serina proteasas Clr y Cls para formar el complejo Cl de la trayectoria de complemento.
Reglones y residuos de aminoácido de IgG involucrados en la unión de FcfR El mapeo de los sitios de unión de IgG humano a diferentes Fc/R se ha estudiado extensivamente. Estos estudios, basados en moléculas IgG genéticamente alteradas han identificado un tramo corto continuo de residuos de aminoácido (234-238) de la parte del término N del dominio CH2 como estando directamente involucrado en la unión a todos los Fc/Rs . Adicionalmente, los residuos 268, 297, 327 y 329 pueden impactar la unión a un subgrupo de FcyRs . También, múltiples residuos localizados en los dominios CH2 y CH3 contribuyen a la unión de Fc/R (Canfield SM. et al., 1991 J Exp Med 173:1483-91, Chappel MS . Et al. 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888:9036-40, Gergely J. et al. 1990 FASEB J 4:3275-83) .
Toxicidad relacionada con el terapéutico del anticuerpo En muchas circunstancias, la unión y la estimulación de las funciones efectoras mediadas por la región Fe de inmunog1obulinas es altamente benéfica, sin embargo, en ciertos casos puede ser más ventajoso disminuir o eliminar la función efectora. Esto es particularmente cierto para aquellos anticuerpos diseñados para suministrar un fármaco (por ejemplo, toxinas e isótopos) a una célula objetivo en donde las funciones efectoras mediadas por Fc/Fcy aportan células inmunitarias sanas en la proximidad de la carga mortal, dando como resultado el consumo de un tejido linfoide normal junto con las células objetivo (Hutchins et al, 1995, PNAS USA 92:11980-11984; White et al, 2001, Annu Rev Med 52: 125-145). En estos casos, el uso de anticuerpos que reclutan pobremente células complemento o efectoras será un beneficio tremendo (ver, por ejemplo, Wu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J. Biol Chem 276:6591-6604; U.S. 6,194,551; U.S. 5,885,573 y publicación PCT WO 04/029207) .
En otros casos, por ejemplo, cuando el bloqueo de la interacción de un receptor ampliamente expresado con su ligando cognado es el objetivo, sería ventajoso disminuir o eliminar toda la función efectora del anticuerpo para reducir la toxicidad indeseada. También, en el caso en donde un anticuerpo terapéutico exhibe una unión promiscua a través de un número de tejidos humanos, sería prudente limitar la activación de la función efectora a un grupo diverso de tejidos para limitar la toxicidad. Aunque existen ciertas subclases de inmunoglobulinas humanas que carecen de funciones efectoras específicas, existen inmunoglobulinas de existencia natural no conocidas que carecen de todas las funciones efectoras. Un método alternativo sería modificar o mutar los residuos críticos en la región Fe que son responsables de la función efectora. Para ejemplos, ver las publicaciones PCT O2006076594 , 0199958572, US20060134709 , O2006047350, WO2006053301 , y U. S. 5,624,821 cada una de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad.
El uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento de muchos estados de enfermedades ha sido bien documentado. Con la miríada de funciones efectoras que un anticuerpo puede activar, uno de los requerimientos terapéuticos del anticuerpo es que activen específicamente un objetivo de interés. Por ejemplo, pero no limitándose a, la especificidad del tejido objetivo se analiza mediante el examen de la inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) de un tejido de interés. Es importante que el terapéutico solamente se una a los tejidos que contienen un objetivo de interés. No hacer esto dará como resultado una toxicidad superior del terapéutico del anticuerpo debido a la activación inapropiada de la función efectora provocada en el sitio no activado. Si la función efectora puede disminuirse o eliminarse, el peligro de una unión extendida del terapéutico puede evitarse. Con todas estas consideraciones, existe una necesidad sin cumplir para anticuerpos con afinidad reducida o eliminada para al menos un ligando Fe responsable, para facilitar la función efectora. Tales anticuerpos serían de beneficio particular para utilizarse en el tratamiento de afecciones inflamatorias crónicas y autoinmunitarias .
Las citas o la explicación de una referencia en la presente no deben construirse como admisión de que tal es la técnica anterior a la presente invención.
Breve Descripción de las Figuras Con el propósito de ilustrar la invención, se describen en las figuras ciertas modalidades de la invención. Sin embargo, la invención no está limitada a con iguraciones e instrumentalidades precisas de las modalidades descritas en las descritas en las figuras.
Figura 1A. alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 7) y de aminoácido (SEC ID NO: 8) de 3F11 VH con las regiones CDR indicadas por una línea superior .
Figura IB. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 9) y de aminoácido (SEC ID NO: 10) de 3F11 VK con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 2A. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 17) y de aminoácidos (SEC ID NO: 18) 4G5 VH con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior.
Figura 2B. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 19) y de aminoácidos (SEC ID NO: 20) de VK 4G5 con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 3A. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 27) y de aminoácidos (SEC ID NO: 28) de 11E2 VH con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 3B. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 29) y de aminoácidos (SEC ID NO: 30) de 11E2 VK con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 4A. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 37) y de aminoácidos (SEC ID NO: 38) de 9D4 VH con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 4B. Alineación de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 39) y de aminoácidos (SEC ID NO: 40) de 9D4 VK con las regiones CDR marcadas indicadas por una línea superior .
Figura 5. Alineación de la secuencias de aminoácido de las regiones constantes de cadena pesada para 9D4. Las flechas indican sustituciones de aminoácidos (no modificadas a modificadas) para aumentar la estabilidad y reducir la afinidad de por lo menos un ligando Fe.
Figura 6A. Perfil de tinción inmunohistoquímica de te ido de cerebro humano tratado con varios anticuerpos anti-IFNAR1. El anticuerpo 9D4 exhibe un perfil de tinción inferior cuando se incuba con tej ido de cerebro humano comparado con los anticuerpos 4G5 y MDX-1333.
Figura 6B. Perfil de tinción inmunohistoquímica de monocitos humanos tratados con varios anticuerpos anti-IFNAR1. Como control positivo, se ensayaron varios anticuerpos anti-IFNARl para reactividad a monocitos humanos.
Figura 7. El anticuerpo 9D4 anti-IFNARl inhibe la señalización de IFNOÍ en una célula con base en el ensayo de activación STAT. El tratamiento con el anticuerpo 9D4 inhibe la forsforilación de tirosina STAT 1/3/4 en respuesta a la estimulación con interferon alfa según lo determinado por el análisis Western Blot con anticuerpos STAT comercialmente disponibles .
Figura 8. Señalización de bloqueo en algunos anticuerpos anti-IFNARl de varias concentraciones de IFN de tipo I derivado de la célula PDC. Se presentan los valores de IC50 para el anticuerpo 9D4 que bloquean la señalización IFN en un ensayo de indicador luciferasa utilizando sobrenadantes IFN de tipo I, purificados 3 donadores independientes. Se incluyen las cantidades relativas de IFNa, IFNS, e IFNCÚ en cada sobrenadante del interferon del tipo I purificado.
Figura 9A-9C. Los anticuerpos 9D4 , 9D4-DM anti- IFNARl (mutante doble) , y 9D4-TM (mutante triple) exhiben similares características de unión. Se presentan los datos que representan el anticuerpo 9D4 sin modificar junto con dos anticuerpos modificados, 9D-DM y 9D4-TM. Los anticuerpos modificados exhiben similares características de unión IFNAR1 para el anticuerpo sin modificar.
Figura 10A. El anticuerpo 9D4 anti-IFNARl se une al receptor del interferón alfa (sIFNaRl) . Se presentan los datos de unión en equilibrio que demuestran la unión dependiente de la dosis de 9D4 al receptor interferón alfa soluble .
Figura 10B. Determinación del Kd de 9D4 en PBMC humano. Se presenta la determinación de la constante de disociación de 9D4 medida a través de la unión a PBMC humano.
Figura 11. Los anticuerpos anti-IFNARl inhiben la señalización inducida por IFNa en un ensayo de indicador de luciferasa. Los anticuerpos anti-IFNARl incluyendo anticuerpos sin modificar y modificados demuestran valores IC50 similares para bloquear la señalización de IFN de leucocito en un sistema de ensayo indicador de luciferasa.
Figura 12A. Determinación del punto isoeléctrico de 9D4 (sin modificar), y anticuerpos 9D4 modificados. Se presenta un gel IEF que documenta los valores pl relativos para los anticuerpos 9D4 TS (sin modificar) , 9D4-DM, y 9D4-TM .
Figura 12B. Determinación de las temperaturas de fusión térmicas de los anticuerpos 9D4 (sin modificar) y 9D4 modificado. Se presenta una curva de fusión que documenta las temperaturas de fusión relativas (Tm) para los anticuerpos 9D4, 9D4-DM, y 9D4-TM.
Figura 13. Tratamiento profiláctico con los anticuerpos anti-IFNAR que bloquean la proteinuria inducida por Adv-IFNa. Los ratones tratados con el vector de control Adv-IFN , Adv-IFNa + pre-tratamiento de control de isotipo, y pre-tratamiento Adv-IFNa + anti-IFNAR se analizaron para proteinuria durante 9 semanas. Los ratones pre-tratados con anti-IFNAR no exhibieron proteinuria después de un ataque con IFNa.
Figura 14. Tratamiento profiláctico con los anticuerpos anti-IFNAR bloquean la regulación ascendente de los genes sensibles a IFNa (IFIT1, IFI44, CXCL11, IFI202b, CXCL19, CXCL9) en la sangre. Los ratones pre-tratados con los anticuerpos anti-IFNAR no exhiben genes sensibles a IFNa seleccionados regulados de manera ascendente después del ataque con IFN alfa codificado de adenovirus en comparación con ratones pre-tratados con virus de control, PBS, o controles IgG de isotipo. Se presenta la expresión relativa de seis genes que se sabe que son sensibles a IFNa en muestras sanguíneas tomadas de ratones 3 semanas después de la incubación IFNa mediante la infección con Adv-IFNa.
Figuras 15A-15B. El tratamiento profiláctico con anticuerpos anti-IFNAR que bloquea la producción de auto-anticuerpos inducidos por IFNa. Los ratones pre-tratados con los anticuerpos anti-IFNAR no exhiben una producción auto-anticuerpo después del ataque con IFNa codificado por adenovirus cuando se compara con ratones pretratados con virus de control, PBS o controles IgG' de isotipo. Se presentan las concentraciones de anti-ADNds y anti-SSA/Ro en muestras sanguíneas tomadas de ratones 6 semanas después de la inducción de IFNa a través de la infección con Adv-IFNa.
Figuras 16A-16B. El tratamiento profiláctico con anticuerpos anti-IFNAR que bloquean la regulación ascendente de citocinas en el riñon. Los ratones pretratados con los anticuerpos anti-IFNAR exhiben citocinas reguladas de manera ascendente en el riñon después del ataque con IFNa5 codificado con adenovirus cuando se compara con ratones pretratados con virus de control, PBS o controles IgG de isotipo. Se presentan la medición de IP-10 y los niveles IL-18 en muestras de riñon tomadas de ratones 6 semanas después de la inducción de IFNa a través de la infección con Adv-IFNo¡5.
Figura 17. Tratamiento profiláctico con anticuerpos anti- IFNAR que bloquean la producción de auto-anticuerpos inducidos por IFN. Se presentan las concentraciones relativas de los anticuerpos del antígeno anti -nuclear (ANA) para suero de ratón. Los ratones pre-tratados con anticuerpos anti-IFNAR exhibieron concentraciones en el suero de ANA inferiores después del ataque con IFN que los ratones pretratados con virus de control, PBS, o control de isotipo.
Figura 18. Inhibición mediada por el anticuerpo del desarrollo de células dendríticas mediadas por plasma SLE. Se presentan los resultados de 5 experimentos individuales en donde el IFN derivado de pacientes con SLE se incubó en la presencia del anticuerpo 9D4 anti-IFNARl y, posteriormente se agregó a los monocitos humanos. La presencia del anticuerpos 9D4 anti-IFNARl inhibió la habilidad de IFN derivado de pacientes con SLE para inducir los marcadores de célula dendrítica CD38 y CD123 en la diferenciación de los monocitos .
Figuras 19A-19C. Los anticuerpos anti-IFNARl suprimen la expresión de CD38, CD86 y CD123 en monocitos estimulados con el interferón de leucocito. Según medido por el porcentaje de supresión de la expresión estimulada por control, los anticuerpos 9D4, 9D4-DM y 9D4-TM anti-IFNARl exhibieron perfiles de inhibición similares para la expresión de CD38, CD86 y CD123 en la diferenciación de monocitos.
Figura 20. Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben una unión disminuida al receptor FcTRI Fe comparado con los anticuerpos anti-IFNARl sin modificar. Los anticuerpos anti-IFNARl 9D4 (sin modificar) , 9D4-DM (modificado) y TM-9D4 (modificado) se analizaron para la habilidad de unirse a una placa con FcTRI unido en un experimento ELISA. Como un control positivo para la unión del receptor Fe, se utilizó un anticuerpo sin modificar no relacionado (anticuerpo de control) .
Figuras 21A-21C. Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben una unión disminuida al receptor FcyRIIIA Fe cuando se compara con los anticuerpos anti-IFNARl sin modificar. La placa del anticuerpo 9D4 (Figura 21A) anti-IFNARl sin modificar unido y los anticuerpos anti-IFNARl 9D4-DM (Figura 21B) y 9D4-TM (Figura 21C) se analizaron para la habilidad de unirse a FcYRIIIA libre en un formato experimental ELISA.
Figuras 22A-22C. Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben una unión disminuida al FcTRIIIA del receptor Fe. El anticuerpo 9D4 (Figura 22A) anti-IFNARl sin modificar libre y los anticuerpos 9D4-DM (Figura 22B) y 9D4-TM (Figura 22C) anti-IFNARl modificados se analizaron para la habilidad de unirse a la placa FcTRIIIA unida en un formato experimental ELISA.
Figura 23A-23E. Neutralización de los subtipos IFN en el suero de pacientes con SLE . Según medido por el ensayo indicador, los anticuerpos MDX-1333, 9D4-WT y 9D4-TM anti-IFNARl inhibieron la señalización mediada por IFN de alO (Figura 23A) , interferón de leucocito (Figura 23B) , a2b (Figura 23C) , ? (Figura 23D) y ß (Figura 23E) .
Figura 24. Los anticuerpos anti-IFNARl neutralizan el interferón de tipo I de pacientes con SLE. A través del ensayo de indicador, el anticuerpo anti-IFNARl, 9D4 , inhibió la señalización mediada por el interferón de tipo I en comparación con un anticuerpo de control, no relacionado.
Figura 25A-25D. Los anticuerpos anti-IFNAR suprimen la población pDC inducida IFNa en PBMC. Los anticuerpos anti-IFNAR bloquean la elevación de las células pDC medidas a través de la expresión de epítopo de superficie celular, inducida por la expresión inducida adenoviral ectópica de interferón alfa en bazo (Figura 25A) , nodos linfoides (Figura 25B) , sangre periférica (Figura 25C) y médula espinal (Figura 25D) .
Figura 26. Análisis de unión de los anticuerpos 9D4-WT, 9D4-DM, y 9D4-TM anti-IFNARl al receptor FcyRI Fe se determinó a través del análisis BIACore. En resumen, los anticuerpos anti-IFNARl se inmovilizaron y se agrego FcT I libre para medir la afinidad. Como se muestra por el rastreo, los anticuerpos modificados 9D4-DM y 9D4TM exhibieron afinidades inferiores al FcyRI libres en comparación con el anticuerpo 9D4-WT sin modificar.
Figuras 27A-27C. El análisis de unión de los anticuerpos 9D4-WT, 9D4-DM, y 9D4-TM anti-IFNARl al receptor FcyRI Fe se determinó a través del análisis Biacore. En resumen, los anticuerpos anti-IFNARl libres se hicieron pasar sobre FcyRI inmovilizado para medir la afinidad. Como se demuestra por el rastreo, los anticuerpos 9D4-DM (Figura 27B) y 9D4-TM (Figura 27C) modificados exhibieron afinidades inferiores a el FcyRI unido en comparación con el anticuerpo 9D4-WT (Figura 27A) sin modificar.
Figura 28. Los anticuerpos anti-IFNAR inhiben la inducción del gen sensible a IFNa en el riñon. En resumen, en el modelo de ratón de lupus acelerado, el tratamiento con los anticuerpos anti-IFNAR bloquea la inducción en el riñon de seis genes (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10 y IFIT1) mediada por la expresión ectópica de IFNa comparado con ratones de control según medido a través de un ensayo Taqman.
Figura 29. Los anticuerpos anti-IFNAR inhiben la producción de anticuerpos de ADN anti-ds en el modelo de ratón de lupus acelerado. En resumen, los ratones que típicamente expresan IFNa y que se trataron con los anticuerpos anti-IFNAR no acumularon anticuerpos anti-ADN a ds al mismo nivel que los ratones similarmente afectados y tratados con un anticuerpo de control IgG.
Figuras 30A-30B. Los anticuerpos anti-IFNAR son capaces de reducir la proteinuria en una configuración terapéutica del modelo de ratón de lupus acelerado. (Figura 30A) En resumen, los ratones expresan ectópicamente síntomas de tipo lupus desarrollados por IFNa, tales como proteinuria. En un estudio terapéutico, los anticuerpos anti-IFNAR se administraron a los ratones una vez que se alcanzo la puntuación de proteinuria de umbral. Los anticuerpos anti-IFNAR, PBS, o control IgG se administraron semi - semanalmente durante un transcurso de 5 semanas. El grupo tratado con el anticuerpo anti-IFNAR exhibió una proteinuria con severidad disminuida durante el experimento comparado con PBS solamente o con grupos tratados con IgG de control .
Figura 31. Los anticuerpos anti-IFNAR son capaces de aumentar la sobrevivencia en una configuración terapéutica del modelo de ratón de lupus acelerado. En resumen, los ratones que expresan ectópicamente IFNa tuvieron un grado de supervivencia reducido de aproximadamente 8 semanas después de desarrollar síntomas de tipo lupus tales como proteinuria. En un estudio terapéutico, los anticuerpos anti-IFNAR se administraron a los ratones una vez que se alcanzó la puntuación de proteinuria de umbral. Los anticuerpos anti-IFNAR, PBS, o IgG de control se administraron semi-semanalmente durante el transcurso de durante 5 semanas . Después de 5 semanas, el tratamiento del anticuerpo se detuvo y la mortalidad se rastreó para los tres grupos de tratamiento. El grupo tratado con el anticuerpo IFNAR exhibió un grado mucho menor de mortalidad que los grupos de PBS solo, o de IgG de control, los cuales ambos exhibieron una mortalidad completa a las 9 semanas.
Figura 32. Representación del contenido unitario asimétrico de los cristales de Fc-TM que comprende las mutaciones L234F/L235E/P331S . La mutación P331 se indica en rojo. Un ion de zinc se quilató a través de dos residuos de histidina espacialmente cercanos. Los residuos de carbohidrato unidos a 297 se moldearon de acuerdo con densidad de electrón.
Figura 33. Las imágenes cinéticas demuestran la internalizacion de 9D4-TM. Las células THP-I se tiñeron con 1 mM de CFSE en una incubadora de C02 a 37 °C durante 10 minutos seguido por 1 mg/ml de Alexa647-9D4-TM en hielo durante 1 hora. Después de la remoción de las partes no unidas las células se incubaron a 37 °C durante los tiempos indicados (0, 15, 30 y 60 minutos) y se tomaron las imágenes de las células.
Figura 34. El anticuerpo anti-IFNARl 9D4-TM no exhibe actividad CDC en un ensayo in vitro. Se presentan en este panel los resultados de un ensayo CDC para determinar la habilidad del anticuerpo 9D4-TM para provocar la actividad CDC. Como se presenta, el anticuerpo 9D4-TM no exhibe ninguna actividad CDC, cuando se compara con el anticuerpo de control positivo. La actividad CDC también fue indetectable para un anticuerpo de control no relacionado, R347. En resumen, las células que expresan el antígeno IFNAR1 se incubaron con ya sea el anticuerpo 9D4-TM o R347 de control positivo. Después de una serie de lavados, se agregó suero humano frescamente preparado. La c itotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se midió utilizando un ensayo de liberación LDH .
Descripción Detallada de la Invención Terminología Los términos "interferón a", "IFNa", "IFNa", "IF A" e "IFN alfa" se utilizan de manera intercambiable y pretenden referirse a proteínas IFN alfa codificadas por un gen funcional del lugar del gen de interferón alfa con 75% o mayor identidad de secuencia al IFN alfa 1 (número de acceso GenBank NP_076918 o proteína codificada por el número de acceso GenBank NM_024013) . Los e emplos de subtipos de IFN alfa incluyen IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 4b, alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 13, alfa 14, alfa 16, alfa 17 y alfa 21. Los términos "interferón alfa", "IFNa", y "IFN alfa" pretenden abarcar las formas recombinantes de varios subtipos de IFN alfa así como preparaciones de existencia natural que comprenden proteínas IFN alfa, tales IFN de leucocito e IFN de linfoblastoide .
Los términos "receptor 1 de interferón alfa", "IFNAR1", "IFNAR-1" y "antígeno IFNAR-1" se utilizan de manera intercambiable, e incluyen variantes, isoformas, especies homologas de IFNAR-1 humano y análogos que tienen por lo menos un epí opo común con IFNAR-I. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la invención pueden, en ciertas modalidades, reaccionar de manera cruzada con IFNAR-I de las especies diferentes de las humanas, u otras proteínas que están estructuralmente relacionadas con IFNAR-I humano (por ejemplo, homólogos de IFNAR-1 humano) . En otras modalidades, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para IFNAR-1 humano y no exhiben especies u otro tipo de reactividad cruzada. La secuencia de ADNc completa de IFNAR-1 humano tiene el número de acceso Genbank NM_000629.
Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones de secuencias conservadoras" pretende incluir modificaciones de aminoácido que no afectan o alteran las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invención a través de técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácido conservadoras son aquellas en las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, uno o más aminoácidos de una polaridad similar actúan como equivalentes funcionales y dan como resultado una alteración en silencio dentro de la secuencia de aminoácido del péptido. Las sustituciones que son carga neutral y que reemplazan un residuo con un residuo más pequeño también pueden considerarse "sustituciones conservadoras" , aún cuando los residuos están en grupos diferentes (por ejemplo, el reemplazo de fenilalanina con isoleucina menor) . Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Varios ejemplos no limitantes de las familias y sustituciones de aminoácidos conservadoras se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Familias de sustituciones de aminoácido conservadoras En contraste con las enseñanzas anteriores, los inventores han encontrado que los anticuerpos anti-IFNARl con una función efectora reducida o eliminada son deseados para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias crónicas. Previamente, los anticuerpos dirigidos contra IFNARl se desarrollaron con el entendimiento de que la función efectora jugaría un papel en la mediación del tratamiento o al menos la moderación de un estado de enfermedad autoinmunitario y/o inflamatorio crónico (ver, por ejemplo Publicación de E . U. A. 20060029601 o Publicación PCT No. O06002177) . Con este concepto, muchas de las enseñanzas previas dirigidas al técnico para identificar anticuerpos anti-IFNARl con una fuerte función efectora y para además mejorar la función efectora aumentando la afinidad del anticuerpo para los receptores Fe (por ejemplo, FcRn, FcyRIIIa, FcRIIb) y/o la, proteína complemento Clq. Estos anticuerpos anti-IFNARl mejoradores de la función efectora resultante se cree que son ventajosos en el tratamiento de estados de enfermedad.
En contraste con el entendimiento previo, la presente invención describe anticuerpos anti-IFNARl con una función efectora reducida o eliminada (tales como ADCC y/o CDC) . A través de los estudios de reactividad cruzada tisular, sorprendentemente se encontró que los anticuerpos anti-IFNARl con una fuerte o mejorada función efectora despliegan una propensión hacia una toxicidad indeseada debido a la prevalencia de la tinción de anti-IFNARl en tejidos no activados. Esta toxicidad resultará de la activación no específica de ADCC y/o CDC en sitios apropiados. Para reducir o eliminar esta toxicidad indeseada, los inventores reconocieron la necesidad de reducir la función efectora de los polipéptidos que comprende una región Fe.
Por consiguiente, un aspecto de la invención abarca anticuerpos modificados u otros polipéptidos que comprenden la región Fe de un anticuerpo, que comprende la adición, sustitución o eliminación de por lo menos un residuo de aminoácido en la región Fe que dando como resultado una afinidad reducida o eliminada de para al menos un ligando Fe (referido en la presente como "anticuerpos de la invención modificados" , "anticuerpos modificados" o "anticuerpos de la invención") . La región Fe interactúa con un número de ligandos que incluyen pero no se limitan a receptores Fe (por ejemplo, FcRn, FcyRIIIa, FcyRIIb) , la proteína complemento Clq, y otras moléculas tales como las proteínas A y G. Estas interacciones son esenciales para una variedad de funciones efectoras y eventos de señalización en corriente descendente que incluye, pero no se limitan a, citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Por consiguiente, en ciertas modalidades los anticuerpos modificados de la invención tienen una afinidad reducida o eliminada para un ligando Fe responsable de facilitar la función efectora comparada con un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácido que el anticuerpo de la invención, pero que no comprende la adición, sustitución o eliminación de por lo menos un residuo de aminoácido para la región Fe (también referido en la presente como un "anticuerpo sin modificar").
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden por lo menos una o más de las siguientes propiedades: función efectora reducida o eliminada (ADCC y/o CDC) , unión reducida o eliminada a receptores Fe, o toxicidad reducida o eliminada. Más específicamente, las modalidades de la invención proporcionan anticuerpos anti-IFNARl con afinidad reducida para los receptores Fe (por ejemplo, FcRn, FcRIIIa, FcRIIb) y/o la proteína complemento Glq.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden una región Fe que comprende por lo menos una adición, sustitución o eliminación del residuo de aminoácido seleccionado de las posiciones que consisten de: 234, 235 y 331, en donde el sistema de numeración de la región constante es la del índice de EU como se estable en Kabat et al. (1991, NIH Publicación 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención comprenden una región Fe que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo de: L234F, L235E y P331S, en donde la primera letra y el número representan el aminoácido sin modificar y su posición y la segunda letra representan el aminoácido sustituido en esa posición.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención además comprenden una región Fe que comprende por lo menos una adición, sustitución o eliminación de un residuo de aminoácido que está correlacionado con una estabilidad incrementada del anticuerpo. En una modalidad, la adición, sustitución o eliminación del residuo de aminoácido está en la posición 228 de la región Fe, en donde el sistema de numeración de la región constante es la del índice de EU como se establece por Kabat et al. En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención comprenden una región Fe que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 228, en donde la sustitución es un residuo de serina. En otra modalidad específica, los anticuerpos de la invención del subtipo IgG4 comprenden una sustitución de aminoácido de serina en la posición 228 de la región Fe. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención ya comprenden un residuo de serina en la posición 228 de la región Fe; en tales modalidades, no se requiere modificación. En modalidades alternativas, los anticuerpos de la invención no requieren modificación en el residuo 228 de la región Fe o ya comprenden una serina en esa posición.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, pero no limitándose a IgG, IgM e IgE) . En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son miembros de la clase IgG de anticuerpo. En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención son de la subclase IgGl . En otra modalidad específica, los anticuerpos de la invención son de la subclase IgGl y comprenden las siguientes sustituciones de aminoácido: 234F, 235E y 33IS de la región Fe. En modalidades alternativas, los anticuerpos de la invención son de la subclase IgG4. En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención son de la subclase IgG4 y comprenden las siguientes sustituciones de aminoácidos: S228P y L235E de la región Fe .
En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados de la presente invención pueden producirse a través de la combinación de un dominio variable, o uno de sus fragmentos, con un dominio Fe que comprende una o más de las sustituciones de aminoácido descritas en la presente. En otras modalidades, los anticuerpos modificados de la invención pueden producirse a través de la modificación de un anticuerpo que contiene el dominio Fe a través de la introducción de uno o más de los residuos de sustitución de aminoácido en el dominio Fe.
Unión reducida a ligandos Fe Un experto en la técnica entenderá que los anticuerpos de la invención pueden tener propiedades de unión alteradas (con relación a un anticuerpo sin modificar) FcyR y/o Clq (ejemplos de las propiedades de unión, incluyen pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación de equilibrio (KD) , grados de disociación y asociación (Kdesactivado y Kactivado respectivamente) , afinidad y/o avidez de unión) y que ciertas alteraciones son más o menos deseable. Se sabe en la técnica que la constante de disociación de equilibrio (KD) se define como Kdesactivado/Kactivado- Un experto en la técnica puede determinar que parámetro idéntico es más importante para una aplicación de anticuerpo dada. Por ejemplo, una modificación que reduce la unión a uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FcyRIIIA) y/o una unión mejorada a un receptor Fe inhibidor (por ejemplo, FcYRIIB) serían adecuados para reducir la actividad de ADCC. Por consiguiente, la relación de las afinidades de unión (por ejemplo, constantes de disociación de equilibrio ( D) ) puede indicar si la actividad ADCC de un anticuerpo de la invención se mejora o disminuye. Adicionalmente , una modificación que reduce la unión a Clq sería adecuada para reducir o eliminar la actividad de CDC.
Las afinidades y propiedades de unión de una región Fe para su ligando, pueden determinarse a través de una variedad de métodos de ensayo in vi tro (ensayos con base bioquímica o inmunológica) conocidos en la técnica para determinar interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de una región Fe a un FcyR que incluye pero no se limita a, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o cinéticos (por ejemplo, el análisis BIACORE®) y otros métodos tales como los ensayos de unión indirectos, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) , electroforesis de gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel) . Estos y otros métodos pueden utilizar una etiqueta o uno o más de los componentes que se examinan y/o utilizan una variedad de métodos de detección que incluyen pero no se limitan a, etiquetas cromogénicas , fluorescentes, luminiscentes, o isotópica. Una descripción descripción de afinidades de unión y los cinéticos puede encontrarse en Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed. , Lippincott-Raven, Philadelphia (1999) .
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una afinidad de unión reducida a uno o más receptores Fe que incluyen, pero no se limitan a FcyRI (CD64) , incluyendo las isoformas FcTRIA, Fc"/RIB y FcTRIC; FcTRII (CD32 incluyendo las isoformas FC7RIIA, FcTRIIB, y FcyRIIC) ; y FcTRIII (CD 16, incluyendo las isoformas FcTRIIIA y FcyRIIB) en comparación con un anticuerpo sin modificar. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención, no comprenden un aumento concomitante en la unión a los receptores FcyRIIB en comparación con un anticuerpo sin modificar (por ejemplo, que contiene una región Fe de tipo silvestre) .
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades disminuidas a FcyRI con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades al receptor FcyRI que son al menos de 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces menor que un anticuerpo sin modificar.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidad al receptor FcyRI que son de al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% que un anticuerpo sin modificar.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una afinidad disminuida para el receptor FcYRIIIA con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos una 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o por lo menos 200 veces menores que un anticuerpo sin modificar.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcYRIIIA que son al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% que un anticuerpo sin modificar.
Se entiende en la técnica que la variante alélica F158V del receptor FcyRIIIA tiene características de unión alteradas a los anticuerpos. En una modalidad, los anticuerpos de la invención se unen con afinidades disminuidas a FcyRIIIA (F158V) con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIIA (F158V) que son al menos 2 veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 7 veces, o por lo menos una 10 veces, o por lo menos 20 veces, o por lo menos 30 veces, o por lo menos 40 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 60 veces, o por lo menos 70 veces, o por lo menos 80 veces, o por lo menos 90 veces, o por lo menos 100 veces, o por lo menos 200 veces menores que la de un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIII (F158V) que son al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% menores que un anticuerpo sin modificar.
En otras modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades aumentadas para el receptor FcyRIIB en comparación con el anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIB que están sin cambiar o aumentadas en al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces que la de un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIB que están aumentadas en al menos 5%, al menos 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos un 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% que un anticuerpo sin modificar.
En otra modalidad, los anticuerpos de invención exhiben afinidades para los receptores Fc/RI , FcyRIIIA o FcyRIIIA (F158V) que están entre aproximadamente aproximadamente 100 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 µ?, o aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para los receptores FcyRI, FcyRIIIA o FcyRIIIA (F158V) que son mayores de 1 µ?, mayores de 5 µ?, mayores de 10 µ?, mayores de 25 µ?, mayores de 50 µ?, o mayores de 100 µ?.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIB que están entre aproximadamente!00 nM a aproximadamente 100 µ?, ? aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 µ?, o aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para los receptores FcyRI , FcYRIIIA o FcyRIIIA (F158V) que son menores de 100 µ?, menores de 50 µ?, menores de 10 µ?, menores de 5 µ?, menores de 2.5 µ?, menores de 1 µ?, o menores de 100 nM, o menores de 10 nM.
En otra modalidad, los anticuerpos de invención exhiben afinidades para el receptor FcyRIIB que están entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 µ?, o aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para los receptores FeyRI, FeyRIIIA o FcyRIIIA (F158V) que son menores de 100 µ?, menores de 50 µ?, menores de 10 µ?, menores de 5 µ?, menores de 2.5 µ , menores de 1 µ?, o menores de 100 nM, o menores de 10 nM.
Actividad ADCC reducida Se conoce en la técnica que los anticuerpos son capaces de dirigir el ataque y la destrucción del antígeno activado a través de múltiples procedimientos colectivamente conocidos en la técnica como funciones efectoras del anticuerpo. Uno de estos procesos, conocido como "citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde el Ig secretado unido a los receptores Fe (FcR) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células aniquiladoras naturales ( K) , neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo que lleva el antígeno y posteriormente aniquilen la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigido a la superficie de las células objetivo "activan" las células citotóxicas y son requeridos para tal aniquilación. La lisis de las células objetivos es extracelular , requiere un contacto de célula a célula directo, y no involucra el complemento. Otro procedimiento abarcado por el término función efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (en lo sucesivo referida como "CDC"), que se refiere a un evento bioquímico de la destrucción de la célula objetivo mediado por el anticuerpo a través de un sistema complemento. El sistema de complemento es un sistema complejo de proteínas encontradas en el plasma sanguíneo normal que se combina con los anticuerpos para destruir bacteria patogénica y otras células foráneas.
La habilidad de cualquier anticuerpo particular-para mediar la lisis de la célula objetivo a través de ADCC puede ensayarse. Para evaluar la actividad de ADCC un anticuerpo de interés se agrega a las células objetivo en combinación con las células efectoras inmunitarias , que pueden activarse a través de complejos de anticuerpo de antígeno que dan como resultado la citólisis de la célula objetivo. La citólisis generalmente se detecta a través de la liberación de una etiqueta (por ejemplo, sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y Células Aniquiladoras Naturales (NK) . Los ejemplos específicos de los ensayos ADCC in vitro se describen en isecarver et al, 1985 79:277-282; Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson et al . , 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38. Alternativa o adicionalmente , la actividad ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo, a través de un modelo de animal tal como el que se describe en Clynes et al., 1998, PNAS USA 95 :652-656.
Se contempla que los anticuerpos de la invención se caracterizan a través de ensayos funcionales in vitro para determinar una o más de las funciones celulares efectoras mediadas por FeyR. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención tienen similares propiedades de unión y funciones celulares efectoras en modelos in vivo (tales como los descritos y explicados en la presente) como los de los ensayos con base in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye los anticuerpos de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos con base in vitro pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben actividades ADCC disminuidas en comparación con un anticuerpo sin modificar. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben actividades ADCC que son al menos 2 veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5, o por lo menos 10 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 100 veces menores que las del anticuerpo sin modificar.
En aún otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben actividades ADCC que se reducen a través de al menos 10%, o al menos 20%, o al menos un 30%, o al menos el 40%, o al menos un 50%, o por al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90%, o al menos 100%, o al menos 200%, o al menos 300%, o al menos 400%, o al menos 500% con relación a un anticuerpo sin modificar. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención no tienen actividad ADCC detectable. En modalidades específicas, la reducción y/o eliminación de la actividad ADCC puede atribuirse a anticuerpos de la invención que exhiben afinidad reducida a los ligandos y/o receptores Fe.
Actividad CDC reducida La trayectoria de activación del complemento se inicia a través de la unión del primer componente del sistema complemento (Clq) a una molécula, un anticuerpo, por ejemplo, un complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al, 1996, J. Immunol . Methods, 202:163, puede llevarse a cabo.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades disminuidas a Clq con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para el receptor Clq que son menores de 2 veces, o por lo menos 3 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 7 veces, o por lo menos 10 veces, o por lo menos 20 veces, o por lo menos 30 veces, o por lo menos 40 veces, o por lo menos 50 veces, o por lo menos 60 veces, o por lo menos 70 veces, o por lo menos 80 veces, o por lo menos 90 veces, o por lo menos 100 veces, o por lo menos 200 veces menores de un anticuerpo sin modificar .
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para Clq que son al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% menores que un anticuerpo sin modificar.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para Clq que están entre aproximadamentelOO nM a aproximadamente 100 µ?, ? aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 µ?, o aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben afinidades para Clq que son mayores de 1 mM, mayores de 5 µ?, mayores de 10 µ?, mayores de 25 µ?, mayores de 50 µ?, o mayores de 100 µ?.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben actividades CDC disminuidas en comparación con el anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben actividades CDC que son al menos 2 veces, o por lo menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 50 veces o al menos 100 veces menores que las del anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben actividades CDC que se reducen en al menos 10%, al menos 20%, o al menos un 30%, al menos el 40%, o al menos un 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90%, o al menos 100%, o al menos 200%, o al menos 300%, o al menos 400%, o al menos 500% con relación a un anticuerpo sin modificar. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención no exhiben actividades CDC detectables. En modalidades específicas, la reducción y/o eliminación de la actividad CDC puede atribuirse a anticuerpos de la invención que exhiben actividad reducida para ligandos y/o receptores Fe.
Toxicidad reducida relacionada con el anticuerpo Se entiende en la técnica que las terapias biológicas pueden tener aspectos de toxicidad adversos asociados con la naturaleza compleja de dirigir el sistema inmunitario para reconocer y atacar células y/u objetivos indeseados. Cuando el reconocimiento y/o activación para atacar no toma lugar en donde el tratamiento lo requiere, las secuencias como la toxicidad adversa pueden ocurrir. Por ejemplo, la tinción del anticuerpo de tejidos no activados puede indicar aspectos de toxicidad potencial.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una tinción reducida de tejidos no activados en comparación con un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una tinción reducida de tejidos no activados que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos una 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces menores que las de un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una tinción reducida de tejidos no activados que se reduce en al menos 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos el 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 100%, o al menos 200%, o al menos 300% , o al menos 400%, o al menos 500% con relación a un anticuerpo sin modificar.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben una toxicidad reducida relacionada con el anticuerpo en comparación con un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben toxicidades que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos una 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces que la de un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención exhiben toxicidades que se reducen en al menos 10%, o al menos 20%, o al menos un 30%, o al menos el 40%, o al menos un 50%, o al menos 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90%, o al menos 100%, o al menos 200%, o al menos 300%, o al menos 400 %, o al menos 500% con relación a un anticuerpo sin modificar.
Internalización de anticuerpos Los anticuerpos de la invención pueden unirse a antígenos de superficie celular que pueden internalizarse, además llevar los anticuerpos en la célula. Una vez dentro de la célula, los anticuerpos pueden liberarse en el citoplasma, activarse a un compartimento específico, o reciclarse en la superficie celular. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a un antígeno de superficie celular que se internaliza. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención pueden activarse a organelos o compartimentos específicos de la célula. En aún otras modalidades, los anticuerpos de la invención pueden reciclarse en la superficie celular o periferia después de la internalizacion. En una modalidad específica, el anticuerpo de la invención es específico para IFNAR1.
La internalizacion de los anticuerpos puede medirse a través de técnicas aceptadas en la técnica tales como las presentadas en el Ejemplo 34. En algunas modalidades, el grado de internalizacion se representa como un porcentaje de la cantidad total del anticuerpo unido a la célula. En otras modalidades, el grado de la internalizacion del anticuerpo se representa como una comparación de un anticuerpo de control no específico. En otras modalidades, el grado de internalizacion del anticuerpo se representa como una comparación con un anticuerpo que se une al antígeno de la superficie celular que no se internaliza. En aún otras modalidades, el grado de internalizacion del anticuerpo se correlaciona con la degradación del anticuerpo. En aún otras modalidades, el grado de internalizacion del anticuerpo se representa como la proporción de tinción citoplásmica contra la de la superficie celular.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención una vez unidos, se internalizan en las células en donde la internalizacion es de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 100%, al menos aproximadamente 110%, al menos aproximadamente 130%, al menos aproximadamente 140%, al menos aproximadamente 150%, al menos aproximadamente 160%, o al menos aproximadamente 170% más que la de un anticuerpo de control no específico.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención una vez unidos, se internalizan en células en donde la internalización es de 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160-170% más que un anticuerpo de control no específico.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención una vez unidos, se internalizan en células en donde la internalización es 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160-170% más que los anticuerpos de control según lo determinado por el ensayo de internalización utilizando un anticuerpo secundario.
Estructura tridimensional de una región Fe humano La presente invención también proporcionan formas cristalinas de una región Fe de IgG, humano en donde la región Fe humana, designada como Fc-TM, comprende sustituciones de aminoácido de L234F, L235E y P331S según enumerado por el índice de EU como se estable en Kabat y exhibe una fusión efectora reducida o eliminada (ADCC y/o CDC) , una unión reducida o eliminada a los receptores Fe, y/o toxicidades reducidas o eliminadas. En ciertas modalidades, los cristales se caracterizan por un grupo de espacio ortorrómbico C222i con una célula unitaria de a=50.18, b=147.30 y c=75.47. En ciertas modalidades, los cristales son de calidad de difracción para permitir la determinación de la estructura de difracción de rayos-X tridimensional del polipéptido (s) cristalino a alta resolución, preferiblemente a una resolución mayor de aproximadamente 3 Á, típicamente en el intervalo de aproximadamente 2 Á a aproximadamente 3 Á.
La presente invención además proporciona estructuras tridimensionales de alta resolución y coordenadas de estructura atómicas de los cristales Fc-TM. Los métodos específicos utilizados para obtener cristales y coordenadas de estructuras se proporcionan en los ejemplos, inf a.
Las coordenadas de la estructura atómica del Fc-TM cristalino, obtenido de C222i del cristal a una resolución 2.3 Á, se enumeran en la Tabla 6. Todos los residuos en las posiciones 236 a 445 deberán rastrearse en la densidad del electrón y densidad del electrón y densidad no de electrón que se observó para residuo de abrazadera antes de la posición 236, incluyendo las mutaciones L234F y L235E. La densidad del electrón 331 corresponde a serina.
La estructura tridimensional general de Fc-T fue muy similar a las estructuras previamente reportadas de regiones Fe sin ligando (Deisenhofer, (1981) . Biochemistry, 20, 2361-2370; Krapp et al, (2003). J. Mol. Biol . 325, 979-989; Matsumiya et al, (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779; Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, Diciembre 11, 2007, en imprenta). Cuando se consideran individualmente, los dominios Fc-TM CH2 y CH3 mostraron una gran conservación estructural y rigidez cuando se compararon con otras estructuras Fe humanas no mutadas sin ligando.
La información de la estructura puede utilizarse en una variedad de métodos computacionales o con base en computadora para clasificar, diseñar o identificar anticuerpos anti-IFNAR que tienen propiedades biológicas alteradas. Por ejemplo, los cristales y las coordenadas de la estructura obtenidas de la misma pueden utilizarse para clasificar, diseñar o identificar adiciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácido en la región Fe que dan como resultado la unión reducida o eliminada de los receptores Fe, la función efectora reducida o eliminada (ADCC y/o CDC) o las toxicidades reducidas o eliminadas.
Una vez que el anticuerpo ha sido diseñado o seleccionado por los métodos anteriores, su función efectora, su unión a los receptores Fe, o toxicidades pueden ensayarse y optimizarse a través de cualquier método conocido por el experto en la técnica. Los métodos ilustrativos se describen en las secciones 5.1-5.4 anteriores.
La presente invención también abarca anticuerpos anti-IFNARl que se diseñan o seleccionan a través del uso de la información de estructura de Fc-TM y que exhiben las actividades biológicas deseadas. En algunas modalidades, tales anticuerpos comprenden una región Fe con las mutaciones L234F, L235E y P331S. En algunas modalidades, tales anticuerpos comprenden una región Fe, con una o más de adición, sustitución o eliminación de un residuo de aminoácido diferente de los residuos de aminoácidos 234, 235 y 331.
Anticuerpos anti-IFNARl En una modalidad, los anticuerpos de la invención son específicos para (es decir, específicamente se unen) IFNAR1. Tales anticuerpos también pueden ser referidos en la presente como "anticuerpos anti-IFNARl de la invención". En otra modalidad, los anticuerpos de la invención son específicos para IFNAR1 humanos. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden reaccionar de manera cruzada con IFNAR1 de especies diferentes de las proteínas humanas u otras proteínas que están estructuralmente relacionados con IFNAR1 humano (por ejemplo, homólogos de IFNAR1 humanos) . En otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden ser específicos para IFNAR1 humanos solamente y no exhibir especies u otros tipos de reactividad cruzada.
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades de unión reducidas para ligandos Fe y tienen por lo menos una de las siguientes propiedades: función efectoras reducida o eliminada (ADCC y/o CDC) , unión reducida o eliminada a los ligandos Fe, o toxicidades reducidas o eliminadas en comparación con un anticuerpo sin modificar .
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden la adición, sustitución o eliminación de por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consistente de: L234F, L235E y P331S. En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden las sustituciones de aminoácido: L234F, L235E y P331S de la región Fe. En una modalidad específica, el anticuerpo anti-IFNARl de la invención es un anticuerpo del isotipo IgG.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención son de la subclase IgG4. En aún otra modalidad, los anticuerpos IgG4 anti-IFNARl de la invención comprenden la sustitución de aminoácido L235E de la región Fe. En otra modalidad, los anticuerpos IgG4 anti-IFNARl de la invención también comprenden un cambio de aminoácido que está correlaciona con una estabilidad aumentada. En una modalidad específica, los anticuerpos IgG4 anti-IFNARl de la invención además comprenden la sustitución del aminoácido S228P de la región Fe.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades de unión reducidas o eliminadas para los receptores Fe (por ejemplo, pero no limitándose a FcYRI (CD64) , que incluyen las isoformas FcTRIA, FcYRIB, y FcTRIC; FcyRII (CD32) , incluyendo las isoformas FcyRIIA, FcTRIIB, y FcTRIIC; y FcTRIII (CD 16) , incluyendo las isoformas FcyRIIIA y FcTRIIB) en comparación con un anticuerpo sin modificar En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades disminuidas a anticuerpos de la exposición invención disminuyó afinidades con FcTRI con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades disminuidas para el receptor FcTRIIIA con relación a un anticuerpo sin modificar. En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención se unen con afinidades disminuidas al alelo 58V de FcTRIIIA con relación a un anticuerpo sin modificar.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades de unión reducidas o disminuidas para Clq en comparación con un anticuerpo sin modificar. En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben afinidades disminuidas a FcyRI con relación a un anticuerpo sin modificar.
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben una función efectora disminuida o eliminada. En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNAR1 de la invención exhibe una actividad ADCC y/o CDC reducida o eliminada. En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben toxicidad reducida o eliminada.
Secuencias de anticuerpo anti-IFNARl En una modalidad, las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención son provistas en la presente como las Figuras 1A, 2A, 3A, 4A y Figuras IB, 2B, 3B, 4B, respectivamente. En otra modalidad, la secuencia de polinucleótido que codifica las regiones variables de cadena pesada y variables de cadena de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención son provistos en la presente como Figuras 1A, 2A, 3A, 4A y Figuras IB, 2B, 3B, 4B, respectivamente.
En otra modalidad, las secuencias seleccionadas de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden encontrarse en la Patente de E. U. A. No. 5,919,453, solicitud de Patente de E. U. A. Nos. de serie: 10/831,459, 10/182,058, 11/157,494, y 11/521,102 cada una de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. En una modalidad alternativa, las secuencias de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención, no comprenden las secuencias encontradas en la Patente de E. U. A. No. 5,919,453, la solicitud de Patente de E. U. A. Nos. de serie: 10/831,459, 10/182,058, 11/157,494, y 11/521,102.
En otras modalidades, los anticuerpos de la invención se describen en la solicitud provisional de la Patente de E . U. A. No. de serie 60/842,925, presentada el 8 de septiembre del 2006, 60/866,917; presentada el 22 de noviembre del 2006; 60/911,397, presentada el 12 de abril del 2007; 60/915,309, presentada el 22 de mayo 2007; solicitud de Patente de E. U. A. No. de serie 11/852,106, presentada el 7 de septiembre del 2007, y solicitud PCT No. de Serie US2007/07791, presentada el 7 de septiembre del 2007, cada una de los cuales se incorporan en su totalidad para todos los propósitos.
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención también incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácido de una región de cadena pesada variable y/o . cadena ligera variable que es al menos el 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de la cadena pesada variable y/o cadena ligera de los anticuerpos 3F11, 11E2, 4G5 y 9D4 (ver Figuras 1A-4B para secuencias) .
Se entenderá que los números de residuos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) referidas en la presente son las de Kabat et al. (1991, NIH Publicación 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . Específicamente, los residuos 24 a 34 (CDR1) , 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (CDR1) , 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) en el dominio variable de cadena pesada. Observar que las CDR varían considerablemente de anticuerpo a anticuerpo (y por definición no exhibirán homología con las secuencias de consenso Kabat) . La alineación máxima de los residuos de estructura frecuentemente requieren la inserción de residuos "separadores" en los sistema de numeración, ha ser utilizados para la región Fv. Se entiende que las CDR referidas en la presente son las de Kabat et al. supra . Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat dado puede variar de la cadena de anticuerpo a cadena de anticuerpo debido a las interespecies o divergencia alélicas.
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden por lo menos un CDR VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VH enumeradas en la Tabla 2. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden por lo menos una CDR VL que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VL enumeradas en la Tabla 2. En otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden una o más de las CDR VH y uno o más de los CDR VL enumeradas en la Tabla 2. En aún otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden cualquier combinación de CDR VH y CDR VL en la Tabla 2. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden comprender por lo menos 1, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 CDR seleccionadas de la Tabla 2. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención puede comprender un dominio VH y/o un dominio VL cada uno comprendiendo 1, 2 ó 3 CDR. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden comprender un VH que además comprende 1, 2 ó 3 CDR cadena pesada (CDRH #) enumeradas en la Tabla 2. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden comprender una VL que además comprende 1, 2, ó 3 CDR de cadena ligera (CDRL #) enumeradas en la Tabla 2.
En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden las CDR del anticuerpos 3F11 (ver, por ejemplo Tabla 2) . En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden las CDR del anticuerpo 4G5 (ver por ejemplo Tabla 2) . En otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden las CDR del anticuerpo 11E2 (ver por ejemplo Tabla 2) . En aún otra modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden las CDR del anticuerpo 9D4 (ver por ejemplo Tabla 2) .
Tabla 2. Secuencias CDR del anticuerpo Anti-IFNARl Anticuerpo CDR Secuencia Sec ID No: 3F11 CDRL1 RASQGIYSVLA 1 3F11 CDRL2 DASRLES 2 3F11 CDRL3 QQFNSYIT 3 3F11 CDRH1 GYFWS 4 3F11 CDRH2 EIDHSGKTNYNPSLKS 5 3F11 CDRH3 ESKYYFGLDV 6 4G5 CDRL1 RATQDISIALV 11 4G5 CDRL2 DASGLGS 12 4G5 CDRL3 QQFNSYPYT 13 4G5 CDRH1 NYYWS 14 4G5 CDRH2 ElILSGSTNYYFDS 15 4G5 CDRH3 ESKWGYYFDS 16 11E2 CDRL1 RASQSVSSSFFA 21 11E2 CDRL2 GASSRAT 22 11E2 CDRL3 QQYYDSSAIT 23 11E2 CDRH1 NYWIA 24 11E2 CDRH2 HYPGDSDIRYSPSFQG 25 11E2 CDRH3 HDIEGFDY 26 9D4 CDRL1 RASQSVSSSFFA 31 9D4 CDRL2 GASSRAT 32 9D4 CDRL3 QQYDSSAIT 33 9D4 CDRH1 NYWIA 34 9D4 CDRH2 HYPGDSDIRYSPSFQG 35 9D4 CDRH3 HDIEGFDY 36 En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que comprende por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 15, o por lo menos 20 sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido en comparación con las cadenas pesadas variables y/o cadenas ligeras representadas en las Figuras 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B ó 4A-4B. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden una o más CDR con por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, o por lo menos 10 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos de una o más CDR enumeradas en la Tabla 2.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden anticuerpos codificados por una secuencia de polinucleótidos que híbrida la secuencia de nucleótidos representada en las Figuras 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B ó 4A-4B bajo condiciones de rigor. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención comprenden una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones de rigor a la secuencia de nucleótido de una o más CDR enumeradas en las Figuras 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B ó 4A- 4B . Las condiciones de hibridación de rigor incluyen, pero no se limitan a, hibridación de un ADN unido a un filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0.2X de SSC/0.1% de SDS a aproximadamente 50-65°C, condiciones altamente de rigor tales como hibridación del ADN unido al filtro en 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0. IX de SSC/0.2% de SDS a aproximadamente 60 °C, o cualquier condición de hibridación de rigor conocida por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al, eds . 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol . 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY págs . 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3). En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos codificados por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de polinucleótido que codifica los anticuerpos 3F11, 11E2, 4G5, o 9D4 (ver Figuras 1A-4B) .
Afinidad de unión de IFNAR1 En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben una alta afinidad de unión para IFNAR1. En una modalidad específica, los anticuerpos anti-IFNAR1 de la exhiben un grado de asociación (kactivado) de por lo menos lO^M^s"1, al menos d???^"^"1 , al menos 106M"1s"1, al menos 5xl06M"1s"1, al menos 107M"1s"1, al menos 5xl07M"1s"1, o al menos 108M"1s"1. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben un kactiVado de al menos 2xl05 M"1s"1, al menos 5xl05 M^s"1, al menos 105 M^s"1, al menos 5xl06 M^s"1, , al menos 107 M^s"1, al menos 5xl07 M^s"1, o al menos 108 M^s"1.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben un grado de disociación (Kdesacti ado) menor de 10"1s"1, menor de 5xl0"1s"1/ menor de 10"2s_1, menor de 5x10" 2s"1, menor de 10"3s"1, menor de SxlO^s"1, menor de 10"4s"1, menor de 5xl0" s"1, menor de I0"5s"1, menor de 5xl0"5s_1, menor de 10"6s_1, menor de SxlO^s"1, menor de lO^s"1, menor de 5x10" 7s"1, menor de 10"8s"1, menor de 5xl0"8s"1, menor de 10"9s"1, menor de 5xl0"9s"1, o menos de 10"10"1s"1. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben un kdesactivado menor 5xl0~4s_1, menor de 10"5s"1, menor de 5xl0"5s"1, menor de 10"6s"1, menor de 5xl0"6s"1, menor de 10"7s"1, menor de 5xl0"7s"1, menor de 10"8s"1, menor de 5xl0"8s"1, menor de 10"9s"1, menor de SxlO^s"1, o menor de 10"10s"1.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben una constante de afinidad o Ka (kactivado/ kdesactivado) de al menos 102M"1, menor de 5xl02M"1, menor de ??3!"!"1, menor de 5xl03M"1, menor de 104M_1, menor de 5xl04M"1, menor de 105M"1, menor de 5xl05M"1, menor de ÍO5!^"1, menor de 5xl06M"1, menor de ÍO7!^"1, menor de 5xl07M"1, menor de 108M"1, menor de 5xl08M"1, menor de 109M"1, menor de 5xl09M"1, menor de menor de 1012M"1, menor de 5xl012M"1, menor de 1013?_1, menor de ????^?"1, menor de 1014?_1, menor de d???^?"1, menor de 1015?_1, o menor de 5xl015M_1.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben una constante de disociación o K¿t ( desactivado/ ^activado) menor de 10~2M, menor de 5xlO~2M, menor de 10"3M, menor de 5xlO"3M, menor de 10~M, menor de 5xlO~4M, menor de 10~5M, menor de 5xlO"5M, menor de 10"6M, menor de 5xlO~6M, menor de 10~7M, menor de 5xlO"7M, menor de 10~8M, menor de 5xlO"8M, menor de 10"9M, menor de 5xlO"9M, menor de 10"10M, menor de 5xlO~10M, menor de 10'1??, menor de 5xlO"i:LM, menor de 10"1M, menor de 5xlO"12M, menor de 10"13M, menor de 5xlO"13M, menor de 10"14M, menor de 5xl0"14M, menor de 10"15M, o menor de 5xlO"15M.
Especificidad del subtipo de interferón alfa En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de uno o más del interferón de tipo I (IFN) , que incluyen, pero no se limitan a, IFNOÍ, IFNS y IFNG La unión de los subtipos IFNOÍ puede determinarse a través de ensayos de competencia de rutina, tales como los descritos en Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de, incluyendo pero no limitándose a, IFNa, IFNS, y IFNco. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de un o más subtipos de IFNa, que incluyen, pero no se limitan a, los subtipos IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 y 21. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de todos los subtipos de IFNa. En este contexto, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión de y/o neutralizar la actividad biológica de los subtipos de IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 y 21. En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención no exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de un o más subtipos de IFNa, que incluyen, pero no se limitan a, los subtipos IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 y 21. En una modalidad particular, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNAR1 y/o neutralizar la actividad biológica de todos los subtipos de IFNa excepto IFNa21.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNARl y/o neutralizar la actividad biológica de por lo menos 1, menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 , al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, menos 12, o al menos 13 de los siguientes subtipos IFNOÍ: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5 , 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 y 21. En una modalidad alternativa, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención no exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNARl y/o neutralizar la actividad biológica de al menos 1, menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 , al menos 9, al menos 10, al menos 11, menos 12, o al menos 13 de los siguientes subtipos IFNa: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16 , 17 y 21.
En otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNARl y/o neutralizar la actividad biológica de interferones de tipo I de existencia natural. Tales interferones de tipo I no existencia natural, o interferones de tipo I híbridos representan moléculas que han sido alteradas a partir de sus estructuras de existencia natural a través de técnicas recombinantes o sintéticas. Los interferones híbridos, como se describe en la Patente de E. U. A. No. 7,232,563, representan un reemplazo molecular de varios segmentos de una estructura de interferón de existencia natural para crear una molécula que tiene potencia incrementada y/o toxicidad reducida.
En otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNARl y/o neutralizar la actividad biológica de los interferones de tipo I mutado. Los interferones de tipo I mutados se describen en las Patentes de E. U. A. Nos. de 6,299,870 y 6,300,474, que se incorporan por referencia en su totalidad.
En aún otras modalidades, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear la unión a IFNARl y/o neutralizar la actividad biológica de los interferones de tipo I derivados de otras especies animales. Tales interferones tipo I se aislan de las especies de pollos, gatos, ratones, ratas, conejos, cabras, caballos y otros animales. En modalidades específicas, los interferones de tipo I humanos se aislan de células derivadas de las especies de pollo, gato, ratón, rata, conejo, cabra, caballo y otros animales. En otras modalidades, los interferones de tipo I humanos implican diferentes patrones de glicosilación cuando se derivan de especies de pollo, gato, ratón, rata, conejo, cabra, caballo y otros animales. La explicación adicional de los interferones de otras especies animales puede encontrarse en la publicación No. O06099451A3 de WIPO que se incorpora aquí por referencia.
Para el propósito de la presente invención, la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención para neutralizar la actividad de IFNa, puede monitorearse , por ejemplo, en un Ensayo de Activación del Receptor de Cinasa (KIRA) , como se describe en WO 95/14930, publicada 1 de junio de 1995, a través de la medición de la habilidad de un anticuerpo candidato para reducir la fosforilación de tirosina (resultando de la unión del ligando) del complejo del receptor IFNAR1/R2.
Alternativamente, u opcionalmente , para el propósito de la presente invención, la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención para neutralizar la obtención de una respuesta celular a través de IFNa puede ensayarse monitoreando la neutralización de la actividad antivírica de IFNa, como se describe por Kawade, J. Interferón Res. 1:61 70 (1980), o Kawade and Watanabe, J. Interferón Res. 4:571 584 (1984), o Yousefi, et al, Am. J. Clin. Pathol . 83: 735 740 (1985), o ensayando la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención para neutralizar la habilidad de IFNa para activar la unión de la molécula de señalización, el factor 3 estimulado por interferón (ISGF3), a un oligonucleótido derivado del elemento de respuesta simulada del interferón (ISRE) , en un ensayo de intercambio de movilidad electroforática, como se describe por Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol, 15: 6386 (1995).
En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de inhibir por lo menos una función mediada por IFNa del receptor IFNAR1. En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención inhibir la actividad del receptor IFNAR1 en respuesta a IFNa o sus subtipos en al menos aproximadamente 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99%. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención inhiben la actividad del receptor IFNAR1 en respuesta a IFNa o uno de sus subtipos como medido por el ensayo de KIRA descrito anteriormente, en al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos el 95%, o al menos 99%. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención inhiben la actividad del receptor IFNAR1 en respuesta a IFNa o sus subtipos, según medido por la unión de la molécula de señalización, el factor 3 estimulado por interferón (ISGF3), a un oligonucleótido derivado del elemento de respuesta estimulada del interferón (ISRE) , en un ensayo de intercambio de movilidad electroforética , como se describe por Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol, 15: 6386 (1995) en al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99%. En otra modalidad., los anticuerpos anti-IFNARl de la invención inhiben la actividad del receptor IFNAR1 en respuesta a IFNa o sus subtipos, según medido por un ensayo conocido en la técnica en al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99%.
En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de neutralizar las propiedades anti-víricas de IFNa o sus subtipos. En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención neutralizan al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos sobre 95%, o al menos aproximadamente 99% de la actividad anti-vírica de IFNa o sus subtipos, según lo determinado por el ensayo anti -vírico de Kawade (1980) , o Yousefi (1985) . En una modalidad alternativa, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención no neutralizan las propiedades antivíricas de IFNa o sus subtipos.
Para el propósito de la presente invención, la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención para bloquear la unión de IFNa o sus subtipos a IFNAR1 puede determinarse a través de un ensayo de competencia de rutina tal como el descrito en los anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988) . En una modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear o inhibir la unión de los siguientes subtipos de IFNOÍ: 1, 2, 4, 5, 8, 10, y 21 a IFNAR1. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención exhiben la habilidad de bloquear o inhibir la unión de: por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, o por lo menos 7 de los siguientes subtipos IFNa: 1, 2, 4, 5, 8, 10, y 21 a IFNAR1.
Los anticuerpos de la invención pueden actuar sobre IFNAR para regular los genes sensibles a IFN-I. Los genes sensibles a IFN-I han sido identificados en las solicitudes de Patentes de E. U. A. tituladas "IFN alpha-induced Pharmacodynamic Markers" , con los siguientes números de serie; 60/873,008, presentada el 6 de diciembre del 2006; 60/907,762, presentada el 16 de abril del 2007; 60/924,584, presentada el 21 de mayo del 2007, 60/960,187, presentada el 19 de septiembre del 2007, 60/966,176, presentada el 5 de noviembre del 2007 y la solicitud PCT con el número de solicitud PCT/US2007/0249 , presentada el 6 de diciembre 2007, cada una de las cuales son incorporados por referencia en su totalidad.
Anticuerpos Los anticuerpos de la invención pueden incluir anticuerpos monoclonales ,. anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena individual FVS (scFv) , anticuerpos FVS enlazados a disulfuro (sdFv) , y anti-idiotípico (anti-Id) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno, estos fragmentos pueden o no pueden fusionados a otro dominio de inmunoglobulina incluyendo, pero no limitándose a, una región Fe, o uno de sus fragmentos. Como se describe en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" específicamente se unen a anticuerpos modificados descritos en la presente. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl y IgA2) o subclase. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo. En una modalidad, los anticuerpos de la invención son del isotipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG . Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos de longitud completa que comprenden regiones variables y constantes, o que pueden ser sus fragmentos de unión a antígeno, tales como, un anticuerpo de cadena individual.
El término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmentos de anticuerpo")/ como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la habilidad de específicamente unirse a un antígeno (por ejemplo, IFNAR1) . Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo a través de los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHi (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados a un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHi, (iv) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) . Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican a través de genes separados, que pueden unir, usando métodos recombinantes , a través de un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv) ; ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) . Tales anticuerpos de cadena individual también pretenden estar abarcados dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocida por el experto en la técnica y los fragmentos se clasifican por la utilidad en la misma forma como si fueran anticuerpos intactos .
En otras modalidades, la invención proporciona proteínas de fusión (en lo sucesivo referidas como "proteínas de fusión de la invención"), que comprenden una región Fe modificada con afinidad reducida o eliminada para un ligando Fe responsable para facilitar la función efectora comparada con una región Fe que tiene la misma secuencia de aminoácido que la proteína de fusión de la invención, pero que no comprende la adición, sustitución o eliminación de por lo menos un residuo de aminoácido para la región Fe.
En algunas modalidades, las proteínas de fusión de la invención pueden comprender un péptido, polipéptido, andamio de proteína, scFv, dsFv, diacuerpo, Tandab, o un mimético del anticuerpo para la región Fe modificada. En algunas modalidades, las proteínas de fusión de la invención comprenden una región de unión que conecta el péptido, polipéptido, proteína de andamiaje, scFv, dsFv, diacuerpo, Tandab, o un anticuerpo mimético a la región Fe modificada. El uso de enlazadores de péptido de existencia natural, así como artificiales para conectar los polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión enlazados se conoce bien en la literatura (Hallewell et al. (1989), J. Biol . Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630; Patente de E. U. A. No. 5,856,456) .
En una modalidad, las proteínas de fusión de la invención comprenden una región Fe que comprende por lo menos una adición, sustitución o eliminación de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consistente de: 234, 235 y 331, en donde el sistema de numeración de la región constante es la del índice EU como se estable por Kabat et al. (1991, NIH Publicación 91- 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . En una modalidad específica, las proteínas de fusión de la invención comprenden una región Fe que comprende por lo menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consistente en: L234F, L235E y P331S.
En otra modalidad, las proteínas de fusión de la invención además comprenden una región Fe que comprende por lo menos una adición, sustitución o eliminación de un residuo de aminoácido que está correlacionado con una estabilidad incrementada de la proteína de fusión. En una modalidad, la adición, sustitución o eliminación de un residuo de aminoácido es en la posición 228 de la región Fe, en donde el sistema de numeración de la región constante es la del índice EU como se establece en Kabat et al. (Supra) . En una modalidad específica, las proteínas de fusión de la invención comprenden una región Fe que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 228, en donde la sustitución es un residuo de serina.
En algunas modalidades, los anticuerpos o proteínas de fusión de la presente invención comprenden una o más glicoformas modificadas, es decir, composición de carbohidrato que está covalentemente unida a una molécula que comprende una región Fe. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, pero no se limitan a reducir la función efectora. Las glicoformas modificadas pueden generarse a través de cualquier método conocido por el experto en la técnica, por ejemplo a través del uso de cepas de expresión modificadas o variantes a través de la co-expresión con una o más enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , mediante la expresión de una molécula que comprende una región Fe en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o a través de la modificación del carbohidrato (s) después de que la molécula que comprende la región Fe ha sido expresada. Los métodos para generar glicoformas modificas se conocen en la técnica, e incluyen pero no se limitan a los descritos en Umana et al, 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et al, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) Patente de E. U. A. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N. J.); Glyco MAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) ; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Ver, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
Conjugados de anticuerpo La presente invención abarca el uso de anticuerpos o sus fragmentos conjugado o fusionados a una o más fracciones, que incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos , proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.
La presente invención abarca el uso de anticuerpos o sus fragmentos recombinantes fusionados o químicamente conjugados (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a una proteína heteróloga o polipéptido (o uno de sus fragmentos, a un polipéptido de por lo menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente necesita ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para activar polipéptidos heterólogos a tipos celulares particular, ya sea in vitro o in vivo, a través de la fusión o conjugación de los anticuerpos a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados a polipéptidos heterólogos también pueden utilizarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación que utilizan métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la publicación Internacional No. WO 93/21232; la patente Europea No. EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett . 39:91-99; Patente de E. U. A. No. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452, que se incorporan por referencia en su totalidad.
Las proteínas de fusión adicionales pueden generarse a través de las técnicas de estructuración de gen, estructuración de motivo, estructuración de exón y/o estructuración de codón (colectivamente referida "estructuración de ADN" ) . La estructuración de ADN puede utilizarse para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o sus fragmentos (por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos con afinidades superiores y grados de disociación inferiores) . Ver, generalmente las Patentes de E . U. A. Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252 y 5,837,458, y Patten et al, 1997, Curr. Opinión Biotechnol . 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2 ) : 76 - 82 ; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol . 287:265-76; y Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2) :308-313 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporadas por referencia en su totalidad) . Los anticuerpos o sus fragmentos, o los anticuerpos codificados o sus fragmentos, pueden modificarse al ser sometidos a mutagénesis aleatoria por medio de PCR propensa al error, inserción de nucleótido aleatorio u otros métodos antes de la recombinación. Una o más proteínas de un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, cuyas porciones específicamente se unen a IFNAR1 puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas.
Además, los anticuerpos o sus fragmentos pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En otras modalidades, la secuencia de aminoácido marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, 91311) , entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluyen, pero no limitado a, la etiqueta de hemaglutinina "HA" , que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) y la etiqueta "bandera".
En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos, sus análogos o derivados se conjugan a un agente de diagnóstico o detectable . Tales anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el desarrollo o el avance de un trastorno inflamatorio como parte de un procedimiento de ensayo clínico, es decir determinando la eficacia de una terapia particular. Tal diagnóstico y detección puede lograr mediante el acoplamiento del anticuerpos a sustancias detectables, incluyendo, pero no limitándose a varias enzimas, tales como pero no limitándose a peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta- galactosidasa, o acetilcolinesterasa ; grupos prostéticos, tales como, pero no limitado a estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitándose a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína , cloruro de dansilo o picoeritrina ; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitándose a, luminol ; materiales bioluminiscentes , tales como, pero no limitándose a, luciferasa, luciferin y aequorin, materiales radiactivos, tales como, pero no limitándose yodo(131I, 125? , 123I, 121I) , carbono (14C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (115In, 113In, 112In, i In,)f y tecnetio (99Tc) , talio (201Ti) , galio (68Ga, S7Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin; metales emisores de positrón que utilizan varias tomografías emisoras de positrón, iones metálicos paramagnéticos no radiactivos, y las moléculas que se radiomarcan o conjugan a radioisótopos específicos.
Las técnicas para conjugar fracciones terapéuticas a anticuerpo son bien conocidas, ver, por ejemplo, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p . 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" , in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al . (eds.), pp. 623-53 ( arcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp . 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol . Rev. 62:119-58.
Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconj gado de anticuerpo como se describe por Segal en la Patente de E . U. A. No. 4,676,980, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad .
La fracción terapéutica o fármaco conjugado a un anticuerpo o su fragmento que se une específicamente a IFNAR1 deberá seleccionarse para lograr el efecto profiláctico o terapéutico deseado para un trastorno particular en un sujeto. Un personal clínico u otro médico deberán considerar lo siguiente cuando deciden que fracción terapéutica o fármaco conjugar con un anticuerpo o uno de sus fragmentos que específicamente se une a IFNAR1 : la naturaleza de la enfermedad, la severidad de la enfermedad, y la condición del suj eto .
Métodos para producir anticuerpos Los anticuerpos o sus fragmentos pueden producirse a través de cualquier método conocido en la técnica para síntesis de anticuerpos, en particular, a través de síntesis química o a través de técnicas de expresión recombinante .
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de hibridoma, recombinante, y tecnologías de despliegue de fago, o una combinación de éstos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma, que incluyen las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ° ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (Elsevier, Nueva York, 1981) (tales referencias se incorporan por referencia en su totalidad) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente no se limita a los anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico, o de fago, y no al método a través del cual se produce.
Los métodos para producir y clasificar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de hibridoma son de rutina y se conocen en la técnica. En resumen, los ratones pueden inmunizarse con IFNAR1 y una vez detectada la respuesta inmune, por ejemplo, los anticuerpos específicos IFNAR1 se detectan en el suero del ratón, el bazo de ratón se cosecha y los esplenocitos se aislan. Los esplenocitos después se fusionan a través de técnicas bien conocidas a cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible de ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan a través de dilución limitada. Los clones del hibridoma después se ensayan a través de métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse al polipéptido de la invención. El fluido de ascitos, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridomas positivos.
Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales pueden generarse cultivando una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en donde el hibridoma se genera a través de la fusión de esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con IFNAR1 con células de mieloma y después filtrando los hibridomas resultantes de la fusión para clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a IFNAR1.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos IFNAR1 específicos pueden generarse a través de cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab' )2 de la invención pueden producirse a través de la división proteolítica de moléculas de inmunoglob lina , utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2)- Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Además, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse utilizando varios métodos despliegue de fagos conocidos en la técnica.
En los métodos de despliegue de fago, los dominios del anticuerpo funcional se despliegan en la superficie de las partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican de colecciones de ADNc de animal (por ejemplo, colecciones de ADNc humanas o de murino de tejidos linfoides) . El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombinan juntos con un enlazador scFv a través de PCR y se clonan en un vector de fagémido (por ejemplo, pCANTAB 6 o pComb 3 HSS) . El vector se electropora en E. coli y el E. coli se infecta con el fago auxiliar. El fago utilizado en estos métodos son típicamente el fago filamentoso que incluye fd y M13 y los dominios VH y VL usualmente se fusionan recombinantemente a cualquiera del gen III o al gen VIII del fago. El fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al epítopo IFNAR1 de interés puede seleccionarse o identificarse con el antígeno, por ejemplo, utilizando un antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de despliegue de fago que puede utilizarse para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al, 1995, J. Immunol . Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; Solicitud Internacional No. PCT/GB91/01134 ; Publicaciones Internacionales Nos. O 90/0'2809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, y W097/13844; y Patentes de E. U. A. Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad .
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección del fago, el anticuerpo que codifica las regiones de fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células planta, levadura y bacteria, por ejemplo, como se describe a continuación. Las técnicas para recombinantemente producir fragmentos Fab, Fab 1 y F(ab')2 pueden también utilizarse utilizando los métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la Publicación Internacional No. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6) : 864-869 ; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (tales referencias se incorporan por referencia en su totalidad) .
Para generar anticuerpos completos, los iniciadores PCR incluyendo las secuencias de nucleótido VH o VL, un sitio de restricción, y una secuencia de flanqueo para proteger el sitio de restricción pueden utilizarse para amplificar las células VH o LV en clones scFv. La utilización de técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan un región constante VH, por ejemplo, la región constante gama 4 humana, y los dominios VL amplificados con PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VL, por ejemplo, las regiones constantes kappa o lambda humanas. En ciertas modalidades, los vectores para expresar los dominios VH o VL comprenden un promotor implicará un EF-lalfa, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes, y un marcador de selección tal como neomicina. Los dominios VH y VL también pueden clonarse en un vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera después se co-transfectan en líneas celulares para generar línea celulares estables o temporales que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, utilizando técnicas conocidas por el experto en la técnica.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humano y ensayos de detección in vi ro, puede ser ventajoso utilizar anticuerpos humanos o quiméricos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de despliegue de fago descritos anteriormente utilizando colecciones de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver también las Patentes de E. U. A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111, y Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741, cada una de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en donde las diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina . Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol . Methods 125:191-202; y Patentes de E . U. A. Nos. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, y 6,311,415, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo o uno de sus fragmentos que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado, y que comprende una región de estructura que tiene substancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos los dominios variables (Fab, Fab 1 , F(ab' ) 2; Fabc, Fv) en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de la inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpos donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de estructura son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En ciertos casos, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Ordinariamente, el anticuerpo contendrá ambas cadenas ligeras, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, de gozne, CH2 , CH3 , y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas , incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2 , IgG3 e lgG4. Usualmente, el dominio constante es un dominio constante de fijación de complemento en donde se desea que el anticuerpo humanizado exhiba: actividad citotóxica, y la clase es típicamente IgGi. Cuando tal actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la experiencia de la técnica. Las regiones de estructura y CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente a las secuencias progenitoras , por ejemplo, la CDR donadora o la estructura de consenso pueden mutagenizarse a través de la sustitución, inserción o eliminación de por lo menos un residuo de tal forma que el residuo de tal forma que la CDR o residuo de estructura en el sitio no corresponde ni al consenso ni al anticuerpo de importación. Tales mutaciones, sin embargo, no serán extensivas. Usualmente, por lo menos 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de la región de estructura progenitora (FR) y las secuencias de CDR, más por lo general 90%, y posiblemente mayor de 95%. El anticuerpo humanizado pueden producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (Patente Europea No. EP 239,400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y Patentes de E. U. A. Nos. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), enchapado o revestimiento (Patentes Europeas Nos. EP 592,106 y 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5) :489-498 ; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7 (6) : 805-814 ; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), estructuración de cadena (Patente de E. U. A. No. 5,565,332), técnicas descritas en, por ejemplo, las Patentes de E. U. A. Nos. 6,407,213, 5,766,886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol . 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9 (10) : 895-904 (1996), Couto et al., Cáncer Res, 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cáncer Res. 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2) :409- 10 (1994), y Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235 (3) : 959-73 (1994). Por lo general los residuos de estructura en las regiones de estructura se sustituirán con residuos correspondientes del anticuerpo donador CDR para alterar o mejorar la unión del antígeno. Estas sustituciones de estructura se identifican a través de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelaje de las interacciones de CDR y los residuos de estructura para identificar residuos de estructura importantes para la unión del antígeno y la comparación de secuencia para identificar residuos de estructura inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen et al, Patente de E. U. A. No. 5,585,089; y Riechmann et al, 1988, Nature 332:323, que se incorporan por referencia en su totalidad) .
Polinucleótidos que codifican un anticuerpo La invención también abarca polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones de alto rigor, intermedio o bajo rigor, por ejemplo, como se definió anteriormente, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención.
Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, a través de cualquier método conocido en la técnica. Ya que las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos se conocen, las secuencias de nucleótidos que codifican estos anticuerpos se puede determinar utilizando métodos conocidos en la técnica, es decir, codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares se ensamblan en tal forma que generan un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o uno de sus fragmento de invención. Tal polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmejer et al., 1994, BioTechniques 17:242), que en resumen, involucran la síntesis del traslape de los oligonucleótidos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, templan y ligan esos oligonucleótidos, y después la amplificación de los oligonucleótidos ligados a través de PCR.
Alternativamente, el polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse del ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo se conoce, un ácido nucleico que codifican la inmunoglobulina puede químicamente sintetizarse u obtenerse de una fuente adecuada ser obtenidos de síntesis química o de una fuente adecuada (por ejemplo, una colección de ADNc de anticuerpos, o una colección de ADNc generada, o un ácido nucleico, usualmente un poli + ARN, aislado de, cualquier tejido o células que expresa el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionados para expresar un anticuerpo de la invención) a través de amplificación PCR utilizando iniciadores sintéticos hibridizables de los extremos 31 y 51 de la secuencia o a través de clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia del gen particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una colección de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR después pueden clonarse en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método conocido en la técnica.
Una vez que la secuencia de nucleótido del anticuerpo se determina, la secuencia de nucleótido del anticuerpo puede manipularse utilizando métodos conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótido, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes , mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc., (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2o Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., eds . , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, las cuales ambas se incorporan por referencia en la presente en su totalidad) , para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácido diferente, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.
En una modalidad específica, una o más de la CDR se insertan dentro de las regiones de estructura utilizando técnicas de ADN recombinante de rutina. Las regiones de estructura pueden ser de existencia natural o regiones de estructura de consenso, y en ciertos casos regiones de estructura humana (ver, por ejemplo, Chothia et al., 1998, J. Mo. Biol. 278: 457-479 para un listado de regiones de estructura humana) . Opcionalmente , el polinucleótido generado por la combinación de las regiones de estructura y la CDR que codifican un anticuerpo que específicamente se unen a IFNAR1. Opcionalmente, una o más sustituciones de aminoácido pueden hacerse dentro de las regiones de estructura, y, en ciertos casos, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente , tales métodos pueden utilizarse para hacer sustituciones o eliminaciones de aminoácido de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en el enlace de disulfuro intercadena para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces de disulfuro intercadena. Otras alteraciones al polinucleótido están abarcadas por la presente invención y dentro de la experiencia en la técnica.
En modalidades específicas, los anticuerpos de la invención se codifican a través de secuencias de polinucleótido ejemplificadas en las Figuras 1A-4B. En otras modalidades específicas, los polinucleótidos de la invención codifican anticuerpos que comprenden regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada que corresponden a SEC ID NO: 41 y 42, respectivamente. En aún otras modalidades específicas, los polinucleótidos de la invención codifican anticuerpos que comprenden regiones constantes de cadena pesada correspondiente a SEC ID NO: 42 con una asignación para la variación alélica en donde la variación es por lo menos uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de las posiciones 214, 221, 356, y 358, como se define por el sistema de numeración del índice de Estados Unidos.
Expresión recombinante de un anticuerpo La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, derivado, análogo o uno de sus fragmentos (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención o una de sus porciones, o un anticuerpo de cadena individual de la invención) , requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que el polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una de sus porciones (pero no necesariamente conteniendo el dominio variable de la cadena pesada o ligera) de la invención han sido obtenidas, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse a través de tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas conocidas en la técnica. De esta forma, los métodos para preparación una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene un anticuerpo que codifica una secuencia de nucleótido como se describe en la presente. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir vectores de expresión que contiene secuencias que codifican el anticuerpo y señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. La invención, de esta forma, proporciona vectores replicable que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una de sus porción, o una CDR de cadena pesada o ligera, operablemente enlazada a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula del anticuerpo (ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 86/05807; Publicación Internacional No. WO 89/01036; y Patente de E. U. A. No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en tal vector para la expresión de su cadena pesada completa o cadena ligera completa, o ambas cadenas pesada y ligera completas.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedera a través de técnicas convencionales y las células transíectadas después se cultivan a través de técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. De esta forma, la invención incluye células hospederas que contiene un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o sus fragmentos, o una cadena pesada o ligera de la misma, o una de sus porciones, o un anticuerpo de cadena individual de la invención, operablemente enlazado a un promotor heterólogo. En otras modalidades para la expresión de anticuerpo de estructura de cadena doble, los vectores que codifican ambas cadenas pesada y ligera pueden co-expresarse en la célula hospedera para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión de hospedero para expresar las moléculas del anticuerpos de la invención (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,807,715). Tales sistemas de expresión de hospedero representan vehículos a través de los cuales las secuencias de codificación de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforma, o transíectadas con las secuencias de codificación de nucleótido apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estas incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacteria (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformada con ADN de bacteriófago recombinante , vectores de expresión de ADN de plásmido o de ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante que contiene secuencias de codificación de anticuerpo, sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contiene secuencias de codificación del anticuerpo; sistemas de células de planta infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, el virus de mosaico de coliflor, CaMV; el virus del mosaico de tabaco, TMV) o transformarse con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación del anticuerpo; o sistemas de célula de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3) que hospedan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus, el promotor de 7.5K del virus de vacuna) . En ciertas modalidades las células bacterianas tales como Escherichia coli, y en otras modalidades, células eucarióticas , especialmente para la expresión de la molécula del anticuerpo recombinante completa, se utiliza para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO) , junto con un vector, tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al, 1986, Gene 45:101, y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 08:02). En una modalidad específica, la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o sus fragmentos que especialmente se unen a IFNAR1 se regulan a través del promotor constitutivo, el promotor inducible o el promotor específico del tejido.
En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión puede ventajosamente seleccionarse dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se va expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tales proteínas, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que fácilmente se purifican pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), en donde la secuencia que codifica el anticuerpo pueden ligarse individualmente en el vector en el marco de la región de codificación lac Z de tal forma que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol . Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden utilizarse para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutationa 5-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden fácilmente purificarse de células lisadas a través de la adsorción y la unión a la matriz de esferas de glutationa agarosa seguida por la elución en la presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o los sitios de división del factor Xa de proteasa de tal forma que el producto de gen objetivo clonado puede liberarse de la fracción GST.
En las células hospederas de mamífero, un número de sistemas de expresión basado en virus pueden utilizarse. En casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de interés' puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, la secuencia promotora tardía o la líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma del adenovirus a través de recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula del anticuerpo en hospederos infectados (ver, por ejemplo, Logan & Shenk, 1984, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 8 1:355-359). Las señales de iniciación específicas también pueden ser requeridas para la traducción eficiente de las secuencias de codificación del anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Además, El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficiencia de la expresión puede mejorarse a través de la inclusión de elementos mej oradores de la transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc., (ver, por ejemplo, Bittner et al, 1987, Methods in Enzymol. 153:516- 544).
Además, se puede seleccionar una cepa de la célula hospedera que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto del gen en una forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, la glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, división) de los productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células hospederas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento post-traducción y la modificación de las proteínas y los productos del gen. Las líneas celulares apropiadas por los sistemas hospederos pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea expresada. En este punto, las células hospederas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto del gen pueden utilizarse. Tales células hospederas de mamífero incluyen pero no se limitan a células CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2 , BT20 y T47D, NSO (una línea celular de mieloma que no producen endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina) , CRL7030 y HsS78Bst.
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que establemente expresan la molécula de un anticuerpo pueden modificarse. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospederas pueden transformarse con ADN controlado a través de elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, mejorador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN foráneo, las células modificadas pueden dejarse cultivar durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se intercambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren establemente en el plásmido en sus cromosomas y se cultiven para formar un foco el cual a su vez se clona y se expande en líneas celulares. Este método puede utilizarse ventajosamente para modificar líneas celulares que expresan la molécula del anticuerpo. Tales líneas celulares modificadas pueden particularmente ser útiles en la clasificación y evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula del anticuerpo .
Puede utilizarse un número de sistemas de selección, que incluyen, pero no se limitan a, los genes de timidina cinasa del virus de (Wigler et al, 1977, Cell 11: 223), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforribosiltransferasa pueden utilizarse en células (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) los genes pueden ser empleados en las células tk- , hgprt o aprt , respectivamente. También, puede utilizarse la resistencia a antimetabolito como la base de la selección para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:357; O 'Haré et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt , que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia a aminoglicosida G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15); e hygro, que confiere resistencia a hidromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Los métodos comúnmente utilizados en la técnica de la técnica de ADN recombinante pueden rutinariamente aplicarse para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol . 150: 1, que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante la amplificación del vector (para una revisión, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol .3. (Academic Press, New York, 1987)) . Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, se aumenta el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedera que aumentará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también se aumentará (Crouse et al, 1983, Mol. Cell. Biol . 3:257).
La célula hospedera puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una igual expresión de los polipéptidos de cadena ligera y pesada. Alternativamente, un solo vector puede utilizarse el cual codifica, y es capaz de expresar, ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera deberá colocarse antes de la cadena pesada para evitar el exceso de una cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2 197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que la molécula del anticuerpo de la invención ha sido producida a través de expresión recombinante , puede purificarse a través de cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglob lina, por ejemplo, a través de cromatografía (por ejemplo, intercambio de ión, afinidad, particularmente a través de afinidad para el antígeno específico después de la cromatografía de la proteína A, y moldeo de la columna) , centrifugación, solubilidad diferencial, o a través de cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteína. Además, los anticuerpos de la presente invención o sus fragmentos pueden fusionarse a secuencias de polipéptido heterólogas descritas en la presente o por el contrario conocidas en la técnica para facilitar la purificación.
Producción escalable de los anticuerpos En un esfuerzo por obtener grandes cantidades, los anticuerpos de la invención pueden producirse a través de un procedimiento escalable (en lo sucesivo referido como "el proceso escalable de la invención"). En algunas modalidades, los anticuerpos pueden producirse a través de un procedimiento escalable de la invención en el laboratorio de investigación que puede escalarse para producir los anticuerpos de la invención en bio-reactores a escala analítica (por ejemplo, pero no limitados a bio-reactores de 5L, 10L, 15L, 30L o 50L) . En otras modalidades, los anticuerpos pueden producirse a través de un procedimiento escalable de la invención en el laboratorio de investigación que puede escalarse producir los anticuerpos de la invención en bio-reactores a escala de producción (por ejemplo, pero no limitados a 75L, 100L, 150L, 300L o 500L) . En algunas modalidades, el procedimiento escalable de la invención da como resultado en poca o nada de reducción en la eficiencia de la producción en comparación con el procedimiento de producción llevado a cabo en el laboratorio de investigación.
En otras modalidades, el procedimiento escalable de la invención produce anticuerpos a una eficiencia de producción de aproximadamente 10 mg/L, aproximadamente 20 m/L, aproximadamente 30 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 75 mg/L, aproximadamente 100 mg/ L, aproximadamente 125 mg/L, aproximadamente 150 mg/L, aproximadamente 175 mg/L, aproximadamente 200 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 300 mg/L o mayor. En otras modalidades, las proteínas de fusión pueden producirse a través de procedimientos escalables de la invención .
En otras modalidades, el procedimiento escalable de la invención produce anticuerpos a una eficiencia de producción de por lo menos aproximadamente 10 mg/L, al menos aproximadamente 20 m/L, al menos aproximadamente 30 mg/L, al menos aproximadamente 50 mg/L, al menos aproximadamente 75 mg/L, al menos aproximadamente 100 mg/L, al menos aproximadamente 125 mg/L, al menos aproximadamente 150 mg/L, al menos aproximadamente 175 mg/L, al menos aproximadamente 200 mg/L, al menos aproximadamente 250 mg/L, al menos aproximadamente 300 mg/L o mayor.
En otras modalidades, el procedimiento escalable de la invención produce anticuerpos a una eficiencia de producción de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 300 mg/L, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 250 mg/L, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 175 mg/L, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 100 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 300 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 250 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 175 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 125 mg/L, de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 100 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 300 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 250 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 175 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 125 mg/L, de aproximadamente 30 mg/L a aproximadamente 100 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 300 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 250 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 175 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 125 mg/L, o de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 100 mg/L .
Métodos adicionales para modificar anticuerpos En otra modalidad, una región de gozne Fe de un anticuerpo de la invención se mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se una o más mutaciones de aminoácido en la región de la interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de gozne Fe de tal forma que el anticuerpo tiene una unión de la proteína A de Staphylococcyl (SpA) deteriorada con relación a la unión de del dominio de gozne Fe nativo. Este método se describe con mayor detalle en la Patente de E. U. A. No. 6,165,745 de Ward et al .
En otra modalidad, un anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Varios métodos son posibles. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de E . U. A. No. 6,277,375. En otra modalidad, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: M252Y, S254T, T256E, como se describe en la Patente de E . U. A. No. 7,083,784. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo puede modificarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión del receptor salvaje tomado de dos ciclos de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las Patentes de E. U. A. Nos. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta et al.
En otras modalidades, una región Fe se modifica a través del reemplazo de por lo menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para reducir la función(s) efectora del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 puede reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de tal forma que el anticuerpo tiene una afinidad reducida para un ligando efector pero retiene la habilidad de unión a antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector del cual la afinidad se reduce puede ser, por ejemplo, un receptor Fe o el componente Cl del complemento. Este método se describe con mayor detalle en las Patentes de E. U. A. Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter et al.
En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 329, 331 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de tal forma que el anticuerpo tiene una unión Clq reducida y/o una citotoxicidad dependiente del complemento reducida o eliminada (CDC) . Este método se describe con mayor detalle en la Patente de E. U. A. No. 6,194,551 de Idusogie et al.
En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 231 y 239 se modifican para por lo tanto reducir la habilidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este método se describe además en la Publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
En otra modalidad, la región Fe de un anticuerpo de la invención además se modifica para disminuir la habilidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpos (ADCC) y/o disminuir la afinidad del anticuerpos para un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones : 238, 239, 248, 249, 252, 254 , 255, 256 , 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272 , 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 333 , 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373 , 376 , 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434 , 435, 437, 438 ó 439. Este método se describe además en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta.
Otra modificación de los anticuerpos en la presente que se contempla por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, aumentar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o uno de sus fragmentos, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG) , tal como un éster reactivo o derivado aldehidos de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se pueden unir al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. En ciertos casos, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) . Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG, que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como la mono-alcoxi de Ci-ao o ariloxi -polietilenglicol o polietilenglicol maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglicosilado . Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y pueden aplicarse a anticuerpos de la invención. Ver, por ejemplo, EP 0 154 316 de Nishimura et al. y EP 0 401 384 de Ishikawa et al De esta forma, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de los anticuerpos anti-IFNARl, por ejemplo, pero no se limitan a 3F11, 4G5, 11E2, y 9D4 , se utilizan para crear anticuerpos anti-IFNARl estructuralmente relacionados que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como la unión a IFNAR1. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 3F11, 4G5, 11E2, o 9D4 , o sus mutaciones, pueden combinarse recombinantemente con regiones de estructura conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-IFNARl recombinantemente modificados adicionales de la invención como se explicó anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las .descritas en las secciones previas. El material de partida para el método de modificación es uno o más de las secuencias de VH y/o VL provistas en la presente, o una o más regiones CDR de la misma. Para crear el anticuerpo modificado, no es necesario actualmente preparar (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tienen una o más de las secuencias VH y/o VL provistas en la presente, o una o más de sus regiones CDR. Más bien, la información contenida en la secuencia (s) se utiliza como material de partida para crear una secuencia (s) de "segunda generación" derivada de la secuencia (s) y después la secuencia (s) de la "segunda generación" se prepara y expresada como una proteína .
Composiciones En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que contienen una o más de una combinación de anticuerpos monoclonales , o proteínas de fusión que comprende una región Fe de la misma, como se describe en la presente, formuladas junto con un potador. Tales composiciones pueden incluir una o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, proteínas de fusión, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. En algunas modalidades, tales composiciones son fisiológicamente tolerables y, como tal, son adecuados para la administración a un sujeto (también referida como una "composición farmacéutica de la invención". Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecífieos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.
En otra modalidad, las composiciones de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición base. Las sales de adición de ácido, incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono-y dicarboxílieos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos alcanoicos de hidroxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición base, incluyen las derivados de metales de tierra alcalina, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N, ' -dibenciletilenodiamina , N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina , procaína y similares.
En otra modalidad, las composiciones de la invención también pueden incluir un anti -oxidante farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables son incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol , y similares; y (3) agentes quelatadores metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden utilizarse en las composiciones contempladas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares), y sus mezclas adecuadas, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, u ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y a través del uso de agentes tensioactivos .
En otra modalidad, las composiciones de la invención también puede contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede acelerarse tanto a través de procedimientos de esterilización como a través de la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , ácido fenol sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como los azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersión inyectables estériles. El uso de tales medios de agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto hasta ahora cualquiera de los medios o agentes convencionales es incompatible con el compuesto activo, su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención se contempla. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente pueden ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposomas, u otra estructura adecuada para una alta concentración de fármacos . El portador puede ser un medio solvente o una dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol ( y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y a través del uso de agentes tensioactivos . En muchos casos, será adecuado incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo la la composición de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento ( liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado de una de sus soluciones estériles-filtradas previamente En una modalidad, las composiciones (por ejemplo, formulaciones líquidas) de la invención son formulaciones libres de pirógeno, que están sustancialmente libres de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que se confinan dentro de un microorganismo y se liberan cuando los microorganismos se separan o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables que inducen fiebre (glicoproteínas) de la membrana exterior de las bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y choque si se administran a humanos. Debido a los efectos dañinos potenciales, es ventajoso eliminar aún las pequeñas cantidades de endotoxinas de las soluciones de fármaco farmacéuticas intravenosamente administradas. La Administración de Alimentos y Fármacos ("FDA") ha establecido un límite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dosis por kilogramo de peso corporal en un período de una hora para aplicaciones de fármaco intravenoso (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000) ) . Cuando las proteínas terapéuticas se administran en cantidades de varios cientos o miles de miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede ser el caso con anticuerpos monoclonales , es ventajoso eliminar aún las cantidades de rastreo de la endotoxina. En una modalidad, los niveles de endotoxina y pirógeno en la composición son menores de 10 EU/mg o menores de 5 UE/mg, o menores de 1 EU/mg, o menores de 0.1 EU/mg o menores de 0.01 UE/mg, o menores de 0.001 EU/mg. En otra modalidad, os niveles de endotoxina y pirógeno en la composición son menores de aproximadamente 10 EU/mg, o menores de aproximadamente 5 EU/mg, o menores de aproximadamente 1 EU/mg, o menores de aproximadamente 0.1 EU/mg, o menores de 0.01 EU/mg, o menores de aproximadamente 0.001 EU/mg.
La cantidad efectiva del ingrediente que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del sujeto que se está tratando, y el modo de administración particular. La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual generalmente será la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del 100%, esta cantidad estará en intervalo de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente 99 por ciento del ingrediente activo, también de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, también de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con el portador farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, una sola inyección rápida puede administrarse, varias dosis divididas puede administrarse con el tiempo o la dosis puede proporcionalmente reducirse o aumentarse según se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria unitaria como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dictan por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos tales como el compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Para la administración de un anticuerpo, los intervalos de dosificación de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg peso corporal, 3 mg/kg peso corporal, 5 mg/kg peso corporal o 10 mg/kg peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo abarca la administración de una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses, o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación, para un anticuerpo anti-IFNARl de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de administración intravenosa, con el anticuerpo siendo dado utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas durante seis dosis, después cada tres meses, (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas .
Alternativamente, un anticuerpo de la proteína de fusión puede administrarse en una formulación de liberación sostenida en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de la administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente no frecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos algunas veces es requerida hasta que el avance de la enfermedad se reduce o termina, y usualmente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A continuación, el paciente puede administrarse un régimen profiláctico.
Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar para así obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, el grado de excreción del compuesto particular que se está utilizando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico anterior del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-IFNARl de la invención resulta en una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o incapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. En el caso de, por ejemplo, Lupus Sistémico Eritematoso (SLE) , una dosis terapéuticamente efectiva puede evitar una deterioración adicional de los síntomas físicos asociados con SLE, tales como, por ejemplo, dolor, fatiga o debilidad. Una dosis terapéuticamente efectiva también puede prevenir o retrasa el inicio del SLE, tal como puede ser deseado cuando los signos tempranos o preliminares de la enfermedad están presentes. Igualmente incluye el avance crónico retrasado asociado con SLE. Las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnóstico de SLE incluyen químicas, hematología, serología y la radiología. Por consiguiente, cualquier ensayo clínico bioquímico que monitorea cualquiera de los anteriores puede utilizarse para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapéuticamente efectiva para el tratamiento de SLE. Un experto en la técnica será capaz de determinar tales cantidades con base en tales factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o la ruta de administración seleccionada .
Una composición de la presente invención puede administrarse a través de una o más rutas de administración utilizando una o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se aprecia por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas seleccionadas para los anticuerpos de la invención incluyen la ruta de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , subcutánea, espinal u otras rutas de parenteral, por ejemplo, a través de inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente a través de inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular , intraorbital , intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural e intrasternal .
Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o en la mucosa, intranasalmente , oralmente, vaginalmente , rectalmente, sublingualmente o tópicamente.
Los compuestos activos pueden preparase con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos , y sistemas de suministro microencapsulado . Los polímeros biocompatibles , biodegradables , pueden utilizarse, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentadas o generalmente se conocen por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en otra modalidad, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las Patentes de E. U. A. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824, o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: Patente de E. U. A. No. 4,487,603, que describe una bomba de micro- infusión implantable para suministrar medicamentos a una velocidad controlada; Patente de E. U. A. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente de E. U. A. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; Patente de E. U. A. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantables de flujo variable para el suministro del fármaco continuo; Patente de E. U. A. No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármacos osmótico que tiene compartimentos multi-cámara, y Patente de E . U. A. No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan aquí por referencia. Muchos de otros de tales implantes, sistemas de suministro, y módulos son conocidos por el expertos en la técnica.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden formularse para asegurar la apropiada distribución in vivo. Por ejemplo, la barrera sanguínea del cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurarse que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea) , pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, ver, por ejemplo, Patentes de E. U. A. Nos. 5,374,548 y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que se transportan selectivamente en células u órganos específicos, de esta forma mejorando el suministro de fármacos activado ver, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol . 29:685) . Las fracciones de activación ilustrativas incluyen folato o biotina (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,416,016 de Low et al); manosidas (Umezawa et al, (1988) Biochem. Biophys . Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); el receptor de la proteína A del agente tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol . 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:9090); ver también K. Keinanen; MX. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994; Immunomethods 4:273.
Usos para diagnóstico En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticos in Vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar niveles de IFNARl, o niveles de células que expresan IFNARl. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniéndose en contacto una muestra (por ejemplo, tal como muestra in vitro) y una muestra de control con el anticuerpo anti-IFNARl bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y IFNAR1. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo e IFNAR1 se detecta y compara en la muestra y el control. Por ejemplo, los métodos estándar de detección, bien conocidos en la técnica, tales como ELISA y ensayos citométricos de flujo, pueden llevarse a cabo utilizando las composiciones de la invención .
Por consiguiente, en un aspecto, la invención además proporciona métodos para detectar la presencia de IFNAR1 (por ejemplo, el antígeno IFNAR1 humano) en una muestra, o medir la cantidad de IFNAR1, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con los anticuerpos de la invención, o una de sus proteínas de unión a antígeno, que específicamente se une a IFNAR1, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o una de sus porciones y IFNAR1. La formación de un complejo después se detecta, en donde una diferencia en la formación del complejos entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia de IFNAR1 en la muestra .
Aplicaciones terapéuticas IFNAR1 forma parte del receptor celular para interferones de tipo I, y los interferones de tipo I se sabe que son citocinas inmunomoduladoras que están involucradas en la diferenciación de la células T, la producción del anticuerpos y la actividad y la supervivencia de las células T de memoria. Además, la expresión aumentada de los interferones de tipo I se ha descrito en numerosas enfermedades autoinmunitarias , en la infección VIH, en rechazo al trasplante y en enfermedad de rechazo contra hospedero (GVHD) . Por consiguiente, los anticuerpos anti-IFNAR1 de la invención o sus fragmentos, que inhiben la actividad funcional de los interferones de tipo I, puede utilizarse en una variedad de indicaciones clínicas que involucran la actividad del interferón de tipo I aberrante o indeseada. La invención abarca métodos para prevenir, tratar, mantener, mitigar o inhibir una enfermedad o trastorno mediada por el interferón de tipo I, en donde los métodos comprenden administrar anticuerpos, o sus porciones de unión a antígeno de la invención.
Los ejemplos específicos de afecciones autoinmunitarias en donde los anticuerpos de la invención pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: lupus sistémico eritematoso (SLE) , diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBM) (incluyendo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enfermedad del abdomen) , esclerosis múltiple (MS) , psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria , artritis reumatoide (RA) y glomerulonefritis . Además, las composiciones de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para inhibir o prevenir el rechazo al trasplante o en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) o en el tratamiento de infecciones de VIH/SIDA.
Los altos niveles de IFNa se han observado en el suero de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) (ver, por ejemplo, Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol . 70:562-569). Además, la administración de IFNa, por ejemplo en el tratamiento de cáncer o infecciones virales, ha demostrado que induce SLE (García-Porrúa et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol . 16:107-108). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de SLE a través de la administración del anticuerpo a un sujeto en la necesidad de tratamiento .
Otros métodos para tratar SLE se describen las Solicitudes de Patentes de E. U. A. tituladas "Methods of treating SLE" con los siguientes números de serie: 60/907,767, presentada el 16 de abril del 2007; 60/966,174, presentada el 5 de noviembre del 2007, y la solicitud PCT número de serie PCT/US2007/02494 , presentada el 9 de diciembre del 2007 cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.
IFNa también ha estado implicado en la patología de diabetes tipo I. Por ejemplo, la presencia de IFNa inmunoreactivo en células beta pancreáticas de pacientes con diabetes tipo I ha sido reportado (Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423-1427). El uso prolongado de IFNa en una terapia anti-viral también ha demostrado que induce diabetes de tipo I (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract . 23:33-36). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl o sus fragmentos de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de diabetes de tipo I a través de la administración del anticuerpo a un sujeto en la necesidad de tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti -diabéticos, tales como insulina.
Los anticuerpos para IFNAR1 han demostrado que son efectivos en un modelo animal de enfermedad inflamatoria del intestino (ver solicitud de Patente de E. U. A. No. 60/465,155). De esta forma, los anticuerpos anti-IFNARl o sus fragmentos de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , que incluyen colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, mediante la administración del anticuerpo a un sujeto en la necesidad de tratamiento.
El tratamiento con IFNa también se ha observado que induce tiroides autoinmunitaria (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3:199-210; Prummel and Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedad de la tiroides autoinmunitaria, que incluye hipotiroidismo primario autoinmunitario, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis destructiva con hipotiroidismo, a través de la administración de un anticuerpo de la invención a un sujeto en la necesidad del tratamiento. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes o tratamientos, tales como los fármacos anti-tiroides, yodo radioactivo y tiroidectomía subtotal .
Los altos niveles de IFN también se han observado en la circulación de pacientes con infección VIH y su presencia con un marcador predictivo del avance de SIDA (DeStefano et al. (1982; J. Infec . Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cáncer Res. 46:417). De esta forma, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de infección por el VIH o SIDA mediante la administración del anticuerpos de la invención . a un sujeto en necesidad de tratamiento. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes anti-VIH, tales como inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleósido, inhibidores de la proteasa e inhibidores de fusión.
Los anticuerpos de IFNAR1 han demostrado ser efectivos en la inhibición del rechazo al aloinjertos y la supervivencia al aloinjerto prolongado (ver, por ejemplo, Tovey et al. (1996) J. Leukoc . Biol . 59:512-517; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18:273-284). Por consiguiente, los anticuerpos anti-IFNARl de la invención también pueden utilizarse en receptores con trasplante para inhibir el rechazo al aloinjertos y/o prolongar la supervivencia por injerto. La presente invención proporciona un método para inhibir el rechazo al trasplante mediante la administración de los anticuerpos anti-IFNARl de la invención a un receptor con trasplante en la necesidad del tratamiento. Los ejemplos de trasplantes de tejido que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, hígado, pulmón, riñon, corazón, intestino delgado, y células de isleta pancreática, así como el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes para inhibir el rechazo al trasplantes, tales como agentes inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, micofenolato de mofetilo, sirilimus, rapamicina, tacrolimus) , agentes antiinfecciosos (por ejemplo, aciclovir, clotrimazol, ganciclovir, nistatina, trimetoprimsulfarnetoxazol ) , diuréticos (por ejemplo, bumetanida, furosemida, metolazona) y medicamentos para úlcera (por ejemplo, cimetidina, famotidina, lansoprazol, omeprazol, ranitidina, sucralfato) .
En otras modalidades específicas, la invención proporciona métodos para administrar y utilizar composiciones y anticuerpos de la invención para tratar y prevenir una amplio intervalo de afecciones inflamatorias, que incluyen tanto afecciones crónicas como agudas, tales como, pero no limitándose a, apendicitis, úlcera péptica, gástrica, y duodenal, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerativa, pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis , epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad del complejo inmunitario, isquemia de órgano, daño por reperfusión, necrosis de órgano, fiebre del heno, asepsia, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia , granuloma eosinofílico, granulomatosis , sarcoidosis, aborto séptico, epididimitis , vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis cística, neumonitis, pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis , alvealitis, bronquiolitis , faringitis, pleuresía, sinusitis, influenza, infección del virus sincitial respiratorio, infección por herpes, infección VIH, infección por el virus de hepatitis B, infección por el virus de hepatitis C, bacteremia diseminada, fiebre del dengue, candidiasis, malaria, filariasis, amibiasis, quistes hidatídicos , quemaduras, dermatitis, dermatomiositis , quemaduras por el sol, urticaria, verrugas, ronchas, vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis , tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia al miocardio, periarteritis nodosa, fiebre reumática, enfermedad de Alzheimer, enfermedad del celiaco, falla cardíaca congestiva, restenosis, síndrome de tensión respiratoria en adultos COPD, meningitis, encefalitis, esclerosis múltiple, infarto al cerebro, embolismo cerebral, síndrome de Guillame-Barré, neuritis, neuralgia, daño en la espina dorsal, parálisis, la uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal , artritis reumatoide, sinovitis, miastenia grave, tiroiditis, lupus sistémico eritematoso, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo al aloinjerto, enfermedad de injerto contra hospedero, diabetes tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, síndrome de Retier y enfermedad de Hodgkin.
En otra modalidad, los métodos de la administración y composiciones de anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la prevención, tratamiento, mejora de los síntomas asociados con las siguientes afecciones o estados de enfermedad: enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, oftalmitis simpática, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria , síndrome linfoproliferativo autoinmunitarioo, el síndrome antifosfolipídico, síndrome de Sjógren, esclerodermia, enfermedad de Addison, síndrome de deficiencia poliendócrina, síndrome de Guillan-Barré, púrpura trombocitopénica inmunitaria, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, enfermedad del tejido conectivo mixto, vitíligo, uveítis autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombopocitopenia autoinmunitaria, enfermedad del celiaco, dermatitis herpetiformis , hepatitis autoinmunitaria, pénfigo, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo pulloso, miocarditis autoinmunitaria, vasculitis autoinmunitaria, alopecia areata, aterosclerosis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, mielopatía autoinmunitaria, hemofilia autoinmunitarias, cistitis intersticial autoinmunitaria, diabetes isipidus autoinmunitaria, endometriosis autoinmunitaria, policondritis reincidente, espondilitis anquilosante, urticaria autoinmunitaria, dermatomiositis , síndrome de Miller-Fisher, nefropatía IgA, síndrome de goodpasture, y herpes gestacional.
En otra modalidad, los métodos de administración y composiciones de anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la prevención, tratamiento, mejora de los síntomas asociados con el síndrome de Sjógren. El síndrome de Sjógren es un trastorno autoinmunitarioo en donde las células inmunitarias atacan y destruyen las glándulas exocrinas que producen lágrimas y saliva. Se denomina por el oftalmólogo Sueco Henrik Sjógren (1899-1986) que primero la describió. El síndrome de Sjógren también está asociado con trastornos reumáticos tales como artritis reumatoide, y es el factor reumatoide positivo en 90 por ciento de los casos. Los síntomas característicos del trastorno son boca seca y ojos secos. Además, el síndrome de Sjógren puede causar sequedad en la piel, nariz y vaginal, y puede afectar otros órganos del cuerpo, incluyendo los ríñones, los vasos sanguíneos, pulmones, hígado, páncreas y cerebro. Nueve de diez pacientes con Sjógren son mujeres y la edad promedio del inicio es a finales de los 40s, aunque Sjógren ocurre en todos tanto en hombres como mujeres. Se estima que ataca tanto como 4 millones de personas en los Estados Unidos convirtiéndola en la segunda enfermedades reumática autoinmunitaria más común.
La miositis es una afección general caracterizada por inflamación de los músculos esqueléticos o del músculo voluntario. La inflamación muscular puede ser causada por una reacción alérgica, exposición a un sustrato o medicina tóxica u otra enfermedad tal como cáncer o afecciones reumatoides, o un virus u otro agente infeccioso. Las miopatías inflamatorias crónicas son idiopáticas, significando que no tienen una causa conocida. Se entiende que para hacer trastornos autoinmunitarias , en donde los glóbulos blancos del cuerpo (que normalmente combaten la enfermedad) atacan los vasos sanguíneos, las fibras musculares normales, y los tejido conectivos en órganos, huesos y articulaciones.
La polimiositis afecta a los músculos esqueléticos (involucrados en los movimientos) en ambos lados del cuerpo. Se ve raramente en personas menores de 18 años; la mayoría de los casos son pacientes entre los 31 y 60. Además de los síntomas listados anteriormente, la debilidad muscular progresiva conduce a dificultar en la deglución, el habla, levantarse en una posición sentada, subir escaleras, levantar objetos, o levantar la cabeza. Los pacientes con polimiositis también pueden experimentar artritis, falta de aliento, y arritmias cardíacas.
La dermatomiositis se caracteriza por una erupción cutánea que precede o acompaña la debilidad muscular progresiva. La erupción se ve irregular, con decoloraciones azulosas-moradas o rojas, y característicamente se desarrolla en los párpados y en los músculos utilizados en las articulaciones extendidas y enderezadas, incluyendo los nudillos, codos, tobillos y dedos. Las erupciones roja también se puede ocurrir en la cara, cuello, hombros, pecho superior, espalda y otros lugares, y puede haber hinchazón en las áreas inflamadas. Las erupciones algunas veces ocurren sin una participación del músculo obvio. Los adultos con dermatomiositis pueden experimentar pérdida de peso o una fiebre de bajo grado, tener pulmones inflamados, y ser sensible a la luz. La dermatomiositis en adultos, a diferencia de la polimiositis , puede estar acompañar de tumores de pecho, pulmones, genitales femeninos, o los intestinos. Los niños y adultos con dermatomiositis pueden desarrollar depósitos cálcicos, que aparecen como protuberancias duras bajo la piel o en los músculos (denominado calcinosis) . La calcinosis por lo general ocurre en los 1-3 años después del inicio de la enfermedad pero pueden ocurrir muchos años después. Estos depósitos se ven más comúnmente en la dermatosis infantil que la dermatomiositis que inicia en adultos. La dermatomiositis puede estar asociada con enfermedades vasculares de colágeno o autoinmunitarias .
La miositis por cuerpos de inclusión (IBM) se caracteriza por debilidad y pérdida de los músculos progresiva. IBM es similar a la polimiositis, pero tiene sus propias características distintivas. El inicio de la debilidad muscular generalmente es gradual (durante meses o años) y afecta tanto a los músculos próximos como distales. La debilidad muscular puede afectar solamente un lado del cuerpo. Se ven pequeños orificios denominados vacuolas en las células de las fibras musculares afectadas. Las caídas y los tropiezos son usualmente los primeros síntomas notables de IBM. Para algunos pacientes el trastorno inicia con debilidad en las muñecas y dedos que causa dificultad para pellizcar, abotonar y sujetar objetos. Puede haber debilidad de los músculos de las muñecas y dedos y atrofia (adelgazamiento o pérdida del volumen) de los músculos del antebrazo y los músculos de los cuádriceps en las piernas. La dificultad para deglutir ocurre en aproximadamente la mitad de los casos IBM. Los síntomas de la enfermedad usualmente inician después de la edad de los 50s, aunque la enfermedad puede ocurrir más tempranamente. A diferencia de la polimiositis y la dermatomiositis , IBM ocurre más frecuente en hombres que en mujeres.
La miositis juvenil tiene algunas similitudes con la dermatomiositis adulta y la polimiositis. Típicamente afecta niños de entre 2 y 15 años, con síntomas que incluyen debilidad muscular próxima e inflamación, edema (recolección anormal de fluidos dentro de los tejidos corporales que causan inflamación) , dolores musculares, fatiga, erupciones en la piel, dolor abdominal, fiebre y contracturas (acortamiento crónico de los músculos o tendones alrededor de las articulaciones, causado por inflamación en los tendones musculares, que evita que las articulaciones se muevan libremente) . Los niños con miositis juvenil también pueden tener dificultad para deglutir y respirar, y el corazón puede estar afectado. Aproximadamente del 20 al 30 por ciento de los niños con dermatomiositis juvenil desarrollan calcinosis.
Los pacientes juveniles pueden no mostrar niveles más altos de los normales de la enzima creatina cinasa del músculo en la sangre pero pueden tener niveles más altos de los normales de otras enzimas musculares.
Por consiguiente, en otras modalidades, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la prevención, tratamiento o mejora de miositis, miositis inflamatoria, miositis idiopática, polimiositis , dermatomiositis , miositis de cuerpos de inclusión (IBM) , miositis juvenil o síntomas asociados con estas afecciones.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la prevención, tratamiento, o mejora de los síntomas asociados con vasculitis.
Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para el tratamiento de esclerodermia . Los métodos para tratar esclerodermia se describen en la solicitud de Patente de E. U. A. titulada "Methods Of Treating Scleroderma" con un número de solicitud de 60/996,175, presentada el 5 de noviembre del 2007 y la solicitud PCT No. PCT/US2008/82481 que se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la prevención, tratamiento, o mejoría de los síntomas asociados con sarcoidosis. Sarcoidosis (también denominada enfermedad sarcoidea o de Besnier-Boeck) es un trastorno del sistema inmunitario caracterizada por granulomas no necrotizantes (nodulos inflamatorios pequeños) . Virtualmente cualquier órgano puede ser afectado; sin embargo, los granulomas por lo general aparecen en los pulmones o en los nodos linfoides. Los síntomas pueden ocasionalmente aparecer de repente pero usualmente aparecen de manera gradual. Cuando se visualizan rayos X de los pulmones, la sarcoidosis puede tener la apariencia de tuberculosis o linfoma.
También dentro del alcance de la invención están los kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, los anticuerpos anti-IFNARl) de la invención e instrucciones para su uso. El kit además puede contener por lo menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno objetivo diferente del primer anticuerpo) . Los kits típicamente incluyen una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material registrado suministrado en o con el kit, o por el contrario que acompaña al kit.
Combinaciones Las composiciones de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, tal como, combinado con otros órganos. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-IFNARl de la presente invención combinado con por lo menos otro inmunosupresor .
En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo usualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalo entre las dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica a través de la medición de los niveles del anticuerpo en la sangre para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 mg/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 mg/ml.
Cuando los anticuerpos para IFNAR1 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IFNARl de la invención pueden utilizarse en combinación con uno o más de los siguientes agentes: fármacos que contienen mesalamina (incluyendo sulfasalazina y otros agentes que contienen ácido 5 -aminosalicílico (5 -ASA) , como olsalazina y balsalazida) , fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAIDs) , analgésicos, corticoesteroides (por ejemplo, predinisona, hidrocortisona) , inhibidores de TNF (incluyendo adalimumab (HUMIRA ®) , etanercept (ENBREL ®) y infliximab (REMICADE ®) ) , inmunosupresores (tal como 6-mercaptopurina , azatioprina y ciclosporina A) , y antibióticos del anticuerpo anti-IFN , anticuerpo del receptor anti-IFNy, y el receptor IFNy soluble. Además, un anticuerpo anti-IFNARl de la invención puede utilizarse en combinación con un antagonista del ligando Flt3 (ver, por ejemplo, Solicitud de E. U. A. No. 2002/0160974).
En otras modalidades, las composiciones de la invención también pueden incluir agentes útiles en el tratamiento del SLE. Tales agentes incluyen analgésicos, corticoesteroides (por ejemplo, predinisona, hidrocortisona) , inmunosupresores (tales como ciclofosfamida, azatioprina y metotrexato) , y antimalarios (tales como hidroxicloroquina) y fármacos biológicos que inhiben la producción de anticuerpos ADNds (por ejemplo, LJP 394) .
Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de verificar utilizando solamente experimentación de rutina, muchos equivalentes a modalidades de la invención descritos en la presente.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan por referencia en la especificación en el mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente estuviera específica e individualmente indicada a ser incorpora aquí por referencia.
Además, las siguientes Solicitudes de Patente Provisionales de los Estados Unidos: 61/006, 962 presentada el 08 de febrero del 2008, 61/034,618 presentada el 7 de marzo del 2007, y 61/049,970 presentada el 2 de mayo del 2008 se incorporan 'por referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos Modalidades específicas 1. - Un anticuerpo monoclonal de la clase IgG modificado específico para IFNAR1, en donde el anticuerpo comprende en . la región Fe por menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de L234F, L235E y P331S, enumerada a través del índice EU como se establece en Kabat y en donde el anticuerpo exhibe una afinidad reducida a por lo menos un ligando Fe comparado con un anticuerpo no modificado. 2. - El anticuerpo de la modalidad 1, en donde el anticuerpo es una subclase IgGl o IgG4. 3. - El anticuerpo de la modalidad 2, en donde anticuerpo es una molécula de clase IgGl. 4. - El anticuerpo de la modalidad 3, en donde el anticuerpo comprende una sustitución de aminoácido de P331S. 5. - El anticuerpo de la modalidad 3, en donde el anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos: L234F y L235E. 6. - El anticuerpo de la modalidad 3, en donde el anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos: L234F, L235E y P331S. 7. - El anticuerpo de la modalidad 3, en donde el anticuerpo es una molécula de la clase IgG . 8. - El anticuerpo de la modalidad 7, en donde el anticuerpo comprende una sustitución de aminoácido de L235E de la región Fe . 9. - El anticuerpo de la modalidad 7, en donde el anticuerpo además comprende en la región Fe la sustitución de aminoácido S228P. 10. - El anticuerpo de cualquiera de modalidades 1-9, en donde el anticuerpo comprende por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) , seleccionada de la Tabla 2. 11. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una CDR1 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 31; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 32; c. una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 33; d. una CDRl de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 34; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 35; y f . una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 36. 12. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde anticuerpo comprende: a. una CDRl de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 1; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO : 2 ; c. una- CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 3; d. una CDRl de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 4; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO : 5; y f. una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 6. 13. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una CDRl de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 11; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende" SEC ID NO: 12; c . una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 13; d. una CDRl de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 14; e . una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 15; y f . una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 16. 14.- El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde anticuerpo comprende: a. una CDRl de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO : 21; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 22; c. una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 23; d. una CDRl de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 24; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO : 25; y f . una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 26. 15.- El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 38; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 40. 16.- El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10. 17. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20. 18. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-10, en donde el anticuerpo comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 28; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 30. 19. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-18, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de la región constante de cadena ligera de SEC ID NO : 41. 20. El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-18, en donde el anticuerpo comprende la región constante de cadena pesada de la SEC ID NO: 42. 21. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-18, en donde el anticuerpo comprende la región constante de de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 41, y la región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 42. 22. - El anticuerpo de cualquiera de modalidades 19-21, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que comprende la variación alélica, en donde la variación alélica es al menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 214, 221, 356 y 358 como se define por el sistema de numeración del índice EU. 23. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: anticuerpo humano,- anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, intracuerpo, y un anticuerpo sintético. 24.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores. 25.- El ácido nucleico de la modalidad 24, en donde el ácido nucleico es un vector replicable. 26.- El ácido nucleico de la modalidad 25, en donde la secuencia de polinucleótido está operablemente enlazada a un promotor. 27.- Una célula hospedera que comprenden o se transforma con el vector de la modalidad 25 ó 26. 28.- Un ratón transgénico que comprende los transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23. 29.- Un hibridoma preparado de ratón de la modalidad 28 en donde el hibridoma produce el anticuerpo. 30. - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 31. - Un método para tratar una afección o una enfermedad asociada con un trastorno inmunitario, que comprende administrar a un sujeto en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de la composición de la modalidad 30. 32. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad es una enfermedad mediada por interferón de tipo I . 33. - El método de la modalidad 32, en donde el interferón de tipo I es interferón alfa. 34. - El método de la modalidad 33, en donde la enfermedad mediada por el interferón de tipo I está asociada con el receptor del interferón de tipo I . 35. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es infección VIH de SIDA. 36. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es lupus sistémico eritematoso. 37.- El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es síndrome de Sjógren. 38. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es miositis. 39. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es miositis inflamatoria. 40. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es polimiositis . 41. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es dermatomiositis . 42.- El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es miositis de cuerpo de inclusión. 43. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es miositis juvenil. 44. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es miositis inflamatoria idiopática. 45. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es vasculitis. 46. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es sarcoidosis. 47.- El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, glomerulonefritis y enfermedad de injerto contra hospedero. 48. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es psoriasis o afecciones que resultan de la misma. 49. - El método de la modalidad 31, en donde la enfermedad o trastorno es el rechazo al trasplante o la enfermedad de injerto contra hospedero. 50. - El método de la modalidad 31 en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, oftalmitis simpática, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, el síndrome antifosfolipídico, síndrome de Sjógren, esclerodermia, enfermedad de Addison, síndrome de deficiencia poliendócrina , síndrome de Guillan-Barré , púrpura trombocitopénica inmunitaria, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, enfermedad del tejido conectivo mixto, vitíligo, uveítis autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombopocitopenia autoinmunitaria, enfermedad del celiático, dermatitis herpetiformis , hepatitis autoinmunitaria , pénfigo, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo pulloso, miocarditis autoinmunitaria, vasculitis autoinmunitaria, alopecia areata, aterosclerosis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, mielopatía autoinmunitaria, hemofilia autoinmunitarias , cistitis intersticial autoinmunitaria, diabetes isipidus autoinmunitaria, endometriosis autoinmunitaria, policondritis reincidente, espondilitis anquilosante, urticaria autoinmunitaria, dermatomiositis , síndrome de Miller-Fisher, nefropatía IgA, síndrome de goodpasture, y herpes gestacional . 51. - El método de cualquiera de modalidades 31-50, que además comprende administrar por lo menos un agente seleccionado del grupo que consiste de: fototerapia, corticoesteroides , prednisona, NSAID, plasmaféresis , inmunosupresores , metotrexato, ácido retinoico, tioguanina, micofenolato mofetilo, ásteres fumárico, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina, e inmunoglobulinas . 52. - El método de cualquiera de las modalidades 31-51, que además comprende administrar por lo menos un agente seleccionado del grupo que consistente de: alefacept (AMEVIVE™) , etanercept (ENBREL®) , adalimumab (HUMIRA®) , infliximab (REMICADE®) , belimumab (LYMPHOSTATB™) , rituxumab (RITUXAN®) , y efalizumab (RAPTIVA®) . 53. - Un cristal que comprende una región Fe de IgG humana, en donde la región Fe de IgG humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de L234F, L235E y P331S, según enumerado por el índice EU como se estable en kabat y en donde el fragmento exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con una región Fe no modificada. 54.- El cristal de la modalidad 53, en donde la región Fe de IgG humana comprende las sustituciones de aminoácido L234F, L235E y P331S. 55.- El cristal de la modalidad 53, que es de calidad de difracción. 56. - El cristal de la modalidad 53, que es un cristal nativo. 57. - El cristal de la modalidad 53, que se caracteriza por una célula unitaria ortorrómbica de a = 50.18 ± 0.2 Á, b = 147.30 ± 0.2 Á, y c = 75.47 + 0.2 Á. 58. - El cristal de la modalidad 53, que tiene un grupo de espacio de C222i. 59. - Un anticuerpo monoclonal modificado, en donde el anticuerpo comprende en la región Fe las sustituciones de aminoácidos L234F, L235E y P331S, según enumeradas por el índice EU como se establece en Kabat y en donde el anticuerpo exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con un anticuerpo no modificado. 60.- Una proteína de fusión que comprende una región Fe modificada, en donde la región Fe comprende las sustituciones de aminoácidos L234F, L235E y P331S, según enumeradas por el índice EU como se establece en Kabat y en donde la región Fe exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con una región Fe. 61. - Un método de hacer el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23 ó 59. 62. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23 ó 59, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de internalización . 63. - La proteína de fusión de la modalidad 60, en ' donde la proteína de fusión es una proteína de fusión de internalización . 64. - La proteína de fusión de la modalidad 63, en donde la proteína de fusión específicamente se une a IFNAR1. 65. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23, 59, ó 62, en donde el anticuerpo exhibe una citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo reducida o eliminada (ADCC) en comparación con el anticuerpo no modificado. 66. - El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23, 59, ó 62, en donde el anticuerpo exhibe una citotoxicidad mediada por el complemento reducida o eliminada (CDC) en comparación con el anticuerpo no modificado. 67.- El anticuerpo de cualquiera de las modalidades 1-23, 59, ó 62, en donde el anticuerpo exhibe una ADCC y CDC reducida o eliminada en comparación con el anticuerpo no modificado. 5.15 Secuencias Región constante de cadena ligera (SEC ID NO: 41) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC Región constante de cadena pesada (SEC ID NO: 42) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP EFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 6. EJEMPLOS Ahora se describe la invención con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son provistos con el propósito de ilustración solamente y la invención no deberá construirse en ninguna forma como estando limitada a estos ejemplos sino más bien deberá construirse para abarcar cualquiera y todas las variaciones que se hacen evidentes como un resultado de las enseñanzas provistas en la presente.
Ejemplo 1: Perfil IHC de múltiples anticuerpos Anti - IFNAR1 Propósito: Evaluar el perfil IHC de anticuerpos anti-IFNARl en un grupo diverso de tejidos.
Métodos: Las técnicas de inmunohistoquímica para estudiar las características de unión del anticuerpo son fácilmente conocidas en la técnica y por ejemplo, podrían llevarse a cabo aislando las células o tejidos deseados y preparándolos para microscopía por técnicas de fijación y montaje estándar.
Macrófagos de ratón: Se centrifugó una suspensión celular para formar gránulos sueltos. Los gránulos se congelaron en un medio de congelamiento OCT para formar un bloque. Las secciones de los portaobjetos se cortaron a un grosor de 5 mieras, se remojaron en acetona por 10 minutos y se dejaron secar con un desecante durante la noche. Antes de utilizarse, las portaobjeto se sumergieron en 10% de formalina regulada en pH neutral por 10 segundos y se lavaron en 3X en regulador de pH (IX de TBS con 0.01% de Tween20) .
Monocitos Humanos: Una suspensión celular se propagó/detectó directamente sobre las portaobjeto. Los portaobjetos se dejaron secar durante la noche y después se remojaron en Acetona por 10 minutos y dejaron secar al aire. Antes de utilizarse, las portaobjeto se sumergieron en 10% de formalina regulada en pH neutral por 10 segundos y se lavaron 3X en regulador de pH (IX TBS con 0.01% de Tween20) .
Tejido Cerebral y Cardíaco Humano: Las muestras tisulares de donadores se congelaron en medio de congelamiento OCT para formar un bloque. Las secciones de los portaobjetos se cortaron a un grosor de 5 mieras, se remojaron en acetona por 10 minutos y se dejaron secar con un desecante durante la noche. Antes de utilizarse, las portaobjeto se sumergieron en 10% de formalina regulada en pH neutral por 10 segundos y se lavaron 3X en regulador de pH (1XTBS con 0.01% de Tween 20) .
Marcación del anticuerpo: Los anticuerpos se conjugaron a biotina a través del siguiente protocolo. Aproximadamente 500 µg del anticuerpo se mezclaron con con un exceso de 20 veces de biotina y se incubaron por 2 horas en la oscuridad a 4°C. Después de 2 horas de incubación, la mezcla de anticuerpo/biotina se aplicó a una columna PD10 pre-equilibrada con IX de PBS . Posteriormente, los anticuerpos conjugados con biotina se concentraron a una concentración deseada utilizando un tubo de concentración Y-30 Centricon.
Tinción del portaobjetos: Después de lavar en regulador de pH, las portaobjeto se trataron para extinguir las peroxidasas endógenas mediante el tratamiento con una solución de Glucosa Oxidasa (1 U/ml, Sigma G0543), B-D(+) Glucosa (10 mM, Sigma G5250) , Azida de Sodio (1 mM, Sigma, S8032) por 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos después se enjuagaron en regulador de pH de lavado (IX de TBS con 0.01% de Tween 20) . Las portaobjeto se colocaron en una solución de bloqueo de proteína (lx de PBS pH7.2 , 0.5% de caseína (amina N-Z, Sigma C0626) , 1% de BSA (Sigma A7906) , 1.5% de suero de Cabra Normal (Jackson Labs #005-000-001) por 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo bioteñido (ver arriba) se aplicó a las portaobjeto a través de la dilución en la solución de bloqueo de proteína. La incubación de los portaobjetos con el anticuerpo bioteñido se llevó a cabo a temperatura ambiente por 2 horas. Las portaobjeto se enjuagaron 3X en regulador de pH de lavado (IX de TBS, 0.01% de Tween 20) . La detección del anticuerpo se llevó a cabo utilizando un Kit Vectastain (Vector Laboratories) . Las portaobjeto se lavaron y contrateñidas con hematoxilin . Los portaobjetos se deshidrataron y montaron con cubreobjetos antes de la visualización .
Resultados: En la Figura 6A se presentan los resultados de un análisis IHC de tejido de cerebro Humano teñidos con varios anticuerpos anti-IFNARl y de control. Los anticuerpos MDX-1333 (75 µg/ml) y 4G5 (50 µg/ml) exhibieron una fuerte tinción por la tinción café/oscura vista a todas las muestras. El anticuerpo 9D4 (50 g/ml) no tiñó la muestra tisular del cerebro humano tan bien como MDX-1333 y 4G5 como se demuestra por la tinción café/oscura reducida en la muestra. Se incluyó un control de isotipo IgGl para demostrara la especificidad de unión de los anticuerpos individuales .
Se presentan en la Figura 6B los resultados de un análisis IHC de monocitos teñidos con varios anticuerpos anti-IFNARl y de control. Los anticuerpos DX-1333 (50 y 20 µg/ml) , 4G5 (50 µg/ml) y 9D4 (50 y 20 µg/ml) todos exhibieron una tinción prominente en monocitos humanos como se demuestra por la tinción café/oscura de las muestras. El isotipo no exhibió una tinción prominente en los monocitos humanos. Además, MDX-1333 (50 µg/ml) no tiñó los macrófagos purificados de ratón.
Conclusiones: En el estudio IHC, el anticuerpo anti-IFNARl 9D4 exhibió un nivel menor de tinción cuando se comparad con otros anticuerpos anti-IFNARl tales como MDX-1333 y 4G5.
Ejemplo 2: Generación del anticuerpo 9D4 TM El anticuerpo anti-IFNARl modificado designado "9D4-TM" se generó a través del siguiente procedimiento; El Fe ?? humano se clonó y modifico de PBL humano primero aislando ARN total, transcribiendo ADNc, y amplificando por PCR las regiones constantes con iniciadores específicos de gen conteniendo los sitios de restricción Apa I y EcoRI para la clonación en el vector de mamífero PEE6. El mutante triple (TM) incluye tres cambios de aminoácido en el IgG humano para disminuir la función efectora ADCC (L234F, L235E, y P331S) . El TM se modificó utilizando IgGl humano (KOL) como una plantilla, y utilizando mutagénesis dirigida al sitio (QuickChange XL, Stratagene) para codificar tres cambios de residuo en Fe. La secuencia de los iniciadores mutagénicos utilizada para codificar los cambios L234F/L235E/P331S fue como sigue: MD1056 = 5' cgtgcccagcacctgaaTtcGAggggggaccgtcagtcttc 3 ' L234F, L235E progresivo (SEC ID NO: 3) MD1057 = 5' gaagactgacggtccccccTCgaAttcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E inversa (SEC ID NO:44) D1058 = 5' ccaacaaagccctcccagccTccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S progresiva (SEC ID NO: 45) MD1059 = 5' ggagatggttttctcgatggAggctgggagggctttgttgg 3' P331S inversa (SEC ID NO: 46) Los clones que codifican el anticuerpo 9D4-TM se secuenciaron para confirmar las mutaciones triples, y se resolvieron en el analizador genético ABI3100.
Ejemplo 3: Generación del anticuerpo 9D4 DM El anticuerpo anti-IFNARl modificado designado "9D4-DM" se generó a través del siguiente procedimiento; El Fe ?4 humano se clonó y modificó de PBLs humanos primero aislando el ARN total, transcribiendo el ADNc, y amplificando por PCR las regiones constantes con iniciadores específicos del gen conteniendo sitios de restricción Apa I y EcoRI para la clonación en el vector de mamífero PEE6.
El mutante doble (DM) consiste de dos mutaciones en el Fe de IgG4 humano: S228P y L235E. Los iniciadores mutagénicos para codificar DM incluyen: MD1060 = 5' ggtcccccatgcccaCcatgcccagcacctg 3' de bisagra S228P progresivo (SEC ID N0:47) MD1061 = 5' caggtgctgggcatgGtgggcatgggggacc 3' de bisagra S228P inverso (SEC ID NO:48) MD1062 = 5' ccagcacctgagttcGAggggggaccatcagtc 3'IgG4 L234F, L235E progresivo (SEC ID NO:49) MD1063 = 5' gactgatggtccccccTCgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E inverso (SEC ID NO: 50) Los clones que codifican el anticuerpo 9D4-DM se secuenciaron para confirmar los cambios codificados, y se resolvieron en el analizador genético ABI3100.
Ejemplo 4. Los anticuerpos Anti-IFNARl inhiben la fosforilación STAT mediada por IFN.
Propósito: Establecer la habilidad del anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl para inhibir fosforilación STAT mediada por IFN en células mononucleares de sangre periférica.
Métodos: Las células mononucleares de sangre periférica se purificaron de donadores humanos sanos utilizando medio LSM (MP Biomedical, Solón OH) . Los PBMC se cuantificaron y sembraron a 106 células por condición por cavidad. Los anticuerpos se adicionaron a 10 en la cavidad apropiada y se incubaron a 37 °C, 5% de C02 por 10 minutos. Después de la pre- incubación con anticuerpos, IFN(X2a humano recombinante (PBL Biomedical, Piscataway NJ) o IFN derivado de célula dendrític'a plasmacitoidea humana (ver a continuación para la generación de sobrenadantes de IFN de tipo I derivados de PDC) se agregaron a las cavidades apropiadas a 100 o 500IU/ml por 20 minutos. Las células se centrifugaron a 1200 rpm por 5 minutos y se lavaron con lx de PBS estéril. Después de una centrifugación adicional, el PBS se eliminó y las células se lisaron utilizando el reactivo de extracción de proteína de mamífero (Pierce, Rockford IL) complementado con 300 µL DE lx de los cocteles 1 y 2 del inhibidor de fosfatasa (Sigma, St . Louis MO) y lx de inhibidor de proteasa (Roche Biomedical, Nutley NJ) . Los lisatos se incubaron por 10 minutos en un agitador orbital para asegurar la lisis completa, se transfirieron a tubos de microfuga y se centrifugaron a 14000 rpm para eliminar los residuos celulares. Se agregó regulador de pH de muestra NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad CA) y dTT (Sigma, St . Louis MO) a los lisatos para una concentración final de lx y todas las muestras se desnaturalizaron en un bloque de calor a 100 °C por aproximadamente 10 minutos. Se agregaron 15 µ? de cada muestra a NuPage 10% de gel de poliacrilamida Bis-tris (Invitrogen, Carlsbad CA) en regulador de pH circulante NuPAGE MES SDS complementado con lx de regulador de pH antioxidante NuPAGE. Las muestras se corrieron a 180V por 30 minutos para la separación de las bandas de proteína. Las proteínas después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y las manchas se bloquearon con lx de PBS (Gibco BRL, Carlsbad CA) conteniendo 5% de BSA (Sigma, St . Louis MO) durante la noche a 4°C. El medio de bloqueo posteriormente se eliminó y se agregaron 0.2 g/ml de anti-STAT1, anti-STATl pY701, o una dilución de 1:1000 de anticuerpos de ß-Actina (Cell Signaling Technology, Danvers MA) en las manchas apropiadas y se incubaron durante la noche a 4°C. Las manchas se lavaron 3x en lx de TBS con 0.05% de T een20 (Sigma, St . Louis MO) . El anticuerpo secundario anticonejo conjugado HRP, diluido a 1:2500 se agregó a las manchas y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Las manchas se lavaron como se describió anteriormente y se agregaron 3 mi de una mezcla 1:1 del reactivo Pico Supersignal West (Pierce, Rockford IL) a cada mancha durantel minuto. Las manchas se drenaron, se eliminó el exceso de reactivo y las bandas se visualizaron utilizando un Procesador Kodak X-omat 1000A.
Resultados: Se presentan en la Figura 7 los resultados de un ensayo de activación STAT en donde las células estimuladas con IFN de leucocito en la presencia o ausencia de anticuerpos anti-IFNARl. En ausencia de anticuerpos, el interferón de leucocito estimula la fosforilación de las isoformas 1, 3 y 5 STAT. La incubación de las células con el anticuerpo 9D4-TM inhibe la fosforilación mediada por el tratamiento con interferón de leucocito. Las células tratadas con el anticuerpo de control de isotipo R3-47 no exhiben la inhibición de la fosforilación STAT en respuesta a la estimulación con el interferón de leucocito.
Conclusiones: Los resultados en la Figura 7 demuestran que 9D4-TM es capaz de inhibir la respuesta a IFNoc tal como la inducción de la fosforilación STAT en células mononucleares de sangre periférica.
Ejemplo 5: Los anticuerpos Anti-IFNARl inhiben la señalización de IFN de tipo I.
Propósito: Utilizando IFN de Tipo I purificado de células pDC, se utilizó un ensayo indicador para ensayar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl para bloquear la señalización de INF de Tipo I.
Métodos: Las células dendríticas de plasmocito (PDC) se aislaron de sangre completa de donadores sanos utilizando un medio de separación de linfocito (MP Biomedical, Solón OH) seguido por selección positiva utilizando el Kit de MicroEsferas CD304 (BDCA-4/Neuropilina- 1) (Milten Biotec, Auburn CA) . Las PDC purificadas después se cultivaron a lxlO6 células/ml en RPMI 1640 complementado con 10% de FBS (Gibco BRL) y 6 µ9/p?1 de CpGA (InVivogen, San Diego CA) . Los sobrenadantes se cosecharon y purificaron después de 20 horas en cultivo y el IFN de tipo I se cuantificó utilizando una línea celular reportera HEK293-ISRE establemente transfectada contra una curva estándar de IFN de leucocito humano (PBL Biomedical, Piscataway NJ) .
Las pDC de tres donadores humanos sanos se utilizaron para generar sobrenadantes de interferon de tipo I derivado de pDC humano, como se describe anteriormente. Las células HEK293 (ATCC, Manassas VA) se transíectaron establemente con el plásmido reportado pHTS-ISRE (Biomyx Technology, San Diego CA) y se mantuvieron en DMEM complementado con 10% de FBS, lx de NEAA, y 700 µg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad CA) . Las células se sembraron a una concentración de 80,000 células por cavidad en placas de 96 cavidades blancas/transparentes Optilix (VWR, West Chester PA) . Se agregaron concentraciones apropiadas de los anticuerpos (611 - 0.00004nM) a cada cavidad seguido por la adición de concentraciones apropiadas de sobrenadantes de interferon de tipo I derivado de PDC humano. Las células, IFN, y anticuerpos se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de C02 y la amplificación de la luciferasa proteína se evaluó lisando las células con el reactivo para Lisis del Cultivo Celular y la visualización utilizando el Sistema de ensayo de Luciferasa (Promega, Madison WI) . La señal se midió en cps y los valores IC50 se generaron.
Resultados: Los sobrenadantes de IFN de Tipo I se cosecharon de células pDC derivadas de los tres donadores individuales. En un ensayo indicador de luciferasa, la incubación de los anticuerpos anti-IFNARl inhibió la habilidad de la señalización de varias concentraciones de sobrenadantes de IFN de Tipo I (Figura 8) .
Conclusiones: Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-IFNARl son capaces de inhibir la señalización mediada por IFN de Tipo I según medido por la actividad del ensayo indicador.
Ejemplo 6: Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben características de unión similares al anticuerpo sin modificar progenitor.
Propósito: Investigar las características de unión de IFNAR1 de anticuerpos modificados cuando se compara con versiones no modificadas progenitoras . Se representan en las Figuras 9A-9C las curvas de la afinidad de unión para 9D4 , 9D4DM, y 9D4TM. Las constantes de unión (Kd) para los anticuerpos 9D4 , 9D4DM, y 9D4TM anti-IFNARl se determinaron de las curvas de unión.
Métodos: Se sembraron 200,000 células HEK 293F en una placa de 96 cavidades de fondo redondo utilizando 50 L de medio RPMI 1640 complementado con 10% FBS . El 9D4-TM marcado con Europio se preparó bajo del contrato de PerkinElmer Life and Analytical Sciences. Para medir la señal de Europio no específico, se agregaron 25 µ? de anticuerpos anti-IFNARl serialmente diluidos, sin marcar con un exceso de 100 veces a las cavidades apropiadas de las 96 cavidades por 5-10 minutos antes de la adición del 9D4-TM marcado. Después se agregaron 25 µ del anticuerpo serialmente diluido, conjugado con europio a las cavidades apropiadas y las células y anticuerpos se agitaron delicadamente a temperatura ambiente por 1-2 horas. Después de la incubación de unión, se agregaron 150 µ? de medio celular a todas las cavidades y las placas se centrifugaron a 1200 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Las placas se decantaron rápidamente y se agregaron 250 µ? de medio celular a todas las cavidades. Se repitieron las centrif gaciones y los lavados para un total de 3 lavados. Las células después se volvieron a suspender en 100 µ? de medio celular. Se transfirieron 50 µ? de células resuspendidas a 200 µ? de solución potenciadora DELPHIA (PerkinElmer) en una placa de microtitulación amarilla DELPHIA y se midió la emisión de Europio en un lector Victor2 Multilabel (PerkinElmer) . La señal se midió en cps y los valores ¾ y los valores Bmax se generaron utilizando el software para análisis GraphPad Prism 4.
Resultados: Los datos representados en las Figuras 9A-9C demuestran que los anticuerpos modificados 9D4-TM y 9D4-DM exigen similares afinidades de unión para IFNARl (9D4 = 0.06 +/- 0.02 nM, 9D4-DM = 0.06 +/- 0.02 nM, 9D4-TM = 0.03 +/- 0.01 nM) para el anticuerpo no modificado progenitor.
Conclusiones: Los datos presentados en este Ejemplo demuestran que los anticuerpos modificados comparten similares características de unión IFNARl con los anticuerpos sin modificar progenitores.
Ejemplo 7: Datos del ensayo de unión en equilibrio para 9D4-T vs . sIFNaRI Propósito: Determinar los datos de unión en equilibrio para 9D4-TM utilizando IFNARl soluble (srIFNARl) .
Métodos: El ligando9 srIFNARI se revistió sobre esferas UltraLink® Biosupport (PIERCE, Rockford, IL) a concentraciones de 5 9/??1 y 50 µ9/p?1 en regulador de pH de recubrimiento (50 mM de regulador de pH de carbonato sódico, pH9) por un período de 1-2 días a 4°C. Las esferas revestidas después se separaron (centrifugación de pulso ligerea) de la solución del ligando sin reaccionar, y se balancearon ligeramente en regulador de pH de bloqueo (1 mi de 1M de Tris, pH8, conteniendo BSA a 10 mg/ml) por aproximadamente 15 min a temperatura ambiente (RT) . Después de esto, la lechada de las esferas de nuevo se centrifugó para elimi8nar la solución de bloqueo, y después el paso de bloqueo se repitió por aproximadamente 2 hrs a RT utilizando una alícuota fresca del regulador de pH de bloqueo. Después del paso de bloqueo, las esferas recubiertas se almacenaron a 4°C hasta uso. Antes de utilizarse, las esferas recubiertas con srIFNARI se transfirieron a un recipiente de esferas, se volvieron a suspender en 27 mis del regulador del pH operativo del instrumento (PBS, pH7.4 - 0.02% NaN3), después se unieron al instrumento KinExA 3000.
Todas las constantes de unión en equilibrio (KD) se obtuvieron de las mediciones hechas en un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) . En resumen, se preparó IgG de 9D4-TM a ???, ???? y 50pM y se suministraron en tres series de tubo. Este intervalo de concentraciones de IgG se diseñó para permitir hacer mediciones tanto bajo el receptor- como las condiciones controladas por KD. Después se titularon diluciones seriales de dos veces del ligado srIFNARI a través de estas soluciones de IgG, a concentraciones en el intervalo de 19.5f - InM. Con base en las simulaciones de la curva teórica, suministradas por el vendedor a través del software (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) , estas mezclas equilibradas se incubaron en cualquier lugar por 2-6 días a RT. Al final de este tiempo, los experimentos de prueba de señal se condujeron para determinar las condiciones de ejecución apropiadas. La detección del anticuerpo libre se hizo posible utilizando un reactivo del anticuerpo secundario marcado con Cy5 , específico de las especies (IgG Anti-humano de cabra del fragmento Cy5 AffiniPure F(ab')2, Parte #109-176-097, Jackson ImmunoResearch Laboratories), utilizado a 0.1, 1.0 o 2.0 µ9/p?1 de PBS, pH7.4 - 0.02% de NaN3 conteniendo BSA a 1 mg/ml. Los datos obtenidos de los experimentos después se adaptaron simultáneamente utilizando el software que proporcionó la característica del análisis de la Curva-n para obtener la constante de unión reportada (KD) .
Resultados: Se describen en la Figura 10A las curvas de unión de tres concentraciones de 9D4-TM (1 pM, 10 pM, y 50 pM) con sIF aRI. Los datos obtenidos de al menos tres experimentos . independientes se adaptaron a un software que deriva la curva de unión para establecer un KD relativo para 9D4-TM. El ¾ de 9D4-T en este ensayo de unión se determinó como siendo 1.1 pM con un intervalo de confianza de 95% de 0.603 pM -1.8 pM. El porcentaje de error para la determinación de KD de 1.1 pM fue 1.96%. El KaCtivacto y Kdesactivado para 9D4-TM también se determinó como siendo 7 x 106 +/- 1.3 x 106 S"1 y 7.7 x 10"6 +/-1.57 xlO"6 1/Ms respectivamente (datos no mostrados) .
Conclusiones: Al anticuerpo anti-IFNARl modificado 9D4=T exhibe un KD muy bajo de aproximadamente 1.1 pM, para sIFNARl según lo determinado por el ensayo KinExa.
Ejemplo 8: Determinación de la afinidad de unión de 9D4-TM en PBMC Humanos.
Propósito: Determinar la afinidad de unión de PBMC humanos .
Métodos: Las células mononucleares de sangre periférica se purificaron de donadores humanos sanos utilizando medio LSM ( P Biomedical, Solón OH) . Las células se contaron y se sembraron 200,000 células en una placa de 96 cavidades redonda utilizando 50 µ? de medio RP I 1640 complementado con 10% de FBS. La 9D4-TM marcada con Europio se preparó bajo el contrato de PerkinElmer Life y Analytical Sciences. Para medir la señal de europio no específica, se agregaron 25 µ? de 9D4-T serialmente diluida, sin marcar con 100 veces en exceso a las cavidades apropiadas de las 96 cavidades por 5-10 minutos antes de la adición de 9D4-TM sin marcar. Después se agregaron 25 µ? de 9D4-TM serialmente diluida conjugadas con europio, a las cavidades apropiadas y las células y los anticuerpos se agitaron ligeramente a temperatura ambiente por 1-2 horas. Después de la incubación para la unión, se agregaron, 150 µ? de medio celular a todas las cavidades y las placas se centrifugaron a 1200 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Las placas se decantaron rápidamente y se agregaron 250 µ? de medio celular a todas las cavidades. Las centrifugaciones y los lavados se repitieron para un total de 3 lavados . Las células después se volvieron a suspender en en 100 µ? de medio celular. Se transfirieron 50 µ? de las células resuspendidas a 200 µ? de solución potenciadora DELPHIA (PerkinElmer) en una placa de microtitulación amarilla DELPHIA y la emisión de Europio se midió en un lector Victor2 Multilabel (PerkinElmer) . La señal se midió en cps y los valores Kd y B max se generaron utilizando el software de análisis GraphPad Prism 4.
Resultados: Utilizando las mediciones de afinidad documentadas en la Figura 10B, se determinó que el Kd para la unión de 9D4-TM a PBMC humano fue de 0.29 nM +/- 0.11 nM con el número de sitios de unión determinado como siendo 1448 +/-447. Utilizando un método similar, se determinó la constante de unión de afinidad para IFNAR de mono cynomologus como siendo 0.65 +/- 0.42 nM con el número de sitios de unión determinado como siendo 648 +/-204 (datos no mostrados).
Conclusiones: Los resultados presentados en la Figura 10B demuestran que 9D4-TM se une específicamente y con alta afinidad a PBMC humanos.
Ejemplo 9: Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben una potencia similar a la del anticuerpo no modificado progenitor.
Propósito: Demostrar que los anticuerpos anti- IFNAR2 modificados (es decir anticuerpos anti-IFNARl con afinidad de ligando Fe reducida) exhiben una potencia similar con los anticuerpos modificados progenitores.
Métodos: El sistema de ensayo Indicador de Luciferasa utilizado en este Ejemplo ha sido descrito previamente (Ver, Ejemplo 3) . Los anticuerpos para IFNAR1 utilizados en este ejemplo incluyen 9D4 , 9D4-DM, 9D4-TM, MDX-1333. Se incluye un anticuerpo de control R3-47.
Resultados: Utilizando el sistema Indicador de Luciferasa, los valores IC50 se generaron para los varios anticuerpos anti-IFNARl descritos anteriormente (Ver Figura 11). El anticuerpo 9D4 anti-IFNARl (0.01 nM) y los anticuerpos modificados, tales como 9D4-DM (0.01 nM) y 9D4-TM (0.02 nM) cada uno provoca un valor IC50 similar en el ensayo indicador lo que demuestra que exhiben una potencia similar. Otro anticuerpo anti-IFNARl, MDX1333 (0.04 nM) también exhibe una potencia similar para el anticuerpo 9D4 sin modificar. El control de isotipo no inhibe la señalización mediada por IFN de Tipo I en este ensayo indicador de Luciferasa.
Conclusiones: Los anticuerpos anti-IFNARl modificados comparten potencias similares a las versiones no modificadas como se demuestra por los valores IC50 generados en un ensayo Indicador de Luciferasa diseñado para cuantificar los eventos de señalización IFN.
Ejemplo 10: 9D4-TM inhibe la actividad de las isoformas de interferón alfa de Tipo I múltiples.
Propósito: Para demostrar que 9D4-TM inhibe la señalización atribuida a isoformas de interferón alfa específicas y múltiples.
Métodos: El sistema de ensayo Indicador de Luciferasa en este ejemplo ha sido previamente descrito arriba (Ver Ejemplo 5) .
Resultados: Los valores IC50 la inhibición mediada por 9D4-TM de la actividad del interferon de Tipo I se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4: Valores IC50 para la inhibición mediada por 9D4-TM de la actividad del interferon de Tipo I Interferon Tipo I 9D4-TM IC50 (nM) IFN-0t2b 0.07 +/- 0 01 IFN-(X2a 0.3 + /- 0 2 IFN-a6 0.04 +/- 0 01 IFN-0C16 0.02 +/- 0 03 IFN- 8 0.03 +/- 0 04 IFN-alO 0.01 +/- 0 01 Interferon de 0.01 +/- 0 .01 leucocito IFN-0C17 0.04 +/- 0 .03 IFN-0C14 0.02 +/- 0 .01 IFN-al 0.004 + /- 0 .01 IFN-0C21 0.01 + /- 0. 002 IFN-0C7 0.04 + /- 0 .01 IFN-a4b 0.02 + /- 0 .01 IFN-ß? 6.8 + /- 9 .4 IFN-? 0.1 +/ - 0 Como se muestra, 9D4-TM exhibe valores intervalo sub-molar para múltiples formas de interferon alfa, interferón de leucocito, e interferón omega .
Conclusiones: El anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl modificado demuestra la habilidad para inhibir la señalización atribuida a múltiples subtipos de interferón alfa específicos así como el interferón alfa de leucocito en un ensayo indicador.
Ejemplo 11: Determinación del punto isoeléctrico de 9D4, 9D4DM y 9D4TM Propósito: Evaluar las características biofísicas del anticuerpo 9D4 sin modificar progenitor en comparación con los anticuerpos 9D4-DM y 9D4-TM modificados.
Métodos: El análisis de Electroforesis en Gel de Poliacrilamida Con Enfoque Isoeléctrico Nativo (IEF-PAGE) se llevó a cabo como sigue: Los geles de anfolina pre-moldeados (Amersham Biosciences, intervalo pl 3.5-9.5) se cargaron con 8 g de proteína. Las muestras de proteína se dializaron en 10 mM de Histidina pH-6 antes de cargarse en el gel. Se utilizaron estándares del marcador con un amplio intervalo pl (Amersham, intervalo pl 3-10, 8 µ?) para determinar el pl relativo para los Mabs . La electroforesis se llevó a cabo a 1500 V, 50 mA por 105 minutos. El gel se fijó por 45 minutos utilizando una solución de fijación Sigma (5x) diluida con agua purificada a lx. La tinción se llevó a cabo durante la noche a temperatura ambiente utilizando la mancha Simply Blue (Invitrogen) . La eliminación de la tinción se llevó a cabo con una solución que consistió de 25% de etanol , 8% de ácido acético y 67% de agua purificada. Los puntos isoeléctricos se determinaron utilizando un Densitómetro Bio-Rad GS-800 con el Software Quantity One Imaging.
Resultados: Se describe en la Figura 12A la determinación del punto isoeléctrico (pl) para los anticuerpos 9D4WT, 9D4DM, y 9D4TM. Las muestras de los anticuerpos se corrieron de acuerdo con los métodos anteriores y exhibieron las siguientes características. El anticuerpo 9D4 WT exhibió bandas de proteína prominentes correspondientes a 8.2, 8.35 y 8.51. El anticuerpo 9D4 DM exhibió una sola banda proteína prominente correspondiente a 7.13. El anticuerpo 9D4 TM bandas de proteína prominentes correspondientes a 8.09 y 8.18.
Conclusiones: Como se presenta en este Ejemplo, los anticuerpos modificados 9D4-DM y 9D4-TM exhiben características biofísicas muy similares (pl) al anticuerpo no modificado progenitor 9D4.
Ejemplo 12: Termoestabilidad de 9D4, 9D4-DM y 9D4-TM Propósito: Evaluar las características biofísicas del anticuerpo 9D4 sin modificar progenitor en comparación con los anticuerpos modificados 9D4-DM y 9D4-TM.
Métodos: La Calorimetría de Exploración Diferencial se llevó a cabo como sigue: las temperaturas de fusión térmicas (Tm) se midieron con un VP-DSC (MicroCal, LLC) utilizando un índice de exploración de 1.0°C/min y un intervalo de temperatura de 20-110°C. Se utilizó un período de filtro de 8 segundos junto con una pre-exploración de 15 minutos. Las muestras se prepararon por diálisis en 10 mM de Histidina-HCl , pH 6, utilizando casetes de diálisis Pierce (3.5 kD) . Las concentraciones Mab fueron 0.14 mg/ml, 0.79 mg/ml , y 0.64 mg/ml según lo determinado por A280. Las temperaturas de fusión se determinaron siguiendo los procedimientos del fabricante utilizando el software Origin suministrado con el sistema. En resumen, las múltiples líneas base se corrieron con regulador de pH en ambas, la muestra y la célula de referencia para establecer el equilibrio térmico. Después de sustraer la línea base del termograma de muestra, los datos fueron concentraciones normalizadas.
Resultados: Los anticuerpos 9D4 , 9D4-DM, 9D4-TM se sometieron a calorimetría de exploración diferencial como se detalla anteriormente presentando los resultados en la Figura 12B. Cada uno de los anticuerpos estudiados exhibió similares temperaturas de fusión en el ensayo. Específicamente, los anticuerpos exhibieron las siguientes temperaturas de fusión; 9D4 T = 70.41°C, 9D4-DM = 70.41°C, y 9D4-TM = 70.88°C.
Conclusiones: Como se presenta en este Ejemplo, los anticuerpos modificados 9D4-DM y 9D4-TM exhiben características biofísicas muy similares (Tm) al anticuerpo no modificado progenitor 9D4.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-IFNAR sustitutos protegen a los ratones de proteinuria inducida por IFNa Propósito: Para evaluar que los anticuerpos anti- IFNAR protegen a los ratones de proteinuria inducida en un modelo de SLE.
Métodos: Se compraron ratones NZB/W Fl hembra de Jackson Labs y se alojaron en instalaciones con barreras sin patógenos. El vector de adenovirus recombinante que contiene el subtipo de ADNc del subtipo 5 de IFNa bajo el control del promotor/potenciador CMV (Adv-mIFNa5) se utilizó para inducir lupus temprano en estos ratones. Los ratones (8 ratones/grupos) se trataron en las semanas 8-11 de edad con una sola inyección i.v. de 0.3 x 1010 partículas virales (vp, por sus siglas en inglés) de Adv-mIFNa5. Los controles recibieron la misma cantidad de partículas Adv. En algunos experimentos, los ratones se inyectaron con dosis graduales de Adv-mIFNa5 en el intervalo de 0.01 x 1010 a 1.0 x 1010 vp/ratón. Para ensayar la eficiencia de anti-IFNARl, los ratones se trataron con 5 dosis sucesivas diariamente i.p. del anticuerpo a 10 mg/kg iniciando el momento del suministro de Adv. Para la proteinuria, la orina se ensayó utilizando una varilla graduada (Chemstrip 2 GP; Roche Diagnostics) . La proteinuria se clasificó como 1 para niveles de 30 mg/dl, 2 para 100 mg/dl, y 3 para niveles > 500 mg/dl. Los ratones se consideró que tienen proteinuria si dos muestras de orina consecutivas se clasificaron como 2 o más altas.
Resultados: Los resultados de los ratones infectados con el adenovirus, tratados con los anticuerpos anti-IFNARl se presentan en la Figura 13. Los ratones con Adv-mIFNa5 exhiben proteinuria con un inicio de aproximadamente 3 semanas. Los ratones infectados tratados con el anticuerpo IgG de ratón de control no están protegidos del inicio de proteinuria durante el curso del experimento como se demuestra por un inicio de proteinuria de aproximadamente 4 semanas. Los ratones tratados con los anticuerpos anti-IFNAR no muestran evidencia de proteinuria en todo el curso de tiempo de 8 semanas. Los ratones tratados con un control de adenovirus no mostraron proteinuria durante el curso del tiempo experimental.
Conclusiones: Tomados juntos, los datos en este ejemplo demuestran que la presencia de los anticuerpos anti- IFNAR es protectora contra proteinuria inducida por adv-IFN en un modelo de ratón in vivo.
Ejemplo 14: Los anticuerpos Anti-IFNAR bloquean la regulación del gen inducida por IFN de Tipo I Propósito: Demostrar que los anticuerpos anti- IFNARl inhiben o reducen la regulación del gen de interferón de Tipo I en un modelo de ratón de SLE .
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para análisis en este ejemplo. El ARN se preparó de tejidos utilizando regulador de pH de lisis RLT (Qiagen) . Para tejidos sólidos (riñon, bazo, piel), se utilizaron no más de 50 mg de tejido para el procesamiento de ARN cada vez. Las muestras se colocaron en regulador de pH de lisis y una matriz A de lisado (Qbiogene) , y se procesaron por 30 segundos a 4.5 m/s utilizando un instrumento homogeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) . Para PBMC, las muestras de sangre completa se centrifugaron y los gránulos se lisaron en regulador de pH RLT. Después de la lisis, las muestras se congelaron inmediatamente a -80°C hasta el procesamiento posterior. Para aislar ARN, los lisatos tisulares descongelados primero se procesaron utilizando columnas de centrifugación Qiashredder, después se agregaron volúmenes iguales de 70% de etanol a los lisatos tisulares y el ARN se purificó utilizando los kits de columna Rneasy mini spin se acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El ADNc se generó de 3 g de ARN utilizando transcriptasa inversa SuperScript III y oligo d(T) como se describe en el protocolo del fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA) . Las muestras de ADNc se diluyeron en agua libre de nucleasa y se almacenaron a -80 °C.
Los niveles de expresión de los genes seleccionados se midieron mediante análisis TaqMan® por PCR en tiempo real utilizando el sistema PCR en tiempo real ABI 7900HT Fast (Applied Biosystems , Foster City, CA) . La ß-actina del gen para mantenimiento se utilizó para el control endógeno. Las mezclas de reacción tuvieron un volumen final de 20 µ? consistiendo de 1 µ? de ADNc, 2 µ? de 20x de iniciadores y sondas (TaqMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems) y 18 µ? de Mezcla Maestra TaqMan® Fast Universal diluida. Las condiciones de la amplificación fueron: 20 segundos a 95°C, 50 ciclos de 1 segundo a 95°C y 20 segundos a 60°C. Los valores CT estuvieron en el intervalo de 0 a 50, con este último número asumiendo que representa la no formación de producto. La cuantificación de la expresión del gen se llevó a cabo utilizando el método CT comparativo (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) y se reportó como la diferencia en veces con relación al gen de mantenimiento.
Resultados: El interferón de Tipo I ectópicamente expresado en ratones (ver ejemplo 13) conduce a la inducción de un número de genes. Se presentan en la Figura 14 el número de veces de los cambios de seis genes sensibles al interferón de Tipo I en diferentes poblaciones de ratones utilizados en este experimento. Específicamente, los genes IFIT1, IFI44, IFI202b, CXCL9, CXCL10, y CXCL11 todos se indujeron en los ratones ectópicamente expresando IFNa y se trataron con IgG de ratón no específico. Los ratones que expresan ectópicamente IFNa y que se trataron con anticuerpos anti-IFNAR no muestran ninguna inducción de los seis genes sensibles a interferon de Tipo I. Como un control para demostrar la especificidad de IFNa adenoviralmente codificado, los ratones tratados con PBS, o adenovirus de control no mostraron ninguna inducción de estos 6 genes. Estos resultados demuestran que la administración de anticuerpos anti-IFNAR puede bloquear la respuesta para la inducción del gen en alfa IFN en un modelo de ratón in vivo.
Conclusiones: Los anticuerpos Anti-IFNAR pueden bloquear la regulación de los genes sensibles al Tipo I en el modelo de ratón de SLE .
Ejemplo 15: Los anticuerpos Anti-IFNAR bloquean la producción de los anticuerpos Anti-ADNds y Anti-SSA/Ro (antigeno anti-nuclear) inducida por interferon de Tipo I Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para bloquear la producción de anticuerpos anti-nucleares, tales como anti-ADNds y anti-SSa/Ro inducido por interferon de Tipo I en un modelo de ratón de SLE.
Métodos: Los ratones se prepararon y trataron como se describe en el Ejemplo 13. Los niveles del auto-anticuerpo anti-ADNds en suero se evaluaron por ELISA. En resumen, las placas ELISA pre-tratadas con poli (L-lisina) (100 g/ml) se cubrieron con ADN activado con timo de becerro (5 yg/ml en en regulador de pH de carbonato-bicarbonato) (SIGMA) . Después de la incubación durante la noche a 4°C, las placas se bloquearon con PBS/10% de FCS . El suero (dilución 1/200) se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. El IgG unido detectado con IgG de anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (1/4000) (KPL) se agregó a las placas por 30 min. La unión se midió a través de la adición de sustrato TMB (KPL) y solución de detención (KPL) , y la DO se leyó a 450 nm. Se corrió el estándar de IgG de anti-ADNds de ratón en suero en una dilución serial (de 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) en cada placa para permitir la estandarización. Los niveles de auto-anticuerpo anti-SSA/Ro en el suero se midieron por ELISA (Alpha Diagnostic) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultados: El interferón de Tipo I ectópicamente expresado en ratones (ver Ejemplo 13) conduce a la acumulación de los anticuerpos anti-ADNds y anti-SSA/Ro. Se presentan en las Figuras 15A-15B las cantidades relativas de los anticuerpos anti-ADNds (Fig. 15A) y anti-SSA/Ro (Fig. 15B) en diferentes poblaciones de ratones (adenovirus de control, Adv-IFNOC + PBS, Adv-IFNa+MuIgG, y Adv-IFNa + Anti-IFNAR) según medidas por ELISA. Los ratones infectados con adenovirus de control mostraron poca acumulación de los anticuerpos anti-ADNds o anti-SSA/Ro en este experimento. Los ratones infectados con IFNa que codifica el adenovirus y tratados con PBS acumularon anticuerpos anti-ADNds y anti-SSA/Ro. Los ratones infectados con Adv-IFNa tratados con los anticuerpos anti-IFNAR adquieren menos anticuerpos anti-ADNds y anti-SSA/Ro que los ratones infectados con Adv-IFNa tratados con IgG no específico. Estos resultados demuestran que el tratamiento con los anticuerpos anti-IFNAR inhibe la acumulación de los anticuerpos anti-ADNds y anti-SSA/Ro en respuesta a los anticuerpos de IFN de Tipo I ectópicamente expresados.
Ejemplo 16: Los anticuerpos Anti-IFNAR bloquean la producción de IP-10 y IL-18 inducida por interferón de Tipo I Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para bloquear la acumulación de citocinas inducidas por IFNa en un modelo de ratón de SLE .
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proporcionaron muestras para el análisis en este ejemplo. Los niveles de citocinas en el suero se midieron por ELISA (sistemas R&D) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultados: El interferón de Tipo I ectópicamente expresado en ratones (Ver Ejemplo 13) conduce a la acumulación de citocinas IP-10 y IL-18. Se presentan en las Figuras 16A-16B las cantidades relativas de IP-10 (Fig. 16A) y IL-18 (Fig. 16B) en las diferentes poblaciones de ratones (PBS, adenovirus de control, Adv-IFNa+MuIgG, y Adv-IFNa + Anti-IFNAR) según medido por ELISA. El interferón de Tipo I ectopicamente expresado en ratones (Ver Ejemplo 12) conduce a la acumulación de las citocinas, IP-10 y IL-18. Los ratones infectados con adenovirus de control mostraron poca acumulación de las citocinas IP-10 (A) o IL-18 (B) en este experimento. Los ratones infectados con Adv- IFNOC tratados con los anticuerpos anti-IFNAR acumulan menos citocinas IP-10 y IL-18 que los ratones infectados con Adv- IFNOC tratados con IgG no específico. Estos resultados demuestran que el tratamiento con los anticuerpos anti-IFNAR inhibe la acumulación de las citocinas IP-10 y IL-18 en respuesta a IFN de Tipo I ectopicamente expresado.
Conclusiones: Los anticuerpos Anti-IFNAR son capaces de bloquear la acumulación de citocinas inducidas con IFNOC en un modelo de ratón de SLE .
Ejemplo 17: Los anticuerpos Anti-IFNAR bloquean la producción de ANA (anticuerpos Anti-nucleares) inducida por interferón de Tipo I Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para bloquear la acumulación de anticuerpos anti-nucleares inducida por IFNOC en un modelo de ratón de SLE .
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. Los niveles del anticuerpo antinuclear (ANA) se midieron a través del kit para la prueba ANA (Antibodies Incorporated) con el sustrato estabilizado Hep-2 y figuras mitóticas siguiendo las instrucciones del fabricante. El suero se diluyó serialmente y se incubó con las células Hep-2 en portaobjetos y el anticuerpo antinuclear unido se detectó a través de IgG antiratón de cabra marcado con Hi-FITC (H+L) (Antibodies Incorporated) . La concentración de ANA ANA se define como el factor de dilución en suero en donde ANA ya río es detectable.
Resultados: El interferón de Tipo I ectópicamente expresado en ratones (Ver Ejemplo 13) conduce a la acumulación de anticuerpos anti-ANA. Se presenta en la Figura 17 la concentración en suero de los anticuerpos anti-ANA en las diferentes poblaciones de ratones (no virus, adenovirus de control, Adv-lFNa + PBS, Adv-lFNa+MulgG, y Adv-IFNOG + Anti-IFNAR) según medido por la tinción de la dilución serial en células HEP2. Los ratones infectados con el adenovirus de control mostraron poca acumulación de anticuerpos anti-ANA en este experimento. Los ratones infectados con adenovirus que codifica IFNa y tratados con PBS acumularon anticuerpos anti-ANA. Los ratones infectados con Adv-IFNoc tratados con anticuerpos anti-IFNAR adquirieron menos anticuerpos anti-ANA que los ratones infectados con Adv-IFNa tratados con IgG no específico. Estos resultados demuestran que el tratamiento con anticuerpos anti-IFNAR inhibe la acumulación de anticuerpos anti-ANA en respuesta a IFN de Tipo I ectópicamente expresado.
Conclusiones: Los anticuerpos Anti-IFNAR son capaces de bloquear la acumulación de anticuerpos antinuclear inducida por IFNa en un modelo de ratón de SLE .
Ejemplo 18: Inhibición del anticuerpo del Desarrollo Celular Dendrítico Mediado Plasma SLE Propósito: El plasma SLE induce el desarrollo de células dendríticas de monocitos humanos normales. En este ejemplo, el anticuerpo monoclonal purificado 9D4-TM se ensayó para la inhibición del desarrollo de células dendríticas, según evaluado por la habilidad de los anticuerpos para inhibir la inducción de los marcadores de superficie celular CD38, y CD123 mediante plasma SLE.
Métodos: Los métodos han sido previamente descritos en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20006/0029601 y se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Esencialmente, los experimentos se condujeron como sigue: Una capa leucocitaria de 25 mi se diluyó cuatro veces con salina regulada en pH con fosfato (PBS) . La muestra se separó en tubos cónicos de 4 x 50 mi, 15 mi del medio se separación de linfocito (ICN Biomedicals) se colocaron en capas por debajo. Después de una centrifugación de 30 minutos a 500 g, la capa leucocitaria que contiene las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se eliminó y lavó con PBS . Las células se volvieron a suspender en el medio del cultivo que contiene 1% de suero humano inactivado con calor a 4 x 106 células/ml. Los monocitos se aislaron a través de la incubación de las PBMC (2.0 x 107 células/5 ml/frasco de 25 cm2) por 1.5 horas a 37°C en el medio del cultivo y después se limpiaron con agua las células no adherentes dos veces. Para la inducción de la maduración del monocito, las células se incubaron con medio conteniendo 25% de plasma humano de voluntarios sanos o de pacientes con con SLE. Los estudios del bloqueo del anticuerpo se condujeron a través de la adición de 30 pg/ml de anticuerpo anti-IFNARl o control de isotipo, IgGl, para el cultivo. Las células se incubaron por 4 días, se lavaron con PBS, y se trataron con 1:5000 de Versene por 10 minutos a 37°C. Cuando fue necesario, las células se desprendieron raspando ligeramente la célula antes de lavarla y analizarla. Cada cultivo se volvió a suspender en medio de tinción (Solución salina balanceada de Hanks con 0.2% de bicarbonato de sodio, 0.01% de azida de sodio, 0.1 mM de EDTA, 20 mM de HEPES, y 2% de suero de becerro fetal) y se separaron igualmente en seis cavidades de una placa de 96 cavidades de fondo en V. Las células se centrifugaron por pulsos a 2100 rpm en un rotor Sorvall RTH-750, y volvieron a suspender en 25 µ? de medio de tinción. Se agregó 1 microgramo de anticuerpo conjugado con ficoeritrina específica a cada cavidad y se incubó en hielo por 45 minutos. Las células se lavaron tres veces, se volvieron a suspender en 200 µ? de 2% de paraformaldehído en PBS, y se analizaron por citrometría de flujo con el FACScalibur de Becton Dickinson. Se trazaron compuertas en la gráfica de dispersión en el lado v progresivo para eliminar las células contaminantes del análisis.
Resultados: En este experimento, la diferenciación de los monocitos humanos de las células dendríticas en respuesta a IFN derivado del plasma de pacientes SLE se bloqueó por el tratamiento con 9D4-TM según medido por expresión en superficie de dos marcadores celulares dendríticos, CD38 y CD123. En la Figura 18, múltiples muestras de suero de pacientes SLE fallaron en el aumento de la expresión en superficie de of CD38 y CD123 en la presencia de 9D4-TM. Los valores IC50 para 9D4-TM variaron de 0.02 nM a 0.06 nM para cada CD38 y CD123.
Conclusiones: El anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl fue capaz de bloquear la habilidad de IFNa derivado de pacientes con SLE para inducir la maduración de pDC según medido por la expresión del marcador de superficie celular.
Ejemplo 19: Los anticuerpos Anti-IFNAR suprimen la expresión de CD38, CD123 y CD86 en monocitos estimulados con Leucocito-IFN.
Propósito: En este ejemplo, los anticuerpos 9D4 , 9D4-DM y 9D4 TM se ensayaron para la inhibición del desarrollo de células dendríticas, según evaluado por la habilidad de los anticuerpos para inhibir la inducción de los marcadores de superficie celular CD38, y CD123 por IFN de leucocito.
Métodos: Los monocitos se aislaron de sangre completa de donadores sanos utilizando un medio de separación de linfocito ( P Biomedical, Solón OH) seguido por selección positiva utilizando el kit para el Aislamiento de Monocitos II (Milteny Biotec, Auburn CA) . Los monocitos purificados después se aislaron a 1 x 10e células/ml en RPMI 1640 complementado con 10% de FBS (Gibco BRL) . Los anticuerpos serialmente diluidos se prepararon a concentraciones finales de 3 µg/ml - 20 pg/ml en media y se agregaron a las cavidades apropiadas de las células. Después de la pre- incubación de aproximadamente 5 minutos, se agregaron 100IU/ mi de IFN de leucocito humano (PBL Biomedical, Piscataway NJ) cavidades apropiadas y los cultivos se incubaron a 37°C, 5% de C02 por 48 horas de después de lo cual se evaluó la expresión en superficie de CD38 y CD123. En resumen, las células se granularon a 1200rpm por 5 minutos y el medio del cultivo se eliminó de las monocapas por aspiración seguido por un lavado lx con PBS estéril. El PBS se eliminó y se agregó 1 mi de regulador de pH de disociación celular estéril (Gibco BRL, Carlsbad CA) o 0.05% de tripsina (Invitrogen, Carlsbad CA) a las cavidades para eliminar las células de las monocapas . Después de 5 minutos y una breve agitación, se agregaron volúmenes iguales de RPMI 1640 complementado con 10% de FBS a cada cavidad, seguido por dos series de centrifugación y lavados con PBS estéril. Se agregaron 50 µ?, de lx de PBS complementado con 5% de BSA (Sigma, St. Louis MO) y 10 µg/ml de IgG humano completo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) a cada cavidad para bloquear la unión del anticuerpo Fe no específico y se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 50 µ? de lx de PBS complementado con 5% de BSA y los anticuerpos PE-anti humano CD123 y FITC-anti humano CD38 (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) a cavidades apropiadas y se incubaron por 30 minutos en hielo. Las células se lavaron una vez en lx de PBS complementado con 5% de BSA y se midió la expresión de la proteína en la superficie en un BD LSRII (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) .
Resultados: Se presentan en las Figuras 19A-19C las curvas de supresión de la expresión de CD38 (Fig. 19A) , CD123 (Fig. 19B) , y CD86 (Fig. 19C) inhibida por PBMC estimulados con leucocito- IFN incubado con los anticuerpos anti-IFNAR 9D4 , 9D4DM, y 9D4TM. Para cada molécula CD, los anticuerpos anti-IFNAR provocaron curvas de supresión similares que se utilizaron para generar los valores IC50.
Para la expresión de CD38 en PBMC estimulada con leucocito-IFN (A) , los anticuerpos anti-IFNAR dieron valores IC50 como sigue: 9D4=4.3 ng/ml , 9D4DM=40 ng/ml, 9D4TM=25 ng/ml . Para la expresión de CD123 en PBMC estimulado con leucocito- IFN (B) , los anticuerpos anti-IFNAR dieron valores IC50 como sigue: 9D4=7 ng/ml, 9D4DM=21 ng/ml, 9D4TM=10 ng/ml. Para la expresión de CD86 en PBMC estimulado con leucocito- IFN (C) , los anticuerpos anti-IFNAR dieron valores IC50 como sigue: 9D4=20 ng/ml, 9D4DM=20 ng/ml, 9D4TM=26 ng/ml.
Conclusiones: Los resultados en este ejemplo demuestran que los anticuerpos de la invención, 9D4-DM y 9D4-TM exhiben similares curvas de supresión de la inducción de IFN de marcadores de superficie celular pDC cuando se compara con el anticuerpo 9D4 progenitor.
Ejemplo 20: Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben una unión disminuida a FcyRI del receptor Fe.
Propósito: Demostrar la unión reducida de un receptor Fe específico a anticuerpos anti-IFNARl modificados.
Métodos: La actividad de unión de los anticuerpos modificados 9D4-DM y 9D4-TM a FcyRI humano (CD64) se evaluó a través de ELISA. FcyRI en PBS (pH7.4) se cubrió a 25 µ?/cavidad en una placa de microtitulación (Costar cat . 3690) a la concentración de 20 yg/ml durante la noche a 4°C. Después del lavado y el bloqueo con 4% de leche 1 hora a temperatura ambiente, se agregaron 9D4 , 9D4TM, 9D4DM bioteñidos y los anticuerpos de control en la placa previamente bloqueada y se incubaron a 37°C por una hora, partiendo de 500 µg/ml y después en una dilución serial de dos veces. La placa se lavó con PBS (pH7.4) conteniendo 0.05% de Tween 20 y se agregaron 25 µ? de Avidina conjugada con HRP a cada cavidad. Después de una hora de incubación a 37°C, las placas se lavaron de nuevo y se agregaron 50 µ?/cavidad de sustrato de peroxidasa SureBlue TMB (KPL cat. 52-00-03) . La reacción se detuvo con 50 µ? de 0.2M de H2S04 después del desarrollo de 5-10 minutos. La señal ELISA se leyó a 450nM.
Resultados: En un ensayo de unión con base en ELISA (Figura 20), los anticuerpos modificados anti-IFNARl 9D4DM y 9D4TM exhibieron menores afinidades de unión al FcyRI que el anticuerpo 9D4WT no modificado así como el anticuerpo de control.
Conclusiones: Estos resultados demuestran que los anticuerpos modificados anti-IFNARl 9D4-DM y 9D4-TM provocan una afinidad menor para el receptor Fe FcyRI cuando se compara con el anticuerpo no modificado 9D4. La afinidad disminuida para el receptor FcyRI conduciría a una menor inducción de ADCC .
Ejemplo 21: El receptor FcYRIIIA exhibe una unión reducida a los anticuerpos modificados anti-IFNARl.
Propósito: Demostrar la unión reducidas de un receptor Fe específico a los anticuerpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM y 9D4-TM cuando se comparar con el anticuerpo no modificado anti-IFNARl 9D4.
Métodos: Cincuenta de los anticuerpos 9D4 , 9D4TM, y 9D4DM diluidos en PBS se cubrieron en una placa de microtitulación Immunlon IV durante la noche a 4°C. Después del lavado y el bloqueo con 4% de leche 1 hora temperatura ambiente las variantes 158F de FcyRIIIA (baja afinidad) y 158V (alta afinidad) con la etiqueta Flag se agregaron a las cavidades de la placa bloqueada, partiendo de 50 g/ml después en una dilución serial de dos veces. La placa se lavó una hora después y se incubó con el anticuerpo anti-Flag conjugado con biotina (Sigma) a 2 µg/ml . Después de lavado se agregaron 25µ1 de Avidina conjugada con HRP a cada cavidad. Los materiales no unidos se eliminaron lavando una hora después de la incubación. La señal de unión se detectó con el sustrato TMB.
Resultados: Los resultados de un ensayo de unión con base en ELISA entre los anticuerpos anti-IFNARl (9D4WT, 9D4DM, y 9D4TM) y FcTRIIIA del receptor Fe- de alta y baja afinidad se presentan en las Figuras 21A-21C. El receptor Fe de alta y baja afinidad se presenta en las Figuras 21A-21C. en la Figura 21A los anticuerpos 9D4 T que cubren la placa ELISA eficientemente se unen al receptor FcYRIIIA de alta afinidad a concentraciones mayores de 3 ng/ml mientras existe una unión limitada del receptor FcyRIIIA de baja afinidad en todas las concentraciones ensayadas. En la Figuras 2 IB los anticuerpos 9D4DM modificados que cubren la placa ELISA no se unen eficientemente a los receptores Fc/RIIIA de alta o baja afinidad en ninguna de las concentraciones ensayadas. Igualmente, en la Figura 21C los anticuerpos modificados 9D4TM que cubren la placa ELISA se se unen eficientemente a los receptores FcyRIIIA de alta o baja afinidad en ninguna de las concentraciones ensayadas.
Conclusiones: Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM y 9D4-TM tienen una afinidad disminuida para el receptor FcTRIIIA cuando se compara con el anticuerpo anti-IFNARl 9D4 sin modificar. Adicionalmente , la afinidad disminuida para el receptor Fe específico conducirá a una disminución de la función efectora de ADCC.
Ejemplo 22: Los anticuerpos modificados 9D4DM y 9D4TM exhiben una unión reducida para FcTRIIIA del receptor Fe.
Propósito: Demostrar la unión reducida de un receptor Fe específico a los anticuerpos modificados 9D4DM y 9D4TM.
Métodos: Cincuenta µ< /p1 de las variantes de FCYRIIIA (FCYRIIIA- 10 158F y FcyRIIIA-lO 158V) en PBS se colocaron en una placa de microtitulación Immunlon IV durante la noche a 4°C. Después del lavado y bloqueo con 4% de leche 1 hora a temperatura ambiente los anticuerpos 9D , 9D4TM, y 9D4DM bioteñidos se agregaron a las cavidades de la placa bloqueada a 100 µg ml. La placa se lavó una hora después y se incubó con Avidina conjugada con HRP. Los materiales no unidos se eliminaron por lavado una hora después de la incubación. La señal de unión se detectó con el sustrato TMB .
Resultados: Los resultados de un ensayo de unión con base en ELISA entre los anticuerpos Fc/RIIIA y anti-IFNAR1 de los receptores Fe de alta y baja afinidad (9D4 T, 9D4DM, y 9D4TM) se presentan en las Figuras 22A-22C. En la Figura 22A el anticuerpo no modificado 9D4 anti-IFNARl, a concentraciones mayores de 3 ng/ml, se une específicamente al al receptor FcyRIIIA de alta afinidad inmovilizado sobre la placa ELISA, mientras el anticuerpo demuestra una unión limitada al receptor FCTRIIIA de baja afinidad inmovilizado a todas las concentraciones ensayadas. En la Figura 22B el anticuerpo 9D4DM modificado anti-IFNARl no se une eficientemente a los receptores FC7RIIIA de alta o baja afinidad inmovilizados en ninguna de las concentraciones ensayadas cuando se compara con el anticuerpo 9D4WT no modificado anti-IFNARl. Igualmente, en la Figura 22C el anticuerpo modificado 9D4TM anti-IFNARl no se une eficientemente a los receptores FcyRIHA de alta o baja afinidad inmovilizados a ninguna de las concentraciones ensayas cuando se compara con el anticuerpo 9D4 T no modificado anti-IFNARl.
Conclusiones: Este ejemplo demuestra que los anticuerpos modificados 9D4DM y 9D4TM, exhiben una afinidad disminuida para el receptor Fe, FC/RIIIA cuando se compara con el anticuerpo 9D4 modificado progenitor. Esta afinidad reducida conduciría a una disminución en la función efectora ADCC mediada por FcyRIIIA cuando se comparar con el anticuerpo progenitor.
Ejemplo 23: Neutralización de los subtipos de IFNa a través de los anticuerpos anti-IFNARl.
Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpo anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4WT, y 9D4TM para neutralizar los subtipos IFNa específicos en un ensayo indicador.
Métodos: Los ensayos indicadors para la neutralización de IFNa han sido bien documentados en la técnica. En este ejemplo, la neutralización de IFNa se mide mediante un ensayo indicador con base en HiL3. Un ejemplo de cómo un ensayo de neutralización de IFNa utiliza células HiL3 como un indicador es como sigue: Una línea celular de hepatoma humano HiL3 se transfirió con un plásmido que contiene luciferasa, un elemento de respuesta estimulada para IFNa (ISRE-Luc) , y un gen de resistencia a neomicina. Estas células fueron amablemente provistas por el Dr. Michael Tovey (CNRS, París, Francia). Las células Hil3, 30,000 células/cavidad, se cultivaron en placas de 96 cavidades reflejantes blancas (DYNEX Microlite) y se cultivaron durante la noche en medio Eagle modificado de Dulbecco conteniendo 10% de suero de bovino fetal y 1 mg/ml de G418 (+penicilina/estreptomicina/L-glutamina) . Después de esta incubación se agregaron varias formas de interferón y las placas se cultivaron por 18 horas. La reacción se terminó a través de la adición de 10 mi de regulador de pH de lisis en el recipiente del sustrato de luciferasa (Luc Lite Plus kit, Perkin-Elmer) ; 100 µ? de esta solución del sustrato se agregaron a cada cavidad y se leyeron en Top Count por 10 minutos (10 minutos de espera en la oscuridad, y después 1 segundo lectura /cavidad) . Los conteos por segundo (cps) en cada concentración de IFN se determinaron y la concentración de IFN o cps en cada muestra se calculó de la curva de titulación IFN utilizando el software Prism software (San Diego, CA) con parámetros de regresión lineal.
Resultados: La capacidad neutralizante de los anticuerpos anti-IFNARl para varias especies IFN en un ensayo indicador HiL3 se presenta en las Figuras 23A-23E. Los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4WT y 9D4TM inhiben los múltiples subtipos de interferón de Tipo I con similar potencia. Los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4 T y 9D4TM neutralizan IFNalO (A) con valores IC50 de 0.09880 µg/ml, 0.008345 µg/ml , y 0.004287 g/ml respectivamente. Los anticuerpos anti-IFNARl, DX-1333, 9D4WT y 9D4TM neutralizan IFN de leucocito humano IFN (B) con valores IC50 de 1.121 µ?/???, 0.02104 µg/ml , y 0.02120 respectivamente. Los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4 T y 9D4TM neutralizan IFNa 2b (C) con valores IC50 de 0.0006462 µ?/p??, 0.002789 , y 0.0008279 µg/ml respectivamente. Los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4 T y 9D4TM neutralizan IFNo (D) con valores IC50 de 5.323 µ9/p?1 , 0.01015 , y 0.01423 µ9/??1 respectivamente. Los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4 T y 9D4TM neutralizan ???ß (E) con valores IC50 de 18.97 µ9/p?1, 0.7403 respectivamente.
Conclusiones: Estos resultados indican que los anticuerpos anti-IFNARl, MDX-1333, 9D4WT (no modificados) y 9D4TM (modificados) exhiben una especificidad de neutralización similar y capacidad para múltiples interferones de Tipo I.
Ejemplo 24: Los anticuerpos Anti-IFNARl neutralizan IFN de Tipo I en plasma para pacientes con SLE.
Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl que neutralizan IFN de Tipo I en plasma aislado de pacientes con SLE según medido por un ensayo indicador.
Métodos: Las células PIL-5 establemente transíectadas se mantuvieron en RPMI 1640 + IX de Pen-strep-glutamina + 10% FBS y se sembraron a 100,000 células por cavidad en placas de 96 cavidades Optilix blancas/transparentes (VWR, West Chester PA) . Los anticuerpos se agregaron titulados a las cavidades apropiadas a una concentración final en el intervalo de 90 µg/ml - 60 pg/ml . Se agregaron las muestras de suero de pacientes SLE humanos positivos a interferón de Tipo I a cada cavidad a un porcentaje final de 50% por cavidad. Las células, IFN, y los anticuerpos se incubaron durante la noche a 37 °C, 5% de C02. Después de la incubación durante la noche, las células se granularon brevemente a 1200 rpm por 5 minutos y la amplificación de la proteína de luciferasa se evaluó lisando las células con el reactivo de Lisis del cultivo celular y la visualización utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega, Madison WI) . La señal se midió en cps y las curvas IC50 se generaron utilizando el software de análisis GraphPad Prism 4.
Resultados: 9D4-TM neutraliza interferones de Tipo I en el plasma de -paciente SLE. Los resultados de un ensayo de neutralización de interferones de Tipo I en el plasma de pacientes SLE se presentan en la Figura 24. La neutralización del interferón de Tipo I contenido en la muestra de plasma de pacientes SLE se neutralizó específicamente con 9D4-TM contra un control de isotipo a altas concentraciones del anticuerpo. Específicamente, 9D4-TM exhiben un IC50 de 0.04 nM en la neutralización de interferones de Tipo I en muestras de plasma tomadas de un paciente SLE.
Conclusiones: Este resultado sugiere que el anticuerpo modificado 9D4-TM anti-IFNARl tiene la capacidad de efectivamente neutralizar interferón de Tipo I en pacientes SLE.
Ejemplo 25: Los anticuerpos Anti-IFNAR suprimen la población pDC inducida por IFNa en PBMC Propósito: Para demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para suprimir la acumulación de células pDC en la sangre periférica de ratones de un modelo de SLE.
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. Los PBMC se aislaron del Bazo, Nodos Linfoides, Médula espinal, y Sangre Periférica utilizando técnicas de aislamiento estándar y se tiñeron para los marcadores de superficie B220 y Ly6C. Los PBMC aislados se analizaron por FACS y las células positivas dobles (B220 y Ly6C) se clasificaron como células pDC y las poblaciones relativas se representan en las Figuras 25A-25D.
Resultados: Como se representa en las Figuras 25A-25D, la expresión ectópica de IFNa activa un aumento en las células pDC dentro de los PBMC aislados de bazo (Fig. 25A) , nodos linfoides (Fig. 25B) , sangre (Fig. 25C) , y médula espinal (Fig. 25D) en la presencia de PBS o IgG de ratón no específico. Los ratones tratados con los anticuerpos anti-IFNAR no acumulan células pDC en respuesta a IFN-alfa. Los ratones tratados con adenovirus de control no acumulan pDC en la población PBMC.
Conclusiones: Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-IFNAR específicamente bloquean la regulación hacia arriba inducida por IFNOC de células pDC.
Ejemplo 26: Los anticuerpos anti-IFNARl modificados exhiben menores afinidades de unión a receptores Fe.
Propósito: Evaluar las afinidades de unión relativas de los anticuerpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM y 9D4-TM con el anticuerpo no modificado progenitor 9D4 para varios receptores Fe.
Métodos: Todos los experimentos se realizaron en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Suecia) . En un experimento típico se utilizaron soluciones de 1 µ? de IgG de 9D4 para inmovilizar cualquier lugar de ~ 7000 RUs - ~ 11,000 RUs de proteína sobre superficies del chipo sensor CM5 sensor utilizando un protocolo de acoplamiento amino estándar (BIAcore, Inc.). De forma separada, también se preparó una superficie en blanco en cada chip utilizando el protocolo idéntico, menos la proteína. Esta superficie en blanco se utilizó como una célula de referencia en todo el experimento, y sirvió para corregir ambos artefactos de unión no específica y de mantenimiento. Para los experimentos de unión de prueba, se preparó FcyRI a 20 n en regulador de pH HBS-EP (BIAcore, Inc., consistiendo de lo siguiente: 10 raM de regulador de pH HEPES, pH7.4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, y 0.005% de P20. Entre las inyecciones de FcyRI , la superficie de IgG se regeneró con un 1 minuto de inyección de 5 mM de HC1. Los revestimientos del sensograma se generaron utilizando el software BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Suecia) .
Resultados: El anticuerpo 9D4 anti-IFNARl y los anticuerpos 9D4-TM y 9D4-DM anti-IFNARl modificados se ensayaron para afinidad de unión para la proteína FcyRI inmovilizada en un formato de ensayo BIAcore. Como se describe en la Figura 26, el anticuerpo 9D4 anti-IFNARl exhibe una alta afinidad para FcyRI inmovilizado. La unión del anticuerpo 9D4 anti-IFNARl a FcyRI es específica ya que el ensayo similar se corrió con ovoalbúmina que exhibe muy poca afinidad al receptor inmovilizado. Los anticuerpos 9D4-TM y 9D4-DM anti-IFNARl modificados exhiben una menor afinidad del receptor inmovilizado FcyRI comparado con el anticuerpo 9D4 anticuerpo anti-IFNARl no modificado.
Conclusiones: Las inferiores afinidades resultantes para FcyRI exhibidas por los anticuerpos 9D4-TM y 9D4-DM anti-IFNARl modificados sugieren que estos anticuerpos tendrían una actividad disminuida para activar ADCC in vivo.
Ejemplo 27: Los receptores Fe exhiben afinidades de unión reducidas a los anticuerpos anti-IFNARl modificados.
Propósito: Evaluar las afinidades de unión relativas de varios receptores Fe a los anticuerpos anti-IFNAR1 modificados 9D4-DM y 9D4-TM y el anticuerpo no modificado parentéral 9D4 anti-IFNARl.
Métodos: Mediciones de Resonancia de Plasmón de Superficie Todos los experimentos se llevaron a cabo en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Suecia) . En un experimento típico se utilizó una solución de 1 µ? de FcyRI para inmovilizar cualquier lugar de ~ 7000 RUs - ~ 11,000 RUs de proteína sobre superficies del chip sensor CM5 utilizando un protocolo de acoplamiento amino estándar (BIAcore, Inc.). De forma separada, también se preparó una superficie en blanco en cada chip utilizando el protocolo idéntico, menos la proteína. Esta superficie en blanco se utilizó como una célula de referencia en todo el experimento, y sirvió para corregir ambos artefactos de unión no específica y de mantenimiento. Para los experimentos de unión de prueba, se prepararon 333 nM en en regulador de pH HBS-EP (BIAcore, Inc., consistiendo de lo siguiente: 10 mM de regulador de pH HEPES, pH7.4 , 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, y 0.005% de P20. Entre las inyecciones de anticuerpo, la superficie de FcyRI, se regeneró con un 1 minuto de inyección de 3M de MgCl2. Los revestimientos del sensograma se generaron utilizando el software BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Suecia) .
Resultados: Los anticuerpos 9D4 , 9D4-TM y 9D4-DM anti-IFNARl se inmovilizaron e incubaron con FcyRI soluble. La afinidad de unión del receptor FcTRI soluble a cada uno de los anticuerpos anti-IFNARIl se midió en un ensayo BIAcore y los rastros resultantes se representan en las Figuras 27A-27C. El FcTRI unió el anticuerpo 9D4 anti-IFNARl inmovilizado con una alta afinidad como se presenta en la Figura 27A. Esta interacción fue altamente específica ya que la ovoalbúmina soluble no mostró ninguna unión al anticuerpo 9D4anti - IFNAR1 inmovilizado. Los anticuerpos 9D4-TM y 9D4-DM modificados no se unen a Fc I tan fuertemente como el anticuerpo 9D4 no modificado de tipo silvestre. En la Figura 27B, el anticuerpo 9D4-DM anti-IFNARl modificado se inmovilizó e incubó con ya sea Fcy I u ovoalbúmina soluble. FcyRI exhibió una baja afinidad de unión para el anticuerpo 9D4-DM inmovilizado. Esta afinidad de unión es similar a la interacción no específica vista con ovoalbúmina soluble. En la Figura 27C, el anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl modificado se inmovilizó e incubó con ya sea FcY I u ovoalbúmina soluble. FcyRI exhibió una afinidad de unión para el anticuerpo 9D4-T inmovilizado. Esta afinidad de unión es similar a la de la interacción no específica vista con ovoalbúmina soluble.
Conclusiones: Las afinidades más bajas exhibidas por el receptor Fe FcyRI para los anticuerpos 9D4-DM y 9D4-TM anti-IFNARl modificados, sobre el anticuerpo no modificado 9D4 anti-IFNARl sugiere que los anticuerpos modificados exhibirían una capacidad menor para provocar una respuesta ADCC .
Ejemplo 28: Los anticuerpos Anti-IFNAR bloquean la inducción del gen sensible a IFNa.
Propósito: Demostrar la habilidad de anticuerpos anti-IFNAR para bloquear la inducción de genes sensibles a IFNa en un modelo de ratón de SLE.
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. Después de 8 semanas en el experimento los ratones se sacrificaron y se eliminó el tejido del riñon. No se utilizaron más de 50 mg del tejido para la extracción de ARN utilizando regulador de pH de lisis RLT (Qiagen) . Las muestras se colocaron en regulador de pH de lisis y la matriz A de lisación (Qbiogene) , y se procesaron por 30 segundos a 4.5 m/s utilizando el instrumento homogeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) . Para aislar ARN, los lisatos tisulares descongelados primero se procesaron utilizando columnas de centrifugación Qiashredder, después se agregaron volúmenes iguales de 70% de etanol a los lisatos tisulares, y el ARN se purificó utilizando kits de columnas Rneasy mini spin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó de 3 yg de ARN utilizando transcriptasa inversa SuperScript III y oligo d(T) como se describe en el protocolo del fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA) . Las muestras de ADNc se diluyeron en agua libre de nucleasa y almacenaron a -80 °C.
Los niveles de expresión de los genes seleccionados se midieron por análisis TaqMan® PCR en tiempo real utilizando el Sistema de PCR en tiempo real Rápido ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) . La ß-actina del gen de mantenimiento se utilizó para el control endógeno. Las mezclas de reacción tuvieron un volumen final de 20 µ? consistiendo de 1 µ? de ADNc, 2 µ? de 20x de iniciadores y sondas (TaqMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems) y 18 µ? de Mezcla Maestra PCR Universal Rápida TaqMan® diluida. La condiciones de la amplificación fueron: 20 segundos a 95°C, 50 ciclos de 1 segundo a 95°C y 20 segundos a 60°C. Los valores CT estuvieron en el intervalo de 0 a 50, con el número más reciente asumiendo que representa no formación de producto. La cuantificación de la expresión del gen se llevó a cabo utilizando el método CT comparativo (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) y se reportó como las veces en diferencias con relación al gen de mantenimiento.
Resultados: Se presentan en la Figura 28 los resultados de un análisis de expresión comparativo en el riñon de 6 genes inducidos por interferón alfa después de 8 semanas en un modelo de ratón con lupus acelerado. Los ratones que ectópicamente expresaron interferón alfa se trataron con IgG de ratón o anticuerpos anti-IFNAR. Después de 8 semanas, los ratones tratados con IgG de control demostraron una alta inducción de genes IFNa sensibles principalmente a ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, e IFIT1. Los ratones tratados con anticuerpos anti-IFNAR no mostraron inducción de los genes IFNa genes sensibles después de 8 semanas.
Conclusiones: El tratamiento del modelo de ratón con lupus acelerado con anticuerpos anti-IFNAR bloquea la inducción en el riñon de seis genes (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, y IFIT1) mediado por la expresión ectópica de IFN-alfa comparado con ratones de control según medido por un ensayo Taqman. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-IFNAR son capaces de bloquear la señalización mediada por IFNa en un modelo de ratón SLE .
Ejemplo 29: Los anticuerpos Anti-IFNAR inhiben la acumulación de auto-anticuerpos en suero Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para inhibir la acumulación de auto-anticuerpos en suero de ratones en un modelo SLE.
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. Se tomaron muestras de sangre completa a intervalos de 1 semana de la semana 2-7 del régimen. Los niveles del auto-anticuerpo anti-ADNds en suero se evaluaron por ELISA. En resumen, las placas de ELISA pre-tratadas con poli (L-lisina) (100 µg/ml) se cubrieron con ADN activado de timo de becerro (5 µ9/??1 en regulador de pH de carbonato-bicarbonato) (SIGMA) . Después de la incubación durante la noche a 4°C( las placas se bloquearon con PBS/10% de FCS . El suero (dilución 1/200) se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. El IgG unido detectado con IgG de anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (1/4000) (KPL) se agregó a las placas por 30 min.
La unión se midió mediante la adición de sustrato TMB (KPL) y solución de detención (KPL) , y la DO se leyó a 450 nm. Un estándar de IgG de ADN anti-ds de ratón en suero se corrió en dilución serial (de 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) en cada placa para permitir la estandarización.
Resultados: Se presentan en la Figura 29 los resultados del análisis con base en ELISA de los niveles de anticuerpos de ADN anti-ds en suero de ratón durante el curso del tiempo del modelo de ratón con lupus acelerado. Los ratones que ectópicamente expresan IFNa se trataron con anticuerpos anti-IFNAR o anticuerpos de control IgG de ratón durante un régimen de 7 semanas . Los ratones tratados con anticuerpos anti-IFNAR no acumularon anticuerpos anti-ADNds a la misma velocidad al mismo grado que los ratones tratados con anticuerpos IgG de control. Los ratones infectados con adenovirus de control no desarrollaron ADN de anticuerpos anti-ds con el transcurso del tiempo.
Conclusiones : Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-IFNAR redujeron la acumulación de anticuerpos anti-ADNds en respuesta a niveles elevados de IFN alfa.
Ejemplo 30: Los anticuerpos Anti-IFNAR reducen la proteinuria en el modelo de ratón con lupus acelerado.
Propósito: Demostrar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNAR para reducir proteinuria establecida (configuración terapéutica) en el modelo de ratón SLE.
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 13 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. Sin embargo, en un método terapéutico, se dejó que los ratones desarrollaran proteinuria como un síntoma de Lupus antes de la aplicación de los anticuerpos. Específicamente, se dejó que los ratones desarrollaran una clasificación de proteinuria de 2.0 - 2.5 como se describe previamente. Una vez que pasaron el nivel de umbral de proteinuria, se condujo un régimen de tratamiento de dosis semi-semanales de PBS, IgG de control o anticuerpos anti-IFNAR por 5 semanas adicionales. A intervalos semi-semanales las muestras de orina se ensayaron y se dio una clasificación de la proteinuria.
Resultados: Se presentan en la Figura 30A los resultados de un estudio terapéutico de anticuerpos anti-IFNAR que reducen la clasificación de la proteinuria de ratones de un modelo con lupus acelerado. En resumen, se dejó que los ratones desarrollaran proteinuria en cuyo momento, al cohorte se le dio ya sea PBS, IgG de control o anticuerpos anti-IFNAR como tratamiento. Como se documenta en la figura, la clasificación de la proteinuria disminuyó solamente en el grupo que recibió anticuerpos anti-IFNAR. Los ratones que recibieron PBS o IgG de control como tratamiento continuaron disminuyendo la clasificación de la proteinuria con el tiempo. (B) Un análisis del área por debajo de la curva para los resultados durante las cinco semanas determinó que el grupo tratado con el anticuerpo anti-INFAR difirió de los grupos con PBS solo o IgG de control, ambos de cuales fueron muy similares.
Conclusiones : Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-IFNAR podrían utilizarse en una configuración terapéutica de SLE.
Ejemplo 31: Los anticuerpos Anti-IFNAR reducen la mortalidad en el modelo de ratón con lupus acelerado.
Propósito: Demostrar la habilidad de anticuerpos anti-IFNAR para reducir la mortalidad en una configuración terapéutica del modelo de ratón con lupus SLE.
Métodos: Los ratones de los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 30 también proveyeron muestras para el análisis en este ejemplo. En un método terapéutico, se dejó que los ratones desarrollaran proteinuria como un síntoma de Lupus antes de la aplicación de los anticuerpos. Específicamente, se dejó que los ratones desarrollaran una clasificación de proteinuria de 2.0 - 2.5 como se describe previamente. Una vez que pasaron el nivel de umbral de proteinuria, se condujo un régimen de tratamiento de dosis semi- semanales de PBS, IgG de control o anticuerpos anti-IFNAR por 5 semanas adicionales. La mortalidad global se rastreó por cuatro semanas más.
Resultados: Se presentan en la Figura 31 los índices de mortalidad de un estudio terapéutico de anticuerpos anti-IFNAR en un modelo de lupus acelerado. En resumen, se dejó que los ratones desarrollaran proteinuria en cuyo momento, al cohorte se le dio ya sea PBS, IgG de control o anticuerpos anti-IFNAR como tratamiento. Los ratones tratados con anticuerpos anti-IFNAR no exhibieron mortalidad en la semana 5, mientras los ratones tratados con PBS o IgG de control exhibieron índices de mortalidad de 87.5% y 62.5% respectivamente. Adicionalmente, durante el estudio de nueve semanas, los animales tratados con anti-IFNAR exhibieron un alto índice de supervivencia comparado con los animales tratados con PBS o IgG de control .
Conclusiones: Los resultados en este Ejemplo demuestran que los anticuerpos anti-IFNAR pueden disminuir la mortalidad asociada con Lupus.
Ejemplo 32: Ausencia de actividad ADCC mediada por 9D4-T .
Propósito: Para verificar que 9D4-TM es incapaz de inducir actividad ADCC, debido a su pobre afinidad de unión a FCYRI y FCYRIIIA, se condujo una serie de experimentos.
Métodos: Se marcaron células objetivo 293F con la etiqueta celular DiO (Invitrogen, experimentos I & II) y se combinaron con PBMC efectores sin marcar (por 4h a 37°C, en la ausencia o presencia de 10 g/ml de 9D4-TM, control negativo del isotipo IgGl humano R3-47, 9D4- T o el anticuerpo anti-EphA2 utilizado como un control positivo. La lisis de las células objetivo se evaluó mediante la medición de la tinción positiva doble con DiO+/PI+ (yoduro de propidio) . La relación del objetivo-efector = 50-1, porcentaje de lisis se calculó de acuerdo con la fórmula: [(porcentaje de tinción positiva doble en la presencia de anticuerpos - porcentaje de tinción positiva doble en medio solo) / (porcentaje de tinción positiva doble en la presencia de regulador de pH de lisis - porcentaje de tinción positiva doble en medio solo)] . El 100% de la lisis se logró mediante la adición de regulador de pH de lisis (Promega) .
Alternativamente, las células objetivo 293F se incubaron con células de una línea celular NK transgénica que expresa establemente FcyRIIIA (experimento III) por 4h a 37 °C, in la ausencia o presencia 10 µ?/t?? de 9D4-TM, control negativo del isotipo IgGl humano R3-47, 9D4-wt o el anticuerpo anti-EphA2 utilizado como un control positivo. Relación de efector-objetivo =4-1 y porcentaje de lisis se calculó de acuerdo con la fórmula: 100 x (Experimental - Efecto Espontáneo - Objetivo Espontáneo) / (Máximo Objetivo-Objetivo Espontáneo).
En los experimentos I & II (relación PBMCs-293H = 50-1) , el porcentaje de lisis se calculó de acuerdo con la fórmula: [(porcentaje de tinción positiva doble en la presencia de anticuerpos - porcentaje de tinción positiva doble en medio solo) / (porcentaje de tinción positiva doble en la presencia de regulador de pH de lisis - porcentaje de tinción positiva doble en medio solo)] . En el experimento III (relación de la línea celular NK transgénica que expresa FcylIIA-293H = 4-1) , el porcentaje de lisis se calculó de acuerdo con la fórmula: 100 x (Experimental - Efector Espontáneo - Objetivo Espontáneo) /(Máximo Objetivo-Objetivo Espontáneo) .
Resultados: El anticuerpo modificado 9D4-TM o el anticuerpo no modificado 9D4- T exhibieron actividad ADCC no detectable en células 293F sobre la observada con el anticuerpo R3-47, (Tabla 4) . En contraste, el anticuerpo del control positivo, un anticuerpo anti-EphA2, causó un aumento de dos veces en la citotoxicidad sobre el nivel anterior. Estos resultados confirman que 9D4-TM no puede mediar ADCC en objetivos que expresan IFNA 1.
Tabla 5: Evaluación de la actividad ADCC cuerpos Anti-IFNARl.
Exp. I/II/III : experimentos I/II/III. ND: no realizado .
Conclusiones: Estos resultados demuestran que el anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl modificado no estimula la actividad ADCC detectable dirigida hacia las células objetivo que expresan IFNAR1.
Ejemplo 33: Estructuras Tridimensionales de la región Fe Humana que comprenden las mutaciones L234F/L235E/P331S.
Propósito: Determinar las estructuras tridimensionales de la región Fe IgGl humana que comprenden las mutaciones L234F/L235E/P331S (Fc-TM) .
Métodos : Purificación de Fc-TM: El fragmento Fc/TM humano se obtuvo de la división enzimática de 9D4-TM. La digestión se llevó a cabo utilizando ficina inmovilizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce) . La purificación primero se llevó a cabo en columnas de Proteína A HiTrap de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Después de la diálisis en 50 mM de NaOAc/pH 5.2, la solución de la proteína se aplicó a una columna SP HP HiTrap (GE Healthcare) y se recolectó en el flujo de paso. El flujo de paso se cargó en una columna Q HiTrap (GE Healthcare) y se eluyó en un gradiente de NaCl para producir una preparación de Fc/TM homogénea, juzgado por SDS-PAGE de reducción y no de reducción. El perfil SDS-PAGE de Fc-TM mostró la presencia de solamente una banda unida de alrededor de 25 kDa o 50 kDa bajo las condiciones de reducción y no de reducción respectivamente. Esta observación claramente demuestra la presencia de al menos un enlace de disulfuro inter-cadena en las posiciones C226 y/o C229. En consecuencia, los residuos "en corriente abajo" mutados F234 y E235 estuvieron presentes en la cadena de polipéptido que comprende el cristal.
Cristalización de Fc-TM: El Fc-TM purificado se concentró a alrededor de 5 mg/ml utilizando un concentrador Centricon (Millipore, Billerica MA, recorte de 30 KDa) . Las condiciones de la cristalización se identificaron utilizando pantallas comerciales de Hampton Research (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) , Emerald BioSystems (Emerald BioSystems, Inc., Bainbridge Island, WA) y Molecular Dimensions (Molecular Dimensions Inc., Apopka, FL) . Cada pantalla produjo varias condiciones de cristalización potencialmente utilizables. Después de la optimización, se obtuvieron cristales con calidad de difracción de 0.2 M de acetato de Zinc, 0.1 M Imidazol-Malato, pH 8.0, 5% de PEG 3350, 5% de glicerol a una concentración de proteína de 2.0 mg/ml. Bajo estas condiciones, los cristales bien moldeados con tres dimensiones en el intervalo de 0.1 a 0.2 mm crecieron en 2-3 días .
Recolección de Datos: Los datos de la diferenciación se recolectaron de un solo cristal en el Centro de Investigación Avanzada en Biotecnología (CARB, University of Maryland Biotechnology Institute, Rockville, MD) utilizando un generador de ánodo giratorio Rigaku MicroMax™ 007 con una placa de imágenes R-AXIS IV++ (Rigaku/MSC, The Woodlands, TX) . Antes del enfriamiento, el cristal se mantuvo durante unos cuantos minutos en su solución de cultivo complementada con 20% de glicerol. El cristal después se enfrió a 105 kelvins con un enfriador criogénico X-stream 2000 (Rigaku/MSC) . La difracción de hasta 2.3 Á se logró después de una ronda de templado como se describe (Oganesyan et al., 2007). Los datos de difracción que comprenden 234 imágenes se recolectaron utilizando un intervalo de oscilación de 0.5°, una distancia de cristal/detector de 200 mm y un tiempo de exposición de 600 s. Los datos se integraron y escalaron utilizando el software HKL 2000 (Otwinowski & Minor, 1997) .
Determinación de la estructura: El reemplazo molecular, refinamiento y cálculo de la densidad del electrón se llevaron a cabo utilizando la suite del programa CCP4 (Collaborative Computational Project) . El cristal ortorómbico centrado de cara C tuvo un contenido de solvente de 58% y VM de 2.9, asumiendo un polipéptido Fe en la unidad asimétrica de la célula. La estructura del cristal de Fc/TM se determinó por reemplazo molecular y se refino a una resolución de 2.3Á. La estructura Fe humana correspondiente al número ID 2DTQ de PDB (Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol . 368:767-779) se utilizó como el modelo debido a su alta resolución y estado no de ligando. En particular, los dominios CH2 y CH3 se consideraron de forma separada para minimizar cualquier desviación en términos de la conformación relativa de los dominios. Los datos de hasta 3.0 Á se utilizaron para el problema del reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy et al., (2005) Acta Cryst . D61, 458-464). Después del refinamiento de las soluciones, la ganancia LL final y la clasificación Z fueron 1192 y 31, respectivamente. La densidad de electrón ponderada calculada con FWT/PHWT a 3.0 Á mostró una buena correspondencia con el modelo con la excepción de algunos bucles en los dominios CH2 y CH3. La fuerte diferencia positiva de la densidad de electrón de electrón calculada con DELFWT/PHDELWT fue visible en el lugar esperado de los residuos de carbohidrato N-enlazados unidos a N297. No hubo densidad- presente para ningún residuo de abrazadera anterior a la posición 236, un resultado presumiblemente atribuible a la alta flexibilidad de esta región. Se observa que solamente dos estructuras Fe humanas sin ligando descritas previamente podrían revelar las posiciones 234 y 235 (2DTQ/2DTS; Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol . 368:767-779). Igualmente, los residuos en las posiciones 446 y 447 no pudieron visualizarse. El residuo en la posición 331 primero se modeló como una alanina.
Varias rondas alternativas de refinamiento con 'Refmac 5' (Murshudov et al., (1997) Acta Cryst . D53, 240-255) y construcción manual utilizando el software "O" graphics (Jones et al., (1991) Acta Cryst. A47, 110-119) convergió con Rfactor de 21.6 y Rfactor Libre de 27.5 para datos de hasta una resolución de 2.3 Á. Después de la primera ronda de refinamiento, la densidad del electrón permitió la colocación de los carbohidratos así como la sustitución por un residuo de serina en la posición 331. En etapas posteriores de refinamiento, el modelo se analizó utilizando el programa TLS Motion Determination (TLSMD) que opera en su servidor web (Painter et al. (2006) . J. Ap l . Cryst. 39, 109-111; Painter et al. (2006) Acta Cryst . D62, 439-450) . El refinamiento adicional después se llevó a cabo con Refmac 5 en TLS y el modo de refinamiento restringido utilizando cinco diferentes grupos de residuos (236-324, 325-341, 342-358, 359-403 y 404-445) . Los iones de zinc presentes en el regulador de pH de cristalización se detectaron en la densidad del electrón y se modelaron como tales cuando lo permitió la coordinación de la esfera y la distancia. En particular, se encontró que un ión de zinc se coordina pro medio de' H310 y H435. Otro se coordinó por H285 y H268 del polipéptido relacionado con la simetría. Otros dos se unieron a E318 y E345. En todos los casos, las moléculas de agua completaron la esfera de coordinación tetraédrica esperada de los iones de zinc. La fracción de carbohidrato se modeló de acuerdo con su densidad de electrón y el modelo final contuvo nueve residuos de azúcar, esencialmente como se describe por nosotros en el contexto de otra estructura Fe humana (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, Diciembre 11, 2007, en imprenta) . El modelo final contuvo 75 moléculas solventes. Los datos de la cristalografía y estadísticas de refinamiento .se dan -en la Tabla 6.
Tabla 6. Recolección de datos de rayos X y estadísticas de refinamiento del modelo Longitud de onda, Á 1.54 Resolución, Á 36.83 - 2.30 (2.38-2.30)3 Grupo de espacio C222x Parámetros de célula, Á 50.18, 147.30, 75.47 Reflexiones totales 54,409 Reflexiones únicas 12,617 Redundancia promedio 4.31 (2.72)a Amplitud, % 98.3 (90.0)a Ragrupar 0.062 (0.300)a ?/s(?) 13.0 (3.3)a Factor R/Factor R Libre 0.216/0.275 Enlaces RMSD, Á 0.012 Ángulos RMSD, ° 1.48 Residuos en la región más favorecida de {f,?} espacio, % Residuos en la región adicionalmente permitida de {f,?} espacio, % Número de átomos de proteína Número de átomos no de proteína Factor B (Modelo/Wilson) , Á2 43/40 a Los valores en paréntesis corresponden a la coraza con más alta resolución.
Resultados: Fc-TM cristalizado en el grupo de espacio C222i con un polipéptido en la unidad asimétrica (Figura 32) . El cristal se difractó a una resolución de 2.3 Á, y exhibió una mosaicicidad promedio relativamente alto de 1.26°. Esta mosaicicidad parece ser una propiedad de ambos cristales enfriado y no enfriado. Todos los residuos en las posiciones 236 a 445 pueden rastrearse en la densidad de electrón y no se observó densidad de electrón para residuos de abrazadera antes de la posición 236, de esta forma convirtiendo a las mutaciones L234F y L235E en invisibles. La densidad de electrón en la posición 331 corresponde a serma.
Las coordenadas atómicas y los factores de la estructura experimental de Fc-TM se han depositado en el Banco de Datos de Proteína con el número de acceso 3C2S.
La estructura tridimensional global de Fc-TM fue muy similar a las estructuras previamente reportadas de regiones Fe humanas sin ligando (Deisenhofer , (1981) . Biochemistry, 20: 2361-2370; Krapp et al., (2003) . J. Mol. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol . 368:767-779; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, Diciembre 11, 2007, en imprenta) . Más precisamente, las estructuras Fe humanas correspondientes a los números ID de PDB 1H3W (Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol . 325:979-989) y 2QL1 (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, Diciembre 11, 2007, en la imprenta) fueron más cercanas a Fc-TM en términos de parámetros celulares, contenido unitario asimétrico, grupo de espacio y empaque. Cuando se consideran individualmente, los dominios Fc-TM CH2 y CH3 mostraron una gran conservación estructural y rigidez cuando se comparan con otras estructuras Fe humanas no mutadas, sin ligando. Por ejemplo, los desplazamientos de coordenada rms de átomos Ca fueron 0.6 y 0.4 Á para los dominios CH2 y CH3 , respectivamente, cuando se sobrepone Fc-TM con la cadena A del PDB con número de ID 2DTQ (Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779).
La Tabla 7 siguiente, proporciona las coordenadas de la estructura atómica de Fc-TM. Se utilizan las siguientes abreviaturas en la Tabla 7.
"Tipo de átomo" se refiere al elemento cuyas coordenadas son provistas. La primera letra en la columna define el elemento.
"A.A. " se refiere al aminoácido.
"X, Y y Z" proporciona las coordenadas Cartesianas del elemento.
"B" es un factor térmico que mide el movimiento del átomo alrededor de su centro.
"OCC" se refiere a la ocupación, y representa los porcentajes de tiempo que el tipo de átomo ocupa en la coordenada particular. Los valores OCC están en el intervalo de 0 a 1, Tabla 7.: Coordenadas de la estructura atómica de Fc-TM COMENT 3 COMENT 3 REFINAMIENTO.
COMENT 3 PROGRAMA REFMAC 5.2.0019 COMENT 3 AUTORES MURSHUDOV, VAGIN, DODSON COMENT 3 COMENT 3 REFINAMIENTO OBJETIVO MAXIMUM LIKELIHOOD COMENT 3 COMENT 3 DATOS UTILIZADOS EN EL REFI AMIENTO.
COMENT 3 ALTO INTERVALO DE RESOLUCION (ANGSTROMS) 2.30 COMENT 3 BAJO INTERVALO DE RESOLUCION (ANGSTROMS) 30.00 COMENT 3 CORTE DE DATOS (SIGMA (F) ) : NINGUNO COMENT 3 INTEGRIDAD PARA EL INTERVALO (%) : 98.43 COMENT 3 NUMERO DE REFLEXIONES : 11994 COMENT 3 COMENT 3 ADAPTAR A DATOS UTILIZADOS EN EL REFINAMIENTO.
COMENT 3 METODO DE VALIDACION CRUZADA : COMPLETAMENTE COMENT 3 SELECCION DEL GRUPO DE PRUEBA DEL VALOR R LIBRE ALEATORIO COMENT 3 VALOR R ( ((OPERATIVO + GRUPO PRUEBA) ) : 0.21928 COMENT 3 VALOR R (GRUPO OPERATIVO) :: 0.21637 COMENT 3 VALOR R LIBRE 0.27541 COMENT 3 TAMAÑO DE GRUPO DE PRUEBA DEL VALOR R LIBRE (%) 4.9 COMENT 3 CONTEO DEL GRUPO DE PRUEBA DEL VALOR LIBRE : 619 COMENT 3 COMENT 3 ADAPTAR EN EL CONTENEDOR CON RESOLUCION MAS ALTA.
COMENT 3 NUMERO TOTAL DE CONTENEDORES UTILIZADOS 20 COMENT 3 CONTENEDOR CON ALTO INTERVALO DE RESOLUCION 2.300 COMENT 3 CONTENEDOR CON BAJO INTERVALO DE RESOLUCION 2.360 COMENT 3 REFLEXION EN EL CONTENEDOR (GRUPO OPERATIVO) 794 COMENT 3 INTEGRIDAD DEL CONTENEDOR (OPERATIVO+PRUEBA) (%) 89.74 COMENT 3 VALOR R DEL CONTENEDOR (GRUPO OPERATIVO) 0.242 COMENT 3 CONTEO FIJADO DEL VALOR R LIBRE DEL CONT . 46 COMENT 3 VALOR R LIBRE DEL CONT. 0.342 COMENT 3 COMENT 3 NUMERO DE ATOMOS NO DE HIDROGENO UTILIZADOS EN EL REFIN.
COMENT 3 TODOS LOS ATOMOS : 1867 COMENT 3 COMENT 3 VALORES B.
COMENT 3 DE LA GRAFICA DE WILSON (A**2) NULO COMENT 3 VALOR B MEDIO (GLOBAL, A**2) : 43.320 COMENT 3 VALOR B ANISOTROPICO GLOBAL COMENT 3 Bll (A**2) : -3.83 COMENT 3 B22 (A**2) : 0.96 COMENT 3 B33 (A**2) 2.88 COMENT 3 B12 (A**2) 0.00 COMENT 3 B13 (A**2) 0.00 COMENT 3 B23 (A**2) 0.00 COMENT 3 COMENT 3 ERROR DE COORDENADA GLOBAL ESTIMADO COMENT 3 ESU CON BASE EN EL VALOR R (A) 327 COMENT 3 ESU CON BASE EN EL VALOR R LIBRE (A) 256 COMENT 3 ESU CON BASE EN LA PROBABILIDAD MAXIMA (A) 194 COMENT 3 ESU PARA VALORES B EN MAXIMA PROBABILIDAD (A**2) 14.024 COMENT 3 COMENT 3 COEFICIENTES DE CORRELACION.
COMENT 3 COEFICIENTE DE CORRELACION FO-FC : 0.941 COMENT 3 COEFICIENTE DE CORRELACION FO-FC LIBRE : 0.898 COMENT 3 COMENT 3 DESVIACIONES RMS DE VALORES IDEALES CONTEO RMS WEIGHT COMENT 3 ATOMOS REFINADOS LONGITUDES UNIDAS (A) 1845 0 012 0 022 COMENT 3 ATOMOS UNIDOS ANGULOS UNIDOS (GRADOS) 2527 1 482 2 032 COMENT 3 ANGULOS TORSION, PERIODO 1 (GRADOS) 209 6 172 5 000 COMENT 3 ANGULOS TORSION, PERIODO 2 (GRADOS) 76 33 844 25 000 COMENT 3 ANGULOS TORSION, PERIODO 3 (GRADOS) 295 17 124 15 000 COMENT 3 ANGULOS TORSION, PERIODO 4 (GRADOS) 6 20 037 15 000 COMENT 3 RESTRICCIONES DE CENTRO QUIRAL (A**3) 302 0 085 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. PLANES GENERALES (A) 1323 0 005 0 020 COMENT 3 ATOMOS REF. CONTACTOS NO UNIDOS (A) 714 0 202 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. TORSION NO UNIDA (A) 1211 0 311 • 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. (X...Y) NO UNIDOS (A) 85 0 168 • 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. ION METALICO POTENC . (A) 1 • 0 013 • 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. VDW SIMETRIA (A) 45 0 267 • 0 200 COMENT 3 ATOMOS REF. UNIDOS A H SIMETRIA (A) 10 • 0 166 • 0 200 COMENT 3 COMENT 3 RESTRICCIONES FACTOR TERMICO ISOTROPICO. CONTEO RMS PESO COMENT 3 ATOMOS REF. UNIDOS CADENA PRINCIPAL. (A**2) : 1090 0.502 1.500 COMENT 3 ATOMOS REF. UNIDOS CADENA LATERAL (A**2) : 1737 0.773 2.000 COMENT 3 ATOMOS REF. UNIDOS CADENA LATERAL (A**2) : 850 1.312 3.000 COMENT 3 ATOMOS REF. ANGULO CADENA LATERAL (A**2) : 790 2.117 4.500 COMENT 3 COMENT 3 ESTADISTICAS DE RESTRICCIONES NCS COMENT 3 NUMERO DE GRUPOS NCS : NULO COMENT 3 COMENT 3 COMENT 3 DETALLLES TLS COMENT 3 NUMERO DE GRUPOS TLS : 5 COMENT 3 REGISTRO DEL ATOMO CONTIENE FACTORES B RESIDUALES SOLAMENTE COMENT 3 COMENT 3 GRUPO TLS : ' 1 COMENT 3 NUMERO DE GRUPOS COMPONENTES : 1 COMENT 3 COMPONENTES C -SSSEQI A C SSSEQI COMENT 3 INTERVALO RESIDUO : A 236 A 324 COMENT 3 ORIGEN PARA GRUPO (A) : 8.338,99 2244..11991133 --4.5478 COMENT 3 TENSOR T COMENT 3 Til: 0 0215 T22 : 0 0920 COMENT 3 T33 : 0 3541 T12 : 0 0433 COMENT 3 T13 : -0 0938 T23 : -0 3463 COMENT 3 TENSOR L COMENT 3 Lll: 5 5174 L22 : 6 9851 COMENT 3 L33 : 1 3110 L12 : 0 6985 COMENT 3 L13: -0 3877 L23 : 1 4474 COMENT 3 TENSOR S COMENT 3 Sil: 0 0024 S12 · -0 9714 S13 : 1.6061 COMENT 3 S21: 0 4006 S22 : 0 0112 S23 : -0.5043 COMENT 3 S31: -0 2230 S32¦ -0 0083 S33 : -0.0136 COMENT 3 COMENT 3 GRUPO TLS : 2 COMENT 3 NUMERO DE GRUPOS DE COMPONENTE : 1 COMENT 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQI COMENT 3 INTERVALO RESIDUO A 325 A 341 COMENT 3 ORIGEN PARA GRUPO (A) : 6.2355 28.7737 -13.
COMENT 3 TENSOR T COMENT 3 Til: 0 .4194 T22 0 .0438 COMENT 3 T33 : 0 .6367 T12 0 .0309 COMENT 3 T13 : -0 .1209 T23 -0 .1743 COMENT 3 TENSOR L COMENT 3 Lll : 2 .0696 L22 7 .3867 COMENT 3 L33 : 3 .9900 L12 0 .5828 COMENT 3 L13 : -0 .3193 L23 2 .0049 COMENT 3 TENSOR S COMENT 3 Sil : -0 .3128 S12 -0 .3347 S13 : 1.6116 COMENT 3 S21 : -0 .6048 S22 0 .4400 S23 : 0.4114 COMENT 3 S31 : -1 .6055 S32 0 .0271 S33 : -0.1271 COMENT 3 COMENT 3 GRUPO TLS : 3 COMENT 3 NUMBER GRUPO DE COMPONENTES : 1 COMENT 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQI COMENT 3 INTERVALO RESIDUO : A 342 A 358 COMENT 3 ORIGEN PARA GRUPO (A) : 19.6741 - 9.9102 -17.
COMENT 3 TENSOR T COMENT 3 Til : 0 .0147 T22 : -0 .0558 COMENT 3 T33 : 0 .2412 T12 : 0 .0130 COMENT 3 TI3 : -0 .0465 T23 0 .0419 COMENT 3 TENSOR L COMENT 3 Lll : 5 .9397 L22 : 3 .4770 COMENT 3 L33 : 1 .3027 L12 : -0 .2675 COMENT 3 L13 : -2 .7731 L23 : 0 .2922 COMENT 3 TENSOR S COMENT 3 Sil : 0 . 1902 S12: 0.1053 S13 : -2.1005 COMENT 3 S21: -0 .2927 S22 : -0 .5125 S23 : -0.3505 COMENT 3 S31 : 0 .2359 S32 : -0 .0277 S33 : 0.3223 COMENT 3 COMENT 3 GRUPO TLS: 4 COMENT 3 NUMBER GRUPO DE COMPONENTES : 1 COMENT 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQI COMENT 3 INTERVALO RESIDUO: A 359 A 403 COMENT 3 ORIGEN PARA GRUPO (A) : 21.2651 - 3.5914 -12.
COMENT 3 TENSOR T COMENT 3 Til: -0 .1689 T22 : -0 .0639 COMENT 3 T33: -0 1638 T12 : 0 0043 COMENT 3 T13 : 0 0241 T23 : 0 0801 COMENT 3 TENSOR L COMENT 3 Lll: 12 .4510 L22 : 2 7911 COMENT 3 L33 : 2 .9332 L12 : 0 0470 COMENT 3 L13 : 0 .1119 L23 : -0 2768 COMENT 3 TENSOR S COMENT 3 Sil: -0 .1346 S12 : -1 2217 S13 : -1. 1281 COMENT 3 S21: 0 .1580 S22 : 0 0409 S23 : -0. 1830 COMENT 3 S31 : 0 .0059 S32 : 0 .2154 S33 : 0. 0937 COMENT 3 COMENT 3 GRUPO TLS: 5 COMENT 3 NUMBER GRUPO DE COMPONENTES : 1 COMENT 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQI COMENT 3 INTERVALO RESIDUO: A 404 A 445 COMENT 3 ORIGEN PARA GRUPO (A) : 19.4718 -9.7512 - 9.1313 COMENT 3 TENSOR T COMENT 3 Til: -0 .0158 T22 : 0 .1994 COMENT 3 T33 : 0 .1938 T12 : 0 .0293 COMENT 3 T13 : 0 .0582 T23 : 0 .3819 COMENT 3 TENSOR L COMENT 3 Lll: 13 .1107 L22 : 0 .0678 COMENT 3 L33 : 1 .6932 L12 : 0 .9209 COMENT 3 L13: -1 .5605 L23 : -0 .0412 COMENT 3 TENSOR S COMENT 3 Sil: -0 .1532 S12 : -2 .3239 S13 : -2 6014 COMENT 3 S21: -0 .0410 S22 : -0 .1484 S23 : -0 1293 COMENT 3 S31 : 0 .3788 S32 : 0 .2592 S33 : 0 3017 COMENT 3 COMENT 3 COMENT 3 MODELACION SOLVENTE EN VOLUMEN.
COMENT 3 METODO UTILIZADO : MASCARA COMENT 3 PARAMETROS PARA CALCULO DE MASCARA COMENT 3 RADIO DE SONDA VDW 1 20 COMENT 3 RADIO DE SONDA DE ION 0. 80 COMENT 3 RADIO DE ENCOGIMIENTO 0. 80 COMENT 3 COMENT 3 OTROS COMENTARIOS DE REFINAMIENTO: NULO COMENT 3 SSBOND 1 CYS A 321 CYS A 261 SSBOND 2 CYS A 425 CYS A 367 LINK Cl NAG C 1 1. 439 ND2 ASN A 297 NAG-ASN CISPEP 1 TYR A 373 PRO A 374 0.
LINK NAG C 1 NAG C 2 BETA1-4 LINK NAG C 2 BMA C 3 BETA1-4 LINK BMA C 3 MAN C 4 ALPHA1-3 LINK MAN C 4 NAG C 5 BETA1-2 LINK BMA C 3 MAN C 7 ALPHA1-6 LINK MAN C 7 NAG C 8 BETA1-2 LINK NAG C 8 GAL C 9 BETAl-4 LINK NAG C 1 FUC C 11 ALPHA1-6 MODRES NAG C 1 NAG-b-D RENAME MODRES NAG C 2 NAG-b-D RENA E MODRES MAN C 4 MAN-a-D RENAME MODRES NAG C 5 NAG-b-D RENAME MODRES MAN C 7 MAN-a-D RENAME MODRES NAG C 8 NAG-b-D RENAME MODRES GAL C 9 GAL-b-D RENAME MODRES FUC C 11 FUC-a-L RENAME CRYST1 50.178 147.301 75.473 90.00 90.00 90.00 C 2 2 21 SCALE1 0.019929 0.000000 0.000000 0.00000 SCALE2 0.000000 0.006789 0.000000 0.00000 SCALE3 0.000000 0.000000 0.013250 0.00000 ATOMO 1 N GLY A 236 18.122 39.286 -14.907 1.00 50.67 N ANISOU 1 N GLY A 236 6366 6478 6407 30 -8 -27 N ATOMO 2 CA GLY A 236 17.938 40 336 -13.862 1.00 50.37 C ANISOU 2 CA GLY A 236 6370 6447 6319 23 15 16 c ATOMO 3 C GLY A 236 17.092 39 872 -12.683 1.00 50.35 C ANISOU 3 C GLY A 236 6337 6451 6340 0 7 36 C ATOMO 4 O GLY A 236 17.603 39 755 -11.559 1.00 50.77 O ANISOU 4 O GLY A 236 6425 6518 6346 -19 -27 64 O ATOMO 5 N GLY A 237 15.805 39 607 -12.942 1.00 49.94 N ANISOU 5 N GLY A 237 6294 6360 6321 -7 22 32 N ATOMO 6 CA GLY A 237 14.821 39 264 -11.889 1.00 48.94 C ANISOU 6 CA GLY A 237 6194 6188 6211 20 42 32 C ATOMO 7 C GLY A 237 15.074 37 906 -11.254 1.00 48.37 C ANISOU 7 C GLY A 237 6128 6107 6142 17 76 5 C ATOMO 8 O GLY A 237 16.078 37 256 -11.568 1.00 48.88 O ANISOU 8 O GLY A 237 6209 6156 6205 · 47 90 -11 O ATOMO 9 N PRO A 238 14.186 37.462 -10.336 1.00 47.63 N ANISOU 9 N PRO A 238 6027 5985 6082 15 57 -17 N ATOMO 10 CA PRO A 238 14.432 36.144 -9.746 1.,00 46.76 C ANISOU 10 CA PRO A 238 5926 5876 5964 31 25 -22 C ATOMO 11 CB PRO A 238 13.327 36.008 -8.686 1.00 46.65 C ANISOU 11 CB PRO A 238 5911 5868 5945 11 -23 3 C ATOMO 12 CG PRO A 238 12.878 37.422 -8.404 1.00 46.85 C ANISOU 12 CG PRO A 238 5930 5861 6007 30 38 0 C ATOMO 13 CD PRO A 238 12.974 38.083 -9..771 1.00 47.56 C ANISOU 13 CD PRO A 238 6038 5947 6084 21 63 -44 C ATOMO 14 C PRO A 238 14.308 35.056 -10..800 1.00 46.45 C ANISOU 14 C PRO A 238 5899 5823 5925 31 3 -16 C ATOMO 15 O PRO A 238 13.803 35.311 -11..898 1.00 46.74 O ANISOU 15 O PRO A 238 5942 5884 5930 50 -21 -25 O ATOMO 16 N SER A 239 14.806 33.868 -10..471 1.00 46.09 N ANISOU 16 N SER A 239 5876 5767 5868 24 12 -30 N ATOMO 17 CA SER A 239 14.710 32.689 -11..333 1.00 45.35 C ANISOU 17 CA SER A 239 5783 5670 5778 -8 43 -6 C ATOMO 18 CB SER A 239 16.093 32.273 -11..833 1.00 45.44 C ANISOU 18 CB SER A 239 5822 5669 5773 12 73 -51 C ATOMO 19 OG SER A 239 16.516 33.126 -12.892 1.00 46.53 O ANISOU 19 OG SER A 239 6055 5754 5871. 22 122 1 O ATOMO 20 C SER A 239 14.112 31.580 -10.496 1.00 44.68¦ C ANISOU 20 C SER A 239 5695 5601 5679 8 13 0 C ATOMO 21 O SER A 239 14 ,.492 31.423 -9 .338 1.00 44.81 O ANISOU 21 O SER A 239 5689 5655 5681 51 18 72 O ATOMO 22 N VAL A 240 13.161 30.845 -11.077 1.00 43.99 N ANISOU 22 N VAL A 240 5587 5491 5634 -1 45 2 N ATOMO 23 CA VAL A 240 12.474 29.760 -10.386 1.00 43.00 C ANISOU 23 CA VAL A 240 5453 5401 5482 -1 37 -22 C ATOMO 24 CB VAL A 240 10.932 29.909 -10. 474 1.00 43.13 C ANISOU 24 CB VAL A 240 5481 5408 5496 8 59 -20 C ATOMO 25 CG1 VAL A 240 10.217 28.789 -9. 696 1.00 42.84 C ANISOU 25 CG1 VAL A 240 5433 5309 5533 54 -34 -15 C ATOMO 26 CG2 VAL A 240 10.519 31.239 -9. 927 1.00 43.46 C ANISOU 26 CG2 VAL A 240 5572 5367 5572 -2 12 0 C ATOMO 27 C VAL A 240 12.868 28.427 -10. .986 1.00 42.45 C ANISOU 27 C VAL A 240 5377 5353 5396 -10 11 -1 C ATOMO 28 O VAL A 240 12.936 28.272 -12. .207 1.00 42.69 O ANISOU 28 O VAL A 240 5376 5426 5419 -44 62 -24 O ATOMO 29 N PHE A 241 13.128 27.468 -10. .108 1.00 41.87 N ANISOU 29 N PHE A 241 5300 5311 5296 -10 1 -22 N ATOMO 30 CA PHE A 241 13.405 26.097 -10 .498 1.00 40.91 C ANISOU 30 CA PHE A 241 5188 5170 5185 -31 -20 -52 C ATOMO 31 CB PHE A 241 14.884 25.757 -10 .294 1.00 41.14 C ANISOU 31 CB PHE A 241 5199 5228 5204 -15 -44 -34 c ATOMO 32 CG PHE A 241 15.799 26.534 -11 .203 1.00 41.60 c ANISOU 32 CG PHE A 241 5289 5240 5274 -81 3 -5 C ATOMO 33 CD1 PHE A 241 16.448 27.682 -10 .744 1.00 41.55 C ANISOU 33 CD1 PHE A 241 5248 5213 5326 -52 1 -15 C ATOMO 34 CE1 PHE A 241 17.271 28.424 -11 .601 1.00 40.85 C ANISOU 34 CE1 PHE A 241 5052 5159 5308 -21 -14 -18 C ATOMO 35 CZ PHE A 241 17.448 28.019 -12 .917 1.00 40.46 C ANISOU 35 CZ PHE A 241 5124 5094 5154 -75 22 -43 C ATOMO 36 CE2 PHE A 241 16.792 26.872 -13 .391 1.00 42.17 C ANISOU 36 CE2 PHE A 241 5259 5419 5342 51 84 -27 C ATOMO 37 CD2 PHE A 241 15.978 26.143 -12.537 1.00 41.34 C ANISOU 37 CD2 PHE A 241 5253 5148 5303 -103 60 -23 C ATOMO 38 C PHE A 241 12.493 25.189 -9.716 1.00 40.07 C ANISOU 38 C PHE A 241 5090 5072 5061 -21 -17 -53 C ATOMO 39 O PHE A 241 12.175 25.475 -8.572 1.00 40.18 O ANISOU 39 O PHE A 241 5110 5045 5111 -37 -101 -113 O ATOMO 40 N LEU A 242 12.044 24.109 -10.356 1.00 39.75 N ANISOU 40 N LEU A 242 5035 5028 5040 6 13 -59 N ATOMO 41 CA LEU A 242 11.017 23.235 -9.794 1.00 38.92 C ANISOU 41 CA LEU A 242 4944 4899 4942 2 21 -61 C ATOMO 42 CB LEU A 242 9.663 23.546 -10.438 1.00 38.70 C ANISOU 42 CB LEU A 242 4941 4864 4898 -18 4 -84 C ATOMO 43 CG LEU A 242 8.396 22.862 -9.936 1.00 38.46 C ANISOU 43 CG LEU A 242 4855 4805 4951 71 -15 -74 c ATOMO 44 CD1 LEU A 242 8.085 23.234 -8.504 1.00 37.91 C ANISOU 44 CD1 LEU A 242 4727 4827 4849 50 -49 -62 C ATOMO 45 CD2 LEU A 242 7.275 23.271 -10.825 1.00 38.22 C ANISOU 45 CD2 LEU A 242 4846 4868 4806 137 -149 -134 C ATOMO 46 C LEU A 242 11.409 21.793 -10.021 1.00 39.20 C ANISOU 46 C LEU A 242 4972 4961 4959 -11 13 -31 C ATOMO 47 O LEU A 242 11.605 21.361 -11.149 1.00 39.40 O ANISOU 47 O LEU A 242 5021 4924 5024 -24 63 -55 O ATOMO 48 N PHE A 243 11.510 21.044 -8.936 1.00 39.65 N ANISOU 48 N PHE A 243 4992 5044 5028 12 -12 -43 N ATOMO 49 CA PHE A 243 12.230 19.792 -8.968 1.00 39.97 C ANISOU 49 CA PHE A 243 5044 5044 5099 -24 -2 -51 C ATOMO 50 CB PHE A 243 13.404 19.823 -7.970 1.00 40.13 C ANISOU 50 CB PHE A 243 5022 5064 5162 -8 40 -26 C ATOMO 51 CG PHE A 243 14.424 20.876 -8.279 1.00 41.34 C ANISOU 51 CG PHE A 243 5170 5154 5381 -72 6 -95 C ATOMO 52 CD1 PHE A 243 14.319 22.156 -7.719 1.00 42.25 C ANISOU 52 CD1 PHE A 243 5360 5249 5441 34 -36 -90 C ATOMO 53 CE1 PHE A 243 15.269 23 146 -8.016 1.00 41.11 C ANISOU 53 CE1 PHE A 243 5158 5065 5394 -69 72 -88 C ATOMO 54 CZ PHE A 243 16.321 22 865 -8.888 1.00 41.69 C ANISOU 54 CZ PHE A 243 5217 5205 5418 -88 -1 -97 C ATOMO 55 CE2 PHE A 243 16.435 21 587 -9.458 1.00 42.21 C ANISOU 55 CE2 PHE A 243 5279 5206 5551 -93 135 -80 C ATOMO 56 CD2 PHE A 243 15.487 20 603 -9.154 1.00 42.21 C ANISOU 56 CD2 PHE A 243 5308 5220 5508 -31 66 -136 C ATOMO 57 C PHE A 243 11.275 18 673 -8.648 1.00 40.06 C ANISOU 57 C PHE A 243 5009 5104 5107 -37 -10 -64 C ATOMO 58 O PHE A 243 10.462 18 809 -7.729 1.00 39.94 O ANISOU 58 O PHE A 243 4936 5131 5107 -18 -13 -92 O ATOMO 59 N PRO A 244 11.369 17 561 -9.405 1.00 40.05 N ANISOU 59 N PRO A 244 5036 5044 5138 -26 19 -78 N ATOMO 60 CA PRO A 244 10.474 16 436 -9.204 1.00 39.94 C ANISOU 60 CA PRO A 244 5074 5000 5099 -2 16 -66 C ATOMO 61 CB PRO A 244 10.819 15 510 -10.373 1.00 40.24 C ANISOU 61 CB PRO A 244 5091 5057 5139 -22 19 -62 C ATOMO 62 CG PRO A 244 12.252 15 834 -10.700 1.00 40.53 C ANISOU 62 CG PRO A 244 5047 5064 5287 -14 -26 -70 C ATOMO 63 CD PRO A 244 12.334 17 315 -10.494 1.00 40.31 C ANISOU 63 CD PRO A 244 5051 5061 5203 -28 -12 -57 C ATOMO 64 C PRO A 244 10.810 15.760 -7.881 1.00 39.34 C ANISOU 64 C PRO A 244 5004 4929 5012 10 -25 -82 C ATOMO 65 O PRO A 244 11.848 16.049 -7.315 1.00 39.44 O ANISOU 65 O PRO A 244 5071 4916 4996 11 -14 -147 O ATOMO 66 N PRO A 245 9.943 14.861 -7.397 1.00 38.79 N AN SOU 66 N PRO A 245 4967 4861 4907 1 -10 -50 N ATOMO 67 CA PRO A 245 10.374 14.051 -6.266 1.00 38.61 C ANISOU 67 CA PRO A 245 4913 4858 4895 -18 -64 -80 C ATOMO 68 CB PRO A 245 9.108 13.286 -5.850 1.00 38.29 C ANISOU 68 CB PRO A 245 4913 4765 4870 -17 -31 -43 C ATOMO 69 CG PRO A 245 7.963 13.883 -6.657 1.00 38.73 C ANISOU 69 CG PRO A 245 4943 4859 4914 -8 -25 -82 C ATOMO 70 CD PRO A 245 8.576 14.533 -7.845 1.00 38.57 C ANISOU 70 CD PRO A 245 4919 4821 4912 41 -48 -19 C ATOMO 71 C PRO A 245 11.490 13.073 -6.621 1.00 38.77 C ANISOU 71 C PRO A 245 4914 4890 4926 -38 -52 -39 C ATOMO 72 O PRO A 245 11.863 12.917 -7.800 1.00 37.94 O ANISOU 72 O PRO A 245 4774 4779 4862 -114 -92 -2 O ATOMO 73 N LYS A 246 12.028 12.430 -5.589 1.00 39.37 N ANISOU 73 N LYS A 246 4984 4983 4991 -16 -60 -30 N ATOMO 74 CA LYS A 246 12.931 11.318 -5.796 1.00 39.82 C ANISOU 74 CA LYS A 246 5023 5058 5050 14 -26 -33 C ATOMO 75 CB LYS A 246 13.669 10.947 -4.509 1.00 40.23 C ANISOU 75 CB LYS A 246 5091 5073 5120 18 -39 -40 C ATOMO 76 CG LYS A 246 14.888 11.842 -4.290 1.00 41.46 C ANISOU 76 CG LYS A 246 5178 5330 5245 -27 39 8 C ATOMO 77 CD LYS A 246 15.623 12.015 -5.627 1.00 45.52 C ANISOU 77 CD LYS A 246 5812 5935 5546 66 -16 -88 C ATOMO 78 CE LYS A 246 16.445 13.285 -5.737 1.00 46.82 C ANISOU 78 CE LYS A 246 5686 5640 6463 -111 -80 -47 C ATOMO 79 NZ LYS A 246 16.762 13.502 -¦7.165 1.00 46.41 N ANISOU 79 NZ LYS A 246 5883 6214 5535 18 173 183 N ATOMO 80 C LYS A 246 12.159 10.148 ¦¦6.374 1.00 39.48 C ANISOU 80 C LYS A 246 4992 5034 4975 21 -27 -32 C ATOMO 81 O LYS A 246 11.088 9.797 ¦ -5.861 1.00 39.69 O ANISOU 81 O LYS A 246 5028 5127 4923 65 -62 -106 O ATOMO 82 N PRO A 247 12.697 9.540 -7.448 1.00 39.18 N ANISOU 82 N PRO A 247 4951 5000 4932 33 -13 -12 N ATOMO 83 CA PRO A 247 12.000 8.478 ¦ -8.161 1.00 38.92 C ANISOU 83 CA PRO A 247 4924 4959 4905 51 -17 -16 C ATOMO 84 CB PRO A 247 13.085 7.878 -9.054 1.00 38.79 C ANISOU 84 CB PRO A 247 4920 4940 4877 55 8 -7 c ATOMO 85 CG PRO A 247 14.014 8.985 -9.285 1.00 38.59 C ANISOU 85 CG PRO A 247 4889 4914 4858 19 11 -18 c ATOMO 86 CD PRO A 247 14.021 9.809 -8.040 1.00 39.18 C ANISOU 86 CD PRO A 247 4973 4976 4934 18 3 -6 C ATOMO 87 C PRO A 247 11.450 7.425 -7.230 1.00 38.87 C ANISOU 87 C PRO A 247 4936 4933 4896 54 4 -38 C ATOMO 88 O PRO A 247 10.303 7.039 -7.385 1.00 38.56 O ANISOU 88 O PRO A 247 4878 4910 4862 97 6 -34 O ATOMO 89 N LYS A 248 12.246 6.970 -6.261 1.00 38.99 N ANISOU 89 N LYS A 248 4950 4955 4907 43 4 -29 N ATOMO 90 CA LYS A 248 11.781 5.891 -5.389 1.00 38.78 C ANISOU 90 CA LYS A 248 4934 4936 4863 41 -23 -10 C ATOMO 91 CB LYS A 248 12.937 5.021 -4.850 1.00 39.27 C ANISOU 91 CB LYS A 248 5026 4978 4917 7 -18 -25 C ATOMO 92 CG LYS A 248 13.648 5.482 -3.580 1.00 36.38 C ANISOU 92 CG LYS A 248 4760 4251 4810 413 -171 220 C ATOMO 93 CD LYS A 248 14.700 4.434 -3.086 1.00 40.67 C A ISOU 93 CD LYS A 248 5196 5302 4953 -77 72 -121 C ATOMO 94 CE LYS A 248 14.061 3.085 -2.711 1.00 35.80 C ANISOU 94 CE LYS A 248 4447 4475 4680 291 -218 261 C ATOMO 95 NZ LYS A 248 15.004 2.044 -2.179 1.00 40.36 N ANISOU 95 NZ LYS A 248 5159 5539 4635 -366 221 -488 N ATOMO 96 C LYS A 248 10.799 6.352 -4.312 1.00 38.61 C ANISOU 96 C LYS A 248 4939 4906 4825 14 -19 -2 C ATOMO 97 O LYS A 248 10.063 5.550 -3.775 1.00 38.84 O ANISOU 97 O LYS A 248 5003 4972 4783 16 -22 -36 O ATOMO 98 N ASP A 249 10.750 7.655 -4.033 1.00 38.44 N ANISOU 98 N ASP A 249 4875 4955 4772 44 3 -16 N ATOMO 99 CA ASP A 249 9.691 8.181 -3.171 1.00 37.92 C .
ANISOU 99 CA ASP A 249 4847 4859 4700 48 -19 22 C ATOMO 100 CB ASP A 249 9.970 9.633 -2.774 1.00 38.25 C ANISOU 100 CB ASP A 249 4896 4868 4767 11 7 17 C ATOMO 101 CG ASP A 249 10.882 9.741 -1.587 1.00 38.86 C ANISOU 101 CG ASP A 249 5031 4871 4860 18 23 22 c ATOMO 102 OD1 ASP A 249 11.024 8.755 -0.860 1.00 41.27 O ANISOU 102 OD1 ASP A 249 5480 5121 5080 125 28 -54 O ATOMO 103 OD2 ASP A 249 11.457 10.815 -1.352 1.00 41.70 O ANISOU 103 OD2 ASP A 249 5332 5260 5250 -57 123 4 O ATOMO 104 C ASP A 249 8.325 8.043 -3.853 1.00 36.93 C ANISOU 104 C ASP A 249 4734 4748 4547 24 -9 14 C ATOMO 105 O ASP A 249 7.300 7.842 -3.198 1.00 36.04 O ANISOU 105 O ASP A 249 4654 4626 4413 57 -57 34 O ATOMO 106 N THR A 250 8.338 8.136 -5.182 1.00 36.24 N ANISOU 106 N THR A 250 4619 4672 4477 50 -15 16 N ATOMO 107 CA THR A 250 7.131 7.982 -5.982 1.00 35.08 C ANISOU 107 CA THR A 250 4477 4569 4283 0 2 47 C ATOMO 108 CB THR A 250 7.233 8.753 -7.345 1.00 35.01 C ANISOU 108 CB THR A 250 4440 4538 4324 26 1 31 C ATOMO 109 OG1 THR A 250 7.969 7.992 -8.287 1.00 33.57 O ANISOU 109 OG1 THR A 250 4192 4584 3978 26 -86 100 O ATOMO 110 CG2 THR A 250 7.901 10.112 -7.157 1.00 34.29 C ANISOU 110 CG2 THR A 250 4178 4535 4312 -61 -10 167 C ATOMO 111 C THR A 250 6.674 6..521 -6.163 1.00 34.51 C ANISOU 111 C THR A 250 4501 4473 4136 12 33 -4 C ATOMO 112 O THR A 250 5.499 6..269 -6.443 1.00 33.70 O ANISOU 112 O THR A 250 4487 4349 3968 -15 94 -34 O ATOMO 113 N LEU A 251 7.570 5..569 -5.940 1.00 34.49 N ANISOU 113 N LEU A 251 4464 4483 4158 -14 57 -24 N ATOMO 114 CA LEU A 251 7.288 4..145 -6.229 1.00 35.46 C ANISOU 114 CA LEU A 251 4591 4519 4360 -36 56 39 C ATOMO 115 CB LEU A 251 8.416 3.552 -7.084 1.00 34.39 C ANISOU 115 CB LEU A 251 4522 4286 4258 -37 43 44 C ATOMO 116 CG LEU A 251 8.640 4.234 -8.448 1.00 32.40 C ANISOU 116 CG LEU A 251 4144 4197 3968 -25 0 -41 C ATOMO 117 CD1 LEU A 251 9.950 3.850 -9.025 1.00 31.29 C ANISOU 117 CD1 LEU A 251 4008 4153 3728 70 -120 25 C ATOMO 118 CD2 LEU A 251 7.538 3.937 -9.435 1.00 30.02 C ANISOU 118 CD2 LEU A 251 3862 3832 3709 -19 204 164 C ATOMO 119 C LEU A 251 6.967 3.247 -4.999 1.00 36.71 C ANISOU 119 C LEU A 251 4788 4688 4471 -34 12 51 C ATOMO 120 O LEU A 251 6.530 2.097 -5.126 1.00 36.26 O ANISOU 120 O LEU A 251 4757 4604 4414 -55 47 142 O ATOMO 121 N MET A 252 7.187 : 791 -3.816 1.00 38.60 N ANISOU 121 N MET A 252 5026 4943 4598 -27 20 29. N ATOMO 122 CA MET A 252 6.895 102 -2.566 1. 00 40.29 C ANISOU 122 CA MET A 252 5241 5198 4870 1 -7 44 C ATOMO 123 CB MET A 252 8.114 092 -1.677 1.00 40.45 C ANISOU 123 CB MET A 252 5226 5262 4879 -22 -28 -14 C ATOMO 124 CG MET A 252 9.210 179 -2.138 1.00 42.62 C ANISOU 124 CG MET A 252 5404 5525 5262 48 6 -36 C ATOMO 125 SD MET A 252 10.657 547 -1.165 1.00 43.78 S ANISOU 125 SD MET A 252 5542 5849 5244 48 -85 63 S ATOMO 126 CE MET A 252 10.140 837 0.396 1..00 45.33 C ANISOU 126 CE MET A 252 5743 5827 5653 -34 103 102 C ATOMO 127 C MET A 252 5.829 879 -1.874 1..00 39.26 C ANISOU 127 C MET A 252 5153 5083 4681 -6 -19 52 C ATOMO 128 O MET A 252 6.043 040 -1.508 1..00 39.40 O ANISOU 128 O MET A 252 5246 5129 4594 -46 -43 54 O ATOMO 129 N ILE A 253 4.682 237 -1.700 1.00 39.08 N ANISOU 129 N ILE A 253 5163 5016 4667 12 -39 49 N ATOMO 130 CA ILE A 253 3.486 888 -1.183 1.00 39.29 C ANISOU 130 CA ILE A 253 5103 5050 4775 29 12 19 C ATOMO 131 CB ILE A 253 2.247 011 -1.395 1.00 38.95 C ANISOU 131 CB ILE A 253 5067 5028 4703 31 24 14 C ATOMO 132 CG1 ILE A 253 0.953 ,823 -1.205 1.00 39.49 C ANISOU 132 CG1 ILE A 253 5092 5115 4795 9 -6 -38 C ATOMO 133 CD1 ILE A 253 -0.330 .042 -1.535 1.00 38.97 C ANISOU 133 CD1 ILE A 253 5004 5047 4756 10 47 50 C ATOMO 134 CG2 ILE A 253 2.320 .777 -0.515 1.00 39.92 C ANISOU 134 CG2 ILE A 253 5138 5135 4895 40 -36 1 C ATOMO 135· C ILE A 253 3.622 4.327 0.280 1.00 39.88 C ANISOU 135 C ILE A 253 5183 5139 4829 56 53 44 C ATOMO 136 O ILE A 253 2.795 5.089 0.776 1.00 40.73 O ANISOU 136 O ILE A 253 5278 5260 4936 23 76 42 O ATOMO 137 N SER A 254 4.683 3.892 0.950 1.00 40.46 N ANISOU 137 N SER A 254 5255 5229 4888 63 59 23 N ATOMO 138 CA SER A 254 4.863 4.181 2.364 1.00 40.63 C ANISOU 138 CA SER A 254 5276 5248 4914 9 50 -9 C ATOMO 139 CB SER A 254 5.567 3.005 3.055 1.00 40.37 C ANISOU 139 CB SER A 254 5254 5212 4870 59 53 -23 C ATOMO 140 OG SER A 254 6.984 3.119 2.972 1.00 40.90 O ANISOU 140 OG SER A 254 5421 5224 4893 -34 108 -21 O ATOMO 141 C SER A 254 5.628 5.488 2.550 1.00 40.97 C ANISOU 141 C SER A 254 5312 5271 4982 -19 76 25 C ATOMO 142 O SER A 254 5.603 6.114 3.632 1.00 41.28 O ANISOU 142 O SER A 254 5346 5328 5007 -41 116 79 O ATOMO 143 N ARG A 255 6.307 5.897 1.484 1.00 41.20 N ANISOU 143 N ARG A 255 5344 5362 4946 -17 73 -22 N ATOMO 144 CA ARG A 255 7.116 7.128 1.464 1.00 40.77 C ANISOU 144 CA ARG A 255 5217 5295 4977 -30 15 -71 C ATOMO 145 CB ARG A 255 8.312 6.960 0.520 1.00 41.05 C ANISOU 145 CB ARG A 255 5254 5318 5025 -26 19 -59 C ATOMO 146 CG ARG A 255 9.203 5.754 0.873 1.00 41.23 C ANISOU 146 CG ARG A 255 5241 5314 5109 -16 -53 -75 C ATOMO 147 CD ARG A 255 10.479 5.781 0.055 1.00 42.71 C ANISOU 147 CD ARG A 255 5282 5481 5463 -20 -70 -52 C ATOMO 148 NE ARG A 255 11.486 4.874 0.595 1.00 44.95 N ANISOU 148 NE ARG A 255 5686 5632 5761 -23 -8 6 N ATOMO 149 CZ ARG A 255 12.800 5.096 0.570 1.00 44.62 C ANISOU 149 CZ ARG A 255 5581 5638 5732 -42 -75 37 C ATOMO 150 NH1 ARG A 255 13.283 6.213 0. 045 1.00 44.95 N ANISOU 150 NH1 ARG A 255 5600 5866 5612 -153 -140 84 N ATOMO 151 NH2 ARG A 255 13.632 4.205 1. 093 1.00 45.14 N ANISOU 151 NH2 ARG A 255 5708 5780 5660 6 -107 -75 N ATOMO 152 C ARG A 255 6.300 8.371 1. 111 1.00 40.62 C ANISOU 152 C ARG A 255 5207 5295 4932 -38 26 -78 C ATOMO 153 O ARG A 255 5.092 8.307 0. .939 1.00 41.23 O ANISOU 153 O ARG A 255 5213 5455 4994 0 -1 -130 O ATOMO 154 N THR A 256 6.959 9.512 1. .013 1.00 40.48 N ANISOU 154 N THR A 256 5221 5247 4910 -13 43 -73 N ATOMO 155 CA THR A 256 6.253 10.779 0. .949 1.00 40.65 C ANISOU 155 CA THR A 256 5233 5241 4969 29 14 6 C ATOMO 156 CB THR A 256 6.265 11.522 2. .350 1.00 40.92 C ANISOU 156 CB THR A 256 5291 5223 5035 40 47 -14 c ATOMO 157 OG1 THR A 256 6.218 10.571 3 .438 1.00 42.34 O ANISOU 157 OG1 THR A 256 5543 5436 5106 142 62 -151 O ATOMO 158 CG2 THR A 256 5.082 12.466 2 .479 1.00 41.51 C ANISOU 158 CG2 THR A 256 5386 5196 5190 75 11 15 C ATOMO 159 C THR A 256 6.931 11.637 -0 .116 1.00 40.11 C ANISOU 159 C THR A 256 5160 5179 4899 0 8 30 C ATOMO 160 O THR A 256 7.896 12.347 0.183 1.00 40.28 O ANISOU 160 O THR A 256 5245 5223 4835 -24 20 133 O ATOMO 161 N PRO A 257 6.448 11.568 -1 .366 1.00 39.60 N ANISOU 161 N PRO A 257 5072 5102 4872 -11 3 -7 N ATOMO 162 CA PRO A 257 7.093 12.373 -2 .402 1.00 39.43 C ANISOU 162 CA PRO A 257 5067 5077 4836 1 -29 -23 C ATOMO 163 CB PRO A 257 6.587 11.750 -3. 00 39.18 C ANISOU 163 CB PRO A 257 5053 5055 4778 -3 -63 C ATOMO 164 CG PRO A 257 5.294 11.091 -3. 00 39.06 C ANISOU 164 CG PRO A 257 5063 5013 4764 -1 -34 C ATOMO 165 CD PRO A 257 5.315 10.781 -1. 00 40.06 C ANISOU 165 CD PRO A 257 5172 5085 4963 17 5 C ATOMO 166 C PRO A 257 6.744 13.855 -2. 00 39.42 C ANISOU 166 C PRO A 257 5113 5073 4792 -37 -56 C ATOMO 167 O PRO A 257 5.645 14.229 -1. 00 38.86 O ANISOU 167 O PRO A 257 5152 4918 4693 -22 -87 O ATOMO 168 N GLU A 258 7.692 14.683 -2. 00 40.26 N ANISOU 168 N GLU A 258 5231 5155 4908 -80 -131 N ATOMO 169 CA GLU A 258 7.562 16.117 -2. 00 40.63 C ANISOU 169 CA GLU A 258 5252 5182 5001 -77 -91 C ATOMO 170 CB GLU A 258 8.386 16.633 -1. 00 41.53 C ANISOU 170 CB GLU A 258 5416 5269 5091 -86 -96 C ATOMO 171 CG GLU A 258 7.818 16.238 -0. 00 44.60 C ANISOU 171 CG GLU A 258 5886 5562 5495 188 -51 C ATOMO 172 CD GLU A 258 8.897 16.116 1 00 40.88 C ANISOU 172 CD GLU A 258 4965 5716 4850 -49 386 C ATOMO 173 OE1 GLU A 258 8.594 15.520 2 00 48.80 O ANISOU 173 OE1 GLU A 258 6168 6166 6208 -119 -284 O ATOMO 174 OE2 GLU A 258 10.041 16.600 0 00 46.91 O ANISOU 174 OE2 GLU A 258 6298 5858 5666 -119 -191 O ATOMO 175 C GLU A 258 8.092 16.753 -3 00 40.29 C ANISOU 175 C GLU A 258 5202 5119 4985 -97 -129 C ATOMO 176 O GLU A 258 9.072 16.292 -4 00 40.44 O ANISOU 176 O GLU A 258 5293 5116 4956 -98 -185 O ATOMO 177 N VAL A 259 7.459 17.840 -4.303 1.00 40.01 N ANISOU 177 N VAL A 259 5143 5064 4994 -48 -92 -112 N ATOMO 178 CA VAL A 259 7.948 18.670 -5.392 1.00 40.26 C ANISOU 178 CA VAL A 259 5155 5061 5081 18 -77 -86 C ATOMO 179 CB VAL A 259 6.797 18.967 -6.381 1.00 40.32 C ANISOU 179 CB VAL A 259 5194 5086 5040 3 -70 -79 C ATOMO 180 CG1 VAL A 259 7.169 20.031 -7.349 1.00 39.85 C ANISOU 180 CG1 VAL A 259 5102 5046 4994 -46 -49 -51 C ATOMO 181 CG2 VAL A 259 6.390 17.682 -7.103 1.00 40.01 C ANISOU 181 CG2 VAL A 259 5111 5024 5065 55 -92 -113 C ATOMO 182 C VAL A 259 8.529 19.942 -4.761 1.00 40.31 C ANISOU 182 C VAL A 259 5146 5030 5137 22 -59 -6 C ATOMO 183 O VAL A 259 7.939 20.517 -3.840 1.00 39.93 O ANISOU 183 O VAL A 259 5181 4910 5080 30 -43 -21 O ATOMO 184 N THR A 260 9.704 20.355 -5.211 1.00 40.59 N ANISOU 184 N THR A 260 5198 5044 5180 37 -40 1 N ATOMO 185 CA THR A 260 10.377 21.475 -4.556 1 00 40.90 C ANISOU 185 CA THR A 260 5225 5103 5210 17 -22 -52 C ATOMO 186 CB THR A 260 11.722 21.052 -3.918 1 00 40.60 C ANISOU 186 CB THR A 260 5177 5055 5191 5 7 -62 C ATOMO 187 OG1 THR A 260 11.488 19.986 -2.986 1.00 40.40 O ANISOU 187 OG1 THR A 260 5213 5077 5059 47 26 -208 O ATOMO 188 CG2 THR A 260 12.342 22.196 -3.157 1.00 40.61 C ANISOU 188 CG2 THR A 260 5192 5102 5132 -11 38 10 C ATOMO 189 C THR A 260 10.510 22.656 -5.512 1.00 41.22 C ANISOU 189 C THR A 260 5246 5148 5267 -11 -3 -54 C ATOMO 190 O THR A 260 11.068 22.527 -6.598 1.00 41.63 O ANISOU 190 O THR A 260 5257 5264 5294 15 23 -122 O ATOMO 191 N CYS A 261 9.943 23.795 -5.109 1.00 41.33 N ANISOU 191 N CYS A 261 5272 5136 5296 -17 -27 -88 N ATOMO 192 CA CYS A 261 10.029 25.032 -5. 889 1.00 41.26 C ANISOU 192 CA CYS A 261 5292 5146 5237 -26 -50 -63 C ATOMO 193 CB CYS A 261 8.691 25.769 -5. 894 1.00 40.72 C ANISOU 193 CB CYS A 261 5249 5103 5116 -4 -33 -99 C ATOMO 194 SG CYS A 261 8.495 27.040 -7. 213 1.00 41.29 S ANISOU 194 SG CYS A 261 5307 4989 5391 -25 -29 -151 S ATOMO 195 C CYS A 261 11.104 25.928 -5. 292 1.00 41.60 C ANISOU 195 C CYS A 261 5340 5207 5259 -19 -18 -67 C ATOMO 196 O CYS A 261 11.014 26.324 -4. 133 1.00 42.19 O ANISOU 196 O CYS A 261 5452 5297 5280 -24 -69 -78 O ATOMO 197 N VAL A 262 12.121 26.234 -6. 084 1.00 41.65 N ANISOU 197 N VAL A 262 5287 5236 5301 -27 5 -70 N ATOMO 198 CA VAL A 262 13.192 27.102 -5. 645 1.00 41.52 C ANISOU 198 CA VAL A 262 5296 5172 5305 -10 -8 -79 C ATOMO 199 CB VAL A 262 14.566 26.403 -5 736 1.00 41.57 C ANISOU 199 CB VAL A 262 5266 5213 5312 -4 -11 -73 C ATOMO 200 CG1 VAL A 262 15.703 27.418 -5 531 1.00 41.51 C ANISOU 200 CG1 VAL A 262 5318 5058 5393 16 35 -129 C ATOMO 201 CG2 VAL A 262 14.667 25.238 -4 732 1.00 40.60 C ANISOU 201 CG2 VAL A 262 5239 5053 5131 -58 -15 -107 C ATOMO 202 C VAL A 262 13.230 28.375 -6 493 1.00 41.97 C ANISOU 202 C VAL A 262 5353 5249 5344 -6 1 -62 C ATOMO 203 O VAL A 262 13.277 28.308 -7 744 1.00 41.34 O ANISOU 203 O VAL A 262 · 5297 5185 5225 3 27 -162 O ATOMO 204 N VAL A 263 13.200 29.523 -5 .795 1.00 41.79 N ANISOU 204 N VAL A 263 5323 5198 5357 -8 26 -81 N ATOMO 205 CA VAL A 263 13.450 30.829 -6.399 1.00 41.87 C ANISOU 205 CA VAL A 263 5331 5210 5365 13 -1 -48 C ATOMO 206 CB VAL A 263 12.381 31.882 -6.011 1.00 42.15 C ANISOU 206 CB VAL A 263 5365 5244 5407 -13 -13 -29 C ATOMO 207 CG1 VAL A 263 12.197 32.897 -7.151 1.00 41.64 C ANISOU 207 CG1 VAL A 263 5414 5099 5308 -3 -61 -36 C ATOMO 208 CG2 VAL A 263 11.070 31.217 -5.688 1.00 41.69 C ANISOU 208 CG2 VAL A 263 5219 5254 5366 28 11 9 C ATOMO 209 C VAL A 263 14.825 31.331 -5.954 1.00 42.07 C ANISOU 209 C VAL A 263 5367 5246 5371 -13 24 -47 C ATOMO 210 O VAL A 263 15.194 31.243 -4.773 1.00 42.24 O ANISOU 210 O VAL A 263 5419 5263 5365 -9 12 -77 O ATOMO 211 N VAL A 264 15.594 31.819 -6.915 1.00 42.34 N ANISOU 211 N VAL A 264 5407 5261 5417 -40 15 -20 N ATOMO 212 CA VAL A 264 16.912 32.371 -6.640 1.00 42.34 C ANISOU 212 CA VAL A 264 5355 5321 5408 -44 -15 0 c ATOMO 213 CB VAL A 264 18.086 31.458 -7.123 1.00 42.32 c ANISOU 213 CB VAL A 264 5369 5281 5427 -74 -22 5 C ATOMO 214 CG1 VAL A 264 18.307 30.333 -6.151 1.00 42.89 C ANISOU 214 CG1 VAL A 264 5398 5442 5455 11 -96 65 c ATOMO 215 CG2 VAL A 264 17.862 30.926 -8.536 1.00 42.03 c ANISOU 215 CG2 VAL A 264 5346 5351 5270 -55 -7 25 C ATOMO 216 C VAL A 264 17.003 33.756 -7.271 1.00 42.94 C ANISOU 216 C VAL A 264 5419 5400 5493 -38 -13 22 C ATOMO 217 O VAL A 264 16.131 34.135 -8.077 1.00 43.29 O ANISOU 217 O VAL A 264 5396 5527 5525 -14 -27 41 O ATOMO 218 N ASP A 265 18.057 34.500 -6.918 1.00 42.97 N ANISOU 218 N ASP A 265 5466 5374 5487 -58 -15 -6 N ATOMO 219 CA ASP A 265 18.204 35.890 -7.353 1.00 43.20 C ANISOU 219 CA ASP A 265 5502 5401 5511 -43 11 9 C ATOMO 220 CB ASP A 265 18.142 36.018 -8.889 1.00 43.15 C ANISOU 220 CB ASP A 265 5545 5394 5456 -50 -12 -19 C ATOMO 221 CG ASP A 265 19.371 35.453 -9.579 1.00 44.92 C ANISOU 221 CG ASP A 265 5679 5711 5678 -48 12 -4 C ATOMO 222 OD1 ASP A 265 19.303 35.191 -10.803 1.00 46.63 O ANISOU 222 OD1 ASP A 265 5857 6021 5836 -140 -10 -71 O ATOMO 223 OD2 ASP A 265 20.411 35.263 -8.906 1..00 47.21 O ANISOU 223 OD2 ASP A 265 5935 5986 6016 -141 -96 -22 O ATOMO 224 C ASP A 265 17.117 36.728 -6.695 1..00 43.08 C ANISOU 224 C ASP A 265 5496 5395 5475 -37 49 -4 C ATOMO 225 O ASP A 265 16.547 37.636 -7.313 1..00 43.22 O ANISOU 225 O ASP A 265 5505 5422 5495 -37 102 40 O ATOMO 226 N VAL A 266 16.787 36.397 -5.449 1..00 43.36 N ANISOU 226 N VAL A 266 5544 5410 5520 -42 9 -52 N ATOMO 227 CA VAL A 266 15.823 37.227 -4.722 1.00 43.59 C ANISOU 227 CA VAL A 266 5576 5445 5541 -38 -7 -62 C ATOMO 228 CB VAL A 266 15.117 36.476 -3.564 1.00 43.62 C ANISOU 228 CB VAL A 266 5567 5440 5564 -36 -10 -65 C ATOMO 229 CG1 VAL A 266 14.260 37.426 -2.730 1.00 43.27 C ANISOU 229 CG1 VAL A 266 5518 5469 5453 -20 -46 -125 C ATOMO 230 CG2 VAL A 266 14.253 35.309 -4.109 1.00 43.36 C ANISOU 230 CG2 VAL A 266 5463 5462 5547 25» -14 -83 C ATOMO 231 C VAL A 266 16.653 38.421 -4.250 1.00 43.81 C ANISOU 231 C VAL A 266 5612 5461 5572 -40 -47 -75 C ATOMO 232 O VAL A 266 17.678 .38.243 -3.606 1.00 44.05 O ANISOU 232 O VAL A 266 5645 5485 5605 -62 -80 -95 O ATOMO 233 N SER A 267 16.252 39.625 -4.629 1.00 44.16 N ANISOU 233 N SER A 267 5674 5467 5637 -42 -51 -55 N ATOMO 234 CA SER A 267 17.044 40.809 -4.291 1.00 44.92 C ANISOU 234 CA SER A 267 5742 5605 5720 -26 -25 -27 C ATOMO 235 CB SER A 267 16.574 42.015 -5.098 1.00 44.80 C ANISOU 235 CB SER A 267 5731 5551 5737 -24 -13 -6 C ATOMO 236 OG SER A 267 15.463 42.605 -4.458 1.00 44.95 O ANISOU 236 OG SER A 267 5676 5584 5816 9 4 -13 O ATOMO 237 C SER A 267 16.978 41.119 -2.789 1.00 45.15 C ANISOU 237 C SER A 267 5807 5630 5718 -32 -6 -55 C ATOMO 238 O SER A 267 16.586 40.278 -1.978 1.00 45.49 O ANISOU 238 O SER A 267 5828 5712 5744 -51 7 -60 O ATOMO 239 N HIS A 268 17.366 42.333 -2.428 1.00 45.94 N ANISOU 239 N HIS A 268 5897 5755 5801 -37 -7 -42 N ATOMO 240 CA HIS A 268 17.252 42.793 -1.044 1.00 46.15 C ANISOU 240 CA HIS A 268 5932 5783 5817 -26 -11 -31 C ATOMO 241 CB HIS A 268 18.614 43.221 -0.546 1.00 46.45 C ANISOU 241 CB HIS A 268 5950 5843 5855 -51 -45 -21 C ATOMO 242 CG HIS A 268 19.575 42.093 -0.372 1.00 47.75 C ANISOU 242 CG HIS A 268 6131 5941 6069 30 -23 -45 C ATOMO 243 ND1 HIS A 268 19.941 41.617 0.869 1.00 49.83 N ANISOU 243 ND1 HIS A 268 6445 6227 6259 116 7 -9 N ATOMO 244 CE1 HIS A 268 20.804 40.628 0.722 1.00 49.57 C ANISOU 244 CE1 HIS A 268 6470 6345 6018 34 60 -31 C ATOMO 245 NE2 HIS A 268 21.011 40.445 -0.570 1.00 49.91 N ANISOU 245 NE2 HIS A 268 6326 6330 6306 20 -64 2 N ATOMO 246 CD2 HIS A 268 20.257 41.354 -1.276 1.00 48.94 C ANISOU 246 CD2 HIS A 268 6300 6208 6085 12 8 -40 C ATOMO 247 C HIS A 268 16.270 43.953 -0.932 1.00 46.31 C ANISOU 247 C HIS A 268 5952 5787 5855 -19 8 -26 C ATOMO 248 O HIS A 268 15.635 44.151 0.120 1.00 46.57 O ANISOU 248 O HIS A 268 6023 5813 5856 -91 5 -43 O ATOMO 249 N GLU A 269 16.140 44.701 -2.032 1.00 46.57 N ANISOU 249 N GLU A 269 5987 5794 5912 0 24 16 N ATOMO 250 CA GLU A 269 15.251 45.875 -2.109 1.00 46.95 C ANISOU 250 CA GLU A 269 5979 5849 6010 4 29 -27 C ATOMO 251 CB GLU A 269 15.603 46.754 -3.323 1.00 46.62 C ANISOU 251 CB GLU A 269 5977 5776 5960 -3 18 -3 C ATOMO 252 CG GLU A 269 17.070 46.679 -3.764 1.00 47.69 C ANISOU 252 CG GLU A 269 5996 5921 6202 -64 .33 27 C ATOMO 253 CD GLU A 269 17.958 47.749 -3.127 1.00 50.37 C ANISOU 253 CD GLU A 269 6386 6291 6460 -14 -39 -64 C ATOMO 254 OE1 GLU A 269 17.419 48.766 -2.634 1.00 49.63 O ANISOU 254 OE1 GLU A 269 6277 6189 6390 40 -9 -219 O ATOMO 255 OE2 GLU A 269 19.208 47.585 -3.161 1.00 51.70 O ANISOU 255 OE2 GLU A 269 6319 6463 6858 16 -192 20 O ATOMO 256 C GLU A 269 13.797 45.428 -2.211 1.00 47.24 C ANISOU 256 C GLU A 269 6001 5892 6054 2 38 -55 C ATOMO 257 O GLU A 269 12.901 46.013 -1.583 1.00 48.33 O ANISOU 257 O GLU A 269 6161 6020 6182 27 66 -84 O ATOMO 258 N ASP A 270 13.572 44.392 -3.019 1.00 47.26 N ANISOU 258 N ASP A 270 6029 5892 6034 10 36 -52 N ATOMO 259 CA ASP A 270 12.251 43.806 -3.226 1.00 46.94 C ANISOU 259 CA ASP A 270 5979 5862 5992 11 11 -19 C ATOMO 260 CB ASP A 270 11.817 44.010 -4.678 1.00 47.64 C ANISOU 260 CB ASP A 270 6125 5924 6052 -10 2 -55 C ATOMO 261 CG ASP A 270 12.011 45.446 - 5.149 1.00 49, 53 C A ISOU 261 CG ASP A 270 6428 6106 6283 5 83 46 C ATOMO 262 ODl ASP A 270 11.562 46.383 - 4.426 1.00 50. 58 O ANISOU 262 ODl ASP A 270 6655 6105 6455 75 138 -47 O ATOMO 263 OD2 ASP A 270 12.620 45.632 - 6.232 1.00 50 17 O ANISOU 263 OD2 ASP A 270 6461 6333 6269 47 198 •153 O ATOMO 264 C ASP A 270 12.379 42.331 - 2.925 1.00 46 46 C ANISOU 264 C ASP A 270 5904 5821 5928 4 5 -41 C ATOMO 265 O ASP A 270 12.490 41.528 - 3.852 1. 00 46 73 O ANISOU 265 O ASP A 270 5861 5902 5992 73 80 -3 O ATOMO 266 N PRO A 271 12.383 41.970 - 1.628 1..00 46 30 N ANISOU 266 N PRO A 271 5872 5815 5902 19 9 -39 N ATOMO 267 CA PRO A 271 12.735 40.625 1.182 1. .00 46 38 C ANISOU 267 CA PRO A 271 5878 5802 5940 8 8 -53 C ATOMO 268 CB PRO A 271 13.321 40.873 0.207 1. .00 46 .74 C ANISOU 268 CB PRO A 271 5927 5842 5990 0 20 -.18 C ATOMO 269 CG PRO A 271 12.532 42.082 0.732 1.00 46 35 C ANISOU 269 CG PRO A 271 5868 5817 5922 37 -13 •51 C ATOMO 270 CD PRO A 271 12.074 42.863 •0.487 1.00 46 34 C ANISOU 270 CD PRO A 271 5887 5812 5907 47 16 -33 C ATOMO 271 C PRO A 271 11.567 39.661 · •1.064 1.00 46 .91 C ANISOU 271 C PRO A 271 5915 5843 6064 16 18 -55 C ATOMO 272 O PRO A 271 11.751 38.464 -1.297 1.00 47 80 O ANISOU 272 O PRO A 271 5999 5932 6231 72 10 -41 O ATOMO 273 N GLU A 272 10.385 40.161 -0.703 1.00 47 .03 N ANISOU 273 N GLU A 272 5924 5834 6111 10 9 -81 N ATOMO 274 CA GLU A 272 9.255 39.289 -0.375 1 .00 46 90 C ANISOU 274 CA GLU A 272 5899 5861 6056 -31 2 -69 C ATOMO 275 CB GLU A 272 8.199 40.002 0.480 1.00 47.05 C ANISOU 275 CB GLU A 272 5905 5909 6061 -29 -1 -57 C ATOMO 276 CG GLU A 272 8.736 40.972 1.528 1.00 48.65 C ANISOU 276 CG GLU A 272 6104 6206 6174 -35 -24 -64 C ATOMO 277 CD GLU A 272 9.674 40.329 2.566 1.00 50.71 C ANISOU 277 CD GLU A 272 6405 6393 6466 10 -66 39 C ATOMO 278 OE1 GLU A 272 9.577 39.104 2.812 1.00 51.33 O ANISOU 278 OE1 GLU A 272 6528 6257 6717 -21 33 -12 O ATOMO 279 OE2 GLU A 272 10.509 41.074 3.139 1.00 50.98 O ANISOU 279 OE2 GLU A 272 6448 6560 6361 -33 -177 -55 O ATOMO 280 C GLU A 272 8.631 38.686 -1.633 1.00 46.54 C ANISOU 280 C GLU A 272 5881 5811 5989 -31 -30 -51 C ATOMO 281 O GLU A 272 8.366 39.380 -2.630 1.00 47.00 O ANISOU 281 O GLU A 272 5929 5827 6100 -69 -26 -34 O ATOMO 282 N VAL A 273 8.434 37.372 -1.573 1.00 45.97 N ANISOU 282 N VAL A 273 5822 5768 5875 -28 -35 -72 N ATOMO 283 CA VAL A 273 7.935 36.586 -2.697 1.00 45.26 C ANISOU 283 CA VAL A 273 5738 5675 5781 -15 -4 -87 C ATOMO 284 CB VAL A 273 9.042 35.675 -3.296 1.00 45.49 C ANISOU 284 CB VAL A 273 5723 5777 5781 -37 9 -110 C ATOMO 285 CG1 VAL A 273 8.629 35.110 -4.669 1.00 45.42 C ANISOU 285 CG1 VAL A 273 5681 5791 5783 -59 0 -59 C ATOMO 286 CG2 VAL A 273 10.363 36.439 -3.429 1.00 45.73 C ANISOU 286 CG2 VAL A 273 5844 5761 5769 -107 2 -86 C ATOMO 287 C VAL A 273 6.749 35.756 -2.202 1.00 44.66 C ANISOU 287 C VAL A 273 5681 5592 5694 0 3 -104 C ATOMO 288 O VAL A 273 6.687 35.353 -1.029 1.00 44.72 O ANISOU 288 O VAL A 273 5778 5509 5704 26 36 -129 O ATOMO 289 N LYS A 274 5.811 35.522 -3.108 1.00 43.97 N ANISOU 289 N LYS A 274 5556 5534 5616 10 13 -109 N ATOMO 290 CA LYS A 274 4.568 34.833 -2.807 1.00 43.21 C ANISOU 290 CA LYS A 274 5485 5435 5495 -5 21 -75 C ATOMO 291 CB LYS A 274 3.407 35.759 -3.179 1.00 42.77 C ANISOU 291 CB LYS A 274 5436 5394 5419 0 -19 -102 C ATOMO 292 CG LYS A 274 2.050 35.407 -2.597 1.00 41.82 C ANISOU 292 CG LYS A 274 5335 5189 5365 -22 -50 -111 C ATOMO 293 CD LYS A 274 0.997 36.393 -3.092 1.00 42.08 C ANISOU 293 CD LYS A 274 5342 5275 5370 -13 -1 -45 C ATOMO 294 CE LYS A 274 0.899 36..385 -4.614 1.00 44.59 C ANISOU 294 CE LYS A 274 5681 5789 5470 -483 152 -326 C ATOMO 295 NZ LYS A 274 -0.045 37..398 -5.185 1.00 40.06 N ANISOU 295 NZ LYS A 274 5019 4610 5590 369 -248 81 N ATOMO 296 C LYS A 274 4.498 33.570 -3.651 1.00 43.36 C ANISOU 296 C LYS A 274 5514 5454 5504 -3 30 -52 C ATOMO 297 O LYS A 274 4.678 33.627 -4.873 1.00 43.92 O ANISOU 297 O LYS A 274 5587 5567 5534 35 17 -66 O ATOMO 298 N PHE A 275 4.229 32.431 -3.024 1.00 43.43 N ANISOU 298 N PHE A 275 5510 5465 5523 17 5 -41 N ATOMO 299 CA PHE A 275 4.007 31.206 -3.803 1.00 43.22 C ANISOU 299 CA PHE A 275 5474 5466 5480 9 9 -42 C ATOMO 300 CB PHE A 275 4.673 30.013 -3.158 1.00 43.00 C ANISOU 300 CB PHE A 275 5486 5398 5452 2 15 -33 C ATOMO 301 CG PHE A 275 6.166 30.040 -3.246 1.00 43.42 C ANISOU 301 CG PHE A 275 5474 5474 5547 30 -1 -25 C ATOMO 302 CD1 PHE A 275 6.929 30.554 -2.193 1.00 42.75 C ANISOU 302 CD1 PHE A 275 5315 5360 5568 9 -25 -65 C ATOMO 303 CE1 PHE A 275 8.322 30.570 -2.263 1.00 42.60 C ANISOU 303 CE1 PHE A 275 5337 5322 5527 -92 -56 14 C ATOMO 304 CZ PHE A 275 8.962 30.062 -3.392 1.00 42.99 C ANISOU 304 CZ PHE A 275 5390 5492 5450 -41 -24 -57 C ATOMO 305 CE2 PHE A 275 8.208 29.543 -4.459 1.00 43.86 C ANISOU 305 CE2 PHE A 275 5445 5657 5560 -71 26 -48 C ATOMO 306 CD2 PHE A 275 6.818 29.538 -4.379 1.00 43.43 C ANISOU 306 CD2 PHE A 275 5481 5591 5428 9 -44 3 C ATOMO 307 C PHE A 275 2.544 30.902 -4.001 1.00 43.40 C ANISOU 307 C PHE A 275 5526 5484 5479 -33 19 -47 C ATOMO 308 O PHE A 275 1.750. 30.906 -3.046 1.00 44.16 O ANISOU 308 O PHE A 275 5666 5605 5505 -26 30 -41 O ATOMO 309 N ASN A 276 2.177 30.660 -5.252 1.00 43.24 N ANISOU 309 N ASN A 276 5500 5462 5466 -18 42 -22 N ATOMO 310 CA ASN A 276 0.890 30.052 -5.539 1.00 43.32 C ANISOU 310 CA ASN A 276 5497 5427 5532 -7 31 -42 C ATOMO 311 CB ASN A 276 0.089 30.864 -6.573 1.00 42.83 C ANISOU 311 CB ASN A 276 5423 5396 5453 32 70 -1 C ATOMO 312 CG ASN A 276 -0.109 32.337 -6.171 1.00 43.44 C ANISOU 312 CG ASN A 276 5519 5499 5487 9 9 -16 C ATOMO 313 OD1 ASN A 276 -0.722 33.112 -6.918 1.00 44.20 O ANISOU 313 OD1 ASN A 276 5682 5657 5455 -11 91 56 O ATOMO 314 ND2 ASN A 276 0.392 32.724 -4.997 1.00 44.64 N ANISOU 314 ND2 ASN A 276 5694 5621 5644 84 -43 23 N ATOMO 315 C ASN A 276 1.193 28.629 -6.021 1.00 43.23 C ANISOU 315 C ASN A 276 5471 5387 5567 12 67 -36 C ATOMO 316 O ASN A 276 2.271 28.381 -6.566 1.00 43.45 O ANISOU 316 O ASN A 276 5468 5431 5610 15 74 -38 O ATOMO 317 N TRP A 277 0.261 27.703 -5.780 1.00 43.29 N A ISOU 317 N TRP A 277 5473 5373 5600 17 43 -43 N ATOMO 318 CA TRP A 277 0.403 26.290 -6.173 1..00 42.95 C ANISOU 318 CA TRP A 277 5415 5377 5523 -6 0 -103 C ATOMO 319 CB TRP A 277 0.758 25.397 -4.985 1.00 42.16 C ANISOU 319 CB TRP A 277 5263 5304 5451 28 -4 -65 C ATOMO 320 CG TRP A 277 2.183 25.417 -4.469 1.00 42.99 C ANISOU 320 CG TRP A 277 5406 5401 5527 5 23 -87 C ATOMO 321 CD1 TRP A 277 2.657 26.129 -3. 398 1.00 42.90 C ANISOU 321 CD1 TRP A 277 5338 5415 5547 10 -15 -143 C ATOMO 322 NE1 TRP A 277 3.990 25.862 -3..194 1.00 43.36 N ANISOU 322 NE1 TRP A 277 5319 5500 5653 -54 -62 -48 N ATOMO 323 CE2 TRP A 277 4.405 24.949 -4..125 1.00 42.25 C ANISOU 323 CE2 TRP A 277 5236 5343 5471 68 39 -134 c ATOMO 324 CD2 TRP A 277 3.289 24.634 -4..943 1.00 42.84 C ANISOU 324 CD2 TRP A 277 5364 5403 5509 30 27 -96 C ATOMO 325 CE3 TRP A 277 3.455 23.715 -5.991 1.00 43.02 C ANISOU 325 CE3 TRP A 277 5359 5403 5582 49 -27 -100 C ATOMO 326 CZ3 TRP A 277 4.717 23.141 -6.186 1.00 42.65 C ANISOU 326 CZ3 TRP A 277 5369 5373 5462 -37 -12 -164 C ATOMO 327 CH2 TRP A 277 5.801 23.471 -5.354 1.00 42.95 C ANISOU 327 CH2 TRP A 277 5324 5462 5533 8 -25 -87 C ATOMO 328 CZ2 TRP A 277 5.668 24.376 -4 .322 1.00 43.40 C ANISOU 328 CZ2 TRP A 277 5423 5476 5590 -13 -3 -46 C ATOMO 329 C TRP A 277 -0.922 25.793 -6.720 1.00 42.96 C ANISOU 329 C TRP A 277 5381 5417 5524 9 0 -104 C ATOMO 330 O TRP A 277 -1.978 26.129 -6 .192 1.00 43.23 O ANISOU 330 O TRP A 277 5408 5439 5576 -15 -28 -119 O ATOMO 331 N TYR A 278 -0.842 24.965 -7.754 1.00 42.84 N ANISOU 331 N TYR A 278 5366 5431 5478 38 -13 -101 N ATOMO 332 CA TYR A 278 -1.988 24.432 -8.471 1.00 42.52 C ANISOU 332 CA TYR A 278 5338 5365 5451 19 -12 -52 C ATOMO 333 CB TYR A 278 -2.247 25.265 -9.746 1.00 43.43 C ANISOU 333 CB TYR A 278 5419 5517 5565 0 -11 -30 C ATOMO 334 CG TYR A 278 -2.307 26.769 -9.500 1.00 44.08 C ANISOU 334 CG TYR A 278 5578 5473 5695 8 54 0 C ATOMO 335 CD1 TYR A 278 -1.140 27.535 -9.452 1.00 43.87 C ANISOU 335 CD1 TYR A 278 5454 5517 5694 19 -5 -65 C ATOMO 336 CE1 TYR A 278 -1.177 28.900 -9.228 1.00 44.77 C ANISOU 336 CE1 TYR A 278 5712 5565 5732 0 -41 -53 C ATOMO 337 CZ TYR A 278 -2.395 29.528 -9.019 1.00 44.46 C ANISOU 337 CZ TYR A 278 5561 5435 5893 3 -8 -83 C ATOMO 338 OH TYR A 278 -2.429 30.889 -8.788 1.00 45.34 O ANISOU 338 OH TYR A 278 5756 5539 5929 47 81 -4 O ATOMO 339 CE2 TYR A 278 -3.575 28.797 -9.047 1.00 46.00 C ANISOU 339 CE2 TYR A 278 5736 5868 5872 2 3 28 C ATOMO 340 CD2 TYR A 278 -3.525 27.416 -9.291 1.00 44.42 C ANISOU 340 CD2 TYR A 278 5603 5446 5827 91 -7 -3 C ATOMO 341 C TYR A 278 -1.705 22.978 -8.845 1.00 42.48 C ANISOU 341 C TYR A 278 5350 5371 5416 -2 -44 -14 C ATOMO 342 O TYR A 278 -0.649 22.659 -9.386 1.00 42.02 O ANISOU 342 O TYR A 278 5346 5257 5361 43 -47 -56 O ATOMO 343 N VAL A 279 -2.658 22.100 -8.551 1.00 42.92 N ANISOU 343 N VAL A 279 5472 5419 5416 -5 -44 20 N ATOMO 344 CA VAL A 279 -2.610 20.701 -8.983 1.00 42.90 C ANISOU 344 CA VAL A 279 5447 5421 5431 20 -27 -3 ATOMO 345 CB VAL A 279 -2.902 19.744 -7.795 1.00 42.52 C ANISOU 345 CB VAL A 279 5413 5380 5362 33 -38 -9 C ATOMO 346 CG1 VAL A 279 -2.993 18.320 -8.244 1.00 41.55 C ANISOU 346 CG1 VAL A 279 5177 5298 5311 13 -94 26 C ATOMO 347 CG2 VAL A 279 -1.824 19.896 -6.731 1.00 42.94 C ANISOU 347 CG2 VAL A 279 5406 5427 5483 79 6 17 C ATOMO 348 C VAL A 279 -3.633 20.546 -10.115 1.00 43.47 C ANISOU 348 C VAL A 279 5510 5501 5503 -5 -32 -11 C ATOMO 349 O VAL A 279 -4.840 20.532 -9.876 1.00 43.83 O ANISOU 349 O VAL A 279 5537 5526 5589 -14 -44 -13 O ATOMO 350 N ASP A 280 -3.133 20.472 -11.348 1.00 43.97 N ANISOU 350 N ASP A 280 5575 5537 5591 11 -28 -30 N ATOMO 351 CA ASP A 280 -3.963 20.499 -12.557 1.00 44.09 C ANISOU 351 CA ASP A 280 5575 5525 5649 5 -64 -42 C ATOMO 352 CB ASP A 280 -4.869 19.252 -12.634 1.00 44.22 C ANISOU 352 CB ASP A 280 5608 5545 5645 17 -30 9 C ATOMO 353 CG ASP A 280 -4.151 18.026 -13.197 1.00 43.82 C ANISOU 353 CG ASP A 280 5606 5434 5609 -22 -32 -26 C ATOMO 354 OD1 ASP A 280 -3.283 18.156 -14.086 1.00 43.76 O ANISOU 354 OD1 ASP A 280 5538 5390 5698 -27 32 -141 O ATOMO 355 OD2 ASP A 280 -4.474 16.915 -12.756 1.00 43.89 O ANISOU 355 OD2 ASP A 280 5597 5469 5609 -7 1 -1 O ATOMO 356 C ASP A 280 -4.786 21.799 -12.756 1.00 44.61 C ANISOU 356 C ASP A 280 5619 5577 5751 16 -59 -63 C ATOMO 357 O ASP A 280 -5.887 21.761 -13.314 1.00 45.34 O ANISOU 357 O ASP A 280 5661 5665 5897 54 -94 -85 O ATOMO 358 N GLY A 281 -4.254 22.941 -12.318 1.00 44.62 N ANISOU 358 N GLY A 281 5615 5564 5774 9 -33 -63 N ATOMO 359 CA GLY A 281 -4.920 24.239 -12.522 1.00 43.93 C ANISOU 359 CA GLY A 281 5546 5506 5639 43 -15 -9 C ATOMO 360 C GLY A 281 -5.889 24.672 -11.425 1.00 44.05 C ANISOU 360 C GLY A 281 5544 5513 5679 30 -12 3 C ATOMO 361 O GLY A 281 -6.548 25.727 -11.535 1.00 44.55 O ANISOU 361 O GLY A 281 5577 5596 5754 17 20 -60 O ATOMO 362 N VAL A 282 -5.968 23.871 -10.367 1.00 43.31 N ANISOU 362 N VAL A 282 5472 5421 5561 14 -8 19 N ATOMO 363 CA VAL A 282 -6.851 24.121 -9.241 1.00 43.04 C ANISOU 363 CA VAL A 282 5464 5380 5508 26 -25 -11 C ATOMO 364 CB VAL A 282 -7.691 22.860 -8.916 1.00 43.44 C ANISOU 364 CB VAL A 282 5511 5459 5536 37 4 -16 C ATOMO 365 CG1 VAL A 282 -8.661 23.101 -7.753 1.00 44.12 C ANISOU 365 CG1 VAL A 282 5583 5557 5621 14 21 -60 C ATOMO 366 CG2 VAL A 282 -8.442 22.350 -10.169 1.00 42.54 C ANISOU 366 CG2 VAL A 282 5348 5334 5481 10 -71 16 C ATOMO 367 C VAL A 282 -5.948 24.480 -8.073 1.00 43.28 C ANISOU 367 C VAL A 282 5520 5394 5528 31 -9 0 c ATOMO 368 O VAL A 282 -4.938 23.807 -7.830 1.00 43.32 O ANISOU 368 O VAL A 282 5586 5392 5480 -4 -7 0 O ATOMO 369 N GLU A 283 -6.269 25.552 -7.361 1.00 43.39 N ANISOU 369 N GLU A 283 5533 5428 5524 46 -30 -15 N ATOMO 370 CA GLU A 283 -5.332 26.039 -6.359 1.00 43.99 C ANISOU 370 CA GLU A 283 5588 5513 5614 39 -27 -44 C ATOMO 371 CB GLU A 283 -5.541 27.527 -6.015 1.00 44.14 C ANISOU 371 CB GLU A 283 5616 5518 5637 22 -32 -77 C ATOMO 372 CG GLU A 283 -4.233 28.237 -5.566 1.00 45.14 C ANISOU 372 CG GLU A 283 5698 5626 5824 1 -30 -88 C ATOMO 373 CD GLU A 283 -4.371 29.755 -5.272 1.00 45.52 C A ISOU 373 CD GLU A 283 5808 5640 5847 63 -22 -79 C ATOMO 374 OE1 GLU A 283 -5.169 30.449 -5.936 1.00 45.98 O ANISOU 374 OE1 GLU A 283 5903 5748 5817 168 -129 -128 O ATOMO 375 OE2 GLU A 283 -3.643 30.256 -4.381 1.00 45.87 O ANISOU 375 OE2 GLU A 283 5852 5692 5885 80 -99 -213 O ATOMO 376 C GLU A 283 -5.379 25.129 -5.137 1.00 43.97 C ANISOU 376 C GLU A 283 5562 5548 5597 37 -9 -38 C ATOMO 377 O GLU A 283 -6.407 24.499 -4.844 1.00 44.59 O ANISOU 377 O GLU A 283 5634 5595 5712 35 51 -49 O ATOMO 378 N VAL A 284 -4.236 24.998 -4.479 1.00 43.75 N ANISOU 378 N VAL A 284 5529 5540 5552 44 -36 -57 N ATOMO 379 CA VAL A 284 -4.120 24.176 -3.273 1.00 43.31 C ANISOU 379 CA VAL A 284 5511 5464 5480 32 -24 -78 C ATOMO 380 CB VAL A 284 -3.476 22.788 -3.586 1.00 43.18 C ANISOU 380 CB VAL A 284 5470 5449 5488 12 -27 -98 C ATOMO 381 CGl VAL A 284 -4.052 22.210 -4.898 1.00 43.69 C ANISOU 381 CGl VAL A 284 5545 5529 5525 52 -3 -77 C ATOMO 382 CG VAL A 284 -1.955 22.880 -3.689 1.00 42.77 C ANISOU 382 CG2 VAL A 284 5474 5424 5350 28 -8 -121 C ATOMO 383 C VAL A 284 -3.295 25.000 -2.284 1.00 43.29 C ANISOU 383 C VAL A 284 5540 5456 5451 58 2 -99 C ATOMO 384 O VAL A 284 -2.599 25.934 -2.685 1.00 43.04 O ANISOU 384 O VAL A 284 5517 5406 5431 65 12 -172 O ATOMO 385 N HIS A 285 -3.359 24.658 -1.005 1.00 43.83 N ANISOU 385 N HIS A 285 5611 5536 5504 66 -17 -98 N ATOMO 386 CA HIS A 285 -2.861 25.567 0.027 1.00 44.27 C ANISOU 386 CA HIS A 285 5668 5587 5565 87 -30 -55 C ATOMO 387 CB HIS A 285 -4.050 26.282 0.698 1.00 44.73 C A ISOU 387 CB HIS A 285 5756 5646 5593 75 -33 -36 C ATOMO 388 CG HIS A 285 -4.976 26.958 -0.275 1.00 44.92 C ANISOU 388 CG HIS A 285 5649 5723 5694 77 -25 -31 C ATOMO 389 ND1 HIS A 285 -4.656 28.136 -0.918 1.00 44.58 N ANISOU 389 ND1 HIS A 285 5612 5609 5716 66 -65 -20 N ATOMO 390 CE1 HIS A 285 -5.646 28.483 -1.724 1.00 45.27 C ANISOU 390 CE1 HIS A 285 5786 5744 5667 95 17 -124 C ATOMO 391 NE2 HIS A 285 -6.598 27.573 -1.625 1.00 43.43 N ANISOU 391 NE2 HIS A 285 5469 5597 5434 28 51 -17 N ATOMO 392 CD2 HIS A 285 -6.199 26.603 -0.735 1.00 44.79 C ANISOU 392 CD2 HIS A 285 5612 5701 5703 19 85 -129 C ATOMO 393 C HIS A 285 -1.950 24.866 1.049 1.00 44.64 C ANISOU 393 C HIS A 285 5770 5605 5584 68 -24 -62 C ATOMO 394 O HIS A 285 -1.415 25.503 1.966 1.00 44.57 O ANISOU 394 O HIS A 285 5789 5585 5561 88 -2 -76 O ATOMO 395 N ASN A 286 -1.729 23.565 0.843 1.00 44.50 N ANISOU 395 N ASN A 286 5789 5535 5584 80 -9 -57 N ATOMO 396 CA ASN A 286 -0.962 22.747 1.781 1.00 44.26 C ANISOU 396 CA ASN A 286 5730 5533 5553 67 -12 -83 C ATOMO 397 CB ASN A 286 -1.450 21.295 1.735 1.00 44.27 C ANISOU 397 CB ASN A 286 5748 5527 5545 38 6 -34 C ATOMO 398 CG ASN A 286 -1.216 20.635 0.373 1.00 44.25 C ANISOU 398 CG ASN A 286 5821 5469 5519 47 -24 -56 C ATOMO 399 OD1 ASN A 286 -1.410 21.255 -0.676 1.00 43.91 O ANISOU 399 OD1 ASN A 286 5808 5508 5364 5 -68 -229 O ATOMO 400 ND2 ASN A 286 -0.803 19.376 0.391 1.00 44.62 N ANISOU 400 ND2 ASN A 286 5770 5592 5590 125 0 -53 N ATOMO 401 C ASN A 286 0.568 22.816 1.625 1.00 44.26 C A ISOU 401 C ASN A 286 5738 5529 5547 68 -18 -77 C ATOMO 402 O ASN A 286 1.286 22.107 2.322 1.00 45.01 O ANISOU 402 O ASN A 286 5800 5597 5702 141 -25 -4 O ATOMO 403 N ALA A 287 1.077 23.681 0.750 1.00 43.66 N ANISOU 403 N ALA A 287 5666 5502 5421 51 -13 -117 N ATOMO 404 CA ALA A 287 2.530 23.836 0.631 1.00 43.65 C ANISOU 404 CA ALA A 287 5588 5531 5464 78 -35 -99 C ATOMO 405 CB ALA A 287 2.881 24.633 - 0.594 1.00 43.62 C ANISOU 405 CB ALA A 287 5586 5509 5477 102 -29 -107 C ATOMO 406 C ALA A 287 3.178 24.463 1.879 1.00 43.97 C ANISOU 406 C ALA A 287 5604 5597 5503 92 -43 -106 C ATOMO 407 O ALA A 287 2.539 25.238 2.598 1.00 43.85 O ANISOU 407 O ALA A 287 5569 5635 5454 105 -67 -115 O ATOMO 408 N LYS A 288 4.453 24.128 2.104 1.00 44.17 N ANISOU 408 N LYS A 288 5627 5595 5558 72 -23 -103 N ATOMO 409 CA LYS A 288 5.217 24.563 3.272 1.00 44.18 C ANISOU 409 CA LYS A 288 5625 5588 5572 29 -45 -99 C ATOMO 410 CB LYS A 288 5.689 23.352 4.080 1.00 44.81 c ANISOU 410 CB LYS A 288 5699 5701 5626 40 -42 -150 C ATOMO 411 CG LYS A 288 4.593 22.555 4.792 1.00 46.48 C ANISOU 411 CG LYS A 288 5865 5903 5892 -76 11 -29 C ATOMO 412 CD LYS A 288 4.200 23.232 6.110 1.00 49.09 C ANISOU 412 CD LYS A 288 6127 6301 6221 -126 134 -75 C ATOMO 413 CE LYS A 288 2.938 22.633 6.718 1.00 52.04 C ANISOU 413 CE LYS A 288 6488 6709 6575 43 -23 -39 C ATOMO 414 NZ LYS A 288 1.723 22.869 5.865 1.00 52.37 N ANISOU 414 NZ LYS A 288 6568 6732 6598 74 -80 19 N ATOMO 415 C LYS A 288 6.420 25.342 2.794 1.00 44.20 C ANISOU 415 C LYS A 288 5613 5591 5587 58 -50 -120 C ATOMO 416 O LYS A 288 7.391 24.752 2.339 1.00 44.44 O ANISOU 416 O LYS A 288 5687 5545 5650 97 -149 -161 O ATOMO 417 N THR A 289 6.354 26.670 2.864 1.00 44.16 N ANISOU 417 N THR A 289 5601 5569 5607 51 -24 -106 N ATOMO 418 CA THR A 289 7.461 27.508 2.418 1.00 44.15 C ANISOU 418 CA THR A 289 5612 5539 5620 39 5 -85 C ATOMO 419 CB THR A 289 6.970 28.884 1.928 1.00 44.07 C ANISOU 419 CB THR A 289 5583 5531 5628 43 0 -85 C ATOMO 420 OG1 THR A 289 5.785 28.708 1.148 1.00 44.05 O ANISOU 420 OG1 THR A 289 5591 5462 5685 41 30 -182 O ATOMO 421 CG2 THR A 289 8.017 29.571 1.057 1.00 43.05 C ANISOU 421 CG2 THR A 289 5481 5379 5495 32 70 -140 C ATOMO 422 C THR A 289 8.492 27.654 3.538 1.00 44.68 C ANISOU 422 C THR A 289 5698 5604 5673 42 1 -63 C ATOMO 423 O THR A 289 8.134 27.775 4.699 1.00 44.31 O ANISOU 423 O THR A 289 5702 5521 5612 66 10 -51 O ATOMO 424 N LYS A 290 9.774 27.609 3.180 1.00 45.81 N ANISOU 424 N LYS A 290 5825 5733 5846 14 -29 -52 N ATOMO 425 CA LYS A 290 10.851 27.684 4.165 1.00 46.81 C ANISOU 425 CA LYS A 290 5945 5856 5982 13 -25 -36 C ATOMO 426 CB LYS A 290 12.115 26.942 3.676 1.00 47.41 C ANISOU 426 CB LYS A 290 6028 5957 6026 13 4 -53 C ATOMO 427 CG LYS A 290 11.847 25.624 2.921 1.00 48.57 C ANISOU 427 CG LYS A 290 6220 6021 6211 -2 67 -25 C ATOMO 428 CD LYS A 290 11.104 24.615 3.765 1.00 51.96 C ANISOU 428 CD LYS A 290 6717 6409 6614 73 185 3 C ATOMO 429 CE LYS A 290 9.953 24.034 2.979 1.00 49.11 C A ISOU 429 CE LYS A 290 6138 6223 6296 -248 15 22 c ATOMO 430 NZ LYS A 290 9.085 23.115 3.801 1.00 53.79 N ANISOU 430 NZ LYS A 290 6802 6907 6729 208 -33 -113 N ATOMO 431 C LYS A 290 11.172 29.147 4.440 1.00 46.84 C ANISOU 431 C LYS A 290 5963 5877 5957 0 -26 -24 C ATOMO 432 O LYS A 290 11.011 29.996 3.549 1.00 47.40 O ANISOU 432 O LYS A 290 5986 5914 6109 0 -16 -3 O ATOMO 433 N PRO A 291 11.592 29.457 5.681 1.00 46.94 N ANISOU 433 N PRO A 291 5985 5900 5950 -14 -59 -1 N ATOMO 434 CA PRO A 291 12.091 30.804 5.994 1.00 46.84 C ANISOU 434 CA PRO A 291 5974 5891 5931 -18 -52 -2 C ATOMO 435 CB PRO A 291 12.554 30.682 7.462 1.00 46.82 C ANISOU 435 CB PRO A 291 5971 5895 5921 -11 -80 -5 C ATOMO 436 CG PRO A 291 12.624 29.199 7.753 1.00 46.92 C ANISOU 436 CG PRO A 291 6015 5881 5931 -28 -125 7 C ATOMO 437 CD PRO A 291 11.585 28.578 6.870 1.00 47.19 C ANISOU 437 CD PRO A 291 6015 5909 6005 -25 -71 32 C ATOMO 438 C PRO A 291 13.261 31.147 5.075 1.00 46.64 C ANISOU 438 C PRO A 291 5925 5886 5910 5 -30 -4 C ATOMO 439 O PRO A 291 14.133 30.296 4.863 1.00 47.04 O ANISOU 439 O PRO A 291 5987 5882 6001 31 -44 -33 O ATOMO 440 N ARG A 292 13.264 32.364 4.520 1.00 46.46 N ANISOU 440 N ARG A 292 5884 5850 5915 18 -40 -33 N ATOMO 441 CA ARG A 292 14.214 32.738 3.462 1.00 46.02 C ANISOU 441 CA ARG A 292 5853 5808 5821 13 -28 -46 C ATOMO 442 CB ARG A 292 13.794 34.046 2.798 1.00 46.45 C ANISOU 442 CB ARG A 292 5904 5847 5896 2 -27 -71 C ATOMO 443 CG ARG A 292 13.611 35.259 3.741 00 47.04 C ANISOU 443 CG ARG A 292 6025 5960 5886 9 -27 -61 C ATOMO 444 CD ARG A 292 13.483 36.560 2.938 00 47.13 C ANISOU 444 CD ARG A 292 6000 5923 5984 -61 -73 -30 C ATOMO 445 NE ARG A 292 12.698 37.551 3.667 00 47.83 N ANISOU 445 NE ARG A 292 6097 5602 6472 -52 16 -335 N ATOMO 446 CZ ARG A 292 13.127 38.770 4.014 00 57.33 C ANISOU 446 CZ ARG A 292 7795 7019 6967 93 -377 229 C ATOMO 447 NH1 ARG A 292 14.348 39.183 3.676 00 49.57 N ANISOU 447 NH1 ARG A 292 5617 6420 6794 -337 306 19 N ATOMO 448 NH2 ARG A 292 12.320 39.589 4.688 00 48.78 N ANISOU 448 NH2 ARG A 292 5976 6056 6501 282 328 -326 N ATOMO 449 C ARG A 292 15.654 32.829 3.962 00 46.46 C ANISOU 449 C ARG A 292 5866 5923 5862 7 -4 -68 C ATOMO 450 O ARG A 292 15.881 33.227 5.111 00 46.71 O ANISOU 450 O ARG A 292 5920 5996 5831 8 24 -119 O ATOMO 451 N GLU A 293 16.617 32.446 3.108 00 46.36 N ANISOU 451 N GLU A 293 5854 5928 5831 24 -8 -73 N ATOMO 452 CA GLU A 293 18.053 32.436 3.465 .00 46.15 C ANISOU 452 CA GLU A 293 5799 5867 5867 0 -8 -62 C ATOMO 453 CB GLU A 293 18.639 31.019 3.384 .00 46.12 C ANISOU 453 CB GLU A 293 5824 5830 5866 1 -58 0 C ATOMO 454 CG GLU A 293 17.798 29.901 3.963 .00 47.34 C ANISOU 454 CG GLU A 293 5940 5960 6085 -28 -21 -38 C ATOMO 455 CD GLU A 293 18.535 28.556 3.942 .00 47.14 C ANISOU 455 CD GLU A 293 5934 5957 6020 39 -105 -55 C ATOMO 456 OE1 GLU A 293 19.338 28.315 4.865 .00 49.59 O ANISOU 456 OE1 GLU A 293 6438 6317 6085 42 -160 10 O ATOMO 457 OE2 GLU A 293 18.316 27.742 3.006 1.00 48.92 O ANISOU 457 OE2 GLU A 293 6228 6211 6148 -49 -12 -85 O ATOMO 458 C GLU A 293 18.833 33.336 2.514 1.00 45.36 C ANISOU 458 C GLU A 293 5761 5721 5752 -18 -34 -35 C ATOMO 459 O GLU A 293 18.457 33.457 1.355 1.00 45.82 O ANISOU 459 O GLU A 293 5815 5803 5791 -15 0 -122 O ATOMO 460 N GLU A 294 19.926 33.938 2.994 1.00 45.28 N ANISOU 460 N GLU A 294 5733 5714 5756 -18 -2 -11 N ATOMO 461 CA GLU A 294 20.712 34.932 2.222 1.00 44.87 C ANISOU 461 CA GLU A 294 5685 5636 5725 -25 -11 -35 C ATOMO 462 CB GLU A 294 21.091 36.145 3.107 1.00 44.81 C ANISOU 462 CB GLU A 294 5705 5615 5706 -20 -7 -42 C ATOMO 463 CG GLU A 294 21.392 37.439 2.323 1.00 44.23 C ANISOU 463 CG GLU A 294 5601 5551 5653 -69 -25 -17 C ATOMO 464 CD GLU A 294 22.111 38.531 3.140 1.00 44.89 C ANISOU 464 CD GLU A 294 5751 5638 5664 -73 2 -26 C ATOMO 465 OE1 GLU A 294 22.680 39.462 2.517 1.00 44.05 O ANISOU 465 OE1 GLU A 294 5729 5440 5566 -143 73 -204 O ATOMO 466 OE2 GLU A 294 22.116 38.473 4.393 1.00 46.43 O ANISOU 466 OE2 GLU A 294 5939 5975 5726 -261 -49 46 O ATOMO 467 C GLU A 294 21.976 34.325 1.586 1.00 44.97 C ANISOU 467 C GLU A 294 5700 5636 5749 -24 -23 -39 C ATOMO 468 O GLU A 294 22.738 33.611 2.247 1.00 45.23 O ANISOU 468 O GLU A 294 5722 5641 5823 4 -34 -91 O ATOMO 469 N GLN A 295 22.211 34.628 0.315 1.00 45.12 N ANISOU 469 N GLN A 295 5687 5686 5771 -24 0 -36 N ATOMO 470 CA GLN A 295 23.288 33.972 -0.424 1.00 45.81 C ANISOU 470 CA GLN A 295 5768 5739 5898 0 -23 -34 C ATOMO 471 CB GLN A 295 22.770 33.466 -1.772 1.00 45.40 C ANISOU 471 CB GLN A 295 5746 5699 5802 14 -9 -34 C ATOMO 472 CG GLN A 295 21.458 32.654 -1.658 1.00 45.05 C ANISOU 472 CG GLN A 295 5671 5623 5819 25 -48 39 C ATOMO 473 CD GLN A 295 21.627 31.319 -0.930 1.00 50.11 C ANISOU 473 CD GLN A 295 6357 6206 6473 -225 -440 -126 C ATOMO 474 OE1 GLN A 295 22.456 30.493 -1.319 1.00 46.51 O ANISOU 474 OE1 GLN A 295 5639 5846 6.183 244 39 -244 O ATOMO 475 NE2 GLN A 295 20.831 31.098 0.119 1.00 44.53 N ANISOU 475 NE2 GLN A 295 5399 5954 5566 -128 161 -70 N ATOMO 476 C GLN A 295 24.555 34.838 -0.580 1.00 46.43 C ANISOU 476 C GLN A 295 5854 5802 5984 26 12 5 C ATOMO 477 O GLN A 295 24.486 36.076 -0.703 1.00 47.58 O ANISOU 477 O GLN A 295 6015 5902 6161 59 10 -25 O ATOMO 478 N TYR A 296 25.714 34 187 -0.561 1.00 46.40 N ANISOU 478 N TYR A 296 5836 5823 5968 44 40 12 N ATOMO 479 CA TYR A 296 26.988 34 887 -0.681 1.00 46.22 C ANISOU 479 CA TYR A 296 5850 5807 5904 6 0 -13 C ATOMO 480 CB TYR A 296 28.136 33 947 -0.299 1.00 46.54 C ANISOU 480 CB TYR A 296 5879 5805 5997 11 21 -4 c ATOMO 481 CG TYR A 296 28.369 33 809 1.199 1.00 46.10 c ANISOU 481 CG TYR A 296 5899 5814 5802 -12 36 13 c ATOMO 482 CD1 TYR A 296 27.454 33 149 2.015 1.00 46.85 c ANISOU 482 CD1 TYR A 296 5952 5814 6034 41 56 -47 C ATOMO 483 CE1 TYR A 296 27.676 33 022 3.393 1.00 47.39 C ANISOU 483 CE1 TYR A 296 6047 6058 5900 5 -74 8 C ATOMO 484 CZ TYR A 296 28.836 33 551 3.951 1.00 46.56 C ANISOU 484 CZ TYR A 296 5965 5924 5799 -82 4 31 C ATOMO 485 OH TYR A 296 29.080 33.427 5.309 1.00 47.47 O ANISOU 485 OH TYR A 296 6193 5903 5937 -47 -8 -40 O ATOMO 486 CE2 TYR A 296 29.756 34.202 3. 145 1.00 47.62 C ANISOU 486 CE2 TYR A 296 5995 5884 6215 36 51 -59 C ATOMO 487 CD2 TYR A 296 29.520 34.324 1. 786 1.00 45.57 C ANISOU 487 CD2 TYR A 296 5830 5826 5658 6 -68 15 C ATOMO 488 C TYR A 296 27.193 35.501 -2.083 1.00 46.49 C ANISOU 488 C TYR A 296 5907 5803 5951 6 -4 3 C ATOMO 489 O TYR A 296 28.292 35.,440 -2.666 1.00 46.50 O ANISOU 489 O TYR A 296 5897 5779 5989 -14 -14 -11 O ATOMO 490 N ASN A 297 26.119 36..064 -2. .631 1.00 46.88 N ANISOU 490 N ASN A 297 5965 5855 5991 17 -15 -17 N ATOMO 491 CA ASN A 297 26.216 36.949 -3. .792 1.00 47.71 C ANISOU 491 CA ASN A 297 6085 5986 6055 26 -38 -12 C ATOMO 492 CB ASN A 297 26.142 36.169 -5..117 1.00 48.85 C ANISOU 492 CB ASN A 297 6260 6139 6160 64 0 -11 C ATOMO 493 CG ASN A 297 24.947 35.221 -5. .195 1.00 50.92 C ANISOU 493 CG ASN A 297 6460 6440 6445 -63 58 -1 c ATOMO 494 OD1 ASN A 297 24.216 35.028 -4 .220 1.00 52.42 O ANISOU 494 OD1 ASN A 297 6674 6584 6659 87 34 -103 O ATOMO 495 ND2 ASN A 297 24.768 34.605 -6 .370 1.00 56.08 N ANISOU 495 ND2 ASN A 297 7171 7114 7021 -39 -31 -25 N ATOMO 496 C ASN A 297 25.188 38.088 -3 .729 1.00 47.37 C ANISOU 496 C ASN A 297 6034 5962 6003 2 -36 -28 C ATOMO 497 O ASN A 297 24.879 38.733 -4 .748 1.00 47.54 O ANISOU 497 O ASN A 297 6064 5970 6028 -37 -68 -27 O ATOMO 498 N SER A 298 24.679 38.332 -2 .516 1.00 47.02 N ANISOU 498 N SER A 298 5921 5925 6017 5 -15 -17 N ATOMO 499 CA SER A 298 23.797 39.477 -2.220 1.00 46.71 C ANISOU 499 CA SER A 298 5868 5873 6005 -26 -29 0 C ATOMO 500 CB SER A 298 24.415 40.801 -2 .693 1.00 46.68 C ANISOU 500 CB SER A 298 5861 5857 6015 -11 -30 45 C ATOMO 501 OG SER A 298 25.715 40.961 -2.150 1.00 48.13 O ANISOU 501 OG SER A 298 6019 6020 6244 -95 -25 -12 O ATOMO 502 C SER A 298 22.395 39.255 -2.792 1.00 46.18 C ANISOU 502 C SER A 298 5828 5812 5906 -33 -31 13 C ATOMO 503 O SER A 298 21.852 40.082 -3 .545 1.00 46.36 O ANISOU 503 O SER A 298 5846 5850 5918 -31 -40 43 O ATOMO 504 N THR A 299 21.810 38.137 -2 .365 1.00 45.58 N ANISOU 504 N THR A 299 5776 5728 5815 -47 -20 0 N ATOMO 505 CA THR A 299 20.634 37.558 -2 .982 1.00 45.03 C ANISOU 505 CA THR A 299 5757 5632 5719 -42 -23 -30 C ATOMO 506 CB THR A 299 21.118 36.736 -4 .229 1.00 45.29 C ANISOU 506 CB THR A 299 5793 5664 5749 -38 -58 -30 C ATOMO 507 OG1 THR A 299 20.498 37.203 -5 .433 1.00 46.45 O ANISOU 507 OG1 THR A 299 5934 5743 5972 21 -92 -8 O ATOMO 508 CG2 THR A 299 20.931 35.249 -4 .066 1.00 45.09 C ANISOU 508 CG2 THR A 299 5820 5677 5634 -42 -57 -34 C ATOMO 509 C THR A 299 19.994 36.667 -1 .895 1.00 44.73 C ANISOU 509 C THR A 299 5717 5578 5700 -68 -31 -58 C ATOMO 510 O THR A 299 20.734 36.055 -1 103 1.00 44.52 O ANISOU 510 O THR A 299 5722 5570 5623 -99 -47 -90 O ATOMO 511 N TYR A 300 18.656 36.609 -1 809 1.00 44.50 N ANISOU 511 N TYR A 300 5713 5554 5640 -37 1 -53 N ATOMO 512 CA TYR A 300 18.007 35.534 -1 007 1.00 44.78 C ANISOU 512 CA TYR A 300 5706 5632 5674 -53 22 -106 C ATOMO 513 CB TYR A 300 16.841 36.048 -0.117 1.00 45.79 C ANISOU 513 CB TYR A 300 5829 5719 5847 -42 30 -116 C ATOMO 514 CG TYR A 300 17.195 37.233 0. 822 1.00 47.96 C ANISOU 514 CG TYR A 300 6051 6119 6052 4 19 -11 C ATOMO 515 CD1 TYR A 300 17.216 38.547 0. 337 1.00 46.79 C ANISOU 515 CD1 TYR A 300 6033 5674 6069 -83 -3 -132 C ATOMO 516 CE1 TYR A 300 17.531 39.614 1. 158 1.00 47.40 C ANISOU 516 CE1 TYR A 300 6116 6018 5876 -35 4 -148 C ATOMO 517 CZ TYR A 300 17.834 39.387 2. 495 1.00 47.96 C ANISOU 517 CZ TYR A 300 6083 6090 6048 47 -15 45 C ATOMO 518 OH TYR A 300 18.148 40.465 3. 318 1.00 46.29 O ANISOU 518 OH TYR A 300 6171 5754 5662 -44 -150 -180 O ATOMO 519 CE2 TYR A 300 17.804 38.096 3. 006 1.00 47.39 C ANISOU 519 CE2 TYR A 300 6071 5825 6109 49 -44 -39 C ATOMO 520 CD2 TYR A 300 17.490 37.029 2 170 1.00 46.41 C ANISOU 520 CD2 TYR A 300 5977 5849 5807 -92 -119 -95 c ATOMO 521 C TYR A 300 17.585 34.279 -1 817 1.00 44.23 C ANISOU 521 C TYR A 300 5614 5568 5621 -41 28 -39 C ATOMO 522 O TYR A 300 17.452 34.291 -3 056 1.00 44.14 O ANISOU 522 O TYR A 300 5567 5606 5598 -57 27 -81 O ATOMO 523 N ARG A 301 17.383 33.193 -1 085 1.00 43.82 N ANISOU 523 N ARG A 301 5560 5519 5571 14 -13 -43 N ATOMO 524 CA ARG A 301 16.918 31.936 -1 647 1.00 43.57 C ANISOU 524 CA ARG A 301 5505 5506 5542 -3 -7 -33 C ATOMO 525 CB ARG A 301 18.004 30.864 -1 .516 1.00 43.36 C ANISOU 525 CB ARG A 301 5504 5467 5501 15 -47 -49 C ATOMO 526 CG ARG A 301 17.592 29.478 -2.000 1.00 44.07 C ANISOU 526 CG ARG A 301 5519 5525 5699 -32 -46 -8 C ATOMO 527 CD ARG A 301 18.816 28.611 -2.243 1.00 44.34 C ANISOU 527 CD ARG A 301 5415 5556 5873 -21 -27 -130 C ATOMO 528 NE ARG A 301 18.503 27.319 -2 .846 1.00 45.93 N ANISOU 528 NE ARG A 301 5462 6031 5957 106 -48 -104 N ATOMO 529 CZ ARG A 301 18.153 26.232 -2 .170 1.00 42.24 C ANISOU 529 CZ ARG A 301 5643 5431 4975 -112 61 -40 C ATOMO 530 NH1 ARG A 301 18.055 26.272 -0 .844 1.00 47.72 N ANISOU 530 NH1 ARG A 301 5737 6114 6280 8 -101 -45 N ATOMO 531 NH2 ARG A 301 17.891 25.102 -2.821 1.00 46.14 N ANISOU 531 NH2 ARG A 301 5495 6132 5903 156 108 67 N ATOMO 532 C ARG A 301 15.674 31.523 -0.876 1.00 43.64 C ANISOU 532 C ARG A 301 5540 5535 5503 1 -17 -7 C ATOMO 533 O ARG A 301 15.705 31.440 0 .362 1.00 44.01 O ANISOU 533 O ARG A 301 5675 5632 5413 52 3 7 O ATOMO 534 N VAL A 302 14.574 31.295 -1 .598 1.00 43.14 N ANISOU 534 N VAL A 302 5467 5424 5499 -21 -5 -6 N ATOMO 535 CA VAL A 302 13.342 30.854 -0 .956 1.00 42.72 C ANISOU 535 CA VAL A 302 5403 5315 5512 -37 8 -17 C ATOMO 536 CB VAL A 302 12.244 31.957 -0 .857 1.00 43.01 C ANISOU 536 CB VAL A 302 5439 5350 5551 -47 13 -13 C ATOMO 537 CG1 VAL A 302 11.403 31.739 0 .404 1.00 42.56 C ANISOU 537 CG1 VAL A 302 5310 5394 5466 -110 -2 -109 C ATOMO 538 CG2 VAL A 302 12.860 33.368 -0 .830 1.00 43.35 C ANISOU 538 CG2 VAL A 302 5471 5351 5646 -38 32 -2 C ATOMO 539 C VAL A 302 12.803 29.606 -1 643 1.00 42.39 C ANISOU 539 C VAL A 302 5389 5308 5407 -33 -5 -28 C ATOMO 540 O VAL A 302 12.657 29.560 -2 863 1.00 41.88 O ANISOU 540 O VAL A 302 5326 5264 5320 -2 -39 -30 O ATOMO 541 N VAL A 303 12.529 28.603 -0.810 1.00 42.33 N ANISOU 541 N VAL A 303 5387 5251 5445 -64 -2 -41 N ATOMO 542 CA VAL A 303 12.107 27.279 -1 .230 1.00 42.18 C ANISOU 542 CA VAL A 303 5328 5270 5427 -26 30 -33 C ATOMO 543 CB VAL A 303 13.036 26.184 -0 .605 1.00 42.24 C ANISOU 543 CB VAL A 303 5310 5283 5454 -22 24 -23 C ATOMO 544 CG1 VAL A 303 12.534 24.790 -0 .910 1.00 41.59 C ANISOU 544 CG1 VAL A 303 5214 5202 5384 -38 86 -28 C ATOMO 545 CG2 VAL A 303 14.501 26.353 -1 .073 1.00 42.85 C ANISOU 545 CG2 VAL A 303 5375 5362 5542 -30 59 -55 C ATOMO 546 C VAL A 303 10.674 27.041 -0 .748 1.00 41.94 C ANISOU 546 C VAL A 303 5300 5258 5377 -12 27 -38 C ATOMO 547 O VAL A 303 10.364 27.277 0 .424 1.00 42.19 O ANISOU 547 O VAL A 303 5391 5257 5381 11 76 22 O ATOMO 548 N SER A 304 9.801 26.596 -1 .648 1.00 41.73 N ANISOU 548 N SER A 304 5238 5240 5375 4 30 -44 N ATOMO 549 CA SER A 304 8.505 26.065 -1 .231 1.00 41.38 C ANISOU 549 CA SER A 304 5196 5202 5323 -26 5 -31 C ATOMO 550 CB SER A 304 7.339 26.861 -1 .831 1.00 41.38 C ANISOU 550 CB SER A 304 5184 5211 5327 -22 -8 -54 C ATOMO 551 OG SER A 304 6.152 26.629 -1 076 1.00 40.98 O ANISOU 551 OG SER A 304 5221 5152 5196 20 16 -154 O ATOMO 552 C SER A 304 8.391 24.579 -1 579 1.00 41.13 C ANISOU 552 C SER A 304 5166 5191 5269 -40 12 -60 C ATOMO 553 O SER A 304 8.646 24.190 -2 718 1.00 40.85 O ANISOU 553 O SER A 304 5073 5198 5250 -55 -3 -38 O ATOMO 554 N VAL A 305 7.992 23.779 -0 583 1.00 41.00 N ANISOU 554 N VAL A 305 5201 5158 5219 -43 -30 -25 N ATOMO 555 CA VAL A 305 7.796 22.329 -0.709 1.00 40.98 C A ISOU 555 CA VAL A 305 5182 5183 5204 -45 -18 -47 C ATOMO 556 CB VAL A 305 8.559 21.550 0.407 1.00 40.91 C ANISOU 556 CB VAL A 305 5162 5158 5221 -31 -36 -13 C ATOMO 557 CG1 VAL A 305 8.340 20.053 0.282 1.00 40.60 C ANISOU 557 CG1 VAL A 305 5114 5164 5145 -82 -121 -82 C ATOMO 558 CG2 VAL A 305 10.044 21.845 0.363 1.00 41.19 C ANISOU 558 CG2 VAL A 305 5200 5121 5326 -85 -25 -36 C ATOMO 559 C VAL A 305 6.306 21.921 -0.660 1.00 41.10 C ANISOU 559 C VAL A 305 5186 5211 5215 -36 -14 -73 C ATOMO 560 O VAL A 305 5.573 22.260 0.293 1..00 40.73 O ANISOU 560 O VAL A 305 5174 5103 5197 -37 9 -126 O ATOMO 561 N LEU A 306 5.887 21.153 -1.666 1..00 41.07 N ANISOU 561 N LEU A 306 5191 5259 5153 -10 -16 -73 N ATOMO 562 CA LEU A 306 4.535 20.592 -1.719 1..00 40.99 C ANISOU 562 CA LEU A 306 5188 5219 5166 -16 -40 -36 C ATOMO 563 CB LEU A 306 3.748 21.148 -2.918 1..00 41.06 C ANISOU 563 CB LEU A 306 5204 5163 5234 -12 -54 -29 C ATOMO 564 CG LEU A 306 2.268 20.728 -3.008 1.00 40.75 C ANISOU 564 CG LEU A 306 5172 5155 5154 53 -5 -10 C ATOMO 565 CD1 LEU A 306 1.434 21.455 -1.976 1.00 40.43 C ANISOU 565 CD1 LEU A 306 5289 5183 4888 -31 -17 50 C ATOMO 566 CD2 LEU A 306 1.705 20.962 -4.394 1.00 40.87 C ANISOU 566 CD2 LEU A 306 5213 5177 5135 -17 -41 -45 C ATOMO 567 C LEU A 306 4.544 19.069 -1.779 1.00 41.08 C ANISOU 567 C LEU A 306 5177 5234 5197 40 -34 -43 C ATOMO 568 O LEU A 306 5.110 18.481 -2.693 1.00 40.95 O ANISOU 568 O LEU A 306 5163 5223 5171 14 -57 -46 O ATOMO 569 N THR A 307 3.895 18.438 -0.807 1.00 41.54 N ANISOU 569 N THR A 307 5217 5276 5288 40 -35 -55 N ATOMO 570 CA THR A 307 3.718 17.004 -0.828 1.00 42.10 C ANISOU 570 CA THR A 307 5268 5362 5363 50 -25 -59 C ATOMO 571 CB THR A 307 3.238 16.490 0.534 1.00 42.33 C ANISOU 571 CB THR A 307 5295 5394 5391 46 -26 -62 C ATOMO 572 OG1 THR A 307 4.261 16.717 1.510 1.00 43.20 O ANISOU 572 OG1 THR A 307 5387 5546 5479 27 -27 -143 O ATOMO 573 CG2 THR A 307 2.943 15.007 0.486 1.00 42.37 C ANISOU 573 CG2 THR A 307 5388 5344 5365 25 -24 -57 C ATOMO 574 C THR A 307 2.738 16.624 -1.946 1.00 42.61 C ANISOU 574 C THR A 307 5343 5394 5449 60 -18 -56 C ATOMO 575 O THR A 307 1.695 17.279 -2.138 1.00 43.31 O ANISOU 575 O THR A 307 5405 5457 5593 122 -38 -50 O ATOMO 576 N VAL A 308 3.092 15.590 -2.705 1.00 41.88 N ANISOU 576 N VAL A 308 5290 5285 5337 54 -5 -77 N ATOMO 577 CA VAL A 308 2.175 15.039 -3.688 1.00 41.32 C ANISOU 577 CA VAL A 308 5239 5211 5250 40 -12 -42 C ATOMO 578 CB VAL A 308 2.772 15.033 -5.136 1.00 41.12 C ANISOU 578 CB VAL A 308 5250 5192 5180 37 -40 -41 C ATOMO 579 CG1 VAL A 308 3.194 16.439 -5.532 1.00 40.83 C ANISOU 579 CG1 VAL A 308 5238 5210 5064 -11 -14 -71 C ATOMO 580 CG2 VAL A 308 3.956 14.098 -5.273 1.00 40.49 C ANISOU 580 CG2 VAL A 308 5160 5093 5131 11 -79 -30 C ATOMO 581 C VAL A 308 1.678 13.663 -3.230 1.00 41.17 C ANISOU 581 C VAL A 308 5209 5209 5223 41 -23 -66 C ATOMO 582 O VAL A 308 2.346 12.959 -2.475 1.00 40.78 O ANISOU 582 O VAL A 308 5262 5123 5107 24 -11 -56 O ATOMO 583 N LEU A 309 0.480 13.302 -3.665 1.00 40.99 N ANISOU 583 N LEU A 309 5170 5164 5238 33 -1 -65 N ATOMO 584 CA LEU A 309 -0.019 11.972 -3.414 1.00 40.25 C ANISOU 584 CA LEU A 309 5082 5101 5109 31 -12 -14 C ATOMO 585 CB LEU A 309 -1.545 11.939 -3.388 1.00 40.44 C ANISOU 585 CB LEU A 309 5114 5151 5098 6 -34 -12 C ATOMO 586 CG LEU A 309 -2.214 12.728 -2.261 1.00 41.27 C ANISOU 586 CG LEU A 309 5230 5236 5213 32 -21 0 C ATOMO 587 CD1 LEU A 309 -3.692 12.898 -2.547 1.00 42.21 C ANISOU 587 CD1 LEU A 309 5289 5393 5355 41 -69 23 C ATOMO 588 CD2 LEU A 309 -2.011 12.051 -0.896 1.00 42.35 C ANISOU 588 CD2 LEU A 309 5357 5365 5366 17 -14 3 C ATOMO 589 C LEU A 309 0.561 10.988 -4.429 1.00 39.55 C ANISOU 589 C LEU A 309 4964 5033 5027 -2 -36 -27 C ATOMO 590 O LEU A 309 0.800 11.310 -5.591 1.00 38.60 O ANISOU 590 O LEU A 309 4763 4962 4938 33 -16 -94 O ATOMO 591 N HIS A 310 0.816 9.795 -3.922 1.00 39.07 N ANISOU 591 N HIS A 310 4906 4954 4982 4 -10 -70 N ATOMO 592 CA HIS A 310 1.381 8.692 -4.663 1.00 38.71 C ANISOU 592 CA HIS A 310 4886 4959 4862 -8 4 -35 c ATOMO 593 CB HIS A 310 1.371 7.441 -3.778 1.00 37.81 C ANISOU 593 CB HIS A 310 4801 4808 4757 22 -8 -14 C ATOMO 594 CG HIS A 310 1.655 6.180 -4.519 1.00 36.41 C ANISOU 594 CG HIS A 310 4652 4701 4480 -32 -3 59 C ATOMO 595 ND1 HIS A 310 2.932 5.690 -4.685 1.00 34.00 N ANISOU 595 ND1 HIS A 310 4396 4421 4101 -33 -38 -4 N ATOMO 596 CE1 HIS A 310 2.880 4.568 -5.376 1.00 34.94 C ANISOU 596 CE1 HIS A 310 4527 4316 4434 -5 -4 140 C ATOMO 597 NE2 HIS A 310 1.614 4.314 -5.667 1.00 34.85 N ANISOU 597 NE2 HIS A 310 4517 4245 4480 61 16 113 N ATOMO 598 CD2 HIS A 310 0.829 5.307 -5.140 1.00 35.34 C ANISOU 598 CD2 HIS A 310 4432 4621 4373 9 62 95 C ATOMO 599 C HIS A 310 0.644 8.427 -5.973 1.00 38.70 C ANISOU 599 C HIS A 310 4902 4960 4840 -15 -27 -46 C ATOMO 600 O HIS A 310 1.277 8.305 -7.027 1.00 37.82 O ANISOU 600 O HIS A 310 4807 4841 4722 -36 -23 -44 O ATOMO 601 N GLN A 311 -0.684 8.335 -5.883 1.00 39.22 N ANISOU 601 N GLN A 311 5005 5002 4894 -3 19 -72 N ATOMO 602 CA GLN A 311 -1.541 8.052 -7.037 1.00 39.83 C ANISOU 602 CA GLN A 311 5068 5069 4997 4 -14 -53 C -2.941 7.575 -6.615 1.00 39.64 ANISOU 603 CB GLN A 311 5050 5101 4910 8 -4 -67 C ATOMO 604 CG GLN A 311 -3.814 8.592 -5.859 1.00 41.81 c ANISOU 604 CG GLN A 311 5349 5334 5203 34 4 3 C ATOMO 605 CD GLN A 311 -3.637 8.590 -4.319 1.00 44.78 C ANISOU 605 CD GLN A 311 5943 5685 5387 -47 37 -57 C ATOMO 606 OE1 GLN A 311 -2.590 8.195 -3.771 1.00 43.08 O ANISOU 606 OE1 GLN A 311 5380 5867 5120 97 -37 -211 O ATOMO 607 NE2 GLN A 311 -4.681 9.036 -3.622 1.00 43.39 N ANISOU 607 NE2 GLN A 311 5563 5667 5256 ' 170 135 -45 N ATOMO 608 C GLN A 311 -1.594 9.229 -7.995 1.00 39.90 C ANISOU 608 C GLN A 311 5049 5064 5045 -16 -7 -58 C ATOMO 609 O GLN A 311 -1.555 9.046 -9.229 1.00 40.38 O ANISOU 609 O GLN A 311 5051 5083 5207 -72 45 -44 O ATOMO 610 N ASP A 312 -1.642 10.431 -7.425 1.00 39.64 N ANISOU 610 N ASP A 312 5014 5048 4998 -22 -10 -70 N ATOMO 611 CA ASP A 312 -1.723 11.662 -8.196 1.00 39.61 C A ISOU 611 CA ASP A 312 5003 5033 5013 -9 -1 -80 C ATOMO 612 CB ASP A 312 -1.841 12.891 -7.276 1.00 39.79 C ANISOU 612 CB ASP A 312 5039 5090 4987 -8 -26 -109 C ATOMO 613 CG ASP A 312 -3.202 13 029 -6.639 1.00 40.70 C ANISOU 613 CG ASP A 312 5104 5172 5186 -39 18 -131 C ATOMO 614 OD1 ASP A 312 -4.081 12 167 -6.863 1.00 42.10 O ANISOU 614 OD1 ASP A 312 5286 5405 5303 51 91 -230 O ATOMO 615 OD2 ASP A 312 -3.389 14.010 -5.888 1.00 43.00. O ANISOU 615 OD2 ASP A 312 5297 5347 5692 -20 69 1 O ATOMO 616 C ASP A 312 -0.518 11.833 -9.091 1.00 38.73 C ANISOU 616 C ASP A 312 4902 4899 4914 11 12 -121 C ATOMO 617 O ASP A 312 -0.655 12.241 -10.251 1.00 39.28 O ANISOU 617 O ASP A 312 4946 4963 5014 -3 85 -129 O ATOMO 618 N TRP A 313 0.656 11.537 -8.543 1.00 37.61 N ANISOU 618 N TRP A 313 4772 4760 4758 -8 10 -110 N ATOMO 619 CA TRP A 313 1.907 11.678 -9.279 1.00 36.85 C ANISOU 619 CA TRP A 313 4619 4730 4649 -7 -60 -88 C ATOMO 620 CB TRP A 313 3.129 11.487 -8.357 1.00 36.13 C ANISOU 620 CB TRP A 313 4550 4680 4494 -8 -75 -20 C ATOMO 621 CG TRP A 313 4.441 11.751 -9.093 1.00 35.34 C ANISOU 621 CG TRP A 313 4466 4697 4264 43 -176 -103 C ATOMO 622 CD1 TRP A 313 5.343 10.827 -9.512 1.00 35.07 C ANISOU 622 CD1 TRP A 313 4501 4715 4109 -17 -197 -29 C ATOMO 623 NE1 TRP A 313 6.406 11.442 -10.135 1.00 34.18 N ANISOU 623 NE1 TRP A 313 4463 4332 4191 -11 -148 20 N ATOMO 624 CE2 TRP A 313 6.187 12.796 -10.146 1.00 35.05 C ANISOU 624 CE2 TRP A 313 4446 4707 4162 -75 -196 -97 C ATOMO 625 CD2 TRP A 313 4.954 13.028 -9.497 1.00 33.56 C A ISOU 625 CD2 TRP A 313 4353 4503 3893 -30 -139 4 C ATOMO 626 CE3 TRP A 313 4.501 14.348 -9.354 1.00 32.76 C ANISOU 626 CE3 TRP A 313 4229 4481 3734 0 -202 82 C ATOMO 627 CZ3 TRP A 313 5.279 15.377 -9.862 1.00 35.07 C ANISOU 627 CZ3 TRP A 313 4469 4665 4192 -3 -238 41 C ATOMO 628 CH2 TRP A 313 6.493 15.113 -10.532 1.00 34.15 C ANISOU 628 CH2 TRP A 313 4324 4418 4233 -22 -142 86 C ATOMO 629 CZ2 TRP A 313 6.959 13.833 -10.685 1.00 35.30 C ANISOU 629 CZ2 TRP A 313 4442 4682 4288 -11 -136 -64 C ATOMO 630 C TRP A 313 1.998 10..709 -10.457 1.00 36.14 C ANISOU 630 C TRP A 313 4477 4717 4537 0 -78 -55 C ATOMO 631 O TRP A 313 2.313 11..107 -11.562 1.00 35.50 O ANISOU 631 O TRP A 313 4328 4708 4450 45 -104 -91 O ATOMO 632 N LEU A 314 1.765 9..438 -10.157 1.00 35.58 N ANISOU 632 N LEU A 314 4401 4613 4503 -13 -76 -52 N ATOMO 633 CA LEU A 314 1.729 8.348 -11.105 1.00 35.56 C ANISOU 633 CA LEU A 314 4445 4567 4497 28 5 -28 c ATOMO 634 CB LEU A 314 1.574 7.016 -10.361 1.00 35.07 C ANISOU 634 CB LEU A 314 4405 4507 4410 -12 18 -47 C ATOMO 635 CG LEU A 314 2.750 6.390 -9.621 1.00 34.91 C ANISOU 635 CG LEU A 314 4444 4487 4331 -14 -28 -14 C ATOMO 636 CD1 LEU A 314 2.290 5.110 -8.980 1.00 35.56 C ANISOU 636 CD1 LEU A 314 4432 4609 4471 17 -104 -47 C ATOMO 637 CD2 LEU A 314 3.922 6.091 -10.522 1.00 34.75 C ANISOU 637 CD2 LEU A 314 4491 4405 4306 41 -118 -7 C ATOMO 638 C LEU A 314 0.618 8.461 -12.146 1.00 35.53 C ANISOU 638 C LEU A 314 4500 4504 4495 -33 -16 -32 C ATOMO 639 O LEU A 314 0.782 7.941 -13.236 1.00 35.75 O ANISOU 639 O LEU A 314 4455 4563 4564 -36 -3 17 O ATOMO 640 N ASN A 315 -0.504 9.110 -11.802 1.00 35.21 N ANISOU 640 N ASN A 315 4478 4419 4481 -76 -52 -36 N ATOMO 641 CA ASN A 315 -1.580 9.402 -12.763 1.00 35.05 C ANISOU 641 CA ASN A 315 4531 4373 4411 -33 2 -57 C ATOMO 642 CB ASN A 315 -2.958 9.466 -12.074 1.00 35.00 C ANISOU 642 CB ASN A 315 4513 4349 4433 -40 -16 -16 C ATOMO 643 CG ASN A 315 -3.500 8.086 -11.725 1.00 35.48 C ANISOU 643 CG ASN A 315 4451 4447 4582 -119 -42 -126 C ATOMO 644 OD1 ASN A 315 -3.252 7.128 -12.445 1.00 33.89 O ANISOU 644 OD1 ASN A 315 4226 4285 4363 -276 -266 -225 O ATOMO 645 ND2 ASN A 315 -4.209 7.977 -10.601 1.00 34.22 N ANISOU 645 ND2 ASN A 315 4214 4375 4410 -223 34 -77 N ATOMO 646 C ASN A 315 -1.379 10.647 -13.620 1.00 34.87 C ANISOU 646 C ASN A 315 4516 4388 4343 -23 1 -67 C ATOMO 647 O ASN A 315 -2.321 11.112 -14.237 1.00 34.63 O ANISOU 647 O ASN A 315 4549 4319 4289 -30 41 -65 O ATOMO 648 N GLY A 316 -0.171 11.197 -13.639 1.00 35.22 N ANISOU 648 N GLY A 316 4517 4502 4360 6 3 -37 · N ATOMO 649 CA GLY A 316 0.165 12.331 -14.516 1.00 35.71 C ANISOU 649 CA GLY A 316 4494 4573 4500 -5 -1 -46 C ATOMO 650 C GLY A 316 -0.397 13 ,709 -14.206 1.00 35.78 C ANISOU 650 C GLY A 316 44S7 4612 4516 -28 -42 -50 C ATOMO 651 O GLY A 316 -0.366 14.597 -15.058 1.00 35.56 O ANISOU 651 O GLY A 316 4332 4654 4522 -7 -66 -97 O ATOMO 652 N LYS A 317 -0.902 13.890 -12.991 1.00 36.31 N ANISOU 652 N LYS A 317 4528 4698 4570 -30 -42 -59 N ATOMO 653 CA LYS A 317 -1.315 15.203 -12.493 00 37.07 C ANISOU 653 CA LYS A 317 4699 4780 4606 -7 -28 -47 C ATOMO 654 CB LYS A 317 -1.755 15.110 -11.031 00 37.28 C ANISOU 654 CB LYS A 317 4696 4803 4663 -25 -9 -80 C ATOMO 655 CG LYS A 317 -3.033 14.325 -10.813 00 38.63 C ANISOU 655 CG LYS A 317 4886 4905 4884 -49 -2 -35 C ATOMO 656 CD LYS A 317 -3.784 14.865 -9.616 00 39.92 C ANISOU 656 CD LYS A 317 4984 5172 5010 19 65 -11 C ATOMO 657 CE LYS A 317 -5.138 14.188 -9.434 00 40.77 C ANISOU 657 CE LYS A 317 5161 5227 5100 116 79 -35 C ATOMO 658 NZ LYS A 317 -6.015 15.042 -8.572 00 41.78 N ANISOU 658 NZ LYS A 317 5263 5525 5086 124 26 96 N ATOMO 659 C LYS A 317 -0.180 16.214 -12.629 00 37.17 C ANISOU 659 C LYS A 317 4747 4823 4551 -27 -28 -80 C ATOMO 660 O LYS A 317 0.980 15.859 -12.440 00 37.06 O ANISOU 660 O LYS A 317 4756 4804 4520 -34 84 -155 O ATOMO 661 N GLU A 318 -0.525 17.462 -12.941 00 37.60 N ANISOU 661 N GLU A 318 4848 4817 4621 -12 -30 -99 N ATOMO 662 CA GLU A 318 0.452 18..519 -13.238 00 40.15 C ANISOU 662 CA GLU A 318 5164 5032 5058 -54 -30 -117 C ATOMO 663 CB GLU A 318 0.052 19.263 -14.523 .00 39.10 C ANISOU 663 CB GLU A 318 5034 4963 4859 -60 -36 -45 C ATOMO 664 CG GLU A 318 0.271 18.492 -15.799 .00 41.10 C ANISOU 664 CG GLU A 318 5181 5159 5275 -19 9 -184 C ATOMO 665 CD GLU A 318 0.118 19.357 -17.031 .00 38.29 C ANISOU 665 CD GLU A 318 4479 5157 4911 107 25 128 C ATOMO 666 OE1 GLU A 318 1.126 19.619 -17.700 .00 46.87 O ANISOU 666 OE1 GLU A 318 6088 5866 5854 -27 -89 -299 O ATOMO 667 OE2 GLU A 318 -0.997 19.815 -17.354 00 46.71 O ANISOU 667 OE2 GLU A 318 6297 5852 5598 -240 197 -211 O ATOMO 668 C GLU A 318 0.583 19.530 -12.092 00 38.57 C ANISOU 668 C GLU A 318 4938 4896 4818 -31 -53 -85 C ATOMO 669 O GLU A 318 -0.425 20.012 -11.578 00 38.13 O ANISOU 669 O GLU A 318 4923 4789 4774 -39 -135 -122 O ATOMO 670 N TYR A 319 1.821 19.851 -11.705 00 38.78 N ANISOU 670 N TYR A 319 4998 4868 4867 -48 -21 -87 N ATOMO 671 CA TYR A 319 2.079 20.701 -10.529 00 39.04 C ANISOU 671 CA TYR A 319 5000 4916 4916 -26 -53 -60 C ATOMO 672 CB TYR A 319 2.884 19.937 -9.476 00 38.84 C ANISOU 672 CB TYR A 319 4972 4905 4879 -26 -72 -93 C ATOMO 673 CG TYR A 319 2.172 18.689 -8.973 00 37.38 C ANISOU 673 CG TYR A 319 4832 4650 4719 -86 32 -11 C ATOMO 674 CD1 TYR A 319 2.258 17.460 -9.673 00 38.12 C ANISOU 674 CD1 TYR A 319 4829 4759 4893 7 -6 -24 c ATOMO 675 CE1 TYR A 319 1.593 16.320 -9.215 00 36.71 C ANISOU 675 CE1 TYR A 319 4646 4520 4781 -18 -157 -183 C ATOMO 676 CZ TYR A 319 0.834 16.411 -8.065 00 36.25 c ANISOU 676 CZ TYR A 319 4621 4505 4646 -178 -20 -20 C ATOMO 677 OH TYR A 319 0.166 15.322 -7.573 00 39.25 O ANISOU 677 OH TYR A 319 5143 5009 4759 54 -255 -66 O ATOMO 678 CE2 TYR A 319 0.725 17.612 -7.374 00 37.40 C ANISOU 678 CE2 TYR A 319 4648 4766 4794 39 -30 -82 C ATOMO 679 CD2 TYR A 319 1.389 18.736 -7.836 00 36.44 C ANISOU 679 CD2 TYR A 319 4701 4522 4622 68 -116 -138 C ATOMO 680 C TYR A 319 2.745 22.028 -10.889 00 39.24 C ANISOU 680 C TYR A 319 5014 4957 4938 -40 -57 -97 C ATOMO 681 O TYR A 319 3.918 22.071 -11.266 1.00 39.11 O ANISOU 681 O TYR A 319 4977 4930 4951 -22 -85 -124 O ATOMO 682 N LYS A 320 1.961 23.101 -10.790 1.00 39.64 N ANISOU 682 N LYS A 320 5077 5012 4970 -1 -53 -107 N ATOMO 683 CA LYS A 320 2.398 24.454 -11.109 1.00 40.77 C ANISOU 683 CA LYS A 320 5193 5147 5150 -23 -13 -85 C ATOMO 684 CB LYS A 320 1.310 25.173 -11.921 1.00 40.27 C ANISOU 684 CB LYS A 320 5129 5063 5107 21 -64 -45 C ATOMO 685 CG LYS A 320 1.704 26.535 -12.547 1.00 46.09 C ANISOU 685 CG LYS A 320 6665 5282 5563 -484 537 -253 C ATOMO 686 CD LYS A 320 0.609 27.084 -13.492 1.00 38.31 C ANISOU 686 CD LYS A 320 4594 5097 4864 287 -177 117 C ATOMO 687 CE LYS A 320 -0.733 27.374 -12.771 1.00 47.84 C ANISOU 687 CE LYS A 320 6419 5509 6250 -354 338 -151 C ATOMO 688 NZ LYS A 320 -1.892 27.744 -13.695 1.00 37.09 N ANISOU 688 NZ LYS A 320 4077 5276 4737 675 -795 197 N ATOMO 689 C LYS A 320 2.759 25.250 -9.840 1.00 40.86 C ANISOU 689 C LYS A 320 5229 5123 5173 18 -10 -35 C ATOMO 690 O LYS A 320 2.030 25.259 -8.843 1.00 40.72 O ANISOU 690 O LYS A 320 5252 5105 5111 38 -28 -57 O ATOMO 691 N CYS A 321 3.915 25.888 -9.894 1.00 41.68 N ANISOU 691 N CYS A 321 5350 5199 5287 18 -5 -32 N ATOMO 692 CA CYS A 321 4.373 26.788 -8.860 1.00 42.24 C ANISOU 692 CA CYS A 321 5408 5260 5381 31 1 -18 C ATOMO 693 CB CYS A 321 5.763 26.361 -8.379 1.00 42.35 C ANISOU 693 CB CYS A 321 5400 5274 5415 9 -9 -35 C ATOMO 694 SG CYS A 321 6.500 27.426 -7.128 1.00 42.58 S ANISOU 694 SG CYS A 321 5484 5270 5421 50 -14 -77 S ATOMO 695 C CYS A 321 4.411 28.191 -9.472 00 42 81 C ANISOU 695 C CYS A 321 5475 5310 5480 8 16 -9 C ATOMO 696 O CYS A 321 5.156 28. 422 -10.460 00 42 92 O ANISOU 696 O CYS A 321 5461 5316 5528 24 61 -9 O ATOMO 697 N LYS A 322 3.570 29. 085 -8.924 00 42.76 N ANISOU 697 N LYS A 322 5459 5348 5439 17 33 -26 N ATOMO 698 CA LYS A 322 3.565 30. 511 -9.287 00 42.86 C ANISOU 698 CA LYS A 322 5437 5374 5471 56 -15 9 C ATOMO 699 CB LYS A 322 2.147 31.078 -9.435 00 43.24 C ANISOU 699 CB LYS A 322 5551 5409 5468 25 18 -36 C ATOMO 700 CG LYS A 322 2.064 32.254 -10.426 00 44.33 C ANISOU 700 CG LYS A 322 5694 5515 5634 14 -35 -25 C ATOMO 701 CD LYS A 322 0.634 32.831 -10.569 00 45.76 C ANISOU 701 CD LYS A 322 5744 5672 5970 -51 35 -111 C ATOMO 702 CE LYS A 322 0.468 33.530 -11.933 00 40.52 C ANISOU 702 CE LYS A 322 4781 4752 5862 1225 -190 243 C ATOMO 703 NZ LYS A 322 -0.714 34.463 -12.029 00 52.37 N ANISOU 703 NZ LYS A 322 7085 6923 5891 -760 97 -81 N ATOMO 704 C LYS A 322 4.352 31.332 -8.284 .00 42.99 C ANISOU 704 C LYS A 322 5456 5381 5497 1 30 0 C ATOMO 705 O LYS A 322 4.196 31.206 -7.065 .00 42.73 O ANISOU 705 O LYS A 322 5391 5361 5482 50 28 -24 O ATOMO 706 N VAL A 323 5.220 32.172 -8.823 .00 43.35 N ANISOU 706 N VAL A 323 5501 5422 5545 -16 -11 12 N ATOMO 707 CA VAL A 323 6.125 32..979 -8.025 .00 42.78 C ANISOU 707 CA VAL A 323 5428 5354 5472 -14 -20 -20 C ATOMO 708 CB VAL A 323 7.586 32.528 -8.212 .00 42.83 C ANISOU 708 CB VAL A 323 5397 5384 5491 -25 -20 12 c ATOMO 709 CG1 VAL A 323 8.557 33.587 -•7.703 1.00 41.95 C ANISOU 709 CG1 VAL A 323 5327 5304 5305 17 -15 -62 C ATOMO 710 CG2 VAL A 323 7.811 31.192 --7.509 1.00 43.44 C ANISOU 710 CG2 VAL A 323 5415 5409 5681 24 -7 -27 C ATOMO 711 C VAL A 323 5.942 34.423 --8.432 1.00 42.81 C ANISOU 711 C VAL A 323 5441 5360 5463 -14 -20 -44 C ATOMO 712 O VAL A 323 6.102 34.796 -9.621 1.00 42.57 O ANISOU 712 O VAL A 323 5408 5357 5408 -89 29 -68 O ATOMO 713 N SER A 324 5.597 35.219 · -7.421 1.00 42.64 N ANISOU 713 N SER A 324 5419 5369 5414 -2 -9 -59 N ATOMO 714 CA SER A 324 5.207 36.605 -7.584 1.00 42.51 C ANISOU 714 CA SER A 324 5426 5317 5408 -11 -3 -71 C ATOMO 715 CB SER A 324 3.750 36.783 -7.154 1.00 42.22 C ANISOU 715 CB SER A 324 5364 5281 5394 16 -26 -72 C ATOMO 716 OG SER A 324 2.864 36.502 -8.216 1.00 41.92 O ANISOU 716 OG SER A 324 5332 5206 5387 19 53 -145 O ATOMO 717 C SER A 324 6.104 37.522 -6.760 1.00 43.07 c ANISOU 717 C SER A 324 5479 5404 5481 -32 -10 -59 C ATOMO 718 O SER A 324 6.352 37.271 -5.575 1.00 42.70 O ANISOU 718 O SER A 324 5452 5352 5420 -41 -68 -72 O ATOMO 719 N ASN A 325 6.571 38.596 -7.396 1.00 44.33 N ANISOU 719 N ASN A 325 5633 5581 5628 -43 19 -83 N ATOMO 720 CA ASN A 325 7.437 39.570 -6.724 1.00 45.40 C ANISOU 720 CA ASN A 325 5802 5719 5727 -31 13 -62 C ATOMO 721 CB ASN A 325 8.886 39.074 -6.668 1.00 45.78 C ANISOU 721 CB ASN A 325 5807 5817 5767 -17 24 -48 C ATOMO 722 CG ASN A 325 9.749 39.887 -5.724 1.00 47.87 C ANISOU 722 CG ASN A 325 6012 6087 6088 -56 -15 -90 C ATOMO 723 OD1 ASN A 325 9.252 40.493 -4.758 00 51.73 O ANISOU 723 OD1 ASN A 325 6606 6613 6436 43 24 -165 O ATOMO 724 ND2 ASN A 325 11.055 39.898 -5.986 00 49.10 N ANISOU 724 ND2 ASN A 325 6088 6256 6312 27 72 40 N ATOMO 725 C ASN A 325 7.379 40.924 -7.396 00 45.82 C ANISOU 725 C ASN A 325 5904 5749 5757 -16 29 -60 C ATOMO 726 O ASN A 325 7.568 41.032 -8.624 00 46.11 O ANISOU 726 O ASN A 325 5966 5817 5735 8 24 -72 O ATOMO 727 N LYS A 326 7.106 41.945 -6.581 00 46.40 N ANISOU 727 N LYS A 326 5999 5832 5798 6 54 -106 N ATOMO 728 CA LYS A 326 7.088 43.359 -6.999 00 46.62 C ANISOU 728 CA LYS A 326 6011 5855 5844 -28 75 -54 C ATOMO 729 CB LYS A 326 6.596 44..250 -5.847 00 46.66 C ANISOU 729 CB LYS A 326 6026 5795 5908 -14 78 -87 C ATOMO 730 CG LYS A 326 5.693 43..541 -4.808 00 46.45 C ANISOU 730 CG LYS A 326 6008 5829 5811 1 106 -66 C ATOMO 731 CD LYS A 326 5.224 44..500 -3.730 00 46.76 C ANISOU 731 CD LYS A 326 6052 5871 5842 -23 128 -26 C ATOMO 732 CE LYS A 326 4.627 43..755 -2.527 .00 47.92 C ANISOU 732 CE LYS A 326 6179 6075 5951 -22 57 57 C ATOMO 733 NZ LYS A 326 3.645 44,.615 -1.795 .00 46.79 N ANISOU 733 NZ LYS A 326 6086 5950 5742 84 143 63 N ATOMO 734 C LYS A 326 8.492 43.774 -7.398 .00 47.27 C ANISOU 734 C LYS A 326 6099 5947 5913 -66 66 -56 C ATOMO 735 O LYS A 326 9.180 44.487 -6.654 .00 48.18 O ANISOU 735 O LYS A 326 6284 6034 5987 -48 39 -1 O ATOMO 736 N ALA A 327 8.916 43.299 -8.570 .00 48.04 N ANISOU 736 N ALA A 327 6153 6097 6003 -80 76 -72 N ATOMO 737 CA ALA A 327 10.266 43.501 -9.120 1.00 48.25 C ANISOU 737 CA ALA A 327 6151 6154 6027 -80 65 -43 C ATOMO 738 CB ALA A 327 11.322 42.844 -8. 247 1.00 48.36 C ANISOU 738 CB ALA A 327 6156 6153 6064 -60 40 -40 C ATOMO 739 C ALA A 327 10.305 42.901 -10. 522 1.00 48.66 C ANISOU 739 C ALA A 327 6209 6190 6089 -90 89 -47 C ATOMO 740 O ALA A 327 11.017 43.403 -11. 396 1.00 49.36 O ANISOU 740 O ALA A 327 6216 6343 6195 -143 160 -32 O ATOMO 741 N LEU A 328 9.531 41.834 -10. .732 1.00 48.61 N ANISOU 741 N LEU A 328 6214 6128 6125 -66 61 -36 N ATOMO 742 CA LEU A 328 9.411 41.216 -12. .056 1.00 48.46 C ANISOU 742 CA LEU A 328 6198 6118 6096 -1 44 -5 C ATOMO 743 CB LEU A 328 8.993 39.743 -11. .934 1.00 48.19 C ANISOU 743 CB LEU A 328 6138 6070 6100 13 48 9 C ATOMO 744 CG LEU A 328 10.002 38.667 -11 .520 1.00 48.23 C ANISOU 744 CG LEU A 328 6153 6038 6133 9 15 36 C ATOMO 745 CD1 LEU A 328 9.283 37.550 -10 .802 1.00 46.88 C ANISOU 745 CD1 LEU A 328 5933 5924 5956 -6 2 89 C ATOMO 746 CD2 LEU A 328 10.797 38.134 -12 .728 1.00 46.84 C ANISOU 746 CD2 LEU A 328 6059 5772 5966 30 -18 8 C ATOMO 747 C LEU A 328 8.377 41.962 -12 .905 1.00 48.82 C ANISOU 747 C LEU A 328 6215 6170 6161 42 47 3 C ATOMO 748 O LEU A 328 7.346 42.391 -12 .370 1.00 49.39 O ANISOU 748 O LEU A 328 6288 6214 6264 62 78 -17 O ATOMO 749 N PRO A 329 8.627 42.096 -14 .233 1.00 48.99 N ANISOU 749 N PRO A 329 6230 6210 6172 52 35 20 N ATOMO 750 CA PRO A 329 7.583 42.691 -15 .083 1.00 48.98 C ANISOU 750 CA PRO A 329 6183 6202 6224 38 16 11 C ATOMO 751 CB PRO A 329 8.121 42.512 -16.512 1.00 48.81 C ANISOU 751 CB PRO A 329 6180 6199 6165 26 5 20 C ATOMO 752 CG PRO A 329 9.255 41.473 -16.402 1.00 49.03 C ANISOU 752 CG PRO A 329 6235 6230 6164 50 -11 24 C ATOMO 753 CD PRO A 329 9.824 41.712 -15.016 1.00 49.11 C ANISOU 753 CD PRO A 329 6245 6228 6184 54 26 18 C ATOMO 754 C PRO A 329 6.275 41.925 -14.898 1.00 49.47 C ANISOU 754 C PRO A 329 6237 6232 6324 32 28 24 C ATOMO 755 O PRO A 329 5.199 42.555 -14.828 1.00 50.19 O ANISOU 755 O PRO A 329 6307 6296 6465 82 62 20 O ATOMO 756 N ALA A 330 6.386 40.588 -14.815 1.00 49.21 N ANISOU 756 N ALA A 330 6236 6180 6279 31 21 35 N ATOMO 757 CA ALA A 330 5.267 39.685 -14.511 1.00 48.97 C ANISOU 757 CA ALA A 330 6221 6162 6220 0 15 46 C ATOMO 758 C ALA A 330 5.734 38.538 -13.611 1.00 48.44 C ANISOU 758 C ALA A 330 6145 6082 6176 14 16 18 C ATOMO 759 O ALA A 330 6.938 38.338 -13.433 1.00 48.63 O ANISOU 759 ' O ALA A 330 6183 6095 6196 22 6 21 O ATOMO 760 CB ALA A 330 4.638 39.170 -15.796 1.00 49.45 C ANISOU 760 CB ALA A 330 6282 6264 6242 -3 41 22 C ATOMO 761 N SER A 331 4.774 37.789 -13.057 1.00 47.86 N ANISOU 761 N SER A 331 6127 5988 6070 15 23 18 N ATOMO 762 CA SER A 331 5.044 36.573 -12.279 1.00 47.47 C ANISOU 762 CA SER A 331 6076 5962 5998 20 52 -2 C ATOMO 763 CB SER A 331 3.732 35.989 -11.759 1.00 47.76 C ANISOU 763 CB SER A 331 6111 5968 6068 -34 62 -6 C ATOMO 764 OG SER A 331 3.328 36.636 -10.566 1.00 49.07 O ANISOU 764 OG SER A 331 6264 6200 6180 -65 112 -82 O ATOMO 765 C SER A 331 5.784 35.490 -13.063 1.00 46.93 C ANISOU 765 C SER A 331 6026 5870 5936 45 11 17 C ATOMO 766 O SER A 331 5.841 35.530 -14.306 1.00 46.88 O ANISOU 766 O SER A 331 6028 5874 5910 64 -8 49 O ATOMO 767 N ILE A 332 6.349 34.524 -12.326 1.00 46.46 N ANISOU 767 N ILE A 332 5955 5859 5838 52 8 10 N ATOMO 768 CA ILE A 332 6.997 33.345 -12.921 1.00 45.16 C ANISOU 768 CA ILE A 332 5784 5664 5710 32 1 -50 C ATOMO 769 CB ILE A 332 8.447 33.111 -12.418 1.00 45.49 C ANISOU 769 CB ILE A 332 5827 5705 5750 38 30 -55 C ATOMO 770 CG1 ILE A 332 9.226 34.425 -12.299 1.00 45.00 C ANISOU 770 CG1 ILE A 332 5746 5597 5752 3 1 -96 C ATOMO 771 CD1 ILE A 332 10.603 34.263 -11.676 1.00 44.54 C ANISOU 771 CD1 ILE A 332 5753 5514 5657 62 -2 -95 C ATOMO 772 CG2 ILE A 332 9.199 32.107 -13.353 1.00 46.08 C ANISOU 772 CG2 ILE A 332 5899 5694 5914 5 5 -81 C ATOMO 773 C ILE A 332 6.212 32.091 -12.614 1.00 45.22 C ANISOU 773 C ILE A 332 5786 5699 5695 11 19 -20 C ATOMO 774 O ILE A 332 5.959 31.784 -11.447 1.00 45.15 O ANISOU 774 O ILE A 332 5742 5739 5670 47 -18 -46 O ATOMO 775 N GLU A 333 5.846 31.365 -13.675 1.00 45.30 N ANISOU 775 N GLU A 333 5774 5702 5736 -22 17 4 N ATOMO 776 CA GLU A 333 5.198 30.059 -13.561 1.00 45.04 C ANISOU 776 CA GLU A 333 5702 5658 5752 6 34 -3 C ATOMO 777 CB GLU A 333 3.920 30.002 -14.403 1.00 45.11 C ANISOU 777 CB GLU A 333 5759 5677 5704 -3 34 16 C ATOMO 778 CG GLU A 333 2.743 30.808 -13.893 1.00 46.10 C ANISOU 778 CG GLU A 333 5802 5868 5845 9 -6 18 C ATOMO 779 CD GLU A 333 1.567 30.734 -14.839 1.00 47.62 C ANISOU 779 CD GLU A 333 6049 5979 6064 -46 8 80 C ATOMO 780 OE1 GLU A 333 0.502 31.308 -14.524 1.00 49.66 O ANISOU 780 OE1 GLU A 333 6257 6258 6355 147 141 19 O ATOMO 781 OE2 GLU A 333 1.706 30.101 -15.911 1.00 49.76 O ANISOU 781 OE2 GLU A 333 6561 6209 6136 66 28 -65 O ATOMO 782 C GLU A 333 6.112 28.961 -14.076 1.00 44.61 C ANISOU 782 C GLU A 333 5648 5599 5700 -8 55 47 C ATOMO 783 O GLU A 333 6.661 29.064 -15.180 1.00 44.56 O ANISOU 783 O GLU A 333 5623 5595 5712 -41 123 71 O ATOMO 784 N LYS A 334 6.230 27.892 -13.290 1.00 44.01 N ANISOU 784 N LYS A 334 5544 5539 5638 18 36 50 N ATOMO 785 CA LYS A 334 6.873 26.659 -13.734 1.00 42.98 C ANISOU 785 CA LYS A 334 5422 5388 5518 15 17 31 C ATOMO 786 CB LYS A 334 8.212 26.486 -13.006 1.00 43.19 C ANISOU 786 CB LYS A 334 5438 5429 5541 15 10 54 C ATOMO 787 CG LYS A 334 9.342 27.415 -13.491 1.00 43.78 C ANISOU 787 CG LYS A 334 5486 5549 5597 -63 48 -57 C ATOMO 788 CD LYS A 334 9.999 26.862 -14.756 1.00 47.27 C ANISOU 788 CD LYS A 334 6256 5959 5746 137 -131 -161 C ATOMO 789 CE LYS A 334 11.210 27.670 -15.180 1.00 41.47 C ANISOU 789 CE LYS A 334 5573 4547 5633 -141 -13 547 C ATOMO 790 NZ LYS A 334 10.822 28.944 -15.871 1.00 48.95 N ANISOU 790 NZ LYS A 334 5949 6476 6171 -108 -137 -288 N ATOMO 791 C LYS A 334 5.942 25.479 -13.449 1.00 42.38 C ANISOU 791 C LYS A 334 5339 5347 5415 47 18 4 C ATOMO 792 O LYS A 334 5.416 25.373 -12.342 1.00 41.36 O ANISOU 792 O LYS A 334 5235 5235 5242 88 46 19 O ATOMO 793 N THR A 335 5.737 24.606 -14.448 1.00 42.28 N ANISOU 793 N THR A 335 5315 5358 5388 22 -3 5 N ATOMO 794 CA THR A 335 4.887 23.413 -14.297 1.00 42.27 C ANISOU 794 CA THR A 335 5328 5336 5394 20 -27 -22 C ATOMO 795 CB THR A 335 3.669 23.442 -15.297 1.00 42.66 C ANISOU 795 CB THR A 335 5389 5366 5451 24 -40 7 C ATOMO 796 OG1 THR A 335 2.797 24.540 -14.973 1.00 43.84 O ANISOU 796 OG1 THR A 335 5548 5558 5551 61 -31 -90 O ATOMO 797 CG2 THR A 335 2.849 22.137 -15.256 1.00 42.03 C ANISOU 797 CG2 THR A 335 5251 5336 5381 1 -34 33 C ATOMO 798 C THR A 335 5.691 22.094 -14.399 1.00 42.02 C ANISOU 798 C THR A 335 5275 5343 5344 6 -2 3 C ATOMO 799 O THR A 335 6.591 21.962 -15.233 1.00 42.24 O ANISOU 799 O THR A 335 5317 5422 5307 -6 27 -4 O ATOMO 800 N ILE A 336 5.364 21.130 -13.536 1.00 41.53 N ANISOU 800 N ILE A 336 5220 5253 5307 -22 0 -2 N ATOMO 801 CA ILE A 336 6.033 19.830 -13.521 1.00 41.14 C ANISOU 801 CA ILE A 336 5192 5158 5280 -5 -6 -31 C ATOMO 802 CB ILE A 336 7.112 19.767 -12.399 1.00 41.49 C ANISOU 802 CB ILE A 336 5260 5196 5307 8 7 -66 C ATOMO 803 CG1 ILE A 336 8.130 18.656 -12.661 1.00 41.08 C ANISOU 803 CG1 ILE A 336 5207 5068 5332 72 -8 -97 C ATOMO 804 CD1 ILE A 336 9.561 19.137 -12.634 1.00 40.27 C ANISOU 804 CD1 ILE A 336 5179 4874 5247 -8 -10 -97 C ATOMO 805 CG2 ILE A 336 6.480 19.580 -11.011 1.00 42.34 C ANISOU 805 CG2 ILE A 336 5379 5259 5448 -35 90 0 C ATOMO 806 C ILE A 336 5.046 18.664 -13.378 1.00 40.65 C ANISOU 806 C ILE A 336 5139 5100 5203 -7 0 -31 C ATOMO 807 O ' ILE A 336 4.003 18.801 -12.761 00 41.39 O A ISOU 807 O ILE A 336 5205 5207 5311 -38 -23 -17 O ATOMO 808 N SER A 337 5.387 17.522 -13.967 00 39.94 N ANISOU 808 N SER A 337 5084 5004 5084 -68 -53 -17 N ATOMO 809 CA SER A 337 4.678 16.250 -13.746 00 38.58 C ANISOU 809 CA SER A 337 4946 4829 4883 -42 -91 -14 C ATOMO 810 CB SER A 337 3.495 16.104 -14.717 00 38.30 C ANISOU 810 CB SER A 337 4878 4805 4869 -19 -98 -9 C ATOMO 811 OG SER A 337 3.996 15.979 -16.037 00 37.12 O ANISOU 811 OG SER A 337 4890 4556 4658 -36 -329 74 O ATOMO 812 C SER A 337 5.671 15.117 -13.992 00 37.26 C ANISOU 812 C SER A 337 4761 4669 4727 -28 -55 -53 C ATOMO 813 O SER A 337 6.763 15.356 -14.454 00 36.64 O ANISOU 813 O SER A 337 4712 4560 4646 -72 -77 -119 O ATOMO 814 N LYS A 338 5.259 13.888 -13.696 00 36.86 N ANISOU 814 N LYS A 338 4689 4665 4651 34 -19 -58 N ATOMO 815 CA LYS A 338 5.995 12.667 -14.048 00 36.00 C ANISOU 815 CA LYS A 338 4571 4534 4570 -3 -18 -52 C ATOMO 816 CB LYS A 338 5.191 11.468 -13.542 00 35.29 C ANISOU 816 CB LYS A 338 4455 4494 4457 5 24 -42 C ATOMO 817 CG LYS A 338 5.828 10.099 -13.681 00 33.67 C ANISOU 817 CG LYS A 338 4244 4375 4173 27 -21 32 C ATOMO 818 CD LYS A 338 4, 832 8.999 -13.385 00 30.62. C ANISOU 818 CD LYS A 338 3883 4010 3741 34 -66 1 C ATOMO 819 CE LYS A 338 3.843 8.803 -14.522 00 29.42 C ANISOU 819 CE LYS A 338 3949 3572 3656 25 104 81 C ATOMO 820 NZ LYS A 338 4.576 8.396 -15.745 00 27.21 N ANISOU 820 NZ LYS A 338 3843 3118 3374 -83 -117 132 N ATOMO 821 C LYS A 338 6.258 12.571 -15.572 1.00 35.50 C ANISOU 821 C LYS A 338 4535 4440 4512 -21 -20 -80 C ATOMO 822 O LYS A 338 5.479 13.073 -16. 374 1.00 34. 30 O ANISOU 822 O LYS A 338 4439 4209 4381 -34 4 -116 O ATOMO 823 N ALA A 339 7.366 11.950 -15. 968 1.00 35 70 N ANISOU 823 N ALA A 339 4573 4471 4517 -35 -30 -65 N ATOMO 824 CA ALA A 339 7.638 11.750 -17. 393 1.00 36 15 C ANISOU 824 CA ALA A 339 4615 4521 4599 -15 -13 -58 C ATOMO 825 CB ALA A 339 8.837 10.811 -17. 606 1.00 36 .05 C ANISOU 825 CB ALA A 339 4546 4589 4559 -45 -58 -37 C ATOMO 826 C ALA A 339 6.373 11.204 -18. 084 1.00 36 .01 C ANISOU 826 C ALA A 339 4591 4506 4583 -12 -7 -66 C ATOMO 827 O ALA A 339 5.767 10.235 -17. 626 1.00 35 .29 O ANISOU 827 O ALA A 339 4495 4403 4508 20 0 -69 O ATOMO 828 N LYS A 340 5.957 11.871 -19. 150 1.00 36 .06 N ANISOU 828 N LYS A 340 4636 4483 4580 -50 15 -31 N ATOMO 829 CA LYS A 340 4.776 11.478 -19. 901 1.00 36 .79 C ANISOU 829 CA LYS A 340 4727 4622 4626 -22 -2 -23 C ATOMO 830 CB LYS A 340 4.201 12.675 -20. 674 1.00 37 .11 C ANISOU 830 CB LYS A 340 4729 4625 4746 -33 22 -34 C ATOMO 831 CG LYS A 340 3.417 13.646 -19. 808 1.00 38 .15 C ANISOU 831 CG LYS A 340 4951 4783 4759 -17 8 -23 C ATOMO 832 CD LYS A 340 3.035 14.930 -20, 552 1.00 38 .31 C ANISOU 832 CD LYS A 340 4857 4845 4852 -53 -56 -11 C ATOMO 833 CE LYS A 340 2.454 15.928 -19 .583 1.00 39 .66 C ANISOU 833 CE LYS A 340 4859 5039 5171 67 -10 -26 C ATOMO 834 NZ LYS A 340 2.557 17.333 -20 .080 1.00 42 .09 N ANISOU 834 NZ LYS A 340 5215 5411 5363 -28 21 40 N ATOMO 835 C LYS A 340 5.120 10.297 -20.833 1.00 36.19 C ANISOU 835 C LYS A 340 4615 4591 4545 0 0 -14 C ATOMO 836 O LYS A 340 6. 286 9.917 -20.940 1.00 36.01 O ANISOU 836 O LYS A 340 4613 4608 4461 -17 -8 -9 O ATOMO 837 N GLY A 341 4. 109 9.717 -21.486 1.00 35.13 N ANISOU 837 N GLY A 341 4487 4443 4417 -7 9 -27 N ATOMO 838 CA GLY A 341 4. 315 8.552 -22.351 1.00 33.53 C ANISOU 838 CA GLY A 341 4232 4341 4165 28 -19 20 C ATOMO 839 C GLY A 341 3. 679 7.281 -21.845 1.00 32.52 C ANISOU 839 C GLY A 341 4085 4155 4114 71 -32 -34 C ATOMO 840 O GLY A 341 3. 552 7.075 -20.628 1.00 31.86 O ANISOU 840 O GLY A 341 3925 4073 4106 82 -44 -75 O ATOMO 841 N GLN A 342 3. 276 6.427 -22.781 1.00 31.81 N ANISOU 841 N GLN A 342 4021 4126 3939 78 -15 -18 N ATOMO 842 CA GLN A 342 2. 697 5.123 -22.472 1.00 31.42 C ANISOU 842 CA GLN A 342 4041 3988 3909 45 -37 -59 C ATOMO 843 CB GLN A 342 2. 283 4.401 -23.770 1.00 31.69 C ANISOU 843 CB GLN A 342 4054 3993 3992 79 -26 -40 C ATOMO 844 CG GLN A 342 1. 017 4.931 -24.463 1.00 30.27 c ANISOU 844 CG GLN A 342 4081 3823 3597 2 -53 -130 c ATOMO 845 CD GLN A 342 -0. 282 4.551 -23.748 1.00 28.05 C ANISOU 845 CD GLN A 342 3804 3406 3445 149 -27 92 C ATOMO 846 OE1 GLN A 342 -0,,345 3.562 -22.997 1.00 31.57 O ANISOU 846 OE1 GLN A 342 4346 4036 3611 80 115 -150 O ATOMO 847 NE2 GLN A 342 -1 .324 5.329 -23.982 1.00 27.78 N ANISOU 847 NE2 GLN A 342 3742 3685 3128 63 86 28 N ATOMO 848 C GLN A 342 3 .699 4.278 -21.678 1.00 31.71 C ANISOU 848 C GLN A 342 4108 3972 3968 2 -33 -40 C ATOMO 849 O GLN A 342 4.828 4.083 -22.128 1.00 31.42 O ANISOU 849 O GLN A 342 4162 3884 3891 -39 -112 -23 O ATOMO 850 N PRO A 343 3.301 3. 785 -20.489 1.00 32.23 N ANISOU 850 N PRO A 343 4160 4035 4051 10 -31 -23 N ATOMO 851 CA PRO A 343 4.181 2. 960 -19.638 1.00 32.69 C ANISOU 851 CA PRO A 343 4213 4109 4098 -3 -4 6 C ATOMO 852 CB PRO A 343 3.380 2. 837 -18.349 1.00 32.19 C ANISOU 852 CB PRO A 343 4159 4011 4060 30 -13 10 C ATOMO 853 CG PRO A 343 1.964 2.866 -18.832 1.00 32.66 C ANISOU 853 CG PRO A 343 4242 4047 4116 0 21 -24 C ATOMO 854 CD PRO A 343 1.968 3. 940 -19.879 1.00 32.17 C ANISOU 854 CD PRO A 343 4181 4052 3987 16 -21 -13 C ATOMO 855 C PRO A 343 4.431 1. 555 -20.220 1.00 33.20 C ANISOU 855 C PRO A 343 4284 4187 4141 -16 -2 31 C ATOMO 856 O PRO A 343 3.523 0. 944 -20.760 1.00 32.66 O ANISOU 856 O PRO A 343 4246 4100 4061 -46 -31 42 O ATOMO 857 N ARG A 344 5.661 1.059 -20.113 1.00 34.11 N ANISOU 857 N ARG A 344 4385 4381 4194 -20 -12 7 N ATOMO 858 CA ARG A 344 5.966 -0. 318 -20.495 1.00 34.88 C ANISOU 858 CA ARG A 344 4443 4484 4326 4 -8 -16 C ATOMO 859 CB ARG A 344 6.837 -0. 389 -21.766 1.00 35.47 C ANISOU 859 CB ARG A 344 4420 4544 4511 -12 -30 -52 C ATOMO 860 CG ARG A 344 6.369 0, ,413 -22.984 1.00 35.46 C ANISOU 860 CG ARG A 344 4558 4556 4357 -10 103 -41 C ATOMO 861 CD ARG A 344 7.187 -0.019 -24.224 1.00 42.30 C ANISOU 861 CD ARG A 344 5121 5594 5357 27 -186 -291 C ATOMO 862 NE ARG A 344 7.453 1 .068 -25.179 1.00 34.97 N ANISOU 862 NE ARG A 344 4759 4835 3690 -15 779 214 N ATOMO 863 CZ ARG A 344 8.223 0.943 -26.268 1.00 46.83 C A ISOU 863 CZ ARG A 344 5377 6384 6029 -370 -579 -303 C ATOMO 864 NH1 ARG A 344 8.798 -0.225 -26.541 1.00 36.80 N ANISOU 864 NH1 ARG A 344 4533 4393 5057 477 227 -349 N ATOMO 865 NH2 ARG A 344 8.406 1.976 -27.085 1.00 32.95 N ANISOU 865 NH2 ARG A 344 4473 3988 4058 -185 138 349 N ATOMO 866 C ARG A 344 6.652 -1.014 -19.326 1.00 35.55 C ANISOU 866 C ARG A 344 4503 4565 4439 -1 2 -55 C ATOMO 867 O ARG A 344 7.600 -0.490 -18.751 1.00 35.51 O ANISOU 867 O ARG A 344 4476 4590 4426 24 -11 -37 O ATOMO 868 N GLU A 345 6.144 -2.186 -18.971 1.00 35.97 N ANISOU 868 N GLU A 345 4588 4586 4489 -8 -41 -78 N ATOMO 869 CA GLU A 345 6.656 -2.995 -17.880 1.00 36.16 C ANISOU 869 CA GLU A 345 4630 4626 4481 3 -56 -31 C ATOMO 870 CB GLU A 345 5.668 -4.114 -17.573 1.00 36.66 C ANISOU 870 CB GLU A 345 4710 4666 4553 2 -39 -45 C ATOMO 871 CG GLU A 345 5.939 -4.802 -16.249 1.00 38.92 C ANISOU 871 CG GLU A 345 5030 4961 4795 50 -70 23 c ATOMO 872 CD GLU A 345 5.466 -6.244 -16.197 1.00 39.25 c ANISOU 872 CD GLU A 345 4949 4976 4987 -33 -88 12 c ATOMO 873 OE1 GLU A 345 6.215 -7.086 -15.680 1.00 41.62 O ANISOU 873 OE1 GLU A 345 5509 5056 5247 -30 46 -48 O ATOMO 874 OE2 GLU A 345 4.360 -6.544 -16.660 1.00 41.29 O ANISOU 874 OE2 GLU A 345 5302 5254 5132 24 -6 -54 O ATOMO 875 C GLU A 345 8.014 -3.607 -18.213 1.00 36.11 C ANISOU 875 C GLU A 345 4648 4610 4459 -14 -51 -17 C ATOMO 876 O GLU A 345 8.151 -4.270 -19.242 1.00 35.55 O ANISOU 876 O GLU A 345 4678 4510 4316 -23 -92 -1 O ATOMO 877 N PRO A 346 9.029 -3.396 -17.338 1.00 35.96 N A ISOU 877 N PRO A 346 4575 4638 4446 -16 -46 -18 N ATOMO 878 CA PRO A 346 10.320 -4.041 -17.561 1.00 35.46 C ANISOU 878 CA PRO A 346 4492 4581 4399 4 -42 -18 C ATOMO 879 CB PRO A 346 11.182 -3.552 -16.380 1.00 35.73 C ANISOU 879 CB PRO A 346 4524 4597 4452 12 -21 4 C ATOMO 880 CG PRO A 346 10.228 -3.061 -15..358 1.00 35.62 C ANISOU 880 CG PRO A 346 4572 4580 4380 38 -12 -22 C ATOMO 881 CD PRO A 346 9.046 -2.540 -16..136 1.00 35.89 C ANISOU 881 CD PRO A 346 4545 4611 4479 -7 -43 -41 C ATOMO 882 C PRO A 346 10.299 -5.561 -17..570 1.00 35.18 C ANISOU 882 C PRO A 346 4416 4581 4370 -24 -79 -24 C ATOMO 883 O PRO A 346 9.494 -6.194 -16..877 1.00 3 .62 O ANISOU 883 O PRO A 346 4353 4580 4219 -12 -186 -66 O ATOMO 884 N GLN A 347 11.219 -6.120 -18.349 1.00 35.18 N ANISOU 884 N GLN A 347 4543 4504 4317 -46 -63 -72 N ATOMO 885 CA GLN A 347 11.631 -7.507 -18 .254 1.00 35.53 C ANISOU 885 CA GLN A 347 4553 4530 4414 0 -45 -78 C ATOMO 886 CB GLN A 347 11.789 -8.075 -19.670 1.00 36.10 C ANISOU 886 CB GLN A 347 4629 4569 4515 5 -25 -114 C ATOMO 887 CG GLN A 347 10.539 -7.907 -20.521 1.00 37.59 C ANISOU 887 CG GLN A 347 4887 4687 4707 85 -90 -113 C ATOMO 888 CD GLN A 347 10.854 -7.408 -21.902 1.00 40.93 C ANISOU 888 CD GLN A 347 5327 5075 5147 -59 -3 9 C ATOMO 889 OE1 GLN A 347 11.724 -7.946 -22 .587 1.00 42.38 O ANISOU 889 OE1 GLN A 347 5289 5375 5436 61 68 117 O ATOMO 890 NE2 GLN A 347 10.135 -6.381 -22 .337 1.00 41.52 N ANISOU 890 NE2 GLN A 347 5299 5090 5385 92 -137 -75 N ATOMO 891 C GLN A 347 12.969 -7.538 -17.513 1.00 34.81 C A ISOU 891 C GLN A 347 4451 4436 4337 -31 7 -68 C ATOMO 892 O GLN A 347 13.907 -6.895 -17.937 1.00 34.34 O ANISOU 892 O GLN A 347 4438 4322 4286 -90 -26 -42 O ATOMO 893 N VAL A 348 13.034 -8.283 -16.409 1.00 34.50 N ANISOU 893 N VAL A 348 4388 4352 4366 -33 16 -8 N ATOMO 894 CA VAL A 348 14.195 -8.336 -15.520 1.00 34.25 C ANISOU 894 CA VAL A 348 4345 4345 4324 -31 17 -6 C ATOMO 895 CB VAL A 348 13.798 -8.061 -14.027 1..00 34.35 C ANISOU 895 CB VAL A 348 4334 4344 4372 -35 28 27 C ATOMO 896 CG1 VAL A 348 14.988 -8.250 -13.096 1..00 33.51 C ANISOU 896 CG1 VAL A 348 4238 4355 4138 -36 50 -12 C ATOMO 897 CG2 VAL A 348 13.222 -6.668 -13.844 1..00 33.93 C ANISOU 897 CG2 VAL A 348 4281 4316 4294 5 17 -7 C ATOMO 898 C VAL A 348 14.833 -9.720 -15.601 1..00 34.64 C ANISOU 898 C VAL A 348 4404 4383 4373 -32 6 27 C ATOMO 899 O VAL A 348 14.156 -10.730 -15.359 1.00 34.49 O ANISOU 899 O VAL A 348 4366 4418 4317 -11 -34 44 O ATOMO 900 N TYR A 349 16.126 -9.769 -15.935 1.00 34.98 N ANISOU 900 N TYR A 349 4437 4393 4459 -54 12 32 N ATOMO 901 CA TYR A 349 16.835 -11.040 -16.125 1.00 35.60 C ANISOU 901 CA TYR A 349 4504 4476 4547 -57 -29 71 C ATOMO 902 CB TYR A 349 17.128 -11.334 -17.612 1.00 33.85 C ANISOU 902 CB TYR A 349 4148 4389 4323 -53 -206 -7 C ATOMO 903 CG TYR A 349 15.930 -11.322 -18.532 1.00 37.15 C ANISOU 903 CG TYR A 349 4880 4508 4724 99 192 -36 C ATOMO 904 CD1 TYR A 349 14.882 -12.237 -18.364 1.00 33.27 C ANISOU 904 CD1 TYR A 349 4290 4016 4335 -10 -59 97 C ATOMO 905 CE1 TYR A 349 13.785 -12.242 -19.206 1.00 31.99 C ANISOU 905 CE1 TYR A 349 4268 3911 3974 66 -115 123 C ATOMO 906 CZ TYR A 349 13.707 -11.324 -20.253 1.00 36.97 C ANISOU 906 CZ TYR A 349 5013 4524 4509 156 357 -207 C ATOMO 907 OH TYR A 349 12.592 -11.340 -21.085 1.00 32.56 O ANISOU 907 OH TYR A 349 3951 4398 4022 -11 -218 -91 O ATOMO 908 CE2 TYR A 349 14.726 -10.404 -20.457 1.00 31.78 C ANISOU 908 CE2 TYR A 349 4079 4051 3944 -130 10 -26 C ATOMO 909 CD2 TYR A 349 15.850 -10.416 -19.605 1.00 34.01 C ANISOU 909 CD2 TYR A 349 4476 4272 4172 69 -61 92 C ATOMO 910 C TYR A 349 18.143 -11.028 -15.368 1.00 36.74 C ANISOU 910 C TYR A 349 4676 4594 4687 -68 -58 59 C ATOMO 911 O TYR A 349 18.887 -10.037 -15.418 1.00 37.20 O ANISOU 911 O TYR A 349 4797 4592 4743 -80 -156 107 O ATOMO 912 N THR A 350 18.432 -12.130 -14.680 1.00 37.32 N ANISOU 912 N THR A 350 4742 4621 4817 -56 -66 36 N ATOMO 913 CA THR A 350 19.718 -12.304 -14.026 1.00 38.14 C ANISOU 913 CA THR A 350 4825 4721 4943 -21 -81 20 C ATOMO 914 CB THR A 350 19.559 -12.839 -12.597 1 00 38.40 C ANISOU 914 CB THR A 350 4860 4761 4966 -31 -61 7 C ATOMO 915 OG1 THR A 350 18.731 -14.018 -12.598 1 ,00 39.46 O ANISOU 915 OG1 THR A 350 4927 4782 5282 -54 -167 -97 O ATOMO 916 CG2 THR A 350 18.928 -11.782 -11.709 1.00 37.43 C ANISOU 916 CG2 THR A 350 4800 4532 4887 17 -112 -76 C ATOMO 917 C THR A 350 20.611 -13.217 -14.868 1.00 38.74 C ANISOU 917 C THR A 350 4927 4769 5022 1 -79 18 C ATOMO 918 O THR A 350 20.123 -14.185 -15.444 1.00 38.86 O ANISOU 918 O THR A 350 4914 4739 5112 8 -126 13 O ATOMO 919 N LEU A 351 21.898 -12.871 -14.979 1.00 39.30 N ANISOU 919 N LEU A 351 4977 4875 5078 7 -62 40 N ATOMO 920 CA LEU A 351 22.867 -13, 658 -15.755 1.00 40.29 C ANISOU 920 CA LEU A 351 5136 5014 5156 0 -38 5 C ATOMO 921 CB LEU A 351 23.357 -12 912 -17.004 1.00 40.56 C ANISOU 921 CB LEU A 351 5169 5086 5156 -3 -7 -12 C ATOMO 922 CG LEU A 351 22.508 -11 927 -17.836 1.00 41.22 C ANISOU 922 CG LEU A 351 5191 5222 5247 -1 -7 19 C ATOMO 923 CD1 LEU A 351 23.198 -11.617 -19.177 1.00 42.94 C ANISOU 923 CD1 LEU A 351 5594 5366 5355 47 57 -43 C ATOMO 924 CD2 LEU A 351 21.117 -12.418 -18.099 1.00 41.57 C ANISOU 924 CD2 LEU A 351 5226 5213 5354 23 -32 -39 C ATOMO 925 C LEU A 351 24.076 -14.028 -14.888 1.00 40.94 C ANISOU 925 C LEU A 351 5192 5092 5268 4 -33 -14 C ATOMO 926 O LEU A 351 24.582 -13.189 -14.116 1.00 41.33 O ANISOU 926 O LEU A 351 5233 5217 5252 6 -14 2 O ATOMO 927 N PRO A 352 24.561 -15.277 -15.020 1.00 41.37 N ANISOU 927 N PRO A 352 5252 5155 5309 -9 -38 -17 N ATOMO 928 CA PRO A 352 25.657 -15.706 -14.168 1.00 41.43 C ANISOU 928 CA PRO A 352 5288 5166 5287 4 -22 0 c ATOMO 929 CB PRO A 352 25.512 -17.225 -14.185 1.00 41.27 C ANISOU 929 CB PRO A 352 5261 5141 5277 -45 -23 -16 C ATOMO 930 CG PRO A 352 25.003 -17.514 -15.565 1.00 41.74 C ANISOU 930 CG PRO A 352 5297 5231 5329 -13 -41 16 C ATOMO 931 CD PRO A 352 24.147 -16.336 -15.966 1.00 41.31 C ANISOU 931 CD PRO A 352 5282 5099 5315 6 7 -17 C ATOMO 932 C PRO A 352 27.006 -15.272 -14.759 1.00 41.59 C ANISOU 932 C PRO A 352 5340 5165 5297 -16 0 11 C ATOMO 933 O PRO A 352 27.064 -14.880 -15.928 1.00 42.08 O ANISOU 933 O PRO A 352 5477 5215 5295 16 16 -12 O ATOMO 934 N PRO A 353 28.089 -15.328 -13.967 1.00 41.79 N ANISOU 934 N PRO A 353 5347 5197 5334 -44 8 11 N ATOMO 935 CA PRO A 353 29.375 -14.972 -14.556 1.00 42.47 C ANISOU 935 CA PRO A 353 5405 5319 5412 -10 26 -14 C ATOMO 936 CB PRO A 353 30.363 -15.451 -13.503 1.00 42.11 C ANISOU 936 CB PRO A 353 5366 5274 5359 6 19 1 C ATOMO 937 CG PRO A 353 29.616 -15.312 -12.210 1.00 41.83 C ANISOU 937 CG PRO A 353 5318 5207 5368 -12 18 34 C ATOMO 938 CD PRO A 353 28.212 -15.662 -12.533 1.00 41.62 C ANISOU 938 CD PRO A 353 5287 5204 5320 -37 9 -1 C ATOMO 939 C PRO A 353 29.664 -15.642 -15.914 1.00 43.38 C ANISOU 939 C PRO A 353 5539 5438 5506 -59 7 0 C ATOMO 940 O PRO A 353 29.099 -16.686 -16.238 1.00 43.79 O ANISOU 940 O PRO A 353 5568 5453 5616 -92 -13 7 O ATOMO 941 N SER A 354 30.550 -15.029 -16.692 1.00 44.02 N ANISOU 941 N SER A 354 5647 5507 5570 -62 32 25 N ATOMO 942 CA SER A 354 31.029 -15.600 -17.947 1.00 44.25 C ANISOU 942 CA SER A 354 5684 5544 5581 -36 2 16 C ATOMO 943 CB SER A 354 31.801 -14.533 -18.728 1.00 43.63 C ANISOU 943 CB SER A 354 5643 5426 5508 -42 5 44 C ATOMO 944 OG SER A 354 32.102 -14.957 -20.044 1.00 43.43 O ANISOU 944 OG SER A 354 5647 5312 5541 -41 -107 63 O ATOMO 945 C SER A 354 31.932 -16.816 -17.684 1.00 44.69 C ANISOU 945 C SER A 354 5752 5587 5640 -28 -2 53 C ATOMO 946 O SER A 354 32.576 -16.911 -16.628 1.00 45.23 O ANISOU 946 O SER A 354 5780 5703 5700 -78 -15 91 O ATOMO 947 N ARG A 355 31.978 -17.740 -18.639 1.00 45.17 N ANISOU 947 N ARG A 355 5825 5641 5696 -10 22 54 N ATOMO 948 CA ARG A 355 32.923 -18. 860 -18.570 1.00 45.90 C ANISOU 948 CA ARG A 355 5863 5750 5824 12 -2 65 C ATOMO 949 CB ARG A 355 32.871 -19. 735 -19.832 1.00 46.10 C ANISOU 949 CB ARG A 355 5934 5737 5845 20 17 36 C ATOMO 950 CG ARG A 355 33.824 -20. 954 -19.799 1.00 47.55 C ANISOU 950 CG ARG A 355 6059 5947 6060 67 78 50 C ATOMO 951 CD ARG A 355 33.145 -22. 221 -19.262 1.00 49.46 C ANISOU 951 CD ARG A 355 6372 5960 6459 -34 23 14 C ATOMO 952 NE ARG A 355 34.055 -23. 376 -19.231 1.00 51.31 N ANISOU 952 NE ARG A 355 6419 6227 6849 47 33 24 N ATOMO 953 CZ ARG A 355 33.662 -24. 659 -19.211 1.00 49.87 C ANISOU 953 CZ ARG A 355 5961 6130 6856 36 60 63 C ATOMO 954 NHl ARG A 355 32.368 -24. 974 -19.225 1.00 51.01 N ANISOU 954 NHl ARG A 355 6530 6058 6792 -50 14 64 N ATOMO 955 NH2 ARG A 355 34.566 -25. 636 -19.183 1.00 51.06 N ANISOU 955 NH2 ARG A 355 6527 6353 6518 -114 122 111 N ATOMO 956 C ARG A 355 34.337 -18.338 -18.363 1.00 46.16 C ANISOU 956 C ARG A 355 5873 5790 5874 3 -27 85 C ATOMO 957 O ARG A 355 35.002 -18 735 -17.402 1.00 46.73 O ANISOU 957 O ARG A 355 5996 5863 5893 12 -54 137 O ATOMO 958 N GLU A 356 34.784 -17 ,436 -19.244 1.00 46.08 N ANISOU 958 N GLU A 356 5863 5771 5872 22 -47 101 N ATOMO 959 CA GLU A 356 36.160 -16 .914 -19.201 1.00 45.95 C ANISOU 959 CA GLU A 356 5824 5716 5915 -12 -25 83 C ATOMO 960 CB GLU A 356 36.460 -16 .024 -20.406 1.00 46.56 C ANISOU 960 CB GLU A 356 5923 5802 5963 -14 -29 55 C ATOMO 961 CG GLU A 356 35.478 -16.076 -21.574 1.00 48.71 C ANISOU 961 CG GLU A 356 6157 6172 6178 -18 -52 -43 C ATOMO 962 CD GLU A 356 35.388 -14.734 -22.325 1.00 44.20 C ANISOU 962 CD GLU A 356 5022 5601 6171 -315 -566 188 C ATOMO 963 OE1 GLU A 356 36.355 -13.927 -22.227 1.00 50.80 O ANISOU 963 OE1 GLU A 356 6751 6418 6131 327 68 47 O ATOMO 964 OE2 GLU A 356 34.348 -14.493 -23.006 1.00 52.20 O ANISOU 964 OE2 GLU A 356 7079 5919 6833 -107 191 -53 O ATOMO 965 C GLU A 356 36.487 -16.133 -17.917 1.00 45.96 C ANISOU 965 C GLU A 356 5812 5714 5934 -1 -14 67 C ATOMO 966 O GLU A 356 37.654 -16.022 -17.533 1.00 46.16 O ANISOU 966 O GLU A 356 5833 5670 6036 10 -15 75 O ATOMO 967 N GLU A 357 35.465 -15.585 -17.259 1.00 46.00 N ANISOU 967 N GLU A 357 5832 5718 5928 -5 -1 46 N ATOMO 968 CA GLU A 357 35.658 -14.822 -16.022 1.00 46.17 C ANISOU 968 CA GLU A 357 5858 5789 5893 -19 -29 37 C ATOMO 969 CB GLU A 357 34.500 -13.832 -15.807 1.00 46.20 C ANISOU 969 CB GLU A 357 5855 5775 5922 -22 -31 25 C ATOMO 970 CG GLU A 357 34.741 -12.830 -14.672 1.00 46.03 C ANISOU 970 CG GLU A 357 5890 5813 5786 -3 20 5 C ATOMO 971 CD GLU A 357 33.511 -12.050 -14.288 1.00 45.84 C ANISOU 971 CD GLU A 357 5810 5736 5870 18 -15 23 C ATOMO 972 OE1 GLU A 357 32.394 -12.574 -14.466 1.00 47.43 O ANISOU 972 OE1 GLU A 357 5997 5800 6223 -69 19 64 O ATOMO 973 OE2 GLU A 357 33.665 -10.908 -13.793 1.00 47.18 O ANISOU 973 OE2 GLU A 357 6018 5915 5990 -47 69 47 O ATOMO 974 C GLU A 357 35.791 -15.713 -14.789 1.00 46.48 C ANISOU 974 C GLU A 357 5902 5797 5962 2 -60 36 C ATOMO 975 O GLU A 357 36.116 -15.242 -13.695 1.00 46.82 O ANISOU 975 O GLU A 357 5954 5880 5956 12 -81 46 O ATOMO 976 N MET A 358 35.527 -17.000 -14 966 1.00 47.05 N ANISOU 976 N MET A 358 5945 5879 6053 -19 -52 49 N ATOMO 977 CA MET A 358 35.559 -17.963 -13 864 1.00 47.74 C ANISOU 977 CA MET A 358 6017 5957 6164 -17 -69 67. C ATOMO 978 CB MET A 358 34.728 -19.192 -14 238 1.00 48.21 C ANISOU 978 CB MET A 358 6105 5944 6269 -34 -75 93 C ATOMO 979 CG MET A 358 33.208 -18.945 -14 .199 1.00 49.31 c ANISOU 979 CG MET A 358 6165 6106 6465 -8 -14 71 C ATOMO 980 SD MET A 358 32.552 -19.075 -12 .527 1.00 52.44 S ANISOU 980 SD MET A 358 6730 6476 6717 -163 20 106 S ATOMO 981 CE MET A 358 32.822 -17.454 -11 .834 1.00 51.39 C ANISOU 981 CE MET A 358 6475 6527 6523 47 -35 165 c ATOMO 982 C MET A 358 36.981 -18.353 -13 .440 1.00 47."84 C ANISOU 982 C MET A 358 6037 5968 6170 -13 -76 65 C ATOMO 983 O MET A 358 37.261 -19.524 -13 .131 1.00 48.04 O ANISOU 983 O MET A 358 6128 5948 6176 -23 -92 42 O ATOMO 984 N THR A 359 37.855 -17.348 -13.399 1.00 47.68 N ANISOU 984 N THR A 359 6033 5948 6134 -20 -77 59 N ATOMO 985 CA THR A 359 39.290 -17.516 -13.163 1.00 47.64 C ANISOU 985 CA THR A 359 6020 5995 6085 0 -63 39 C ATOMO 986 CB THR A 359 40.100 -17.070 -14.403 1.00 47.73 C ANISOU 986 CB THR A 359 6003 6022 6108 15 -50 37 C ATOMO 987 OG1 THR A 359 39.769 -17.914 -15.522 1.00 49.09 O ANISOU 987 OG1 THR A 359 6271 6170 6209 91 -41 16 O ATOMO 988 CG2 THR A 359 41.608 -17.130 -14 .143 1.00 48.38 C ANISOU 988 CG2 THR A 359 6138 6071 6172 -8 -78 7 C ATOMO 989 C THR A 359 39.722 -16.691 -11.958 1.00 47.42 C ANISOU 989 C THR A 359 5966 5981 6070 -5 -71 67 C ATOMO 990 O THR A 359 40.618 -17.090 -11.219 1.00 47.99 O ANISOU 990 O THR A 359 6050 6064 6120 6 -66 108 O ATOMO 991 N LYS A 360 39.081 -15.545 -11.763 1.00 46.86 N ANISOU 991 N LYS A 360 5868 5926 6009 11 -50 41 N ATOMO 992 CA LYS A 360 39.494 -14.595 -10.743 1.00 47.00 C ANISOU 992 CA LYS A 360 5889 5971 5996 29 -30 61 C ATOMO 993 CB LYS A 360 39.110 -13.153 -11.142 1.00 46.95 C ANISOU 993 CB LYS A 360 5886 5968 5983 21 -5 46 C ATOMO 994 CG LYS A 360 38.907 -12.927 -12.637 1.00 47.63 C ANISOU 994 CG LYS A 360 5963 6082 6050 61 -16 111 C ATOMO 995 CD LYS A 360 40.223 -12.855 -13.426 1.00 50.53 C ANISOU 995 CD LYS A 360 6261 6404 6531 60 21 9 C ATOMO 996 CE LYS A 360 39.961 -12.875 -14.932 1.00 49.77 C ANISOU 996 CE LYS A 360 6180 6480 6250 30 132 33 C ATOMO 997 NZ LYS A 360 41.160 -12.482 -15.751 1.00 53.54 N ANISOU 997 NZ LYS A 360 6756 6647 6937 76 9 -32 N ATOMO 998 C LYS A 360 38.846 -15.001 -9.427 1.00 47.06 C ANISOU 998 C LYS A 360 5905 5954 6021 12 -44 84 C ATOMO 999 O LYS A 360 38.141 -16.004 -9.374 1.00 47.87 O ANISOU 999 O LYS A 360 6011 6041 6135 7 -64 106 O ATOMO 1000 N ASN A 361 39.081 -14.239 -8.368 1.00 46.80 N ANISOU 1000 N ASN A 361 5895 5940 5944 39 -18 64 N ATOMO 1001 CA ASN A 361 38.505 -14.578 -7.076 1.00 47.13 C ANISOU 1001 CA ASN A 361 5932 5982 5992 48 -3 96 C ATOMO 1002 CB ASN A 361 39.554 -14.470 -5.963 1.00 47.64 C ANISOU 1002 CB ASN A 361 5962 6070 6066 49 -24 69 C ATOMO 1003 CG ASN A 361 40.414 -13.225 -6.085 1.00 48.35 C ANISOU 1003 CG ASN A 361 6032 6093 6242 20 57 53 C ATOMO 1004 OD1 ASN A 361 39.932 -12.094 -5.891 1.00 50.52 O ANISOU 1004 OD1 ASN A 361 6442 6402 6351 180 54 178 O ATOMO 1005 ND2 ASN A 361 41.709 -13.426 -6.389 1.00 49.41 N ANISOU 1005 ND2 ASN A 361 6268 6360 6143 31 14 44 N ATOMO 1006 C ASN A 361 37.271 -13.744 -6.746 1.00 46.75 C ANISOU 1006 C ASN A 361 5840 5963 5960 64 -21 151 C ATOMO 1007 O ASN A 361 36.510 -14.058 -5.815 1.00 47.14 O ANISOU 1007 O ASN A 361 5925 6049 5938 101 -35 168 O ATOMO 1008 N GLN A 362 37.081 -12.666 -7.503 1.00 46.36 N ANISOU 1008 N GLN A 362 5775 5900 5936 28 11 116 N ATOMO 1009 CA GLN A 362 35.802 -11.967 -7.500 1.00 45.32 C ANISOU 1009 CA GLN A 362 5680 5745 5794 29 -4 84 c ATOMO 1010 CB GLN A 362 35.974 -10.507 -7.118 1.00 45.41 C ANISOU 1010 CB GLN A 362 5707 5735 5811 14 -8 83 C ATOMO 1011 CG GLN A 362 36.150 -10.334 -5.621 1.00 45.58 C ANISOU 1011 CG GLN A 362 5724 5792 5802 -53 11 71 C ATOMO 1012 CD GLN A 362 36.166 -8.891 -5.204 1.00 45.91 C ANISOU 1012 CD GLN A 362. 5751 5817 5875 17 163 20 C ATOMO 1013 OE1 GLN A 362 35.381 -8.478 -4.363 1.00 47.89 O ANISOU 1013 OE1 GLN A 362 6152 5957 6085 -12 83 107 O ATOMO 1014 NE2 GLN A 362 37.063 -8.105 -5.797 1.00 48.21 N ANISOU 1014 NE2 GLN A 362 6100 5959 6259 38 0 10 N ATOMO 1015 C GLN A 362 35.119 -12.139 -8.842 1.00 44.69 C ANISOU 1015 C GLN A 362 5577 5712 5689 45 2 97 C ATOMO 1016 O GLN A 362 35.779 -12.142 -9.875 1.00 45.00 O ANISOU 1016 O GLN A 362 5562 5769 5766 68 40 92 O ATOMO 1017 N VAL A 363 33.799 -12.329 -8.807 1.00 44.15 N ANISOU 1017 N VAL A 363 5530 5638 5605 38 -12 83 N ATOMO 1018 CA VAL A 363 32.983 -12.486 -10.023 1.00 43.03 C ANISOU 1018 CA VAL A 363 5413 5445 5488 52 -6 43 C ATOMO 1019 CB VAL A 363 32.402 -13.912 -10.140 1.00 43.18 C ANISOU 1019 CB VAL A 363 5453 5459 5492 67 13 28 C ATOMO 1020 CG1 VAL A 363 33.520 -14.906 -10.390 1.00 43.95 C ANISOU 1020 CG1 VAL A 363 5470 5624 5603 82 29 48 C ATOMO 1021 CG2 VAL A 363 31.600 -14.302 -8.882 1.00 42.30 C ANISOU 1021 CG2 VAL A 363 5359 5266 5446 80 -4 36 C ATOMO 1022 C VAL A 363 31.853 -11.440 -10.120 1.00 42.52 C ANISOU 1022 C VAL A 363 5376 5398 5380 63 -27 59 C ATOMO 1023 O VAL A 363 31.447 -10.834 -9.104 1.00 42.81 O ANISOU 1023 O VAL A 363 5403 5365 5495 71 -45 3 O ATOMO 1024 N SER A 364 31.354 -11.252 -11.343 1.00 41.31 N ANISOU 1024 N SER A 364 5256 5207 5231 62 -5 118 N ATOMO 1025 CA SER A 364 30.298 -10.280 -11.635 1.00 40.20 C ANISOU 1025 CA SER A 364 5150 5057 5065 36 -19 138 C ATOMO 1026 CB SER A 364 30.652 -9.403 -12.850 1.00 39.70 C ANISOU 1026 CB SER A 364 5109 4974 5002 54 -65 171 C ATOMO 1027 OG SER A 364 31.895 -8.732 -12.692 1.00 37.97 O ANISOU 1027 OG SER A 364 5007 4675 4744 119 -32 315 O ATOMO 1028 C SER A 364 28.962 -10.967 -11.868 1.00 39.95 C ANISOU 1028 C SER A 364 5127 5016 5034 45 -31 160 C ATOMO 1029 O SER A 364 28.831 -11.854 -12.735 1.00 39.44 O ANISOU 1029 O SER A 364 5142 4888 4955 54 -17 221 O ATOMO 1030 N LEU A 365 27.981 -10.554 -11.071 1.00 39.87 N ANISOU 1030 N LEU A 365 5068 5037 5042 61 -21 140 N ATOMO 1031 CA LEU A 365 26.589 -10.955 -11.269 1.00 39.99 C ANISOU 1031 CA LEU A 365 5074 5073 5045 9 -33 86 C ATOMO 1032 CB LEU A 365 25.924 -11.321 -9.937 1.00 40.04 C ANISOU 1032 CB LEU A 365 5074 5098 5040 -11 -44 81 C ATOMO 1033 CG LEU A 365 26.530 -12.451 -9.066 1.00 40.30 C ANISOU 1033 CG LEU A 365 5182 5030 5100 14 -46 30 C ATOMO 1034 CD1 LEU A 365 25.665 -12.646 -7.874 1.00 39.40 C ANISOU 1034 COI LEU A 365 5149 4949 4869 -42 31 113 C ATOMO 1035 CD2 LEU A 365 26.697 -13.782 -9.784 1.00 39.06 C ANISOU 1035 CD2 LEU A 365 5102 4928 4808 -9 -43 35 C ATOMO 1036 C LEU A 365 25.801 -9.848 -11.985 1.00 39.79 C ANISOU 1036 C LEU A 365 4994 5066 5057 24 -48 75 C ATOMO 1037 O LEU A 365 25.823 -8.677 -11.582 1.00 38.88 O ANISOU 1037 O LEU A 365 4910 4982 4882 74 -17 36 O ATOMO 1038 N THR A 366 25.099 -10.244 -13.044 1.00 39.92 N ANISOU 1038 N THR A 366 5000 5095 5069 45 -33 66 N ATOMO 1039 CA THR A 366 24.421 -9.292 -13.933 1.00 39.88 C ANISOU 1039 CA · THR A 366 4988 5034 5128 11 -42 67 C ATOMO 1040 CB THR A 366 24.903 -9.487 -15.393 1.00 39.60 C ANISOU 1040 CB THR A 366 4964 5029 5051 11 -16 62 c ATOMO 1041 OG1 THR A 366 26.320 -9.308 -15.459 1.00 38.90 O ANISOU 1041 OG1 THR A 366 5015 4949 4816 -20 -181 162 O ATOMO 1042 CG2 THR A 366 24.235 -8.512 -16.335 1.00 38.62 C ANISOU 1042 CG2 THR A 366 4770 4839 5062 -13 46 66 C ATOMO 1043 C THR A 366 22.871 -9.311 -13.869 1.00 39.94 C ANISOU 1043 C THR A 366 4957 5035 5180 37 -21 65 C ATOMO 1044 O THR A 366 22.232 -10.335 -14.103 1.00 39.93 O ANISOU 1044 O THR A 366 4869 5040 5262 43 12 60 O ATOMO 1045 N CYS A 367 22.280 -8.161 -13.565 1.00 39.76 N ANISOU 1045 N CYS A 367 4930 5062 ' 5115 29 -27 86 N ATOMO 1046 CA CYS A 367 20.852 -7. 960 -13.805 1.00 39.32 C ANISOU 1046 CA CYS A 367 4931 4985 5022 26 -8 80 C ATOMO 1047 CB CYS A 367 20.233 -7. 205 -12.634 1.00 39.39 C ANISOU 1047 CB CYS A 367 4944 5076 4946 21 -2 117 C ATOMO 1048 SG CYS A 367 18.472 -7. 483 -12.391 1.00 39.53 S ANISOU 1048 SG CYS A 367 4830 5094 5094 24 -129 170 S ATOMO 1049 C CYS A 367 20.601 -7. 210 -15.139 1.00 38.81 C ANISOU 1049 C CYS A 367 4865 4957 4923 15 -1 46 C ATOMO 1050 O CYS A 367 21.014 -6. 067 -15.311 1.00 38.63 O ANISOU 1050 O CYS A 367 4817 5047 4814 9 43 133 O ATOMO 1051 N LEU A 368 19.929 -7. 861 -16.076 1.00 38.38 N ANISOU 1051 N LEU A 368 4830 4891 4859 14 7 46 N ATOMO 1052 CA LEU A 368 19.456 -7. 190 -17.282 1.00 37.80 C ANISOU 1052 CA LEU A 368 4781 4779 4800 -21 24 8 C ATOMO 1053 CB LEU A 368 19.625 -8, 079 -18.516 1.00 37.58 C ANISOU 1053 CB LEU A 368 4733 4775 4770 -33 5 0 C ATOMO 1054 CG LEU A 368 18.982 -7 599 -19.827 1.00 37.13 C ANISOU 1054 CG LEU A 368 4703 4665 4738 -43 63 -35 C ATOMO 1055 CD1 LEU A 368 19.398 -6 178 -20.237 1.00 34.47 C ANISOU 1055 CD1 LEU A 368 4419 4312 4366 -26 110 -219 C ATOMO 1056 CD2 LEU A 368 19.275 -8 606 -20.956 1.00 37.22 C ANISOU 1056 CD2 LEU A 368 4639 4690 4810 -62 -1 -69 C ATOMO 1057 C LEU A 368 17.999 -6 740 -17.158 1.00 37.59 C ANISOU 1057 C LEU A 368 4799 4734 4747 -15 12 21 C ATOMO 1058 O LEU A 368 17.086 -7 ,556 -17.070 1.00 38.09 O ANISOU 1058 O LEU A 368 4826 4762 4883 0 0 19 O ATOMO 1059 N VAL A 369 17.785 -5.433 -17.182 1.00 36.66 N ANISOU 1059 N VAL A 369 4710 4628 4590 -14 8 -31 N ATOMO 1060 CA VAL A 369 16.437 -4.899 -17.150 1.00 35.51 C ANISOU 1060 CA VAL A 369 4618 4432 4441 -32 24 -25 C ATOMO 1061 CB VAL A 369 16.240 -3.901 -15.978 1.00 35.04 C ANISOU 1061 CB VAL A 369 4579 4397 4336 -16 9 -42 C ATOMO 1062 CG1 VAL A 369 14.774 -3.571 -15.809 1.00 32.99 C ANISOU 1062 CG1 VAL A 369 4372 4088 4074 -154 64 -67 C ATOMO 1063 CG2 VAL A 369 16.828 -4.445 -14.690 1.00 33.45 C ANISOU 1063 CG2 VAL A 369 4399 4030 4280 -68 82 -84 C ATOMO 1064 C VAL A 369 16.149 -4.214 -18.495 1.00 35.59 C ANISOU 1064 C VAL A 369 4633 4477 4411 -5 55 -52 C ATOMO 1065 O VAL A 369 16.819 -3.261 -18.862 1.00 33.94 O ANISOU 1065 O VAL A 369 4433 4347 4113 -86 75 14 O ATOMO 1066 N LYS A 370 15.142 -4.699 -19.212 1.00 35.68 N ANISOU 1066 N LYS A 370 4629 4439 4486 5 61 -52 N ATOMO 1067 CA LYS A 370 14.862 -4.155 -20.524 1.00 36.56 C ANISOU 1067 CA LYS A 370 4733 4538 4619 -4 54 -72 C ATOMO 1068 CB LYS A 370 15.582 -4.963 -21.616 1.00 37.40 C ANISOU 1068 CB LYS A 370 4812 4631 4766 21 15 -67 C ATOMO 1069 CG LYS A 370 14.926 -6.255 -22.047 1.00 38.42 C ANISOU 1069 CG LYS A 370 4880 4762 4953 -43 -18 -43 C ATOMO 1070 CD LYS A 370 15.576 -6.722 -23.346 1.00 38.00 C ANISOU 1070 CD LYS A 370 4710 5016 4710 -111 -78 -144 C ATOMO 1071 CE LYS A 370 14.530 -7.210 -24.325 1.00 42.54 C ANISOU 1071 CE LYS A 370 5280 5298 5583 88 107 -138 C ATOMO 1072 NZ LYS A 370 14.737 -6.578 -25.665 1.00 40.11 N ANISOU 1072 NZ LYS A 370 5090 5259 4890 -7 15 108 N ATOMO 1073 C LYS A 370 13.393 -3.913 -20.847 1.00 36.36 C ANISOU 1073 C LYS A 370 4750 4479 4586 26 55 -79 C ATOMO 1074 O LYS A 370 12.496 -4. 426 -20.174 1.00 35.86 O ANISOU 1074 O LYS A 370 4750 4336 4537 38 36 -46 O ATOMO 1075 N GLY A 371 13.164 -3. 101 -21.873 1.00 36.40 N ANISOU 1075 N GLY A 371 4754 4514 4560 14 101 -70 N ATOMO 1076 CA GLY A 371 11.821 -2.792 -22.348 1.00 36.43 C ANISOU 1076 CA GLY A 371 4719 4559 4561 16 44 -51 C o ATOMO 1077 C GLY A 371 10.981 -1.871 -21.467 1.00 36.58 C ANISOU 1077 C GLY A 371 4751 4566 4581 22 1 -59 C ATOMO 1078 O GLY A 371 9.739 -1.850 -21.601 1.00 36.50 O ANISOU 1078 O GLY A 371 4704 4546 4617 42 12 -66 O ATOMO 1079 N PHE A 372 11.624 -1.118 -20.566 1.00 35.97 N ANISOU 1079 N PHE A 372 4631 4483 4552 -15 -16 -47 N ATOMO 1080 CA PHE A 372 10.853 -0.250 -19.635 1.00 34.98 C ANISOU 1080 CA PHE A 372 4543 4431 4315 -24 -65 -38 C ATOMO 1081 CB PHE A 372 11.347 -0.338 -18.188 1.00 34.15 C ANISOU 1081 CB PHE A 372 4462 4305 4208 -30 -25 7 C ATOMO 1082 CG PHE A 372 12.732 0.220 -17.952 1.00 31.81 C ANISOU 1082 CG PHE A 372 4269 4040 3776 7 34 78 C ATOMO 1083 CD1 PHE A 372 12.902 1.534 -17.521 1.00 29.99 C ANISOU 1083 CD1 PHE A 372 4046 4049 3299 -75 66 87 C ATOMO 1084 CE1 PHE A 372 14.158 2.,046 -17.270 1.00 29.52 C ANISOU 1084 CE1 PHE A 372 4091 3871 3254 -37 73 41 C ATOMO 1085 CZ PHE A 372 15.278 1.245 -17.432 1.00 30.63 C ANISOU 1085 CZ PHE A 372 4204 3924 3509 -6 99 84 C ATOMO 1086 CE2 PHE A 372 15.126 -0.073 -17.842 1.00 30.13 C ANISOU 1086 CE2 PHE A 372 4163 4003 3281 -10 108 120 C ATOMO 1087 CD2 PHE A 372 13.849 -0.580 -18.094 1.00 29.81 C ANISOU 1087 CD2 PHE A 372 4076 3919 3330 -84 142 106 C ATOMO 1088 C PHE A 372 10.664 1.198 -20.081 1.00 34.59 C ANISOU 1088 C PHE A 372 4487 4398 4257 -43 -112 -70 C ATOMO 1089 O PHE A 372 11.487 1.745 -20.787 1.00 33.11 O ANISOU 1089 O PHE A 372 4403 4216 3961 -15 -136 -82 O ATOMO 1090 N TY A 373 9.549 1.783 -19.647 1.00 34.91 N ANISOU 1090 N TYR A 373 4521 4486 4255 -49 -176 -43 N ATOMO 1091 CA TYR A 373 9.193 3.175 -19.910 1.00 35.31 C ANISOU 1091 CA TYR A 373 4589 4543 4284 -16 -143 -35 C ATOMO 1092 CB TYR A 373 8.567 3.358 -21.307 1.00 35.68 C ANISOU 1092 CB TYR A 373 4580 4691 4283 -10 -157 -87 C ATOMO 1093 CG TYR A 373 8.621 4.789 -21.762 1.00 34.18 C ANISOU 1093 CG TYR A 373 4411 4534 4041 -21 -162 -10 C ATOMO 1094 CD1 TYR A 373 9.690 5.243 -22.509 1.00 34.45 C ANISOU 1094 CD1 TYR A 373 4413 4527 4147 23 -212 -54 C ATOMO 1095 CE1 TYR A 373 9.774 6.554 -22.912 1.00 34.42 C ANISOU 1095 CE1 TYR A 373 4358 4572 4148 -101 -173 -16 C ATOMO 1096 CZ TYR A 373 8.780 7.423 -22.558 1.00 34.48 C ANISOU 1096 CZ TYR A 373 4422 4435 4243 -45 -91 0 C ATOMO 1097 OH TYR A 373 8.873 8.715 -22.969 1.00 36.84 O ANISOU 1097 OH TYR A 373 4769 4819 4407 -28 -199 64 O ATOMO 1098 CE2 TYR A 373 7.702 7.007 -21.797 1.00 35.52 C ANISOU 1098 CE2 TYR A 373 4524 4712 4258 83 -192 -76 C ATOMO 1099 CD2 TYR A 373 7.622 5.698 -21.414 1.00 33.27 C ANISOU 1099 CD2 TYR A 373 4467 4373 3798 -92 -214 63 C ATOMO 1100 C TYR A 373 8.202 3.675 -18.866 1.00 35.10 C ANISOU 1100 C TYR A 373 4544 4556 4234 -5 -101 20 C ATOMO 1101 O TYR A 373 7.290 2.959 -18.526 1.00 35.49 O ANISOU 1101 O TYR A 373 4648 4556 4281 -4 -149 -115 O ATOMO 1102 N PRO A 374 8.373 4.908 -18.352 1.00 34.96 N ANISOU 1102 N PRO A 374 4537 4551 4194 45 -66 59 N ATOMO 1103 CA PRO A 374 9.466 5.844 -18.520 1.00 35.26 C ANISOU 1103 CA PRO A 374 4581 4561 4251 42 -69 28 C ATOMO 1104 CB PRO A 374 8.950 7.099 -17.813 1.00 35.21 C ANISOU 1104 CB PRO A 374 4553 4560 4265 58 -42 60 C ATOMO 1105 CG PRO A 374 7.997 6.614 -16.837 1.00 35.05 C ANISOU 1105 CG PRO A 374 4419 4469 4428 84 -49 79 C ATOMO 1106 CD PRO A 374 7.309 5.495 -17.527 1.00 35.26 C ANISOU 1106 CD PRO A 374 4566 4516 4316 65 -103 72 C ATOMO 1107 C PRO A 374 10.783 5.361 -17.913 1.00 35.32 C ANISOU 1107 C PRO A 374 4595 4588 4236 62 -26 0 C ATOMO 1108 O PRO A 374 10.835 4.264 -17.344 1.00 35.13 O ANISOU 1108 O PRO A 374 4500 4669 4178 31 -57 -52 O ATOMO 1109 N SER A 375 11.825 6.180 -18.055 1.00 35.27 N ANISOU 1109 N SER A 375 4649 4543 4206 33 -50 -18 N ATOMO 1110 CA SER A 375 13.189 5.833 -17.672 1.00 35.64 C ANISOU 1110 CA SER A 375 4661 4565 4316 56 -9 -5 C ATOMO 1111 CB SER A 375 14.180 6.826 -18.293 1.00 35.47 C ANISOU 1111 CB SER A 375 4643 4554 4277 90 -42 37 C ATOMO 1112 OG SER A 375 14.059 8.122 -17.713 1.00 35.13 O ANISOU 1112 OG SER A 375 4615 4635 4097 -15 -115 99 O ATOMO 1113 C SER A 375 13.422 5.744 -16.151 1.00 36.11 C AN SOU 1113 C SER A 375 4725 4626 4366 77 20 5 C ATOMO 1114 O SER A 375 14.398 5.153 -15.722 1.00 35.49 O ANISOU 1114 O SER A 375 4766 4553 4165 116 99 -42 O ATOMO 1115 N ASP A 376 12.533 6.347 -15.358 1.00 36.79 N ANISOU 1115 N ASP A 376 4838 4675 4462 79 35 8 N ATOMO 1116 CA ASP A 376 12.622 6.326 -13.893 1.00 37.26 C ANISOU 1116 CA ASP A 376 4809 4708 4637 54 59 -73 C ATOMO 1117 CB ASP A 376 11.505 7.175 -13.281 1.00 37.66 C ANISOU 1117 CB ASP A 376 4923 4705 4679 39 24 -73 C ATOMO 1118 CG ASP A 376 11.316 8.474 -14.010 1.00 37.98 C ANISOU 1118 CG ASP A 376 5073 4681 4676 103 74 -82 C ATOMO 1119 OD1 ASP A 376 10.191 8.720 -14.495 1.00 38.29 O ANISOU 1119 OD1 ASP A 376 5022 4872 4652 110 58 -124 O ATOMO 1120 OD2 ASP A 376 12.302 9.227 -14.118 1.00 35.66 O ANISOU 1120 OD2 ASP A 376 4760 4253 4535 135 89 -76 O ATOMO 1121 C ASP A 376 12.549 4.905 -13.354 1.00 37.15 C ANISOU 1121 C ASP A 376 4817 4718 4579 80 84 -76 C ATOMO 1122 O ASP A 376 11.569 4.191 -13.564 1.00 36.68 O ANISOU 1122 O ASP A 376 4770 4615 4551 97 140 -112 O ATOMO 1123 N ILE A 377 13.600 4.508 -12.657 1.00 37.17 N ANISOU 1123 N ILE A 377 4813 4723 4588 72 69 -107 N ATOMO 1124 CA ILE A 377 13.763 3.128 -12.208 1.00 37.39 C ANISOU 1124 CA ILE A 377 4797 4801 4607 45 40 -64 C ATOMO 1125 CB ILE A 377 14.301 2.230 -13.385 1.00 37.15 C ANISOU 1125 CB ILE A 377 4748 4758 4609 63 21 -92 C ATOMO 1126 CG1 ILE A 377 14.247 0.732 -13.024 1.00 36.97 C ANISOU 1126 CG1 ILE A 377 4634 4816 4597 20 -23 -72 C ATOMO 1127 CD1 ILE A 377 14.240 -0.238 -14.232 1.00 36.57 C ANISOU 1127 CD1 ILE A 377 4633 4701 4559 59 46 -11 C ATOMO 1128 CG2 ILE A 377 15.680 2.712 -13.815 1.00 35.92 C ANISOU 1128 CG2 ILE A 377 4679 4583 4385 86 48 -83 C ATOMO 1129 C ILE A 377 14.714 3.107 -11.004 1.00 37.34 C ANISOU 1129 C ILE A 377 4800 4829 4556 19 37 -66 C ATOMO 1130 O ILE A 377 15.420 4.080 -10.762 1.00 37.26 O ANISOU 1130 O ILE A 377 4794 4872 4491 24 40 -63 O ATOMO 1131 N ALA A 378 14.715 2.004 -10.259 1.00 37.20 N ANISOU 1131 N ALA A 378 4763 4859 4511 46 40 -67 N ATOMO 1132 CA ALA A 378 15.600 1.828 -9.108 1.00 37.25 C ANISOU 1132 CA ALA A 378 4784 4835 4533 7 69 -43 C ATOMO 1133 CB ALA A 378 14.914 2.277 -7.836 1.00 36.48 C ANISOU 1133 CB ALA A 378 4699 4751 4411 9 47 -91 C ATOMO 1134 C ALA A 378 16.010 0.362 -9.005 1.00 36.92 C ANISOU 1134 C ALA A 378 4754 4825 4447 10 95 -25 C ATOMO 1135 O ALA A 378 15.193 -0.530 -9.200 1.00 36.27 O ANISOU 1135 O ALA A 378 4740 4750 4291 -5 121 -49 O ATOMO 1136 N VAL A 379 17.279 0.120 -8.715 1.00 36.82 N ANISOU 1136 N VAL A 379 4725 4842 4420 2 94 1 N ATOMO 1137 CA VAL A 379 17.784 -1.248 -8.628 1.00 37.12 C ANISOU 1137 CA VAL A 379 4726 4809 4568 -25 45 13 C ATOMO 1138 CB VAL A 379 18.544 -1.709 -9.905 1.00 36.60 C ANISOU 1138 CB VAL A 379 4604 4751 4550 -2 47 -13 C ATOMO 1139 CG1 VAL A 379 18.767 -3.219 -9.875 1.00 35.07 C ANISOU 1139 CG1 VAL A 379 4394 4622 4307 -46 -4 35 C ATOMO 1140 CG2 VAL A 379 17.795 -1.317 -11.182 1.00 35.08 C ANISOU 1140 CG2 VAL A 379 4482 4481 4363 10 124 -1 C ATOMO 1141 C VAL A 379 18.671 -1.420 -7.396 1.00 38.16 C ANISOU 1141 C VAL A 379 4798 4927 4773 -24 7 3 C ATOMO 1142 O VAL A 379 19.429 -0.532 -7.037 1.00 38.18 O ANISOU 1142 O VAL A 379 4785 4914 4805 -16 -25 12 ATOMO 1143 N GLU A 380 18.537 -2.590 -6.782 1.00 39.23 N ANISOU 1143 N GLU A 380 4938 5049 4919 -34 -11 35 N ATOMO 1144 CA GLU A 380 19.132 -2.979 -5.521 1.00 39.91 C ANISOU 1144 CA GLU A 380 5001 5151 5009 -14 -15 58 C ATOMO 1145 CB GLU A 380 18.105 -2.836 -4.402 1.00 40.43 C ANISOU 1145 CB GLU A 380 5124 5190 5045 -5 -16 64 C ATOMO 1146 CG GLU A 380 18.362 -1.738 -3.389 1.00 42.17 C ANISOU 1146 CG GLU A 380 5360 5320 5342 32 -171 80 C ATOMO 1147 CD GLU A 380 17.614 -2.017 -2.100 1.00 42.78 C ANISOU 1147 CD GLU A 380 5158 5727 5370 116 5 121 C ATOMO 1148 OE1 GLU A 380 18.231 -2.566 -1.163 1.00 47.83 O ANISOU 1148 OE1 GLU A 380 6101 6126 5945 -126 75 20 O ATOMO 1149 OE2 GLU A 380 16.400 -1.757 -2.035 1.00 44.96 O ANISOU 1149 OE2 GLU A 380 5954 5476 5650 139 -62 98 O ATOMO 1150 C GLU A 380 19.455 -4.455 -5.653 1.00 39.85 C ANISOU 1150 C GLU A 380 5002 5135 5004 -37 4 77 C ATOMO 1151 O GLU A 380 18.764 -5.188 -6.373 1.00 40.25 O ANISOU 1151 O GLU A 380 5041 5193 5055 -78 -3 155 O ATOMO 1152 N TRP A 381 20.525 -4.883 -4.991 1.00 39.62 N ANISOU 1152 N TRP A 381 4988 5103 4960 -22 19 92 N ATOMO 1153 CA TRP A 381 20.811 -6.302 -4.832 1.00 39.46 C ANISOU 1153 CA TRP A 381 4896 5090 5004 38 -4 35 C ATOMO 1154 CB TRP A 381 22.186 -6.672 -5.399 1.00 36.87 C ANISOU 1154 CB TRP A 381 4655 4832 4520 30 23 -91 C ATOMO 1155 CG TRP A 381 22.339 -6.667 -6.907 1.00 35.55 C ANISOU 1155 CG TRP A 381 4204 4698 4603 56 -104 34 C ATOMO 1156 CD1 TRP A 381 22.580 -5.579 -7.708 1.00 34.03 C ANISOU 1156 CD1 TRP A 381 4124 4434 4368 59 -71 -36 ATOMO 1157 NE1 TRP A 381 22.702 -5.972 -9.020 1.00 32.72 N ANISOU 1157 NE1 TRP A 381 4017 4085 4329 60 -50 143 N ATOMO 1158 CE2 TRP A 381 22.554 -7.332 -9.093 1.00 33.85 C ANISOU 1158 CE2 TRP A 381 3981 4555 4323 111 -94 101 C ATOMO 1159 CD2 TRP A 381 22.337 -7.806 -7.779 1.00 33.47 C ANISOU 1159 CD2 TRP A 381 3886 4432 4397 76 -69 127 C ATOMO 1160 CE3 TRP A 381 22.170 -9.179 -7.580 1.00 32.88 C ANISOU 1160 CE3 TRP A 381 3976 4447 4068 -65 -127 39 C ATOMO 1161 CZ3 TRP A 381 22.231 -10.030 -8.681 1.00 35.44 C ANISOU 1161 CZ3 TRP A 381 4009 4794 4660 101 -42 213 C ATOMO 1162 CH2 TRP A 381 22.435 -9.520 -9.972 1.00 34.99 C ANISOU 1162 CH2 TRP A 381 4060 4680 4552 47 1 121 C ATOMO 1163 CZ2 TRP A 381 22.611 -8.179 -10.191 1.00 33.99 C ANISOU 1163 CZ2 TRP A 381 4025 4431 4455 65 -84 182 C ATOMO 1164 C TRP A 381 20.740 -6.654 -3.337 1.00 40.26 C ANISOU 1164 C TRP A 381 5035 5192 5067 47 -30 55 c ATOMO 1165 O TRP A 381 20.945 -5.799 -2.475 1.00 39.66 O ANISOU 1165 O TRP A 381 4949 5140 4979 133 -91 17 O ATOMO 1166 N GLU A 382 20.443 -7.914 -3.051 1.00 41.50 N ANISOU 1166 N GLU A 382 5218 5300 5247 27 -21 45 N ATOMO 1167 CA GLU A 382 20.251 -8.407 -1.685 1.00 42.87 C ANISOU 1167 CA GLU A 382 5409 5466 5411 39 -22 74 C ATOMO 1168 CB GLU A 382 18.793 -8.269 -1.244 1.00 43.55 C ANISOU 1168 CB GLU A 382 5498 5513 5534 40 6 64 C ATOMO 1169 CG GLU A 382 18.342 -6.887 -0.771 1.00 46.25 C ANISOU 1169 CG GLU A 382 5998 5768 5807 -22 21 16 C ATOMO 1170 CD GLU A 382 16.931 -6.573 -1.248 1.00 44.15 C ANISOU 1170 CD GLU A 382 5607 6334 4832 111 89 195 C ATOMO 1171 OE1 GLU A 382 16.003 -6.614 -0.420 1.00 48.91 O ANISOU 1171 OE1 GLU A 382 6266 6173 6143 76 -184 -79 O ATOMO 1172 OE2 GLU A 382 16.748 -6, 330 -2.470 1.00 51.39 O ANISOU 1172 OE2 GLU A 382 6325 6387 6814 -32 -58 41 O ATOMO 1173 C GLU A 382 20.600 -9 891 -1.653 1.00 43.58 C ANISOU 1173 C GLU A 382 5532 5524 5502 23 -11 78 C ATOMO 1174 O GLU A 382 20.553 -10 579 -2.697 1.00 42.96 O ANISOU 1174 O GLU A 382 5527 5460 5335 -5 -20 53 O ATOMO 1175 N SER A 383 20.946 -10 360 -0.445 1.00 44.09 N ANISOU 1175 N SER A 383 5623 5628 5499 25 18 122 N ATOMO 1176 CA SER A 383 21.216 -11 777 -0.161 1.00 44.79 C ANISOU 1176 CA SER A 383 5700 5676 5639 6 37 118 C ATOMO 1177 CB SER A 383 22.699 -12 113 -0.341 1.00 44.80 C ANISOU 1177 CB SER A 383 5702 5678 5642 31 37 101 c ATOMO 1178 OG SER A 383 22.882 -13 478 -0.685 1.00 45.36 O ANISOU 1178 OG SER A 383 5763 5641 5831 -6 83 127 O ATOMO 1179 C SER A 383 20.796 -12 028 1.283 1.00 45.26 C ANISOU 1179 C SER A 383 5775 5768 5653 -9 11 120 C ATOMO 1180 O SER A 383 20.992 -11 161 2.160 1.00 45.04 O ANISOU 1180 O SER A 383 5758 5784 5569 19 43 149 O ATOMO 1181 N ASN A 384 20.208 -13 ,202 1.518 1.00 46.24 N ANISOU 1181 N ASN A 384 5912 5856 5798 7 -6 130 N ATOMO 1182 CA ASN A 384 19.541 -13 .516 2.797 1.00 47.30 C ANISOU 1182 CA ASN A 384 5994 6002 5973 9 40 89 C ATOMO 1183 CB ASN A 384 20.223 -14 .686 3.546 1.00 47.81 C ANISOU 1183 CB ASN A 384 6076 6055 6032 50 28 85 C ATOMO 1184 CG ASN A 384 21.711 -14 .835 3.202 1.00 49.23 C ANISOU 1184 CG ASN A 384 6239 6244 6220 11 -19 15 C ATOMO 1185 OD1 ASN A 384 22.561 -14.139 3.771 1.00 51.62 O ANISOU 1185 OD1 ASN A 384 6694 6509 6407 -81 -122 -51 O ATOMO 1186 ND2 ASN A 384 22.030 -15.768 2.276 1.00 50.24 N ANISOU 1186 ND2 ASN A 384 6461 6386 6242 154 -7 90 N ATOMO 1187 C ASN A 384 19.305 -12.315 3.720 1.00 47.46 C ANISOU 1187 C ASN A 384 6002 5998 6034 3 30 68 C ATOMO 1188 O ASN A 384 19.988 -12.138 4.745 1.00 47.50 O ANISOU 1188 O ASN A 384 5997 6046 6002 -31 14 128 O ATOMO 1189 N GLY A 385 18.354 -11.468 3.321 1.00 48.01 N ANISOU 1189 N GLY A 385 6027 6061 6150 -4 39 51 N ATOMO 1190 CA GLY A 385 17.871 -10.396 4.198 1.00 48.23 C ANISOU 1190 CA GLY A 385 6064 6061 6200 13 51 19 C ATOMO 1191 C GLY A 385 18.621 -9.098 4.087 1.00 48.46 C ANISOU 1191 C GLY A 385 6080 6127 6205 -3 47 15 C ATOMO 1192 O GLY A 385 18.014 -8.041 3.849 1.00 49.13 O ANISOU 1192 O GLY A 385 6172 6193 6300 0 74 -4 O ATOMO 1193 N GLN A 386 19.938 -9.186 4.258 1.00 48.32 N ANISOU 1193 N GLN A 386 6069 6151 6136 -3 -15 14 N ATOMO 1194 CA GLN A 386 20.841 -8.054 4.091 1.00 48.32 C ANISOU 1194 CA GLN A 386 6053 6229 6077 -28 -15 30 C ATOMO 1195 CB GLN A 386 22.184 -8.360 4.790 1.00 48.91 C ANISOU 1195 CB GLN A 386 6138 6313 6130 -23 -19 49 C ATOMO 1196 CG GLN A 386 22.173 -8.184 6.332 1.00 49.93 C ANISOU 1196 CG GLN A 386 6349 6323 6297 12 17 -18 C ATOMO 1197 CD GLN A 386 21.542 -6.872 6.784 1.00 53.93 C ANISOU 1197 CD GLN A 386 7210 6843 6437 62 21 77 C ATOMO 1198 OE1 GLN A 386 22.249 -5.898 7.064 1.00 52.63 O ANISOU 1198 OE1 GLN A 386 6586 6564 6846 -191 -29 -6 O ATOMO 1199 NE2 GLN A 386 20.209 -6.839 6.856 1.00 50.58 N A ISOU 1199 NE2 GLN A 386 6207 6607 6405 -46 59 43 N ATOMO 1200 C GLN A 386 21.064 -7.587 2. 620 1.00 47.59 C ANISOU 1200 C GLN A 386 5946 6111 6025 -11 -32 25 C ATOMO 1201 O GLN A 386 20.871 -8.355 1. 660 1.00 47.43 O ANISOU 1201 O GLN A 386 5872 6171 5978 -14 5 -8 O ATOMO 1202 N PRO A 387 21.469 -6.317 2. .452 1.00 46.79 N ANISOU 1202 N PRO A 387 5884 5981 5912 8 -30 38 N ATOMO 1203 CA PRO A 387 21.779 -5.739 1. .158 1.00 46.49 C ANISOU 1203 CA PRO A 387 5862 5936 5864 6 -19 30 C ATOMO 1204 CB PRO A 387 21.498 -4.243 1. .368 1.00 46.62 C ANISOU 1204 CB PRO A 387 5909 5918 5886 -16 -15 26 C ATOMO 1205 CG PRO A 387 21.249 -4.046 2. .854 1.00 46.58 C ANISOU 1205 CG PRO A 387 5910 5950 5836 -20 -43 57 C ATOMO 1206 CD PRO A 387 21.622 -5.325 3 .529 1.00 47.03 C ANISOU 1206 CD PRO A 387 5913 5996 5958 15 -45 16 C ATOMO 1207 C PRO A 387 23.235 -5.928 0 .705 1.00 46.20 C ANISOU 1207 C PRO A 387 5849 5892 5812 -33 -23 39 C ATOMO 1208 O PRO A 387 24.173 -5.617 1 .452 1.00 46.11 O ANISOU 1208 O PRO A 387 5879 5882 5758 -50 -52 64 O ATOMO 1209 N GLU A 388 23.408 -6.433 -0 .517 1.00 45.47 N ANISOU 1209 N GLU A 388 5756 5801 5720 -47 -20 52 N ATOMO 1210 CA GLU A 388 24.694 -6.403 -1 .195 1.00 44.97 C ANISOU 1210 CA GLU A 388 5683 5738 5662 -18 -10 44 C ATOMO 1211 CB GLU A 388 24.706 -7.402 -2 .338 1.00 44.97 C ANISOU 1211 CB GLU A 388 5665 5761 5658 -20 -28 47 C ATOMO 1212 CG GLU A 388 24.340 -8.830 -1 .945 1.00 46.39 C ANISOU 1212 CG GLU A 388 5861 5872 5891 -63 -42 82 C ATOMO 1213 CD GLU A 388 25.323 -9.460 -0.970 1.00 48.03 C A ISOU 1213 CD GLU A 388 6158 6071 6019 -44 -74 23 C ATOMO 1214 OE1 GLU A 388 26.552 -9.400 -1.201 1.00 47.49 O ANISOU 1214 OE1 GLU A 388 6152 6000 5891 0 39 1 O ATOMO 1215 OE2 GLU A 388 24.856 -10.029 0.035 1.00 49.67 O ANISOU 1215 OE2 GLU A 388 6394 6329 6149 -70 29 56 O ATOMO 1216 C GLU A 388 24.879 -4.998 -1.738 1.00 44.67 C ANISOU 1216 C GLU A 388 5627 5760 5582 -57 10 43 C ATOMO 1217 O GLU A 388 24.084 -4.530 -2.545 1.00 45.07 O ANISOU 1217 O GLU A 388 5666 5799 5660 -63 32 78 O ATOMO 1218 N ASN A 389 25.901 -4.298 -1.279 1.00 44.47 N ANISOU 1218 N ASN A 389 5659 5699 5537 -59 24 35 N ATOMO 1219 CA ASN A 389 26.079 -2.904 -1.704 1.00 44.04 C ANISOU 1219 CA ASN A 389 5629 5641 5462 -27 10 35 C ATOMO 1220 CB ASN A 389 26.024 -1.961 -0.492 1.00 44.59 C ANISOU 1220 CB ASN A 389 5722 5687 5532 -8 38 20 C ATOMO 1221 CG ASN A 389 24.585 -1.678 -0.037 1.00 46.42 C ANISOU 1221 CG ASN A 389 5840 6045 5752 -29 -7 33 C ATOMO 1222 OD1 ASN A 389 23.682 -1.555 -0.863 1.00 47.34 O ANISOU 1222 OD1 ASN A 389 6045 6314 5625 -18 -114 -3 O ATOMO 1223 ND2 ASN A 389 24.374 -1.565 1.288 1.00 48.67 N ANISOU 1223 ND2 ASN A 389 6260 6364 5865 -48 -31 -51 N ATOMO 1224 C ASN A 389 27.307 -2.672 -2.610 1.00 43.16 C ANISOU 1224 C ASN A 389 5533 5513 5352 -26 18 33 C ATOMO 1225 O ASN A 389 27.627 -1.534 -2.972 1.00 43.60 O ANISOU 1225 O ASN A 389 5592 5599 5374 -86 14 23 O ATOMO 1226 N ASN A 390 27.945 -3.773 -2.997 1.00 41.86 N ANISOU 1226 N ASN A 390 5352 5379 5173 23 45 56 N ATOMO 1227 CA ASN A 390 29.083 -3.793 -3.919 1.00 41.00 C ANISOU 1227 CA ASN A 390 5220 5249 5109 20 7 74 C ATOMO 1228 CB ASN A 390 29.966 -4.979 -3.549 1.00 41.19 C ANISOU 1228 CB ASN A 390 5221 5310 5120 45 27 70 C ATOMO 1229 CG ASN A 390 31.368 -4.870 -4.090 1.00 41.56 C ANISOU 1229 CG ASN A 390 5312 5363 5115 -2 43 34 C ATOMO 1230 OD1 ASN A 390 31.868 -3.776 -4.364 1.00 41.19 O ANISOU 1230 OD1 ASN A 390 5395 5253 5003 -42 153 41 O ATOMO 1231 ND2 ASN A 390 32.025 -6.025 -4.233 1.00 41.17 N ANISOU 1231 ND2 ASN A 390 5229 5437 4976 143 37 31 N ATOMO 1232 C ASN A 390 28.594 -3.918 -5.382 1.00 40.10 C ANISOU 1232 C ASN A 390 5080 5147 5009 44 50 76 C ATOMO 1233 O ASN A 390 28.961 -4.838 -6.130 1.00 39.50 O ANISOU 1233 O ASN A 390 5007 5028 4970 3 76 100 O ATOMO 1234 N TYR A 391 27.732 -2.989 -5.776 1.00 38.85 N ANISOU 1234 N TYR A 391 4892 5023 4845 30 31 97 N ATOMO 1235 CA TYR A 391 27.123 -3.060 -7.093 1.00 37.67 C ANISOU 1235 CA TYR A 391 4723 4859 4729 39 55 30 C ATOMO 1236 CB TYR A 391 25.674 -3.607 -7.023 1.00 37.59 C ANISOU 1236 CB TYR A 391 4770 4816 4693 80 13 10 C ATOMO 1237 CG TYR A 391 24.671 -2.674 -6.375 1.00 38.73 C ANISOU 1237 CG TYR A 391 4872 5036 4808 -63 -19 82 C ATOMO 1238 CD1 TYR A 391 24.362 -2.780 -5.014 1.00 37.63 C ANISOU 1238 CD1 TYR A 391 4713 4862 4722 177 116 46 C ATOMO 1239 CE1 TYR A 391 23.443 -1.907 -4.407 1.00 38.01 C ANISOU 1239 CE1 TYR A 391 4865 4872 4702 -18 48 130 C ATOMO 1240 CZ TYR A 391 22.846 -0.928 -5.185 1.00 38.97 C ANISOU 1240 CZ TYR A 391 4955 4954 4896 -4 -26 90 ATOMO 1241 OH TYR A 391 21.946 -0.056 -4.628 1.00 37.74 O ANISOU 1241 OH TYR A 391 4898 4791 4649 209 262 -75 O ATOMO 1242 CE2 TYR A 391 23.138 -0.815 -6.539 1.00 35.97 C ANISOU 1242 CE2 TYR A 391 4646 4399 4619 38 163 83 C ATOMO 1243 CD2 TYR A 391 24.039 -1.671 -7.119 1.00 36.37 C ANISOU 1243 CD2 TYR A 391 4651 4617 4551 -25 77 44 C ATOMO 1244 C TYR A 391 27.200 -1.701 -7.765 1.00 36.92 C ANISOU 1244 C TYR A 391 4614 4817 4594 42 51 55 C ATOMO 1245 O TYR A 391 27.351 -0.657 -7.114 1.00 36.53 O ANISOU 1245 O TYR A 391 4501 4815 4562 -50 -10 88 O ATOMO 1246 N LYS A 392 27.118 -1.716 -9.081 1.00 36.62 N ANISOU 1246 N LYS A 392 4561 4727 4624 54 58 1 N ATOMO 1247 CA LYS A 392 27.049 -0.484 -9.842 1.00 35.22 C ANISOU 1247 CA LYS A 392 4471 4551 4359 25 92 57 C ATOMO 1248 CB LYS A 392 28.381 -0.165 -10.507 1.00 34.96 C ANISOU 1248 CB LYS A 392 4479 4541 4263 56 38 59 C ATOMO 1249 CG LYS- A 392 29.467 0.393 -9.610 1.00 33.97 C ANISOU 1249 CG LYS A 392 4364 4380 4162 9 118 142 C ATOMO 1250 CD LYS A 392 29.178 1.783 -9.077 1.00 30.65 C ANISOU 1250 CD LYS A 392 3873 4093 3676 -50 -59 22 C ATOMO 1251 CE LYS A 392 30.097 2.063 -7.905 1.00 34.02 C ANISOU 1251 CE LYS A 392 4211 4391 4322 54 232 178 C ATOMO 1252 NZ LYS A 392 29.956 3.443 -7.308 1.00 33.12 N ANISOU 1252 NZ LYS A 392 4344 4095 4143 80 8 56 N ATOMO 1253 C LYS A 392 25.990 -0.715 -10.856 1.00 34.87 C ANISOU 1253 C LYS A 392 4403 4536 4310 11 107 58 C ATOMO 1254 O LYS A 392 25.872 -1.819 -11.377 1.00 35.62 O ANISOU 1254 O LYS A 392 4423 4675 4433 32 181 150 ATOMO 1255 N THR A 393 25.182 0.301 -11.113 1.00 34.71 N ANISOU 1255 N THR A 393 4367 4517 4301 -7 76 10 N ATOMO 1256 CA THR A 393 24.148 0.202 -12.152 1.00 34.16 C ANISOU 1256 CA THR A 393 4265 4432 4281 0 19 3 C ATOMO 1257 CB THR A 393 22.709 0.335 -11.564 1.00 34.10 C ANISOU 1257 CB THR A 393 4267 4421 4266 -9 30 -26 C ATOMO 1258 OG1 THR A 393 22.539 -0.610 -10.500 1.00 33.81 O ANISOU 1258 OG1 THR A 393 4259 4412 4172 -1 -82 -7 O ATOMO 1259 CG2 THR A 393 21.632 0.074 -12.619 1.00 32.60 C ANISOU 1259 CG2 THR A 393 4085 4261 4038 42 66 47 C ATOMO 1260 C THR A 393 24.399 1.248 -13.221 1.00 33.43 C ANISOU 1260 C THR A 393 4164 4382 4153 14 6 11 C ATOMO 1261 O THR A 393 24.712 2.402 -12.916 1.00 32.42 O ANISOU 1261 O THR A 393 3933 4348 4036 27 -28 52 O ATOMO 1262 N THR A 394 24.280 0.831 -14.475 1.00 33.41 N ANISOU 1262 N THR A 394 4194 4326 4173 -21 1 -3 N ATOMO 1263 CA THR A 394 24.354 1.770 -15.604 1.00 32.96 C ANISOU 1263 CA THR A 394 4273 4227 4022 -7 8 -20 C ATOMO 1264 CB THR A 394 24.438 1.072 -17.010 1.00 32.13 C ANISOU 1264 CB THR A 394 4197 4083 3928 -5 10 -4 C ATOMO 1265 OG1 THR A 394 23.164 0.562 -17.403 1.00 30.15 O ANISOU 1265 OG1 THR A 394 4301 3693 3462 100 189 -92 O ATOMO 1266 CG2 THR A 394 25.420 -0.023 -17.015 1.00 32.17 C ANISOU 1266 CG2 THR A 394 4155 4105 3960 10 -1 -49 C ATOMO 1267 C THR A 394 23.180 2.745 -15.578 1.00 33.10 C ANISOU 1267 C THR A 394 4317 4262 3996 22 -31 -57 C ATOMO 1268 O THR A 394 22.111 2.399 -15.084 1.00 31.47 O ANISOU 1268 O THR A 394 4242 4074 3640 41 -14 -63 ATOMO 1269 N PRO A 395 23.384 3.974 -16.096 1.00 33.99 N ANISOU 1269 N PRO A 395 4452 4367 4095 17 0 -46 N ATOMO 1270 CA PRO A 395 22.219 4.810 -16.436 1.00 34.48 C ANISOU 1270 CA PRO A 395 4508 4400 4191 5 0 -2 C ATOMO 1271 CB PRO A 395 22.838 6.025 -17.138 1.00 34.62 C ANISOU 1271 CB PRO A 395 4510 4435 4207 39 10 16 C ATOMO 1272 CG PRO A 395 24.252 6.053 -16.758 1.00 34.22 C ANISOU 1272 CG PRO A 395 4486 4452 4064 2 -63 -21 C ATOMO 1273 CD PRO A 395 24.661 4.648 -16.377 1.00 33.86 C ANISOU 1273 CD PRO A 395 4399 4344 4121 12 -25 -108 C ATOMO 1274 C PRO A 395 21.270 4.066 -17.399 1.00 34.85 C ANISOU 1274 C PRO A 395 4538 4450 4251 -27 24 75 C ATOMO 1275 O PRO A 395 21.690 3.069 -18.027 1.00 33.16 O ANISOU 1275 O PRO A 395 4370 4274 3952 -56 11 94 O ATOMO 1276 N PRO A 396 19.994 4.510 -17.489 1.00 35.07 N ANISOU 1276 N PRO A 396 4573 4414 4338 -15 31 90 N ATOMO 1277 CA PRO A 396 19.125 3.923 -18.487 1.00 35.48 C ANISOU 1277 CA PRO A 396 4599 4477 4402 -4 21 48 C ATOMO 1278 CB PRO A 396 17.743 4.529 -18.186 1.00 35.53 C ANISOU 1278 CB PRO A 396 4659 4433 4407 -25 75 67 C ATOMO 1279 CG PRO A 396 17.867 5.217 -16.873 1.00 35.18 C ANISOU 1279 CG PRO A 396 4624 4408 4334 -59 3 93 C ATOMO 1280 CD PRO A 396 19.303 5.531 -16.681 1.00 35.32 C ANISOU 1280 CD PRO A 396 4594 4469 4356 -36 28 82 C ATOMO 1281 C PRO A 396 19.586 4.324 -19.886 1.00 35.60 C ANISOU 1281 C PRO A 396 4558 4488 4477 -4 25 45 C ATOMO 1282 O PRO A 396 19.954 5.475 -20.105 1.00 34.99 O ANISOU 1282 O PRO A 396 4438 4447 4409 -29 -6 -1 O ATOMO 1283 N VAL A 397 19.574 3.361 -20.811 1..00 35.51 N ANISOU 1283 N VAL A 397 4544 4506 4441 17 17 29 N ATOMO 1284 CA VAL A 397 19.934 3.603 -22.199 1.00 35.28 C ANISOU 1284 CA VAL A 397 4527 4479 4397 49 41 -32 C ATOMO 1285 CB VAL A 397 21.078 2.664 -22.649 1.00 35.15 C ANISOU 1285 CB VAL A 397 4516 4432 4406 15 -5 15 C ATOMO 1286 CG1 VAL A 397 21.631 3.022 -24.077 1.00 32.51 C ANISOU 1286 CG1 VAL A 397 4128 4063 4159 162 -111 -9 C ATOMO 1287 CG2 VAL A 397 22.212 2.715 -21.598 1.00 3 .48 C ANISOU 1287 CG2 VAL A 397 4490 4344 4264 57 -19 107 C ATOMO 1288 C VAL A 397 18.679 3.500 -23.052 1.00 35.75 C ANISOU 1288 C VAL A 397 4638 4562 4383 61 96 -101 C ATOMO 1289 O VAL A 397 17.902 2.554 -22.928 1.00 35.03 O ANISOU 1289 O VAL A 397 4596 4513 4200 112 126 -186 O ATOMO 1290 N LEU A 398 18.454 4.511 -23.882 1.00 36.47 N ANISOU 1290 N LEU A 398 4739 4629 4488 94 73 -100 N ATOMO 1291 CA LEU A 398 17.325 4.490 -24.793 1.00 37.45 C ANISOU 1291 CA LEU A 398 4793 4772 4664 41 20 -48 C ATOMO 1292 CB LEU A 398 17.122 5.874 -25.398 1.00 37.18 C ANISOU 1292 CB LEU A 398 4747 4739 4639 16 -9 -44 C ATOMO 1293 CG LEU A 398 16.080 5.972 -26.506 1.00 37.09 C ANISOU 1293 CG LEU A 398 4734 4681 4674 50 -12 25 C ATOMO 1294 CD1 LEU A 398 14.703 6.031 -25.905 1.00 33.79 C ANISOU 1294 CD1 LEU A 398 4353 4255 4230 41 -3 61 C ATOMO 1295 CD2 LEU A 398 16.370 7.193 -27.347 1.00 35.57 C ANISOU 1295 CD2 LEU A 398 4571 4494 4446 -15 49 72 C ATOMO 1296 C LEU A 398 17.556 3.429 -25.888 1.00 38.23 C ANISOU 1296 C LEU A 398 4890 4908 4728 11 15 -44 C ATOMO 1297 O LEU A 398 18.563 3.460 -26.582 1.00 38.51 O ANISOU 1297 O LEU A 398 4999 4941 4690 0 55 -39 O ATOMO 1298 N ASP A 399 16.635 2.480 -25.991 1.00 38.60 N ANISOU 1298 N ASP A 399 4899 4972 4792 -36 -27 -45 N ATOMO 1299 CA ASP A 399 16.765 1.320 -26.873 1.00 39.01 C ANISOU 1299 CA ASP A 399 4912 5053 4854 -29 24 -35 C ATOMO 1300 CB ASP A 399 16.199 0.086 -26.161 1.00 38.88 C ANISOU 1300 CB ASP A 399 4905 4978 4887 15 -41 -51 C ATOMO 1301 CG ASP A 399 16.844 -1.192 -26.597 1.00 38.32 C ANISOU 1301 CG ASP A 399 4804 4963 4792 -65 -106 -121 C ATOMO 1302 OD1 ASP A 399 17.484 -1.181 -27.654 1.00 37.78 O ANISOU 1302 OD1 ASP A 399 4733 4944 4677 -131 237 20 O ATOMO 1303 OD2 ASP A 399 16.695 -2.218 -25.888 1.00 34.88 O ANISOU 1303 OD2 ASP A 399 4527 4630 4095 -144 -197 -160 O ATOMO 1304 C ASP A 399 16.021 1.580 -28.189 1.00 39.56 C ANISOU 1304 C ASP A 399 4970 5121 4940 -44 -39 -55 C ATOMO 1305 O ASP A 399 15.173 2.463 -28.256 1.00 39.73 O ANISOU 1305 O ASP A 399 4986 5183 4925 -115 -74 -71 O ATOMO 1306 N SER A 400 16.337 0.812 -29.230 1.00 40.64 N ANISOU 1306 N SER A 400 5096 5273 5071 -57 -46 -54 N ATOMO 1307 CA SER A 400 15.840 1.082 -30.596 1.00 41.15 C ANISOU 1307 CA SER A 400 5251 5323 5061 -17 -32 -8 C ATOMO 1308 CB SER A 400 16.537 0.177 -31.634 1.00 41.51 C ANISOU 1308 CB SER A 400 5316 5343 5111 -10 -34 -7 C ATOMO 1309 OG SER A 400 16.267 -1.193 -31.421 1.00 41.13 O ANISOU 1309 OG SER A 400 5528 5227 4871 -68 -46 -78 O ATOMO 1310 C SER A 400 14.306 1.094 -30.795 1.00 41.37 C ANISOU 1310 C SER A 400 5252 5362 5103 -45 -34 -4 C ATOMO 1311 O SER A 400 13.809 1.646 -31.793 00 41.91 O ANISOU 1311 O SER A 400 5272 5451 5198 -42 -44 15 O • ATOMO 1312 N ASP A 401 13.567 0.507 -29.850 00 40.91 N ANISOU 1312 N ASP A 401 5201 5318 5025 -65 -57 -11 N ATOMO 1313 CA ASP A 401 12.096 0.529 -29.865 00 40.44 C ANISOU 1313 CA ASP A 401 5132 5251 4983 -27 -42 18 C ATOMO 1314 CB ASP A 401 11.534 -0.798 -29.335 00 40.38 C ANISOU 1314 CB ASP A 401 5139 5233 4968 -25 -21 -7 C ATOMO 1315 CG ASP A 401 11.904 -1.060 -27.886 00 38.85 C ANISOU 1315 CG ASP A 401 4987 4862 4910 -73 -13 26 C ATOMO 1316 OD1 ASP A 401 12.436 -0.155 -27.202 00 37.74 O ANISOU 1316 OD1 ASP A 401 4636 5156 4545 38 31 174 O ATOMO 1317 OD2 ASP A 401 11.649 -2.183 -27.431 00 39.72 O ANISOU 1317 OD2 ASP A 401 5010 5104 4977 -4 75 7 O ATOMO 1318 C ASP A 401 11.449 1.680 -29.094 00 39.90 C ANISOU 1318 C ASP A 401 5041 5177 4940 -43 -37 66 C ATOMO 1319 O ASP A 401 10.225 1, 774 -29.043 00 40.25 O ANISOU 1319 O ASP A 401 5049 5289 4953 -69 -45 118 O ATOMO 1320 N GLY A 402 12.250 2 543 -28.477 00 39.08 N ANISOU 1320 N GLY A 402 4955 5065 4828 -36 -20 89 N ATOMO 1321 CA GLY A 402 11.704 3 649 -27.704 00 37.86 C ANISOU 1321 CA GLY A 402 4786 4893 4704 -52 -13 78 C ATOMO 1322 C GLY A 402 11.595 3 341 -26.218 00 37.33 C ANISOU 1322 C GLY A 402 4692 4826 4663 -63 -17 32 C ATOMO 1323 O GLY A 402 11.207 4.196 -25.442 00 36.37 O ANISOU 1323 O GLY A 402 4563 4782 4474 -59 -1 82 O ATOMO 1324 N SER A 403 11.926 2.109 -25.833 00 37.09 N ANISOU 1324 N SER A 403 4673 4844 4574 -62 -36 47 N ATOMO 1325 CA SER A 403 11.950 1.716 -24.434 1.00 36.37 C ANISOU 1325 CA SER A 403 4631 4747 4437 -49 -21 -12 C ATOMO 1326 CB SER A 403 11.448 0.278 -24.256 1.00 36.02 C ANISOU 1326 CB SER A 403 4574 4762 4349 -7 -46 2 C ATOMO 1327 OG SER A 403 12.414 -0.692 -24.631 1.00 33.78 O ANISOU 1327 OG SER A 403 4447 4556 3833 -138 -49 0 O ATOMO 1328 C · SER A 403 13.386 1.883 -23.941 1.00 36.54 C ANISOU 1328 C SER A 403 4660 4740 4482 -12 25 -5 C ATOMO 1329 O SER A 403 14.295 2.067 -24.761 1.00 36.38 O ANISOU 1329 O SER A 403 4672 4720 4430 -40 37 14 O ATOMO 1330 N PHE A 404 13.581 1.845 -22.620 1.00 35.39 N ANISOU 1330 N PHE A 404 4542 4621 4282 -38 41 -73 N ATOMO 1331 CA PHE A 404 14.907 1.883 -22.036 1.00 34.51 C ANISOU 1331 CA PHE A 404 4526 4498 4089 6 74 -104 C ATOMO 1332 CB PHE A 404 14.966 2.842 -20.820 1.00 33.40 C ANISOU 1332 CB PHE A 404 4419 4290 3980 33 38 -95 C ATOMO 1333 CG PHE A 404 14.744 4.276 -21.166 1.00 30.44 C ANISOU 1333 CG PHE A 404 4161 4147 3255 -31 -6 -191 C ATOMO 1334 CD1 PHE A 404 15.823 5.101 -21.466 1.00 26.60 C ANISOU 1334 CD1 PHE A 404 3621 3887 2596 99 -79 -402 C ATOMO 1335 CE1 PHE A 404 15.644 6.447 -21.816 1.00 26.39 C ANISOU 1335 CE1 PHE A 404 3482 3882 2662 -15 8 -185 C ATOMO 1336 CZ PHE A 404 14.347 6.978 -21.858 1.00 32.27 C ANISOU 1336 CZ PHE A 404 4351 4333 3573 50 -33 -132 C ATOMO 1337 CE2 PHE A 404 13.225 6.145 -21.550 1.00 29.16 C ANISOU 1337 CE2 PHE A 404 3933 3731 3415 -11 40 -51 C ATOMO 1338 CD2 PHE A 404 13.445 4.805 -21.208 1.00 30.50 C ANISOU 1338 CD2 PHE A 404 4166 4173 3248 -128 106 -201 ATOMO 1339 C PHE A 404 15.373 0.499 -21.608 1.00 34.61 C ANISOU 1339 C PHE A 404 4525 4477 4146 26 99 -204 C ATOMO 1340 O PHE A 404 14.573 -0.420 -21.433 1.00 33.02 O ANISOU 1340 O PHE A 404 4344 4311 3889 47 220 -276 O ATOMO 1341 N PHE A 405 16.690 0.368 -21.449 1.00 34.74 N ANISOU 1341 N PHE A 405 4575 4438 4184 43 52 -212 N ATOMO 1342 CA ' PHE A 405 17.272 -0.759 -20.737 1.00 34.42 C ANISOU 1342 CA PHE A 405 4502 4382 4192 -2 44 -125 C ATOMO 1343 CB PHE A 405 17.776 -1.837 -21.701 1.00 32.43 C ANISOU 1343 CB PHE A 405 4151 4159 4010 -72 155 -97 C ATOMO 1344 CG PHE A 405 19.014 -1.437 -22.476 1.00 33.02 C ANISOU 1344 CG PHE A 405 4397 3928 4220 8 -32 -287 C ATOMO 1345 CD1 PHE A 405 20.277 -1.889 -22.081 1.00 29.57 C ANISOU 1345 CD1 PHE A 405 4067 3437 3730 -38 -280 -316 C ATOMO 1346 CE1 PHE A 405 21.400 -1.541 -22.787 1.00 25.41 C ANISOU 1346 CE1 PHE A 405 3611 3087 2955 -141 -47 125 C ATOMO 13 7 CZ PHE A 405 21.292 -0.716 -23.897 1.00 32.01 C ANISOU 1347 CZ PHE A 405 4279 3768 4114 -148 -68 -437 C ATOMO 1348 CE2 PHE A 405 20.048 -0.245 -24.310 1.00 27.60 C ANISOU 1348 CE2 PHE A 405 3778 3209 3499 -32 -193 -158 C ATOMO 1349 CD2 PHE A 405 18.915 -0.607 -23.606 1.00 29.13 C ANISOU 1349 CD2 PHE A 405 4022 3536 3508 -50 -6 -170 C ATOMO 1350 C PHE A 405 18.415 -0.275 -19.858 1.00 34.59 C ANISOU 1350 C PHE A 405 4492 4419 4230 -18 50 -131 C ATOMO 1351 O PHE A 405 18.909 0.844 -20.028 1.00 33.97 O ANISOU 1351 O PHE A 405 4478 4384 4045 -56 30 -88 O ATOMO 1352 N LEU A 406 18.811 -1.132 -18.922 1.00 34.15 N ANISOU 1352 N LEU A 406 4406 4368 4199 -66 89 -89 N ATOMO 1353 CA LEU A 406 20.063 -0.990 -18.217 1.00 34.71 C ANISOU 1353 CA LEU A 406 4441 4465 4282 -10 69 -40 C ATOMO 1354 CB LEU A 406 19.973 0.066 -17.112 1.00 34.26 C ANISOU 1354 CB LEU A 406 4416 4403 4198 0 3 -2 C ATOMO 1355 CG LEU A 406 19.362 -0.080 -15.723 1.00 32.70 C ANISOU 1355 CG LEU A 406 4113 4273 4036 -57 -11 1 C ATOMO 1356 CD1 LEU A 406 18.140 0.758 -15.580 1.00 31.62 C ANISOU 1356 CD1 LEU A 406 3956 4197 3860 -42 -51 147 C ATOMO 1357 CD2 LEU A 406 19.149 -1.480 -15.240 1.00 30.79 C ANISOU 1357 CD2 LEU A 406 3828 4056 3815 -202 -43 -257 C ATOMO 1358 C LEU A 406 20.593 -2.310 -17.687 1.00 35.03 C ANISOU 1358 C LEU A 406 4496 4493 4320 -22 88 -40 C ATOMO 1359 O LEU A 406 19.908 -3.316 -17.763 1.00 35.15 O ANISOU 1359 O LEU A 406 4419 4618 4318 -7 134 -19 O ATOMO 1360 N TYR A 407 21.835 -2.297 -17.198 1.00 35.31 N ANISOU 1360 N TYR A 407 4535 4528 4351 -7 40 -34 N ATOMO 1361 CA TYR A 407 22.410 -3.423 -16.471 1.00 35.65 C ANISOU 1361 CA TYR A 407 4544 4568 4430 -6 40 -15 C ATOMO 1362 CB TYR A 407 23.581 -4.065 -17.216 1.00 34.84 C ANISOU 1362 CB TYR A 407 4429 4478 4327 -14 12 -49 C ATOMO 1363 CG TYR A 407 23.321 -4.723 -18.548 1.00 34.08 C ANISOU 1363 CG TYR A 407 4249 4291 4407 40 57 9 C ATOMO 1364 CD1 TYR A 407 23.139 -3.959 -19.694 1.00 32.26 C ANISOU 1364 CD1 TYR A 407 3966 3991 4300 71 69 -29 C ATOMO 1365 CE1 TYR A 407 22.945 -4.551 -20.936 1.00 31.35 C ANISOU 1365 CE1 TYR A 407 3804 3854 4251 1 -7 29 C ATOMO 1366 CZ TYR A 407 22.964 -5.923 -21.046 1.00 32.84 C ANISOU 1366 CZ TYR A 407 3810 4228 4440 0 45 0 C ATOMO 1367 OH TYR A 407 22.771 -6.460 -22.284 1.00 34.03 O ANISOU 1367 OH TYR A 407 4198 4350 4380 16 61 8 O ATOMO 1368 CE2 TYR A 407 23.163 -6.726 -19 925 1.00 31.27 C ANISOU 1368 CE2 TYR A 407 3774 3877 4229 25 90 -36 C ATOMO 1369 CD2 TYR A 407 23.354 -6.119 -18 681 1.00 32.21 C ANISOU 1369 CD2 TYR A 407 3878 4149 4210 -57 57 56 C ATOMO 1370 C TYR A 407 22.935 -2.988 -15 099 1.00 35.88 C ANISOU 1370 C TYR A 407 4601 4620 4411 -27 26 -8 C ATOMO 1371 O TYR A 407 23.460 -1.890 -14 934 1.00 35.29 O ANISOU 1371 O TYR A 407 4616 4570 4220 18 -14 -3 O ATOMO 1372 N SER A 408 22.794 -3.888 -14 .134 1.00 36.43 N ANISOU 1372 N SER A 408 4686 4700 4454 -17 21 8 N ATOMO 1373 CA SER A 408 23.367 -3.750 -12 .801 1.00 36.52 C ANISOU 1373 CA SER A 408 4655 4722 4499 -22 28 33 C ATOMO 1374 CB SER A 408 22.296 -3.911 -11 .702 1.00 36.58 C ANISOU 1374 CB SER A 408 4665 4728 4507 -32 27 15 C ATOMO 1375 OG SER A 408 22.782 -3.508 -10 .426 1.00 34.60 O ANISOU 1375 OG SER A 408 4359 4564 4222 70 111 165 O ATOMO 1376 C SER A 408 24.397 -4.849 -12.686 1.00 36.40 C ANISOU 1376 C SER A 408 4657 4704 4467 -12 38 50 C ATOMO 1377 O SER A 408 24.159 -5.985 -13 .121 1.00 36.21 O ANISOU 1377 O SER A 408 4674 4649 4435 -17 72 98 O ATOMO 1378 N LYS A 409 25.553 -4.484 -12 .145 1.00 36.10 N ANISOU 1378 N LYS A 409 4657 4695 4362 4 -34 66 N ATOMO 1379 CA LYS A 409 26.659 -5.409 -11 .944 1.00 35.94 C ANISOU 1379 CA LYS A 409 4630 4629 4395 7 -40 60 C ATOMO 1380 CB LYS A 409 27.906 -4.935 -12 .709 1.00 35.47 C ANISOU 1380 CB LYS A 409 4588 4563 4326 -11 -12 65 ATOMO 1381 CG LYS A 409 29.104 -5.896 -12.600 1.00 36.03 C ANISOU 1381 CG LYS A 409 4596 4593 4500 -14 25 105 C ATOMO 1382 CD LYS A 409 30.197 -5.695 -13. 673 1.00 36.06 C ANISOU 1382 CD LYS A 409 4630 4581 4491 54 -44 108 C ATOMO 1383 CE LYS A 409 31.116 -4.491 -13. 396 1.00 33.48 C ANISOU 1383 CE LYS A 409 4373 4343 4003 26 -214 0 C ATOMO 1384 NZ LYS A 409 31.618 -4.426 -11. 979 1.00 34.29 N ANISOU 1384 NZ LYS A 409 4556 4113 4356 53 22 193 N ATOMO 1385 C LYS A 409 26.941 -5.580 -10. .425 1.00 35.82 C ANISOU 1385 C LYS A 409 4612 4607 4388 -8 -73 104 C ATOMO 1386 O LYS A 409 27.346 -4.637 -9. .738 1.00 35.11 O ANISOU 1386 O LYS A 409 4621 4589 4130 -13 -162 98 O ATOMO 1387 N LEU A 410 26.673 -6.777 -9. .920 1.00 35.61 N ANISOU 1387 N LEU A 410 4529 4579 4420 14 -95 141 N ATOMO 1388 CA LEU A 410 26.958 -7.114 -8. .531 1.00 35.76 C ANISOU 1388 CA LEU A 410 4598 4561 4426 4 1 114 C ATOMO 1389 CB LEU A 410 25.857 -7.992 -7 .911 1.00 35.47 C ANISOU 1389 CB LEU A 410 4524 4542 4409 -3 -25 72 C ATOMO 1390 CG LEU A 410 26.145 -8.413 -6 .445 1.00 35.65 C ANISOU 1390 CG LEU A 410 4571 4520 4452 10 25 122 C ATOMO 1391 CD1 LEU A 410 26.011 -7.260 -5 .456 1.00 33.68 C ANISOU 1391 CD1 LEU A 410 4444 4388 3963 51 76 155 C ATOMO 1392 CD2 LEU A 410 25.311 -9.570 -6 .007 1.00 35.81 C ANISOU 1392 CD2 LEU A 410 4430 4679 4494 -71 30 184 C ATOMO 1393 C LEU A 410 28.292 -7.843 -8 .495 1.00 35.82 C ANISOU 1393 C LEU A 410 4590 4560 4458 39 -21 187 C ATOMO 1394 O LEU A 410 28.479 -8.850 -9 .213 1.00 35.64 O ANISOU 1394 O LEU A 410 4599 4489 4455 42 -33 257 O ATOMO 1395 N THR A 411 29.225 -7.315 -7.707 1.00 36.06 N A ISOU 1395 N THR A 411 4693 4596 4410 41 -16 193 N ATOMO 1396 CA THR A 411 30.513 -7.989 -7.514 1.00 37.46 C ANISOU 1396 CA THR A 411 4777 4828 4625 24 0 147 C ATOMO 1397 CB THR A 411 31.705 -7.010 -7.613 1.00 37.32 C ANISOU 1397 CB THR A 411 4746 4809 4625 10 -29 154 C ATOMO 1398 OG1 THR A 411 31.761 -6.416 -8.930 1.00 37.50 0 ANISOU 1398 OG1 THR A 411 4710 4871 4664 84 -11 125 O ATOMO 1399 CG2 THR A 411 33.018 -7.757 -7.351 1.00 36.73 C ANISOU 1399 CG2 THR A 411 4767 4595 4593 3 22 161 C ATOMO 1400 C THR A 411 30.540 -8.758 -6.171 1.00 38.50 C ANISOU 1400 C THR A 411 4928 4919 4780 58 -33 132 C ATOMO 1401 O THR A 411 30.377 -8.166 -5.098 1.00 38.70 O ANISOU 1401 O THR A 411 4944 5052 4708 98 23 156 O ATOMO 1402 N VAL A 412 30.733 -10.070 -6.231 1.00 40.03 N ANISOU 1402 N VAL A 412 5107 5068 5034 48 -15 105 N ATOMO 1403 CA VAL A 412 30.898 -10.879 -4.999 1.00 41.18 C ANISOU 1403 CA VAL A 412 5270 5215 5159 42 -14 107 C ATOMO 1404 CB VAL A 412 29.671 -11.783 -4.715 1.00 40.91 C ANISOU 1404 CB VAL A 412 5223 5145 5175 45 -26 100 C ATOMO 1405 CG1 VAL A 412 28.459 -10.957 -4.333 1.00 41.72 C ANISOU 1405 CG1 VAL A 412 5340 5253 5258 8 5 95 C ATOMO 1406 CG2 VAL A 412 29.378 -12.688 -5.898 1.00 41.30 C ANISOU 1406 CG2 VAL A 412 5288 5262 5143 56 -93 79 C ATOMO 1407 C VAL A 412 32.130 -11.777 -5.058 1.00 41.92 C ANISOU 1407 C VAL A 412 5342 5298 5284 55 2 92 C ATOMO 1408 O VAL A 412 32.501 -12.230 -6.148 1.00 42.01 O ANISOU 1408 O VAL A 412 5411 5272 5277 51 -15 74 O ATOMO 1409 N ASP A 413 32.741 -12.050 - 3.895 1.00 43.17 N ANISOU 1409 N ASP A 413 5497 5486 5417 25 -27 44 N ATOMO 1410 CA ASP A 413 33.828 -13.058 ¦ 3.794 1.00 44.45 C ANISOU 1410 CA ASP A 413 5685 5613 5589 20 -20 37 C ATOMO 1411 CB ASP A 413 34.281 -13.268 ¦ 2.345 1.00 45.14 C ANISOU 1411 CB ASP A 413 5771 5740 5638 27 -24 76 C ATOMO 1412 CG ASP A 413 34.976 -12.041 ¦ 1.745 1.00 46.83 C ANISOU 1412 CG ASP A 413 6015 5966 5809 -56 -80 52 C ATOMO 1413 OD1 ASP A 413 35.210 -11.035 ¦ 2.457 1.00 48.90 O ANISOU 1413 OD1 ASP A 413 6156 6319 6102 -40 23 125 O ATOMO 1414 OD2 ASP A 413 35.288 -12.084 · 0.535 1.00 49.87 O ANISOU 1414 OD2 ASP A 413 6489 6388 6071 -31 -24 57 O ATOMO 1415 C ASP A 413 33.345 -14.385 4.372 1.00 44.46 C ANISOU 1415 C ASP A 413 5701 5572 5620 -1 2 46 C ATOMO 1416 O ASP A 413 32.224 -14.799 4.093 1.00 44.32 O ANISOU 1416 O ASP A 413 5691 5550 5596 4 41 42 O ATOMO 1417 N LYS A 414 34.185 -15.020 5.195 1.00 44.94 N ANISOU 1417 N LYS A 414 5770 5623 5682 8 -7 53 N ATOMO 1418 CA LYS A 414 33.820 -16.224 5.971 1.00 45.58 C ANISOU 1418 CA LYS A 414 5844 5751 5721 -21 -31 35 C ATOMO 1419 CB LYS A 414 34.997 -16.633 6.850 1.00 45.72 C ANISOU 1419 CB LYS A 414 5836 5796 5740 -19 -14 37 C ATOMO 1420 CG LYS A 414 34.725 -17.758 7.819 1.00 45.82 C ANISOU 1420 CG LYS A 414 5880 5705 5824 30 -23 30 C ATOMO 1421 CD LYS A 414 35.966 -18.024 8.634 1.00 47.84 C ANISOU 1421 CD LYS A 414 6077 6009 6089 18 52 -1 C ATOMO 1422 CE LYS A 414 35.693 -18.974 9.784 1.00 48.47 C ANISOU 1422 CE LYS A 414 6126 6229 6062 23 11 -100 C ATOMO 1423 NZ LYS A 414 36.972 -19.359 -10.462 1.00 49.66 N A ISOU 1423 NZ LYS A 414 6253 6358 6256 15 38 -89 N ATOMO 1424 C LYS A 414 33.401 -17.438 -5.138 1.00 46.06 C ANISOU 1424 C LYS A 414 5882 5808 5809 -53 -60 44 C ATOMO 1425 O LYS A 414 32.556 -18.234 -5.566 1.00 47.07 O ANISOU 1425 O LYS A 414 5999 5982 5903 -24 -123 54 0 ATOMO 1426 N SER A 415 34.012 -17.606 -3.971 1.00 46.26 N ANISOU 1426 N SER A 415 5896 5861 5817 -68 -56 60 N ATOMO 1427 CA SER A 415 33.679 -18.728 -3.088 1.00 46.61 C ANISOU 1427 CA SER A 415 5930 5891 5888 -68 -54 52 C ATOMO 1428 CB SER A 415 34.552 -18.712 -1.810 1.00 46.81 C ANISOU 1428 CB SER A 415 5974 5905 5906 -59 -48 70 C ATOMO 1429 OG SER A 415 34.803 -17.392 -1.321 1.00 46.84 O ANISOU 1429 OG SER A 415 6000 5875 5923 -99 -111 22 O ATOMO 1430 C SER A 415 32.167 -18.732 -2.781 1.00 46.70 C ANISOU 1430 C SER A 415 5922 5886 5935 -46 -18 49 C ATOMO 1431 O SER A 415 31.521 -19.780 -2.836 1.00 47.24 O ANISOU 1431 O SER A 415 5992 5952 6003 -61 -44 28 O ATOMO 1432 N ARG A 416 31.617 -17.544 -2.512 1.00 46.83 N ANISOU 1432 N ARG A 416 5915 5904 5972 -34 -6 62 N ATOMO 1433 CA ARG A 416 30.171 -17.325 -2.328 1.00 46.36 C ANISOU 1433 CA ARG A 416 5861 5859 5894 -34 0 66 C ATOMO 1434 CB ARG A 416 29.887 -15.849 -2.088 1.00 46.60 C ANISOU 1434 CB ARG A 416 5918 5875 5912 0 41 69 C ATOMO 1435 CG ARG A 416 29.867 -15.452 -0.644 1.00 47.76 C ANISOU 1435 CG ARG A 416 6143 6052 5950 -60 -4 53 C ATOMO 1436 CD ARG A 416 29.723 -13.956 -0.492 1.00 47.81 C ANISOU 1436 CD ARG A 416 5941 6058 6165 -177 -24 4 ATOMO 1437 NE ARG A 416 30.998 -13.332 -0.127 1.00 51.98 N ANISOU 1437 NE ARG A 416 6596 6580 6574 64 83 221 N ATOMO 1438 CZ ARG A 416 31.182 -12.562 0. 945 1.00 48.85 C ANISOU 1438 CZ ARG A 416 5973 6438 6150 -125 66 -142 C ATOMO 1439 NHl ARG A 416 30.168 -12.312 1. 763 1.00 53.54 N ANISOU 1439 NHl ARG A 416 6843 6710 6787 7 1 33 N ATOMO 1440 NH2 ARG A 416 32.379 -12.028 l. .196 1.00 52.19 N ANISOU 1440 NH2 ARG A 416 6821 6562 6445 124 29 86 N ATOMO 1441 C ARG A 416 29.326 -17.787 -3. .503 1.00 46.10 C ANISOU 1441 C ARG A 416 5811 5841 5864 -26 -12 80 C ATOMO 1442 O ARG A 416 28.229 -18.318 -3. .299 1.00 46.58 O ANISOU 1442 O ARG A 416 5912 5852 5931 3 -22 129 O ATOMO 1443 N TRP A 417 29.814 -17.566 -4. .727 1.00 45.76 N ANISOU 1443 N TRP A 417 5753 5790 5841 -39 -6 47 N ATOMO 1444 CA TRP A 417 29.109 -18.028 -5 .933 1.00 45.44 C ANISOU 1444 CA TRP A 417 5708 5726 5828 -4 -12 32 C ATOMO 1445 CB TRP A 417 29.750 -17.485 -7 .222 1.00 43.60 C ANISOU 1445 CB TRP A 417 5388 5589 5589 11 -113 20 C ATOMO 1446 CG TRP A 417 29.056 -17.925 -8 .508 1.00 43.73 C ANISOU 1446 CG TRP A 417 5357 5558 5700 39 -41 38 C ATOMO 1447 CD1 TRP A 417 29.598 -18.674 -9 .537 1.00 41.28 C ANISOU 1447 CD1 TRP A 417 4777 5490 5416 116 -99 22 C ATOMO 1448 NE1 TRP A 417 28.662 -18.887 -10 .523 1.00 44.32 N ANISOU 1448 NE1 TRP A 417 5725 5455 5657 -184 23 161 N ATOMO 1449 CE2 TRP A 417 27.488 -18.279 -10 .152 1.00 41.66 C ANISOU 1449 CE2 TRP A 417 5146 5311 5372 46 -8 -11 C ATOMO 1450 CD2 TRP A 417 27.698 -17.665 -8 .888 1.00 43.53 C ANISOU 1450 CD2 TRP A 417 5499 5455 5584 22 36 94 C ATOMO 1451 CE3 TRP A 417 26.634 -16.972 -8.286 1.00 42.96 C ANISOU 1451 CE3 TRP A 417 5359 5442 5518 17 14 67 C ATOMO 1452 CZ3 TRP A 417 25.417 -16.905 -8.962 1.00 42.84 C ANISOU 1452 CZ3 TRP A 417 5360 5442 5473 -41 61 -2 C ATOMO 1453 CH2 TRP A 417 25.246 -17.517 -10.217 1.00 43.50 C ANISOU 1453 CH2 TRP A 417 5561 5399 5567 -97 121 76 C ATOMO 1454 CZ2 TRP A 417 26.263 -18.206 -10.824 1.00 42.87 C ANISOU 1454 CZ2 TRP A 417 5358 5337 5590 -6 99 73 C ATOMO 1455 C TRP A 417 29.072 -19.558 -5.927 1.00 46.18 C ANISOU 1455 C TRP A 417 5795 5803 5946 7 -35 30 C ATOMO 1456 O TRP A 417 28.009 -20.167 -6.166 1.00 46.90 O ANISOU 1456 O TRP A 417 5817 5939 6064 -1 -68 67 O ATOMO 1457 N GLN A 418 30.217 -20.167 -5.598 1.00 46.23 N ANISOU 1457 N GLN A 418 5783 5839 5941 48 -14 42 N ATOMO 1458 CA GLN A 418 30.356 -21.636 -5.575 1.00 46.42 C ANISOU 1458 CA GLN A 418 5870 5841 5926 17 -2 41 C ATOMO 1459 CB GLN A 418 31.842 -22.049 -5.700 1.00 46.09 C ANISOU 1459 CB GLN A 418 5815 5825 5872 36 19 53 C ATOMO 1460 CG GLN A 418 32.458 -21.757 -7.083 1.00 46.48 C ANISOU 1460 CG GLN A 418 5847 5833 5976 34 73 -10 C ATOMO 1461 CD GLN A 418 34.002 -21.715 -7.095 1.00 46.67 C ANISOU 1461 CD GLN A 418 5898 5914 5920 16 24 20 C ATOMO 1462 OE1 GLN A 418 34.665 -21.686 -6.048 1.00 47.82 O ANISOU 1462 OE1 GLN A 418 6033 6136 6000 53 -33 66 O ATOMO 1463 NE2 GLN A 418 34.571 -21.701 -8.297 1.00 47.35 N ANISOU 1463 NE2 GLN A 418 5961 6023 6004 33 66 26 N ATOMO 1464 C GLN A 418 29.653 -22.299 -4.363 1.00 46.78 C ANISOU 1464 C GLN A 418 5905 5866 6002 -9 -3 20 C ATOMO 1465 O GLN A 418 29.001 -23.337 -4.506 1.00 47.00 O ANISOU 1465 O GLN A 418 5932 5847 6078 -40 -29 35 O ATOMO 1466 N GLN A 419 29.777 -21.696 -3.180 1.00 47.14 N ANISOU 1466 N GLN A 419 6009 5940 5961 -18 -9 36 N ATOMO 1467 CA GLN A 419 29.014 -22.148 -2.017 1.00 48.11 C ANISOU 1467 CA GLN A 419 6130 6033 6117 -16 -35 52 C ATOMO 1468 CB GLN A 419 29.192 -21.182 -0.827 1.00 47.74 C ANISOU 1468 CB GLN A 419 6122 5956 6058 -21 -65 7 C ATOMO 1469 CG GLN A 419 30.584 -21.313 -0.189 1.00 48.88 C ANISOU 1469 CG GLN A 419 6202 6136 6231 -31 -83 18 C ATOMO 1470 CD GLN A 419 30.835 -20.383 1.010 1.00 48.22 C ANISOU 1470 CD GLN A 419 6253 6005 6062 61 -160 -28 C ATOMO 1471 OE1 GLN A 419 30.374 -19.232 1.050 1.00 51.84 O ANISOU 1471 OE1 GLN A 419 6788 6288 6621 72 -49 -14 O ATOMO 1472 NE2 GLN A 419 31.595 -20.883 1.981 1.00 48.48 N ANISOU 1472 NE2 GLN A 419 6320 6025 6074 22 -59 -61 N ATOMO 1473 C GLN A 419 27.538 -22.358 -2.393 1.00 47.88 C ANISOU 1473 C GLN A 419 6103 5976 6111 -20 -69 81 C ATOMO 1474 O GLN A 419 26.977 -23.449 -2.213 1.00 48.69 O ANISOU 1474 O GLN A 419 6259 5993 6247 -19 -60 110 O ATOMO 1475 N GLY A 420 26.911 -21.333 -2.954 1.00 47.48 N ANISOU 1475 N GLY A 420 6057 5915 6069 -12 -64 79 N ATOMO 1476 CA GLY A 420 25.605 -21.536 -3.553 1.00 46.95 C ANISOU 1476 CA GLY A 420 5936 5893 6010 15 -32 74 C ATOMO 1477 C GLY A 420 24.588 -20.527 -3.120 1.00 46.55 C ANISOU 1477 C GLY A 420 5880 5886 5920 12 -26 49 C ATOMO 1478 O GLY A 420 23.394 -20.701 -3.397 1.00 46.93 O ANISOU 1478 O GLY A 420 5889 5969 5972 -9 -8 74 O ATOMO 1479 N ASN A 421 25.070 -19.488 -2.433 1.00 46.34 N ANISOU 1479 N ASN A 421 5839 5872 5896 40 -50 46 N ATOMO 1480 CA ASN A 421 24.289 -18.301 -2.077 1.00 45.85 C ANISOU 1480 CA ASN A 421 5786 5865 5770 64 -39 9 C ATOMO 1481 CB ASN A 421 25.211 -17.091 -1.903 1.00 45.59 C ANISOU 1481 CB ASN A 421 5783 5824 5712 51 -56 13 C ATOMO 1482 CG ASN A 421 25.560 -16.808 -0.438 1.00 46.44 C ANISOU 1482 CG ASN A 421 5950 5950 5741 86 -2 -15 C ATOMO 1483 OD1 ASN A 421 26.110 -17.659 0.284 1.00 43.48 O ANISOU 1483 OD1 ASN A 421 5884 5482 5152 142 48 64 O ATOMO 1484 ND2 ASN A 421 25.277 -15.577 -0.009 1.00 47.25 N ANISOU 1484 ND2 ASN A 421 6145 5952 5855 165 -93 -103 N ATOMO 1485 C ASN A 421 23.213 -17.924 -3.095 1.00 45.79 C ANISOU 1485 C ASN A 421 5772 5862 5764 76 -20 43 C ATOMO 1486 O ASN A 421 23.401 -18.062 -4.327 1.00 45.60 O ANISOU 1486 O ASN A 421 5768 5864 5693 63 -16 71 O ATOMO 1487 N VAL A 422 22.089 -17.454 -2.553 1.00 45.55 N ANISOU 1487 N VAL A 422 5739 5837 5731 49 -11 67 N ATOMO 1488 CA VAL A 422 21.035 -16.834 -3.337 1.00 45.24 C ANISOU 1488 CA VAL A 422 5704 5739 5744 26 10 70 C ATOMO 1489 CB VAL A 422 19.661 -17.027 -2.690 1.00 45.54 C ANISOU 1489 CB VAL A 422 5700 5790 5810 24 9 65 C ATOMO 1490 CG1 VAL A 422 18.638 -16.039 -3.274 1.00 46.04 C ANISOU 1490 CG1 VAL A 422 5848 5757 5887 73 42 96 C ATOMO 1491 CG2 VAL A 422 19.197 -18.476 -2.879 1.00 45.88 C ANISOU 1491 CG2 VAL A 422 5756 5710 5965 34 -24 7 C ATOMO 1492 C VAL A 422 21.346 -15.357 -3.459 1.00 44.78 C ANISOU 1492 C VAL A 422 5682 5693 5638 10 15 94 C ATOMO 1493 O VAL A 422 21.613 -14.670 -2.457 1.00 44.88 O ANISOU 1493 O VAL A 422 5745 5738 5570 0 98 124 O ATOMO 1494 N PHE A 423 21.369 -14.880 -4.698 1.00 44.38 N ANISOU 1494 N PHE A 423 5592 5648 5622 7 -27 107 N ATOMO 1495 CA PHE A 423 21.495 -13.452 -4.933 1.00 43.56 C ANISOU 1495 CA PHE A 423 5497 5571 5482 0 -24 111 C ATOMO 1496 CB PHE A 423 22.798 -13.133 -5.646 1.00 43.29 C ANISOU 1496 CB PHE A 423 5394 5556 5497 -7 -79 107 C ATOMO 1497 CG PHE A 423 24.008 -13.224 -4.759 1.00 44.33 C ANISOU 1497 CG PHE A 423 5633 5632 5577 -92 29 161 C ATOMO 1498 CD1 PHE A 423 24.936 -14.249 -4.937 1.00 42.42 C ANISOU 1498 CD1 PHE A 423 5139 5468 5509 38 -37 193 C ATOMO 1499 CE1 PHE A 423 26.047 -14.339 -4.131 1.00 42.33 C ANISOU 1499 CE1 PHE A 423 5468 5273 5342 -127 119 -44 C ATOMO 1500 CZ PHE A 423 26.245 -13.401 -3.133 1.00 45.72 C ANISOU 1500 CZ PHE A 423 5685 6031 5653 -193 105 211 C ATOMO 1501 CE2 PHE A 423 25.328 -12.362 -2.944 1.00 41.37 C ANISOU 1501 CE2 PHE A 423 4978 5384 5355 209 -92 166 C ATOMO 1502 CD2 PHE A 423 24.217 -12.288 -3.751 1.00 43.86 C ANISOU 1502 CD2 PHE A 423 5670 5522 5470 -44 136 92 C ATOMO 1503 C PHE A 423 20.288 -12.976 -5.723 1.00 43.24 C ANISOU 1503 C PHE A 423 5452 5530 5446 -1 -11 102 C ATOMO 1504 O PHE A 423 19.889 -13.612 -6.714 1.00 42.35 O ANISOU 1504 O PHE A 423 5366 5482 5242 -37 -48 112 O ATOMO 1505 N SER A 424 19.699 -11.880 -5.251 1.00 42.62 N ANISOU 1505 N SER A 424 5361 5473 5357 9 17 73 N ATOMO 1506 CA SER A 424 18.502 -11.336 -5.875 1.00 42.62 C ANISOU 1506 CA SER A 424 5334 5509 5350 15 32 50 ATOMO 1507 CB SER A 424 17.269 -11.580 -4.983 1.00 42.80 C ANISOU 1507 CB SER A 424 5346 5561 5353 30 34 25 C ATOMO 1508 OG SER A 424 17.321 -10. 787 -3.812 1.00 42.53 O ANISOU 1508 OG SER A 424 5276 5654 5226 85 74 39 O ATOMO 1509 C SER A 424 18.626 -9. 859 -6.300 1.00 42.35 C ANISOU 1509 C SER A 424 5296 5467 5328 20 18 77 C ATOMO 1510 O SER A 424 19.033 -8. 992 -5.518 1.00 41.38 O ANISOU 1510 O SER A 424 5174 5364 5184 -26 -2 71 O ATOMO 1511 N CYS A 425 18.282 -9. 603 -7.563 1.00 42.32 N ANISOU 1511 N CYS A 425 5228 5490 5359 38 3 113 N ATOMO 1512 CA CYS A 425 18.182 -8. 238 -8.086 1.00 42.32 C ANISOU 1512 CA CYS A 425 5236 5477 5364 15 4 122 C ATOMO 1513 CB CYS A 425 18.691 -8. 193 -9.527 1.00 42.07 C ANISOU 1513 CB CYS A 425 5168 5425 5391 5 -28 131 C ATOMO 1514 SG CYS A 425 18.168 -6. 769 -10.529 1.00 41.39 S ANISOU 1514 SG CYS A 425 4930 5467 5327 77 -26 166 S ATOMO 1515 C CYS A 425 16.729 -7. 761 -7.995 1.00 42.83 C ANISOU 1515 C CYS A 425 5386 5497 5390 14 2 110 C ATOMO 1516 O CYS A 425 15.813 -8 361 -8.585 1.00 42.19 O ANISOU 1516 O CYS A 425 5252 5457 5320 -2 48 124 O ATOMO 1517 N SER A 426 16.521 -6 693 -7.231 1.00 43.33 N ANISOU 1517 N SER A 426 5489 5511 5460 6 -17 101 N ATOMO 1518 CA SER A 426 15.185 -6 185 -7.025 1.00 43.91 C ANISOU 1518 CA SER A 426 5550 5598 5534 -21 -15 67 C ATOMO 1519 CB SER A 426 14.815 -6 ,219 -5.538 1.00 44.36 C ANISOU 1519 CB SER A 426 5616 5660 5575 -47 -55 69 C ATOMO 1520 OG SER A 426 15.437 -5 .186 -4.808 1.00 45.92 O ANISOU 1520 OG SER A 426 5898 5798 5752 -91 -95 43 O ATOMO 1521 C SER A 426 14.983 -4.801 -7.660 1.00 43.57 C ANISOU 1521 C SER A 426 5506 5553 5493 -13 -31 57 C ATOMO 1522 O SER A 426 15.711 -3.850 -7.371 1.00 43.22 O ANISOU 1522 O SER A 426 5456 5506 5457 -9 -46 60 O ATOMO 1523 N VAL A 427 13.976 -4.725 -8.528 1.00 42.97 N ANISOU 1523 N VAL A 427 5449 5498 5380 -15 -21 49 N ATOMO 1524 CA VAL A 427 13.734 -3.579 -9.400 1.00 42.05 C ANISOU 1524 CA VAL A 427 5340 5430 5205 0 -15 33 C ATOMO 1525 CB VAL A 427 13.627 -4.051 -10.884 1.00 41.86 C ANISOU 1525 CB VAL A 427 5301 5420 5181 17 -2 -11 C ATOMO 1526 CG1 VAL A 427 13.382 -2.874 -11.821 1.00 40.21 C ANISOU 1526 CG1 VAL A 427 5056 5232 4987 -44 57 -23 C ATOMO 1527 CG2 VAL A 427 14.872 -4.811 -11.296 1.00 41.53 C ANISOU 1527 CG2 VAL A 427 5292 5317 5170 0 -112 30 C ATOMO 1528 C VAL A 427 12.453 -2.820 -9.041 1.00 41.50 C ANISOU 1528 C VAL A 427 5362 5341 5064 -13 8 28 C ATOMO 1529 O VAL A 427 11.390 -3.408 -8.880 1.00 40.96 O ANISOU 1529 O VAL A 427 5279 5330 4951 -6 48 98 O ATOMO 1530 N MET A 428 12.559 -1.500 -8.969 1.00 41.12 N ANISOU 1530 N MET A 428 5318 5327 4978 -22 7 9 N ATOMO 1531 CA MET A 428 11.395 -0.647 -8.805 1.00 40.47 C ANISOU 1531 CA MET A 428 5291 5197 4889 -14 60 -23 C ATOMO 1532 CB MET A 428 11.585 0.281 -7.620 1.00 40.36 C ANISOU 1532 CB MET A 428 5204 5222 4908 -56 23 -2 C ATOMO 1533 CG MET A 428 12.037 -0.413 -6.373 1.00 41.31 C ANISOU 1533 CG MET A 428 5409 5218 5068 -29 52 -5 C ATOMO 1534 SD MET A 428 11.727 0.663 -4.974 1.00 42.39 S ANISOU 1534 SD MET A 428 5767 5498 4839 -41 119 -25 S ATOMO 1535 CE MET A 428 9.947 0 788 -5.114 1.00 40.75 C A ISOU 1535 CE MET A 428 5472 5091 4920 29 70 102 C ATOMO 1536 C MET A 428 11.096 0 175 -10.057 1.00 39.15 C ANISOU 1536 C MET A 428 5085 5011 4777 14 40 -108 C ATOMO 1537 O MET A 428 11.944 0 908 -10.555 1.00 38.37 O ANISOU 1537 O MET A 428 5039 4855 4683 13 60 -72 O ATOMO 1538 N HIS A 429 9.876 0 038 -10.556 1.00 37.88 N ANISOU 1538 N HIS A 429 4935 4841 4613 56 57 -125 N ATOMO 1539 CA HIS A 429 9.427 0 779 -11.730 1..00 36.90 C ANISOU 1539 CA HIS A 429 4763 4738 4517 31 43 -119 C ATOMO 1540 CB HIS A 429 9.829 0 086 -13.033 1..00 35.73 C ANISOU 1540 CB HIS A 429 4590 4600 4386 -2 24 -67 C ATOMO 1541 CG HIS A 429 9.560 0 914 -14.246 1..00 33.46 C ANISOU 1541 CG HIS A 429 4228 4253 4232 12 111 -213 C ATOMO 15 2 ND1 HIS A 429 8.334 0 950 -14.870 1.00 31.22 N ANISOU 1542 ND1 HIS A 429 4260 3907 3694 25 43 -229 N ATOMO 1543 CE1 HIS A 429 8.385 1.778 -15.894 1.00 30.83 C ANISOU 1543 CE1 HIS A 429 4069 3810 3833 -36 51 -163 C ATOMO 1544 NE2 HIS A 429 9.602 2.278 -15.960 1.00 31.02 N ANISOU 1544 NE2 HIS A 429 4048 3977 3758 10 -105 -163 N ATOMO 1545 CD2 HIS A 429 10.353 1.763 -14.935 1.00 32.35 C ANISOU 1545 CD2 HIS A 429 4277 3969 4045 86 47 -124 C ATOMO 1546 C HIS A 429 7.929 0.843 -11.664 1.00 36.82 C ANISOU 1546 C HIS A 429 4799 4771 4418 26 9 -122 C ATOMO 1547 O HIS A 429 7.297 -0.115 -11.229 1.00 36.28 O ANISOU 1547 O HIS A 429 4722 4796 4265 10 -12 -179 O ATOMO 1548 N GLU A 430 7.374 1.964 -12.119 1.00 36.71 N ANISOU 1548 N GLU A 430 4815 4761 4371 55 19 -106 N ATOMO 1549 CA GLU A 430 5.934 2.203 -12.098 1.00 36.80 C ANISOU 1549 CA GLU A 430 4811 4731 4437 41 6 -42 C ATOMO 1550 CB GLU A 430 5.594 3.547 -12. 773 1.00 36.76 C ANISOU 1550 CB GLU A 430 4791 4744 4430 -9 -30 -31 C ATOMO 1551 CG GLU A 430 5.694 3.553 -14. 307 1.00 35.19 C ANISOU 1551 CG GLU A 430 4490 4486 4392 25 72 100 C ATOMO 1552 CD GLU A 430 5.001 4.742 -14. 895 1.00 34.83 C ANISOU 1552 CD GLU A 430 4558 4546 4128 -71 229 48 C ATOMO 1553 OE1 GLU A 430 5.453 5.862 -14.630 1.00 30.64 O ANISOU 1553 OE1 GLU A 430 4122 4033 3484 -100 187 82 O ATOMO 1554 OE2 GLU A 430 3.991 4.560 -15. 606 1.00 34.10 0 ANISOU 1554 OE2 GLU A 430 4321 4585 4048 -96 202 -27 O ATOMO 1555 C GLU A 430 5.110 1.099 -12. 716 1.00 36.55 c ANISOU 1555 C GLU A 430 4793 4631 4463 48 -12 -17 c ATOMO 1556 O GLU A 430 4.035 0.794 -12. 223 1.00 36.45 O ANISOU 1556 O GLU A 430 4876 4636 4334 94 23 -111 O ATOMO 1557 N ALA A 431 5.613 0.513 -13. 803 1.00 36.85 N ANISOU 1557 N ALA A 431 4769 4635 4595 51 -26 26 N ATOMO 1558 CA ALA A 431 4.836 -0.427 -14. 622 1.00 36.97 C ANISOU 1558 CA ALA A 431 4763 4665 4617 35 0 -11 C ATOMO 1559 CB ALA A 431 5.256 -0.312 -16, 072 1.00 36.63 C ANISOU 1559 CB ALA A 431 4680 4637 4600 53 -51 -6 C ATOMO 1560 C ALA A 431 4.901 -1.891 -14 129 1.00 37.11 C ANISOU 1560 C ALA A 431 4752 4712 4633 -16 12 -11 C ATOMO 1561 O ALA A 431 4.366 -2.798 -14 .764 1.00 37.32 O ANISOU 1561 O ALA A 431 4770 4750 4656 -49 59 -15 O ATOMO 1562 N LEU A 432 5.562 -2.117 -13 .003 1.00 36.79 N ANISOU 1562 N LEU A 432 4741 4648 4588 -2 5 7 N ATOMO 1563 CA LEU A 432 5.501 -3.419 -12.333 1.00 37.15 C ANISOU 1563 CA LEU A 432 4763 4747 4605 -3 -9 8 C ATOMO 1564 CB LEU A 432 6.813 -3.728 -11.587 1.00 36.16 C ANISOU 1564 CB LEU A 432 4697 4593 4448 14 -19 45 C ATOMO 1565 CG LEU A 432 8.039 -3.920 -12.494 1.00 35.48 C ANISOU 1565 CG LEU A 432 4565 4483 4433 11 -70 72 C ATOMO 1566 CD1 LEU A 432 9.375 -3.695 -11.782 1.00 33.76 C ANISOU 1566 CD1 LEU A 432 4494 4326 4005 44 -80 116 C ATOMO 1567 CD2 LEU A 432 8.019 -5.273 -13.221 1.00 34.94 C ANISOU 1567 CD2 LEU A 432 4448 4511 4315 30 -64 152 C ATOMO 1568 C LEU A 432 4.287 -3.470 -11.401 1.00 37.38 C ANISOU 1568 C LEU A 432 4819 4804 4578 -12 -9 34 C ATOMO 1569 O LEU A 432 3.802 -2.445 -10.931 1.00 37.28 O ANISOU 1569 O LEU A 432 4766 4889 4509 32 1 67 O ATOMO 1570 N HIS A 433 3.768 -4.663 -11.178 1.00 38.17 N ANISOU 1570 N HIS A 433 4911 4926 4663 -24 -11 39 N ATOMO 1571 CA HIS A 433 2.747 -4.869 -10.161 1.00 38.86 C ANISOU 1571 CA HIS A 433 4958 5015 4789 -27 -2 49 C ATOMO 1572 CB HIS A 433 2.447 -6.358 -10.078 1.00 39.24 C ANISOU 1572 CB HIS A 433 4992 5068 4847 -27 6 41 C ATOMO 1573 CG HIS A 433 1.480 -6.722 -9.003 1.00 41.29 C ANISOU 1573 CG HIS A 433 5182 5325 5179 -26 27 73 C ATOMO 1574 ND1 HIS A 433 0.117 -6.574 -9.150 1.00 42.44 N ANISOU 1574 ND1 HIS A 433 5238 5453 5433 -68 34 41 N ATOMO 1575 CE1 HIS A 433 -0.482 -6.986 -8.046 1.00 42.23 C ANISOU 1575 CE1 HIS A 433 5381 5485 5176 10 -17 -10 C ATOMO 1576 NE2 HIS A 433 0.443 -7.399 -7.197 1.00 41.94 N ANISOU 1576 NE2 HIS A 433 5411 5442 5079 -19 12 -1 N ATOMO 1577 CD2 HIS A 433 1.678 -7.241 -•7.769 1.00 40.89 C ANISOU 1577 CD2 HIS A 433 5136 5376 5025 -8 -29 20 C ATOMO 1578 C HIS A 433 3.279 -4.308 ¦-8.824 1.00 38.60 C ANISOU 1578 C HIS A 433 4959 4969 4737 -33 8 95 C ATOMO 1579 O HIS A 433 4.392 -4.632 ¦ -8.416 1.00 38.55 O ANISOU 1579 O HIS A 433 4974 5004 4668 -49 -28 116 O ATOMO 1580 N ASN A 434 2.522 -3.420 ·-8.187 1.00 38.26 N ANISOU 1580 N ASN A 434 4920 4949 4665 -74 17 108 N ATOMO 1581 CA ASN A 434 2.994 -2.709 ¦ -6.994 1.00 38.50 C ANISOU 1581 CA ASN A 434 4948 4950 4727 -75 13 90 C ATOMO 1582 CB ASN A 434 2.999 -3.639 -5.763 1.00 38.77 C ANISOU 1582 CB ASN A 434 4941 5054 4733 -120 20 41 C ATOMO 1583 CG ASN A 434 1.631 -4.134 -5.413 1.00 38.47 C ANISOU 1583 CG ASN A 434 4913 5088 4614 -105 23 7 C ATOMO 1584 OD1 ASN A 434 1.466 -5.285 -5.048 1.00 38.40 O ANISOU 1584 OD1 ASN A 434 5064 4785 4740 -130 -43 51 O ATOMO 1585 ND2 ASN A 434 0.635 -3.275 -5.548 1.00 35.57 N ANISOU 1585 ND2 ASN A 434 4416 4664 4435 -105 161 -54 N ATOMO 1586 C ASN A 434 4.372 -2.064 -7.143 1.00 38.65 C ANISOU 1586 C ASN A 434 4962 4997 4727 -89 12 73 C ATOMO 1587 O ASN A 434 5.092 -1.904 -6.156 1.00 38.37 O ANISOU 1587 O ASN A 434 4948 4953 4677 -158 44 68 O ATOMO 1588 N HIS A 435 4.729 -1.721 -8.384 1.00 38.28 N ANISOU 1588 N HIS A 435 4930 4968 4646 -59 -13 18 N ATOMO 1589 CA HIS A 435 5.963 -1.016 -8.726 1.00 37.58 C ANISOU 1589 CA HIS A 435 4881 4891 4504 -25 5 35 C ATOMO 1590 CB HIS A 435 5.952 0.417 -8.155 1.00 37.74 C ANISOU 1590 CB HIS A 435 4898 4903 4537 -23 -29 -1 C ATOMO 1591 CG HIS A 435 4.584 1.032 -8.082 1.00 37.92 C ANISOU 1591 CG HIS A 435 4873 4934 4598 -13 14 -80 C ATOMO 1592 ND1 HIS A 435 3.749 1.135 -9.174 1.00 37.42 N ANISOU 1592 ND1 HIS A 435 4902 4856 4459 161 35 -122 N ATOMO 1593 CE1 HIS A 435 2.607 1.686 -8.810 1.00 38.63 C ANISOU 1593 CE1 HIS A 435 4913 4743 5020 62 15 82 C ATOMO 1594 NE2 HIS A 435 2.681 1.979 -7.524 1.00 36.99 N ANISOU 1594 NE2 HIS A 435 4821 4801 4432 32 -57 3 N ATOMO 1595 CD2 HIS A 435 3.903 1.573 -7.044 1.00 38.62 C ANISOU 1595 CD2 HIS A 435 4975 4958 4739 -34 6 -67 C ATOMO 1596 C HIS A 435 7.236 -1.770 -8.330 1.00 37.17 C ANISOU 1596 C HIS A 435 4870 4880 4372 -25 31 22 C ATOMO 1597 O HIS A 435 8.273 -1.176 -8.127 1.00 35.86 O ANISOU 1597 O HIS A 435 4733 4829 4063 47 22 64 O ATOMO 1598 N TYR A 436 7.153 -3.088 -8.248 1.00 37.91 N ANISOU 1598 N TYR A 436 4963 4964 4476 1 14 15 N ATOMO 1599 CA TYR A 436 8.235 -3.873 -7.684 1.00 38.88 C ANISOU 1599 CA TYR A 436 5029 4992 4751 2 12 -9 C ATOMO 1600 CB TYR A 436 8.058 -3.997 -6.158 1.00 38.93 c ANISOU 1600 CB TYR A 436 5047 4980 4765 8 -25 -6 c ATOMO 1601 CG TYR A 436 9.235 -4.641 -5.455 1.00 39.72 C ANISOU 1601 CG TYR A 436 5116 5014 4959 60 6 -69 c ATOMO 1602 CD1 TYR A 436 9.202 -5.986 -5.059 1.00 40.15 C ANISOU 1602 CD1 TYR A 436 5192 5178 4884 57 49 35 C ATOMO 1603 CE1 TYR A 436 10.302 -6.573 -4.438 1.00 39.78 C ANISOU 1603 CE1 TYR A 436 5150 5156 4806 17 -21 78 C ATOMO 1604 CZ TYR A 436 11.426 -5.797 -4.193 1.00 40.05 C ANISOU 1604 CZ TYR A 436 5151 5177 4887 17 10 47 ATOMO 1605 OH TYR A 436 12.530 -6.318 -3.580 1.00 39.84 O A ISOU 1605 OH TYR A 436 5240 5038 4856 63 -12 9 O ATOMO 1606 CE2 TYR A 436 11.465 -4.467 -4.566 1.00 40.35 C ANISOU 1606 CE2 TYR A 436 5160 5135 5036 62 -59 13 C ATOMO 1607 CD2 TYR A 436 10.389 -3.905 -5.195 1.00 40.97 C ANISOU 1607 CD2 TYR A 436 5145 5122 5300 80 3 -58 C ATOMO 1608 C TYR A 436 8.303 -5.264 -8. 287 1.00 39.02 C ANISOU 1608 C TYR A 436 5083 5005 4736 -49 -25 -2 C ATOMO 1609 O TYR A 436 7.289 -5.871 -8. 531 1.00 38.66 O ANISOU 1609 O TYR A 436 5121 4885 4682 -64 -60 4 O ATOMO 1610 N THR A 437 9.514 -5.755 -8.503 1.00 39.50 N ANISOU 1610 N THR A 437 5159 5021 4828 -10 2 -25 N ATOMO 1611 CA THR A 437 9.734 -7.163 -8. .753 1.00 40.83 C ANISOU 1611 CA THR A 437 5264 5167 5080 -30 15 33 C ATOMO 1612 CB THR A 437 9.495 -7.556 -10. .250 1.00 40.93 C ANISOU 1612 CB THR A 437 5246 5166 5137 -33 3 -17 C ATOMO 1613 OG1 THR A 437 9.270 -8.968 -10. .336 1.00 41.06 O ANISOU 1613 OG1 THR A 437 5236 5079 5286 15 103 -13 O ATOMO 1614 CG2 THR A 437 10.665 -7.153 -11.145 1.00 39.50 C ANISOU 1614 CG2 THR A 437 5153 4957 4898 -9 5 -1 C ATOMO 1615 C THR A 437 11.121 -7.579 -8 .248 1.00 41.64 C ANISOU 1615 C THR A 437 5343 5262 5214 -19 -19 68 C ATOMO 1616 O THR A 437 11.926 -6.731 -7.857 1.00 41.69 O ANISOU 1616 O THR A 437 5358 5239 5240 -28 -17 144 O ATOMO 1617 N GLN A 438 11.371 -8.886 -8 .250 1.00 42.72 N ANISOU 1617 N GLN A 438 5471 5368 5392 -15 17 61 N ATOMO 1618 CA GLN A 438 12.573 -9.499 -7 .668 1.00 43.76 C ANISOU 1618 CA GLN A 438 5564 5521 5541 0 12 72 C ATOMO 1619 CB GLN A 438 12.260 -10.041 -6.266 1.00 43.80 C ANISOU 1619 CB GLN A 438 5570 5515 5557 21 -19 59 C ATOMO 1620 CG GLN A 438 13.471 -10.272 -5.363 1.00 45.09 C ANISOU 1620 CG GLN A 438 5780 5691 5659 13 21 68 C ATOMO 1621 CD GLN A 438 13.088 -10.493 -3.894 1.00 44.91 C ANISOU 1621 CD GLN A 438 5851 5578 5634 4 82 72 C ATOMO 1622 OE1 GLN A 438 12.943 -11.640 -3.453 1.00 46.59 O ANISOU 1622 OE1 GLN A 438 5980 5851 5871 -13 157 97 O ATOMO 1623 NE2 GLN A 438 12.927 -9.394 -3.132 1.00 45.98 N ANISOU 1623 NE2 GLN A 438 5903 5784 5783 -47 135 46 N ATOMO 1624 C GLN A 438 12.951 -10.641 -8.584 1.00 43.72 C ANISOU 1624 C GLN A 438 5579 5440 5593 3 -9 94 C ATOMO 1625 O GLN A 438 12.083 -11.348 -9.079 1.00 43.70 O ANISOU 1625 O GLN A 438 5600 5396 5605 -1 -19 100 O ATOMO 1626 N LYS A 439 14.239 -10.788 -8.859 1.00 44.68 N ANISOU 1626 N LYS A 439 5693 5568 5715 -2 -26 96 N ATOMO 1627 CA LYS A 439 14.741 -11.933 -9.615 1.00 45.43 C ANISOU 1627 CA LYS A 439 5800 5662 5798 -16 -9 70 C ATOMO 1628 CB LYS A 439 15.058 -11.555 -11.064 1.00 45.89 C ANISOU 1628 CB LYS A 439 5825 5736 5873 -5 -9 40 C ATOMO 1629 CG LYS A 439 13.856 -11.073 -11.880 1.00 46.21 C ANISOU 1629 CG LYS A 439 5900 5781 5874 51 -46 49 C ATOMO 1630 CD LYS A 439 12.907 -12.194 -12.253 1.00 46.24 C ANISOU 1630 CD LYS A 439 5775 5776 6016 -18 -95 97 C ATOMO 1631 CE LYS A 439 11.616 -11.657 -12.829 1.00 47.33 C ANISOU 1631 CE LYS A 439 6039 5979 5962 -62 19 23 C ATOMO 1632 NZ LYS A 439 10.782 -12.775 -13.332 1.00 47.50 N ANISOU 1632 NZ LYS A 439 6069 6016 5962 -55 -46 41 ATOMO 1633 C LYS A 439 15.969 -12.490 -8,.917 1.00 46.09 C ANISOU 1633 C LYS A 439 5848 5746 5916 -7 -7 78 C ATOMO 1634 O LYS A 439 16.907 -11.749 -8 , 596 1.00 46.55 O ANISOU 1634 O LYS A 439 5959 5751 5975 6 -6 117 O ATOMO 1635 N SER A 440 15.946 -13.796 -8 .655 1.00 46.72 N ANISOU 1635 N SER A 440 5934 5839 5979 -31 -11 81 N ATOMO 1636 CA SER A 440 17.032 -14.454 -7 .942 1.00 46.85 C ANISOU 1636 CA SER A 440 5928 5897 5975 -7 -17 88 C ATOMO 1637 CB SER A 440 16.496 -15.469 -6 .913 1.00 47.28 C ANISOU 1637 CB SER A 440 5941 6005 6016 -9 -20 46 C ATOMO 1638 OG SER A 440 16.183 -14.836 -5 .671 1.00 48.78 O ANISOU 1638 OG SER A 440 6002 6424 6105 -24 17 60 O ATOMO 1639 C SER A 440 17.973 -15.124 -8 .918 1.00 46.89 C ANISOU 1639 C SER A 440 5980 5868 5969 -17 -17 95 C ATOMO 1640 O SER A 440 17.545 -15.633 -9 .959 1.00 47.05 O ANISOU 1640 O SER A 440 6023 5846 6007 -34 -57 109 O ATOMO 1641 N LEU A 441 19.258 -15.097 -8 .571 1.00 47.27 N ANISOU 1641 N LEU A 441 6010 5908 6042 16 -21 93 N ATOMO 16 2 CA LEU A 441 20.323 -15.741 -9 .329 1.00 47.61 C ANISOU 1642 CA LEU A 441 6027 5975 6087 14 1 78 C ATOMO 1643 CB LEU A 441 21.264 -14.677 -9 .907 1.00 47.64 C ANISOU 1643 CB LEU A 441 6073 5959 6066 37 7 102 C ATOMO 1644 CG LEU A 441 22.391 -15.101 -10 .862 1.00 47.04 C ANISOU 1644 CG LEU A 441 5967 5906 5997 40 6 66 C ATOMO 1645 CD1 LEU A 441 21.849 -15.691 -12 .147 1.00 47.09 C ANISOU 1645 CD1 LEU A 441 6088 5875 5927 76 24 60 C ATOMO 1646 CD2 LEU A 441 23.266 -13.921 -11 .162 1.00 47.11 C ANISOU 1646 CD2 LEU A 441 5985 5891 6020 25 -6 88 C ATOMO 1647 C LEU A 441 21.101 -16.740 -8.437 1.00 48.31 C A ISOU 1647 C LEU A 441 6136 6022 6196 33 -7 89 C ATOMO 1648 O LEU A 441 21.434 -16.440 -7.269 1.00 47.92 O ANISOU 1648 O LEU A 441 6026 5982 6196 0 -72 71 O ATOMO 1649 N SER A 442 21.366 -17.924 -8.998 1.00 49.31 N ANISOU 1649 N SER A 442 6259 6162 6314 38 26 67 N ATOMO 1650 CA SER A 442 22.025 -19.032 -8.263 1.00 50.46 C ANISOU 1650 CA SER A 442 6432 6297 6442 43 18 55 C ATOMO 1651 CB SER A 442 20.983 -19.965 -7.635 1.00 50.19 C ANISOU 1651 CB SER A 442 6428 6217 6421 34 26 71 C ATOMO 1652 OG SER A 442 20.685 -19.603 -6.297 1.00 50.93 O ANISOU 1652 OG SER A 442 6648 6207 6496 55 -43 19 O ATOMO 1653 C SER A 442 22.947 -19.865 -9.145 1.00 51.22 C ANISOU 1653 C SER A 442 6514 6433 6515 40 21 51 C ATOMO 1654 O SER A 442 22.689 -20.034 -10.346 1.00 51.69 O ANISOU 1654 O SER A 442 6550 6551 6539 26 -4 45 O ATOMO 1655 N LEU A 443 24.012 -20.392 -8.537 1.00 52.28 N ANISOU 1655 N LEU A 443 6616 6628 6619 21 5 55 N ATOMO 1656 CA LEU A 443 24.886 -21.388 -9.174 1.00 53.25 C ANISOU 1656 CA LEU A 443 6742 6744 6746 33 0 26 C ATOMO 1657 CB LEU A 443 25.940 -21.890 -8.178 1.00 53.57 C ANISOU 1657 CB LEU A 443 6795 6808 6748 31 -4 40 C ATOMO 1658 CG LEU A 443 27.061 -22.777 -8.734 1.00 53.94 C ANISOU 1658 CG LEU A 443 6821 6927 6747 71 10 64 C ATOMO 1659 CD1 LEU A 443 27.662 -22.226 -10.044 1.00 55.71 C ANISOU 1659 CD1 LEU A 443 7063 7076 7027 -4 40 67 C ATOMO 1660 CD2 LEU A 443 28.135 -22.952 -7.702 1.00 55.22 C ANISOU 1660 CD2 LEU A 443 6963 7124 6892 17 6 -2 C ATOMO 1661 C LEU A 443 24.112 -22.576 -9.771 1.00 53.71 C ANISOU 1661 C LEU A 443 6819 6793 6792 4 2 27 C ATOMO 1662 O LEU A 443 23.550 -23.410 -9.032 1.00 53.76 O ANISOU 1662 O LEU A 443 6815 6847 6764 25 9 84 O ATOMO 1663 N SER A 444 24.103 -22.645 -11.106 1.00 54.22 N ANISOU 1663 N SER A 444 6928 6846 6826 -17 15 25 N ATOMO 1664 CA SER A 444 23.320 -23.649 -11.835 1.00 54.89 C ANISOU 1664 CA SER A 444 6984 6928 6940 -35 12 13 C ATOMO 1665 CB SER A 444 23.149 -23.261 -13.303 1.00 54.86 C ANISOU 1665 CB SER A 444 6962 6941 6939 -49 23 16 C ATOMO 1666 OG SER A 444 22.201 -24.103 -13.928 1.00 54.82 O ANISOU 1666 OG SER A 444 7079 6949 6799 -69 14 -88 O ATOMO 1667 C SER A 444 23.919 -25.055 -11.752 1.00 55.51 C ANISOU 1667 C SER A 444 7024 6992 7072 -18 33 3 C ATOMO 1668 O SER A 444 25.131 -25.226 -11.969 1.00 55.87 O ANISOU 1668 O SER A 444 7048 7066 7112 -44 54 -23 O ATOMO 1669 N PRO A 445 23.069 -26.066 -11.448 1.00 55.87 N ANISOU 1669 N PRO A 445 7077 7024 7123 -21 55 28 N ATOMO 1670 CA PRO A 445 23.527 -27.447 -11.334 1.00 56.18 C ANISOU 1670 CA PRO A 445 7138 7066 7139 -14 43 20 C ATOMO 1671 CB PRO A 445 22.634 -28.013 -10.213 1.00 56.09 C ANISOU 1671 CB PRO A 445 7127 7062 7121 -19 38 43 C ATOMO 1672 CG PRO A 445 21.374 -27.115 -10.201 i.00 55.99 C ANISOU 1672 CG PRO A 445 7107 7028 7136 -18 60 17 C ATOMO 1673 CD PRO A 445 21.619 -25.973 -11.182 1.00 55.94 C ANISOU 1673 CD PRO A 445 7068 7042 7143 -13 32 27 C ATOMO 1674 C PRO A 445 23.313 -28.224 -12.636 1.00 56.28 C ANISOU 1674 C PRO A 445 7162 7119 7100 -20 5 9 C ATOMO 1675 O PRO A 445 22.773 -27.671 -13.598 1.00 56.74 O A ISOU 1675 O PRO A 445 7250 7159 7148 -40 -2 46 O ATOMO 1676 Cl NAG C 1 23.582 33.784 -6.381 1.00 62.40 C ANISOU 1676 Cl NAG C 1 7883 7954 7870 -44 -8 -30 C ATOMO 1677 C2 NAG C 1 23.462 33.722 -7.905 1.00 65.49 C ANISOU 1677 C2 NAG C 1 8282 8330 8269 -28 6 -4 C ATOMO 1678 N2 NAG C 1 23.093 35.025 -8.441 1.00 66.24 N ANISOU 1678 N2 NAG C 1 8456 8344 8368 18 29 25 N ATOMO 1679 C7 NAG C 1 23.585 35.522 -9.579 1.00 67.45 C ANISOU 1679 C7 NAG C 1 8530 8535 8561 -1 -2 14 C ATOMO 1680 07 NAG C 1 23.964 34.827 -10.522 1.00 67.51 O ANISOU 1680 07 NAG C 1 8538 8539 8571 59 54 -2 O ATOMO 1681 C8 NAG C 1 23.648 37.017 -9.676 1.00 66.89 C ANISOU 1681 C8 NAG C 1 8466 8432 8517 -1 16 31 C ATOMO 1682 C3 NAG C 1 22.443 32.665 -8.344 1.00 65.88 C ANISOU 1682 C3 NAG C 1 8333 8317 8379 -25 6 -44 C ATOMO 1683 03 NAG C 1 22.590 32.483 -9.734 1.00 66.07 O ANISOU 1683 03 NAG C 1 8394 8322 8385 -34 33 -29 O ATOMO 1684 C4 NAG C 1 22.599 31.331 -7.598 1.00 65.99 C ANISOU 1684 C4 NAG C 1 8321 8333 8418 5 7 -11 C ATOMO 1685 04 NAG C ' 1 21.474 30.499 -7.821 1.00 66.44 O ANISOU 1685 04 NAG C 1 8287 8408 8547 13 31 9 O ATOMO 1686 C5 NAG C 1 22.752 31.577 -6.097 1.00 66.41 C ANISOU 1686 C5 NAG C 1 8343 8413 8474 -27 15 -25 C ATOMO 1687 C6 NAG C 1 22.991 30.280 -5.319 1.00 70.02 C ANISOU 1687 C6 NAG C 1 8892 8745 8966 21 22 38 C ATOMO 1688 06 NAG C 1 23.519 30.524 -4.020 1.00 73.85 O ANISOU 1688 06 NAG C 1 9391 9317 9349 -6 -44 -16 O ATOMO 1689 05 NAG C 1 23.817 32.482 -5.871 1.00 63.94 O ANISOU 1689 05 NAG C 1 8161 8050 8084 80 50 57 O ATOMO 1690 Cl NAG C 2 21 .730 29.460 -8.798 1.00 65.34 C ANISOU 1690 Cl NAG C 2 8142 8275 8407 44 10 1 C ATOMO 1691 C2 NAG C 2 21 .096 28.144 -8.338 1.00 65.73 C ANISOU 1691 C2 NAG C 2 8184 8346 8442 35 -16 -3 C ATOMO 1692 N2 NAG C 2 21 .683 27.718 -7.084 1.00 64.89 N ANISOU 1692 N2 NAG C 2 8185 8149 8320 -5 14 -2 N ATOMO 1693 C7 NAG C 2 20 .978 27.261 -6.059 1.00 63.76 C ANISOU 1693 C7 NAG C 2 8044 7955 8225 -2 10 -19 C ATOMO 1694 07 NAG C 2 19 .755 27.237 -6.045 1.00 64.27 O ANISOU 1694 07 NAG C 2 8126 7933 8360 58 -45 -18 O ATOMO 1695 C8 NAG C 2 21 .759 26.753 -4.886 1.00 63.17 C ANISOU 1695 C8 NAG C 2 8009 7902 8089 -43 0 -70 C ATOMO 1696 C3 NAG C 2 21 .272 27.045 -9.384 1.00 66.30 C ANISOU 1696 C3 NAG C 2 8307 8391 8490 -9 39 -16 C ATOMO 1697 03 NAG C 2 20 .552 25.897 -9.004 1.00 66.84 O ANISOU 1697 03 NAG C 2 8376 8464 8554 36 21 -17 O ATOMO 1698 C4 NAG C 2 20 .804 27.518 -10.758 1.00 67.01 C ANISOU 1698 C4 NAG C 2 8356 8544 8559 11 6 16 C ATOMO 1699 04 NAG C 2 21 .178 26.580 -11.745 1.00 68.38 O ANISOU 1699 04 NAG C 2 8536 8661 8781 48 1 -50 O ATOMO 1700 C5 NAG C 2 21 .470 28.857 -11.105 1.00 66.52 C ANISOU 1700 C5 NAG C 2 8316 8433 8524 47 10 -29 C ATOMO 1701 C6 NAG C 2 20 .959 29.383 -12.447 1.00 65.54 C ANISOU 1701 C6 NAG C 2 8421 8024 8454 24 13 40 C ATOMO 1702 06 NAG C 2 20 .896 30.794 -12.448 1.00 66.76 O ANISOU 1702 06 NAG C 2 8300 8669 8396 -35 74 -46 ATOMO 1703 05 NAG C 2 21.262 29.813 -10.083 1.00 65.04 O ANISOU 1703 05 NAG C 2 8097 8260 8355 41 32 14 O ATOMO 1704 Cl BMA C 3 20.170 25.602 -12.036 1.00 69.16 C ANISOU 1704 Cl BMA C 3' 8600 8769 8908 4 18 7 C ATOMO 1705 C2 BMA C 3 20.218 25.313 -13.529 1.00 70.30 C ANISOU 1705 C2 BMA C 3 8850 8920 8938 19 27 -8 C ATOMO 1706 02 BMA C 3 21.569 24.990 -13.866 1.00 70.44 O ANISOU 1706 02 BMA C 3 8922 8873 8967 -10 1 -5 O ATOMO 1707 C3 BMA C 3 19.301 24.146 -13.887 1.00 71.64 C ANISOU 1707 C3 BMA C 3 8983 9046 9190 8 23 33 C ATOMO 1708 03 BMA C 3 19.431 23.763 -15.259 1.00 75.50 O ANISOU 1708 03 BMA C 3 9547 9570 9568 -21 91 -86 O ATOMO 1709 C4 BMA C 3 19.635 22.931 -13.035 1.00 69.90 c ANISOU 1709 C4 BMA C 3 8765 8895 8898 29 63 -28 c ATOMO 1710 04 BMA C 3 18.694 21.909 -13.353 1.00 69.61 O ANISOU 1710 04 BMA C 3 8791 8790 8869 -4 63 40 O ATOMO 1711 C5 BMA C 3 19.565 23.304 -11.562 1.00 68.25 C ANISOU 1711 C5 BMA C 3 8529 8638 8763 43 25 26 C ATOMO 1712 C6 BMA C 3 19.992 22.163 -10.656 1.00 66.92 C ANISOU 1712 C6 BMA C 3 8364 8482 8579 9 30 -59 C ATOMO 1713 06 BMA C 3 20.187 22.675 -9.336 1.00 64.81 O ANISOU 1713 06 BMA C 3 8159 8199 8264 28 -14 -16 O ATOMO 1714 05 BMA C 3 20.426 24.412 -11.292 1.00 68.53 O ANISOU 1714 05 BMA C 3 8472 8748 8818 3 -2 14 O ATOMO 1715 Cl MAN C 4 18.485 24.451 -16.100 1.00 80.48 C ANISOU 1715 Cl MAN C 4 10175 10231 10170 54 -11 39 C ATOMO 1716 C2 MAN C 4 17.857 23.471 -17.095 1.00 83.30 C ANISOU 1716 C2 MAN C 4 10595 10536 10515 -34 3 -45 C ATOMO 1717 02 MAN C 16.758 24.059 -17.785 1.00 86.66 O ANISOU 1717 02 MAN C 10987 10961 10976 56 -72 11 O ATOMO 1718 C3 MAN C 18.909 22.950 -18.097 1. 00 83.53 C ANISOU 1718 C3 MAN C 10571 10594 10570 -3 -6 -16 C ATOMO 1719 03 MAN C 18.291 22.361 -19.225 1. 00 83.93 O ANISOU 1719 03 MAN C 10617 10659 10610 21 0 -35 0 ATOMO 1720 C4 MAN C 19.916 24.011 -18.569 1.00 83.25 C ANISOU 1720 C4 MAN C 10531 10556 10544 0 21 -13 C ATOMO 1721 04 MAN C 21.086 23.342 -18.983 1. 00 82.77 O ANISOU 1721 04 MAN C 10525 10482 10441 -7 36 -14 O ATOMO 1722 C5 MAN C 20.281 25.007 -17.461 1..00 82.93 C ANISOU 1722 C5 MAN C 10477 10508 10524 23 16 -3 C ATOMO 1723 C6 MAN C 21.110 26.187 -17.945 1. .00 82.33 C ANISOU 1723 C6 MAN C 10560 10453 10268 -61 -54 -113 C ATOMO 1724 06 MAN C 21.526 26.916 -16.808 1..00 84.80 0 ANISOU 1724 06 MAN C 10612 10772 10835 71 57 111 O ATOMO 1725 05 MAN C 19.111 25.485 -16.823 1.00 81.69 O ANISOU 1725 05 MAN C 10367 10342 10328 -38 18 6 0 ATOMO 1726 Cl NAG C 15.457 23.728 -17.226 1.00 89.09 C ANISOU 1726 Cl NAG C 11237 11320 11293 -16 29 -14 C ATOMO 1727 C2 NAG C 14.333 24.200 -18.167 1.00 90.32 C ANISOU 1727 C2 NAG C 11439 11436 11441 8 -17 15 C ATOMO 1728 N2 NAG C 13.146 24.596 -17.413 1.00 90.36 N ANISOU 1728 N2 NAG C 11463 11426 11444 5 8 -13 N ATOMO 1729 C7 NAG C 12.233 25.470 -17.860 1.00 91.03 C ANISOU 1729 C7 NAG C 11565 11585 11434 -4 21 -26 C ATOMO 1730 07 NAG C 12.477 26.652 -18.106 1.00 90.45 O ANISOU 1730 07 NAG C 11527 11441 11396 -12 27 -5 O ATOMO 1731 C8 NAG C 5 10.835 24.956 -18.055 1, 00 90.77 C A ISOU 1731 C8 NAG C 5 11519 11492 11476 -12 -1 -20 C ATOMO 1732 C3 NAG C 5 13.944 23.170 -19.237 1..00 91.25 C ANISOU 1732 C3 NAG C 5 11585 11552 11533 1 -6 -9 C ATOMO 1733 03 NAG C 5 14.135 23.730 -20.517 1.00 91.88 O ANISOU 1733 03 NAG C 5 11692 11628 11590 -8 8 -1 O ATOMO 1734 C4 NAG C 5 14.713 21.851 -19.167 1.00 91.47 C ANISOU 1734 C4 NAG C 5 11616 11584 11554 13 -11 -4 C ATOMO 1735 04 NAG C 5 13.982 20.876 -19.882 1.00 91.95 O ANISOU 1735 04 NAG C 5 11633 11671 11632 -13 -47 -33 O ATOMO 1736 C5 NAG C 5 14.961 21.352 -17.736 1.00 91.25 C ANISOU 1736 C5 NAG C 5 11588 11546 11537 9 -15 -10 C ATOMO 1737 C6 NAG C .5 16.052 20.276 -17.726 1.00 92.24 C ANISOU 1737 C6 NAG C 5 11575 11579 11891 0 -46 -137 C ATOMO 1738 06 NAG C 5 16.007 19 560 -16.510 1.00 90.72 O ANISOU 1738 06 NAG C 5 11735 11388 11344 -24 -54 91 O ATOMO 1739 05 NAG C 5 15.297 22 377 -16.797 1.00 90.15 O ANISOU 1739 05 NAG C 5 11430 11414 11406 5 -15 26 O ATOMO 1740 Cl MAN C 7 20.272 21 548 -8.453 1.00 64.56 C ANISOU 1740 Cl MAN C 7 8141 8188 8199 -9 -4 -47 C ATOMO 1741 C2 MAN C 7 19.819 21 886 -7.041 1.00 64.34 C ANISOU 1741 C2 MAN C 7 8131 8140 8175 3 1 -13 C ATOMO 1742 02 MAN C 7 19.851 20 689 -6.290 1.00 64.37 O ANISOU 1742 02 MAN C 7 8170 8136 8152 13 14 -72 O ATOMO 1743 C3 MAN C 7 20.773 22 900 -6.390 1.00 64.46 C ANISOU 1743 C3 MAN C 7 8127 8187 8177 -25 13 -19 C ATOMO 1744 03 MAN C 7 20.410 23 ,129 -5.037 1.00 63.53 O ANISOU 1744 03 MAN C 7 7975 8057 8105 -67 -15 -101 O ATOMO 1745 C4 MAN C 7 22.239 22.434 -6.476 1.00 64.50 C ANISOU 1745 C4 MAN C 7 8179 8148 8180 7 13 -40 C ATOMO 1746 04 MAN C 7 23.132 23.509 -6.221 1.00 64.35 O ANISOU 1746 04 MAN C 7 8206 8105 8139 46 -5 -78 O ATOMO 1747 C5 MAN C 7 22.602 21.790 -7.827 1.00 64.16 C ANISOU 1747 C5 MAN C 7 8159 8123 8096 -6 0 -11 C ATOMO 1748 C6 MAN C 7 23.842 20.915 -7.667 1.00 63.34 C ANISOU 1748 C6 MAN C 7 7929 7985 8151 -24 -13 57 C ATOMO 1749 06 MAN C 7 24.053 20.180 -8.846 1.00 61.06 O ANISOU 1749 06 MAN C 7 7751 7711 7737 40 -16 -78 O ATOMO 1750 05 MAN C 7 21.565 20.982 -8.380 1.00 64.42 O ANISOU 1750 05 MAN C 7 8221 8144 8112 -36 17 -13 O ATOMO 1751 Cl NAG C 8 18.593 20.003 -6.270 1.00 63.46 C ANISOU 1751 Cl NAG C 8 8070 8012 8030 -5 -1 -34 C ATOMO 1752 C2 NAG C 8 18.856 18.592 -5.766 1.00 64.09 C ANISOU 1752 C2 NAG C 8 8169 8111 8072 -6 -10 14 C ATOMO 1753 N2 NAG C 8 19.889 17.946 -6.563 1.00 63.96 N ANISOU 1753 N2 NAG C 8 8038 8176 8088 48 -11 12 N ATOMO 1754 C7 NAG C 8 21.157 17.831 -6.142 1.00 67.85 C ANISOU 1754 C7 NAG C 8 8475 8217 9086 -90 51 262 C ATOMO 1755 07 NAG C 8 21.540 18.162 -5.017 1.00 63.54 O ANISOU 1755 07 NAG C 8 8084 8252 7806 -67 -148 -118 O ATOMO 1756 C8 NAG C 8 22.133 17.253 -7.129 1.00 63.31 C ANISOU 1756 C8 NAG C 8 8014 8140 7899 131 171 -31 C ATOMO 1757 C3 NAG C 8 17.561 17.785 -5.725 1.00 63.80 C ANISOU 1757 C3 NAG C 8 8109 8055 8075 0 -8 -41 C ATOMO 1758 03 NAG C 8 17.802 16.564 -5.040 1.00 64.18 O ANISOU 1758 03 NAG C 8 8158 8167 8059 20 -18 -53 O ATOMO 1759 C4 NAG C 16.450 18.562 -4.999 1.00 62.99 C ANISOU 1759 C4 NAG C 8022 7934 7977 24 -38 -22 C ATOMO 1760 04 NAG C 15.194 17.950 -5.229 1.00 63.13 O ANISOU 1760 04 NAG C 8044 7901 8038 54 -37 -48 O ATOMO 1761 C5 NAG C 16.391 20.062 -5.340 1.00 62.31 C ANISOU 1761 C5 NAG C 7922 7895 7856 3 2 -21 C ATOMO 1762 C6 NAG C 15.637 20.861 -4.271 1.00 61.45 C ANISOU 1762 C6 NAG C 7823 7770 7755 -29 -23 -11 C ATOMO 1763 06 NAG C 16.235 20.685 -2.999 1.00 59.23 O ANISOU 1763 06 NAG C 7510 7497 7498 24 71 -106 O ATOMO 1764 05 NAG C 17.675 20.637 -5.415 1.00 62.28 O ANISOU 1764 05 NAG C 7944 7849 7870 -26 -26 4 O ATOMO 1765 Cl GAL C 14.603 17.561 -3.972 1.00 62.63 C ANISOU 1765 Cl GAL C 7968 7907 7920 -3 -4 -28 C ATOMO 1766 C2 GAL C 13.290 16.787 -4.178 1.00 62.38 C ANISOU 1766 C2 GAL C 7981 7842 7878 19 -5 -33 C ATOMO 1767 02 GAL C 12.274 17.622 -4.709 1.00 60.03 O ANISOU 1767 02 GAL C 7846 7411 7550 -14 6 -131 O ATOMO 1768 C3 GAL C 12.818 16 148 -2.860 1.00 62.73 C ANISOU 1768 C3 GAL C 8016 7945 7872 38 8 -36 C ATOMO 1769 03 GAL C 11.849 15 158 -3.102 1.00 62.97 O ANISOU 1769 03 GAL C 7994 7990 7941 -25 39 8 O ATOMO 1770 C4 GAL C 13.958 15.500 -2.082 1.00 63.15 C ANISOU 1770 C4 GAL C 8053 7994 7944 4 6 44 C ATOMO 1771 04 GAL C 14.499 14.420 -2.818 1.00 61.84 O ANISOU 1771 04 GAL C 7873 7903 7720 12 9 65 O ATOMO 1772 C5 GAL C 15.022 16.559 -1.867 1.00 63.69 C ANISOU 1772 C5 GAL C 8052 8039 8108 -2 -14 28 C ATOMO 1773 C6 GAL C 9 16.117 16.112 -0.903 1.00 64.97 C A ISOU 1773 C6 GAL C 9 8268 8195 8220 44 -44 59 C ATOMO 1774 06 GAL C 9 17.286 16.891 -1.077 1.00 65.24 O ANISOU 1774 06 GAL C 9 8290 8153 8345 -73 -89 82 O ATOMO 1775 05 GAL C 9 15.525 16.843 -3.157 1.00 64.20 O ANISOU 1775 05 GAL C 9 8132 8127 8132 15 -28 -36 O ATOMO 1776 Cl FUC C 11 24.736 29.847 -3.954 1.00 77.44 C ANISOU 1776 Cl FUC C 11 9759 9799 9837 29 -9 1 C ATOMO 1777 C2 FUC C 11 26.080 30.499 -4.293 1.00 78.54 C ANISOU 1777 C2 FUC C 11 9883 9910 10014 -7 4 2 C ATOMO 1778 02 FUC C 11 26.808 30.755 -3.112 1.00 79.77 O ANISOU 1778 02 FUC C 11 9917 10007 10050 72 -20 -34 O ATOMO 1779 C3 FUC C 11 26.977 29.696 -5.231 1.00 78.25 C ANISOU 1779 C3 FUC C 11 9972 9993 10072 -6 44 -18 C ATOMO 1780 03 FUC C 11 26.852 30.264 -6.510 1.00 79.46 O ANISOU 1780 03 FUC C 11 10023 10064 10081 -17 58 20 O ATOMO 1781 C4 FUC C 11 26.769 28.174 -5.286 1.00 77.45 C ANISOU 1781 C4 FUC C 11 10020 10011 10048 -23 33 -20 C ATOMO 1782 04 FUC C 11 26.880 27.703 -6.627 1.00 78.56 O ANISOU 1782 04 FUC C 11 10076 9967 9991 -28 42 -26 O ATOMO 1783 C5 FUC C 11 25.463 27.641 -4.693 1.00 77.17 C ANISOU 1783 C5 FUC C 11 10016 10033 10124 13 23 -2 C ATOMO 1784 C6 FUC C 11 24.460 27.240 -5.783 1.00 78.48 C ANISOU 1784 C6 FUC C 11 10059 9937 10067 0 46. -62 C ATOMO 1785 05 FUC C 11 24.873 28.467 -3.681 1.00 79.38 O ANISOU 1785 05 FUC C 11 9928 9876 10085 -4 13 -44 O ATOMO 1786 ZN ZN I 1 1.011 2.625 -6.522 1.00 37.90 ZN ANISOU 1786 ZN ZN I 1 5916 5645 2837 -109 -134 -300 ZN ATOMO 1787 ZN ZN I 2 -2.850 29.288 0.411 1.00 66.11 ZN ANISOU 1787 ZN ZN I 2 8310 7792 9014 476 23 -269 ZN ATOMO 1788 ZN ZN I 3 0.081 21.125 -18.851 0.50 60.89 ZN ANISOU 1788 ZN ZN I 3 7926 7551 7656 24 -73 15 ZN ATOMO 1789 ZN ZN I 4 4.094 -7.924 -14.198 0.50 63.49 ZN ANISOU 1789 ZN ZN I 4 7915 7950 8259 -54 190 -25 ZN ATOMO 1790 OW HOH W 1 -2.686 -4.705 -7.680 1.00 51.42 O ANISOU 1790 OW HOH W 1 6584 6695 6258 169 -102 48 O ATOMO 1791 OW HOH W 2 15.326 7.920 -11.915 1.00 41.62 O ANISOU 1791 OW HOH W 2 5180 5671 4961 -35 -220 -272 O ATOMO 1792 OW HOH W 3 11.705 21.084 -15.919 1.00 53.41 O ANISOU 1792 OW HOH W 3 6696 6842 6755 76 -83 53 O ATOMO 1793 OW HOH W 4 4.028 8.613 -6.717 1.00 24.34 O ANISOU 1793 OW HOH W 4 3616 2379 3251 0 -336 632 O ATOMO 1794 OW HOH W 5 4.904 7.310 -3.564 1.00 23.00 O ANISOU 1794 OW HOH W 5 3808 3315 1615 -69 307 -476 O ATOMO 1795 OW HOH W 6 2.707 2.220 -14.972 1.00 23.50 O ANISOU 1795 OW HOH W 6 3794 2827 2306 91 -630 374 O ATOMO 1796 OW HOH W 7 0.086 8.821 -15.891 1.00 13.87 O ANISOU 1796 OW HOH W 7 2598 1403 1268 195 51 -373 O ATOMO 1797 OW HOH W 8 23.163 6.265 -13.153 1.00 41.03 O ANISOU 1797 OW HOH W 8 5402 4550 5636 147 229 45 O ATOMO 1798 OW HOH W 9 20.619 3.699 -13.114 1.00 23.85 O ANISOU 1798 OW HOH W 9 3742 2526 2794 -240 -69 -539 O ATOMO 1799 OW HOH W 10 -2.466 -6.638 -5.878 1.00 44.21 O ANISOU 1799 OW HOH W 10 5803 5719 5275 -213 103 100 O ATOMO 1800 OW HOH W 11 12.642 -1.804 -2.353 1.00 63.47 O ANISOU 1800 OW HOH W 11 8214 7905 7995 -35 -45 -9 O ATOMO 1801 OW HOH W 12 22.639 6.534 -20.972 1.00 33.47 O ANISOU 1801 OW HOH W 12 3867 4337 4510 -144 129 -236 O ATOMO 1802 OW HOH W 13 21.422 1.104 -8.987 1.00 24.16 O ANISOU 1802 OW HOH W 13 3539 3414 2226 -145 221 76 O ATOMO 1803 OW HOH W 14 8.879 4.061 -13.080 1.00 24.97 O ANISOU 1803 OW HOH W 14 3170 3239 3075 162 -18 -220 O ATOMO 1804 OW HOH W 15 11.288 6.795 -26.054 1.00 45.90 o ANISOU 1804 OW HOH W 15 5829 5389 6220 -13 40 27 O ATOMO 1805 OW HOH W 16 14.749 -1.980 -24.051 1.00 16.53 O ANISOU 1805 OW HOH W 16 3271 2274 735 26 224 -273 O ATOMO 1806 OW HOH W 17 -0.444 6.851 -20.367 1.00 17.75 O ANISOU 1806 OW HOH W 17 2576 1988 2179 732 234 28 O ATOMO 1807 OW HOH W 18 2.245 11.930 -0.120 1.00 32.42 O ANISOU 1807 OW HOH W 18 4359 4213 3746 -160 29 -125 O ATOMO 1808 OW HOH W 19 5.162 7.718 -18.328 1.00 25.83 O ANISOU 1808 OW HOH W 19 3497 3439 2878 96 -375 -584 O ATOMO 1809 OW HOH W 20 0.796 0.967 -5.140 1.00 21.38 O ANISOU 1809 OW HOH W 20 3124 2654 2344 142 186 -165 O ATOMO 1810 OW HOH W 21 -2.715 28.725 2.415 1.00 36.34 O ANISOU 1810 OW HOH W 21 4766 4654 4387 -175 10 163 O ATOMO 1811 OW HOH W 22 30.225 -4.400 -9.331 1.00 25.40 O ANISOU 1811 OW HOH W 22 3794 3473 2383 -207 171 921 O ATOMO 1812 OW HOH W 23 7.961 6.779 -13.116 1.00 20.66 O ANISOU 1812 OW HOH W 23 2905 2729 2214 -3 224 -281 O ATOMO 1813 OW HOH W 24 7.734 8.056 -10.907 1.00 11.86 O ANISOU 1813 OW HOH W 24 2940 1037 527 120 -14 -462 O ATOMO 1814 OW HOH W 25 -0.824 -8.657 -5.241 1.00 50.76 O ANISOU 1814 OW HOH W 25 6516 6602 6166 -193 254 42 O ATOMO 1815 OW HOH W 26 -5.085 12.307 -13.493 1.00 33.94 O ANISOU 1815 OW HOH W 26 4426 4303 4165 0 -23 -112 O ATOMO 1816 OW HOH W 27 21.117 -3.680 -2.105 1.00 36.56 O ANISOU 1816 OW HOH W 27 4582 4997 4310 -135 5 141 O ATOMO 1817 OW HOH W 28 26.199 1.780 -6.259 1.00 42.44 O ANISOU 1817 OW HOH W 28 5350 5564 5209 -205 54 -69 O ATOMO 1818 OW HOH W 29 25.352 2.736 -9.492 1.00 26.64 O ANISOU 1818 OW HOH W 29 2921 3682 3517 -164 -195 80 O ATOMO 1819 OW HOH W 30 2.621 13.373 -12.530 1.00 27.62 O ANISOU 1819 OW HOH W 30 3212 3716 3565 -15 69 381 O ATOMO 1820 OW HOH W 31 1.676 -5.459 -13.242 1.00 40.05 O ANISOU 1820 OW HOH W 31 5122 5075 5018 -150 -104 -138 O ATOMO 1821 OW HOH W 32 5.616 -7.649 -12.054 1.00 25.11 O ANISOU 1821 OW HOH W 32 3700 2636 3203 249 375 178 O ATOMO 1822 OW HOH W 33 0.073 12.268 -18.854 0.50 29.68 O ANISOU 1822 OW HOH W 33 4084 3873 3317 5 87 -2 O ATOMO 1823 OW HOH W 34 -0.277 3.231 -8.278 1.00 36.13 O ANISOU 1823 OW HOH W 34 4577 4672 4477 -7 -155 -157 O ATOMO 1824 OW HOH W 35 19.204 7.619 -19.539 1.00 41.16 O ANISOU 1824 OW HOH W 35 5228 5167 5241 76 175 -195 O ATOMO 1825 OW HOH W 36 21.318 8.586 -18.968 1.00 51.27 O ANISOU 1825 OW HOH W 36 6874 6589 6015 -17 -36 -19 O ATOMO 1826 OW HOH W 37 20.898 9.827 -16.899 1.00 40.21 O ANISOU 1826 OW HOH W 37 5588 4786 4901 -99 37 53 o ATOMO 1827 OW HOH W 38 19.991 12.076 -17.304 1.00 40.03 O ANISOU 1827 OW HOH W 38 5127 5018 5064 -96 287 75 O ATOMO 1828 OW HOH W 39 22.786 6.524 -23.584 1.00 29.46 O ANISOU 1828 OW HOH W 39 4105 3167 3919 -272 63 -315 O ATOMO 1829 OW HOH W 40 12.659 7.843 -28.830 1.00 40.36 O ANISOU 1829 OW HOH W 40 5338 4722 5272 -206 -20 69 O ATOMO 1830 OW HOH W 41 12.960 24.065 -13.045 1.00 46.62 O ANISOU 1830 OW HOH W 41 5904 6077 5733 92 33 -161 O ATOMO 1831 OW HOH W 42 11.135 11.754 -10.185 1.00 30.37 O ANISOU 1831 OW HOH W 42 4271 4163 3103 204 -349 187 O ATOMO 1832 OW HOH W 43 13.202 12.031 -11.515 1.00 36.35 O ANISOU 1832 OW HOH W 43 4845 3955 5010 28 -111 -34 O ATOMO 1833 OW HOH W 44 10.537 13.629 -2.714 1.00 36.03 O ANISOU 1833 OW HOH W 44 4892 4473 4324 -219 -62 -316 O ATOMO 1834 OW HOH W 45 13.983 -0.137, 1.252 0.50 26.99 O ANISOU 1834 OW HOH W 45 3481 3502 3270 -79 -42 -87 O ATOMO 1835 OW HOH W 46 13.547 11.524 0.333 1.00 50.26 O ANISOU 1835 OW HOH W 46 6295 6703 6097 45 -125 13 O ATOMO 1836 OW HOH W 47 -3.193 30.208 -1.659 1.00 52.68 O ANISOU 1836 OW HOH W 47 6778 6676 6562 -56 51 -22 O ATOMO 1837 OW HOH W 48 2.590 0.640 -3.975 1.00 38.51 O ANISOU 1837 OW HOH W 48 4885 5274 4470 286 140 -394 O ATOMO 1838 OW HOH W 49 -4.829 10.389 -8.743 1.00 30.98 O ANISOU 1838 OW HOH W 49 4328 4157 3286 -6 85 54 O ATOMO 1839 OW HOH W 50 -5.682 15.166 -5.147 1.00 62.12 O ANISOU 1839 OW HOH W 50 7854 7808 7937 93 -68 -65 O ATOMO 1840 OW HOH W 51 9.256 11.495 -13.968 1.00 24.43 O ANISOU 1840 OW HOH 51 3144 3093 3042 17 -92 -182 O ATOMO 1841 OW HOH W 52 10.348 13.858 -13.762 1.00 31.05 O ANISOU 1841 OW HOH W 52 3599 3978 4219 -257 -125 70 O ATOMO 1842 OW HOH W 53 1.049 14.118 -17.122 1.00 31.08 O ANISOU 1842 OW HOH W 53 3973 4342 3492 -11 -363 -196 O ATOMO 1843 OW HOH W 54 1.515 10.299 -19.955 1.00 35.99 O ANISOU 1843 OW HOH W 54 4519 4385 4770 160 52 168 O ATOMO 1844 OW HOH W 55 2.150 9.713 -17.242 1.00 38.39 O ANISOU 1844 OW HOH W 55 4625 5500 4461 81 -84 35 O ATOMO 1845 OW HOH W 56 3.020 6.247 -17.374 1.00 18.01 O ANISOU 1845 OW HOH W 56 3197 2872 774 149 -339 -801 O ATOMO 1846 OW HOH W 57 7.330 25.213 -16.752 1.00 49.75 O ANISOU 1846 OW HOH W 57 6292 6287 6321 -124 -65 56 O ATOMO 1847 OW HOH W 58 6.140 4.420 -24.421 1.00 31.76 O ANISOU 1847 OW HOH W 58 4147 4290 3628 107 5 22 O ATOMO 1848 OW HOH W 59 6.934 6.415 -25.965 1.00 48.06 O ANISOU 1848 OW HOH W 59 6126 6215 5917 104 -184 125 O ATOMO 1849 OW HOH W 60 2.789 -10.262 -14.281 1.00 52.27 O ANISOU 1849 OW HOH W 60 6829 6640 6389 -85 61 -132 O ATOMO 1850 OW HOH W 61 10.173 -11.474 -17.131 1.00 43.89 O ANISOU 1850 OW HOH W 61 5243 5991 5441 -19 145 -51 O ATOMO 1851 OW HOH W 62 10.423 -9.588 -15.301 1.00 41.60 O ANISOU 1851 OW HOH W 62 4910 5490 5403 -299 -111 149 O ATOMO 1852 OW HOH W 63 12.562 10.469 -16.760 1.00 47.26 O ANISOU 1852 OW HOH W 63 6061 6168 5726 54 -119 90 O ATOMO 1853 OW HOH W 64 25.207 4.876 -13.048 1.00 43.98 O ANISOU 1853 OW HOH W 64 5382 5861 5465 4 11 -150 O ATOMO 1854 OW HOH W 65 20.403 6.945 -24.246 1.00 31.68 O ANISOU 1854 OW HOH W 65 4456 4465 3114 -263 -194 -229 O ATOMO 1855 OW HOH W 66 16.219 5.833 -30.699 1.00 53.61 O ANISOU 1855 OW HOH W 66 6744 6870 6754 -31 -25 -174 O ATOMO 1856 OW HOH 67 15.439 -3.579 -28.825 1.00 50.26 O ANISOU 1856 OW HOH W 67 6356 6649 6091 19 -89 -6 ATOMO 1857 OW HOH W 68 0.448 -2.007 -9.703 1.00 47 76 O ANISOU 1857 OW HOH W 68 5769 6029 6348 -118 -41 33 O ATOMO 1858 OW HOH W 69 9.088 10.333 -11.458 1.00 45 89 O ANISOU 1858 OW HOH W 69 5637 5868 5931 55 174 101 O ATOMO 1859 OW HOH W 70 2.301 8.833 3 .077 1.00 41 79 O ANISOU 1859 OW HOH W 70 5409 5255 5212 66 -371 ¦158 O ATOMO 1860 OW HOH W 71 19.184 33.621 -4 .885 1.00 59 40 O ANISOU 1860 OW HOH W 71 7601 7341 7625 -69 -45 •52 O ATOMO 1861 OW HOH W 72 11.411 47.589 -7.153 1.00 50 .72 O ANISOU 1861 OW HOH W 72 6739 6215 6314 -100 -123 -98 O ATOMO 1862 OW HOH W 73 -2.721 22.353 -19.060 1 00 50 .88 O ANISOU 1862 OW HOH W 73 6801 6612 5916 38 18 -78 O ATOMO 1863 OW HOH W 74 -2.520 30.795 -12.887 1 00 44 98 O ANISOU 1863 OW HOH W 74 5923 5326 5838 -14 57 136 O ATOMO 1864 OW HOH W 75 35.811 -10.347 -12.530 1 00 32 21 O ANISOU 1864 OW HOH W 75 4854 4402 2979 196 130 O FIN Conclusión: La estructura tridimensional de Fc/TM se encontró muy similar a la de otras regiones Fe humanas no mutadas sin ligando. Los efectos funcionales de amplio intervalo, dramáticos del grupo TM de sustituciones no fueron causados por las reconfiguraciones estructurales principales en la estructura Fe, sino más bien por la pérdida de unas cuantas interacciones localizadas en los sitios de mutación.
Ejemplo 34: Internalización de anticuerpos anti- IFNAR1 Propósito: Investigar la habilidad de los anticuerpos anti-IFNARl anticuerpos para internalizarse en las células células.
Métodos: Las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 conteniendo 0.05 mM de 2 -mercaptoetanol y 10% de suero de bovino fetal a 37 °C en una incubadora con 5% de C02. Las células THP-1 se sembraron a 2 x 105 células/ml en medio de cultivo fresco en el día anterior a los experimentos. En el día del experimento, las células se lavaron, contaron y volvieron a suspender en PBS a 3 x 106 células/ml. Las células se tiñeron con 1 µ? de CFSE en una incubadora a 37 °C con C02 por 10 min. Después de dos lavados adicionales con PBS, las células se colocaron en hielo y se incubaron con un bloque FcR utilizando 20 µ? por 106 células sobre hielo por 5 minutos y después se tiñeron con con 1 de Alexa647-9D4-TM o Alexa 647-R347 (anticuerpo de control no específico) en hielo por 1 hora. Después de la eliminación del mAb no unido a través de tres lavados con PBS, las células se volvieron a suspender en PBS conteniendo 2% de BSA y azida de sodio. La internalización inició transfiriendo las células a una cámara ambientalmente controlada bajo 37°C, 5% de C02 y 70% de humedad y los cinéticos de internalización de Alexa647-9D4-TM se registraron con el tiempo a través de las imágenes de fluorescencia de las células.
Las imágenes fluorescentes de las células se analizaron utilizando un algoritmo. El algoritmo utilizó el colorante citológico CFSE para identificar los límites de una célula y una región de membrana. El algoritmo cuantificó la fluorescencia asociada con 9D4-TM dentro de las células así como en la membrana. El grado de fluorescencia acumulada dentro de las células se calculó mediante el modelo que adapta los datos utilizando el software SAAMII.
Resultados: Alexa647 - 9D4 -TM se unión a las células THP-1. No se observó ninguna unión de Alexa647 -R347 , el control de isotipo de 9D4-TM, en las mismas células. Este resultado demuestra la unión específica a células THP-1 a través de 9D4-TM (Figura 33) . A 4°C, la unión de 9D4-TM se localizó predominantemente en la superficie celular (0 min -Figura 33) . Una vez que las células se incubaron a 37°C, la señal de fluorescencia para la tinción con 9D4-TM disminuyó significativamente de la superficie celular y se acumuló en el compartimiento citosólico como puntos interrumpidos. Las imágenes cinéticas registradas durante 60 minutos indican una migración gradual de la fluorescencia de la superficie celular a puntos interrumpidos localizados en el compartimiento citosólico (puntos en el tiempo de 15, 30 y 50 min, Figura 33) . El resultado claramente demuestra la internalización de 9D4-TM en células THP-1.
Ejemplo 35: Ausencia de actividad CDC mediada por 9D4-TM Propósito: Para determinar si 9D4-TM es incapaz de inducir la actividad CDC se condujeron una serie de experimentos Métodos: Se recolectó sangre humana recién aislada de donadores humanos, sanos (aproximadamente 100 mi) y se centrifugó durante 10 minutos a 3000G para separar el suero de las células. La fracción del suero se separó en dos tubos. El primer tubo se diluyó con RPMI 1640 sin fenol a una concentración final de 10% de suero (no inactivado con calor o NHI) . El segundo tubo se colocó en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos para inactivar con calor los componentes complementarios. Posteriormente, el segundo tubo se diluyó con medio RPMI-1640 sin fenol a una concentración final de 10% de suero humano inactivado con calor (HI) .
Las células B Daudi se utilizaron como células objetivo ya que expresan CD20 (objetivo para el anticuerpo de control positivo) e IFNAR1. Las células objetivo se lavaron y volvieron a suspender en ya sea medio RPMI sin fenol con 10% de suero no inactivado con calor o en medio RPMI sin fenol con 10% de suero inactivado con calor a una concentración final de 0.4 xlO6 células/ml. Las soluciones de anticuerpo se prepararon como series de dilución de 3x con las concentraciones en el intervalo de 50 ug/ml - 1.3 x 10"6 µg/ml. Las preparaciones duplicadas de las diluciones del anticuerpo se hicieron en ya sea medio con suero humano inactivado con calor o no inactivado con calor. El ensayo CDC se preparó mediante la adición de 50 µ? de medio NHI o HI a las cavidades apropiadas de una placa de fondo redondo de 96 cavidades. Se agregaron 50 µ? de las series del anticuerpo a las cavidades apropiadas. Posteriormente, se agregaron 50 µ? de la preparación de la célula objetivo a las cavidades, incluyendo extra cavidades con células objetivo solas para controles. Las placas se incubaron a 37°C por 4 horas en 5% de C02. Después de la incubación de 3.5 horas, se agregaron 20 ul de regulador de pH de lisis a las cavidades de control apropiadas designadas para la determinación de la señal de lisis máxima. En ensayo LDK Quantitate™ se llevó a cabo utilizando protocolos definidos en el ensayo de citotoxicidad no radioactivo Promega, #G1780. La absorbencia se midió a 490 nM y los valores Kd se generaron utilizando el software de análisis GraphPad Prism 4.
Resultados: Se presentan en la Figura 34 los resultados de la CDC realizada como se describe anteriormente. El anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl modificado, no exhibió actividad detectable en las células B Daudi objetivo sobre la observada con el anticuerpo R347. En contraste, el anticuerpo de control positivo, que se une a CD20 expresado en las células B Daudi, causó un aumento dependiente de la dosis en citotoxicidad sobre los niveles de fondo. Estos resultados confirman que 9D4-TM no puede mediar CDC en células objetivo que expresan IFNARl Ejemplo 36: El anticuerpo 9D4-T anti- IFNARl modificado no despliega ninguna toxicidad adversa Propósito: Para establecer que 9D4-TM no provoca ninguna toxicidad adversa, se realizó un estudio de toxicidad de dosis individual en monos cynomolgus .
Métodos: En este estudio, 4 grupos de 10 animales, cada uno ( 5/sexo/grupo) recibió una sola dosis de 0, 5, 30, o 100 mg/kg de 9D4-TM en el Día 1. Después de la dosificación, 2 animales/sexo/grupo se asignaron a necropsia en el Día 3 y todos los animales restantes se monitorearon hasta el Día 70 y después se eliminaron del estudio sin necropsia. La toxicidad se evaluó con base en la mortalidad, signos clínicos (incluyendo menstruación), inmunotipificación, pesos corporales, exámenes físicos (incluyendo ritmo cardíaco, ritmo respiratorio, y temperatura corporal) , patología clínica, pesos de órganos, y datos microscópicos .
Resultados: Bajo las condiciones descritas anteriormente, no hubo cambios adversos relacionados con 9D4-TM en mortalidad, signos clínicos (incluyendo menstruación) , inmunotipificación, pesos corporales, exámenes físicos - (incluyendo ritmo cardíaco, ritmo respiratorio, y temperatura corporal) , patología clínica, pesos de órganos, y datos microscópicos. Estos resultados sugieren que el anticuerpo 9D4-TM anti-IFNARl modificado no provoca ninguna toxicidad adversa .
Mientras que se han descrito modalidades particulares de la invención para propósitos de descripción, se apreciará por los expertos en la técnica que pueden hacerse numerosas variaciones de los detalles sin apartarse de la invención como se describe en las reivindicaciones anexas .
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia en la especificación al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente se indicara específica e individualmente a ser incorporada en la presente por referencia.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (67)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. - Un anticuerpo monoclonal de la clase IgG modificado específico para IFNAR1, caracterizado porque comprende en la región Fe por lo menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de L234F, L235E y P331S, enumerada a través del índice EU como se establece en Kabat y en donde el anticuerpo exhibe una afinidad reducida a por lo menos un ligando Fe comparado con un anticuerpo no modificado.
2. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es de la subclase IgGl o IgG .
3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es una molécula de clase IgGl.
4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende una sustitución de aminoácido de P331S.
5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende las sustituciones de aminoácidos: L234F y L235E.
6. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende las sustituciones de aminoácidos: L234F, L235E y P331S.
7. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es una molécula de la clase IgG4.
8. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende una sustitución de aminoácido de L235E de la región Fe.
9. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende en la región Fe la sustitución de aminoácido S228P.
10. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque comprende por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) , seleccionada de la Tabla 2.
11. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una CDR1 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO : 31; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 32; c. una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 33; d. una CDR1 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 34; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 35; y f. una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 36.
12.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una CDRl de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 1 ; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 2; c. una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 3; d. una CDRl de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 4 ; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 5; y f . una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 6.
13.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una CDRl de la región variable de cadena pesada, humana que comprende SEC ID NO: 11; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 12; c . una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 13; d. una CDR1 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 14; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 15; y f . una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 16.
14. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una CDR1 de la región variable de cadena pesada humana >que comprende SEC ID NO: 21; b. una CDR2 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 22; c. una CDR3 de la región variable de cadena pesada humana que comprende SEC ID NO: 23; d. una CDR1 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 24; e. una CDR2 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO : 25; y f. una CDR3 de la región variable de cadena ligera humana que comprende SEC ID NO: 26.
15. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 38; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 40.
16.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10.
17.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20.
18. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque comprende: a. una región variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 28; y b. una región variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 30.
19. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque comprende la secuencia de la región constante de cadena ligera de SEC ID NO: 41.
20. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque comprende la región constante de cadena pesada de la SEC ID NO: 42.
21. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque comprende la región constante de de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 41, y la región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 42.
22.- El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que comprende variación alélica, en donde la variación alélica es al menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 214, 221, 356 y 358 como se define por el sistema de numeración del índice EU.
23. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, intracuerpo, y un anticuerpo sintético.
24. - Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
25. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque es un vector replicable .
26. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido está operablemente enlazada a un promotor.
27. - Una célula hospedera caracterizada porque comprende o se transforma con el vector de conformidad con la reivindicación 25 ó 26.
28.- Un ratón transgénico caracterizado porque comprende los transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23.
29.- Un hibridoma preparado de ratón de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque produce el anticuerpo.
30. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
31. - Un método para tratar una afección o una enfermedad asociada con un trastorno inmunitario, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 30.
32. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad mediada por interferón de tipo I.
33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el interferón de tipo I es interferón alfa.
34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la enfermedad mediada por el interferón de tipo I está asociada con el receptor del interferón de tipo I.
35. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es infección VIH de SIDA.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es lupus sistémico eritematoso.
37. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es síndrome de Sjógren.
38. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es miositis.
39.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es miositis inflamatoria.
40.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es polimiositis .
41.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es dermatomiositis .
42. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es miositis de cuerpo de inclusión.
43. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es miositis juvenil.
44. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es miositis inflamatoria idiopática.
45. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es vasculitis .
46.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es sarcoidosis .
47.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, glomerulonefritis y enfermedad de injerto contra hospedero.
48.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es psoriasis o afecciones que resultan de la misma.
49. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es el rechazo al trasplante o la enfermedad de injerto contra hospedero.
50. - El método de conformidad con la reivindicación 31 caracterizado porque la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, oftalmitis simpática, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, el síndrome antifosfolipídico, síndrome de Sjógren, esclerodermia, enfermedad de Addison, síndrome de deficiencia poliendócrina, síndrome de Guillan-Barré , púrpura trombocitopénica inmunitaria, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, enfermedad del tejido conectivo mixto, vitíligo, uveítis autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombopocitopenia autoinmunitaria, enfermedad del celiático, dermatitis herpetiformis , hepatitis autoinmunitaria, pénfigo, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo pulloso, miocarditis autoinmunitaria, vasculitis autoinmunitaria, alopecia areata, aterosclerosis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, mielopatía autoinmunitaria, hemofilia autoinmunitarias , cistitis intersticial autoinmunitaria, diabetes isipidus autoinmunitaria, endometriosis autoinmunitaria, policondritis reincidente, espondilitis anquilosante, urticaria autoinmunitaria, dermatomiositis , síndrome de Miller-Fisher, nefropatía IgA, síndrome de goodpasture, y herpes gestacional .
51. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-50, caracterizado porque además comprende administrar por lo menos un agente seleccionado del grupo que consiste de: fototerapia, corticoesteroides , prednisona, NSAIDS, plasmaféresis, inmunosupresores , metotrexato, ácido retinoico, tioguanina, micofenolato mofetilo, ésteres fumáricos, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina, e inmunoglobulinas .
52. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-51, caracterizado porque además comprende administrar por lo menos un agente seleccionado del grupo que consistente de: alefacept (AMEVIVE™) , etanercept (ENBREL®) , adalimumab (HUMIRA®) , infliximab (REMICADE®) , belimumab (LYMPHOSTATB™) ,' rituxumab (RITUXAN®) , y efalizumab (RAPTIVA®) .
53. - Un cristal que comprende una región Fe de IgG humana, caracterizado porque la región Fe de IgG humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de L234F, L235E y P331S, según se enumera en el índice EU como se estable en Kabat y en donde el fragmento exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con una región Fe no modificada.
54. - El cristal de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la región Fe de IgG humana comprende las sustituciones de aminoácido L234F, L235E y P331S.
55.- El cristal de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque es de calidad de difracción .
56. - El cristal de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque es un cristal nativo.
57.- El cristal de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque es una célula unitaria ortorrómbica de a = 50.18 ± 0.2 Á, b = 147.30 ± 0.2 Á, y c = 75.47 + 0.2 Á.
58.- El cristal de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque tiene un grupo de espacio de 0222 .
59. - Un anticuerpo monoclonal modificado, caracterizado porque comprende en la región Fe las sustituciones de aminoácidos L234F, L235E y P331S, según se enumera en el índice EU como se establece en Kabat y en donde el anticuerpo exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con un anticuerpo no modificado.
60. - Una proteína de fusión que comprende una región Fe modificada, caracterizada porque la región Fe comprende las sustituciones de aminoácidos L234F, L235E y P331S, según enumeradas por el índice EU como se establece en Kabat y en donde la región Fe exhibe una afinidad reducida para al menos un ligando Fe comparado con una región Fe.
61. - Un método caracterizado porque es para hacer el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23 ó 59.
62. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23 ó 59, caracterizado porque es un anticuerpo de internalizacion.
63.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque es una proteína de fusión de internalizacion.
64. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque específicamente se une a IFNAR1.
65. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, 59, ó 62, caracterizado porque exhibe una citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) reducida o eliminada en comparación con el anticuerpo no modificado.
66. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, 59, ó 62, caracterizado porque exhibe una citotoxicidad mediada por el complemento reducida o eliminada en comparación con el anticuerpo no modificado.
67.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, 59, ó 62, caracterizado porque exhibe una ADCC y CDC reducida o eliminada en comparación con el anticuerpo no modificado.
MX2010008578A 2008-02-08 2009-02-06 Anticuerpos anti-receptor 1 de interferon alfa con afinidad reducida al ligando fc. MX2010008578A (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US696208P 2008-02-08 2008-02-08
US3461808P 2008-03-07 2008-03-07
US4997008P 2008-05-02 2008-05-02
PCT/US2009/033358 WO2009100309A2 (en) 2008-02-08 2009-02-06 Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2010008578A true MX2010008578A (es) 2010-11-10

Family

ID=40952709

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2010008578A MX2010008578A (es) 2008-02-08 2009-02-06 Anticuerpos anti-receptor 1 de interferon alfa con afinidad reducida al ligando fc.

Country Status (23)

Country Link
US (5) US20110059078A1 (es)
EP (1) EP2250279B1 (es)
JP (1) JP5608100B2 (es)
KR (2) KR101666229B1 (es)
CN (1) CN101952454B (es)
AU (1) AU2009212273B2 (es)
BR (1) BR122020023189B1 (es)
CA (1) CA2713981C (es)
CY (1) CY1117827T1 (es)
DK (1) DK2250279T3 (es)
ES (1) ES2581917T3 (es)
FR (1) FR22C1019I2 (es)
HK (1) HK1149297A1 (es)
HR (1) HRP20160855T1 (es)
HU (3) HUE028958T2 (es)
LT (1) LTPA2022514I1 (es)
MX (1) MX2010008578A (es)
NO (1) NO2022016I1 (es)
PL (1) PL2250279T3 (es)
PT (1) PT2250279E (es)
SG (1) SG188129A1 (es)
SI (1) SI2250279T1 (es)
WO (1) WO2009100309A2 (es)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
TWI464262B (zh) 2007-09-26 2014-12-11 中外製藥股份有限公司 抗體固定區的變異
AU2008332271C1 (en) 2007-12-05 2014-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-NR10 antibody and use thereof
PL2250279T3 (pl) * 2008-02-08 2016-11-30 Przeciwciała anty-ifnar1 o zmniejszonym powinowactwie do liganda fc
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US20120071634A1 (en) 2009-03-19 2012-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody Constant Region Variant
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
MA33405B1 (fr) 2009-05-15 2012-07-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-axl
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
DK2506871T3 (da) 2009-11-30 2017-01-02 Janssen Biotech Inc ANTISTOF-Fc-MUTANTER MED ABLATEREDE EFFEKTORFUNKTIONER
US10053513B2 (en) 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
KR101941514B1 (ko) * 2010-12-22 2019-01-23 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 개선된 반감기를 가지는 변형된 항체
RS57895B1 (sr) 2011-03-29 2019-01-31 Roche Glycart Ag Fc varijante antitela
EP2725101B1 (en) * 2011-06-21 2017-09-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Protein comprising truncated form of extracellular domain protein of frizzled 2, and pharmaceutical composition for treating bone diseases which comprises said protein
CA2849866A1 (en) * 2011-11-01 2013-05-10 Roche Glycart Ag In vivo adcc model
CN108310375A (zh) * 2012-06-13 2018-07-24 米迪缪尼有限公司 针对抗i型干扰素受体（ifnar）抗体的固定剂量方案
CA2877363A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin receptor ligand polypeptide fc-region fusion polypeptides and conjugates with altered fc-effector function
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN104428315B (zh) 2012-07-13 2017-09-29 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗‑vegf/抗‑ang‑2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
EP4130044A1 (en) 2013-09-13 2023-02-08 BeiGene Switzerland GmbH Anti-pd1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
AU2014376328A1 (en) * 2014-01-13 2016-07-21 Christine E. BROWN Chimeric antigen receptors (CARs) having mutations in the Fc spacer region and methods for their use
US20170081406A1 (en) * 2014-03-05 2017-03-23 Ucb Biopharma Sprl Multimeric fc proteins
MX2016015456A (es) 2014-06-06 2017-02-23 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (gitr) y sus usos.
KR102130600B1 (ko) 2014-07-03 2020-07-08 베이진 엘티디 Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
HUE050596T2 (hu) 2014-11-21 2020-12-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek CD73 ellen és azok felhasználásai
MX2017006323A (es) 2014-11-21 2017-08-21 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas.
WO2016131893A1 (en) 2015-02-18 2016-08-25 Medimmune Limited Incretin fusion polypeptides
AU2016224409B2 (en) 2015-02-27 2021-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
CN107743586B (zh) 2015-06-03 2021-07-02 百时美施贵宝公司 用于癌症诊断的抗gitr抗体
KR102168005B1 (ko) * 2015-08-19 2020-10-21 아스트라제네카 아베 안정한 항-ｉｆｎａｒ1 제형
BR112018008865A8 (pt) * 2015-11-02 2019-02-26 Five Prime Therapeutics Inc polipeptídeos do domínio extracelular cd80 e seu uso no tratamento do câncer
JP6983776B2 (ja) 2015-11-19 2021-12-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
WO2017157948A1 (en) * 2016-03-14 2017-09-21 Innate Pharma Anti-cd39 antibodies
CN106243226B (zh) * 2016-08-05 2019-02-12 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人ifnar1的抗体及其用途
WO2018033135A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Beigene, Ltd. Use of a combination comprising a btk inhibitor for treating cancers
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11840569B2 (en) 2016-11-16 2023-12-12 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides capable of binding CD123 and TCR alpha/beta
US20200031943A1 (en) * 2017-03-21 2020-01-30 Austrianni Gmbh Type 1 interferon receptor antagonists for use in methods of treating tuberculosis and other infectious diseases
MX2019012849A (es) 2017-04-28 2019-11-28 Five Prime Therapeutics Inc Metodos de tratamiento con polipeptidos del dominio extracelular del cd80.
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
KR20200006115A (ko) 2017-05-16 2020-01-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-gitr 효능제 항체에 의한 암의 치료
CA3066518A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 Beigene, Ltd. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma
CA3074111A1 (en) 2017-08-28 2019-03-07 Angiex, Inc. Anti-tm4sf1 antibodies and methods of using same
TW201927816A (zh) 2017-10-14 2019-07-16 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 抗體、可活化之抗體、雙特異性抗體、和雙特異性可活化之抗體、及其使用方法
US11786529B2 (en) 2017-11-29 2023-10-17 Beigene Switzerland Gmbh Treatment of indolent or aggressive B-cell lymphomas using a combination comprising BTK inhibitors
BR112020016400A2 (pt) 2018-02-14 2020-12-15 Viela Bio, Inc. Anticorpos para o ligante do receptor de tirosina cinase 3 similar ao sarcoma felino de mcdonough (fms) (flt3l) e suas utilizações para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias
CN116327926A (zh) 2018-03-15 2023-06-27 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
AU2019344765A1 (en) * 2018-09-18 2021-03-18 I-Mab Biopharma (Hangzhou) Co., Ltd. Anti-IFNAR1 antibodies for treating autoimmune diseases
CA3128785A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Astrazeneca Ab Type i interferon-mediated disorders
US11511147B2 (en) 2019-02-21 2022-11-29 Kathline Lilly Workout station
KR20210143192A (ko) 2019-02-22 2021-11-26 우한 이지 바이오파마 씨오., 엘티디. 변형된 Fc 단편, 이를 포함하는 항체 및 이의 응용
AU2020357550A1 (en) 2019-10-04 2022-05-05 Tae Life Sciences, Llc Antibody compositions comprising Fc mutations and site-specific conjugation properties
JP2023501462A (ja) 2019-11-11 2023-01-18 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 全身性エリテマトーデスにおけるｉ型インターフェロン阻害
AU2021279277A1 (en) 2020-05-29 2023-02-02 Astrazeneca Ab Treatment of cardiometabolic disease with inhibitors of type I interferon signalling
TW202237647A (zh) 2020-10-08 2022-10-01 瑞典商阿斯特捷利康公司 狼瘡發作之治療
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
CA3200884A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Astrazeneca Ab Steroid sparing
KR20230166134A (ko) 2021-04-23 2023-12-06 아스트라제네카 아베 피하 주사용 항-ifnar1 투여 요법
CA3216390A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Astrazeneca Ab Treatment of cutaneous lupus erythematous
IL307751A (en) 2021-04-23 2023-12-01 Astrazeneca Ab Treatment of lupus of the kidney using an antibody against the type I INF receptor aniprolumab
WO2022238479A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Astrazeneca Ab Inhibitor of type 1 interferon receptor steroid sparing in systemic lupus erythematosus patients
CN113278071B (zh) 2021-05-27 2021-12-21 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人干扰素α受体1单克隆抗体及其应用
AU2022317215A1 (en) 2021-07-27 2024-02-29 Astrazeneca Ab Treatment of lupus
WO2023056069A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same
WO2023057369A2 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Astrazeneca Ab Treatment of lupus
WO2023073599A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Novartis Ag Engineered fc variants
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2023239803A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Angiex, Inc. Anti-tm4sf1 antibody-drug conjugates comprising cleavable linkers and methods of using same
EP4299731A1 (en) 2022-06-29 2024-01-03 ASOCIACIÓN CENTRO DE INVESTIGACIÓN COOPERATIVA EN NANOCIENCIAS "CIC nanoGUNE" Synthetic primase-polymerase and uses thereof
WO2024027793A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 I-Mab Biopharma (Hangzhou) Co., Ltd. Bispecific antibodies targeting ifnar1 and blys

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0563487A1 (en) 1992-03-31 1993-10-06 Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1994004670A1 (en) 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
JPH09501827A (ja) 1993-06-11 1997-02-25 ペストカ バイオメディカル ラボラトリーズ インコーポレイテッド インターフェロンおよびインターロイキンを含む超タンパク質
US6299870B1 (en) 1993-06-11 2001-10-09 Pbl Biomedical Laboratories Mutant human interferons
EP0714409A1 (en) * 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
AU698975B2 (en) 1993-11-23 1998-11-12 Genentech Inc. Kinase receptor activation assay
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
DE69531148T2 (de) 1994-01-31 2004-04-29 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
ATE549918T1 (de) 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0970126B1 (en) 1997-04-14 2001-04-18 Micromet AG Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6311415B1 (en) 1998-09-14 2001-11-06 Lind Shoe Company Bowling shoe with replaceable tip
EP2386574A3 (en) 1999-01-15 2012-06-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270147T4 (da) 1999-04-09 2020-08-31 Kyowa Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
AU1574401A (en) 1999-10-20 2001-04-30 Zymogenetics Inc. Granulocyte peptide homolog zgpa1
JPWO2002030954A1 (ja) 2000-10-06 2004-02-19 協和醗酵工業株式会社 抗体を精製する方法
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
AP2003002800A0 (en) 2000-10-13 2003-06-30 Richard Boyd Hematopoietic stem cell gene therapy
EP2357187A1 (en) 2000-12-12 2011-08-17 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20020160974A1 (en) 2001-01-09 2002-10-31 Banchereau Jacques F. Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
JP2005525784A (ja) 2001-08-12 2005-09-02 ペプジェン コーポレイション ハイブリッドインターフェロン／インターフェロンτタンパク質、組成物、および使用方法
US7151164B2 (en) * 2002-02-14 2006-12-19 Immunomedics, Inc. Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
DK1553975T3 (da) * 2002-09-27 2012-05-07 Xencor Inc Optimerede Fc-varianter og fremgangsmåder til generering heraf.
US20060134105A1 (en) * 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
RU2377254C2 (ru) 2003-12-25 2009-12-27 Кирин Фарма Кабусики Кайся Мутанты анти-cd40 антитела
ES2403055T3 (es) * 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
US7662381B2 (en) * 2004-06-21 2010-02-16 Medarex, Inc. Interferon alpha receptor 1 antibodies and their uses
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
EP1810035A4 (en) 2004-11-10 2010-03-17 Macrogenics Inc EFFECTOR FUNCTION OBTAINED BY CREATION BY BIOLOGICAL GENE OF FC ANTIBODY REGIONS
EP1817340B1 (en) 2004-11-12 2012-05-16 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
AU2006204791A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
EP1859042A2 (en) 2005-03-14 2007-11-28 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel human, feline, chicken and other animal interferons and uses thereof
RU2530561C2 (ru) 2007-11-05 2014-10-10 Медиммун, Ллк Способы лечения склеродермии
PL2250279T3 (pl) * 2008-02-08 2016-11-30 Przeciwciała anty-ifnar1 o zmniejszonym powinowactwie do liganda fc
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Also Published As

Publication number Publication date
DK2250279T3 (en) 2016-08-01
HUE028958T2 (en) 2017-01-30
AU2009212273A1 (en) 2009-08-13
HUS2200022I1 (hu) 2022-06-28
BR122020023189B1 (pt) 2022-02-01
JP2011514150A (ja) 2011-05-06
EP2250279A2 (en) 2010-11-17
US20110059078A1 (en) 2011-03-10
LTPA2022514I1 (es) 2022-07-25
KR20100117108A (ko) 2010-11-02
CN101952454B (zh) 2014-06-04
KR101666229B1 (ko) 2016-10-14
AU2009212273B2 (en) 2014-07-31
EP2250279A4 (en) 2011-03-30
ES2581917T3 (es) 2016-09-08
US10301390B2 (en) 2019-05-28
US20200055944A1 (en) 2020-02-20
PT2250279E (pt) 2016-06-03
RU2010137000A (ru) 2012-03-20
PL2250279T3 (pl) 2016-11-30
HRP20160855T1 (hr) 2016-09-23
WO2009100309A2 (en) 2009-08-13
CA2713981A1 (en) 2009-08-13
EP2250279B1 (en) 2016-04-13
CN101952454A (zh) 2011-01-19
BRPI0907735A2 (pt) 2017-06-13
CA2713981C (en) 2016-11-01
HUS2200023I1 (hu) 2022-06-28
RU2556125C2 (ru) 2015-07-10
NO2022016I1 (no) 2022-05-25
FR22C1019I2 (fr) 2024-04-05
SG188129A1 (en) 2013-03-28
US20180244791A1 (en) 2018-08-30
CY1117827T1 (el) 2017-05-17
FR22C1019I1 (fr) 2022-07-15
JP5608100B2 (ja) 2014-10-15
HK1149297A1 (zh) 2011-09-30
US20180118839A1 (en) 2018-05-03
KR20160070165A (ko) 2016-06-17
US20200172625A1 (en) 2020-06-04
WO2009100309A3 (en) 2009-12-30
US9988459B2 (en) 2018-06-05
SI2250279T1 (sl) 2016-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2009212273B2 (en) Anti-IFNAR1 antibodies with reduced Fc ligand affinity
US20220380479A1 (en) Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
US11639378B2 (en) Polyomavirus neutralizing antibodies
AU2016340989B2 (en) Anti-IL-2 antibodies and compositions and uses thereof
US10759854B2 (en) Interferon alpha and omega antibody antagonists
US20170291939A1 (en) Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags
CA2906526A1 (en) Interferon alpha and omega antibody antagonists
AU2014256356A1 (en) Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity
WO2023209177A1 (en) Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
BRPI0907735B1 (pt) Anticorpo monoclonal de classe igg modificado específico para ifnar1, ácido nucleico isolado e composição farmacêutica
NZ709739B2 (en) Anti-il-17a antibodies and their use in treating autoimmune and inflammatory disorders

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration