TWI432209B - Anti-NR10 antibody and its use - Google Patents

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TWI432209B
TWI432209B TW098141125A TW98141125A TWI432209B TW I432209 B TWI432209 B TW I432209B TW 098141125 A TW098141125 A TW 098141125A TW 98141125 A TW98141125 A TW 98141125A TW I432209 B TWI432209 B TW I432209B
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Taichi Kuramochi
Keiko Kasutani
Souhei Ohyama
Hiroyuki Tsunoda
Tomoyuki Igawa
Tatsuhiko Tachibana
Hirotake Shiraiwa
Keiko Esaki
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

抗NR10抗體及其使用
本發明關於抗NR10抗體及含有抗NR10抗體之醫藥組合物。
關於多種細胞的增殖分化或分化成熟的細胞機能賦活化之液性因子，已知有多種細胞激素的存在。生物體中受到細胞激素刺激的細胞產生其他的細胞激素，因複數種細胞激素而形成網絡。生物體的恆定性經由此網絡互相調節配合，維持在微妙的平衡之上。多數免疫炎症性患者被認為是因為這些細胞激素‧網絡產生破綻而造成，以單株抗體形成的抗細胞激素療法受到注目。例如抗TNF抗體及抗IL-6受體的抗體臨床上顯示高效果。然而另一方面，實際的疾病狀態引起回饋路徑，只阻斷IL-4等一種細胞激素，無法得到治療效果，失敗的例子也很多。
本發明人成功分離與IL-6訊息傳遞受體gp130相同性高的新穎細胞激素受體NR10(專利文獻1)。NR10與抑瘤素M受體(oncostatin M receptor;OSMR)形成異質二聚體(heterodimer)，為IL-31受體之功能(非專利文獻1)。對於IL-31，已有報導過度表現IL-31的轉殖基因鼠自然發病為搔癢性皮膚炎(專利文獻2)。
考量與NR10結合而抑制IL-31及NR10結合的抗體有效於炎症性疾病的治療，但是為了臨床上使用的抗NR10抗體，必需為免疫原性低的抗體。又為了發揮高的治療效果，希望是對NR10的結合活性或中和活性高的抗體。
本發明之先前技術文獻如下述。
[專利文獻1]WO00/75314
[專利文獻2]WO03/060090
[非專利文獻1]IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.,J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):418-25.
本發明鑑於上述背景所完成，本發明以含有抗NR10抗體之醫藥組合物的提供為課題。
本發明人為解決上述課題進行研究。本發明人成功取得對NR10具有有效中和活性之抗NR10抗體。而且本發明人成功使維持抗體活性狀態之抗體人型化。而且本發明人成功製作藥物動力提升、對抗原結合活性增強、安定性提升、及/或免疫原性風險降低之抗體。前述抗體有效作為炎症性疾病治療劑。
本發明關於抗NR10的抗體及抗NR10抗體之醫藥組合物，更具體地包含下列[1]~[15]發明。
[1]辨識NR10區域1(domain 1)的抗體。
[2]具有中和活性之[1]記載之抗體。
[3]為人型化抗體之[1]或[2]記載之抗體。
[4]以下(1)~(8)任一項記載之抗NR10抗體；
(1)具有包含：具有序列識別號：1之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：2之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：3之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：4之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：5之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：6之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：7之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體
(4)具有序列識別號：8之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[5]以下(1)~(8)任一項記載之抗NR10抗體；
(1)具有包含：具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：12之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：15之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：16之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[6]以下(1)~(8)任一項記載之抗NR10抗體；
(1)具有包含：具有序列識別號：17之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：18之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：19之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：20之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：21之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：22之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：23之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：24之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[7]以下(1)~(8)任一項記載之抗NR10抗體；
(1)具有包含：具有序列識別號：25之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：26之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：27之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：28之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：29之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：30之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：31之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：32記載之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[8]以下(1)~(20)任一項記載之抗體可變區或抗體；
(1)具有序列識別號：196之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：197之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H17)；
(2)具有序列識別號：176之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：197之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H19)；
(3)具有序列識別號：196之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：197之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H28、H42)；
(4)具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：197之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H30、H44)；
(5)具有序列識別號：176之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：197之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H34、H46)；
(6)具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：198之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H57、H78)；
(7)具有序列識別號：176之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：198之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H71、H92)；
(8)具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：199之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區(H97、H98)；
(9)具有序列識別號：200之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：170之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：193之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區(L11)；
(10)具有序列識別號：201之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：170之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：193之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區(L12)；
(11)具有序列識別號：202之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：170之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：193之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區(L17)；
(12)具有序列識別號：203之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：170之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：193之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區(L50)；
(13)包含(3)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區的抗體；
(14)包含(4)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區的抗體；
(15)包含(5)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區的抗體；
(16)包含(6)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區的抗體；
(17)包含(7)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區的抗體；
(18)包含(8)之重鏈可變區及(12)之輕鏈可變區的抗體；
(19)為(13)~(18)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(13)~(18)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(20)與(13)~(18)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[9]以下(1)~(32)任一項記載之抗體可變區或抗體；
(1)具有序列識別號：204之胺基酸序列的重鏈可變區(H17)；
(2)具有序列識別號：205之胺基酸序列的重鏈可變區(H19)；
(3)具有序列識別號：206之胺基酸序列的重鏈可變區(H28)；
(4)具有序列識別號：207之胺基酸序列的重鏈可變區(H30)；
(5)具有序列識別號：208之胺基酸序列的重鏈可變區(H34)；
(6)具有序列識別號：209之胺基酸序列的重鏈可變區(H42)；
(7)具有序列識別號：210之胺基酸序列的重鏈可變區(H44)；
(8)具有序列識別號：211之胺基酸序列的重鏈可變區(H46)；
(9)具有序列識別號：212之胺基酸序列的重鏈可變區(H57)；
(10)具有序列識別號：213之胺基酸序列的重鏈可變區(H71)；
(11)具有序列識別號：214之胺基酸序列的重鏈可變區(H78)；
(12)具有序列識別號：215之胺基酸序列的重鏈可變區(H92)；
(13)具有序列識別號：216之胺基酸序列的重鏈可變區(H97)；
(14)具有序列識別號：217之胺基酸序列的重鏈可變區(H98)；
(15)具有序列識別號：218之胺基酸序列的輕鏈可變區(L11)；
(16)具有序列識別號：219之胺基酸序列的輕鏈可變區(L12)；
(17)具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)；
(18)具有序列識別號：221之胺基酸序列的輕鏈可變區(L50)；
(19)包含(3)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H28L17)；
(20)包含(4)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H30L17)；
(21)包含(5)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H34L17)；
(22)包含(6)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H42L17)；
(23)包含(7)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H44L17)；
(24)包含(8)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H46L17)；
(25)包含(9)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H57L17)；
(26)包含(10)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H71L17)；
(27)包含(11)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H78L17)；
(28)包含(12)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H92L17)；
(29)包含(13)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區的抗體(H97L50)；
(30)包含(14)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區的抗體(H98L50)；
(31)為(19)~(30)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(19)~(30)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(32)與(19)~(30)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[10]為人型化抗體之[4]-[9]任一項記載之抗NR10抗體。
[11]以下(1)~(32)任一項記載之抗體重鏈、抗體輕鏈、或抗體；
(1)具有序列識別號：222之胺基酸序列的重鏈(H17)；
(2)具有序列識別號：223之胺基酸序列的重鏈(H19)；
(3)具有序列識別號：224之胺基酸序列的重鏈(H28)；
(4)具有序列識別號：225之胺基酸序列的重鏈(H30)；
(5)具有序列識別號：226之胺基酸序列的重鏈(H34)；
(6)具有序列識別號：227之胺基酸序列的重鏈(H42)；
(7)具有序列識別號：228之胺基酸序列的重鏈(H44)；
(8)具有序列識別號：229之胺基酸序列的重鏈(H46)；
(9)具有序列識別號：230之胺基酸序列的重鏈(H57)；
(10)具有序列識別號：231之胺基酸序列的重鏈(H71)；
(11)具有序列識別號：232之胺基酸序列的重鏈(H78)；
(12)具有序列識別號：233之胺基酸序列的重鏈(H92)；
(13)具有序列識別號：234之胺基酸序列的重鏈(H97)；
(14)具有序列識別號：235之胺基酸序列的重鏈(H98)；
(15)具有序列識別號：236之胺基酸序列的輕鏈(L11)；
(16)具有序列識別號：237之胺基酸序列的輕鏈(L12)；
(17)具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)；
(18)具有序列識別號：239之胺基酸序列的輕鏈(L50)；
(19)包含(3)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H28L17)；
(20)包含(4)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H30L17)；
(21)包含(5)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H34L17)；
(22)包含(6)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H42L17)；
(23)包含(7)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H44L17)；
(24)包含(8)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H46L17)；
(25)包含(9)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H57L17)；
(26)包含(10)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H71L17)；
(27)包含(11)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H78L17)；
(28)包含(12)之重鏈及(17)之輕鏈的抗體(H92L17)；
(29)包含(13)之重鏈及(18)之輕鏈的抗體(H97L50)；
(30)包含(14)之重鏈及(18)之輕鏈的抗體(H98L50)；
(31)為(19)~(30)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(19)~(30)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(32)與(19)~(30)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
[12]包含[1]~[11]任一項記載之抗體的醫藥組合物。
[13]為炎症性疾病治療劑之[12]記載之醫藥組合物。
[14]包含投予[1]~[11]任一項記載之抗體的步驟之炎症性疾病的治療或預防方法。
[15][1]~[11]任一項記載之抗體在炎症性疾病治療劑製造上之使用。
 NR10
NR10與抑瘤素M受體(OSMR)形成異質二聚體(heterodimer)，為IL-31受體功能的蛋白質。已知亦稱為glm-r(J Biol Chem 277,16831-6,2002)、GPL(J Biol Chem 278,49850-9,2003)、IL31RA(Nat Immunol 5,w752-60,2004)等名稱，本發明之NR10也包含這些名稱的蛋白質。
本發明之NR10(也稱為IL31RA、GPL或glm-r)的來源沒有特別限定，包含來自人、鼠、猿、其他哺乳動物的NR10，但較佳為來自人、鼠或猿的NR10，特別是來自人的NR10較佳。
來自人的NR10已知為複數個接合突變體(splicing variant)(WO00/075314)。上述接合突變體中，NR10.1由662個胺基酸構成，特徵為具有細胞膜貫穿區域。NR10.2為252個胺基酸序列構成的不具有膜貫穿區域之可溶性受體狀蛋白質。另一方面，作為細胞膜貫穿型受體蛋白質功能的NR10接合突變體，已知有NR10.3及IL31RAv3。本發明之人NR10與抑瘤素M受體(OSMR)形成異質二聚體，作為IL-31受體之功能者，沒有特別限制，但是較佳的NR10可列舉NR10.3(也稱為ILRAv4(Nat Immunol 5,752-60,2004))及IL31RAv3。NR10.3(IL31RAv4)由662個胺基酸所構成(WO00/075314，Nat Immunol 5,752-60,2004)，IL31RAv3由732個胺基酸所構成(GenBank ACCESSION No. NM_139017)。IL31RAv4的胺基酸序列如序列識別號：79所示，IL31RAv3的胺基酸序列如序列識別號：80所示。另一方面，來自鼠的NR10，例如序列識別號：81記載的胺基酸序列所構成之蛋白質。來自蟹食猿(Macaca fascicularis)的NR10例如序列識別號：66記載的胺基酸序列所構成之蛋白質。
抗體(序列)
本發明之抗NR10抗體的較佳態樣可列舉如下列(A)~(D)中(1)~(8)任一項記載之抗NR10抗體。
(A)NS18
(1)具有包含：具有序列識別號：1(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：2(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：3(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：4(VH)之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：5(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：6(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：7(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：8(VL)之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
(B)NS22
(1)具有包含：具有序列識別號：9(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：10(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：11(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：12(VH)之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：13(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：14(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：15(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：16(VL)之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
上述有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的具體例，沒有特別限定，可列舉如下述之修飾。
序列識別號：9的重鏈CDR1中第3位的Ile被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Val。
序列識別號：9的重鏈CDR1中第4位的Met被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Ile。
序列識別號：9的重鏈CDR1中第4位的Met被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Leu。
序列識別號：9的重鏈CDR1中第3位的Ile被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Ala。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第1位的Leu被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Glu。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第3位的Asn被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第13位的Gln被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第14位的Lys被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Gln。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第16位的Lys被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Gln。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第17位的Gly被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第16位的Lys及第17位的Gly被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第16位的Lys被取代為Gln，第17位的Gly被取代為Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第14位的Lys、第16位的Lys及第17位的Gly被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第14位的Lys被取代為Gln，第16位的Lys被取代為Gln，第17位的Gly被取代為Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第13位的Gln、第14位的Lys、第16位的Lys及第17位的Gly被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第13位Gln被取代為Asp，第14位Lys被取代為Gln，第16位Lys被取代為Gln，第17位Gly被取代為Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第10位的Ser被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：10的重鏈CDR2中第13位的Gln被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Pro。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第3位的Tyr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Leu。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第10位的Met被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Leu。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第11位的Asp被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Glu。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第12位的Tyr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Thr或Ser。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第10位的Met、第11位的Asp及第12位的Tyr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第10位Met被取代為Leu、第11位Asp被取代為Glu、第12位Tyr被取代為Thr。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第11位的Asp及第12位的Tyr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第11位Asp被取代為Glu、第12位Tyr被取代為Thr。
序列識別號：11的重鏈CDR3中第3位的Tyr、第11位的Asp及第12位的Tyr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第3位Tyr被取代為Leu、第11位Asp被取代為Glu、第12位Tyr被取代為Thr。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第1位的Arg被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Gln。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第5位的Asn被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第1位的Arg及第5位的Asn被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第1位Arg被取代為Gln，第5位Asn被取代為Asp。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第8位的Ser被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Arg。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第10位的Leu被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Val。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第8位的Ser及第10位的Leu被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第8位Ser被取代為Arg，第10位Leu被取代為Val。
序列識別號：13的輕鏈CDR1中第2位的Thr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Ala或Ser。
序列識別號：14的輕鏈CDR2中第1位的Asn被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：14的輕鏈CDR2中第3位的Lys被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Gln。
序列識別號：14的輕鏈CDR2中第5位的Leu被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Glu。
序列識別號：14的輕鏈CDR2中第7位的Lys被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Gln或Asp。
序列識別號：14的輕鏈CDR2中第3位的Lys、第5位的Leu及第7位的Lys被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，例如第3位Lys被取代為Gln、第5位Leu被取代為Glu，第7位Lys被取代為Gln。
序列識別號：15的輕鏈CDR3中第5位的Glu被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：15的輕鏈CDR3中第6位的Ser被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Asp。
序列識別號：15的輕鏈CDR3中第9位的Thr被取代為其他胺基酸。取代後的胺基酸沒有特別限定，較佳例如Phe。
上述的取代可單獨進行，也可組合複數個取代。也可以組合上述之取代及上述以外之取代。藉由此述之取代可使抗體藥物動力(血漿中滯留性)提升、對抗原結合活性增強、安定性提升、及/或免疫原性風險降低。
本發明中組合上述取代的可變區之具體例，可列舉具有序列識別號：167之胺基酸序列的重鏈可變區或具有序列識別號：168之胺基酸序列的輕鏈可變區。而且，組合上述取代之抗體例如包含具有序列識別號：167之胺基酸序列的重鏈可變區及具有序列識別號：168之胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體。
又組合上述取代之重鏈可變區或輕鏈可變區的具體例，可列舉下列的可變區。
(a)包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3的重鏈可變區(H17)。
(b)包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3之重鏈可變區(H19)。
(c)包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H28、H42)。
(d)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H30、H44)。
(e)包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H34、H46)。
(f)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H57、H78)。
(g)包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H71、H92)。
(h)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：199之CDR2、序列識別號：184之CDR3之重鏈可變區(H97、H98)。
(i)包含序列識別號：200之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3之輕鏈可變區(L11)。
(j)包含序列識別號：201之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3之輕鏈可變區(L12)。
(k)包含序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3之輕鏈可變區(L17)。
(l)包含序列識別號：203之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3之輕鏈可變區(L50)。
而且，組合上述取代之抗體的具體例，可列舉下列抗體。
(i)包含(c)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區的抗體。
(ii)包含(d)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區的抗體。
(iii)包含(e)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區的抗體。
(iv)包含(f)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區的抗體。
(v)包含(g)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區的抗體。
(vi)包含(h)之重鏈可變區及(l)之輕鏈可變區的抗體。
(C)NS23
(1)具有包含：具有序列識別號：17(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：18(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：19(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：20(VH)之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：21(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：22(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：23(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：24(VL)之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
(D)NS33
(1)具有包含：具有序列識別號：25(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：26(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：27(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區的抗體；
(2)具有序列識別號：28(VH)之重鏈可變區的抗體；
(3)具有包含：具有序列識別號：29(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號：30(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2、具有序列識別號：31(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區的抗體；
(4)具有序列識別號：32(VL)之輕鏈可變區的抗體；
(5)具有(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區的抗體；
(6)具有(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區的抗體；
(7)為(1)~(6)任一項記載之抗體中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之抗體，具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性之抗體；
(8)與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
上述(1)或(3)記載之抗體中可使用任何一種框架區(framework region;FR)，但是較佳使用來自人的FR。又上述(1)~(8)記載之抗體中，恆定區也可使用任何的恆定區，但是較佳使用來自人的恆定區。本發明抗體所使用之FR或恆定區的胺基酸序列，可直接使用原始FR或恆定區的胺基酸序列，也可使用有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入等不同的胺基酸序列。
上述NS18的重鏈胺基酸序列如序列識別號：34所示，編碼該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：33所示。又NS18的輕鏈胺基酸序列如序列識別號：36所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：35所示。
NS22的重鏈胺基酸序列如序列識別號：38所示，編碼該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：37所示。又NS22的輕鏈胺基酸序列如序列識別號：40所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：39所示。
上述NS23的重鏈胺基酸序列如序列識別號：42所示，編碼該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：41所示。又NS23的輕鏈胺基酸序列如序列識別號：44所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：43所示。
上述NS33的重鏈胺基酸序列如序列識別號：46所示，編碼該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：45所示。又NS33的輕鏈胺基酸序列如序列識別號：48所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：47所示。
本發明中「具有與(1)~(6)任一項記載之抗體相同活性」意謂對NR10(例如人NR10)的結合活性及/或中和活性相同。本發明中「相同」不必為一定相同程度的活性，可以是活性增強者，或者也可以是限於具有活性而活性減少者。活性減少的抗體可例如較原來抗體，具有30%以上的活性之抗體，較佳為具有50%以上的活性之抗體，更佳為具有80%以上的活性之抗體。
上述(1)~(6)任一項記載之抗體限於具有對NR10的結合活性及/或中和活性，可變區(CDR序列及/或FR序列)的胺基酸序列可有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入。為了製造胺基酸序列中被1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入並對NR10具有結合活性及/或中和活性之抗體的胺基酸序列，熟悉該技術領域之人士熟知之方法已知有蛋白質導入突變之方法。例如該技術領域之人士使用部位特異性突變誘導法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations Via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82,488-492)等，藉由對於具有對NR10結合活性及/或中和活性之抗體的胺基酸序列導入適當突變，可製造與具有對NR10結合活性及/或中和活性之抗體功能上相同的突變體。因此，可變區中有1個或複數個胺基酸突變之具有對NR10結合活性及/或中和活性之抗體也包含於本發明抗體中。
使胺基酸殘基突變的情形中，希望在保存胺基酸側鏈的性質下而使其他胺基酸突變。例如胺基酸側鏈的性質可例如疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、有脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)、有含羥基側鏈的胺基酸(S、T、Y)、有含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)、有含碳酸及醯胺側鏈的胺基酸(D、N、E、Q)、有含鹼基側鏈的胺基酸(R、K、H)、及有含芳香族側鏈的胺基酸(H、F、Y、W)(括號內以單字母表示胺基酸)。這些各群內的胺基酸取代稱為保留性取代。已知具有對某胺基酸序列的1個或複數個胺基酸殘基缺少、增加及/或被其他胺基酸取代所修飾的胺基酸序列的多胜肽，維持其生物學上的活性(Mark,D. F. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:5662-6；Zoller,M. J. and Smith,M.,Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500;Wang,A. et al.,Science(1984)224:1431-3;Dalbadie-McFarland,G. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79:6409-13)。此種突變體具有本發明的可變區(例如CDR序列、FR序列、可變區全體)的胺基酸序列至少70%的胺基酸序列相同性，較佳為至少75%，更佳為至少80%，再更佳為至少85%，再更佳為至少90%，最佳為至少95%。本說明書中的序列相同性定義為，使序列相同性成為最大而視需要調整序列，導入適當間隙(gap)後，與原始的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列殘基相同的殘基比例。胺基酸序列的相同性可根據後述方法決定。
可變區(CDR序列及/或FR序列)的胺基酸序列中，已有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加/或插入並具有對NR10的結合活性及/或中和活性的可變區之胺基酸序列，也可由編碼該可變區胺基酸序列的鹼基序列所形成之核酸在嚴謹條件下雜交的核酸而獲得。分離編碼可變區胺基酸序列的鹼基序列所形成之核酸在嚴謹條件下雜交之核酸，嚴謹的雜交條件為列如6M尿素、0.4% SDS、0.5×SSC、37℃的條件或與此相等的嚴謹雜交條件。更高的嚴謹條件，例如使用6M尿素、0.4% SDS、0.1×SSC的條件、42℃，可期待更高相同性的核酸的分離。分離的核酸序列的決定可如後述公知方法進行。分離的核酸相同性具有鹼基序列整體的至少50%以上的序列相同性，較佳為70%以上，更佳為90%以上(例如95%、96%、97%、98%、99%以上)的序列相同性。
變化利用上述雜交技術之方法，可利用以基本上合成編碼可變區胺基酸序列之鹼基序列資訊的引子之基因擴增法，例如利用聚合酶鏈反應(PCR)法，分離與編碼可變區胺基酸序列之鹼基序列所形成之核酸在嚴謹條件下雜交之核酸。
鹼基序列及胺基酸序列的相同性可根據Karlin及Altschul的演算法BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993)90:5873-7)來決定。基於此演算法開發出BLASTIN或BLASTX軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.(1990)215:403-10)。 以 BLAST為基礎經BLASTN分析鹼基序列的情形時，參數為例如score=100，wordlength=12。又基於BLAST以BLASTX分析胺基酸序列的情形時，參數為例如score=50，wordlength=3。使用BLAST及間隙(gapped)BLAST軟體的情形時，使用各軟體的設定參數(default parameters)。這些分析方法的具體操作為公知(參考NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本發明亦提供與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位結合的抗體。
抗體是否辨識與其他抗體相同的抗原決定位，可經由對兩個抗原決定位的競爭而確認。抗體間的競爭可根據競爭結合分析而評估，其方法例如ELISA、螢光能量轉移測定法(FRET)及螢光微量測定技術(FMAT(商標))等。與抗原結合的前述抗體量間接與對相同抗原決定位結合而競爭的候選競爭抗體(被檢測抗體)的結合能力有關。亦即，對相同抗原決定位的被檢測抗體的量及親和性增加的情形，對該抗體的抗原結合量降低，對抗原的被檢測抗體的結合量增加。具體地說，對抗原同時添加適當標誌的該抗體及應評估的抗體，利用標誌檢測出已結合的該抗體。與抗原結合的該抗體量已預先標示該抗體而可容易測定。此標誌沒有特別限制，選擇依評估方法的標識方法。標識方法具體例如螢光標識、放射線標識、酵素標識等。
例如，對表現NR10的動物細胞同時添加螢光標識的該抗體及未標識的該抗體或被檢測抗體，經螢光微量測定技術檢出標識的該抗體。
所謂「辨識相同抗原決定位的抗體」為對於標識的抗體，以未標識的該抗體之結合的結合量的50%濃度(IC50 )來看，被檢測抗體以未標識抗體的IC50 通常為100倍的濃度，較佳為80倍，更佳為50倍，再更佳為30倍，又更佳為10倍的濃度，其為使至少50%標識的抗體的結合量降低之抗體。
上述之與(1)~(7)任一項記載之抗體結合的抗原決定位的抗體，以具有特別高的中和活性的觀點為有用的。
上述之(1)~(8)任一項記載之抗體沒有特別限制，以人型化抗體為佳。
再者，本發明提供編碼上述(A)~(D)中(1)~(8)任一項記載之抗NR10的基因。本發明之基因可為任何的基因，例如可為DNA，也可為RNA。
抗體(人型化)
本發明之抗體的較佳態樣之一，可如與NR10結合的人型化抗體。人型化抗體可使用該技術領域中之人士已知的方法製造。
抗體的可變區域通常4個框架(FR)中有3個互補性決定區域(complementarity determining region;CDR)而構成。CDR為實質上決定抗體結合特異性的區域。CDR的胺基酸序列富有多樣性。構成一方FR的胺基酸序列，即使是具有不同結合特異性的抗體之間，大多顯示高的相同性。因此，一般而言，經由CDR移植可將抗體的結合特異性移植到其他抗體。
人型化抗體又稱為再構成(reshaped)人抗體，為來自人以外的哺乳動物的CDR移植到人抗體的CDR者，其一般的基因重組方法也為已知(參考歐洲專利申請公開號EP 125023、WO 96/02576)。
具體而言，例如CDR為來自小鼠抗體的情形，設計為連接小鼠CDR與人抗體的框架區(framework region;FR)的DNA序列，由在CDR及FR兩方的末端區域具有重疊的部分所製作的數個寡核苷酸作為引子使用，經PCR法合成(參考WO98/13388)。所得的DNA與編碼人抗體恆定區的DNA連接，之後組入表現載體，將此載體導入宿主，使該DNA產生而獲得(歐洲專利申請公開號EP 239400、國際專利申請公開號WO 96/02576)。
與CDR連接的人抗體的框架區選擇互補性決定區域形成良好抗原結合部位者。可視需要，如再構成的人抗體的互補性決定區域形成適當的抗原結合部位，抗體可變區中的框架區之胺基酸可有取代、缺少、增加、及/或插入等。例如應用將小鼠CDR移植於人FR所使用的PCR法，可將胺基酸突變導入FR。具體而言，可將部份鹼基序列的突變導入連接(anneallng)於FR的引子(primer)。如此引子合成的FR中導入鹼基序列的突變。以上述方法測定、評估胺基酸取代的突變型抗體之抗原的結合活性，可選擇具有所希望的性質之突變的FR序列(Sato,K. et al.,CancerRes.(1993) 53,851-856)。
人型化抗體的C區，使用人抗體者，例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L鏈可使用Cκ、Cλ。Cκ的胺基酸序列如序列識別號：58所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：57所示。Cγ1的胺基酸序列如序列識別號：60所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：59所示。Cγ2的胺基酸序列如序列識別號：62所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：61所示。Cγ4的胺基酸序列如序列識別號：64所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號：63所示。又，為了改善抗體或其生產的安定性，也可修飾人抗體的C區。修飾的人抗體C區例如後述之C區。人型化時使用的人抗體，可為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何同型物(isotype)的人抗體，但是本發明中較佳使用IgG。IgG可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。
製作人型化抗體後，可變區(例如CDR、FR)及恆定區中的胺基酸也可以其他胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等，本發明之人型化抗體也可包含此類胺基酸取代等的人型化抗體。
人型化抗體中的CDR的來源沒有特別限制，可來自任何動物。例如可使用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、駱駝抗體等的序列，但是較佳為小鼠抗體的CDR序列。
抗體的人型化中，通常以維持原本抗體的結合活性及中和活性的狀態進行人型化，有其困難，但是本發明中，成功取得具有原來小鼠抗體相同之結合活性及/或中和活性之人型化抗體。人型化抗體在人體內的免疫原性降低，因此有效於以治療目的投予人的情形。
本發明中人型化抗NR10抗體的較佳例，可例如下列(a)~(e)任一項記載之抗體。
(a)包含具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列的重鏈可變區之人型化抗體；
(b)包含具有序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列的重鏈可變區之人型化抗體；
(c)包含具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列的輕鏈可變區之人型化抗體；
(d)包含具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列的重鏈可變區及具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列的輕鏈可變區之人型化抗體；
(e)包含具有序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區及具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區之人型化抗體。
具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列的重鏈可變區、具有序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區、及具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列的輕鏈可變區可有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入。胺基酸的取代、缺少、增加及/或插入可在CDR或FR中進行，或者也可在CDR及FR兩者中進行。
因此，本發明中人型化抗NR10抗體的較佳其他態樣可例如以下(f)~(j)任一項記載之抗體。
(f)包含具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的重鏈可變區之抗體；
(g)包含具有序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的重鏈可變區之抗體；
(h)包含具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的輕鏈可變區之抗體；
(i)包含具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的重鏈可變區、及具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的輕鏈可變區之抗體；
(j)包含具有序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的重鏈可變區、及具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入的輕鏈可變區之抗體。
沒有特別限定，但(f)~(j)任一項記載之抗體較佳具有與(a)~(e)任一項記載之抗體相同活性者。
胺基酸的取代、缺少、增加及/或插入沒有特別限定，但具體例如可進行上述之胺基酸取代。
更具體例如下列的胺基酸取代。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)的第3位的Ile被取代為Val(序列識別號：73)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：173之胺基酸序列的CDR1之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)的第4位的Met被取代為Ile(序列識別號：174)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：174之胺基酸序列的CDR1之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)的第4位的Met被取代為Leu(序列識別號：175)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：175之胺基酸序列的CDR1之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)的第3位的Ile被取代為Ala(序列識別號：176)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：176之胺基酸序列的CDR1之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第1位的Leu被取代為Glu(序列識別號：113)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：113之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第3位的Asn被取代為Asp(序列識別號：114)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：114之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第13位的Gln被取代為Asp(序列識別號：115)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：115之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第14位的Lys被取代為Gln(序列識別號：116)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：116之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第16位的Lys被取代為Gln(序列識別號：117)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：117之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第17位的Gly被取代為Asp(序列識別號：118)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：118之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第16位的Lys被取代為Gln及第17位的Gly被取代為Asp(序列識別號：119)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：119之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第14位的Lys被取代為Gln、第16位的Lys被取代為Gln、及第17位的Gly被取代為Asp(序列識別號：167)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：167之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第13位的Gln被取代為Asp、第14位的Lys被取代為Gln、第16位的Lys被取代為Gln、及第17位的Gly被取代為Asp(序列識別號：172)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：172之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第10位的Ser被取代為Asp(序列識別號：177)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：177之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)的第13位的Gln被取代為Pro(序列識別號：178)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：178之胺基酸序列的CDR2之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第3位的Tyr被取代為Leu(序列識別號：179)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：179之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第10位的Met被取代為Leu(序列識別號：180)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：180之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第11位的Asp被取代為Glu(序列識別號：181)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：181之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第12位的Tyr被取代為Thr(序列識別號：182)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：182之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第12位的Tyr被取代為Ser(序列識別號：183)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：183之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第10位的Met被取代為Leu、第11位的Asp被取代為Glu及第12位的Tyr被取代為Thr(序列識別號：184)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：184之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第11位的Asp被取代為Glu及第12位的Tyr被取代為Thr(序列識別號：185)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：185之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第3位的Tyr被取代為Leu、第11位的Asp被取代為Glu及第12位的Tyr被取代為Thr(序列識別號：186)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：186之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)的第3位的Tyr被取代為Leu、第11位的Asp被取代為Glu及第12位的Tyr被取代為Ser(序列識別號：187)。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：187之胺基酸序列的CDR3之重鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第1位的Arg被取代為Gln(序列識別號：121)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：121之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第5位的Asn被取代為Asp(序列識別號：122)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：122之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第8位的Ser被取代為Arg(序列識別號：188)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：188之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第10位的Leu被取代為Val(序列識別號：189)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：189之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第8位的Ser被取代為Arg及第10位的Leu被取代為Val(序列識別號：190)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：190之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第2位的Thr被取代為Ala(序列識別號：191)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：191之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第2位的Thr被取代為Ser(序列識別號：192)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：192之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第1位的Asn被取代為Asp(序列識別號：123)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：123之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第3位的Lys被取代為Gln(序列識別號：124)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：124之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第5位的Leu被取代為Glu(序列識別號：125)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：125之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第7位的Lys被取代為Gln(序列識別號：126)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：126之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第7位的Lys被取代為Asp(序列識別號：127)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：127之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)的第1位的Arg被取代為Gln及第5位的Asn被取代為Asp(序列識別號：169)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1被置換為具有序列識別號：169之胺基酸序列的CDR1之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)的第3位的Lys被取代為Gln、第5位的Leu被取代為Glu及第7位的Lys被取代為Gln(序列識別號：170)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：170之胺基酸序列的CDR2之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)的第5位的Glu被取代為Asp(序列識別號：193)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：15之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：193之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)的第6位的Ser被取代為Asp(序列識別號：194)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：15之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：194之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)的第9位的Thr被取代為Phe(序列識別號：195)。因此，本發明提供在具有序列識別號：52之胺基酸序列的輕鏈可變區中，具有序列識別號：15之胺基酸序列的CDR3被置換為具有序列識別號：195之胺基酸序列的CDR3之輕鏈可變區。
而且，上述的胺基酸取代以外的取代，可例如具有序列識別號：97之胺基酸序列的重鏈FR2中第3位Arg被取代為其他胺基酸者。取代後的胺基酸沒有特別限定，但較佳可例如Gln。而且，也可能是序列識別號：97的第3位Arg被取代為Gln的情形，第5位的Ala被取代為Ser，FR2成為人序列者。序列識別號：97之胺基酸序列中，第3位的Arg被取代為Gln、第5位的Ala被取代為Ser的胺基酸序列，如序列識別號：120所示。因此，本發明提供在具有序列識別號：50或序列識別號：112之胺基酸序列的重鏈可變區中，具有序列識別號：97之胺基酸序列的FR2可被置換為具有序列識別號：120之胺基酸序列的FR2之重鏈可變區。
上述胺基酸取代可單獨使用，也可與上述其他胺基酸取代組合。也可與上述以外之胺基酸取代組合。
進行上述取代之抗體具體例，可例如包含具有序列識別號：167之胺基酸序列的重鏈可變區之抗體、包含具有序列識別號：168之胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體、包含具有序列識別號：167之胺基酸序列的重鏈可變區及具有序列識別號：168之胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體等。
又，進行上述取代之重鏈可變區的具體例，可列舉如下列重鏈可變區。
(1)具有序列識別號：204之胺基酸序列之重鏈可變區(H17)；
(2)具有序列識別號：205之胺基酸序列之重鏈可變區(H19)；
(3)具有序列識別號：206之胺基酸序列之重鏈可變區(H28)；
(4)具有序列識別號：207之胺基酸序列之重鏈可變區(H30)；
(5)具有序列識別號：208之胺基酸序列之重鏈可變區(H34)；
(6)具有序列識別號：209記載之胺基酸序列之重鏈可變區(H42)；
(7)具有序列識別號：210之胺基酸序列之重鏈可變區(H44)；
(8)具有序列識別號：211之胺基酸序列之重鏈可變區(H46)；
(9)具有序列識別號：212之胺基酸序列之重鏈可變區(H57)；
(10)具有序列識別號：213之胺基酸序列之重鏈可變區(H71)；
(11)具有序列識別號：214之胺基酸序列之重鏈可變區(H78)；
(12)具有序列識別號：215之胺基酸序列之重鏈可變區(H92)；
(13)具有序列識別號：216之胺基酸序列之重鏈可變區(H97)；
(14)具有序列識別號：217之胺基酸序列之重鏈可變區(H98)。
又，進行上述取代之輕鏈可變區的具體例，可列舉如下列輕鏈可變區。
(15)具有序列識別號：218之胺基酸序列之輕鏈可變區(L11)；
(16)具有序列識別號：219之胺基酸序列之輕鏈可變區(L12)；
(17)具有序列識別號：220之胺基酸序列之輕鏈可變區(L17)；
(18)具有序列識別號：221之胺基酸序列之輕鏈可變區(L50)。
又，包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體的具體例，可列舉如下列抗體。
(19)包含(3)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H28L17)；
(20)包含(4)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H30L17)；
(21)包含(5)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H34L17)；
(22)包含(6)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H42L17)；
(23)包含(7)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H44L17)；
(24)包含(8)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H46L17)；
(25)包含(9)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H57L17)；
(26)包含(10)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H71L17)；
(27)包含(11)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H78L17)；
(28)包含(12)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區的抗體(H29L17)；
(29)包含(13)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區的抗體(H97L50)；
(30)包含(14)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區的抗體(H98L50)。
本發明之人型化抗體所使用的恆定區沒有特別限定，可以使用來自人抗體的任何恆定區。來自人抗體的任何恆定區較佳例如來自IgG1或IgG2的恆定區。也可以使用來自人抗體的恆定區中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加、及/或插入的恆定區。
來自人抗體的恆定區中有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加、及/或插入之恆定區，沒有特別限定，但可例如以下之恆定區。
具有序列識別號：128之胺基酸序列的恆定區(M58)；具有序列識別號：129之胺基酸序列的恆定區(M14)；具有序列識別號：62之胺基酸序列的恆定區(SKSC)。
使用上述恆定區之重鏈或抗體的具體例可列舉如以下之重鏈或抗體。
(1)包含具有序列識別號：167之胺基酸序列的可變區及序列識別號：128之胺基酸序列的恆定區之重鏈；
(2)在(1)重鏈中，具有序列識別號：171之胺基酸序列的CDR2被置換為具有序列識別號：172之胺基酸序列的CDR2之重鏈；
(3)包含(1)重鏈及具有序列識別號：152之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(4)包含(2)重鏈及具有序列識別號：152之胺基酸序列的輕鏈之抗體。
本發明之人型化抗NR10抗體之更具體例，可列舉列(k)~(o)任一項記載之抗體。
(k)包含具有序列識別號：54(H0-VH+恆定區)之胺基酸序列的重鏈之抗體；
(l)包含具有序列識別號：130(H1-VH+恆定區)之胺基酸序列的重鏈之抗體；
(m)包含具有序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(n)包含具有序列識別號：54(H0-VH+恆定區)之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(o)包含具有序列識別號：130(H1-VH+恆定區)之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列的輕鏈之抗體。
而且，具有序列識別號：54(H0-VH+恆定區)之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列的輕鏈，可有1個或複數個胺基酸被取代、缺使、增加及/或插入。胺基酸的取代、缺少、增加及/或插入可在可變區或恆定區中進行，也可在可變區及恆定區兩者進行。
因此，本發明提供以下(p)~(t)任一項記載之抗體。
(p)包含在序列識別號：54(H0-VH+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的重鏈之抗體；
(q)包含在序列識別號：130(H1-VH+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的重鏈之抗體；
(r)包含在序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(s)包含在序列識別號：54(H0-VH+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的重鏈、及在序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(t)包含在序列識別號：130(H1-VH+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的重鏈、及在序列識別號：56(L0-VL+恆定區)之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的輕鏈之抗體。
沒有特別限定但(p)~(t)任一項記載之抗體較佳具有與(k)~(o)任一項記載之抗體相同活性者。
胺基酸之取代、缺少、增加及/或插入沒有特別限定，但具體例可進行例如上述之胺基酸取代。
再者，編碼上述人型化重鏈可變區之胺基酸序列(序列識別號：50)之鹼基序列如序列識別號：49所示，編碼上述人型化輕鏈可變區之胺基酸序列(序列識別號：52)之鹼基序列如序列識別號：51所示，編碼上述人型化重鏈之胺基酸序列(序列識別號：54)之鹼基序列如序列識別號：53所示，編碼上述人型化輕鏈之胺基酸序列(序列識別號：56)之鹼基序列如序列識別號：55所示。
而且，本發明提供辨識與上述(a)~(t)任一項記載之抗體辨識的抗原決定位相同的抗原決定位之抗體，對於與相同的抗原決定位的結合如已記載者。
本發明更提供以下(u)~(w)任一項記載之抗體。
(u)包含具有序列識別號：151之胺基酸序列的重鏈之抗體；
(v)包含具有序列識別號：152之胺基酸序列的輕鏈之抗體；
(w)包含(u)重鏈及(v)輕鏈之抗體。
本發明更提供以下任一記載之重鏈、輕鏈、或抗體。
(1)具有序列識別號：222之胺基酸序列的重鏈(H17)；
(2)具有序列識別號：223之胺基酸序列的重鏈(H19)；
(3)具有序列識別號：224之胺基酸序列的重鏈(H28)；
(4)具有序列識別號：225之胺基酸序列的重鏈(H30)；
(5)具有序列識別號：226之胺基酸序列的重鏈(H34)；
(6)具有序列識別號：227之胺基酸序列的重鏈(H42)；
(7)具有序列識別號：228之胺基酸序列的重鏈(H44)；
(8)具有序列識別號：229之胺基酸序列的重鏈(H46)；
(9)具有序列識別號：230之胺基酸序列的重鏈(H57)；
(10)具有序列識別號：231之胺基酸序列的重鏈(H71)；
(11)具有序列識別號：232之胺基酸序列的重鏈(H78)；
(12)具有序列識別號：233之胺基酸序列的重鏈(H92)；
(13)具有序列識別號：234之胺基酸序列的重鏈(H97)；
(14)具有序列識別號：235之胺基酸序列的重鏈(H98)；
(15)具有序列識別號：236之胺基酸序列的輕鏈(L11)；
(16)具有序列識別號：237之胺基酸序列的輕鏈(L12)；
(17)具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)；
(18)具有序列識別號：239之胺基酸序列的輕鏈(L50)；
(19)包含(3)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H28L17)；
(20)包含(4)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H30L17)；
(21)包含(5)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H34L17)；
(22)包含(6)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H42L17)；
(23)包含(7)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H44L17)；
(24)包含(8)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H46L17)；
(25)包含(9)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H57L17)；
(26)包含(10)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H71L17)；
(27)包含(11)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H78L17)；
(28)包含(12)重鏈及(17)輕鏈之抗體(H92L17)；
(29)包含(13)重鏈及(18)輕鏈之抗體(H97L50)；
(30)包含(14)重鏈及(18)輕鏈之抗體(H98L50)；
(31)在(1)~(14)任一項記載之重鏈中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的重鏈；
(32)在(15)~(18)任一項記載之輕鏈中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的輕鏈；
(33)在(19)~(30)任一項記載之抗體中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺少、增加及/或插入之胺基酸序列的抗體；
(34)辨識與(19)~(33)任一項記載之抗體所辨識的抗原決定位相同之抗原決定位的抗體。
胺基酸之取代、缺少、增加及/或插入如上所述。辨識與抗體辨識之抗原決定位相同的抗原決定位之抗體如上所述。
本發明更提供編碼本發明之可變區、本發明之重鏈、本發明之輕鏈或編碼本發明抗體的基因。
本發明更提供含有上述基因之載體。
本發明更提供經上述載體轉形的宿主細胞。
本發明更關於包含培養上述宿主細胞之步驟之製造本發明之可變區、本發明之重鏈、本發明之輕鏈或本發明之抗體的方法。
關於載體、宿主細胞、宿主細胞的培養，如下所述。
區域(domain)辨識抗體
本發明之抗NR10抗體的較佳態樣之一，例如辨識區域(domain) 1的抗體，或辨識區域(domain)2的抗體。本發明中，區域1為序列識別號：76記載之人NR10之胺基酸序列中包含訊息胜肽(signal peptide)的狀態之第21位的胺基酸至第120位的胺基酸之區域(LPAKP~LENIA)。本發明中，區域2為序列識別號：76記載之人NR10之胺基酸序列中包含訊息胜肽(signal peptide)的狀態之第121位的胺基酸至第227位的胺基酸之區域(KTEPP~EEEAP)。
此抗體沒有特別限制，但是通常為具有中和活性之抗體，較佳為人型化抗體。
本發明中較佳的抗體例，可列舉辨識區域1的抗體。辨識區域1的抗體具有高的中和活性，作為醫藥品特別有用。
抗體(中和活性)
本發明更提供具有中和活性之抗NR10的抗體。
本發明中對NR10的中和活性為抑制NR10與其配體(ligand)IL-31結合的活性，較佳為抑制基於NR10的生理活性之活性。
具有NR10中和活性之抗體的分類，例如可經由在IL-31依賴性細胞株中添加候補抗體之時，觀察該IL-31依賴性細胞株的增殖抑制效果之方法而進行。上述方法中抑制IL-31依賴性細胞株增殖的抗體被判斷為具有對NR10中和活性之抗體。
抗體(一般)
本發明之抗體沒有限定來源，可以是人抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等的任何動物來源的抗體。也可以是嵌合(chimera)抗體及人型化(humanized)抗體等的重組抗體。如上所述，本發明之較佳抗體可例如人型化抗體。
嵌合抗體為由人以外的哺乳動物，例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區與人抗體的重鏈、輕鏈的恆定區所構成之抗體。嵌合抗體可使用已知方法製造。例如可經由從融合瘤(hybridoma)中選殖(cloning)抗體基因，組入適當的載體，將該載體導入宿主而進行(例如Carl,A. K. Borrebaeck,James,W. Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。具體而言，使用反轉錄酶從融合瘤的mRNA合成抗體可變區(V區)的cDNA。獲得編碼目的抗體的V區之DNA，與編碼所希望的人抗體恆定區(C區)的DNA連結，將此組入表現載體。或者也可以是，將編碼抗體V區的DNA組入含有人抗體C區之DNA的表現載體中。表現控制區域，例如促進子(enhancer)、啟動子(promoter)的原本控制表現的形式，組入表現載體。其次經由此表現載體轉形於宿主細胞，使嵌合抗體表現。
再者，人抗體的取得方法也已經知道。例如在活體外(in vitro )以所希望的抗原或表現所希望的抗原之細胞，使人淋巴球發生免疫，將免疫的淋巴球與例如U266的人骨髓瘤(myeloma)細胞融合，也可獲得具有與抗原結合活性之所希望的人抗體(參考特公平1-59878)。又，以所希望的抗原使具有人抗體基因全長儲存(repertory)的轉殖基因動物產生免疫，可取得所希望的人抗體(參考WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
而且，使用人抗體噬菌體基因庫(phage library)經篩選(panning)法取得人抗體之技術也是已知。例如將人抗體可變區作成單鏈抗體(scFv)，經噬菌體展現法(phage display)在噬菌體表面表現，可選擇與抗原結合的噬菌體。分析選擇的噬菌體基因，可決定編碼與抗原結合的人抗體可變區之DNA序列。如果與抗原結合的scFv的DNA序列明確，則可製作具有該序列之適當表現載體而取得人抗體。此種方法為周知，可參考WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388等。
本發明之抗體只限於具有對NR10的結合活性及/或中和活性者，不只包括IgG代表的二價抗體，也包含一價抗體，或IgM代表的多價抗體，或者可與不同抗原結合的雙特異性(Bispecific)抗體。本發明之多價抗體包含具有全部相同的抗原結合部位之多價抗體，或者具有部分或全部不同的抗原結合部位的多價抗體。本發明之抗體，不限於抗體的全長分子，只要與NR10蛋白質結合者，也可為小分子化抗體或其修飾物。
本發明之抗體也可為小分子化抗體。小分子化抗體為含有全長抗體(whole antibody，例如全長IgG等)部分缺損的抗體片段之抗體，除限於具有對NR10的結合活性及/或中和活性，沒有特別限制。本發明中小分子化抗體除包含全長的一部分之外，沒有特別限定，但是較佳包含重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)者，特別是包含VH及VL兩者的小分子化抗體為佳。又，本發明之小分子化抗體的其他較佳例，可列舉含有抗體CDR的小分子化抗體。小分子化抗體所含的CDR可包含抗體的6個CDR全部，也可包含部分的CDR。
本發明中的小分子化抗體較佳為分子量比全長抗體更小者，也有形成例如二元體(dimer)、三元體(trimer)、四元體(tetramer)等的多元體者等，也有分子量較全長抗體更大者。
抗體片段的具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。小分子化抗體的具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙功能抗體(diabody)、sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)等。此述之抗體的多元體(例如二元體、三元體、四元體、聚合體(polymer))也包含於本發明之小分子化抗體中。
抗體片段可獲得自例如以酵素處理抗體而形成抗體片段。形成抗體片段的酵素，例如木瓜酵素、胃蛋白酶或血纖維蛋白溶酶(plasmine)等已為公知。或者，構築編碼該抗體片段的基因，將其導入表現載體後，在適當宿主細胞中表現(例如Co,M.s. et al.,J. Immunol.(1994) 152,2968-2976、Better,M. & Horwitz,A. H. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496、Plueckthun,A. & Skerra,A. Methods in Enzymology(1989) 178,497-515、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989) 121,652-663、Rousseaux,J. et al.,Methods in Enzymology(1989) 121,663-66、Bird,R. E. et al.,TIBTECH(1991)9,132-137.)。
消化酵素切斷抗體片段的特定位置，給予如下述的特定構造之抗體片段。由此類酵素獲得的抗體片段可利用基因工程的方法使抗體的任意部分缺少。
使用上述消化酵素時所得的抗體片段如以下所示。
木瓜酵素：F(ab)2或Fab
胃蛋白酶：F(ab’)2或Fab’
血纖維蛋白溶酶(plasmine)：Facb
本發明中的小分子化抗體限於具有對NR10的結合活性及/或中和活性，可包含缺少任意區域的抗體片段。
雙功能抗體(diabody)是指經基因融合所構築的二價(bivalent)抗體片段(Holliger P et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)、EP404,097、WO93/11161等)。雙功能抗體(diabody)是由2個多胜肽鍵所構成的二元體(dimer)。一般而言，構成二元體的多胜肽鍵係各自在同一化學鍵中以連接物(linker)使VL與VH結合。雙功能抗體(diabody)中的連接物(linker)通常短於VL與VH無法互相結合的位置。具體而言，構成連接物(linker)的胺基酸殘基例如約為5個殘基。因此，同一多胜肽鏈上編碼的VL及VH不能形成單鏈可變區片段(fragment)，而形成其他單鏈可變區片段(fragment)與二元體。此結果使雙功能抗體(diabody)成為具有2個抗原結合部位者。
scFv抗體為以連接物(linker)等結合重鏈可變區([VH])及輕鏈可變區([VL])成為單鏈多胜肽的抗體(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988)85,5879-5883、Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol. 113,Resenburg及Moore編,Springer Verlag,New York,pp. 269-315,(1994))。scFv中H鏈V區及L鏈V區也可來自本說明書記載之任一抗體。連結V區的胜肽連接物(linker)沒有特別限制。例如可由約3-25殘基所形成的任意單鏈胜肽作為連接物(linker)使用。具體地說，可使用例如下述的胜肽連接物(linker)等。
兩鏈的V區可使用例如上述PCR法連結。為了以PCR法連接V區，首先下列的DNA中，將編碼全部胺基酸序列或希望的部分胺基酸序列之DNA作為模板利用。
編碼抗體H鏈或H鏈V區的DNA序列，及編碼抗體L鏈或L鏈V區的DNA序列。
使用具有對應應擴增的DNA兩端序列之序列的引子一對，經PCR法，使編碼H鏈及L鏈的V區的DNA各自擴增。其次準備編碼部分胜肽連接物(linker)的DNA。利用編碼胜肽連接物(linker)的DNA經PCR而合成。此時利用的引子的5’端，已增加可與各別合成的各V區擴增產物連接之鹼基序列。其次，利用[H鏈V區DNA]-[胜肽連接物DNA]-[L鏈V區DNA]的各DNA及聚合(assembly)PCR用的引子，進行PCR反應。
聚合(assembly)PCR用的引子由連接(aneal)於[H鏈V區DNA]5’端的引子及連接(aneal)於[L鏈V區DNA]3’端的引子組合而成。也就是說，聚合(assembly)PCR用的引子為可擴增編碼應合成的scFv全長序列的DNA之引子組。另一方面，[胜肽連接物DNA]中增加可與各V區DNA連結的鹼基序列。結果為，此述的DNA被連結，而且藉由聚合PCR用的引子，最終產生全長scFv的擴增產物。一旦製作編碼scFv的DNA，可遵循常法，取得包含前述DNA之表現載體，及由該表現載體轉形的重組細胞。而且經由培養此結果所得的重組細胞，使編碼該scFv的DNA表現，可取得該scFv。
結合的重鏈可變區及輕鏈可變區的順序沒有特別限定，也可以任何順序排列，例如可為下列順序。
[VH]連接物[VL]
[VL]連接物[VH]
sc(Fv)2為2個VH及2個VL以連接物等結合的單鏈小分子化抗體(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2例如可將scFv以連接物結合製作。
雖然2個VH及2個VL較佳為以單鏈多胜肽的N端為基點，依VH、VL、VH、VL([VH]連接物[VL]連接物[VH]連接物[VL])的順序連接為特徵的抗體，但是2個VH及2個VL的順序不特定限於上述的配置，也可以為任何順序連接。例如可為以下順序。
[VL]連接物[VH]連接物[VH]連接物[VL]
[VH]連接物[VL]連接物[VL]連接物[VH]
[VH]連接物[VH]連接物[VL]連接物[VL]
[VL]連接物[VL]連接物[VH]連接物[VH]
[VL]連接物[VH]連接物[VL]連接物[VH]
小分子抗體中的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列也可被取代、缺失、增加、及/或插入。而且在組合重鏈可變區及輕鏈可變區的情形，只限於具有抗原結合活性，也可使部分缺損，或增加其他多胜肽。又可變區也可被嵌合化(chimera)或人型化。
本發明中結合抗體可變區的連接物(linker)可使用經基因工程導入的任意胜肽連接物，或合成化合物的連接物，例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996揭示之連接物。
本發明中較佳的連接物(linker)為胜肽連接物。胜肽連接物的長度沒有特別限定，可視目的由該技術領域人士適當選擇，但是通常為1~100個胺基酸，較佳為3~50個胺基酸，更佳為5~30個胺基酸，特佳為12~18個胺基酸(例如15個胺基酸)。
胜肽連接物的胺基酸序列可例舉如以下序列。
Ser
Gly‧Ser
Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：：82)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：：83)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：：84)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：：85)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：：86)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：：87)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：：88)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：：89)
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：：84))n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：：85))n
[n為1以上的整數]等。
胜肽連接物的胺基酸序列可視目的由該技術領域人士適當選擇。例如決定上述胜肽連接物長度的n，通常為1-5，較佳為1-3，更佳為1或2。
合成化合物的連接物(化學交聯劑)為胜肽交聯常用的交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫基雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫基雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(磺基-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺基氧基羰氧基)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀醯亞胺基氧基羰氧基)乙基]碸(磺基-BSOCOES)等，此述的交聯劑為市售。
結合4個抗體可變區的情形，通常必須要3個連接物。複數個連接物可使用相同或不同的連接物。
本發明之抗體也包含本發明抗體的胺基酸序列中增加1個或複數個胺基酸殘基的抗體。此述抗體與其他胜肽或蛋白質也包含融合的融合蛋白。融合蛋白的製作方法宜為將編碼本發明抗體的多核苷酸與編碼其他胜肽或多胜肽的多核苷酸使其框架(frame)相同而連接，將其導入表現載體，在宿主中表現，可使用該技術領域中人士公知的方法。與本發明抗體融合的其他胜肽或多胜肽可使用例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、6個His(組胺酸)殘基構成的6×His、10×His、流行性感冒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-微管蛋白(tubulin)片段、B-tag、蛋白C片段等公知的胜肽。又與本發明抗體融合的其他多胜肽，例如GST(榖胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流行性感冒凝集素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。市售的編碼前述胜肽或多胜肽之多核苷酸與編碼本發明抗體的多核苷酸融合，使由此調製的融合多核苷酸表現，可製造融合多胜肽。
本發明之抗體也可為與聚乙二醇(PEG)或透明質酸等高分子物質、放射性物質、螢光物質、發光物質、酵素、毒素等各種分子結合的結合抗體(conjugate antibody)。此述的結合抗體可對所得的抗體進行化學修飾而得。抗體的修飾方法在此技術領域中已確立(例如US 5057313、US 5156840)。本發明中的「抗體」也包括此述的結合抗體(conjugate antibody)。
而且，本發明使用的抗體也可為雙特異性抗體(biSpecific antibody)。所謂雙特異性抗體(bispecific antibody)是在同一抗體分子內具有辨識不同抗原決定位的可變區之抗體。本發明中，雙特異性抗體可為辨識NR10分子上不同抗原決定位的雙特異性抗體，一抗原結合部位辨識NR10，另一抗原結合部位辨識其他物質的雙特異性抗體。
製造雙特異性抗體的方法為公知。例如使辨識抗原與不同的2種抗體結合，可製作雙特異性抗體。結合的抗體可以各自為具有H鏈及L鏈的1/2分子，也可以為只有H鏈的1/4分子。或者，也可以使產生不同單株抗體的融合瘤(hybridoma)融合，製作產生雙特異性抗體的融合細胞。更可以藉由基因工程方法製作雙特異性抗體。
本發明之抗體在經過產生後述抗體的細胞及宿主或純化方法，可在胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈或型態等上不同。然而，所得的抗體只要具有與本發明抗體相同功能者，皆包含於本發明中。例如本發明抗體以原核細胞(例如大腸桿菌)表現的情形，在抗體本身的胺基酸序列N端增加甲硫胺酸(methionine)殘基。本發明之抗體也包括此類抗體。
抗體的製造
本發明之抗體可為多株抗體，也可為單株抗體。具有對NR10的結合活性及/或中和活性之單株抗體，可得自例如以來自人及小鼠等哺乳動物的NR10或其片段胜肽形成免疫原，經公知方法製造抗NR10的單株抗體後，從所得的抗NR10單株抗體中分類出具有NR10結合活性及/或中和活性的抗體。亦即，將希望的抗原或表現所希望的抗原的細胞作成產生免疫的抗原使用，進行一般免疫方法使產生免疫。所得的免疫細胞經一般的細胞融合法與已知的親代細胞融合，經由一般的篩選法篩選單株抗體的抗體產生細胞(融合瘤(hybridoma))，可製作抗NR10的單株抗體。被免疫的動物可使用例如小鼠、大鼠、兔、羊、猿、山羊、驢、牛、馬、豬等哺乳動物。抗原的製造可使用公知的NR10基因序列，依據公知的方法，例如使用桿狀病毒(baculovirus)的方法(WO 98/46777等)進行。
融合瘤的製造可根據例如Milstein等人的方法(Rohler,G. and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73:3-46)等進行。抗原的免疫原性低的情形也可與白蛋白(albumin)等免疫原性的巨大分子結合進行免疫。
具有對本發明NR10的結合活性及/或中和活性的抗體之一態樣，例如具有對人NR10的結合活性及/或中和活性的單株抗體。製作具有對人NR10的結合活性及/或中和活性的單株抗體用的免疫原，限於製作具有對人NR10的結合活性及/或中和活性的抗體，沒有其他特別限制。例如人NR10中已知存在有複數種變異體(varient)，但只限於具有對人NR10的結合活性及/或中和活性的抗體，任何變異體都可作為免疫原。或者在相同條件下，NR10的胜肽片段及天然的NR10序列中增加人為突變者，也可作為免疫原。在製作具有對本發明之NR10的結合活性及/或中和活性的抗體之中，人NR10.3為較佳的免疫原之一。
對抗體NR10的結合活性及/或中和活性的測定可經由例如實施例記載之觀察該IL-31依賴性細胞株的增殖抑制效果的方法進行。
另一方面，單株抗體也可經由DNA免疫(DNA immunization)獲得。DNA免疫為由免疫動物中以編碼抗原蛋白質的基因的可表現狀態所構築的載體DNA，投予該免疫動物，在該免疫動物體內表現免疫抗原，給予免疫刺激的方法。與投予蛋白質抗原的一般免疫方法相比，DNA免疫可期待如下述的優點。
-可維持膜蛋白的構造，給予免疫刺激
-無須純化免疫抗原
然而，另一方面，在DNA免疫中，難以與輔劑等的免疫刺激手段組合。
以DNA免疫得到單株抗體中，首先將編碼NR10的DNA投予免疫動物。編碼NR10的DNA可經由PCR等公知方法合成。將得到的DNA插入適當的表現載體，投予免疫動物。表現載體可利用例如pcDNA3.1等市售的表現載體。將載體投予生物體的方法，也可以利用一般使用的方法。例如將吸附表現載體的金顆粒以基因槍(gene gum)打入細胞內，進行DNA免疫。DNA免疫之後，以NR10表現細胞進行追加免疫(boost)，為較佳獲得單株抗體的方法。
如此免疫的哺乳動物，在確認血清中希望的抗體量上升後，從哺乳動物採集免疫細胞，進行細胞融合。較佳的免疫細胞特別可使用脾細胞。
與上述免疫細胞融合的細胞使用哺乳動物的骨髓瘤(myeloma)細胞。骨髓瘤細胞較佳為具有篩選用的適當篩選標記(marker)。篩選標記(marker)是指在特定培養條件下可(或不可)生存的特徵。篩選標記(marker)中，次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase)缺損(以下簡稱HGPRT缺損)、或胸腺核苷激酶(thymidine kinase)缺損(以下簡稱TK缺損)等為公知。具有HGPRT及TK缺損的細胞具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺核苷(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine)敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞在HAT篩選培養基中不會進行DNA的合成而死亡，但是與正常細胞融合者可利用正常細胞的補救路徑(salvage pathway)繼續DNA的合成，因此即使在HAT篩選培養基中也可以增殖。
HGPRT缺損及TK缺損的細胞可分別經由含有6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)、8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)(以下簡稱為8AG)、或5’-溴化脫氧尿苷(5’-bromodeoxyuridine)的培養基而選擇。正常的細胞因為將此種嘧啶類似物(pyrimidine analogue)取入DNA中而死亡，但是缺損這類酵素的細胞因為沒有取入這類嘧啶類似物而可在篩選培養基中生存。其他稱為G418耐受性的篩選標記，因新黴素(neomycin)耐受性基因而對2-脫氧鏈黴胺(2-deoxystreptamine)系抗生素(健大黴素(gentamycin)類似體)具有耐受性。適合細胞融合的多種骨髓瘤細胞為公知。
基本上以公知的方法例如Kohler及Milstein等人的方法(Kohler,G. and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46.)等為基準，進行免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。
更具體為，例如在細胞融合促進劑存在下的一般營養培養液中可實施細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。為了更高融合效率也可視需要添加二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide)等的輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可任意設定。例如對骨髓瘤細胞而言，免疫細胞為1至10倍者為佳。細胞融合所用的培養液可利用例如適合骨髓瘤細胞株增殖的RPMI1640培養液、MEM培養液、其他、此種細胞培養所用的一般培養液者。而且培養基可添加胎牛血清(FCS)等的血清補充液。
細胞融合係將免疫細胞及骨髓瘤細胞的特定量在培養液中良好混合，經混合預先加熱至約37℃的PEG溶液，形成目的融合細胞(融合瘤)。細胞融合法中，例如平均分子量約1000至約6000的PEG通常以30~60%(w/v)的濃度添加。之後，逐次添加如上述列舉的適當培養液，離心去除上清液，重複此操作，去除不利融合瘤生長的細胞融合劑。
如此獲得的融合瘤可利用細胞融合使用的骨髓瘤所具有的篩選標記之篩選培養液，進行篩選。例如具有HGPRT及TK缺損的細胞，可經HAT培養液(含有次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺核苷的培養液)培養而篩選。亦即，將HAT敏感性的骨髓瘤細胞用於細胞融合的情形，在HAT培養液中，與正常細胞成功細胞融合的細胞選擇地增殖。因為目的融合瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡，有充分的時間使用上述HAT培養液繼續培養。具體地說，通常經過數日至數週間的培養可篩選目的融合瘤。因此，經由實施一般的限界稀釋法，可實施對產生目的抗體的融合瘤之篩選及單一選殖(cloning)。或者，根據WO 03/104453記載之方法製作辨識NR10的抗體。
目的抗體的篩選及單一選殖可基於公知的抗原抗體反應經篩選方法適當實施。例如聚苯乙烯(polystyrene)等的微珠或市售的96孔微滴定盤等的載體與抗原結合，與融合瘤的培養上清液反應。其次，洗淨載體之後，使酵素標記的次級抗體等反應。假使培養上清液中含有與產生免疫的抗原反應之目的抗體的情形，次級抗體經由此抗體與載體結合。最後，經檢出與載體結合的二次抗體，可決定目的抗體是否存在於培養上清液中。產生具有對抗原結合能力的希望抗體之融合瘤可經由限界稀釋法等進行篩選。此時，抗原為開始免疫者，可適當使用實質上相同性質的NR10蛋白質。例如表現NR10的細胞株、NR10的細胞以外的區域(domain)、或者構成該區域的部分之胺基酸序列所構成的寡胜肽，可作為抗原利用。
除了使人以外的動物抗原免疫而獲得上述融合瘤的方法以外，也可使人淋巴球產生抗原敏感而獲得目的抗體。具體而言，首先在體外(in vitro )以NR10蛋白質使人淋巴球發生免疫。其次已發生免疫的淋巴球與適當的融合夥伴(parterner)融合。融合夥伴可利用例如來自人、具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞(參考特公平1-59878號公報)。由此方法而得的抗體為具有對NR10蛋白質結合活性之人抗體。
由上述方法等取得的編碼抗NR10抗體之鹼基序列、胺基酸序列可由該技術領域之人士依公知方法獲得。而且，本發明記載之胺基酸序列所包含的胺基酸也可為轉譯後經修飾的情形(例如N端的榖胺酸(glutamine)為焦榖胺酸化(pyroglutamine)的焦榖胺酸修飾，為該技術領域人士已知之修飾)，但是此類胺基酸即使為轉譯後修飾的情形，也包含於本發明記載之胺基酸序列。
基於得到的抗NR10抗體序列，該技術領域之人士可使用公知的基因重組技術製作抗NR10抗體。具體地說，基於辨識NR10的抗體序列，構築編碼抗體的寡核苷酸，將其導入表現載體後，以適當的素主細胞表現為佳(例如Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994)152,2968-297;Better,M. and Horwitz,A. H.,Methods Enzymol. (1989) 178,476-496;Pluckthun,A. and Skerra,A.,Methods Enzymol. (1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Mehtods Enzymol. (1986)121,652-663;RRousseaux,J. et al.,Mehtods Enzymol. (1986)121,663-669;Bird,R. E. and Walker,B. W.,Trends Biotechnol. (1991)9,132-137.)。
載體的例子，例如M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又在以cDNA次選殖(subcloning)、篩選出來為目的的情況下，除上述載體以外，例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在產生本發明抗體的目的中，使用載體的情形特別以表現載體為有效。作為表現載體，例如以大腸桿菌表現為目的的情形，載體除具有以大腸桿菌擴增的特徵以外，當宿主為JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等的大腸桿菌的情形時，必須具有大腸桿菌可更有效率地表現的啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子(Ward等,Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB啟動子(Better等,Science(1988)240,1041-1043)、或T7啟動子。此類的載體除上述載體以外，例如pGEX-5X-1(Pharmacy製)、「QIAexpress system」(Qiagen製)、pEGFP、或pET(此種情形下，宿主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)。
又，載體也可包含抗體分泌用的訊息(signal)序列。抗體分泌用的訊息(signal)序列，為產生大腸桿菌的胞漿(periplasma)的情形時，可使用pelB訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol.(1987)169,4379)。對宿主細胞的載體導入可使用例如氯化鈣法、電穿孔法(electroporation)進行之。
除了大腸桿菌以外，製造本發明抗體的載體例如來自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen製)或pEF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、來自昆蟲的表現載體(例如「Bac-to-BAC桿狀病毒(baculovirus)表現系統」(GIBCO BRL製)、pBacPAK8)、來自植物的表現載體(例如pMH1、pMH2)、來自動物病毒的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIPneo)、來自酵母菌的表現載體(例如、「Pichia Expression Kit」(Invitrogen製)、pNV11、SP-Q01)、來自枯草菌的表現載體(例如pPL608、pKTH50)。
以CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞表現為目的的情形時，表現質體的載體必須具有細胞內表現的必要啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMV啟動子等，更佳為具有篩選細胞轉形用的基因(例如藥劑(neomycin、G418等)可判別的藥劑耐受性基因)。具有此類特性的載體例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
而且，以穩定地表現基因且在細胞內擴增基因的複製數為目的的情形時，例如在缺少核酸合成路徑的CHO細胞中導入具有與其互補的DHFR基因之載體(例如pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))等)，經由甲基喋呤(Methotrexate；MTX)擴增的方法，或者以基因暫時性表現為目的的情形時，例如使用在染色體上具有表現SV40 T抗原之基因的COS細胞，以具有SV40複製起點的載體(pcD等)轉形的方法。複製的開始點可使用來自多瘤病毒(polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、牛乳突狀病毒(BPV)等者。而且為了以宿主細胞系擴增基因複製數，表現載體可包括胺基糖基轉移酶(amino glycosyltransferase；APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黄嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標記(marker)。
因此，本發明提供以本發明之多胜肽或編碼本發明多胜肽之基因製造被編碼的多胜肽之方法，包含培養導入編碼本發明多胜肽的多核苷酸之載體的宿主細胞之步驟。
更具體地提供包含以下步驟之本發明多胜肽之製造方法。
(a)培養包含導入編碼本發明多胜肽之基因的載體之宿主細胞的步驟：
(b)經該基因取得被編碼的多胜肽步驟。
如此所得的本發明抗體可由宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離，實質上純化為均一的抗體而精製。抗體的分離、精製可使用通常的抗體精製所使用的分離、純化方法，沒有任何限定。例如適當選擇或組合層析柱、過濾、限制過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，可分離、純化抗體。
層析法例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、膠濾過法、逆相層析法、吸附層析法等(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。此述的層析法可使用液相層析法，例如HPLC、FPLC等的液相層析法進行。親和性層析法使用的柱例如蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A的柱例如Hyper D,POROS,Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)等所示。本發明也包含使用此述的純化方法高度精製的抗體。
所得的抗體對NR10受體的結合活性之測定可以該技術領域人士公知方法進行。例如測定抗體的抗原結合活性之方法可使用ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光抗體法。例如使用酵素免疫測定法時，在塗覆抗原的盤上加入含有抗體的試料，例如抗體產生細胞的培養上清液或精製抗體。添加以鹼化磷酸酶等酵素標記的次級抗體，培養該盤，洗淨後加入p-硝苯基磷酸等的酵素基質，測定吸光度，評估抗原結合活性。
醫藥組成物
本發明提供含有上述抗體為有效成分的醫藥組成物。本發明更提供以上述抗體為有效成分的炎症性疾病治療劑。
本發明中炎症性疾病為經由物理上、化學上、或生物學上作用物質造成的損傷及異常刺激而關於在罹患的血管及鄰近組織所引起的細胞學、組織學反應伴隨病理學上所見的疾病(STEDMAN’S MEDICAL DICTI0NARY,5th ed.,MEDICAL VIEW Co.,LTD.,2005.)。一般而言，炎症性疾病例如皮膚炎(異位性皮膚炎、慢性皮膚炎等)、炎症性腸疾病(大腸炎等)、氣喘、關節炎(風濕性關節炎、變形性關節炎等)、支氣管炎、Th-2型自體免疫疾病、全身性紅斑性狼瘡、重症肌無力、慢性GVHD、克隆氏症、變形性脊椎炎、腰痛、痛風、手術外傷後炎症、腫脹的緩解、神經痛、咽喉頭炎、膀胱炎、肝炎(非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎等)、B型肝炎、C型肝炎、動脈硬化、搔癢等。
本發明對象之炎症性疾病較佳例，如異位性皮膚炎、慢性皮膚炎、風濕性關節炎、變形性關節炎、慢性氣喘、搔癢等。
所謂「含有抗NR10抗體為有效成分」，是指含有抗NR10抗體為活性成分的至少1種，不限制其含有率。本發明之炎症性疾病之治療劑也可包含與上述抗NR10抗體組合的其他促進炎症性疾病治療的成分。
而且，本發明之治療劑也可用於預防目的。
本發明之抗NR10抗體可依慣例製劑化(例如Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U. S. A)。而且可視需要同時包含醫藥容許載劑及/或添加劑。例如可包含界面活性劑(PEG、Tween等)、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、著色料、香料、保存料、安定劑、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、其他有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等張劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑、流動促進劑、矯味劑等。然而，本發明的炎症性疾病之預防劑或治療劑不限於此述，也可適當包含其他常用的載劑。具體地說，例如輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酯、聚乙烯吡咯酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。也可包含其他低分子量的多胜肽、血清白蛋白、明膠及免疫球蛋白等的蛋白質及胺基酸。當為注射用的水溶液時，將抗NR10抗體溶解於含有例如生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥的等張溶液中。輔助藥也可與例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等，更可以並用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子界面活性劑(聚山梨糖醇80、HCO-50)等。
可視需要將抗NR10抗體封入微膠囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等的微膠囊)，也可作成膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微粒、微乳化液、奈米粒子、及奈米膠囊等)(參考Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition &,Oslo Ed.(1980)等)。而且將藥劑作成徐放性藥劑的方法也是公知，可適用於抗NR10抗體(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15:167-277;Langer,Chem. Tech.(1982)12: 98-105；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman et al.,Biopolymers(1983)22:547-56;EP第133,988號)。
本發明之醫藥組成物可經口或非經口投予，但是較佳為非經口投予。具體為經由注射及經皮投予來投予患者。注射劑型可例如以靜脈內注射、肌肉內注射、或皮下注射等全身性或局部性投予。也可對抑制炎症部位或其週邊局部注入，特別是以肌肉內注射為佳。可根據患者年齡、症狀選擇適當投予的方法。投予量可選擇例如每次每1kg體重的活性成分為0.0001mg~100mg的範圍。或者例如投予人患者時，可選擇每位患者投予0.001~1000mg/kg體重之範圍，每次投予量宜包含例如本發明抗體約0.01~50mg/kg體重的量。然而，本發明之炎症性疾病的預防或治療劑不限於此述之投予量。
本說明書中引用的所有先前技術參照併入本說明書中。
[實施例1]　融合瘤製作 1.1. DNA免疫用的人NR10質體(plasmid)、蟹食猿(Macaca fascicularis)NR10質體的製作 1.1.1. hNR10、cynNR10表現載體的製作
將人NR10(鹼基序列序列識別號：75、胺基酸序列序列識別號：76)組入在小鼠β-肌動蛋白(β-actin)的啟動子(promoter)控制下表現蛋白的載體pMacII(WO 2005/054467)，製作成hNR10表現載體。以相同的方法，從蟹食猿NR10(鹼基序列序列識別號：65，胺基酸序列序列識別號：66)構築cynNR10表現載體。
1.1.2. DNA卡匣(cartridge)的製作
為了將1.1.1.製作的hNR10或cynNR10表現載體用於對小鼠的DNA免疫，使用Herios基因槍用的卡匣(BIO-RAD公司製)，對各自的DNA製作可以每次1μg的DNA免疫之DNA卡匣。
1.2.　產生抗人NR10抗體的融合瘤製作 1.2.1.　使用人NR10及蟹食猿NR10免疫鼠的融合瘤製作
對10隻Balb/c小鼠(雌性，免疫開始時6週齡，日本CharlesRiver)如下述使人NR10或蟹食猿NR10產生免疫。第一次免疫使用Herios基因槍系統(BIO-RAD公司製)使hNR10表現載體製作的DNA卡匣產生免疫。第二次免疫在1週後使用Herios基因槍系統(BIO-RAD公司製)投予cynNR10表現載體製作的DNA卡匣。第三次以後的免疫以間隔1週交互免疫hNR10及cynNR10表現載體。確認對人NR10的血清抗體價上升之後，最後的免疫為靜脈內投予10μg/隻的稀釋於PBS(-)的人NR10蛋白質(細胞外區域)(參考例4)。最後免疫的4日後，使用PEG1500(Roche Diagnostics)依常法使小鼠脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U.1(稱為P3U1，ATCCCRL-1597)細胞融合。融合細胞，即融合瘤，培養於含有10%FBS的RPMI 1640培養基(以下稱為10%FBS/RPMI 1640)。
1.2.2.　融合瘤的篩選
融合的次日，(1)將融合細胞懸浮於半流動的培養基(StemCells)，進行融合瘤的篩選培養及實施融合瘤的群落化(colony)。
融合後第9日或第10日，採取融合瘤的群落(colony)，以每孔1群落播種於添加HAT篩選培養基(10%的FBS/RPMI1640，2vol%的HAT 50x濃度(大日本製藥)，5vol%的BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))的96孔盤。培養3~4天後，回收各孔的培養上清液，測定培養上清液中的小鼠IgG濃度。對於小鼠IgG可確認的培養上清液，以人IL-31依賴性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞；參考例2)的中和活性評估，得到具有高NR10中和活性的幾個選殖株(clone)(第3圖)。獲得濃度依賴性抑制經人IL-31刺激的細胞增殖之選殖株，及濃度依賴性抑制經蟹食猿IL-31刺激的細胞(cynNR10/cynOSMR/BaF3細胞；參考例2)增殖之選殖株(第4圖)。
[實施例2]嵌合抗體的製作 嵌合抗體的表現載體的製作
使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)，從融合瘤細胞萃取出全部RNA，以SMART RACE cDNA擴增套組(BD Biosciences)合成cDNA。使用SMART RACE cDNA擴增套組(BD Biosciences)中附有的10x通用引子A混合物(Universal Primer A Mix)及設定為抗體各恆定區的引子(H鏈：mIgG1-rnot，L鏈：mIgK-rnot)，以PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR，分離抗體的可變區基因。使用BigDye終止子循環定序套組(Terminator Cycle Sequencing Kit)(Applied Biosystems)，在DNA定序機ABI PRISM 3730xL DNA定序機或ABI PRISM 3700 DNA定序機(Applied Biosystems)，根據附帶的說明書記載的方法，確定分離的各DNA片段的鹼基序列。得到的NS18、NS22、NS23及NS33的小鼠抗體之胺基酸序列的H鏈可變區如第1圖所示，其L鏈可變區如第2圖所示。
對得到的H鏈、L鏈各片段，使用表1記載的組合引子，經PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR，使得到的擴增片段與恆定區(分別為人γ1或γ2、人κ)結合，插入動物細胞的表現載體。使用BigDye終止子循環定序套組(Applied Biosystems)，在DNA定序機ABI PRISM 3730X1 DNA定序機或ABI PRISM 3700 DNA定序機(Applied Biosystems)，根據附帶的說明書記載的方法，確定各DNA片段的鹼基序列。
嵌合抗體的製作
將來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)，以6×105 個細胞/mL的細胞濃度對細胞固定用培養盤(dish)(直徑10cm，CORNING)每盤播下10mL，在CO2 培養箱(37℃、5% CO2 )中培養一夜後，吸除培養基，添加6.9mL的CHO-S-SFMII(1nvitrogen)培養基。調製的質體DNA混合液(總計13.8μg)中加入CHO-S-SFMII培養基，形成700μL，加入20.7μL的1μg/mL聚乙烯亞胺(polyethylenimine)(Polysciences Inc.)混合，室溫靜置10分鐘，投入各盤的細胞，在CO2 培養箱(37℃、5% CO2 )中培養4~5小時。之後，添加6.9mL的CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基，在CO2 培養箱內培養3~4日。回收培養上清液後，離心(約2000g，5分鐘，室溫)，去除細胞，再通入0.22μm濾器MILLEX(商標)-GV(Millipore)。各樣本直到使用時保存在4℃。使用蛋白G Sepharose(Amersham Biosciences)，從該上清液純化抗體。純化的抗體使用Amicon Ultra 15(Millipore)濃縮，再以PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences)將溶劑替換為含有0.05%的NaNO3 的PBS(-)。以ND-1000分光光譜儀(NanoDrop)測定280nm吸光度，依Pace等人的方法(Protein Science(1995) 4:2411-2423)計算濃度。
嵌合NS22的活性評估
使用hIL-31用量依賴性增殖的hNR10/hOSMR/BaF3細胞株，如下述評估hIL-31的中和活性。
將hNR10/h0SMR/BaF3細胞以含有10%FBS(MOREGATE)、1%盤林西林(Penicillin)-鏈黴素(Streptomycin)(Invitrogen)的RPMI1640培養基(GIBCO)調製成1.5×105 cells/mL。取其一部分添加hIL-31(R&D Systems)，形成4ng/mL(IL-31(+)，終濃度2ng/mL)。剩餘的細胞懸浮液標記為IL-31(-)。將純化的NS22以培養基調整為2μg/mL，再調製稀釋公比3、合計為8系列的稀釋液(終濃度≦1μg/mL)。於96孔平底盤(CORNING)的各孔播入細胞懸浮液及嵌合NS22(人γ1、κ)稀釋溶液各50μL，在37℃、5% CO2 培養箱培養2日。培養結束後，各孔添加細胞計數套組-8(Dojindo)與PBS等量混合的溶液20μL，測定吸光度(450nm/620nm)(TECAN，SUNRISE CLASSIC)。37℃、5% CO2 培養箱反應2小時後，再次測定吸光度。NS22中和活性以2小時的值減去0小時的值，表示抑制率。結果NS22在hNR10/hOSMR/BaF3細胞中明顯抑制因濃度依賴性IL-31刺激的細胞增殖，證明對人IL-31訊息傳遞(signaling)具有中和活性(第5圖)。
使用因IL-31刺激而誘導IL-6產生的DU145細胞株(人前列腺癌細胞株)，如下述評估IL-31的中和活性。
將DU145以含有10%FBS(MOREGATE)、2mmol/L的L-麩醯胺酸(glutamine)(Invitrogen)、1mmol/L的丙酮酸鈉(SIGMA)的MEM培養基(Invitrogen)調製成2.5×105 cells/mL，在48孔盤(CORNING)的各孔分別注入200μL，37℃、5% CO2 條件下培養一晚。純化的嵌合NS22(人γ1、κ)以含有10%FBS、2mmol/L的L-麩醯胺酸(Invitrogen)、丙酮酸鈉(SIGMA)的MEM培養基稀釋成100μg/mL，使用此溶液調製稀釋公比5、合計為6系列的稀釋液，分別與100ng/mL的人介白素-31(R&D Systems)以1：1混合，各孔添加50μL。37℃、5% CO2 條件下培養2日後，培養上清液中IL-6濃度以DuoSet ELISA發展套組(R&D Systems)測定。NS22的中和活性作為抑制率(%)評估。即在IL-31不存在下的IL-6濃度(A)為最大抑制活性(100%抑制)，添加IL-31且不添加NS22下的IL-6濃度(B)為沒有抑制活性(0%抑制)，添加IL-31且添加NS22下的IL-6濃度(C)如下式計算。
抑制率(%)=(B-C)/(B-A)×100
結果NS22在DU145細胞中明顯抑制因濃度依賴性IL-31刺激的IL-6產生，證明對人IL-31訊息傳遞具有中和活性(第6圖)。
嵌合抗NR10抗體的IL-31競爭活性評估
對人IL-31(R&D Systems)經FMAT藍單功能反應染色(FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye)(Applied Biosystems)進行標記。於50Mm磷酸鈉緩衝液(pH8.0)調製成0.5mg/mL的hIL-31，取100μL，添加溶於DMSO(Junsei)的25nmole FMAT藍5.25μL，震動(vortex)後，常溫下靜置15分鐘。加入1M的Tris-HCl(pH7.4)5μL及10%的Tween20 1.1μL，停止對hIL-31的FMAT藍的導入反應後，以Superdex 75(GE Healthcare,17-0771-01)作為柱使用進行膠過濾，在0.1%的Tween20/PBS展開液上分離FMAT藍-標記的hIL-31及未反應的FMAT藍。
使用表現hNR10的CHO細胞，如下述評估抗體的IL-31/NR10結合抑制活性。
將NS22及NA633(恆定區分別為γ1、κ)以分析緩衝液(10mM的HEPES，140mM的NaCl，2.5mM的CaCl2 ，3mM的MgCl2 ，2%的FBS，0.01%的NaN3 )稀釋成適當濃度，再調製成稀釋公比2、合計7系列的稀釋液，以每孔40μL添加於盤(96孔FMAT盤，Applied Biosystems)。繼續，FMAT藍-標記的hIL-31以分析緩衝液稀釋400倍，每孔添加20μL。最後以分析緩衝液使細胞懸浮液調整為2.5×105 /mL，每孔添加40μL/well(終濃度為每孔1×104 /well)。從添加細胞的2小時之後，以8200細胞偵測系統(8200 Cellular Detection System)(Applied Biosystems)測定螢光(FL1)。結果顯示NS22用量依賴性抑制hIL-31/hNR10的結合，證明其活性較NA633更良好(第7圖)。
[實施例3]抗NR10抗體對NR10的競爭
從融合瘤培養上清液中更純化的NS22抗體，以FMAT藍(Applied Biosystems,4328853)進行標記。對1mg/ml-PBS調製的NS22的170μL，添加溶於17μL的1M NaHCO3 溶液及DMSO之17nmole的FMAT藍3.4μL，震動(vortex)後，常溫下靜置30分鐘。加入8μL的1M Tris-HCl(pH7.4)及1.9μL的1%Tween 20，使對NS22的FMAT藍導入反應停止後，以Superdex 75(GE Healthcare,17-0771-01)作為柱使用進行膠過濾，在0.01%的Tween20/PBS展開液上分離FMAT藍-標記的NS22(FMAT藍-NS22)及未反應的FMAT藍。
得到的FMAT藍-NS22的表現hNR10的CHO細胞(參考例3)的結合受各種抗體的抑制，以8200細胞偵測系統(Applied Biosystems,4342920)檢討。對8.8×10-2 μg/mL的FMAT藍-NS22、每孔7500 cells/well，添加多種濃度的嵌合抗NR10抗體(恆定區分別為γ1、κ)，在暗處靜置4小時後，測定與細胞結合的來自FMAT藍的螢光訊號。反應在含有2.5mM的CaCl2 、3mM的MgCl2 、140mM的NaCl、2%FBS、0.01%的NaNO3 的10mM的Hepes-KOH中進行。結果如第8圖所示。對於NS22與NS23抗體的濃度上升，表示對FMAT藍-NS22的NR10表現細胞的結合之螢光值F1減少。另一方面，幾乎不認為F1伴隨NA633抗體(參考例6)濃度上升而降低(第8圖)。
[實施例4] NS22抗體的人型化 各框架(framework)序列的選定
比較小鼠NS22抗體的可變區及人生殖細胞(germline)序列。其中，用於人型化時的FR序列如表2所示。CDR、FR的確認根據Kabat編號進行。人型化的可變區，H鏈為由表2記載之FR1、FR2、FR3_1、FR4所構成之序列H0-VH(序列識別號：50)；FR1、FR2、FR3_2、FR4所構成之序列H1-VH(序列識別號：112)。L鏈為由FR1、FR2、FR3、FR4所構成之序列為L0(序列識別號：52)。
人型化NS22 H0L0的可變區的製作
為了製作將NS22的CDR區移植到人型化時使用的FR區之人型化NS22可變區，分別設計合成的寡DNA之H鏈、L鏈。混合各合成的寡DNA，經聚合PCR製作編碼人型化NS22可變區的基因。聚合PCR使用KOD-Plus(TOYOBO)進行，根據以下條件實施PCR法。由附帶的PCR緩衝液、dNTPs、MgSO4 、KOD-Plus及10pmol的合成寡DNA形成的反應混合物，在94℃加熱5分鐘之後，由94℃2分鐘、55℃2分鐘、68℃2分鐘構成的PCR反應循環，進行2次循環之後，在可變區5’端增加限制酶位及Kozac序列的引子、及在3’端增加限制酶位的引子，分別添加10pmol，經由94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘構成的PCR反應循環，進行35次循環，獲得擴增片段。所得的擴增片段於TOPO TA選殖載體(TOYOBO)選殖(cloning)，經定序確認鹼基序列。組合製作的可變區及恆定區，製作HO-SKSC(序列識別號：54)、LO(序列識別號：56)，組入可在動物細胞表現插入基因的表現載體中。各DNA片段的鹼基序列，使用BigDye終止子循環定序套組(Applied Biosystems)，在DNA定序機ABI PRISM 3730xL DNA定序機或ABI PRISM 3700 DNA定序機(Applied Biosystems)中根據附帶的說明書記載的方法而確認。
人型化NS22 H1的可變區的製作
H1-SKSC(序列識別號：130)的製作經由存在於H0-SKSC(序列識別號：54)的FR3之kabat編號第73位麩醯胺酸(E)被取代為離胺酸(K)而進行。突變體的製造使用市售QuikChang位導向突變套組(QuikChang site-Directed Muagenesis Kit)(Stratagene)進行，根據附屬的說明書方法製作突變體。
IgG化抗體的表現
抗體的表現如以下方法進行。將來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)中，以5~6×105 個/mL細胞濃度播入細胞固定用培養盤(直徑10cm，CORNING)，每盤播下10mL，在CO2 培養箱(37℃、5% CO2 )中培養一夜後，吸除培養基，添加6.9mL的CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基。調製的質體DNA混合液(總計13.8μg)與20.7μL的1μg/mL聚乙烯亞胺(polyethylenimine)(Polysciences Inc.)及CHO-S-SFMII培養基690μL混合，室溫靜置10分鐘，投入各盤的細胞，在CO2 培養箱(37℃、5% CO2 )中培養4~5小時。之後，添加6.9mL的CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基，在CO2 培養箱內培養3日。回收培養上清液後，離心(約2000g，5分鐘，室溫)，去除細胞，再通入0.22μm濾器-GV(Millipore)，滅菌。各樣本直到使用時保存在4℃。
IgG化抗體的純化
所得的培養上清液中添加懸浮於TBS中的rPotein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，4℃上下混合4小時以上。將此溶液移到0.22μm過濾杯Ultrafree(商標)-MC(Millipore)，以500μL的TBS洗淨3次之後，懸浮於100μL的50mM乙酸鈉水溶液pH3.3的rPotein A SepharoseTM 樹脂中，靜置3分鐘之中，溶出抗體。再直接加入6.7μL的1.5M Tris-HCl、pH7.8中和。進行2次溶出，獲得200μL的純化抗體。將含有抗體的溶液2μL提供於ND-1000分光光譜儀(NanoDrop公司)(Thermo Scientific NanoDropTM 1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific公司))、或將含有抗體的溶液50μL提供於分光光度計DU-600(BECKMAN)，測定280nm吸光度，依Pace等人的方法(Protein Science(1995)4:2411-2423)算出抗體濃度。
使用FMAT的IL-31競爭活性的測定
使用表現hNR10的CHO細胞，如下述評估抗體的IL-31/NR10結合抑制活性。將NS22嵌合抗體及NS22_H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)以分析緩衝液(10mM的HEPES，140mM的NaCl，2.5mM的CaCl2 ，3mM的MgCl2 ，2%的FBS，0.01%的NaN3 ，pH7.4)稀釋成適當濃度，再調製成稀釋公比2、合計8系列的稀釋液，以每孔40μL/well添加於盤(96孔FMAT盤，Applied Biosystems)。繼續，FMAT藍-標記的hIL-31以分析緩衝液稀釋400倍，每孔添加20μL/well。最後以分析緩衝液使細胞懸浮液調整為2.5×105 /mL，每孔添加40μL/well(終濃度為每孔1×104 /well)。從添加細胞後2小時之後，以8200細胞偵測系統(Applied Biosystems)測定螢光(FL1)。
結果顯示人型化NS22抗體H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)、H1L0(H鏈H1-SKSC/序列識別號：130，L鏈L0/序列識別號：56)如第9圖所示，與嵌合抗體幾乎相同的競爭活性，因此稱為H0L0、H1L0人型化的抗IL-31受體抗體。H0L0、H1L0的FR被認為皆可在人型化之時作為FR使用。
因此考量對以下實施例所示之CDR的突變位置，也可導入H0、H1任一者。
[實施例5]人型化抗IL-31受體抗體中的新穎恆定區M14及M58的異質性(heterogeneity)減少效果
如參考例7~9所示，在人型化抗IL-6受體抗體huPM1抗體中，恆定區由IgG2轉換成M14或M58，確認安定性未降低，但可降低來自IgG2樞紐區的異質性。此處檢討在人型化抗IL31受體抗體中恆定區由野生型IgG2轉換成M14或M58是否可降低異質性。
H鏈使用含有參考例8及9製作的M14(序列識別號：129)、M58(序列識別號：128)的IgG1(序列識別號：60)及IgG2(序列識別號：132)及實施例4製作的人型化抗IL-31受體抗體的H鏈可變區H0(H0-VH/序列識別號：50)組合的H0-M14、H0-M58、H0-IgG1及H0-IgG2，L鏈使用實施例4製作的L0(L0/序列識別號：56)，製作H0L0-IgG1(H鏈H0-IgG1/序列識別號：133、L鏈L0/序列識別號：56)、H0L0-IgG2(H鏈H0-IgG2/序列識別號：134、L鏈L0/序列識別號：56)、H0L0-M14(H鏈H0-M14/序列識別號：134、L鏈L0/序列識別號：56)、及H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)。各抗體的表現、純化如實施例4記載之方法進行。
異質性的評估方法以陽離子交換層析法進行評估。製作的抗體的異質性評估，使用ProPac WCX-10(Dionex)作為柱，移動相A為20mM的乙酸鈉，pH5.0，移動相B為20mM的乙酸鈉、1M NaCl，pH5.0，以適當流速及梯度實施。陽離子交換層析法(IEC)的評估結果如第10圖所示。
如第10圖所示，抗IL-31受體抗體中，恆定區由IgG1轉變成IgG2，異質性增加，恆定區轉變成M14或M58者，兩種抗體的異質性皆可降低。
[實施例6]抗IL31受體抗體中的新穎恆定區M58的藥物動力改善效果
如參考例9所示，抗IL-6受體抗體huPM1抗體中，恆定區由IgG1轉變成M58者，對人FcRn的結合性提高，在人FcRn轉殖基因鼠中，被發現藥物動力升高。此處檢討恆定區轉換為M58者對於抗IL-31受體抗體的藥物動力是否提高。
實施例4及5製作的H0L0-IgG1(H鏈　H0-IgG1/序列識別號：133、L鏈　L0/序列識別號：56)、H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈　L0/序列識別號：56)如參考例9所示之方法，評估對人FcRn的結合性。其結果如表3所示。
如表3所示，抗IL-31受體抗體H0L0中恆定區由IgG1轉變為M58者，與抗IL-6受體抗體hPM1相同，確認對人FcRn的結合性提升。由此顯示恆定區由IgG1轉換成M58者，抗IL-31受體也可能提高在人體內的藥物動力。
[實施例7]　使等電點降低的突變位置的確認突變體的製作
各突變體的製作依實施例4的方法或使用PCR的聚合PCR來進行。使用聚合PCR的方法進行根據含有突變部位的順向鏈及反向鏈的序列而合成寡DNA。含有突變部位的順向鏈的寡DNA與插入進行突變的基因之載體結合的反向鏈寡DNA、含有突變部位的反向鏈的寡DNA與插入進行突變的基因之載體結合的順向鏈寡DNA，各自組合，使用PrimeSTAR(TAKARA)進行PCR，製作含有突變部位的片段之5’端及3’端兩個。此兩個片段經聚合PCR組合製作各突變體。將製作的突變體插入可能在動物細胞中表現插入基因的表現載體，得到的表現載體的鹼基序列以該技術領域中公知方法確認。抗體的製作及純化如實施例4之方法進行。
突變位置的確認
為了提高H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54、L鏈L0/序列識別號：56)的藥物動力，進行可使可變區等電點降低的突變位置之檢討。篩選從立體結構模型推測的可變區突變位置之結果，發現不使對NR10的結合大幅降低而使可變區的等電點降低之位置，如表4所示(Hp5-VH/序列識別號：137，Hp7-VH/序列識別號：138，Hp8-VH/序列識別號：139，Hp6-VH/序列識別號：140，Hp9-VH/序列識別號：141，Hp1-VH/序列識別號：142，Hp13-VH/序列識別號：143，Lp1-VL/序列識別號：144，Lp2-VL/序列識別號：145，Lp3-VL/序列識別號：146，Lp4-VL/序列識別號：147，Lp7-VL/序列識別號：148，Lp5-VL/序列識別號：149，Lp6-VL/序列識別號：150)。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
各突變體的hIL-31/hNR10結合抑制活性以FMAT評估。方法如實施例4的方法進行。如第11圖所示，各突變體的競爭活性與H0L0相比，未顯示大幅地降低。
上列表4中※符號表示與形成人序列用的等電點無關的突變位置。
使此述突變組合的等電點降低的人型化NS22抗體，例如Hp3-Lp15(H鏈Hp3-SKSC/序列識別號：151，L鏈Lp15/序列識別號：152)。對Hp3-Lp15的NR10的親和性、等電點、小鼠血漿中滯留性，與H0L0相比。
親和性的測定
各抗體對NR10的親和性如參考例10的方法進行。
測定的親和性結果如表5所示。Hp3Lp15的親和性顯示與H0L0的親和性幾乎相同。
等電點的測定
為了評估因可變區的胺基酸改變造成的全長抗體等電點的變化，進行各抗體的等電點電泳分析。等電點電泳的方法如以下所述。
使用Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences公司製)，以下列膨潤液使Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences公司製)膠膨潤約30分鐘。
Milli-Q水　1.5mL
IEF用的Pharmalyte 5-8　100μL
(Amersham Biosciences公司製)
使用已膨潤的膠，經PhastSystem(Amersham Biosciences公司製)進行下列程序進行電泳。樣本在步驟2時添加於膠中。pl標誌物(marker)使用pl(Amersham Biosciences公司製)用的校準套組(calibration kit)。
步驟1: 2000V　2.5mA　3.5W　15℃　75Vh
步驟2: 200V　2.5mA　3.5W　15℃　15Vh
步驟3: 2000V　2.5mA　3.5W　15℃　410Vh
電泳後的膠以20%TCA固定後，使用銀染套組、蛋白質(Amersham Biosciences社製)，根據該套組所附的操作方法進行銀染。染色後，從p1標誌物的已知等電點計算樣本(全長抗體)的等電點。
由等電點電泳測定等電點的結果，H0L0的等電點為約7.8，Hp3Lp15的等電點為約5.5，因此Hp3Lp15的等電點較H0L0的等電點低約2.3。又將可變區VH/VL的理論等電點以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算時，H0L0的理論等電點為約7.76，Hp3Lp15的理論等電點為約4.63，因此Hp3Lp15的理論等電點較H0L0的理論等電點低約3.13。
降低使用小鼠的等電點之抗體藥物動力的評估
為了評估使等電點降低的突變抗體Hp3Lp15的血漿中滯留性，進行H0L0及Hp3Lp15在正常小鼠中的血漿中滯留性的比較。將H0L0及Hp3Lp15以1mg/kg靜脈內單次投予小鼠(C57BL/6J，日本Charles River)，比較血漿中濃度變化。血漿中濃度測定以ELISA法測定。將適當的濃度檢測線試料及血漿測定試料分注於固定有抗人IgG(Fc-特異性)抗體(Sigma公司製)的免疫盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社製))，室溫下靜置1小時。將羊的抗人IgG-ALP(Sigma公司製)在室溫下反應1小時後，以BluePhos微孔磷酸酶基質系統(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)作為基質(substrate)使用，進行顯色反應，在微盤讀器(microplate reader)上測定650nm的吸光度。從檢測線的吸光度以分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算血漿中濃度。
將所得的血漿中濃度變化數據經藥物動力分析軟體WinNonlin(Pharsight社製)計算藥物動力學的參數(AUC，全身的清除率(clearance；CL))，如表6所示。相對於H0L0，Hp3Lp15在靜脈內投予後的AUC增加約14%，清除率降低約12%。由此可見，使H0L0等電點降低的Hp3Lp15，其藥物動力提升。
[實施例8]可變區與恆定區的組合對生物活性的影響
為了評估不同恆定區而對生物活性的影響，製作下列的突變體。
H鏈為，組合參考例7及9所製作的SKSC(序列識別號：62)、M58(序列識別號：128)為恆定區，實施例7製作的可變區域Hp3(Hp3-VH/序列識別號：167)為可變區，製作Hp3-M58(序列識別號：240)、Hp3-SKSC(序列識別號：151)。組合製作的H鏈及實施例7製作的L鏈Lp15(Lp15/序列識別號：152)，製作Hp3Lp15-SKSC(H鏈Hp3-SKSC/序列識別號：151，L鏈Lp15/序列識別號：152)及Hp3Lp15-M58(H鏈Hp3-M58/序列識別號：240，L鏈Lp15/序列識別號：152)。各抗體的表現、純化如實施例4之方法進行。
對於上述製作的各抗體以及使用參考例7記載的恆定區SKSC(序列識別號：62)的H0L0-SKSC(H 鏈 H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)、實施例5製作的H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L0/序列識別號：56)及H0L0-IgG2(H鏈H0-IgG2/序列識別號：134，L鏈L0/序列識別號：56)，以實施例2記載之方法進行BaF/NR10的生物活性，結果如第18圖所示。
如第18圖所示，恆定區之間沒有測出生物活性有大的差異。兩個可變區H0、Hp3與各恆定區的組合也沒有對生物活性造成影響，因此可考量今後製作的可變區與任何恆定區組合也不會改變生物活性。
[實施例9]抑制經熱加速試驗的分解之突變位置的鑑定
醫藥品使用的抗體，即使是來自單一抗體產生細胞的選殖株(clone)所得的單株抗體，都存在異質性(heterogeneity)。這種抗體的異質性已知會因為氧化、脫醯胺化等的修飾而引起、或在長時間保存中及所謂熱、光的壓力條件下暴露而增加(參考文獻：Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences,vol. 97,No. 7,2426-2447)。然而，在將抗體開發為醫藥品時，其蛋白質的物性，特別是均一性及安定性極為重要，希望降低目標物質/關聯物質的異質性，儘可能為單一物質。在此，評估在壓力條件下的抗體異質性，為了降低該異質性進行以下實驗。
用於評估分解物，以下列方法製造H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)的熱加速品。對於製造的熱加速品及未加速品(initial)，以下列方法經陽離子交換樹脂進行分析。
‧熱加速品的調製方法
緩衝液：PBS
抗體濃度：0.2-1.0mg/mL
加速温度：60℃
加速期：1日
‧陽離子交換層析法的分析方法
柱：ProPac WCX-10,4×250mm(Dionex)
移動相：(A)　25mmol/L MES/NaOH,pH 6.1
(B)　25mmol/L MES/NaOH,250mmol/L NaCl,pH 6.1
流速：0.5mL/min
柱温度：40℃
梯度：%B 0至0(0-5min)→0至30(5-80min)
檢測：280nm
H0L0的熱加速前後的樣本層析結果如第19圖所示。H0L0的熱加速前後的樣本中，得到鹼性峰(peak)增加的傾向。
此處，為了降低該峰，進行篩選的結果發現Ha355、Ha356、Ha360、Ha362，製作組合該H鏈突變體及L0的Ha355L0(H鏈Ha355-SKSC/序列識別號：242，L鏈L0/序列識別號：56)、Ha356L0(H鏈Ha356-SKSC/序列識別號：243，L鏈L0/序列識別號：56)、Ha360L0(H鏈Ha360-SKSC/序列識別號：244，L鏈L0/序列識別號：56)、Ha362L0(H鏈Ha362-SKSC/序列識別號：245，L鏈L0/序列識別號：56)。各突變體的序列如表7所示。
上述的各抗體的表現、純化如實施例4之方法進行。將製作的各抗體與H0L0相同地調製熱加速品，以陽離子交換層析法分析，結果如第19圖所示。
此結果為，包含H鏈第101位的天冬胺酸(aspartic acid)置換為麩胺酸(glutamic acid)的突變之突變抗體，其熱加速後增加的鹼性峰的產生較H0L0的少。將此述的突變抗體以實施例2記載之方法進行BaF/NR10的生物活性，結果如第20圖所示。如第20圖所示，前述的突變的生物活性與H0L0相比，為幾乎相同或高於H0L0。由上述來看，Ha355、Ha356、Ha360、Ha362的突變抑制因熱加速而生成的分解物，在提高抗體的安定性上是具有效果的。
[實施例10]使親和性增加的突變位置的確定
為了提高H0L0對NR10的親和性，製作CDR序列中導入突變的基因庫(library)，進行檢討。篩選CDR序列中導入突變的基因庫(library)之結果，發現對NR10親和性升高的突變，如表8所示。分別將H鏈突變體Ha101-SKSC(序列識別號：246)、Ha103-SKSC(序列識別號：247)、Ha111-SKSC(序列識別號：248)、Ha204-SKSC(序列識別號：249)、Ha219-SKSC(序列識別號：250)與L0(L0/序列識別號：56)組合，及分別將L鏈突變體La134(序列識別號：251)、La130(序列識別號：252)、La303(序列識別號：253)、La328(序列識別號：254)與H0(H0-SKSC/序列識別號：54)組合，製作各種抗體。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
各突變體對NR10的親和性以Biacore評估，如表9所示。方法如參考例10記載之方法進行。如表9所示，與H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)相比，各突變體的KD值明顯較為升高。
組合此述之使親和性增加的突變及使實施例7製作的等電點降低的突變之例，例如Ha401La402(H鏈Ha401-SKSC/序列識別號：255，L鏈La402/序列識別號：256)或H17L11(H鏈H17-M58/序列識別號：222，L鏈L11/序列識別號：236)。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
Ha401La402(H鏈Ha401-SKSC/序列識別號：255，L鏈La402/序列識別號：256)對NR10的親和性及BaF/NR10的生物活性，如參考例10及實施例2記載之方法進行，與H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)作比較。測定的親和性結果如表10所示，BaF/NR10的生物活性如第21圖所示。不論是親和性、生物活性上，皆較H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54，L鏈L0/序列識別號：56)為高。
再對H17L11(H鏈H17-M58/序列識別號：222，L鏈L11/序列識別號：236)對NR10的親和性及BaF/NR10的生物活性，如實施例7及實施例2記載之方法進行，與H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L0/序列識別號：56)作比較。測定的親和性結果如表11所示，BaF/NR10的生物活性如第22圖所示。不論是親和性、生物活性上，皆較H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L0/序列識別號：56)為高。
[實施例11]為減少免疫原性風險的突變位置之確認H鏈CDR1的免疫原性風險的減少
將H0L0可變序列中的T細胞抗原決定位(epitope)以TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)進行分析。結果預測存在與H鏈CDR1多的HLA結合的T細胞抗原決定位(免疫原性風險高的序列)。此處，在TEPITOPE分析中，檢討降低H鏈CDR1免疫原性風險的改變時，發現當kabat編號第33位的異白胺酸(isoleucine)(I)置換為丙胺酸(alanine)(A)時，免疫原性風險大幅減少，標示出該改變(表12)。將此突變加入以實施例10製作的H17，製作成H19(H19-M58/序列識別號：223)。製作的H19與L12組合，製作成H19L12(H鏈H19-M58/序列識別號：223，L鏈L12/序列識別號：237)。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
對NR10的親和性及BaF/NR10的生物活性如參考例10及實施例2記載之方法行，與H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L0/序列識別號：56)相比。測定的親和性結果如表13所示，BaF/NR10的生物活性如第23圖所示。親和性及生物活性皆顯示與H0L0幾乎相同活性。
L鏈CDR1的免疫原性風險的減少
L鏈CDR1中的kabat編號第25號的蘇胺酸(threonine)(T)在生殖細胞系列的序列中為丙胺酸(alanine)(A)或絲胺酸(serine)(S)。此處預期將第25位的蘇胺酸(T)改變為丙胺酸(A)或絲胺酸(S)的方式，可使免疫原性風險降低(表14)。此處，以L12加入上述突變製作成L17(序列識別號：238)。將製作的L17與H0組合，形成H0L17(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L17/序列識別號：238)。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
各突變體對NR10的親和性及BaF/NR10的生物活性如參考例10及實施例2記載之方法進行，比較H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L0/序列識別號：56)及H0L12(H鏈H0-M58/序列識別號：136，L鏈L12/序列識別號：237)。L12因為包含使親和性升高的序列，與H0L0相比顯示約2倍高的親和性。測定的親和性結果如表15所示，BaF/NR10的生物活性如第24圖所示。親和性及生物活性皆顯示與H0L12幾乎相同的親和性及生物活性。
[實施例12]完全人型化NS22抗體的製作
由上述實施例所發現的使pl降低的突變、使親和性上升的突變、抑制H鏈分解的突變、使免疫原性風險降低的突變，對H0(H0-M58/序列識別號：136)、H1(H1-M58/序列識別號：257)、或L0(L0/序列識別號：56)作複數種組合，製作NS22突變體的可變區域，進行各種篩選的結果，發現H28L17(H鏈　H28-M58/序列識別號：224，L鏈　L17/序列識別號：238)、H30L17(H鏈　H30-M58/序列識別號：225，L鏈　L17/序列識別號：238)、H34L17(H鏈　H34-M58/序列識別號：226，L鏈　L17/序列識別號：238)、H42L17(H鏈　H42-M58/序列識別號：227，L鏈　L17/序列識別號：238)、H44L17(H鏈　H44-M58/序列識別號：228，L鏈　L17/序列識別號：238)、H46L17(H鏈　H46-M58/序列識別號：229，L鏈　L17/序列識別號：238)、H57L17(H鏈　H57-M58/序列識別號：230，L鎖　L17/序列識別號：238)、H71L17(H鏈　H71-M58/序列識別號：231，L鏈　L17/序列識別號：238)、H78L17(H鏈　H78-M58/序列識別號：232，L鏈　L17/序列識別號：238)、H92L17(H鏈　H92-M58/序列識別號：233，L鏈　L17/序列識別號：238)、H97L50(H鏈　H97-M58/序列識別號：234，L鏈　L50/序列識別號：239)、H98L50(H鏈　H98-M58/序列識別號：235，L鏈　L50/序列識別號：239)。各突變體的製作、純化如實施例4記載之方法進行。
各突變體對NR10的親和性及BaF/NR10的生物活性如參考例10及實施例2記載之方法進行，與H0L0(H鏈　H0-M58/序列識別號：136，L鏈　L0/序列識別號：56)相比。測定的親和性結果如表16所示，BaF/NR10的生物活性如第25-1及25-2圖所示。親和性及生物活性皆顯示與H0L0幾乎相同或者高於H0L0。
[實施例13]抗NR10中和抗體的結合區域(domain)之分析 (1)人‧小鼠野生型抗原及嵌合(chimera)抗原的製作
將編碼人與小鼠的野生型及嵌合的NR10細胞外區域(hhh(序列識別號：258)、mmm(序列識別號：259)、hhm(序列識別號：260)、mmh(序列識別號：261)、hmm(序列識別號：262)、mhm(序列識別號：263)、mhh(序列識別號：264))的基因，在C端加上Histag及Myc tag(HHHHHHEQKLISEEDL/序列識別號：287)，插入動物細胞表現載體，以FreeStyle 293表現系統(invitrogenTM )一次性表現。此述人‧小鼠野生型及嵌合體NR10-ECD的模式圖如第26圖所示。
從培養上清液中對人‧小鼠野生型及嵌合抗原(hhh、mmm、hhm、mmh、hmm、mhm、mhh)的純化，以Ni-NTA Superflow柱層析法進行。亦即，將1mL的Ni-NTA Superflow(QIAGEN)填充於預先準備的空柱(BioRad)，各添加30mL的培養上清液，以含有150mM的氯化鈉及20mM的咪唑(imidazole)的D-PBS(Dulbecco’s磷酸緩衝生理食鹽水)洗淨之後，以含有150mM的氯化鈉及250mM的咪唑的D-PBS溶出。溶出的分層部分以分層分子量10K的Amicon-Ultra(Millipore)置換為D-PBS之後濃縮。
(2)以西方點漬法(Western Blot)檢測結合的抗原
將前述調製的人‧小鼠野生型及嵌合抗原以每一道各0.5μg加入3個4-20%聚丙烯醯胺膠(第一化學)進行電泳。在Semidry型點漬裝置電性轉寫至PVDF膜(Millipore)，以含有5%脫脂乳的TBS終止。1個(人型化抗人NR10抗體檢出系)為5μg/mL的H44M58L17，1個(小鼠抗人NR10抗體檢出系)為5μg/mL的ND41，1個(Myctag檢出系)為以含5%脫脂乳的TBS稀釋500倍的抗Myc抗體(SantaCruz、Cat.#sc-789)，在室溫下反應1小時。
以含有0.05% TweenTM 20的TBS在3分鐘內清洗3次，與次級抗體反應。人型化抗人NR10抗體檢出系與鹼性磷酸酶標記的羊抗人IgGγ(BIOSOURCE、Cat.#AHI0305)室溫下反應1小時，小鼠抗人NR10抗體檢出系與鹼性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG(SantaCruz、Cat.#sc-2008)室溫下反應1小時，Myctag檢出系與鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(SantaCruz、Cat.#sc-2057)室溫下反應1小時。以含有0.05%的TweenTM 20的TBS在3分鐘內洗淨4次之後，經BCIP/NBT磷酸酶基質、1-組成系統(KPL)顯色。此處使用的TBS(Tris-緩衝生理食鹽水)為使1包的TBS(Tris-緩衝生理食鹽水)粉末(TaKaRa)溶於1L的蒸餾水而製備。結果如第27圖所示。
使用人型化抗體、小鼠抗體的情形時，檢測出只與NR10細胞外區域hhh、hhm、hmm結合。
[參考例1]蟹食猿的NR10、OSMR、IL-31基因的分離
為了前臨床階段的安全性評估，考量對蟹食猿的交叉性‧中和活性之重要，嘗試分離蟹食猿的NR10基因、OSMR基因。從已公開的恆河猴基因體等資料，設計引子，經PCR法從蟹食猿胰臟cDNA成功增殖NR10基因、OSMR基因。分離的蟹食猿NR10、OSMR、IL-31基因序列，如序列識別號：65、69、67所示。蟹食猿的NR10、OSMR、IL-31的胺基酸序列如序列識別號：66、70、68所示。
[參考例2]NR10及OSMR表現的Ba/F3細胞株的建立
將人全長的NR10的cDNA(序列識別號：75)組入表現載體pCOS1(Biochem Biophys Res Commun. 228,p838-45,1996)，製作pCosNR10.3。將oligostatin M受體cDNA(OSMR,GenBank accession No. NM003999)從人胎盤基因庫經PCR法分離，同樣地構築表現載體pCosl-hOSMR。分別將每個10μg的載體同時經電穿孔法(electroporation)導入來自小鼠IL-31依賴性pro-B細胞的細胞株Ba/F3中(BioRad GenePulser,960μF,0.33kV)。導入後添加人IL-31(R＆D System)培養，獲得具IL-31依賴性增殖的細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)。再者，將蟹食猿IL-31基因(序列識別號：67)組入哺乳動物用的表現載體，將其導入CHO細胞株DG44，其培養上清液中獲得蟹食猿IL-31。使用此培養上清液，與hNR10/hOSMR/BaF3相同，將蟹食猿全長NR10及蟹食猿OSMR基因分別插入表現載體pCOS1，使Ba/F3細胞表現，建立蟹食猿IL-31依賴性細胞株(cynNR10/cynOSMR/BaF3細胞)。
[參考例3]表現NR10的CHO細胞株的建立
將細胞內區域缺少型人NR10基因(序列識別號：73)及細胞內區域缺少型蟹食猿NR10基因(序列識別號：71)分別插入哺乳動物用的表現載體，此載體經限制酶形成直線狀後，經電穿孔法導入CHO細胞株DG44(BioRad Gene Pulser,25μF,1.5Kv)。經藥劑篩選，使用抗人NR10抗體，經FCM分析、篩選、建立NR10表現細胞。又細胞內區域缺少型人NR10基因的鹼基序列(序列識別號：73)編碼的胺基酸序列以序列識別號：74表示，細胞內區域缺少型蟹食猿NR10基因的鹼基序列(序列識別號：71)編碼的胺基酸序列以序列識別號：72表示。
[參考例4]NR10蛋白質(細胞外區域)的製備
以人NR10 cDNA為模板，經PCR法只增殖細胞外區域，C端加上FLAG tag序列，組入哺乳動物細胞用的表現載體。將形成直線狀的載體10μg，經電穿孔法導入中國豚鼠的卵巢細胞株DG44中(BioRad Gene PulserII,25μF,1.5kV)，獲得高表現的細胞株。將此細胞株大量培養，其培養上清液經抗FLAG抗體柱(SIGMA製)、膠濾過法純化，獲得可溶型NR10。可溶型NR10的鹼基序列以序列識別號：77表示，胺基酸以序列序列識別號：78表示。
[參考例5]抗人NR10抗體的製作
以人NR10蛋白(細胞外區域)[如參考例4記載]使小鼠免疫，經一般方法製作融合瘤(hybridoma)。以參考例2所述的人IL-31依賴性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)的中和活性，評估此述的融合瘤培養上清液，獲得具有NR10中和活性的NA633。
再使用插入人NR10的全長基因(序列識別號：75)的哺乳動物用的表現載體，使用氦氣射出基因槍進行DNA免疫，經一般方法製作融合瘤。以參考例2所述的人IL-31依賴性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)的中和活性，評估此述的融合瘤培養上清液，獲得具有NR10中和活性的ND41。
[參考例6]人‧嵌合抗體的製作
NA633的重鏈可變區的胺基酸序列如序列識別號：104所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如序列識別號：108所示。NA633的重鏈可變區的CDR1的胺基酸序列如序列識別號：105所示，CDR2的胺基酸序列如序列識別號：106所示，CDR3的胺基酸序列如序列識別號：107所示，輕鏈可變區的CDR1的胺基酸序列如序列識別號：109所示，CDR2的胺基酸序列如序列識別號：110所示，CDR3的胺基酸序列如序列識別號：111所示。而且根據一般方法，製作此述的小鼠可變區與人恆定區(H鏈為γ1，L鎖鏈為κ)的嵌合抗體。
[參考例7]安定性不降低但減少野生型IgG2的異質性的huPM1-SKSC的製作
由於NS22抗體為NR10中和抗體，在考慮免疫原性及副作用的情形時，考慮其與Fcγ受體的結合不佳的可能性。為了降低與Fcγ受體的結合，恆定區的同型物(isotype)不使用IgG1，考慮選擇IgG2或IgG4(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)，從Fcγ受體I及血中滯留性觀點，認為IgG2較IgG4為所希望者(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。另外，將抗體作為醫藥品開發之時，其蛋白質的物性，特別是均一性及安定性非常重要，已知IgG2同型物(isotype)有非常多的來自樞紐區域(hinge domain)的雙硫鍵的異質性(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.)。要維持來自這些目的物質/關聯物質的異質性的製造間差並且作為醫藥品大量製造，並不容易，關係到成本增加，故希望儘可能為單一物質。因此，在將IgG2同型物的抗體作為醫藥品的開發上，希望為安定性不降低但減少來自雙硫鍵的異質性者。
以減少對野生型IgG2的異質性為目的，進行IgG2的樞紐(hinge)部分的雙硫鍵及存在CH1區域(domain)的雙硫鍵的改變。檢討各種突變體的結果，野生型IgG2恆定區序列中，存在H鏈的CH1區域中的EU編號(Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No. 91-3242)第131位的半胱胺酸(cysteine)及第133位的精胺酸(arginine)分別改變為絲胺酸(serine)及離胺酸(lysine)、存在H鏈的上樞紐(upper hinge)的EU編號第219位的半胱胺酸(cysteine)改變為絲胺酸(serine)的恆定區之SKSC(序列識別號：62)，認為可能不降低安定性但減少異質性。另一方面，減少異質性的方法，認為只有存在H鏈的上樞紐的EU編號第219號的半胱胺酸(cysteine)改變為絲胺酸(serine)的方法，及只有第220位的的半胱胺酸(cysteine)改變為絲胺酸(serine)的方法。此處製作IgG2的EU編號第219號的半胱胺酸(cysteine)改變為絲胺酸(serine)的恆定區SC(序列識別號：153)、及IgG2的EU編號第220號的半胱胺酸(cysteine)改變為絲胺酸(serine)的恆定區CS(序列識別號：154)。
H鏈使用，組合上述製作的各恆定區及IgG1(序列識別號：60)及IgG2(序列識別號：132)及人型化抗IL-6受體的抗體可變區(H鏈可變區huPM1-VH/序列識別號：155，L鏈可變區huPM1-VL/序列識別號：156)(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6.)的huPM1-SC(序列識別號：157)、huPM1-CS(序列識別號：158)、huPM1-IgG1(序列識別號：159)、huPM1-IgG2(序列識別號：160)及huPM1-SKSC(序列識別號：161)，L鏈使用huPM1-L(序列識別號：162)，製作各抗體。各抗體的表現、純化如實施例4記載之方法進行。
進行各抗體的異質性比較。huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC的異質性的評估方法，以陽離子交換層析法評估。柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，移動相A使用20mM乙酸鈉，pH5.0；移動相B使用20mM乙酸鈉，1M NaCl，pH5.0，以適當流量及梯度實施。以陽離子層析的評估結果如第12圖所示。
結果如第12圖所示，雖然恆定區由IgG1變換為IgG2的異質性增加，但是恆定區變換為SKSC的異質性大幅降低。另一方面，恆定區為SC的情形與恆定區為SKSC的情形相同，異質性大幅降低，但當恆定區為CS的情形時異質性未有充分改善。
一般為了將抗體作為醫藥品開發，希望異質性少且具有調製安定製劑用的高安定性者。此處安定性的評估方法，以示差式掃描熱量分析儀(DSC)的熱變性中間溫度(Tm)進行評估(VP-DSC，Microcal社製)。熱變性中間溫度(Tm)為安定性的指標，在作為醫藥品製作安定製劑上，希望為熱變性中間溫度(Tm值)高者(J Pharm Sci. 2008 Apr;97(4):1414-26.)。此處，以20mM乙酸鈉、150mMNaCl、pH6.0的溶液(EasySEP，TOMY)對huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC進行透析，以約0.1mg/mL的蛋白質濃度，1℃/min升溫速度從40℃升溫至100℃，進行DSC測定。所得DSC的變性曲線如第13圖所示，Fab部分的Tm值如表17所示。
huPM1-IgG1及huPM1-IgG2的Tm值幾乎相同，約94℃(IgG2者低約1℃)，huPM1-SC及huPM1-CS的Tm值為約86℃，與huPM1-IgG1及huPM1-IgG2相比，明顯Tm值降低。另外，huPM1-SKSC的Tm值為約94℃，幾乎與huPM1-IgG1及huPM1-IgG2相同。huPM1-SC及huPM1-CS的安定性明顯較IgG2低，因此作為醫藥品開發上，考量CH1區域的半胱胺酸(cysteine)也改變為絲胺酸(serine)的huPM1-SKSC為佳。huPM1-SC及huPM1-CS的Tm值較IgG2大幅降低的理由，認為是因為huPM1-SC及huPM1-CS與IgG2的雙硫鍵結合模式為不同的形式。
再比較DSC變性曲線的情形，相對於huPM1-IgG1及huPM1-SKSC的Fab部分的變性峰(peak)陡急，huPM1-SC及huPM1-CS與其相比，Fab部分的變性峰(peak)平坦，認為huPM1-IgG2的Fab部分的變性峰(peak)在低溫側為較短峰(shorter peak)。DSC的變性峰在為單一成分的情形時，呈現一般陡急(尖銳)的變性峰，但是在有不同的複數種成分(即異質性)存在的情形下，認為Tm的變性峰變得平坦。亦即，huPM1-IgG2、huPM1-SC及huPM1-CS中有複數種成分存在，暗示huPM1-SC及huPM1-CS不能充分減少天然型IgG2的異質性的可能。因此，判斷天然型IgG2的異質性不僅與樞紐部分的半胱胺酸有關，也與存在CH1區域中的半胱胺酸有關，為了減少DSC上的異質性，認為不僅要改變樞紐部分的半胱胺酸，也必須要改變CH1區域的半胱胺酸。如上所述，改變樞紐部分的半胱胺酸及CH1區域的半胱胺酸者可具有與原始天然型IgG2相同的安定性。
由以上所述，減少來自IgG2樞紐區域的異質性之恆定區，認為只有樞紐部分的半胱胺酸置換為絲胺酸的恆定區SC及CS，在異質性及安定性的觀點上並不足夠，然發現將存在CH1區域中的EU編號第131位的半胱胺酸也置換為絲胺酸者，可維持與原始IgG2相同的安定性且大幅降低異質性。此述恆定區例如SKSC。
[參考例8]Fcγ受體非結合的最佳化恆定區M14的製作及評估
IgG2的恆定區Fcγ受體結合部位之中EU編號：233、24、235、26為非結合型，但是Fcγ受體結合部位之中EU編號：第327、330、331位為與非結合型IgG4的序列不同的序列，因此必須要將EU編號：第327、330、331位的胺基酸改變為IgG4的序列(Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24中的G2Δa)。然而，IgG4中EU編號第339位的胺基酸為精胺酸(arginine)，IgG2為蘇胺酸(threonine)，因此只將EU編號：第327、330、331位的胺基酸改變為IgG4的序列會形成非天然存在的T細胞抗原決定位胜肽，出現9個胺基酸的新胜肽序列，產生免疫原性風險。此處發現，在上述改變中加上新的IgG2的EU編號第339位的蘇胺酸(threonine)改變為精胺酸(arginine)者，可防止新的胜肽序列的出現。在此述突變中加上，使IgG2在酸性條件下的安定性提高的IgG2的EU編號第397位的甲硫胺酸(methionine)改變成纈胺酸(valine)的突變。而且以參考例7製作的來自樞紐區雙硫鍵的異質性改善的SKSC(序列識別號：62)，因為具有第131位及第133位突變導入的非天然存在的T細胞抗原決定位胜肽所形成的9個胺基酸的新胜肽序列出現所產生的免疫原性風險，因此，將EU編號的第137位的麩胺酸(glutamic acid)改變成甘胺酸(glycine)、第138位的絲胺酸(serine)改變成甘胺酸(glycine)的突變導入，使第131~139位附近的胜肽序列與IgG1者相同。製作將此述突變全部導入的恆定區序列M14(序列識別號：129)。
H鏈為huPM1-M14、L鏈為huPM1-L(序列識別號：162)的huPM1-M14，其表現、純化如參考例7記載之方法進行。製作的huPM1-M14(序列識別號：163)及huPM1-IgG1、huPM1-IgG2的異質性評估以陽離子交換層析法根據參考例7記載之方法實施。
如第14圖所示，huPM1-M14中也與huPM1-SKSC相同減少異質性。
[參考例9]使H鏈C端側的異質性減少及藥物動力提升的huPM1-M58之製作 huPM1-M58分子的製作
huPM1為IgG1抗體。IgG1抗體的H鏈C端序列的異質性已知來自C端胺基酸的離胺酸(lysine)殘基缺少及C端的2個胺基酸甘胺酸(glycine)及離胺酸(lysine)缺少所造成的C端胺基酸醯胺(amide)化(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。huPM1中，雖其主成分為鹼基序列上存在的C端胺基酸離胺酸(lysine)經轉譯後修飾而缺少的序列，但是離胺酸(lysine)殘存的副成分及因甘胺酸(glycine)及離胺酸(lysine)皆缺少所造成的C端胺基酸醯胺(amide)化的副成分，也形成異質性存在。要維持目的物質/關聯物質的異質性的製造間差且作為醫藥品大量製造不易，關係到成本增加，希望儘可能為單一物質，在將抗體作為醫藥品開發上希望減少這些異質性。因此，在醫藥品的開發上希望不存在H鏈C端的異質性。又為了減少抗體投予量，希望延長抗體的血漿中半衰期。
此處，以製作H鏈C端的異質性減少、較huPM1-IgG1改善藥物動力、及不降低安定性而減少來自野生型IgG2的異質性的新穎恆定區為目的，導入如下述的突變。
具體地說，對於具有高安定性及與IgG2同型物恆定區抗體相關的上述異質性減少的huPM1-SKSC，發現EU編號第137位的麩胺酸(glutamic acid)改變為甘胺酸(glycine)、第138位的絲胺酸(serine)改變為甘胺酸(glycine)、第268位的組胺酸(histidine)改變為麩醯胺酸(glutamine)、第355位的精胺酸(arginine)改變為麩醯胺酸(glutamine)、第419位的麩醯胺酸(glutamine)改變為麩胺酸(glutamic acid)，再加上為了減少H鏈C端的異質性而缺少第446位的甘胺酸(glycine)及第447位的離胺酸(lysine)之huPM1-M58(序列識別號：164)。H鏈為huPM1-M58，L鏈為huPM1-L(序列識別號：162)的huPM1-M58之表現、純化如實施例4記載之方法進行。
製作的huPM1-M58及huPM1-IgG1、huPM1-IgG2的異質性以陽離子交換層析法評估，安定性評估使用DSC，分別如實施例5記載之方法實施。
DSC的結果如表18所示。又如第13及16圖所示，huPM1-M58也與huPM1-SKSC相同，在無損安定性下減少異質性。
huPM1-M58的血漿中滯留性評估
IgG分子的血漿中滯留性長(消失慢)者是因為作為IgG分子的挽救受體(salvage receptor)已知的FcRn功能(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)。經胞飲作用(pinocytosis)進入內囊胞(endosome)的IgG分子，在內囊胞內酸性條件下(pH6.0附近)，與內囊胞內表現的FcRn結合。未與FcRn結合的IgG分子進入溶酶體(lysosome)，在該處被分解，但是與FcRn結合的IgG分子移到細胞表面，在血漿中的中性條件下(pH4.0附近)，由FcRn解離，再回到血漿中。
IgG型抗體已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的同型物但是在人的血漿中半衰期為，IgG1、IgG2約36天，IgG3約29天，IgG4為16天(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.)，IgG1及IgG2的血漿中滯留性最長。一般抗體醫藥的同型物為IgG1、IgG2、IgG4，但是使這些IgG抗體的藥物動力更為提高的方法，已知以改變IgG恆定區的序列使上述對人FcRn的結合性提高的方法(J BioI Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Immunol. 2006 Janl;176(1):346-56)。
小鼠FcRn與人FcRn有種差的存在(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14)，因此為了預測改變恆定區序列的IgG抗體在人體的血漿中滯留性，考量希望對人FcRn的結合評估及評估在人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性(Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69)。
對人FcRn的結合評估
FcRn為FcRn與β2-微球蛋白(microglobulin)的複合體。依已公開的人FcRn基因序列(J. Exp. Med. 180(6),2377-2381(1994))製作寡DNA引子。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)作為模板，使用上述製作的引子經PCR法調製編碼全長基因的DNA片段。將得到的DNA片段作為模板，經PCR法增殖編碼含有訊息區域的細胞外區域(Met1-Leu290)的DNA片段，將其插入動物細胞表現載體(人FcRn胺基酸序列/序列識別號：165)。相同地，根據已公開的人β2-微球蛋白的基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26),16899-16903(2002))製作寡DNA引子。以人cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)為模板，使用上述製作的引子，經PCR法調製編碼全長基因的DNA片段。將得到的DNA片段作為模板，經PCR法增殖編碼含有訊息區域的β2-微球蛋白全長(Met1-Met119)的DNA片段，將其插入動物細胞表現載體(人β2-微球蛋白胺基酸序列/序列識別號：166)。
可溶型人FcRn的表現係使用10%胎牛血清(Invitrogen)將上述調製的人FcRn及人β2-微球蛋白的質體經脂染法(lipofection)導入來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)。所得的培養上清液經回收後，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)根據(J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.)方法純化。之後以HiTrap Q HP(GE Healthcare)純化。
對人FcRn的結合評估使用Biacore 3000，與感應晶片上固定的蛋白L或兔抗人IgGκ鏈抗體結合的抗體，作為分析物，從與人FcRn相互作用時的FcRn的結合量，計算親和性(KD)。具體地說，電泳緩衝液(running buffer)使用含有150mM NaCl的50mM Na-磷酸緩衝液，pH6.0，經胺偶合(amine coupling)法，將蛋白質L固定在感應晶片CM5(BIACORE)上。之後，以含有0.02% Tween20的電泳緩衝液(running buffer)稀釋抗體，注射，使抗體與晶片結合後，注射人FcRn，評估抗體對人FcRn的結合性。
親和性的計算使用軟體BIAevaluation。從所得的感應圖(sensergram)中求得人FcRn注射結束時對抗體的hFcRn結合量，此結合量經穩定狀態親和性(steady state affinity)法固定(fitting)，計算人FcRn對抗體的親和性。
使用huPM1-IgG1、huPM1-M58的人FcRn的人體血漿中滯留性的預測評估
huPM1-IgG1及huPM1-M58對人FcRn的結合性經BIAcore評估。如表19所示，huPM1-M58的結合性較huPM1-IgG1高約1.4倍。
人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性的評估
人FcRn轉殖基因鼠(B6. mFcRn-/-. hFcRn Tg系276+/+鼠，Jackson Laboratories)中的藥物動力的評估如以下進行。將抗體以1mg/kg的投予量靜脈內單次投予小鼠，適時採血。將採集的血液直接在4℃下以15,000rm離心15分鐘，取得血漿。分離的血漿保存在設定-20℃以下的冷凍庫中，直到進行測定時。血漿中濃度以ELISA法測定。
使用huPM1-IgG1、huPM1-M58的人FcRn轉殖基因鼠預測評估人體中的血漿中滯留性
進行huPM1-IgG1及huPM1-M58的人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性的評估。結果如第17圖所示，確認huPM1-M58較huPM1-IgG1藥物動力被改善。暗示對人FcRn的結合性與人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性相關。
[參考例10]使用Biacore的抗原抗體反應的親和性測定
使用Biacore T100(GE Healthcare BioSciene)，進行抗原抗體反應的速度論分析。在感應晶片上固定重組蛋白A(ZYMED)(以下稱蛋白質A)，此固定化的蛋白質A捕捉抗體，而且抗原作為分析物反應，測定抗體與抗原的交互作用。抗原使用調製成各種濃度的rhNR10。從測定所得的感應圖(sensergram)，計算動態參數(kinetics parameter)的結合速度係數ka(1/Ms)及解離速度係數kd(1/s)，根據此數值計算KD(M)。各參數的計算使用Biacore T100評估軟體1.1版(GE Healthcare BioSciene)。
蛋白質A在感應晶片上的固定化
經胺偶合(amine coupling)法將蛋白質A固定化於感應晶片CM5(GE Healthcare BioSciene)的所有流式細胞。電泳緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+(10mM HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05% v/v界面活性劑P20)，以流速10μL/min進行實驗。感應晶片上的羧甲基葡聚糖(carboxymethyl dextran)的羧基(carboxyl)經100μL的75mg/mL EDC(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)及11.5mg/mL NHS(N-hydroxysuccinimide)的1:1混合液活化，流入以10mM乙酸緩衝液(pH4.5)調配成50μg/mL的蛋白質A而反應。之後，流入100μL的1M的乙醇胺鹽酸鹽(pH8.5)，使未反應的活性基不活化。最後約4000-5000RU固定化。整個實驗在25℃下進行。
蛋白質A所捕捉的抗體與rhNR10的抗原抗體反應的親和性測定
電泳緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+。各抗體調配成0.25μg/mL，或與蛋白質A約100RU結合調配。作為分析物使用的rhNR10，使用HBS-EP+，調配成0、38.5、77.0、154nM，或0、19.25、77.01nM。測定方法為，首先蛋白質A捕捉抗體溶液，再以流速20μL/min，使分析物溶液反應3分鐘，之後切換成HBS-EP+5分鐘，測定解離相。解離相的測定結束後，以10mM的甘胺酸(glycine)-HCl(pH1.5)洗淨，使感應晶片再生。從獲得的感應圖(sensergram)，使用Biacore專用的數據分析軟體Biacore T100評估軟體1.1版進行速度論的分析。
 [產業上利用性]
由本發明所取得的抗NR10抗體，顯示對NR10有效的中和活性，有效作為例如炎症性疾病的治療劑。
第1圖為顯示小鼠抗體NS18、NS22、NS23、NS33的重鏈可變區的胺基酸序列之圖。
第2圖為顯示小鼠抗體NS18、NS22、NS23、NS33的輕鏈可變區的胺基酸序列之圖。
第3圖為顯示融合瘤培養上清液對hNR10/hOSMR/BaF3細胞增殖的抑制之曲線圖。
第4圖為顯示融合瘤培養上清液對cynNR10/cynOSMR/BaF3細胞增殖的抑制之曲線圖。
第5圖為顯示對嵌合體NS22的活性評估(BaF)之曲線圖。
第6圖為顯示對嵌合體NS22的活性評估(DU-145)之曲線圖。
第7圖為顯示對嵌合體NS22的IL-31競爭活性評估之曲線圖。
第8圖為顯示對抗NR10抗體的NR10結合競爭活性之曲線圖。
第9圖為顯示對人型化NS22(H0L0)的IL-31競爭活性之曲線圖。
第10圖為以陽離子交換層析法評估人型化抗NR10抗體H0L0恆定區對異質性的影響之圖。
第11圖為顯示對人型化抗NR10抗體的NR10的結合不大幅降低而可降低可變區的等電點之突變體的IL-31競爭活性評估之曲線圖。
第12圖為以陽離子交換層析法評估抗IL-6受體抗體恆定區對異質性的影響之圖。
第13圖為以DSC評估抗IL-6受體抗體恆定區對變性峰的影響之圖。
第14圖為以陽離子交換層析法評估，抗IL-6受體抗體中新的恆定區M14對異質性的影響之圖。
第15圖為以陽離子交換層析法評估，抗IL-6受體抗體中新的恆定區M58對異質性的影響之圖。
第16圖為以DSC評估，抗IL-6受體抗體中新的恆定區M58對變性峰的影響之圖。
第17圖為顯示huPM1-IgG1及huPM1-M58在人FcRn轉殖基基因鼠中的血漿中滯留性的評估結果之圖。
第18圖為顯示對各抗體的BaF/NR10之生物活性之曲線圖。
第19圖為以陽離子交換層析法分析得到的各突變抗體的熱加速品(虛線)及未加速品(實線)，比較熱加速前後的分解物生成之圖。箭頭處顯示確認變化的鹼基性成分峰位置。
第20圖為顯示對各突變體的活性評估(BaF)之曲線圖。
第21圖為顯示Ha401La402、H0L0的活性評估(BaF)之曲線圖。
第22圖為顯示H17L11、H0L0的活性評估(BaF)之曲線圖。
第23圖為顯示H19L12、H0L0的活性評估(BaF)之曲線圖。
第24圖為顯示H0L12及H0L17之BaF/NR10的生物活性之曲線圖。
第25-1圖為顯示各突變體的活性評估(BaF)之曲線圖。
第25-2圖接續第25-1圖。
第26圖為人、鼠野生型及嵌合體NR10-ECD的模式圖。
第27圖為使用西方點漬法檢測結合區域(domain)的照片。
第27A圖為顯示經由人型化抗人NR10抗體檢測的結果之照片。
第27B圖為顯示經由鼠抗人NR10抗體檢測的結果之照片。
第27C圖為顯示經由抗Myc抗體檢測的結果之照片。經抗人NR10抗體只檢出hhh、hhm、hmm的結合抗原，mmm、mmh、mhm的結合無法確認。
第28-1圖為顯示H0(序列識別號：50)的各突變體的胺基酸序列之圖。
第28-2圖接續第28-1圖。
第28-3圖接續第28-2圖。
第29-1圖為顯示L0(序列識別號：52)的各突變體的胺基酸序列之圖。
第29-2圖接續第29-1圖。

Claims (6)

  1. 一種如下列(1)~(6)任一項記載之抗體：(1)包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H28、H42)及序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L17)的抗體；(2)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H30、H44)及序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L17)的抗體；(3)包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H34、H46)及序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L17)的抗體；(4)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H57、H78)及序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L17)的抗體；(5)包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H71、H92)及序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L17)的抗體；(6)包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：199之CDR2、序列識別號：184之CDR3的重鏈可變區(H97、H98)及序列 識別號：203之記載CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3的輕鏈可變區(L50)的抗體。
  2. 一種如下列(1)~(12)任一項記載之抗體：(1)包含具有序列識別號：206之胺基酸序列的重鏈可變區(H28)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H28L17)；(2)包含具有序列識別號：207之胺基酸序列的重鏈可變區(H30)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H30L17)；(3)包含具有序列識別號：208之胺基酸序列的重鏈可變區(H34)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H34L17)；(4)包含具有序列識別號：209之胺基酸序列的重鏈可變區(H42)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H42L17)；(5)包含具有序列識別號：210之胺基酸序列的重鏈可變區(H44)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H44L17)；(6)包含具有序列識別號：211之胺基酸序列的重鏈可變區(H46)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H46L17)；(7)包含具有序列識別號：212之胺基酸序列的重鏈可變區(H57)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H57L17)； (8)包含具有序列識別號：213之胺基酸序列的重鏈可變區(H71)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H71L17)；(9)包含具有序列識別號：214之胺基酸序列的重鏈可變區(H78)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H78L17)；(10)包含具有序列識別號：215之胺基酸序列的重鏈可變區(H92)及具有序列識別號：220之胺基酸序列的輕鏈可變區(L17)的抗體(H92L17)；(11)包含具有序列識別號：216之胺基酸序列的重鏈可變區(H97)及具有序列識別號：221之胺基酸序列的輕鏈可變區(L50)的抗體(H97L50)；(12)包含具有序列識別號：217之胺基酸序列的重鏈可變區(H98)及具有序列識別號：221之胺基酸序列的輕鏈可變區(L50)的抗體(H98L50)。
  3. 一種如下列(1)~(12)任一項記載之抗體：(1)包含具有序列識別號：224之胺基酸序列的重鏈(H28)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H28L17)；(2)包含具有序列識別號：225之胺基酸序列的重鏈(H30)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H30L17)；(3)包含具有序列識別號：226之胺基酸序列的重鏈(H34)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體 (H34L17)；(4)包含具有序列識別號：227之胺基酸序列的重鏈(H42)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H42L17)；(5)包含具有序列識別號：228之胺基酸序列的重鏈(H44)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H44L17)；(6)包含具有序列識別號：229之胺基酸序列的重鏈(H46)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H46L17)；(7)包含具有序列識別號：230之胺基酸序列的重鏈(H57)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H57L17)；(8)包含具有序列識別號：231之胺基酸序列的重鏈(H71)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H71L17)；(9)包含具有序列識別號：232之胺基酸序列的重鏈(H78)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H78L17)；(10)包含具有序列識別號：233之胺基酸序列的重鏈(H92)及具有序列識別號：238之胺基酸序列的輕鏈(L17)的抗體(H92L17)；(11)包含具有序列識別號：234之胺基酸序列的重鏈(H97)及具有序列識別號：239之胺基酸序列的輕鏈(L50)的抗體 (H97L50)；(12)包含具有序列識別號：235之胺基酸序列的重鏈(H98)及具有序列識別號：239之胺基酸序列的輕鏈(L50)的抗體(H98L50)。
  4. 一種醫藥組合物，包含申請專利範圍第1-3項任一項所述之抗體。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之醫藥組合物，其為炎症性疾病治療劑。
  6. 一種申請專利範圍第1-3項任一項所述之抗體的使用，用於炎症性疾病治療劑的製造。
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