ES2708988T3

ES2708988T3 - Anticuerpos anti-IL-23p19 obtenidos por ingeniería genética

Info

Publication number: ES2708988T3
Application number: ES11172014T
Authority: ES
Inventors: Leonard G Presta; Brian M Beyer; Richard N Ingram; Peter Orth; Yan-Hui Liu
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2028-02-21
Also published as: SI2426144T1; AU2008218968B2; CN101687925A; ATE554791T1; US20130122009A1; US20100272731A1; HUS1800045I1; MX2009009079A; FR18C1051I2; HUE042172T2; JP2012135319A; HRP20120611T1; EP2059534A1; EP2426144A1; LTPA2018015I1; US9809648B2; TR201821029T4; CY1121327T1; JP6054898B2; PT2426144T

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a IL-23 humana en un epítopo que comprende los restos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106 , A107 y L110 de la SEQ ID NO: 47; en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en el que: CDRL1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 36 o una variante de la misma; CDRL2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 41 o una variante de la misma; y CDRL3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 46 o una variante de la misma; en el que cada variante comprende hasta una sustitución de aminoácido modificado de forma conservativa; y (b) un dominio variable de cadena pesada, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en el que: CDRH1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma; CDRH2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25; y CDRH3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 31 o una variante de la misma; en el que cada variante comprende hasta una sustitución de aminoácido modificado de forma conservativa.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos anti-IL-23p19 obtenidos por ingeniena genetica

La presente invencion se refiere, en lmeas generales, a anticuerpos espedficos contra interleuquina-23p19 (IL-23p19) y usos de los mismos, como se define en las reivindicaciones. Mas espedficamente, la invencion se refiere a anticuerpos humanizados como se define en las reivindicaciones que reconocen IL-23p19 humana y modulan su actividad, particularmente en trastornos inflamatorios, autoinmunitarios y proliferativos.

El sistema inmunitario funciona protegiendo a los individuos de agentes infecciosos, por ejemplo, bacterias, organismos multicelulares, y virus, asf como de canceres. Este sistema incluye varios tipos de celulas linfoides y mieloides tales como monocitos, macrofagos, celulas dendnticas (CD), eosinofilos, celulas T, celulas B, y neutrofilos. Estas celulas linfoides y mieloides a menudo producen protemas de senalizacion conocidas como citoquinas. La respuesta inmunitaria incluye inflamacion, es decir, la acumulacion de celulas inmunitarias sistemicamente o en una localizacion particular del cuerpo. En respuesta a un agente infeccioso o sustancia foranea, las celulas inmunitarias secretan citoquinas que, a su vez, modulan la proliferacion, desarrollo, diferenciacion, o migracion de las celulas inmunitarias. La respuesta inmunitaria puede producir consecuencias patologicas, por ejemplo, cuando implica inflamacion excesiva, como en los trastornos autoinmunitarios (vease, por ejemplo, Abbas y col. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim y Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian y Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson y Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).

La interleuquina-12 (IL-12) es una molecula heterodimerica compuesta por las subunidades p35 y p40. Los estudios han indicado que la IL-12 desempena una tarea cntica en la diferenciacion de linfocitos T vfrgenes en los linfocitos T CD4+ tipo 1 auxiliares que secretan IFNy. Se ha demostrado tambien que la IL-12 es esencial para respuesta inmunitarias dependientes de linfocitos T e inflamatorios in vivo. Vease, por ejemplo, Cua y col. (2003) Nature 421:744-748. El receptor de IL-12 esta compuesto por las subunidades IL-12P1 e IL-12P2.

La interleuquina-23 (IL-23) es una citoquina heterodimerica compuesta por dos subunidades, p19 que es unica para IL-23, y p40, que esta compartida con IL-12. La subunidad p19 esta estructuralmente relacionada con IL-6, el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), y la subunidad p35 de IL-12. La IL-23 media la senalizacion uniendose a un receptor heterodimerico, compuesto por IL-23R e IL-12P1, que esta compartida por el receptor de IL-12. Varios estudios previos demostraron que las consecuencias de una deficiencia genetica en p40 (raton p40 knockout; raton p40KO) eran mas graves que las encontradas en un raton p35KO. Algunos de estos resultados finalmente se explicaron por el descubrimiento de IL-23, y el hallazgo de que p40KO evita la expresion no solamente de IL-12, sino tambien de IL-23 (vease, por ejemplo, Oppmann y col. (2000) Immunity 13:715-725; Wiekowski y col. (2001) J. Immunol. 166:7563-7570; Parham y col. (2002) J. Immunol. 168:5699-708; Frucht (2002) Sci STKE 2002, E1-E3; Elkins y col. (2002) Infection Immunity 70:1936-1948).

Recientes estudios, a traves del uso de ratones p40 KO, han demostrado que el bloqueo tanto de IL-23 como de IL-12 es un tratamiento eficaz para diversos trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. Sin embargo, el bloqueo de IL-12 a traves de p40 parece tener diversas consecuencias sistemicas tales como susceptibilidad aumentada a infecciones microbianas oportunistas. Bowman y col. (2006) Curr. Opin. Infect. Dis. 19:245.

Pueden usarse anticuerpos terapeuticos para bloquear la actividad citoquina. La limitacion mas significativa en el uso de anticuerpos como agente terapeutico in vivo es la inmunogenicidad de los anticuerpos. Como la mayona de los anticuerpos monoclonales se obtienen de roedores, su uso repetido en seres humanos provoca la generacion de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo terapeutico. Dicha respuesta inmunitaria provoca una perdida de eficacia terapeutica como mmimo y una potencial respuesta anafilactica fatal como maximo. Los esfuerzos iniciales por reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos de roedores implicaron la produccion de anticuerpos quimericos, en los que se fusionaron regiones variables de raton con regiones constantes humanas. Liu y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43. Sin embargo, ratones inyectados con Idbridos de regiones variables humanas y regiones constantes de raton desarrollan una fuerte respuesta anti-anticuerpo contra la region variable humana, lo que sugiere que la retencion de la region Fv completa de roedor en dichos anticuerpos quimericos puede aun provocar una inmunogenicidad no deseada en los pacientes.

Generalmente se cree que los bucles de la region determinante de complementariedad (CDR) de los dominios variables comprenden el sitio de union de moleculas de anticuerpo. Por lo tanto, se intento el injerto de bucles CDR de roedor en regiones flanqueantes humanas (es decir, la humanizacion) para minimizar adicionalmente las secuencias de roedores. Jones y col. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen y col. (1988) Science 239:1534. Sin embargo, los intercambios de bucles CDR aun no producen de forma uniforme un anticuerpo con las mismas propiedades de union que el anticuerpo de origen. Tambien se requieren cambios en los restos flanqueantes (FR), los restos implicados en el soporte del bucle CDR, en anticuerpos humanizados para conservar la afinidad de union a antfgeno. Kabat y col. (1991) J. Immunol. 147:1709. Aunque se ha informado del uso de injertos de CDR y la conservacion de restos flanqueantes en varias construcciones de anticuerpos humanizados, es diffcil predecir si una secuencia particular producira el anticuerpo con la union deseada, y a veces las propiedades biologicas. Vease, por ejemplo, Queen y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181, y Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5. Ademas, la mayona de los estudios usaron diferentes secuencias humanas para las secuencias animales variables ligera y pesada, haciendo que fuera cuestionable la naturaleza predictiva de dichos estudios. Se han usado secuencias de anticuerpos conocidos o, mas tipicamente, aquellas de anticuerpos que tienen estructuras conocidas de rayos X, anticuerpos NEW y KOL. Vease, por ejemplo, Jones y col., supra; Verhoeyen y col., supra; y Gorman y col., supra. Se ha informado de la informacion de secuencia exacta para unas pocas construcciones humanizadas. Se describen anticuerpos disenados por ingeniena genetica ejemplares contra IL-23p19 en las solicitudes de patente provisional de Estados Unidos de cesion comun N° 60/891.409 y 60/891.413 transferidas legalmente (ambas presentadas el 23 de febrero de 2007), en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2007/0009526 y 2007/0048315, y en las publicaciones de patente internacional N° WO 2007/076524, WO 2007/024846 y WO 2007/147019.

Existe la necesidad de anticuerpos anti-huIL-23p19 para su uso, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios, y proliferativos. Preferiblemente, dichos anticuerpos se disenan por ingeniena genetica para introducir secuencias humanas de la lmea germinal para reducir la inmunogenicidad en sujetos humanos, por ejemplo, en las regiones flanqueantes. Preferiblemente, dichos anticuerpos tendran elevada afinidad por huIL-23p19 y se uniran con elevada especificidad a huIL-23p19. Little, M. y col., Immunology Today, Vol. 21(8), 1 de agosto de 2000, paginas 364-370, describen un hibridoma y anticuerpos recombinantes. El documento WO 2007/027714 (publicado el 8 de marzo de 2007) describe anticuerpos disenados por ingeniena genetica anti-IL-23. Glenn E. Morris, The Protein Protocols Handbook, 1 de enero de 1996, paginas 595-600, describe el mapeo epitopico de antfgenos proteicos por ELISA de competicion. Rudikoff S. y col., PNAS, Vol. 79(6), 1 de marzo de 1982, paginas 1979-1983, describe una sustitucion unica de aminoacido que altera la especificidad de union al antfgeno.

La presente invencion es como se define en las reivindicaciones. La divulgacion proporciona compuestos de union, tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos recombinantes humanizados o quimericos, que se unen a IL-23p19 humana, que comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que tiene al menos una, dos o tres CDR seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32-46. En una realizacion, el compuesto de union de la presente divulgacion comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos un CDRL1 seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32-36; al menos un CDRL2 seleccionado entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 37-41; y al menos un CDRL3 seleccionado entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 42-46.

En una realizacion de la divulgacion, el compuesto de union comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que tiene al menos una, dos o tres CDR seleccionadas entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 15-31. En una realizacion, el compuesto de union de la presente divulgacion comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos un CDRH1 seleccionado entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 15-19; al menos un CDRH2 seleccionado entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 20-26; y al menos un CDRH3 seleccionado entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 27-31.

En otras realizaciones, el compuesto de union de la presente divulgacion comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, o los fragmentos de union a antfgeno de los mismos, descritos en los dos parrafos precedentes.

En algunas realizaciones, el compuesto de union comprende una region flanqueante, en la que la secuencia de aminoacidos de la region flanqueante es toda o sustancialmente toda la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana.

En algunas realizaciones, los dominios variables de cadena ligera y/o cadena pesada comprenden una variante de una o mas de las CDR como se define en las reivindicaciones. En diversas realizaciones, el dominio variante comprende hasta 1 resto aminoaddico modificado de forma conservativa con relacion a la secuencia de los respectivos numeros de SEC ID. Las sustituciones conservativas de aminoacidos se proporcionan en la Tabla 1.

En algunas realizaciones de la divulgacion, el dominio variable de cadena ligera comprende los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 14 o una variante del mismo. En algunas realizaciones de la divulgacion, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por los restos 1-116 de las SEQ ID NO: 6-8, tales como la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En diversas realizaciones de la divulgacion, el dominio variable variante comprende hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 o mas restos aminoaddicos modificados de forma conservativa con relacion a la secuencia de las respectivas SEQ ID NO. En otra realizacion adicional de la divulgacion, el compuesto de union comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, o los fragmentos de union a antfgeno de los mismos, descritos en este parrafo.

En una realizacion de la divulgacion, el compuesto de union comprende una secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y/o un secuencia de cadena pesada seleccionada entre el grupo compuesto por las SEQ ID NO: 6-8.

En otras realizaciones, el compuesto de union de la presente divulgacion comprende un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que consiste esencialmente en los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 14, y/o un dominio variable de cadena pesada, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por los restos 1-116 de las SEQ ID NO: 6-8, tal como la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En otras realizaciones, el compuesto de union de la presente divulgacion comprende un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que tiene al menos un 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homologfa de secuencia con los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 14, y/o un dominio variable de cadena pesada, o un fragmento de union a antigeno del mismo, que tiene al menos un 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homologfa de secuencia con una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por los restos 1-116 de la SEQ ID NO: 6-8, tal como la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En una realizacion desvelada en el presente documento, el compuesto de union se une a IL-23p19 humana (SEQ ID NO: 47) en un epftopo que comprende los restos 20-30, o los restos 82-110, o ambos. En otra realizacion de la divulgacion, el compuesto de union a IL-23p19 se une a un epftopo que comprende algunos o todos los restos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 y L110, y opcionalmente los restos L24, L85, T91, S100 y V102. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de la invencion, como se define en las reivindicaciones, se une a IL-23 humana en un epftopo que comprende los restos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 y L110 de la SEQ ID NO: 47. En diversas realizaciones, el epftopo para un anticuerpo de interes se determina obteniendo una estructura cristalina de rayos X de un complejo anticuerpo:antfgeno y determinando cuales de los restos en IL-23p19 estan dentro de una distancia especificada de restos en el anticuerpo de interes, en el que la distancia especificada es, por ejemplo, 4 A o 5 A. En algunas realizaciones de la divulgacion, el epftopo se define como un tramo de 11 o mas restos aminoaddicos contiguos a lo largo de la secuencia de IL-23p19 en la que al menos el 30 %, 40 %, 45 %, 50 % o 54 % de los restos estan dentro de la distancia especificada del anticuerpo.

En una realizacion, la divulgacion se refiere a anticuerpos que son capaces de bloquear la union de un compuesto de union de la presente invencion a IL-23 humana en un ensayo de bloqueo cruzado. En otra realizacion, la divulgacion se refiere a compuestos de union que son capaces de bloquear la actividad mediada por IL-23, incluyendo dichas actividades, aunque sin limitacion, la union a su receptor y la promocion de la proliferacion o supervivencia de celulas Th17.

En algunas realizaciones, el compuesto de union de la presente invencion comprende adicionalmente una region constante de cadena pesada, en la que la region constante de cadena pesada comprende una region constante de cadena pesada humana y1, y2, y3, o y4 o una variante de la misma. En diversas realizaciones, la region constante de cadena ligera comprende una region constante de cadena ligera humana lambda o kappa.

En diversas realizaciones, los compuestos de union de la presente invencion son anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos, humanizados o completamente humanos o un fragmento de los mismos. La presente invencion tambien contempla que el fragmento de union a antfgeno sea un fragmento de anticuerpo seleccionado entre el grupo compuesto por, por ejemplo, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.

La presente divulgacion abarca un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria en un sujeto humano que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo (o un fragmento de union a antfgeno del mismo) espedfico para IL-23 en una cantidad suficiente para bloquear la actividad biologica de IL-23. En algunas realizaciones, el anticuerpo espedfico para IL-23 es el anticuerpo humanizado o quimerico. En realizaciones adicionales, la respuesta inmunitaria es una respuesta inflamatoria, incluyendo artritis, psoriasis, y enfermedad inflamatoria del intestino. En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria es una respuesta autoinmunitaria, incluyendo esclerosis, uveftis, lupus sistemico eritematoso y diabetes. En otra realizacion, el sujeto tiene cancer y la respuesta inmunitaria es una respuesta Th17. En una realizacion, la invencion proporciona el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo como se define en las reivindicaciones para su uso en la supresion de una respuesta inmunitaria en un sujeto humano, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inflamatoria o una respuesta autoinmunitaria; tal como para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, diabetes y cancer.

La presente divulgacion tambien contempla administrar un agente inmunosupresor o anti-inflamatorio adicional. Los compuestos de union de la presente divulgacion pueden estar en una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de union, o fragmento de union a antfgeno del mismo, en combinacion con un vetftculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una realizacion adicional de la divulgacion, la composicion farmaceutica comprende adicionalmente un agente inmunosupresor o anti-inflamatorio.

La presente divulgacion abarca un acido nucleico aislado que codifica la secuencia polipeptfdica de una realizacion de anticuerpo del compuesto de union de la presente invencion. El acido nucleico puede estar en un vector de expresion unido de forma funcional a secuencias de control reconocidas por una celula hospedadora transfectada con el vector. Tambien se abarca una celula hospedadora que comprende el vector, y un procedimiento para producir un polipeptido, que comprende cultivar la celula hospedadora en condiciones en las que la secuencia de acido nucleico se expresa, produciendo de este modo el polipeptido, y recuperar el polipeptido de la celula hospedadora o el medio.

En diversas realizaciones, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento de trastornos incluyendo, aunque sin limitacion, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, cancer, enfermedad infecciosa (por ejemplo, infeccion bacteriana, micobacteriana, vftica o fungica, incluyendo infecciones cronicas), artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, uveftis, lupus sistemico eritematoso y diabetes.

En otras realizaciones, la divulgacion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto de union como se desvela en el presente documento para tratar trastornos incluyendo, aunque sin limitacion, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, cancer, enfermedad infecciosa (por ejemplo, infeccion bacteriana, micobacteriana, vmca o fungica, incluyendo infecciones cronicas), artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, uveftis, lupus sistemico eritematoso y diabetes.

En algunas realizaciones, el compuesto de union o composicion farmaceutica de la presente divulgacion, induce un periodo prolongado de remision de los smtomas de enfermedad en un sujeto, de modo que puede ampliarse el intervalo de dosificacion a mucho mas de la semi-vida del compuesto de union en el sujeto, por ejemplo en el tratamiento de una enfermedad remitente-recurrente. En diversas realizaciones, el intervalo entre una administracion y otra es de 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 30 semanas o mas. En otras realizaciones, una unica administracion es suficiente para evitar recidivas permanentemente.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra comparaciones de las secuencias clonales de raton del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-IL-23p19 humana. Se proporcionan las secuencias para los clones m1A11, m11C1, m5F5, m21D1, m13B8, h13B8a, h13B8b y h13B8c. Las CDR estan indicadas. En ambas figuras, un prefijo "m" indica un anticuerpo murino y una "h" indica un anticuerpo humanizado. Los sufijos "a", "b" y "c" se refieren a variantes de secuencia del dominio variable de cadena pesada 13B8 humanizado, como se analiza a continuacion en mayor detalle.

La Figura 2 muestra comparaciones de secuencias clonales de raton del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-IL-23p19 humana. Se proporcionan las secuencias para los clones m1A11, m11C1, m5F5, m21D1, m13B8, h13B8. Las CDR estan indicadas.

Descripcion detallada

Como se usa en este documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una", y "el", "la", incluyen sus correspondientes referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. La siguiente Tabla 7 proporciona una lista de identificadores de secuencia usados en esta solicitud. La citacion de las referencias en este documento no se entiende como una admision de que algo de lo anterior es tecnica previa pertinente, ni constituye ninguna admision en cuanto a los contenidos o fecha de estas publicaciones o documentos.

I. Definiciones

"Actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesaria para, o que esta espedficamente asociada con, por ejemplo, la division celular normal, asf como cancer, tumores, displasia, transformacion celular, metastasis, y angiogenesis.

"Administracion" y "tratamiento", aplicado a un animal, ser humano, sujeto experimental, celula, tejido, organo, o fluido biologico, se refiere al contacto de un agente exogeno farmaceutico, terapeutico, de diagnostico, o composicion con el animal, ser humano, sujeto, celula, tejido, organo, o fluido biologico. "Administracion" y "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a procedimientos terapeuticos, farmacocineticos, de diagnostico, de investigacion, y experimentales. El tratamiento de una celula abarca el contacto de un reactivo con la celula, asf como el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido esta en contacto con la celula. "Administracion" y "tratamiento" tambien significan tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una celula, mediante una composicion reactiva, de diagnostico, de union, o por otra celula. "Tratamiento", aplicado a un ser humano, sujeto veterinario, o de investigacion, se refiere a tratamiento terapeutico, profilactico o medidas preventivas, para aplicaciones de investigacion y de diagnostico. "Tratamiento" aplicado a un ser humano, sujeto veterinario, o de investigacion, o celula, tejido, u organo, abarca el contacto de un agente con un sujeto animal, una celula, tejido, compartimiento fisiologico, o fluido fisiologico. "El tratamiento de un celula" tambien abarca situaciones en las que el agente contacta con el receptor de IL-23 (heterodfmero IL-23R/IL-12Rbeta1), por ejemplo, en la fase fluida o fase coloidal, pero tambien situaciones en las que el agonista o antagonista no contacta con la celula o el receptor.

Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que muestre la actividad biologica deseada. Por tanto, se usa en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos), anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, etc. siempre que muestren la actividad biologica deseada.

Como se usa en este documento, los terminos "fragmento de union a IL-23p19", "fragmento de union del mismo' o "fragmento de union a antigeno del mismo' abarcan un fragmento o un derivado de un anticuerpo que aun retiene sustancialmente su actividad biologica de inhibir la actividad de IL-23p19. Por lo tanto, el termino "fragmento de anticuerpo" o fragmento de union a IL-23p19 se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region variable o de union a antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, sc-Fv; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Tfpicamente, un fragmento de union o derivado retiene al menos el 10% de su actividad inhibidora de IL-23p19. Preferiblemente, un fragmento de union o derivado retiene al menos el 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o mas) de su actividad inhibidora de IL-23p19, aunque sera util cualquier fragmento de union con suficiente afinidad para ejercer el efecto biologico deseado. Tambien se pretende que un fragmento de union a IL-23p19 pueda incluir variantes que tienen sustituciones conservativas de aminoacidos que no alteran sustancialmente su actividad biologica.

El termino "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto para posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos contra un unico epttopo antigenico. En contraste, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) tfpicamente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o espedficos para) diferentes epftopos. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe entenderse como que requiere produccion del anticuerpo mediante ningun procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invencion pueden prepararse por el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256: 495, o pueden prepararse por procedimientos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse de bibliotecas magicas de anticuerpos usando las tecnicas descritas en Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de este documento incluyen espedficamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada. Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional que contiene solamente la region variable de una cadena pesada o la region variable de una cadena ligera. En algunos casos, se unen covalentemente dos o mas regiones Vh con un enlazador peptfdico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente puede estar dirigido a los mismos o a diferentes antfgenos.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de union a antfgeno. En algunos casos, los dos sitios de union tienen las mismas especificidades de antfgeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespedficos (vease a continuacion).

Como se usa en este documento, el termino anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una cadena polipeptfdica sencilla. Generalmente, el polipeptido Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptfdico entre los dominios Vh y Vl, que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la union al antfgeno. Para una revision de sFv, vease Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pag. 269-315.

Los anticuerpos monoclonales de este documento tambien incluyen anticuerpos camelidos de dominio sencillo. Vease, por ejemplo, Muyldermans y col. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann y col. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; documento WO 94/04678; documento WO 94/25591; patente de Estados Unidos N° 6.005.079. En una realizacion, la presente divulgacion proporciona anticuerpos de dominio sencillo que comprende dos dominios Vh con modificaciones de modo que se formen anticuerpos de dominio sencillo.

Como se usa en este documento, el termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union a antfgeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptfdica (Vh-Vl o Vl-Vh). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de union a antfgeno. Los diacuerpos se describen mas completamente en, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revision de variantes de anticuerpo disenadas por ingeniena genetica, vease en lmeas generales Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol.

23:1126-1136.

Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) as ^ como anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos contienen la secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todo de al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. El prefijo "hum", "hu" o "h" se anade a las denominaciones del clon de anticuerpo cuando es necesario distinguir los anticuerpos humanizados (por ejemplo, hum13B8) de los anticuerpos parentales de roedor (por ejemplo, 13B8 de raton, o m13B8). Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor generalmente comprenderan las mismas secuencias CDR de los anticuerpos parentales de roedor, aunque pueden incluirse ciertas sustituciones de aminoacidos para aumentar la afinidad, aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado, o por otras razones.

Los anticuerpos de la presente invencion tambien incluyen anticuerpos con regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.624.821; el documento WO2003/086310; el documento WO2005/120571; el documento WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Dicha modificacion puede usarse para potenciar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en diagnosis y terapia. Las alteraciones de la region Fc incluyen cambios de aminoacidos (sustituciones, detenciones e inserciones), glucosilacion o desglucosilacion, y anadir multiples Fc. Los cambios al Fc tambien pueden alterar la semi-vida de los anticuerpos en anticuerpos terapeuticos, y una semi-vida mas larga provocana una dosificacion menos frecuente, con la concomitante comodidad aumentada y uso disminuido de material. Vease, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 a 734-35.

El termino "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que comprende solamente secuencias de la protema inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas murinas de carbohidrato si se producen en un raton, en una celula de raton, o en un hibridoma derivado de una celula de raton. Asimismo, "anticuerpo de raton" se refiere a un anticuerpo que comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de raton. Un anticuerpo completamente humano puede generarse en un ser humano, en un animal transgenico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana de la lmea germinal, por presentacion en fagos u otros procedimientos de biologfa molecular.

Como se usa en este documento, el termino "region hipervariable" se refiere a los restos aminoaddicos de un anticuerpo que son responsables de la union al antfgeno. La region hipervariable comprende los restos aminoaddicos de una "region determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena ligera y los restos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada (Kabat y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (Chotia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)). Como se usa en este documento, el termino restos "flanqueantes" o "FR" se refiere a aquellos restos del dominio variable diferentes a los restos de la region hipervariable definidos en este documento como restos CDR. La numeracion de restos anterior se refiere al sistema de numeracion de Kabat y no corresponde necesariamente en detalle a la numeracion de secuencia en la lista de secuencias adjunta.

"Compuesto de union" se refiere a una molecula, molecula pequena, macromolecula, polipeptido, anticuerpo o fragmento o analogo del mismo, o receptor soluble, capaz de unirse a una diana. "Compuesto de union" tambien puede referirse a un complejo de moleculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molecula ionizada, y a una molecula modificada covalente o no covalentemente, por ejemplo, modificada por fosforilacion, acilacion, reticulacion, ciclacion, o escision limitada, que es capaz de unirse a una diana. Cuando se usa con referencia a anticuerpos, el termino "compuesto de union" se refiere tanto a anticuerpos como a fragmentos de union a antfgeno de los mismos. "Union" se refiere a una asociacion de la composicion de union con una diana, donde la asociacion provoca la reduccion en el movimiento browniano normal de la composicion de union, en casos en los que la composicion de union puede disolverse o suspenderse en solucion. "Composicion de union" se refiere a una molecula, por ejemplo, un compuesto de union, en combinacion con un estabilizador, excipiente, sal, tampon, disolvente, o aditivo, capaz de unirse a una diana.

"Variantes modificadas de forma conservativa" o "sustitucion conservativa" se refiere a sustituciones de aminoacidos conocidas para los especialistas en esta tecnica y que pueden hacerse generalmente sin alterar la actividad biologica de la molecula resultante, incluso en regiones esenciales del polipeptido. Dichas sustituciones ejemplares se hacen preferiblemente de acuerdo con las expuestas en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Ademas, los especialistas en esta tecnica reconocen que, en general, sustituciones individuals de aminoacidos en regiones no esenciales de un polipeptido no alteran sustancialmente la actividad biologica. Vease, por ejemplo, Watson y col. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pag. 224 (4a Edicion).

La expresion "consiste esencialmente en", o variaciones tales como "consisten esencialmente en' o "que consiste esencialmente en", como se usa en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, indica la inclusion de cualquier elemento o grupo de elementos indicados, y la inclusion opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente a la de los elementos indicados, que no cambia de forma material las propiedades basicas o nuevas del regimen de dosificacion especificado, procedimiento, o composicion. Como ejemplo no limitante, un compuesto de union que consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos indicada tambien puede incluir uno o mas aminoacidos, incluyendo sustituciones de uno o mas restos aminoaddicos, que no afectan de forma material a las propiedades del compuesto de union.

"Cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un smtoma o signo de la afeccion medica. Cantidad eficaz tambien significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar la diagnosis. Una cantidad eficaz para un paciente o sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la afeccion que se esta tratando, la salud global del paciente, el procedimiento, via y dosis de administracion y la gravedad de los efectos secundarios. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.888.530. Una cantidad eficaz puede ser la dosis maxima o el protocolo de dosificacion que evite los efectos secundarios o efectos toxicos significativos. El efecto provocara una mejora de una medicion o parametro de diagnostico en al menos un 5 %, habitualmente en al menos el 10 %, mas habitualmente al menos el 20 %, mucho mas habitualmente al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 40 %, mas preferiblemente al menos el 50 %, mucho mas preferiblemente al menos el 60 %, idealmente al menos el 70 %, mas idealmente al menos el 80 %, y mucho mas idealmente al menos el 90 %, donde el 100 % se define como el parametro de diagnostico mostrado por un sujeto normal. Vease, por ejemplo, Maynard y col. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU.

"Afeccion inmunitaria" o "trastorno inmunitario" abarca, por ejemplo, inflamacion patologica, un trastorno inflamatorio, y un trastorno o enfermedad autoinmunitaria. "Afeccion inmunitaria" tambien se refiere a infecciones, infecciones persistentes, y afecciones proliferativas, tales como cancer, tumores, y angiogenesis, incluyendo infecciones, tumores, y canceres que resisten a su erradicacion por el sistema inmunitario. "Afeccion cancerosa" incluye, por ejemplo, cancer, celulas cancerosas, tumores, angiogenesis, y afecciones precancerosas tales como displasia.

"Trastorno inflamatorio" significa un trastorno o afeccion patologica en que la patologfa esta provocada, en conjunto o en parte, por, por ejemplo, un cambio en la cantidad, un cambio en la velocidad de migracion, o un cambio en la activacion, de celulas del sistema inmunitario. Las celulas del sistema inmunitario incluyen, por ejemplo, celulas T, celulas B, monocitos o macrofagos, celulas presentadoras de antfgeno (APC), celulas dendnticas, microglia, celulas NK, celulas NKT, neutrofilos, eosinofilos, mastocitos, o cualquier otra celula asociada espedficamente con la inmunologfa, por ejemplo, celulas endoteliales o epiteliales productoras de citoquinas.

Una "celula productora de IL-17" significa un linfocito T que no es un linfocito T tipo TH1 clasico o linfocito T tipo TH2 clasica, conocida como celulas Th17. Las celulas Th17 se analizan en mayor detalle en Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato y O'Shea (2006) Nature 441:166-168; Iwakura e Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218 1222. "Celula productora de IL-17" tambien significa un linfocito T que expresa un gen o polipeptido de la Tabla 10B de la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2004/0219150 (por ejemplo, protema P sensible a mitogenos; quimioquina ligando 2; interleuquina-17 (IL-17); factor de transcripcion relacionado con RAR; y/o supresor 3 de la senalizacion de citoquinas), donde la expresion con tratamiento por un agonista de IL-23 es mayor que con tratamiento con un agonista de IL-12, donde "mayor que" se define a continuacion. La expresion con un agonista de IL-23 es habitualmente al menos 5 veces mayor, tfpicamente al menos 10 veces mayor, mas tfpicamente al menos 15 veces mayor, mucho mas tfpicamente al menos 20 veces mayor, preferiblemente al menos 25 veces mayor, y mucho mas preferiblemente al menos 30 veces mayor, que con tratamiento con IL-12. La expresion puede medirse, por ejemplo, con tratamiento de una poblacion sustancialmente pura de celulas productoras de IL-17. Una respuesta Th17 es una respuesta inmunitaria en que esta potenciada la actividad y/o proliferacion de linfocitos Th17, tfpicamente acoplada con una respuesta Th1 reprimida.

Ademas, "celula productora de IL-17" incluye una celula progenitora o precursora que esta comprometida, en una via de desarrollo celular o diferenciacion celular, a diferenciarse en una celula productora de IL-17, como se ha definido anteriormente. Una celula progenitora o precursora a la celula productora de IL-17 puede encontrarse en un ganglio linfatico de drenaje (GLD). Ademas, "celula productora de IL-17" abarca una celula productora de IL-17, como se ha definido anteriormente, que, por ejemplo, se ha activado, por ejemplo, mediante un ester de forbol, ionoforo, y/o carcinogeno, se ha diferenciado adicionalmente, almacenado, congelado, desecado, inactivado, parcialmente degradado, por ejemplo, por apoptosis, proteolisis, u oxidacion lipfdica, o modificado, por ejemplo, por tecnologfa recombinante.

Como se usa en este documento, el termino "molecula de acido nucleico aislada" se refiere a una molecula de acido nucleico que esta identificada y separada de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que esta habitualmente asociada en la fuente natural del acido nucleico del anticuerpo. Una molecula de acido nucleico aislada es diferente en la forma o entorno en que se encuentra en la naturaleza. Las moleculas de acido nucleico aisladas, por lo tanto, se distinguen de la molecula de acido nucleico que existe en celulas naturales. Sin embargo, una molecula de acido nucleico aislada incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que expresan habitualmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molecula de acido nucleico esta en una localizacion cromosomica diferente de la de celulas naturales.

La expresion "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de union al ribosoma. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, senales de poliadenilacion, y potenciadores.

Un acido nucleico esta "unido de forma funcional" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o lfder de secrecion esta unido de forma funcional al ADN para un polipeptido si se expresa como una preprotema que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta unido de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta unido de forma funcional a una secuencia codificante si esta situado de modo que facilite la traduccion. Generalmente, "unido de forma funcional" significa que las secuencias de ADN que se estan uniendo son contiguas y, en el caso de un lfder de secrecion, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La union se consigue por ligamiento en sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotfdicos sinteticos de acuerdo con la practica convencional.

Como se usa en este documento, las expresiones "celula", "lmea celular", y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable y todas estas denominaciones incluyen descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "celulas transformadas" incluyen la celula objeto primaria y cultivos derivados a partir de la misma independientemente de la cantidad de transferencias. Tambien se entiende que toda la descendencia puede no ser identica de forma precisa en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la descendencia mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica determinada en la celula originalmente transformada. Cuando se pretendan denominaciones distintas, quedara claro a partir del contexto.

Como se usa en este documento, "reaccion en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o tecnica en que cantidades insignificantes de un trozo espedfico de acido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.683.195. Generalmente, tiene que estar disponible la informacion de secuencia desde los extremos de la region de interes o mas alla, de modo que pueden disenarse cebadores oligonucleotidicos; estos cebadores seran identicos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleotidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias espedficas de ARN, secuencias espedficas de ADN de un ADN genomico total, y ADNc transcrito a partir de un ARN celular total, secuencias bacteriofagas o plasirndicas, etc. Vease, en lmeas generales, Mullis y col. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como se usa en este documento, se considera que la PCR es un ejemplo, aunque no el unico, de un procedimiento de reaccion de la polimerasa del acido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de acido nucleico que comprende el uso de un acido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de acido nucleico para amplificar o generar una parte espedfica de acido nucleico.

Como se usa en este documento, el termino "secuencia de la lmea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas, incluyendo secuencias de la lmea germinal de roedores (por ejemplo, raton) y humana. Puede usarse cualquier fuente adecuada de ADN de inmunoglobulina no reordenado. Las secuencias humanas de la lmea germinal pueden obtenerse, por ejemplo, de las bases de datos de lmea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del United States National Institutes of Health. Las secuencias de raton de la lmea germinal pueden obtenerse, por ejemplo, como se describe en Giudicelli y col. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Para examinar el grado de inhibicion de la actividad IL-23, por ejemplo, se tratan muestras o ensayos que comprenden, por ejemplo, una protema, gen, celula, u organismo dado, con un agente activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras de control sin el agente. A las muestras de control, es decir, no tratadas con agente, se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. La inhibicion se consigue cuando la el valor de actividad relativo al control es de aproximadamente el 90 % o menos, tfpicamente del 85 % o menos, mas tfpicamente del 80 % o menos, mucho mas tfpicamente del 75 % o menos, generalmente del 70 % o menos, mas generalmente del 65 % o menos, mucho mas generalmente del 60 % o menos, tfpicamente del 55 % o menos, habitualmente del 50 % o menos, mas habitualmente del 45 % o menos, mucho mas habitualmente del 40 % o menos, preferiblemente del 35 % o menos, mas preferiblemente del 30 % o menos, aun mas preferiblemente del 25 % o menos, y mucho mas preferiblemente menor del 25 %. La activacion se consigue cuando el valor de actividad relativo al control es de aproximadamente el 110%, generalmente de al menos el 120%, mas generalmente de al menos el 140%, mas generalmente de al menos el 160 %, a menudo de al menos el 180 %, mas a menudo de al menos 2 veces, mucho mas a menudo de al menos 2,5 veces, habitualmente de al menos 5 veces, mas habitualmente de al menos 10 veces, preferiblemente de al menos 20 veces, mas preferiblemente de al menos 40 veces, y mucho mas preferiblemente mas de 40 veces mayor.

Los criterios de valoracion en activacion o inhibicion pueden controlarse del siguiente modo. La activacion, inhibicion, y respuesta al tratamiento, por ejemplo, de una celula, fluido fisiologico, tejido, organo, y sujeto animal o humano, puede controlarse por un criterio de valoracion. El criterio de valoracion puede comprender una cantidad o porcentaje predeterminado de, por ejemplo, un indicio de inflamacion, oncogenicidad, o desgranulacion o secrecion celular, tal como la liberacion de una citoquina, oxfgeno toxico, o una proteasa. El criterio de valoracion puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte de iones; migracion celular; adhesion celular; proliferacion celular; potencial de metastasis; diferenciacion celular; y cambio en el fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresion de genes relacionados con la inflamacion, apoptosis, transformacion, ciclo celular, o metastasis (vease, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme y col. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins y Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, y col. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

Un criterio de valoracion de inhibicion es generalmente un 75 % del control o menos, preferiblemente un 50 % del control o menos, mas preferiblemente un 25 % del control o menos, y mucho mas preferiblemente un 10 % del control o menos. Generalmente, un criterio de valoracion de activacion es al menos un 150% del control, preferiblemente al menos dos veces el control, mas preferiblemente al menos cuatro veces el control, y mucho mas preferiblemente al menos 10 veces el control.

"Molecula pequena" se define como una molecula con un peso molecular que es de menos de 10 kDa, tipicamente de menos de 2 kDa, y preferiblemente de menos de 1 kDa. Las moleculas pequenas incluyen, aunque sin limitacion, moleculas inorganicas, moleculas organicas, moleculas organicas que contienen un componente inorganico, moleculas que comprenden un atomo radiactivo, moleculas sinteticas, mimeticos de peptidos, y mimeticos de anticuerpos. Como agente terapeutico, una molecula pequena puede ser menos permeable para las celulas, menos susceptible a la degradacion, y menos apta para provocar una respuesta inmunitaria que moleculas grandes. Se describen moleculas pequenas, tales como mimeticos peptfdicos de anticuerpos y citoquinas, asf como toxinas de molecula pequena. Vease, por ejemplo, Casset y col. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos y col. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini y col. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues y col. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Sone (2003) Biochem. J. 371: 603-608; patente de Estados Unidos N° 6.326.482.

Se une "espedficamente" o "selectivamente", cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antfgeno, u otro par de union, indica una reaccion de union que es determinante de la presencia de la protema en una poblacion heterogenea de protemas y otros agente biologicos. Por tanto, en condiciones designadas, un ligando espedfico se une a un receptor particular y no se une en un grado significativo a otras protemas presentes en la muestra. Como se usa en este documento, se dice que un anticuerpo se une espedficamente a un polipeptido que comprende una secuencia dada (en este caso IL-23p19) si se une a polipeptidos que comprenden la secuencia de IL-23p19 pero no se une a protemas que carecen de la secuencia de IL-23p19. Por ejemplo, un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido que comprende IL-23p19 puede unirse a una forma marcada con FLAG® de IL-23p19 pero no se unira a otras protemas marcadas con FLAG®.

El anticuerpo, o composicion de union derivada del sitio de union a antfgeno de un anticuerpo, del procedimiento contemplado, se une a su antfgeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferiblemente al menos diez veces mayor, mas preferiblemente al menos 20 veces mayor, y mucho mas preferiblemente al menos 100 veces mayor que la afinidad con antfgenos no relacionados. En una realizacion preferida, el anticuerpo tendra una afinidad que es mayor de aproximadamente 109 litros/mol, determinada, por ejemplo, por analisis de Scatchard. Munsen y col. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

Como se usa en este documento, el termino "agente inmunomodulador" se refiere a agentes naturales o sinteticos que suprimen o modulan una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta humoral o celular. Los agentes inmunomoduladores abarcan agentes inmunosupresores o anti-inflamatorios.

"Agentes inmunosupresores", "farmacos inmunosupresores", o "inmunosupresores" como se usan en este documento son agentes terapeuticos que se usan en terapia inmunosupresora para inhibir o evitar la actividad del sistema inmunitario. Clfnicamente se usan para prevenir el rechazo de organos y tejidos trasplantados (por ejemplo, medula osea, corazon, rinon, tugado), y/o en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o enfermedades que son muy probablemente de origen autoinmunitario (por ejemplo, artritis reumatoide, miastenia grave, lupus sistemico eritematoso, colitis ulcerosa, esclerosis multiple). Los farmacos inmunosupresores pueden clasificarse en cuatro grupos: glucocorticoides citostaticos; anticuerpos (incluyendo modificadores de respuesta biologica o DMARD); farmacos que actuan sobre inmunofilinas; otros farmacos, incluyendo agentes quimioterapeuticos conocidos usados en el tratamiento de trastornos proliferativos. Para esclerosis multiple, en particular, los anticuerpos de la presente invencion pueden administrarse junto con una nueva clase de agentes terapeuticos tipo protema de union a mielina, conocidos como copaxones.

"Agentes anti-inflamatorios" o "farmacos anti-inflamatorios", se usan para representar agentes terapeuticos tanto esteroideos como no esteroideos. Los esteroides, tambien conocidos como corticosteroides, son farmacos que se parecen mucho al cortisol, una hormona producida de forma natural por las glandulas suprarrenales. Los esteroides se usan como tratamiento principal para ciertas afecciones inflamatorias, tales como: vasculitis sistemica (inflamacion de los vasos sangumeos); y miositis (inflamacion del musculo). Los esteroides tambien podnan usarse selectivamente para tratar afecciones inflamatorias tales como: artritis reumatoide (artritis inflamatoria cronica en articulaciones en ambos lados del cuerpo); lupus sistemico eritematoso (una enfermedad generalizada causada por una funcion anormal del sistema inmunitario); smdrome de Sjogren (trastorno cronico que causa sequedad ocular y sequedad en la boca).

Los farmacos anti-inflamatorios no esteroideos, habitualmente abreviados como AINE, son farmacos con afectos analgesicos, antipireticos y anti-inflamatorios - reducen el dolor, la fiebre y la inflamacion. El termino "no esteroideo" se usa para distinguir estos farmacos de los esteroides, que (entre una amplia gama de otros efectos) tienen una accion anti-inflamatoria de depresion eicosanoide similar. Los AINE estan generalmente indicados para el alivio sintomatico de las siguientes afecciones: artritis reumatoide; osteoartritis; artropatfas inflamatorias (por ejemplo, espondilitis anquilosante, artritis psoriasica, smdrome de Reiter); gota aguda; dismenorrea; dolor oseo metastasico; cefalea y migrana; dolor postoperatorio; dolor de leve a moderado debido a inflamacion y lesion tisular; pirexia; y colico renal. Los AINE incluyen salicilatos, acido arilalcanoicos, acidos 2-arilpropionicos (profenos), acidos N-arilantramlicos (acidos fenamicos), oxicams, coxibs, y sulfonanilidas.

II. General

La presente invencion proporciona anticuerpos anti-IL-23 disenados por ingeniena genetica como se define en las reivindicaciones y usos de los mismos para tratar trastornos inflamatorios, autoinmunitarios, y proliferativos como se define en las reivindicaciones.

Varias citoquinas tienen una tarea en la patologfa o reparacion de trastornos neurologicos. La IL-6, la IL-17, el interferon-gamma (IFNgamma, IFN-y), y el factor estimulador de colonias de granulocitos (GM-CSF) se han asociado con la esclerosis multiple. Matusevicius y col. (1999) Multiple Sclerosis 5:101-104; Lock y col. (2002) Nature Med.

8:500-508. La IL-1alfa, la IL-1beta, y el factor de crecimiento transformante-beta 1 (TGF-beta1) desempenan una tarea en la ALS, la enfermedad de Parkinson, y la enfermedad de Alzheimer. Hoozemans y col. (2001) Exp. Gerontol.

36:559-570; Griffin y Mrak (2002) J. Leukocyte Biol. 72:233-238; Ilzecka y col. (2002) Cytokine 20:239-243. El TNF-alfa, la IL-1beta, la IL-6, la IL-8, el interferon-gamma, y la IL-17 parecen modular la respuesta a isquemia cerebral. Vease, por ejemplo, Kostulas y col. (1999) Stroke 30:2174-2179; Li y col. (2001) J. Neuroimmunol. 116:5-14. El factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) esta asociado con la ALS. Cleveland y Rothstein (2001) Nature 2:806 819.

Los trastornos inflamatorios del intestino, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la enfermedad celfaca, y el smdrome del intestino irritable, estan mediados por celulas del sistema inmunitario y por citoquinas. Por ejemplo, la enfermedad de Crohn esta asociada con un aumento de IL-12 e IFNy, mientras que la colitis ulcerosa esta asociada con un aumento de IL-5, IL-13, y factor de crecimiento transformante-beta (TGFbeta). La expresion de IL-17 tambien puede aumentar en la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Vease, por ejemplo, Podolsky (2002) New Engl. J. Med. 347:417-429; Bouma y Strober (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521-533; Bhan y col. (1999) Immunol. Rev.

169:195-207; Hanauer (1996) New Engl. J. Med. 334:841-848; Green (2003) The Lancet 362:383-391; McManus (2003) New Engl. J. Med. 348:2573-2574; Horwitz y Fisher (2001) New Engl. J. Med. 344:1846-1850; Andoh y col. (2002) Int. J. Mol. Med. 10:631-634; Nielsen y col. (2003) Scand. J. Gastroenterol. 38:180-185; Fujino y col. (2003) Gut 52:65-70.

El receptor de IL-23 es un complejo heterodimerico de las subunidades IL-23R e IL-12RP1. Vease Parham y col. (2000) J. Immunol. 168:5699. El receptor de IL-12 es un complejo de las subunidades IL-12R(P1 e IL-12RP2. Vease Presky y col. (1996) Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 93:14002. IL-23R se ha implicado como factor generico crftico en los trastornos inflamatorios del intestino enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Duerr y col. (2006) Sciencexpress 26-octubre-2006:1. Un estudio de genoma completo hallo que el gen para IL-23R estaba altamente asociado con la enfermedad de Crohn, confiriendo una variante codificante poco comun (Arg381Gln) una fuerte proteccion contra la enfermedad. Esta asociacion genetica confirma los hallazgos biologicos previos (Yen y col. (2006) J. Clin. Investigation 116:1218) que sugenan que la IL-23 y su receptor son dianas prometedoras para nuevos agentes terapeuticos enfocados a tratar la IBD.

Las enfermedades inflamatorias de la piel, las articulaciones, el SNC, asf como los trastornos proliferativos, provocan respuestas inmunitarias similares, por tanto el bloqueo de IL-23 debena proporcionar la inhibicion de estos trastornos inflamatorios mediados por el sistema inmunitario, sin comprometer la capacidad del hospedador de combatir las infecciones sistemicas. Antagonizar la IL-23 debena aliviar la inflamacion asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la artritis reumatoide, la artritis psoriasica, la psoriasis, la espondilitis anquilosante, y la dermatitis atopica. El uso de inhibidores de IL-23 tambien proporcionara la inhibicion de trastornos proliferativos, por ejemplo, cancer y trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, esclerosis multiple, diabetes tipo I, y SLE. Pueden encontrarse descripciones de IL-23 en estos diversos trastornos en las siguientes solicitudes PCT publicadas: WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; y WO 01/18051. Los inhibidores de IL-23 tambien pueden encontrar uso en el tratamiento de infecciones, incluyendo infecciones cronicas, tales como infecciones bacterianas, micobacterianas, vmcas y fungicas.

La subunidad p19 de la IL-23 es un miembro de la familia de 'cadena larga' de citoquinas hematopoyeticas (Oppmann y col. (2000) supra) y comprende cuatro a-helices empaquetadas llamadas A, B, C y D, con una topologfa arriba-arriba-abajo-abajo. Las 4 helices estan conectadas por 3 bucles polipeptfdicos. Los bucles A-B y C-D estan modelados para ser relativamente largos ya que conectan helices paralelas. El corto bucle B-C conecta las helices B y C antiparalelas. La subunidad p19 de la IL-23 es un miembro de la familia de IL-6 de citoquinas helicoides. Esta familia de citoquinas se une a sus receptores afines a traves de tres epftopos conservados (sitio I, II y III; Bravo y Heath (2000) EMBO J. 19:2399-2411). La subunidad p19 interacciona con tres subunidades de receptor de citoquinas para formar el complejo de senalizacion competente. Cuando se expresa en una celula, la subunidad p19 primero forma un complejo con la subunidad p40, que comparte con IL-12. Como se ha indicado anteriormente, el complejo p19p40 se secreta de la celula en forma de una protema heterodimerica y se llama IL-23. Vease, por ejemplo, Oppmann y col., supra. El complejo receptor celular necesario para transducir la senal de IL-23 consta de dos miembros de las subunidades del receptor de senalizacion toll de la familia IL-6/IL-12 de citoquinas, el IL-23R espedfico de IL-23 (vease, por ejemplo, Parham y col., supra) y el IL-12Rb1, que esta compartido con IL-12.

Aportes en la base estructural del reconocimiento citoquina de 'cadena larga'/receptor han demostrado que aunque se ocultan grandes areas de la superficie proteica en la formacion de complejos citoquina - receptor, la afinidad de la interaccion esta dominada por unos pocos restos aminoaddicos a menudo estrechamente agrupados que forman un 'punto caliente' energetico en el centro de la superficie de contacto de union. La identidad de los restos que dominan la energfa de union de una gran superficie de contacto protema-protema se ha llamado 'epftopo funcional'. La afinidad de la interaccion (y por tanto la especificidad biologica) se define por consiguiente por la complementariedad estructural de los epftopos funcionales del ligando y el receptor. Estudios detallados de mutagenesis han demostrado que los restos mas significativos que componente los epftopos funcionales de las citoquinas y los receptores son contactos hidrofobos que implican cadenas laterales no polares tales como triptofano, los componentes alifaticos de cadenas laterales no polares o la estructura polipeptfdica. El nucleo 'no polar' esta rodeado por un halo de restos polares de menor importancia para la energfa de union. Estudios cineticos indican que la tarea principal de los epftopos funcionales es estabilizar la interaccion protema-protema disminuyendo la velocidad de disociacion del complejo. Se ha sugerido que el contacto inicial entre la citoquina y el receptor esta dominado por difusion aleatoria o 'balanceo' de las superficies proteicas que produce muchos contactos inestables. El complejo se estabiliza despues cuando los epftopos funcionales del receptor y el ligando se acoplan. Vease, por ejemplo, Bravo y Heath, supra.

III. Generacion de anticuerpos espedficos para IL-23

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para generar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, puede inmunizarse a un destinatario con una forma reticulada o no reticulada (por ejemplo, de origen natural) del heterodfmero IL-23, o un fragmento del mismo. Puede usarse cualquier procedimiento adecuado de inmunizacion. Dichos procedimientos pueden incluir adyuvantes, otros inmunoestimuladores, inmunizaciones de refuerzo repetidas, y el uso de una o mas via de inmunizacion.

Puede usarse cualquier fuente adecuada de IL-23 como inmunogeno para la generacion del anticuerpo no humano, espedfico para la subunidad p19, de las composiciones y procedimientos descritos en este documento. Dichas formas incluyen, aunque sin limitacion, la protema completa, incluyendo heterodfmeros reticulados y de origen natural, peptidos(s), y epftopos, generados a traves de medios de degradacion recombinante, sintetica, qrnmica o enzimatica conocidos en la tecnica.

Puede usarse cualquier forma del antfgeno para generar el anticuerpo que es suficiente para generar un anticuerpo biologicamente activo. Por tanto, el antfgeno productor puede ser un unico epftopo, multiples epftopos, o la protema completa sola o en combinacion con uno o mas agentes potenciadores de inmunogenicidad conocidos en la tecnica. El antfgeno productor puede ser una protema de longitud completa aislada, una protema de superficie celular (por ejemplo, inmunizando con celulas transfectadas con al menos una parte del antfgeno), o una protema soluble (por ejemplo, inmunizando con solamente la parte del dominio extracelular de la protema). El antfgeno puede producirse en una celula geneticamente modificada. El ADN que codifica el antfgeno puede ser genomico o no genomico (por ejemplo, ADNc) y codifica al menos una parte del dominio extracelular. Como se usa en este documento, el termino "parte" se refiere a la cantidad minima de aminoacidos o acidos nucleicos, segun sea apropiado, para constituir un epftopo inmunogenico del antfgeno de interes. Puede emplearse cualquier vector genetico adecuado para la transformacion de las celulas de interes, incluyendo, aunque sin limitacion, vectores adenovirales, plasmidos, y vectores no virales, tales como ftpidos cationicos.

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para producir un anticuerpo con las propiedades biologicas deseadas para inhibir la IL-23. Es deseable preparar anticuerpos monoclonales (mAb) a partir de diversos hospedadores mamferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Puede encontrarse una descripcion de las tecnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales en, por ejemplo, Stites y col. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en ese documento; Harlow y Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, Nueva York, NY. Por tanto, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por una diversidad de tecnicas familiares para los investigadores especializados en la tecnica. Tfpicamente, se inmortalizan esplenocitos de un animal inmunizado con un antfgeno deseado, habitualmente por fusion con una celula de mieloma. Vease Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511 519. Los procedimientos alternativos de inmortalizacion incluyen transformacion con virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros procedimientos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Doyle y col. (eds. 1994 y suplementos periodicos) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que surgen de las celulas inmortalizadas individuales se exploran para la produccion de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antfgeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas celulas puede potenciarse por diversas tecnicas, incluyendo inyeccion en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union a antfgeno del mismo explorando una biblioteca de ADN de celulas B humanas de acuerdo, por ejemplo, con el protocolo general descrito por Huse y col. (1989) Science 246:1275-1281.

Otras tecnicas adecuadas implican la seleccion de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Vease, por ejemplo, Huse y col. supra; y Ward y col. (1989) Nature 341:544-546. Los polipeptidos desvelados en el presente documento y los anticuerpos de la presente invencion pueden usarse con o sin modificacion, incluyendo anticuerpos quimericos o humanizados. Frecuentemente, los polipeptidos y anticuerpos se marcaran uniendo, de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una senal detectable. Se conoce una amplia diversidad de marcadores y tecnicas de conjugacion y se presentan de forma extensiva en la bibliograffa tanto cientifica como de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionuclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminescentes, partmulas magneticas, y similares. Las patentes que muestran el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de Estados Unidos N° 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Ademas, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, vease Cabilly patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Queen y col. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o prepararse en ratones transgenicos, vease Mendez y col. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Veanse tambien las tecnologfas Abgenix y Medarex.

Pueden producirse anticuerpos o composiciones de union contra fragmentos predeterminados de IL-23 por inmunizacion de animales con conjugados del polipeptido, fragmentos, peptidos, o epftopos con protemas veldculo. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de celulas que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden explorarse para la union a IL-23 normal o defectuoso. Estos anticuerpos monoclonales habitualmente se uniran con al menos una Kd de aproximadamente 1 |iM, mas habitualmente de al menos aproximadamente 300 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM o mejor, habitualmente determinada por ELISA. Los anticuerpos no humanos adecuados tambien pueden identificarse usando los ensayos biologicos descritos en los Ejemplos 5 y 6, a continuacion.

Se deposito un hibridoma que expresa el anticuerpo 13B8 en cumplimiento del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, Virginia, EEUU) el 17 de agosto de 2006 con el numero de referencia PTA-7803.

IV. Humanizacion de anticuerpos espedficos para IL-23

Puede usarse cualquier anticuerpo no humano adecuado como fuente para la region hipervariable. Las fuentes para anticuerpos no humanos incluyen, aunque sin limitacion, murinos, lagomorfos (incluyendo conejos), bovinos, y primates. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de la region hipervariable del receptor estan remplazados por restos de la region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region flanqueante (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se remplazan por restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo de la actividad biologica deseada. Para detalles adicionales, vease Jones y col. (1986) Nature 321:522-525; Reichmann y col. (1988) Nature 332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Se han descrito procedimientos para disenar de forma recombinante anticuerpos, por ejemplo, por Boss y col. (patente de Estados Unidos N° 4.816.397), Cabilly y col. (patente de Estados Unidos N° 4.816.567) Law y col. (publicacion de solicitud de patente europea N° EP438310A1) y Winter (patente europea N° EP239400B1).

Se preparan variantes de secuencia de aminoacidos del anticuerpo anti-IL-23 humanizado introduciendo cambios apropiados de nucleotidos en el ADN del anticuerpo anti-IL-23 humanizado, o por smtesis peptfdica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, restos dentro de la secuencia de aminoacidos mostrada para el anticuerpo anti-IL-23 humanizado. Cualquier combinacion de delecion, insercion, y sustitucion se hace para llegar a la construccion final, con la condicion de que la construccion final tenga las caractensticas deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-IL-23 humanizado, tal como cambiando la cantidad o posicion de los sitios de glucosilacion.

Un procedimiento util para la identificacion de ciertos restos o regiones del polipeptido del anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado que son localizaciones preferidas para mutagenesis, se llama "mutagenesis por rastreo de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Aqrn, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) y se remplazan por un aminoacido neutro o cargado negativamente (mas preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interaccion de los aminoacidos con el antfgeno IL-23. Los restos aminoaddicos que muestran sensibilidad funcional a las sustituciones entonces se refinan introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitucion. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variacion en la secuencia de aminoacidos esta predeterminada, no tiene que predeterminarse la naturaleza de la mutacion per se. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se realiza mutagenesis por rastreo de Ala o aleatoria en el codon o region diana y las variantes expresadas del anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado se exploran para la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoacidos incluyen fusiones amino- y/o carboxil-terminales que vanan en longitud desde un resto hasta polipeptidos que contienen cien o mas restos, asf como inserciones dentro de la secuencia de un unico resto aminoaddico o multiples restos aminoaddicos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen el anticuerpo anti-IL-23 humanizado con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una marca epitopica. Otras variantes de insercion de la molecula del anticuerpo anti-IL-23 humanizado incluyen la fusion al extremo N o C del anticuerpo anti-IL-23 humanizado de una enzima o un polipeptido que aumenta la semi-vida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitucion de aminoacido. Estas variantes tienen al menos un resto aminoaddico en la molecula del anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interes para mutagenesis de sustitucion incluyen los bucles hipervariables, pero tambien se contemplan alteraciones en la FR.

Otro tipo de variante a nivel aminoacido del anticuerpo altera el patron original de glucosilacion del anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar uno o mas restos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo, y/o anadir uno o mas sitios de glucosilacion que no estan presentes en el anticuerpo. La glucosilacion de los anticuerpos es tipicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la union del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptfdicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de estas secuencias tripeptfdicas en un polipeptido crea un sitio potencial de glucosilacion. Glucosilacion ligada a O se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoacido, mas comunmente serina o treonina, aunque tambien pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adicion de sitios de glucosilacion al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos de modo que contenga una o mas de las secuencias tripeptfdicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilacion ligados a N). La alteracion tambien puede hacerse por la adicion de, o sustitucion por, uno o mas restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilacion ligados a O).

Otro tipo mas de variante a nivel aminoacido es la sustitucion de restos para proporcionar mayor estabilidad qrnmica del anticuerpo humanizado final. Por ejemplo, puede cambiarse un resto de asparagina (N) para reducir el potencial de formacion de isoaspartato en cualquier secuencia NG dentro de una CDR de roedor. Puede existir un problema similar en una secuencia DG. Reissner y Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. La formacion de isoaspartato puede debilitar o anular completamente la union de un anticuerpo a su antfgeno diana. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734. En una realizacion, la asparagina se cambia a glutamina (Q). Ademas, los restos de metionina en CDR de roedor pueden cambiarse para reducir la posibilidad de que el azufre de la metionina se oxide, lo que podna reducir la afinidad de union al antfgeno y tambien contribuir a la heterogeneidad molecular en la preparacion final de anticuerpos. Id. En una realizacion, la metionina se cambia a alanina (A). Los anticuerpos con dichas sustituciones se exploran posteriormente para asegurar que las sustituciones no disminuyen la afinidad de union a IL-23p19 a niveles inaceptables.

Las moleculas de acido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoacidos del anticuerpo humanizado espedfico para IL-23 se preparan por una diversidad de procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen, aunque sin limitacion, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoacidos de origen natural) o preparacion por mutagenesis mediada por oligonucleotido (o dirigida al sitio), mutagenesis por PCR, y mutagenesis con casete de una variante preparada previamente o una version no variante del anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado.

Habitualmente, las variantes de secuencia de aminoacidos del anticuerpo anti-IL-23 humanizado tendran una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos del anticuerpo humanizado original de la cadena pesada o ligera, mas preferiblemente al menos un 80 %, mas preferiblemente al menos un 85 %, mas preferiblemente al menos un 90 %, y mucho mas preferiblemente al menos un 95, 98, o 99 %. La identidad u homologfa con respecto a esta secuencia se define en este documento como el porcentaje de restos aminoaddicos en la secuencia candidata que son identicos a los restos de anti-IL-23 humanizado, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje maximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la identidad de secuencia. Ninguna extension, delecion, o insercion N-terminal, C-terminal, o interna en la secuencia del anticuerpo se interpretara como influyente en la identidad u homologfa de secuencia.

El anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede usarse cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgG-i, IgG2, IgG3, e IgG4. Tambien se contemplan variantes de los isotipos IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de mas de una clase o isotipo. La optimizacion de las secuencias del dominio constante necesarias para generar la actividad biologica deseada se consigue facilmente explorando los anticuerpos en los ensayos biologicos descritos a continuacion.

Asimismo, puede usarse cualquier clase de cadena ligera en las composiciones y procedimientos de este documento. Espedficamente, son utiles kappa, lambda, o variantes de las mismas en las presentes composiciones y procedimientos.

Puede usarse cualquier parte adecuada de las secuencias CDR del anticuerpo no humano. Las secuencias CDR pueden mutagenizarse por sustitucion, insercion o delecion de al menos un resto, de modo que la secuencia CDR sea distinta de la secuencia de anticuerpo humano y no humano empleada. Se contempla que dichas mutaciones sean irnnimas. Tfpicamente, al menos el 75 % de los restos del anticuerpo humanizado corresponded a los de los restos CDR no humanos, mas del 90 %, y muy preferiblemente mas del 95 %.

Puede usarse cualquier parte adecuada de las secuencias FR del anticuerpo humano. Las secuencias FR pueden mutagenizarse por sustitucion, insercion o delecion de al menos un resto de modo que la secuencia FR sea distinta de la secuencia de anticuerpo humano y no humano empleada. Se contempla que dichas mutaciones sean mmimas. ^picamente, al menos el 75 % de los restos del anticuerpo humanizado corresponded a los de los restos FR humanos, mas a menudo el 90 %, y muy preferiblemente mas del 95, 98, o 99 %.

Los restos CDR y FR se determinan de acuerdo con la definicion de secuencia convencional de Kabat. Kabat y col. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. Las SEQ ID NO: 1-5 muestran las secuencias del dominio variable de cadena pesada de diversos anticuerpos de raton anti-IL-23p19 humana, y las SEQ ID NO: 9-13 representan las secuencias del dominio variable de cadena ligera. Las Fig. 1 y 2 proporcionan alineaciones de secuencia de dominios variables de cadena pesada y ligera de los diversos anticuerpos desvelados en el presente documento. Las CDR se indican en las figuras, y las secuencias CDR individuales estan cada una representada con Identificadores de Secuencia unicos indicados en la Tabla 7.

Se proporcionan formas humanizadas del anticuerpo 13B8. La secuencia de cadena ligera humanizada de 13B8 (con la region constante kappa) se proporciona en la SEQ ID NO: 14, y el dominio variable de cadena ligera comprende los restos 1-108 de esa secuencia. Se proporcionan tres versiones de la secuencia de cadena pesada humanizada de 13B8 (con regiones constantes y1) en las SEQ ID NO: 6-8, y el dominio variable de cadena pesada comprende los restos 1-116 de esas secuencias. Las variantes de cadena pesada de 13B8 se ilustran en la Tabla 2, con las diferencias respecto a la secuencia parental indicadas en negrita. La Met (M) se modifico a Lys (K) para evitar el potencial de oxidacion del resto y la inactivacion del anticuerpo. La sustitucion de AQKLQ para NEMFE es un remplazo de la secuencia CDR murina con la secuencia humana de la lmea germinal procedente de la region flanqueante humana seleccionada para humanizar el anticuerpo.

Tabla 2

Las formas humanizadas de los otros anticuerpos descritos en este documento pueden crearse simplemente sustituyendo las CDR parentales del anticuerpo de roedor en las secuencias de cadena ligera y pesada para el 13B8 humanizado proporcionadas en las SEQ ID NO: 14 y 6. Este enfoque muy probablemente es satisfactorio para cadenas de anticuerpo con CDR que tienen elevada homologfa con las CDR del anticuerpo 13B8, por ejemplo, el clon 11C1 en la cadena pesada y los clones 11C1 y 21D1 en la cadena ligera. Como alternativa, los anticuerpos murinos pueden humanizarse independientemente usando los enfoques expuestos en este documento, por ejemplo en el Ejemplo 2.

En una realizacion, las CDR incluyen variantes de cualquier CDR de secuencia sencilla descrita en este documento (SEQ ID NO: 15-46), en que la variante comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sustituciones conservativas de aminoacidos relativas a la secuencia descrita, determinadas usando los datos de la Tabla 1.

Tambien se contemplan anticuerpos quimericos. Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos quimericos tfpicos comprenden una parte de la cadena pesada y/o ligera identica, u homologa a, secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada. Vease la patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

Tambien son utiles anticuerpos biespedficos en los presentes procedimientos y composiciones. Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo biespedfico" se refiere a un anticuerpo, tfpicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de union por al menos dos epftopos antigenicos diferentes, por ejemplo, IL-23p19 e IL-17. En una realizacion, los epftopos son del mismo antfgeno. En otra realizacion, los epftopos son de dos antfgenos diferentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos pueden producirse de forma recombinante usando la co-expresion de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Vease, por ejemplo, Milstein y col. (1983) Nature 305: 537-39. Como alternativa, los anticuerpos biespedficos pueden prepararse usando enlace qmmico. Vease, por ejemplo, Brennan y col. (1985) Science 229:81. Los anticuerpos biespedficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespedfico. Vease, por ejemplo, Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber y col. (1994) J. Immunol.

152:5368.

En otras realizaciones mas, pueden anadirse diferentes dominios constantes a las regiones Vl y Vh humanizadas proporcionadas en este documento. Por ejemplo, si un uso pretendido particular de un anticuerpo (o fragmento) de la presente invencion fuera exigir funciones efectoras alteradas, puede usarse un dominio constante de cadena pesada diferente de IgG1. Aunque los anticuerpos IgG1 proporcionan una larga semi-vida y funciones efectoras, tales como activacion del complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, dichas actividades pueden no ser deseables para todos los usos del anticuerpo. En dichos casos, puede usarse un dominio constante de IgG4, por ejemplo.

V. Actividad biologica del anti-IL-23 humanizado

Los anticuerpos que tienen las caractensticas identificadas en este documento como deseables en un anticuerpo anti-IL-23 humanizado pueden explorarse para su actividad biologica inhibidora in vitro o la adecuada afinidad de union. Para explorar anticuerpos que se unen a un epftopo en IL-23 humana (es decir, la subunidad p19) unida por un anticuerpo de interes (por ejemplo, aquellos que bloquean la union de la citoquina a su receptor), puede realizarse un ensayo rutinario de bloqueo cruzado tal como el descrito en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Los anticuerpos que se unen al mismo epftopo probablemente efectuan bloqueo cruzado en dichos ensayos, pero no todos los anticuerpos de bloqueo cruzado necesariamente se uniran en precisamente el mismo epftopo, ya que el bloqueo cruzado puede resultar de la impedancia esterica de la union del anticuerpo por anticuerpos que se unen en epftopos solapantes, o incluso epftopos no solapantes cercanos.

Como alternativa, puede realizarse un mapeo de epftopos, por ejemplo, como se describe en Champe y col. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epftopo de interes. Tambien puede usarse "mutagenesis por rastreo de alanina", como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081 1085, o alguna otra forma de mutagenesis puntual de restos aminoaddicos en IL-23 humana para determinar el epftopo funcional para un anticuerpo anti-IL-23 de la presente invencion. Los estudios de mutagenesis, sin embargo, tambien pueden revelar restos aminoaddicos que son cruciales para la estructura tridimensional global de IL-23 pero que no estan directamente implicados en los contactos anticuerpo-antfgeno, y por tanto pueden ser necesarios otros procedimientos para confirmar un epftopo funcional determinado usando este procedimiento.

El epftopo unido por un anticuerpo espedfico tambien puede determinarse evaluando la union del anticuerpo a peptidos que comprenden fragmentos de IL-23p19 humana (SEQ ID NO: 47). La secuencia de la subunidad p40 de IL-12 e IL-23 se encuentra en el numero de referencia a GenBank P29460. Puede sintetizarse una serie de peptidos solapantes que abarcan la secuencia de IL-23p19 y explorarse para la union, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde el peptido se evalua para su capacidad de evitar la union de un anticuerpo a IL-23p19 unida a un pocillo de una placa de microtitulacion), o en un chip. Dichos procedimientos de exploracion de peptidos pueden no ser capaces de detectar algunos epftopos funcionales discontinuos, es decir, epftopos funcionales que implican restos aminoaddicos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena polipeptfdica de IL-23p19.

El epftopo unido por anticuerpos de la presente invencion tambien puede determinarse por procedimientos estructurales, tales como determinacion de la estructura cristalina por rayos X (por ejemplo, documento WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopfa por resonancia magnetica nuclear (RMN), incluyendo determinacion por RMN de las tasas de intercambio H-D de hidrogenos labiles de amida en IL-23 cuando estan libres y cuando estan unidos en un complejo con un anticuerpo de interes (Zinn-Justin y col.(1992) Biochemistry 31:11335 11347; Zinn-Justin y col. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

Con respecto a la cristalograffa de rayos X, la cristalizacion puede conseguirse usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, Giege y col. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), incluyendo difusion en microlotes (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5:1269 1274), difusion de vapor en gota colgante (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), siembra y dialisis. Es deseable usar una preparacion de protemas que tenga una concentracion de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalizacion puede conseguirse mejor en una solucion precipitante que contenga polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular promedio que vana de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferiblemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, mas preferiblemente aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varfan de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% (p/v). Tambien puede ser deseable incluir un agente estabilizador de protemas, por ejemplo, glicerol a una concentracion que vana de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 %. Tambien puede ser deseable una sal adecuada, tal como cloruro sodico, cloruro de litio o citrato sodico en la solucion precipitante, preferiblemente en una concentracion que vana de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante esta preferiblemente tamponado a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 10,0, a menudo de aproximadamente 7,0 a 8,5, por ejemplo pH 8,0. Los tampones espedficos utiles en la solucion precipitante pueden variar y son bien conocidos en la tecnica. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York. Los ejemplos de tampones utiles incluyen, aunque sin limitacion, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales pueden cultivarse a un amplio intervalo de temperaturas, incluyendo 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.

Los cristales anticuerpo:antfgeno pueden estudiarse usando tecnicas bien conocidas de difraccion de rayos X y pueden refinarse usando un software informatico tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; vease, por ejemplo, Blundell y Johnson (1985) Meth. Enzymol. 1 l4 y 115, H. W. Wyckoff y col. eds., Academic Press; la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter y Sweet, eds.; Roversi y col. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).

Pueden obtenerse anticuerpos adicionales que se unan al mismo epftopo que un anticuerpo de la presente invencion, por ejemplo, explorando anticuerpos creados contra IL-23 para la union al epftopo, o por inmunizacion de un animal con un peptido que comprende un fragmento de IL-23 humana que comprende la secuencia del epftopo. Podna esperarse que anticuerpos que se unen al mismo epftopo funcional mostraran actividades biologicas similares, tales como bloqueo de la union al receptor, y dichas actividades pueden confirmarse por ensayos funcionales de los anticuerpos.

Las afinidades de los anticuerpos (por ejemplo, para IL-23 humana) pueden determinarse usando analisis convencional. Los anticuerpos humanizados preferidos son aquellos que se unen a IL-23p19 humana con un valor de Kd de no mas de aproximadamente 1x10'7; preferiblemente de no mas de aproximadamente 1x10'8; mas preferiblemente de no mas de aproximadamente 1x10'9; y mucho mas preferiblemente de no mas de aproximadamente 1x10'1° o incluso 1x10'11 M.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos utiles en las presentes composiciones y procedimientos son anticuerpos y fragmentos biologicamente activos. Como se usa en este documento, el termino "biologicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse al epftopo antigenico deseado y de ejercer directa o indirectamente un efecto biologico. Tfpicamente, estos efectos resultan del fracaso de IL-23 en unirse a su receptor. Como se usa en este documento, el termino "espedfico" se refiere a la union selectiva del anticuerpo al epftopo antigenico diana. Los anticuerpos pueden ensayarse para la especificidad de union comparando la union a IL-23 con la union a un antfgeno o mezcla de antigeno irrelevante en una serie dada de condiciones. Si el anticuerpo se une a IL-23 al menos 10, y preferiblemente 50 veces mas que a un antfgeno o mezcla de antfgenos irrelevante, entonces se considera que es espedfico. Un anticuerpo que se une a IL-12 no es un anticuerpo espedfico para IL-23. Un anticuerpo que "se une espedficamente" a IL-23p19 no se une a protemas que no comprenden las secuencias derivadas de IL-23p19, es decir "especificidad" como se usa en este documento, se refiere a especificidad por IL-23p19, y no por cualquier otra secuencia que pueda estar presente en la protema en cuestion. Por ejemplo, como se usa en este documento, un anticuerpo que "se une espedficamente" a IL-23p19 tipicamente se unira a FLAG®-hIL-23p19, que es una protema de fusion que comprende IL-23p19 y un peptido marcador FLAG®, pero no se une al peptido marcador FLAG® solo o cuando esta fusionado con una protema diferente de IL-23p19.

Los compuestos de union espedficos para IL-23 de la presente invencion, tal como anticuerpos inhibidores espedficos para IL-23p19, pueden inhibir su actividad biologica de cualquier modo, incluyendo, aunque sin limitacion, la produccion de IL-1 p y TNF por macrofagos peritoneales e IL-17 por linfocitos T Th17. Vease Langrish y col. (2004) Immunol. Rev. 202:96-105. Los anticuerpos anti-IL-23p19 tambien seran capaces de inhibir la expresion genica de IL-17A, IL-17F, CCL7, CCL17, CCL20, CCL22, CCR1, y GM-CSF. Vease Langrish y col. (2005) J. Exp. Med. 201:233 240. Los anticuerpos anti-IL-23p19 de la invencion, tambien bloquearan la capacidad de IL-23 de potenciar la proliferacion o supervivencia de celulas Th17. Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559. La actividad inhibidora del anti-IL-23p19 disenado por ingeniena genetica sera util en el tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios, y proliferativos. Ejemplos de dichos trastornos se describen en las publicaciones de solicitud de patente PCT WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; y WO 01/18051.

VI. Composiciones farmaceuticas

Para preparar composiciones farmaceuticas o esteriles que incluyan el anticuerpo contra IL-23p19, se mezcla el analogo o mutema de la citoquina, anticuerpo contra la misma, o acido nucleico del mismo, con un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y la U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Las formulaciones de agentes terapeuticos y de diagnostico pueden prepararse mezclando con vehmulos, excipientes, o estabilizadores fisiologicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, pastas, soluciones o suspensiones acuosas. Vease, por ejemplo, Hardman y col. (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, NY; Avis y col. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY.

La toxicidad y eficacia terapeutica de las composiciones de anticuerpo, administradas solas o en combinacion con un agente inmunosupresor, pueden determinarse por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion). La proporcion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la proporcion de DL50 a DE50. Se prefieren anticuerpos que muestran elevados indices terapeuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse para formular una gama de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificacion de dichos compuestos esta preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulacion que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada.

El modo de administracion no es particularmente importante. Las vfas adecuadas de administracion pueden incluir, por ejemplo, administracion oral, rectal, transmucosa, o intestinal; suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, intradermicas, subcutaneas, intramedulares, asf como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares. La administracion del anticuerpo usado en la composicion farmaceutica o para la practica del procedimiento de la presente divulgacion puede realizarse de una diversidad de modos convencionales, tales como ingestion oral, inhalacion, aplicacion topica o inyeccion cutanea, subcutanea, intraperitoneal, parenteral, intra-arterial o intravenosa.

Como alternativa, se puede administrar el anticuerpo de una forma local en lugar de sistemica, por ejemplo, mediante inyeccion del anticuerpo directamente en una articulacion artntica o lesion inducida por el patogeno caracterizada por inmunopatologfa, a menudo en una formulacion de deposito o de liberacion sostenida. Ademas, puede administrarse el anticuerpo en un sistema de suministro de farmaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo espedfico de tejido, dirigido, por ejemplo, a la articulacion artntica o lesion inducida por el patogeno caracterizada por inmunopatologfa. Los liposomas estaran dirigidos a y captados selectivamente por el tejido afectado.

La seleccion de un regimen de administracion para un agente terapeutico depende de varios factores, incluyendo la tasa de renovacion serica o tisular de la entidad, el nivel de smtomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las celulas diana en la matriz biologica. Preferiblemente, un regimen de administracion maximiza la cantidad de agente terapeutico suministrado al paciente, coherente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de agente biologico suministrado depende, en parte, de la entidad particular y la gravedad de la afeccion que se este tratando. Hay directrices disponibles sobre la seleccion de las dosis apropiadas de anticuerpos, citoquinas, y moleculas pequenas. Vease, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, RU; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom y col. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon y col. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz y col. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky y col. (2000) New Engl. J. Med.

343:1594-1602.

La determinacion de la dosis apropiada la hace el medico, por ejemplo, usando parametros o factores que se sabe o se sospecha en la tecnica que afectan al tratamiento o se preve que afecten al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis optima y se aumenta en pequenos incrementos despues de ello hasta que se consigue el efecto deseado u optimo con relacion a cualquier efecto secundario negativo. Las mediciones importantes de diagnostico incluyen aquellas de smtomas de, por ejemplo, la inflamacion o el nivel de citoquinas inflamatorias producidas. Preferiblemente, un agente biologico que se usara se obtiene sustancialmente de la misma especie que el animal abordado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sujetos humanos), minimizando de este modo cualquier respuesta inmunitaria al reactivo.

Pueden proporcionarse anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y citoquinas por infusion continua, o por dosis a intervalos de, por ejemplo, un dfa, 1-7 veces por semanas, una semana, dos semanas, mensualmente, bimensualmente, etc. Las dosis pueden proporcionarse por via intravenosa, subcutanea, topica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, intraespinal, o por inhalacion. Un protocolo de dosis preferido es uno que implica la dosis o frecuencia de dosis maxima que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 |ig/kg, 0,2 |ig/kg, 0,5 |ig/kg, 1 |ig/kg, 10 |ig/kg, 100 |ig/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corporal o mas. Vease, por ejemplo, Yang y col. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold y col. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu y col. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji y col. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. La dosis deseada de un agente terapeutico de molecula pequena, por ejemplo, un mimetico peprtdico, producto natural, o agente qmmico organico, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipeptido, en una base de moles/kg.

Como se usa en este documento, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los smtomas asociados con la enfermedad autoinmunitaria o inmunopatologfa inducida por el patogeno y/o una reduccion en la gravedad de dichos smtomas que se desarrollaran o se espera que se desarrollen. Las expresiones adicionalmente incluyen mejorar los smtomas inmunopatologicos existentes no controlados o indeseados relacionados con autoinmunidad o inducidos por el patogeno, prevenir smtomas adicionales, y mejorar o prevenir las causas subyacentes de dichos smtomas. Por tanto, los terminos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con una enfermedad o smtoma inmunopatologico inducido por autoinmunidad o un patogeno, o con el potencial de desarrollar dicha enfermedad o smtoma.

Como se usa en este documento, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto de union espedfico para IL-23p19, por ejemplo un anticuerpo, que cuando se administra solo o en combinacion con un agente terapeutico adicional a una celula, tejido, o sujeto es eficaz para prevenir o mejorar la enfermedad autoinmunitaria o la enfermedad o afeccion inmunopatologica inducida por un patogeno o la progresion de la enfermedad. Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere adicionalmente a la cantidad del compuesto suficiente para provocar la mejora de los smtomas, por ejemplo, tratamiento, curacion, prevencion o mejora de la afeccion medica relevante, o un aumento en la tasa de tratamiento, curacion, prevencion o mejora de dichas afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una cantidad terapeuticamente eficaz se refiere a ese principio solo. Cuando se aplica a una combinacion, una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que provocan el efecto terapeutico, se administren en combinacion, en serie o de forma simultanea. Una cantidad eficaz de agente terapeutico disminuira los smtomas tipicamente en al menos un 10 %; habitualmente en al menos un 20 %; preferiblemente en al menos aproximadamente un 30 %; mas preferiblemente en al menos un 40 %, y mucho mas preferiblemente en al menos un 50 %.

Los procedimientos para la co-administracion o tratamiento con un segundo agente terapeutico, por ejemplo, una citoquina, anticuerpo, esteroide, agente quimioterapeutico, antibiotico, o radiacion, son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Hardman y col. (eds.) (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., PA; Chabnery Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., PA. La composicion farmaceutica de la divulgacion tambien puede contener otros agentes inmunosupresores o inmunomoduladores. Puede emplearse cualquier agente inmunosupresor adecuado incluyendo, aunque sin limitacion, agentes anti-inflamatorios, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus (es decir, FK-506), sirolimus, interferones, receptores solubles de citoquinas (por ejemplo, sTNRF y sIL-1R), agentes que neutralizan la actividad citoquina (por ejemplo, inflixmab, etanorcept), micofenolato mofetilo, 15-desoxiespergualina, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato, y similares. La composicion farmaceutica tambien puede emplearse con otras modalidades terapeuticas tales como fototerapia y radiacion.

Los sujetos veterinarios, experimentales, o de investigacion tfpicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, cobayas, caballos, y seres humanos.

VII. Produccion de anticuerpos

En una realizacion, para la produccion recombinante de los anticuerpos de la presente invencion, se afslan los acidos nucleicos que codifican las dos cadenas y se insertan en uno o mas vectores replicables para su clonacion adicional (amplificacion del ADN) o para su expresion. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se afsla facilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotfdicas que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Estan disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion. En una realizacion, las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente invencion se expresan a partir del mismo vector, por ejemplo, un plasmido o un vector adenoviral.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En una realizacion, los anticuerpos se expresan en celulas de marnffero o insecto en cultivo, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas renales embrionarias humanas (HEK) 293, celulas NSO de mieloma de raton, celulas renales de cna de hamster (BHK), celulas de ovario de Spodoptera frugiperda (Sf9). En una realizacion, los anticuerpos secretados de celulas CHO se recuperan y se purifican por procedimientos cromatograficos convencionales, tales como cromatograffa con protema A, de intercambio cationico, de intercambio anionico, de interaccion hidrofoba, y con hidroxiapatita. Los anticuerpos resultantes se concentran y se almacenan en acetato sodico 20 mM, pH 5,5.

En otra realizacion, los anticuerpos de la presente invencion se producen en levaduras de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO2005/040395. En resumen, los vectores que codifican las cadenas ligera o pesada individuales de un anticuerpo de interes se introducen en diferentes celulas haploides de levadura, por ejemplo, diferentes tipos de apareamiento de la levadura Pichia pastoris, siendo dichas celulas haploides de levadura opcionalmente auxotrofos complementarios. Las celulas haploides de levadura transformadas despues pueden aparearse o fusionarse para dar una celula diploide de levadura capaz de producir las cadena tanto pesada como ligera. La cepa diploide entonces es capaz de secretar el anticuerpo completamente ensamblado y biologicamente activo. Los niveles de expresion relativa de las dos cadenas pueden optimizarse, por ejemplo, usando vectores con diferente numero de copias, usando promotores de transcripcion de diferente fuerza, o induciendo la expresion a partir de promotores inducibles que dirigen la transcripcion de los genes que codifica una o ambas cadenas.

En una realizacion, se introducen las respectivas cadenas pesada y ligera de una pluralidad de diferentes anticuerpos anti-IL-23p19 (los anticuerpos "originales") en celulas haploides de levadura para crear una biblioteca de cepas haploides de levadura de un tipo de apareamiento que expresa una pluralidad de cadenas ligeras, y una biblioteca de cepas haploides de levadura de un tipo diferente de apareamiento que expresa una pluralidad de cadenas pesadas. Estas bibliotecas de cepas haploides pueden aparearse (o fusionarse como esferoplastos) para producir una serie de celulas diploides de levadura que expresan una biblioteca combinatoria de anticuerpos compuestos por las diversas posibles permutaciones de cadenas ligera y pesada. La biblioteca combinatoria de anticuerpos entonces puede explorarse para determinar si alguno de los anticuerpos tiene propiedades que sean superiores (por ejemplo, mayor afinidad por IL-23) a las de los anticuerpos originales. Vease, por ejemplo, el documento WO2005/040395.

En otra realizacion, los anticuerpos de la presente invencion son anticuerpos de dominio humanos en los que partes de un dominio variable del anticuerpo estan unidas en un polipeptido de peso molecular aproximadamente de 13 kDa. Vease, por ejemplo, publicacion de patente de Estados Unidos N° 2004/0110941. Para dicho dominio sencillo, agentes de bajo peso molecular proporcionan numerosas ventajas en terminos de facilidad de smtesis, estabilidad, y via de administracion. La invencion proporciona el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo como se define en las reivindicaciones para su uso en la supresion de una respuesta inmunitaria en un sujeto humano, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inflamatoria o una respuesta autoinmunitaria; tal como para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, diabetes y cancer.

VIII. Usos

La presente divulgacion proporciona procedimientos para usar anticuerpos anti-IL-23 disenados por ingeniena genetica y fragmentos de los mismos para el tratamiento y diagnosis de trastornos y afecciones inflamatorias, por ejemplo, del sistema nervioso central, el sistema nervioso periferico, y del tracto gastrointestinal, asf como trastornos autoinmunitarios y proliferativos.

Se proporcionan procedimientos para el tratamiento de, por ejemplo, la esclerosis multiple (MS), incluyendo MS remitente-recurrente y MS progresiva primaria, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (a.k.a. ALS; enfermedad de Lou Gehrig), lesion cerebral isquemica, enfermedades por priones, y demencia asociada con el VIH. Tambien se proporcionan procedimientos para tratar el dolor neuropatico, las neuropatfas post-traumaticas, el smdrome de Guillain-Barre (GBS), la polineuropatfa periferica, y la regeneracion nerviosa.

Se proporcionan procedimientos para tratar o mejorar una o mas de las siguientes caractensticas, smtomas, aspectos, manifestaciones, o signos de esclerosis multiple, u otro trastorno o afeccion inflamatorio del sistema nervioso: lesiones cerebrales, lesiones de la mielina, desmielinizacion, placas desmielinizadas, alteracion visual, perdida de equilibrio o coordinacion, espasticidad, alteraciones sensoriales, incontinencia, dolor, debilidad, fatiga, paralisis, alteracion cognitiva, bradifrenia, diplopia, neuritis optica, parestesia, ataxia del caminar, fatiga, smtoma de Uhtoff, neuralgia, afasia, apraxia, convulsiones, perdida de campos visuales, demencia, fenomenos extrapiramidales, depresion, sensacion de bienestar, u otros smtomas emocionales, mielopatfa progresiva cronica, y un smtoma detectado por imagenes de resonancia magnetica (MRI), incluyendo lesiones potenciadas por gadolinio, registros de potencial provocado, o examen de lfquido cefalorraqrndeo. Vease, por ejemplo, Kenealy y col. (2003) J. Neuroimmunol. 143:7 12; Noseworthy y col. (2000) New Engl. J. Med. 343:938-952; Miller y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:15-23; Chang y col. (2002) New Engl. J. Med. 346:165-173; Bruck y Stadelmann (2003) Neurol. Sci. 24 Supl. 5:S265-S267.

Ademas, la presente divulgacion proporciona procedimientos para tratar y diagnosticar trastornos inflamatorios del intestino, y la invencion proporciona el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, y smdrome del intestino irritable. Se proporcionan procedimientos para tratar o mejorar uno o mas de los siguientes smtomas, aspectos, manifestaciones, o signos de un trastorno inflamatorio del intestino: mala absorcion de alimentos, motilidad alterada del intestino, infeccion, fiebre, dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, perdida de peso, signos de malnutricion, enfermedad perianal, masa abdominal, y fallo en el crecimiento, asf como complicaciones intestinales tales como estenosis, fistulas, megacolon toxico, perforacion, y cancer, e incluyendo hallazgos endoscopicos, tales como, friabilidad, ulceras aftosas y lineales, aparicion de calculos, pseudopolipos, e implicacion rectal y, ademas, anticuerpos antilevadura. Vease, por ejemplo, Podolsky, supra; Hanauer, supra; Horwitz y Fisher, supra.

Tambien se contempla el tratamiento de trastornos inflamatorios tales como psoriasis, dermatitis atopica, artritis, incluyendo artritis reumatoide, osteoartritis, y artritis psoriasica, trastornos autoinmunitarios, tales como lupus sistemico eritematoso y diabetes tipo I, y trastornos proliferativos tales como cancer. Veanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente PCT WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; y WO 01/18051.

Los compuestos de union a IL-23p19 de la presente invencion tambien puede usarse en combinacion con uno o mas antagonistas de otras citoquinas (por ejemplo, anticuerpos), incluyendo, aunque sin limitacion, IL-17A, IL-17F, IL-1 p, IL-6y TGF-p. Vease, por ejemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333. En diversas realizaciones, se administra un compuesto de union a IL-23p19 de la invencion antes, de forma concurrente con, o despues de la administracion del otro antagonista o antagonistas, tal como un anticuerpo anti-IL-17A. En una realizacion, se usa un compuesto de union a IL-17A en el tratamiento de la fase temprana aguda de una respuesta inmunitaria adversa (por ejemplo, MS, enfermedad de Crohn) solo o en combinacion con un anticuerpo antagonista de IL-23 de la presente invencion. En el ultimo caso, el compuesto de union a IL-17A puede disminuirse gradualmente y el tratamiento con el antagonista de IL-23 solo se continua para mantener la supresion de la respuesta adversa. Como alternativa, pueden administrarse antagonistas de IL-ip, IL-6 y/o TGF-p de forma concurrente con, antes o despues de un compuesto de union a IL-23p19 de la presente invencion. Vease Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato y O'Shea (2006) Nature 441: 166-168; Iwakura e Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222.

La invencion se entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar las invenciones a las realizaciones espedficas. Las realizaciones espedficas descritas en este documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invencion debe limitarse por los terminos de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimientos generales

Se describen procedimientos convencionales en biologfa molecular. Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrooky Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA. Los procedimientos convencionales tambien aparecen en Ausbel y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonacion en celulas bacterianas y la mutagenesis del ADN (Vol. 1), la clonacion en celulas de mairnfero y levaduras (Vol. 2), los glucoconjugados y la expresion de protemas (Vol. 3), y la bioinformatica (Vol. 4).

Se describen procedimientos para la purificacion de protemas incluyendo inmunoprecipitacion, cromatograffa, electroforesis, centrifugacion, y cristalizacion. Coligan y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. Se describen el analisis qmmico, la modificacion qmmica, la modificacion posttraduccional, la produccion de protemas de fusion, la glucosilacion de protemas. Vease, por ejemplo, Coligan y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pag. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pag. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pag. 384-391. Se describen la produccion, purificacion, y fragmentacion de anticuerpos policlonales y monoclonales. Coligan y col. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, supra. Estan disponibles tecnicas convencionales para caracterizar interacciones ligando/receptor. Vease, por ejemplo, Coligan y col. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York.

Estan disponibles procedimientos para citometna de flujo, incluyendo sistemas de deteccion por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS®). Vease, por ejemplo, Owens y col. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Estan disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar acidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de acido nucleico, polipeptidos, y anticuerpos para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnostico. Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.

Se describen procedimientos convencionales de histologfa del sistema inmunitario. Vease, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt, y col. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, y Wilkins, Phila, PA; Louis, y col. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY.

Estan disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigenicos, secuencias lfder, plegamiento de protemas, dominios funcionales, sitios de glucosilacion, y alineaciones de secuencia. Vease, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne y col. (2000) Bioinformatics 16: 741 742; Menne y col. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren y col. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683 4690.

Ejemplo 2

Generacion y humanizacion de anticuerpos anti-IL-23p19 humana

Se generaron anticuerpos anti-IL-23p19 humana inmunizando ratones IL-23p19 knockout con IL-23 quimerica (p19 humana:p40 de raton). Los anticuerpos monoclonales se prepararon por procedimientos convencionales.

La humanizacion de los dominios variables del anticuerpo murino 13B8 (IgG1 de raton/kappa) se realizo esencialmente como se describe en las publicaciones de solicitud de patente PCT WO 2005/047324 y WO 2005/047326.

En resumen, la secuencia de aminoacidos del dominio VH no humano del anticuerpo 13B8 se compare con un grupo de cinco secuencias de aminoacidos de la lrnea germinal de VH humano; un representante de los subgrupos IGHV1 e IGHV4 y tres representantes del subgrupo IGHV3. Los subgrupos VH se enumeran en M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:100-116. El anticuerpo 13B8 obtuvo la mayor valoracion contra DP-14 de la lrnea germinal de cadena pesada humana en el subgrupo VH1.

La secuencia VL del anticuerpo 13B8 es de la subclase kappa de VL. La secuencia de aminoacidos del dominio VL no humano se compare con un grupo de cuatro secuencias de aminoacidos de la lrnea germinal de VL kappa humano. El grupo de cuatro esta compuesto por un representante de cada uno de los cuatro subgrupos establecidos de VL humano enumerados en V. Barbie y M.-P. Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics 15:171-183 y M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:161-174. Los cuatro subgrupos tambien corresponden a los cuatro subgrupos enumerados en Kabat y col. (1991 -5a Ed.) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, pag. 103-130. El anticuerpo 13B8 obtuvo la mayor valoracion contra Z-012 de la lrnea germinal de cadena ligera humana en el subgrupo VLkI.

Se hicieron sustituciones adicionales de aminoacidos en CDRH2, como se ha analizado supra y se describen en las SEQ ID NO: 24-26. Se clonaron los dominios variables de cadena pesada y ligera de 13B8 humanizado en vectores que codifican un dominio constante de cadena pesada y1 humano (IgG1) y un dominio constante de cadena ligera kappa, respectivamente. El anticuerpo 13B8 humanizado resultante (IgG1/kappa) se une a IL-23 humana y de mono cynomolgus pero no a IL-12 humana, p40 humana o IL-23 de raton.

Una vez se han determinado las secuencias de aminoacidos diana de las cadenas pesada variable y ligera, pueden generarse plasmidos que codifican el anticuerpo humanizado de longitud completa. Las secuencias plasirndicas pueden alterarse usando mutagenesis de Kunkel (Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488-492) para cambiar la secuencia de ADN para las secuencias diana del anticuerpo humanizado. Simultaneamente, puede realizarse la optimizacion de codones para proporcionar una expresion potencialmente optima.

Pueden construirse formas humanizadas de otros anticuerpos descritos en este documento sustituyendo las regiones flanqueantes humanas descritas para el anticuerpo 13B8 humanizado, o repitiendo el procedimiento para la seleccion de las mejores regiones flanqueantes humanas por los procedimientos descritos en este Ejemplo. La sustitucion de las regiones flanqueantes humanas descritas en este documento como parte del anticuerpo humanizado 13B8 es mas apropiada para anticuerpos con secuencias CDR similares a 13B8.

Ejemplo 3

Determinacion de la constante de disociacion en equilibrio (Kd) para el anticuerpo humanizado anti-IL-23 humana usando tecnologfa KinExA

La constante de disociacion en equilibrio (Kd) para anticuerpos anti-IL-23 humana se determina usando el instrumento KinExA 3000. Sapidyne Instruments Inc., Boise Idaho, EEUU. KinExA usa el principio del procedimiento de ensayo de exclusion cinetica basado en la medicion de la concentracion de anticuerpo no en complejo en una mezcla de anticuerpo, antfgeno y complejo anticuerpo-antfgeno. La concentracion anticuerpo libre se mide exponiendo la mezcla a un antfgeno inmovilizado en fase solida durante un periodo de tiempo muy corto. En la practica, esto se consigue haciendo fluir la mezcla antfgeno-anticuerpo en fase de solucion pasando por las partfculas recubiertas con antfgeno atrapadas en una cubeta de flujo. Los datos generados por el instrumento se analizan usando un software adaptado. Las constantes de equilibrio se calculan usando una teona matematica basada en las siguientes suposiciones:

1. La union sigue la siguiente ecuacion de union reversible para el equilibrio:

kon [Ac][Ag] = koff[AcAg]

2. El anticuerpo y el antfgeno se unen 1:1 y el anticuerpo total es igual al complejo antfgeno-anticuerpo mas el anticuerpo libre.

3. La senal del instrumento esta linealmente relacionada con la concentracion de anticuerpo libre.

Se recubren partfculas PMMA de 98 micrometres (Sapidyne, N° Cat. 440198) con IL-23 biotinilada de acuerdo con el "Protocolo para recubrir partfculas PMMA con ligandos biotinilados que tienen brazos enlazadores cortos o inexistentes" de Sapidyne. En este experimento, la IL-23 biotinilada comprende un complejo de IL-12p40 de raton e IL-23p19 humana. Se usa EZ-link TFP PEO-biotina (Pierce, N° Cat. 21219) para preparar IL-23 biotinilada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (boletm Pierce 0874). Todos los procedimientos experimentales se hacen de acuerdo con el manual KinExA 3000.

La union de anticuerpos anti-IL-23p19 se evalua en un ensayo de union competitiva, en el que los anticuerpos se pre-incuban con IL-23 humana no ligada (nativa) que comprende dos cadenas unidas por enlace disulfuro, p19 humana (SEQ ID NO: 47) y p40 humana (numero de referencia a GenBank P29460), a una serie de concentraciones. Las muestras resultantes, que comprenden una mezcla de anticuerpos no unidos y anticuerpos unidos a IL-23, despues se hacen fluir sobre las partfculas PMMA de rhIL-23 ("elastiquina") descritas en el parrafo precedente. La cantidad de anticuerpo capturado por las partfculas PMMA entonces se detecta usando un anticuerpo secundario marcado den forma fluorescente.

La Tabla 3 muestra los resultados del analisis KinExA, incluyendo determinaciones duplicadas para cada anticuerpo.

Tabla 3

Valores de Kd determinados por KinExA

Anticuerpo Kd_(pM)

m13B8 15, 52

hum13B8-a 64±40, 110, 365, 447

hum13B8-b 47,470,520

hum13B8-c 47,52,470

Ejemplo 4

Determinacion de la constante de disociacion en equilibrio (Kd) para anticuerpos humanizados anti-IL-23p19 humana usando tecnologfa BIAcore

Las determinaciones BIAcore se realizan esencialmente como se describe en el Ejemplo 4 de la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2007/0048315 transferida legalmente. En resumen, se inmovilizan los ligandos (mAb anti-IL-23) en un chip detector BIAcore CM5 usando un procedimiento convencional de acoplamiento con amina. La IL-23 se diluye en PBS para producir diversas concentraciones. Las constantes cineticas para las diversas interacciones se determinan usando el software BIAevaluation 3.1. La Kd se determina usando las constantes de velocidad de disociacion y asociacion calculadas.

La Tabla 4 proporciona los valores de Kd determinados por BIAcore, incluyendo determinaciones duplicadas.

Tabla 4

Determinacion de Kd por BIAcore

Anticuerpo Kd (pM)

m13B8 173,228

hum13B8-a 72-104, 68-100, 81-129

hum13B8-b 77-129, 69-116

hum13B8-c 92-153

Ejemplo 5

Bioensayos de proliferacion para la evaluacion de anticuerpos neutralizantes anti-IL-23

Se evaluo la capacidad de un anticuerpo monoclonal de neutralizar biologicamente IL-23 mediante la aplicacion de bioensayos de proliferacion a corto plazo que emplean celulas que expresan receptores recombinantes de IL-23. La lmea celular transfectante IL-23R (Ba/F3-2.2Io-hIL-23R) expresa tanto hIL-23R como hIL-12Rp1, y es sensible tanto a IL-23 humana como a IL-23 de mono cynomolgus. Las celulas transfectantes Ba/F3-2.210 proliferan en respuesta a IL-23 humana y la respuesta puede inhibirse por un anticuerpo neutralizante anti-IL-23. Se titula un anticuerpo frente a una concentracion de IL-23 elegida dentro de la region lineal de la curva de respuesta a dosis, casi plana y por encima de la CE50. La proliferacion, o la ausencia de la misma, se mide por medios colorimetricos usando azul de Alamar, un colorante indicador de crecimiento basado en la deteccion de la actividad metabolica. La capacidad de un anticuerpo de neutralizar la IL-23 se evalua mediante su valor de CI50, o la concentracion del anticuerpo que induce la inhibicion mitad de la maxima de la proliferacion de IL-23.

Los transfectantes Ba/F3 se mantienen en medio RPMI-1640, suero de ternera fetal al 10%, 2-mercaptoetanol 50 |iM, L-Glutamina 2 mM, 50 |ig/ml de penicilina-estreptomicina, y 10 ng/ml de IL-3 de raton. Los bioensayos de proliferacion de Ba/F3 se realizan en medio RPMI-1640, suero de ternera fetal al 10%, 2-mercaptoetanol 50 |iM, L Glutamina 2 mM, y 50 |ig/ml de penicilina-estreptomicina.

Procedimiento

Los ensayos se realizan en placas de fondo plano de 96 pocillos (Falcon 3072 o similar) en 150 |il por pocillo. Los anticuerpos anti-IL-23 se pre-incuban con IL-23 durante 30-60 min., seguido de la adicion de celulas e incubacion durante 40-48 horas. Se anade azul de Alamar (Biosource N° Cat. DAL1100) y se deja revelar durante 5-12 horas. Despues se lee la absorbancia a 570 nm y 600 nm (lector de microplacas VERSAmax, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EEUU), y se obtiene una DO570-600.

Las celulas se usan en un estado de crecimiento sano, generalmente a densidades de 3-8 x 105/ml. Las celulas se cuentan, se sedimentan, se lavan dos veces en medio de bioensayo, y se suspenden a la densidad apropiada para la siempre en placa. Se realiza una respuesta a dosis de IL-23 usando diluciones 1:3 en serie (25:50 |il en medio de bioensayo) de IL-23. Se selecciona una concentracion de IL-23 de 3 ng/ml (50 pM) para su uso en los ensayos de anticuerpos. Tambien se realiza una respuesta a dosis de anticuerpo neutralizante usando diluciones 1:3 en serie (25:50 |il en medio de bioensayo).

Los valores de CI50 se determinan usando el software GraphPad Prism® 3.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, California, EEUU), en que se representa la absorbancia frente a la concentracion de citoquina o anticuerpo y los valores de CI50 se determinan usando regresion no lineal (ajuste a curva) de la respuesta a dosis sigmoidal.

La Tabla 5 muestra los valores de CI50 para bloquear la proliferacion de las celulas Ba/F3 mediante anticuerpos anti-IL-23p19. Se incluyen los valores para multiples determinaciones para algunos anticuerpos.

Tabla 5

Ejemplo 6

Ensayo de esplenocitos de raton para IL-23 basado en la produccion de IL-17

La actividad biologica de los anticuerpos anti-IL-23p19 de la presente invencion se evalua usando el ensayo de esplenocitos esencialmente como se describe en Aggarwal y col. (2003) J. Biol. Chem. 278:1910 y Stumhofer y col. (2006) Nature Immunol. 7:937. El ensayo de esplenocitos de raton mide la actividad de IL-23 en una muestra como un nivel de produccion de IL-17 por esplenocitos murinos. La actividad inhibidora de los anticuerpos anti-IL-23p19 entonces se evalua determinando la concentracion de anticuerpo necesaria para reducir la actividad IL-23 en una muestra dada en un 50 % (la CI50). La CI50 medida por este ensayo es mayor o igual a la constante de union de disociacion en equilibrio (Kd), es decir, la Kd puede ser igual o inferior a la CI50. Como siempre, valores de CI50 y Kd inferiores reflejan mayores actividades y afinidades.

En resumen, se obtienen bazos de ratones C57BL/6J hembra de 8-12 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, EEUU). Los bazos se trituran, se sedimentan dos veces, y se filtran a traves de un filtro celular (nylon de 70 |im). Las celulas recuperadas se cultivan en placas de 96 pocillos (4 X 105 celulas/pocillo) en presencia de IL-23 humana (10 ng/ml, ~170 pM) y anticuerpos de raton anti-CD3e (1 |ig/ml) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EEUU), con o sin el anticuerpo anti-IL-23p19 a ensayar. Los anticuerpos anti-IL-23p19 se anaden a 10 |ig/ml y a una serie de diluciones de factor 3. Las celulas se cultivan durante 72 horas, se sedimentan, y se ensaya el sobrenadante para los niveles de IL-17 por ELISA tipo sandwich.

El ELISA de IL-17 se realiza del siguiente modo. Se recubren placas con un anticuerpo de captura anti-IL-17 (100 ng/pocillo) durante una noche a 4 °C, se lavan y se bloquean. Se anaden las muestras y los patrones y se incuban durante dos horas a temperatura ambiente con agitacion. Se lavan las placas, y se anade un anticuerpo de deteccion biotinilado anti-IL-17 (100 ng/pocillo) y se incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitacion. Los anticuerpos de captura y deteccion son anticuerpos diferentes que se unen ambos a IL-17 de raton pero no realizan bloqueo cruzado. Se lavan las palcas, y se detecta el anticuerpo de deteccion unido usando estreptavidina-HRP (peroxidasa de rabano rusticano) y TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). La placa despues se lee a 450-650 nm y se calcula la concentracion de IL-17 en las muestras por comparacion con los patrones.

Los valores de CI50 del ensayo de esplenocitos se proporcionan en la Tabla 6, incluyendo algunas determinaciones duplicadas.

Tabla 6

Ejemplo 7

Caracterizacion de una preparacion de anticuerpo 13B8-b anti-IL-23p19

El anticuerpo humanizado 13B8-b anti-IL-23p19 se prepara a partir de celulas de mairnfero usando un vector que alberga secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de 13B8-b, proporcionadas en las SEQ ID NO: 49 y 50, respectivamente.

Hum 13B8-b tiene una Kd de 297 pM para IL-23 humana cuando se ensaya por analisis BIAcore, esencialmente como se describe en el Ejemplo 4 (supra).

La actividad biologica de hum13B8-b se evalua usando el ensayo de proliferacion de Ba/F3, esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 (supra), excepto que se usa 340 pM de IL-23 para estimular la proliferacion, en lugar de 50 pM. La actividad inhibidora de los anticuerpos anti-IL-23p19 (la CI50) se evalua determinando la concentracion de anticuerpo necesaria para reducir la actividad IL-23 en una muestra dada en un 50 %. Como siempre, valores inferiores de CI50 reflejan actividades mas elevadas. Hum13B8-b muestra una CI50 de 187 pM en el ensayo de proliferacion de Ba/F3.

La actividad biologica de hum13B8-b tambien se evalua usando un ensayo de esplenocitos humanos, esencialmente como se describe en el Ejemplo 6 (supra) con la excepcion de que los esplenocitos se obtienen de bazos humanos en lugar de bazos de raton, no se usa anticuerpo anti-CD3e, y la lectura es de IFN-y en lugar de IL-17. El ensayo mide la actividad de IL-23 en una muestra determinando el nivel de produccion de IFN-y por esplenocitos primarios humanos. Los esplenocitos humanos se exponen a IL-23 humana (170 pM) en presencia de diversas concentraciones de anticuerpo hum13B8-b anti-IL-23p19, o en ausencia del anticuerpo. El IFN-y se detecta por ELISA tipo sandwich. Hum13B8-b muestra una CI50 de 59-144 pM en el ensayo de esplenocitos humanos.

La actividad biologica de hum13B8-b se evalua adicionalmente usando un ensayo de fosforilacion de KIT225 con STAT-3, esencialmente como se describe en Parham y col. (2002) J. Immunol. 168:5699. Se estimulan celulas KIT225 humanas, una lmea leucemica de celulas T, con IL-23 humana 138 pM en presencia de diversas concentraciones de anticuerpo hum13B8-b anti-IL-23p19, o en ausencia del anticuerpo. La actividad IL-23 se mide detectando el nivel de fosforilacion de STAT3. Hum13B8-b muestra una CI50 de 130 pM en el ensayo de KIT225.

Ejemplo 8

Epttopo para el anticuerpo humanizado 13B8-b anti-IL-23p19

El epftopo para la union del anticuerpo humanizado 13B8-b a IL-23p19 humana (SEQ ID NO: 47) se determino por cristalograffa de rayos X. Se determinaron las coordenadas para un complejo de un fragmento Fab del anticuerpo humanizado 13B8-b anti-IL-23p19 e IL-23 humana no ligada, que comprende las subunidades p19 y p40. La subunidad p40 en la IL-23 usada para determinar la estructura cristalina tiene una sustitucion N222q en la que la Asn222 esta remplazada por Gln. La secuencia de IL-23p19 humana se encuentra en la SEQ ID NO: 47 y la secuencia de la forma madura de IL-12/IL-23 p40 humana se encuentra en los restos 23-328 del numero de referencia a GenBank P29460. El anticuerpo humanizado 13B8-b anti-IL-23p19 comprende la cadena pesada humanizada de 13B8-b (SEQ ID NO: 7), la cadena ligera humanizada de 13B8-b (SEQ ID NO: 14). Las condiciones de cristalizacion son polietilenglicol 4000 al 15%, acetato sodico 60 mM, TRIS-HCl 100 mM (pH 8). Los cristales tambien pueden obtenerse con otros tampones a o aproximadamente a pH 8.

Los restos aminoaddicos de IL-23 dentro de una distancia de 4,0 A de restos en el anticuerpo 13B8-b incluyen K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 y L110. Los restos adicionales L24, L85, T91, S100 y V102 estaban dentro de una distancia de 5,0 A. Un resto aminoaddico en IL-23p19 se considera dentro de una distancia dada del anticuerpo (por ejemplo, 4,0 A o 5,0 A) si las coordenadas de cualquier atomo de resto estan dentro de la distancia dada de las coordenadas de cualquier atomo del anticuerpo.

La mayona de estos restos contactados estan dentro de dos grupos principales a lo largo de la estructura primaria de IL-23p19, comprendiendo el primer grupo los restos 20-30 (en el que 6 de los 11 restos estan dentro de una distancia de 5,0 A del anticuerpo y 5 de los 11 estan dentro de una distancia de 4,0 A) y comprendiendo el segundo grupo los restos 82-110 (en el que 16 de los 29 restos estan dentro de una distancia de 5,0 A del anticuerpo y 12 de los 29 estan dentro de una distancia de 4,0 A). Estos grupos definen epftopos que comprenden tramos de 11 o mas restos aminoaddicos contiguos de IL-23p19 en los que el 30 %, 40 %, 45 %, 50 % o 54 % o mas de los restos estan dentro de una distancia de 4,0 A o 5,0 A del anticuerpo.

Se esperana que anticuerpos que se unen a cualquiera de estos grupos o a ambos, bloquearan la union del anticuerpo 13B8-b, y se esperana que mostraran actividades biologicas similares.

La Tabla 7 proporciona una breve descripcion de las secuencias de la lista de secuencias.

Tabla 7

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que se une a IL-23 humana en un epttopo que comprende los restos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106 , A107 y L1l0 de la SEQ ID NO: 47; en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende:

(a) un dominio variable de cadena ligera, o fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende CDRL1, c Dr L2 y CDRL3, en el que:

CDRL1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 36 o una variante de la misma;

CDRL2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 41 o una variante de la misma; y

CDRL3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 46 o una variante de la misma;

en el que cada variante comprende hasta una sustitucion de aminoacido modificado de forma conservativa; y

(b) un dominio variable de cadena pesada, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en el que:

CDRH1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma;

CDRH2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25; y

CDRH3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 31 o una variante de la misma;

en el que cada variante comprende hasta una sustitucion de aminoacido modificado de forma conservativa.

2. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una region constante de cadena pesada que comprende una region constante de cadena pesada humana y1 o y4 o una variante de la misma, en la que la variante de la region constante comprende hasta 20 sustituciones de aminoacido modificado de forma conservativa.

3. Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F (ab')2, y un diacuerpo.

4. Un acido nucleico aislado que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de la reivindicacion 1.

5. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 4, unido de forma funcional a secuencias de control que reconoce una celula hospedadora cuando la celula hospedadora se transfecta con el vector.

6. Un procedimiento de produccion de un polipeptido que comprende:

cultivar una celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 5 en un medio de cultivo en condiciones en las que se expresa la secuencia de acido nucleico, produciendo de este modo polipeptidos que comprenden los dominios variables de cadena ligera y pesada; y

recuperar los polipeptidos de la celula hospedadora o el medio de cultivo.

7. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en combinacion con un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

8. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como un medicamento.

9. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en la supresion de una respuesta inmunitaria en un sujeto humano, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inflamatoria o una respuesta autoinmunitaria.

10. El anticuerpo o anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, diabetes y cancer.