CZ304514B6 - Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23 - Google Patents

Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23 Download PDF

Info

Publication number
CZ304514B6
CZ304514B6 CZ2012-829A CZ2012829A CZ304514B6 CZ 304514 B6 CZ304514 B6 CZ 304514B6 CZ 2012829 A CZ2012829 A CZ 2012829A CZ 304514 B6 CZ304514 B6 CZ 304514B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
ala
leu
sequence
binding
Prior art date
Application number
CZ2012-829A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2012829A3 (cs
Inventor
Petr Malý
ebo Peter Ĺ
Milan Kuchař
Lucie Vaňková
Hana Petroková
Original Assignee
Biotechnologický Ústav Av Čr, V.V.I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnologický Ústav Av Čr, V.V.I. filed Critical Biotechnologický Ústav Av Čr, V.V.I.
Priority to CZ2012-829A priority Critical patent/CZ304514B6/cs
Priority to PCT/CZ2013/000137 priority patent/WO2014079399A1/en
Priority to EP13792577.2A priority patent/EP2922560B1/en
Publication of CZ2012829A3 publication Critical patent/CZ2012829A3/cs
Publication of CZ304514B6 publication Critical patent/CZ304514B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Předkládané řešení se týká polypeptidů, které jsou odvozeny z albumin-vazebné domény streptokokového proteinu G divokého typu o sekvenci LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP (ABDwt) a vykazují schopnost vazby na receptor pro lidský cytokin IL-23 s afinitní konstantou K.sub.d.n. menší než 10.sup.-7.n. M. Tyto polypeptidy byly vybrány z ABD peptidové knihovny, připravené randomizací 11 zbytků ABDwt, s ohledem na vazbu k IL-23R. Součástí řešení je také jejich použití pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob, zejména psoriázy, Crohnovy choroby, revmatoidní artritidy a roztroušené sklerózy.

Description

Předkládaný vynález se týká nových polypeptidů odvozených od albumin-vazebné domény (ABD) streptokokového proteinu G, které jsou vhodné pro léčbu autoimunitních chorob a jako diagnostická činidla.
Dosavadní stav techniky
O autoimunitních chorobách, jakými jsou například psoriáza, Crohnova choroba, revmatoidní artritida nebo roztroušená skleróza, je známo, že souvisejí s cytokinem IL-23 indukujícím signalizační funkci zprostředkovanou subpopulaci TH17 buněk nebo přirozených zabíječských buněk (NKC), které exprimují buněčně povrchový receptor pro IL-23 (Oppmann B et al.: Immunity 2000; 13(5):715—725; Cua DJ et al.: Nátuře 2003; 421 (6924):744-748; Langrish CL et al.: J Exp Med 2005;201(2):233-240; Chán JR et al.: J Exp Med 2006;203(12):2577-2587; Capon F et al.: Hum Genet 2007; 122(2):201-206; Vaknin-Dembinsky A et al.: J. Immunol 2006; 176(12):77687774; Duerr RH et al.: Science 2006;314(5804): 1461-1463). V těchto typech buněk cytokin IL23, uvolněný z dendritických buněk a sestávající z unikátní podjednotky pl9 a obecné podjednotky p40 (Beyer BM et al.: J Mol Biol 2008;382(4):942-955; Lupardus PJ et al.: J Mol Biol 2008;382(4):931-941), aktivuje signální dráhu prostřednictvím interakce pl9 podjednotky se svým buněčným membránovým receptorem IL-23R a interakcí podjednotky p40 s povrchovým receptorem βΐ cytokinů IL-12 (Pharm C et al.: J Immunol 2002; 168(11):5699-5708; Kastelein RA et al.: Annu Rev Immunol 2007;25:221-242). Synergická vazba heterodimeru IL-23 k oběma receptorovým jednotkám vede k heterodimerizaci receptoru následované tvorbou kvartemího komplexu, která spouští signální kaskádu dráhy jak/stat, zahrnující molekuly Jak2, Tyk2, Stati, Stat3, Stat4 a Stat5. Transdukce signálu aktivuje transkripci, která vyvolává sekreci směsi modulátorů zánětu, jimiž jsou IL-17A, IL-17F, IL-22 a některé chemokiny stimulující keratinocyty a další typy buněk, a tedy hrajících zásadní roli v prozánětlivém procesu (přehledový článek Bonifáce K et al.: Immunol Rev 2008;226:132-146).
Efektivní terapeutická intervence potlačující hyperproliferaci keratinocytů jako klinický projev psoriázy vede k blokádě interakce mezi podjednotkami pl9/p40 IL-23 a jejich receptory v buněčných membránách (Toichi E et al.: J Immunol 2006; 177(7):4917-4926; Krueger GG et al.: N Engl J Med 2007;356(6):580-592; Gottlieb AB et al.: Curr Med Res Opin 2007;23(5): 1081-1092). Nedávno bylo ukázáno, že léčivo na bázi monoklonální protilátky Stelara (ustekinumab, Janssen Biotech), blokující podjednotku p40 cytokinů IL-23 a bránící její interakci s βΐ receptorem cytokinů IL-12, dosahuje výborných výsledků v léčbě středních a těžkých forem psoriázy (Leonardi CL et al.: Lancet 2008;371(9625): 1665-1674; Papp KA et al.: Lancet 2008;371(9625): 1675-1684). Protože však podjednotka p40 je součástí cytokinů IL-12 i IL-12, ovlivňuje léčivo dvě rozdílné signální dráhy, což přináší nežádoucí vedlejší účinky včetně kardiovaskulárních problémů a vyššího rizika rakoviny. Pozornost se proto v současné době soustředí na vývoj nových léčiv cíleně zasahujících pouze signální dráhu zprostředkovanou IL-23, jakými jsou specifické anti-pl9 protilátky MK-3222 (Merck), CNTO 1959 (Janssen Biotech) and AMG 139 (Amgen/Medlmmune) (Garber K: Nat Biotechnol 2012;30(6):475^t77), nebo cílené protilátky popsané v patentových přihláškách WO 2008/103 432, WO 2010/027 766 a WO2012/093 127. Protilátky jsou však velké molekuly, náročné na přípravu a s omezenou pohyblivostí v organismu, a to především z hlediska prostupnosti kůží a tkáněmi.
Alternativou ke konvenčním léčivům založeným na monoklonálních protilátkách jsou uměle vytvořené vazebné molekuly odvozené od malých proteinových struktur (Binz HK et al.: Current Opinion in Biotechnology 2005;16(4):459—469; Nygren PA et al.: Journal of Immunological
-1 CZ 304514 B6
Methods 2004;290(l-2):3-28; Gronwall C et al.: J Biotechnol 2009; 140(3—4):254-269). Malé proteinové struktury vzniklé modifikací aminokyselin ABD streptokokového proteinu G jsou známy z US 2008/0 187 517, kde byly připraveny za účelem zvýšení afinity k lidskému sérovému albuminu (HSA). Dále jsou známy proteiny odvozené od fibronektinu, vážící IL-23 (WO 2011/103 105).
Receptor IL-23 patří do rodiny cytokinových receptorů třídy I a sdílí typické znaky s tandemovými doménami fibronektinového typu III (FalII) obsahujícími typické disulfidové vazby a WQPWS sekvenci, podobající se WSXWS sekvenci cytokinových receptorů lokalizované v transmembránové proximální doméně FnlII (Parham C et al.: J Immunol 2002;168(l 1):56995708). Obě domény tvoří cytokin-vážící homologní oblast (CHR), která je spolu s terminální imunoglobulinu podobnou doménou považována za zásadní pro vazbu IL-23.
Protože přesná molekulární struktura komplexu IL-23/IL-23R dosud nebyla objasněna je navrhování efektivních inhibitorů funkce IL-23 se slibným terapeutickým účinkem značně problematické.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou polypeptidy obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:
KYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 1)
TYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 2)
YYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 3)
VYKNTINIAIPVRVVKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 4)
AYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 5)
HYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 6)
RYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 7)
WYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 8)
HYKNSINPAPQVIVVKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 11)
RYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 12)
EYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 13)
WYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 15) přičemž na N-konci uvedené sekvence je přímo připojena sekvence mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující
LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 17)
LAEAKVLTNRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 18)
LAETKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 19), přičemž asociační a disociační rovnováha vazby uvedeného polypeptidu na receptor pro lidský cytokin IL-23 charakterizovaná vazebnou afinitní konstantou Kd vykazuje hodnotu menší než ΙΟ'7 M.
-2CZ 304514 B6
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že polypeptidy podle vynálezu, odvozené z albumin-vazebné domény streptokokového proteinu G divokého typu (ABDwt, SEQ. ID NO. 16), jsou vhodnými kandidáty pro látky vážící se na receptor pro lidský cytokin IL-23 a blokující tak specificky jeho vazbu s podjednotkou pl 9 IL-23. ABDwt je tříhelikální struktura a bylo zjištěno, že zejména helixy 2 a 3 (aminokyselinové zbytky 20 až 46) jsou důležité pro vazbu na receptor IL-23. Sekvence helixu 1 (aminokyselinové zbytky 1 až 19) nebo její část může být připojena na N-konec sekvence nebo na C-konec sekvence odvozené od aminokyselinových zbytků 20 až 46 nebo její části. Dále mohou být prováděny bodové záměny aminokyselin, s výhodou alespoň 5 aminokyselinových zbytků, a také zkrácení či prodloužení sekvence.
Asociační a disociační rovnováha vazby polypeptidů (P) podle předkládaného vynálezu na receptor IL-23 (L) za vzniku komplexu (C), je vyjádřena vztahem C P + L, a je charakterizována vazebnou afínitní konstantou spočítanou podle vzorce LH (kde [P] je koncentrace
P, [L] je koncentrace L a [C] je koncentrace C vyjádřené v mol/l), která vykazuje hodnotu menší než 10 7 M. Tato vazebná afínitní konstanta může být stanovena známými metodami, které poskytují ekvivalentní výsledky, vhodnou metodou může být například metoda povrchové rezonance plasmonů (SPR).
S výhodou je polypeptid vybrán ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1 až SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 11 až SEQ ID NO. 13, a SEQ ID NO. 15, které mají na C-konci nebo na Nkonci připojenu sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO. 17 až SEQ ID NO. 19.
Předmětem předkládaného vynálezu je také sekvence DNA vybraná ze skupiny zahrnující komplementární DNA kódující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle předkládaného vynálezu a DNA hybridizující s uvedenou komplementární DNA za vysoce stringentních podmínek. Vysoce stringentními podmínkami jsou v tomto vynálezu míněny následující podmínky pro odmytí značené DNA sondy: použití odmývacího roztoku obsahujícího 0,5 x SSC + 0,1% SDS o teplotě 60 °C.
Předkládaný vynález dále zahrnuje použití uvedené sekvence DNA pro přípravu polypeptidů podle vynálezu produkovaných v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích nebo lidských hostitelských buňkách, a rovněž tyto hostitelské buňky, obsahující sekvence DNA podle vynálezu.
Polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné pro použití v medicíně, zejména v léčbě autoimunitních chorob. Zejména terapeuticky vhodné jsou polypeptidy obsahující sekvence SEQ ID NO. 1-7, nejvhodnější jsou polypeptidy obsahující sekvence SEQ ID NO. 3 a 6.
Polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné i pro použití jako diagnostická činidla, zejména pro autoimunitní choroby. Za tímto účelem je zejména vhodné připojit k polypeptidům podle předkládaného vynálezu chromofor nebo fluorofor.
Autoimunitní choroby jsou choroby zahrnující prozánětlivé procesy zprostředkované IL-23, a zahrnují například psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.
Polypeptidy podle vynálezu inhibují vazbu podjednotky pl9 k receptoru IL-23R interakcí s receptorem, čímž specificky blokují prozánětlivou signální dráhu, tedy jsou vhodné jako léčiva další generace pro léčbu autoimunitních chorob. Tato inhibiční schopnost byla prokázána v in vitro vazebných stanoveních, kompetičních experimentech i v ex vivo funkčním stanovení. Dále sekvence podle předkládaného vynálezu vykazují sníženou afinitu proti sérovým albuminům.
-3CZ 304514 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Vazba rozpustného fúzního rekombinantního proteinu DH-MBP-pl9 a refoldovaného DH-pl9 k imobilizovanému IL-23 receptorů ověřená testem ELISA. Receptor byl produkován v bakteriálním kmeni E. coli SHuffle a po extrakci refoldován z roztoku 8M močoviny. Interakce byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky proti lidskému interleukinu 23 (anti-human IL-23 (pl9)) a sekundární kozí protilátky fúzované s křenovou peroxidázou (anti-IgG-HRP). Výsledek ukazuje, že námi připravené bakteriální produkty se vzájemně rozpoznávají na základě specifické vazby.
Obr. 2 Vazebná doména ABD jako strukturní kostra pro konstrukci vazebných proteinů proti různým cílovým molekulám (tzv. ABD scaffold). Proteinová struktura (PDBID 1GJT) s vyobrazenými 11 aminokyselinovými pozicemi vybranými pro randomizovanou mutagenezi byla použita k tvorbě vysoce komplexní knihovny ABD variant o teoretické komplexitě 1014 variant (podrobnosti jsou uvedeny v publikaci Ahmad a ost., Proteins 2012;80(3):774-789, 2012).
Obr. 3. Fylogenetický strom znázorňující sekvenční podobnost klonů REX selektovaných pro vazbu na receptor exIL-23R. Sekvenční analýza klonů ukázala 18 unikátních variant z celkového počtu 34 analyzovaných klonů. Pro tuto analýzu byla použita oblast sekvencí mezi 20. a 46. pozicí aminokyselin. Předcházející část (N-konec) aminokyselin 1-19 představující nemutovanou oblast aminokyselinové sekvence nebyla do této analýzy zahrnuta.
Obr. 4.(a) Vazba REX variant k imobilizovanému receptorů exIL-23 s použitím ELISA. Receptor byl produkován v kmeni E. coli SHuffle a po extrakci refoldován z roztoku 8M močoviny. Interakce byla detegována pomocí streptavidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou (b) Vazba receptorů exIL-23R k imobilízovaným REX variantám. Interakce byla detegována pomocí polyklonální protilátky proti lidskému receptorů exIL-23R (anti-human IL-23R) a sekundární protilátky fúzované s křenovou peroxidázou (anti-goat IgG-HRP). Grafy ukazují cíleně navozenou vazbu REX variant k IL-23 receptorů v porovnání s původní nemutovanou molekulou ABDwt.
Obr. 5. Kompetiční ELISA stanovení. Deset variant REX-TolA-AVI (obr. 4 a, b) soutěží s fuzním proteinem DH-MBP-pl9 o vazbu k imobilizovanému receptorů exIL-23R vyprodukovanému z bakteriálního kmene E. coli SHuffle. Z jednotlivých variant REX klonů byly připraveny série ředění v roztoku PBST s 1% BSA obsahující 20nM DH-MBP-pl9. Zvyšující se koncentrace inhibujících REX variant měla za následek snížení vazby pl9 proteinu na receptor v protikladu k původní nemutované molekule ABDwt. Vazba p 19 na receptor byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky anti-IL-23 (pl9) rozpoznané anti-IgG-HRP konjugátem kozí protilátky s křenovou peroxidázou. Tyto výsledky ukazují inhibiční účinky příslušných REX variant ve vazebném systému využívajícím bakteriální refoldovaný receptor.
Obr. 6. Kompetice inhibiěních variant REX009 a REX 125 s pl9/IL-23 o vazbu na receptor IL23R. Zvýšení koncentrace inhibiěních variant REX (REX-TolA-AVI) má za následek úbytek vazby jak rekombinantního fúzního proteinu DH-MBP-pl9 (a), tak kompletního eukaryotického produktu IL-23 cytokinu (b) k imobilizovanému rozpustnému receptorů ve formě chiméry IL23R-IgG vyprodukované v myších fibroblastech. Vazba pl9 byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky anti-IL-23 (pl9) rozpoznané sekundární kozí protilátkou anti-IgG-HRP konjugovanou s křenovou peroxidázou. Původní nemodifikovaná varianta ABD použitá jako negativní kontrola ve formě proteinu ABDwt-TolA-AVI v rozmezí použitých koncentrací proteinů neovlivňuje vazbu pl9 na IL-23R. Tento výsledek dokumentuje, že inhibiční účinek použitých REX variant nalezený s použitím bakteriálního receptorů je zachován i v případě rozpustné eukaryoticky produkované a glykosylované formy IL-23 receptorů a je potvrzen i sníženou vazbou kompletního lidského IL-23.
-4CZ 304514 B6
Obr. 7 Termální stability vazebných variant REX-TolA-AVI měřené metodou fluorescenčního posunu vlivem tepelné denaturace (tzv. fluorescence-based thermal-shift assay). Během vzrůstající teploty dochází k postupnému rozvolňování struktury proteinu (denaturaci), a tím zpřístupnění těchto oblastí pro vazbu fluorescenčního činidla SYPRO® Orange, v důsledku čehož narůstá měřený fluorescenční signál (excitace při 470 nm a emise 570 nm). Grafy ukazují průběhy normalizovaných hodnot fluorescence v závislosti na vzrůstající denaturační teplotě (a) a její derivace (b). Zjištěná teplota tání Tm pro REX009 je 50,0 °C, pro REX125 je 56,0 °C a pro REX128 je měřením odhadnuta na 56,5 °C. Tyto výsledky dokumentují dostatečnou stabilitu použitých variant.
Obr. 8 (a) K-562 a THP-1 buňky exprimují na svém povrchu molekuly IL-23 receptoru a toto je dokumentováno vazbou anti-!L23R protilátky. Buňky byly vystaveny vazbě protilátky proti lidskému IL-23R značené APC nebo její izotypové kontrole konjugované s APC a poté analyzovány průtokovou cytometrií. (b) Analýza vazby různých variant ligandů REX-TolA-AVI na K-562 a THP-1 buňky. Buňky byly inkubovány s in vivo biotinylovanými REX proteiny nebo s negativními kontrolami, a to s ABDwt nebo s variantou His-TolA molekuly postrádající ABD doménu, tzv. klonem delta (Δ) ABD. Navázané proteiny byly následně obarveny streptavidinem značeným fycoerytrinem a analyzovány průtokovou cytometrií. N.P. značí vzorek samotných buněk bez ABD i REX proteinu.
Obr. 9. Vazba různých variant REX ligandů na lidské buněčné linie koreluje s expresí IL-23 receptoru na těchto buňkách (a) K-562 a Jurkat buňky exprimují na svém povrchu molekuly IL23 receptoru. Buňky byly vystaveny vazbě protilátky proti lidskému IL-23R značené APC nebo její izotypové kontrole a analyzovány průtokovou cytometrií. (b) Profil vazby REX ligandů na K-562 a Jurkat buňky koreluje s intenzitou vazby protilátky proti lidskému IL-23R. Buňky byly inkubovány s in vivo biotinylovanými REX proteiny nebo s negativní kontrolou (ABDwt) a navázané proteiny byly následně obarveny streptavidinem značeným fýcoeiytrinem a analyzovány průtokovou cytometrií.
Obr. 10. REX varianty inhibují produkci IL-17 pozitivních T-buněk získaných z mononukleárních buněk periferní krve. (a) Intracelulámí barvení buněk produkujících IL—17. Významný pokles výskytu IL-17+ populace byl pozorován ve vzorcích stimulovaných IL-23 kultivovaných v přítomnosti REX ligandů oproti vzorkům s ABD-WT kontrolou nebo bez přítomnosti ABD proteinu, (b) Počet buněk produkujících IL-17 v jedné jamce po třídenní inkubaci s IL-23 a IL-2 bez přídavku ligandů nebo v kombinaci s přidaným REX009, REX125, REX128 nebo negativní kontrolou ABDwt. Buňky byly zpočátku stimulovány anti-CD3 protilátkou a poté znovu stimulovány ve třetím dni inkubace. Přítomnost CD4+ T-buněk produkujících IL-17 byla prokázána použitím intracelulámího barvení cytokinů. Tento výsledek dokumentuje imunomodulační potenciál vytvořených antagonistů IL-23 receptoru a potvrzuje, že vytvořené vazebné REX proteiny blokují IL-23R-zprostředkovanou aktivací T-buněk vedoucí k produkci a sekreci IL-17.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody
Protilátky a detekční činidla: monoklonální protilátky (mAbs) anti-lidský IL-23R-Allophycocynini (APC) (myší IgG2B) specifický pro lidský receptor IL-23 a IgG2B isotypová kontrolaAPC (myší IgG2b) byly získány od R&D Systems, Minneapolis, MN. Myší anti-pl9 monoklonální protilátka byla získána od Biolegend, San Diego, CA. Cy5 konjugovaný kozí anti-myší IgG (F(ab')2 fragment) byl získán z Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA. Streptavidin-fykoerytrin byl zakoupen od eBioscience, San Diego, CA.
Buněčné linie a podmínky kultivace: v příkladech byly použity buněčné linie lidské akutní monocytické leukémie THP-1 (ATCC číslo: TIB-202), lidské leukémie K-562 (ATCC číslo: CCL-5CZ 304514 B6
243) a lidského T-buněčného lymfomu Jurkat (ATCC číslo: T1B-152). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementovaném 10% fetálním telecím sérem (FCS) (GIBCO, Grand Island, N.Y.) a roztokem antibiotik a antimykotik (ATB) (SigmaAldrich, St. Louis, MO).
Příprava rekombinantního IL-23R
Lidský gen pro receptor IL-23 se skládá z 10 exonů kódujících 629 aminokyselin receptorové molekuly. cDNA kódující extracelulámí část (fragment Gly24-Asn350) lidského receptoru IL23 (IL-23R, GenBank: AF461422.1) byla amplifikována metodou PCR pomocí forward primeru IL23Rex-F-Nco-his (ATTACCATGGGCAGCAGCCACCATCATCATCATCACAGCAGCGGAATTACAAATATAAACTGCTCTGG), obsahujícího startovní kodón a polyhistidinylovou sekvenci (Hisé), a reverzního primeru IL23Rex-R-Xho (GGGCACCTTACTTCTGACAACTGACTCGAGATAT) nesoucího TGA stop kodón. Výsledný PCR produkt byl vložen do pET-28b vektoru (Novagen, Německo) za využití Ncol a Xhol klonovacích míst a vložen do buněk Escherichia coli TOP 10. Výsledný plazmid byl použit pro produkci proteinu v E. coli, kmene SHuffle (SHuffle T7 Express Competent E. coli, New England Biolabs, Ipswich, MA). Bakteriální buňky byly kultivovány v LB médiu s kanamycinem (60 pg/l) při 30 °C, produkce proteinu byla indukována přídavkem lmM isopropyl-p-Dthiogalaktopyranosidu (IPTG) poté, co kultura dosáhla denzity ODéoo = 0,6, a buňky byly sklizeny centrifugací 4 hodiny po indukci. Protein byl extrahován po sonikaci v TN pufru (50mM Tris, 150mM NaCl, pH = 8,0) jako nerozpustný při fyziologickém pH. Sraženina proteinu byla zcentrifugována při 40000xg po dobu 20 minut a promyta TN pufrem, poté centrifugována a rozpuštěna v TN pufru obsahujícím 8M močovinu (50mM Tris, 150mM NaCl, 8M močovina, pH = 8,0). Pro zvýšení čistoty proteinu byla provedena Ni-NTA afinitní chromatografie a výsledný protein byl eluován v elučním pufru EB (50mM Tris, 150mM NaCl, 250mM imidazol, pH = 8,0) obsahujícím 4M močovinu (50mM Tris, 150mM NaCl, 250mM imidazol, 4M močovina, pH = 8,0).
Pro produkci proteinu v periplasmě byla příslušná cDNA vložena po směru čtení (downstream) za pelB-vedoucí sekvenci do pET-26b vektoru (Novagen, Německo) s využitím stejných restrikčních míst jak je uvedeno výše a poté vložena do E. coli kmene BL21 (DE3). Kultura v LB médiu s kanamycinem (60 pg/l) byla pěstována při 30 °C do dosažení denzity OD60o = 1,0, produkce proteinu byla indukována lmM IPTG a buňky byl sklizeny po 4 hodinách. Exprese vedla k produkci nerozpustného proteinu, který byl po sonikaci extrahován 8M močovinou v TN pufru a přečištěn na koloně s Ni-NTA-agarózou.
Produkce rekombinantní podjednotky pl9 cytokinů IL-23
Pro studium interakcí mezi IL-23R a IL-23 byly sestrojeny plazmidové konstrukty pro produkci pl9/IL-23 v bakteriích. Rekombinantní pl9/IL—23 (jeho vypočtená molámí hmotnost je 23,3 kDa) s N-terminálním dvojitým polyhistidylovým motivem His6 a TEV konzervativním štěpícím místem pro proteázu (tzv. DH-p 19 protein) byl připraven použitím syntetické, kodónově optimalizované pl9 kódující cDNA (GENEART, Německo), která byla vpravena do vektoru pET-28b klonováním s využitím Ncol+Xhol restrikčních míst. Vzniklý plazmid byl vložen do buněk E. coli Top 10, namnožen a sekvenováním ověřen. Protein byl poté produkován v hostitelských buňkách E. coli BL21(DE3). Kultivace přes noc v 50 ml média LB obsahujícím 60 pg/ml kanamycinu byla použita pro inokulaci 1 1 LB média a následnou kultivaci při 37 °C do dosažení ODřoo = 1,0. Kultura byla indukována lmM IPTG po dobu 4 h při 37 °C. Buňky byly sklizeny centrifugací (6000xg, 20 min), promyty TN pufrem (50mM Tris pufr s 150mM NaCl, pH = 8) a znovu centrifugovány (5000xg, 10 min). Pelety byly resuspendovány v 10 ml TN pufru a rozrušeny sonikátorem MISONIX 3000. Lyzáty byly centrifugovány 20 min při 40000xg a nerozpustný DH-p 19 byl extrahován z inkluzních tělísek 2 ml 8M močoviny v TN pufru. Močovinový extrakt byl ponechán třepat 1 h při laboratorní teplotě a centrifugován 20 min při 40000xg. Supematant byl aplikován na 1 ml Ni-NTA agarózovou kolonu ekvilibrovanou 5 ml TN pufru. Promývání
-6CZ 304514 B6 bylo prováděno 10 ml TN pufru s 8M močovinou a poté TN pufrem obsahujícím 8M močovinu a 20mM imidazol. DH-pl9 byl eluován TN pufrem obsahujícím 8M močovinu a 250mM imidazol v 0,5ml frakcích.
Alternativně byl rozpustný pl9 připraven z upraveného konstruktu DNA ve formě fuzního proteinu s cDNA proteinu vážícího maltózu (MBP) (Mal E) nesoucího dvojití His6 značení na Nkonci (vypočtená molární hmotnost 69 kDa). Bylo zjištěno, že malE cDNA kódující MBP v kombinaci s modifikací na C-konci podporuje rozpustnost výsledného pl9-MBP fúzního proteinu. Sekvence pl9 byla vložena do vektoru odvozeného od pET-28b, nesoucího sekvenci kódující dvojitý polyhistidinylový tag za tvorby výsledné sekvence pro produkci proteinu His6-MBPTEV-MCS-TEV-6xHis, a to s použitím primerů pl9-F-NheI (GGGCTAGCTAGCAGAGCTGTGCCTGGGGGC) a pl9-R-XhoI (GCGCCTCGAGGGGACTCAGGGTTGCTGCTC). Hostitelské buňky E. coli ΤΘΡ10 (Life Technologies, Carlsbad, CA) byly transformovány vektorem s klonovaným pl9 a vysety na LB agar suplementovaný 60 pg/ml kanamycinu. Protein byl produkován v E. coli BL21(DE3). K inokulaci 50 ml LB média obsahujícího 60 pg/ml kanamycinu byla použita jediná kolonie. 20 ml kultury pěstované přes nos bylo použito k inokulaci 1 1 kultivačního média a dále pěstováno při 37 °C do dosažení OD60o = 0,6. Kultura byla indukována IPTG při 20 °C a ponechána růst 4 h. Buňky byly sklizeny centrifugací 20 min při 6000xg, promyty TN pufrem (pH = 8) a centrifugovány 10 min při 5000xg. Pelety byly resuspendovány v 10 ml TN pufru a rozrušeny ultrazvukovými pulsy na sonikátoru MISONIX3000. Lyzáty byly centrifugovány 20 min při 4000xg. Cytoplazmatická frakce obsahující rozpustný DH-MBP-pl9 byla nalita na 5ml His-Trap kolonu s Ni-NTA agarózou a přečištěna na ÁKTA purifier (GE Healthcare, Británie). Eluce byla provedena ve třech krocích s pufrem obsahujícím 250, 500 a lOOOmM imidazol. Frakce o objemu 1,5 ml získané elucí 500mM imidazolem byly ověřeny na SDS-PAGE a ty, které obsahovaly DH-MBP-pl9, byly sloučeny a použity dále.
ELISA test vazebné aktivity exIL-23R a ρ 19
Rekombinantní extracelulámí receptor IL-23 (exIL-23R) nebo protein pl9 byly imobilizovány přímo na NUNC Polysorp 96-jamkovou destičku zředěním ve vazebném pufru (lOOmM hydrogenuhličitanový/uhliěitanový roztok, pH = 9,6) na koncentraci 5 až 10 pg/ml a inkubovány za nízké teploty (cca 7 °C) přes noc. Další den byla destička omyta PBS pufrem obsahujícím 0,05% Tween (PBST) a blokována 1% BSA rozpuštěným ve stejném roztoku (PBSTB). V případě imobilizace exIL-23R (£. coli SHuffle a BU21 (DE3)) byl tento receptor v 4M močovinovém roztoku zředěn alespoň 20x ve vazebném pufru; a přečištěné rekombinantní proteiny DH-MBP-pl9 i DH-pl9 byly aplikovány v sériovém ředění v PBSTB a detegovány za použití kozí polyklonální protilátky proti lidskému IL-23 (anti—pl9) a následně myšího anti-kozího konjugátu IgGkřenové peroxidázy (HRP) (BioLegend, San Diego, CA), obojí zředěno v PBSTB 1:1000. Vazba exIL-23R k imobilizovanému DH-MBP-pl9 byla detegována pomocí kozí polyklonální protilátky anti-IL-23R (1:250) a následně sekundárního králičího anti-kozího konjugátu sHRP (1:1000) (R&D Systems, Minneapolis, MN).
Všechny experimenty ELISA byly vizualizovány enzymatickou reakcí HRP s OPD substrátem (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) v citrátovém pufru (3,31% dihydrát citrátu trisodného, fosforečná kyselina, pH = 5,0), reakce byla zastavena 2M kyselinou sírovou a byla měřena absorbance při 492 nm.
Pomocí ELISA, kde byly imobilizované proteiny exIL-23R testovány na vazbu pl9, bylo ověřeno, že oba rekombinantní exIL-23R proteiny rozeznávají pl9 protein. Jakje ukázáno na obr. 1, rozpustný DH-MBP-pl9 se váže na imobilizovaný produkt H-exIL23R s vysokou afinitou. Tento výsledek byl potvrzen i inverzním provedením ELISA, kde byl imobilizován DH-MBP-pl9, a také ELIAS testy, kde byl protein DH-MBP-pl9 zaměněn za refoldovaný DH-pl9. Obě varianty proteinů pl9 vázaly také pelB-H-exIL-23R. Kombinace všech dat ukazuje, že refolding HexIL-23R je dostačující pro to, aby byl protein rozpoznán pl9, a tedy může být používán jako cíl pro selekci IL-23 R-specifických vazebných molekul.
-7 CZ 304514 B6
Konstrukce ABD knihovny a selekce pomocí ribozomálního displeje
Kombinatoriální knihovna DNA o teoretické komplexitě 1014 variant proteinů byla vytvořena metodami popsanými dříve (Ahmad JN et al.: Proteins 2012;80(3):774—789). Sestavená knihovna byla transkribována/translatována in vitro v jediném kroku pomocí extraktu E. coli (EasyXpress Protein Synthesis Mini Kit, QIAGEN, Německo) a použita pro selekci přeložených vazebných proteinů pomocí metody ribozomálního displeje. Pro selekci vazebných proteinů byly jamky na Maxisorp destičce (NUNC, Dánsko) pokryty rekombinantním IL-23R, vyprodukovaným kmenem E. coli SHuffle (DH-exIL-23R) a blokovány 3% BSA. Preselekce byla prováděna v jamkách pokrytých jen BSA. Dvě skupiny cDNA vazebných proteinů ABD přepsaných po třetím nebo pátém kole selekčního procesu byly klonovány mezi restrikční místa Ncol a Xhol ve vektoru pET-28b obsahujícím vloženou úplnou sekvenci tolA cDNA, a transformovány do hostitelských buněk E. coli TOP 10. Dále byla na C-konec tolA přidána sekvence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE), umožňující biotinylaci na lysinu a vazbu streptavidinu. Sekvence AviTag byla vložena pomocí PCR s forward primerem EWT5-ABDforl (TTCCTCCATGGGTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTA) a reverzním primerem tolA-AVIrevl (TTTCCGCTCGAGCTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGGCCCGGTTTGAAGTCCAATGGCGC). Finální fúzní vazebné proteiny 6xHis-ABD-TolA-AviTag byly připraveny jako biotinylované proteiny v kmeni Escherichia coli BL21 (DE3) BirA exprimujícím biotin ligázu (BirA). Bakteriální buňky byly kultivovány v LB médiu obsahujícím kanamycin (60 pg/ml) a 50μΜ d-biotin (připraven 5mM roztok v lOmM bicinovém pufru, pH = 8.3). Produkce proteinů byla indukována přidáním 2mM IPTG poté, co kultura dosáhla denzity OD6oo = 0,6. Kultura byla sklizena 4 hodiny po indukci, sonikována v Tris pufru (50mM Tris, 150mM NaCl, pH = 8,0), centrifugována a protein byl pak přečištěn na koloně s Ni-NTA agarózou.
Byla identifikována sada vazebných polypeptidů vážících se na rekombinantní H-exIL-23R. Aby bylo možno produkovat in vivo biotinylované varianty ABD potřebné pro ověření vazebné afinity metodu ELISA, byly varianty ABD nalezené po třetím nebo pátém kole selekčního procesu modifikovány vložením Avitag sekvence po směru přepisu (downstream) od C-konce TolA. Dále byly testovány následující sekvence vazebných polypeptidů:
LAEAKVLANRELDKYGVSDKYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 20) (REX001) LAEAKVLANRELDKYGVSDTYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 21) (REX005) LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 22) (REX009) LAEAKVLANRELDKYGVSDVYKNTINIAIPVRWKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 23) (REX115) LAEAKVLTNRELDKYGVSDAYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 24) (REX122) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 25) (REX125) LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 26) (REX128) LAEAKVLANRELDKYGVSDWYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 27) (REX129) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNPINVAWTVGRVKVWIDAILAPLP (SEQ ID NO. 28) (REX012) LAEAKVLANRELDKYGVSDPYKNPINCACPVTEVKPPIDAILALLP (SEQ. ID NO. 29) (REX016) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNSINPAPQVIWKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 30) (REX101) LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 31) (REX107) LAEAKVLANRELDKYGVSDEYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 32) (REX108) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNSINPAFKVHSVKMGIDWILAGLP (SEQ. ID NO. 33) (REX127) LAETKVLANRELDKYGVSDWYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 34) (REX136).
-8CZ 304514 B6
Konstrukce a produkce proteinu ABD divokého typu (ABDwt)
Pro všechny vazebné testy byl používán fuzní protein TolA s původní albumin-vazebnou doménou (ABDwt) jako negativní kontrola. Konstrukce ABDwt se sekvencemi TolA a AviTag (6xHis-ABDwt-TolA-AVI) byla provedena PCR amplifikaci s ABDwt-tolA plazmidovou DNA jako templátem, forward primerem EWT5-ABDforl (viz výše) a reverzním primerem ABDrev (TTACTAGGATCCAGGTAATGCAGCTAAAATTTC). Amplifikovaný produkt PCR byl štěpen enzymy Ncol a BamHI a ligován do vektoru pET-28b nesoucího sekvenci tolA-AVI po směru (downstream) od BamHI. Výsledný exprimovaný protein ABDwt-TolA-AVI byl produkován a přečištěn stejným způsobem jako modifikované varianty, jak je popsáno výše.
Screening vazebných variant IL-23R metodou ELISA
Pro vazebné testy byly použity vybrané klony a vkládaná sekvence byla ověřena restrikční analýzou (Ncol, BamHI, Xhol) a DNA sekvencováním. Klony obsahující správnou sekvenci 6xHisABD-TolA-AviTag byly použity pro izolaci plazmidové DNA a následnou transformaci kmene E. coli BL21 (DE3) BirA. Pro ELISA analýzu produkovaných modifikovaných variant ABD byl použit buněčný lyzát klonů připravený podle dříve popsaného protokolu (Ahmad JN et al.: Proteins 2012;80(3):774-789) nebo přečištěné proteiny. Byla použita dvě různá sendvičová uspořádání. V prvním případě byla destička NUNC Polysorp přímo pokryta proteinem exIL-23R (5 pg/ml, rekombinantní varianta produkována v kmenu E. coli SHuffle) ve vazebném pufru za nižší teploty (cca 7 °C) přes noc. Další den byla destička omyta pufrem PBST a jamky byly blokovány PBSTB. Vzorky lyzátů REX variant v PBSTB nebo varianty přečištěných proteinů a kontrolní ABDwt byly aplikovány v sériovém ředění v PBSTB a vázané biotinylované REX klony byly detegovány konjugátem streptavidinu-HRP naředěném ve stejném pufru 1:1000 (Pierce). V druhém případě byla destička pokryta streptavidinem (1 pg/ml) ve vazebném pufru a blokována stejným způsobem. Biotinylované varianty modifikovaného ABD naředěné v PBSTB na koncentraci 5 pg/ml byly imobilizovány streptavidinem. exIL-23R v roztoku 4M močoviny byl naředěn 20x a pak dále vždy 3x, takže byla připravena série ředění proteinu v PBSTB a vazba receptoru k variantám modifikovaného ABD byla detegována kozí polyklonální protilátkou antiexIL-23R (1:250) a následně sekundárním králičím anti-kozím HRP konjugátem (1:1000) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Metodou ELISA testované pozitivní buněčné lyzáty klonů polypeptidů podle předkládaného vynálezu s TolA-AVI sekvencemi byly použity pro další analýzu. Kompetiční ELISA stanovení
Destičky Maxisorp nebo Polysorp (NUNC, Denmark) byly pokryty H-exIL-23R vyprodukovaným v kmeni E. coli SHuffle nebo periplazmatickým pelB-exIL-23R vyprodukovaným v E. coli BL21(DE3), a vazba DH-MBP-pl9 nebo DH-pl9 jako analytů byla detegována pomocí protilátek, jak bylo popsáno výše. Alternativně byly destičky pokryty DH-MBP-pl9 nebo DH-pl9 a byla detegována vazba receptorových variant pomocí odpovídajících protilátek. V obou uspořádáních experimentu byla použita konstantní koncentrace každého analytu (20nM DH-MBP-pl9, 50nM DH-pl9, 60nM oba exIL-23R) v roztoku v PBSTB, z níž byly sériovým ředěním připravovány vzorky pro kompetici s testovanými modifikovanými ABD proteiny. Dvě nejúčinněji inhibující varianty, REX009 a REX125, byly testovány na imobilizovaném rekombinantním IL23R Fc chimémím proteinu (R&D Systems, Minneapolis, MN) produkovaném buněčnou linií myšího myelomu. Destička Polysorp byla pokryta 1 až 2 pg/ml IL-23R chimémího proteinu naředěného ve vazebném pufru, a DH-MBP-pl9 (20nM) nebo lidský cytokin IL-23 (23nM) (R&D Systems, Minneapolis, MN) byl následně použit pro kompetici s REX009 a REX 125 obsahujícími klony.
Na základě výsledků vazebných testů byla dále zkoumána schopnost nejlepších modifikovaných ABD proteinů inhibovat vazbu pl9/IL-23R. Zde byla použita kompetiční ELIAS s mobilizovaným H-exIL-23R a konstantním množstvím DH-MBP-pl9 analytu s různými koncentracemi
-9CZ 304514 B6 modifikovaných ABD proteinů-TolA-AVI. Zjistili jsme, že 11 variant vykazuje inhibici vazby pl9 v mikromolámích koncentracích, a dvě nejlepší varianty, REX009 a REX125, dokonce v nanomolámích koncentracích. Výsledky kompetiční ELISA pro 10 nejlepších modifikovaných ABD proteinů jsou ukázány na obr. 5. Pro ověření inhibičního potenciálu polypeptidů podle předkládaného vynálezu byla zopakována kompetiční ELISA i v opačném uspořádání, která potvrdila výsledky.
Ověření stability proteinů pomocí stanovení posunu teplotní denaturace na bázi fluorescenční detekce
Vzorky proteinů (0,1 mg/ml) v HEPES pufru a činidlo 5x Syppo Orange (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) byly smíchány do finálního objemu 25 μΐ. Pomocí real-time PCR Detection System CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, USA) byly proteiny inkubovány v teplotním gradientu od 20 do 80 °C s přírůstkem teploty 0,5 °C v intervalu 30 s. Stupeň rozbalení proteinů byl sledován kanálem FRET (fluorescence resonance energy transfer), který zachycoval spektrální vlastnosti komplexů Sypro Orange s rozbaleným proteinem (excitační vlnová délka «470 nm a emisní vlnová délka «570 nm). Data byla analyzována softwarem CFX Manager a teploty tání byly stanoveny pomocí první derivace spektra.
Detekce IL-23R na povrchu buněk a vazba modifikovaných ABD proteinů a pl9/IL—23 k buněčným liniím
Všechna stanovení byla prováděna v pufru HBSS (ÍOmM HEPES, pH 7,4, 140mM NaCl, 5mMKCl) doplněném 2mM CaCl2, 2mM MgCl2 a 1% (v/v) FCS (cHBSS) na 96-jamkových kultivačních destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark). Barvení molekul IL-23R na buněčném povrchu bylo prováděno tak, že bylo 30 min při 4 °C inkubováno 5 x 105 buněk v 50 μΐ pufru cHBSS obsahujícího anti-lidský IL-23R-APC (ředění 1:5) nebo monoklonální protilátky isotypové kontroly-APC (ředění 1:5). Ve vazebných stanoveních pro modifikované ABD proteiny bylo inkubováno 5 x 105 buněk ve 100 μΐ pufru cHBSS s biotinylovanými modifikovanými ABD proteiny nebo ABD kontrolami (10 pg/ml) po dobu 30 min při 4 °C, promyto cHBSS, a na buňkách vázaný komplex modifikovaného ABD proteinu s biotinem nebo ABD-biotin byl barven streptavidin-phycoerythrinem (ředění 1:400) po dobu 30 min při 4 °C. Při vazebném stanovení s DH-pl9 bylo inkubováno 5 x 105 buněk ve 100 μΐ cHBSS s nebo bez DH-pl9 (10 pg/ml) po dobu 30 min při 4 °C. Buňky byly promyty cHBSS a na buňkách vázaný DH-pl9 byl barven myší monoklonální protilátkou proti pl9 (ředění 1:50) po dobu 30 min při 4 °C a po promytí dále kozí anti-myší prolátkou IgG značenou Cy5 (ředění 1:50) po dobu 30 minut při 4 °C.
Buňky byly promyty, resuspendovány v 100 μΐ HBSS a analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACS LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) v přítomnosti 5 pg/ml propidium jodidu. K vyloučení buněčných agregátů a mrtvých buněk byly použity odpovídající nastavení parametrů pro třídění buněk a vazebná data byla stanovena na základě průměrných intenzit fluorescence (MFI).
DH-pl9 blokování vazby modifikovaných ABD proteinů k buňkám THP-1
Blokování vazby modifikovaných ABD proteinů k buňkám k molekule receptoru IL-23 proteinem DH-pl9 bylo zkoumáno tak, že buňky THP-1 (2 x 105) byly preinkubovány po dobu 15 min při 4 °C v přítomnosti sériově ředěného DH-pl9 v 50 μΐ pufru cHBSS. Biotinylované klony REX-TolA-AVI nebo ABD-WT-TolA-AVI jako negativní kontrola v 50 μΐ pufru cHBSS v konečné koncentraci 13nM byly přidány k buňkám ve stálé přítomnosti DH-pl9 a inkubovány při 4 °C po dobu 30 min. Buňky byly promyty cHBSS a na buňce vázané biotinylované modifikované ABD proteiny nebo ABDwt byly detegovány konjugátem streptavidinu-fykoerytrinu (ředění 1:400) po dobu 30 min při 4 °C. Buňky byly promyty, resuspendovány v 100 μΐ HBSS a analyzovány průtokovou cytometrií, jak je popsáno výše.
-10CZ 304514 B6
Testování T-buněk produkujících IL—17 pomocí anti-CD3 stimulace PBMC
Neseparované buňky periferní krve odebrané do zkumavek obsahujících EDTA byly použity pro získání přečištěných mononukleámích buněk (PBMCs) za použití Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden). PBMCs byly jednou promyty PBS a resuspendovány v úplném médiu RPMI 1640 (RPMI 1640 suplementované 10% tepelně inaktivovaným FCS, 100 U/ml penicilinem, 100 pg/ml streptomycin sulfátem a l,7mM glutamátem sodným). Buňky PBMC byly vyředěny na koncentraci 2x 106 buněk/ml a aktivovány na 96-jamkové destičce předem potažené anti-CD3 (MEM-56, 10 μg/ml, Exbio Praha a.s., Praha) v přítomnosti kostimulačních protilátek (CD28/CD49d, 1 pg/ml, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), IL-23 (10 ng/ml), IL-2 (100 U/ml). Do každé jamky buď nebyl přidán žádný inhibitor, nebo byly přidány modifikované ABD proteiny REX009, REX125, REX128 nebo kontrola ABDwt REXWT (7 pg/ml), a buňky byly ínkubovány tři dny při 37 °C. Pak byly buňky ponechány stát přes noc při 37 °C v čerstvých jamkách. Další ráno byly buňky restimulovány v jamkách předem pokrytých protilátkou anti-CD3 (10 pg/ml, Exbio Praha, Praha) a znovu byly přidány kostimulační protilátky (CD29/CD49d, 1 pg/ml, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Buňky byly inkubovány 2 h při 37 °C. Poté byl do každé jamky přidán brefeldin A (10 pg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Stimulace pokračovala další 4 h při 37 °C. Po inkubaci byly buňky barveny protilátkami proti CD8 Horizon V-500 (BDB) po dobu 15 min ve tmě. Buňky byly pak promyty promývacím pufrem (PBS obsahující 0,1% azid sodný a 2% želatinu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a fixovány pomocí lyzačního roztoku pro FACS/FACS Perm 2 (BDB) podle instrukcí výrobce. Po fixaci a permeabilizaci byly buňky promyty a barveny CD3 PerCP-Cy5.5 (eBioscience, San Diego, CA, USA), CD4 ECD (Immunotech, Marseille, France) a intracelulámími markéry lidského interferonu-γ PE Cy7, IL2 APC, IL17 PB (eBioscience) a CD 154 PE (Immunotech). Buňky pak byly znovu promyty a měřeny na průtokovém cytometru FACS ARIA II (BDB). Pomocí trubiček BD Truecount (BDB) naplněných známým množstvím referenčních perliček byly získány absolutní počty buněk, a buňky byly barveny Syto-16 a DAPI (Invitrogen).
Seznam sekvencí <110> Biotechnologický ústav AV ČR, v. v. i.
<120> Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23 <130> P <160> 34 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 1
Lys Tyr Lys Asn Gly ile Asn Asn Ala Leu Cys val Arg Arg Val Lys 15 10 15
Ala Leu Ile Asp Trp ile Leu Ala Tyr Leu Pro 20 25
- 11 CZ 304514 B6 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 2
Thr Tyr Lys Asn Asp Ile Asn Ala Ala Ser Tyr 10 val Pro Ala val 15 Lys
1 5
Trp Ala Ile Asp Arg Ile Leu Ala Ser Leu Pro
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
<400> 3
Tyr Tyr Lys Asn Arg Ile Asn Pro Ala Cys His val Leu Ser val Lys
1 5 10 15
Ser t Asn Ile Asp Trp Ile Leu Ala Ser Leu Pro
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
<400> 4
Val Tyr Lys Asn Thr Ile Asn ile Ala Ile Pro val Arg val Val Lys
1 5 10 15
Arg val Ile Asp Trp Ile Leu Ala val Leu Pro
25 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
- 12CZ 304514 B6
<400> 5
Ala 1 Tyr Lys Asn Leu ile 5 Asn Ala Ala Leu ile val Ala Lys val Lys
10 15
Leu Leu Ile Asp Ala Ile Leu Ala Pro Leu Pro
20 25
<210> 6
5 <211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
10 <223> modified ABD sequence
<400> 6
His Tyr Lys Asn Trp ile Asn Pro Ala Arg Arg val Arg Pro val Lys
1 5 10 15
Trp Leu ile Asp Ala ile Leu Ala Ala Leu Pro
20 25
15 <210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> modified ABD sequence
<400> 7
Arg Tyr Lys Asn Ser Ile Asn Arg Ala Leu Pro val Ala Ala val Lys
1 5 10 15
Trp Ala Leu Asp Leu ile Leu Ala Trp Leu Pro
25 20 25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
30 <213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
35 <400> 8
Trp Tyr Lys Asn Cys Ile Thr Ala Ala Arg Ala Val Thr Thr val Lys
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Thr ile Leu Ala Leu Leu Pro
25
- 13 CZ 304514 B6 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 9
His Tyr Lys Asn Pro Ile Asn Val Ala Trp Thr Val Gly Arg Val Lys
1 5 10 15
val Trp ile Asp Ala Ile Leu Ala Pro Leu Pro
20 25
<210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
<400> 10
Pro Tyr Lys Asn Pro ile Asn Cys Ala Cys Pro val Thr Glu val Lys
1 5 10 15
Pro Pro ile Asp Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro
20 25
<210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 11
His Tyr Lys Asn Ser Ile Asn Pro Ala Pro Gin Val Ile Val Val Lys 15 10 15
Val Asn Ile Asp Leu ile Leu Ala Gly Leu Pro 20 25 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
- 14CZ 304514 B6 <400> 12
Arg Tyr Lys Asn Trp ile Asn Arg Ala Trp Leu Val Ala Leu val Lys 15 10 15
Arg Gin ile Asp Gin Ile Leu Ala Leu Leu Pro 20 25 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 13
Glu Tyr Lys Asn Ala ile Asn Ala Ala Asn Pro val Ser Gly val Lys 15 10 15
Arg Pro ile Asp val ile Leu Ala Ala Leu Pro 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 14
His Tyr Lys Asn Ser ile Asn Pro Ala Phe Lys Val His Ser Val Lys 15 10 15
Met Gly Ile Asp Trp ile Leu Ala Gly Leu Pro 20 25 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 15 <400> 15
Trp Tyr Lys Asn Arg ile Asn Thr Ala Leu Thr Val Ala Cys val Lys 15 10 15
Leu Val Ile Asp Trp Ile Leu Ala Ala Leu Pro 20 25
- 15CZ 304514 B6 <210> 16 <211> 46 <212> PRT <213> Streptococcus sp.
<400> 16
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr val Glu
20 25 30
Gly val Lys Ala Leu ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
40 45 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 17
Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15 val ser Asp <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 18
Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Thr Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15 val Ser Asp <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
-16CZ 304514 B6 <400> 19
Leu Ala Glu Thr Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15
Val Ser Asp <210> 20 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 20
Leu Ala Glu Ala 1 Lys 5 val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
10 15
val Ser Asp Lys Tyr Lys Asn Gly Ile Asn Asn Ala Leu cys Val Arg
20 25 30
Arg val Lys Ala Leu ile Asp Trp Ile Leu Ala Tyr Leu Pro
40 45 <210> 21 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 21
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Thr Tyr Lys Asn Asp ile Asn Ala Ala Ser Tyr val Pro
20 25 30
Ala Val Lys Trp Ala Ile Asp Arg Ile Leu Ala Ser Leu Pro
40 45 <210> 22 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
- 17CZ 304514 B6 <400> 22
Leu Ala Glu Ala 1 Lys 5 val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Arg Ile Asn Pro Ala cys His val Leu
20 25 30
Ser val Lys Ser Asn Ile Asp Trp Ile Leu Ala Ser Leu pro
40 45 <210> 23 5 <211> 46 <212> PRT <213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
<400> 23
Leu 1 Ala Glu Ala Lys 5 val Leu Ala Asn Arg 10 Glu Leu Asp Lys Tyr 15 Gly
val Ser Asp val 20 Tyr Lys Asn Thr Ile 25 Asn ile Ala ile Pro 30 val Arg
val val Lys 35 Arg val ile Asp Trp 40 Ile Leu Ala val Leu 45 Pro
<210> 24 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 24
Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Thr Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Ala Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Ala Ala Leu ile val Ala
20 25 30
Lys Val Lys Leu Leu ile Asp Ala Ile Leu Ala Pro Leu Pro
40 45 <210> 25 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
- 18CZ 304514 B6 <400> 25
Leu Ala Glu 1 Ala Lys Val 5 Leu Ala Asn Arg 10 Glu Leu Asp Lys Tyr 15 Gly
val Ser Asp His Tyr Lys Asn Trp Ile Asn Pro Ala Arg Arg Val Arg
20 25 30
Pro val Lys Trp Leu Ile Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
40 45 <210> 26 5 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 26
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Arg Tyr Lys Asn Ser Ile Asn Arg Ala Leu Pro Val Ala
20 25 30
Ala val Lys Trp Ala Leu Asp Leu Ile Leu Ala Trp Leu Pro
40 45 <210> 27 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 27
Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Trp Tyr Lys Asn cys ile Thr Ala Ala Arg Ala val Thr
20 25 30
Thr Val Lys Leu Leu ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Leu pro
40 45 <210> 28 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
-19CZ 304514 B6 <400> 28
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val ser Asp Hi s Tyr Lys Asn Pro Ile Asn val Ala Trp Thr val Gly
20 25 30
Arg val Lys val Trp ile Asp Ala Ile Leu Ala Pro Leu Pro
40 45 <210> 29 <211> 46 <212> PRT <213> artificial
<220>
<223> modified ABD sequence
<400> 29
Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Pro Tyr Lys Asn Pro ile Asn cys Ala cys Pro val Thr
20 25 30
Glu val Lys Pro Pro ile Asp Ala Ile Leu Ala Leu Leu pro
35 40 45
<210> 30 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 30
Leu Ala Glu Ala 1 Lys 5 val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
10 15
val Ser Asp His Tyr Lys Asn Ser Ile Asn pro Ala Pro Gin Val Ile
20 25 30
val val Lys val Asn Ile Asp Leu ile Leu Ala Gly Leu pro
40 45 <210> 31 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
-20CZ 304514 B6
<400> 31 Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg 10 Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 val Ser 5 Arg Ala Trp 15
Asp Arg Tyr 20 Lys Asn Trp Ile 25 Asn Leu 30 val Ala
Leu val Lys Arg Gin ile Asp Gin Ile Leu Ala Leu Leu Pro
35 40 45
<210> 32 <211> 46 <212> PRT <213> artificial ío <220>
<223> modified ABD sequence <400> 32
Leu Ala Glu Ala 1 Lys 5 val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
10 15
val Ser Asp Glu Tyr Lys Asn Ala Ile Asn Ala Ala Asn Pro val Ser
20 25 30
Gly val Lys Arg Pro ile Asp val ile Leu Ala Ala Leu Pro
40 45 <210> 33 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence <400> 33
Leu Ala Glu Ala 1 Lys 5 Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
10 15
val Ser Asp His Tyr Lys Asn Ser ile Asn Pro Ala Phe Lys Val Hi s
20 25 30
Ser val Lys Met Gly ile Asp Trp ile Leu Ala Gly Leu Pro
25 3 5 4 0 4 5 <210> 34 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> modified ABD sequence
-21 CZ 304514 B6
<400: > 34
Leu Ala Glu Thr Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
val Ser Asp Trp Tyr Lys Asn Arg Ile Asn Thr Ala Leu Thr Val Ala
20 25 30
Cys Val Lys Leu Val Ile Asp Trp Ile Leu Ala Ala Leu pro
35 40 45
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Polypeptid, obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:
KYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 1) TYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 2) YYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 3) VYKNTINIAIPVRVVKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 4) AYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 5) HYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 6) RYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 7) WYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 8) HYKNSINPAPQVIVVKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 11) RYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 12) EYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 13) WYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 15)
15 přičemž na N-konci uvedené sekvence je přímo připojena sekvence mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující
LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 17)
LAEAKVLTNRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 18)
LAETKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 19),
20 přičemž asociační a disociační rovnováha vazby uvedeného polypeptidu na receptor pro lidský cytokin IL-23 charakterizovaná vazebnou afinitní konstantou Kd vykazuje hodnotu menší než ΙΟ'7 M.
2. Sekvence DNA vybraná ze skupiny zahrnující komplementární DNA kódující aminokyseli25 novou sekvenci polypeptidů podle nároku 1 a DNA hybridizující s uvedenou komplementární
DNA za vysoce stringentních podmínek.
-22CZ 304514 B6
3. Použití sekvence DNA podle nároku 2 pro přípravu polypeptidů podle nároku 1 produkovaných v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích nebo lidských hostitelských buňkách.
4. Hostitelské buňky obsahující komplementární sekvenci DNA podle nároku 2 kódující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle nároku 1.
5. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v medicíně.
6. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v léčbě autoimunitních chorob.
7. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v léčbě autoimunitních chorob vybraných ze skupiny zahrnující psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.
8. Polypeptid podle nároku 1 pro použití jako diagnostické činidlo.
9. Použití polypeptidu podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob.
10. Použití polypeptidu podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob vybraných ze skupiny zahrnující psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.
CZ2012-829A 2012-11-23 2012-11-23 Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23 CZ304514B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-829A CZ304514B6 (cs) 2012-11-23 2012-11-23 Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23
PCT/CZ2013/000137 WO2014079399A1 (en) 2012-11-23 2013-10-25 Polypeptide antagonists of human il-23 receptor for treatment of autoimmune diseases
EP13792577.2A EP2922560B1 (en) 2012-11-23 2013-10-25 Polypeptide antagonists of human il-23 receptor for treatment of autoimmune diseases

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-829A CZ304514B6 (cs) 2012-11-23 2012-11-23 Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2012829A3 CZ2012829A3 (cs) 2014-06-11
CZ304514B6 true CZ304514B6 (cs) 2014-06-11

Family

ID=49619773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2012-829A CZ304514B6 (cs) 2012-11-23 2012-11-23 Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2922560B1 (cs)
CZ (1) CZ304514B6 (cs)
WO (1) WO2014079399A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307849B6 (cs) * 2016-06-03 2019-06-26 Biotechnologický ústav AV ČR, v. v. i. Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci podjednotky p19 lidského cytokinu IL-23

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11505576B2 (en) 2018-03-13 2022-11-22 Affibody Ab Polypeptides based on a scaffold

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010027767A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-11 Schering Corporation Engineered anti-il-23r antibodies
US20110086770A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Anaphore, Inc. Combinatorial Libraries Based on C-type Lectin-like Domain

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2380594B1 (en) 2004-04-06 2019-12-04 Affibody AB Use of a serum albumin binding peptide to reduce the immunogenicity of a protein
HUE042172T2 (hu) 2007-02-23 2019-06-28 Merck Sharp & Dohme Genetikailag elõállított anti-il-23P19 antitestek
CN101990547A (zh) * 2007-07-06 2011-03-23 瓦勒瑞萨欣Hsj有限合伙公司 Il-23受体拮抗剂以及其应用
MX2011002159A (es) 2008-08-27 2011-03-29 Schering Corp Formulaciones liofilizadas de anticuerpos anti-interleucina-23p19 construidos por ingenieria.
EP2435480A1 (en) * 2009-05-27 2012-04-04 Ablynx N.V. Biparatopic protein constructs directed against il-23
EA201270713A1 (ru) 2010-02-18 2013-01-30 Бристол-Майерс Сквибб Компани Белки на основе фибронектина с каркасными доменами, которые связывают ил-23
US20130302343A1 (en) 2011-01-04 2013-11-14 Charité Universitätsmedizin Berlin Modulators of il-12 and/or il-23 for the prevention or treatment of alzheimer's disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010027767A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-11 Schering Corporation Engineered anti-il-23r antibodies
US20110086770A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Anaphore, Inc. Combinatorial Libraries Based on C-type Lectin-like Domain

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ahmad JN et al. Novel high-affinity binders of human interferon gamma derived from albumin-binding domain of protein G. Proteins, 2012, 80, 774-789, publikováno online 29.10.2011. *
Alm T et al. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnology Journal, 2010, 5(6), 605-617. *
Jonsson A et al. Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin. Protein Engineering, Design & Selection, 2008, 21(8), 515-527. *
Zahnd C et al. Ribosome display: selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a target. Nature Methods, 2007, 4(3), 269-279. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307849B6 (cs) * 2016-06-03 2019-06-26 Biotechnologický ústav AV ČR, v. v. i. Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci podjednotky p19 lidského cytokinu IL-23

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014079399A1 (en) 2014-05-30
EP2922560A1 (en) 2015-09-30
CZ2012829A3 (cs) 2014-06-11
EP2922560B1 (en) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2018526989A (ja) Ｌａｇ−３およびｐｄ−１に特異的な新規融合ポリペプチド
JP6475713B2 (ja) 標的修飾ｉｌ−１ファミリーメンバー
JP7482488B2 (ja) Ｃｄ１３７とｐｄ－ｌ１に特異的な新規融合タンパク質
US9221885B2 (en) Muteins of human lipocalin 2 with affinity for CTLA-4
KR20160014010A (ko) 신규 항체
KR20180002855A (ko) 항암 융합 폴리펩타이드
JP2017521998A (ja) 新規多重特異性分子及びかかる多重特異性分子に基づく新規治療方法
JP5368301B2 (ja) 可溶性ヘテロ二量体レセプター及びその使用
TW201529601A (zh) 人類抗ｉｌ－３３中和單株抗體
KR20160007604A (ko) 이중특이성 작제물 및 다양한 질병의 치료에서의 이의 용도
CA3175728A1 (en) Interleukin-2 mutant and use thereof
WO2018134279A1 (en) Novel fusion polypeptides specific for lag-3 and pd-1
Velásquez et al. Leucine-rich-repeat-containing variable lymphocyte receptors as modules to target plant-expressed proteins
CZ304514B6 (cs) Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23
KR20160113268A (ko) 이기능 융합단백질,이의 제조방법 및 용도
Moricoli et al. Blocking monocyte transmigration in in vitro system by a human antibody scFv anti-CD99. Efficient large scale purification from periplasmic inclusion bodies in E. coli expression system
CZ307849B6 (cs) Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci podjednotky p19 lidského cytokinu IL-23
JP2023116826A (ja) 抗原結合分子
KR102154177B1 (ko) 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법
JP2023527908A (ja) ４－１ｂｂをターゲティングする多量体免疫調節物質
CN117242094A (zh) 蛋白酶可切割的前药
Qing et al. Construction and characterization of an enhanced GFP-tagged TIM-1 fusion protein
CN115605494A (zh) 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20201123