KR20160014010A - 신규 항체 - Google Patents

신규 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20160014010A
KR20160014010A KR1020157036661A KR20157036661A KR20160014010A KR 20160014010 A KR20160014010 A KR 20160014010A KR 1020157036661 A KR1020157036661 A KR 1020157036661A KR 20157036661 A KR20157036661 A KR 20157036661A KR 20160014010 A KR20160014010 A KR 20160014010A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
gly
thr
ser
antibody
Prior art date
Application number
KR1020157036661A
Other languages
English (en)
Inventor
테 군데
세바스티안 메이어
데이비드 우레흐
Original Assignee
누맙 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2014/001282 external-priority patent/WO2014180577A1/en
Application filed by 누맙 아게 filed Critical 누맙 아게
Publication of KR20160014010A publication Critical patent/KR20160014010A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 높은 친화성과 높은 항체성을 겸비한 신규한 항체들, 상세하게는 신규한 항원결정부위에 대한 신규한 항체들에 관한 것이다.

Description

신규 항체{NOVEL ANTIBODIES}
본 발명은 높은 친화성과 높은 항체성을 겸비한 신규한 항체들, 상세하게는 신규한 항원결정부위에 대한 신규한 항체들에 관한 것이다.
본 발명은 고친화성과 고항체성을 겸비한 신규한 항-CD3 항체들에 관한 것으로, 더 상세하게는 신규한 CD3 항원결정부위를 특이적으로 인식할 수 있는 신규한 항체들에 관한 것이다.
T 세포 수용체 또는 TCR은 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에서 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것을 담당하는 T 임파구 (또는 T 세포)의 표면 상에서 발견되는 분자이다. TCR과 항원 사이의 결합은 친화도가 상대적으로 낮다. TCR이 항원 및 MHC와 연계될 때, T 임파구는 연합되어 있는 효소들, 보조-수용체들, 특정화된 부속 분자들 및 활성화되었거나 방출된 전사 인자들에 의해 매개되는 일련의 생화학적 사건들을 통해 활성화된다.
상기 TCR은 포유동물에서 세 개 구별되는 사슬 (γ, δ, 및 ε)을 보유하고 있는 CD3, 및 ζ2 (CD247) 복합체 또는 ζ/η 복합체와 같은 다른 분자와 연합된다. 이러한 부속 분자들은 경막 부위를 가지며 및 TCR로부터 상기 세포로 신호를 전달하는 데 활성적이다; TCR의 세포질 꼬리는 매우 짧아서, 신호 전달에 참여하는 것으로 보이지 않는다. CD3- 및 ζ-사슬들은, TCR과 함께, T 세포 수용체 복합체로 알려진 것을 형성한다.
CD3ε은 특정 T 세포의 표면상에 발현되는 타입 I 경막 단백질이다. 이는 세포 수용체 (TCR) 복합체에 참여하고 및 이 복합체의 다른 도메인과 상호작용한다. 이러한 상호작용 파트너들 중의 하나는 CD3γ고, 이는 CD3ε과 1:1 화학 당량으로 결합한다 (De la Hera 등, J. Exp.Med.1991; 173: 7-17). 도 5는 CD3ε/CD3γ를 포함하는 TCR 복합체의 모식도이다. TCR이 항원 제시 세포 (APC)의 표면상에 있는 MHC-펩타이드 복합체에 결합하고 후속적으로 T 세포가 APC를 따라 이동하게 되면 TCR 복합체가 회전하게 되어 CD3ε 및 CD3γ가 서로에 대하여 떨어지는 결과를 낳고, 이는 효과적인 TCR 신호전달에 및 따라서 T-세포들의 활성화에 요구되는 것으로 믿어진다. CD3ε에 대한 특정 항체들은 TCR 신호전달을 유도하는 것으로 증명되었으나 다른 것들은 그렇지 않았다. TCR-활성화 항체들은 전형적으로 CD3ε 상의 노출된 항원결정부위에 결합하나 (참조 도 5, "작동적 (agonistic) 항원결정부위"), 반면 특정 비자극 항체들은 CD3ε 및 CD3γ 사이의 계면에 또는 CD3ε 및 CD3γ 둘 다에 동시에 결합하는 것으로 증명이 되었고 (참조 도 5, "길항적 (antagonistic) 항원결정부위"), 따라서 CD3ε 및 CD3γ의 상대적 변위를 방해할 가능성이 있다 (Kim 등, JBC.2009; 284: 31028-31037).
펩타이드-MHC 복합체들은 TCR과 저친화도 및 빠른 이탈 속도로써 결합한다고 알려져 있다 (Matsui 등, Science. 1991; 254: 1788-1791; Weber 등, Nature. 1992; 356: 793-796). 이러한 낮은 친화도는 몇 개의 펩타이드-MHC 복합체들이 반복적으로 결합하고 해리됨으로써 많은 TCR들을 일련적으로 촉발하게 하는데 유용하다는 것이 제시되었다 (Valitutti 등, Nature. 1995; 375: 148-151). 이러한 일련적 촉발은 오랫동안 신호전달을 지속하게 하여 T 세포들이 결국 활성화 역치에 도달하게 하는 데 결정적이다 (Valitutti 등, Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia 등, Cell. 1999; 96: 1-4). 이러한 개념은 펩타이드-MHC 복합체들과 비교할 때, 높은 친화성 항-CD3 항체들이 TCR을 1:1 화학양론적으로 촉발하기 때문에 T 세포들을 효과적으로 자극하지 못한다는 것의 발견에 의해 지지되고 있고 (Viola 등, Science 1996; 273: 104-106), 이는 낮은 친화성 항체들이, 반복적으로 CD3ε과 해리하고 재결합하는 능력으로 인해 TCR 신호전달을 통해 T 세포를 자극하는 데 더 효과적이 될 수 있다는 것을 제시하고 있다. 실제, 모두 상이한 친화도로 결합하는, 항-CD3ε 항체 TR66의 세 가지 유도체와 직접 비교하면, 중간 친화도를 가지는 야생형 TR66가 더 높거나 낮은 친화도를 가지는 이의 유도체에 비하여 T 세포 활성화에서 최고 효율을 나타냈다 (Bortoletto 등, J. Immuno. 2002;32:3102-3107). 따라서, TR66과 유사한 KD 는 T 세포들을 자극하는 데 이상적이다. TR66의 친화도는 표면-플라즈몬 공명 (SPR) 기술은 물론 유세포법을 사용하여 결정되었고, 평형해리 상수가 각각 2.6 x 10-7 M (Moore 등, Blood. 2011; 117: 4542-4551) 및 1.0 x 10-7 M (Amann 등, Cancer Res. 2008; 68: 143-151)으로 산출되었다. 이와 일치되게, 10-8 M 미만의 친화도를 가지는 항-CD3 항체들을 사용하는 것에 권고되었고 (미국특허번호7,112,324), 및 인간 요법에 대하여 공개된 T 세포-자극성 항체들은 동일한 범위 내 친화도를 가지고 인간 CD3ε에 결합한다. 따라서, 일련의 TCR 촉발의 이론에 따라서 및 항-CD3ε 항체들에 대하여 공개된 결과와 일치하여, 공개된 것보다 상당히 더 나은 친화도를 가지는 단클론성 항체들은 T 세포들의 더 강력한 자극자인 것으로 예상되지 않고 반대로 더 약한 활성자인 것으로 예상된다.
CD3ε 대한 공개된 항체들 일부는 T 세포 제조물로 동물들을 면역화하고 후속적으로 소위 하이브리도마 과정에 의해 단클론성 항체들을 분리함으로써 생성되었다. 이러한 방식의 약점은, 한편으로는, 동물에서 다양한 외부 (인간) T 세포들에 대한 비선택적 면역 반응 및 다른 한편으로는 하이브리도마 과정의 빈약한 효율이 T 세포-자극 활성을 가진 단클론성 항체들을 확인하는 확률을 감소시키는 것이고, 이는 이러한 작동적 항체들이 항-CD3ε 항체들 전체에서 소수를 대변하고 있기 때문이다. 타겟된 항원결정부위를 관통하는 선형 펩타이드로 면역화하면 면역 반응의 선택성을 높이나, 천연적인 전장 CD3ε을 인식하지 못하거나 비선택적TCR 자극을 발휘하는 항체들을 결과할 수 있다.
다른 타입-I 경막 단백질로 동물을 면역화하는 경우, 정제된 세포외 도메인 (ECD)을 사용하는 것이 특히 유용하다. 그러나, CD3ε의 정제된 ECD는 집합되는 성형이 있고, 집합체들은 천연 단백질에 비해 변경된 구조를 가질 수 있다. 또한, 이러한 방식은 선호적으로 항체들이 CD3ε 및 CD3γ 사이의 계면에 결합하도록 이끌 수 있다. 반대로, 유연한 펩타이드 링커에 의해 연결된, 단쇄 단백질로서 생성된 CD3ε 및 CD3γ의 복합체는 단량체 분획물로서 및 이의 천연 구조로 정제될 수 있다 (Kim 등, JMB.2000; 302: 899-916). 그러한 CD3ε/γ 단쇄 단백질로 동물들을 면역화하는 것은 CD3ε 및 CD3γ를 동시에 결합하는 항체들로 유도될 수 있고, 이는 길항적 효과를 결과하게 된다.
인간 CD3ε에 대하여 지향된 몇 가지 항체들은 과거에 개발된 것이다.
단클론성 항체 SP34는 비인간 영장류 CD3와 교차 결합하는 쥐 항체이고, 또한 인간 및 비인간 영장류 PBMC들 둘 다에서 세포 증식을 유도할 수 있다 (Pessano 등., The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20-kD T3 (T3δ and T3ε) subunits. EMBO J 4 (1985) 337-344).
WO 2007/042261 및 WO 2008/119567는 둘 다 Micromet에 의해 출원된 것으로, CD3ε에서 각각 항원결정부위 FSEXE 및 QDGNE에 대하여 지향된 교차-반응성 결합자들을 개시하고 있다. 허여된 유럽 특허 번호 EP 2 155 783 (WO 2008/119567의 지역적 단계에 기반한)에 대한 몇몇의 대립자들에 의해 출원된 반대적인 과정에서, SP34는 항원결정부위 QDGNE에 또한 결합하고 있다고 제시된다.
그러나, 항-CD3 항체들을 얻는 것, 또는 일반적으로 특히 유리한 특성을 지닌 분자들과 결합하는 것을 실현하기 위해 많은 시도를 했음에도 불구하고, 아직까지 제한된 성공만을 이뤘을 뿐이다.
따라서, 고 효능을 제한하지 않고, 높은 친화도를 가진 신규한 CD3 결합 분자들, 특히 신규한 항-CD3 항체들을 개발할 필요가 여전히 만족하지 못한 채 남아있다. 또한, 다른 종과, 특히 사이노멀거스 원숭이들과 같은 비인간 영장류와 교차 반응성인, 높은 친화도를 가진 신규한 CD3 결합 분자들, 특히 신규한 항-CD3 항체들을 개발할, 충족되지 않은 필요가 있다.
이러한 문제에 대한, 본 발명에 의해 제공되는 해결책, 즉 토끼를 유전적으로 면역화하고 및 친화성 성숙 메모리 B-세포를 스크리닝함으로써 얻는, CD3-결합 분자들, 특히 항-CD3 항체들, 및 신규한 작동성 항원 결정부위에 대한 특이성을 가진 CD3-결합 분자들, 특히 항-CD3 항체들은 여태까지 선행 기술에 의해 성취되거나 제시되지 않았다.
본 발명은 결합 부위 특히 항원-결합 부위를 포함하는 신규한 단리된 CD3-결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것으로서, 상기 분자, 특히 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물은 인간 CD3의 항원결정부위에, 특히 CD3ε의 신규한 작동성 항원결정부위에 특이적이며, 상기 결합 분자, 특히 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 선행기술 항체들, 특히 OKT-3 및/또는 TR66보다 더 높은 친화도를 가지며 동시에 더 높은 효능을 보인다.
본 발명은 결합 부위 특히 항원-결합 부위를 포함하는 신규한 단리된 CD3-결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것으로서, 상기 분자, 특히 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물은 인간 CD3의 항원결정부위에, 특히 CD3ε의 신규한 작동성 항원결정부위에 특이적이며, 상기 결합 분자, 특히 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 선행기술 항체들, 특히 OKT-3 및/또는 TR66보다 더 높은 친화도를 가지며 동시에 더 높은 효능을 보인다.
따라서, 제1관점에서, 본 발명은 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적인 결합부위를 포함하는 단리된 결합 분자, 특히 결합에 결정적인 잔기로서 아미노산 잔기 N4를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제2 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 것으로서, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수로써 인간 CD3에 결합하는 신규한 단리된 CD3-결합 분자에 관한 것이고, 특히, 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M미만의 일가 결합에 대한 해리상수로써 인간 CD3에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제3 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5배 강하게 T-세포 활성화를 유도하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제4 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 더 길게 지속되는 T-세포 활성화를 결과하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제5 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, T-세포들의 용량-의존적 균등한 활성화 상태를 결과하는 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제6 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, IgG 포맷에서 시험할 때, (i) 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수에서 인간 CD3와 결합하고; 및 (iia) 교차연결시, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5배 더 강한 T-세포 활성화를 유도하고; (iib) 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66을 사용할 때보다 더 길게 유지되는 T-세포 활성화를 결과하고; (iic) T-세포의 용량 의존적 균등한 활성화를 결과하고; 및/또는 (iid) 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적이며, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로서 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
제7 관점에서, 본 발명은 후술하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물과 같은 항원결정부위에 기본적으로 결합하는, 단리된 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 가능적 단편물에 관한 것이다.
제8 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물, 및 조건적으로는 약학적 허용 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제9 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물에 관한 것이다.
제10 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물을 포함하는 벡터 또는 벡터들의 집합물에 관한 것이다.
제11 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터들의 집합물을 포함하는 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포에 관한 것이다.
제12 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터들의 집합물, 또는 본 발명의 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
제13 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 기능적 항체 단편물을 생성하는 방법으로서:
a) 토끼를 CD3ε-발현 플라즈미드로 면역화하여 천연 전장 CD3ε을 숙주 세포들의 표면 상에 제시하는 단계;
b) 형광 활성된 세포 분류법을 사용하여 CD3ε/γ 단쇄와 상호작용하는 친화도 숙성 메모리 B-세포를 클론 분리하는 단계;
c) 단일 분류된 B 세포를 분류된 클론의 불멸화를 요구하지 않는 공동 배양 시스템에서 배양하는 단계;
d) B 세포 배양 상등액을 세포-기반 ELISA에서 스크리닝하여 T 세포의 표면 상의 TCR 복합체에 끼워져 있는 천연 CD3ε에 결합하는 항체들을 동정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제14 관점에서 본 발명은 CD3 입실론과 CD3 감마 사이의 계면에는 위치하지 않고 및T 세포 상에 발현된 천연 TCR의 맥락에서 항체에 의해 여전히 결합될 수 있는 CD3 입실론의 아미노산 잔기들을 독점적으로 포함하는 인간 CD3 입실론의 특정 항원결정부위에 관한 것으로서, 본 발명의 가교된 항체들에 대한 이의 결합은 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5 배 강한 T-세포 활성화를 유도하고; (iib) 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서에서 72 시간 자극 후 CD69 발현에서 적어도 1.5 배 더 큰 증가로 나타내는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66을 사용하는 것보다 더 오랫동안 유지되는 T-세포 활성화를 결과하고; 및/또는 (iic) T-세포들의 용량 의존적 균질적인 활성화 상태를 결과하는 항원결정부위에 관한 것이다.
제15 관점에서, 본 발명은 인간 CD3ε의 신규한 항원결정부위에 특이적인 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 동정하는 방법으로서, (a) 인간 CD3에 결합하는 하나 이상의 분자 중에서, 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적인 결합 부위를 포함하고, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로 포함하는 적어도 하나의 결합 분자를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 결합 부위 특히 항원-결합 부위를 포함하는 신규한 단리된 CD3-결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것으로서, 상기 분자, 특히 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물은 인간 CD3의 항원결정부위에, 특히 CD3ε의 신규한 작동성 항원결정부위에 특이적이며, 상기 결합 분자, 특히 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 선행기술 항체들, 특히 OKT-3 및/또는 TR66보다 더 높은 친화도를 가지며 동시에 더 높은 효능을 보인다.
도 1은 단클론성 토끼 항체들로부터의 연계된 VH 및 VL CDR 서열들의 계통발생적 클러스팅을 나타낸다.
도 2는 정제된 단클론성 토끼 항체의 저캣 (Jurkat) T 세포에 대한 결합을 나타낸다.
도 3은 교차 연결된 항-CD3ε mAb들에 의한 CD69 발현의 자극을 나타낸다. T-세포 활성화를 유도하는, 정제된 단클론성 토끼 항-CD3 항체들 및 비교 항체들 TR66 및 OKT-3의 능력을 CD69 발현을 측정하여 평가하였다. 세 가지 상이한 농도의 교차 연결된 항체들을 사용하여 저캣 세포를 자극하였고 및 24 시간 후 유세포 분석법으로 CD69 발현을 평가하였다. 항체 농도는 1.25 μg/ml (a), 5.0 μg/ml (b) 및 20 μg/ml (c)이었다.
도 4 는 시간에 따른 교차 연결된 토끼 mAb들에 의한 CD69의 자극을 나타낸다. T-세포 활성화를 유도하는, 정제된 단클론성 토끼 항-CD3 항체들의 능력을 CD69 발현을 측정함으로써 산정하였다. 교차 연결된 항체들을 5.0 μg/ml의 농도에서 사용하여 저캣 세포들을 자극하고 및 0, 4, 15, 24, 48 및 72 시간 후에 유세포분석법을 사용하여 CD69 발현을 평가하였다. CD69 발현을 정성적으로 검출하기 위해, 기하 평균에서 신호강도를 반영하는 평균 형광 강도 (MFI)를 음성 대조군은 물론 시험 항체들 둘 다에 대하여 측정하였다. 시험 항체 및 음성 대조군 간의 MFI 차이 (ΔMFI)를 CD69 발현에 대한 측정치로서 계산하였다.
도 5는 TCR 복합체, CD3ε/CD3γ를 포함한, TCR 복합체의 간편화된 모식도를 나타낸다.
도 6은 선행 기술 항체들의 항원결정부위 매핑 실험의 결과를 나타낸다: (a) 항체 SP34의 항원결정부위 매핑 (EP 2 155 788의 포대 참조); (b) Micromet 항체의 항원결정부위 매핑 (EP 2 155 788 / WO 2008/119567 참조; 도 6은 단일 알라닌 돌연변이들의 결합 실험 결과를 나타낸 것으로, 주어진 돌연변이에 대한 결합의 감소는 항체 결합에 관하여, 상응하는 야생형 아미노산 잔기의 관련성을 나타낸다 (예, 낮은 막대 = 결합에 대한 높은 상관성).
도 7은 본 발명의 항체들에 대하여, ELISA에 의한 항원결정부위 매핑 실험의 결과를 나타낸다 (클론-02, 클론-03, 클론-06); 도 7은 결합 실험의 결과를 펩타이드 스캔 분석으로 나타낸다. 인간 CD3ε으로부터 유도된 15-량체 (15-mer) 선형 배열체들, 즉 각 위치는 18개 아미노산들 (시스테인외 모든 천연 아미노산)에 의해 치환되는 잔기들 1-15을 각 항체의 0.1 μg/ml 로 탐침하여 항원결정부위로의 결합에 영향을 주는 아미노산 특이성들을 연구하였다. ELISA에서 결합 신호의 감소는 (a) 개별적으로는 각 치환에 대하여, 및 (b) 각 위치에 있어 18 개 상이한 치환에 걸쳐서 평균적으로 주어진다. 도 7b 에서의 막대의 높이는 항체 결합에 대한 상응하는 야생형 아미노산 잔기의 상관성을 나타낸다 (예, 큰 막대 = 결합에 높은 상관성).
도 8은 항-CD3 x 항-IL5R scDb들의 저캣 T-세포 및 CHO-IL5R 세포들에 대한 결합을 나타낸다. A) 작제물 1, B) 작제물 2 및 C) 작제물 3의 저캣 T-세포 및 CD3-음성 저캣 세포들에 대한 결합 및 D) 작제물 1, E) 작제물 2 및 F) 작제물 3의 IL5R-CHO 세포는 물론 야생형 CHO 세포에 대한 결합을 유세포분석법으로 평가하였다. 작제물 1, 작제물 2 및 작제물 3은 동일한 항-IL5R 분체를 가지나 다양한 친화도로 CD3에 결합하는 3 개의 상이한 항-CD3 분체들을 가진다 (작제물 1에 대해 1.15 x 10-8 M, 작제물 2에 대해 2.96 x 10-8 M, 및 작제물 3에 대해 1.23 x 10-7 M); 작제물 1 = 클론-06의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 2 = 클론-02의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 3 = 클론-03의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다.
도 9은 scDb들에 의한 세포독성 T-세포와 타겟 세포의 가교에 의한 인터루킨-2 분비의 특이적 자극을 나타낸다. CD8+ T-세포를 CHO-IL5R 또는 CHO 세포 존재하에서 scDb들의 농도를 높이면서 배양하였다. 16 시간 배양 후, 배양 상등액에서 인터루킨-2 농도를 ELISA로 측정하였다; 작제물 1 = 클론-06의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 2 = 클론-02의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 3 = 클론-03의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다.
도 10은 항-CD3 x 항-IL5R scDb들에 의한 인간 IL5R-발현 CHO 세포의 특이적 용해를 나타낸다. CD8+ T-세포를 CHO-IL5R 또는 CHO 세포 존재하에서 scDb들의 농도를 높이면서 배양하였다. 타겟 세포 (CHO-IL5R 및 CHO)에 cell tox green 염료로 표지하고 및 88 시간 배양 후 형광 강도를 측정하여 세포 용해를 결정하였다; 작제물 1 = 클론-06의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 2 = 클론-02의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 3 = 클론-03의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다.
이전의 항-CD3 항체들과 비교한 본 발명의 특성은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 신규한 단리된 항체들 또는 이의 기능적 단편물들은 선행 기술 항체들, 특히 OKT-3 및/또는 TR66보다 더 높은 친화도를 가지면서, 동시에 더 높은 능을 나타낸다.
따라서, 제1관점에서, 본 발명은 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적인 결합 부위를 포함하는 단리된 결합 분자에 관한 것이고, 특히 항원-결합 부위를 포함하고, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로서 포함하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 아미노산 잔기는 "결합에 대하여 결정적"인 것으로 간주될 수 있는 것은, 그 결정적 아미노산 잔기가 알라닌에 의해 대체되어 아미노산 잔기 위치를 포함하는 펩타이드로의 결합분자의 결합 친화도가 야생형 펩타이드 서열의 결합 친화도의 적어도 50%, 구체적으로 적어도 25%, 더 구체적으로 적어도 10%, 및 가장 구체적으로 적어도 5%로 감소될때이고, 및/또는 상기 결정적 아미노산 잔기가 시스테인을 제외하고 다른 천연 아미노산 잔기들 각각에 의해 별개로 교환되어, 상기 아미노산 잔기 위치를 포함하는 펩타이드에 결합하는 것으로부터 나온 평균 신호 강도가, 실시예 7의 ELISA에 의해 결정시, 야생형 펩타이드 서열로의 결합 신호의 적어도 50%, 구체적으로 적어도 25%, 및 가장 구체적으로 적어도 10%로 감소될 때이다.
특정 구체예에서, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 E6를 결합에 연루된 잔기로서 더 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 E6를 결합에 결정적인 잔기로서 더 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 아미노산 잔기가 "결합에 연루된" 것으로 간주되는 것은, 그 아미노산 잔기가 알라닌으로 교체되어 결합 분자의 결합 친화도가 적어도 80%로 감소될 때 및/또는 그 아미노산 잔기가 개별적으로 시스테인이 아닌 다른 천연 아미노산 잔기 각각에 의해 교체되어, 실시예 7의 ELISA에 의해 결정되는 바, 상기 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드로의 결합으로부터 결과하는 평균 신호 강도가 적어도 80%로 감소할 때이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 이의 기능적 단편물이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 구체적으로 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합한다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 특히 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 평형 해리 상수로써 인간 CD3에 결합한다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자는 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5 배 강하게 T-세포 활성화를 유도하는, 항체 또는 이의 기능적 단편물이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자는 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 더 길게 지속되는 T-세포 활성화를 결과하는, 항체 또는 이의 기능적 단편물이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자는, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, OKT-3 또는 TR66에 의한 활성화와 비교할 때 덜 이종적인 T-세포의 용량 의존적 균등한 활성화를 결과하는, 항체 또는 이의 기능적 단편물이다.
제2 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 것으로서, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수로써 인간 CD3에 결합하는 신규한 단리된 CD3-결합 분자에 관한 것이고, 특히, 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리상수로써 인간 CD3에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 구체적으로 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합한다.
제3 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5-배 강하게 T-세포 활성화를 유도하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 구체적으로 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합한다.
제4 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 더 길게 지속되는 T-세포 활성화를 결과하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 구체적으로 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합한다.
제5 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, OKT-3 또는 TR66에 의한 활성화와 비교하여 덜 이종적인 T-세포들의 용량-의존적 활성화 상태를 결과하는 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 상기 결합 분자, 구체적으로 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은, 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합한다.
제6 관점에서, 본 발명은 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, IgG 포맷에서 시험할 때, (i) 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수에서 인간 CD3와 결합하고; 및 (iia) 교차연결시, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5배 더 강한 T-세포 활성화를 유도하고; (iib) 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66을 사용할 때보다 더 길게 유지되는 T-세포 활성화를 결과하고; (iic) OKT-3 또는 TR66에 의한 활성화와 비교하여 덜 이종적인 T-세포의 용량 의존적 활성화 상태를 결과하고; 및/또는 (iid) 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적이며, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로서 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다. 간결하게 하기 위해, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 (i)의 특성을 가지고 및 (iia) 내지 (iid)에 따른 특성 중 적어도 하나를 추가로 가진다.
특정의 그러한 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 추가로 교차결합한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "항체"는 "면역글로불린" (Ig)에 대한 동의어로서 사용되는 것으로서, 분류등급 IgG, IgM, IgB, IgA, 또는 IgD (또는 이의 임의의 아분류등급)에 속한 단백질로서 정의되며 및, 모든 통상적인 공지의 항체들 및 이의 기능적 단편물들을 포함한다. 항체/면역글로불린의 "기능적 단편물"은 항원-결합 부위를 보유하는 항체/면역글로불린 (예, IgG의 가변부위)의 단편물로서 정의된다. 항체의 "항원-결합 부위"는 항체의 하나 이상의 초가변 부위(들), 예, CDR-1, -2, 및/또는 -3 부위에서 발견된다; 그러나, 상기 가변적 "기본구조 (framework)" 부위는 또한 CDR들에 골격을 제공함으로써와 같이, 항원 결합에서 중요한 역할을 수행한다. 바람직하게는, 상기 "항원-결합 부위"는 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 아미노산 잔기 5 내지 109, 더 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 아미노산 잔기 4 내지 111을 포함하고, 및 특히 바람직한 것은 하게는 온전한 VL 및 VH 사슬들이다 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; 번호매김은 WO 97/08320에 의거한다). 토끼 항체들의 경우, 상기 CDR 부위들은 표 7에서 나타난다 (하기 참조). 본 발명에 사용하기 바람직한 면역글로불린의 분류등급은 IgG이다. 본 발명의 "기능적 단편물"들은 F(ab')2 단편물, Fab 단편물 및 scFv의 도메인을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인들 간에 발생하는 분자간 디설파이드 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 없애버리도록 조작할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 결합 분자는 인간 CD3 (또는 인간 CD3의 항원결정부위)와 같은 타겟 "에/에 대하여 특이적인", "을 특이적으로 인식하는", 또는 "에 특이적으로 결합하는" 것으로, 이는 결합 특이성이 절대적이지 않고 상대적인 특성이기 때문에 그러한 결합 분자가 그러한 타겟 생물분자와 하나 이상의 참조 분자(들) 사이에 구별할 수 있을 때인 것이다. 이의 일반적인 형태에서 (및 정의된 참조물이 전혀 언급되지 않을 때), "특이적 결합"은 예를 들어, 당해 분야에 공지된 특이성 분석 방법에 따라 결정할 때, 관심의 타겟 생물분자와 관련없는 생물분자 사이를 구별하는 상기 결합 분자의 능력을 지칭한다. 그러한 방법들은, 웨스턴 블랏, ELISA, RIA, ECL, IRMA 시험 및 펩타이드 스캔을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석법을 수행할 수 있다. 점수화는 표준 발색법으로 수행될 수 있다 (예, 이차 항체와 고추냉이 과산화물, 및 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소). 특정 웰에서의 반응은 예를 들어, 450 nm에서 광학 밀도로 점수화된다. 전형적인 배경(= 음성 반응)은 약 0.1 OD일 수 있다; 전형적인 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이것은 양성 및 음성 점수 간의 비율이 10-배 이상이 될 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 생물분자를 사용하는 것이 아니라, 우유 분말, BSA, 트랜스페린 등과 같은 3 내지 5 개 비관련 생물분자 집단을 사용하여 수행된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 90% 및 110% 사이를 의미한다.
그러나, "특이적 결합"은 또한 타겟 생물분자 및 참조 점으로서 사용되는 하나 이상의 연관된 생물분자(들) 사이를 구별할 수 있는 결합 분자의 능력을 지칭할 수 있다. 추가로, "특이적 결합"은 이의 타겟 항원의 상이한 부분들, 예, 타겟 생물분자의 상이한 도메인들, 부위 또는 항원결정부위들 사이, 또는 타겟 생물분자의 아미노산 잔기들의 하나 이상의 주요 잔기들 사이를 구별할 수 있는 결합 분자의 능력에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항원결정부위"는 타겟 생물분자 및 결합 분자 사이의 특이적 결합에 요청되는 주어진 타겟 생물분자의 그 부분을 지칭한다. 항원결정부위는 연속적, 즉, 타겟 생물 분자에 존재하는 인접 구조 요소에 의해 형성되거나, 또는 불연속적, 즉 타겟으로서 단백질의 아미노산 서열 내에 있는 것과 같은, 타겟 생물분자의 일차 서열에서 상이한 위치에 있지만, 체액 내에서와 같이, 타겟 생물분자가 가지는 삼차원 구조에서 밀접한 위치에 있는 구조적 요소에 의해 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항원결정부위는 인간 CD3의 입실론 사슬 상에 위치한다.
특정 구체예에서, 인간 CD3ε에 대한 결합은 IgG 포맷으로 있는 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물이 인간 유래의 이종이량성 CD3εγ 의 정제된 세포외 도메인으로의 친화성을 결정함으로써 결정된다.
특정 구체예에서, 하기 조건들이 실시예 1에 나타난 바와 같이 사용된다: MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors); 포획 항체: 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 항체 SPR-2 Affinity Sensor chip, Amine, Sierra Sensors 에 고정화된 상기 IgG의 Fc 부위에 특이적인 항체; 90 내지 2.81 nM의 범위로 2배 연속 희석된 인간 이종이량성 단쇄 CD3εγ 세포외 도메인, 유세포로 3 분간 주입 및 센서 칩 상에 포획된 IgG로부터 5 분간 단백질을 해리, 각 주입 회차 후 10 mM 글리신-HCl을 두 번 주입하여 표면 재생, 일대일 랭무어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로써, 겉보기 해리 (kd) 및 결합 (ka) 속도 상수 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 계산.
특정 구체예에서, 상기 (iia) 및/또는 (iic)에 따른 T-세포 활성화의 유도는 IgG 형태의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 CD69 발현의 자극을 결정함으로써 결정된다.
특정 구체예에서, 하기 조건들이 실시예 3에서 나타난 바와 같이 사용된다: IgG 형태로 있는 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물의 20 μg/ml, 5 μg/ml 및 1.25 μg/ml으로 저캣 세포(100,000 세포/웰)를 24 시간 자극 후, 3-배 과량의 항-IgG 항체를 첨가함으로써 가교 (대조군: OKT3 (BioLegend, Cat. No. 317302) 또는 TR66 (Novus Biologicals, Cat. No. NBP1-97446), 토끼 항-마우스 IgG 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 315-005-008)로 가교); 자극 후 CD69 발현에 대하여, 인간 CD69에 특이적인 피코에리틴 (PE)-표지된 항체(BioLegend, Cat. No. 310906)를 사용하여 세포 염색, 유세포 분석기 (FACS aria III, Becton Dickinson)로 분석; 음성 대조군: 상기 항-CD69 항체로 염색된 가교 항체로 배양된 미자극된 저캣 세포.
특정 구체예에서, (iib)에 의한 상기 더 길게 유지되는 T-세포 활성화는 IgG 형태로 있는 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 CD69 발현에 대한 자극의 시간 경과를 결정함으로써 결정된다.
특정 구체예에서, 하기 조건들이, 실시예 3에서 나타난 바와 같이 사용된다: 100,000개 저캣 세포/웰을 IgG 형태의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물 5 μg/ml, 전술한 바와 같이 가교된 항-CD3 항체들로 0, 4, 15, 24, 48 및 72 시간 자극, 및 전술한 바와 같이 유세포분석법에 의해 CD69 발현의 분석.
특정 구체예에서, (iia) 및/또는 (iic)에 따른 T-세포 활성화의 유도는 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 IL-2 분비의 자극을 결정함으로써 결정된다.
특정 구체예에서, 하기 조건이 실시예 4에 나타난 바와 같이 사용된다: 저캣 세포들(200,000개 세포/웰)을 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물로 5 μg/ml 농도에서 4 개 상이한 분석 구성을 사용하여 자극: (a) 저캣 세포를 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물로 자극하고 3-배 더 높은 농도의 항IgG 항체를 첨가하여 교차반응 (대조군: OKT3 (BioLegend, Cat. No. 317302) 또는 TR66 (Novus Biologicals, Cat. No. NBP1-97446), 토끼 항-마우스 IgG 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 315-005-008)로 가교); (b) 가교 항체 부재하에서T-세포 활성화; (c) 조직 배양 플레이트 상에서 밤새 배양하여 상기 가교 항체들을 고정화; (d) 가교 항체 부재하 밤새 배양하여 조직 배양판 상에서 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물 (또는 대조군 항체들)의 자극; 각 구성에서, 첨가 한 시간 후에, 10 ng/ml PMA 및 상등액 수집물로 세포를 자극하고, 24, 48 및 72 시간 후, IL-2 분비를 측정하고, 상업적 이용 가능한 ELISA (BioLegend, Cat. No. 431801)를 사용하여 정량화한다.
특정 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물은 (i) 토끼 항체 또는 이의 기능적 단편물, 또는 (ii) (i)의 토끼 항체 또는 이의 기능적 단편물을 인간화함으로써 얻은 항체 또는 이의 기능적 단편물이다.
토끼 항체들의 인간화를 위한 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, Borras 등., J Biol Chem. 2010 Mar 19;285(12):9054-66; Rader 등, The FASEB Journal, express article 10.1096/fj.02-0281fje, 2002년 10월 18일 공개; Yu 등 (2010) A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models. PLoS ONE 5(2): e9072. doi:10.1371/journal.pone.0009072).
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10에 존재하는 하나 CDR1, 하나 CDR2 및 하나 CDR3 부위의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항원-결합 부위, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9에 존재하는 하나 CDR1, 하나 CDR2 및 하나 CDR3 부위의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 바, 구체적으로 상기 VH 도메인은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10에 존재하는 기본 구조 도메인들로부터 선택되는 기본구조 도메인을 포함하고, 및 구체적으로 상기 VL 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9에 존재하는 기본 구조 도메인들로부터 선택되는 기본구조 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 21에 존재하는 기본구조 도메인들로부터 선택된 기본구조 도메인들을 포함하고 및 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 존재하는 기본구조 도메인들로부터 선택된 기본구조 도메인들을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 21에 존재하는 기본구조 도메인들의 변이체인 기본구조 도메인을 포함하고 및/또는 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 존재하는 기본구조 도메인들의 변이체인 기본구조 도메인들을 포함하는 바, 구체적으로 하나 이상의 비인간 공여체 아미노산 잔기, 구체적으로 서열번호 1 내지 20로부터 선택된 서열들의 하나에 존재하는 공여체 아미노산 잔기를, 서열번호 21 및/또는 22에 존재하는 상응하는 인간 수용체 아미노산 잔기 대신에 포함하는 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중 하나, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10에 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중 하나, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9에 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하며, 구체적으로 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중 하나, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10에 존재하는 기본구조 도메인들의 조합을 포함하고, 및 구체적으로 상기 VL 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중 하나, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9에 존재하는 기본구조 도메인들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 21에 존재하는 기본구조 도메인들로부터 선택된 기본구조 도메인들을 포함하고 및 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 존재하는 기본구조 도메인들로부터 선택된 기본구조 도메인들을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 VL 도메인은 서열번호 21에 존재하는 기본구조 도메인들의 변이체인 기본구조 도메인을 포함하고 및/또는 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 존재하는 기본구조 도메인들의 변이체인 기본구조 도메인들을 포함하는 바, 구체적으로 하나 이상의 비인간 공여체 아미노산 잔기, 구체적으로 서열번호 1 내지 20로부터 선택된 서열들의 하나에 존재하는 공여체 아미노산 잔기를, 서열번호 21 및/또는 22에 존재하는 상응하는 인간 수용체 아미노산 잔기 대신에 포함하는 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10으로부터 선택된 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19, 특히 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20, 특히 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10로부터 선택된 VH 도메인의 변이체이고, 및/또는 상기 VL 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9로부터 선택된 VL 도메인의 변이체로서, 구체적으로 상기 변이체는 상기 기본구조 도메인들 및/또는 항원 결합에 연루되지 않는 CDR 잔기들 내에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 변이체이다.
예를 들어, 동족성 아미노산 잔기들에 의한 교환에 적합한 기분구조 부위에서의 아미노산 잔기들을 동정하는 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바, 예를 들어, 고도로 보존된 잔기들 (구체적으로 일정하게 유지된) 및 가변된 서열 위치 (구체적으로 그 위치에서 자연적으로 발견된 잔기들의 하나에 의해 변경될 수 있는)의 존재에 대하여 상동적 서열들의 군을 분석하는 것을 포함하여 공지되어 있다.
예를 들어, 상동적 아미노산 잔기들에 의한 치환에 적합한 CDR 부위에서 아미노산 잔기를 동정하는 방법은, 예를 들어, 항체 결합 도메인들의 구조, 구체적으로 항원들을 가진 복합체 내에서의 항체 결합 도메인의 구조를 항원-상호작용 잔기들 (구체적으로 일정하게 유지된) 및 항원과 접촉되지 않은 서열 위치들 (개질될 수 있는)의 존재에 대하여 분석하는 것을 포함하여, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
다른 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10, 및 22로부터 선택된 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9 및 21로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10 및 22으로부터 선택된 VH 도메인의 변이체이고, 및/또는 상기 VL 도메인 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9 및 21으로부터 선택된 VL 도메인의 변이체이고, 구체적으로, 상기 변이체는 상기 기본구조 도메인에서 및/또는 항원 결합에 연루되지 않은 CDR 잔기들에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 서열번호 1/서열번호 2; 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 및 서열번호 19/서열번호 20, 구체적으로 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 및 서열번호 9/서열번호 10, 더 구체적으로 서열번호 9/서열번호 10으로부터 선택된 VH/VL 도메인 조합을 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 서열번호 1/서열번호 2; 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 및 서열번호 19/서열번호 20, 구체적으로 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 및 서열번호 9/서열번호 10, 더 구체적으로 서열번호 9/서열번호 10으로부터 선택된 VH/VL 도메인 조합의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하며, 그러한 변이체에서, 적어도 상기 VL 또는 상기 VH 도메인은 기재된 상기 VL / VH 도메인의 변이체이다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 VH/VL 도메인 조합 서열번호 21/서열번호 22을 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 VH/VL 도메인 조합 서열번호 21/서열번호 22을 포함하는 항원-결합 부위의 변이체를 포함하며, 그러한 변이체에서, 적어도 상기 VL 또는 상기 VH 도메인은 기재된 VL/VH 도메인의 변이체이다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 본 발명에서 개시된 서열들의 변이체인 항원-결합 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 20를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물의 특성들, 구체적으로 위의 설명들에서 정의된 특성들 중 하나 이상을 가지는 항체 또는 이의 기능적 단편물을 포함하는 것으로서: 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10로 구성되는 CDR 부위에서 적어도 60 퍼센트 서열 동일성, 구체적으로 적어도 70 퍼센트 서열 상동성, 더 구체적으로 적어도 80 퍼센트 서열 상동성, 및 가장 구체적으로 적어도 90 퍼센트 서열 상동성, 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8; 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20, 구체적으로 서열번호 4, 6, 및 10, 더 구체적으로 서열번호 10으로 구성되는 CDR 부위에서 적어도 80 퍼센트 서열 상동성, 더 구체적으로 적어도 90 퍼센트 서열 상동성, 가장 구체적으로 적어도 95 퍼센트 서열 상동성을 가지는 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는: 서열번호 1, 3, 5, 7; 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9로 구성되는 CDR 부위에서 적어도 60 퍼센트 서열 동일성, 구체적으로 적어도 70 퍼센트 서열 동일성, 더 구체적으로 적어도 80 퍼센트 서열 동일성, 및 가장 구체적으로 적어도 90 퍼센트 서열 동일성, 및/또는 서열번호 1, 3, 5, 7; 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19, 구체적으로 서열번호 3, 5, 및 9, 더 구체적으로 서열번호 9로 구성되는 CDR 부위에서 적어도 80 퍼센트 서열 상동성, 더 구체적으로 적어도 90 퍼센트 서열 상동성, 가장 구체적으로 적어도 95 퍼센트 서열 상동성을 가진 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. BLOSUM (Henikoff, S. & Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)와 같은 상동성 검색 매트릭스를 사용함으로써 서열상동성을 결정하는 방법, 및 상동성에 따른 서열들을 집단화하는 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 그러한 변이체들은 서열번호 19의 VL 서열에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들의 세트를 포함하는 VL 서열, 및/또는 서열번호 20의 VH 서열에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들의 세트를 포함하는 VH 서열을 포함하며, 각 경우, 서열번호 19 및/또는 20에서 모든 축퇴된 위치 "X"에서 나타난 지시된 아미노산 잔기들 중 하나가 선택된다. 예를 들어, 서열번호 19의 CDR1에서 "X(S/N)"으로서 나타난 위치들 각각의 경우에서, 임의의 그러한 변이체는 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 "S" 또는 아미노산 잔기 "N"을 포함한다.
다른 구체예에서, 그러한 변이체는 서열번호 19의 서열에 따른 VL 서열, 및/또는 서열번호 20의 서열에 따른 VH 서열을 포함하고, 각 경우, 서열번호 19 및/또는 20에서의 모든 축퇴 위치 "X"에서 나타난 지시된 아미노산 잔기들 중 하나가 선택된다. 예를 들어, 서열번호 19의 기본구조 1에서 "X(P/A)"로서 나타난 위치의 경우, 임의의 그러한 변이체는 그러한 위치에서 아미노산 잔기 "P" 또는 아미노산 잔기 "A"를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 위에서 설명한 항원-결합 부위를 인간화함으로써 수득된 항원-결합 부위를 포함한다
제7관점에서, 본 발명은 위에서 설명한 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물과 동일한 항원결정부위에 기본적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물은 사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 추가로 교차결합한다.
제8 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물, 및 조건적으로는 약학적 허용 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제9 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 특히 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물에 관한 것이다.
제10 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물을 포함하는 벡터 또는 벡터들의 집합물에 관한 것이다.
제11 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터들의 집합물을 포함하는 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포에 관한 것이다.
제12 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합물, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터들의 집합물, 또는 본 발명의 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 분자, 구체적으로 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
제13 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 기능적 항체 단편물을 생성하는 방법으로서:
a) 토끼를 CD3ε-발현 플라즈미드로 면역화하여 천연 전장 CD3ε을 숙주 세포들의 표면상에 제시하는 단계;
b) 형광 활성된 세포 분류법을 사용하여 CD3ε/γ 단쇄와 상호작용하는 친화도 숙성 메모리 B-세포를 클론 분리하는 단계;
c) 분류된 B 세포를 분류된 클론의 불멸화를 요구하지 않는 공동-배양 시스템에서 배양하는 단계;
d) B 세포 배양 상등액을 세포-기반 ELISA에서 스크리닝하여 T 세포의 표면 상의 TCR 복합체에 끼워져 있는 천연 CD3ε에 결합하는 항체들을 동정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제14관점에서, 본 발명은 CD3 입실론과 CD3 감마 사이의 계면에는 위치하지 않고 및T 세포 상에 발현된 천연 TCR의 맥락에서 항체에 의해 여전히 결합될 수 있는 CD3 입실론의 아미노산 잔기들을 독점적으로 포함하는 인간 CD3 입실론의 특정 항원결정부위에 관한 것으로서, 본 발명의 가교된 항체들에 대한 이의 결합은 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체들 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5-배 강한 T-세포 활성화를 유도하고; (iib) 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 CD69 발현에서 적어도 1.5-배 더 큰 증가로 나타내는 바와 같이 항체들 OKT-3 또는 TR66을 사용하는 것보다 더 오랫동안 유지되는 T-세포 활성화를 결과하고; 및/또는 (iic) T-세포들의 용량 의존적 균질적인 활성화 상태를 결과하는 항원결정부위에 관한 것이다.
제15 관점에서, 본 발명은 인간 CD3ε의 신규한 항원결정부위에 특이적인 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 동정하는 방법으로서, (a) 인간 CD3에 결합하는 하나 이상의 분자 중에서, 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적인 결합 부위를 포함하고, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로 포함하는 적어도 하나의 결합 분자를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 단계 (a)는 CD3ε의 N-말단 부분을 관통하는 중첩 펩타이드를 사용하여 항원결정부위 매핑을 수행하여 각각의 결정적 선형 결합 부위를 동정함으로써 수행된다. 단계 (b)에서, 야생형 아미노산이 (i) 알라닌, 또는 (ii) 임의의 천연 아미노산 (시스테인 제외)으로 각 위치에서 개별적으로 치환된 이러한 선형 결합 부위의 유도체가 생성된다. 결과된 펩타이드 라이브러리는 실시예 7 및 8에서 설명된 ELISA를 사용하여 스크린하여 결합에 대한 각 위치의 상관성을 평가한다. 특히, 목록으로부터 선택된 일군의 펩타이드들을 사용한다:
실시예
하기 실시예들은 그 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시한다.
본 명세서에서 설명된 본 발명에 대하여 사용된 방식은 T 세포 자극 항체들을 확인하는 성공 확률을 높이는 단계적 절차이다. 이러한 방법은 하기 과정을 포함한다:
a) 토끼들을 면역화용 숙주로서 사용하는 데 토끼 항체들이 일반적으로 설치류에 비해 더 큰 클론성 다양성을 보이기 때문이다. 따라서, 토끼 사용으로 특정 항원결정부위에 대한 결합체를 확인하는 확률을 높이고 신규한 항원결정부위들을 동정하는 확률을 향상시킨다,
b) 토끼들을 CD3ε-발현 플라즈미드로 면역화하여 숙주 세포의 표면상에 천연 전장 CD3ε을 제시한다. 이러한 방식은 전장 CD3ε에 대한 강한 면역 반응으로 이끌게 되고 및 CD3ε 및 CD3γ에 동시적으로 결합하는 항체들의 발생을 피하게 한다;
c) 형광 활성된 세포 분류법을 사용하여 CD3ε/γ 단쇄와 상호작용하는 숙성된 메모리 B-세포의 친화도 클론성 단리. 이러한 과정은 CD3ε과 CD3γ 간의 계면에 결합하는 항체들의 선택을 피하게 하고, 그로써 선택의 특이성을 높인다.
d) 단일 분류된 B 세포들을 분류된 클론들의 불멸화를 요하지 않는 공-배양 시스템에서 배양하고, 이로써, 하이브리보마 과정의 열등한 효율을 극복한다.
e) B 세포 배양 상등액을 세포-기반 ELISA로 스크리닝하여 T 세포의 표면상의 TCR 복합체에 박혀있는 천연 CD3ε에 결합하는 항체들을 동정한다.
실시예 1: CD3 상의 T 세포-자극 항원결정부위에 결합하는 단클론성 항체들의 동정 및 선택
형광 활성화된 세포 분류법을 사용하여 CD3ε에 결합하는 토끼 메모리 B 세포들을 하나의 면역화된 토끼로부터 단리하였다. CD3ε 및 CD3γ의 계면에 결합하는 항체들을 배제하기 위해, 유연한 펩타이드 링커(scCD3γε)에 의해 연결된 CD3ε과 CD3γ 사이의 세포외 도메인들로 구성된 피코에리트린 (PE)-표지된 단쇄 단백질 작제물을 사용하였다. PE-scCD3γε에 결합하는 총 4,270개의 메모리 B 세포를 96-웰 배양 플레이트로 개별적으로 분류하고, 공지된 조건에서 배양하였다 (Lightwood 등, JIM 2006; 316: 133-143). 먼저 모든 배양 상등액을 scCD3γε에 대한 결합에 대해 ELISA로 스크린하였고, 441 사건들이 산출되었다. 두 번째 스크리닝에서, 첫 번째 스크리닝으로부터 얻은 양성 상등액을 저캣 세포의 표면상에 있는 TCR 복합체에 박혀있는 천연 CD3ε에 결합하는 능력에 대하여 시험하였다 (하기 방법 참조). 총 22 건의 사건이 CD3ε 발현 저캣 세포로의 결합을 나타냈으나, cd3-/- 저캣 세포에는 결합을 나타내지 않았다. 인간 및 사이노멀거스 원숭이 유리의 이종이량성 CD3εγ의 정제된 세포외 도메인으로의 친화성을 상기 22 건에 대하여 SPR을 사용하여 측정하였다. 인간 CD3εγ로의 친화도는 KD 로 표현할 때, 0.16 내지 9.28 nM 범위였다 (데이터 미제시). 상기 스크리닝 사건들 중 하나는 SPR에 의하면 결합을 보이지 않았고 따라서 추가 분석에 대해 고려하지 않았다.
나머지 21개 클론들의 가변적 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 RT-PCR 및 DNA 시퀀싱으로써 만들고 및 18 개의 독립적인 클론들을 결과하였다. 이러한 토끼 IgG들을 포유동물 발현 시스템에서 재조합적으로 생성하고 인간 및 사이노멀거스 유래의 scCD3γε에 대한 친화도 및 저캣 세포로의 결합능에 대하여 특성화하였다. 이러한 18 개 서열을 계통발생적 서열 분석하여, 명백히 서로 다른 두 개의 주된 클러스터가 나타났고, 이 두 클러스터들 내에서 유의한 상동성이 있었다 (도 1). 한 클러스터로부터의 모든 대표물은 동일한 항원-결합 부모 B 세포로부터 십중팔구 유도되기 때문에, 이들은 동일한 항원결정부위에 결합하게 된다. 따라서, 최대 다양성을 다루기 위해, 가장 다양한 클론들을 각 클러스터로부터 선택하여 12개 클론을 얻고 이들을 T 세포에 결합하고 활성화시키는 능력에 대하여 더 시험하였다. T 세포 결합은 세포-기반 ELISA에서 평가하였고 T 세포 자극은 FACS로 CD69의 발현을 측정함으로써 정량화하였다. 대표적인 항체들 실시예 2 내지 4에서 나타난 바와 같이 더 특성화하였다.
실시예 2: 정제된 단클론성 토끼 항-CD3ε 항체들의 저캣 T 세포 및 사이노멀거스 원숭이 HSC-F T 세포에 대한 결합
저캣 인간 T 세포 및 사이노멀거스 원숭이 HSC-F T 세포를, 방법 단락에서 설명한 바와 같이, 상기 정제된 단클론성 토끼 항체들의 농도를 높이면서 배양하였다. 모든 항체들을 시험할 때, 인간 CD3ε에 대한 특이적 결합은 항체 농도가 증가함에 따라 증가하였다 (도 2). 저캣 인간 T 세포에 대한 최대 절반 결합을 나타내는 EC50 값은 모든 항체들에 대하여 매우 유사하였고, 0.28 내지 1.87 nM 범위였다 (참조 표 1, 이는 정제된 단클론성 토끼 항체들의 약역학적 특성을 나타낸다. CD69 발현의 정성적 검출을 위해 기하 평균에서 신호강도를 반영하는 평균 형광 강도 (MFI)를 음성 대조군은 물론 시험 항체들 둘 다에 대하여 측정하였다. 정규화된 MFI는 음성 대조군 항체의 MFI를 통해 시험 항체의 MFI를 나눔으로써 계산되었다). 사이노멀거스 원숭이 HSC-F T 세포로의 결합에 대한 EC50 값은 3 가지 항체들에 대하여 나타낸다 (클론-06, 클론-02, 클론-03) (참조 표 4).
Figure pct00001
클론 ID KD (인간) / KD (사이노)
클론-01 3
클론-02 13
클론-03 13
클론-04 36
클론-06 4
클론-09 10
클론-10 7
클론-11 3
클론-12 20
클론 ID 인간 CD3ε [KD]로의 친화성 사이노 CD3ε으로의 친화성 [KD]
클론-06 2.23x10-9 M 8.95x10-9 M
클론-02 3.04x10-10 M 3.86x10-9 M
클론-03 9.05x10-10 M 1.15x10-8 M
세포 표면으로의 결합하는 토끼 IgG
클론 ID 인간 저캣 T 세포로의 결합 [EC 50 ] 사이노 HSC-F T 세포로의 결합 [EC 50 ]
클론-06 0.67 nM 1.6 nM
클론-02 0.71 nM 3.82 nM
클론-03 1.45 nM 23.9 nM
실시예 3: T 세포 상에서 CD69 발현을 자극하는 정제된 단클론성 토끼 항-CD3ε 항체의 능력
T-세포 활성화를 유도하는 단클론성 토끼 항-CD3 항체들의 능력을, CD69 발현을 측정하여 평가하여 (방법 참조) 공개된 항체들 OKT-3 및 TR66과 비교하였다. 첫 번째 방식에서, 가교된 항체들의 세 가지 다른 농도를 사용하여 저캣 세포를 자극하였고 및 CD69 발현은 24 시간 후에 유세포 분석법으로 평가하였다. CD69 발현에서의 유의한 증가가 1.25 μg/ml에서 모든 시험된 항체들에서 관측되었다 (도 3 및 표 1). 흥미롭게도, 모든 시험된 토끼 항체들은 공개된 OKT-3 및 TR66보다 더 강하게 CD69발현을 자극하였다. 이것은 토끼 항체들이 OKT-3 또는 TR66보다 더 높은 친화성으로 인간 scCD3γε에 결합함에 따라 예상치 못한 것이고, 이는 선행 기술에 따라서, TCR 신호전달을 순차적으로 촉발하고 따라서 향상시키는 능력에 역영향을 주는 것이다. 토끼 항체들의 농도를 높임에 따라, CD69 발현 수준은 더 증가되었고, OKT-3 또는 TR66의 농도가 증가함에 따라 CD69 발현이 중간 정도의 증가가 있을 뿐이었다. 또한, 상기 토끼 항체들를 사용할 때, 막대그래프에서의 피크가 더 좁아졌고, 이는 모두 CD69을 유사하게 높은 수준에서 발현하는 더 균등한 T 세포 집단을 가르킨다. 반대로, 시험된 각 농도에서 OKT-3 또는 TR66로 자극된 T 세포 집단에서 CD69 발현 수준이 넓게 분포되어 있었다. 용량 의존적으로 구별되고 균등한 T 세포 활성화 수준을 이끄는 항체는 더 나은 용량 조절을 하게 하여 효능을 최적하고 부작용을 조절하게 한다.
두 번째 방식에서, 상이한 시간으로 항-CD3 항체들에 의한 자극 후의 T-세포 활성화를 분석하였다. 저캣 세포를 가교된 항체들로 자극하였고 및 CD69 발현을 0, 4, 15, 24, 48 및 72 h 후에 상기에서 설명한 바와 같이 평가하였다 (도 4).
실시예 4: 저캣 T 세포 및 CHO-IL5R 세포로의 항-CD3 x 항-IL5R 항체의 결합
작동성 항-CD3 항체들의 유익함을 나타내기 위해, 이중특이성 항-CD3 x IL5R 단쇄 다이아바디 (scDb들)의 일군을 표준 방법으로 만들었다 (방법/데이터 미제시; 작제물 1 = 클론-06의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 2 = 클론-02의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다; 작제물 3 = 클론-03의 인간화된 가변성 도메인을 포함한다).
저캣 T 세포 및 IL5R-발현 CHO 세포 (CHO-IL5R)들을 방법 단락에서 설명한 바와 같이, 상기 scDb들의 1 μg/ml 및 10 μg/ml과 처리하였다. 시험된 모든 scDb들에서, CD3ε에의 특이적 결합 및 IL5R 발현 세포주로의 발현이 검출되지만 대조군 세포주로의 비특이적 결합이 없었다. 동일한 항-IL5R 분체를 포함하지만 항-CD3 분체는 상이한 세가지 상이한 scDb들 (작제물 1 내지 3)을 IL5R 또는 CD3ε을 발현하는 세포로의 특이적 결합에 대하여 시험하였다. 상기 항-CD3 부분들은 가변적인 친화성으로 중첩되는 항원결정부위들에 결합한다 (표 1과 3 및 도 7). 예상되는 바와 같이, CHO-IL5R 세포로의 결합은 시험된 모든 scDb들에 유사하였다 (도 8). 반대로, 저캣 T-세포로의 결합은 CD3ε 결합 도메인의 친화도가 낮아짐에 따라 감소하였다. 어떠한 저캣 T-세포로의 결합이 시험된 최고 농도에서 낮은 친화성 결합체 작제물 3에 대하여 검출되지 않았다 (도 8).
실시예 5: T 세포로부터 IL-2 분비를 자극하는 이중특이성 항-CD3 x IL5R scDb들의 능력
타겟 세포에 결합된 scDb들이 T-세포 활성화를 유도하는 능력은 인간 혈액으로부터 정제된 세포독성 T-세포들에 의한 IL-2 분비를 측정함으로써 평가될 수 있다. (참조 방법론). 상기 상이한 scDb들을 타겟 발현 CHO-IL5R 세포가 10:1의 주효자(effector):타겟 세포 비율로 존재하는 조건에서 CD8+ 세포독성 T-세포와 배양하였고, 및 IL-2 분비는 16시간 배양후 분석하였다. CHO-IL5R 세포의 존재 하에서 IL-2 분비의 용량-의존적 자극이 관찰되는 반면 기본적으로 어떠한 IL-2 분비도 야생형 CHO 세포의 존재하에서 관찰되지 않는다 (표 5 및 도 9의 대표적 데이터 참조). 따라서, T-세포 활성화는 타겟 발현 세포들의 존재하에서 특이적으로 유도된다. 또한, IL-2 분비 유도능은 재조합적으로 생성된 CD3εγ에 대한 결합 친화성 및 T-세포에 결합하는 능력과 상관된다. 친화성 분석과 일치하여, 최고 친화도를 가진 결합체인 작제물 1은 작제물 2보다 더 강력한 IL-2 분비의 유도체이고, 저 친화성 scDb 작제물 3에서는 어떠한 IL-2 분비도 관찰되지 않는다 (도 9).
IL5RxCD3 scDb 형식의 인간화된 항-CD3ε 도메인
클론 ID 친화성 인간 CD3ε
[KD] 		타겟 세포 용해능 [EC 50 ] T 세포에 의한 IL-2 분비 자극능 [EC 50 ]
클론-06 1.15x10-8 M 0.1 nM 0.96 nM
클론-02 2.96x10-8 M 0.96 M 5.67 nM
클론-03 1.23x10-7 M no lysis no signal
실시예 6: 세포독성 T-세포에 의한 특이적 scDb 매개 타겟 세포 용해
항-CD3 x IL5R scDb들에 의해 매개된 세포독성 T-세포들에 의한 타겟 세포의 특이적 용해를 CellTox™ green 세포독성분석법으로 88시간 배양 후 분석하였다 (참조 방법론). T-세포 활성화에 대해 상기 논의된 결과와 유사하게, CHO-IL5R 세포 존재하에서, 용량 의존적 타겟 세포 용해가 작제물 1 및 작제물 2에서 관찰된 반면 야생형 CHO 세포 존재하에서는 어떠한 용해도 관찰되지 않았다 (표 5 및 도 10의 작제물 1 내지 3에 대한 대표적 데이터 참조). 전술한 결과와 일치하여, 높은 친화성을 가지고 CD3ε으로 결합하는 scDb들은 더 낮은 친화성 scDb들에 비하여 더 강력한 용해를 나타낸다. 어떠한 타겟 세포 용해도 저 친화성 scDb 작제물 3에 대해 관찰되지 않는다. 본 발명자들은 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 또한 교차 반응성인 항체들의 상이한 클러스터 (클러스터 1)으로부터 유래한 추가의 CD3ε 결합 클론 (클론-05)의 인간화된 변이체를 포함하는 scDb의 타겟 세포 용해능을 더 시험하였다. 클론-05는 클론-06에 비하여 더 높은 친화성을 가지고 결합하나 (토끼 IgG 및 이의 인간화된 유도체에 대하여 각각 KD = 8.45 x 10-10 M 및 4.29 x 10-9 M), 중요하게는, 클러스터 2 (클론-06, 클론-02 및 클론-03)로부터의 결합체보다 상이한 항원결정부위에 결합하는 것이다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 상기 각각의 항-IL5RxCD3 scDb가 인간화된 클론-06를 포함하는 scDb보다 더 약한 CHO-IL5R 타겟 세포의 T-세포 의존적 용해 유도능(EC50 = 9.9 x 10-9 M)을 나타낸다고 발견하였고, 이는 클론-06의 항원결정부위가 타겟 세포들을 용해하도록 세포독성 T 세포들을 재지향하도록 하는 데 특히 적합하다는 것을 나타낸다. OKT-3 및 TR66 보다 클러스터 2로부터 출처된 가교된 부모 IgG들의 우수한 효능 (실시예 3)은 시험된 scDb 형태로 있는 것들보다 더 높은 친화성을 사용하더라도, 이후에 상기 능력이 감소될 어떠한 친화성 최적이 발견되지 않았다는 것을 확인한다.
실시예 7: 항원결정부위 매핑 및 파인-매핑
항원결정부위 매핑 및 파인 매핑을 기본적으로 설명된 바와 같이 수행하였다 (Timmerman 등., Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS™ technology.J.Mol.Recognit.20 (2007) 283-99; Slootstra 등., Structural aspects of antibody antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity 1: 87 (1996) 96). 요약하자면, CLIPS 기술은 펩타이드를 정의된 삼차원 구조물로 구조적으로 고정한다. 이것은 가장 복잡한 결합 부위 조차도 기능적 모방체로 만드는 결과를 낳는다. CLIPS 기술은 현재 펩타이드 라이브러리를 단일, 이중 또는 삼중 루프 구조는 물론 시트 및 나선형 폴드로 형상화하는데 통상적으로 사용된다.
CLIPS 라이브러리 스크리닝은 조합 매트릭스 디자인을 사용하여 상기 타겟 단백질을 10,000개까지의 중첩 펩타이드 작제물의 라이브러리로 전환함으로써 시작한다. 고체 운반체 상에서, 선형 펩타이드들의 매트릭스를 합성하고 후속적으로 이를 공간적으로 정의된 CLIPS 작제물로 형상화한다. 올바른 형태로 있는 불연속 항원결정부위의 부분 둘 다를 나타내는 작제물들은 높은 친화성으로 상기 항체와 결합하고, 이는 검출되고 정량화된다. 불완전한 항원결정부위를 제시하는 작제물을 낮은 친화도로 항체와 결합하는 반면, 상기 항원결정부위를 포함하지 않는 작제물들은 결합하지 않는다. 친화성 정보를 반복 스크린에서 사용하여 항원결정부위들의 서열과 형태를 자세히 정의한다.
하기 클론들을 분석하였다: 클론-02, 클론-03, 클론-04, 클론-06, 및 클론-10. CD3 (N-말단 서열)의 하기 타겟 서열들을 사용하였다.
인간CD3:
2 DGNEEMGGIT QTPYKVSISG TTVILTCPQY PGSEILWQHN DKNIGGDEDD 51
52 KNIGSDEDHL SLKEFSELEQ SGYYVCYPRG SKPEDANFYL YLRARVCENC 101
102 MEMD 105
사이노멀거스 CD3:
2 DGNEEMGSIT QTPYQVSISG TTVILTCSQH LGSEAQWQHN GKNKEDSGDR 51
52 LFLPEFSEME QSGYYVCYPR GSNPEDASHH LYLKARVCEN CMEMD 96
서열 정렬
CLUSTAL 2.1 다중 서열 정렬:
인간 DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIG
|||||||.||||||:||||||||||||.|: ||| ||||.|| ||. |
사이노멀거스 DGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNK---EDS---G
인간 SDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
|:| | ||||:|||||||||||||:|||| :|||:|||||||||||
사이노멀거스 ---DRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMD
펩타이드의 합성
상기 타겟 분자의 불연속적 항원결정부위들을 재건축하기 위해, 구조화된 펩타이드들의 라이브러리를 합성하였다. 이는 소위 "Chemically Linked peptides on Scaffolds" (CLIPS) 기술을 사용하여 수행된다. CLIPS 기술은 펩타이드들을 단일 루프, 이중 루프, 삼중 루프, 시트형 폴드, 나선형 폴드 및 이의 조합으로 구조화되게 한다. CLIPS 주형들은 시스테인 잔기들과 짝지워진다. 펩타이드 내의 다중 시스테인의 측쇄들은 하나 이상의 CLIPS 주형과 연결된다. 예를 들어, T2 CLIPS 주형 1,3 비스(브로모메틸)벤젠의0.5 mM 용액을 암모늄 중탄산염(20 mM, pH 7.9) / 아세토니트릴 (1:1(v/v))에 용해한다. 이 용액을 상기 펩타이드 어레이에 첨가한다. 상기 CLIPS 주형은 상기 펩타이드 어레이들 (455 웰 플레이트, 3 μl 웰을 가짐)의 고형상 결합 펩타이드에 제시된 바, 두 개 시스테인의 측쇄에 결합할 것이다. 상기 펩타이드 어레이들을 상기 용액에서 부드럽게 30 내지 60분간 진탕하면서 용액속에 완전히 녹였다. 최종적으로, 상기 펩타이드 어레이들을 과량의 H2O로 많이 세척하고, 1 퍼센트 SDS/0.1 퍼센트 베타 머캅토에탄올을 함유한 PBS (pH 7.2)의 파괴 완충액에서 70℃에서 30 분간 초음파처리한 후, H2O에서 다시 45분간 초음파처리하였다. T3 CLIPS을 보유한 펩타이드들을 유사하지만 세 개 시스테인을 사용하여 만들었다.
ELISA 스크리닝
각 어레이로 항체의 결합을 일차 항체 용액으로 처리하였다 (4℃에서 밤새). 세척 후, 상기 펩타이드 어레이들을 항체 페록시다제 접합체 (SBA, cat.nr.2010 05)의1/1000 희석액으로 한시간동안 25℃에서 처리하였다. 세척 후, 페록시다제 기질 2,2' 아지노 디 3 에틸벤즈티아졸린 설포네이트 (ABTS) 및 2 μl/ml 3% H2O2를 첨가하였다. 한 시간 후, 발색을 측정하였다. 발색은 전하결합소자 (CCD) 카메라 및 이미지 처리 시스템으로 정량화하였다.
펩타이드의 디자인
화학적으로 합성된 CLIPS 펩타이드들을 하기 계획에 따라 전술한 바와 같이 합성하였다.
세트 1
모방 유형 선형 펩타이드: 인간 및 사이노멀거스 서열들 둘 다에 대한 선형 펩타이드류의 이중 세트. 길이는 15개 잔기로 14개의 중첩을 가진다. 상기 세트들 중 둘은 이중 알라닌 돌연변이를 특징으로 한다 (회색으로 표시).
서열 (인간 서열 중 처음 10개 표시)
DGNEEMGGITQTPYK
GNEEMGGITQTPYKV
NEEMGGITQTPYKVS
EEMGGITQTPYKVSI
EMGGITQTPYKVSIS
MGGITQTPYKVSISG
GGITQTPYKVSISGT
GITQTPYKVSISGTT
ITQTPYKVSISGTTV
TQTPYKVSISGTTVI
Figure pct00002
세트 2
모방 유형 전하가 추가된 선형 펩타이드
설명 펩타이드 어레이 표면과 강하게 상호작용하는 특정 항체들에게 요구되는 전하가 추가된 대조군 세트
서열 (인간 서열의 처음 10 개 표시)
Figure pct00003
세트 3
모방 유형 형태적 펩타이드
설명 펩타이드 서열은 세트 1과 유사하나, CLIPS 형태적 루프로 한정된다.
서열 (비개질된 인간 서열 중 처음 10개 표시)
Figure pct00004
세트 4
모방 유형 CLIPS 형태적 펩타이드
설명 20mer CLIPS 형태적 펩타이드들의 중첩 세트
서열 (인간 서열 처음 10개 표시)
Figure pct00005
세트 5
모방 유형 CLIPS 불연속 매트릭스 펩타이드
설명 13mer 펩타이드들의 조합적 세트로서, 이중 루프 CLIPS 구조로 쌍으로 한정. 인간 및 사이노멀거스 펩타이드들은 짝짓는 방식의 정렬에 따라 정돈하여 기술적 변화를 최소화시킴.
서열 (처음 10 개 표시)
Figure pct00006
추정되는 항원결정부위의 동정
일반적으로, 모든 5 개 항체들은 매우 유사한 결합 특성을 나타냈다. 모든 결합은 인간 CDD3ε의 N 말단 상에서 일어났다 (데이터 미제시). 한정된 및 비한정된 펩타이드로부터의 결합 강도 및 관찰자료를 고려하면, 모든 항체들들은 선형 항원결정부위에 주로 결합하는 것으로 나타나는 바 이는 하기와 같은 이유 때문이다:
* 결합은 오직 N-말단 서열에서만 관찰되었다
* D2 또는 G3의 손실은 결합을 강하게 감소시키지 않는다
* 2DGN4의 손실은 결합을 완전히 폐지한다.
결론
분석은 시험된 모든 5 개 항체들에서 결합 부위를 동정하였다. 모든 항체들은 N 말단상의 선형으로 보이는 항원결정부위에 결합하는 것으로 발견되었다. 모든 항체들은 결합에 대하여 2DGN4에 강하게 의존하는 유사한 항원결정부위에 결합하는 것으로 발견되었다.
실시예 8: 항원결정부위 파인-매핑
방법론
각 위치는 18개 아미노산 (시스테인을 제외한 모든 천연 아미노산)에 의해 치환된 인간 및 사이노멀거스 CD3ε 잔기 2 - 16 및 5 - 20에서 유도된 15mer 선형 어레이들을 상기 항체들로 탐침하고 결합에 영향을 끼치는 특이성을 발견하였다.
결과
모든 항체들은 N 말단과 결합하였고 이에는 N4가 절대적으로 필요하고 E6가 연루되고, 및 유의한 유사성을 공유한다. 모든 항체들은 핵심 항원결정부위에 인접한 서열에서의 작은 차이에도 불구하고, CD3ε의 인간과 사이노멀거스 버전 둘 다 결합한다.
타겟 단백질
처음 매핑은 CD3ε의 N 말단 상의 선형 부위를 시험된 모든 항체들에 대한 핵심 항원결정부위로서 동정하였다. 하기 서열들의 잔기 2 - 20을 사용하여 선형 15mer 펩타이드들의 전체 치환 라이브러리를 설계하였다.
방법론
펩타이드의 합성
선형 펩타이드들을 표준 Fmoc 합성방법으로써 Hi-Sense 표면의 하이드로젤 상에서 합성하였다. 탈보호 및 세척 후, 카드들을 독점적 세척 완충액을 사용하여 초음파조에서 많이 세척하였다.
ELISA 스크리닝
합성된 펩타이드의 각각으로의 항체들의 결합을 ELISA로 시험하였다. 상기 펩타이드 어레이들을 일차 항체 용액과 배양하였다 (밤새 4℃에서). 세척 후, 상기 펩타이드 어레이들을 항체 페록시다제 접합체 (SBA, cat.nr.2010-05)의 1/1000 희석물로 1 시간동안 25℃에서 배양하였다. 세척 후, 페록시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트 (ABTS) 및 2 μl/ml의 3% H2O2 를 첨가하였다. 1 시간 후, 발색을 측정하였다. 발색은 전하결합소자 (CCD)-카메라 및 이미지 처리 시스템을 사용하여 정량하였다.
펩타이드의 설계
화학적 합성 CLIPS 펩타이드들을 하기 계획에 따라 합성하였다 (참조 방법 단락).
세트 1
모방 유형
선형 펩타이드
설명
인간 CD3ε 잔기 2 - 16로부터 유도된 15mer 펩타이드. 각 펩타이드에서, 잔기들 중 하나는 모든 천연적 아미노산들 (시스테인 제외)에 의해 대체되어, 포화 돌연변이 라이브러리를 만들었다.
서열 (처음 10개 표시)
AGNEEMGGITQTPYK
DGNEEMGGITQTPYK
GGNEEMGGITQTPYK
HGNEEMGGITQTPYK
LGNEEMGGITQTPYK
MGNEEMGGITQTPYK
NGNEEMGGITQTPYK
PGNEEMGGITQTPYK
QGNEEMGGITQTPYK
RGNEEMGGITQTPYK
세트 2
모방 유형: 선형 펩타이드
설명
사이노멀거스 CD3ε 잔기 2 - 16로부터 유도된 선형 15mer 펩타이드. 각 펩타이드에서, 상기 잔기들 중 하나는 모든 천연 발생 아미노산 (시스테인 제외)에 의해 치환되어, 포화 돌연변이 라이브러리를 창출한다.
서열 (처음 10개 표시)
AGNEEMGSITQTPYQ
DGNEEMGSITQTPYQ
GGNEEMGSITQTPYQ
HGNEEMGSITQTPYQ
LGNEEMGSITQTPYQ
MGNEEMGSITQTPYQ
NGNEEMGSITQTPYQ
PGNEEMGSITQTPYQ
QGNEEMGSITQTPYQ
RGNEEMGSITQTPYQ
세트 3
모방 유형: 선형 펩타이드
설명
인간 CD3ε 잔기 5 - 20으로부터 유도된 선형 15mer 펩타이드. 각 펩타이드에서, 상기 잔기들 중 하나는 모든 천연 발생 아미노산 (시스테인 제외)에 의해 치환되어, 포화 돌연변이 라이브러리를 창출한다.
서열 (처음 10개 표시)
Figure pct00007
세트 4
모방 유형
선형 펩타이드
설명
사이노멀거스 CD3ε 잔기 5 - 20로부터 유도된 선형 15mer 펩타이드. 각 펩타이드에서, 상기 잔기들 중 하나는 모든 천연 발생 아미노산 (시스테인 제외)에 의해 치환되어, 포화 돌연변이 라이브러리를 창출한다.
서열 (처음 10개 표시)
AEMGSITQTPYQVSI
DEMGSITQTPYQVSI
GEMGSITQTPYQVSI
HEMGSITQTPYQVSI
LEMGSITQTPYQVSI
MEMGSITQTPYQVSI
NEMGSITQTPYQVSI
PEMGSITQTPYQVSI
QEMGSITQTPYQVSI
REMGSITQTPYQVSI
샘플의 비교
모든 5 개 항체들은 절대적으로 N4 (히스티딘에 의해서 대체될)를 요구하고 및 제한된 치환은 감내되지만 E6에 대한 매우 큰 선호를 나타내면서, CD3ε N 말단의 인간 및 사이노멀거스 변이체로부터 유도된 선형 펩타이드에 매우 유사한 방식으로 결합하나, 그 위치에서 가장 선호되는 잔기는 글루타메이트인 것으로 보인다. 상기 항체들 어느것도 잔기 5-20의 펩타이드에 결합하지 않았다. 이러한 5 개의 군 내에서, 세 개 항체들 (클론 2, 클론 3, 및 클론 4)는 나머지 두 개 (클론 6, 및 클론 10)보다 사이노 서열에서의 변이에 더 민감하였는데, 이는 세 개의 전자 군이 G3, E5, 및/또는 G8의 대체에 더 민감하기 때문이다. 이러한 관측은 SPR로 결정되는 바와 같이, 단백질의 인간 및 사이노멀거스 형태에 대한 친화성에서의 차이와 일치된다 (참조 표 1).
결론
상기 분석은 상기 5 개 항체들의 항원결정부위를 파인 매핑하였고, 이들은 N 말단과의 결합에 N4 및 E6를 절대적으로 요구하며, 및 상당한 유사점을 공유한다. 모든 항체들은 핵심 항원결정부위에 인접한 서열에서의 작은 차이에도 불구하고, CD3ε의 인간과 사이노멀거스 버전 둘 다 결합한다.
일반적 방법론:
일차 서열 분석
상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들 (VL 및 VH)의 수득된 서열 정보를 정렬하고 서열 상동성에 따라 그룹을 지었다. 토끼 가변성 도메인들의 세트들을 분석하여 독특한 클론들과 CDR들의 독특한 세트들을 동정하였다. 양쪽 도메인들의 연합 아미노산 서열에 기반하여 VL 및 VH 도메인들의 조합된 정렬을 수행해서 독특한 클론들을 동정하였다. 상기 가변 도메인들의 정렬에 더하여, 각 토끼 IgG 클론의 6 개 상보성 결정 부위 (CDR들)의 서열들의 세트를 상이한 클론 간에 비교하여 CDR들의 독특한 세트를 동정하였다. 다중 정렬 수단 COBALT를 사용하여 이러한 독특한 CDR 세트들을 정렬하고 계통발생 나무를 Neighbor Joining 알고리즘을 사용하여 만들었다. CDR 세트들을 각 클론의 연결된 CDR 서열들의 서열 상동성에 기반하여 그룹을 짓고 및 클러스터 역치를 서열 상동성 및 동일성에 근거하여 결정하였다. 개별 토끼 IgG 클론들의 스크리닝 분석 결과 및 클러스터 합병에 근거하여, 후보자들을 추가 분석을 위해 선택하였다. 높은 서열 다양성으로써 진행하고자, 상이한 클러스터로부터 출처된 클론들을 선택하였다.
토끼 IgG 제조
토끼 IgG 가변 도메인들을 RT-PCR 증폭하고 및 리더 서열 및 각각의 상수적 도메인들을 포함하는 일시적 이종적 발현용의 적절한 포유동물 발현 벡터, 예 pFUSE-rIgG 벡터 (Invivogen)에 결찰함으로써 클론하였다. 기능적 rIgG의 일시적 발현은 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터들을 FreeStyle™ MAX 시스템을 사용하여 CHO S 세포에서 공동 형질감염시킴으로써 수행되었다. 수 일간의 배양 후, 항체 분비 세포들의 상등액을 회수하여 정제하였다. 후속적으로 분비된 토끼 IgG들을 자기 Protein A 비드 (GE Healthcare)를 사용하여 친화성 정제하였다. IgG가 탑재된 비드들을 세척하고 및 정제된 항체들을 pH 변화로 용출하였다. 용출 분획물을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법 (SDS-PAGE), 280 nm에서의 UV 흡광 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)로 분석하여 모든 샘플들에 대하여 비견할 만한 질을 확증하였다.
인간화 단쇄 Fv 단편물 및 IgG들의 조작 및 특성화
토끼 항체 클론의 인간화는 토끼 CDR들을 Vκ1/VH3 유형의 Numab의 독점적 scFv 수용체 기본구조 상에 이전하는 것을 포함한다. 이러한 과정에서, 주어진 토끼 클론의 6 개 CDR 부위들의 아미노산 서열을 공개된 바와 같이, 토끼 항체 공여 서열 상에서 동정하였고 (Borras, L. 등. 2010. JBC;285:9054-9066) 및 Numab 수용체 골격 서열로 접합하였다. 토끼 클론 클론-06의 경우, 예를 들어, 결과된 인간화 클론-06의 VL 및 VH 서열들은 서열번호 21 및 22에 각각 나타나 있다.
인간화된 IgG 작제물을 위에서 설명된 방식과 유사하게 만들 수 있다.
단클론성 항-CD3 항체들의 결합 역학 및 종별 교차 반응성 결정을 위한 SPR 분석법
단클론성 토끼 항-CD3 항체들의 결합 친화성은 MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. 친화성 측정의 경우, 토끼 IgG들의 Fc 부위에 특이적인 항체 (Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A)를 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors) 상에 고정시켰다. 토끼 단클론성 항체들은 상기 고정된 항-토끼 IgG 항체에 의해 포획되었다. 인간 이종이량성 단쇄 CD3εγ 세포외 도메인 (자체 생산)의 90 내지 2.81 nM 범위의 이배 차수 연속 희석물을 유세포로 3 분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상에 포획된 IgG로부터 단백질을 5 분간 해리하였다. 각 주입 주기 후, 표면을 10 mM 글리신-HCl로 두 번 주입하여 재생하였다. 겉보기 해리 속도 상수 (kd)와 결합 속도 상수 (ka) 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭무어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로써 계산하였다
종간 교차-반응성의 결정
사이노멀거스 원숭이 단쇄 CD3εγ 세포외 도메인에 대한 종 교차-반응성을 동일한 분석 구성장치를 사용하여 측정하였다. 사이노멀거스 원숭이 이종이량성 CD3εγ 세포외 도메인 (자체 제작)의 90 내지 0.12 nM 범위의 3 배 차수 순차 희석액을 유세포에 3 분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상에 포획된 IgG로부터 단백질을 5 분간 해리하였다. 각 주입 주기 후, 표면을 10 mM 글리신-HCl로 두 번 주입하여 재생하였다. 겉보기 해리 속도 상수 (kd)와 결합 속도 상수 (ka) 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭무어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로써 계산하였다.
T-세포의 세포 표면 상에서 발현된 CD3ε으로의 단클론성 항-CD3 항체들의 결합을 결정하는 세포-기반 ELISA
인간 T 세포주인 저캣 세포 (클론 E6-1)을, 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내의 10% FBS을 함유한 100 μl 인산염-완충 식염수(PBS)에 300,000개 세포/웰로 심었다. 항-CD3 토끼 단클론성 항체들의 90 nM 내지 0.0058 nM 범위로 5 배 차수 순차 희석물을 상기 플레이트 내 10% FBS 함유 100 μl PBS에 첨가하였다. 저캣 세포의 표면 상에 발현된 CD3ε으로의 토끼 항체들의 결합은 IgG 아형의 토끼 항체들의 Fc 부분을 특이적으로 인지하는 이차 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 111-035-046)에 의해 검출되었다. 이러한 이차 항체는 효소 고추냉이 페록시다제 (HRP)에 연결되었다. HRP 활성은 TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00)을 첨가하여 측정하였고, 상기 기질은 비색 반응에서 HRP에 의해 가공된다. 가공된 기질의 색깔 강도는 저캣 세포에 결합된 항-CD3 항체의 양에 직접적으로 비례한다. 색깔 강도를 정량화하기 위해, 각자의 파장에서 흡광 (광밀도)을 마이크로티터 플레이트 판독기 (Infinity reader M200 Pro, Tecan)를 사용하여 측정하였다.
저캣 세포의 세포 표면상에 제시된 미지의 성분에 대한 항체들의 비특이적 결합을 수정하기 위해, 저캣 T 세포주 (J.RT3-T3.5)의 CD3ε 결핍 유도체를 사용하였다. 이러한 세포주에 대한 단클론성 항체들의 결합은 저캣 세포들에 대하여 전술한 바와 같이 측정되었다. 저캣 세포로의 특이적 결합을 정량화하기 위해, 음성 대조군으로의 결합에 대한 광밀도를 저캣 세포로의 결합에 대한 광밀도로부터 차감하였다. 데이터는 4-변수 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 통해 분석되었고, 50% 결합에 도달되는 것에 요구되는 항-CD3 항체의 몰 농도 (EC50, 표준 곡선의 중간-OD)는 용량 반응 곡선으로부터 유도되었다.
종 교차-반응성의 결정
HSC-F T 세포의 세포 표면상에 제시된 사이노멀거스 원숭이 CD3로의 결합을 동일한 분석 구성장치를 사용하여 측정하였다. 사이노멀거스 원숭이 T 세포주인 HSC-F 세포들을 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내의 10% FBS을 함유한 100 μl 인산염-완충 식염수(PBS)에 300,000개 세포/웰로 심었다. 항-CD3 토끼 단클론성 항체들의 18 nM 내지 0.0058 nM 범위로 5 배 차수 순차 희석물을 상기 플레이트 내 10% FBS 함유 100 μl PBS에 첨가하였다. HSC-F 세포의 표면상에 발현된 사이노멀거스 원숭이 CD3ε으로의 토끼 항체들의 결합은 IgG 아형의 토끼 항체들의 Fc 부분을 특이적으로 인지하는 이차 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 111-035-046)에 의해 검출되었다. 이러한 이차 항체는 효소 고추냉이 페록시다제 (HRP)에 연결되었다. HRP 활성은 전술한 바와 같이 측정되었다.
상기 세포 표면상에 제시된 미지의 성분에 대한 항체들의 비특이적 결합을 수정하기 위해, CD3ε 음성 인간 B 임파아구 세포주(DB)를 사용하였다. 이러한 세포로의 단클론성 항체들의 결합을 전술한 바와 같이 측정하였다. HSC-F 세포로의 특이적 결합을 정량화하기 위해, 상기 음성 대조군으로의 결합에 대한 광밀도를 HSC-F 세포로의 결합에 대한 광밀도로부터 차감하였다. 데이터는 4-변수 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 통해 분석되었고, 50% 결합에 도달되는 것에 요구되는 항-CD3 항체의 몰 농도 (EC50, 표준 곡선의 중간-OD)는 용량 반응 곡선으로부터 유도되었다.
단클론성 항-CD3 항체에 의한 T-세포 활성화: CD69 발현의 유도
단클론성 토끼 항-CD3 항체들의 T-세포 활성화를 유도하는 능력은 설명된 대로, 저캣 세포에서 조기 T-세포 활성화 마커인 CD69 발현의 유도를 측정함으로써 평가되었다 (Gil 등, Cell. 2002; 109: 901-912). 용량 반응 분석을 위해, 저캣 세포 (100,000개 세포/웰)를 20 μg/ml, 5 μg/ml 및 1.25 μg/ml의 항-CD3 항체들로 24 시간 자극하였다. 항-CD3 단클론성 항체를 저캣 세포에 첨가하기 전, OKT3 (BioLegend, Cat. No. 317302) 또는 TR66 (Novus Biologicals, Cat. No. NBP1-97446)을 사용할 때 각각 3 배 과량의 염소 항-토끼 IgG 항체 (Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A) 및 토끼 항-마우스 IgG 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 315-005-008)을 첨가하여 항-CD3 항체들을 가교시켰다. 자극 후, 인간 CD69에 특이적인 피코에리트린 (PE)-표지된 항체 (BioLegend, Cat. No. 310906)을 사용하여 세포들을 CD69 발현에 대하여 염색하였고 및 다음 유세포 분석기 (FACS aria III, Becton Dickinson)로 분석하였다. 미자극된 음성 대조군으로서, 가교 항체로 배양된 저캣 세포들을 전술한 바와 같이, 항-CD69 항체를 사용하여 염색하였다. 시간에 따른 T-세포 활성화를 전술한 바와 같이 유사한 분석 구성장치를 분석하여 평가하였다. 100,000개 저캣 세포/웰을 전술한 바와 같이 가교된 5 μg/ml 항-CD3 항체들을 사용하여 0, 4, 15, 24, 48 및 72 시간동안 자극하였다. 용량 반응 분석에 동일하게, CD69 발현을 유세포 분석법으로 분석하였다.
scDb 작제물의 제조
다양한 항-IL5R x CDE3ε scDb 작제물들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열들을 처음부터 합성하였고 pET26b(+) 기본구조 (Novagen)에 기반한 E.coli 발현용으로 채택된 벡터로 클론하였다. 상기 발현 작제물들을 E.coli 균주 BL12 (DE3) (Novagen)로 형질전환하였고 및 상기 세포를 초기 배양액으로서 2YT 배지 (Sambrook, J., 등., Molecular Cloning: A Laboratory Manual)에 배양하였다. 발현 배양물들을 접종하고 진탕 플라스크 내 37℃ 및 200 rpm에서 배양하였다. 일단 OD600 nm가 1에 도달하면, 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 밤새 발현 후, 상기 세포들을 4000 g에서 원심분리하여 수확하였다. 봉입체 제조를 위해, 세포 펠렛을 IB 재현탁 완충액 (50　mM Tris-HCl pH　7.5, 100　mM NaCl, 5　mM EDTA, 0.5% Triton X-100)에 재현탁하였다. 세포 슬러리에 1　mM DTT, 0.1　mg/mL 라이소자임, 10　mM 류펩틴, 100　μM PMSF 및 1　μM 펩스타틴으로 보충하였다. 세포들을 얼음 상에서 냉각시키면서 3 차례 초음파 호모게나이제이션하여 파괴하였다. 후속적으로, 0.01　mg/mL DNAse를 첨가하고 및 균질화물을 실온에서 20　분간 배양하였다. 15000　g 및 4℃에서 원심분리하여 봉입체를 침전시켰다. 봉입체들을 IB 재현탁 완충액에 재현탁시키고 초음파 처리후 원심분리하였다. IB 재현탁 완충액으로 총 최소한 3 번 세척하고 그 후 IB 세척 완충액 (50　mM Tris-HCl pH　7.5, 100　mM NaCl, 5　mM EDTA)으로 2 번 세척하여 최종 봉입체를 생성하였다.
단백질 재폴딩을 위해, 상기 단리된 IB들을 가용화 완충액 (100　mM Tris/HCl pH 8.0, 6　M Gdn-HCl, 2　mM EDTA)에 습윤 IB들의 그람당 5　mL의 비율로 재현탁하였다. 가용화물을 실온에서 30분간 처리한 후 DTT를 최종농도 20　mM으로 첨가하고 및 다시 30분간 항온처리하였다. 가용화를 완수한 후, 용액을 21500 g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 깨끗하게 하였다. 재폴딩은 재폴딩 완충액 (일반적으로 100　mM Tris-HCl pH 8.0, 5.0　M 우레아, 5　mM 시스테인, 1　mM 시스틴)에 가용화된 단백질의 최종 단백질 농도 0.3 g/L에서 신속히 희석시켜 수행되었다. 재폴딩 반응액을 최소 14시간 항온처리하였다. 결과된 단백질 용액을 8500　g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 깨끗하게 하였다. 재폴딩된 단백질은 Capto L 수지 (GE Healthcare)상에서 친화도 크로마토그래피로 정제되었다. 분리된 단량체 분획물을 크기-배제 HPLC로 처리하고, 순도에 대해 SDS-PAGE에 의해, 및 단백질 함량에 대해 UV/Vis 분광분석법으로 분석하였다. 완충액을 투석으로 천연 완충액(50　mM 시트레이트-포스페이트 pH　6.4, 200　mM NaCl)으로 교체하였다.
이중특이성 항-CD3 x IL5R scDb들의 결합 역학을 측정하는 SPR 분석법
항-CD3 x IL5R scDb들의 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors)를 사용하여 측정하였다. CD3로의 친화도 측정을 위해, 인간 이종이량성 단쇄 CD3εγ 세포외 도메인 (자체 제작)을 표준 아민-커플링 방법을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors) 상에 고정하였다. scDb들의 90 내지 0.1 nM 범위의 3-배 차순 순차 희석물을 상기 유세포로 3 분간 투여하고 및 단백질을 상기 센서 칩 상에 고정된 CD3εγ로부터 12분간 해리하였다. 각 주입 주기 후, 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.0)로 두 번 주입하여 재생하였다. IL5R에 반하여 친화도 측정을 위해, 인간 IgG들의 Fc 부위에 특이적인 항체를 아민-결합으로 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors) 상에 고정시켰다. 인간 IL5R-Fc 키메라 단백질 (Novus Biologicals)을 고정화된 항체로 포획하였다. IL5R (90 nM -0.1 nM)에 특이적인 scDb들의 3 배 차수 순차 희석액을 유세포에 3 분간 첨가하고 및 해리를 12 분간 모니터하였다. 각 주입 주기 후, 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 두 번 주입하여 재생하였다. 겉보기 해리 속도 상수 (kd)와 결합 속도 상수 (ka) 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭무어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로써 계산하였다.
T-세포의 세포 표면상에 발현된 CD3ε으로 및 CHO 세포 (CHO-IL5R 세포)의 표면 상에 발현된 IL5R로 이중특이성 항-CD3 x IL5R scDb들의 결합
인간 T 세포주인 저캣 세포 (클론 E6-1, ATCC)의 세포 표면상에 발현된 CD3ε으로의 scDb들의 결합을 유세포 분석법으로 분석하였다. 저캣 세포의 세포 표면상에 제시된 미지의 성분에 대한 항체들의 비특이적 결합을 평가하기 위해, 저캣 T 세포주 (J.RT3-T3.5, ATCC)의 CD3ε 결핍 유도체를 사용하였다. 세포-표면 상에 발현된 IL5R으로의 scDb들의 결합을 유전자이식성 (transgenic) CHO-IL5R 세포 (ZHAW에서 발생)을 사용하여 분석하였고 및 야생형 CHO 세포들 (Invitrogen)을 비특이적 결합에 대하여 대조군으로 사용하였다. 양쪽 세포주들을 scDb들의 1 μg/mL 및 10 μg/Ml과 같이 1 시간 동안 배양하고 결합된 scDb들을 RPE-표지된 단백질 L (BioVision)을 첨가하여 검출한 후, 유세포 분석기 (FACS aria III, Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 음성 대조군으로서, 미관련 타겟에 특이적인 scFv를 사용하였다. 저캣 및 CHO-IL5R 세포들로의 결합을 정성 평가하기 위해, 기하 평균에서 신호강도를 반영하는 평균 형광 강도 (MFI)를 비특이적 scFv은 물론 시험 scDb들 둘 다에 대하여 측정하였다. 시험 항체 및 음성 대조군 항체 간의 MFI 차이 (ΔMFI)를 결합에 대한 측정치로서 계산하였다. 또한, 정규화된 MFI는 음성 대조군 scFv의 MFI를 통해 시험 scDb의 MFI를 나눔으로써 계산되었다.
이중특이성 항-CD3 x IL5R scDb들에 의한 T-세포 활성화: IL-2 분비의 유도
항-CD3 x 항-IL5R scDb들이 타겟 세포의 존재하에서 IL-2 발현을 CD8+ 세포독성 T-세포에서 유도하는 능력을 하기와 같이 평가하였다. RosetteSepTM 인간 CD8+ T-세포 밀집화 칵테일 (STEMCELL Technologies)을 제조사의 지침대로 사용하여 세포독성 T-세포들을 인간 혈액으로부터 새로이 분리하였다. CHO-IL5R 세포 (10'000개 세포/웰)을 CD8+ 세포독성 T-세포와 같이 10:1의 주효자:타겟 비율로 10-배 차수 순차 희석된 scDb들 (100 nM 내지 0.001 nM)의 존재하에서 96 웰 마이크로티터 플레이트에서 배양하였다. T-세포들의 비특이적 자극을 평가하기 위해, 야생형 CHO 세포들을 타겟 세포로서 사용하였다. 16시간 공동-배양한 후 상등액을 수집하여 IL-2 분비를 측정하였다. IL-2 분비는 상업적으로 판매되는 ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 정량화되었다. 데이터는 4-변수 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 SoftMax® Pro data analysis Software (Molecular Devices)를 통해 분석되었고, 최대 절반 IL-2 분비를 유도하는 데 요구되는 scDb의 몰 농도 (EC50)는 용량 반응 곡선으로부터 유도되었다.
세포독성 T 세포에 의한 IL5R 발현 CHO 세포의 scDb 매개 용해
타겟 세포 용해를 유도하는 이중특이성 항-CD3 x IL5R scDb들의 능력을 산정하기 위해, 유전자이식성 IL5R 발현 CHO 세포주를 사용하였다 (CHO-IL5R). 전술한 바와 같이 분리한 비자극된 인간 CD8+ T-세포를 주효 (effector) 세포로서 사용하였다. 타겟 세포들을 cell tox green 염료(Promega)로 제조사 지침에 따라 표지하였다. 세포 용해는 CellTox™ green 세포독성분석법(Promega)으로 관찰하였다. 상기 분석법은 세포 사멸의 결과로서 일어나는 세포막 온전성에서의 변화를 측정한다. 상기 분석법은 살아있는 세포로부터는 배제되지만, 죽은 세포 DNA를 선호적으로 염색하는 비대칭적 시아닌 염료를 사용한다. 상기 염료가 손상된 세포에서 DNA와 결합할 때, 그 형광 특성은 실질적으로 향상된다. 살아있는 세포들은 형광에서 유의한 증가를 나타내지 않는다. 따라서, 죽은 세포 DNA와의 결합 상호작용에 의해 생성된 형광 신호는 세포독성에 비례한다. 전술한 바와 유사하게, 표지된 CHO-IL5R 세포 (10'000 세포/웰)을 10-배 차수 순차 희석된 scDb들 (100 nM 내지 0.001 nM) 존재하 96 웰 마이크로티터 플레이트에서 CD8+ 세포독성 T-세포와 같이 10:1의 주효자:타겟 비율로 배양하였다. 상기 타겟을 발현하지 않는 세포의 비특이적 용해를 평가하기 위해, T-세포를 표지된 야생형 CHO 세포와 공배양하였다. 88 시간 배양 후, 다중 모드 마이크로플레이트 판독기 (FlexStation 3, Molecular Devices)를 사용하여 형광 강도를 분석하였다. 데이터는 4-변수 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 SoftMax® Pro data analysis Software (Molecular Devices)를 통해 분석되었고, 최대 절반 타겟 세포 용해를 유도하는 데 요구되는 scDb의 몰 농도 (EC50)는 용량-반응 곡선으로부터 유도되었다.
상이한 항체들의 결합에 가장 영향을 주는 잔기
클론 식별 번호 세트 1 세트 2 세트 3 세트 4
클론-06 N4; E6 N4; E6 낮은 결합 낮은 결합
클론-02 N4; E6 N4; E6; (G8) 낮은 결합 낮은 결합
클론-03 N4; E6 N4; E6; (G8) 낮은 결합 낮은 결합
클론-04 N4; E6 G3; E6 낮은 결합 낮은 결합
클론-10 N4; E6 N4; E6 낮은 결합 낮은 결합
항-CD3 항체의 서열
서열번호 항체 클론 중쇄/경쇄 아미노산 서열
1 클론-01 VL AQVLTQTASSVSAAVGGTVTISC QSSESVYNNNRLS WFQQKPGQPPKQLIY SASSLAS GVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYC QGEFSCSSADCFT FGGGTEVVVKGD
2 클론-01 VH QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPL SSYAMI WVRQAPGKGLEWIG MILRAGNIYYASWAKG RFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAR RQYNTDGYPIGIGDL WGPGTLVTVSS
3 클론-02 VL AQVLTQTPSSVSAVVGGTVTISCQSSESVYSNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTITDLECDDAATYFCQGEFSCSSVDCFSFGGGTEVVVKGD
4 클론-02 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSAYAMIWVRQAPGKGLEWIGMIIRSGTVYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARRHYNADGYPIGIGDLWGPGTLVTVSS
5 클론-03 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTISCQSNENIYSNNRLSWFQQKPGQPPNQLIYSASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFNCNSADCFTFGGGTEVVVKGD
6 클론-03 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLNRYAMLWVRQAPGKGLEWIGLITRADKKYYASWAKGRFTISKTSTTVDLEITGPTTEDTATYFCARRHYNTDGYPIAIGDLWGPGTLVTVSS
7 클론-04 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYTTSSLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQGEFSCSRADCFNFGGGTEVVVKGD
8 클론-04 VH QSLEESGGRLVKPDETLTLTCTVSGFPLSSYAMGWFRQAPGKGLEWIGMILRSDNTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARRHYNASGNPIAIGDLWGPGTLVTVSS
9 클론-06 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTISCQSSESVYNNKRLSWFQQKPGQPPKQLIYTASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFTCSNADCFTFGGGTEVVVKGD
10 클론-06 VH QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGMILRAGNIYYASWVKGRVTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARRHYNREGYPIGIGDLWGPGTLVTVSS
11 클론-09 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTISCQSNENIYSNNRLSWFQQKPGQPPNQLIYSASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFNCNSADCFTFGGGTEVVVKGD
12 클론-09 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLNRYAMLWVRQAPGKGLEWIGLITRADKKYYASWAKGRFTISKTSTTVDLEITGPTTEDTATYFCARRHYNTDGYPVAIGDLWGPGTLVTVSS
13 클론-10 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTATISCQSNENIYSNNRLSWFQQKAGQPPNQLIYSASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFSCSSADCFTFGGGTEVVVKGD
14 클론-10 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSSFAMLWVRQAPGKGLEWIGMIMRAHNMYYASWAKGRFTISKTSTTVDLEITSPTTEDTATYFCARRHYNTYGYPIAIGDLWGPGTLVTVSS
15 클론-11 VL AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYTASSLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQGEFSCSSADCFTFGGGTEVVVKGD
16 클론-11 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSSYAMGWFRQAPGKGLEWIGMILRADNTYYASWVNGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARRHYNTYGYPVAIGDLWGPGTLVTVSS
17 클론-12 VL AQVLTQTPSSVSATVGGTVTISCQSNENIYSNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYSASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGEFNCNSADCFTFGGGTEVVVKGD
18 클론-12 VH QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSRYAMLWVRQAPGKGLEWIGLITRADNKYYASWAKGRFTISKTSTTVDLEITSPTTEDTATYFCARRHYNTDGYPIAIGDLWGPGTLVTVSS
19 컨센서스 VL AQVLTQTX(P/A)SSVSAX(A/V/T)VGGTX(V/A)TIX(S/N)CQSX(S/N)X(E/Q)X(S/N)X(V/I)YX(S/N)NX(N/K)RLSWFQQKX(P/A)GQPPX(K/N)X(Q/L)LIYX(S/T)X(A/T)SX(S/T)LASGVPSRFKGSGSGTX(Q/E)FTLTIX(S/T)DLECX(D/A)DAATYX(Y/F)CQGEFX(S/N/T)CX(S/N)X(S/N/R)X(A/V)DCFX(T/S/N)FGGGTEVVVKGD
20 컨센서스 VH QSX(L/V)EESGGRLVX(T/K)PX(G/D)X(T/E)X(P/T)LTLTCTVSGFPLX(S/N)X(S/A/R)X(Y/F)AMX(L/I/G)WX(V/F)RQAPGKGLEWIGX(M/L)IX(L/T/M/I)RX(A/S)X(D/G/H)X(N/K/T)X(K/T/I/M)YYAX(S/N)WX(A/V)X(K/N)GRX(F/V)TISKTSTTVDLX(K/E)ITX(S/G)PTTEDTATYFCARRX(H/Q)YNX(T/A/R)X(D/Y/S/E)GX(Y/N)PX(I/V)X(A/G)IGDLWGPGTLVTVSS
21 인간화 클론-06 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYNNKRLSWYQQKPGKAPKLLIYTASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGEFTCSNADCFTFGQGTKLTVLG
22 인간화 클론-06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGMILRAGNIYYASWVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYNREGYPIGIGDLWGQGTLVTVSS
[서열번호 1과 2에서 볼드체와 밑줄 친 것으로 나타난 CDR 1 내지 3은 모든 서열에 대표적인 것이다]
[서열번호 19 및 20에서: 위치 "X"는 축퇴된 위치이다: 각각의 축퇴성은 개별 "X" 뒤의 괄호로 제시된다]
* * * * *
본 발명은 본 명세서에서 설명된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제, 본 명세서에서 설명된 것에 더하여 발명의 다양한 개질이 전술한 설명으로부터 당해 분야의 숙련자에게 명백하게 될 것이다. 그러한 개질은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
각각의 특허법하에서 가능한 정도로, 본 명세서에서 인용된 모든 특허, 출원서, 공개물, 시험 방법, 문헌 및 다른 물질들은 언급함으로써 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다.
<110> Numab AG <120> Novel Antibodies <130> IPP20150005EP <150> EP 13 002 769.1 <151> 2013-05-28 <150> EP 13 005 113.9 <151> 2013-10-25 <150> PCT/EP2014/001282 <151> 2014-05-12 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 1 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 2 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gln 85 90 95 Tyr Asn Thr Asp Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 3 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Val Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Val Asp Cys Phe Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 4 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ala Tyr Ala 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Ile Arg Ser Gly Thr Val Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Ala Asp Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 5 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Asn Cys 85 90 95 Asn Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 6 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Asn Arg Tyr Ala 20 25 30 Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Leu Ile Thr Arg Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Thr Asp Gly Tyr Pro Ile Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 7 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Arg Ala Asp Cys Phe Asn Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 8 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Leu Arg Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Ala Ser Gly Asn Pro Ile Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 9 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Thr Cys 85 90 95 Ser Asn Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 10 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly 50 55 60 Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Arg Glu Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 11 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Asn Cys 85 90 95 Asn Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 12 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Asn Arg Tyr Ala 20 25 30 Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Leu Ile Thr Arg Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Thr Asp Gly Tyr Pro Val Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 13 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ser Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro Asn Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 14 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Phe Ala 20 25 30 Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Met Arg Ala His Asn Met Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Thr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 15 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 16 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Leu Arg Ala Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Thr Tyr Gly Tyr Pro Val Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 17 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Thr Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Asn Cys 85 90 95 Asn Ser Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 18 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Arg Tyr Ala 20 25 30 Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Leu Ile Thr Arg Ala Asp Asn Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg His 85 90 95 Tyr Asn Thr Asp Gly Tyr Pro Ile Ala Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X: degenerate position: mixture of P and A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X: degenerate position: mixture of A, V and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> X: degenerate position: mixture of V and A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> X: degenerate position: mixture of E and Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> X: degenerate position: mixture of V and I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> X: degenerate position: mixture of K and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42) <223> X: degenerate position: mixture of P and A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47) <223> X: degenerate position: mixture of K and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48) <223> X: degenerate position: mixture of Q and L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52) <223> X: degenerate position: mixture of S and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53) <223> X: degenerate position: mixture of A and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55) <223> X: degenerate position: mixture of S and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72) <223> X: degenerate position: mixture of Q and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78) <223> X: degenerate position: mixture of S and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83) <223> X: degenerate position: mixture of D and A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89) <223> X: degenerate position: mixture of Y and F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95) <223> X: degenerate position: mixture of S, N and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98) <223> X: degenerate position: mixture of S, N and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99) <223> X: degenerate position: mixture of A and V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103) <223> X: degenerate position: mixture of T, S and N <400> 19 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Xaa Ser Ser Val Ser Ala Xaa Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Xaa Thr Ile Xaa Cys Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Asn 20 25 30 Xaa Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Pro Pro Xaa Xaa 35 40 45 Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Xaa Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Xaa Asp Ala Ala Thr Tyr Xaa Cys Gln Gly Glu Phe Xaa Cys 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Asp Cys Phe Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys Gly Asp 115 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X: degenerate position: mixture of L and V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> X: degenerate position: mixture of T and K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X: degenerate position: mixture of G and D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> X: degenerate position: mixture of T and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> X: degenerate position: mixture of P and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> X: degenerate position: mixture of S, A and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> X: degenerate position: mixture of Y and F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34) <223> X: degenerate position: mixture of L, I and G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36) <223> X: degenerate position: mixture of V and F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49) <223> X: degenerate position: mixture of M and L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51) <223> X: degenerate position: mixture of L, T, M and I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53) <223> X: degenerate position: mixture of A and S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54) <223> X: degenerate position: mixture of D, G and H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55) <223> X: degenerate position: mixture of N, K and T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56) <223> X: degenerate position: mixture of K, T, I and M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60) <223> X: degenerate position: mixture of S and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62) <223> X: degenerate position: mixture of A and V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63) <223> X: degenerate position: mixture of K and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66) <223> X: degenerate position: mixture of F and V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78) <223> X: degenerate position: mixture of K and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81) <223> X: degenerate position: mixture of S and G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96) <223> X: degenerate position: mixture of H and Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99) <223> X: degenerate position: mixture of T, A and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100) <223> X: degenerate position: mixture of D, Y, S and E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102) <223> X: degenerate position: mixture of Y and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104) <223> X: degenerate position: mixture of I and V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105) <223> X: degenerate position: mixture of A and G <400> 20 Gln Ser Xaa Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Xaa Xaa Xaa Ala 20 25 30 Met Xaa Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Xaa Ile Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Xaa Trp Xaa Xaa Gly 50 55 60 Arg Xaa Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Xaa Ile Thr 65 70 75 80 Xaa Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Xaa 85 90 95 Tyr Asn Xaa Xaa Gly Xaa Pro Xaa Xaa Ile Gly Asp Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Thr Cys 85 90 95 Ser Asn Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody variable domain <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg His Tyr Asn Arg Glu Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 100 <210> 24 <211> 95 <212> PRT <213> Cynomolgus <400> 24 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu Gly 20 25 30 Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser Gly 35 40 45 Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly Tyr 50 55 60 Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His His 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 85 90 95 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 35 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Ala Ala Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 36 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Ala Ala Tyr Lys Val 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 37 Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Ala Ala Lys Val Ser 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 38 Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ala Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 39 Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Ala Ala Ser Ile Ser 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 40 Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Ala Ala Ile Ser Gly 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 41 Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ala Ala Ser Gly Thr 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 42 Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ala Ala Gly Thr Thr 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 43 Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ala Ala Thr Thr Val 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 44 Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Ala Ala Thr Val Ile 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 45 Glu Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 46 Glu Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 47 Glu Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 48 Glu Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile 1 5 10 15 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 49 Glu Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 50 Glu Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 51 Glu Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 52 Glu Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu 1 5 10 15 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 53 Glu Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His 1 5 10 15 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 54 Glu Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 1 5 10 15 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 55 Lys Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 56 Lys Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 57 Lys Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 58 Lys Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile 1 5 10 15 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 59 Lys Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys 1 5 10 15 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 60 Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 61 Lys Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser 1 5 10 15 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 62 Lys Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu 1 5 10 15 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 63 Lys Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His 1 5 10 15 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 64 Lys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 1 5 10 15 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 65 Cys Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Cys <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 66 Cys Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Cys <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 67 Cys Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser 1 5 10 15 Cys <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 68 Cys Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 Cys <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 69 Cys Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser 1 5 10 15 Cys <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 70 Cys Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly 1 5 10 15 Cys <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 71 Cys Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 Cys <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 72 Cys Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr 1 5 10 15 Cys <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 73 Cys Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 Cys <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 74 Cys Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile 1 5 10 15 Cys <210> 75 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 75 Cys Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Cys 20 <210> 76 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 76 Cys Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser 1 5 10 15 Ile Ser Gly Thr Thr Cys 20 <210> 77 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 77 Cys Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser 1 5 10 15 Gly Thr Thr Val Ile Cys 20 <210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 78 Cys Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 Thr Val Ile Leu Thr Cys 20 <210> 79 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 79 Cys Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 Ile Leu Thr Ser Pro Cys 20 <210> 80 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 80 Cys Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ser Pro Gln Tyr Cys 20 <210> 81 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 81 Cys Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Ser 1 5 10 15 Pro Gln Tyr Pro Gly Cys 20 <210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 82 Cys Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Ser Pro Gln 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Ser Glu Cys 20 <210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 83 Cys Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Ser Pro Gln Tyr Pro 1 5 10 15 Gly Ser Glu Ile Leu Cys 20 <210> 84 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 84 Cys Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Ser Pro Gln Tyr Pro Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ile Leu Trp Gln Cys 20 <210> 85 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 85 Cys Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 86 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 86 Cys Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 87 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 87 Cys Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 88 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 88 Cys Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 89 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 89 Cys Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 90 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 90 Cys Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 91 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 91 Cys Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 92 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 92 Cys Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 93 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 93 Cys Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 94 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 94 Cys Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Cys Asp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Cys 20 25 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 95 Ala Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 96 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 97 Gly Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 98 His Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 99 Leu Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 100 Met Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 101 Asn Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 102 Pro Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 103 Gln Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 104 Arg Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 105 Ala Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 106 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 107 Gly Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 108 His Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 109 Leu Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 110 Met Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 111 Asn Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 112 Pro Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 113 Gln Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 114 Arg Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 115 Ala Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 116 Asp Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 117 Gly Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 118 His Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 119 Leu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 120 Met Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 121 Asn Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 122 Pro Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 123 Gln Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 124 Arg Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 125 Ala Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 126 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 126 Asp Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 127 Gly Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 128 His Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 129 Leu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 130 Met Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 131 Asn Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 132 Pro Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 133 Gln Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 134 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 134 Arg Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile 1 5 10 15

Claims (26)

  1. 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적인 결합부위를 포함하는 것으로서, 상기 항원-결합 부위는 결합에 결정적인 잔기로서 아미노산 잔기 N4를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 E6를 결합에 관계하는 잔기로서 더 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서,
    사이노멀거스 CD3, 구체적으로 사이노멀거스 CD3ε과, 인간 CD3ε에 대한 것과 비하여 100-배 미만, 구체적으로 30-배 미만, 더욱더 구체적으로 15-배 미만, 및 가장 구체적으로 5-배 미만으로 상이한 사이노멀거스 원숭이 CD3ε에 대한 친화도를 가지고 교차결합하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  4. 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10-8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수로써 인간 CD3에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  5. 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5-배 강하게 T-세포 활성화를 유도하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  6. 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체 OKT-3 또는 TR66보다 더 길게 지속되는 T-세포 활성화를 결과하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  7. 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 교차 연결 시 IgG 포맷에서 시험할 때, T-세포들의 용량-의존적 균등한 활성화 상태를 결과하는, 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  8. 인간 CD3의 항원결정부위에 특이적인 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, IgG 포맷에서 시험할 때, (i) 3.0 x 10-8 M 미만, 구체적으로 1.5 x 10- 8 M 미만, 더 구체적으로 1.2 x 10-8 M 미만, 및 가장 구체적으로 1.0 x 10-8 M 미만의 일가 결합에 대한 해리 상수에서 인간 CD3와 결합하고; 및 (iia) 교차-연결시, 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 24시간 자극 후 항체 OKT-3 또는 TR66보다 적어도 1.5-배 더 강한 T-세포 활성화를 유도하고; (iib) 1.25 μg/ml의 IgG 농도에서 72시간 자극 후 적어도 1.5-배 더 큰 CD69 발현에서 나타나는 바와 같이 항체 OKT-3 또는 TR66을 사용할 때보다 더 길게 유지되는 T-세포 활성화를 결과하고; (iic) T-세포의 용량-의존적 균등한 활성화 상태를 결과하고; 및/또는 (iid) 인간 CD3ε의 항원결정부위에 특이적이며, 상기 항원결정부위는 아미노산 잔기 N4를 결합에 결정적인 잔기로서 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 이의 기능적 단편물.
  9. 제4항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어, 상기 항원결정부위는 인간 CD3의 입실론 사슬 상에 위치하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  10. 제1항 내지 3항, 및 9항 중 어느 한 항에 있어,
    인간 CD3ε에 대한 결합은 IgG 포맷으로 있는 상기 항체 또는 이의 기능적 단편물이 인간 유래의 이종이량성 CD3εγ 의 정제된 세포외 도메인으로의 친화성을, 표면 플라즈몬 공명 실험을 사용하여, 구체적으로 하기 조건을 사용하여 결정함으로써 결정되는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물:
    MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors); 포획 항체: 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 항체 SPR-2 친화성 센서칩, Amine, Sierra Sensors 에 고정화된 상기 IgG의 Fc 부위에 특이적인 항체; 90 내지 2.81 nM의 범위로 2-배 차수 순차 희석된 인간 이종이량성 단쇄 CD3εγ 세포외 도메인, 유세포로 3 분간 주입 및 센서 칩 상에 포획된 IgG로부터 5 분간 단백질을 해리, 각 주입 회차 후 10 mM 글리신-HCl을 두 번 주입하여 표면 재생, 일대일 랭무어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로써, 겉보기 해리 (kd) 및 결합 (ka) 속도 상수 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 계산.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (iia) 및/또는 (iic)에 따른 T-세포 활성화의 유도는 IgG 형태의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 CD69 발현의 자극을, 하기 조건을 사용하여 결정함으로써 결정되는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물:
    IgG 형태로 있는 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물의 20 μg/ml, 5 μg/ml 및 1.25 μg/ml으로 저캣 세포(100,000 세포/웰)를 24 시간 자극 후, 3-배 잉여의 항-IgG 항체를 첨가함으로써 가교 (대조군: OKT3 (BioLegend, Cat. No. 317302) 또는 TR66 (Novus Biologicals, Cat. No. NBP1-97446), 토끼 항-마우스 IgG 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 315-005-008)로 가교); 자극 후 CD69 발현에 대하여, 인간 CD69에 특이적인 피코에리틴 (PE)-표지된 항체(BioLegend, Cat. No. 310906)를 사용하여 세포 염색, 유세포 분석기 (FACS aria III, Becton Dickinson)로 분석; 음성 대조군: 상기 항-CD69 항체로 염색된 가교 항체로 배양된 미자극된 저캣 세포.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iib)에 따른 상기 더 길게 유지되는 T-세포 활성화는 IgG 형태로 있는 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 CD69 발현에 대한 자극의 시간 경과를 구체적으로 하기 조건을 사용하여 결정함으로써 결정되는, 단리된 항체 및 이의 기능적 단편물:
    100,000개 저캣 세포/웰을 IgG 형태의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물 5 μg/ml, 제10항에서와 같이 가교된 항-CD3 항체들로 0, 4, 15, 24, 48 및 72 시간 자극, 및 제10항에서와 같이 유세포분석법에 의해 CD69 발현의 분석.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iia) 및/또는 (iic)에 따른 T-세포 활성화의 유도는 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물에 의한 IL-2 분비의 자극을 구체적으로 하기 조건을 사용하여 결정함으로써 결정되는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물:
    저캣 세포들(200,000 세포/웰)을 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물로 5 μg/ml 농도에서 4 개 상이한 분석 구성을 사용하여 자극: (a) 저캣 세포를 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물로 자극하고 3-배 더 높은 농도의 항IgG 항체를 첨가하여 교차반응 (대조군: OKT3 (BioLegend, Cat. No. 317302) 또는 TR66 (Novus Biologicals, Cat. No. NBP1-97446), 토끼 항-마우스 IgG 항체 (JacksonImmuno Research, Cat. No. 315-005-008)로 가교); (b) 가교 항체 부재하에서 T-세포 활성화; (c) 조직 배양 플레이트 상에서 밤새 배양하여 상기 가교 항체들을 고정화; (d) 가교 항체 부재하 밤새 배양하여 조직 배양판 상에서 IgG 형식의 상기 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물 (또는 대조군 항체들)의 자극; 각 구성에서, 첨가 한 시간 후에, 10 ng/ml PMA 및 상등액 수집물로 세포를 자극하고, 24, 48 및 72 시간 후, IL-2 분비를 측정하고, 상업적 이용 가능한 ELISA (BioLegend, Cat. No. 431801)를 사용하여 정량화.
  14. 제4항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이노멀거스 CD3와 교차 반응하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 토끼 항체 또는 이의 기능적 단편물이거나, 또는 (ii) (i)의 토끼 항체 또는 이의 기능적 단편물을 인간화함으로써 수득된 것인, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  16. 제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10및 22에 존재하는 하나 CDR1, 하나 CDR2 및 하나 CDR3 부위의 조합을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9및 21에 존재하는 하나 CDR1, 하나 CDR2 및 하나 CDR3 부위의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서,
    상기 VH 도메인은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10 및 22에 존재하는 기본 구조 도메인들로부터 선택되는 기본구조 도메인을 포함하고, 및 구체적으로 상기 VL 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9 및 21에 존재하는 기본 구조 도메인들로부터 선택되는 기본구조 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  17. 제16항에 있어서,
    서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10및 22 중 하나에 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위의 조합을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9및 21중 하나에 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 것으로서, 상기 VH 도메인은 서열번호, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10 및 22, 더 구체적으로즌 서열번호 10 및 22 중 하나에 존재하는 기본구조 도메인들의 조합을 포함하고, 및 상기 VL 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9 및 21 중 하나에 존재하는 기본구조 도메인들의 조합을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  18. 제17항에 있어서,
    서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22, 구체적으로 서열번호 4, 6, 10, 및 22, 더 구체적으로 서열번호 10 및 22로부터 선택되는 VH 도메인, 및 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21, 구체적으로 서열번호 3, 5, 9, 및 21, 더 구체적으로 서열번호 9 및 21로부터 선택되는 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  19. 제18항에 있어서,
    서열번호 1/서열번호 2; 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 서열번호 7/서열번호 8, 서열번호 9/서열번호 10, 서열번호 11/서열번호 12, 서열번호 13/서열번호 14, 서열번호 15/서열번호 16, 서열번호 17/서열번호 18, 서열번호 19/서열번호 20, 및 서열번호 21/서열번호 22; 구체적으로 서열번호 3/서열번호 4; 서열번호 5/서열번호 6; 서열번호 9/서열번호 10, 및 서열번호 21/서열번호 22; 더 구체적으로 서열번호 9/서열번호 10 및 서열번호 21/서열번호 22으로부터 선택되는 VH/VL 도메인 조합을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  20. 제16항 내지 19항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물과 동일한 항원결정부위에 기본적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  21. 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    제18항 또는 19항의 항원-결합 부위를 인간화함으로써 수득된 항원-결합 부위를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물.
  22. 제1항 내지 21항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물, 및 조건적으로 약학적 허용 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제1항 내지 21항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합체.
  24. 제23항의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합체를 포함하는 벡터 또는 벡터들의 집합체.
  25. 제23항의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합체, 또는 제24항의 벡터 또는 벡터들의 집합체를 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포.
  26. 제23항의 핵산 서열 또는 핵산 서열들의 집합체, 또는 제24항의 벡터 또는 벡터들의 집합체, 또는 제25항의 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 21항의 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 기능적 단편물을 제조하는 방법.
KR1020157036661A 2013-05-28 2014-05-28 신규 항체 KR20160014010A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13002769 2013-05-28
EP13002769.1 2013-05-28
EP13005113.9 2013-10-25
EP13005113 2013-10-25
EPPCT/EP2014/001282 2014-05-12
PCT/EP2014/001282 WO2014180577A1 (en) 2013-05-10 2014-05-12 Bispecific constructs and their use in the treatment of various diseases
PCT/EP2014/001460 WO2014191113A1 (en) 2013-05-28 2014-05-28 Novel antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160014010A true KR20160014010A (ko) 2016-02-05

Family

ID=51988042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157036661A KR20160014010A (ko) 2013-05-28 2014-05-28 신규 항체

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20160090416A1 (ko)
EP (1) EP3004164A1 (ko)
JP (1) JP2016520600A (ko)
KR (1) KR20160014010A (ko)
CN (1) CN105408357A (ko)
AU (1) AU2014273475A1 (ko)
CA (1) CA2913069A1 (ko)
HK (1) HK1217023A1 (ko)
SG (1) SG11201509361TA (ko)
WO (1) WO2014191113A1 (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
BR112015007120A2 (pt) 2012-10-08 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso, célula hospedeira e método de produção de um anticorpo
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR101833602B1 (ko) 2013-02-26 2018-02-28 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
SG10201800250XA (en) 2013-12-17 2018-02-27 Genentech Inc Anti-cd3 antibodies and methods of use
NZ766556A (en) 2014-08-04 2024-02-23 Hoffmann La Roche Bispecific t cell activating antigen binding molecules
MX2017003022A (es) 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados.
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
HUE045216T2 (hu) 2014-12-05 2019-12-30 Hoffmann La Roche Anti-CD79B antitestek és alkalmazási eljárások
BR112017014805A2 (pt) 2015-01-23 2018-01-09 Sanofi anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd123 e anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a cd3 e/ou cd123
HRP20231134T1 (hr) 2015-06-16 2024-01-05 F. Hoffmann - La Roche Ag Humanizirana i afinitetno zrela protutijela na fcrh5 i postupci za uporabu
WO2016205200A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and methods of use
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016329111A1 (en) 2015-10-02 2018-02-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CEAXCD3 T cell activating antigen binding molecules
CA2997406A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
PL3400246T3 (pl) 2016-01-08 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworów z dodatnim markerem cea z wykorzystaniem antagonistów wiążących oś pd-1 oraz przeciwciał dwuswoistych anty-cea/anty-cd3
PL3433280T3 (pl) 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki limfocytów T aktywowane przez proteazy
CA3059010A1 (en) 2016-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
US11466094B2 (en) 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
WO2018224441A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Numab Innovation Ag Novel anti-cd3 antibodies
CN111148761B (zh) * 2017-06-25 2024-02-13 西雅图免疫公司 多特异性抗体及其制备和使用方法
WO2019045856A1 (en) * 2017-08-28 2019-03-07 Systimmune, Inc. ANTI-CD ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THEM
CN111108119B (zh) * 2017-09-21 2022-11-15 上海药明生物技术有限公司 新型抗CD3ε抗体
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
JOP20210298A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Provention Bio Inc طرق وتركيبات للوقاية من مرض السكري من النوع الأول
MX2022007158A (es) 2019-12-13 2022-07-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y metodos de uso.
WO2021141996A1 (en) * 2020-01-06 2021-07-15 Cytomx Therapeutics, Inc. Single- and multi-chain polypeptides that bind specifically to cd3 epsilon
IL295896A (en) 2020-02-26 2022-10-01 Biograph 55 Inc c19 c38 bispecific antibodies
IL298402A (en) 2020-06-19 2023-01-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to CD3 and CD19
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
KR20240005722A (ko) 2021-04-30 2024-01-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체를 사용한 치료를 위한 투약
WO2023180353A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
JP2024517042A (ja) 2022-04-13 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の薬学的組成物及び使用方法
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2155783T1 (sl) * 2007-04-03 2013-10-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Medvrstno specifiäśna cd3-epsilon vezavna domena
AU2009299794B2 (en) * 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody

Also Published As

Publication number Publication date
HK1217023A1 (zh) 2016-12-16
JP2016520600A (ja) 2016-07-14
CA2913069A1 (en) 2014-12-04
CN105408357A (zh) 2016-03-16
WO2014191113A1 (en) 2014-12-04
US20160090416A1 (en) 2016-03-31
AU2014273475A1 (en) 2015-11-19
WO2014191113A8 (en) 2015-02-19
SG11201509361TA (en) 2015-12-30
EP3004164A1 (en) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20160014010A (ko) 신규 항체
US10604576B2 (en) Antibodies and immunocytokines
US20170073415A1 (en) Novel multispecific molecules and novel treatment methods based on such multispecific molecules
CN107955071B (zh) 人源抗人cd47抗体及其编码基因与应用
JP2023182705A (ja) 細胞傷害性ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｔｌａ－４）に対する新規モノクローナル抗体
WO2017049452A1 (zh) 抗人cd137的完全人抗体及其应用
JP7215759B2 (ja) ４－１ｂｂ抗体およびその製造方法と使用
JP7209464B2 (ja) ヒトインターロイキン－２に対する免疫刺激性モノクローナル抗体
CA2948686A1 (en) Novel multispecific molecules and novel treatment methods based on such multispecific molecules
US10906965B2 (en) Methods of treating autoimmune disease or chronic inflammation wtih antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1
TW201623327A (zh) Ｏｘ４０ｌ融合蛋白及其用途
JP7053479B2 (ja) ＩＬ７受容体細胞外ドメインα鎖に対する非拮抗性抗体及び癌治療におけるそれらの使用
JP2013529070A (ja) Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場
Könitzer et al. Generation of a highly diverse panel of antagonistic chicken monoclonal antibodies against the GIP receptor
JP2021528382A (ja) 免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞へ誘引する方法及び手段
KR20200028447A (ko) 피브로넥틴 iii형 도메인에 대한 항원 결합 영역 및 이의 사용 방법
JP2023525495A (ja) 抗ｃｄ２６タンパク質及びそれらの使用法
WO2019192493A1 (zh) 抗人lag-3单克隆抗体及其应用
TWI603979B (zh) 抗人類膜錨定型免疫球蛋白a抗體能夠溶解帶有膜錨定型免疫球蛋白a的b淋巴球與降低免疫球蛋白a 的生產
JP2023116826A (ja) 抗原結合分子
KR20230042090A (ko) 항-cd22 단일 도메인 항체 및 치료학적 작제물
CN113874396A (zh) 包含抗间皮素抗体、抗cd3抗体或抗egfr抗体的融合蛋白、包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，及其用途
TW202204418A (zh) Ｐｄ－１抗原結合蛋白及其應用
Cutolo Structural and functional study of the interaction between CXCL12 chemokine and its receptors: CXCR4 and ACKR3/CXCR7
CN117580858A (zh) 多价蛋白质及筛选方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid