TW202204418A - Ｐｄ－１抗原結合蛋白及其應用 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及一種能夠結合PD-1的抗原結合蛋白，以及包含該抗原結合蛋白的融合蛋白，該融合蛋白能夠靶向PD-1和CD73。本申請還涉及該抗原結合蛋白和/或融合蛋白的製備方法和應用。

Description

PD-1抗原結合蛋白及其應用
本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種結合PD-1的抗原結合蛋白及其應用。
程式性死亡受體1(Programmed Death-1,PD-1)是具有288個胺基酸的I型膜蛋白，主要表達在啟動的T細胞表面。PD-1有兩個配體，即程式性死亡配體-1(Programmed Death Ligand-1，PD-L1)和PD-L2。PD-1與PD-L1及PD-L2相互作用會下調T細胞的活性，減弱細胞因子的分泌，起到免疫抑制作用。PD-1/PD-L1通路抑制劑可以阻斷PD-1與PD-L1的結合，阻斷負向調控信號，使T細胞恢復活性，發揮殺傷腫瘤細胞的作用，進而抑制腫瘤生長。因此，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調節對腫瘤抑制有重要的意義。
CD73(也叫胞外-5’-核苷酸酶)是能夠將AMP(單磷酸腺苷)分解成腺苷的酶，藉由AMP的分解產生的腺苷抑制以T細胞為代表的免疫系統細胞的功能。已經報導CD73在許多不同腫瘤細胞上表達，CD73表達與腫瘤細胞的增殖、遷移、新血管形成、侵襲力、轉移及較短患者存活期相關。因此，CD73在免疫應答的調節中發揮著重要的作用。CD73可以直接及間接方式調控癌症進展，凸顯其作為新穎治療靶的潛能。
目前，PD-1/PD-L1通路的阻斷型抗體藥物在臨床上仍面臨諸多挑戰，例如有效性低、耐藥性和副作用等。臨床前的研究結果表明，PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑和CD73單株抗體聯用殺傷腫瘤細胞，會有強有力的協同效應。一些臨床試驗(NCT03454451、NCT03835949和NCT02503774)也正在聯合使用PD-1或者PD-L1抗體和CD73單株抗體治療癌症，以提高安全性和有效性。但是聯合用藥的給藥方式和臨床試驗均比較複雜且價格昂貴，且需同時具備或開發兩個單藥，週期和難度均較大。為解決現有的挑戰，亟需研發同時針對PD-1/PD-L1免疫檢查點和CD73靶點，且抗腫瘤效果高、安全性好的新產品。
本申請提供了一種能夠結合PD-1的抗原結合蛋白，其能夠阻斷PD-1和PD-L1及PD-L2的結合，刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌，能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。本申請還提供了一種僅含“重鏈”的重鏈抗體，具有與人PD-1和食蟹猴PD-1特異性結合的活性。該PD-1重鏈抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半，由於不含輕鏈的這一特點，使得該抗體可以用於雙特異性抗體，並解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題。本申請還提供了包含PD-1結合部分和CD73結合部分的融合蛋白，其能夠以協同增加刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌，進一步協同抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖；同時，該融合蛋白能夠識別CD73蛋白，抑制CD73酶活的活性，並可誘導CD73的腫瘤細胞內化，導致細胞表面上的CD73活性進一步降低。
一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1 包含SEQ ID NO：359所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：360所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：361所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH，重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該HCDR1包含SEQ ID NO：11-16中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：50-55中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：92-97中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
(1)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：92；
(2)HCDR1：SEQ ID NO：12，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：93：
(3)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：51，和HCDR3：SEQ ID NO：94；
(4)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：52，和HCDR3：SEQ ID NO：95；
(5)HCDR1：SEQ ID NO：15，HCDR2：SEQ ID NO：53，和HCDR3： SEQ ID NO：96；
(6)HCDR1：SEQ ID NO：16，HCDR2：SEQ ID NO：54，和HCDR3：SEQ ID NO：97；以及，
(7)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：55，和HCDR3：SEQ ID NO：92。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：368所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：151-158中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白還包括抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：238-245中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，該LCDR1包含SEQ ID NO：365所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：366所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：367所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1包含SEQ ID NO：121-125中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：130-135中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：140-145中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
(1)LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140；
(2)LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：131，和LCDR3：SEQ ID NO：141；
(3)LCDR1：SEQ ID NO：123，LCDR2：SEQ ID NO：132，和LCDR3：SEQ ID NO：142；
(4)LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：133，和LCDR3：SEQ ID NO：143；
(5)LCDR1：SEQ ID NO：124，LCDR2：SEQ ID NO：134，和LCDR3：SEQ ID NO：144；以及
(6)LCDR1：SEQ ID NO：125，LCDR2：SEQ ID NO：135，和LCDR3：SEQ ID NO：145。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈可變區VL，且該VL包含SEQ ID NO：369所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：231-236中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白還包括抗體輕鏈恆定 區。
在某些實施方式中，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：353所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：324-329中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈或其片段和抗體輕鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
(1)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：92，LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140；
(2)HCDR1：SEQ ID NO：12，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：93，LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：131，和LCDR3：SEQ ID NO：141；
(3)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：51，和HCDR3：SEQ ID NO：94，LCDR1：SEQ ID NO：123，LCDR2：SEQ ID NO：132，和LCDR3：SEQ ID NO：142；
(4)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：52，和HCDR3：SEQ ID NO：95，LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：133，和LCDR3：SEQ ID NO：143；
(5)HCDR1：SEQ ID NO：15，HCDR2：SEQ ID NO：53，和HCDR3： SEQ ID NO：96，
LCDR1：SEQ ID NO：124，LCDR2：SEQ ID NO：134，和LCDR3：SEQ ID NO：144；
(6)HCDR1：SEQ ID NO：16，HCDR2：SEQ ID NO：54，和HCDR3：SEQ ID NO：97，LCDR1：SEQ ID NO：125，LCDR2：SEQ ID NO：135，和LCDR3：SEQ ID NO：145；以及，
(7)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：55，和HCDR3：SEQ ID NO：92，LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH和抗體輕鏈可變區VL，且該VH和VL包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
(1)VH：SEQ ID NO：151和VL：SEQ ID NO：231；
(2)VH：SEQ ID NO：152和VL：SEQ ID NO：232；
(3)VH：SEQ ID NO：153和VL：SEQ ID NO：233；
(4)VH：SEQ ID NO：154和VL：SEQ ID NO：234；
(5)VH：SEQ ID NO：155和VL：SEQ ID NO：235；
(6)VH：SEQ ID NO：156和VL：SEQ ID NO：232；
(7)VH：SEQ ID NO：157和VL：SEQ ID NO：236；以及
(8)VH：SEQ ID NO：158和VL：SEQ ID NO：231。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
(1)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1；
(2)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
(3)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
(4)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
(5)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
另一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：362所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：363所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：364所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH，重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗原結合片段為重鏈抗體(HCAb)。在某些實施方式中，該抗原結合片段為VHH。
在某些實施方式中，該抗原結合片段為該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該抗原結合片段為該HCDR1包含SEQ ID NO：18-33中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：57-68中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：99-101和103-111中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗原結合片段為該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
(1)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(2)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：99；
(3)HCDR1：SEQ ID NO：19，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：99；
(4)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：101；
(5)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(6)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(7)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(8)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(9)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(10)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：103：
(11)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(12)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(13)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：104；
(14)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：105；
(15)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(16)HCDR1：SEQ ID NO：22，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(17)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：106；
(18)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：107；
(19)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
(20)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：62，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(21)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(22)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(23)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(24)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：63，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
(25)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(26)HCDR1：SEQ ID NO：24，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(27)HCDR1：SEQ ID NO：26，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(28)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(29)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(30)HCDR1：SEQ ID NO：26，HCDR2：SEQ ID NO：67，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
(31)HCDR1：SEQ ID NO：27，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：110；
(32)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(33)HCDR1：SEQ ID NO：28，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(34)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(35)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：68，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(36)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(37)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
(38)HCDR1：SEQ ID NO：30，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(39)HCDR1：SEQ ID NO：29，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(40)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：68，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(41)HCDR1：SEQ ID NO：29，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(42)HCDR1：SEQ ID NO：30，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
(43)HCDR1：SEQ ID NO：31，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(44)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(45)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(46)HCDR1：SEQ ID NO：32，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
(47)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：109；以及
(48)HCDR1：SEQ ID NO：33，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：254所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：160-166和168-221中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白還包括抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：247-253和255-309中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一 種或多種：
a)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1；
b)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
c)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
d)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
e)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
另一方面，本身請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH，重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗原結合片段為重鏈抗體(HCAb)。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該HCDR1包含SEQ ID NO：18、25、28和34-38中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：64-66中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：108、111和112中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任 意一組的胺基酸序列：
(1)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(2)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(3)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(4)HCDR1：SEQ ID NO：34，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(5)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
(6)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(7)HCDR1：SEQ ID NO：35，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(8)HCDR1：SEQ ID NO：36，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(9)HCDR1：SEQ ID NO：36，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：112；
(10)HCDR1：SEQ ID NO：37，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
(11)HCDR1：SEQ ID NO：28，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3： SEQ ID NO：111；以及
(12)HCDR1：SEQ ID NO：38，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：167所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：196、197、200、201、202和222-230中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白還包括抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：310-323中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
a)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1；
b)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
c)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
d)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
e)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
另一方面，本申請提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含PD-1結合部分，其中該PD-1結合部分包含本申請的分離的抗原結合蛋白。
在某些實施方式中，該第二靶向部分包含CD73結合部分。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包括特異性結合CD73的抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該HCDR1、HCDR2和HCDR3分別依次包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包括抗體重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3分別依次包含SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包括抗體輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包含Fab。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包含抗體重鏈，且該抗體重鏈包含SEQ ID NO：246所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CD73結合部分包含抗體輕鏈，且該抗體輕 鏈包含SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該PD-1結合部分位於該CD73結合部分的N端或C端。
在某些實施方式中，該融合蛋白包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包括該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的VH，該第二多肽鏈包括該CD73結合部分的VL。
在某些實施方式中，在該第一多肽鏈中，該PD-1結合部分的VH位於該CD73結合部分的VH的N端。
在某些實施方式中，在該第一多肽鏈中，該PD-1結合部分的VH位於該CD73結合部分的VH的C端。
在某些實施方式中，該第一多肽鏈還包含抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該第一多肽鏈自N端至C端，依次包含該PD-1結合部分的VH、該CD73結合部分的VH和該抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該PD-1結合部分的VH與該CD73結合部分的VH藉由連接肽間接連接。
在某些實施方式中，該連接肽包含SEQ ID NO：334-352中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：333所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第二多肽鏈還包含抗體輕鏈恆定區。
在某些實施方式中，該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包括兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。
另一方面，本申請提供了免疫綴合物，該免疫綴合物包含該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，該分離的一種或多種核酸分子編碼該分離的抗原結合蛋白和/或該融合蛋白。
另一方面，本申請提供了載體，該載體包含該核酸分子。
另一方面，本申請提供了細胞，該細胞包含該核酸分子或該載體。
另一方面，本申請提供了製備該分離的抗原結合蛋白和/或該融合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白和/或該融合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
另一方面，本申請提供了醫藥組成物，該醫藥組成物包含該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。
另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療PD-1介導的疾病或病症。
在某些實施方式中，該PD-1介導的疾病或病症包括腫瘤、自體免疫疾病或炎症。在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
一種增加受試者中T細胞活性的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了預防、緩解或治療PD-1介導的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物；視需要地，與一種或多種其他腫瘤治療方法聯用。
在某些實施方式中，該PD-1介導的疾病或病症包括腫瘤、自體免疫疾病或炎症。在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤或非實體瘤。在某些實施方式中，該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物，其中用於預防、緩解或治療PD-1介導的疾病或病症。
在某些實施方式中，該PD-1介導的疾病或病症包括腫瘤、自體免疫疾病或炎症。在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤或非實體瘤。在某些實施方式中，該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
另一方面，本申請提供了試劑盒或給藥裝置，該試劑盒或給藥裝置包括該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L1蛋白和PD-1蛋白結合的方法， 該方法包括使用該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在某些實施方式中，該方法為體外方法。
在某些實施方式中，該方法為非診斷和/或治療目的的方法。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L2蛋白和PD-1蛋白結合的方法，該方法包括使用該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在某些實施方式中，該方法為體外方法。
在某些實施方式中，該方法為非診斷和/或治療目的的方法。
另一方面，本申請提供了檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，該方法包括使用該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在某些實施方式中，該方法為體外方法。
在某些實施方式中，該方法為非診斷和/或治療目的的方法。
該抗原結合蛋白、該融合蛋白、該綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物，與一種或多種其他腫瘤治療方法聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤。
在某些實施方式中，該一種或多種其他腫瘤治療方法包括化療和/或放療。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
該分離的抗原結合蛋白，和抗CD73抗體聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如將認識到的，本申請的內容使得能夠對所公開的實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明書如下：
圖1A是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678和PR000679與人PD-1蛋白的結合活性。
圖1B顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000680與人PD-1蛋白的結合活性。
圖1C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002474、PR002476、PR002479和PR002481與人PD-1蛋白的結合活性。
圖2顯示的是本申請的抗原結合蛋白R002474、PR002476、PR002479 和PR002481與食蟹猴PD-1蛋白的結合活性。
圖3A顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678和PR000680與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖3B顯示的是本申請的抗原結合蛋白R002473、R002474、PR002475、PR002476、R002477、PR002478、PR002479和PR002481與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖3C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR005090、PR005093、PR005096、PR005097、PR005098、PR005099、PR005100、PR005101、PR005102、PR005103和PR005104與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖3D顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR005090、PR005145、PR005149、PR005150、PR005141、PR005142、PR005144、PR005147和PR005148與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖3E顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481、PR005585、PR005583、PR005578、PR005577、PR005575、PR005572和PR005569與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖3F顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481、PR005584、PR005582、PR005581、PR005574、PR005573、PR005571和PR005570與CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白的結合活性。
圖4顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680與CHO-K1細胞上表達的食蟹猴PD-1蛋白的結合活性。
圖5A顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680阻斷CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白和PD-L1蛋白的結合的活性。
圖5B顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002473、PR002474、PR002475、PR002476、PR002477、PR002478、PR002479和PR002481阻斷CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白和PD-L1蛋白的結合的活性。
圖5C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680阻斷CHO-K1細胞上表達的人PD-1蛋白和PD-L2蛋白的結合的活性。
圖6A顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000678、PR000679和PR000680對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖6B顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR005090、PR005093、PR005096、PR005097、PR005098、PR005099、PR005100、PR005101、PR005102、PR005103和PR005104對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖6C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR005090、PR005145、PR005149、PR005150、PR005141、PR005142、PR005144、PR005147和PR005148對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖6D顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481、PR005570、PR005571、PR005573和PR005574對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖6E顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481、PR005577、 PR005581、PR005582和PR005584對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖6F顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481、PR005569、PR005572、PR005575、PR005583和PR005585對PD-1信號通路的抑制作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖7A、圖7B和圖7C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680啟動T細胞的能力(混合淋巴細胞反應實驗)。
圖8A和圖8B顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR000674、PR000678和PR000679啟動T細胞的能力(混合淋巴細胞反應實驗)。
圖8C顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR002481啟動T細胞的能力(混合淋巴細胞反應實驗)。
圖9顯示的是本申請的抗原結合蛋白PR005569、PR005572、PR005575、PR005583和PR005585和PR002481啟動T細胞的能力(混合淋巴細胞反應實驗)。
圖10顯示的是本申請的融合蛋白示例性的分子結構。
圖11顯示的是本申請的融合蛋白PR003568與CHO-K1細胞上表達的人CD73細胞的結合活性。
圖12顯示的是本申請的融合蛋白PR003568與CHO-K1細胞上表達的人PD-1細胞的結合活性。
圖13顯示的是本申請的融合蛋白PR003568抑制CD73的酶活性。
圖14顯示的是本申請的融合蛋白PR003568對PD-1信號通路的抑制 作用(利用報告基因細胞系檢測)。
圖15A和圖15B顯示的是本申請的融合蛋白啟動T細胞分泌細胞因子的能力(混合淋巴細胞反應實驗)。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“PD-1”通常是指程式性細胞死亡1，也稱為“程式性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”。PD-1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達，並參與細胞凋亡。PD-1通常包含一個細胞外IgV結構域，跨膜區和胞內結構域。PD-1可結合兩種配體，PD-L1和PD-L2。該“PD-1”包括任何脊椎動物來源的任何天然PD-1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人和食蟹猴)和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-1以及由細胞加工所產生的任何形式的PD-1。PD-1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，還包括PD-1的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與PD-1共同表位的類似物。在本申請中，該PD-1可以包括人PD-1和/或猴(例如，食蟹猴)PD-1。示例性的人PD-1胺基酸序列可以在NCBI登錄號NP_005009.2中找到。示例性的食蟹猴PD-1胺基酸序列可以在NCBI登錄號NP_001271065.1中找到。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程式性細胞死亡1配體1，也可稱為B7同源物1、B7-H1、分化簇274、(3)274或CD274，其與PD-1結合後下調T細胞活化和細胞因子分泌。“PD-L1”包括任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人和食蟹猴)和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-L1”包括完整的PD-L1及其片段，還包括PD-L1的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與PD-L1共同表位的類似物。PD-L1的基本結構包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。示例性的人PD-L1胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_001254653或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。示例性的食蟹猴PD-L1胺基酸序列可在NCBI登錄號XP_005581836.1下找到。
在本申請中，術語“CD73”也稱為5’外切核苷酸酶，通常是指能夠將胞外核苷5'單磷酸轉化為核苷，即將單磷酸腺苷(AMP)轉化為腺苷的酶(核苷酸酶)。術語“CD73”包括細胞天然表達的CD73的任何變體或同工型。可以從天然表達它們的細胞或組織中分離出CD73或其任何變體和同工型，或者可以使用本領域中眾所周知的技術和/或本文該那些重組產生。人CD73的胺基酸序列可以參見GenBank中登錄號AAH65937.1(5'-核苷酸酶，ecto)，或NP_002517(同工型1前蛋白)和NP_001191742(同工型2前蛋白)下。
【(0255】在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結 合片段(Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab’”通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中，術語“抗體”其以最廣泛意義使用，且具體涵蓋，但不限於，單株抗體(包括包含兩條輕鏈和兩條重鏈的全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體、重鏈抗體和駱駝化單結構域抗體(如，重鏈可變結構域抗體)。抗體通常具有免疫球蛋白的結構，可以包含藉由二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的蛋白，或其抗原結合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可 將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗體中，重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可進一步細分為超變性的區域，稱為互補決定區(CDR)，其與稱為框架區(FR)的較保守的區域交替。各VH和VL包含三個CDR和四個框架區(FR)，從胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDRs連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)結合。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗 體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))、基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，J Mol Biol 273：927-48,1997)和基於IMGT本體論(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific圖表規則的IMGT定義規則。在本申請中，該抗原結合蛋白的CDR按照Chothia定義規則進行劃分。具體如表1所示。
表1 Chothia對CDR的劃分
Figure 110126069-A0101-12-0030-1
在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本申請使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製 備。
在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。
在本申請中，術語“VHH”通常是指重鏈可變結構域抗體。對於雙鏈抗體(免疫球蛋白)說，VHH通常缺失抗體輕鏈和/或重鏈恆定區，只包含重鏈可變結構域的部分。
在本申請中，術語“重鏈抗體”也可稱為HCAb，通常是指相對雙鏈抗體(免疫球蛋白)來說，缺失抗體輕鏈，只包含重鏈的抗體。該重鏈抗體可以包含兩條抗體重鏈。
在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對…特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。
在本申請中，術語“在……之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3 的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。
在本申請中，術語“KD”、“K D ”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表示抗原結合蛋白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等離子共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中，術語“分離的核酸分子”或“分離的多核苷酸”通產是指基因組、mRNA、cDNA或合成來源的DNA或RNA或其一定組合，其不與在自然界中發現的多核苷酸的全部或一部分締合，或連接至其在自然界中不連接的多核苷酸。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請的抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HeLa細胞，HEK293細胞，COS-1細胞，NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中，術語“重組細胞”通常是指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞，還包括這些細胞的後代。
在本申請中，術語“藥學上可接受的載體”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是pH緩衝水溶液。生理學可接受載體的例子可包括緩衝劑，抗氧化劑，低分子量(少於約10個殘基)多肽，蛋白質，親水性聚合物，胺基酸，單糖，二糖和其它碳水化合物，螯合劑，糖醇，成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑。
在本申請中，術語“治療”通常是指期望改變所治療個體的天然病程，且可為實現防治或在臨床病變過程中進行的臨床介入。合乎需要的治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發性、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態以及緩和或改善預後。在一些情形中，抗體(例如，抗PD-1抗體)可用來延遲疾病發展或減緩疾 病進展。
在本申請中，術語“施用”通常是指向受試者(例如，患者)給予一定劑量的化合物(例如，抗癌治療劑)或醫藥組成物(例如，包含抗癌治療劑的醫藥組成物)的方法。施用可藉由任何合適的方式進行，包括腸胃外、肺內和鼻內，以及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。在本申請中，該腫瘤可以為細胞和組織的PD-1或PD-L1高表達的腫瘤。腫瘤可包括實體瘤和/或非實體瘤(例如，血液瘤、淋巴瘤)。
在本申請中，術語“免疫綴合物”通常是指抗原結合蛋白與其它活性劑連接形成的物質，其他活性劑可以是小分子活性劑，例如化療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針或光譜探針。
在本申請中，術語“試劑盒”通常是指包含用於給予本申請的抗原結合蛋白治療PD-1介導的相關病症的組分的包裝產品。試劑盒的組分可包含在分開的小瓶中(即具有分開部分的試劑盒)，或在單個小瓶內提供。試劑盒可包含試劑，諸如緩衝劑、蛋白穩定試劑、信號產生體系(例如，螢光信號生成體系)、抗體、對照蛋白、以及測試容器。試劑盒還可以包含實施該方法的說明書。
在本申請中，術語“給藥裝置”包括：(i)輸注模組，該輸注模組用於對受試者施用包括具有一活性成分的醫藥組成物；(ii)用於輸注的醫藥組成物，該醫藥組成物中含有一活性成分，該活性成分選自下組：抗原結合蛋白、多特異性抗體、免疫細胞、抗體藥物偶聯物或其組合；以及(iii)視需要的藥效監控 模組。
在本申請中，術語“聯用”通常是指是指兩種或更多種治療劑可以在混合物中、作為單一藥劑同時地或作為單一藥劑以任何順序先後地共同向受檢者施用。
在本申請中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本申請中，該變體可以為，在該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請的抗原結合蛋白)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本申請中，該抗原結合蛋白的胺基酸序列的一部分可以與來自特定物種的抗體中相應的胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，抗體的可變區及恆定部分均可以來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請的抗原結合蛋白)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、 類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索．，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
如本文所用，術語“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或情況可以發生但不是必須發生。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由……組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、 3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
抗原結合蛋白
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：368所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：359所示的胺基酸序列：GX2X3X4SX6X7X8X9，其中，X2=D、F、G或L，X3=I、S或T，X4=F、L或V，X6=D、N或S，X7=N或Y，X8=S或不存在胺基酸，且X9=A或不存在胺基酸。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO；11-16中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR2。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：360所示的胺基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1=I、L、S、W或Y，X2=G、P、S或Y，X3=D、I、R或S，X4=F、G或S，X5=D、K、S或Y，X6=K、N、S、T或W，X7=Y或不存在胺基酸。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：50-55中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR3。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：361所示的胺基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14，其中，X1=E、L、N或S，X2=D、G、P、S或T，X3=D、G、H、L或P，X4=D或Y，X5=S、V、Y或不存在胺基酸，X6=G、S或不存在胺基酸，X7=N、S或不存在胺基酸，X8=G、W或不存在胺基酸，X9=S、Y或不存在胺基酸，X10=Q、Y或不存在胺基酸，X11=L、Y或不存在胺基酸，X12=D、F或不存在胺基酸，X13=Q、Y或不存在胺基酸，且X14=H或不存在胺基酸。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：92-97中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：359所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：360所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：361所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11-16中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：50-55中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：92-97中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3， 該HCDR1可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR1，該HFWR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連。在本申請中，該HFWR1可包含SEQ ID NO：1-7中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR2，該HFWR2位於該HCDR1與該HCDR2之間。在本申請中，該HFWR2可包含SEQ ID NO：39-44中 任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR3，該HFWR3位於該HCDR2與該HCDR3之間。在本申請中，該HFWR3可包含SEQ ID NO：69-75中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR4，該HFWR4的N末端與該HCDR3的C末端相連。在本申請中，該HFWR4可包含SEQ ID NO：113-115中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，且該VH可包含SEQ ID NO：368所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL可包含SEQ ID NO：369所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈互補決定區LCDR1。在本申請中，該抗原結合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：365所示的胺基酸序列：RASQX5X6SX8X9LA，其中，X5=S或T，X6=I或V，X8=I、R或S，X9=D、S、W或Y。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：121-125中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈互補決定區LCDR2。在本申請中，該抗原結合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO：366所示的胺基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1=D、G或K，X2=A或T，X3=A或S，X4=K、N、S或T，X5=L或R，X6=A或E，X7=S或T。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO：130-135中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈互補決定區LCDR3。在本申請中，該抗原結合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO：367所示的胺基酸序列：X1QX3X4X5X6X7X8X9，其中，X1=H或Q，X3=F、H、R或Y，X4=N或S，X5=N、S或Y，X6=Y或W，X7=I、P或W，X8=F、I、L或T，且X9=T或不存在胺基酸。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO：140-145中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：365所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：366所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：367所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：121-125中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130-135中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：140-145中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：140所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO；141所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：133所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：134所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：144所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：135所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：140所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區LFWR1，該LFWR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連。在本申請中，該LFWR1可包含SEQ ID NO：116-119中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區LFWR2，該LFWR2位於該LCDR1與該LCDR2之間。在本申請中，該LFWR2可包含SEQ ID NO：126-129中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區LFWR3，該LFWR3位 於該LCDR2與該LCDR3之間。在本申請中，該LFWR3可包含SEQ ID NO：136-139中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區LFWR4，該LFWR4的N末端與該LCDR3的C末端相連。在本申請中，該LFWR4可包含SEQ ID NO：147-150中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL，且該VL可包含SEQ ID NO：369所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：140所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：94所 示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：133所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：134所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：144所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：135所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：140所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：368所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：369所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：151-158中任一項所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：231-236中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：151所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：231所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：152所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：232所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：233所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：234所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：155所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：235所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：156所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：232所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：236所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：231所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：238所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：324所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：239所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：325所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：240所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：326所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：241所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：327所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：242所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：328所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：243所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：325所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：244所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：329所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：245所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：324所示的胺基酸序列。
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：254所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：362所示的胺基酸序列：GFX3VX5X6X7，其中，X3=A、F、N或S，X5=D、R、S或V，X6=F、G、R、S或Y，F7=F、H、N或Y。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：18-33中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR2。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：363所示的胺基酸序列：X1X2X3GX5，其中，X1=D或H，X2=G、I、K、R或S，X3=A、G或S，且X5=G或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：57-68中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR3。在本申請 中，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：364所示的胺基酸序列：AX2X3VX5EX7X8GYNYPFNY，其中，X2=I或T，X3=A、E、M、Q或R，X5=A、P或R，X7=A、E或K，X8=G、N或Q。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：99-101和103-111中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：362所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：363所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：364所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18-33中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：57-68中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：99-101和103-111中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：57 所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：105所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3， 該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64 所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3， 該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66 所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR1，該HFWR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連。在本申請中，該HFWR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR2，該HFWR2位於該HCDR1與該HCDR2之間。在本申請中，該HFWR2可包含SEQ ID NO：46-49中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR3，該HFWR3位於該HCDR2與該HCDR3之間。在本申請中，該HFWR3可包含SEQ ID NO：77-80和82-91中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR4，該HFWR4的N末端與該HCDR3的C末端相連。在本申請中，該HFWR4可包含SEQ ID NO：113中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，且該VH可包含SEQ ID NO：160-166和168-221中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可包含SEQ ID NO：247-253和255-309中任一項所示的胺基酸序列。
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：167所示的胺 基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列：GFX3VX5X6X7，其中，X3=N或T，X5=A或S，X6=F或S，X7=F、H或Y。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：18、25、28和34-38中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR2。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列：DKX3GS，其中，X3=A、G或S。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：64-66中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR3。在本申請中，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列：ATX2VREKX8GYNYPFNY，其中，X2=A或E，X8=N或Q。例如，該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
例如，該抗原結合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：108、111和112中任一項所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18、25、28和34-38中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64-66中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108、111和112中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR1，該HEWR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連。在本申請中，該HFWR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR2，該HFWR2位 於該HCDR1與該HCDR2之間。在本申請中，該HFWR2可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR3，該HFWR3位於該HCDR2與該HCDR3之間。在本申請中，該HFWR3可包含SEQ ID NO：82、84、85、87、88和89中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFWR4，該HFWR4的N末端與該HCDR3的C末端相連。在本申請中，該HFWR4可包含SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，且該VH可包含SEQ ID NO：196、197、201、202和222-230中任一項所示的胺基酸序列
在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可包含SEQ ID NO：310-323中任一項所示的胺基酸序列。
可藉由本領域已知的各種測定鑒別、篩選或表徵本申請的PD-1抗原結合蛋白或融合蛋白的物理/化學特性和/或生物活性。
在一個方面，例如可藉由已知方法諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FACS)、免疫組織化學、免疫螢光等來測試本申請抗原結合蛋白或融合蛋白的抗原結合活性。本申請的抗原結合蛋白(例如，PD-1抗體)能夠特異性結合PD-1抗原。“特異性結合”PD-1抗原的抗原結合蛋白(例如，PD-1抗體)通常可以結合PD-1，但不結合缺乏PD-1序列的其它蛋白。本申請的抗原結合蛋白(例如，PD-1抗體)能夠特異性結合PD-1抗原或其標記形式(例如，螢光標記的PD-1抗原)，但不會結合缺乏PD-1表位的其它蛋白。抗原結合蛋白(例如，抗體)是否結合PD-1抗原可使用本領域中已知的任何 測定法確定。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面等離子共振(SPR)或生物膜干涉技術(BLI)。
本申請的抗原結合蛋白可以結合人PD-1蛋白。在某些情形中，本申請的抗原結合蛋白還可以與猴(例如，食蟹猴)的PD-1交叉反應。例如，藉由流式分析技術和酶聯免疫反應所檢測的。如本文所用，“交叉反應性”是指抗體與來自其它物種的同源蛋白反應的能力。
在某些情形中，本申請的抗原結合蛋白與PD-1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。例如，在FACS檢測中，使用穩定表達人或猴PD-1的宿主細胞(如CHO-K1細胞)，該PD-1抗原結合蛋白與PD-1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約80nM之間，約0.01nM至約60nM之間，約0.05nM至約50nM之間，約0.05nM至約40nM之間，約0.05nM至約30nM之間，約0.05nM至約20nM之間，約0.05nM至約10nM之間或約0.05nM至約5nM之間。又例如，在ELISA中，使用人PD-1抗原蛋白，該PD-1抗原結合蛋白與PD-1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.001nM至約1nM之間或約0.01nM至約1nM之間。
在另一個方面，本申請的抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。例如，首先將穩定表達PD-L1的宿主細胞(如CHO-K1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-1蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合。又例如，首先將PD-L1抗原蛋白包被在板上，將遞減量的未標記的該抗原結合蛋白和生物素標記的PD-1蛋白混合後，共同孵育。然後，使用ELISA分 析細胞，以證實該抗原結合蛋白可以阻斷PD-1和PD-L1的結合。
在另一個方面，本申請的抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L2的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L2的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。例如，首先將穩定表達PD-1的宿主細胞(如CHO-K1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-L2蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L2結合。又例如，首先將PD-1抗原蛋白包被在板上，將遞減量的未標記的該抗原結合蛋白和生物素標記的PD-L2蛋白混合後，共同孵育。然後，使用ELISA分析細胞，以證實該抗原結合蛋白可以阻斷PD-1與PD-L2的結合。
本申請的抗原結合蛋白能夠刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌。該免疫細胞可包括淋巴細胞，例如B細胞、T細胞、天然殺傷細胞，髓樣細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜鹼細胞和粒細胞。可用本領域任何技術人員已知的方法測定免疫細胞中細胞因子的分泌，例如，藉由酶聯免疫法(ELISA)定量測定免疫細胞(例如T細胞)增殖情況或由免疫細胞產生的細胞因子(例如由T細胞產生的IFN-γ或IL-2)。
融合蛋白
另一方面，本申請提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含PD-1結合部分，其中該PD-1結合部分包含本申請的分離的抗原結合蛋白。
在本申請中，該融合蛋白的第二靶向部分可包含CD73結合部分。在本申請中，該CD73結合部分可包含特異性結合CD73的抗體或其抗原結合片段。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1，該HCDR1可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR2，該HCDR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR3，該HCDR3可包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該HCDR1、HCDR2和HCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包括抗體重鏈可變區VH，該VH可包含SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1，該LCDR1可包含SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR2，該LCDR2可包含SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列。
【(0465】在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體輕鏈或其 片段，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR3，該LCDR3可包含SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包括抗體輕鏈可變區VL，該VL可包含SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，該HCDR1、HCDR2和HCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含Fab。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體重鏈，且該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：246所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的該CD73結合部分可包含抗體輕鏈，且該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白中，該PD-1結合部分可以位於該CD73結 合部分的N端。在本申請中，該融合蛋白中，該PD-1結合部分可以位於該CD73結合部分的C端。
在本申請中，該融合蛋白可包括第一多肽鏈和第二多肽鏈。在本申請中，該融合蛋白的第一條多肽鏈可包含該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的VH。在本申請中，該融合蛋白的第二條多肽鏈可包含該CD73結合部分的VL。
在本申請中，自N端至C端，該融合蛋白的第一條多肽鏈可依次包含該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的VH。
在本申請中，該融合蛋白的第一條多肽鏈可包含抗體重鏈恆定區。在本申請中，自N端至C端，該融合蛋白的第一條多肽鏈可依次包含該PD-1結合部分的VH、該CD73結合部分的VH和該抗體重鏈恆定區。
在本申請中，該融合蛋白的第一條多肽鏈可包含該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的抗體重鏈。在本申請中，自N端至C端，該融合蛋白的第一條多肽鏈可依次包含該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的抗體重鏈。
在本申請中，在該融合蛋白的第一條多肽鏈中，該PD-1結合部分和該CD73結合部分可直接連接。
在本申請中，在該融合蛋白的第一條多肽鏈中，該PD-1結合部分和該CD73結合部分可藉由連接肽連接。在本申請中，該連接肽可包含SEQ ID NO：334-352中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該第一多肽鏈可以包括SEQ ID NO：333所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白的第二條多肽鏈還可包含抗體輕鏈恆定區。例如，該第一多肽鏈可以包括SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
在本申請中，該融合蛋白可包括兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。在本申請中，該融合蛋白可以為同二聚體。在本申請中，該融合蛋白為對稱結構。
本申請的融合蛋白的實例性結構可以如圖10所示，其包含兩條多肽鏈：第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL-A-CL；第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH-B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。其中，VH_A和VL_A分別為任意的CD73抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH_B為本申請的PD-1重鏈抗體的重鏈可變區。CL是任意的輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是任意的重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L是任意的連接肽(例如，本文提到的那些連接肽)，h是任意的IgG抗體的鉸鏈區或衍生序列。
在本申請中，該融合蛋白具有該抗原結合蛋白的生物活性，例如，結合PD-1抗體、阻斷PD-1與其配體(例如，PD-L1和/或PD-L2)的結合，刺激T細胞分泌細胞因子等。此外，本申請的融合蛋白還能結合CD73蛋白，抑制CD73的酶活性。
核酸分子、載體和細胞
另一方面，本申請提供了一種或多種核酸分子，其可以編碼本申請的分離的抗原結合蛋白和/或該多特異性抗體。本申請的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
另一方面，本申請提供了一種載體，其可以包含本申請的核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其可以包含本申請的核酸分子或本申請的載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請的核酸分子或載體。例如，可將本申請的載體引入該宿主細胞中，例如真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請的載體引入該宿主細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
醫藥組成物
另一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其可包含本申請的抗原結合蛋白和/或該多特異性抗體，該核酸分子，該載體，該宿主細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體(carrier)。該藥學上可接受的載體在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒性，並且可包括緩衝劑，抗氧化劑，防腐劑，低分子量(小於約10個殘基)多肽，蛋白質，親水性聚合物，胺基酸，碳水化合物，成鹽反離子，金屬絡合物，和/或非離子表面活性劑。本申請中的醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化 合物。此類藥物的類型和有效量取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型，以及受試者的臨床參數。
本申請的醫藥組成物可以包含預防和/或治療有效量的該抗原結合蛋白、多特異性抗體。該預防和/或治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的疾病或病症和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其可以包含細胞毒性劑，以及本申請的抗原結合蛋白。免疫綴合物通常是指採用特定的連接子將抗原結合蛋白和小分子細胞毒藥物連接起來，其主要組成成分可以包括抗原結合蛋白、連接子和小分子細胞毒藥物。
另一方面，本申請提供了一種試劑盒，其可以包含本申請的抗原結合蛋白，載體，核酸分子，細胞，免疫綴合物，和/或本申請的醫藥組成物。其可在單一常用容器中包括本申請的抗原結合蛋白，載體，核酸分子，細胞，免疫綴合物，和/或本申請的醫藥組成物，也可視需要地與一種或多種治療劑組合，視需要地一起配製於試劑盒中。
另一方面，本申請提供了一種給藥裝置，它可以用來施用本申請的抗原結合蛋白，載體，核酸分子，細胞，免疫綴合物，和/或本申請的醫藥組成物。
製備方法
另一方面，本申請提供了製備該抗原結合蛋白的方法。該方法可包括，在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養該本申請的宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是本領域普通技 術人員所瞭解的。
任何適於產生單株抗體的方法都可用於產生本申請的抗原結合蛋白。例如，可以用連接或天然存在的PD-1蛋白或其片段，免疫動物。可以使用合適的免疫接種方法，包括佐劑、免疫刺激劑、重複加強免疫接種，可以使用一種或多種途徑。
任何合適形式的PD-1都可以作為免疫原(抗原)，用於產生對PD-1特異的非人抗體，篩選該抗體的生物學活性。激發免疫原可以是全長的成熟人PD-1，包括天然的同源二聚體，或含單個/多個表位的肽。免疫原可以單獨使用，或與本領域已知的一種或多種免疫原性增強劑組合使用。
人源化抗體可以選自任何種類的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申請中，抗體是IgG抗體，使用IgG1或IgG4亞型。可以藉由用下文實施例中描述的生物學測定篩選抗體實現必需恆定結構域序列的優化，以產生所需生物學活性。同樣，任一類輕鏈都可以在本文的化合物和方法中使用。具體地說，κ、λ鏈或其變體在本申請的化合物和方法中是可以用的。
本申請的抗原結合蛋白或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組文庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後藉由常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，藉由先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。然後可將該核酸分子引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或 如載體)和細胞中。
本申請還涉及包含上述的適當核酸分子以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。例如，動物細胞可以包括(但並不限於)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293細胞。
本申請中該用重組DNA轉化宿主細胞的步驟可用本領域熟知的技術進行。獲得的轉化子可用常規方法培養，轉化子表達本申請的核酸分子所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，用常規培養基在合適的條件下培養。通常，在適合本申請抗原結合蛋白表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等熟知的常規分離純化手段純化得到本申請的抗原結合蛋白。
所得單株抗體可用常規手段來鑑定。比如，單株抗體的結合特異性可用免疫沉澱或體外結合試驗(如流式細胞分選技術(FACS)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來測定。
方法和用途
另一方面，本申請提供了抑制PD-1與PD-L1結合的方法，包括施用本申請的抗原結合蛋白。該方法可以是離體或體外方法。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請的抗原結合蛋白和/或PD-L1在容許該抗原結合蛋白和/或PD-1結合PD-L1的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-1之間是否形成複合物，和檢測PD-1與PD-L1之間是否形成複合物。
另一方面，本申請提供了抑制PD-1與PD-L2結合的方法，包括施用本申請的抗原結合蛋白。該方法可以是離體或體外方法。在某些情形中，該方法包括使生物樣品與本申請的抗原結合蛋白和/或PD-L2在容許該抗原結合蛋白和/或PD-L2結合PD-1的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-1之間是否形成複合物，和檢測PD-L1與PD-1之間是否形成複合物。該抗原結合蛋白和/或醫藥組成物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本申請的醫藥組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展，可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
另一方面，本申請提供了一種該抗原結合蛋白和/或該多特異性抗體在製備藥物中的用途。該藥物可用於治療癌症，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
另一方面，本申請提供了刺激免疫細胞分泌細胞因子的方法，其包括施用該分離的抗原結合蛋白和/或該多肽。該細胞因子可以是IL-2。該免疫細胞可以是淋巴細胞。例如，T淋巴細胞。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非診斷和/或治療目的的方法。
另一方面，本申請提供了一種用於檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，其包括施用該分離的抗原結合蛋白和/或該融合蛋白。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非診斷和/或治療目的的方法。
本申請還提供了抗原結合蛋白在診斷患有腫瘤或癌症的受試者的方法中的用途，該方法包括：藉由使樣品與本申請的抗原結合蛋白接觸並檢測結合的抗體的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-1的存在或表達水準。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的 融合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
下面顯示的實施例意在說明本發明的具體實施方案，並且不意在以任何方式限制本說明書或申請專利範圍的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法.這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E．F．and Maniais，T．(1989)MolecuLar Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1 抗原結合蛋白的製備
為獲得針對PD-1特異性結合的抗體分子，通常可以利用PD-1抗原對實驗動物進行免疫，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，轉基因技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。這種轉基因小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域，即H2L2形式的抗體具有兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈。
Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。即HCAb形式的抗體包含兩條抗體重鏈，不包含抗體輕鏈。
1.1 PD-1免疫小鼠
(1)免疫H2L2小鼠
用可溶的重組人PD-1-hFc融合蛋白(Shanghai ChemPartner)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後藉由皮下經腹股溝注射或藉由腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50μg抗原蛋白(人PD-1-hFc)與完全弗氏佐劑(Sigma,#F5881)以體積比1：1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25μg抗原蛋白與Ribi佐劑(Sigma Adjuvant System,#S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩週，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行細胞融合前3天，以每隻小鼠25μg抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
(2)免疫HCAb小鼠
6~8週齡Harbour人源抗體轉基因小鼠採用了2組免疫方案對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。免疫方案1，用重組的人PD-1-hFc(Shanghai ChemPartner)抗原蛋白進行免疫。每隻小鼠每次免疫時藉由皮下經腹股溝注射或 藉由腹腔注射接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50微克抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma,#F5881)以體積比1：1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25微克抗原蛋白與Ribi佐劑(Sigma Adjuvant System,#S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。免疫方案2，用過表達人PD-1的HEK293/hPD-1(Shanghai ChemPartner)穩定細胞系進行免疫。每隻小鼠每次免疫時腹腔注射2×106細胞懸液。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩週，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
採集小鼠血液，對血液進行10倍稀釋取5個濃度(1：100、1：1000、1：10000、1：100000、1：1000000)，在包被有人PD-1-His(Shanghai ChemPartner)的ELISA板進行ELISA檢測來確定小鼠血液中抗人PD-1的滴度，並經流式細胞術檢測2個濃度的小鼠血液(1：100、1：1000)對PD-1高表達的CHO-K1/hPD-1細胞(Shanghai ChemPartner)和CHO-K1母細胞的特異反應性。空白對照組(PB)為免疫前老鼠的血清。
1.2 獲得融合瘤純株和抗體序列
(1)獲得抗PD-1的H2L2抗體序列
當檢測H2L2小鼠血清中PD-1特異的抗體滴度達到一定的水準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞系融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，分離出至少8個表達抗-PD-1的單株抗體分子的融合瘤。分離的融合瘤細胞及其表達的單株抗體都使用對應的純株號來表示，例如：4004_10H9A12，4004_12H9C1等。分離的融合瘤表達具有完整的人可變結構域和 大鼠恆定結構域的重鏈和輕鏈的抗體分子。對上述單株抗體進行進一步的鑑定，根據其對人PD-1的結合能力、食蟹猴PD-1的結合能力、抑制PD-1與PD-L1結合能力等參數，選出若干個融合瘤純株進行測序。利用常規的融合瘤測序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗PD-1單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。在本申請中，該CDR序列藉由Chothia定義規則劃分。
(2)獲得抗PD-1的HCAb抗體序列
當檢測小鼠血清中PD-1特異的抗體滴度達到一定的水準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD FACS AriaII Cell Sorter分選CD138陽性的漿細胞和人PD-1抗原陽性的B細胞群。提取B細胞的RNA，反轉錄cDNA(SuperScript IV First-Strand synthesis system,Invitrogen,#18091200)，然後用特異性的引子PCR擴增人VH基因。PCR引子5’-GGTGTCCAGTGT(G/C)AGGTGCAGCTG-3’(SEQ ID NO：357),5’-AATCCCTGGGCACTGAAGAGACGGTGACC-3’(SEQ ID NO：358)。將擴增的VH基因片段構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列(SEQ ID NO：355)的哺乳動物細胞表達質粒pCAG載體中。
構建好的質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)進行表達獲得HCAb的抗體。檢測表達HCAb的上清與過表達人PD-1的CHO-K1/hPD-1(GenScript，#M00529)穩定細胞系的結合，同時用陽性抗體作為陽性對照，進行Miroball螢光流式儀器(Sptlabtech)篩選。具體步驟是：用無血清的F12K培養基(Thermofisher，#21127022)洗滌CHO-K1/hPD-1細胞，將其用無血清的培養基重新懸浮至1×106/ml。加入Draq5螢光探針(CTS，#4048L)(1μL Draq5至1ml CHO-K1/hPD-1細胞中，1：1000稀釋)，在避光處孵育30分鐘。離心細胞後用培養基洗滌細胞， 調整細胞密度至1.0×105細胞/ml。再加入1：1000稀釋後的Alexa Fluor® 488,AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific二抗(Jackson，#109-545-098)，取每孔30ul的該混合物加入384孔板(Greiner，#781091)。再在384孔板中加入10μL陽性對照或者表達HCAb的上清，孵育2小時。在Miroball螢光流式儀器上讀取螢光值。陽性單株抗體進一步用FACS檢測與CHO-K1/hPD-1細胞的結合，以及和食蟹猴PD-1-his蛋白(Novoprotein，#CM98)的ELISA檢測來驗證結合交叉結合活性。利用常規的測序手段對陽性抗體進行測序，獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。
抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign(http：//imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)或者NCBI/IgBLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。
上述獲得的抗體的胚系基因分析如下表2所示，抗體的序號和各片段序列如下表3和表4所示。
同時，本申請的抗PD-1的陽性對照抗體Pembrolizumab類似物，對應的抗體編號為PR000150。其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫，抗體重鏈序列SEQ ID NO：332，抗體輕鏈序列SEQ ID NO：331。
表2 抗PD-1 H2L2和HCAb抗體的序列胚系基因分析
Figure 110126069-A0101-12-0077-2
表3 抗PD-1 H2L2和HCAb抗體的序號
Figure 110126069-A0101-12-0078-3
表4 抗PD-1 H2L2和HCAb抗體的胺基酸序列
Figure 110126069-A0101-12-0079-4
1.3 重組全人源抗體的製備
上述實施例1.2和1.3中得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表達，得到重組抗體分子，重組抗體分子的輕重鏈序列如表3中所示。
在本實施例中Harbour H2L2小鼠得到的抗體輕鏈可變結構域序列(VL)藉由基因合成並選殖到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。抗體重鏈可變結構域序列(VH)藉由基因合成並選殖到編碼人IgG4抗體重鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO：354)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生IgG4抗體的全長重鏈。
將編碼Harbour H2L2抗體重鏈的質粒和編碼抗體輕鏈的質粒同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。或者將編碼Harbour HCAb抗體重鏈的質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有HCAb重鏈重組抗體。
具體說來，將HEK293細胞在FreeStyleTM F17 Expression Medium培養基(Thermo，#A1383504)擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8×105細胞/ml，於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×106細胞/ml。準備30ml培養的細胞。將上述編碼H2L2抗體的重鏈質粒和輕鏈質粒以2：3的比例混合或者編碼HCAb的重鏈質粒溶解於1.5ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo，#31985088)，並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences Inc，#23966-2)120μL，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫孵育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelectTM(GE Healthcare Life Science，#71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad，#7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱。用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白， 後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore，#UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop(Thermo ScientificTMNanoDropTM One)測定濃度，分裝、存儲備用。
1.4 利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體
使用分析型分子尺寸排阻層析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience,#08541,5μm,7.8mm x 30cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10μg，樣品濃度調整到1mg/ml)用0.22μm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS(pH 7.4)緩衝液將樣品以1.0ml/min的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘；檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
上述獲得的全人源H2L2和HCAb抗體的產量和純度等如下表5所示。
表5 PD-1抗體的產量和純度分析
Figure 110126069-A0101-12-0082-44
1.5 優化HCAb抗體序列提高結合PD-1的親和力
本實施例藉由定點飽和突變的方法對抗PD-1的HCAb抗體PR002481進行親和力的改造。此親和力成熟的方法分為2輪。
第一輪，對PR002481這個分子的三個CDRs的28胺基酸逐點掃描。建立28個胺基酸位置的單點飽和突變的酵母小庫。將3個CDR的小庫各自混合，形成3個CDR的酵母突變庫。對三個CDR的突變庫在流式細胞儀上進行分選，分選出來的酵母細胞進行測序，並對這些陽性分子進一步鑑定，根據其對人PD-1的結合能力，選出若干個突變熱點。在本實施例中抗體可變結構域的CDR序列藉由Chothia CDR定義規則進行分析。
第二輪，將第一輪中飽和突變找到的熱點進行隨機組合，建立一 個包含所有突變組合的酵母庫。然後對組合庫在流式細胞儀上進行分選。分選下來的酵母細胞藉由測序以及對人PD-1的結合能力鑑定，選出若干個突變體。
在本實施例中藉由親和力成熟得到的抗體重鏈可變結構域序列(VH)藉由基因合成並選殖到編碼Flag和6xHis標籤的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生PD1單域抗體(VH)分子。
或者，將親和力成熟得到的抗體的VH基因片段構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列(SEQ ID NO：355)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼HCAb的全長重鏈。
本發明藉由上述親和力成熟的方法得到單價形式PR002481變體(均為單域抗體，帶Flag-6His標籤)及其序列如下表6所示(涉及HCDR1，SEQ ID NOs：18，20-33：HCDR2，SEQ ID NOs：58-68；HCDR3,SEQ ID NOs：：100，103-111)。其中，PR005090即為PR002481母本序列對應的單域抗體(帶Flag-6His標籤)。對表6中的單域抗體進行評價，據於Koff排序，表達量及報告基因活性的結果，藉由綜合分析或直接挑選單域抗體表達HCAb或重組表6中已有CDR表達HCAb，或在已有CDR區域引入一些熱點突變設計產生新CDR用於HCAb抗體的表達，本發明經過突變、篩選獲得的HCAb抗體如表7所示(涉及HCDR1，SEQ ID NOs：18，25，28，34-38；HCDR2，SEQ ID NOs：64-65；HCDR3,SEQ ID NOs：：108，111-112)。
表6 單價形式PR002481變體(單域)抗體的序列表
Figure 110126069-A0101-12-0084-6
Figure 110126069-A0101-12-0085-7
表7 PR002481變體(HCAb)抗體的序列表
Figure 110126069-A0101-12-0086-9
1.6 PR002481親和力變體的生產和純化
上述實施例1.5中得到編碼PR002481親和力變體可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將重鏈可變結構域序列和相應的純化標籤進行融合表達，得到重組HCAb單域抗體分子。
將編碼重組HCAb單域抗體的質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CHO)，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到相應的純化重組抗體。
單域抗體的生產純化方法具體為：將ExpiCHO-STM細胞(Gibco,#A29127)在ExpiCHOTM Expression Medium培養基(Gibco,#A2910001)擴培。暫態轉 染開始之前，調節細胞濃度至3~4×106細胞/ml，於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時，細胞濃度至7~10×106細胞/ml，再稀釋至6×106細胞/ml，準備10ml培養的細胞。將上述編碼HCAb單域抗體的質粒8μg(質粒與細胞的比例為0.8μg：1ml)溶解於0.4ml OptiPROTM SFM培養基(Gibco,#12309019)，並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取32μl ExpiFectamineTM CHO試劑(Gibco,#A29129)加入0.37ml OptiPROTM SFM培養基(Gibco,#12309019)。立即把ExpiFectamineTM CHO試劑溶液緩慢加入質粒溶液中，顛倒混勻，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒和轉染試劑混合溶液，於37℃ 8% CO2搖床中培養8-9天。8天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清，然後將上清用0.22μm濾膜過濾去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有Ni Sepharose excel(GE Healthcare Life Science，#17531802)的重力管柱(Bio-Rad，#7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱。先後用5-10倍管柱體積的PBS和5-10倍管柱體積的20mM咪唑溶液(pH7.4)沖洗管柱。再用500mM咪唑溶液(pH7.4)洗脫目的蛋白，最後用超濾管(Millipore，#UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop(Thermo ScientificTM NanoDropTM One)測定濃度，分裝、存儲備用。
HCAb抗體的生產純化方法具體為：將HEK293細胞在FreeStyleTM F17 Expression Medium培養基(Thermo，#A1383504)擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8×105細胞/ml，於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×106細胞/ml。準備30ml培養的細胞。將編碼HCAb的重鏈質粒溶解於1.5ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo，#31985088)，並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences Inc，#23966-2)120μL，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫孵育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液， 於37℃ 8% CO2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelectTM(GE Healthcare Life Science，#71-5020-91 AE)的重力柱(Bio-Rad，#7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱。用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore，#UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop(Thermo ScientificTM NanoDropTM One)測定濃度，分裝、存儲備用。
利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體
使用分析型分子尺寸排阻層析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience,08541,5μm,7.8mm x 30cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10μg，樣品濃度調整到1mg/ml)用0.22μm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS(pH 7.4)緩衝液將樣品以1.0ml/min的流速流過層析管柱，最長時間為20分鐘；檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
利用HPLC-HIC分析蛋白純度和疏水性
使用分析型疏水相互作用層析層析法(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型層析管柱TSKgel Buty1-NPR(Tosoh Bioscience,14947,4.6mm x 3.5cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流 動相A(20mM組胺酸，1.8M硫酸銨，pH 6.0)至100%流動相B(20mM組胺酸，pH 6.0)的線性梯度，流速設定為0.7ml/min，蛋白樣品濃度1mg/ml，進樣體積20μl,檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
利用DSF測定蛋白分子的熱穩定性
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)是一種常用的高通量的用來測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器藉由監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反映蛋白質的變性的過程，從而反映出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10μg蛋白加入96-孔PCR板(Thermo,AB-0700/W)，接著加入2μl 100X稀釋的染料SYPROTM(Invitrogen,2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40μl每孔。將PCR板密封，放置於即時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃孵育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。
PR002481親和力成熟變體HCAb的表達和物理化學性質見表8，結果顯示，測試抗體均有較高的產率，純化的純度較高，且物理化學性質穩定。
表8 PR002481親和力成熟變體(HCAb)的理化性質
Figure 110126069-A0101-12-0090-10
實施例2 抗原結合蛋白人和食蟹猴PD-1蛋白的結合
2.1 抗原結合蛋白與人PD-1蛋白的結合(ELISA)
將人PD-1-His蛋白(ACROBiosystems,# PD1-H5221)用PBS稀釋為2μg/ml，加至96孔板(Corning，cat#9018)中，每孔100μl，4℃下孵育過夜。棄去液體後用PBST緩衝液(pH 7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，加入250μl 2% BSA封閉液，37℃條件下孵育1小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05%吐溫-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白，自100nM濃度起，依次進行5倍濃度稀釋，共8至10個濃度梯度，每個孔加入100μl，37℃孵育1小時，同型抗體作為對照。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05%吐溫-20)清洗3次後，加入稀釋4000倍的羊抗人HRP二抗(Invitrogen,#A18805)，37℃條件下，避光孵育1小時。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)清洗3次後，添加100μl/孔TMB(Biopanda,#TMB-S-003)，室溫避光放置約5分鐘；每孔加入50μl/孔終止液(BBI life sciences,#E661006-0200)終止反應，置酶標儀(PerkinElemer,#Enspire)中測定450nm吸光度(OD450)值。根據測定結果計算半數最大結合效應濃度(EC50)。
結果如圖1A-圖1C所示。圖1A和圖1B顯示，本申請的抗PD-1的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680均能與人PD-1抗原結合，且結合活性與陽性對照抗體pembrolizumab相當。圖1C結果顯示本申請的抗PD-1的HCAb抗體PR002474、PR002476、PR002479和PR002481均能與人PD-1抗原結合，且結合活性與陽性對照抗體pembrolizumab相當。
2.2 抗原結合蛋白與食蟹猴PD-1蛋白的結合(ELISA)
將食蟹猴(Cynomolgus)的PD-1-His蛋白(AcroBiosystems,# PD1- C5223)用PBS稀釋為2μg/ml，加至96孔板(Corning,#9018)中，每孔100μl，4℃下孵育過夜。棄去液體後用PBST洗板3次，加入250μl的2%BSA封閉，室溫條件下孵育1小時。棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)洗板3次，將待測抗原結合蛋白濃度稀釋至5μg/ml，加入100μl/孔，37℃孵育1小時。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% tween-20)清洗3次後，加入稀釋4000倍稀釋的羊抗人HRP二抗(Invitrogen,#A18805)，37℃孵育1小時。清洗後添加100μl/孔TMB(Biopanda,#TMB-S-003)，室溫避光放置5分鐘；每孔加入50μl/孔終止液(BBI life sciences,#E661006-0200)終止反應，置酶標儀(PerkinElemer,#Enspire)中測定450nm吸光度(OD450)值。
結果如圖2所示，本申請的抗PD-1的HCAb抗體PR002474、PR002476、PR002479和PR002481均能結合食蟹猴PD-1蛋白，且結合活性與陽性對照抗體pembrolizumab相當。
實施例3 抗原結合蛋白與過表達人/食蟹猴PD-1的細胞的結合(FACS)
為了研究PD-1抗原結合蛋白體外結合人/食蟹猴PD-1的活性。採用過表達人或食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hPD-1，CHO-K1/cyno PD-1，來源於GenScript)進行細胞水準的結合實驗。簡言之，消化細胞CHO-K1-hPD-1細胞，並用F-12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,Cat#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM或300nM，共8至11個濃度，hIgG作為對照。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘， 棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(山羊抗人IgG(H+L)第二抗體，Alexa Fluor® 488 conjugate,Invitrogen，Cat #A11013,1：1000)，4℃，避光孵育30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值。
圖3A結果顯示，本申請的抗PD-1的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678和PR000680均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞，且部分抗體的結合活性與陽性對照抗體pembrolizumab相當。
圖3B結果顯示，本申請的抗PD-1的HCAb抗體PR002473、PR002474、PR002475、PR002476、PR002477、PR002478、PR002479和PR002481均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞。
圖3C結果顯示，PR002481突變體的HCAb抗體PR005093、PR005096、PR005097、PR005098、PR005099、PR005100、PR005101、PR005102、PR005103和PR005104均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞，親和力優於PR005090。
圖3D結果顯示，PR002481突變體的HCAb抗體PR005145、PR005149、PR005150、PR005141、PR005142、PR005144、PR005147和PR005148均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞，親和力優於PR005090。
圖3E結果顯示，PR002481突變體的HCAb抗體PR005585、PR005583、PR005578、PR005577、PR005575、PR005572和PR005569均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞，親和力優於親本PR002481。
圖3F結果顯示，PR002481突變體的HCAb抗體PR005584、PR005582、PR005581、PR005574、PR005573、PR005571和PR005570均能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞，親和力優於PR002481。
圖4結果顯示，本申請的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680均能結合過表達食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞，且部分抗體的結合活性與陽性對照抗體pembrolizumab相當。
實施例4 利用BLI方法測定抗原結合蛋白與人PD-1的親和力
該實施例利用Octet Red96e儀器對PR002481親和力成熟突變體進行了動力學的測定。帶有組胺酸和avi標籤的人PD-1蛋白購自廠家ACRO Biosystems(貨號PD1-H82E4)，測試緩衝液為1x動力學緩衝液(從10x動力學緩衝液(ForteBio，貨號18-1105)稀釋)，用於動力學測試以及抗原、抗體的稀釋。藉由生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet分子相互作用分析儀(ForteBio，型號Octet Red96e)，來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
測定抗原和抗體的結合動力學時，感測器轉動速度為1000轉/分鐘。先將置於一列的8個SA感測器在測試緩衝液中平衡10分鐘後用SA感測器捕獲PD-1，捕獲高度0.5nm，然後將SA感測器在測試緩衝液中平衡100s，再與稀釋至單濃度的各抗體及一行空白緩衝液孔結合180s，解離600s。每個迴圈換用一列新的SA感測器。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行資料分析時，選擇單扣除模式(reference well)扣除參照信號，選擇“1：1 Local fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗體結合的動力學參數，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
結果表9所示，PR02481的親和力成熟變體與PD-1均能結合，大部分KD值在1E9至1E8之間，甚至小於1E12，且多數變體的親和力較PR005090(基於親本序列的單域抗體)有明顯提高。
表9 PR002481親和力成熟變體與人PD-1蛋白的親和力
Figure 110126069-A0101-12-0095-11
實施例5 抗原結合蛋白阻斷人PD-L1或PD-L2與過表達人PD-1的 CHO-K1細胞的結合
為了研究人PD-1結合蛋白體外阻斷人PD-1與人PD-L1以及PD-L2結合的活性，採用過表達人PD-1的CHO-K1細胞株(CHO-K1-hPD-1)進行細胞水準的人PD-1/人PD-L1以及進行細胞水準的人PD-1/人PD-L2結合阻斷實驗。簡言之，消化CHO-K1-hPD-1細胞，並用F-12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,Cat#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍或5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM或300nM，共8個濃度，hIgG作為對照。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清，隨後加入50μL/孔，1μg/mL濃度的生物素標記的人PD-L1蛋白(AcroBiosystems,PD1-H82F2)或者1μg/mL濃度的生物素標記的人PD-L2蛋白(AcroBiosytems,PD2-H82F6)，4℃，避光孵育30分鐘。加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。加入100μL/孔螢光二抗(PE Streptavidin,BD,Cat# 554061，1：200)，4℃，避光孵育30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值，計算IC50。
結果如圖5A、圖5B和圖5C所示。圖5A和圖5B分別顯示本申請的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680，以及HCAb抗體PR002473、PR002474、PR002475、PR002476、PR002477、PR002478、PR002479和PR002481均能阻斷人PD-L1與細胞表面的人PD-1結合，且抑制能力與陽性對照pembrolizumab相當。圖5C顯示本申請的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和 PR000680均能阻斷人PD-L2與細胞表面的人PD-1結合。
實施例6 利用報告基因細胞系檢測抗原結合蛋白對PD-1信號通路的抑制作用
將過表達PD-L1和OS8(CD3單鏈抗體跨膜蛋白)的Hep3B(Shanghai ChemPartner構建)細胞，或者是過表達PD-L1和OS8的HEK293T細胞，鋪到96孔板上，細胞量為1.25×104/孔，100μL/孔。37℃在5% CO2環境下孵育過夜。去除上清液，加入50μL/孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為50nM，4倍濃度稀釋(或者起始濃度為500nM，5倍濃度稀釋)，hlgG1為對照組。加入5×104/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報告基因的Jurkat報告細胞(Shanghai ChemPartner構建)50μL/孔。37℃在5% CO2環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑(Promega,#E6110)，室溫孵育5分鐘，酶標儀檢測發光值。
結果如圖6A-圖6F所示，本申請抗體對PD-1信號通路的抑制能力與陽性對照相當。
圖6A顯示本申請的H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000678、PR000679和PR000680對PD-1信號通路有抑制作用。
圖6B顯示PR002481突變體的HCAb抗體PR005090、PR005093、PR005096、PR005097、PR005098、PR005099、PR005100、PR005101、PR005102、PR005103和PR005104對PD-1信號通路有抑制作用。
圖6C顯示PR002481突變體的HCAb抗體PR005090、PR005145、PR005149、PR005150、PR005141、PR005142、PR005144、PR005147和PR005148對PD-1信號通路有抑制作用。
圖6D和圖6E顯示PR002481突變體的HCAb抗體對PD-1信號通路有 抑制作用。
圖6F顯示PR002481突變體的HCAb抗體PR005569、PR005572、PR005575、PR005583和PR005585對PD-1信號通路均有抑制作用。
實施例7 抗原結合蛋白在混合淋巴細胞反應(MLR)中刺激細胞因子分泌
購買AllCells PBMC細胞，分離monocytes細胞，加入重組人源白介素4(IL-4)(R&D，#204-GMP)和人源GM-CSF(R&D，#215-GM/CF)誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS；Sigma,#L2630)，誘導24小時，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。採用T細胞分離試劑盒(StemCell，#17951)從第二供體PBMC細胞中分離得到T淋巴細胞。將1×105/孔的T淋巴細胞和1×104/孔的mDC細胞按10：1比例接種至96孔板，加入10μg/ml各抗原結合蛋白和及陰陽性對照抗體，並做10倍或者對應倍數的稀釋。於37℃，5% CO2培養箱孵育5天。收集第三天和第五天的上清液，採用ELISA試劑盒，分別檢測IL-2(ThermoFisher，#88-7025-88)和IFN-γ(ThermoFisher，#88-7316-88)的分泌量。
首先使用了12個供體的PBMC分成了六組供體配對進行混合淋巴細胞反應(MLR)。結果如圖7和圖8所示，在六次獨立的MLR實驗中，H2L2抗體PR000673、PR000674、PR000675、PR000676、PR000677、PR000678、PR000679和PR000680，以及PR002481都能增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ。
圖9顯示PR002481突變體的HCAb抗體PR005569、PR005572、PR005575、PR005583和PR005585均能增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ，且啟動能力與陽性對照相當。
實施例8 CD73×PD-1雙特異性抗體的結構和設計
本實施例利用抗CD73的IgG抗體PR000846的抗原結合結構域Fab，和抗PD-1的HCAb抗體PR002481的抗原結合結構域VH，來構建PD-1×CD73的雙特異性抗體分子。PR000846輕重連的胺基酸序列如表10所示。
表10 抗CD73的H2L2抗體PR000846的序列編號
Figure 110126069-A0101-12-0099-12
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗CD73的IgG單抗PR000846，亦為CD73×PD-1雙抗分子的CD73端的親本單抗。陽性對照分子為抗PD-1的IgG單抗PR002481，亦為CD73×PD-1雙抗分子的PD-1端的親本單抗。
以圖10為例進行說明，Fab端來源於常規抗體PR000846，VH_A和VL_A分別為抗體PR000846的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體PR002481，VH_B為重鏈抗體PR002481的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L是連接肽GS_15(SEQ ID NO：338)，h是IgG抗體的鉸鏈區或衍生序列。VH_B在VH_A的N端。IgG1為L234A,L235A突變。製備得到的四價對稱結構的雙特異性抗體為PR003568，包含兩條多肽鏈，其中長鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：333所示，短鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：330所示。製備的雙抗抗體分子樣品並理化性質分析，總結於表11。
表11 雙抗分子蛋白的表達和物理化學性質
Figure 110126069-A0101-12-0099-13
實施例9 CD73×PD-1雙特異性抗體與過表達人PD-1或人CD73的細胞的結合(FACS)
為了研究CD73×PD-1雙特異性抗體與結合人CD73和PD-1的活性，採用過表達人CD73或PD-1的CHO-K1細胞株(CHO-K1-hCD73，CHO-K1-hPD-1)進行細胞水準的結合實驗。簡言之，消化CHO-K1-hCD73和CHO-K1-hPD-1細胞，並用F-12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。稀釋抗體至最高終濃度50nM，3倍稀釋，共8個濃度。取100μL稀釋後的抗體加入到細胞中，將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(山羊抗人IgG(H+L)第二抗體，Alexa Fluor® 488 conjugate,Invitrogen，Cat#A11013,1：1000)，4℃，避光孵育30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值。
如圖11和圖12所示PR003568具有很好的結合CD73和PD-1的活性。其中PR003568雙特異性抗體PD-1端的活性與親本單株抗體PR002481一致，CD73端的活性比親本單株抗體PR000846有稍微下降。
實施例10 CD73×PD-1雙特異性抗體結抑制CD73的酶活性
利用孔雀綠法測定可溶性重組CD73的活性，首先在384孔板(Corning,#3799)中加入12.5μL 1nM重組CD73和12.5μL 1nM的抗體(實驗緩衝液為25mM Tris pH 7.5，5mM MgCl2，0.005%吐溫-20)，室溫孵育1小時。加入25μL AMP(最高濃度200μM，用實驗緩衝液2倍稀釋至8個濃度)，室溫孵育15分鐘。檢測每個孔中無機磷酸根的濃度，無機磷酸根的濃度是根據製造商的說明書孔雀綠法測定的。測定結束後用Molecular Devices(SPECTRAMax plus384)讀板機記錄620nm光吸收值。實驗結果用GraphPad Prism 8.0分析作圖。
如圖13所示PR003568具有很好的抑制CD73的酶活活性，和親本單株抗體PR000846活性相當。
實施例11 利用報告基因細胞系檢測CD73×PD-1雙特異性抗體對PD-1信號通路的抑制作用
將表達PD-L1和OS8(CD3單鏈抗體跨膜蛋白)的HEK293T(eBioscience)細胞鋪到96孔板上，細胞量為1.25×104/孔，100μL/孔。37℃在5% CO2環境下孵育過夜。去除上清液，加入50μL/孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為100nM，5倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入5×104/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報告基因的Jurkat報告細胞(UPharm)50μL/孔。37℃在5% CO2環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑(Promega，貨號E6110)，室溫孵育5分鐘，酶標儀檢測發光值。
如圖14所示PR003568具有很好的PD-1信號通路抑制作用，和親本單株抗體PR002481活性相當。
實施例12 雙特異性抗體在混合淋巴細胞反應試驗中啟動T細胞
購買AllCells PBMC細胞，分離monocytes細胞，加入重組人源白介素4(IL-4)(R&D，#204-GMP)和人源GM-CSF(R&D，#215-GM/CF)誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS；Sigma,#L2630)，誘導24小時，獲得成熟的樹突狀細胞 (mDC細胞)。採用T細胞分離試劑盒(StemCell，#17951)從第二供體PBMC細胞中分離得到T淋巴細胞。將1×105/孔的T淋巴細胞和1×104/孔的mDC細胞按10：1比例接種至96孔板，加入10μg/ml各抗原結合蛋白和及陰陽性對照抗體，並做10倍或者對應倍數的稀釋。於37℃，5% CO2培養箱孵育5天。收集第三天和第五天的上清液，採用ELISA試劑盒，分別檢測IL-2(ThermoFisher，#88-7025-88)和IFN-γ(ThermoFisher，#88-7316-88)的分泌量。
如圖15A和圖15B所示，CD73×PD-1雙特異性抗體PR003568的MLR活性要優於PD-1單抗PR002481。

Claims (105)

  1. 一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：359所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：360所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：361所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項1至2中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH、重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
  4. 如請求項2至3中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11-16中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：50-55中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：92-97中任一項所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：92；
    (2)HCDR1：SEQ ID NO：12，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：93；
    (3)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：51，和HCDR3：SEQ ID NO：94；
    (4)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：52，和HCDR3：SEQ ID NO：95；
    (5)HCDR1：SEQ ID NO：15，HCDR2：SEQ ID NO：53，和HCDR3：SEQ ID NO：96；
    (6)HCDR1：SEQ ID NO：16，HCDR2：SEQ ID NO：54，和HCDR3：SEQ ID NO：97；以及，
    (7)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：55，和HCDR3：SEQ ID NO：92。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：368所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項7所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：151-158中任一項所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其還包括抗體重鏈恆定區。
  10. 如請求項9所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
  11. 如請求項9至10中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
  12. 如請求項9至11中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：238-245中任一項所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，該LCDR1包含SEQ ID NO：365所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：366所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：367所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項14所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：121-125中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：130-135中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：140-145中任一項所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項14至15中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140；
    (2)LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：131，和LCDR3：SEQ ID NO：141；
    (3)LCDR1：SEQ ID NO：123，LCDR2：SEQ ID NO：132，和LCDR3：SEQ ID NO：142；
    (4)LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：133，和LCDR3：SEQ ID NO：143：
    (5)LCDR1：SEQ ID NO：124，LCDR2：SEQ ID NO：134，和LCDR3：SEQ ID NO：144；以及
    (6)LCDR1：SEQ ID NO：125，LCDR2：SEQ ID NO：135，和LCDR3：SEQ ID NO：145。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其 包含抗體輕鏈可變區VL，且該VL包含SEQ ID NO：369所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項17所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：231-236中任一項所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其還包括抗體輕鏈恆定區。
  20. 如請求項19所述的分離的抗原結合蛋白，其中該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：353所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：324-329中任一項所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段和抗體輕鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：92，LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140；
    (2)HCDR1：SEQ ID NO：12，HCDR2：SEQ ID NO：50，和HCDR3：SEQ ID NO：93，LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：131，和LCDR3：SEQ ID NO：141；
    (3)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：51，和HCDR3：SEQ ID NO：94，LCDR1：SEQ ID NO：123，LCDR2：SEQ ID NO：132，和LCDR3：SEQ ID NO：142；
    (4)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：52，和HCDR3：SEQ ID NO：95，LCDR1：SEQ ID NO：122，LCDR2：SEQ ID NO：133，和LCDR3：SEQ ID NO：143；
    (5)HCDR1：SEQ ID NO：15，HCDR2：SEQ ID NO：53，和HCDR3：SEQ ID NO：96，
    (6)LCDR1：SEQ ID NO：124，LCDR2：SEQ ID NO：134，和LCDR3：SEQ ID NO：144；
    (7)HCDR1：SEQ ID NO：16，HCDR2：SEQ ID NO：54，和HCDR3：SEQ ID NO：97，LCDR1：SEQ ID NO：125，LCDR2：SEQ ID NO：135，和LCDR3：SEQ ID NO：145；以及，
    (8)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：55，和HCDR3：SEQ ID NO：92，LCDR1：SEQ ID NO：121，LCDR2：SEQ ID NO：130，和LCDR3：SEQ ID NO：140。
  23. 如請求項1至22中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH和抗體輕鏈可變區VL，且該VH和VL包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)VH：SEQ ID NO：151和VL：SEQ ID NO：231；
    (2)VH：SEQ ID NO：152和VL：SEQ ID NO：232；
    (3)VH：SEQ ID NO：153和VL：SEQ ID NO：233；
    (4)VH：SEQ ID NO：154和VL：SEQ ID NO：234；
    (5)VH：SEQ ID NO：155和VL：SEQ ID NO：235；
    (6)VH：SEQ ID NO：156和VL：SEQ ID NO：232；
    (7)VH：SEQ ID NO：157和VL：SEQ ID NO：236；以及
    (8)VH：SEQ ID NO：158和VL：SEQ ID NO：231。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
    a)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1；
    b)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
    c)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
    d)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
    e)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
  25. 一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：362所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：363所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：364所示的胺基酸序列。
  26. 如請求項25所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  27. 如請求項25至26中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH，重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
  28. 如請求項25至27中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段為重鏈抗體(HCAb)或VHH。
  29. 如請求項25至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  30. 如請求項25至29中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：18-33中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：57-68中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO： 99-101和103-111中任一項所示的胺基酸序列。
  31. 如請求項25至30中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (2)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：99；
    (3)HCDR1：SEQ ID NO：19，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：99；
    (4)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：57，和HCDR3：SEQ ID NO：101；
    (5)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (6)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (7)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (8)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (9)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (10)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (11)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (12)HCDR1：SEQ ID NO：20，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (13)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：104；
    (14)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：105；
    (15)HCDR1：SEQ ID NO：21，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (16)HCDR1：SEQ ID NO：22，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (17)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：106；
    (18)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：107；
    (19)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：58，和HCDR3：SEQ ID NO：103；
    (20)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：62，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (21)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：61，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (22)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：59，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (23)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：60，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (24)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：63，和HCDR3：SEQ ID NO：100；
    (25)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (26)HCDR1：SEQ ID NO：24，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (27)HCDR1：SEQ ID NO：26，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (28)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (29)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (30)HCDR1：SEQ ID NO：26，HCDR2：SEQ ID NO：67，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
    (31)HCDR1：SEQ ID NO：27，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：110；
    (32)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (33)HCDR1：SEQ ID NO：28，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (34)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (35)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：68，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (36)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (37)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
    (38)HCDR1：SEQ ID NO：30，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (39)HCDR1：SEQ ID NO：29，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (40)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：68，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (41)HCDR1：SEQ ID NO：29，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (42)HCDR1：SEQ ID NO：30，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
    (43)HCDR1：SEQ ID NO：31，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (44)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：111：
    (45)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (46)HCDR1：SEQ ID NO：32，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：109；
    (47)HCDR1：SEQ ID NO：23，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：109；以及
    (48)HCDR1：SEQ ID NO：33，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111。
  32. 如請求項25至31中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：254所示的胺基酸序列。
  33. 如請求項32所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：160-166和168-221中任一項所示的胺基酸序列。
  34. 如請求項25至33中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其還包括抗體重鏈恆定區。
  35. 如請求項34所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
  36. 如請求項34至35中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
  37. 如請求項34至36中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
  38. 如請求項25至37中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：247-253和255-309中任一項所示的胺基酸序列。
  39. 如請求項25至38中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
    (1)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1；
    (2)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
    (3)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
    (4)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
    (5)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
  40. 一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，該HCDR1包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
  41. 如請求項40所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  42. 如請求項40至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH、重鏈抗體(HCAb)和/或dAb。
  43. 如請求項40至42中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段為重鏈抗體(HCAb)。
  44. 如請求項41至43中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  45. 如請求項40至44中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：18、25、28和34-38中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：64-66中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：108、111和112中任一項所示的胺基酸序列。
  46. 如請求項40至45中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR1、HCDR2和HCDR3包含選自以下任意一組的胺基酸序列：
    (1)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：66，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (2)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (3)HCDR1：SEQ ID NO：25，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (4)HCDR1：SEQ ID NO：34，HCDR2：SEQ ID NO：65，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (5)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：108；
    (6)HCDR1：SEQ ID NO：18，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (7)HCDR1：SEQ ID NO：35，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (8)HCDR1：SEQ ID NO：36，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111：
    (9)HCDR1：SEQ ID NO：36，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：112；
    (10)HCDR1：SEQ ID NO：28，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；
    (11)HCDR1：SEQ ID NO：37，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111；以及
    (12)HCDR1：SEQ ID NO：38，HCDR2：SEQ ID NO：64，和HCDR3：SEQ ID NO：111。
  47. 如請求項40至46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：167所示的胺基酸序列。
  48. 如請求項47所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：196、197、200、201、202和222-230中任一項所示的胺基酸序列。
  49. 如請求項40至48中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其還包括抗體重鏈恆定區。
  50. 如請求項49所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
  51. 如請求項49至50中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區和/或人IgG1恆定區。
  52. 如請求項49至51中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：354-355中任一項所示的胺基酸序列。
  53. 如請求項40至52中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其 包括抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：310-323中任一項所示的胺基酸序列。
  54. 如請求項40至53中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
    (1)能夠以1×108M以下的KD值結合人PD-1：
    (2)能夠阻斷PD-1和PD-L1結合；
    (3)能夠阻斷PD-1和PD-L2結合；
    (4)能夠刺激免疫細胞中IL-2和/或IFN-γ的分泌；以及
    (5)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。
  55. 一種融合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含PD-1結合部分，其中該PD-1結合部分包含請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  56. 如請求項55所述的融合蛋白，其中該第二靶向部分包含CD73結合部分。
  57. 如請求項55至56中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包括特異性結合CD73的抗體或其抗原結合片段。
  58. 如請求項55至57中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該HCDR1、HCDR2和HCDR3分別依次包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
  59. 如請求項55至58中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包括抗體重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：159所示的胺基酸 序列。
  60. 如請求項55至59中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3分別依次包含SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：146所示的胺基酸序列。
  61. 如請求項55至60中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包括抗體輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列。
  62. 如請求項56至61中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包含Fab。
  63. 如請求項56至62中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包含抗體重鏈，且該抗體重鏈包含SEQ ID NO：246所示的胺基酸序列。
  64. 如請求項56至63中任一項所述的融合蛋白，其中該CD73結合部分包含抗體輕鏈，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
  65. 如請求項56至64中任一項所述的融合蛋白，其中該PD-1結合部分位於該CD73結合部分的N端或C端。
  66. 如請求項56至65中任一項所述的融合蛋白，其包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包括該PD-1結合部分的VH和該CD73結合部分的VH，該第二多肽鏈包括該CD73結合部分的VL。
  67. 如請求項66所述的融合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該PD-1結合部分的VH位於該CD73結合部分的VH的N端。
  68. 如請求項66所述的融合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該PD-1結合部分的VH位於該CD73結合部分的VH的C端。
  69. 如請求項66至68中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽鏈還包含抗體重鏈恆定區。
  70. 如請求項66至69中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽鏈自N端至C端，依次包含該PD-1結合部分的VH、該CD73結合部分的VH和該抗體重鏈恆定區。
  71. 如請求項66至70中任一項所述的融合蛋白，其中該PD-1結合部分的VH與該CD73結合部分的VH藉由連接肽間接連接。
  72. 如請求項71所述的融合蛋白，其中該連接肽包含SEQ ID NO：334-352中任一項所示的胺基酸序列。
  73. 如請求項66至72中任一項所述的融合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：333所示的胺基酸序列。
  74. 如請求項66至73中任一項所述的融合蛋白，其中該第二多肽鏈還包含抗體輕鏈恆定區。
  75. 如請求項66至74中任一項所述的融合蛋白，其中該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：330所示的胺基酸序列。
  76. 如請求項66至75中任一項所述的融合蛋白，其包括兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。
  77. 一種免疫綴合物，其包含請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或請求項55至76中任一項所述的融合蛋白。
  78. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白和/或如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白。
  79. 一種載體，其包含如請求項78所述的核酸分子。
  80. 一種細胞，其包含如請求項78所述的核酸分子或如請求項79所述的載體。
  81. 一種製備如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白和/或如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白和/或如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白表達的條件下，培養如請求項80所述的細胞。
  82. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體和/或如請求項80所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。
  83. 一種如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療PD-1介導的疾病或病症。
  84. 如請求項83所述的用途，其中該PD-1介導的疾病或病症包括腫瘤、自體免疫疾病或炎症。
  85. 如請求項84所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  86. 如請求項84至85中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
  87. 一種預防、緩解或治療PD-1介導的疾病或病症的方法，該 方法包括向有需要的受試者施用如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物；視需要地，與一種或多種其他腫瘤治療方法聯用。
  88. 如請求項87所述的方法，其中該PD-1介導的疾病或病症包括腫瘤、自體免疫疾病或炎症。
  89. 如請求項88所述的方法，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  90. 如請求項88至89中任一項所述的方法，其中該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和食管癌。
  91. 一種增加受試者中T細胞活性的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或請如求項82所述的醫藥組成物。
  92. 一種試劑盒或給藥裝置，其包含如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物。
  93. 一種抑制PD-L1蛋白或PD-L2蛋白與PD-1蛋白結合的方法，其包含使用如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求 項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物。
  94. 如請求項93所述的方法，其為體外方法。
  95. 如請求項93所述的方法，其為非診斷目的的方法。
  96. 一種檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，其包含使用如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物。
  97. 如請求項96所述的方法，其為體外方法。
  98. 如請求項96所述的方法，其為非診斷目的的方法。
  99. 一種如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項55至76中任一項所述的融合蛋白、如請求項77所述的免疫綴合物、如請求項78所述的核酸分子、如請求項79所述的載體、如請求項80所述的細胞和/或如請求項82所述的醫藥組成物，與一種或多種其他腫瘤治療方法聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤。
  100. 如請求項99所述的用途，其中該一種或多種其他腫瘤治療方法包括化療和/或放療。
  101. 如請求項99至100中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  102. 如請求項99至101中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括 肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
  103. 一種如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，和抗CD73抗體聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤。
  104. 如請求項103所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  105. 如請求項103至104中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括肺癌、肝癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、頭頸鱗癌、淋巴瘤、胃癌和/或食管癌。
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