CN105408357A - 新型抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兼具高亲和力和高效价的新型抗体，特别是针对新型表位的新型抗体。
Description
技术领域
本发明涉及兼具高亲和力与高效价的新型抗体，特别是针对新型表位的新型抗体。
背景技术
本发明涉及组合高亲和力与高效价的新型抗CD3抗体，并且具体来说是特异性识别新型CD3表位的新型抗体。
T细胞受体或TCR是一种见于T淋巴细胞(或T细胞)表面上的负责识别抗原递呈细胞(APC)表面上结合于主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原的分子。TCR与抗原之间的结合具有相对较低亲和力。当TCR与抗原和MHC啮合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、专门化辅助分子以及活化或释放的转录因子介导的生物化学事件而被活化。
TCR与如CD3的其它分子缔合，所述CD3具有在哺乳动物中的三种不同链(γ、δ和ε)以及ζ2(CD247)复合物或ζ/η复合物。这些辅助分子具有跨膜区域，并且对将信号从TCR传送至细胞中至关重要；TCR的细胞质尾部极短，从而使得它不可能参与信号传导。CD3链和ζ链连同TCR一起形成称为T细胞受体复合物的复合物。
CD3ε是在某些T细胞的表面上表达的I型跨膜蛋白质。它参与T细胞受体(TCR)复合物，并且与这个复合物的其它结构域相互作用。这些相互作用伴侣中的一个是CD3γ，其以1:1化学计量结合CD3ε(DelaHera等,J.Exp.Med.1991；173:7-17)。图5显示包括CD3ε/CD3γ的TCR复合物的示意图。据信TCR结合抗原递呈细胞(APC)表面上的MHC-肽复合物以及随后T细胞沿APC移动会导致TCR复合物发生某一旋转，从而导致CD3ε和CD3γ相对于彼此错位，此为高效TCR信号传导以及因此活化T细胞所需。针对CD3ε的某些抗体已被证明会诱导TCR信号传导，而其它抗体不会。TCR活化性抗体通常结合CD3ε上的暴露表位(参见图5，“激动性表位”)，而一些非刺激性抗体已被证明会结合CD3ε与CD3γ之间的界面，或相伴结合CD3ε和CD3γ(参见图5，“拮抗性表位”)，因此可能干扰CD3ε和CD3γ的相对位移(Kim等,JBC.2009；284:31028-31037)。
明确确定的是肽-MHC复合物以低亲和力和快速解离速率结合TCR(Matsui等,Science.1991；254:1788-1791；Weber等,Nature.1992；356:793-796)。已表明这个低亲和力有助于允许少许肽-MHC复合物通过反复结合和解离来连续触发许多TCR(Valitutti等,Nature.1995；375:148-151)。这个连续触发对随时间持续信号传导，从而允许T细胞最终达到活化阈值是关键的(Valitutti等,Immunol.Today.1997；18:299-304；Lanzavecchia等,Cell.1999；96:1-4)。这个见解由以下研究结果支持：当相较于肽-MHC复合物时，高亲和力抗CD3抗体不高效刺激T细胞，因为它们以1:1化学计量触发TCR(Viola等,Science1996；273:104-106)，从而表明低亲和力抗体由于能够反复解离以及再结合CD3ε而可更有效通过TCR信号传导来刺激T细胞。实际上，在直接比较抗CD3ε抗体TR66的三种全都以不同亲和力进行结合的衍生物时，具有中等亲和力的野生型TR66在相较于它的具有较高或较低亲和力的衍生物时，在T细胞活化方面显示最佳功效(Bortoletto等,J.Immuno.2002；32:3102-3107)。因此，处于TR66的KD附近的KD对于刺激T细胞是理想的。已通过使用表面等离子体共振(SPR)技术以及通过流式细胞计量术来测定TR66的亲和力，分别得到平衡解离常数2.6×10-7M(Moore等,Blood.2011；117:4542-4551)和1.0×10-7M(Amann等,CancerRes.2008；68:143-151)。与此一致，已推荐使用亲和力小于10-8M的抗CD3抗体(US7,112,324)，并且已被公开供人治疗使用的T细胞刺激性抗体以在相同范围内的对人CD3ε的亲和力进行结合。因此，根据连续TCR触发的理论，并且与抗CD3ε抗体的公开结果一致，亲和力显著优于公开亲和力的单克隆抗体不被预期是更强力T细胞刺激剂，而是相反被预期是更弱活化剂。
已通过用所谓杂交瘤程序，用T细胞制剂使动物免疫，以及随后分离单克隆抗体来产生一些针对CD3ε的公开抗体。这个方法的弱点在于一方面动物中针对外来(人)T细胞的各种抗原的不选择性免疫应答以及另一方面杂交瘤程序的不良效率使鉴定具有T细胞刺激性活性的单克隆抗体的概率降低，同时因为这些激动性抗体可能占抗CD3ε抗体整体中的少数。用跨越靶向表位的线性肽进行免疫使免疫应答的选择性增加，然而，可产生不识别天然全长CD3ε或可施加非最优TCR刺激的抗体。
对于用其它I型跨膜蛋白质使动物免疫，已特别适用的是使用纯化细胞外结构域(ECD)。然而，CD3ε的纯化ECD倾向于聚集，并且聚集体相较于天然蛋白质可具有改变的结构。此外，这个方法可优先产生结合CD3ε与CD3γ之间的界面的抗体。相比之下，CD3ε和CD3γ的以单链蛋白质形式产生，由可挠性肽连接体连接的复合物可以单体部分形式以及以它的天然构象加以纯化(Kim等,JMB.2000；302:899-916)。然而，用所述CD3ε/γ单链蛋白质使动物免疫可产生相伴结合CD3ε和CD3γ的抗体，此将导致拮抗作用。
过去已开发针对人CD3ε的若干抗体。
单克隆抗体SP34是一种与非人灵长类动物CD3交叉反应，并且也能够诱导人和非人灵长类动物PBMC的细胞增殖的鼠类抗体(Pessano等,TheT3/Tcellreceptorcomplex:antigenicdistinctionbetweenthetwo20-kDT3(T3δandT3ε)subunits.EMBOJ4(1985)337–344)。
转让至Micromet的WO2007/042261和WO2008/119567两件申请公开了针对CD3ε中的分别表位FSEXE和QDGNE的交叉反应性结合剂。在由反对所授予的欧洲专利EP2155783(基于WO2008/119567的区域性时期)的若干异议者提交的异议程序中，提出SP34也结合表位QDGNE。
然而，尽管已进行许多尝试来解决获得具有特别有利性质的抗CD3抗体或一般来说结合分子的问题，但迄今为止这些尝试已取得的成功是有限的。
因此，对开发就获得高效价不具有限制性的高亲和力来说新型CD3结合分子，具体来说新型抗CD3抗体仍然存在巨大未满足的需要。另外，对开发就高亲和力来说新型CD3结合分子，具体来说新型抗CD3抗体仍然存在巨大未满足的需要，所述结合分子与其它物种，具体来说与如食蟹猕猴的非人灵长类动物具有交叉反应性。
迄今为止先前技术尚未实现或建议这个问题的已由本发明提供的解决方案，即CD3结合分子，具体来说通过使兔遗传免疫，以及筛选亲和力成熟的记忆B细胞获得的抗CD3抗体，以及具体来说对新型激动性表位具有特异性的CD3结合分子，具体来说抗CD3抗体。
发明内容
本发明涉及新型分离的CD3结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段，各自包含结合区域，特别是抗原结合区域，其中所述结合分子，具体来说所述抗体或其功能性片段对人CD3的表位，特别是对CD3ε的新型激动性表位具有特异性，其中所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段比先前技术抗体，特别是OKT-3和/或TR66具有更高亲和力，同时展现较高效价。
因此，在第一方面，本发明涉及一种包含对人CD3ε的表位具有特异性的结合区域的分离的结合分子，具体来说涉及一种包含抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合关键的残基。
在第二方面，本发明涉及一种对人CD3的表位具有特异性的新型分离的CD3结合分子，其中所述分离的CD3结合分子结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M，具体来说涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M。
在第三方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少为其1.5倍。
在第四方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示。
在第五方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，导致T细胞的剂量依赖性均质活化状态。
在第六方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，(i)结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M；以及(iia)在交联后，在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍；(iib)导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示；(iic)导致T细胞的剂量依赖性均质活化状态；和/或(iid)对人CD3ε的表位具有特异性，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合关键的残基。
在第七方面，本发明涉及一种与章节[0078]至[0080]、[0083]至[0085]以及[0089]的分离的抗体或其功能性片段结合基本上相同表位的分离的结合分子，特别是分离的抗体或其功能性片段。
在第八方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的结合分子结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段，以及任选药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第九方面，本发明涉及编码本发明的结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段的一种核酸序列或核酸序列的集合。
在第十方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的一种载体或载体的集合。
在第十一方面，本发明涉及一种包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合、或本发明的载体或载体的集合的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
在第十二方面，本发明涉及一种用于产生本发明的结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段的方法，其包括使以下表达的步骤：本发明的核酸序列或核酸序列的集合、本发明的载体或载体的集合、或本发明的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
在第十三方面，本发明涉及一种用于产生本发明的分离的抗体或功能性抗体片段的方法，其包括以下步骤：
a)用CD3ε表达性质粒使兔免疫以在宿主细胞的表面上呈现天然全长CD3ε；
b)使用荧光激活的细胞分选来克隆分离与CD3ε/γ单链相互作用的亲和力成熟的记忆B细胞；
c)在不需要分选克隆的永生化的共培养系统中培养单一分选的B细胞；
d)在细胞基ELISA中筛选B细胞培养物上清液以鉴定结合T细胞表面上包埋在TCR复合物中的天然CD3ε的抗体。
在第十四方面，本发明涉及人CD3ε的一种特定表位，其仅包含CD3ε的不位于CD3ε与CD3γ之间的界面中，并且仍然可在T细胞上表达的天然TCR的情形下由抗体结合的氨基酸残基，由本发明的交联抗体对所述表位的结合在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍；(iib)导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示；和/或(iic)导致T细胞的剂量依赖性均质活化状态。
在第十五方面，本发明涉及一种用于鉴定包含对人CD3ε的新型表位具有特异性的结合区域的结合分子的方法，其包括以下步骤：(a)从一种或多种结合人CD3的分子选择至少一种包含对人CD3ε的表位具有特异性的结合区域的结合分子，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合关键的残基。
附图说明
图1显示来自单克隆兔抗体的联合VH和VLCDR序列的系统发生簇聚；
图2显示纯化单克隆兔抗体与JurkatT细胞的结合。
图3显示由交联抗CD3εmAb对CD69表达的刺激。通过测量CD69表达来评估纯化单克隆兔抗CD3抗体和比较物抗体TR66和OKT-3诱导T细胞活化的潜力。三种不同浓度的交联抗体用于刺激Jurkat细胞，并且24小时后通过流式细胞计量术评估CD69表达。抗体浓度是1.25μg/ml(a)、5.0μg/ml(b)和20μg/ml(c)。
图4显示由交联兔mAb随时间对CD69的刺激。通过测量CD69表达来评估纯化单克隆兔抗CD3抗体诱导T细胞活化的潜力。交联抗体在5.0μg/ml的浓度下用于刺激Jurkat细胞，并且0、4、15、24、48和72小时后通过流式细胞计量术评估CD69表达。对于定性检测CD69表达，测量阴性对照以及测试抗体两者的反映处于几何平均值的信号强度的平均荧光强度(MFI)。计算测试抗体与阴性对照之间的MFI差异(ΔMFI)作为CD69表达量度。
图5显示包括CD3ε/CD3γ的TCR复合物的简化示意图。
图6显示先前技术抗体的表位定位实验的结果：(a)抗体SP34(参见EP2155788的文件历史)的表位定位；(b)Micromet抗体(参见EP2155788/WO2008/119567)的表位定位；图6显示单丙氨酸突变体的结合实验的结果，其中给定突变体的结合降低指示相应野生型氨基酸残基用于抗体结合的相关性(即低棒条＝高度结合相关)。
图7显示本发明的抗体(克隆02、克隆03、克隆06)的通过ELISA进行的表位定位实验的结果；图7显示肽扫描分析中的结合实验结果。用0.1μg/ml各抗体探测源于人CD3ε残基1–15的15聚体线性阵列以研究影响与表位结合的氨基酸特异性，其中各位置被18种氨基酸(除半胱氨酸之外的所有天然氨基酸)取代。给出ELISA中结合信号降低，(a)对于各个别取代，以及(b)各位置历经18种不同取代加以平均化。图7b中的棒条高度指示相应野生型氨基酸残基用于抗体结合的相关性(即大棒条＝高度结合相关)。
图8显示抗CD3×抗IL5RscDb与JurkatT细胞和CHO-IL5R细胞的结合。通过流式细胞计量术来评估A)构建体1、B)构建体2和C)构建体3与JurkatT细胞和CD3阴性Jurkat细胞的结合，以及D)构建体1、E)构建体2和F)构建体3与IL5R-CHO细胞以及野生型CHO细胞的结合。构建体1、构建体2和构建体3具有相同抗IL5R部分，但3个不同抗CD3部分以不同亲和力(1.15×10-8M(对于构建体1)、2.96×10-8M(对于构建体2)和1.23×10-7M(对于构建体3))结合CD3；构建体1＝包含克隆06的人源化可变结构域；构建体2＝包含克隆02的人源化可变结构域；构建体3＝包含克隆03的人源化可变结构域。
图9显示通过scDb使细胞毒性T细胞与靶标细胞交联所达成的对白介素-2分泌的特异性刺激。在CHO-IL5R或CHO细胞存在下使CD8+T细胞与递增浓度的scDb一起孵育。在孵育16小时之后通过ELISA测量培养物上清液中的白介素-2浓度；构建体1＝包含克隆06的人源化可变结构域；构建体2＝包含克隆02的人源化可变结构域；构建体3＝包含克隆03的人源化可变结构域。
图10显示由抗CD3×抗IL5RscDb达成的使人IL5R表达性CHO细胞的特异性溶解。在CHO-IL5R或CHO细胞存在下使CD8+T细胞与递增浓度的scDb一起孵育。用细胞毒性绿染料标记靶标细胞(CHO-IL5R和CHO)，并且在孵育88小时之后通过测量荧光强度来测定细胞溶解；构建体1＝包含克隆06的人源化可变结构域；构建体2＝包含克隆02的人源化可变结构域；构建体3＝包含克隆03的人源化可变结构域。
具体实施方式
相较于先前存在的抗CD3抗体，本发明的特质在于以下事实：包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的新型分离的抗体或其功能性片段比先前技术抗体，特别是OKT-3和/或TR66具有更高亲和力，同时展现较高效价。
因此，在第一方面，本发明涉及一种包含对人CD3ε的表位具有特异性的结合区域的分离的结合分子，具体来说涉及一种包含抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合关键的残基。
在本发明的情形下，氨基酸残基在以下情况时被视为“对结合关键”：当所述关键氨基酸残基被丙氨酸交换时，结合分子与包含所述氨基酸残基位置的肽的结合亲和力降低至与野生型肽序列的结合亲和力的至少50％，具体来说至少25％，更具体来说至少10％，并且最具体来说至少5％，和/或当所述关键氨基酸残基分别被除半胱氨酸之外的各其它天然氨基酸残基交换时，由与包含所述氨基酸残基位置的肽结合产生的如通过实施例7的ELISA测定的平均信号强度降低至与野生型肽序列的结合信号的至少50％，具体来说至少25％，并且最具体来说至少10％。
在特定实施方案中，所述表位进一步包含氨基酸残基E6作为结合中涉及的残基。在特定实施方案中，所述表位进一步包含氨基酸残基E6作为对结合关键的残基。
在本发明的情形下，氨基酸残基在以下情况时被视为“涉及于结合中”：当所述氨基酸残基被丙氨酸交换时，结合分子的结合亲和力降低至至少80％，和/或当所述氨基酸残基分别被除半胱氨酸之外的各其它天然氨基酸残基交换时，由与包含所述氨基酸残基位置的肽结合产生的如通过实施例7的ELISA测定的平均信号强度降低至至少80％。
在特定实施方案中，所述结合分子是抗体或其功能性片段。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述抗体或其功能性片段结合人CD3的单价结合平衡解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M。
在特定实施方案中，所述结合分子是抗体或其功能性片段，其在以IgG形式测试时，在交联后，在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍。
在特定实施方案中，所述结合分子是抗体或其功能性片段，其在以IgG形式测试时，在交联后，导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示。
在特定实施方案中，所述结合分子是抗体或其功能性片段，其在以IgG形式测试时，在交联后，导致的T细胞的剂量依赖性活化状态在相较于由OKT-3或TR66达成的活化时，异质性较小。
在第二方面，本发明涉及一种对人CD3的表位具有特异性的新型分离的CD3结合分子，其中所述分离的CD3结合分子结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M，具体来说涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在第三方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在第四方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在第五方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，导致的T细胞的剂量依赖性活化状态在相较于由OKT-3或TR66达成的活化时，异质性较小。
在特定实施方案中，所述结合分子，具体来说所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在第六方面，本发明涉及一种包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，(i)结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M；以及(iia)在交联后，在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍；(iib)导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示；(iic)导致的T细胞的剂量依赖性活化状态在相较于由OKT-3或TR66达成的活化时，异质性较小；和/或(iid)对人CD3ε的表位具有特异性。为明晰起见，根据这个实施方案，分离的抗体或其功能性片段具有性质(i)以及另外至少一种根据(iia)至(iid)的性质。
在特定所述实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段另外与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在本发明的情形下，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，其定义为属于类别IgG、IgM、IgB、IgA或IgD(或其任何子类)的蛋白质，并且包括所有常规已知抗体及其功能性片段。抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”定义为抗体/免疫球蛋白的保留抗原结合区域的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区域”通常见于抗体的一个或多个高变区，即CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区中；然而，可变“框架”区也可如通过为CDR提供骨架来在抗原结合中起重要作用。优选地，“抗原结合区域”包含至少可变轻(VL)链的氨基酸残基4至103以及可变重(VH)链的氨基酸残基5至109，更优选地，VL的氨基酸残基3至107以及VH的氨基酸残基4至111，并且特别优选的是完整VL和VH链(VL的氨基酸位置1至109以及VH的氨基酸位置1至113；根据WO97/08320编号)。在兔抗体的情况下，CDR区域被指示在表4(参见下文)中。用于本发明中的优选免疫球蛋白类别是IgG。本发明的“功能性片段”包括F(ab')2片段、Fab片段和scFv的结构域。F(ab')2或Fab可被工程改造以使发生在CH1结构域与CL结构域之间的分子间二硫化物相互作用最小，或完全移除所述相互作用。
如本文所用，因为结合特异性不是绝对而是相对性质，所以当结合分子能够区分靶标生物分子与一种或多种参照分子时，所述结合分子“特异于”、“特异性识别”或“特异性结合”所述靶标，如人CD3(或人CD3的表位)。以“特异性结合”的最一般形式来说(并且当不提及确定参照时)，它涉及结合分子能够区分目标靶标生物分子与无关生物分子，如例如根据本领域中已知的特异性测定方法所确定。所述方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试和肽扫描。举例来说，可进行标准ELISA测定。可通过标准显色(例如二级抗体与辣根过氧化物以及四甲基联苯胺与过氧化氢)来进行评分。通过例如在450nm下的光密度来对某些孔中的反应评分。典型本底(＝阴性反应)可为约0.1OD；典型阳性反应可为约1OD。这意味着阳性评分与阴性评分之间的比率可为10倍或高于10倍。通常，通过使用不止单一参照生物分子，而是一组约三种至五种无关生物分子(如奶粉、BSA、转铁蛋白等)来进行结合特异性测定。
在本发明的情形下，术语“约”或“近似”意指在给定值或范围的90％与110％之间。
然而，“特异性结合”也可指结合分子能够区分靶标生物分子与一种或多种用作参照点的密切相关生物分子。另外，“特异性结合”可涉及结合分子能够区分它的靶标抗原的不同部分，例如靶标生物分子的不同结构域、区域或表位，或区分靶标生物分子的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基的链段。
在本发明的情形下，术语“表位”是指给定靶标生物分子的为靶标生物分子与结合分子之间的特异性结合所需的部分。表位可为连续的，即由靶标生物分子中存在的邻近结构元件形成，或为不连续的，即由在靶标生物分子的一级序列中，如在作为靶标的蛋白质的氨基酸序列中在不同位置处，但在靶标生物分子如在体液中采用的三维结构中紧密邻近的结构元件形成。
在一个实施方案中，表位位于人CD3的ε链上。
在某些实施方案中，通过使用表面等离子体共振实验测定呈IgG形式的所述抗体或其功能性片段对人来源的异二聚CD3εγ的纯化细胞外结构域的亲和力来测定与人CD3ε的所述结合。
在一特定实施方案中，如实施例1中所示，使用以下条件：MASS-1SPR仪器(SierraSensors)；捕集抗体：对使用标准胺偶联程序固定在SPR-2亲和传感器芯片(胺，SierraSensors)上的所述IgG的Fc区具有特异性的抗体；在90至2.81nM的范围内两倍连续稀释人异二聚单链CD3εγ细胞外结构域，注射至流动池中持续3分钟，以及使蛋白质从在传感器芯片上捕集的IgG解离5分钟，在各注射循环之后以两次注射10mM甘氨酸-HCl进行表面再生，用MASS-1分析软件(Analyzer,SierraSensors)，使用一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
在特定实施方案中，通过测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段对CD69表达的刺激来测定根据(iia)和/或(iic)的对T细胞活化的所述诱导。
在一特定实施方案中，如实施例3中所示，使用以下条件：在通过添加3倍过量的抗IgG抗体进行先前交联之后，用20μg/ml、5μg/ml和1.25μg/ml呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段刺激Jurkat细胞(100,000个细胞/孔)24小时(对照：OKT3(BioLegend,目录号317302)或TR66(NovusBiologicals,目录号NBP1-97446)，与兔抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,目录号315-005-008)交联)；在刺激之后使用藻红素(PE)标记的对人CD69具有特异性的抗体(BioLegend,目录号310906)进行针对CD69表达的细胞染色，用流式细胞仪(FACSariaIII,BectonDickinson)分析；阴性对照：用所述抗CD69抗体染色的与交联抗体一起孵育的未刺激Jurkat细胞。
在特定实施方案中，通过测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段刺激CD69表达的时程来测定根据(iib)的所述较长持续T细胞活化。
在一特定实施方案中，如实施例3中所示，使用以下条件：用5μg/ml呈IgG形式抗CD3抗体形式的已如[0071]中交联的所述分离的抗体或其功能性片段刺激100,000个Jurkat细胞/孔0小时、4小时、15小时、24小时、48小时和72小时，以及如[0071]中通过流式细胞计量术来分析CD69表达。
在特定实施方案中，通过测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段对IL-2分泌的刺激来测定根据(iia)和/或(iic)的对T细胞活化的所述诱导。
在一特定实施方案中，如实施例4中所示，使用以下条件：使用4种不同测定设置用呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段在5μg/ml的浓度下刺激Jurkat细胞(200,000个细胞/孔)：(a)用呈IgG形式的通过添加3倍更高浓度的抗IgG抗体交联的所述分离的抗体或其功能性片段刺激Jurkat细胞(对照：OKT3(BioLegend,目录号317302)或TR66(NovusBiologicals,目录号NBP1-97446)，与兔抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,目录号315-005-008)交联)；(b)在不存在交联抗体下进行T细胞活化；(c)通过过夜孵育来将所述交联抗体固定在组织培养板上；(d)通过在不存在交联抗体下过夜孵育来将呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段(对照抗体)固定在组织培养板上；在各设置中，在添加之后一小时，用10ng/mlPMA刺激细胞，以及在24、48和72小时之后收集上清液以测量IL-2释放，使用可商购获得的ELISA(BioLegend,目录号431801)进行定量。
在特定实施方案中，抗体或其功能性片段是(i)兔抗体或其功能性片段，或(ii)通过使(i)的兔抗体或其功能性片段人源化获得的抗体或其功能性片段。
用于使兔抗体人源化的方法为任一本领域普通技术人员所熟知(参见例如Borras等,JBiolChem.2010年3月19日；285(12):9054-66；Rader等,TheFASEBJournal,expressarticle10.1096/fj.02-0281fje,2002年10月18日线上发表；Yu等(2010)AHumanizedAnti-VEGFRabbitMonoclonalAntibodyInhibitsAngiogenesisandBlocksTumorGrowthinXenograftModels.PLoSONE5(2):e9072.doi:10.1371/journal.pone.0009072)。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10中存在的一个CDR1、一个CDR2和一个CDR3区的组合，具体来说其中所述VH结构域包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10中存在的框架结构域的框架结构域；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9中存在的一个CDR1、一个CDR2和一个CDR3区的组合，具体来说其中所述VL结构域包含选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9中存在的框架结构域的框架结构域。在特定实施方案中，VL结构域包含选自SEQIDNO:21中存在的框架结构域的框架结构域，并且VH结构域包含选自SEQIDNO:22中存在的框架结构域的框架结构域。在其它特定实施方案中，VL结构域包含是SEQIDNO:21中存在的框架结构域的变体的框架结构域，和/或VH结构域包含是SEQIDNO:22中存在的框架结构域的变体的框架结构域，具体来说是包含一个或多个非人供体氨基酸残基，特别是一个选自SEQIDNO:1至20的序列中存在的供体氨基酸残基，而非SEQIDNO:21和/或22中存在的相应人接受体氨基残基的变体。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10中的一个，更具体来说SEQIDNO:10中存在的CDR1、CDR2和CDR3的组合，具体来说其中所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10中的一个，更具体来说SEQIDNO:10中存在的框架结构域的组合；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9中的一个，更具体来说SEQIDNO:9中存在的CDR1、CDR2和CDR3的组合，具体来说其中所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9中的一个，更具体来说SEQIDNO:9中存在的框架结构域的组合。在特定实施方案中，VL结构域包含选自SEQIDNO:21中存在的框架结构域的框架结构域，并且VH结构域包含选自SEQIDNO:22中存在的框架结构域的框架结构域。在其它特定实施方案中，VL结构域包含是SEQIDNO:21中存在的框架结构域的变体的框架结构域，和/或VH结构域包含是SEQIDNO:22中存在的框架结构域的变体的框架结构域，具体来说是包含一个或多个非人供体氨基酸残基，特别是一个选自SEQIDNO:1至20的序列中存在的供体氨基酸残基，而非SEQIDNO:21和/或22中存在的相应人接受体氨基残基的变体。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10的VH结构域；以及选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9的VL结构域。在其它特定实施方案中，VH结构域是选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10的VH结构域的变体，和/或VL结构域是选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9的VL结构域的变体，具体来说是在框架结构域中和/或在不涉及于抗原结合中的CDR残基中包含一个或多个氨基酸残基交换的变体。
用于鉴定框架区中适于例如被同源氨基酸残基交换的氨基酸残基的方法为本领域普通技术人员所熟知，包括例如分析各组同源序列中高度保守残基(其特定保持恒定)以及多样化序列位置(其可具体来说通过一个天然见于那个位置处的残基加以修饰)的存在。
用于鉴定CDR区中适于例如被同源氨基酸残基交换的氨基酸残基的方法为本领域普通技术人员所熟知，包括例如分析抗体结合结构域的结构，具体来说与抗原的复合物中的抗体结合结构域的结构中抗原相互作用残基(其特定保持恒定)以及不与抗原接触的序列位置(其可被修饰)的存在。
在特定其它实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22的VH结构域；以及选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21的VL结构域。在其它特定实施方案中，VH结构域是选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22的VH结构域的变体，和/或VL结构域是选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21的VL结构域的变体，具体来说是在框架结构域中和/或在不涉及于抗原结合中的CDR残基中包含一个或多个氨基酸残基交换的变体。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:1/SEQIDNO:2；SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；SEQIDNO:7/SEQIDNO:8、SEQIDNO:9/SEQIDNO:10、SEQIDNO:11/SEQIDNO:12、SEQIDNO:13/SEQIDNO:14、SEQIDNO:15/SEQIDNO:16、SEQIDNO:17/SEQIDNO:18、和SEQIDNO:19/SEQIDNO:20，具体来说SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；和SEQIDNO:9/SEQIDNO:10，更具体来说SEQIDNO:9/SEQIDNO:10的VH/VL结构域组合。在特定其它实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:1/SEQIDNO:2；SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；SEQIDNO:7/SEQIDNO:8、SEQIDNO:9/SEQIDNO:10、SEQIDNO:11/SEQIDNO:12、SEQIDNO:13/SEQIDNO:14、SEQIDNO:15/SEQIDNO:16、SEQIDNO:17/SEQIDNO:18、和SEQIDNO:19/SEQIDNO:20，具体来说SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；和SEQIDNO:9/SEQIDNO:10，更具体来说SEQIDNO:9/SEQIDNO:10的VH/VL结构域组合的变体，其中在所述变体中，至少VL或VH结构域是所列VL/VH结构域的变体。
在一特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含VH/VL结构域组合SEQIDNO:21/SEQIDNO:22。在另一实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含含有VH/VL结构域组合SEQIDNO:21/SEQIDNO:22的抗原结合区域的变体，其中在所述变体中，至少VL或VH结构域是所列VL/VH结构域的变体。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含是本文公开的序列的变体的抗原结合区域。因此，本发明包括具有包含SEQIDNO:1至20的分离的抗体或其功能性片段的一种或多种性质，具体来说章节[0042]、[0047]以及[0054]至[0061]中定义的性质的分离的抗体或其功能性片段，其包含以下重链氨基酸序列：在CDR区中与包含在SEQIDNO:2、4、6、8；10、12、14、16、18或20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10中的CDR区具有至少60序列同一性百分比，具体来说至少70序列同一性百分比，更具体来说至少80序列同一性百分比，并且最具体来说至少90序列同一性百分比，和/或在CDR区中与包含在SEQIDNO:2、4、6、8；10、12、14、16、18或20，具体来说SEQIDNO:4、6和10，更具体来说SEQIDNO:10中的CDR区具有至少80序列同源性百分比，更具体来说至少90序列同源性百分比，最具体来说至少95序列同源性百分比，和/或包含以下轻链氨基酸序列：在CDR区中与包含在SEQIDNO:1、3、5、7；9、11、13、15、17或19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9中的CDR区具有至少60序列同一性百分比，具体来说至少70序列同一性百分比，更具体来说至少80序列同一性百分比，并且最具体来说至少90序列同一性百分比，和/或在CDR区中与包含在SEQIDNO:1、3、5、7；9、11、13、15、17或19，具体来说SEQIDNO:3、5和9，更具体来说SEQIDNO:9中的CDR区具有至少80序列同源性百分比，更具体来说至少90序列同源性百分比，最具体来说至少95序列同源性百分比。用于例如通过使用如BLOSUM(Henikoff,S.和Henikoff,J.G.(1992).Aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,10915-10919)的同源性搜索矩阵来确定序列同源性的方法，以及用于根据同源性来将序列分组的方法为本领域普通技术人员所熟知。
在特定实施方案中，所述变体包含含有根据SEQIDNO:19的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3序列集合的VL序列和/或含有根据SEQIDNO:20的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3序列集合的VH序列，其中在各情况下，选择显示在SEQIDNO:19和/或20中的每个简并位置“X”处的一个指示氨基酸残基。举例来说，在SEQIDNO:19的CDR1中显示为“X(S/N)”的各位置的情况下，任何所述变体在相应位置处包含氨基酸残基“S”或氨基酸残基“N”。
在特定其它实施方案中，所述变体包含根据序列SEQIDNO:19的VL序列和/或根据序列SEQIDNO:20的VH序列，其中在各情况下，选择显示在SEQIDNO:19和/或20中的每个简并位置“X”处的一个指示氨基酸残基。举例来说，在SEQIDNO:19的框架1中显示为“X(P/A)”的位置的情况下，任何所述变体在那个位置处包含氨基酸残基“P”或氨基酸残基“A”。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段包含通过使章节[0078]至[0080]以及[0083]至[0085]的抗原结合区域人源化获得的抗原结合区域。
在第七方面，本发明涉及一种与章节[0078]至[0080]、[0083]至[0085]以及[0089]的分离的抗体或其功能性片段结合基本上相同表位的分离的抗体或其功能性片段。
在特定实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
在第八方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的结合分子结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段，以及任选药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第九方面，本发明涉及编码本发明的结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段的一种核酸序列或核酸序列的集合。
在第十方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的一种载体或载体的集合。
在第十一方面，本发明涉及一种包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合、或本发明的载体或载体的集合的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
在第十二方面，本发明涉及一种用于产生本发明的结合分子，具体来说分离的抗体或其功能性片段的方法，其包括使以下表达的步骤：本发明的核酸序列或核酸序列的集合、本发明的载体或载体的集合、或本发明的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
在第十三方面，本发明涉及一种用于产生本发明的分离的抗体或功能性抗体片段的方法，其包括以下步骤：
a)用CD3ε表达性质粒使兔免疫以在宿主细胞的表面上呈现天然全长CD3ε；
b)优选使用荧光激活的细胞分选来克隆分离与CD3ε/γ单链相互作用的亲和力成熟的记忆B细胞；
c)优选在不需要分选克隆的永生化的共培养系统中培养单一分选B细胞；
d)具体来说通过细胞基ELISA筛选B细胞培养物上清液以鉴定结合T细胞表面上包埋在TCR复合物中的天然CD3ε的抗体。
在第十四方面，本发明涉及人CD3ε的一种特定表位，其仅包含CD3ε的不位于CD3ε与CD3γ之间的界面中，并且仍然可在T细胞上表达的天然TCR的情形下由抗体结合的氨基酸残基，由本发明的交联抗体对所述表位的结合在IgG浓度1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化比抗体OKT-3或TR66强烈至少1.5倍；(iib)导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，如通过在IgG浓度1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大所指示；和/或(iic)导致T细胞的剂量依赖性均质活化状态。
在第十五方面，本发明涉及一种用于鉴定包含对人CD3ε的新型表位具有特异性的结合区域的结合分子的方法，其包括以下步骤：(a)从一种或多种结合人CD3的分子选择至少一种包含对人CD3ε的表位具有特异性的结合区域的结合分子，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合关键的残基。
在特定实施方案中，通过使用跨越CD3ε的N末端部分的重叠肽进行表位定位以鉴定相应CD3ε结合剂的关键线性结合区域来进行步骤(a)。在步骤(b)中，产生这个线性结合区域的衍生物，其中个别地在各位置处，野生型氨基酸被(i)丙氨酸，或(ii)任何天然氨基酸(除半胱氨酸之外)分别交换。通过使用实施例7和8中所述的ELISA来筛选所得肽文库以评估各位置的结合相关性。具体来说，使用选自以下清单的一组肽：
实施例
以下实施例说明本发明而不限制它的范围。
本文所述的用于本发明的方法是一种用以增加鉴定T细胞刺激性抗体的成功概率的逐步程序。这个方法涵盖以下程序：
a)使用兔作为免疫宿主，因为相较于啮齿动物，兔抗体通常显示更大克隆多样性。因此，使用兔会增加鉴定针对特定表位的结合剂的概率，并且增强鉴定新型表位的概率，
b)用CD3ε表达性质粒使兔免疫以在宿主细胞的表面上呈现天然全长CD3ε。这个方法导致针对全长CD3ε的强烈免疫应答，并且避免产生相伴结合CD3ε和CD3γ的抗体；
c)使用荧光激活的细胞分选来克隆分离与CD3ε/γ单链相互作用的亲和力成熟的记忆B细胞。这个程序避免选择结合CD3ε与CD3γ之间的界面的抗体，由此增加选择的特异性。
d)在不需要分选克隆的永生化的共培养系统中培养单一分选B细胞，由此克服杂交瘤程序的效率不良。
e)在细胞基ELISA中筛选B细胞培养物上清液以鉴定结合T细胞表面上包埋在TCR复合物中的天然CD3ε的抗体。
实施例1：鉴定和选择结合CD3上的T细胞刺激性表位的单克隆抗体
使用荧光激活的细胞分选从一只免疫兔分离结合CD3ε的兔记忆B细胞。为排除结合CD3ε和CD3γ的界面的抗体，使用藻红素(PE)标记的由CD3ε和CD3γ的通过可挠性肽连接体接合的细胞外结构域组成的单链蛋白质构建体(scCD3γε)。总计，将4,270个结合PE-scCD3γε的记忆B细胞个别地分选至96孔培养板中，并且在其它地方(Lightwood等,JIM2006；316:133-143)公开的条件下培养。首先通过ELISA，针对与scCD3γε结合筛选所有培养物上清液，此举产生441个命中物。在第二筛选中，测试来自第一筛选的阳性上清液结合Jurkat细胞表面上包埋在TCR复合物中的天然CD3ε的能力(参见以下方法)。总计22个命中物显示结合CD3ε表达性Jurkat细胞，但不结合cd3-/-Jurkat细胞。使用SPR测量22个命中物对来自人和食蟹猕猴来源的异二聚CD3εγ的纯化细胞外结构域的亲和力。对人CD3εγ的亲和力通过在0.16至9.28nM的范围内的KD来表示(数据未显示)。根据SPR，一个筛选命中物不显示结合，并且因此不被考虑供进一步分析。
通过RT-PCR来撷取剩余21个克隆的编码可变结构域的DNA序列，并且进行DNA测序并产生18个独立克隆。在哺乳动物表达系统中重组产生这些兔IgG，并且在对来自人和食蟹猕猴来源的scCD3γε的亲和力以及它们结合Jurkat细胞的能力方面加以表征。对这18个序列的系统发生序列分析揭示两个明确不同于彼此的主要簇，但在两个簇内存在显著同源性(图1)。因为来自一个簇的所有代表物都假定源于相同抗原结合母体B细胞，所以它们可能结合相同表位。因此，为涵盖最大多样性，从各簇选择最不同的克隆，从而产生12个克隆，其被进一步测试它们结合以及活化T细胞的能力。在细胞基ELISA中评估T细胞结合，并且通过FACS测量CD69的表达来定量T细胞刺激。如实施例2至4中所示进一步表征代表性抗体。
实施例2：纯化单克隆兔抗CD3ε抗体与JurkatT细胞以及与食蟹猕猴HSC-FT细胞的结 合
如方法章节中所述，使Jurkat人T细胞和食蟹猕猴HSC-FT细胞与递增浓度的纯化单克隆兔抗体一起孵育。就所有测试抗体来说，与人CD3ε的特异性结合随抗体浓度增加而增加(图2)。所有抗体的指示与Jurkat人T细胞的半数最大结合的EC50值都极其类似，在0.28至1.87nM的范围内(参见表1，其显示纯化单克隆兔抗体的药力学特征。对于定性检测CD69表达，测量阴性对照以及测试抗体两者的反映处于几何平均值的信号强度的平均荧光强度(MFI)。通过用测试抗体的MFI除以阴性对照抗体的MFI来计算标准化MFI。)。显示3个抗体(克隆06、克隆02、克隆03)结合食蟹猕猴HSC-FT细胞的EC50值(参见表2C)。
表2A：
| 克隆ID | KD(人)/KD(食蟹猕猴) |
| 克隆01 | 3 |
| 克隆02 | 13 |
| 克隆03 | 13 |
| 克隆04 | 36 |
| 克隆06 | 4 |
| 克隆09 | 10 |
| 克隆10 | 7 |
| 克隆11 | 3 |
| 克隆12 | 20 |
表2B：
表2C：兔IgG与细胞表面的结合
实施例3：纯化单克隆兔抗CD3ε抗体刺激T细胞上的CD69表达的能力
将如通过测量CD69表达(参见方法)评估的纯化单克隆兔抗CD3抗体诱导T细胞活化的潜力与公开抗体OKT-3和TR66进行比较。在第一方法中，三种不同浓度的交联抗体用于刺激Jurkat细胞，并且24小时后通过流式细胞计量术评估CD69表达。用在1.25μg/ml下的所有测试抗体都观察到CD69表达显著增加(图3和表1)。引起关注的是所有测试兔抗体都显示对CD69表达的刺激强于公开的OKT-3和TR66。这是出乎意料的，因为兔抗体结合人scCD3γε的亲和力比OKT-3或TR66高得多，根据先前技术，此应负面影响它们连续触发以及由此增强TCR信号传导的能力。随着兔抗体的浓度增加，CD69表达水平进一步增加，而随着OKT-3或TR66的浓度增加，CD69表达仅存在中度增加。此外，在兔抗体的情况下，直方图中的峰值变窄，从而指示T细胞的群体更均质，全都在类似高水平下表达CD69。相比之下，用OKT-3或TR66在各测试浓度下刺激的T细胞群体中的CD69表达水平存在广泛分布。视剂量而定导致不同以及均质T细胞活化水平的抗体允许进行更佳剂量调整以优化功效以及控制副作用。
在第二方法中，分析在通过抗CD3抗体刺激的不同时间点之后的T细胞活化。通过交联抗体刺激Jurkat细胞，并且在0、4、15、24、48和72小时之后如上所述评估CD69表达(图4)。
实施例4：抗CD3×抗IL5R抗体与JurkatT细胞和CHO-IL5R细胞的结合
为显示激动性抗CD3抗体的益处，通过标准方法来构建一组双特异性抗CD3×IL5R单链双功能抗体(scDb)(方法/数据未显示；构建体1＝包含克隆06的人源化可变结构域；构建体2＝包含克隆02的人源化可变结构域；构建体3＝包含克隆03的人源化可变结构域)。
如方法章节中所述，使JurkatT细胞和IL5R表达性CHO细胞(CHO-IL5R)与1μg/ml和10μg/mlscDb一起孵育。就所有测试scDb来说，检测到与CD3ε和IL5R表达性细胞系特异性结合，但并不不特异性结合对照细胞系。测试三种含有相同抗IL5R部分，而抗CD3部分不同的不同scDb(构建体1至3)与表达IL5R或CD3ε的细胞的特异性结合。然而，抗CD3部分以可变亲和力结合重叠表位(表1和3以及图7)。如所预期，所有测试scDb与CHO-IL5R细胞的结合都是类似的(图8)。相比之下，与JurkatT细胞的结合随CD3ε结合结构域的亲和力降低而降低。在最高测试浓度下未检测到低亲和力结合剂构建体3与JurkatT细胞结合(图8)。
实施例5：双特异性抗CD3×IL5RscDb刺激IL-2从T细胞分泌的潜力
可通过测量由从人血液纯化的细胞毒性T细胞达成的IL-2分泌(参见方法)来评估scDb结合于靶标细胞以诱导T细胞活化的潜力。使不同scDb与CD8+细胞毒性T细胞一起在靶标表达性CHO-IL5R细胞存在下，在效应物:靶标细胞比率10:1下孵育，并且在孵育16小时之后分析IL-2分泌。在CHO-IL5R细胞存在下观察到对IL-2分泌的剂量依赖性刺激，而在野生型CHO细胞存在下基本上未观察到IL-2分泌(参见表3中以及图9中的代表性数据)。因此，在靶标表达性细胞存在下，T细胞活化被明确诱导。此外，诱导IL-2分泌的潜力与对重组产生的CD3εγ的结合亲和力以及结合T细胞的能力相关联。与亲和力分析一致，作为具有最高亲和力的结合剂的构建体1是比构建体2更强力的IL-2分泌诱导剂，而用低亲和力scDb构建体3未观察到IL-2分泌(图9)。
表3：IL5R×CD3scDb形式中的人源化抗CD3ε结构域
实施例6：scDb介导的由细胞毒性T细胞达成的特异性靶标细胞溶解
在孵育88小时之后用CellToxTM绿色细胞毒性测定(参见方法)分析由抗CD3×IL5RscDb介导的由细胞毒性T细胞对靶标细胞的特异性溶解。类似于以上对于T细胞活化讨论的结果，在CHO-IL5R细胞存在下观察到构建体1和构建体2的剂量依赖性靶标细胞溶解，而在野生型CHO细胞存在下未观察到溶解(参见表3中以及图10中构建体1至3的代表性数据)。与以上提及的结果一致，相较于较低亲和力scDb，以高亲和力结合CD3ε的scDb显示更强力溶解。未观察到低亲和力scDb构建体3的靶标细胞溶解。我们进一步测试含有源于也与食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性的不同簇(簇1)抗体的另一CD3ε结合克隆(克隆05)的人源化变体的scDb用以溶解靶标细胞的效价。克隆05相较于克隆06以甚至更高亲和力(兔IgG及其人源化衍生物的KD分别＝8.45×10-10M和4.29×10-9M)进行结合，但重要的是，与来自簇2的结合剂(克隆06、克隆02和克隆03)结合不同表位。引起关注的是，我们发现相应抗IL5R×CD3scDb显示的用以诱导CHO-IL5R靶标细胞的T细胞依赖性溶解的效价(EC50＝9.9×10-9M)弱于含有人源化克隆06的scDb，从而表明克隆06的表位特别充分适于重定向细胞毒性T细胞以溶解靶标细胞。来自簇2的交联亲本IgG相对于OKT-3和TR66具有优越效价(实施例3)确认即使在亲和力高于以scDb形式测试的亲和力下，也未发现在其之后效价将降低的亲和力最优值。
实施例7：表位定位和精细定位
基本上如所述进行表位定位和精细定位(Timmerman等,FunctionalreconstructionandsyntheticmimicryofaconformationalepitopeusingCLIPSTMtechnology.J.Mol.Recognit.20(2007)283-99；Slootstra等,Structuralaspectsofantibodyantigeninteractionrevealedthroughsmallrandompeptidelibraries,MolecularDiversity1:87(1996)96)。简要来说，CLIPS技术在结构上将肽固定成确定三维结构。这产生甚至最复杂结合位点的功能性模拟物。CLIPS技术目前常规用于将肽文库塑造成单环、双环或三环结构以及薄片和螺旋样折叠。
CLIPS文库筛选以使用组合矩阵设计将靶标蛋白质转换成多达10,000个重叠肽构建体的文库起始。在固体载体上，合成线性肽的矩阵，所述肽随后被塑造成在空间上确定的CLIPS构建体。表示不连续表位的呈正确构象的两个部分的构建体以被检测和定量的高亲和力结合抗体。呈现不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含有表位的构建体完全不结合。亲和力信息在迭代筛选中用于详细确定表位的序列和构象。
分析以下克隆：克隆02、克隆03、克隆04、克隆06和克隆10。使用CD3的以下靶标序列(N末端序列)
人CD3：
2DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDD51
52KNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENC101
102MEMD105
食蟹猕猴CD3：
2DGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDR51
52LFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMD96
序列比对
CLUSTAL2.1多重序列比对：
肽的合成
为重建靶标分子的不连续表位，合成结构化肽的文库。这是使用所谓“在骨架上化学连接肽”(CLIPS)技术来进行的。CLIPS技术允许使肽结构化成为单环、双环、三环、薄片样折叠、螺旋样折叠及其组合。使CLIPS模板偶联于半胱氨酸残基。使肽中的多个半胱氨酸的侧链偶联于一个或两个CLIPS模板。举例来说，将0.5mMT2CLIPS模板1,3双(溴甲基)苯的溶液溶解于碳酸氢铵(20mM，pH7.9)/乙腈(1:1(v/v))中。将这个溶液添加于肽阵列上。CLIPS模板将结合如肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中存在的两个半胱氨酸的侧链。在完全覆盖于溶液中的情况下，将肽阵列于溶液中温和振荡30至60分钟。最后，用过量H2O充分洗涤肽阵列，并且在70℃下在于PBS中含有1％SDS/0.1％β巯基乙醇的破坏缓冲液(pH7.2)中超声处理30分钟，随后在H2O中再超声处理45分钟。以类似方式制备T3CLIPS携带性肽，但现时使用三个半胱氨酸。
ELISA筛选
通过与初级抗体溶液一起孵育(在4℃下过夜)来达成抗体与各阵列结合。在洗涤之后，使肽阵列与1/1000稀释的抗体过氧化物酶缀合物(SBA,目录号201005)一起在25℃下孵育1小时。在洗涤之后，添加过氧化物酶底物2,2’连氮基二3乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。在1小时之后，测量显色。用电荷耦合器件(CCD)照相机和图像处理系统定量显色。
肽的设计
根据以下设计，如上所述合成化学合成的CLIPS肽。
设置1
模拟物型线性肽：人序列与食蟹猕猴序列两者的双重组线性肽。长度是15个残基，其中重叠14个残基。两组的特征在于双重丙氨酸突变(以灰色显示)。
序列(显示前10个人序列)
设置2
具有添加的电荷的模拟物型线性肽
描述对照组具有为一些抗体与肽阵列表面强烈相互作用所需的添加的电荷
序列(显示前10个人序列)
设置3
模拟物型构象肽
描述肽序列类似于设置1，但被约束成CLIPS构象环。
序列(显示前10个未修饰的人序列)
设置4
模拟物型CLIPS构象肽
描述20聚体CLIPS构象肽的重叠设置
序列(显示前10个人序列)
设置5
模拟物型CLIPS不连续矩阵肽
描述成对约束成双环CLIPS结构的13聚体肽的组合设置。根据成对比对来将人和食蟹猕猴肽排序以使技术性变化最小。
序列(显示前10个)
鉴定推定表位
一般来说，所有5个抗体都显示极其类似的结合特征。所有结合都发生在人CDD3ε的N末端上(数据未显示)。考虑到来自约束肽和非约束肽的结合强度和观察结果，最可能的是所有抗体都主要结合线性表位，因为：
·观察到结合仅针对N末端序列
·损失D2或G3不强烈降低结合
·损失2DGN4完全消除结合。
结论
分析鉴定出所有5个测试抗体的结合区域。发现所有抗体都结合N末端上似乎线性表位。发现所有抗体都结合强烈依赖于2DGN4来达成结合的类似表位。
实施例8：表位精细定位
方法
用抗体探测源于人和食蟹猕猴CD3ε的15聚体线性阵列，即残基2–16以及5–20，其中各位置被18种氨基酸(除半胱氨酸之外的所有天然氨基酸)取代；并且查明影响结合的特异性。
结果
所有抗体都以绝对需要N4以及涉及E6的方式结合N末端，并且共有显著类似性。尽管邻近于核心表位的序列存在较小差异，但所有抗体都结合人CD3ε形式与食蟹猕猴CD3ε形式两者。
靶标蛋白质
初始定位将CD3ε的N末端上的线性链段鉴定为所有测试抗体的核心表位。以下序列的残基2–20用于设计线性15聚体肽的完全取代文库。
方法
肽的合成
通过标准Fmoc合成将线性肽合成于高感测表面的水凝胶上。在脱保护以及洗涤之后，于超声浴中用专有洗涤缓冲液充分洗涤卡片。
ELISA筛选
通过ELISA来测试抗体与各合成肽的结合。使肽阵列与初级抗体溶液一起孵育(在4℃下过夜)。在洗涤之后，使肽阵列与1/1000稀释的抗体过氧化物酶缀合物(SBA,目录号2010-05)一起在25℃下孵育1小时。在洗涤之后，添加过氧化物酶底物2,2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。在1小时之后，测量显色。用电荷耦合器件(CCD)照相机和图像处理系统定量显色。
肽的设计
根据以下设计合成(也参见方法章节)化学合成的CLIPS肽。
设置1
模拟物型
线性肽
描述
线性15聚体肽源于人CD3ε残基2–16。在各肽中，一个残基被所有天然存在的氨基酸(除半胱氨酸之外)替换，从而产生饱和诱变文库。
序列(显示前10个)
AGNEEMGGITQTPYK
DGNEEMGGITQTPYK
GGNEEMGGITQTPYK
HGNEEMGGITQTPYK
LGNEEMGGITQTPYK
MGNEEMGGITQTPYK
NGNEEMGGITQTPYK
PGNEEMGGITQTPYK
QGNEEMGGITQTPYK
RGNEEMGGITQTPYK
设置2
模拟物型：线性肽
描述
线性15聚体肽源于食蟹猕猴CD3ε残基2-16。在各肽中，一个残基被所有天然存在的氨基酸(除半胱氨酸之外)替换，从而产生饱和诱变文库。
序列(显示前10个)
AGNEEMGSITQTPYQ
DGNEEMGSITQTPYQ
GGNEEMGSITQTPYQ
HGNEEMGSITQTPYQ
LGNEEMGSITQTPYQ
MGNEEMGSITQTPYQ
NGNEEMGSITQTPYQ
PGNEEMGSITQTPYQ
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设置3
模拟物型：线性肽
描述
线性15聚体肽源于人CD3ε残基5–20。在各肽中，一个残基被所有天然存在的氨基酸(除半胱氨酸之外)替换，从而产生饱和诱变文库。
序列(显示前10个)
设置4
模拟物型
线性肽
描述
线性15聚体肽源于食蟹猕猴CD3ε残基5–20。在各肽中，一个残基被所有天然存在的氨基酸(除半胱氨酸之外)替换，从而产生饱和诱变文库。
序列(显示前10个)
AEMGSITQTPYQVSI
DEMGSITQTPYQVSI
GEMGSITQTPYQVSI
HEMGSITQTPYQVSI
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样品比较
所有5个抗体都以极其类似方式，通过绝对需要N4(仅将被组氨酸代替)以及极大偏好E6来结合源于人和食蟹猕猴CD3εN末端变体的线性肽，其中容许E6的有限取代，然而，似乎谷氨酸是那个位置处的最优选残基。无抗体结合于跨越残基5-20的肽。在这个5抗体组内，3个抗体(克隆2、克隆3和克隆4)比其它2者(克隆6和克隆10)对食蟹猕猴序列中的突变更敏感，因为前述3抗体组也对G3、E5和/或G8的替换更敏感。这个观察结果与如通过SPR测定的对人和食蟹猕猴蛋白质形式的亲和力差异一致(参见表1)。
结论
分析精细定位5个抗体的表位，所述抗体以绝对需要N4和E6的方式结合N末端，并且共有显著类似性。尽管邻近于核心表位的序列存在较小差异，但所有抗体都结合人CD3ε形式与食蟹猕猴CD3ε形式两者。
一般性方法：
一级序列分析
比对相应重链和轻链可变结构域(VL和VH)的所得序列信息，并且根据序列同源性加以分组。分析各组兔可变结构域以鉴定独特克隆和独特CDR集合。基于两种结构域的联合氨基酸序列进行VL和VH结构域的组合比对以鉴定独特克隆。除比对可变结构域之外，在不同克隆之间比较各兔IgG克隆的六个互补决定区(CDR)的序列集合以鉴定独特CDR集合。使用多重比对工具COBALT比对这些独特CDR集合，并且用相邻接合算法(NeighborJoiningalgorithm)产生系统发生树。基于各克隆的联合CDR序列的序列同源性来将CDR集合分组，并且基于序列同源性和同一性来确定簇阈值。基于个别兔IgG克隆的筛选测定结果和簇亲缘关系，选择候选物供进一步分析。选择来自不同簇的克隆，旨在以高序列多样性继续前进。
兔IgG制造
通过RT-PCR扩增来克隆兔IgG可变结构域，并且连接至适于短暂异源性表达的含有前导序列和相应恒定结构域的哺乳动物表达载体，例如pFUSE-rIgG载体(Invivogen)中。通过用FreeStyleTMMAX系统使编码重链和轻链的载体共转染于CHOS细胞中来进行功能性rIgG的短暂表达。在培养数天之后，回收抗体分泌细胞的上清液以进行纯化。随后，通过磁性蛋白质A珠粒(GEHealthcare)来亲和纯化分泌的兔IgG。洗涤IgG装载的珠粒，并且通过pH变换来洗脱纯化抗体。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、在280nm下的UV吸光度以及尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)来分析洗脱份以确保所有样品具有类似品质。
工程改造和表征人源化单链Fv片段和IgG
兔抗体克隆的人源化包括将兔CDR转移于Numab的专有Vκ1/VH3型scFv接受体框架上。在这个方法中，如其它地方(Borras,L.等2010.JBC；285:9054-9066)所述鉴定兔抗体供体序列上给定兔克隆的六个CDR区的氨基酸序列，并且移植入Numab接受体骨架序列中。在例如兔克隆06的情况下，所得人源化克隆06的VL和VH序列分别显示于SEQIDNO:21和22中。
可类似于[00129]中所述的方法制备人源化IgG构建体。
用于确定单克隆抗CD3抗体的结合动力学和物种交叉反应性的SPR测定
通过使用MASS-1SPR仪器(SierraSensors)进行表面等离子体共振(SPR)来测量单克隆兔抗CD3抗体的结合亲和力。对于亲和力测量，使用标准胺偶联程序将对兔IgG的Fc区具有特异性的抗体(BethylLaboratories,目录号A120-111A)固定在传感器芯片(SPR-2亲和力传感器，胺，SierraSensors)上。通过固定的抗兔IgG抗体来捕集兔单克隆抗体。将在90至2.81nM的范围内的两倍连续稀释的人异二聚单链CD3εγ细胞外结构域(内部产生)注射至流动池中持续3分钟，并且允许蛋白质从传感器芯片上捕集的IgG进行解离5分钟。在各注射循环之后，以两次注射10mM甘氨酸-HCl来再生表面。用MASS-1分析软件(Analyzer，SierraSensors)，使用一对一朗缪尔结合模型计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
确定物种交叉反应性
使用相同测定设置测量与食蟹猕猴单链CD3εγ细胞外结构域的物种交叉反应性。将在90至0.12nM的范围内的三倍连续稀释的食蟹猕猴异二聚CD3εγ细胞外结构域(内部产生)注射至流动池中持续3分钟，并且允许蛋白质从传感器芯片上捕集的IgG进行解离5分钟。在各注射循环之后，以两次注射10mM甘氨酸-HCl来再生表面。用MASS-1分析软件(Analyzer，SierraSensors)，使用一对一朗缪尔结合模型计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
用于测定单克隆抗CD3抗体与在T细胞的细胞表面上表达的CD3ε的结合的细胞基ELISA
将作为人T细胞系的Jurkat细胞(克隆E6-1)于100μl含有10％FBS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在300,000个细胞/孔下接种在圆底96孔板中。添加于100μl含有10％FBS的PBS中在90nM至0.0058nM的范围内五倍连续稀释的抗CD3兔单克隆抗体至各板中。通过特异性识别IgG亚型的兔抗体的Fc部分的二级抗体(JacksonImmunoResearch,目录号111-035-046)来检测兔抗体与在Jurkat细胞的表面上表达的CD3ε的结合。这个二级抗体被连接于酶辣根过氧化物酶(HRP)。通过添加TMB底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，KPL,目录号53-00-00)来测量HRP活性，所述底物在比色反应中被HRP处理。处理的底物的颜色强度与结合于Jurkat细胞的抗CD3抗体的量成正比。为定量颜色强度，使用微量滴定板读取器(Infinity读取器M200Pro,Tecan)测量在相应波长下的吸光度(光密度)。
为修正抗体与Jurkat细胞的细胞表面上呈现的未知组分的不特异性结合，使用JurkatT细胞系的CD3ε缺乏性衍生物(J.RT3-T3.5)。如上对于Jurkat细胞所述来测量单克隆抗体与这个细胞系的结合。对于定量与Jurkat细胞的特异性结合，从与Jurkat细胞结合的光密度中减去与阴性对照结合的光密度。利用Softmax数据分析软件(MolecularDevices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析数据，并且由剂量应答曲线获得为达到50％结合所需的抗CD3抗体的摩尔浓度(EC50，标准曲线的中间OD)。
确定物种交叉反应性
使用相同测定设置来测量与HSC-FT细胞的细胞表面上呈现的食蟹猕猴CD3的结合。将作为食蟹猕猴T细胞系的HSC-F细胞于100μl含有10％FBS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在300,000个细胞/孔下接种在圆底96孔板中。添加于100μl含有10％FBS的PBS中在18nM至0.0058nM的范围内五倍连续稀释的抗CD3兔单克隆抗体至各板中。通过特异性识别IgG亚型的兔抗体的Fc部分的二级抗体(JacksonImmunoResearch,目录号111-035-046)来检测兔抗体与在HSC-F细胞的表面上表达的食蟹猕猴CD3ε的结合。这个二级抗体被连接于酶辣根过氧化物酶(HRP)。如上所述测量HRP活性。
为修正抗体与细胞表面上呈现的未知组分的不特异性结合，使用CD3ε阴性人B成淋巴细胞细胞系(DB)。如上所述测量单克隆抗体与这个细胞系的结合。对于定量与HSC-F细胞的特异性结合，从与HSC-F细胞结合的光密度中减去与阴性对照结合的光密度。利用Softmax数据分析软件(MolecularDevices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析数据，并且由剂量应答曲线获得为达到50％结合所需的抗CD3抗体的摩尔浓度(EC50，标准曲线的中间OD)。
由单克隆抗CD3抗体达成的T细胞活化：诱导CD69表达
通过在其它地方(Gil等,Cell.2002；109:901-912)所述，测量对Jurkat细胞中CD69表达(一种早期T细胞活化标志物)的诱导来评估单克隆兔抗CD3抗体诱导T细胞活化的潜力。对于剂量-应答测定，用20μg/ml、5μg/ml和1.25μg/ml抗CD3抗体刺激Jurkat细胞(100,000个细胞/孔)24小时。在添加抗CD3单克隆抗体至Jurkat细胞中之前，当使用OKT3(BioLegend,目录号317302)或TR66(NovusBiologicals,目录号NBP1-97446)时，通过分别添加3倍过量的山羊抗兔IgG抗体(BethylLaboratories,目录号A120-111A)和兔抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,目录号315-005-008)来使抗CD3抗体交联。在刺激之后，使用藻红素(PE)标记的对人CD69具有特异性的抗体(BioLegend,目录号310906)针对CD69表达使细胞染色，接着用流式细胞仪(FACSariaIII,BectonDickinson)分析。作为阴性对照，与交联抗体一起孵育的未刺激的Jurkat细胞用上述抗CD69抗体染色。以如上所述的类似测定设置来评估T细胞随时间的活化。用5μg/ml已如上所述交联的抗CD3抗体刺激100,000个Jurkat细胞/孔0小时、4小时、15小时、24小时、48小时和72小时。与剂量-应答测定相同，通过流式细胞计量术来分析CD69表达。
制造scDb构建体
重新合成编码各种抗IL5R×CDE3εscDb构建体的核苷酸序列，并且克隆至适于大肠杆菌表达的基于pET26b(+)骨架(Novagen)的载体中。将表达构建体转化至大肠杆菌菌株BL12(DE3)(Novagen)中，并且在2YT培养基(Sambrook,J.,等,MolecularCloning:ALaboratoryManual)中培养细胞作为起始培养物。接种表达培养物，并且在37℃和200rpm下在振荡烧瓶中孵育。一旦OD600nm达到1，即通过在最终浓度0.5mM下添加IPTG来诱导蛋白质表达。在过夜表达之后，通过在4000g下离心来收集细胞。对于制备包涵体，将细胞集结粒再混悬于IB再混悬缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)、100mMNaCl、5mMEDTA、0.5％曲通(Triton)X-100)中。细胞浆液补充以1mMDTT、0.1mg/mL溶菌酶、10mM亮肽素(Leupeptin)、100μMPMSF和1μM抑肽素(Pepstatin)。通过在冰上冷却下进行3个超声均质化循环来使细胞溶解。随后，添加0.01mg/mLDNA酶，并且在室温下孵育匀浆20分钟。通过在15000g和4℃下离心来使包涵体沉积。将IB再混悬于IB再混悬缓冲液中，并且通过超声处理来均质化，随后再进行离心。总计用IB再混悬缓冲液进行最少3次洗涤步骤，随后用IB洗涤缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)、100mMNaCl、5mMEDTA)进行2次洗涤以产生最终IB。
对于蛋白质再折叠，以每克湿IB5mL的比率将分离的IB再混悬于溶解缓冲液(100mMTris/HCl(pH8.0)、6MGdn-HCl、2mMEDTA)中。在室温下孵育溶解物30分钟，直至在最终浓度20mM下添加DTT，并且再继续孵育30分钟。在完成溶解之后，通过在21500g和4℃下离心10分钟来使溶液澄清。通过在再折叠缓冲液(通常：100mMTris-HCl(pH8.0)、5.0M脲、5mM半胱氨酸、1mM胱胺酸)中，在0.3g/L最终蛋白质浓度的溶解蛋白质下快速稀释来进行再折叠。通常孵育再折叠反应最少14小时。通过在8500g和4℃下离心10分钟来使所得蛋白质溶液澄清。通过在CaptoL树脂(GEHealthcare)上进行亲和色谱法来纯化再折叠蛋白质。通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE(针对纯度)和UV/Vis光谱法(针对蛋白质含量)分析分离的单体洗脱份。通过透析使缓冲液交换成天然缓冲液(50mM柠檬酸盐-磷酸盐(pH6.4)、200mMNaCl)。
用于确定双特异性抗CD3×IL5RscDb的结合动力学的SPR测定
通过使用MASS-1SPR仪器(SierraSensors)进行表面等离子体共振(SPR)来测量抗CD3×IL5RscDb的结合亲和力。对于针对CD3的亲和力测量，使用标准胺偶联程序将人异二聚单链CD3εγ细胞外结构域(内部产生)固定在传感器芯片(SPR-2亲和力传感器，高容量，胺，SierraSensors)上。将在90至0.1nM的范围内的三倍连续稀释的scDb注射至流动池中持续3分钟，并且允许蛋白质从传感器芯片上固定的CD3εγ进行解离12分钟。在各注射循环之后，用10mM甘氨酸-HCl(pH2.0)进行两次注射来再生表面。对于针对IL5R的亲和力测量，通过胺偶联将对人IgG的Fc区具有特异性的抗体固定在传感器芯片(SPR-2亲和力传感器，高容量，胺，SierraSensors)上。通过固定的抗体来捕集人IL5R-Fc嵌合蛋白(NovusBiologicals)。将三倍连续稀释的对IL5R具有特异性的scDb(90nM-0.1nM)注射至流动池中持续3分钟，并且监测解离12分钟。在各注射循环之后，用10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行三次注射来再生表面。用MASS-1分析软件(Analyzer，SierraSensors)，使用一对一朗缪尔结合模型计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
双特异性抗CD3×IL5RscDb与在T细胞的细胞表面上表达的CD3ε以及与在CHO细胞(CHO-IL5R细胞)的表面上表达的IL5R的结合
通过流式细胞计量术来分析scDb与在作为人T细胞系的Jurkat细胞(克隆E6-1，ATCC)的细胞表面上表达的CD3ε的结合。为评估scDb与Jurkat细胞的细胞表面上呈现的未知组分的不特异性结合，使用JurkatT细胞系的CD3ε缺乏性衍生物(J.RT3-T3.5，ATCC)。使用转基因CHO-IL5R细胞(在ZHAW产生)分析scDb与在细胞表面上表达的IL5R的结合，并且野生型CHO细胞(Invitrogen)用作不特异性结合对照。使两种细胞系与1μg/mL和10μg/mLscDb一起孵育1小时，并且通过添加RPE标记的蛋白质L(BioVision)来检测结合的scDb，接着用流式细胞仪(FACSariaIII,BectonDickinson)进行分析。作为阴性对照，使用对无关靶标具有特异性的scFv。对于定性评估与Jurkat和CHO-IL5R细胞的结合，测量不特异性scFv以及测试scDb两者的反映处于几何平均值的信号强度的平均荧光强度(MFI)。计算测试抗体与阴性对照抗体之间的MFI差异(ΔMFI)作为结合量度。此外，通过用测试scDb的MFI除以阴性对照scFv的MFI来计算标准化MFI。
由双特异性抗CD3×IL5RscDb达成的T细胞活化：诱导IL-2分泌
如下评估在靶标细胞存在下抗CD3×抗IL5RscDb诱导CD8+细胞毒性T细胞中的IL-2表达的潜力。通过根据制造商说明书使用RosetteSepTM人CD8+T细胞富集混合物(STEMCELLTechnologies)来从人血液新鲜分离细胞毒性T细胞。使CHO-IL5R细胞(10’000个细胞/孔)与CD8+细胞毒性T细胞在效应物:靶标比率10:1下，在10倍连续稀释的scDb(100nM至0.001nM)存在下，在96孔微量滴定板中一起孵育。为评估对T细胞的不特异性刺激，野生型CHO细胞用作靶标细胞。在共孵育16小时之后收集上清液以测量IL-2释放。使用可商购获得的ELISA试剂盒(BioLegend)定量IL-2释放。利用Pro数据分析软件(MolecularDevices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析数据，并且由剂量-应答曲线获得为诱导半数最大IL-2分泌所需的scDb的摩尔浓度(EC50)。
scDb介导的通过细胞毒性T细胞来溶解IL5R表达性CHO细胞
对于评估双特异性抗CD3×IL5RscDb诱导靶标细胞溶解的潜力，使用转基因IL5R表达性CHO细胞系(CHO-IL5R)。如上所述分离的未刺激人CD8+T细胞用作效应细胞。根据制造商说明书用细胞毒性绿染料(Promega)标记靶标细胞。通过CellToxTM绿细胞毒性测定(Promega)来监测细胞溶解。测定测量由于细胞死亡而发生的膜完整性变化。测定使用被从活细胞排除，但优先染色死细胞DNA的不对称花青染料。当染料结合受损害的细胞中的DNA时，它的荧光性质被实质上增强。活细胞不产生可感知的荧光增加。因此，通过与死细胞DNA的结合相互作用产生的荧光信号与细胞毒性成比例。类似地如上所述，使标记的CHO-IL5R细胞(10'000个细胞/孔)与CD8+细胞毒性T细胞在效应物:靶标比率10:1下，在10倍连续稀释的scDb(100nM至0.001nM)存在下，在96孔微量滴定板中一起孵育。为评估不表达靶标的细胞的不特异性溶解，使T细胞与标记的野生型CHO细胞一起共同孵育。在孵育88小时之后使用多模式微板读取器(FlexStation3，MolecularDevices)分析荧光强度。利用Pro数据分析软件(MolecularDevices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析数据，并且由剂量-应答曲线获得为诱导半数最大靶标细胞溶解所需的scDb的摩尔浓度(EC50)。
表3：最大程度影响不同抗体的结合的残基
| 克隆识别号 | 设置1 | 设置2 | 设置3 | 设置4 |
| 克隆06 | N4；E6 | N4；E6 | 结合低下 | 结合低下 |
| 克隆02 | N4；E6 | N4；E6；(G8) | 结合低下 | 结合低下 |
| 克隆03 | N4；E6 | N4；E6；(G8) | 结合低下 | 结合低下 |
| 克隆04 | N4；E6 | G3；E6 | 结合低下 | 结合低下 |
| 克隆10 | N4；E6 | N4；E6 | 结合低下 | 结合低下 |
表4：抗CD3抗体的序列
[CDR1至3在SEQIDNO:1和2中以粗体和加下划线显示，作为所有序列的代表]
[在SEQIDNO:19和20中：位置“X”是简并位置：方括号中提供的相应简并性在个别“X”之后]
*****
本发明在范围方面不受本文所述的特定实施方案限制。实际上，除本文所述的那些修改之外，本发明的各种修改将根据先前描述而变得对本领域技术人员明显。所述修改意图属于随附权利要求的范围。
在根据相应专利法所允许的程度上，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其它材料据此以引用的方式并入本文。
Claims (26)
1.一种分离的抗体或其功能性片段，所述分离的抗体或其功能性片段包含对人CD3ε的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对于结合是关键的残基。
2.如权利要求2所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述表位进一步包含氨基酸残基E6作为结合中涉及的残基。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3，具体来说食蟹猕猴CD3ε具有交叉反应性，具体来说具有的对食蟹猕猴CD3ε的亲和力与对人CD3ε的亲和力有小于100倍，具体来说小于30倍，甚至更具体来说小于15倍，并且最具体来说小于5倍不同。
4.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述抗体或其功能性片段结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M。
5.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，在IgG浓度为1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导T细胞活化的程度比抗体OKT-3或TR66的程度大至少1.5倍。
6.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，引起T细胞活化持续时间长于抗体OKT-3或TR66，表示为通过在IgG浓度为1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69的表达增加至少1.5倍大。
7.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，在交联后，导致T细胞的剂量依赖性的均质活化状态。
8.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含对人CD3的表位具有特异性的抗原结合区域，其中所述抗体或其功能性片段在以IgG形式测试时，(i)结合人CD3的单价结合解离常数小于3.0×10-8M，具体来说小于1.5×10-8M，更具体来说小于1.2×10-8M，并且最具体来说小于1.0×10-8M；以及(iia)在交联后，在IgG浓度为1.25μg/ml下刺激24小时之后，诱导的T细胞活化为抗体OKT-3或TR66的至少1.5倍强度；(iib)导致T细胞活化持续长于抗体OKT-3或TR66，表示为通过在IgG浓度为1.25μg/ml下刺激72小时之后CD69表达增加至少1.5倍大；(iic)导致T细胞的剂量依赖性的均质活化状态；和/或(iid)对人CD3ε的表位具有特异性，其中所述表位包含氨基酸残基N4作为对结合是关键的残基。
9.如权利要求4至8中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述表位位于人CD3的ε链上。
10.如权利要求1至3以及9中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，通过使用表面等离子体共振实验，具体来说利用以下条件测定呈IgG形式的所述抗体或其功能性片段对人来源的异二聚CD3εγ的纯化细胞外结构域的亲和力来测定与人CD3ε的所述结合：MASS-1SPR仪器(SierraSensors)；捕集抗体：对使用标准胺偶联程序固定在SPR-2亲和传感器芯片，胺，SierraSensors上的所述IgG的Fc区具有特异性的抗体；在90至2.81nM的范围内两倍连续稀释人异二聚单链CD3εγ细胞外结构域，注射至流动池中持续3分钟，以及使蛋白质从在传感器芯片上捕集的IgG解离5分钟，在每次注射循环之后以两次注射10mM甘氨酸-HCl进行表面再生，用MASS-1分析软件(Analyzer,SierraSensors)，使用一对一朗缪尔结合模型计算表观解离(kd)和缔合(ka)速率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，通过，具体来说使用以下条件，测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段对CD69表达的刺激来测定根据(iia)和/或(iic)所述的对T细胞活化的诱导：在通过添加3倍过量的抗IgG抗体进行先前交联之后，用20μg/ml、5μg/ml和1.25μg/ml的呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段刺激Jurkat细胞(100,000个细胞/孔)24小时(对照：OKT3(BioLegend,目录号317302)或TR66(NovusBiologicals,目录号NBP1-97446)，与兔抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,目录号315-005-008)交联)；在刺激之后使用藻红素(PE)标记的对人CD69具有特异性的抗体(BioLegend,目录号310906)进行针对CD69表达的细胞染色，用流式细胞仪(FACSariaIII,BectonDickinson)分析；阴性对照：用所述抗CD69抗体染色的与交联抗体一起孵育的未刺激Jurkat细胞。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，通过，具体来说使用以下条件，测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段刺激CD69表达的时程来测定根据(iib)所述的较长持续时间的T细胞活化：用5μg/ml呈IgG形式抗CD3抗体形式的已进行如权利要求10中交联的所述分离的抗体或其功能性片段刺激100,000个Jurkat细胞/孔持续0小时、4小时、15小时、24小时、48小时和72小时，以及如权利要求10中通过流式细胞仪来分析CD69表达。
13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，通过，具体来说使用以下条件，测定由呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段对IL-2分泌的刺激来测定根据(iia)和/或(iic)的对T细胞活化的所述诱导：使用4种不同分析设置用呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段在5μg/ml的浓度下刺激Jurkat细胞(200,000个细胞/孔)：(a)用呈IgG形式的通过添加3倍更高浓度的抗IgG抗体交联的所述分离的抗体或其功能性片段刺激Jurkat细胞(对照：OKT3(BioLegend,目录号317302)或TR66(NovusBiologicals,目录号NBP1-97446)，与兔抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,目录号315-005-008)交联)；(b)在不存在交联抗体下进行T细胞活化；(c)通过过夜孵育来将所述交联抗体固定在组织培养板上；(d)通过在不存在交联抗体下过夜孵育来将呈IgG形式的所述分离的抗体或其功能性片段(或对照抗体)固定在组织培养板上；在各设置中，在添加之后一小时，用10ng/mlPMA刺激细胞，以及在24、48和72小时之后收集上清液以测量IL-2释放，使用可商购获得的ELISA(BioLegend,目录号431801)进行定量。
14.如权利要求4至13中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段与食蟹猕猴CD3具有交叉反应性。
15.如权利要求1至14中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段是(i)兔抗体或其功能性片段，或(ii)通过使(i)的兔抗体或其功能性片段人源化获得的抗体或其功能性片段。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22中存在的一个CDR1、一个CDR2和一个CDR3区域的组合，具体来说其中所述VH结构域包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22中存在的框架结构域的框架结构域；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21中存在的一个CDR1、一个CDR2和一个CDR3区的组合，具体来说其中所述VL结构域包含选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21中存在的框架结构域的框架结构域。
17.如权利要求16所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和20，更具体来说SEQIDNO:10和22中的一个中存在的CDR1、CDR2和CDR3的组合，具体来说其中所述VH结构域包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18以及20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22中的一个中存在的框架结构域的组合；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21中的一个中存在的CDR1、CDR2和CDR3的组合，具体来说其中所述VL结构域包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21中的一个中存在的框架结构域的组合。
18.如权利要求17所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22，具体来说SEQIDNO:4、6、10和22，更具体来说SEQIDNO:10和22的VH结构域；以及选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21，具体来说SEQIDNO:3、5、9和21，更具体来说SEQIDNO:9和21的VL结构域。
19.如权利要求18所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段包含抗原结合区域，所述抗原结合区域包含选自SEQIDNO:1/SEQIDNO:2；SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；SEQIDNO:7/SEQIDNO:8、SEQIDNO:9/SEQIDNO:10、SEQIDNO:11/SEQIDNO:12、SEQIDNO:13/SEQIDNO:14、SEQIDNO:15/SEQIDNO:16、SEQIDNO:17/SEQIDNO:18、SEQIDNO:19/SEQIDNO:20和SEQIDNO:21/SEQIDNO:22，具体来说SEQIDNO:3/SEQIDNO:4；SEQIDNO:5/SEQIDNO:6；SEQIDNO:9/SEQIDNO:10和SEQIDNO:21/SEQIDNO:22；更具体来说SEQIDNO:9/SEQIDNO:10和SEQIDNO:21/SEQIDNO:22的VH/VL结构域组合。
20.一种分离的抗体或其功能性片段，所述分离的抗体或其功能性片段与如权利要求16至19中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段结合实质上相同的表位。
21.如权利要求1至17中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述分离的抗体或其功能性片段包含通过使如权利要求18或19所述的抗原结合区域人源化获得的抗原结合区域。
22.一种药物组合物，包含如权利要求1至21中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段以及任选药学上可接受的载体和/或赋形剂。
23.一种核酸序列或核酸序列的集合，所述核酸序列或核酸序列的集合编码如权利要求1至21中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段。
24.一种载体或载体的集合，包含如权利要求23所述的核酸序列或核酸序列的集合。
25.一种宿主细胞，特别是表达宿主细胞，包含如权利要求23所述的核酸序列或核酸序列的集合，或如权利要求24所述的载体或载体的集合。
26.一种用于产生如权利要求1至21中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段的方法，所述方法包括使以下表达的步骤：如权利要求23所述的核酸序列或核酸序列的集合，或如权利要求24所述的载体或载体的集合，或如权利要求25所述的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Vaden Weir, Switzerland Applicant after: Numa Innovation Co., Ltd. Address before: Vaden Weir, Switzerland Applicant before: NUMAB AG |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160316 |