BR112020004992A2

BR112020004992A2 - anticorpos, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, métodos de expressar o anticorpo e de modulação, métodos para tratar uma doença, para ativar células t, para promover o processamento, para detectar e para diagnosticar, uso do anticorpo e kit

Info

Publication number: BR112020004992A2
Application number: BR112020004992-1A
Authority: BR
Inventors: Jing Li; Qin Mei
Original assignee: WuXi Biologics Ireland Limited
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2020-10-06
Also published as: WO2019057099A1; CN115991777A; EP3684806A4; CN111108119A; IL273393A; JP2020534830A; US20230192850A1; US11440962B2; SG11202001358RA; MX2020003087A; AU2018336519A1; EP3684806A1; TWI820041B; US20200299384A1; JP2023126851A; MY199530A; KR20200055052A; ZA202001314B; NZ762170A; CN111108119B

Abstract

A presente divulgação fornece anticorpos anti-CD3 épsilon monoclonais isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma ou mais sequências CDR de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e/ou uma ou mais sequências CDR de cadeia leve kappa selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 48, polinucleotídeos isolados que codificam tais sequências, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e o uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE EXPRESSAR O ANTICORPO E DE MODULAÇÃO, MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA, PARA ATIVAR CÉLULAS T, PARA PROMOVER O PROCESSAMENTO, PARA DETECTAR E PARA DIAGNOSTICAR, USO DO ANTICORPO E KIT” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente divulgação refere-se de modo geral a novos anticorpos anti-CD3 épsilon humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O correceptor de células T, CD3 (do inglês, Cluster of Differentiation), é um complexo proteico e é composto por quatro cadeias distintas, uma cadeia gama CD3, uma cadeia delta CD3 e duas cadeias épsilon CD3. Essas cadeias se associam a uma molécula conhecida como receptor de células T (TCR) e a cadeia zeta para gerar sinal de ativação nos linfócitos T. O TCR, a cadeia zeta e as moléculas CD3, juntos, compreendem o complexo TCR, no qual o TCR como uma subunidade reconhece e se liga ao antígeno, e o CD3 como uma subunidade transfere e transmite a estimulação do antígeno para a via de sinalização e, finalmente, regula a atividade da célula T. A proteína CD3 está praticamente presente em todas as células T.

[003] O CD3 juntamente com o TCR forma um complexo CD3- TCR, que desempenha um papel crucial na modulação de inúmeras funções nas células T na resposta imune inata e resposta imune adaptativa, bem como na função imune celular e humoral. Estas funções incluem e eliminação de organismos patogênicos e controle do crescimento tumoral por ampla gama de efeitos citotóxicos.

[004] Os anticorpos monoclonais de camundongo específicos para CD3 humano, como OKT3 (Kung et al. (1979) Science 206: 347-9), foram os anticorpos CD3 de primeira geração para tratamento. Embora o OKT3 tenha forte potência imunossupressora, seu uso clínico foi dificultado por sérios efeitos colaterais associados aos potenciais efeitos imunogênicos e mitogênicos (Chatenoud (2003) Nature Reviews 3: 123-132). O OKT3 induziu uma resposta antiglobulina, promovendo sua própria eliminação e rápida neutralização (Chatenoud et al. (1982) Eur. J. Immunol. 137: 830-8). Além disso, o OKT3 induziu proliferação de células T e produção de citocinas in vitro, e levou a uma liberação em larga escala de citocinas in vivo (Hirsch et al.

(1989) J. Immunol 142: 737-43, 1989). A liberação de citocinas (também chamada de “tempestade de citocinas”) levou a uma síndrome “gripal”, caracterizada por febre, calafrios, dores de cabeça, náusea, vômito, diarreia, dificuldade respiratória, meningite séptica e hipotensão (Chatenoud, 2003).

Tais efeitos colaterais graves limitaram o uso mais difundido do OKT3 no transplante, bem como a extensão de seu uso em outros campos clínicos, como na autoimunidade (Id.).

[005] Existe uma necessidade significativa de novos anticorpos anti-CD3.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] Ao longo da presente divulgação, os artigos “um/uma” e “o/a” são utilizados para se referirem a um ou a mais do que um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um anticorpo” significa um anticorpo ou mais do que um anticorpo.

[007] A presente divulgação provê novos anticorpos monoclonais anti-CD3 épsilon, sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos mesmos, e usos dos mesmos.

[008] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma, duas ou três sequências CDR de cadeia pesada selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e/ou 1, 2, ou 3 sequências CDR de cadeia leve kappa selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 48.

[009] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem 1, 2 ou 3 sequências CDR de cadeia pesada com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem 1, 2 ou 3 sequências CDR de cadeia leve com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ou 48.

[010] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29; f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41; e h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47.

[011] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; c) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 e/ou SEQ ID NO: 18;

d) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; e) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30; f) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36; g) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42; e h) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48.

[012] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41 e 47.

[013] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 43; b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID

NO: 39 e SEQ ID NO: 45; e c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 47.

[014] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência CDR1 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 44; b) uma sequência CDR2 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 46; e c) uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 48.

[015] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 43; b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID

NO: 39 e SEQ ID NO: 45; c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 47; d) uma sequência CDR1 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 44; e) uma sequência CDR2 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 46; e f) uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 48.

[016] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 8,

SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12;

c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 14,

SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 19, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;

e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 25, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30;

f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 31, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 32,

SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;

g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42; ou h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48.

[017] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda 1, 2, 3 ou 4 sequências de regiões de arcabouço (regiões estruturais ou Framework (FR)) de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas: SEQ ID NOs: 57, 59, 61, 63, 73, 75, 77 e 79 e/ou 1, 2, 3 ou 4 sequências de regiões de arcabouço (FR) de cadeia leve selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 58, 60, 62, 64, 74, 76, 78 e 80.

[018] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda a sequência FR1 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 57 e 73; a sequência FR2 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 59 e 75; a sequência FR3 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 61 e 77; e a sequência FR4 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 63 e 79.

[019] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda a sequência FR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 58 e 74; a sequência FR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 60 e 76; a sequência FR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 62 e 78; e a sequência FR4 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 64 e 80.

[020] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117 e uma sequência homóloga da mesma possuindo pelo menos, 80% (por exemplo pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência.

[021] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119 e uma sequência homóloga da mesma possuindo pelo menos, 80% (por exemplo pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência.

[022] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem toda ou uma porção da sequência da região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, e 117; e/ou, toda ou uma porção da sequência da região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115 e 119. Em um exemplo de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são um anticorpo de domínio único que consiste em toda ou uma porção da região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113 e 117.

[023] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 83; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 87; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 91; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 93 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 95; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 97 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 99; f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 101 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 103; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 105 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 107; h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 111;

i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 113 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 115; ou j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 119.

[024] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos e ainda mantém uma afinidade de ligação específica para o CD3 épsilon.

[025] Em determinados exemplos de realização, a substituição está em uma ou mais sequências CDR, ou em uma ou mais sequências FR, ou em uma ou ambas as sequências de região variável, ou na região Fc. Em alguns exemplos de realização, pelo menos uma (ou todas) as substituições nas sequências CDR, sequências FR, sequências de regiões variáveis ou região Fc compreendem uma substituição conservadora.

[026] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências CDRs selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 1-48. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências FR selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 57-80. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições no total em sequências CDR e/ou sequências FR de sequências de regiões variáveis da cadeia pesada selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113 e

117. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em todas as FRs de sequências da região variável da cadeia leve selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115 e 119.

[027] Em determinados exemplos de realização, a substituição confere uma ou mais propriedades desejáveis selecionadas a partir de: a) melhorar a afinidade de ligação ao CD3 épsilon, b) introduzir ou remover um sítio de glicosilação, c) introduzir um resíduo de cisteína livre, d) melhorar ou reduzir o ADCC ou CDC, e) aumentar da meia-vida sérica; e f) aumentar a ligação ao FcRn.

[028] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de imunoglobulina. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante de IgG. Em um exemplo de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante da IgG1 humana.

[029] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno é um anticorpo murino ou um anticorpo humanizado.

[030] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são; um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um scFv, um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv)2, um dsFv-dsFv’, um fragmento Fv, um Fab, um Fab’, um F(ab')2, um diacorpo ds, um nanocorpo (nanobody), um anticorpo de domínio ou um anticorpo de domínio bivalente.

[031] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são biespecíficos. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui uma primeira especificidade antigênica para CD3 épsilon, e uma segunda especificidade antigênica. Em certos exemplos de realização, a segunda antigenicidade é para um segundo antígeno diferente do CD3 épsilon, onde a presença do segundo antígeno na proximidade de células T expressando CD3 épsilon é desejável para o segundo antígeno para ser reconhecido pelo sistema imune. Em determinados exemplos de realização, a primeira especificidade antigênica é para CD3 épsilon e a segunda especificidade antigênica é para um antígeno associado a um tumor.

[032] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos estão ligados a um ou mais conjugados. Em certos exemplos de realização, o conjugado pode ser um agente quimioterápico, uma toxina, um isótopo radioativo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador de substrato enzimático.

[033] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente ao CD3 épsilon. Em certos exemplos de realização, o CD3 épsilon é derivado de camundongo, rato, macaco ou humano. Em alguns exemplos de realização, o CD3 épsilon é um CD3 épsilon recombinante ou uma CD3 épsilon expresso sobre uma superfície celular.

[034] Em determinados exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de ligar especificamente ao CD3 épsilon humano, expresso na superfície de uma célula com um valor KD coreceptor5x10-9 M, não maior do que 4x10-9 M, não maior do que 3x10-9 M, não maior do que 2x10-9 M, não maior do que 10-9 M, não maior do que 5x10-10 M, não maior do que 4x10-10 M, não maior do que 3x10-10 M,

não maior do que 3x10-10 M, não maior do que 2x10-10 M, não maior do que 10- 10 M, não maior do que 5x10-11 M, não maior do que 4x10-11 M, não maior do que 3x10-11 M, não maior do que 2x10-11 M ou 10-11 M conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano expresso na superfície de células com uma EC50 de não maior do que 0,50 nM, ou não maior do que 1,10 nM por ensaio de citometria de fluxo.

[035] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon recombinante de macaco cinomolgo com uma EC50 não superior a 0,001 nM, não superior a 0,005 nM, não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM ou não superior a 0,05 nM, conforme medido por ELISA.

[036] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano recombinante a uma EC 50 não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM, não superior a 0,05 nM, não superior a 0,06 nM, não superior a 0,07 nM ou não superior a 0,08 nM, conforme medido por ELISA.

[037] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano, expresso em uma célula que expressa CD3 na superfície a uma EC50 não maior que 0,5 nM, não maior que 0,6 nM, não maior que 0,7 nM, não maior que 0,8 nM, não maior que 0,9 nM, não maior que 1 nM, não maior que 2 nM, não maior que 3 nM, não maior que 4 nM, não maior que 5 nM, não maior que 6 nM, não maior que 7 nM, não maior que 8 nM, não maior que 9 nM ou não maior que 10 nM, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[038] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos são anticorpos humanizados que são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano expresso sobre a superfície de células que expressam CD4 a uma EC50 não superior a 0,50 nM, ou não superior a 1,10 nM por ensaio de citometria de fluxo.

[039] Em um aspecto, a presente divulgação provê um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o qual compete pelo mesmo epítopo com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui proporcionado.

[040] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certos exemplos de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente que é capaz de aumentar um efeito terapêutico do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou é capaz de reduzir um efeito colateral do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[041] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona ainda um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui proporcionado. Em certos exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 e 120.

[042] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um vetor compreendendo o referido polinucleotídeo isolado.

[043] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda uma célula hospedeira compreendendo o referido vetor.

[044] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método para expressar o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido, compreendendo o cultivo da referida célula hospedeira sob a condição na qual o referido polinucleotídeo é expresso.

[045] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método de tratamento de uma doença ou condição em um sujeito que se beneficiaria com a modulação da atividade do CD3 épsilon, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido no presente documento ou a composição farmacêutica aqui fornecida. Em determinados exemplos de realização, o referido sujeito é humano. Em determinados exemplos de realização, a referida doença ou condição é uma doença ou condição relacionada ao CD3. Em certos exemplos de realização, a referida doença ou condição é câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.

[046] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método de ativação de células T expressando CD3 épsilon in vivo ou in vitro, compreendendo o contato das células T expressando CD3 épsilon com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido.

[047] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método de modular a atividade de CD3 em uma célula expressando CD3 épsilon, compreendendo expor a célula expressando CD3 épsilon ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido.

[048] Em um aspecto, a presente divulgação provê ainda um método de promover, in vivo ou in vitro, o processamento de um segundo antígeno por células T expressando CD3 épsilon, compreendendo o contato das células T expressando CD3 épsilon com um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido pela presente invenção,

em que o anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente às células T que expressam o CD3 épsilon e a um segundo antígeno, trazendo assim ambos em estreita proximidade.

[049] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método para detectar a presença ou quantidade de CD3 épsilon em uma amostra, compreendendo o contato da amostra com o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido e determinando a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra.

[050] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito, compreendendo: a) obter uma amostra do sujeito; b) colocar a amostra em contato com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui proporcionados; c) determinar a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra; e d) correlacionar a presença ou a quantidade de CD3 épsilon a uma doença ou condição no sujeito.

[051] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo ou de seu fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecidos na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito.

[052] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo ou de seu fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecidos na fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD3.

[053] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um kit compreendendo o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido, útil na detecção de CD3 épsilon. Em certos exemplos de realização, o kit compreende anticorpos ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo útil na detecção de CD3 épsilon recombinante, CD3 épsilon expresso na superfície celular ou células que expressam CD3 épsilon.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[054] A Figura 1 mostra a ligação dos anticorpos monoclonais WBP3311_2.166.48-uIgG1K, WBP3311_2.306.4 - uIgG1K e WBP3311_2.166.48 à proteína recombinante CD3 épsilon de macaco- cinomolgo, medida pelo ensaio ELISA.

[055] A Figura 2 mostra a ligação dos anticorpos monoclonais WBP3311_2.166.48-uIgG1K, WBP3311_2.306.4 - uIgG1K, WBP3311_2.166.48, e WBP3311_2.306.4 às células T CD4 humanas conforme mensurado por citometria de fluxo.

[056] A Figura 3 mostra a afinidade de ligação de oito anticorpos de camundongo (W3311-2.166.48, W3311-2.306.4, W3311-2.383.47, W3311-

2.400.5, W3311-2.482.5, W3311-2.488.33, W3311-2.615. 8 e W3311-2.844.8) para células que expressam CD3 humanas (células Jurkat), conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[057] A Figura 4A mostra a afinidade de ligação do anticorpo humanizado WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K às células que expressam CD3 humanas (células Jurkat), conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[058] A Figura 4B mostra o resultado da afinidade de ligação do anticorpo humanizado WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K às células que expressam CD3 humanas (células Jurkat), conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[059] A Figura 4C mostra o resultado da afinidade de ligação do controle positivo, ligação do OKT3 às células que expressam CD3 humanas (células Jurkat), conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[060] A Figura 5 mostra a taxa de internalização celular de oito anticorpos de camundongo (W3311-2.166.48, W3311-2.306.4, W3311-

2.383.47, W3311-2.400.5, W3311-2.482.5, W3311-2.488.33, W3311-2.615. 8 e

W3311-2.844.8) para células que expressam CD3 humanas (células Jurkat), conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[061] A Figura 6 mostra o resultado da ativação de células T humanas por oito anticorpos de camundongo (W3311-2.166.48, W3311-

2.306.4, W3311-2.383.47, W3311-2.400.5, W3311-2.482.5, W3311-2.488.33, W3311-2.615.8 e W3311-2.844.8) medido por coloração/marcação de citocina intracelular TNFalfa e IFNgama.

[062] A Figura 7 mostra o resultado da ativação de células T humanas por dois anticorpos humanizados (WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K e WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K), medidos por coloração para citocina intracelular TNFalfa e IFN gama.

[063] A Figura 8 mostra o resultado do agrupamento de epítopos (epitope binning) de sete anticorpos de camundongo (W3311-2.166.48, W3311-

2.306.4, W3311-2.400.5, W3311-2.482.5, W3311-2.488.33, W3311-2.615.8 e W3311 -2,844.8) contra o clone WBP3311_ 2.383.47.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[064] A descrição a seguir da presente divulgação é meramente destinada a ilustrar os diversos exemplos de realização da divulgação. Assim, as modificações específicas discutidas não devem ser interpretadas como limitações no escopo da divulgação. Será evidente para um especialista no assunto que vários equivalentes, alterações e modificações podem ser feitos sem nos afastarmos do escopo da divulgação, e entende-se que tais exemplos de realização equivalentes devem estar incluídos no presente pedido. Todas as referências aqui citadas, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, são integralmente incorporados ao presente como referência.

DEFINIÇÕES

[065] O termo “anticorpo”, conforme utilizado na presente invenção, inclui qualquer imunoglobulina, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo multivalente, anticorpo bivalente, anticorpo monovalente, anticorpo multiespecífico ou anticorpo biespecífico que se liga a um antígeno específico. Um anticorpo intacto nativo compreende duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L). As cadeias pesadas de mamíferos são classificadas como alfa, delta, épsilon, gama e mu, e cada cadeia pesada é constituída por uma região variável (VH) e uma primeira, segunda, e terceira região constante (CH1, CH2, CH3, respectivamente); as cadeias leves de mamíferos são classificadas como λ ou κ, e cada cadeia leve é constituída por uma região variável (V L para a cadeia leve λ ou VK para a cadeia leve κ, respectivamente) e uma região constante (CL para a cadeia leve λ ou CK para cadeia leve κ, respectivamente).

O anticorpo tem a forma de “Y”, com o caule do Y consistindo na segunda e terceira regiões constantes de duas cadeias pesadas ligadas entre si por meio de ligação de dissulfeto. Cada braço do Y inclui a região variável e a primeira região constante de uma única cadeia pesada ligada às regiões variáveis e constantes de uma única cadeia leve. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada são responsáveis pela ligação ao antígeno. As regiões variáveis em ambas as cadeias geralmente contêm três alças altamente variáveis denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (CDRs de cadeia leve incluindo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e CDRs de cadeia pesada incluindo HCDR1, HCDR2, HCDR3). Os limites da CDR para os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno divulgados no presente podem ser definidos ou identificados pelas convenções de Kabat, IMGT, Chothia ou Al-Lazikani (Al- Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. e Lesk, A.M., J.

Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877- 83 (1989) ; Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md.

(1991)). As três CDRs são interpostas entre trechos de flanco conhecidos como regiões de arcabouço ou estruturais (FR do inglês, Framework), que são mais altamente conservadas que as CDRs e formam um andaime para suportar as alças hipervariáveis. As regiões constantes das cadeias pesadas e leves não estão envolvidas na ligação ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras.

Os anticorpos são atribuídos a classes com base na sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas. As cinco principais classes ou isotipos de anticorpos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, caracterizadas pela presença de cadeias pesadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente.

Várias das principais classes de anticorpos são divididas em subclasses como IgG1(cadeia pesada gama1), IgG2 (cadeia pesada gama2), IgG3 (cadeia pesada gama3), IgG4 (cadeia pesada gama4), IgA1 (cadeia pesada alfa1) ou IgA2 (cadeia pesada alfa2).

[066] O termo “bivalente”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo dois locais de ligação ao antígeno; o termo “monovalente” refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo apenas um único local de ligação ao antígeno; e o termo “multivalente” refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo múltiplos locais de ligação ao antígeno. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são bivalentes.

[067] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo “biespecífico” refere-se a um anticorpo artificial que tem fragmentos derivados de dois anticorpos monoclonais diferentes e é capaz de se ligar a dois epítopos diferentes. Os dois epítopos podem estar presentes no mesmo antígeno, ou podem estar em dois antígenos diferentes.

[068] O termo “fragmento de ligação ao antígeno”, como usado no presente pedido, refere-se a um fragmento de anticorpo formado a partir de uma porção de um anticorpo que compreende 1, 2 ou 3 CDRs, ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno, mas não compreende uma estrutura intacta de anticorpo nativo. Exemplos de fragmento de ligação ao antígeno incluem, sem limitação, um diacorpo, um Fab, um Fab’, um F(ab’) 2, um fragmento Fv, um fragmento Fv estabilizado por bissulfeto (dsFv), um (dsFv)2, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv’), um diacorpo (diabody) estabilizado por ligações de bissulfeto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scFv), um dímero scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio e um anticorpo de domínio bivalente. Um fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo parental se liga.

[069] “Fab”, com relação a um anticorpo, refere-se àquela porção do anticorpo que consiste em uma única cadeia leve (ambas as regiões variáveis e constantes) ligada à região variável e primeira região constante de uma única cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto.

[070] “Fab” refere-se a um fragmento Fab que inclui uma porção da região de dobradiça.

[071] “F(ab’)2” refere-se a um dímero de Fab’. “Fv”, com relação a um anticorpo, refere-se ao menor fragmento do anticorpo para suportar o sítio de ligação ao antígeno completo. Um fragmento Fv consiste na região variável de uma única cadeia leve ligada à região variável de uma única cadeia pesada.

[072] Um “dsFv” refere-se a um fragmento de Fv estabilizado com dissulfeto de modo que a ligação entre a região variável de uma única cadeia leve e a região variável de uma única cadeia pesada é uma ligação de bissulfeto. Em alguns exemplos de realização, um “(dsFv)2” ou “(dsFv-dsFv')” compreende três cadeias peptídicas: dias porções VH ligadas por um ligante peptídico (por exemplo, um ligante flexível longo) à duas porções VL, respectivamente, através de pontes de bissulfeto. Em alguns exemplos de realização, dsFv-dsFv’ é biespecífico, em que cada cadeia pesada e leve pareada com ligações de dissulfeto tem uma especificidade de antígeno diferente.

[073] “Anticorpo Fv de cadeia única” ou “scFv” refere-se a um anticorpo manipulado que consiste em uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada conectada uma à outra diretamente ou através de uma sequência de ligação peptídica (Huston J.S. et al. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879 (1988)).

[074] “Fc”, com relação a um anticorpo, refere-se àquela porção do anticorpo que consiste na segunda e terceira regiões constantes de uma primeira cadeia pesada ligada à segunda e terceira regiões constantes de uma segunda cadeia pesada através de ligação de bissulfeto. A porção Fc do anticorpo é responsável por várias funções efetoras como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), mas não funciona na ligação ao antígeno.

[075] “Anticorpo Fv de cadeia única–Fc” ou “scFv-Fc” refere-se a um anticorpo modificado que consiste em um scFv ligado à região Fc de um anticorpo.

[076] “Anticorpo de domínio único camelizado”, “anticorpo de cadeia pesada” ou “HCAb” refere-se a um anticorpo que contém dois domínios VH sem cadeias leves (Riechmann L. e Muyldermans S., J Immunol Methods, 10 de dezembro; 231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun; 74(4):277-302 (2001); documentos WO94/04678; WO94/25591; Patente US

6.005.079). Os anticorpos de cadeia pesada foram originalmente derivados de Camelidae (camelos, dromedários e lhamas). Embora desprovidos de cadeias leves, os anticorpos camelizados possuem um autêntico repertório de ligação ao antígeno (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. “Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,” Immunogenetics. 54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al. Immunology. 109(1):93-101 (2003)). O domínio variável de um anticorpo de cadeia pesada (domínio VHH) representa a menor unidade de ligação ao antígeno conhecida gerada por respostas imunes adaptativas (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov; 21 (13): 3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).

[077] Um “nanocorpo” ou “nanobody” refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um domínio VHH a partir de um anticorpo de cadeia pesada e dois domínios constantes, CH2 e CH3.

[078] Os “diacorpos” ou “diabodies” ou “dAbs” incluem pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio VH ligado a um domínio VL na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL ou VH-VL) (vide, por exemplo, Holliger P. et al. , Proc Natl Acad Sci USA. Jul 15; 90 (14): 6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161). Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, criando, desse modo, dois sítios de ligação ao antígeno. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser direcionados ao mesmo antígeno (ou epítopos) ou a antígenos (ou epítopos) diferentes. Em certos exemplos de realização, um “diacorpo ds biespecífico” é um diacorpo direcionado a dois antígenos diferentes (ou epítopos). Em certos exemplos de realização, um “dímero scFv” é um diacorpo bivalente ou ScFv bivalente (BsFv) que compreende V H-VL (ligado por um ligante peptídico) dimerizado com outra porção V H-VL de tal modo que as VH's de uma porção coordenadas com as VL's da outra porção formam dois sítios de ligação que podem visar os mesmos antígenos (ou epítopos) ou antígenos diferentes (ou epítopos). Em outros exemplos de realização, um “dímero scFv” é um diacorpo biespecífico compreendendo V H1- VL2 (ligado por um ligante peptídico) associado a VL1-VH2 (também ligado por um ligante peptídico), de modo que VH1 e VL1 estão coordenados e VH2 e VL2 estão coordenados e cada par coordenado têm uma especificidade a diferentes antígenos.

[079] Um “anticorpo de domínio” refere-se a um fragmento de anticorpo contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em certos casos, dois ou mais domínios VH são covalentemente ligados a um ligante peptídico para criar um anticorpo de domínio bivalente ou multivalente. Os dois domínios VH de um anticorpo de domínio bivalente podem se direcionar ao mesmo antígeno ou a antígenos diferentes.

[080] O termo “quimérico”, como usado no presente pedido, significa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que tem uma porção de cadeia pesada e/ou cadeia leve derivada de uma espécie, e o resto da cadeia pesada e/ou cadeia leve derivado de uma espécie diferente. Em um exemplo ilustrativo, um anticorpo quimérico pode compreender uma região constante derivada de humano e uma região variável de uma espécie não humana, tal como de camundongo. Em alguns exemplos de realização, o animal não humano é um mamífero, por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, uma cabra, uma ovelha, um porquinho-da-índia ou um hamster.

[081] O termo “humanizado”, como usado no presente pedido, com referência ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, significa que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende CDRS derivadas de animais não humanos, regiões FR derivadas de humanos e, quando aplicável, as regiões constantes derivadas de humanos.

[082] “CD3”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se à proteína ‘grupo de diferenciação 3 (em inglês, Cluster of Differentiation 3) derivada de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos, macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em mamíferos, a molécula CD3 é um complexo multiproteico de seis cadeias, incluindo: uma cadeia CD3 gama, uma cadeia CD3 delta, duas cadeias CD3 épsilon e um homodímero de cadeias CD3 zeta, em que a cadeia CD3 zeta é a cauda intracelular de molécula CD3, e as cadeias CD3 gama, CD3 delta e CD3 épsilon contêm o domínio extracelular (ECD) expresso na superfície de células T. A sequência exemplar de CD3 humana inclui a proteína CD3 épsilon humana (NCBI Ref Seq NP_000724), proteína CD3 delta humana (NCBI Ref Seq NP_000723) e a proteína CD3 gama humana (NCBI Ref Seq NP_000064). A sequência exemplificativa da CD3 não humana inclui a proteína CD3 épsilon de Macaca fascicularis (macaco) (NCBI Ref Seq Nº NP_001270544), proteína CD3 delta de Macaca fascicularis (macaco) (NCBI Ref. Seq NP_001274617), proteína CD3 gama de Macaca fascicularis (Macaco) (NCBI Ref Seq No. NP_001270839); proteína CD3 épsilon de camundongo (NCBI Ref Seq No. NP_031674), proteína CD3 delta de camundongo (NCBI Ref Seq No. NP_038515), proteína CD3 gama de camundongo (NCBI Ref Seq No. AAA37400); proteína CD3 épsilon de Rattus norvegicus (rato) (NCBI Ref Seq No. NP_001101610), proteína CD3 delta de Rattus norvegicus (rato) (NCBI Ref Seq No. NP_037301), proteína CD3 gama de Rattus norvegicus (rato) (NCBI Ref Seq No. NP_001071114). Em certos exemplos de realização, o CD3 utilizado na presente invenção também pode ser CD3 recombinante, por exemplo, incluindo a proteína CD3 épsilon recombinante, proteína CD3 delta recombinante e proteína CD3 gama recombinante, que pode opcionalmente ser expressa como um complexo CD3 recombinante. O complexo CD3 recombinante pode ser expresso na superfície da célula ou, alternativamente, pode ser expresso como uma forma solúvel que não está associada à superfície celular.

[083] O termo “CD3 épsilon”, conforme utilizado na presente invenção, destina-se a abranger qualquer forma de CD3 épsilon, por exemplo, 1) molécula CD3 épsilon nativa não processada, cadeia CD3 épsilon

“completa/de comprimento total” ou variantes de ocorrência natural de CD3 épsilon, incluindo, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas; 2) qualquer forma de CD3 épsilon resultante do processamento na célula; ou 3) comprimento total, um fragmento (por exemplo, uma forma truncada, um domínio extracelular/transmembranar) ou uma forma modificada (por exemplo, uma forma mutada, glicosilada/PEGuilada, uma forma marcada com His- tag/imunofluorescência) da subunidade CD3 épsilon gerada por método recombinante.

[084] O termo “anticorpo anti-CD3 épsilon” refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar de maneira específica ao CD3 épsilon (por exemplo, CD3 épsilon humano ou de macaco).

[085] O termo “ligação específica” ou “se ligar de maneira específica” ou “se ligar especificamente”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma reação de ligação não aleatória entre duas moléculas, como, por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno proporcionados no presente pedido se ligam especificamente ao CD3 épsilon humano com uma afinidade de ligação (KD) ≤ 10-6 M (por exemplo, ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 1x10-7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 1x10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 4x10-9 M, ≤ 3x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ou ≤ 10-9 M). O valor de KD aqui utilizado refere-se à relação entre a velocidade de dissociação pela velocidade de associação (koff/kon), que pode ser determinada por meio de qualquer método convencional conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando ao método de ressonância plasmônica de superfície, método de termoforese em microescala, um método HPLC-MS e citometria de fluxo (tal como o método FACS). Em certos exemplos de realização, o valor KD pode ser adequadamente determinado pelo uso da citometria de fluxo.

[086] A capacidade de “bloquear a ligação” ou “competir pelo mesmo epítopo” conforme utilizado no presente refere-se à capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de inibir a interação de ligação entre duas moléculas (por exemplo, CD3 épsilon humano e um anticorpo anti- CD3 épsilon) em qualquer grau detectável. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que bloqueia a ligação entre duas moléculas inibe a interação de ligação entre as duas moléculas em pelo menos 85% ou pelo menos 90%. Em certos exemplos de realização, essa inibição pode ser maior do que 85% ou maior do que 90%.

[087] O termo “epítopo”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao grupo específico de átomos ou aminoácidos em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Dois anticorpos podem se ligar ao mesmo epítopo ou a um epítopo estreitamente relacionado dentro de um antígeno se eles exibirem uma ligação competitiva para o antígeno. Por exemplo, se um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno bloqueia a ligação de um anticorpo de referência ao antígeno (por exemplo, CD3 épsilon humano/de macaco recombinante ou CD3 épsilon expresso na superfície de células na presente divulgação) em, pelo menos, 85%, ou pelo menos 90%, então o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser considerado um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo/epítopo estreitamente relacionado ao do anticorpo de referência.

[088] Os peritos hábeis na técnica reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação indevida, se um anticorpo monoclonal humano se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo da presente divulgação (por exemplo, os anticorpos monoclonais de camundongo WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP331_2.488.33, WBP3311_2.615.8, WBP3311_2.844.8, e os anticorpos humanizados WBP3311_2.166.48-Z1-Z1 e WBP3311_2.306.4) determinando se o primeiro impede que o último se ligue a um polipeptídeo antígeno CD3 épsilon. Se o anticorpo teste competir com o anticorpo da presente divulgação, como mostrado por uma diminuição na ligação do anticorpo da presente divulgação ao polipeptídeo antígeno CD3 épsilon, os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo, ou a um epítopo estreitamente relacionado. Ou se a ligação de um anticorpo teste ao polipeptídeo antígeno CD3 épsilon foi inibida pelo anticorpo da presente divulgação, então os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo intimamente relacionado.

[089] Os vários símbolos usados nos nomes de anticorpos, conforme fornecido na presente divulgação, são de representação diferente: “mIgG2” refere-se a um anticorpo com a região constante do camundongo do isotipo IgG2; “uIgG1” refere-se a um anticorpo com a região constante humana do isotipo IgG1; “K” ou “L” refere-se a um anticorpo usando a cadeia leve kappa ou lambda.

[090] Uma “substituição conservadora” com referência à sequência de aminoácidos refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente possuindo uma cadeia lateral com propriedades físico-químicas semelhantes. Por exemplo, substituições conservadoras podem ser feitas entre resíduos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas (por exemplo, Met, Ala, Val, Leu e Ile), entre resíduos com cadeias laterais hidrofílicas neutras (por exemplo, Cys, Ser, Thr, Asn e Gln), entre resíduos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, Asp, Glu), entre aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, His, Lys e Arg) ou entre resíduos com cadeias laterais aromáticas (por exemplo, Trp, Tyr e Phe). Como conhecido no estado da técnica, a substituição conservadora geralmente não causa mudança significativa na estrutura conformacional da proteína e, portanto, pode reter a atividade biológica de uma proteína.

[091] O termo “homólogo” e “homólogo”, conforme usado no presente, são intercambiáveis e se referem a sequências de ácidos nucleicos (ou sua cadeia complementar) ou sequências de aminoácidos que possuem uma identidade de sequência de pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) com outras sequências quando alinhadas de maneira ideal.

[092] A “percentagem (%) de identidade de sequência”, em relação à sequência de aminoácidos (ou sequência de ácido nucleico), é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido (ou ácidos nucleicos) em uma sequência de referência, após alinhar as sequências e, se necessário, introduzir lacunas (gaps), para atingir o número máximo de aminoácidos idênticos (ou ácidos nucleicos). A substituição conservadora dos resíduos de aminoácidos pode ou não ser considerada como resíduos idênticos. O alinhamento para determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) pode ser conseguido, por exemplo, utilizando ferramentas publicamente disponíveis, tais como BLASTN, BLASTp (disponível no site do Centro Nacional de Informação Biotecnológica dos EUA (NCBI - US National Center for Biotechnology Information), vide também, Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)), ClustalW2 (disponível no site do Instituto Europeu de Bioinformática, vide também Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 ( 1996), Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 23 (21):2947-8 (2007)) e programas ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem usar os parâmetros padrão fornecidos pela ferramenta, ou podem personalizar os parâmetros, conforme apropriado para o alinhamento, como, por exemplo, selecionando um algoritmo adequado.

[093] “Funções efetoras”, conforme utilizado na presente invenção, referem-se a atividades biológicas atribuíveis à ligação da região Fc de um anticorpo aos seus efetores, tais como, complexo C1 e receptor de Fc.

Funções efetoras exemplares incluem: citotoxicidade dependente do complemento (CDC) induzida pela interação de anticorpos e C1q no complexo C1; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) induzida pela ligação da região Fc de um anticorpo ao receptor de Fc em uma célula efetora; e fagocitose.

[094] “Tratar” ou “tratamento de” uma condição, conforme utilizado na presente invenção, inclui a prevenção ou o alívio de uma condição, o retardo do início ou da taxa de desenvolvimento de uma condição, a redução do risco de desenvolver uma condição, a prevenção ou retardo do desenvolvimento de sintomas associados a uma condição, a redução ou término de sintomas associados a uma condição, a geração de uma regressão completa ou parcial de uma condição, a cura de uma condição ou combinações dos mesmos.

[095] Uma substância “isolada” foi alterada pela mão do homem a partir do estado natural. Se uma composição ou substância “isolada” ocorre na natureza, ela foi alterada ou removida do seu ambiente original, ou ambos.

Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está “isolado”, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é “isolado” se for suficientemente separado dos materiais coexistentes em seu estado natural de modo a existir em um estado substancialmente puro. Uma “sequência de ácido nucleico isolada” refere-se à sequência de uma molécula de ácido nucleico isolada. Em certos exemplos de realização, um “anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado” refere-se a anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno possuindo uma pureza de, pelo menos, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99%, conforme determinado por métodos eletroforéticos (como SDS- PAGE, focalização isoelétrica, eletroforese capilar) ou métodos cromatográficos (como cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase reversa).

[096] O termo “vetor” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um veículo no qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína pode ser operacionalmente inserido de modo a provocar a expressão dessa proteína. Um vetor pode ser usado para transformar, transduzir ou transfectar uma célula hospedeira de modo a provocar a expressão do elemento genético que ela transporta dentro da célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem plasmídeos, fagoides, cosmídeos, cromossomos artificiais, como cromossomo artificial de fermento (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos como fago lambda ou fago M13 e vírus de animais. As categorias de vírus animais utilizados como vetores incluem retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociados, vírus da herpes (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (por exemplo, SV40). Um vetor pode conter uma variedade de elementos para controlar a expressão, incluindo sequências promotoras, sequências iniciadoras da transcrição, sequências facilitadoras (enhancers), elementos selecionáveis e genes repórter. Além disso, o vetor pode conter uma origem de replicação. Um vetor também pode incluir materiais para auxiliar na sua entrada na célula, incluindo, mas não se limitando a, uma partícula viral, um lipossoma ou proteína de revestimento. Um vetor pode ser um vetor de expressão ou um vetor de clonagem. A presente divulgação provê vetores (por exemplo, vetores de expressão) contendo a sequência de ácido nucleico aqui fornecida que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pelo menos, um promotor (por exemplo, SV40, CMV, EF-1α) operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico e pelo menos um marcador selecionável.

Exemplos de vetores incluem, entre outros, de retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociado, herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus, papovavírus (por exemplo, SV40), fago lambda e Fago M13, plasmídeo pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos e etc.

[097] A frase “célula hospedeira” tal como utilizada na presente invenção refere-se a uma célula na qual um polinucleotídeo exógeno e/ou um vetor foi introduzido.

[098] Uma frase “doença ou condição relacionada ao CD3”, conforme usada no presente pedido, refere-se a qualquer doença ou condição causada, exacerbada por, ou de outra forma ligada ao aumento ou diminuição da expressão ou atividades de CD3. Em alguns exemplos de realização, a condição relacionada ao CD3 é um distúrbio relacionado ao sistema imunológico, como, por exemplo, câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.

[099] O termo “câncer”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer condição médica caracterizada pelo crescimento celular ou neoplasia maligna de células, proliferação anormal, infiltração ou metástase e inclui tumores sólidos e cânceres não sólidos (malignidades hematológicas), como a leucemia. Conforme utilizado na presente invenção, “tumor sólido” refere-se a uma massa sólida de células neoplásicas e/ou malignas.

[100] O termo “farmaceuticamente aceitável” indica que o veículo, transportador, diluente, excipiente(s) e/ou sal designado é, em geral,

quimicamente e/ou fisicamente compatível com os outros ingredientes que compreendem a formulação e fisiologicamente compatível com o seu receptor.

ANTICORPO ANTI-CD3 ÉPSILON

[101] A presente divulgação fornece anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) sequências CDR de um anticorpo anti- CD3 épsilon WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP331_2.488.33, WBP3311_2.615.8, ou WBP3311_2.844.8. Ao longo da presente divulgação, o termo “WBP3311” em relação aos nomes de anticorpos é usado de forma intercambiável com “W3311”. Por exemplo, o anticorpo WBP3311_2.166.48 também é referido como W3311_2.166.48 e esses nomes se referem ao mesmo anticorpo.

[102] “WBP3311_2.166.48”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 81, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 83.

[103] “WBP3311_2.306.4”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 85, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 87.

[104] “WBP3311_2.383.47”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 89, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 91.

[105] “WBP3311_2.400.5”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 95.

[106] “WBP3311_2.482.5”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 97, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 99.

[107] “WBP331_2.488.33”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 101, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 103.

[108] “WBP3311_2.615.8”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 105, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 107.

[109] “WBP3311_2.844.8”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 109, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 111.

[110] A Tabela 1 mostra as sequências de CDR destes 8 anticorpos anti-CD3 épsilon. As sequências da região variável de cadeia pesada e cadeia leve também são fornecidas abaixo.

TABELA 1. Anticorpo ID: CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 WBP3311_2.166.48

VH GYSFTTYYIH WIFPGNDNIKYSEKFKG DSVSIYYFDY SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6 WBP3311_2.166.48

VK KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRKS TQSFILRT SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 WBP3311_2.306.4

VH GFAFTDYYIH WISPGNVNTKYNENFKG DGYSLYYFDY SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 12 WBP3311_2.306.4

VK KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRQS TQSHTLRT SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17 WBP3311_2.383.47

VH GFTFTNYYIH WISPENGNTKYNENFQD DGYSLYYFDY

Anticorpo ID: CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 18 WBP3311_2.383.47

VK KSSQSLLNSRTRKNYLA WASIRVS TQSHTLRT SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 WBP3311_2.400.5

VH GYSFTNYYLH WIFPESDNTKYNEKLKG DSVGNYFFDF SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24 WBP3311_2.400.5

VK KSSQSLVNNRTRKNYLA WASTRES AQSFILRT SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 29 WBP3311_2.482.5

VH GYTFTTYYIH WIFPGSDNIKYNENFKD DSVSRYYFDY SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 30 WBP3311_2.482.5

VK KSSQSLVNDRTRKNYLA WASTRES AQSFILRT SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 35 WBP331_2.488.33

VH GFSFTNYYIH WIFPGTVNTKYNEKFKG DSVGIYYFDF SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 36 WBP331_2.488.33

VK KSSQSLLNNRTRKNYLA WASTRES TQSFILRT SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 WBP3311_2.615.8

VH GYSFTDFYTH WIFPGSDNIKYNEKFKG DSVSVYYFDY SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 42 WBP3311_2.615.8

VK KSSQSLLNIRTRKNYLA WASTRDS TQSFILRT SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 47 WBP3311_2.844.8

VH GFAFTDYYIH WISPGNVNTKYNENFKG DGYSLYYFDY SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 48 WBP3311_2.844.8

VK KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRES TQSHTLRT

[111] As sequências de regiões variáveis de cadeia pesada ou leve kappa dos anticorpos WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP331_2.488.33, WBP3311_2.615.8 e WBP3311_2.844.8 e anticorpos humanizados WBP3311_2.166.48 e WBP3311_2.306.4, são fornecidas abaixo.

WBP3311_2.166.48-VH

[112] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 81):

QVQLQQSGPELVKPGASVKIACKASGYSFTTYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIF PGNDNIKYSEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAIDSVSIYYF DYWGQGTTLTVSS.

[113] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 82):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCTTC AGTGAAGATTGCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAACCTACTATAT ACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGG ATTTTTCCTGGAAATGATAATATTAAGTACAGTGAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACACTGACGGCAGACACTTCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAG CAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCTATAGACTCCGT TAGTATCTACTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTC CTCA.

WBP3311_2.166.48-VK

[114] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 83):

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKL LIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGG GTKLEIK.

[115] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 84):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGA GAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAA CCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT AAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCG CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTGT GCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCG GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA.

WBP3311_2.306.4-VH

[116] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 85):

QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIS PGNVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLY YFDYWGQGTTLTVSS.

[117] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 86):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTC CGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATAT ACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGG ATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGG GCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATA TTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTC CTCA.

WBP3311_2.306.4-VK

[118] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 87):

DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKL LIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGG GTKLEIK.

[119] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 88):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGA GAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAA CCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCT AAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGT GCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCG GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA.

WBP3311_2.383.47-VH

[120] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 89):

QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGFTFTNYYIHWVIQRPGQGLEWIGWISP ENGNTKYNENFQDKATLTADISSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYF DYWGQGTTLTVSS.

[121] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 90):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTC AGTGAGGATATCCTGCAAGACTTCTGGCTTCACCTTCACAAACTACTATATA CACTGGGTGATACAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGTTGGAT TTCTCCTGAAAATGGTAATACTAAATACAATGAAAACTTCCAGGACAAGGC CACACTGACTGCAGACATATCGTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCA GCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGGTATT CCCTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCT CA.

WBP3311_2.383.47-VK

[122] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 91):

DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKL LIYWASIRVSGVPDRFTGSGSGTTFTLTISGVQAEDLAVYYCTQSHTLRTFGG GTKLEIK.

[123] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 92):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGA GAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAA CCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT AAGCTACTGATCTACTGGGCATCCATTAGGGTATCTGGGGTCCCTGATCG CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAACTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGT GCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTATTGCACGCAATCTCATACTCTTCG GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA.

WBP3311_2.400.5-VH

[124] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 93):

QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYSFTNYYLHWVKQRPGQGLEWIGWIF PESDNTKYNEKLKGKATLTADTSSDTAYMHLSSLTFEDSAVYFCARDSVGNYF FDFWGQGTTLTVSS.

[125] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 94):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAATCCTGGGGCTTC AGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACAAACTACTATTTA CACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGAT TTTTCCTGAAAGTGATAATACCAAGTACAATGAGAAATTGAAGGGCAAGGC CACACTGACGGCAGACACATCCTCCGATACAGCCTACATGCACCTCAGCA GCCTGACATTTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTG GAAACTACTTCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCT CA.

WBP3311_2.400.5-VK

[126] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 95):

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMRCKSSQSLVNNRTRKNYLAWYQQKPGQPPKL LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCAQSFILRTFGGG TKLEIK.

[127] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 96):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCGGGAGAG AAGGTCACTATGAGGTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGGTCAACAATAGAACC CGAAAGAACTACTTGGCATGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAA CTATTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC ACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAG GCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCGCGCAATCTTTTATTCTTCGGACGT TCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAA.

WBP3311_2.482.5-VH

[128] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 97):

QVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKPSGYTFTTYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFP GSDNIKYNENFKDKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDSVSRYYF DYWGQGTILTVSS.

[129] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 98):

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGTCTTCA GTGAAGATATCCTGCAAACCTTCTGGCTACACCTTCACAACTTACTATATAC ATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATT TTTCCTGGAAGTGATAATATTAAATACAATGAGAATTTCAAGGACAAGGCCA CACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGC CTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTCAGTA GGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCATTCTCACAGTTTCTTCA.

WBP3311_2.482.5-VK

[130] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 99):

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLVNDRTRKNYLAWYQQKPGLSPKLL IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCAQSFILRTFGGGT KLEIK.

[131] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 100):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAG AAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGGTCAATGATAGAACC CGAAAAAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCTGTCTCCTAAA CTGCTGATCTACTGGGCTTCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC ACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAG GCTGAAGACCTGGCTGTTTATTACTGCGCGCAATCTTTTATTCTTCGGACGT TCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA.

WBP331_2.488.33-VH

[132] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 101):

QVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKASGFSFTNYYIHWVKQRPGQGPEWIGWIFP GTVNTKYNEKFKGKATLTADTSSNTAFMQLSSLTSADSAVYFCARDSVGIYYFD FWGLGTTLTVSS.

[133] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 102):

CAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGACTTCA GTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAGCTTCACAAACTACTATATAC ACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACCTGAGTGGATTGGATGGATT TTTCCTGGAACTGTTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCA CACTGACGGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTTCATGCAGCTCAGCAGCC TGACTTCTGCGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTGGTAT CTACTACTTTGACTTCTGGGGCCTAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA.

WBP331_2.488.33-VK

[134] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 103):

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTVSCKSSQSLLNNRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLL IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGGGT KLEIK.

[135] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 104):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAG AAGGTCACTGTGAGTTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAATAGAACC CGAAAAAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAA CTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC ACAGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAG GCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCGGACGT TCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAA.

WBP3311_2.615.8-VH

[136] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 105):

QVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDFYTHWVRQRPGQGLEWIGWIF PGSDNIKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDSVSVYYF DYWGQGTTLTVSS.

[137] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 106):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAACCTGGGACTTC AATGAAAATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACAGACTTCTATACA CACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGAT TTTTCCTGGAAGTGATAATATTAAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCC ACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAG CCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTAGT GTCTACTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA.

WBP3311_2.615.8-VK

[138] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 107):

DIVMSQSPSSLAVTAGEKVTMSCKSSQSLLNIRTRKNYLAWYQQKPGQSPKL LIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGG GTKLEIK.

[139] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 108):

GACATCGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGACAGCAGGAGA GAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACATTAGAAC CCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGTCTCCTA AACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGACTCTGGGGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTG

CAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA. WBP3311_2.844.8-VH

[140] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 109):

[141] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 110):

WBP3311_2.844.8-VK

[142] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 111):

DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKL LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGG GTKLEIK.

[143] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 112):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGA GAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAA CCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT AAGCTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCG CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTG TGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTC GGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA.

[144] Sabe-se que as CDRs são responsáveis pela ligação ao antígeno; entretanto, verificou-se que nem todas as 6 CDRs são indispensáveis ou imutáveis. Em outras palavras, é possível substituir ou alterar ou modificar uma ou mais CDRs do anticorpo anti-CD3 épsilon WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP331_2.488.83, WBP331_2.488.83 ou WBP3311_2.844.8, e ainda reter substancialmente a afinidade de ligação específica ao CD3 épsilon.

[145] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência CDR3 de cadeia pesada de um dos anticorpos anti-CD3 épsilon WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.42.5, WBP3311, WBP331_2.488.33, WBP3311_2.615.8 e WBP3311_2.844.8. Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos compreendem uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41 e 47. As regiões CDR3 da cadeia pesada estão localizadas no centro do local de ligação ao antígeno e, portanto, acredita-se que elas façam o maior contato com o antígeno, fornecendo a energia mais livre à afinidade do anticorpo ao antígeno. Acreditasse também que a CDR3 de cadeia pesada é de longe a CDR mais diversa do sítio de ligação ao antígeno em termos de comprimento, composição de aminoácidos e conformação por múltiplos mecanismos de diversificação (Tonegawa S. Nature. 302: 575-81). A diversidade na cadeia pesada CDR3 é suficiente para produzir a maioria das especificidades de anticorpos (Xu J.L., Davis M.M.. Immunity. 13: 37-45), bem como a afinidade de ligação ao antígeno desejável (Schier R,. J Mol Biol. 263: 551 -67).

[146] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção compreendem sequências adequadas da região de arcabouço ou estrutural (FR do inglês, Framework), desde que os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos possam se ligar especificamente ao CD3 épsilon. As sequências de CDR fornecidas na Tabela 1 são obtidas a partir de anticorpos de camundongo, mas podem ser enxertadas em quaisquer sequências FR adequadas de qualquer espécie adequada, como camundongo, humano, rato, coelho, entre outras espécies, usando métodos adequados conhecidos no estado da técnica, como técnicas recombinantes.

[147] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos são humanizados. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno humanizado é desejável por sua imunogenicidade reduzida em humanos. Um anticorpo humanizado é quimérico em suas regiões variáveis, uma vez que as sequências CDR não humanas são enxertadas em sequências FR humanas ou substancialmente humanas. A humanização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser essencialmente realizada pela substituição de genes da CDR não humanos (por exemplo, murinos) pelos genes da CDR humanos correspondentes em um gene da imunoglobulina humana (consulte,

por exemplo, Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536).

[148] Os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve humanos adequados podem ser selecionados para alcançar esse objetivo usando métodos conhecidos no estado da técnica. Em um exemplo ilustrativo, a abordagem de “melhor ajuste” (best fit) pode ser usada, onde uma sequência de domínio variável de anticorpo não humano (por exemplo, de roedor) é rastreada ou submetida a comparação utilizando o programa BLAST contra um banco de dados de sequências conhecidas de domínio variável humano; e a sequência humana mais próxima da sequência de consulta não humana é identificada e usada como suporte humano para enxertar as sequências de CDR não humanas (consulte, por exemplo, Sims et al., (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol 196: 901). Alternativamente, uma estrutura derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos pode ser utilizada para o enxerto de CDRs não humanas (consulte, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al.

(1993) J. Immunol., 151: 2623).

[149] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno é composto de substancialmente todas as sequências humanas, exceto para as sequências CDR que são não humanas. Em alguns exemplos de realização, as FRs de região variável e regiões constantes, se presentes, são totalmente ou substancialmente de sequências de imunoglobulina humana. As sequências de FR humanas e as sequências da região constante humana podem ser derivadas de diferentes genes de imunoglobulina humana, por exemplo, sequências FR derivadas de um anticorpo humano e região constante de outro anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende FR1-4 humano e JH e Jκ humano.

[150] Em certos exemplos de realização, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos pela presente invenção compreendem uma ou mais sequências FR de WBP3311_2.166.48-z1 ou WBP3311_2.306.4-z1. A Tabela 2 abaixo mostra as sequências FR de WBP3311_2.166.48-z1 ou WBP3311_2.306.4-z1. As sequências FR nativas de camundongo também estão listadas na Tabela 2. As sequências da região variável de cadeia pesada e cadeia leve também são fornecidas abaixo.

[151] “WBP3311_2.166.48-z1”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao anticorpo humanizado baseado no WBP3311_2.166.48 que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 113, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 115. O WBP3311_2.166.48-z1 tem afinidade ao antígeno comparável quando comparado com seu anticorpo parental WBP3311_2.166.48.

[152] “WBP3311_2.306.4-z1”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao anticorpo humanizado baseado no WBP3311_2.306.4 que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 117, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 119. O WBP3311_2.306.4-z1 tem afinidade ao antígeno comparável quando comparado com seu anticorpo parental WBP3311_2.306.4.

TABELA 2 FR1 FR2 FR3 FR4 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 53 WBP3311_2.1 51 NO: 55

66.48-VH QVQLQQSGPELVKPG WVKQRPGQ KATLTADTSSSTAYMQLSS WGQGTT

ASVKIACKAS GLEWIG LTSEDSAVYFCAI LTVSS SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 61 WBP3311_2.1 59 NO: 63

66.48-z1-VH QVQLVQSGAEVKKPG WVRQAPGQ RVTITADKSTSTAYMELSSL WGQGTL

SSVKVSCKAS GLEWMG RSEDTAVYYCAI VTVSS WBP3311_2.1 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 54

66.48-VK 52 NO: 56

FR1 FR2 FR3 FR4

DIVMSQSPSSLAVSA WYQQKPGQ GVPDRFTGSGSGTDFTLTI FGGGTK

GEKVTMSC SPKLLIY NSVQAEDLAVYYC LEIK SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 62 WBP3311_2.1 60 NO: 64

66.48-z1-VK DIVMTQSPDSLAVSLG WYQQKPGQ GVPDRFSGSGSGTDFTLTI FGGGTK

ERATINC PPKLLIY SSLQAEDVAVYYC VEIK SEQ ID NO: SEQ ID NO: 69 SEQ ID SEQ ID NO: 65 WBP3311_2.3 67 NO: 71

06.4-VH QVQLQQSGPELVKPG WMKQRPGQ RATVTADLSSSTAYMQLSS WGQGTT

ASVRLSCKAS GLEWIG LTSEDSAVYFCAR LTVSS SEQ ID NO: SEQ ID NO: 77 SEQ ID SEQ ID NO: 73 WBP3311_2.3 75 NO: 79

06.4-z1-VH QVQLVQSGAEVKKPG WVRQAPGQ RVTITADKSTSTAYMELSSL WGQGTL

SSVKVSCKAS GLEWMG RSEDTAVYYCAR VTVSS SEQ ID NO: SEQ ID NO: 70 SEQ ID SEQ ID NO: 66 WBP3311_2.3 68 NO: 72

06.4-VK DIVMSQSPSSLTVSAG WYQQKPGQ GVPDRFTGSGSGTAFTLTI FGGGTK

EKVTMSC SPKLLIY SGVQAEDLAVYFC LEIK SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 74 76 NO: 80 WBP3311_2.3

06.4-z1-VK

DIVMTQSPDSLAVSL WYQQKPGQ GVPDRFSGSGSGTDFTLTI FGGGTK

GERATINC PPKLLIY SSLQAEDVAVYYC VEIK WBP3311_2.166.48-Z1-VH

[153] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 113):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIF PGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDY WGQGTLVTVSS.

[154] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 114):

CAGGTGCAACTCGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTTCA GTCAAGGTCAGTTGCAAGGCCAGTGGGTATTCCTTCACTACCTACTACATCC ACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGGCTTGAGTGGATGGGCTGGATC TTTCCCGGCAACGATAATATTAAGTACAGCGAGAAGTTCAAAGGGAGGGTCA CCATTACCGCCGACAAATCCACTTCCACAGCCTACATGGAGTTGAGCAGCCT GAGATCCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCATTGACAGCGTGTCCAT CTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGAGCAGC.

WBP3311_2.166.48-Z1-VK

[155] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 115):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY WASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKV EIK.

[156] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 116):

GACATCGTCATGACCCAGTCCCCAGACTCTTTGGCAGTGTCTCTCGGGGAA AGAGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTTCTGAACAGCAGGACC AGGAAGAATTACCTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCCGGACAGCCTCCTAAG CTCCTGATCTACTGGGCCTCAACCCGGAAGAGTGGAGTGCCCGATCGCTTT AGCGGGAGCGGCTCCGGGACAGATTTCACACTGACAATTTCCTCCCTGCAG GCCGAGGACGTCGCCGTGTATTACTGTACTCAGAGCTTCATTCTGCGGACAT TTGGCGGCGGGACTAAAGTGGAGATTAAG.

WBP3311_2.306.4-Z1-VH

[157] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 117):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIS PGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYF DYWGQGTLVTVSS.

[158] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 118):

CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGT GTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCC ACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATC TCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCA CCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCC TCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCC TGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC.

WBP3311_2.306.4-Z1-VK

[159] Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 119):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKL LIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGG GTKVEIK.

[160] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 120):

GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGA AAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGA CCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCT AAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCG GTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACT GCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCC GCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG.

[161] Os dois anticorpos anti-CD3 épsilon humanizados exemplificativos WBP3311_2.166.48-z1 ou WBP3311_2.306.4-z1 mantiveram a afinidade de ligação específica para células que expressam CD3 (por exemplo, célula T CD4) e são pelo menos comparáveis a, ou até melhores que, os anticorpos parentais de camundongos nesse aspecto. Os dois exemplos de anticorpos humanizados mantiveram sua interação funcional com a célula que expressa CD3, na medida em que ambos podem ativar células T humanas e desencadear a liberação de citocinas TNFalfa e IFNgama.

[162] Em alguns exemplos de realização, as regiões FR derivadas de humanos podem compreender a mesma sequência de aminoácidos que da imunoglobulina humana da qual são derivadas. Em alguns exemplos de realização, um ou mais resíduos de aminoácidos da FR humana são substituídos pelos resíduos correspondentes do anticorpo não humano original. Isto pode ser desejável em certos exemplos de realização para fazer com que o anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo se aproxime a estrutura do anticorpo parental não humano. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em cada uma das sequências FR humanas, ou não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em todas as FRs de um domínio variável de cadeia pesada ou leve. Em alguns exemplos de realização, essa alteração no resíduo de aminoácido pode estar presente apenas nas regiões FR da cadeia pesada, apenas nas regiões FR da cadeia leve ou em ambas as cadeias.

[163] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos ao fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência do domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência do domínio variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119.

[164] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos compreendem toda ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada e/ou toda ou uma porção do domínio variável da cadeia leve. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção são anticorpos de domínio único que consistem em todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada aqui fornecido. Mais informações sobre esse anticorpo de domínio único estão disponíveis na técnica (consulte, por exemplo, a Patente US 6.248.516).

[165] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e seus fragmentos fornecidos pela presente invenção compreendem ainda uma região constante de imunoglobulina. Em alguns exemplos de realização, uma região constante de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada e/ou uma de cadeia leve. A região constante da cadeia pesada compreende as regiões CH1, de dobradiça, e/ou CH2-CH3. Em determinados exemplos de realização, a região constante da cadeia pesada compreende uma região Fc. Em certos exemplos de realização, a região constante de cadeia leve compreende Cκ.

[166] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos têm uma região constante do isotipo IgG1 ou IgG2a, que possui função efetora reduzida ou depletada, tal como ADCC ou CDC, que pode ser avaliada usando vários ensaios, como o ensaio de ligação ao receptor de Fc, ensaio de ligação ao C1q e ensaio de lise celular.

[167] A afinidade de ligação do anticorpo e fragmento fornecido pela presente invenção pode ser representada pelo valor K D, que representa a relação da velocidade de dissociação pela velocidade de associação (k off/kon) quando a ligação entre o antígeno e de ligação do antígeno molécula atinge equilíbrio. A afinidade de ligação ao antígeno (por exemplo, KD) pode ser adequadamente determinada utilizando métodos adequados conhecidos no estado da técnica, incluindo, por exemplo, o ensaio de citometria de fluxo. Em alguns exemplos de realização, a ligação do anticorpo ao antígeno em diferentes concentrações podem ser determinadas por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência média (MFI) determinada pode ser representada graficamente, primeiramente contra a concentração de anticorpo, o valor KD pode depois ser calculado ajustando a dependência da intensidade de fluorescência da ligação específica (Y) e a concentração de anticorpos (X) na equação de saturação de um local: Y=Bmax*X/(KD+X) usando o programa Prism versão 5 (GraphPad Software, San Diego, CA), em que Bmax refere-se à ligação específica máxima do anticorpo testado ao antígeno.

[168] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos são capazes de se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano expresso na superfície da célula ou a um CD3 épsilon humano recombinante. O CD3 épsilon é um receptor expresso na célula. Um CD3 épsilon recombinante é CD3 épsilon solúvel que é expresso de forma recombinante e não está associado a uma membrana celular. Um CD3 épsilon recombinante pode ser preparado por diversas tecnologias recombinantes. Em um exemplo, a sequência de DNA do CD3 épsilon que codifica o domínio extracelular do CD3 épsilon humano (NP_000724.1) (Met1-Asp126) pode ser fundida com um marcador poli-histidina na extremidade C-terminal em um vetor de expressão e depois transfectada e expressa em células 293E e purificada por cromatografia de afinidade-Ni.

[169] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos são capazes de ligar especificamente ao CD3 épsilon humano, expresso sobre a superfície de células com uma afinidade de ligação (KD) não maior do que 5x10-9 M, não maior do que 4x10-9 M, não maior do que 3x10-9 M, não maior do que 2x10-9 M, não maior do que 10-9 M, não maior do que 5x10-10 M, não maior do que 4x10-10 M, não maior do que 3x10-10 M, não maior do que 3x10-10 M, não maior do que 2x10-10 M, não maior do que 10-10 M, não maior do que 5x10- 11 M, não maior do que 4x10-11 M, não maior do que 3x10-11 M, não maior do que 2x10-11 M ou 10-11 M conforme medido por ensaio de citometria de fluxo.

[170] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção reagem de maneira cruzada com o macaco CD3 épsilon de macaco cinomolgo, por exemplo, o CD3 épsilon de macaco cinomolgo expresso em uma superfície celular ou um CD3 épsilon de macaco cinomolgo solúvel recombinante.

[171] A ligação dos anticorpos ao CD3 épsilon recombinante ou CD3 épsilon expresso sobre a superfície das células também pode ser representada pelo valor da “metade da concentração máxima eficaz” (EC50), que se refere à concentração de um anticorpo na qual 50% de seu efeito máximo é observado (por exemplo, ligação ou inibição etc.). O valor de EC 50 pode ser medido por métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, ensaios tipo sanduíche, como ELISA, Western Blot, ensaio de citometria de fluxo e outros ensaios de ligação. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou seus fragmentos aqui fornecidos se ligam especificamente ao CD3 épsilon humano recombinante a uma EC50 (ou seja, 50% da concentração de ligação) não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM, não superior a 0,05 nM, não superior a 0,06 nM, não superior a 0,07 nM ou não superior a 0,08 nM, conforme medido por ELISA. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e os fragmentos dos mesmos aqui fornecidos se ligam especificamente ao CD3 épsilon humano expresso sobre a superfície de células a uma EC50 não maior que 0,5 nM, não maior que 0,6 nM, não maior que 0,7 nM, não maior que 0,8 nM, não maior que 0,9 nM, não maior que 1 nM, não maior que 2 nM, não maior que 3 nM, não maior que 4 nM, não maior que 5 nM, não maior que 6 nM, não maior que 7 nM, não maior que 8 nM, não maior que 9 nM ou não maior que 10 nM, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

[172] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos se ligam ao CD3 épsilon de macaco cinomolgo com uma afinidade de ligação semelhante à do CD3 épsilon humano. Por exemplo, a ligação dos anticorpos exemplares

WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4, WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP3311_2.488.33, WBP3311_2.615.8, WBP3311_2.844.8 ao CD3 épsilon de macaco cinomolgo tem uma afinidade ou valor EC50 semelhante ao do CD3 épsilon humano.

[173] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e os fragmentos dos mesmos aqui fornecidos se ligam especificamente ao CD3 épsilon recombinante de macaco cinomolgo a uma EC50 não superior a 0,001 nM, não superior a 0,005 nM, não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM ou não superior a 0,05 nM, medido por ELISA.

[174] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos fornecidos na presente invenção têm uma afinidade de ligação específica ao CD3 épsilon humano que é suficiente para fornecer uso diagnóstico e/ou terapêutico. Várias estratégias terapêuticas modulam a imunidade de células T visando a sinalização de TCR, particularmente por anticorpos monoclonais anti-CD3 humano que são usados clinicamente.

[175] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo recombinante, anticorpo biespecífico, anticorpo marcado, anticorpo bivalente ou anticorpo anti-idiotípico. Um anticorpo recombinante é um anticorpo preparado in vitro usando métodos recombinantes ao invés de animais.

ANTICORPOS VARIANTES

[176] A presente divulgação também abrange várias formas variantes dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos. Em determinados exemplos de realização, a presente divulgação engloba vários tipos de variantes de um anticorpo exemplar aqui fornecido, ou seja, WBP3311_2.166.48, WBP3311_2.306.4,

WBP3311_2.383.47, WBP3311_2.400.5, WBP3311_2.482.5, WBP331_2.488.33, WBP3311_2.615.8 e WBP3311_2.844.8.

[177] Em certos exemplos de realização, os anticorpos variantes compreendem uma ou mais modificações ou substituições em uma ou mais sequências de CDR, tal como previsto na Tabela 1, uma ou mais sequências FR fornecidas na Tabela 2, as sequências da região variável de cadeia pesada ou leve, e/ou a região constante aqui fornecidas (por exemplo, região Fc). Tais variantes retêm a afinidade de ligação específica para o CD3 épsilon dos anticorpos parentais, mas tem uma ou mais propriedades desejáveis conferidas pela(s) modificação(ões) ou substituição(ões). Por exemplo, as variantes de anticorpo podem ter afinidade de ligação ao antígeno aprimorada, padrão de glicosilação aprimorado, risco reduzido de glicosilação, desaminação reduzida, função(ões) efetora(s) reduzida(s) ou empobrecida(s), ligação ao receptor FcRn melhorada, meia-vida farmacocinética, sensibilidade ao pH e/ou compatibilidade com conjugação (por exemplo, um ou mais resíduos de cisteína introduzidos).

[178] A sequência de anticorpo parental pode ser rastreada para identificar resíduos adequados ou preferidos a serem modificados ou substituídos, usando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, “mutagênese de varredura de alanina” (consulte, por exemplo, Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081 -1085). Resumidamente, os resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados como Arg, Asp, His, Lys e Glu) podem ser identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina), e os anticorpos modificados são produzidos e rastreado para a propriedade interessada. Se a substituição em um determinado sítio de aminoácidos demonstrar uma mudança funcional de interesse, em seguida, a posição pode ser identificada como um resíduo potencial para a modificação ou substituição. Os resíduos potenciais podem ser avaliados posteriormente substituindo-os por um tipo diferente de resíduo (por exemplo, resíduo de cisteína, resíduo carregado positivamente, etc.).

VARIANTE DE AFINIDADE

[179] Uma variante de afinidade pode conter modificações ou substituições em uma ou mais sequências de CDR, conforme fornecido na Tabela 1, em uma ou mais sequências FR fornecidas na Tabela 2, ou nas sequências de regiões variáveis de cadeia pesada ou leve aqui fornecidas. As variantes de afinidade retêm a afinidade de ligação específica ao CD3 épsilon do anticorpo parental, ou até apresentam uma afinidade de ligação específica ao CD3 épsilon melhorada sobre o anticorpo parental. Em certos exemplos de realização, pelo menos uma (ou todas) as substituições nas sequências CDR, sequências FR ou sequências de regiões variáveis compreendem uma substituição conservadora.

[180] Um especialista no assunto entenderá que nas sequências CDR e FR fornecidas na Tabela 1 e Tabela 2, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, ainda que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno resultante retenha a afinidade de ligação ao CD3 épsilon, ou mesmo tenha uma afinidade de ligação aprimorada. Diversos métodos conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para atingir esse objetivo. Por exemplo, uma biblioteca de variantes de anticorpo (como variantes de Fab ou scFv) pode ser gerada e expressa com a tecnologia de exibição de fagos e depois pesquisada quanto à afinidade de ligação ao CD3 épsilon humano. Por outro exemplo, o software de computador pode ser usado para simular virtualmente a ligação dos anticorpos ao CD3 épsilon humano e identificar os resíduos de aminoácidos nos anticorpos que formam a interface de ligação. Tais resíduos podem ser evitados na substituição, de modo a evitar redução na afinidade de ligação, ou direcionados para a substituição, para proporcionar uma ligação mais forte.

[181] Em certos exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências de CDR e/ou uma ou mais sequências de FR. Em certos exemplos de realização, uma variante de afinidade compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições nas sequências CDR e/ou sequências FR no total.

[182] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem 1, 2 ou 3 sequências de CDR com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência àquela (ou aquelas) listada(s) na Tabela 1, enquanto mantêm a afinidade de ligação ao CD3 épsilon em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental.

[183] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma ou mais sequências FR com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência àquela (ou aquelas) listada(s) na Tabela 2, enquanto mantêm a afinidade de ligação ao CD3 épsilon em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental.

[184] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma ou mais sequências de regiões variáveis com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com aquela (ou aquelas) listada(s) na SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID

NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 87 ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, enquanto retém a afinidade de ligação ao CD3 épsilon em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados na sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 119. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões CDRs (ou seja, nas FRs).

VARIANTE DE GLICOSILAÇÃO

[185] Os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos também abrangem uma variante de glicosilação, que pode ser obtida para aumentar ou diminuir a extensão da glicosilação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[186] O anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender um ou mais resíduos de aminoácidos com uma cadeia lateral à qual uma porção de carboidrato (por exemplo, uma estrutura de oligossacarídeo) pode ser ligada. A glicosilação de anticorpos é tipicamente N- ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina, por exemplo, um resíduo de asparagina em uma sequência de tripeptídeo, tal como asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceil- galactosamina, galactose ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente a serina ou treonina. A remoção de um sítio de glicosilação nativo pode ser convenientemente realizada, por exemplo, alterando a sequência de aminoácidos de modo que uma das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada) ou resíduos de serina ou treonina (para sítios de glicosilação O-ligada) presentes na sequência são substituídos. Um novo sítio de glicosilação pode ser criado de uma maneira semelhante, introduzindo uma sequência de tripeptídeo ou resíduo de serina ou treonina.

VARIANTE COM MANIPULAÇÃO DE CISTEÍNA

[187] Os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos também abrangem formas variantes com modificação / manipulação de cisteína, que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos cisteína livres introduzidos.

[188] Um resíduo de cisteína livre é aquele que não faz parte de uma ponte dissulfeto. Uma variante com manipulação de cisteína é útil para conjugação com, por exemplo, um composto citotóxico e/ou de geração de imagens, um marcador ou um radioisótopo entre outros, no local da cisteína manipulada, através de, por exemplo, uma maleimida ou haloacetila. Os métodos para a modificação de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para introdução de resíduos de cisteína livres são conhecidos no estado da técnica, veja, por exemplo, o documento WO2006/034488.

FC VARIANTE

[189] Os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção também abrangem uma forma variante de Fc, que compreende uma ou mais modificações ou substituições de resíduos de aminoácidos em sua região Fc e/ou região de dobradiça.

[190] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a ligação dependente do pH ao receptor Fc neonatal (FcRn). Essa variante pode ter uma meia-vida farmacocinética prolongada, pois se liga ao FcRn em pH ácido, o que lhe permite escapar da degradação no lisossomo e depois ser translocado e liberado para fora da célula. Os métodos de modificação de um anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno para melhorar a afinidade de ligação ao FcRn são bem conhecidos no estado da técnica, vide, por exemplo, Vaughn, D.

et al, Structure, 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R. et al, Antibody Engineering, Volume 1, Cap 27: Engineering of the Fc region for improved PK, publicado pela Springer, 2010; Yeung, Y. et al, Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010); e Hinton, P. et al, J. Immunology, 176:346-356 (2006).

[191] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que alteram a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Certos resíduos de aminoácidos no domínio CH2 da região Fc podem ser substituídos para fornecer atividade ADCC aprimorada.

Alternativa ou adicionalmente, as estruturas de carboidratos no anticorpo podem ser alteradas para aumentar a atividade de ADCC. Os métodos para alterar a atividade de ADCC por manipulação por engenharia genética de anticorpos foram descritos no estado da técnica, consulte, por exemplo, Shields RL. et al., J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604; Idusogie EE. et al., J Immunol.

2000.164(8):4178-84; Steurer W. et al., J Immunol. 1995, 155(3): 1165- 74; Idusogie EE. et al., J Immunol. 2001, 166(4): 2571-5; Lazar GA. et al., PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010; Ryan MC. et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 3009- 3018; Richards JO,. et al., Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27; Shields R. L.

et al, J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T. et al, J. Biol. Chem, 2003, 278: 3466-3473.

[192] Em determinados exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que alteram a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, melhorando ou diminuindo a ligação ao C1q e/ou CDC (consulte, por exemplo, o documento WO99/51642; Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); Patente US 5.648.260; Patente US 5.624.821); e documento WO94/29351 relativos a outros exemplos de região Fc variantes.

[193] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos na interface da região Fc para facilitar e/ou promover a heterodimerização. Essas modificações compreendem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo Fc, em que a protuberância pode ser posicionada na cavidade de modo a promover a interação do primeiro e do segundo polipeptídeo Fc para formar um heterodímero ou um complexo. Os métodos para produção de anticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.

FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[194] A presente invenção também provê fragmentos de ligação ao antígeno anti-CD3 épsilon. Vários tipos de fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos no estado da técnica e podem ser desenvolvidos com base nos anticorpos anti-CD3 épsilon aqui fornecidos, incluindo, por exemplo, os anticorpos exemplares cujas sequências CDR e FR são mostradas nas Tabelas 1 e 2 e suas diferentes variantes (como variantes de afinidade, variantes de glicosilação, variantes de Fc, variantes com modificações de cisteína e assim por diante).

[195] Em certos exemplos de realização, um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD3 épsilon aqui fornecido é um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv) 2, um dsFv-dsFv', um fragmento Fv, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um anticorpo biespecífico, um diacorpo ds, um nanocorpo (nanobody), um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio único ou um anticorpo de domínio bivalente.

[196] Diversas técnicas podem ser usadas para a produção desses fragmentos de ligação ao antígeno. Os métodos ilustrativos incluem digestão enzimática de anticorpos intactos (consulte, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)), células hospedeiras de expressão recombinantes como E. Coli (por exemplo, para os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv), triagem utilizando uma biblioteca de exibição em fago, como discutido acima (por exemplo, para ScFv), e o acoplamento químico de dois fragmentos Fab'-SH para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

[197] Em certos exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno é um scFv. A geração de scFv está descrita, por exemplo, no documento WO 93/16185; e Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. O scFv pode ser fundido com uma proteína efetora na extremidade amino- ou carbóxi- terminal para proporcionar uma proteína de fusão (consulte, por exemplo, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck).

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS, ANTICORPOS MULTIVALENTES

[198] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos são bivalentes, tetravalentes, hexavalentes ou multivalentes. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos monoespecíficos ou biespecíficos.

[199] O termo “valente”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se à presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma determinada molécula. Assim, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Uma molécula bivalente pode ser monoespecífica se os dois sítios de ligação são ambos para ligação específica do mesmo antígeno ou do mesmo epítopo. Da mesma forma, uma molécula trivalente pode ser biespecífica, por exemplo, quando dois sítios de ligação são monoespecíficos para um primeiro antígeno (ou epítopo) e o terceiro sítios de ligação é específico para um segundo antígeno (ou epítopo).

[200] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser monoespecíficos, mas bivalentes, trivalentes ou tetravalentes, com pelo menos dois sítios de ligação específicos para o mesmo antígeno ou epítopo. Isso, em certos exemplos de realização, proporciona uma ligação mais forte ao antígeno ou ao epítopo do que uma contraparte monovalente. Em certos exemplos de realização, em uma porção de ligação ao antígeno bivalente, a primeira valência de sítio de ligação e a segunda valência do sítio de ligação são estruturalmente idênticas (ou seja, possuem as mesmas sequências) ou estruturalmente diferentes (ou seja, possuem sequências diferentes, embora com a mesma especificidade).

[201] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos são biespecíficos. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos biespecíficos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos têm uma primeira especificidade para o CD3 épsilon e uma segunda especificidade. Em alguns exemplos de realização, a segunda especificidade é para CD3 épsilon, mas para epítopos diferentes. Em alguns exemplos de realização, a segunda especificidade é para um segundo antígeno diferente do CD3 épsilon, e cuja presença na proximidade de células T expressando CD3 épsilon é desejável para o segundo antígeno ser reconhecido pelo sistema imune. Por exemplo, aproximando as células T que expressam CD3 épsilon a um antígeno tumoral ou a um antígeno patogênico e, portanto, promovendo o reconhecimento ou a eliminação desse antígeno pelo sistema imunológico.

[202] Em certos exemplos de realização, a segunda especificidade é para um antígeno associado a um tumor ou um epítopo do mesmo. O termo “antígeno associado ao tumor” refere-se a um antígeno que é ou pode ser apresentado na superfície celular de um tumor e que está localizado sobre ou dentro das células tumorais. Em alguns exemplos de realização, os antígenos associados ao tumor podem ser apresentados apenas por células tumorais e não por células normais, isto é, células não tumorais. Em outros exemplos de realização, os antígenos associados ao tumor podem ser expressos exclusivamente em células tumorais ou podem representar uma mutação específica do tumor em comparação com células não tumorais. Em outros exemplos de realização, os antígenos associados ao tumor podem ser encontrados tanto nas células tumorais quanto nas células não tumorais, mas são superexpressos nas células tumorais quando comparados às células não tumorais ou são acessíveis para ligação de anticorpos nas células tumorais devido à estrutura menos compacta do tecido tumoral em comparação com o tecido não tumoral. Em alguns exemplos de realização, o antígeno associado ao tumor está localizado na vasculatura de um tumor.

[203] Exemplos ilustrativos de um antígeno associado a um tumor são CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, tirosina quinase 3 do tipo Fms (FLT-3, CD135), proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4, proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), Her2, Her3, IGFR, IL3R, proteína ativadora de fibroblastos

(FAP), CDCP1, Derlin1, Tenascina, frizzled 1-10, antígenos vasculares VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-alfa (CD140a), PDGFR-beta (CD140b), Endoglina, CLEC14, Tem1-8 e Tie2. Outros exemplos podem incluir A33, CAMPATH-1 (CDw52), antígeno carcinoembrionário (CEA), Carboanidrase IX (MN/CA IX), de2-7, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, proteína de ligação ao folato, G250, tirosina quinase 3 tipo Fms (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina da superfície celular associado ao melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno específico da próstata (PSA) e TAG-72.

[204] Os anticorpos biespecíficos e fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos podem ser feitos com quaisquer métodos adequados conhecidos no estado da técnica. Em uma abordagem convencional, dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo diferentes especificidades antigênicas podem ser coexpressos em uma célula hospedeira para produzir anticorpos biespecíficos de uma forma recombinante (vide, por exemplo, Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983)), seguido de purificação por cromatografia de afinidade.

[205] A abordagem recombinante também pode ser usada, em que as sequências que codificam os domínios variáveis de cadeia pesada do anticorpo para as duas especificidades são respectivamente fundidas às sequências do domínio constante da imunoglobulina, seguidas pela inserção em um vetor de expressão que é cotransfectado com um vetor de expressão com as sequências de cadeia leve em uma célula hospedeira adequada para expressão recombinante do anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, o documento WO 94/04690; Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)). De modo semelhante, os dímeros de scFv também podem ser recombinantemente construídos e expressos a partir de uma célula hospedeira (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).

[206] Em outro método, peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab’ de dois anticorpos diferentes por meio de fusão gênica. Os anticorpos ligados são reduzidos na região da dobradiça para quatro meios-anticorpos (isto é, monômeros) e depois reoxidados para formar heterodímeros (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)).

[207] Os dois domínios de ligação ao antígeno também podem ser conjugados ou reticulados para formar um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno. Por exemplo, um anticorpo pode ser acoplado à biotina enquanto o outro anticorpo à avidina, e a forte associação entre biotina e avidina complexaria os dois anticorpos juntos para formar um anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, a Patente US 4.676.980; WO 91/00360, WO 92/00373 e EP 03089). Para outro exemplo, os dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser reticulados por métodos convencionais conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como divulgado na Patente US 4.676.980.

[208] Os fragmentos de ligação ao antígeno biespecíficos podem ser gerados a partir de um anticorpo biespecífico, por exemplo, por clivagem proteolítica ou por ligação química. Por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab') de um anticorpo pode ser preparado e convertido em Fab'-tiol derivado e, em seguida, misturado e reagido com outro Fab' derivado convertido com uma especificidade antigênica diferente para formar um fragmento de ligação ao antígeno biespecífico (vide, por exemplo, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)).

[209] Em certos exemplos de realização, o anticorpo biespecífico ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser manipulados na interface, de modo que uma associação do tipo “knobs-into-holes” (protuberâncias-em- cavidades) possa ser formada para promover a heterodimerização dos dois sítios de ligação ao antígeno diferentes. “Knob-in-hole”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma interação entre dois polipeptídeos (como o domínio CH3), em que um polipeptídeo tem uma protuberância (ou seja, “knob” devido à presença de um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral volumosa (por exemplo, tirosina ou triptofano) e o outro polipeptídeo possui uma cavidade (por exemplo, “hole”) onde reside um resíduo de aminoácido de cadeia lateral pequena (por exemplo, alanina ou treonina), e a protuberância é posicionável na cavidade para promover a interação dos dois polipeptídeos para formar um heterodímero ou um complexo. Os métodos para produção de polipeptídeos com estas modificações knobs-into-holes são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.

CONJUGADOS

[210] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-CD3 épsilon e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda um conjugado. É contemplado que uma variedade de conjugados possa estar ligada aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

Um conjugado é uma porção não proteinácea que pode ser ligada ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. É contemplado que uma variedade de conjugados possa estar ligada aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção (vide, por exemplo, “Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E.

Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nova Iorque, (1989)). Estes conjugados podem estar ligados aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno por meio de ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação de coordenadas, complexação, associação, mistura ou adição, entre outros métodos.

[211] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno descritos na presente invenção podem ser manipulados para conter sítios específicos fora da porção de ligação do epítopo que podem ser utilizados para ligação a um ou mais conjugados. Por exemplo, tal sítio pode incluir um ou mais resíduos de aminoácidos reativos, como, por exemplo, resíduos de cisteína ou histidina, para facilitar a ligação covalente a um conjugado.

[212] Em certos exemplos de realização, os anticorpos podem estar ligados indiretamente a um conjugado, ou através de outro conjugado.

Por exemplo, o anticorpo ou os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser conjugados com a biotina, depois conjugados indiretamente com um segundo conjugado que está conjugado com a avidina. O conjugado pode ser uma toxina (por exemplo, um agente quimioterápico), um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador tipo substrato enzimático).

[213] Uma “toxina” pode ser qualquer agente prejudicial para as células ou que pode danificar ou matar células. Exemplos de toxinas incluem, sem limitação, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitoxantrona, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina e seus análogos, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes, cloridrato de cloridrato de tetracaína carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daxomiotina) (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina)).

[214] Exemplos de marcadores detectáveis podem incluir marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, rodamina, dansil, ficoeritrina ou Texas Red), marcadores de enzima-substrato (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, luceriferases, glucoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases ou p-D-galactosidase), radioisótopos (por exemplo, I123, I124, I125, I131, S35, H3, In111, In112, C14, Cu64, Cu67, Y86, Y88, Y90, Lu177, At211, Re186, Re188, Sm153, Bi212 e P32, outros lantanídeos, marcadores luminescentes), cromóforos, digoxigenina, biotina/avidina, molécula de DNA ou ouro para detecção.

[215] Em determinados exemplos de realização, o conjugado pode ser uma fração modificadora da farmacocinética, tal como PEG que auxilia a aumentar a meia-vida do anticorpo. Exemplos ilustrativos incluem polímeros solúveis em água, tais como PEG, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, copolímeros de etilenoglicol/propileno glicol e similares. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados por anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes.

[216] Em certos exemplos de realização, o conjugado pode ser uma fração de purificação, como uma esfera magnética.

[217] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção são usados como base para um conjugado.

POLINUCLEOTÍDEOS E MÉTODOS RECOMBINANTES

[218] A presente divulgação fornece polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em certos exemplos de realização, os polinucleotídeos isolados compreendem uma ou mais sequências de nucleotídeos, como mostrado nas SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, e/ou 120, que codificam a região variável dos anticorpos exemplares aqui proporcionados. O DNA codificante do anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). O DNA codificante também pode ser obtido por métodos sintéticos.

[219] O polinucleotídeo isolado que codifica os anticorpos anti- CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, incluindo as sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 e/ou 120) pode ser inserido em um vetor para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou expressão, utilizando técnicas recombinantes conhecidas no estado da técnica.

Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes vetores, geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador/facilitador (enhancer), um promotor (por exemplo SV40, CMV, EF-1α) e uma sequência de terminação da transcrição.

[220] Em alguns exemplos de realização, o sistema de vetor inclui sistemas de mamífero, bactérias, leveduras, etc., e compreende plasmídeos tais como, mas não se limitando a, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO,pVIVO, pMAL, pMD18-T, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 etc. e outros vetores laboratoriais e comercialmente disponíveis. Os vetores adequados podem incluir plasmídeos ou vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados).

[221] Vetores que compreendem a sequência polinucleotídica que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno podem ser introduzidos em uma célula hospedeira para clonagem ou expressão de genes.

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores da presente invenção são células de procariotos, leveduras, ou células eucarióticas superiores descritas acima. Células hospedeiras apropriadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, tal como a Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tal como o B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas tal como a P. aeruginosa, e Streptomyces.

[222] Além dos procariotos, micróbios eucariotos tais como fungos filamentosos e leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores que codificam o anticorpo anti-CD3 épsilon. O Saccharomyces cerevisiae ou fermento comum é o micro-organismo eucarioto mais comumente utilizado dentre os micro-organismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis para a presente invenção, tal como, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K .

thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tal como A. nidulans e A. niger.

[223] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são derivadas de organismos eucariotos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus e células hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquitos), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de cepas virais para a transfecção está disponível publicamente, por exemplo, o variante de L-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente na transfecção de células da Spodoptera frugiperda.

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

[224] Entretanto, há um maior interesse em células de vertebrados e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornaram-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares de hospedeiros mamíferos incluem linhagem CV1 de rim de macaco transformada com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de rim de rato “buffalo rat” (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor da mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em alguns exemplos de realização preferidos, a célula hospedeira é a célula 293F.

[225] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpos anti-CD3 épsilon e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas. Em outro exemplo de realização, o anticorpo pode ser produzido por recombinação homóloga conhecida no estado da técnica.

[226] As células hospedeiras utilizadas para a produção dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura. Os meios de crescimento comercialmente disponíveis, tais como o meio Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descrito em Ham et al., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704, US 4.657.866, US 4.927.762, US 4.560.655, US 5.122.469 documentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou no pedido de Patente US 30.985, pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, se necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como a adenosina e timidina), antibióticos (como GENTAMYCIN ®),

oligoelementos (definidas como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura tais como, temperatura, pH, e similares são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico hábil no assunto.

[227] Quando técnicas recombinantes são utilizadas, os anticorpos podem ser produzidos intracelularmente, no espaço periplasmático, ou secretados diretamente no meio de cultura. Se o anticorpo é produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, tanto de células hospedeiras quanto fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10:163- 167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos secretados no espaço periplasmático da E. coli. Em resumo, a pasta celular é fundida na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante 30 minutos. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é secretado no meio, o sobrenadante destes sistemas de expressão é, em geral, primeiramente concentrado pelo uso de um filtro de concentração proteica comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de utrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como o PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes indesejados.

[228] Os anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos preparados a partir das células podem ser purificados pelo uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose, precipitação de sulfato de amônio, método de precipitação por salificação (salting out), cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida.

[229] Em certos exemplos de realização, a proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade do anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas gama1, gama2, ou gama4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para a gama3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). A matriz ao qual o ligante de afinidade é acoplado é mais frequentemente, agarose, mas também outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidade de fluxo mais rápido e tempo de processamento mais curto do que aqueles que podem ser alcançados com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE®, cromatografia em uma resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocusação, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[230] Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, cerca de 0 a 0,25 M de sal).

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[231] A presente descrição proporciona ainda composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-CD3 épsilon ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[232] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para uso nas composições farmacêuticas aqui reveladas podem incluir, por exemplo, veículos líquidos, em gel ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis, veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos, agentes de suspensão/dispersantes, agentes sequestradores ou quelantes, diluentes, adjuvantes, excipientes ou substâncias auxiliares não tóxicas, outros componentes conhecidos no estado da técnica, ou várias combinações dos mesmos.

[233] Os componentes úteis podem incluir, por exemplo, antioxidantes, cargas (fillers), aglutinantes, desintegrantes, tampões, conservantes, lubrificantes, aromatizantes, espessantes, agentes corantes, emulsificantes ou estabilizantes, tais como açúcares e ciclodextrinas. Os antioxidantes adequados podem incluir, por exemplo, metionina, ácido ascórbico, EDTA, tiossulfato de sódio, platina, catalase, ácido cítrico, cisteína, tioglicerol, ácido tioglicólico, tiosorbitol, hidroxanisol butilado, hidroxitolueno butilado e/ou galato propílico. Conforme descrito na presente invenção, a inclusão de um ou mais antioxidantes tais como a metionina em uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e os conjugados, tal como proporcionado pela presente invenção, diminuem a oxidação do anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno.

Esta redução na oxidação previne ou reduz a perda de afinidade de ligação, melhorando assim a estabilidade do anticorpo e maximizando a vida útil.

Consequentemente, em determinados exemplos de realização são proporcionadas composições que compreendem um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno como os aqui revelados e um ou mais antioxidantes, tal como a metionina. São fornecidos ainda métodos para prevenir a oxidação, prolongar a vida útil e/ou melhorar a eficácia de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como os proporcionados pela presente invenção, pela mistura do anticorpo ou dos fragmentos de ligação ao antígeno com um ou mais antioxidantes, tal como a metionina.

[234] Para ilustrar, os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, veículos aquosos tal como cloreto de sódio para injeção, solução de Ringer para injeção, injeção isotônica de dextrose, água estéril para injeção ou dextrose e Ringer para injeção com lactato, veículos não aquosos, como óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo ou óleo de amendoim, agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, agentes isotônicos como cloreto de sódio ou dextrose, tampões como tampões de fosfato ou citrato, antioxidantes como bissulfato de sódio, anestésicos locais, tal como cloridrato de procaína, agentes de suspensão e dispersão tal como carboximetilceluose sódica, hidroxipropilmetilcelulose ou polivinilpirrolidona, agentes emulsificantes como o Polissorbato 80 (TWEEN-80), agentes sequestradores ou quelantes, tal como EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou EGTA (ácido etilenoglicol tetra-acético), álcool etílico, polietileno glicol, propileno glicol, hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático. Os agentes antimicrobianos utilizados como veículos podem ser adicionados a composições farmacêuticas em recipientes de doses múltiplas que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e porpil p-hidroxibenzoico,

timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os excipientes adequados podem incluir, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. As substâncias auxiliares não tóxicas adequadas podem incluir, por exemplo, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, estabilizantes, potenciadores da solubilidade ou agentes como acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina ou ciclodextrina.

[235] As composições farmacêuticas podem estar em uma solução líquida, suspensão, emulsão, pílula, cápsula, comprimido, formulação de libertação controlada ou pó. As formulações orais podem incluir veículos padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinil-pirrolidona, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.

[236] Em determinados exemplos de realização, as composições farmacêuticas são formuladas em uma composição injetável. As composições farmacêuticas injetáveis podem ser preparadas em qualquer forma convencional, tal como, por exemplo, solução líquida, suspensão, emulsão ou formas sólidas adequadas para gerar solução líquida, suspensão ou emulsão.

As preparações para injeção podem incluir soluções estéreis e/ou apirogênicas prontas para injeção, produtos solúveis em seco estéril, como pó liofilizado, pronto para ser combinado com um solvente imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos estéreis insolúveis em seco prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes do uso, e emulsões estéreis e/ou não pirogênicas.

As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.

[237] Em alguns exemplos de realização, as preparações parenterais de dose unitária são embaladas em uma ampola, frasco ou seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis e não pirogênicas, tal como é conhecido e praticado no estado da técnica.

[238] Em alguns exemplos de realização, um pó estéril e liofilizado é preparado por dissolução de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como o descrito na presente invenção em um solvente adequado.

O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outros componentes farmacológicos do pó ou solução reconstituída, preparados a partir do pó. Os excipientes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, água, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente pode conter um tampão, tal como citrato, sódio ou fosfato de potássio ou outro tampão conhecido pelos especialistas na técnica, em um exemplo de realização, em pH próximo do neutro. A filtração esterilizada subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecidas pelos especialistas na técnica proporciona uma formulação desejável. Em um exemplo de realização, a solução resultante será distribuída em frascos para liofilização. Cada frasco pode conter uma dose única ou doses múltiplas do anticorpo anti-CD3 épsilon ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a sua composição. Os frascos cheios em demasia com uma pequena quantidade acima da necessária para uma dose ou conjunto de doses (por exemplo, cerca de 10%) são aceitáveis de modo a facilitar a retirada precisa da amostra e uma dosagem precisa. O pó liofilizado pode ser armazenado em condições adequadas, tal como cerca de 4 °C até à temperatura ambiente.

[239] A reconstituição de um pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso na administração parenteral. Em um exemplo de realização, para a reconstituição, a água estéril e/ou não pirogênica ou outro veículo adequado líquido é adicionado ao pó liofilizado. A quantidade precisa depende da terapia selecionada sendo dada e pode ser determinada empiricamente.

MÉTODOS DE USO

[240] A presente divulgação também provê métodos terapêuticos compreendendo: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como proporcionado pela presente invenção a um sujeito com tal necessidade, e, desse modo, tratando ou prevenindo uma condição ou um distúrbio relacionado com CD3. Em alguns exemplos de realização, a condição ou distúrbio relacionado ao CD3 é câncer, doença autoimune, doença inflamatória, ou doenças infecciosas.

[241] Exemplos de câncer incluem, entre outros, câncer de pulmão de células não pequenas (escamoso/não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células, câncer de células renais, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de mama (incluindo carcinoma basal de mama, carcinoma ductal) carcinoma lobular da mama), câncer de pâncreas, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, câncer de esôfago, mesotelioma, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, sarcoma, câncer de próstata, glioblastoma, câncer de colo do útero, carcinoma tímico, melanoma, mielomas, micoses fungoides, câncer de células de Merkel, carcinoma hepatocelular (CHC), fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, malignidade linfoide, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireoide, feocromocitomas carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer do colo uterino, tumor testicular, seminoma, linfoma de Hodgkin clássico (CHL), linfoma de grandes células b primário do mediastino, linfoma linfócitos B/histiócitos ricos em células T, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica, policitemia vera, tumores derivados de mastócitos, PTLD positivo e negativo para EBV e linfoma de grandes células B difusos (DLBCL), linfoma plasmático, linfoma extranodal de células NK/T, carcinoma nasofaríngeo, linfoma primário de efusão associado ao HHV8, linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, linfoma primário do SNC, tumor da coluna espinhal, glioma do tronco encefálico, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangiobla estoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

[242] As doenças autoimunes incluem, mas não estão limitadas a, Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS, que é uma doença viral com um componente autoimune), alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolípide, doença autoimune de Addison, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno (AIED), síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), púrpura trombocitopênica autoimune (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, dermatite celíaca- dermatite hepetiforme; síndrome da disfunção da fadiga crônica imune (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (DPIP), pênfigo cicatricial, doença por aglutinina a frio, síndrome da crista, doença de Crohn, doença de Degos, dermatomiosite juvenil, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, doença de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura de trombocitopenia idiopática (ITP), nefropatia por IgA, diabetes mellitus dependente de insulina, artrite crônica juvenil (doença de Still), artrite reumatoide juvenil, doença de Meniere, doença do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia prejudicial, poliarterite nodosa, policondrite,

síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, alfagamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, síndrome de Raynaud, escleroderma rara (esclerose sistêmica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistêmica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, colite ulcerosa, uveíte, vitiligo e granulomatose de Wegener. Os distúrbios inflamatórios incluem, por exemplo, distúrbios inflamatórios crônicos e agudos.

Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem doença de Alzheimer, asma, alergia atópica, alergia, aterosclerose, asma brônquica, eczema, glomerulonefrite, doença do enxerto contra hospedeiro, anemias hemolíticas, osteoartrite, sepse, acidente vascular cerebral, transplante de tecidos e órgãos, vasculite, retinopatia diabética e lesão pulmonar induzida por ventilador. Em alguns exemplos de realização, as condições associadas ao CD3 são doenças inflamatórias, como lúpus eritematoso sistêmico (LES), inflamação da mucosa intestinal, doença debilitante associada à colite, esclerose múltipla, infecções virais, artrite reumatoide, osteoartrite, doença de Cohn e doença inflamatória intestinal, psoríase, esclerodermia sistêmica, diabetes autoimune e similares.

[243] As doenças infecciosas incluem, mas não estão limitadas a, infecção por fungos, infecção por parasita/protozoário ou infecção viral crônica, por exemplo, malária, Coccidioidomicose immitis, histoplasmose, onicomicose, aspergilose, blastomicose, candidíase (Candida albicans), paracoccidioiomicose, microsporidiose, Acanthamoeba keratitis, amebiase, ascaridíase, Babesiose, Balantidiase, bailisascaridíase, doença de Chagas, clonorquíase, infecção por Cochliomyia , criptosporidiose, Difilobotríase, dracunculíase, equinococose, elefantíase, enterobiose, fasciolíase, fasciolopsíase, filariose, giardíase, gnatostomíase, himenolepíase, isosporíase, febre de Katayama, leishmaniose, doença de Lyme, metagonimíase, miíase,

oncocercose, pediculose, escabiose, esquistossomose, doença do sono, estrongiloidíase, teníase, toxocaríase, toxoplasmose, triquinose, tricuríase, tripanossomíase, infecção helmíntica, infecção por vírus da hepatite B (HBV), e hepatite C (HCV), vírus da herpes, vírus Epstein-Barr, HIV, citomegalovírus, vírus herpes simplex tipo I, vírus herpes simplex tipo II, papilomavírus humano, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana I, vírus da imunodeficiência humana II, epidemias do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi ocidental, vírus do anel fino (Torque teno vírus), vírus linfotrófico T humano I, vírus linfotrófico T humano II, varicela zoster, vírus JC ou vírus BK.

[244] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para tratar uma condição em um sujeito que se beneficiaria da regulação positiva de resposta imune, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como fornecidos na presente invenção, ao sujeito com necessidade.

[245] A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme fornecido no presente pedido, dependerá de vários fatores conhecidos no estado técnica como, por exemplo, peso corporal, idade, histórico médico, medicamentos atuais, estado de saúde do sujeito e o potencial de reação cruzada, alergias, sensibilidades e efeitos colaterais adversos, bem como a rota de administração e a extensão de desenvolvimento da doença. As dosagens podem ser proporcionalmente reduzidas ou aumentadas por um dos técnicos hábil no assunto (por exemplo, médico ou veterinário), conforme indicado por essas e outras circunstâncias ou exigências.

[246] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme fornecido no presente pedido pode ser administrado em uma dosagem terapeuticamente eficaz de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg). Em alguns desses exemplos de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a uma dosagem de cerca de 50 mg/kg ou menos, e em alguns desses exemplos de realização a dosagem é de 10 mg/kg ou menos, 5 mg/kg ou menos, 1 mg/kg ou menos, 0,5 mg/kg ou menos, ou 0,1 mg/kg ou menos.

Em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração pode mudar ao longo do tratamento. Por exemplo, em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração inicial pode ser superior às dosagens de administração subsequentes. Em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração pode variar ao longo do tratamento, dependendo da reação do sujeito.

[247] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar uma resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma única dose pode ser administrada, ou várias doses podem ser administradas, divididas ao longo do tempo.

[248] Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados por qualquer via/rota conhecida no estado da técnica, tal como, por exemplo, parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, incluindo a infusão intravenosa, injeção intramuscular ou intradérmica) ou não parenteral (por exemplo, oral, intranasal, intraocular, sublingual, retal ou tópica).

[249] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais meios ou agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterápico ou fármaco anticâncer.

[250] Em alguns desses exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tal como divulgado na presente invenção que é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode ser administrado simultaneamente com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, e em alguns desses exemplos de realização o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser administrados como parte da mesma composição farmacêutica. No entanto, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno administrado “em combinação” com outro agente terapêutico não tem necessariamente que ser administrado simultaneamente com ou na mesma composição que o agente. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno administrado antes ou depois de outro agente é considerado como sendo administrado “em combinação” com esse agente, tal como a frase aqui utilizada, mesmo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno e o segundo agente sejam administrados através de rotas diferentes. Sempre que possível, os agentes terapêuticos adicionais administrados em combinação com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção são administrados de acordo com o cronograma listado na folha de informações do produto de agente terapêutico adicional, ou de acordo com o Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57ª Ed, Medical Economics Company, ISBN: 1563634457; 57ª edição (novembro de 2002)) ou protocolos bem conhecidos no estado técnica.

[251] A presente divulgação provê ainda métodos de uso de anticorpos anti-CD3 épsilon e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de ativação de células T de expressão de CD3 épsilon in vivo ou in vitro, compreendendo: o contato das células T expressando CD3 épsilon com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido. Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê ainda métodos de modular a atividade de CD3 em uma célula expressando CD3 épsilon, compreendendo expor a célula expressando CD3 épsilon ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido na presente invenção.

[252] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê métodos de promover, in vivo ou in vitro, o processamento de um segundo antígeno por células T expressando CD3 épsilon, compreendendo o contato das células T expressando CD3 épsilon com um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido pela presente invenção, em que o anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente às células T que expressam o CD3 épsilon e a um segundo antígeno, trazendo assim ambos em estreita proximidade.

[253] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê métodos para detectar a presença ou quantidade de CD3 épsilon em uma amostra, compreendendo o contato da amostra com o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e determinando a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra.

[254] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê métodos para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito, compreendendo a etapas de: a) obter uma amostra a partir do sujeito; b) colocar a amostra obtida a partir do sujeito em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido pela presente invenção; c) determinar a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra; e d) correlacionar a existência do CD3 épsilon com a doença ou condição relacionada ao CD3 no referido sujeito.

[255] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação também fornece o uso do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito, na fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD3.

[256] Os exemplos a seguir são fornecidos para melhor ilustrar a invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Todas as composições, materiais e métodos específicos descritos abaixo, no todo ou em parte, se enquadram no escopo da presente invenção. Estas composições específicas, materiais e métodos não são destinados a limitar a invenção, pois são utilizados apenas para ilustrar os exemplos de realização específicos abrangidas no escopo da invenção. Um técnico no assunto pode desenvolver composições equivalentes, materiais e métodos sem o exercício da capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção. Será compreendido que podem ser feitas diversas variações nos procedimentos descritos no presente pedido enquanto ainda permanecendo dentro dos limites da presente invenção. É intenção dos inventores que essas variações sejam incluídas no escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

GERAÇÃO DE ANTICORPO DE HIBRIDOMA

1.1 IMUNIZAÇÃO ANIMAL

[257] Proteínas de domínios extracelulares (ECD) recombinantes de CD3 humano, incluindo CD3 épsilon humano (CD3 épsilon) marcados com His-Tag (código cat.: 10977-H08H; Sino Biological Inc. Beijing, China), CD3 gama humano (CD3 gama) (cat: Ab140563; Abcam Shanghai China) e CD3 delta humano (CD3 delta) com His-Tag (cat.: 10977-H08H; Sino Biological Inc.

Beijing, China) foram utilizados como imunógenos para imunização animal. Os camundongos Balb/c foram adquiridos da Shanghai SLAC laboratory animal Co, Ltd. e foram alojados em um biotério aprovado pelo comitê institucional (IACUC). Os camundongos foram imunizados com a mistura de proteínas ECD de CD3 épsilon, CD3 gama e CD3 delta ou imunizados com 7 x 10 6 células T humanas recém isoladas para cada camundongo, misturadas com o adjuvante Titermax por injeções subcutâneas e no coxim plantar a cada duas semanas.

[258] O sangue foi coletado de camundongos antes e após a imunização e os títulos séricos contra as proteínas alvo foram monitorados por ELISA.

1.2 GERAÇÃO DO HIBRIDOMA:

[259] O camundongo com o título sérico mais alto foi escolhido para fusão celular. As células B de baço e linfonodos de camundongos foram fundidas com células SP2/0 de mieloma por eletrofusão, de acordo com os procedimentos gerais de eletrofusão. Após a fusão celular, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços com meio DMEM suplementado com 20% de SBF e 1% de reagente seletivo de HAT.

[260] Os anticorpos apresentados no sobrenadante do meio de hibridoma foram rastreados usando células Jurkat que expressam CD3 pelo teste do citômetro de fluxo (FACS) e contrarrastreados usando células T MOLT-4 T negativas para CD3 por FACS. As células de hibridoma com atividade de ligação para células Jurkat, mas não com ligação cruzada para células MOLT-4 foram coletadas como linhagem de células de hibridoma positivas e, em seguida, prosseguiram para o estágio de subclonagem usando a abordagem de meio semissólido.

[261] Colônias únicas foram coletadas em placas de 96 poços com meio DMEM suplementado com 10% de SBF por 2 a 3 dias e novamente rastreadas contra o alvo de CD3 usando células Jurkat que expressam CD3 por citometria de fluxo (FACS) e contrarrastreadas usando Células T MOLT-4 CD3- negativas por ensaio FACS.

1.3 SEQUENCIAMENTO DE HIBRIDOMA

[262] O RNA foi extraído a partir das células de hibridoma e o cDNA foi amplificado usando o kit 5'-RACE, seguido da amplificação por PCR usando os iniciadores (primers) degenerados em 3'. Os produtos da PCR foram então clonados no vetor pMD18-T, transformados, amplificados e sequenciados.

[263] Foram gerados oito anticorpos monoclonais de camundongo, cujas sequências CDR são mostradas na Tabela 1 acima.

EXEMPLO 2

GERAÇÃO DE ANTICORPO HUMANIZADO

2.1 CONVERSÃO DE IGG E HUMANIZAÇÃO

[264] Geração de anticorpo quimérico a partir de anticorpos monoclonais (mAbs) derivados de murinos: Os genes de WBP3311_2.166.48 e WBP3311_2.306.4 e WBP3312_3.179.16 e genes VH e VL foram amplificados com iniciadores de clonagem contendo sítios de restrição apropriados e clonados no vetor de expressão proprietário da WuXi Biologics para criar clones correspondentes de anticorpos quiméricos com a região constante de IgG1 humana.

[265] Humanização e síntese de genes V humanizados: A abordagem de “melhor ajuste” (best fit) foi usada para humanizar as cadeias leve e pesada do WBP3311_2.166.48 e WBP3311_2.306.4. Para cadeias leves, as sequências de aminoácidos dos genes V correspondentes foram submetidas a pesquisa Blast contra o banco de dados interno do gene V de linhagem germinativa humana. A sequência do gene VL humanizado foi derivada através da substituição de sequências de CDR humanas na melhor correspondência por sequências de CDR de camundongos usando a definição de CDR de Kabat. As regiões de arcabouço foram definidas usando CDR estendida, em que a CDR1 de Kabat foi estendida por 5 aminoácidos no N-terminal. Criaram-se múltiplas sequências humanizadas para cada cadeia pesada e cadeia leve utilizando a pesquisa no Blast das regiões de arcabouço (framework) de camundongos contra o banco de dados de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Diferentes combinações de FR foram criadas e analisadas quanto à afinidade de ligação, os três principais resultados foram utilizados para derivar sequências de genes VH humanizados. Os genes humanizados foram retrotraduzidos, códon-otimizados para expressão em mamíferos e sintetizados pela GeneArt Costum Gene Synthesis (Life Technologies). Os genes sintéticos foram reclonados no vetor de expressão de IgG, expressos e purificados. As FRs dos dois anticorpos humanizados e seus anticorpos parentais de camundongo foram mostrados na Tabela 2 acima.

[266] Expressão transitória e purificação de anticorpos quiméricos e humanizados: Os anticorpos quiméricos e humanizados descritos acima foram construídos no vetor de expressão de propriedade da WuXi Biologics e expressos a partir de células 293F. O sobrenadante da cultura contendo os anticorpos correspondentes foi coletado e purificado utilizando cromatografia de proteína A.

EXEMPLO 3

CARACTERIZAÇÃO IN VITRO

3.1 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS POR ELISA E FACS

[267] Os antígenos, anticorpos e células utilizados no ELISA e FACS descritos abaixo estão listados na tabela 3.

TABELA 3 ANTÍGENOS, ANTICORPOS E CÉLULAS UTILIZADOS NO ELISA E FACS Material Empresa Nº do Cat. Proteína CD3 épsilon humana (CD3 Sino Biological Inc. 10977-H08H épsilon) (His Tag)

Material Empresa Nº do Cat. Proteína CD3 delta humana (CD3 delta) Sino Biological Inc. 10981-H08H (His) Proteína CD3 Gama humana (CD3 gama) Abcam ab140563 Proteína CD3 épsilon de macaco ACRO CDE-C5226 cinomolgo PharmaLegacy Laboratories PBMCs de macaco cinomolgo (Shanghai) Co. 10977-MM03 Anticorpo monoclonal de camundongo Sino Biological Inc. (Clone NO.: anti-CD3 épsilon humano 1A7E5G5) Anticorpo monoclonal de camundongo Sino Biological Inc. 10981-MM08 anti-CD3 delta humano Anticorpo monoclonal de camundongo SANTA CRUZ sc-55563 anti-CD3 gama humano BIOTECHNOLOGY, INC Anticorpo de referência, OKT3 Abcam ab86883 Células Jurkat ATCC TIB-152 Células HUT78 ATCC ECACC-880401901 Células MOLT-4 ATCC CRL-1582 Meio semissólido Stemcells 03814

[268] Ligação de anticorpos à proteína por ELISA e EC50: As proteínas humanas CD3 épsilon, CD3 delta e CD3 gama foram pré- revestidas em placas de 96 poços, respectivamente. A afinidade de ligação de oito mAb em várias concentrações para estes três domínios extracelulares da proteína CD3 diferentes foi detectada utilizando um anticorpos secundários marcados com HRP correspondentes. A EC 50 da ligação (concentração do anticorpo teste quando se atinge metade da ligação máxima) foi analisada utilizando o programa de computador GraphPad Prism: regressão não linear (ajuste de curva)-log (agonista) vs.

inclinação variável-resposta.

[269] Ligação específica de anticorpos à proteína CD3 épsilon humana por ELISA: Oito mAbs de camundongos mostraram atividade de ligação altamente específica para CD3 épsilon humano, sem ligação ao CD3 gama e CD3 delta, os dados estão apresentados na Tabela 5.

TABELA 5 LIGAÇÃO ESPECÍFICA CONTRA A PROTEÍNA DA SUBUNIDADE CD3 ÉPSILON HUMANA ELISA (A450) mAbs CD3 épsilon humano CD3 gama humano CD3 delta humano (PC: 1,6; NC: 0,05) (PC: 1,21; NC: 0,05) (PC: 1,9; NC: 0,05) W3311-2.166.48 1,64 0,05 0,05 W3311-2.306.4 1,46 0,06 0,05 W3311-2.383.47 1,61 0,05 0,05 W3311-2.400.5 1,57 0,05 0,05 W3311-2.482.5 1,33 0,06 0,05 W3311-2.488.33 1,70 0,06 0,05 W3311-2.615.8 1,55 0,05 0,05 W3311-2.844.8 1,54 0,07 0,06

[270] Ligação celular de anticorpos por FACS e EC50: Várias concentrações de mAbs teste foram adicionadas às células Jurkat, e em seguida, a atividade de ligação dos mAbs sobre a superfície das células foi detectada utilizando um anticorpo secundário marcado com FITC. O OKT3 foi usado como controle positivo. As células coradas foram analisadas usando um instrumento BD Biosciences FACSCanto II e o software Flow Jo. A EC50 da ligação foi calculada usando a equação do software GraphPad Prism: regressão não linear (ajuste de curva)-log (agonista) vs. inclinação variável-resposta.

[271] Ligação específica ao receptor CD3 humano na superfície de células T: Oito mAbs mostraram atividade de ligação altamente específica para células que expressam CD3 humano (células Jurkat), sem ligação nas células negativas para CD3 (células MOTL-4 e células 293F), conforme exibido na Tabela

6.

TABELA 6 LIGAÇÃO ESPECÍFICA AO RECEPTOR CD3 HUMANO EM DIVERSAS LINHAGENS DE

CÉLULAS POR FACS MFI (FACS ) MFI (FACS ) MFI (FACS ) mAbs (JurkatB10: (MOLT-4: 22,7~27,3) (293F:22,6~24,6) 3145~4045) W3311-2.166.48 2139 42,5 24,9

MFI (FACS ) MFI (FACS ) MFI (FACS ) mAbs (JurkatB10: (MOLT-4: 22,7~27,3) (293F:22,6~24,6) 3145~4045) W3311-2.306.4 3365 53,5 29,1 W3311-2.383.47 2132 44,5 29,8 W3311-2.400.5 2741 54,5 25,1 W3311-2.482.5 2390 54,8 25,0 W3311-2.488.33 2266 58,4 30,2 W3311-2.615.8 2215 57,2 25,7 W3311-2.844.8 984 42,5 22,7

3.2 LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS ÀS PROTEÍNA ALVO DE DIFERENTES ESPÉCIES

POR ELISA E FACS

[272] As afinidades de ligação dos anticorpos teste ao CD3 de diferentes espécies foram analisadas. A homologia das sequências de referência do CD3 humano, de macaco, rato e camundongo é mostrada abaixo.

TABELA 4 HOMOLOGIA ENTRE AS SEQUÊNCIAS DO DOMÍNIO CD3 DE HUMANO, MACACO, RATO

E CAMUNDONGO Espécie CD3 épsilon (%) CD3 delta (%) CD3 gama (%) 100 100 100 Humano (NP_000724) (NP_000723) (NP_000064) Macaca fascicularis 83 94 81 (macaco) (NP_001270544) (NP_001274617) (NP_001270839) 84 94 82 Macaca mulatta (macaco) (XP_001097204) (NP_001097302) (NP_001253854) Camundongo 59 (NP_031674) 64 (NP_038515) 70 (AAA37400) 57 71 Rattus norvegicus (Rato) 69 (NP_037301) (NP_001101610) (NP_001071114)

[273] Ligação cruzada de anticorpos ao CD3 épsilon de macaco cinomolgo e CD3 épsilon de camundongo por ELISA: Diversas concentrações de anticorpos teste, controles positivos e negativos foram adicionados em placas de 96 poços que foram pré-revestidas com CD3 épsilon de macaco cinomolgo e CD3 épsilon de camundongo. A ligação dos anticorpos á proteína CD3 épsilon de macaco cinomolgo e CD3 épsilon de rato foi detectada por anticorpo secundário marcado com HRP correspondente (Bethyl, A90-231P). A

EC50 da ligação foi calculada usando a equação do software GraphPad Prism: Os dados mostraram que todos os oito mAbs apresentaram potente atividade de ligação cruzada ao CD3 épsilon de macaco cinomolgo, mas nenhuma ligação ao CD3 épsilon de camundongo. O controle positivo, OKT3, não mostrou atividade de ligação cruzada com o CD3 épsilon de macaco-cinomolgo ou com o CD3 épsilon de camundongo, vide a Tabela 7.

TABELA 7 LIGAÇÃO CRUZADA CONTRA O CD3 ÉPSILON DE MACACO CINOMOLGO E O CD3

ÉPSILON DE CAMUNDONGO ELISA A450 mAbs CD3 épsilon de CD3 épsilon de CD3 épsilon humano macaco cinomolgo camundongo Controle Negativo 0,046 0,046 0,179 OKT3 0,048 0,052 0,24 W3311-2.166.48 2,761 2,808 0,446 W3311-2.306.4 2,909 2,822 0,711 W3311-2.383.47 2,786 2,756 0,666 W3311-2.400.5 2,828 2,794 0,709 W3311-2.482.5 2,953 2,874 0,61 W3311-2.488.33 2,914 2,831 0,607 W3311-2.615.8 2,824 2,713 0,471 W3311-2.844.8 2,923 2,75 0,6

[274] Ligação cruzada de anticorpos ao CD3 épsilon do macaco cinomolgo por FACS: PBMCs de macacos cinomolgos foram isoladas a partir do sangue total de macacos cinomolgos saudáveis por centrifugação em gradiente utilizando Ficoll-Paque PLUS e etapas de centrifugação de 100 g para remover os trombócitos. As PBMCs foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo até estarem prontas para uso. Várias concentrações de anticorpos teste foram adicionadas às PBMCs de macacos cinomolgos, em seguida, a atividade de ligação dos anticorpos na superfície das células foi detectada utilizando anticorpos secundários marcados com FITC (Jackson, 115-095-008).

[275] As células coradas foram analisadas usando um instrumento BD Biosciences FACSCanto II e o software Flow Jo. A EC50 da ligação foi calculada usando a equação do software GraphPad Prism: regressão não linear (ajuste de curva).

[276] Classificação de epítopos de anticorpos por FACS: Várias concentrações de anticorpos teste foram misturadas com certa quantidade de anticorpo biotinilado W3311-2.383.47, respectivamente. A mistura foi então adicionada às células expressando CD3 em placas de 96 poços e incubada a 4ºC por 1 hora. A ligação do anticorpo alvo nas células que expressam CD3 foi detectada usando o anticorpo anti-biotina conjugado com PE. As amostras foram testadas por citometria de fluxo e os dados foram analisados pelo programa Flow Jo.

[277] Ligação contra a proteína CD3 épsilon humana e CD3 épsilon de macaco cinomolgo e cálculo de EC50 por ELISA: Oito mAbs mostraram forte atividade de ligação para o CD3 épsilon humano e ligação cruzada para a proteína CD3 épsilon de macaco cinomolgo e mostram EC 50 comparável em um intervalo nM baixo entre CD3 épsilon humano e CD3 épsilon de macaco cinomolgo, vide a Tabela 8.

TABELA 8 EC50 DE OITO MABS PARA CD3 ÉPSILON HUMANO E CD3 ÉPSILON DE MACACO

CINOMOLGO EC50 para CD3 épsilon EC50 para CD3 épsilon de macaco mAbs humano(nM) cinomolgo (nM) W3311-2.166.48 0,049 0,033 W3311-2.306.4 0,012 0,011 W3311-2.383.47 0,074 0,028 W3311-2.400.5 0,053 0,024 W3311-2.482.5 0,069 0,028 W3311-2.488.33 0,026 0,019 W3311-2.615.8 0,033 0,025 W3311-2.844.8 0,011 0,009 WBP331-BMK1 (UCHT1) 0,186 NA

EC50 para CD3 épsilon EC50 para CD3 épsilon de macaco mAbs humano(nM) cinomolgo (nM) Control isotípico NA NA

4.3 DETECÇÃO DE LIGAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES DOS ANTICORPOS HUMANIZADOS

[278] Ligação à proteína CD3 épsilon de macaco cinomolgo e valor de EC50 de dois mAbs humanizados: Todos os dados indicaram que ambos os mAbs humanizados mantiveram a sua elevada atividade de ligação à proteína CD3 épsilon de macaco cinomolgo (vide a Figura 1) com um valor EC50 de 0,043 nM para ambos os anticorpos humanizados, conforme mostrado na Tabela 9.

TABELA 9 EC50 DE DOIS MABS HUMANIZADOS PARA O CD3 ÉPSILON DE MACACO CINOMOLGO mAbs EC50 (nM) W3311-2.166.48-z1- 0,043 uIgG1K W3311-2.306.4-z1-uIgG1K 0,043 W3311-2.166.48 0,125 controle isotípico N/A

[279] Afinidade de Anticorpos por FACS: 5x104 células Jurkat/poço foram semeadas em placas de 96 poços, seguido pela adição anticorpos purificados testes em várias concentrações como anticorpo primário durante 1 hora a 4ºC. O anticorpo secundário de cabra anti-Fc IgG de camundongo marcado com FITC foi adicionado e incubado durante 30 minutos a 4ºC, e, em seguida, as células coradas por FITC foram detectadas por FACS.

O valor KD foi calculado de acordo com o método descrito acima.

[280] Dois mAbs humanizados foram testados quanto à atividade de ligação às células T CD4 humanas: Os dados indicaram que ambos os anticorpos humanizados mantiveram alta atividade de ligação às células T CD4 (consulte a Figura 2) com baixos valores de EC50 de 1,01 e 0,46 nM para

WBP3311-2.166.48-z1-uIgG1k e WBP3311-2.306.4-z1-uIgG1k, respectivamente, que foram 0,5-1 vezes inferiores ao dos respectivos anticorpos parentais, consulte a Tabela 10.

TABELA 10 LIGAÇÃO DE DOIS MABS HUMANIZADOS ÀS CÉLULAS T HCD4 POR FACS E EC50 mAbs EC50 (nM) W3311-2.166.48-z1-uIgG1K 1,01 W3311-2.166.48-mIgG2aK 3,514 W3311-2.306.4-z1-uIgG1K 0,253 W3311-2.306.4-mIgG2bK 0,461 OKT3 0,202 controle isotípico N/A

4.5 AFINIDADE E EC50 DE ANTICORPOS POR FACS

[281] Oito mAbs foram testados para seus EC50 por FACS e foi testada a afinidade dos mAbs para células que expressam CD3 humano (células Jurkat). A EC50 dos 8 mAbs variou de 0,57 nM a 6,91 nM (consulte a Tabela 11), e a afinidade variou de 1,3x10 -9 a 9,3x10-10 M, conforme mostrado na Tabela 12.

TABELA 11 MEDIÇÃO DA EC50 EM CÉLULAS JURKAT POR FACS mAbs EC50 (nM) W3311-2.166.48 6,91 W3311-2.306.4 0,57 W3311-2.383.47 0,91 W3311-2.400.5 2,5 W3311-2.482.5 3,71 W3311-2.488.33 2,97 mAbs EC50 (nM) W3311-2.615.8 4,65 W3311-2.844.8 0,77 OKT3 0,2 TABELA 12

VALOR KD DE OITO MABS EM CÉLULAS JURKAT POR FACS WBP3311.OKT3- W3311-2.166.48 W3311-2.383.47 W3311-2.488.33 W3311-2.306.4 W3311-2.400.5 W3311-2.482.5 W3311-2.615.8 W3311-2.844.8 Amostra méd; Melhor 1,26E- 1,17E- 1,12E- 1,13E- 1,30E- 1,30E- 1,20E- 1,19E- 9,41E- ajuste-Bmax 10 10 10 10 10 10 10 10 11 Melhor 1,67E- 1,91E- 4,03E- 9,34E- 2,29E- 1,32E- 2,23E- 2,52E- 1,29E- ajuste-KD 09 10 10 10 09 09 09 10 10 1,66E- 1,19E- 1,62E- 1,76E- 2,35E- 2,51E- 2,18E- 1,00E- 1,95E- EP-Bmax 12 12 12 12 12 12 12 12 12 5,62E- 8,32E- 2,15E- 4,38E- 9,63E- 6,98E- 9,47E- 8,64E- 1,27E- EP-KD 11 12 11 11 11 11 11 12 11

4.6 MEDIÇÃO DA KD CINÉTICA DE AFINIDADE DE DOIS MABS HUMANIZADO POR

FACS

[282] Dois mAbs humanizados foram testados para medição de afinidade em células Jurkat por FACS. Os dados indicaram que ambos os mAbs humanizados retinham a atividade de alta afinidade para células Jurkat com valores KD semelhantes aos seus respectivos mAbs parentais, consulte a Figura 4 e Tabela 13.

TABELA 13

MEDIÇÃO DE KD CINÉTICA DE DOIS MABS HUMANIZADOS EM CÉLULAS JURKAT POR

FACS WBP3311-2,166,48-z1- WBP3311-2,306,4-z1- Amostra OKT3 uIgG1k uIgG1k Melhor ajust.-Bmax 7,32E-12 6,83E-12 6,06E-12 Melhor ajust.-KD 2,01E-10 5,30E-11 2,77E-11 EP-Bmax 3,82E-13 3,49E-13 2,19E-13 EP-KD 4,38E-11 1,14E-11 5,13E-12

3.3 ENSAIOS FUNCIONAIS BASEADOS EM CÉLULAS

[283] Internalização celular de anticorpos por FACS: As células Jurkat foram inoculadas a 1x105/poço em placas de 96 poços. Os anticorpos de teste (1 µg/mL) foram adicionados às células e incubados por 1 hora a 4ºC.

Após a incubação, os anticorpos não ligados foram lavados e as células foram então incubadas durante 3 horas a 4ºC ou 37ºC com 5% de CO 2. Após a incubação, a presença de anticorpos na superfície celular foi detectada pelo segundo anticorpo (Abcam, ab98742). As células coradas foram analisadas usando um instrumento BD Biosciences FACSCanto II e o software Flow Jo. A taxa de internalização foi calculada da seguinte forma: [(MFI 0 hora - MFI3 horas) / MFI0 hora] * 100 %.

4.7 MEDIÇÃO DA TAXA DE INTERNALIZAÇÃO CELULAR

[284] A taxa de internalização foi testada usando células Jurkat por FACS. Os dados indicaram todos os 8 mAbs mostraram alta taxa de internalização que vão desde 86-94% de anticorpo internalizado após o período de estudo de 3 horas, enquanto que o OKT3 mostrou cerca de 72% de taxa de internalização, conforme mostrado na Figura 5.

[285] Ativação de células T por anticorpos com ensaio de coloração de citocina intracelular: A coloração de citocina intracelular é um ensaio baseado em citometria de fluxo que pode detectar a produção de citocinas por células imunes em combinação com marcadores de superfície celular. PBMCs humanas foram isoladas de doador saudável. Resumidamente, foi utilizada a centrifugação em gradiente Ficoll-Paque PLUS com subsequentes etapas de centrifugação de 100 g para remover os trombócitos.

As PBMCs foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo. As PBMCs foram ressuspensas em meio de cultura de células suplementado com Golgi Stop e inoculadas a 2x105/poço em placas de 96 poços. Várias concentrações de anticorpos teste, controles positivos e negativos foram adicionadas e depois incubadas com as células por 4,5 horas a 37ºC. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com BSA a 1% e depois coradas para seus criadores de superfície usando o anticorpo anti-CD4-FITC humano (BD, 550628) e o anticorpo anti-CD8-PE humano (BD, 560959), seguido de fixação e permeabilização usando o Kit de coloração de células T reguladoras humanas (eBioscience, 88-8999). Após a fixação/permeabilização, as células foram detectadas quanto à produção de citocinas usando o anticorpo anti-TNF- APC humano (BD, 554514) e o anticorpo anti-IFN-PerCP-Cy5.5 humano (eBioscience, 45-7319-42). As células coradas foram analisadas usando o software BD Biosciences FACSCanto II e FlowJo Version.

[286] Ativação de células T: A ativação de células T foi avaliada usando PBMCs humanas pelo método de coloração de citocinas intracelular e as citocinas TNFα e INFγ foram monitoradas. Os dados indicaram que, entre os 8 mAbs testados, 2.306.4 e 2.844.8, não exibiram eventos significativos de ativação de células T, pois não foram monitoradas liberações significativas das citocinas TNFα e INFγ, enquanto todos os outros 6 mAbs testados mostraram ativação de células T na mesma extensão que o OKT3, exceto o clone

2.383.47, que mostrou uma ativação mais fraca das células T em comparação com o OKT3, os dados são mostrados na Figura 6.

[287] Ativação de células T humanas de dois mAbs humanizados: Os dois mAbs humanizados foram testados quanto a atividade de ativação de células T em PBMCs humanas pelo método de coloração intracelular de citocinas, e as citocinas de TNFα e IFNγ foram monitoradas. Os dados indicaram que ambos os anticorpos humanizados mostraram ativação de células T em extensão semelhante ao do controle positivo OKT3 nas células T CD8+, enquanto que os dois mAbs humanizados mostraram ativação em menor extensão de células T CD4+ em comparação com o OKT3. Observou-se também que o anticorpo parental de camundongo do clone 2.306.4 não exibiu repetidamente nenhuma ativação de células T. Os dados são mostrados na Figura 7.

3.4 CLASSIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS DE ANTICORPOS POR FACS:

[288] Classificação de epítopos: Sete dentre 8 mAbs são agrupados contra o clone 2.383.47 e o resultado mostrou que todos os 8 mAbs compartilham a mesma categoria de epítopos, conforme mostrado na Figura 8.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO, isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender 1, 2 ou 3 sequências da região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e/ou 1, 2, ou 3 sequências CDR de cadeia leve kappa selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 48.

2. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29;

f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41; e h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47.

3. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; c) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18; d) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; e) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30;

f) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36; g) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42; e h) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48.

4. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 14,

SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18;

d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;

e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30;

f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;

g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 37, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 38,

SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42; ou h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1,

2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID

NO: 43, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48.

5. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda 1, 2, 3 ou 4 sequências de regiões de arcabouço (Framework (FR)) de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas: SEQ ID NOs: 57, 59, 61, 63, 73, 75, 77 e 79 e/ou 1, 2, 3 ou 4 sequências de regiões de arcabouço (FR) de cadeia leve selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 58, 60, 62, 64, 74, 76, 78 e 80.

6. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117 e as sequências homólogas que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência com as mesmas.

7. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119 e as sequências homólogas que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência com as mesmas.

8. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,

caracterizado por compreender:

a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 83;

b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 87;

c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 91;

d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 93 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 95;

e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 97 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 99;

f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 101 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 103;

g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 105 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 107;

h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 111;

i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

SEQ ID NO: 113 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 115; ou j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 119.

9. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos e ainda manter a afinidade de ligação específica para o CD3 épsilon.

10. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela substituição estar presente em uma ou mais sequências CDR e/ou em uma ou mais sequências FR, em uma ou ambas as sequências de região variável e/ou na região Fc.

11. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pela substituição conferir uma ou mais propriedades desejáveis selecionadas dentre: a) melhorar a afinidade de ligação ao CD3 épsilon, b) introduzir ou remover de um sítio de glicosilação, c) introduzir um resíduo de cisteína livre, d) aumentar ou reduzir a ADCC ou CDC, e) aumentar da meia-vida sérica; e f) aumentar da ligação ao FcRn.

12. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda uma região constante de imunoglobulina, opcionalmente uma região constante de IgG, opcionalmente uma região constante de IgG1 humana.

13. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo humanizado.

14. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um scFv, um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv)2, um dsFv- dsFv’, um fragmento Fv, um Fab, um Fab’, um F(ab')2, um ds diacorpo, um nanocorpo, um anticorpo de domínio ou um anticorpo de domínio bivalente.

15. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser biespecífico.

16. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ter uma primeira especificidade para o CD3 épsilon e uma segunda especificidade.

17. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela segunda especificidade ser para um segundo antígeno diferente do CD3 épsilon, em que a presença do segundo antígeno na proximidade de células T que expressam CD3 épsilon é desejável para que o segundo antígeno seja reconhecido pelo sistema imune.

18. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela primeira especificidade antigênica ser uma especificidade para o CD3 épsilon e a segunda especificidade antigênica ser uma especificidade para um antígeno associado a um tumor.

19. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,

caracterizado por estar ligado a um ou mais conjugados.

20. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo conjugado compreender um agente quimioterápico, uma toxina, um isótopo radioativo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador de substrato enzimático.

21. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar especificamente ao CD3 épsilon e, opcionalmente, compreende CD3 épsilon ser derivado de camundongo, rato, macaco ou humano e, opcionalmente, compreende CD3 épsilon ser um CD3 épsilon recombinante ou CD3 épsilon expresso sobre uma superfície celular.

22. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de ligar especificamente ao CD3 épsilon humano, expresso na superfície de uma célula com um valor KD não maior do que 5x10-9 M, não maior do que 4x10-9 M, não maior do que 3x10-9 M, não maior do que 2x10-9 M, não maior do que 10-9 M, não maior do que 5x10-10 M, não maior do que 4x10-10 M, não maior do que 3x10-10 M, não maior do que 3x10-10 M, não maior do que 2x10-10 M, não maior do que 10-10 M, não maior do que 5x10-11 M, não maior do que 4x10-11 M, não maior do que 3x10-11 M, não maior do que 2x10-11 M ou 10-11 M conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.

23. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se ligar especificamente ao CD3 épsilon recombinante de macaco cinomolgo com uma EC50 não superior a 0,001 nM, não superior a 0,005 nM, não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM ou não superior a 0,05 nM, conforme medido por

ELISA.

24. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se ligar especificamente ao CD3 épsilon humano recombinante a uma EC50 não superior a 0,01 nM, não superior a 0,02 nM, não superior a 0,03 nM, não superior a 0,04 nM, não superior a 0,05 nM, não superior a 0,06 nM, não superior a 0,07 nM ou não superior a 0,08 nM, conforme medido por ELISA.

25. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por competir com o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações anteriores pela ligação ao mesmo epítopo.

26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

27. POLINUCLEOTÍDEO isolado, caracterizado por codificar o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo das reivindicações 1 a 25.

28. POLINUCLEOTÍDEO isolado, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 e 120.

29. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo isolado da reivindicação 27 ou 28.

30. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizado por compreender o vetor da reivindicação 29.

31. MÉTODO DE EXPRESSAR O ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado por compreender o cultivo da célula hospedeira da reivindicação 30 sob condições em que o vetor da reivindicação 29 seja expresso.

32. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA ou condição em um sujeito que se beneficiaria pela modulação da atividade de CD3 épsilon, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 25 ou a composição farmacêutica da reivindicação 26 ao sujeito.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela doença ou condição ser uma doença ou condição relacionada ao CD3.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela doença ou condição ser câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ser biespecífico e a doença ou condição ser o câncer.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo sujeito ser humano.

37. MÉTODO PARA ATIVAR CÉLULAS T que expressam CD3 épsilon de maneira in vivo ou in vitro, caracterizado por compreender o contato das células T que expressam CD3 épsilon com o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 25.

38. MÉTODO DE MODULAÇÃO da atividade de CD3 em uma célula que expressa CD3 épsilon, caracterizado por compreender a exposição das células que expressam CD3 épsilon ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25.

39. MÉTODO PARA PROMOVER O PROCESSAMENTO in vivo ou in vitro de um segundo antígeno por células T expressando CD3 épsilon, caracterizado por compreender o contato das células T expressando CD3 épsilon com um anticorpo biespecífico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 18, em que o anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente às células T que expressam o CD3 épsilon e a um segundo antígeno, trazendo assim ambos em estreita proximidade.

40. MÉTODO PARA DETECTAR a presença ou quantidade de CD3 épsilon em uma amostra, caracterizado por compreender o contato da amostra com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25; e determinar a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra.

41. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito, caracterizado por compreender: a) obter uma amostra a partir do sujeito; b) colocar a amostra obtida a partir do sujeito em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25; c) determinar a presença ou quantidade de CD3 épsilon na amostra; e d) correlacionar a presença ou quantidade de CD3 épsilon com a existência ou estado de uma doença ou condição relacionada ao CD3 no sujeito.

42. USO DO ANTICORPO ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pela fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição relacionada ao CD3 em um sujeito.

43. USO DO ANTICORPO ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pela fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD3.

44. KIT, caracterizado por compreender o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, útil na detecção de CD3 épsilon, opcionalmente CD3 épsilon recombinante, CD3 épsilon expresso na superfície celular ou células que expressam CD3 épsilon.