JP2016520600A

JP2016520600A - 新規抗体

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Publication number: JP2016520600A
Application number: JP2016515677A
Authority: JP
Inventors: グンデテア; マイヤーセバスティアン; ウレッヒダービト
Original assignee: ヌマブアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-07-14
Also published as: CN105408357A; WO2014191113A8; KR20160014010A; US20160090416A1; EP3004164A1; HK1217023A1; WO2014191113A1; CA2913069A1; AU2014273475A1; SG11201509361TA

Abstract

本発明は、高い効能と高い親和性とを兼ね備える新規抗体、特に新規エピトープに対する新規抗体に関する。

Description

発明の分野

発明の背景

本発明は、高い能力と高い親和性とを兼ね備える新規抗体、及び特に、新規ＣＤ３エピトープを特異的に認識する新規抗体に関する。

Ｔ細胞受容体又はＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される抗原の認識のために応答できるＴリンパ球（又はＴ細胞）の表面上に見出される分子である。ＴＣＲと抗原との間の結合は、比較的低い親和性のものである。ＴＣＲが抗原及びＭＨＣと係合する場合、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、特殊化されたアクセサリー分子、及び活性化されたか又は放出された転写因子により介在される一連の生化学的現象を通して活性化される。

ＴＣＲは、哺乳類における３種の異なった鎖（γ、δ及びε）、及びζ２ (ＣＤ２４７) 複合体又はζ/η 複合体の何れかを有する、ＣＤ３のような他の分子に関連している。それらのアクセサリー分子はトランスメンブラン領域を有し、そして細胞中へのＴＣＲからのシグナルを伝搬するために不可欠であり；ＴＣＲの細胞質端は非常に短く、シグナル伝達への参加を不可能にする。ＣＤ３−及びζ鎖は、ＴＣＲと一緒に、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。

ＣＤ３εは、特定のＴ細胞の表面上に発現されるタイプＩトランスメンブランタンパク質である。それは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関与し、そしてこの複合体の他のドメインと相互作用する。それらの相互作用パートナーの１つはＣＤ３γであり、これは１：１の化学量的にＣＤ３εに結合する（De la Hera et al, J. Exp. Med.1991 ; 173: 7-17）。図５は、ＣＤ３ε／ＣＤ３γを包含するＴＣＲ複合体の概略図を示す。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣ−ペプチド複合体へのＴＣＲの結合、及びＡＰＣに沿ってのＴ細胞の続く移動が、ＴＣＲ複合体の一定の回転を導き、お互いに関してＣＤ３ε及びＣＤ３γの変位をもたらし、これは、効果的ＴＣＲシグナル伝達及び従って、Ｔ−細胞の活性化のために必要とされると思われる。ＣＤ３εに対する特定の抗体は、他の抗体では示されていないが、ＴＣＲシグナル伝達を誘発することが実証されている。ＴＣＲ−活性化抗体は典型的には、ＣＤ３ε上の露出されたエピトープに結合し（図５、「アゴニストエピトープ」を参照のこと）、ところがいくつかの非刺激性抗体は、ＣＤ３εとＣＤ３γとの間のインターフェースに結合するか、又は同時に、ＣＤ３ε及びＣＤ３γに結合することが示されており（図５、「アンタゴニストエピトープ」を参照のこと）、従って、たぶん、ＣＤ３ε及びＣＤ３γの相対的変位を干渉する（Kim et al, JBC.2009; 284: 31028-31037）。

ペプチド−ＭＨＣ複合体が、低親和性及び早い解離速度でＴＣＲを結合することは十分に確立されている（Matsui et al, Science.1991 ; 254: 1788-1791 ; Weber et al, Nature.1992; 356: 793-796）。この低い親和性は、反復された結合及び解離により、多くのＴＣＲを連続的にトリガーする（Valitutti et al, Nature.1995; 375: 148-151）、少数のペプチド−ＭＨＣ複合体を可能にするための手段であることが示唆されている。この連続的トリガーは、時間と共にシグナル伝達を維持するために重要であり、結果的に、活性化閾値へのＴ細胞の到達を可能にする（Valitutti et al, Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia et al, Cell. 1999; 96: 1-4）。この概念は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に比較して、高親和性抗−ＣＤ３抗体は、それらが１：１の化学量的にＴＣＲをトリガーするので、Ｔ細胞を効果的に刺激せず（Viola et al, Science 1996; 273: 104-106）、このことは、低親和性抗体が、反復して、解離し、そしてＣＤ３εに再結合するそれらの能力のために、ＴＣＲシグナル伝達を介してのＴ細胞の刺激において、より効果的であり得ることを示唆する発見により支持される。実際、異なった親和性ですべて結合する、抗−ＣＤ３ε抗体ＴＲ６６の３種の誘導体の直接的比較によれば、中間の親和性を有する野生型ＴＲ６６は、より高いか又はより低い親和性を有する誘導体に比較して、Ｔ細胞活性化に最良の有効性を示した（Bortoletto et al, J. Immuno.2002;32:3 02-3107）。従って、ＴＲ６６のＫ_Ｄ近くのＫ_Ｄが、Ｔ細胞の刺激のためには理想的である。ＴＲ６６の親和性は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技法の使用により、及びそれぞれ２．６×１０^−７Ｍ（Moore et al, Blood.201 1 ; 117: 4542-4551）及び１．０×１０^−７Ｍ（Amann et al, Cancer Res. 2008; 68: 143-151）の平衡解離定数をもたらす、フローサイトメトリーにより決定された。これに伴い、１０^−８Ｍ未満の親和性を有する抗−ＣＤ３抗体（米国特許第７，１１２，３２４号）を使用することが推薦されており、そしてヒト治療用途のために公開されたＴ細胞−刺激抗体は、同じ範囲でヒトＣＤ３εへの親和性で結合する。従って、連続的ＴＣＲトリガーの理論によれば、及び抗−ＣＤ３ε抗体についての公開された結果と一致して、公開された親和性よりも有意に良好な親和性を有するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞のより有能な刺激因子であることは予想されないが、しかし対照的に、より弱い活性化因子であることが予想される。

ＣＤ３εに対する公開された抗体のいくつかは、Ｔ細胞調製物による動物の免疫化、及びいわゆるハイブリドーマ方法によるモノクローナル抗体の続く単離を介して生成されて来た。このアプローチの弱点は、一方では、動物における外来性（ヒト）Ｔ細胞の種々の抗原に対する非選択的免疫応答、及び他方では、ハイブリドーマ方法の不良な効率が、Ｔ細胞−刺激活性を有するモノクローナル抗体を同定する確立を低め、また、それらのアゴニスト抗体が抗−ＣＤ３ε抗体全体において少数派を表すためである。標的化されたエピトープに及ぶ線状ペプチドによる免疫化が免疫応答の選択性を高めるが、しかしながら、ネイティブ完全長ＣＤ３εを認識しないか、又は非最適ＴＣＲ刺激を発揮することができる抗体をもたらすことができる。

他のタイプＩトランスメンブランタンパク質による動物の免疫化のために、精製された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いることが特に有用であった。しかしながら、ＣＤ３εの精製されたＥＣＤは凝集する傾向があり、そして凝集物は、ネイティブタンパク質に比べて、変更された構造を有する。さらに、このアプローチは、ＣＤ３εとＣＤ３γとの間のインターフェースに結合する抗体を優先的に導くことができる。対照的に、柔軟なペプチドリンカーにより結合される、一本鎖タンパク質として精製されるＣＤ３ε及びＣＤ３γの複合体は、モノマー画分及びその天然のコンホメーション下で精製され得る（Kim et al, JMB.2000; 302: 899-916）。しかしながら、そのようなＣＤ３ε／γ一本鎖タンパク質による動物の免疫化は、アンタゴニスト効果をもたらすであろう、ＣＤ３ε及びＣＤ３γに同時に結合する抗体を導くことができる。

ヒトＣＤ３εに対して向けられたいくつかの抗体は、これまで開発されている。

モノクローナル抗体ＳＰ３４は、非ヒト霊長類ＣＤ３と交差反応し、そしてまた、ヒト及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣ上で細胞増殖を誘発することもできるネズミ抗体である（Pessano et al., The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20-kD T3 (Τ3δ and Τ3ε) subunits. EMBO J 4 (1985) 337-344）。

国際公開第２００７／０４２２６１号及び国際公開第２００８／１１９５６７号（両者ともMicrometに譲渡されている）は、それぞれ、ＣＤ３εにおいて、エピトープＦＳＥＸＥ及びＱＤＧＮＥに対して向けられた交差反応性結合体を開示する。付与された欧州特許ＥＰ２１５５７８３号（国際公開第２００８／１１９５６７号の広域段階に基づかれる）に対するいくつかの異議申立入により提出された異議申立手続きにおいて、ＳＰ３４がエピトープＱＤＧＮＥにも結合することが提出されている。

しかしながら、多くの試みが、抗−ＣＤ３抗体を得るための、又は特に有用な性質を有する、一般的に結合分子への問題に対処するためになされてきた事実にもかかわらず、これまで、それらの試みは限られた成功を収めて来た。

従って、高い効力のために制限されない高親和性のための新規ＣＤ３結合分子、特に新規抗−ＣＤ３抗体を開発する大きな満たされていない必要性が依然として残っている。さらに、他の種、特に非ヒト霊長類、例えばカニクイザルと交差反応性である、高親和性のための新規ＣＤ３結合分子、特に新規抗−ＣＤ３抗体を開発する大きな満たされてない必要性が依然として存在する。

本発明により提供されて来たこの問題、すなわちＣＤ３−結合分子、特にウサギの遺伝学的免疫化及び親和性成熟記憶Ｂ細胞のスクリーニングにより得られる抗−ＣＤ３抗体、及び特に新規アゴニストエピトープに対する特異性を有するＣＤ３−結合分子、特に抗−ＣＤ３抗体についての解決策は、これまで先行技術によって達成もまた、示唆もされていない。

本発明は、結合領域、特に抗原−結合領域を個々に含む、新規単離ＣＤ３−結合分子、特に単離抗体又はその機能的フラグメントに関し、ここで前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、ヒトＣＤ３のエピトープ、特にＣＤ３εの新規アゴニストエピトープに対して特異的であり、より高い効力を発揮しながら、従来技術の抗体、特にＯＫＴ−３及び／又はＴＲ６６よりも高い親和性を有する。

従って、１つの態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である結合領域を含む単離結合分子、特に抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントに関し、ここで前記エピトープは、結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む。

第２の態様によれば、本発明は、３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である新規単離ＣＤ３−結合分子、特に３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第３の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第４の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第５の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第６の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、（ｉ）３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的であり；そして／又は（ｉｉｄ）結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である、抗原−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第７の態様によれば、本発明は、セクション[0078] − [0080]、[0083] − [0085]及び [0089]の単離抗体又はその機能的フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する、単離された結合分子、特に単離抗体又は機能的フラグメントに関する。

第８の態様によれば、本発明は、本発明の結合分子、特に単離抗体又はその機能的フラグメント、及び任意には、医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。

第９の態様によれば、本発明は、本発明の結合分子、特に単離抗体又はその機能的フラグメントをコードする核酸配列又はその集合物に関する。

第１０の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物を含むベクター又はその集合物に関する。

第１１の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物を含む宿主細胞、特に発現宿主に関する。

第１２の態様によれば、本発明は、本発明の結合分子、特に単離抗体又はその機能的フラグメントの生成方法に関し、ここで前記方法は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物、又は本発明の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現する工程を含んで成る。

第１３の態様によれば、本発明は、本発明の単離抗体又はその機能的フラグメントの生成方法に関し、ここで前記方法は、下記工程：
ａ）宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提供するために、ＣＤ３ε−発現プラスミドによるウサギの免疫化；
ｂ）蛍光活性化細胞選別を用いての、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互反応する親和性成熟記憶Ｂ細胞のクローン単離；
ｃ）選別されたクローンの不死化を必要としない、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞の培養；
ｄ）Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡにおけるＢ細胞培養上清液のスクリーニングの工程を含んで成る。

第１４の態様によれば、本発明は、ＣＤ３εとＣＤ３γとの間のインターフェースに配置されず、そしてＴ細胞上に発現されるネイティブＴＣＲに関して抗体によりまだ結合され得る、ＣＤ３εのアミノ酸残基を独占的に含むヒトＣＤ３εの特定エピトープに関し、ここで本発明の架橋された抗体によるその結合は、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；そして/又は（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす。

第１５の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３εの新規エピトープに対して特異的である結合領域を含む結合分子の同定方法に関し、ここで前記方法は、（ａ）結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である結合領域を含む少なくとも１つの結合分子を、ヒトＣＤ３に結合する１又は２以上の分子から選択する工程を含んで成る。

図１は、ウサギモノクローナル抗体からの連結されたＶＨ及びＶＬＣＤＲ配列の系統発生的クラスターリングを示す。

図２は、Jurkat Ｔ細胞への精製されたウサギモノクローナル抗体の結合を示す。

図３は、架橋された抗−ＣＤ３ε ｍＡｂによるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。図３は、架橋された抗−ＣＤ３ε ｍＡｂによるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。

図４は、時間の経過とともに、架橋されたウサギｍＡｂによるＣＤ６９の刺激を示す。Ｔ細胞活性化を誘発する、精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体の可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。架橋された抗体は、Jurkat細胞を刺激するために５．０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、そしてＣＤ６９発現は、０、４、１５、２４、４８及び７２時間後、フローサイトメトリーにより評価された。ＣＤ６９発現の定性的検出に関しては、幾何学的平均でのシグナル強度を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、負の対照及び試験抗体の両者のために測定された。試験抗体と負の対照との間のＭＦＩの差異（ΔＭＦＩ）が、ＣＤ６９発現のために尺度として計算された。

図５は、ＣＤ３ε／ＣＤ３γを包含するＴＣＲ複合体の単純化された概略図を示す。

図６は、従来技術の抗体についての次のエピトープマッピング実験の結果を示す：（ａ）抗体ＳＰ３４のエピトープマッピング（欧州特許第２１５５７８８号のファイル履歴を参照のこと）；（ｂ）Micromet抗体のエピトープマッピング（欧州特許第２１５５７８８号／国際公開第２００８／１１９５６７号を参照のこと）；図６は、単一のアラニン変異体の結合実験の結果を示し、ここで所定の変異体についての結合の低下が、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、低いバー＝結合についての高い関連性）。

図７は、本発明の抗体についてのＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング実験の結果を示し（クローン−０２、クローン−０３、クローン−０６）；図７は、ペプチド走査分析における結合実験の結果を示す。ヒトＣＤ３εに由来する１５マー線状アレイ、すなわち各位置が１８個のアミノ酸（システインを除くすべての天然アミノ酸）により置換される残基１−１５が、エピトープに対する結合に影響を及ぼすアミノ酸特異性を研究するために、０．１μｇ／ｍｌの各抗体によりプローブされた。ＥＬＩＳＡにおける結合シグナルの低下が、（ａ）個々の各置換のために、与えられ、そして（ｂ）各位置について１８の異なった置換にわたって平均化される。図７ｂにおけるバーの高さは、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、大きなバー＝結合について高い関連性）。図７は、本発明の抗体についてのＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング実験の結果を示し（クローン−０２、クローン−０３、クローン−０６）；図７は、ペプチド走査分析における結合実験の結果を示す。ヒトＣＤ３εに由来する１５マー線状アレイ、すなわち各位置が１８個のアミノ酸（システインを除くすべての天然アミノ酸）により置換される残基１−１５が、エピトープに対する結合に影響を及ぼすアミノ酸特異性を研究するために、０．１μｇ／ｍｌの各抗体によりプローブされた。ＥＬＩＳＡにおける結合シグナルの低下が、（ａ）個々の各置換のために、与えられ、そして（ｂ）各位置について１８の異なった置換にわたって平均化される。図７ｂにおけるバーの高さは、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、大きなバー＝結合について高い関連性）。

図８は、Jurkat Ｔ−細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５ＲｓｃＤｂの結合を示す。Jurkat Ｔ−細胞及びＣＤ３−陰性Jurkat細胞へのＡ）コンストラクト１、Ｂ）コンストラクト２及びＣ）コンストラクト３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞及び野生型ＣＨＯ細胞へのＤ）コンストラクト１、Ｅ）コンストラクト２及びＦ）コンストラクト３の結合が、フローサイトメトリーにより評価された。コンストラクト１、コンストラクト２及びコンストラクト３は、同じ抗−ＩＬ５Ｒ成分を有するが、しかし多様な親和性（コンストラクト１については１，１５×１０^−８Ｍ、コンストラクト２については２．９６×１０^−８Ｍ、及びコンストラクト３については２．２３×１０^−７Ｍ）でＣＤ３ニ結合する３種の異なった抗−ＣＤ３成分を有する；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。図８は、Jurkat Ｔ−細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５ＲｓｃＤｂの結合を示す。Jurkat Ｔ−細胞及びＣＤ３−陰性Jurkat細胞へのＡ）コンストラクト１、Ｂ）コンストラクト２及びＣ）コンストラクト３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞及び野生型ＣＨＯ細胞へのＤ）コンストラクト１、Ｅ）コンストラクト２及びＦ）コンストラクト３の結合が、フローサイトメトリーにより評価された。コンストラクト１、コンストラクト２及びコンストラクト３は、同じ抗−ＩＬ５Ｒ成分を有するが、しかし多様な親和性（コンストラクト１については１，１５×１０^−８Ｍ、コンストラクト２については２．９６×１０^−８Ｍ、及びコンストラクト３については２．２３×１０^−７Ｍ）でＣＤ３ニ結合する３種の異なった抗−ＣＤ３成分を有する；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

図９は、ｓｃＤｂによる細胞傷害性Ｔ−細胞と標的細胞との架橋によるインターロイキン−２分泌の特異的刺激を示す。ＣＤ８＋Ｔ−細胞が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で、上昇する濃度のｓｃＤｂと共にインキュベートされた。培養上清液におけるインターロイキン−２濃度が、インキュベーションの１６時間後、ＥＬＩＳＡにより測定された；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

図１０は、抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５ＲｓｃＤｂによるヒトＩＬ５Ｒ−発現ＣＨＯ細胞の特異的溶解を示す。ＣＨ８＋Ｔ−細胞が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で上昇する濃度のｓｃＤｂと共にインキュベートされた。標的細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ）が、緑色細胞毒性色素により標識され、そして細胞溶解が、インキュベーションの８８時間後、蛍光強度の測定により決定された；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

以前の抗−ＣＤ３抗体と比較して、本発明の特異性は、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含む新規の単離抗体又はその機能的フラグメントが、より高い効力を同時に示しながら、従来技術の抗体、特にＣＫＴ−３及び／又はＴＲ６６よりも高い親和性を有する事実である。

従って、第１の態様によれば、本発明は、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である結合領域を含む単離結合分子、特に抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントに関し、ここで前記エピトープは、結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む。

本発明に関しては、アミノ酸残基は、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合分子の結合親和性が、野生型ペプチド配列への結合親和性の少なくとも５０％、特に少なくとも２５％、より特定には少なくとも１０％、及び最も特定には少なくとも５％低められる場合、すなわち前記重要なアミノ酸残基がアラニンにより置換される場合、そして／又は実施例７のＥＬＩＳＡにより決定されるように、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合に起因する平均シグナル強度が、野生型ペプチド配列への結合シグナルの少なくとも５０％、特に少なくとも２５％、及び最も特定には少なくとも１０％低められる場合、すなわち前記重要なアミノ酸残基がシステインを除く他の天然の各アミノ酸残基により、別々に置換される場合、「結合のために重要である（critical for binding）」として見なされる。

特定の実施形態によれば、前記エピトープはさらに、結合に関与する残基として、アミノ酸残基Ｅ６を含む。特定の実施形態によれば、前記エピトープはさらに、結合のために重要である残基として、アミノ酸残基Ｅ６を含む。

本発明に関して、アミノ酸残基は、結合分子の結合親和性が少なくとも８０％まで低められる場合、すなわち前記アミノ酸残基がアラニンにより置換される場合、そして／又は実施例７のＥＬＩＳＡにより決定されるように、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合に起因する平均シグナル強度が少なくとも８０％に低められる場合、すなわち、前記アミノ酸残基がシステインを除く他の天然の各アミノ酸残基により別々に置換される場合、「結合に関与する（involved in binding）」として見なされる。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための平衡解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発する、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、ＯＫＴ−３又はＴＲ６６による活性化に比較して、低い不均一性である、Ｔ−細胞の用量依存性活性化状態をもたらす抗体又はその機能的フラグメントである。

第２の態様によれば、本発明は、３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である新規単離ＣＤ３−結合分子、特に３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含んでなる単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第５の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、ＯＫＴ−３又はＴＲ６６による活性化に比較して、低い不均一性である、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

第６の態様によれば、本発明は、ＩｇＧ形式で試験される場合、（ｉ）３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）ＯＫＴ−３又はＴＲ６６による活性化に比較して、低い不均一性である、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的であり；そして／又は（ｉｉｄ）結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である、抗原−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。明確にするために、本実施形態によれば、単離抗体又はその機能的フラグメントは、（ｉ）の性質、及びさらに、（ｉｉａ）−（ｉｉｄ）の性質の少なくとも１つを有する。

特定のそのような実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、さらに、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

本発明に関しては、用語「抗体」（antibody）とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＢ、ＩｇＡ又はＩｇＤ（又はそれらの何れかのサブクラス）に属するタンパク質として定義され、そしてすべての従来の公知抗体及びそれらの機能的フラグメントを包含する、「免疫グロブリン」（immunoglobulin）(Ｉｇ)の同義語として使用される。抗体／免疫グロブリンの「機能意的フラグメント」（functional fragment）は、抗原−結合領域を保持する、抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原−結合領域」（antigen-binding region）は典型的には、抗体の１又は２以上の超可変領域、すなわちＣＤＲ−１、−２及び／又は−３領域に見出されるが；しかしながら、その可変「骨格」（framework）領域はまた、例えばＣＤＲのための足場を提供することにより、抗原結合において重要な役割も演じることができる。好ましくは、「抗原−結合領域」（antigen-binding region）は、可変Ｌ鎖（ＶＬ）の少なくともアミノ酸残基４−１０３及び可変Ｈ鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基５−１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３−１０７及びＶＨのアミノ酸残基４−１１１を含み、そして完全ＶＬ及びＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１−１０９及びＶＨの１−１１３；国際公開第９７／０８３２０号に従っての番号付け）が特に好ましい。ウサギ抗体の場合、ＣＤＲ領域が表４に示されている（下記参考のこと）。本発明に使用のための好ましい種類の免疫グロブリンはＩｇＧである。本発明の「機能的フラグメント」（functional fragments）は、Ｆ（ａｂ‘）_２フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖのドメインを含む。（Ｆ（ａｂ’）_２又はＦａｂは、ＣＨ１とＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最少にするか、又は完全に除去するよう構築され得る。

本明細書において使用される場合、結合分子は、結合特異性は絶対的ではないが、しかし相対的性質であるので、そのような結合分子がそのような標的生体分子と、１又は２以上の参照分子との間を区別できるので、標的物、例えばヒトＣＤ３（又はヒトＣＤ３のエピトープ）、「に対して特異的であり」（specific to/for）、「特異的に認識し」（specifically recognizes）、又は「特異的に結合する」（specifically binds to）。その最も一般的な形で（及び定義される参照が言及されていない場合）、「特異的結合」（specific binding）とは、当業界において公知の特異性アッセイ方法に従って決定される場合、目的の生体分子と無関係な生体分子との間を区別する結合分子の能力を言及する。そのような方法は、ウェスターンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ試験及びペプチド走査を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイが実施され得る。スコアリングは、標準的発色（例えば、二次抗体とホースラディシュペルオキシダーゼ及びテトラメチルベンジジンと過酸化水素）により実施され得る。特定ウェル中の反応が、例えば４５０ｎｍでの光学密度によりスコアリングされる。典型的なバックグラウンド（＝負の反応）は、約０．１のＯＤであり得；典型的な陽性反応は、約１のＯＤであり得る。これは、正の評点と負の評点との間の比が１０倍又はそれ以上であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照生体分子ではなく、約３〜５種の無関係生体分子、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン又は同様のものを用いることにより実施される。

本発明においては、用語「約」（about）又は「およそ」（approximately）とは、所定の値又は範囲の９０％〜１１０％を意味する。

しかしながら、「特異的結合」（specific binding）とはまた、参照点として使用される、標的生体分子と１又は２以上の密接に関連する生体分子との間を区別する結合分子の能力を言及することができる。さらに、「特異的結合」（specific binding）は、その標的抗原の異なった部分、例えば標的生体分子の異なったドメイン、領域又はエピトープ間、又は標的生体分子の１又は２以上のキーアミノ酸残基又は一定長のアミノ酸残基間を区別する結合分子の能力に関連する。

本発明においては、用語「エピトープ」（epitope）とは、標的生体分子と結合分子との間の特異的結合のために必要とされる所定の標的生体分子のその部分を言及する。エピトープは、連続的であり得、すなわち標的生体分子に存在する隣接する構造要素により形成されるか、又は不連続であり得、すなわち標的生体分子の一次配列において、例えば標的物としてのタンパク質のアミノ酸配列において異なった位置で存在する構造要素により形成される。

１つの実施形態によれば、エピトープは、ヒトＣＤ３のε鎖上に位置する。

特定の実施形態によれば、ヒトＣＤ３εへの前記結合は、表面プラスモン共鳴実験を用いて、ヒト起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞該ドメインへの、ＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントの親和性を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例１に示されるように、使用される：ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ計器（Sierra Sensors）；捕捉抗体：標準のアミンカップリング法を用いて、ＳＰＲ−２ Affinity Sensorチップ、Amine, Sierra Sensors上に固定された前記ＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体；９０−２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインの二倍連続希釈、流動細胞中への３分間の注入及びセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の５分間の解離、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入での各注入サイクル後の表面再生、one−to−one Langmuir結合モデルを用いて、Ｍａｓｓ−１分析ソフトウェア（Analyzer、Sierra Sensors）による見掛け解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）の計算。

特定の実施形態によれば、(ｉｉａ)及び／又は(ｌｉｃ)に従ってのＴ−細胞活性化の前記誘発は、ＩｇＧ形式での前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例３に示されるようにして使用される：３倍過剰の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗体−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋しているＯＫＴ３（BioLegend, カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novns Biolgicals、カタログ番号ＮＢＰ1−９９４４６））の添加による事前の架橋後において、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントにより、２４時間のJurkat細胞（１００，０００個の細胞／ウェル）を刺激する；刺激後にＣＤ６９発現を、ヒトＣＤ６９に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体（BioLegend，カタログ番号３１０９０６）を使用して細胞染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ aria III、Becton Dickinson）により分析する；陰性対照：前記架橋抗体とインキュベートされた未刺激刺のJurkat細胞を前記抗−ＣＤ６９抗体により染色する。

特定の実施形態によれば、(ｉｉｂ)に従っての前記長く持続するＴ−細胞活性化は、ＩｇＧ形式での前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激の経時を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例３に示されるようにして使用される：段落［００７１] のようにして架橋された、ＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメント、抗−ＣＤ３抗体による、０，４，１５，２４，４８及び７２時間の１００，０００個のJurkat細胞／ウェルの刺激、及び段落[００７１]に記載のフローサイトメーターによるＣＤ６９発現の分析。

特定の実施形態によれば、(ｉｉａ)及び／又は(ｌｉｃ)に従ってのＴ−細胞活性化の前記誘発は、ＩｇＧ形式での前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＩＬ−２分泌の刺激を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例４に示されるようにして使用される：５μｇ／ｍｌの濃度でのＩｇＧ形式での前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞（２００，０００個の細胞／ウェル）の下記４種の異なったアッセイ設定を用いての刺激：（ａ）３倍高い濃度の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋する、ＯＫＴ３（BilLegend、カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novus Biologicals, カタログ番号ＮＢＰ−９７４４６））の添加により架橋された、ＩｇＧ形成での前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞の刺激；（ｂ）架橋抗体の不在下でのＴ−細胞活性化；（ｃ）一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上への前記架橋抗体の固定化；（ｄ）架橋抗体の不在下での一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上へのＩｇＧ形式での前記単離抗体又はその機能的フラグメント（又は対照抗体）の固定化；各設定においては、添加の１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡによる細胞の刺激及び２４、４８及び７２時間後での上清液の収集、ＩＬ−２放出の測定、市販のELISA（Biolegenｄ、カタログ番号４３１８０１）を用いての定量化を伴う。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、(ｉ)ウサギ抗体又はその機能的フラグメント、又は(ii)（i）の前記ウサギ抗体又はその機能的フラグメントをヒト化することに得られる抗体又はその機能的フラグメントである。

ウサギ抗体のヒト化のための方法は、当業者の誰にでも良く知られている（例えば、Borras et al., J Biol Chem. 2010 Mar 19;285(12):9054-66; Rader et al, The FASEB Journal, express article 10.1096/fj.02-0281 fje, published online October 18, 2002; Yu et al (2010) A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models. PLoS ONE 5(2): e9072. doi:10.1371/journal.pone.0009072を参照のこと）。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）を含む抗原−結合領域を含む。特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含み、そしてＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインの変異体であるフレームワークドメインを含み、そして／又はＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインの変異体、特に配列番号２１及び／又は２２に存在するその対応するヒト受容体アミノ酸残基の代わりに、１又は２以上の非ヒトドナーアミノ酸残基、特に配列番号１−２０から選択された配列の１つに存在するドナーアミノ酸残基を含む変異体であるフレームワークドメインを含む。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）を含む抗原−結合領域を含む。特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含み、そしてＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインの変異体であるフレームワークドメインを含み、そして／又はＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインの変異体、特に配列番号２１及び／又は２２に存在するその対応するヒト受容体アミノ酸残基の代わりに、１又は２以上の非ヒトドナーアミノ酸残基、特に配列番号１−２０から選択された配列の１つに存在するドナーアミノ酸残基を含む変異体であるフレームワークドメインを含む。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０から選択されたＶＨドメインの変異体であり、そして／又はＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９から選択されたＶＬドメインの変異体、特にフレームワークドメイン、及び／又は抗原結合に関与しないＣＤＲ残基に、１又は２以上のアミノ酸残基置換を含む変異体である。

高く保存された残基（特に、一定に維持される）及び多彩な配列位置（特に、その位置で天然において見出される残基の１つにより修飾され得る）の存在について相同配列群の分析を包含する、相同アミノ酸残基による、置換のために適切なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基の同定方法は、当業者に良く知られている。

抗体結合ドメインの構造、特に抗原−相互作用残基（特に、一定に維持される）及び抗原と接触して存在しない配列位置（修飾され得る）の存在について抗原との複合体中の抗体血結合ドメインの構造の分析を包含する、相同アミノ酸残基による、置換のために適切なＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基の同定方法は、当業者に良く知られている。

特に他の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメインの変異体であり、そして／又はＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１から選択されたＶＬドメインの変異体、特にフレームワークドメイン、及び／又は抗原結合に関与しないＣＤＲ残基に、１又は２以上のアミノ酸残基置換を含む変異体である。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号１/配列番号２; 配列番号３/配列番号４; 配列番号５/配列番号６; 配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、及び配列番号１９/配列番号２０、特に配列番号３/配列番号４; 配列番号５/配列番号６; 及び配列番号９/配列番号１０、より特定には配列番号９/配列番号１０から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む。特に他の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号１/配列番号２; 配列番号３/配列番号４; 配列番号５/配列番号６; 配列番号７/配列番号８、配列番号９/配列番号１０、配列番号１１/配列番号１２、配列番号１３/配列番号１４、配列番号１５/配列番号１６、配列番号１７/配列番号１８、及び配列番号１９/配列番号２０、特に配列番号３/配列番号４; 配列番号５/配列番号６; 及び配列番号９/配列番号１０、より特定には配列番号９/配列番号１０から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せの変異体を含む抗原−結合領域を含み、ここでそのような変異体においては、少なくともＶＬ又はＶＨドメインは、列挙されるＶＬ／ＶＨドメインの変異体である。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的にフラグメントは、配列番号２１／配列番号２２のＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む。別の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２１／配列番号２２のＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域の変異体を含み、ここでそのような変異体においては、少なくともＶＬ又はＶＨドメインは、列挙されるＶＬ／ＶＨドメインの変異体である。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、本明細書に開示される配列の変異体である抗原−結合領域を含む。従って、本発明は、配列番号１−２０を含む、単離抗体又はその機能的フラグメントの性質、特に配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０、特に配列番号４、６及び１０、より特定に配列番号１０に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の配列同一性、より特定には少なくとも８０％の配列同一性、及び最も特定には、少なくとも９０％の配列同一性、及び／又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも８０％の配列相同性、より特定には少なくとも９０％の配列相同性、及び最も特定には少なくとも９５％の配列相同性を有するＨ鎖アミノ酸配列、及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の配列同一性、より特定には少なくとも８０％の配列同一性、及び最も特定には、少なくとも９０％の配列同一性、及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも８０％の配列相同性、より特定には少なくとも９０％の配列相同性、最も特定には少なくとも９５％の配列相同性を有するＬ鎖アミノ酸配列を含む、セクション[００４２]、[００４７]及び[００５４]―[００６１]に定義される性質の１又は２以上の性質を有する単離抗体又はその機能的フラグメントを包含する。例えば、相同性検索マトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ（Henikoff, S. & Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919）を用いることによる配列相同性の決定方法、及び相同性に従っての配列の分類方法は、当業者に良く知られている。

特定の実施形態によれば、そのような変異体は、配列番号１９のＶＬ配列に従ってのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列の組を含むＶＬ配列、及び／又は配列番号２０のＶＨ配列に従ってのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列の組を含むＶＨ配列を含み、ここで各場合、配列番号１９及び／又は２０におけるすべての縮重位置「Ｘ」で示される、それらの示されるアミノ酸残基が選択される。例えば、配列番号１９のＣＤＲ１において「Ｘ（Ｓ／Ｎ）」として示される各位置の場合、任意のそのような変異体は、それらの対応する位置で、アミノ酸残基「Ｓ」又はアミノ酸残基「Ｎ」の何れかを含む。

特定の他の実施形態によれば、そのような変異体は、配列番号１９の配列に従ってのＶＬ配列、及び／又は配列番号２０の配列に従ってのＶＨ配列を含み、ここで各場合、配列番号１９及び／又は２０におけるすべての縮重位置「Ｘ」で示される、それらの示されるアミノ酸残基が選択される。例えば、配列番号１９のフレームワーク１における「Ｘ（Ｐ／Ａ）」として示される位置の場合、任意のそのような変異体は、その位置でアミノ酸残基「Ｐ」又はアミノ酸残基「Ａ」の何れかを含む。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、セクション[0078]-[0080]、及び[0083]-[0085]の抗原−結合領域をヒト化することにより得られる抗原−結合領域を含む。

第７の態様によれば、本発明は、セクション[0078]-[0080]、[0083]-[0085]及び [0089]の単離抗体又はその機能的フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する、単離された結合分子、特に単離抗体又は機能的フラグメントに関する。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

第１０の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物を含むベクター又は該ベクターの集合物に関する。

第１３の態様によれば、本発明は、本発明の単離抗体又はその機能的フラグメントの生成方法に関し、ここで前記方法は、下記工程：
ａ）宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提供するために、ＣＤ３ε−発現プラスミドによるウサギの免疫化；
ｂ）蛍光活性化細胞選別を用いての、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互反応する親和性成熟記憶Ｂ細胞のクローン単離；
ｃ）選別されたクローンの不死化を必要としない、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞の培養；
ｄ）Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定するために、特に細胞ベースのＥＬＩＳＡによる、Ｂ細胞培養上清液のスクリーニングの工程を含んで成る。

特定の実施形態によれば、工程(ａ)は、それぞれのＣＤ３ε−結合体の重要な線状結合領域を同定するために、ＣＤ３εのＮ末端部分に及ぶオーバーラップペプチドを用いてエピトープマッピングを実施することにより行われる。工程（ｂ）においては、この線状結合領域の誘導体が生成され、ここでそれぞれ各位置で、野生型アミノ酸が、(ｉ)アラニン、又は(ｉｉ)天然のアミノ酸（システインを除く）の何れかにより、別々に置換される。得られるペプチドライブラリーは、結合のための各位置の関連性を評価するために、実施例７及び８に記載されるＥＬＩＳＡの使用により、スクリーンをされる。

次の実施例は、本発明のを例示するもので、その範囲を制限するものではない。

本明細書に記載される本発明のために使用されるアプローチは、Ｔ細胞刺激抗体を同定するために、成功の確率を高める段階的手順である。このアプローチは、次の手順を包含する：
ａ）ウサギ抗体は一般的に、齧歯類に比較して、より高いクローン多様性を示すので、免疫化のための宿主としてのウサギの使用。従って、ウサギの使用は、特定のエピトープに対する結合体を同定する確立を高め、そして新規エピトープの同定の確立を増強する。
ｂ）宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提供するために、ＣＤ３ε−発現プラスミドによるウサギの免疫化。このアプローチは、完全長ＣＤ３εに対する強い免疫応答を導き、そしてＣＤ３ε及びＣＤ３γに同時に結合する抗体の生成を回避する。
ｃ）蛍光活性化細胞選別を用いて、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互作用する親和性成熟記憶Ｂ−細胞のクローン単離。この方法は、ＣＤ３εをＣＤ３γとの間のインターフェースに結合する抗体の選択を回避し、それにより、選択の特異性を高める。
ｄ）選別されたクローンの免疫化を必要とせず、それにより、ハイブリドーマ手順の不良な効率を克服する、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞の培養。
ｅ)Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡにおけるＢ細胞培養上清液のスクリーニング。

実施例１：ＣＤ３上のＴ細胞−刺激性エピトープに結合するモノクローナル抗体の同定及び選択
ＣＤ３εに結合するウサギ記憶Ｂ細胞を、蛍光活性化細胞選別を用いて、１つの免疫化されたウサギから単離した。ＣＤ３ε及びＣＤ３γのインターフェースに結合する抗体を排除するために、柔軟ペプチドリンカー（ｓｃＣＤ３γε）により連結される、ＣＤ３ε及びＣＤ３γの細胞外ドメインから成る、フィコエリトリン（ＰＥ）−標識された一本鎖タンパク質コンストラクトを使用した。ＰＥ−sｃＣＤ３γεに結合する４，２７０の記憶Ｂ細胞を、９６ウェル培養プレート中に個々に選別し、そして他の場所に公開された条件で培養した（Lightwood et al, JIM 2006; 316: 133-143）。まず最初に、すべての培養上清液を、ｓｃＣＤ３γεへの結合のためにＥＬＩＳＡによりスクリーンし、これにより、４４１のヒットをもたらした。第２のスクリーニングにおいて、最初のスクリーニングからの陽性上清液を、Jurkat細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εを結合するそれらの能力について試験した（下記方法を参照のこと）。合計２２のヒットが、ＣＤ３ε発現Jurkat細胞への結合を示したが、しかしｃｄ３−／−Jurkat細胞への結合は示さなかった。ヒト及びカニクイザル起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞外ドメインへの親和性を、２２のヒットに関して、ＳＰＲを用いて測定した。Ｋ_Ｄにより表されるように、ヒトＣＤ３εγへの親和性は、０．１６−９．２８ｎＭの範囲であった（データは示されていない）。スクリーニングヒットの１つは、ＳＰＲによる結合を示されず、そして従って、さらなる分析のためには見なされなかった。

残る２１のクローンの可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＲＴ−ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定により検索し、そして１８の独立したクローンをもたらした。それらのウサギＩｇＧを、哺乳類発現システム下で組換え的に生成し、そしてヒト及びカニクイザル起源のｓｃＣＤ３γεへの親和性及びJurkat細胞に結合するそれらの能力について特徴づけた。それらの１８の配列の系統発生学的配列分析は、２つの主要クラスターを示し、それらはお互い明確に異なるが、ところが２つのクラスター内に有意な相同性が存在した（図１）。１つのクラスターからのすべての代表物はたぶん、同じ抗原−結合親Ｂ細胞由来であるので、それらはたぶん、同じエピトープに結合する。従って、最大の多様性をカバーするために、最も多様なクローンを、Ｔ細胞を結合し、そして活性化するそれらの能力について、さらに試験された１２のクローンをもたらす各クラスターから選択した。Ｔ細胞を、細胞ベースのＥＬＩＳＡにより評価し、そしてＴ細胞刺激を、ＦＡＣＳによりＣＤ６９の発現を測定することにより定量化した。代表的抗体をさらに、実施例２−４に示されるようにして、特徴づけた。

実施例２：Jurkat Ｔ細胞及びカニクイザルＨＳＣ−ＦＴ細胞への精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３ε抗体の結合
JurkatヒトＴ細胞及びカニクイザルＨＳＣ−ＦＴ細胞を、方法セクションに記載のようにして、上昇する濃度の精製されたモノクローナルウサギ抗体と共にインキュベートした。試験されるすべての抗体に関して、ヒトＣＤ３εに対する特異的結合は、抗体濃度の上昇と共に上昇した（図２）。JurkatヒトＴ細胞への最大結合の半分を示すＥＣ_５０値は、すべての抗体に関して非常に類似し、０．２８〜１．８７ｎＭの範囲であった（表１を参照のこと、これは、精製されたモノクローナルウサギ抗体の薬力学的特性を示す。ＣＤ６９発現の定性的検出のために、幾何学的平均でシグナル強度に影響を及ぼす平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、不の対照及び試験抗体の両者のために測定した。標準化されたＭＦＩを、負の対照抗体のＭＦＩを介して試験抗体のＭＦＩを割算することにより計算した。）カニクイザルＨＳＣ−ＦＴ細胞への結合についてのＥＣ_５０値が、３種の抗体（クローン−０６、クローン−０２、クローン−０３）について示されている（表２Ｃを参照のこと）。

実施例３：Ｔ細胞上のＣＤ６９発現を刺激する、精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３ε抗体の可能性
ＣＤ６９発現の測定（方法を参照のこと）により評価されるように、Ｔ−細胞活性化を誘発する、精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の可能性を、公開されている抗体ＯＫＴ−３及びＴＲ６６と比較した。第１のアプローチによれば、３種の異なった濃度の架橋された抗体を用いて、Jurkat細胞を刺激し、そしてＣＤ６９発現を、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ６９発現の有意な上昇が、１．２５μｇ／ｍｌで、すべての試験された抗体により観察された（図３及び表Ｉ）。興味深いことには、すべての試験されたウサギ抗体は、公開されているＯＫＴ−３及びＴＲ６６よりも、ＣＤ６９発現のより強い刺激を示した。これは、ウサギ抗体が、従来技術によれば、連続的にトリガーし、そしてＴＣＲシグナル伝達を増強するそれらの能力に負の影響を及ぼすはずであるＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも、より高い親和性でヒトｓｃＣＤ３γεに結合するので、予測外である。上昇する濃度のウサギ抗体により、ＣＤ６９発現レベルはさらに上昇し、ところが、上昇する濃度のＯＫＴ−３又はＴＲ６６により、ＣＤ６９発現の単に中程度の上昇が存在した。さらに、ウサギ抗体により、ヒストグラムのピークが狭くなり、このことは、Ｔ細胞のより均質な集団を示し、すべては同様に高レベルでＣＤ６９を発現した。対照的に、試験された各濃度でＯＫＴ−３又はＴＲ６６により刺激されたＴ細胞集団においてＣＤ６９発現レベルの広範囲な分布が存在した。用量に依存して、明確で且つ均質なＴ細胞活性化レベルをもたらす抗体は、効能を最適化し、そして副作用を制限するために良好な用量調節を可能にする。

第２のアプローチによれば、抗−ＣＤ３抗体により異なった時点での刺激の後のＴ−細胞活性化を分析した。Jurkat細胞を、架橋された抗体により刺激し、そしてＣＤ６９発現を、０，４，１５，２４，４８及び７２時間後、上記のようにして評価した（図４）。

実施例４：Jurkat Ｔ細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５Ｒ抗体の結合
アゴニスト性抗−ＣＤ３抗体の効果を示すために、１組の二重特異性抗−ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ一本鎖ダイアボディ（diabodies）(scDb)を、標準方法により構成した（方法／データは示されたいない；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含む；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含む；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む）。

Jurkat Ｔ細胞及びＩＬ５Ｒ−発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）を、方法セクションに記載のようにして、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと共にインキュベートした。試験されるすべてのｓｃＤｂに関して、ＣＤ３ε及びＩＬ５Ｒ発現細胞系に対する特異的結合が検出されたが、しかし対照細胞系に対する非特異的結合は検出されない。抗−ＣＤ３成分とは異なるが、同一の抗−ＩＬ５Ｒ成分を含む３種の異なったｓｃＤｂ（コンストラクト１−３）を、ＩＬ５Ｒ又はＣＤ３εの何れかを発現する細胞に対する特異的結合について試験した。抗−ＣＤ３部分は、可変性親和性を有する重複エピトープに結合する（表１及び３、及び図７）。予想されるように、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合は、試験されたすべてのｓｃＤｂに関して、類似した（図８）。対照的に、Jurkat Ｔ−細胞への結合は、ＣＤ３ε結合ドメインの親和性の低下と共に、低下した。Jurkat Ｔ−細胞への結合が、試験される最高濃度で低親和性結合体コンストラクト３については検出されたなかった（図８）。

実施例５：Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を刺激する、二重特異的抗−ＣＤ３×ＩＬ５ＲｓｃＤｂの可能性
Ｔ−細胞活性化を誘発する、標的細胞に結合されるｓｃＤｂの可能性を、ヒト血液から精製された細胞毒性Ｔ−細胞によるＩＬ−２分泌の測定（方法を参照のこと）により評価することができる。異なったｓｃＤｂを、１０：１のエフェクター：標的細胞比で、標的発現ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共にインキュベートし、そしてＩＬ−２分泌を、１６時間のインキュベーションの後、分析する。ＩＬ−２分泌の用量依存性刺激が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で観察されるが、ところがＩＬ−２分泌は、野生型ＣＨＯ細胞の存在下では実質的に観察されない（表３及び図９における代表的データを参照のこと）。従って、Ｔ−細胞活性化は、標的発現細胞の不在下で特異的に誘発される。さらに、ＩＬ−２分泌を誘発する可能性は、組換え的に生成されたＣＤ３εγへの結合親和性及びＴ−細胞に結合する能力と相関する。親和性分析と一致して、最高の親和性を有する結合体であるコンストラクト１は、コンストラクト２よりも、ＩＬ−２分泌のより有能なインヂューサーであり、ところがＩＬ２分泌は、低親和性ｓｃＤｂコンストラクト３には観察されない（図９）。

実施例６：細胞毒性Ｔ−細胞による特異的ｓｃＤｂ介在性標的細胞溶解
抗−ＣＤ３×ＩＬ５ＲｓｃＤｂにより介在される細胞毒性Ｔ−細胞による標的細胞の特異的溶解を、８８時間のインキュベーションの後、ＣｅｌｌＴｏｘ(登録商標)緑色細胞毒性アッセイ（方法を参照のこと）により分析する。Ｔ−細胞活性化について上記に論じられた結果に類似して、用量依存性標的細胞溶解が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で、コンストラクト１及びコンストラクト２に関して観察され、ところが溶解は、野生型ＣＨＯ細胞の存在下では観察されていない（表３及び図１０におけるコンストラクト１−３についての代表的データを参照のこと）。上記に言及された結果と一致して、ＣＤ３εに対する高い親和性を有するｓｃＤｂ結合は、低い親和性のｓｃＤｂに比較して、より有能な溶解性を示す。標的細胞溶解は、低親和性ｓｃＤｂコンストラクト３については観察されない。本発明者はさらに、カニクイザルＣＤ３εに対してもまた交差反応する抗体の異なったクラスター（クラスター１）に起因する追加のＣＤ３εクローン（クローン−０５）のヒト化変異体を含むｓｃＤｂの標的細胞を溶解する可能性を試験した。クローン−０５は、クローン−０６と比較して、さらに高い親和性で結合し（それぞれ、ウサギＩｇＧ及びヒト化されたその誘導体について、ＫＤ＝８．４５×１０^−１０Ｍ及び４．２９×１０^−９Ｍ）、但し重要なことには、クラスター２（クローン−０６、クローン−２及びクローン−０２）からの結合体とは異なるエピトープに結合する。興味深いことには、本発明者は、それぞれの抗−ＩＬ５ＲｘＣｄ３ｓｃＤｂが、ヒト化されたクローン−０６を含むｓｃＤｂよりも弱い、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ標的細胞（ＥＣ_５０＝９．９×１０^−９Ｍ）のＴ−細胞依存性溶解を誘発する可能性を示すことを見出し、このことは、クローン−０６のエピトープが特に標的細胞を溶解する細胞毒性Ｔ細胞の再方向付けのために適していることを示唆する。ＯＫＴ−３及びＴＲ６６に対するクラス２からの架橋された親ＩｇＧの卓越した効能（実施例３）は、ｓｃＤｂ形式で試験されたそれらの親和性よりも高い親和性でさえ、親和性の最適性は、見出されず、その後、効力は低下するであろうことを確証する。

実施例７：エピトープマッピング及びファイン−マッピング
エピトープマッピング及びファイン−マッピングを、記載のようにして実質的に実施した（Timmerman et al., Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TM technology.J.Mol.Recognit.20 (2007) 283-99; Slootstra et al., Structural aspects of antibody antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity 1 : 87 (1996) 96）。手短に言えば、ＣＬＩＰＳ技法は、ペプチドを、定義された立体構造に固定する。これは、最も複雑な結合部位の機能的模倣をもたらす。ＣＬＩＰＳ技法は現在、日常、単一、二重又は三重ループ構造、及びシート及びへリックス様折りたたみにペプチドライブラリーを成形するために使用される。

ＣＬＩＰＳライブラリースクリーニングは、組合せマトリックス企画を用いて、最大１０，０００の重複ペプチドコンストラクトのライブラリーへの標的タンパク質の変換で開始する。固体担体上で、線状ペプチドのマトリックスが合成され、続いて、空間的に規定されたＣＬＩＰＳコンストラクトに形状化される。正しいコンフォメーションで不連続エピトープの両部分を表すコンストラクトは、検出され、そして定量化される、高い親和性を有する抗体を結合する。不完全エピトープを提供するコンストラクトは、低い親和性を有する抗体を結合し、ところが、そのエピトープを含まないコンストラクトはまったく結合しない。親和性情報は、エピトープの配列及びコンホメーションを詳細に定義するために、反復スクリーンに使用される。

次のクローンを分析した：クローン−０２、クローン−０３、クローン−０４、クローン−０６及びクローン−１０。ＣＤ３の次の標的配列（Ｎ−末端配列）を使用した：
ヒトＣＤ３：

ペプチドの合成
標的分子の不連続エピトープを再構成するために、構成されたペプチドのライブラリーを合成した。これは、いわゆる「足場上での化学的に連結されたペプチド」（Chemically Linked Peptides on Scaffolds）(CLIPS)技法を用いて実施された。ＣＬＩＰＳ技法は、単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様折りたたみ、へリックス様折りたたみ及びそれらの組合せへのペプチドの構成を可能にする。ＣｌＩＰＳ鋳型は、システイン残基にカップリングされる。ペプチドにおける多重システインの側鎖を、１又は２つのＣＬＩＰＳ鋳型にカップリングする。例えば、Ｔ２ＣＬＩＰＳ鋳型１，３ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭの溶液を、炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（v/v））に溶解する。この溶液を、ペプチドアレイ上に添加する。ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイの固相結合ペプチドに存在するような２つのシステインの側鎖に結合するであろう（３μｌのウェルを有する４５５のウェルプレート）。ペプチドアレイを、完全に溶液で覆いながら、３０〜６０分間、溶液中で軽く振盪する。最後に、ペプチドアレイを、過剰の水により十分に洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１％のＳＤＳ／０．１％のβ−メルカプトエタノールを含む破壊緩衝液下で７０℃で３０分間、音波処理し、続いて水中において、さらに４５分間、音波処理する。Ｔ３ＣＬＩＰＳ担持ペプチドを、類似する手段で、但し３個のシステインを用いて製造した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング
各アレイへの抗体の結合を、一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄の後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼ接合体（SBA, cat.nr.2010 05）の１／１０００希釈溶液と共に、２５℃で１時間、インキュベートした。洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２μ／ｍｌの３％Ｈ_２Ｏ_２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムにより定量化した。

ペプチドの設計
化学的に合成されたＣＬＩＰＳペプチドを、次の企画に従って、上記のようにして合成した。

推定エピトープの同定
一般的に、すべての５種の抗体が、非常に類似する結果特性を示した。すべての結合は、ヒトＣＤ３εのＮ末端上で行われた（データは示されていない）。制限された及び制限されていないペプチドからの結合強度及び観察を考慮すれば、すべての抗体は、下記理由で、線状ペプチドに優先的に結合する可能性が高い：
・Ｎ末端配列に対してのみの結合が観察された、
・Ｄ２又はＧ３の損失は結合を強く低めない、
・２ＤＧＮ４の損失は結合を完全になくす。

結論
分析により、試験されたすべての５種の抗体についての結合領域を同定した。すべての抗体は、Ｎ末端上の一見直線状のエピトープに結合することが見出された。すべての抗体は、結合のために２ＤＧＮ４に強く依存する類似するエピトープに結合することが見出された。

実施例８：エピトープファイン−マッピング
方法
各位置が１８種のアミノ酸（システインを除くすべての天然のアミノ酸）により置換されている、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε残基２−１６及び５−２０由来の１５マーの線状アレイを、抗体によりプローブし、そしてその結合に影響を及ぼす特異性が見出された。

結果
すべての抗体は、Ｎ４のための絶対的条件及びＥ６の関与でＮ末端を結合し、そして有意な類似性を共有する。すべての抗体は、コアエピトープに近接する配列における小さな差異にもかかわらず、ヒト及びカニクイザルバージョンのＣＤ３εを結合する。

標的タンパク質
初期マッピングは、試験されるすべての抗体のためのコアエピトープとして、ＣＤ３εのＮ末端上に線状ストレッチを同定した。下記配列の残基２−２０を用いて、１５マーの線状ペプチドの十分な置換ライブラリーを企画した。

方法
ペプチドの合成
線状ペプチドを、Ｈｉ−Ｓｅｎｓｅ表面のヒドロゲル上で標準Ｆｍｏｃ合成により合成した。保護解除及び洗浄の後、カードを、独自の洗浄緩衝液により、音波処理浴中で広範に洗浄した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング
各合成されたペプチドへの抗体の結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄の後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼ接合体（SBA, cat.nr.2010 05）の１／１０００希釈溶液と共に、２５℃で１時間、インキュベートした。洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２μ／ｍｌの３％Ｈ_２Ｏ_２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムにより定量化した。

ペプチドの企画
化学的に合成されたＣＬＩＰＳペプチドを、次の企画に従って、上記のようにして合成した。

サンプルの比較
すべての５種の抗体は、Ｎ４を絶対的に必要とすることにより（唯一ヒスチジンにより取って代わられる）、及びＥ６のための高い優先を伴って（このためには、制限された置換が許容されるが、しかしながら、グルタミン酸がその位置での最も好ましい残基である）、非常に類似する態様で、ＣＤ３εＮ末端のヒト及びカニクイザル変異体由来の線状ペプチドに結合する。何れの抗体も、残基５−２０に及びペプチドには結合しなかった。５種のこのグループ内で、３種の抗体（クローン２、クローン３及びクローン４）が他の２種（クローン６及びクローン１０）よりも、前者の３種のグループはまた、Ｇ３、Ｅ５、及び／又はＧ８の置換に対してより敏感であることから、カニクイザル配列における突然変異に対してより敏感である。この観察は、ＳＰＲにより決定されるように、タンパク質のヒト及びカニクイザル形についての親和性の差異と一致する（表１を参照のこと）。

結論
この分析は、Ｎ４及びＥ６の絶対的必要性を伴って、Ｎ末端を結合し、そして有意な類似性を共有する、５種の抗体のエピトープをファインマッピングした。すべての抗体は、コアエピトープに隣接する配列における小さな差異にかかわらず、ＣＤ３εのヒト及びカニクイザルバージョンに結合する。

一般的方法：
一次配列分析
その対応するＨ鎖及びＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）の得られる配列情報を、配列相同性に従って、整列し、そしてグループ分けした。ウサギ可変ドメインの組を、ユニーククローン及びユニーク組のＣＤＲを同定するために分析した。ＶＬ及びＶＨドメインの組合わされたアライメントを、ユニーククローンを同定するために、両ドメインの結合アミノ酸配列に基づいて実施した。可変ドメインのアライメントの他に、各ウサギＩｇＧクローンの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列組を、ユニーク組のＣＤＲを同定するために、異なったクローン間で比較した。それらのユニークＣＤＲ組を、複数のアライメントツールＣＯＢＡＩＴを用いて整列し、そして系統樹を、近隣結合アリゴリズムにより生成した。ＣＤＲ組を、各クローンの結合されるＣＤＲ配列の配列相同性に基づいてグループ分けし、そしてクラスター閾値を、配列相同性及び同一性に基づいて決定した。個々のウサギＩｇＧクローンのスクリーニングアッセイ結果及びクラスター所属に基づいて、候補体を、さらなる分析のために選択する。異なったクラスターからのクローンを、高い配列多様性を続行することを目的として選択した。

ウサギＩｇＧの製造
ウサギＩｇＧ可変ドメインを、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、及びリーダー配列及びそれぞれの不変ドメイン、例えばpFUSE-rlgG ベクター(Invivogen)を含む一過性異種発現のための適切な哺乳類発現ベクター中への連結によりクローン化した。機能的rIgGの一過性発現を、ＣＨＯＳ細胞における、Ｈ及びＬ鎖をコードするベクターとFreeStyle^TM MAXシステムとの同時トランスフェクションにより実施した。７日間の培養の後、抗体分泌細胞の上清液を、精製のために回収した。続いて、分泌されたウサギＩｇＧを、磁気プロテインＡビーズ（ＧＨ Healthcare））により親和性精製した。ＩｇＧ負荷ビーズを洗浄し、そして精製された抗体を、ｐＨシフトにより溶出した。溶出画分を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳道（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、及びサイズ排除高速流体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により分析し、すべてのサンプルの同等の品質を確保した。

ヒト化された一本鎖Ｆｖフラグメント及びＩｇＧの構築及び特性化
ウサギ抗体クローンのヒト化は、Ｖｋ１／ＶＨ３タイプのNumab独自のｓｃＦｃ受容体フレームワーク上へのウサギＣＤＲのトランスファーを包含した。この工程においては、所定のウサギクローンの６種のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を、他に記載されるように、ウサギ抗体ドナー配列上で同定し（Borras, L. et al. 2010. JBC;285:9054-9066）、そしてNumab受容体足場配列中に移植した。ウサギクローン、クローン−０６の場合、例えば得られるヒト化クローン−０６のＶＬ及びＶＨ配列が、それぞれ配列番号２１及び２２で示される。

ヒト化ＩｇＧコンストラクトを、[００１２９]に記載される方法に類似して製造することができる。

モノクローナル抗−ＣＤ３抗体の結合動力学及び種交差性の決定のためのアッセイ
モノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の結合親和性を、ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）を用いて、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。親和性測定のために、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体（Bethyl Laboratories, カタログ番号A120-111A）を、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors）上に標準アミン−カップリング手順を用いて固定した。９０〜２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）の二倍連続希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を、５分間、進行せしめた。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（ＫＤ）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

種交差反応性の決定
カニクイザル一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインに対する種交差反応性を、同じアッセイ設定を用いて測定した。９０〜０．１２ｎＭの範囲のカニクイザルへテロダイマーＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）の連続三倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を、５分間、進行せしめた。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（ＫＤ）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

Ｔ−細胞の細胞表面上で発現されるＣＤ３εへのモノクローナル抗−ＣＤ３抗体の結合の決定のための細胞ベースのＥＬＩＳＡ
ヒトＴ細胞系のJurkat細胞（クローンＥ６−１）を、１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを含む丸底９６−ウェルプレートにおいて、３００，００細胞／ウェルで播種した。９０ｎＭ〜０．００５８ｎＭの範囲である抗−ＣＤ３ウサギモノクローナル抗体の連続５倍希釈溶液を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ１００μｌを含むプレートに添加した。Jurkat細胞の表面上に発現されたＣＥ３εへのウサギ抗体の結合を、ＩｇＧサブタイプのウサギ抗体のＦｃ部分（Jackson Immuno Research, カタログ番号1 1-035-046）を特異的に認識する二次抗体により検出した。この二次抗体を、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結した。ＨＲＰ活性を、比色反応において、ＨＲＰにより処理されるＴＭＢ基質（３、３′、５、５′−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−００）の添加により測定した。処理された基質の色の強度は、Jurkat細胞に結合される抗−ＣＤ３抗体の量に正比例する。色の強度を定量化するために、それぞれの波長での吸光度（光学密度）を、マイクロタイタープレートリーダー（Infinity reader M200 Pro, Tecan）を用いて測定した。

Jurkat細胞の細胞表面上に提供される未知の成分への抗体の非特異的結合を補正するために、Jurkat Ｔ細胞系（Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５）のＣＤ３ε欠損誘導体を使用した。この細胞系へのモノクローナル抗体の結合を、Jurkat細胞について上記に記載のようにして、測定した。Jurkat細胞への特異的結合の定量化のために、負の対照への結合のための光学密度を、Jukat細胞への結合のための光学密度から差し引いた。データを、Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)を用いて４−パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて分析し、そして５０％結合に達するために必要とされる抗体−ＣＤ３抗体のモル濃度（ＥＣ_５０、標準曲線の中間−ＯＤ）を、用量応答曲線から得た。

種交差−反応性の決定
ＨＳＣ−ＦＴ細胞の表面上に提供されるカニクイザルＣＤ３への結合を、同じアッセイ設定を用いて測定した。カニクイザルＴ細胞系のＨＳＣ−Ｆ細胞を、１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを含む丸底９６−ウェルプレートにおいて、３００，００細胞／ウェルで播種した。１８ｎＭ〜０．００５８ｎＭの範囲である抗−ＣＤ３ウサギモノクローナル抗体の連続５倍希釈溶液を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ１００μｌを含むプレートに添加した。ＨＳＣ−Ｆ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＣＥ３εへのウサギ抗体の結合を、ＩｇＧサブタイプのウサギ抗体のＦｃ部分（Jackson Immuno Research, カタログ番号1 1-035-046）を特異的に認識する二次抗体により検出した。この二次抗体を、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結した。
ＨＲＰ活性を、上記のようにして測定した。

細胞表面上に提供される未知の成分への抗体の非特異的結合を補正するために、ＣＤ３ε負のヒトＢリンパ芽球細胞系（ＤＢ）を用いた。この細胞系へのモノクローナル抗体の結合を、上記のようにして測定した。ＨＳＣ−Ｆ細胞への特異的結合の定量化のために、負の対照への結合のための光学密度を、ＨＳＣ−Ｆ細胞への結合のための光学密度から差し引いた。データを、Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)を用いて４−パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて分析し、そして５０％結合に達するために必要とされる抗体−ＣＤ３抗体のモル濃度（ＥＣ_５０、標準曲線の中間−ＯＤ）を、用量応答曲線から得た。

モノクローナル抗体−ＣＤ３抗体によるＴ−細胞活性化：ＣＤ６９発現の誘発
Ｔ−細胞活性化を誘発するモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の可能性を、他に記載されるようにして（Gil et al, Cell.2002; 109: 901-912）、Jurkat細胞におけるＣＤ６９発現の誘発の測定、すなわち初期Ｔ−細胞活性化マーカーにより評価した。用量−応答アッセイのために、Jarkat細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、２０μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３抗体により２４時間、刺激した。Jurkat細胞への抗−ＣＤ３モノクローナル抗体の添加の前、抗−ＣＤ３抗体を、ＯＫＴ３（BioLegend,カタログ番号317302）又はＴＲ６６Ｃ（Novus Biologicals, Cat. No. N BP 1-97446）が使用される場合、それぞれ、３倍過剰のヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（Bethyl Laboratories, カタログ番号A120-1 11 A）、及びウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research, カタログ番号315-005-008）の添加により架橋した。刺激の後、細胞を、ヒトＣＤ６９（BioLegend, カタログ番号310906）に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体を用いて、ＣＤ６９発現のために染色し、そして次に、フローサイトメーター（FACS aria III, Becton Dickinson）により分析した。負の対照として、架橋抗体と共にインキュベートされた、刺激されていないJurkat細胞を、上記抗−ＣＤ６９抗体により染色した。時間の経過にわたってのＴ−細胞活性化を、上記のようにして類似するアッセイ設定により評価した。１００，０００Jurkat細胞／ウェルを、上記のようにして架橋された抗−ＣＤ３抗体５μｇ／ｍｌにより、０，４，１５，２４，４８及び７２時間、刺激した。用量応答アッセイと同一のＣＤ６９発現を、フローサイトメトーにより分析した。

ｓｃＤｂコンストラクトの製造
種々の抗−ＩＬ５ＲｘＣＤＥ３ε ｓｃＤｂコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を、新たに合成し、そしてpＥＴ２６ｂ（＋）主鎖（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づかれるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のための適合ベクター中にクローン化した。この発現コストラクトを用いて、Ｅ．コリ株ＢＬ１２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、そして細胞を、出発培養物として、２ＹＴ培地（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual）において培養した。発現培養物を接種し、そして振盪フラスコにおいて３７℃及び２００ｒｐｍでインキュベートした。１のＯＤ６００に達すると、タンパク質発現を、０．５ｍＭの最終濃度でのＩＰＴＧの添加により誘発した。一晩の発現の後、細胞を、４０００ｇの遠心分離により収穫した。封入体の調製のために、細胞ペレットを、ＩＢ再懸濁緩衝液（50 mM Tris-HCI pH 7.5、100 mM NaCI、5 mM EDTA、0.5% Triton X-100）に再懸濁した。細胞スラリーを、1 Mmの DTT、0.1 mg/mLのリゾチーム、10 mM のロイペプチン、100 μMの PMSF 及び1 μMのペプスタチンにより補充した。細胞を、氷上で冷却しながら、３サイクルの超音波均質化により溶解した。続いて、０．０１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼを添加し、そして均質物を室温で２０分間インキュベートした。封入体を、ｌ５０００ｇ及び４℃での遠心分離により沈降せしめた。ＩＢを、ＩＢ再懸濁緩衝液に再懸濁し、そして音波処理により均質化し、その後、別の遠心分離にゆだねた。ＩＢ再懸濁緩衝液により、合計で最少３回の洗浄工程を実施し、そして続いて、ＩＢ洗浄緩衝液（50 mM Tris-HCI pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM EDTA）による２回の洗浄を実施し、最終ＩＢを得た。

タンパク質再折りたたみのために、単離されたＩＢを、可溶化緩衝液（100 mM Tris/HCI pH 8.0,6 M Gdn-HCl,2 mM EDTA）に、湿ったＩＢの１ｇ当たり５ｍｌの比率で再懸濁した。可溶化は、ＤＴＴが２０ｍＭの最終濃度で添加されるまで、室温で３０分間インキュベートされ、そしてインキュベーションはさらに３０分間、続けられた。可溶化が完結された後、溶液は、２１５００ｇ及び４℃での１０分間の遠心分離により透明化された。再折りたたみを、再折りたたみ緩衝液（典型的には：100 mM Tris-HCI pH 8.0, 、5.0 M のウレア、 5 mMのシステイン、1 mMのシスチン）中、０．３ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度の溶解されたタンパク質による急速希釈により実施した。再折りたたみ反応を、最少１４時間、通常通りインキュベートした。得られるタンパク質溶液を、８５００ｇ及び４℃での１０分間の遠心分離により透明化した。再折りたたまれたタンパク質を、ＣａｐｔｏＬ樹脂（GE Healthcare）上での親和性クロマトグラフィーにより精製した。単離されたモノマー画分を、サイズ排除ＨＰＬＣ、純度に関してはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びタンパク質含有量に関してはＵＶ／Ｖｉｓ分光計により分析した。緩衝液を、透析により、ネイティブ緩衝液（50 mM のクエン酸 - リン酸pH 6.4、200 mMの NaCl）に交換した。

二重特異性抗−ＣＤ３ × ＩＬ５ＲｓｃＤｂの結合動力学の決定のためのＳＰＲアッセイ
抗−ＣＤ３ × ＩＬ５ＲｓｃＤｂの結合親和性を、ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）を用いて、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。ＣＤ３への親和性測定のために、ヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）を、標準アミン−カップリング方法を用いて、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定した。９０〜０．１ｎＭの範囲のｓｃＤｂの連続的３倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に固定されたＣＤ３εγからのタンパク質の解離を、１２分間、進行せしめた。各注入のサイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の２回の注入により再生する。ＩＬ５Ｒに対する親和性測定のために、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体を、アミン−カップリングにより、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定した。ＩＬ５Ｒ（９０ｎＭ−０．１ｎＭ）に対して特異的なｓｃＤｂの連続３倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そして解離を１２分間、モニターした。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の３回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

Ｔ細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ３ε及びＤＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞）の表面上に発現されるＩＬ５Ｒへの二重特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５ＲｓｃＤｂの結合
ヒトＴ細胞系のJurkat細胞（クローンＥ６−１、ＡＴＣＣ）の細胞表面上に発現されるＣＤ３εへのｓｃＤｂの結合を、フローサイトメトリーにより分析した。Jurkat細胞の細胞表面上に提供される未知の成分へのｓｃＤｂの非特異的結合を評価するために、Jurkat Ｔ細胞系（J.RT3-T3.5, ATCC）のＣＤ３ε欠損誘導体を使用した。細胞表面上に発現されるＩＬ５ＲへのｓｃＤｂの結合を、トランスジェニックＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（ＺＨＡＷで生成された）を用いて分析し、そして野生型ＣＨＯ細胞（Invitrogen）を、非特異的結合のための対照として使用した。両細胞系を、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと共に１時間インキュベートし、そして結合されたｓｃＤｂを、ＲＰＥ−標識されたプロテインＬ（BioVision）の添加により検出し、そして次に、フローサイトメーター（FACS aria III, Becton Dickinson）により分析した。負の対照として、無関係な標的物に対して特異的なｃｓＦｖを使用した。Jurkat及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合の定性的評価のために、幾何学的平均でのシグナル強度に影響を及ぼす平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、非特異的ｓｃＦｖ及び試験ｓｃＤｂの両者について測定した。試験抗体と負の対照抗体との間のＭＦＩの差異（ΔＭＦＩ）を、結合のための尺度として計算した。さらに、標準化されたＭＦＩを、負の対照ｓｃＦｖのＭＦＩを介して試験ｓｃＤｂのＭＦＩを割算することにより計算した。

二重特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５ＲｓｃＤｂによるＴ−細胞活性化：ＩＬ−２分泌の誘発
標的細胞の存在下でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞におけるＩＬ−２発現を誘発する、抗−ＣＤ３ × 抗−ＩＬ５ＲｓｃＤｂの可能性を、次の通りに評価した。細胞毒性Ｔ−細胞を、RosetteSep（登録商標）ヒトCD8+ T-細胞富化カクテル(STEMCELL Technologies)を用いて、その製造業者の説明書に従って、ヒト血液から新たに単離した。ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０倍に連続的に希釈されたｓｃＤｂ（１００ｎＭ−０．００１ｎＭ）の存在下で、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共に、１０：１のエフェクター：標的物比でインキュベートした。Ｔ−細胞の非特異的刺激を評価するために、野生型ＣＨＯ細胞を、標的細胞として使用した。上清液を、１６時間の同時インキュベーションの後、収集し、ＩＬ−２放出を測定した。ＩＬ−２放出を、市販のＥＬＩＳＡキット（BilLegend）を用いて定量化した。データを、SoftMax（登録商標）Proデータ分析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて、４−パラメーターロジスティック曲線適合により分析し、そして最大の半分のＩＬ−２分泌（ＥＣ_５０）を誘発するのに必要とされるｓｃＤｂのモル濃度を、用量応答曲線から誘導する。

細胞毒性Ｔ細胞によりＩL５Ｒ発現ＣＨＯ細胞のｓｃＤｂ介在性溶解
標的細胞溶液を誘発する二重特特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５ＲｓｃＤｂの可能性の評価のために、トランスジェニックＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞系を用いて（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）。上記のようにして単離された、刺激されていないヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞を、エフェクター細胞として使用した。標的細胞を、細胞ｔｏｘ緑色色素（Promega）により、その製造業者の説明書に従って、標識した。細胞溶液を、ＣｅｌｌＴｏｘ（登録商標）緑色細胞毒性アッセイ(Promega)緑色細胞毒性アッセイ（Promega）によりモニターした。アッセイは、細胞死の結果として生じる膜完全性の変化を測定する。アッセイは、生存細胞から排除されるが、しかし死亡細胞ＤＮＡを優先的に染色する非対称シアニン色素を用いる。色素が危険にさらされた細胞においてＤＮＡを結合する場合、蛍光特性は実質的に増強される。生存細胞は、蛍光の適切な上昇を生成しない。従って、死亡細胞ＤＮＡとの結合相互作用により生成される蛍光シグナルは、細胞毒性に比例する。同様に、上記のように、標識されたＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０倍に連続的に希釈されたｓｃＤｂ（１００ｎＭ−０．００１ｎＭ）の存在下で、１０：１のエフェクター：標的物比でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共にインキュベートした。標的物を発現しない細胞の非特異的溶解性を評価するために、Ｔ−細胞を、標識された野生型ＣＨＯ細胞と共に同時インキュベートした。蛍光強度を、マルチモードマイクロタイターリーダー（FlexStation 3, Molecular Devices）を用いて、８８時間のインキュベーションの後、分析した。データを、SoftMax（登録商標）Proデータ分析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて、４−パラメーターロジスティック曲線適合により分析し、そして最大の半分のＩＬ−２分泌（ＥＣ_５０）を誘発するのに必要とされるｓｃＤｂのモル濃度を、用量応答曲線から誘導する。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定するものではない。実際、本発明に記載される修飾の他に、本発明の種々の修飾が前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

それぞれの特許法の下で可能な限り、本明細書に引用される、すべての特許、出願、出版物、試験方法、文献及び他の材料は、引用により本明細書に組込まれる。

Claims

ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的である抗原結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントであって、当該エピトープが、結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、前記単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記エピトープが、さらに、結合に関与する残基としてアミノ酸残基Ｅ６を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含む、単離抗体又はその機能的フラグメントであって、前記抗体又はその機能的フラグメントが、３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数でヒトＣＤ３に結合する、単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含む、単離抗体又はその機能的フラグメントであって、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合に、当該抗体又はその機能的フラグメントが、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での２４時間の刺激後において、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強いＴ−細胞活性化を誘発する、前記単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントであって、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合、前記抗体又はその機能的フラグメントが、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での７２時間の刺激後において、ＣＤ６９発現の少なくとも１．５倍の増加により示される、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、前記単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントであって、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合、当該抗体又はその機能的フラグメントが、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、前記単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントであって、ＩｇＧ形式で試験される場合、前記抗体又はその機能的フラグメントが、（ｉ）３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^−８Ｍ未満の一価結合についての解離定数でヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋された状態で、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での２４時間の刺激後に、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での７２時間の刺激後に、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍の増加により示される、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらし、及び/又は（ｉｉｄ）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的であり、ここで当該エピトープが結合に重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、前記単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記エピトープがヒトＣＤ３のε鎖上に位置する、請求項４〜８のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
ヒトＣＤ３εへの前記結合が、ヒト起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞外ドメインへの、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントの親和性を、表面プラズモン共鳴実験を用いて、特に次の条件：
ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）; 捕捉抗体：標準アミン−カップリング方法を用いて、ＳＰＲ−２ Affinity Sensor chip, Amine, Sierra Sensors上に固定された前記ＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体；９０−２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインの二倍連続希釈、フローセル中への３分間の注入、及びセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の５分間の解離、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入による各注入サイクル後の表面再生、one−to−one Langmuir結合モデルを用いて、Ｍａｓｓ−１分析ソフトウェア（Analyzer、Sierra Sensors）による見掛け解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）の計算
を用いて、決定することにより決定される、請求項１〜３、及び９のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
（ｉｉａ）及び／又は（ｉｉｃ）に従ったＴ−細胞活性化の前記誘発が、ＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激を、特に次の条件：
３倍過剰の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋されているＯＫＴ３（BioLegend, カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novns Biolgicals、カタログ番号ＮＢＰ1−９９４４６））の添加による事前の架橋の後において、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントにより、２４時間Jurkat細胞（１００，０００個の細胞／ウェル）を刺激し；
ヒトＣＤ６９に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体（BioLegend，カタログ番号３１０９０６）を用いて、刺激後のＣＤ６９発現を細胞染色し；
フローサイトメーター（ＦＡＣＳ aria III、Becton Dickinson）で分析し；ここで陰性対照が前記架橋抗体とインキュベートされ、前記抗−ＣＤ６９抗体により染色された未刺激のJurkat細胞である
を用いて決定することにより、決定される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
（ｉｉｂ）に従った前記長く持続するＴ−細胞活性化が、ＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激のタイムコースを、特に次の条件：
５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメント、すなわち請求項１０に記載のようにして架橋された抗−ＣＤ３抗体により、０，４，１５，２４，４８及び７２時間の１００，０００個のJurkat細胞／ウェルを刺激し、そして請求項１０に記載のようにフローサイトメーターによりＣＤ６９発現の分析する
を用いて決定することにより、決定される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
（ｉｉａ）及び／又は（ｉｉｃ）に従ったＴ−細胞活性化の前記誘発が、ＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるＩＬ−２分泌の刺激を、
特に次の条件：
５μｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞（２００，０００個の細胞／ウェル）を、次の４種の異なったアッセイ設定を用いて刺激し：
（ａ）３倍高い濃度の抗ＩｇＧ抗体の添加により架橋されたＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメント（対照：ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）で架橋されているＯＫＴ３（BilLegend、カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novus Biologicals, カタログ番号ＮＢＰ−９７４４６））によるJurkat細胞の刺激；
（ｂ）架橋抗体の不在下でのＴ−細胞活性化；
（ｃ）一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上への前記架橋抗体の固定化；
（ｄ）架橋抗体の不在下での一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上へのＩｇＧ形式の前記単離抗体又はその機能的フラグメント（又は対照抗体）の固定化
各設定においては、添加の１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで細胞を刺激し、そして２４、４８及び７２時間後に上清を収集して、市販のELISA（Biolegenｄ、カタログ番号４３１８０１）を用いて定量されたＩＬ−２放出を測定する
を用いて決定することにより決定される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である、請求項４〜１３のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、(i)ウサギ抗体又はその機能的フラグメント、又は(ii)（i）の前記ウサギ抗体又はその機能的フラグメントをヒト化することに得られる抗体又はその機能的フラグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）を含む抗原−結合領域を含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）を含む抗原−結合領域を含む、請求項１６に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、特に配列番号３、５、９及び２１、より特定には配列番号９及び２１から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む、請求項１７に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号１／配列番号２；配列番号３／配列番号４；配列番号５／配列番号６；配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、及び配列番号２／配列番号２２；特に配列番号３／配列番号４；配列番号５／配列番号６；配列番号９／配列番号１０、及び配列番号２１／配列番号２２；より特定には配列番号９／配列番号１０及び配列番号２１／配列番号２２から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む、請求項１８に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載される単離抗体又はその機能的フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する単離抗体又はその機能的フラグメント。
前記単離抗体又はその機能的フラグメントが、請求項１８又は１９に記載される抗原−結合領域をヒト化することにより得られる抗原−結合領域を含む、請求項１〜１７のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその機能的フラグメント、及び場合により医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
請求項１〜２１のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメントをコードする核酸配列又はその集合物。
請求項２３に記載の核酸配列又はその集合物を含む、ベクター又はその集合物。
請求項２３に記載の核酸配列又はその集合物、又は請求項２４に記載のベクター又はその集合物を含む、宿主細胞、特に発現宿主細胞。
請求項１〜２１のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメントの生成方法であって、請求項２３に記載の核酸配列又はその集合物、又は請求項２４に記載のベクター又はその集合物、又は請求項２５に記載の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現する工程を含む、前記方法。