DK2504359T3 - Monospecifikke polypeptidreagenser - Google Patents

Monospecifikke polypeptidreagenser Download PDF

Info

Publication number
DK2504359T3
DK2504359T3 DK10798744.8T DK10798744T DK2504359T3 DK 2504359 T3 DK2504359 T3 DK 2504359T3 DK 10798744 T DK10798744 T DK 10798744T DK 2504359 T3 DK2504359 T3 DK 2504359T3
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
igg
cad
ser
seq
gly gly
Prior art date
Application number
DK10798744.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Poppe
Original Assignee
Orgentec Diagnostika Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orgentec Diagnostika Gmbh filed Critical Orgentec Diagnostika Gmbh
Application granted granted Critical
Publication of DK2504359T3 publication Critical patent/DK2504359T3/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/528—CH4 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Beskrivelse
Den foreliggende opfindelse angår en ny antigen-bindende proteinkonstruktion eller „modubody", der indeholder mindst tre funktionelle enkeltdomænemoduler i et antistof. Modubodies indeholder et domæne fra den variable tungkæderegion af et antistof (VH), et domæne fra den variable letkæderegion af et antistof (VL) og binder sig monospecfikt til et antigen. Desuden indeholder modubodies et domæne fra den konstante region af antistoffer. Modubodies kan anvendes til diagnostiske eller terapeutiske formål.
Opfindelsens baggrund Antistofstruktur
Antistoffer er plasmaglycoproteiner, der består af flere polypeptidkæder, der er forbundet ved hjælp af disulfidbroer. Et standardantistof består af to identiske tunge immunglobulin (Ig)-kæder og to identiske lette kæder. Begge antistofkæder består af forskellige ca. 110 aminosyrerester lange proteindomæner, der er opbygget i form af en karakteristisk immunglobulinfoldning af β-foldebade. Den tunge kæde består af et variabelt (VH) domæne og tre eller fire konstante domæner (CH1, CH2, CH3, CH4). Den lette kæde består af et variabelt (VL) og et konstant (CL) domæne. De variable andele af den tunge og den lette kæde, særligt de hypervariable komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) medvirker til antigenspecificitet. Immunsystemet leverer en stor diversitet af antistoffer mod vidt forskellige antigener. Antistoffer kan tilordnes forskellige klasser, f.eks. IgM, IgA, IgG, IgE, IgD.
Antistoffragmenter og substrukturer
Antistoffragmenter kan opnås gennem encymatisk spaltning eller ved hjælp af rekombinante fremgangsmåder. Et fab-fragment, der er forsynet med antisofidentifikationsfunktionen indeholder, forbundet med hinanden via disulfidbroer, VH-CH1-domænerne fra den tunge kæde og VL-CL-domænerne fra den lette kæde, mens Fv-fragmentet kun omfatter de variable regioner fra den tunge og den lette kæde. Disse fragmenter, der består af flere proteinunderenheder, kan imidlertid kun vanskeligt fremstilles i biologisk aktiv form med et tilfredsstillende udbytte (Read et al. (2007), Appl. Environ. Microbiol. 73: 5088-96).
Et enkeltkædet Fv-fragment (scFv) udgør en lille ca. 28 kDa tung antigenbindende substruktur i form af en kovalent kobling af VH- og VL-domæner via en peptidlinker (Flu et al. (1996), Cancer Res 56: 3055-61). Foldningeffektiviteten, den undertiden manglende stabilitet og toksiciteten ved disse strukturer begrænser imidlertid ofte udbyttet ved fremstillingen af biologisk aktive scFv i bakterielle ekspressionssystemer (Nieba et al. (1997), Protein Eng 10:435-44).
Som Minibody (mini-antistof) betegnes et ca. 75 kDa tungt kimært molekyle fra et scFv og en hinge-region fra den tunge kæde fusioneret med CFI3-domænet, der understøttet af CFI3-domænet sammenlagres med et bivalent molekyle, der er forbundet kovalent via disulfidbroer i hinge-regionen (Wu, EP0627932B1). CFI3-domænet tjener i den forbindelse som dimeriseringsdomæne til fremstilling af homodimerer (jf. DObel et al., Biol. Unserer Zeit, 34. Jg., Nr. 6, S. 372-379, 2004). Disse molekyler fremviser ved ekspression i E. coli imidlertid lave ekspressionsrater og proteolytisk nedbrydning i hinge-regionen. (Flu. et al. (1996), Cancer Research 56: 3055-61).
Ligesom Minibody har Diabody to antigenbindingssteder. I Diabody er VL- og VFI-domæner i form af en polypeptidkæde forbundet til et divalent og bispecifikt molekyle (FHollinger et al. (1993), PNAS 90: 6444-48).
Monobodies udgør kimære antigenbindende polypeptider, der inden for en fibronektin type lll-skabelon præsenterer hypervariable CDR-sløjfer (Koide, EP0985039B1). Disse molekyler tilvejebringer en værdifuld klasse af nye affinitetsreagenser. Ved transplantation af CDR-sløjfer til en heterolog fibronektinskabelon går imidlertid effektor- og detektionsfunktioner af naturligt forekommende antistoffer tabt.
Nanobodies består af enkeltkædede antigenbindende VinFI-dormæner (variabelt domæne af et tungkæde-antistof) og beror på iagttagelsen af, at der ved kameler og lamaer forekommer naturlige og funktionelle antistoffer, der kun består af tunge kæder (Caserman und Harmers, EP19930919098). Opløseligheden af humane VH-domæner (variable tungkæde-domæner) er imidlertid ofte indskrænket på grund af hydrofobe regioner, der i det intakte antistof interagerer med regioner fra den lette kæde (Barthelemy et al. (2007) J. Biol. Chem. 283: 3639-54). EP 1 575 622 A1 angår bivalente antistofkonstrukter, der har et heterotetramert eller homodimert format, der stabiliseres af disulfidbroer.
Shao & Zhang (Cellular and Molecular Immunology, bind 5, nr. 4, side 299-306, 2008) beskriver ekspressionen og karakteriseringen af et bifunktionelt protein i E coli til en autolog erythrocyt-agglutineringstest. Hvad angår det bifunktionelle protein, drejer det sig om et rekombinant fusionsprotein fra en ScFv (VH-linker-VL), der koder for anti-H-antigenet i det monoklonale antistof 2E8, og en HIV-1 gp41-antigenpeptid.
Li et al. (Protein Engineering, bind 10, nr. 6, side 731-736,1997) beskriver ekspressionen af dimere små immunproteine (small immune proteins; SIP) i pattedyrsceller. Hvad angår SIP, drejer det sig om bivalente molekyler, der eventuelt er stabiliseret af disulfidbroer.
Antistoffer i immundiagnose
Der findes en lang række immunassayformater til i en biologisk prøve at bestemme tilstedeværelsen eller koncentrationen af et specifikt antistof, f.eks. mod et patogen, et autoantigen eller et allergen. I reglen er disse assays indrettet til påvisning af en specifik antistofklasse eller en kombination af bestemte antistofklasser og anvender specifikke interne kontroller eller kalibratorer. Immunoassays, der eksempelvis er egnet til bestemmelse af humane antistoffer, indeholder i reglen en positivkontrol, en negativkontrol samt en indekskalibrator eller en klassificering af forskellige kalibratorkoncentrationer (standardrække) til udarbejdelse af en kalibreringskurve, med hvilken antistofkoncentrationer kan interpoleres i en prøve. Sædvanligvis fremstilles disse kontrol- og kalibreringsreagenser ved fortynding af seropositive plasmaer eller sera i et egnet fortyndingsmedium.
Eksempelvis præpareres kali brato rerne og kontrollerne til den isotypespecifikke bestemmelse af B2-glycoprotein-autoantistoffer af serummet fra humane donorer, der indeholder høje koncentrationer af disse autoantistoffer fra klasserne IgG, IgM og/eller IgA. Anvendelsen af humant seropositivt serum eller plasma til fremstilling af kontroller og kalibratorer er imidlertid forbundet med en lang række ulemper som f.eks. vanskeligheden, der består i at tilvejebringe sådanne reagenser i store mængder og egnet kvalitet, forskelle i bindingskarakteristika ved forskellige serier, heterogen polyklonal specifitet, heterogen isotypesammensætning, forekomst af patogener, omkostninger etc.
Da antistoffer med høj specifitet og affinitet binder sig til antigener, har de afgørende betydning inden for immundiagnose. Størrelsen af det naturlige antistofmolekyle og dets komplekse opbygning af flere polypeptidkæder med et stort antal af inter- og intradomæner, tværbindinger via disulfidbroer samt glykosileringspositioner udgør en betydelig vanskelighed i forbindelse med konstruktionen og den rekombinante ekspression af specifikke antistoffer.
Hackett et al. (EP1018019 B1) præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling af reagenser til anvendelse som kalibratorer og kontroller, hvor reagensen er et kimært monoklonalt antistof, der omfatter variable regioner af den tunge og lette kæde fra en første værtsart, fusioneret til de konstante regioner af den tunge og den lette kæde fra en anden værtsart, der svarer til værtsarten for antistoffet, der skal bestemmes. Fremstilling af disse arts-kimære monoklonale antistoffer forudsætter imidlertid et omfattende teknisk arbejde, der er enestående inden for produktion af monoklonale antistoffer. Hackett nævner ganske vist den teoretiske mulighed for også at anvende polypeptider som kunstige kalibratorer, der specifikt binder sig til en forudbestemt ligand og er fusioneret til en region af antistoffer fra de ønskede værtsarter. Hackett leverer imidlertid ingen fremgangsmåde, ved hjælp af hvilken der kan opbygges enkeltkædede syntetiske polypeptidkalibratorer.
Der er således et vedvarende behov for små, antistof-lignende molekyler, der identificerer et antigen specifikt, med antistoffer danner komplekser mod naturlige immunglobuliner og kan fremstilles i stor mængde i bakterielle ekspressionssystemer.
Sammenfatning af opfindelsen
En genstand for opfindelsen er en fusionspolypeptid, der omfatter (i) et første domæne, der omfatter den variable tungkæderegion af et antistof (VH) eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, (ii) et andet domæne, der omfatter den variable letkæderegion af et antistof (VL) eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, og (iii) et tredje domæne, der omfatter et afsnit af en konstant tungkæderegion af et antistof (CHX), hvor domænet (iii) har en længde på 80-130 aminosyrerester og aminosyrepositioner, hvis sidekæder svarende til konceptet for „knobs-into-holes"-anordningen har interaktioner, er modificeret, hvor domænerne (i), (ii) og (iii) er forbundet med hinanden via peptidlinkere (L), hvor peptidlinkerne (L) uafhængigt af hinanden har en længde på 25-45 aminosyrerester og udelukkende består af glycin- og/eller serinrester, og hvor fusionspolypeptidet ikke danner intermolekylære disulfidbroer og ikke indeholder hinge-regioner af antistoffer.
En yderligere genstand for opfindelsen er en nukleinsyre, der koder for en fusionspolypeptid som angivet ovenfor.
Endnu en yderligere genstand for opfindelsen er en værtscelle, der indeholder en nukleinsyre ifølge opfindelsen.
Endnu en yderligere genstand for opfindelsen er en fremgangsmåde til fremstilling af et fusionspolypeptid ved kultivering af en værtscelle ifølge opfindelsen og udvinding af fusionspolypeptid fra cellen eller kultursupernatanten.
Yderligere aspekter ved den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af fusionspolypeptider som reagenser i diagnostiske eller biokemiske test samt medicinske anvendelser af fusionspolypeptider, nukleinsyrer og værtsceller.
De ovenfor beskrevne fusionspolypeptider ifølge opfindelsen betegnes som „modubodies".
Modubodies er konstruktioner, der består af domæner af de variable tunge (VH) og variable lette (VL) kæder i et antistof og en eller flere domæner af den konstante region af den tunge kæde (CH1, CH2, CH3, CH4) i antistoffer, idet disse domæner af et antistof er koblet sammen med hinanden via egnede linkersekvenser i form af en lineær sekvens af funktionsmoduler, der er struktureret uafhængigt af hinanden. De enkelte domæner har en længde på 80-130 aminosyrer. Modubodies består af en enkelt polypeptidkæde og har et enkelt antigenbindingssted, der dannes af domænerne VH og VL. Modubodies kan ikke danne intermolekylære disulfidbroer, således at de foreligger som monomerer. Modubodies har ingen hinge-regioner af antistoffer. De er dermed miniatureversioner af monovalente antistoffer, der i form af en enkelt proteinkæde kan fremstilles let og i store mængder i egnede ekspressionssystemer, f.eks. bakterielle ekspressionssystemer. Modubodies er på grundlag af deres enkeltkædede struktur, deres begrænsede størrelse, den monoklonale sammensætning, deres lette fremstilling og deres stabilitet ideelle reagenser til biokemisk forskning, til anvendelse i diagnostiske assays og som helbredende midler.
En modubody er således et kimært molekyle med en typisk opbygning som på figur 1, der består af separate funktionsmoduler, der afledes af domæner af de variable tunge (VH) og variable lette (VL) kæder af et antistof og et eller flere domæner af den konstante region af den tunge kæde (CHX, f.eks. CH1, CH2, CH3 eller CH4) af antistoffer. De enkelte funktionsmodule, der er struktureret uafhængigt af hinanden, er koblet sammen med hinanden i en lineær sekvens via egnede linkersekvenser (L).
Beskrivelse af tegningerne
Figur 1:
Skematisk opbygning af en udførelsesform for et fusionspolypeptid (modubody) ifølge opfindelsen, hvor VL udgør et domæne af den variable lette kæde, VH et domæne af den variable tunge kæde og CHX et domæne af den konstante region af den tunge kæde (CH1, CH2, CH3 eller CH4) af antistoffer. De enkelte domæner er forbundet med hinanden via heterologe, fleksible peptidlinkere L i en lineær sekvens.
Figur 2:
Karakterisering af bindingsreaktionen ved et scFv-CAD-reaktionsmodul til målet B2-glycoprotein.
Til ELISA-detektion af den specifikke B2-glycoprotein-bindingsaktivitet ved scFv-CAD-reaktionsmodulet blev der påført fortyndingsserier af scFv-CAD i den viste koncentration på mikrotiterplader, der var belagt med B2-glycoprotein og til kontrol med kvægserumalbumin (BSA). Bindingen blev bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof (Qiagen, Hilden) og en tetramethylbenzidin (TMB)-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 3:
Karakterisering af stabiliteten af et scFv-CAD-reaktionsmodul over for temperaturstress. A. For at kunne undersøge indflydelsen fra 50 °C temperaturstress på B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten ved CAD-scFv blev det rensede proteinmodul i en koncentration af 5 pg/ml over et tidsrum på 0-180 minutter udsat for en temperatur på 50 °C. Bindingen af scFv-CAD til B2-glycoprotein blev i ELISA bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450. B. For at bestemme inaktiveringstemperaturen af scFv-CAD blev det rensede proteinmodul i en koncentration af 5 pg/ml i et kalibratorfortyndingsmedium i 10 min udsat for en serie af temperaturer på 20 °C til 90 °C. Bindingen af scFv-CAD til B2-glycoprotein blev i ELISA bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 4:
Karakterisering af kalibratorfunktionen af en CAD-lgG-CH3 modubody ved binding til målet 32-glycoprotein og detektion med et anti-human-lgG-peroxidase sekundært antistof. CAD-lgG-CH3 blev påført i den viste koncentration på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein, og bindingen blev bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof (Jackson Immunoresearch) og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 5:
Karakterisering af stabiliteten af en CAD-lgG-CH3 modubody over for temperaturstress. Stabiliteten over for varmestress blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgG-CH3 modubody i de viste koncentrationer blev inkuberet i 60 minutter og 90 minutter ved 50 °C og blev undersøgt ved sammenligning med en ved rumtemperatur opbevaret fortyndingsserie i anti-32-glycoproteinimmunoassayet. I den forbindelse blev bindingen af CAD-lgG-CH3 modubody til 32-glycoprotein bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 6:
Karakterisering af stabiliteten af en CAD-lgG-CH3 modubody over for opbevaring ved 36 °C. Stabiliteten over for øget opbevaringstemperatur blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgG-CH3 modubody i de viste koncentrationer blev inkuberet i 1,2, 4, 7, 10 dage ved 36 °C og blev undersøgt ved sammenligning med en fortyndingsserie, der blev opbevaret ved 4 °C, i anti-32-glycoproteinimmunassayet. I den forbindelse blev bindingen af CAD-lgG-CH3 modubody til 32-glycoproteinet bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-IgG antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 7:
Karakterisering af stabiliteten af en CAD-lgG-CH3 modubody over for indtørring. Stabiliteten over for indtørring blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgG-CH3 modubody blev tørret i en Speedvak-anordning under vakuum ved 22 °C og efterfølgende blev gensolubiliseret til de viste koncentrationer. Derefter blev bindingen af den gensolubiliserede CAD-lgG-CH3 modubody til 32-glycoprotein bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 8:
Karakterisering af stabiliteten af en CAD-lgG-CH3 modubody over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser. Stabiliteten over for gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH3 modubody blev nedfrosset i fem gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C og efterfølgende blev undersøgt med de viste koncentrationer i anti-32-glycoproteinimmunassayet. I den forbindelse blev bindingen af CAD-lgG-CH3 modubody til 32-glycoproteinet bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450.
Figur 9:
Karakterisering af kalibratorfunktionen af CAD-lgG-CH2-modubody ved binding til målet B2-glycoprotein og detektion med et anti-human-lgG-peroxidase sekundært antistof. CAD-lgG-CH2 blev påført i den viste koncentration på mikrotiterplader, der var blevet belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin, og bindingen blev bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof (Jackson Immunoresearch) og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450 nm.
Figur 10:
Karakterisering af stabiliteten af CAD-lgG-CH2-modubody over for indtørring. Stabiliteten over for indtørring blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgG-CH2-modubody blev indtørret i en Speedvak-anordning under vakuum ved 22 °C og efterfølgende blev gensolubiliseret til de viste koncentrationer. Derefter blev bindingen af den gensolubiliserede CAD-lgG-CH2-modubody til 32-glycoprotein bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450 nm.
Figur 11:
Karakterisering af stabiliteten af CAD-lgG-CH2-modubody over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser. Stabiliteten over for gentagne nedfrysnings- optøningscyklusser blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH2-modubodies i fem gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev nedfrosset ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C og efterfølgende blev undersøgt med de viste koncentrationer på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. I den forbindelse blev bindingen af CAD-lgG-CH2-modubody til B2-glycoprotein bestemt med et peroxidase-markeret anti-human-lgG-antistof og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450 nm.
Figur 12:
Karakterisering af kalibratorfunktionen af den multifunktionelle CAD-lgM-lgA-lgG-modubody ved binding til målet B2-glycoprotein og separat detektion med de isotypespecifikke anti-human-lgM-, Anti-human-lgA- og anti-human-lgG-peroxidase sekundære antistoffer. CAD-lgM-lgA-lgG blev påført i den viste koncentration på mikrotiterpladen, der var belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin, og bindingen blev bestemt ved separate bestemmelser med isotypespecifikke peroxidase-markerede anti-human-lgM-, anti-human-lgA- og anti-human-lgG-antistoffer (Jackson Immunoresearch) og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450 nm.
Figur 13:
Karakterisering af stabiliteten af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody over for indtørring. Stabiliteten over for indtørring blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody blev tørret i en Speedvak-anordning under vakuum ved 22 °C og efterfølgende blev gensolubiliseret til de viste koncentrationer. Derefter blev bindingen af den gensolubiliserede CAD-lgM-lgA-lgG-modubody til B2-glycoprotein bestemt ved separate bestemmelser med isotypespecifikke peroxidase-markerede anti-human-lgM-, anti-human-lgA- og anti-human-lgG-antistoffer (Jackson Immunoresearch) og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450nm.
Figur 14:
Karakterisering af stabiliteten af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser. Stabiliteten over for gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgM-lgA-lgG- modubody i fem gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev nedfrosset ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C og efterfølgende blev undersøgt med de viste koncentrationer på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Derefter blev bindingen af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody til 32-glycoprotein bestemt ved separate bestemmelser med isotypespecifikke peroxidase-markerede anti-human-lgM-, anti-human-lgA-og anti-human-lgG-antistoffer (Jackson Immunoresearch) og en TMB-farvereaktion ved måling af O.D. 450nm.
Figur 15:
Karakterisering af bindingsreaktionen ved CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody til målet 32-glycoprotein. Til ELISA detektion af den specifikke 32-glycoprotein-bindingsaktivitet ved CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody blev der påført fortyndingsserier af CAD-lgG-CH3-Knob02 i den viste koncentration på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein og til kontrol med kvægserumalbumin (BSA). Bindingen blev bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof (Qiagen, Hilden) og en tetramethylbenzidin (TMB)-farvereaktion ved måling af O.D. 450nm.
Udførlig beskrivelse af opfindelsen
Hidtidige fremgangsmåder til fremstilling af antistoffer, antistoffragmenter og små antistoflignende molekyler har en lang række begrænsninger med hensyn til muligheden for at fremstille disse med lave omkostninger i biologisk aktiv form.
Hidtidige fremgangsmåder til fremstilling af kalibratorer og standardmaterialer til diagnostiske assays indebærer en lang række ulemper med hensyn til disponibilitet, ensartede bindings- og stabilitetskarakteristika, sikring af fravær af patogener og fremstillingsomkostninger. Disse indskrænkninger og ulemper afhjælpes med den foreliggende opfindelse. Derudover er der et vedvarende behov for små antistof-lignende molekyler, der identificerer et antigen specifikt og danner komplekser med antistoffer mod naturlige immunglobuliner.
Den foreliggende beskrivelse muliggør fremstilling af monospecifikke polypeptidreagenser - „modubodies" - til biokemisk forskning, til anvendelse i diagnostiske assays eller som bestanddel af lægemidler.
En modubody er en kimær enkeltkædet fusionspolypeptid, der består af mindst tre domæner, nemlig et første domæne fra den variable tungkæderegion af et antistof (VH), et andet domæne fra den variable letkæderegion af et antistof (VL) og et tredje domæne, der omfatter et delafsnit af en konstant tungkæderegion af et antistof (CHX). De enkelte domæner er forbundet med hinanden via egnede peptidlinkere. Modubodyen er monovalent, dvs. den har et enkelt antigenbindingssted.
De præsenterede modubodies har eksempelvis en struktur (begyndende ved N-terminus) som følger: VH - L - VL - L - CHX eller VL - L - VH - L - CHX, hvor VH er den variable tungkæderegion af et antistof eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, VL er den variable letkæderegion af et antistof eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, L er en peptidlinker og CHX er et domæne, der omfatter et delafsnit af en konstant tungkæderegion af et antistof. CHX kan eksempelvis vælges fra afsnittene CH1, CH2, CH3 og CH4 fra den konstante tungkæderegion af antistoffer, fortrinsvis af antistoffer fra klasserne IgG, IgM, IgE og IgA, særligt foretrukket af humane antistoffer fra klasserne IgG, IgM, IgE og IgA. Foretrukne eksempler på domæne CHX er lgG-CH1, lgG-CH2, lgG-CH3, lgA-CH2, lgA-CH3, lgM-CH2, lgM-CH3 og lgM-CH4, særligt fra de respektive humane antistoffer.
Det første domæne (VH) og det andet domæne (VL) danner sammen med hinanden antigenbindingsstedet (bindingsmodul). De vælges fortrinsvis på en sådan måde, at de begge stammer fra et enkelt oprindeligt antistof. Dette oprindelige antistof er et vilkårligt monoklonalt antistof, f.eks. et monoklonalt antistof fra en ikke-human pattedyrsart (f.eks. rotte, mus eller kanin), et humant antistof eller et humaniseret antistof.
Modubodyen kan være indrettet til et antigen efter ønske, eksempelvis et diagnostisk eller terapeutisk relevant antigen. Foretrukne eksempler på specifikke antigener er 32-glycoprotein, phosphatidylserin, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A), Tumor Necrosis Factor (TNF-alpha), Smoothened Flomolog (SMO), Protein Patched Flomolog (PTC1), B-Lymphocyte Antigen (CD20), Cytotoxic T-Lymphocyte Protein 4 (CTLA4), Amyloid beta A4 Protein (APP), Presenilin-1 (PS1), CC-Chemokine Receptor (CCR-5), Telomer Repeat-binding Factor 1 (TRF1) og Toll-like Receptors (TLR1-10).
Det første og det andet domæne af polypeptidet ifølge opfindelsen kan indeholde de fuldstændige variable tung- eller letkæderegioner af et antistof eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen. Fortrinsvis indeholder domænerne i det mindste regionerne CDR1, CDR2 og CDR3 i den pågældende tung- eller letkæderegion fuldstændigt og i det mindste dele af de tilsvarende framework-regioner FR1, FR2, FR3 og FR4. Længden af domænerne VFH og VL udgør mindst 80, mindst 90 eller mindst 100 aminosyrerester og op til 110 eller op til 120 aminosyrerester.
Fusionspolypeptidet ifølge opfindelsen indeholder i det mindste et domæne, der omfatter et afsnit af en konstant tungkæderegion af et antistof (CFIX). Fortrinsvis ligger domæne henholdsvis domænerne af den tredje type C-terminalt i forhold til VFH- og VL-domænerne. Et tredje domæne kan indeholde et fuldstændigt afsnit af en konstant tungkæderegion eller et delafsnit heraf, der giver fusionspolypeptidet en tilstrækkelig strukturel stabilitet. Længden af et tredje domæne udgør mindst 80, mindst 90 eller mindst 100 aminosyrerester og op til 110, op til 120 eller op til 130 aminosyrerester. Fusionspolypeptidet kan eventuelt indeholde flere domæner af den tredje type, der er ens eller forskellige, f.eks. 2, 3 eller 4. FHvis der foreligger flere domæner af den tredje type, er disse hver især forbundet med hinanden via peptidlinkere og fortrinsvis placeret ved fusionspolypeptidets C-terminus. Eksempler på den strukturelle opbygning af fusionspolypeptider ifølge opfindelsen med 2 (eller 3) domæner af den tredje type er som følger: VH - L - VL - L - CHX1 - L - CHX2 (-L-CHX3) eller VL - L - VH - L - CHX1 - L - CHX2 (-L-CHX3), hvor VH, L og VL er defineret som ovenfor og CHX1, CHX2 og CHX3 hver især er et tredje domæne CHX som defineret ovenfor.
Fusionspolypeptidet indeholder domæner af en første, anden og tredje type, der hver især er forbundet med hinanden via peptidlinkere (L). Disse peptidlinkere består af sekvenser, der er heterologe i forhold til aminosyresekvenser af domænerne af første, anden og tredje type sind henholdsvis af sekvenser, der ikke foreligger i naturlige immunglobuliner. Peptidlinkerne, der forbinder de enkelte domæner med hinanden, kan i hvert enkelt tilfælde være ens eller forskellige. Peptidlinkerne har uafhængigt af hinanden en længde på 25-45 og særligt foretrukket på 30-40 aminosyrerester. Desuden er peptidlinkerne fleksible linkere uden sekundærstruktur. Peptidlinkerne er sammensat udelukkende af glycin-og/eller serinrester. Særligt egnet er peptidlinkerne, der indeholder flere sekvenser af sekvens SGGGG. Et særligt foretrukket eksempel på en peptidlinker er vist i SEQ ID NO: 3. Der kan eventuelt også foreligge linkersekvenser ved fusionspolypeptidets N- og/eller C-terminus.
Foruden domænerne (i), (ii) og (iii) samt peptidlinkerne, der er placeret mellem domænerne, kan fusionspolypeptidet eventuelt indeholde yderligere sekvensafsnit, eksempelvis et signalpeptidafsnit, der er placeret ved N- og/eller C-terminus og letter ekspressionen og/eller sekretionen af polypeptidet. Desuden kan fusionspolypeptidet indeholde et eller flere yderligere ikke-immunglobulin-domæner, f.eks. påvisnings- eller identifikationsdomæner, dvs. peptidsekvenser (tags), der er egnet til påvisning eller identifikation af fusionspolypeptidet, f.eks. et FLAG-epitop eller en poly-his-sekvens. Desuden kan fusionspolypeptidet eventuelt også indeholde et eller flere ikke-immunglobulin-effektordomæner. De yderligere domæner er - såfremt de forefindes - fortrinsvis forbundet med den resterende fusionspolypeptid via en peptidlinker, f.eks. en peptidlinker som defineret ovenfor.
Særligt foretrukne eksempler på fusionspolypeptider ifølge opfindelsen indeholder et eller flere domæner VH, VL og/eller CHX som defineret ovenfor, der har en identitet på aminosyreniveau på mindst 90 %, fortrinsvis på mindst 95 % i forhold til de tilsvarende domæner iht. SEQ ID NO: 1 (VL), SEQ ID NO: 2 (VH), SEQ ID NO: 4 (VH, VL), SEQ ID NO: 8 (lgG-CH1), SEQ ID NO: 10 (lgG-CH2), SEQ ID NO: 12 (lgG-CH3), SEQ ID NO: 14 (lgA-CH2), SEQ ID NO: 16 (lgA-CH3), SEQ ID NO: 18 (lgM-CH2), SEQ ID NO: 20 (lgM-CH3) eller SEQ ID NO: 22 (lgM-CH4).
Fusionspolypeptidet ifølge opfindelsen kan eventuelt indbefatte en eller flere modifikationer i forhold til den naturlige sekvens af de deri indeholdte VH-, VL- og CHX-domæner. Således kan eksempelvis mindst en asparaginrest ved en glykosileringsposition, f.eks. i et CHX-domæne, være erstattet af en anden aminosyrerest, fortrinsvis serin, alanin eller glycin. Derudover kan eventuelt mindst en cysteinrest, f.eks. i et CHX-domæne, der ikke danner en disulfidbro med en anden cysteinrest, der forefindes i det pågældende domæne, og derfor potentielt bevirker dannelsen af intermolekylærer disulfidbroer, være erstattet af en anden aminosyrerest, fortrinsvis serin, alanin eller glycin.
Modubodies ifølge opfindelsen er kunstige monospecifikke antistoflignende molekyler, der i form af en enkelt proteinkæde kan fremstilles let og i store mængder i egnede ekspressionssystemer, f.eks. bakterielle ekspressionssystemer. Som reagenser for biokemiske eller diagnostiske assays kan modubodies binde specifikt via et bindingsmodul (VH + VL) og påvises specifikt via et reaktionsmodul (CHX) med arts- og isotypespecifikke sekundære antistoffer. En sekvens af flere reaktionsmoduler (f.eks. CHX1 og CHX2 eller CHX og en ikke-immunglobulin-påvisnings- eller identifikationsdomæne) muliggør detektion med forskellige reagenser, f.eks. med forskellige arts- eller isotypespecifikke sekundære antistoffer. Som reagenser for terapeutiske funktioner kan modubodies via et bindingsmodul binde sig specifikt til et antigen på en målstruktur og via et reaktionsmodul (CHX) eller en serie af reaktionsmoduler (f.eks. CHX1 og CHX2 eller CHX og et ikke-immunglobulin-effektordomæne) udøve specifikke effektorfunktioner. CHX-domæner, der potentielt kan danne dimerer, bliver modificeret på en sådan måde, at en dimerisering kan udelukkes og modubodies foreligger monovalent.
Aminosyrepositioner, hvis sidekæder har interaktioner svarende til konceptet for „knobs-into-holes"-anordningen (Crick, F.H.C. (1952), Nature, 170: 882-883), modificeres. Således kan aminosyrepositioner, hvis sidekæder udformer kontakter på grænsefladen af lgGi-CH3-dimerer (Ridgway J.B.B et al. (1996), Protein Engineering, 9: 617-621), modificeres på en sådan måde, at der på over for hinanden liggende kontaktsteder i lgG-CH3-dimeren foreligger voluminøse aminosyresidekæder og en dimerisering blokeres sterisk af denne „knob-knob"-position. Interaktionen mellem de kontakterende aminosyresidekæder i to IgGi-CH3-domæner kan eksempelvis blokeres ved udskiftning af aminosyrepositionerne Threonin 366, Threonin 394, Phenylalanin 405 med Tyrosin i position 366, 394 og 405 (nummereringsskema svarende til Kabat EU Index (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest 5 th Edition, NIH Publication 91-3242).
Modubodies ifølge opfindelsen udmærker sig desuden ved en overraskende stabilitet, f.eks. stabilitet over for temperaturstress eller stabilitet over for tørrings-/rekonstitutions- eller nedfrysnings-/optøningscyklusser. Således bevares, i forhold til en ubehandlet prøve, også i fortyndede opløsninger (5 pg/ml) af modubodies over 90 % af antigenbindingsaktiviteten efter 10 dages inkubation ved 36 °C eller efter tørring og rekonstitution eller efter nedfrysnings-/optøningscyklusser, der er gentaget 5 gange. de novo konstruktion af en modubody omfatter fortrinsvis følgende trin: a) valg af rumligt afgrænsede domæner fra immunglobuliner med kendt eller modelleret rumlig struktur under hensyntagen til sekvens- og strukturdatabaseinformationer; b) disulfidbrooptimering af de valgte domæner, idet cysteinpositioner, der i sammenhæng med den intakte immunglobulin danner disulfidbroer uden for det valgte domæne, redigeres til en strukturneutral aminosyre, fortrinsvis serin, alanin eller glycin; c) optionel redigering af asparagin-koblede glykosilerings-positioner fortrinsvis til serin, alanin eller glycin; d) forbindelse af et udvalg af funktionsmodulerne, der resulterer af trinnene a) til c), med fleksible linkersekvenser, der består af aminosyrerne glycin og/eller serin og særligt foretrukket svarer til linkersekvensen (SEQ ID NO: 3), idet afhængigt af funktionsmodulets position inden for modubodyen og kloningsstrategien en modulsekvens, der resulterer af trinnene a) til c), kan forbindes med en fleksibel linkersekvens, og linkersekvensen kan danne funktionsmodulets N- eller C-terminus, og idet der optionelt kan genereres en aminosyresekvens, der omfatter flere funktionsmoduler, eller en aminosyresekvens, der opbygger den komplette modubody; e) oversættelse af aminosyresekvenserne, der resulterer af trinnene a) til d), til korresponderende DNA-sekvenser, fortrinsvis under hensyntagen til en codonhyppighedstabel, der er optimeret til det planlagte ekspressionssystem, idet de resulterende DNA-sekvenser optionelt kan forsynes med flankerende restriktionsenzymgrænseflader og konservative basesubstitutioner til undgåelse af uønskede restriktionsenzymgrænseflader; f) fremstilling af sekvenserne, der er defineret i trin e), som syntetisk DNA ved gensyntese og kloning af de genetiske enheder, der koder enkelte funktionsmoduler eller en serie af flere ens eller forskellige funktionsmoduler, til egnede vektorer, kloning af hele modubodien ved sammenføjning af de enkelte funktionsmoduler eller funktionsmodulserier tilsigter funktionsmodulsekvens og antal, idet der optionelt også direkte kan klones en genetisk enhed, der koder den komplette modubody.
Denne konstruktionsmåde, f.eks. valget af rumligt afgrænsede domæner, undgåelse af disulfidbroer, der stabiliserer en dimer, og forbindelse af de enkelte moduler ved hjælp af fleksible glycin-serin linkere med en foretrukken længde på 30-40 aminosyrer har til hensigt, at de enkelte moduler kan agere uafhængigt af hinanden.
Opfindelsen angår desuden en nukleinsyre, f.eks. et DNA eller RNA, der koder for en fusionspolypeptid som beskrevet ovenfor. Denne nukleinsyre kan eventuelt foreligge i en operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens, f.eks. en promotor. Opfindelsen angår dermed også ekspressionsvektorer, der indeholder en nukleinsyresekvens, der koder for en fusionspolypeptid ifølge opfindelsen, og er egnede til ekspression af denne nukleinsyre i en værtscelle. Værtscellen kan være en prokaryotisk værtscelle såsom en gram-negativt bakterie som f.eks. E. coli eller en gram-negativt bakterie som f.eks. B. subtilis men også en eukaryotisk værtscelle, f.eks. en gærcelle, en svampecelle, en insektcelle eller en pattedyrscelle. For at forbedre ekspressionen af nukleinsyren i den valgte værtscelle kan den optimeres med hensyn til codonanvendelse i den pågældende værtscelle. Tilsvarende fremgangsmåder er kendt af fagmanden.
En yderligere genstand for opfindelsen er en værtscelle som angivet ovenfor, der indeholder en nukleinsyre ifølge opfindelsen. Nukleinsyren kan føres ind i den pågældende værtscelle med kendte teknikker, f.eks. transformation eller transfektion. Til fremstilling af fusionspolypeptidet ifølge opfindelsen kan værtscellen kultiveres og fusionspolypeptidet udvindes fra cellen eller kultursupernetanten efter metoder, der principielt er kendt.
Fusionspolypeptiderne ifølge opfindelsen kan eksempelvis anvendes som reagens i en diagnostisk eller biokemisk test, særligt i en test, der er baseret på immunologiske metoder, eksempelvis som kontrol- eller kalibratorreagens eller også som testreagens til bestemmelse af en analyt. Påvisningen af fusionspolypeptiderne ifølge opfindelsen kan i den forbindelse foretages via CHX-domænet(-erne) f.eks. under anvendelse af isotype- eller artsspecifikke identifikationsreagenser, f.eks. sekundære antistoffer og/eller via ikke-immunglobulin-identifikationsdomæner under anvendelse af specifikke bindingspartnere til disse domæner. Tilsvarende testformater kendes af fagmanden.
Desuden kan fusionspolypeptidet, nukleinsyren eller værtscellen ifølge den foreliggende opfindelse også anvendes til medicinske formål, f.eks. inden for human- eller veterinærmedizin. Fusionspolypeptider kan eksempelvis anvendes som immunologiske lægemidler, eventuelt koblet sammen med ikke-immunglobulin-effektordomæner, f.eks. radionukleider eller toksiner. Nukleinsyrerne, der koder for fusionspolypeptidet, kan eksempelvis anvendes som nukleinsyrevaccine.
En endnu yderligere genstand for opfindelsen er således en farmaceutisk sammensætning, der indeholder fusionspolypeptidet, nukleinsyren eller værtscellen sammen med farmaceutisk egnede bærestoffer. Indgivelsen af den farmaceutiske sammensætning kan udføres efter kendte metoder, som de eksempelvis anvendes til terapi med antistoffer eller DNA-vaccinering, til et subjekt, f.eks. en menneskelig patient, der har brug for en tilsvarende terapeutisk behandling.
Desuden skal den foreliggende opfindelse forklares ved hjælp af de følgende eksempler.
Eksempler
Eksempel 1: Konstruktion, kloning og karakterisering af et B2-glycoprotein-bindingsmodul (scFv-CAD)
1.1 Konstruktion af scFv-CAD
Det følgende eksempel beskriver konstruktionen af et B2-glycoprotein-specifikt bindingsmodul (scFv-CAD) i form af en syntetisk konstruktion.
Andele af den variablen region af den lette kæde VL (SEQ ID NO:1) og af den variable region af den tunge kæde VH (SEQ ID NO:2) i det monoklonale antistof WBCAL-1, der stammer fra en musemodel for antiphospholipidsyndromet, F1 mus fra New Zealand white X BXSB (Ichikawa et al. (1999), Arthritis and Rheumatism 42:2461) blev valgt som elementer til et B2-glycoproteinidentifikationsmodul, føjet sammen med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) og flankerende sekvenser til en kunstig proteinsekvens scFv-RP-CAD-P (SEQ ID NO: 4). Denne proteinsekvens blev under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, forsynet med flankerende kloningssekvenser og fremstillet ved hjælp af gensyntese som kunstig DNA-sekvens scFv-RP-CAD-N, der koder for et B2-glycoprotein-identifikationsmodul (SEQ ID NO: 5). VL-domænet strækker sig fra aminosyre 1-118 i SEQ ID NO: 4, VH-domænet strækker sig fra aminosyre 159-272 i SEQ ID NO: 4.
1.2 Kloning af scFv-CAD
Til konstruktionen blev den under eksempel 1.1 beskrevne syntetiske DNA-sekvens scFv-RP-CAD-N (SEQ ID NO: 5), der koder for et B2-glycoprotein-detektionsdomæne, amplificeret med primerne RP-CAD01 (SEQ ID NO: 6), RP-CAD02 (SEQ ID NO: 7) ved polymerasekædereaktion (PCR). 856 basepar (bp)-amplifikatet blev isoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-kit (Qiagen, Hilden). Det isolerede fragment blev først fordøjet med restriktionsenzymet Hind III og derefter underkastet en Bglll partial fordøjelse. Restriktionsfragmentet blev ligeret med plasmid pQE-80L (Qiagen, Hilden), der blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindi 11, og transformeret til E. co//-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham). Transformationsopløsningen blev udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med 50 pg/ml carbenicillin, og inkuberet natten over (n.o.), (16-20 h) ved 36 °C. Enkeltkolonier af den resulterende E. co//-stamme CAD-pQE80-NovaBlue blev formeret på rysteanordningen ved 180 omdrejninger i minuttet (o/min) i LB-mediet, der var supplementeret med 50 pg/ml carbenicillin (LB-Carb) (36 °C, o.n.). Fra enkeltklonkulturerne blev der oprettet frysestammekulturer. 1 ml fra enkeltklonkulturerne blev i hvert enkelt tilfælde anvendt til plasmidpræparation. De isolerede plasmider blev analyseret ved hjælp af EcoRI/Hindlll-fordøjelse. Kloner med et forventet 901 bp-fragment blev undersøgt yderligere ved induktionsanalyse. Hertil blev de udvalgte enkeltkloner dyrket i LB-Carb og induceret ved en O.D.500 på 0,5 til 1,0 ved tilsætning af et kulturvolumen LB-Carb, 1 mM isopropylthiogalactosid (IPTG) til ekspression af proteinet, der var kodet ved hjælp af det klonede DNA-fragment, og kultiveret i 16 timer (h), ved 36 °C, 180 o/min. Induktionscellerne blev lyseret i natriumdodecylsulfat (SDS)-holdigt prøvebuffer, proteiner blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). I Western-Blot blev ekspressionen af et forventet 30 kDa scFv-CAD-protein påvist ved detektion med et Anti-RGS-6xHis-peroxidase-koblet antistof (Qiagen, Hilden). Den korrekte kloning blev bekræftet ved sekvensering.
1.3 Ekspression af scFv-CAD
Den under 1.2. med ekspressionskonstruktet transformerede E. co//-stamme CAD-pQE80-NovaBlue blev dyrket i LB-Carb-mediet ved 36 °C indtil en O.D.500 på 0,5 til 1,0 og induceret ved tilsætning af IPTG til syntese af scFv-CAD. Den inducerede kultur blev kultiveret ved 36 °C i 4 timer til natten over. Induktionscellerne blev høstet og lyseret efter lysozymbehandling i et 8 M urinstof-holdigt Tris-HCI-natriumchlorid-buffer (TBS). Eksprimeret scFv-CAD blev renset ved en kombination af affinitets- og ionbytningskromatografi til homogenitet. I det coomassieblåt farvede SDS-polyacrylamidgel er scFv-CAD-proteinet synligt i form af et 30 kDa-bånd. Berigelsen af B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten ledsages af rensning af 30 kDa-båndet.
1.4 Karakterisering af scFv-CAD
Bindingsspecifiteten af scFv-CAD blev kontrolleret in Enzyme linked Immunosorbent-Assay (ELISA) med mikrotiterplader belagt med 32-glycoprotein henholdsvis kvægserumalbumin (BSA). Stabiliteten af scFv-CAD over for varmestress blev undersøgt ved egnede fortyndinger af scFv-CAD.
1.4.1 Bindingsspecifitet af scFv-CAD
For at bestemme, om scFv-CAD har en specifik 32-glycoproteinbindingsaktivitet, blev det rensede proteinmodul testet med immunoassays. Til dette formål blev fortyndingsserier af scFv-CAD påført på mikrotiterplader til Anti-32-glycoprotein-assayet, der var belagt med 32-glycoprotein (ORG 521, ORGENTEC Diagnostika GmbH, Mainz), og til kontrol af bindingsspecifiteten på BSA-belagte plader og inkuberet 30 min ved 20-25 °C. Mikrotiterpladerne blev vasket og bindingen af scFv-CAD blev bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof (Qiagen, Hilden) og en tetramethylbenzidin (TMB)-farvereaktion ved måling af O.D. 450. I den forbindelse blev der som vist på Figur 2 allerede ved en koncentration af scFv-CAD på 19 ng/ml påvist en specifik binding til 32-glycoprotein. Sammenligningen af reaktionsniveauet for scFv-CAD-fortyndingstrinnene ved binding til 32-glycoprotein henholdsvis BSA belagte mikrotiterplader viser, at der ikke forekommer nogen uspecifik binding i koncentrationsområdet på 0,019-10 pg/ml scFv-CAD.
1.4.2 Temperaturstabilitet ved scFv-CAD
For at undersøge indflydelsen af temperaturstress på den specifikke 32-glycoprotein-bindingsaktivitet ved scFv-CAD blev det rensede proteinmodul udsat for en temperatur på 50 °C i en koncentration på 5 pg/ml i et tidsrum på 0-180 minutter. Bindingen af scFv-CAD til 32-glycoprotein blev bestemt i et immunoassay som beskrevet under 1.4.1. I den forbindelse viste scFv-CAD-modulet, der var fortyndet i kalibratorfortyndingsmediet, sig, som vist på figur 3A, at være resistent over for en temperatur på 50 °C i 3 timer.
For at bestemme inaktiveringstemperaturen af scFv-CAD blev det rensede proteinmodul udsat for en serie af temperaturer på 20 °C til 90 °C i en koncentration på 5 pg/ml i et kalibratorfortyndingsmedium i 10 min. Bindingen af de varmebehandlede scFv-CAD-fortyndinger til 32-glycoprotein blev bestemt i et immunoassay som beskrevet under 1.4.1. I den forbindelse viste scFv-CAD-modulet sig, som vist på figur 3B, at være stabilt op til en temperatur på 50 °C, fra en temperatur på 60 °C opstod der en betydelig inaktivering.
Eksempel 2: Konstruktion af en serie af reaktionsmoduler for modubodies
Det følgende eksempel beskriver konstruktionen af en serie af reaktionsmoduler, der er afledt fra domæner af den konstante region af den tunge kæde i humane antistoffer. Til dette formål blev strukturelt og funktionelt afgrænsede domæner afledt fra proteinsekvenser af den tunge kæde af humane antistoffer fra klasserne IgG, IgA, IgM med kendt rumlig struktur. De udvalgte proteinsekvenser blev kontrolleret med henblik på potentielle interdomæne-disulfidbroer. Cysteinpositioner, der uden for det valgte domæne danner disulfidbroer med regioner af det intakte immunglobulin, blev redigeret fra cystein til serin. Ved enkelte glykosileringspositioner blev der ligeledes udført en redigering fra asparagin til serin. De udvalgte immunglobulindomænesekvenser blev sammenføjet til kunstige reaktionsmodulsekvenser som elementer til reaktionsmoduler med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) og flankerende sekvenser. Disse reaktionsmodulsekvenser blev baseret på en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, forsynet med flankerende kloningssekvenser og fremstillet ved gensyntese som kunstige DNA-sekvenser. 2.1 Konstruktion af et humant lgG-CH1-reaktionsmodul
Fra Worldwide Protein Data Bank (pdb), (Berman et al. (2003), Nature Structural Biology 10: 980) blev sekvenspositionerne 125-219 udvalgt fra krystalstrukturen af Fab-fragmentet i Anti-Factor lx-antistoffet 10c12 på baggrund af proteinstrukturdatabaseposten pdb 3D69H som repræsentativt lgG-CH1-domæne.
Den udvalgte lgG-CH1 immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgG-CH1-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH1-G-P (SEQ ID NO: 8) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, forsynet yderligere med flankerende kloningssekvenser (BamHI, Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH1-G-N (SEQ ID NO: 9). lgG-CH1-domænet strækker sig fra aminosyre 37-131 i SEQ ID NO: 8. 2.2 Konstruktion af et humant lgG-CH2-reaktionsmodul
Fra krystalstrukturen af det muterede Adcc-forstærkede Fc-fragment blev sekvenspositionerne 15-116 på baggrund af proteinstrukturdatabaseposten pdb 2QL1A udvalgt som repræsentativt lgG-CH2-domæne. Den udvalgte lgG-CH2-immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgG-CH2-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH2-G-P (SEQ ID NO: 10) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyre, der er optimeret til ekspressionen i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH2-G-N (SEQ ID NO: 11). lgG-CH2-domænet strækker sig fra aminosyre 37-138 i SEQ ID NO: 10. 2.3 Konstruktion af et humant lgG-CH3-reaktionsmodul
Fra krystalstrukturen af den tunge kæde af et humant immunglobulin med en hinge-deletion blev sekvenspositionerne 330-428 på baggrund af proteinstrukturdatabaseposten pdb 1MCO_H (GI: 494350) udvalgt som repræsentativt lgG-CH3-domæne. Den udvalgte lgG-CH3-immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgG-CH3-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH3-G-P (SEQ ID NO: 12) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH3-G-N (SEQ ID NO: 13). lgG-CH3-domænet strækker sig fra aminosyre 37-135 i SEQ ID NO: 12. 2.4 Konstruktion af et humant lgA-CH2-reaktionsmodul
Fra en strukturmodel for humant IgA, der blev afledt på basis af neutronspredning i opløsning og homologimodellering (Boehm et al. (1999) J.Mol.Biol. 286:1421-1447), blev sekvenspositionerne 126-222 (i henhold til UNIPROT P01876) fra proteinstrukturdatabaseposten pdb 11GA på baggrund af den rumlige struktur af den tunge kæde af humant lgA1 udvalgt som repræsentativt lgA-CH2-domæne. Ved positionerne 182,192 blev cystein redigeret til serin. Den udvalgte og redigerede lgA-CH2-immunglobulindomænesekvens blev som element til et IgA-CH2-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH2-A-P (SEQ ID NO: 14) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH2-A-N (SEQ ID NO: 15). lgA-CH2-domænet strækker sig fra aminosyre 37-133 in SEQ ID NO: 14. 2.5 Konstruktion af et humant lgA-CH3-reaktionsmodul
Fra proteinstrukturdatabaseposten PDB 11GA blev sekvenspositionerne 227-331 (i henhold til UNIPROT P01876) på baggrund af den rumlige struktur af den tunge kæde af humant lgA1 udvalgt som repræsentativt lgA-CH3-domæne. Den udvalgte lgA-CH3-immunglobulindomænesekvens blev som element til et IgA-CH3-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens sc-RP-CH3-A-P (SEQ ID NO: 16) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens sc-RP-CH3-A-N (SEQ ID NO: 17). lgA-CH3-domænet strækker sig fra aminosyre 37-141 i SEQ ID NO: 16. 2.6 Konstruktion af et humant lgM-CH2-reaktionsmodul
Fra en strukturmodel af humant IgM, der blev afledt på basis af røntgenstråling i opløsning og modellering (Perkins et al. (1991) J.Mol.Biol. 221:1345-1366) blev sekvenspositionerne 106-217 (i henhold til UNIPROT P01871) fra proteinstrukturdatabaseposten pdb 2rcj på baggrund af den rumlige struktur af den tunge kæde af humant IgM udvalgt som repræsentativt lgM-CH2-domæne og redigeret. Ved position 214 blev cystein redigeret til serin, ved position 109 blev asparagin redigeret til serin. Den udvalgte og redigerede lgM-CH2-immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgM-CH2-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH2-M-P (SEQ ID NO: 18) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH2-M-N (SEQ ID NO: 19). lgM-CH2-domænet strækker sig fra aminosyre 37-148 i SEQ ID NO: 18. 2.7 Konstruktion af et humant lgM-CH3-reaktionsmodul
Fra proteinstrukturdatabaseposten pdb 2rcj blev sekvenspositionerne 218-323 (entsprechend UNIPROT P01871) på baggrund af den rumlige struktur af den tunge kæde af humant IgM udvalgt som repræsentativt lgM-CH3-domæne og redigeret. Ved position 291 blev cystein redigeret til serin, ved positionerne 272 og 279 blev asparagin redigeret til serin. Den udvalgte og redigerede lgM-CH3-immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgM-CH3-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH3-M-P (SEQ ID NO: 20) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH3-M-N (SEQ ID NO: 21). lgM-CH3-domænet strækker sig fra aminosyre 37-142 i SEQ ID NO: 20. 2.8 Konstruktion af et humant lgM-CH4-reaktionsmodul
Fra proteinstrukturdatabaseposten pdb 2rcj blev sekvenspositionerne 324-452 (i henhold til UNIPROT P01871) på baggrund af den rumlige struktur af den tunge kæde af humant IgM udvalgt som repræsentativt lgM-CH3-domæne og redigeret. Ved position 451 blev cystein redigeret til serin, ved positionerne 439 blev asparagin redigeret til serin. Den udvalgte og redigerede lgM-CH3-immunglobulindomænesekvens blev som element til et lgM-CH3-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CH4-M-P (SEQ ID NO: 22) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHl/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP-CH4-M-N (SEQ ID NO: 23). lgM-CH4-domænet strækker sig fra aminosyre 37-165 i SEQ ID NO: 22. 2.9 Konstruktion af et monovalent humant lgG-CH3-Knob02-reaktionsmodul
Fra krystalstrukturen af den tunge kæde af et humant immunglobulin med en hinge-deletion blev sekvenspositionerne 330-428 på baggrund af proteinstrukturdatabaseposten pdb 1MCO_H (Gl:494350) udvalgt som repræsentativt lgG-CH3-domæne og redigeret. I den forbindelse blev positioner af aminosyrerester, hvis sidekæder danner kontakter ved grænsefladen til lgGi-CH3-dimerer (Ridgway J.B.B et al. (1996), Protein Engineering, 9: 617-621), modificeret på en sådan måde, at der ikke kan ske en dimerisering af lgG-CFI3-domænet. Ved positionerne 351 og 379 blev threonin redigeret til tyrosin, ved position 390 blev phenylalanin redigeret til tyrosin. Den udvalgte og redigerede lgG-CFI3 immunglobulindomæne-sekvens blev som element til et lgG-CH3-Knob02-reaktionsmodul med en fleksibel linker (SEQ ID NO: 3) føjet sammen til en kunstig proteinsekvens Sc-RP-CFI3-G-Knob02-P (SEQ ID NO: 32) og under hensyntagen til en codonhyppighedstabel oversat til en nukleinsyresekvens, der er optimeret til ekspression i E. coli, yderligere forsynet med flankerende kloningssekvenser (BamHI/Hindlll) og fremstillet ved gensyntese som kunstig DNA-sekvens Sc-RP- CH3-G-Knob02-N (SEQ ID NO: 33). lgG-CH3-Knob02-domænet strækker sig fra aminosyre 37-135 in SEQ ID NO: 32.
Eksempel 3: Den enkeltkædede CAD-lgG-CH3 modubody 3.1 Konstruktion og kloning af den enkeltkædede CAD-lgG-CH3 modubody
Det følgende eksempel beskriver konstruktionen og kloningen af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH3, der er forsynet med lgG-CH3-detektionsdomæne.
Til konstruktion af CAD-lgG-CH3-modubodyen blev modulerne scFv-CAD (eksempel 1) og lgG-CH3 (eksempel 2.3) sammensat til en CAD-lgG-CH3 kodende sekvens (SEQ ID NO: 26) ved restriktionsfordøjelse og ligation i domænerækkefølgen VL-linker-VH-linker-lgG-CH3.
Hertil blev det under eksempel 2.3 beskrevne syntetiske lgG-CH3-reaktionsmodul Sc-RP-CH3-G-N i henhold til sekvens SEQ ID NO: 13 amplificeret med primerne CH05 (SEQ ID NO: 24) og CH04 (SEQ ID NO: 25) ved hjælp af PCR. 443 b-amplifikatet blev isoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-kit (Qiagen, Hilden). Det isolerede fragment blev først fordøjet med restriktionsenzymerne Bell og Hindlll. Restriktionsfragmenterne blev ligeret med det under eksempel 1 beskrevne CAD-scFv-pQE80-vektorkonstrukt, der blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll, og transformeret til E. co//-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham). Transformationsopløsningen blev udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml), og inkuberet natten over ved 36 °C. Enkeltkolonier af den resulterende E. co//-stamme CAD-lgG-CH3-pQE80-NovaBlue blev formeret i LB-Carb-mediet (36 °C, natten over 180 o/min). Fra enkeltklonkulturerne blev der oprettet frysestammekulturer, 1 ml fra enkeltklonkulturerne blev i hvert enkelt tilfælde anvendt til plasmidpræparation. De isolerede plasmider blev analyseret ved hjælp af EcoRI/Hindlll-fordøjelse. Kloner med et forventet 1312 bp-fragment blev undersøgt yderligere ved induktionsanalyse. Hertil blev de udvalgte enkeltkloner dyrket i LB-Carb og induceret ved en O.D.500 på 0,5 til 1,0 ved tilsætning af et kulturvolumen LB-Carb, der var supplementeret med 1 mM IPTG, til ekspression af det rekombinante protein og kultiveret i 16 timer ved 36 °C, 180 o/min. Induktionscellerne blev lyseret i SDS-prøvebuffer, proteiner blev separeret ved hjælp af SDS-PAGE. I Western-Blot blev ekspressionen af den forventede 44 kDa-CAD-lgG-CH3-modubody påvist ved detektion med et Anti-RGS-6xHis-peroxidase-koblet antistof (Qiagen, Hilden). Den korrekte kloning blev bekræftet ved sekvensering. 3.2 Ekspression og rensning af den enkeltkædede CAD-lgG-CH3-modubody
Det følgende eksempel beskriver ekspression og rensning af det 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH3, der er forsynet med et humant lgG-CH3-detektionsdomæne.
Den under 3.1 med ekspressionskonstruktet transformerede E. co/f-stamme CAD-lgG-CH3-pQE80-NovaBlue blev dyrket i LB-Carb-mediet ved 36 °C indtil en O.D.500 på 0,5 til 1.0 og under tilsætning af IPTG induceret til syntese af CAD-lgG-CH3 modubody. Den inducerede kultur blev kultiveret ved 36 °C i 4 timer til natten over. Induktionscellerne blev høstet og lyseret efter lysozymbehandling i et 8 M urinstof-holdigt TBS-buffer. Eksprimerede scFv-CAD-modubodies blev renset ved en kombination af affinitets- og ionbytningskromatografi for at opnå homogenitet. I det coomassieblåt farvede SDS-polyacrylamidgel er et 44 kDa-bånd synligt. Berigelsen af 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten og en reaktivitet med et peroxidase-koblet anti-human-lgG sekundært antistof (Jackson Immunoresearch) ledsages af rensning af 44 kDa-båndet. 3.3 Karakteristika for det enkeltkædede CAD-lgG-CH3-modubody
Det følgende eksempel beskriver karakteriseringen af det 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH3, der er forsynet med et humant lgG-CH3-detektionsdomæne med hensyn til specifik antigenidentifikation via et anti-human-lgG sekundært antistof og stabilitet over for øgede temperaturer, indtørring og nedfrysnings-optønings-cyklusser. 3.3.1 Kalibratorfunktion af CAD-lgG-CH3-modubody
For at bestemme, om CAD-lgG-CH3-modubody har bevaret 32-glycoprotein-bindings-aktiviteten ved scFv-CAD, og bindingen til antigenet via et anti-human-IgG sekundært antistof kan påvises specifikt, blev rensede CAD-lgG-CH3-præparationer undersøgt i et anti-32-glycoproteinimmunoassay. Den rensede CAD-lgG-CFI3-modubody blev i en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/pl, 1,25 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml i et kalibratorfortyndingsmedium påført på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-32-glycoprotein-assayet (ORG 521, ORGENTEC GmbFI, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 80 ng/ml. På figur 4 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm vist afhængigt af koncentrationen. Under de valgte reaktionsbetingelser blev CAD-lgG-CH3-modubody påvist ved en koncentration på 5 pg/ml med en O.D. 450 på 2,2. 3.3.2 Stabilitet af CAD-lgG-CFI3-modubody
Til karakterisering af robustheden af CAD-lgG-CH3-modubody blev fortyndinger i kalibratorfortyndingsmedium udsat for stressfaktorerne 50 °C-varmestress, øget opbevaringstemperatur ved 36 °C, tørhed og gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser. I sammenligning med ubehandlede prøver blev 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten og detekterbarheden bestemt med et anti-hu-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof (Jackson Immunoresearch). 3.3.2.1 Stabilitet af CAD-lgG-CH3-modubody over for varmestress
Stabiliteten over for varmestress blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH3-modubody i kalibratorfortyndingsmedium blev inkuberet i koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/μΙ, 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml i 60 minutter og 90 minutter ved 50 °C og blev undersøgt ved sammenligning med en ved rumtemperatur opbevaret fortyndingsserie i anti-32-glycoproteinimmunoassayet. I den forbindelse blev 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-B2-glycoprotein-assayet (ORG 521, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 80 ng/ml. På figur 5 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm for fortyndingsserierne ved inkubation i 60 og 90 minutter ved 50 °C vist i sammenligning med fortyndingsserien, der var opbevaret ved rumtemperatur. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH3-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 0,31 pg/ml til 20 pg/ml ved 50 °C temperaturstress i 60 minutter eller 90 minutter ikke indskrænket.
3.3.2.2 Stabilitet af CAD-lgG-CH3-modubody over for opbevaring ved 36 °C
Stabiliteten over for øget opbevaringstemperatur blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH3-modubody i koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/μΙ, 1,25 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ni, 20 pg/ml i kalibratorfortyndingsmedium blev inkuberet i 1,2, 4, 7,10 dage ved 36 °C og blev undersøgt ved sammenligning med en under 4 °C opbevaret fortyndingsserie i anti-B2-glycoproteinimmunoassayet. I den forbindelse blev B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-B2-glycoprotein-assayet (ORG 521, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 80 ng/ml. På figur 6 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm for fortyndingsserierne ved opbevaring i 1,2, 4, 7, 10 dage ved 36 °C vist i sammenligning med fortyndingsserien, der var opbevaret ved 4 °C. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH3-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 0,31 pg/ml til 20 pg/ml ved opbevaring ved 36 °C i en periode på ti dage ikke indskrænket. 3.3.2.3 Stabilitet af CAD-lgG-CH3-modubody over for indtørring
Stabiliteten over for indtørring blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH3-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml blev tørret i en speedvak under vakuum ved 22 °C. De tørrede prøver blev gensolubiliseret med et 450 μΙ kalibratorfortyndingsmedium og 50 μΙ vand til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/pl, 1,25 μ9/ΓηΙ, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml og undersøgt i sammenligning med en ubehandlet fortyndingsserie i et anti-32-glycoprotein-cardiolipinimmunoassay. I den forbindelse blev B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-B2-glycoprotein-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 80 ng/ml. På figur 7 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm for de indtørrede prøver vist i sammenligning med den ubehandlede fortyndingsserie. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH3-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af indtørring. 3.3.2.4 Stabilitet af CAD-lgG-CH3-modubody over for nedfrysningsoptøningscyklusser
Stabiliteten over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH3-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml i fem gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser blev nedfrosset ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C. Derefter blev prøverne fortyndet med 450 pi kalibratorfortyndingsmedium til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/pl, 1,25 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml og undersøgt ved sammenligning med en ubehandlet CAD-lgG-CH3-fortyndingsserie i anti-B2-cardiolipin-glycoprotein-immunoassayet. I den forbindelse blev 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-32-glycoprotein-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 80 ng/ml. På figur 8 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm vist for de gentagne gange nedfrosne og optøede prøver i sammenligning med den ubehandlede fortyndingsserie. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH3-modubody i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af gentagne nedfrysnings-optønings-cyklusser.
Eksempel 4: Den enkeltkædede CAD-lgG-CH2-modubody 4.1 Konstruktion og kloning af den enkeltkædede CAD-lgM-CH2-modubody
Det følgende eksempel beskriver konstruktion og kloning af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH2, der er forsynet med et monomert humant lgG-CH2-detektionsdomæne.
Til konstruktion af CAD-lgG-CH2-modubody blev modulerne scFv-CAD (eksempel 1) og lgG-CH2 (eksempel 2.2) sammensat ved restriktionsfordøjelse og ligation i domænerækkefølgen VL-linker-VH-linker-lgG-CH2 til en CAD-lgG-CH2 kodende sekvens (SEQ ID NO: 27). Hertil blev det under eksempel 2.2 beskrevne syntetiske lgG-CH2-reaktionsmodul Sc-RP-CH2-G-N i henhold til sekvens SEQ ID NO: 11 med primerne CH03 (SEQ ID NO: 28) og CH04 (SEQ ID NO: 25) ampliceret ved hjælp af PCR. 443 bp-amplifikatet blev gelisoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-Kit (Qiagen, Hilden). Det gelisolerede fragment blev først fordøjet med restriktionsenzymet Bell und Hindlll. Restriktionsfragmenterne blev ligeret med det under eksempel 1 beskrevne CAD-scFv-CAD-pQE80-vektorkonstrukt, der blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll, og transformeret til E. coli-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham). Transformationsopløsningen blev udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml), og inkuberet natten over (n.o.) ved 36 °C. Enkeltkolonier af den resulterende E. co//-stamme CAD-lgG-CH2-pQE80-NovaBlue blev formeret i LB-medium, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml) (LB-Carb.) (36 °C, natten over 180 (o/min). Fra enkeltklonkulturerne blev der oprettet frysestammekulturer, 1 ml fra enkeltklonkulturerne blev i hvert enkelt tilfælde anvendt til plasmidpræparation. De isolerede plasmider blev analyseret ved hjælp af EcoRI/Hindlll-fordøjelse. Kloner med et forventet 1321 bp-fragment blev undersøgt yderligere ved induktionsanalyse. Hertil blev de udvalgte enkeltkloner dyrket i LB-Carb og induceret ved en O.D.500 på 0,5 til 1,0 ved tilsætning af et kulturvolumen LB-Carb, der var supplementeret med 1 mM IPTG til ekspression af det rekombinante protein og kultiveret i 16 timer ved 36 °C, 180 o/min. Induktionscellerne blev lyseret i SDS-prøvebuffer, proteiner blev separeret ved hjælp af SDS-PAGE. I Western-Blot blev ekspressionen af et forventet 44 kDa-CAD-lgG-CH2-modubody påvist ved detektion med et Anti-RGS-6xHis-peroxidase-koblet antistof (Qiagen, Hilden). Den korrekte kloning blev bekræftet ved sekvensering. 4.2 Ekspression og rensning af den enkeltkædede CAD-lgG -CH2-modubody
Det følgende eksempel beskriver ekspression og rensning af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH2, der er forsynet med et monomert humant lgG-CH2-detektionsdomæne.
Den under 4.1 med ekspressionskonstruktet transformerede E. coli-stamme CAD-lgG-CH2-pQE80-NovaBlue blev dyrket i LB-Carb.-medium ved 36 °C indtil en O.D.500 på 0,5 til 1,0 og induceret ved tilsætning af IPTG til syntese af CAD-lgG-CH2-modubody. Den inducerede kultur blev kultiveret ved 36 °C i 4 timer natten over. Induktionscellerne blev høstet og lyseret efter lysozymbehandling i et 8 M urinstof-holdigt TBS -buffer. Eksprimerede CAD-lgG-CH2-modubodies blev renset ved hjælp af Ni-NTA-affinitetskromatografi. I det coomassieblåt farvede SDS-polyacrylamidgel er et 44 kDa-bånd synligt. Berigelsen af 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten og en reaktivitet med et peroxidase-koblet anti-human-lgG-sekundært antistof (Jackson Immunoresearch) ledsages af rensning af 44 kDa-båndet. 4.3 Karakteristika for den enkeltkædede CAD-lgG-CH2-modubody
Det følgende eksempel beskriver karakteriseringen af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH2, der er forsynet med et monomert humant lgG-CH2-detektionsdomæne med hensyn til specifik antigenidentifikation, specifik påviselighed via et anti-human-lgG sekundært antistof og stabilitet over for øgede temperaturer, indtørring og nedfrysnings-optøningscyklusser. 4.3.1 Kalibratorfunktion af CAD-lqG-CH2-modubody
For at bestemme, om CAD-lgG-CH2-modubody har bevaret B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten ved scFv-CAD, og bindingen til antigenet via et anti-human-lgG sekundært antistof kan påvises specifikt, blev rensede CAD-lgG-CH2-præparationer undersøgt i anti-cardiolipin/B2-glycoproteinimmunoassayet. Den rensede CAD-lgG-CH2-modubody blev påført i en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 pg/ml, 0,62 pg/μΙ, 1,25 pg/ml,2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml i kalibratorfortyndingsmedium på mikrotiterplader, der var belagt med B2-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof (Jackson Immunoresearch) i en koncentration på 200 ng/ml. På figur 9 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm vist afhængigt af koncentrationen. Under de valgte reaktionsbetingelser blev CAD-lgG-CH2-modubody påvist ved en koncentration på 20 pg/ml med et O.D. 450 nm på 1,7. 4.3.2 Stabilitet af CAD-lgG-CH2-modubody over for indtørring
Stabiliteten over for indtørring blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgG-CH2-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml blev tørret i en Speedvak-anordning under vakuum ved 22 °C. De tørrede prøver blev gensolubiliseret med et 450 μΙ kalibratorfortyndingsmedium og 50 μΙ vand til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 μg/ml, 0,31 μg/ml, 0,62 μg/μl, 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/mlog påført i sammenligning med en ubehandlet fortyndingsserie på mikrotiterplader, der var belagt med B2-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof i en koncentration på 200 ng/ml. På figur 10 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm for de indtørrede prøver vist i sammenligning med den ubehandlede fortyndingsserie. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH2-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af indtørring. 4.3.3 Stabilitet af CAD-lgG-CH2-modubody over for nedfrysningsoptøningscyklusser
Stabiliteten over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgG-CH2-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml i fem gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev nedfrosset ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C. Efterfølgende blev prøverne fortyndet med 450 μΙ kalibratorfortyndingsmedium til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 μg/ml, 0,31 μg/ml, 0,62 μg/μl, 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml og i sammenligning med en ubehandlet CAD-lgG-CH2-fortyndingsserie påført på mikrotiterplader, der var belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), og et anti-human-lgG-peroxidase-markeret sekundært antistof (Jackson Immunoresearch) i en koncentration på 200 ng/ml. På figur 11 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm vist for de gentagne gange nedfrosne og optøede prøver i sammenligning med den ubehandlede fortyndingsserie. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgG-CH2-modubody i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser.
Eksempel 5: Den enkeltkædede multifunktionelle CAD-lgM-lgA-lgG-modubody I den enkeltkædede multifunktionelle modubody CAD-lgM-lgA-lgG er der indeholdt fire funktionsmoduler i en lineær rækkefølge. En 32- glycoproteinidentifikationsdomæne og flere reaktionsmoduler, der afledes af CH3-domæner af den tunge kæde i det humane immunglobulin IgM, IgA og IgG er forbundet via peptidlinkere. Detektionen af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody kan således foretages via forskellige isotypespecifikke sekundære antistoffer. 5.1 Konstruktion og kloning af den enkeltkædede CAD-lgM-lgA-lgG-modubody
Det følgende eksempel beskriver konstruktion og kloning af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgM-lgA-lgG, der er forsynet med humane IgM-, IgG-og lgA-CH3-detektionsdomæner.
Til konstruktion af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody blev modulerne scFv-CAD (eksempel 1), lgM-CH3 (eksempel 2.7), lgA-CH3 (eksempel 2.5) og lgG-CH3 (eksempel 2.3) ved restriktionsfordøjelse og ligation i domænerækkefølgen VL-linker-VH-linker-lgM-CH3-linker-lgA-CH3-linker-lgG-CH3 sat sammen til en CAD-lgM-lgA-lgG kodende sekvens (SEQ ID NO: 29). Hertil blev reaktionsmodulerne lgM-CH3, lgA-CH3 og lgG-CH3 i en iterativ proces fra restriktioner af vektorkonstrukter og insertligationer indsat i det under eksempel 1 beskrevne CAD-scFv-pQE80-vektorkonstrukt. I det første konstruktionstrin blev det under eksempel 2.7 beskrevne syntetiske lgM-CH3-reaktionsmodul Sc-RP-CH3-M-N i henhold til sekvens SEQ ID NO: 21 amplificeret med primerne CH09 (SEQ ID NO: 30) og CH04 (SEQ ID NO: 25) ved hjælp af PCR. 455 bp-amplifikatet blev gelisoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-kittet (Qiagen, Hilden). Det gelisolerede fragment blev fordøjet med restriktionsenzymerne Bell og Hindi 11. Restriktionsfragmenterne blev ligeret med det under eksempel 1 beskrevne scFv-CAD-pQE80-vektorkonstrukt, der blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll, og transformeret til E. co//-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham) og udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml) og inkuberet natten over ved 36 °C. Fra en enkeltklon med korrekt insertligation blev der isoleret plasmid-DNA. I et andet konstruktionstrin blev det under eksempel 2.5 beskrevne syntetiske lgA-CH3-reaktionsmodul Sc-RP-CH3-A-N i henhold til SEQ ID NO: 17 amplificeret med primerne CH07 (SEQ ID NO: 31) og CH04 (SEQ ID NO: 25) ved hjælp af PCR. 452 bp-amplifikatet blev gelisoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-Kit (Qiagen, Hilden). Det isolerede fragment blev fordøjet med restriktionsenzymerne Bell og Hindlll. Restriktionsfragmenterne blev ligeret med vektorkonstruktet, som blev isoleret i det første konstruktionstrin, og som blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll, og transformeret til E. coli-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham) og udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml), og inkuberet natten over ved 36 °C. Fra en enkeltklon med korrekt insertligation blev der isoleret plasmid-DNA. I et tredje konstruktionstrin blev det under eksempel 2.3 beskrevne syntetiske lgG-CH3-reaktionsmodul Sc-RP-CH3-G-N i henhold til sekvens SEQ ID NO: 13 amplificeret med primerne CH05 (SEQ ID NO: 24) og CH04 (SEQ ID NO: 25) ved hjælp af PCR. 434 bp-amplifikatet blev gelisoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-Kit (Qiagen, Hilden). Det isolerede fragment blev fordøjet med restriktionsenzymerne Bell og Hindlll. Restriktionsfragmenterne blev ligeret med vektorkonstruktet, som blev isoleret i det andet konstruktionstrin, og som blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll, og transformeret til E. co//-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham). Transformationsopløsningen blev udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml), og inkuberet natten over ved 36 °C. Enkeltkolonier af den resulterende E. co//-stamme CAD-lgM-lgA-lgG-pQE80-NovaBlue blev formeret i LB-medium, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml) (LB-Carb.) (36 °C, natten over 180 o/min). Fra enkeltklonkulturerne blev der oprettet frysestammekulturer, 1 ml fra enkeltklonkulturerne blev i hvert enkelt tilfælde anvendt til plasmidpræparation. De isolerede plasmider blev analyseret ved hjælp af EcoRI/Hindlll-fordøjelse. Kloner med et forventet 2173 bp-fragment blev undersøgt yderligere ved induktionsanalyse. Hertil blev de udvalgte enkeltkloner dyrket i LB-Carb og induceret ved en O.D.500 på 0,5 til 1,0 ved tilsætning af et kulturvolumen LB-Carb, der var supplementeret med 1 mM IPTG, til ekspression af proteinet, der var kodet ved hjælp af det klonede DNA-konstrukt, og kultiveret i 16 timer ved 36 °C, 180 o/min. Induktionscellerne blev lyseret i SDS-prøvebuffer, proteiner blev separeret ved hjælp af SDS-PAGE. I Western-Blot blev ekspressionen af det forventede 72 kDa CAD-lgM-lgA-lgG-modubody påvist ved detektion med et Anti-RGS-6xHis-peroxidase-koblet antistof (Qiagen, Hilden). Den korrekte kloning blev bekræftet ved sekvensering. 5.2 Ekspression og rensning af den enkeltkædede CAD-lgM-lgA-lgG-modubody
Det følgende eksempel beskriver ekspression og rensning af den 32-glycoprotein-specifkke modubody CAD-lgM-lgA-lgG, der er forsynet med humant lgM-CH3, lgA-CH3 og lgG-CH3-detektionsdomæner.
Den under 5.1 med ekspressionskonstruktet transformerede E. coli-stamme CAD-lgM-lgA-lgG-pQE80-NovaBlue blev dyrket i LB-Carb medium ved 36 °C indtil et O.D.500 på 0,5 til 1.0 og induceret ved tilsætning af IPTG til syntese af CAD-lgM-IgA-lgG-modubody. Den inducerede kultur blev kultiveret ved 36 °C i 4 timer natten over. Induktionscellerne blev høstet og lyseret efter lysozymbehandling i et 8 M urinstof-holdigt TBS-buffer. Eksprimerede CAD-lgM-lgA-lgG-modubodies blev renset ved hjælp af affinitetskromatografi. I det coomassieblåt farvede SDS-polyacrylamidgel er et 72 kDa-bånd synligt. Berigelsen af 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten og en reaktivitet med peroxidase-koblet anti-human-lgM, -IgA-og —IgG sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch) ledsages af rensningen af 72 kDa-båndet. 5.3 Karakteristika af den enkeltkædede CAD-lgM-lgA-lgG-modubody
Det følgende eksempel beskriver karakteriseringen af den 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgM-lgA-lgG, der er forsynet med humane lgM-CH3-, lgA-CH3- og lgG-CH3-detektionsdomæner med hensyn til specifik antigenidentifikation, specifik påviselighed via anti-human-lgM-, -IgA- og -IgG sekundære antistoffer og stabilitet over for nedfrysnings-optøningscyklusser. 5.3.1 Kalibratorfunktion af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody
For at bestemme, om CAD-lgM-lgA-lgG-modubody har bevaret 32-glycoprotein-bindingsaktiviteten ved scFv-CAD, og bindingen til antigenet via forskellige isotypespecifikke anti-human sekundære antistoffer kan påvises, blev rensede CAD-lgM-lgA-lgG-præparationer undersøgt i anti-32-glycoprotein/cardiolipin-immunoassayet. Den rensede CAD-lgM-lgA-lgG-modubody blev påført i en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 pg/ml, 0,31 pg/ml, 0,62 pg/pl, 1,25 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml i kaibratorfortyndingsmedium på mikrotiterplader belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Antigen bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), i separate bestemmelser med anti-human-lgM-, anti-human-lgA- og anti-human-lgG-peroxidase-markerede sekundære antistoffer i koncentrationer på 80 ng/ml. På figur 12 er forløbet af OD 450 nm-bestemmelserne vist med de valgte detektionsantistoffer afhængigt af koncentrationen af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody. Under de valgte reaktionsbetingelser blev CAD-lgM-lgA-lgG-modubody påvist ved en koncentration på 5 pg/ml ved detektion med anti-human-lgM, anti-human-lgA og anti-human-lgG sekundære antistoffer med O.D. 450 nm-værdier på 2,8, 1,8 og 2,7. 5.3.2 Stabilitet af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody over for indtørring
Stabilitet over for indtørring blev undersøgt, ved at fortyndinger af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml blev tørret i en Speedvak-anordning under vakuum ved 22 °C. De tørrede prøver blev gensolubiseret med 450 μΙ kalibratorfortyndingsmedium og 50 μΙ vand til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 μg/ml, 0,31 μg/ml, 0,62 μg/μl, 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml og ved sammenligning med en ubehandlet fortyndingsserie påført på mikrotiterplader belagt med 32-glycoprotein 1 kompleks med cardiolipin. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), i separate bestemmelser med anti-human-lgM-, anti-human-lgA- og anti-human-lgG-peroxidase-markerede sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch) i koncentrationer på 80 ng/ml. På figur 13 er forløbet af OD 450 nm-bestemmelserne vist med de valgte detektionsantistoffer ved ubehandlede prøvefortyndingstrin i en sammenligning med indtørrede prøvefortyndingstrin. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af indtørring. 5.3.2.3 Stabilitet af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody over for nedfrysningsoptøningscyklusser
Stabiliteten over for gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser blev undersøgt, idet fortyndinger af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody i kalibratorfortyndingsmedium i 50 μΙ portioner i koncentrationerne 0 pg/ml, 3,1 pg/ml, 6,21 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml in i fem gentagne nedfrysningsoptøningscyklusser blev nedfrosset ved -70 °C og optøet igen ved 37 °C. Efterfølgende blev prøverne med 450 μΙ kalibratorfortyndingsmedium fortyndet til en fortyndingsserie med koncentrationerne 0 μg/ml, 0,31 μg/ml, 0,62 μg/μl, 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml og ved sammenligning med en ubehandlet CAD-lgM-lgA-lgG-fortyndingsserie påført på mikrotiterplader belagt med 32-glycoprotein i kompleks med cardiolipin. Antigen-bindingsaktiviteten blev bestemt under inkubationsbetingelserne, der er beregnet til anti-cardiolipin-assayet (ORG 515, ORGENTEC GmbH, Mainz), i separate bestemmelser med anti-human-lgM-, anti-human-lgA- og anti-human-lgG-peroxidase-markerede sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch) i koncentrationerne på 80 ng/ml. På figur 14 er forløbet af OD 450 nm-bestemmelserne vist med de valgte detektionsantistoffer ved ubehandlede prøvefortyndingstrin i en sammenligning med de gentagne gange nedfrosne og optøede prøver. Under de valgte reaktionsbetingelser blev funktionen af CAD-lgM-lgA-lgG-modubody i fortyndinger i koncentrationsområdet på 3,1 pg/ml til 200 pg/ml ikke indskrænket som følge af gentagne nedfrysnings-optøningscyklusser.
Eksempel 6: Den enkeltkædede CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody 6.1 Konstruktion og kloning af den enkeltkædede CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody
Det følgende eksempel beskriver konstruktion og kloning af den enkeltkædede 32-glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH3-Knob02, der er forsynet med et monomert modificeret humant lgG-CH3-Knob02-detektionsdomæne.
Til konstruktion af CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody blev modulerne scFv-CAD (eksempel 1) og lgG-CH3-Knob02 (eksempel 2.9) ved restriktionsfordøjelse og ligation i domænerækkefølgen VL-linker-VH-linker-lgG-CH3-Knob02 sat sammen til en CAD-lgG-CH3-Knob02 kodende sekvens (SEQ ID NO: 34). Hertil blev det under eksempel 2.9 beskrevne syntetiske lgG-CH3-Knob02-reaktionsmodul Sc-RP-CH3-Knob02-G-N i henhold til sekvens SEQ ID NO: 33 frigjort fra vektorkonstruktet lgG-CH3-Knob02-pMA ved fordøjelse med restriktionsenzymerne BamHI og Hindil. 417 bp restriktionsfragmentet blev gelisoleret efter agarosegelelektroforese med QiaExll-kit (Qiagen, Hilden) og ligeret med det under eksempel 1 beskrevne CAD-scFv-pQE80-vektorkonstrukt, der blev fordøjet med de kompatible enzymer BamHI og Hindlll. Ligationsprodukterne blev transformeret til E. co//-stamme NovaBlue (Merck, Nottingham). Transformationsopløsningen blev udpladet på LB-agarplader, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml), og inkuberet natten over ved 36 °C. Enkeltkolonier af den resulterende E. co//-stamme CAD-lgG-CH3-Knob02-pQE80-NovaBlue blev formeret i LB-medium, der var supplementeret med carbenicillin (50 pg/ml) (LB-Carb.), (36 °C, natten over, 180 o/min). Fra enkeltklonkulturerne blev der oprettet frysestammekulturer, 1 ml fra enkeltklonkulturerne blev i hvert enkelt tilfælde anvendt til plasmidpræparation. De isolerede plasmider blev analyseret ved hjælp af EcoRI/Hindlll-fordøjelse. Kloner med et forventet 1308 bp-fragment blev undersøgt yderligere ved induktionsanalyse. Hertil blev de udvalgte enkeltkloner dyrket i LB-Carb og induceret ved et O.D.500 på 0,5 til 1,0 ved tilsætning af et kulturvolumen LB-Carb., der var supplementeret med 1 mM IPTG, til ekspression af proteinet, der var kodet ved hjælp af det klonede DNA-fragment, og kultiveret i 16 timer ved 36 °C, 180 o/min. Induktionscellerne blev lyseret i SDS-prøvebuffer, proteiner blev separeret ved hjælp af SDS-PAGE. I Western-Blot blev ekspressionen af den forventede 44 kDa-CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody påvist ved detektion med med et Anti-RGS-6xHis-peroxidase-koblet antistof (Qiagen, Hilden). Den korrekte kloning blev bekræftet ved sekvensering. 6.2 Ekspression og rensning af den enkeltkædede CAD-lgG-CH3-Knob02-Modubodies
Det følgende eksempel beskriver ekspression og rensning af den B2-Glycoprotein-specifikke modubody CAD-lgG-CH3-Knob02, der er forsynet med et modificeret humant lgG-CH3-Knob02 detektionsdomæne.
Den under 6.1 med ekspressionskonstruktet transformerede E. coli-stamme CAD-lgG-CH3-Knob02-pQE80-NovaBlue blev dyrket i LB-Carb medium ved 36 °C indtil et O.D.500 på 0,5 til 1.0 og induceret ved tilsætning af IPTG til syntese af CAD-CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody. Den inducerede kultur blev kultiveret ved 36 °C i 4 timer natten over. Induktionscellerne blev høstet og lyseret efter lysozymbehandling i et 8 M urinstof-holdigt TBS-buffer. Eksprimerede CAD-lgG-CH3-Knob02-modubodies blev renset ved hjælp af Ni-NTA-affinitetskromatografi. I det coomassieblåt farvede SDS-polyacrylamidgel er et 44 kDa-bånd synligt. Berigelsen af B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten og en reaktivitet med et peroxidase-koblet anti-human-lgG sekundært antistof (Jackson Immunoresearch) ledsages af rensningen af 44 kDa-båndet. 6.3 Binding af CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody til B2-glycoprotein
For at bestemme, om CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody bevarede B2-glycoprotein-bindingsaktiviteten ved scFv-CAD, blev rensede CAD-lgG-CH3-Knob02-præparationer testet med immunoassays. Hertil blev fortyndingsserier for CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody påført på mikrotiterplader til det med B2-glycoprotein belagte anti-B2-glycoprotein-assay (ORG 521, ORGENTEC Diagnostika GmbH, Mainz) og til kontrol af bindingsspecifiteten på BSA-belagte plader og inkuberet i 30 min ved 20-25 °C. Mikrotiterpladerne blev vasket, og bindingen ved CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody blev bestemt med et peroxidase-markeret RGS-6X-His-antistof (Qiagen, Hilden) og en tetramethylbenzidin (TMB)-farvereaktion ved måling af O.D. 450 nm. På figur 15 er forløbet af det under de valgte reaktionsbetingelser bestemte OD 450 nm vist afhængigt af koncentrationen. Allerede ved en koncentration af CAD-lgG-CH3-Knob02-modubody på 19 ng/ml blev der påvist en specifik binding til B2-glycoprotein. Sammenligningen af reaktionsniveauet i CAD-lgG-CH3-Knob02-fortyndingstrinnene ved bindingen til B2-Glycoprotein- henholdsvis BSA-belagte mikrotiterplader viser, at der i koncentrationsområdet på 0,019-10 pg/ml CAD-lgG-CH3-Knob02 ikke forekommer en uspecifik binding.
SEQUENCE LISTING <110> ORGENTEC Diagnostika GmbH <120> Monospezifische Polypeptidreagenzien <130> 46816P WO <160> 34 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 112
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> WBCAL-1 VL <400> 1
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> WBCAL-1 VH <400>2
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Thr Leu Asp Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide linker <400>3
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly 35 <210> 4 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> scFv-RP-CAD-P <220> <221 > DOMAIN <222> (1)..(118) <223> VL domain <220> <221 > DOMAIN <222> (159)..(272) <223> VH domain <400>4
Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser 15 10 15
Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 20 25 30
Gin Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu 35 40 45
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 80
Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 100 105 110
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Glu Val 145 150 155 160
Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val 165 170 175
Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met 180 185 190
His Trp Val Arg Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Glu 195 200 205 lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly 210 215 220
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin 225 230 235 240
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 245 250 255
Gly Thr Leu Asp Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val 260 265 270
Thr Val Ser Ser 275 <210> 5 <211 >862 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> scFv-RP-CAD-N <400>5 ggtaccggat ccctggttcc gcgtggttct gatgttctga tgacccagac accgctgtct 60 ctgccggtta gcctgggtga tcaggcaagc attagctgtc gtagcagcca gagcattgtt 120 catagcaatg gcaataccta tctggaatgg tatctgcaga aaccgggtca gagcccgaaa 180 ctgctgattt ataaagtgag caatcgcttt agcggtgttc cggatcgttt tagcggttca 240 ggttctggca ccgattttac cctgaaaatt agccgtgttg aagcagaaga tctgggcgtt 300 tattattgtt ttcagggtag ccatgttccg tatacctttg gtggtggcac caaactggaa 360 attaaacgta ccggtagcgg tagtggaggt ggtggaagcg gtggtggcgg ttctggcggt 420 ggaggttctt ctggtggcgg tggatcaggt ggaggtggct caggcggtgg cggtagcggc 480 agcggtgaag ttcagctgca gcagagcggt ccggaactgg ttaaaccggg tgcaagcgtt 540 aaaattagct gtaaagccag cggctatacc tttaccgatt attatatgca ttgggttcgt 600 cagcgtccgg gtcagggtct ggaatggatt ggtgaaattt atccgggtag cggtaatacc 660 agctataatg aaaaatttcg tggcaaagca accctgaccg cagataaaag cagcagcacc 720 gcatatatgc agctgtctag cctgaccagc gaagatagcg cagtttactt ttgtgcacgt 780 ggcaccctgg attataccat ggattattgg ggacagggca ccagcgttac cgttagcagc 840 ggatcctaat aagcttgagc tc 862 <210> 6 <211 >27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer RP-CAD01 <400>6 agtagatctc tggttccgcg tggttct 27 <210> 7 <211> 18
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer RP-CAD02 <400>7 ctcaagctta ttaggatc 18 <210> 8 <211 > 131
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CHI-G-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(131) <223> lgG-CH1 domain <400>8
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 35 40 45
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 50 55 gø
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 65 70 75 80
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 85 90 95
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 100 105 110
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 115 120 125
Lys Val Glu 130 <210> 9 <211 >427 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CHI-G-N <400>9 gageteggat ccggcagtgg tggaggtggc teaggeggag gtggaagcgg tggaggeggt 60 tetteaggtg gcggtggaag tggcggtgga ggtagtggtg gcggaggctc tggateaggt 120 ggtccgagcg ttttteeget ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg cacagcagca 180 ctgggctgtc tggtgaaaga ttatttteeg gaaccggtta ccgttagctg gaatagcggt 240 gcactgacca gcggtgttca tacctttccg geagttetge agageagegg tetgtatage 300 etgageageg ttgttaccgt tccgtctagc agcctgggca cccagaccta tatttgcaat 360 gtgaatcata aaccgagcaa tacgaaagtg gataaaaaag tggaaggatc etgataaget 420 tggtacc 427 <210> 10 <211 > 138 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH2-G-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(138) <223> lgG-CH2 domain <400> 10
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125
Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 <210> 11 <211 >448
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH2-G-N <400> 11 gageteggat ccggttctgg tgggggaggg tetggeggag gtggctctgg eggaggeggt 60 tcaagcggtg geggaggtag tggcggtggt ggtagtggag gcggaggctc tggtteaggt 120 ggtccggatg tttttctgtt tccgcctaaa ccgaaagata ccctgatgat tagccgtaca 180 ccggaagtta cctgtgttgt tgttgatgtg agccatgaag ateeggaagt gaaatttaat 240 tggtatgtgg atggtgtgga agtteataat gccaaaacca aaccgcgtga agaaeagtat 300 aatagcacct atcgtgttgt ttctgttctg accgttctgc ateaggattg gctgaatggc 360 aaagaatata aatgcaaagt gtctaataaa gcactgccgc tgeeggaaga aaaaaccatt 420 agcaaaggat cctaataagc ttggtacc 448 <210> 12 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH3-G-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(135) <223> lgG-CH3 domain <400> 12
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Giv 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Ara Glu 35 40 45
Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 50 55 60
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 85 90 95
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 100 105 110
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 115 120 125
Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 130 135 <210> 13 <211 >439
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH3-G-N <400> 13 gagctcggat ccggtagcgg tggtggtggt tctggcggtg gtggcagcgg aggtggcggt 60 agctcaggtg gcggaggtag tggcggtgga ggcagtggtg gcggtggctc tggatctggt 120 gaaccgcagg tttataccct gcctccgagc cgtgaagaaa tgaccaaaaa tcaggttagc 180 ctgacctgtc tggtgaaagg tttttatccg agcgatattg cagttgaatg ggaaagcaat 240 ggtcagccgg aaaataatta taaaaccaca cctccggttc tggattctga tggtagcttt 300 tttctgtata gcaaactgac cgttgataaa agccgttggc agcagggtaa tgtttttagc 360 tgtagcgtta tgcatgaagc cctgcataat cattataccc agaaaagcct gagcctggga 420 tcctaataag cttggtacc 439 <210> 14 <211 > 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH2-A-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(133) <223> lgA-CH2 domain <400> 14
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 35 40 45
Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 50 55 60
Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 65 70 75 80
Ala Val Gin Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Ser Tyr Ser Val 85 90 95
Ser Ser Val Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr 100 105 110
Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala 115 120 125
Thr Leu Ser Lys Ser 130 <210> 15 <211 >433
<212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Sc-RP-CH2-A-N <400> 15 gagctcggat ccggaagtgg cggaggcgga tcaggtggag gtggcagcgg aggtggcggt 60 agctctggtg gcggtggtag tggcggtgga ggtagtggtg gcggaggctc tggttctggt 120 cgtctgagcc tgcatcgtcc ggcactggaa gatctgctgc tgggtagcga agcaaatctg 180 acctgtaccc tgaccggtct gcgtgatgca agcggtgtta catttacctg gaccccgagc 240 agcggtaaaa gcgcagttca gggtccgcct gaacgtgatc tgtgtggtag ctatagcgtt 300 agcagcgttc tgcctggtag cgcagaaccg tggaatcatg gtaaaacctt tacctgtacc 360 gcagcatatc cggaaagcaa aacaccgctg accgcaaccc tgagcaaaag cggatcctaa 420 taagcttggt acc 433 <210> 16 <211 > 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH3-A-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(141) <223> lgA-CH3 domain <400> 16
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 io i5
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 35 40 45
Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Giv 50 55 gO
Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gin Gly Ser Gin Glu 65 70 75 80
Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gin Glu Pro Ser 85 90 95
Gin Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala 100 105 110
Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu 115 120 125
Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gin Lys Thr Ile Asp Arg 130 135 140 <210> 17 <211 >457
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH3-A-N <400> 17 gagctcggat ccggtagcgg aggtggcgga agcggaggtg gaggcagtgg tggaggcggt 60 agctcaggtg gcggtggaag tggtggaggt ggctcagggg gtggaggttc tggttctggt 120 cgtccggaag ttcatctgct gcctccgcct agcgaagaac tggcactgaa tgaactggtt 180 accctgacct gtctggcacg tggttttagc ccgaaagatg ttctggttcg ttggctgcag 240 ggtagccagg aactgcctcg cgaaaaatat ctgacctggg catctcgcca ggaaccgagc 300 cagggcacca ccacctttgc agttaccagc attctgcgtg ttgcagcaga agattggaaa 360 aaaggcgata cctttagctg tatggttggt catgaagcac tgccgctggc atttacccag 420 aaaaccatcg atcgcggatc ctaataagct tggtacc 457 <210> 18 <211 > 148
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH2-M-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(148) <223> lgM-CH2 domain <400> 18
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 5 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val 35 40 45
Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile 50 55 60
Cys Gin Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gin Ile Gin Val Ser Trp Leu 65 70 75 80
Arg Glu Gly Lys Gin Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gin Val Gin 85 90 95
Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr 100 105 110
Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gin Ser Met Phe Thr Cys 115 120 125
Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gin Gin Ser Ala Ser Ser Met 130 135 140
Ser Val Pro Asp 145 <210> 19 <211 >478 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH2-M-N <400> 19 gageteggat ccggttcagg tggtggtggt tctggtggtg gaggeagtgg aggtggeggt 60 tetageggtg gcggtggaag tggeggaggt ggcagtggtg gcggtggctc tggttctggt 120 attgeagaae tgcctccgaa agttagegtt tttgttcctc egegtgatgg tttttttggt 180 aatccgcgta aaagcaaact gatttgtcag gcaaccggtt tttctccgcg teagatteag 240 gttagctggc tgcgtgaagg taaacaggtt ggtagcggtg ttaccaccga teaggtteag 300 geagaageaa aagaaagegg tccgaccacc tataaagtta ccagcaccct gaccattaaa 360 gaaagcgatt ggctgggtca gagcatgttt acctgtcgtg ttgatcatcg tggtetgacc 420 ttteageaga gcgcaagcag catgagcgtt ccggatggat cctaataagc ttggtacc 478 <210> 20 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH3-M-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(142) <223> lgM-CH3 domain <400> 20
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Gin Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro 35 40 45
Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu 50 55 60
Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg 65 70 75 80
Gin Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Ser Ile Ser Glu Ser His 85 90 95
Pro Ser Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Ser Glu Asp 100 105 110
Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp 115 120 125
Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gin Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly 130 135 140 <210> 21 <211 >460
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH3-M-N <400> 21 gagctcggat ccggaagtgg tggaggtggc agcggtggtg gtggctctgg tggaggcggt 60 agctcaggtg gcggtggtag tggcggtgga ggtagtggtg gcggaggttc tggatctggt 120 caggataccg caattcgtgt ttttgcaatt cctccgagct ttgcaagcat ttttctgacc 180 aaaagcacca aactgacctg tctggttacc gatctgacca cctatgatag cgttaccatt 240 agctggaccc gtcagaatgg tgaagcagtt aaaacccata ccagcattag cgaaagccat 300 ccgagcgcaa cctttagcgc agttggtgaa gcaagcattt ctgaagatga ttggaatagc 360 ggtgaacgtt ttacctgtac cgttacccat accgatctgc cgtcaccgct gaaacagacc 420 attagccgtc cgaaaggtgg atcctaataa gcttggtacc 460 <210> 22 <211 > 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH4-M-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(165) <223> lgM-CH4 domain <400> 22
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro 35 40 45
Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys 50 55 60
Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gin Trp Met Gin 65 70 75 80
Arg Gly Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met 85 90 95
Pro Glu Pro Gin Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr 100 105 110
Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala 115 120 125
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser 130 135 140
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Ser Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr 145 150 155 160
Ala Gly Thr Ser Tyr 165 <210> 23 <211> 529 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC-RP-CH4-M-N <400> 23 gagctcggat ccggatctgg tggaggcgga tctggcggtg gaggcagcgg aggtggcgga 60 agctcaggtg gcggtggaag tggcggtggt ggtagtggtg gcggtggctc tggttctggt 120 gttgcactgc atcgtccgga tgtttatctg ctgcctccgg cacgtgaaca gctgaatctg 180 cgtgaaagcg caaccattac ctgtctggtt accggttttt ctccggcaga tgtttttgtt 240 cagtggatgc agcgtggtca gccgctgtct ccggaaaaat atgttaccag cgcaccgatg 300 ccggaaccgc aggcaccggg tcgttatttt gcacatagca ttctgaccgt tagcgaagaa 360 gaatggaata caggcgaaac ctatacctgt gttgcacatg aagcactgcc gaatcgtgtt 420 accgaacgta ccgttgataa aagcaccggt aaaccgaccc tgtatagcgt tagcctggtt 480 atgagcgata cagcaggcac aagctatgga tcctaataag cttggtacc 529 <210> 24 <211 >29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CH05 <400> 24 agttgatcag gtagcggtgg tggtggttc 29 <210> 25 <211 > 19
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CH04 <400> 25 taccaagctt attaggatc 19 <210> 26 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAD-lgG-CH3 <400> 26 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctctgg ttccgcgtgg ttctgatgtt 60 ctgatgaccc agacaccgct gtctctgccg gttagcctgg gtgatcaggc aagcattagc 120 tgtcgtagca gccagagcat tgttcatagc aatggcaata cctatctgga atggtatctg 180 cagaaaccgg gtcagagccc gaaactgctg atttataaag tgagcaatcg ctttagcggt 240 gttccggatc gttttagcgg ttcaggttct ggcaccgatt ttaccctgaa aattagccgt 300 gttgaagcag aagatctggg cgtttattat tgttttcagg gtagccatgt tccgtatacc 360 tttggtggtg gcaccaaact ggaaattaaa cgtaccggta gcggtagtgg aggtggtgga 420 agcggtggtg gcggttctgg cggtggaggt tcttctggtg gcggtggatc aggtggaggt 480 ggctcaggcg gtggcggtag cggcagcggt gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa 540 ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatt agctgtaaag ccagcggcta tacctttacc 600 gattattata tgcattgggt tcgtcagcgt ccgggtcagg gtctggaatg gattggtgaa 660 atttatccgg gtagcggtaa taccagctat aatgaaaaat ttcgtggcaa agcaaccctg 720 accgcagata aaagcagcag caccgcatat atgcagctgt ctagcctgac cagcgaagat 780 agcgcagttt acttttgtgc acgtggcacc ctggattata ccatggatta ttggggacag 840 ggcaccagcg ttaccgttag cagcggatca ggtagcggtg gtggtggttc tggcggtggt 900 ggcagcggag gtggcggtag ctcaggtggc ggaggtagtg gcggtggagg cagtggtggc 960 ggtggctctg gatctggtga accgcaggtt tataccctgc ctccgagccg tgaagaaatg 1020 accaaaaatc aggttagcct gacctgtctg gtgaaaggtt tttatccgag cgatattgca 1080 gttgaatggg aaagcaatgg tcagccggaa aataattata aaaccacacc tccggttctg 1140 gattctgatg gtagcttttt tctgtatagc aaactgaccg ttgataaaag ccgttggcag 1200 cagggtaatg tttttagctg tagcgttatg catgaagccc tgcataatca ttatacccag 1260 aaaagcctga gcctgggatc ctaa 1284 <210> 27 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAD-lgG-CH2 <400> 27 atgagaggat cgcatcaeca tcaccatcac ggatctctgg ttccgcgtgg ttctgatgtt 60 ctgatgaccc agacaccgct gtctctgccg gttagcctgg gtgatcaggc aageattage 120 tgtegtagea gccagagcat tgttcatagc aatggcaata cctatctgga atggtatctg 180 cagaaaccgg gtcagagccc gaaactgctg atttataaag tgagcaatcg ctttagcggt 240 gttccggatc gttttagcgg ttcaggttct ggcaccgatt ttaccctgaa aattagccgt 300 gttgaagcag aagatctggg cgtttattat tgttttcagg gtagccatgt tccgtatacc 360 tttggtggtg gcaccaaact ggaaattaaa cgtaccggta gcggtagtgg aggtggtgga 420 agcggtggtg gcggttctgg cggtggaggt tcttctggtg gcggtggatc aggtggaggt 480 ggctcaggcg gtggcggtag eggeageggt gaagttcagc tgeageagag cggtccggaa 540 ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatt agctgtaaag ccagcggcta tacctttacc 600 gattattata tgcattgggt tegteagegt ccgggtcagg gtctggaatg gattggtgaa 660 atttatccgg gtagcggtaa taccagctat aatgaaaaat ttcgtggcaa agcaaccctg 720 accgcagata aaagcagcag caccgcatat atgcagctgt ctagcctgac cagcgaagat 780 agcgcagttt acttttgtgc acgtggcacc ctggattata ccatggatta ttggggacag 840 ggcaccagcg ttaccgttag cagcggatca ggttctggtg ggggagggtc tggcggaggt 900 ggctctggcg gaggcggttc aagcggtggc ggaggtagtg gcggtggtgg tagtggaggc 960 ggaggctctg gttcaggtgg tccggatgtt tttctgtttc cgcctaaacc gaaagatacc 1020 ctgatgatta gccgtacacc ggaagttacc tgtgttgttg ttgatgtgag ccatgaagat 1080 ccggaagtga aatttaattg gtatgtggat ggtgtggaag ttcataatgc caaaaccaaa 1140 ccgcgtgaag aacagtataa tagcacctat cgtgttgttt ctgttctgac cgttctgcat 1200 caggattggc tgaatggcaa agaatataaa tgcaaagtgt etaataaage actgccgctg 1260 ccggaagaaa aaaccattag caaaggatcc taa 1293 <210> 28 <211 >30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CH03 <400> 28 agttgatcag gttctggtgg gggagggtct 30 <210> 29 <211 >2145 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAD-lgM-lgA-lgG <400> 29 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctctgg ttccgcgtgg ttctgatgtt 60 ctgatgaccc agacaccgct gtctctgccg gttagcctgg gtgatcaggc aagcattagc 120 tgtcgtagca gccagagcat tgttcatagc aatggcaata cctatctgga atggtatctg 180 cagaaaccgg gtcagagccc gaaactgctg atttataaag tgagcaatcg ctttagcggt 240 gttccggatc gttttagcgg ttcaggttct ggcaccgatt ttaccctgaa aattagccgt 300 gttgaagcag aagatctggg cgtttattat tgttttcagg gtagccatgt tccgtatacc 360 tttggtggtg gcaccaaact ggaaattaaa cgtaccggta gcggtagtgg aggtggtgga 420 agcggtggtg gcggttctgg cggtggaggt tcttctggtg gcggtggatc aggtggaggt 480 ggctcaggcg gtggcggtag cggcagcggt gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa 540 ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatt agctgtaaag ccagcggcta tacctttacc 600 gattattata tgcattgggt tcgtcagcgt ccgggtcagg gtctggaatg gattggtgaa 660 atttatccgg gtagcggtaa taccagctat aatgaaaaat ttcgtggcaa agcaaccctg 720 accgcagata aaagcagcag caccgcatat atgcagctgt ctagcctgac cagcgaagat 780 agcgcagttt acttttgtgc acgtggcacc ctggattata ccatggatta ttggggacag 840 ggcaccagcg ttaccgttag cagcggatca ggaagtggtg gaggtggcag cggtggtggt 900 ggctctggtg gaggcggtag ctcaggtggc ggtggtagtg gcggtggagg tagtggtggc 960 ggaggttctg gatctggtca ggataccgca attcgtgttt ttgcaattcc tccgagcttt 1020 gcaagcattt ttctgaccaa aagcaccaaa ctgacctgtc tggttaccga tctgaccacc 1080 tatgatagcg ttaccattag ctggacccgt cagaatggtg aagcagttaa aacccatacc 1140 agcattagcg aaagccatcc gagcgcaacc tttagcgcag ttggtgaagc aagcatttct 1200 gaagatgatt ggaatagcgg tgaacgtttt acctgtaccg ttacccatac cgatctgccg 1260 tcaccgctga aacagaccat tagccgtccg aaaggtggat caggtagcgg aggtggcgga 1320 agcggaggtg gaggcagtgg tggaggcggt agctcaggtg gcggtggaag tggtggaggt 1380 ggctcagggg gtggaggttc tggttctggt cgtccggaag ttcatctgct gcctccgcct 1440 agcgaagaac tggcactgaa tgaactggtt accctgacct gtctggcacg tggttttagc 1500 ccgaaagatg ttctggttcg ttggctgcag ggtagccagg aactgcctcg cgaaaaatat 1560 ctgacctggg catctcgcca ggaaccgagc cagggcacca ccacctttgc agttaccagc 1620 attctgcgtg ttgcagcaga agattggaaa aaaggcgata cctttagctg tatggttggt 1680 catgaagcac tgccgctggc atttacccag aaaaccatcg atcgcggatc aggtagcggt 1740 ggtggtggtt ctggcggtgg tggcagcgga ggtggcggta gctcaggtgg cggaggtagt 1800 ggcggtggag gcagtggtgg cggtggctct ggatctggtg aaccgcaggt ttataccctg 1860 cctccgagcc gtgaagaaat gaccaaaaat caggttagcc tgacctgtct ggtgaaaggt 1920 ttttatccga gcgatattgc agttgaatgg gaaagcaatg gtcagccgga aaataattat 1980 aaaaccacac ctccggttct ggattctgat ggtagctttt ttctgtatag caaactgacc 2040 gttgataaaa gccgttggca gcagggtaat gtttttagct gtagcgttat gcatgaagcc 2100 ctgcataatc attataccca gaaaagcctg agcctgggat cctaa 2145 <210> 30 <211 >28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CH09 <400> 30 agttgatcag gaagtggtgg aggtggca 28 <210> 31 <211> 28
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CH07 <400> 31 agttgatcag gtagcggagg tggcggaa 28 <210> 32 <211 > 135 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH3-Knob02-P <220> <221 > DOMAIN <222> (37)..(135) <223> lgG-CH3-Knob02 domain <400> 32
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Giv 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 35 40 45
Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe 50 55 60
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 85 90 95
Tyr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 100 105 110
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 115 120 125
Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 130 135
<210> 33 <211 >423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sc-RP-CH3-Knob02-N <400> 33 ggatccggta gcggtggtgg tggtagtggt ggcggtggtt caggtggtgg tggcagcagt 60 ggtggtggcg gttctggcgg tggcggttca ggtggcggag gtagcggtag cggtgaaccg 120 caggtttata ccctgcctcc gagccgtgaa gaaatgacca aaaatcaggt tagcctgtat 180 tgcctggtga aaggttttta tccgagcgat attgcagttg aatgggaaag caatggtcag 240 ccggaaaata actataaaac ctatccgcct gtgctggata gtgatggtag cttttatctg 300 tatagcaaac tgaccgtgga taaaagccgt tggcagcagg gtaatgtttt tagctgtagc 360 gttatgcatg aagccctgca taatcactac acccagaaaa gcctgagcct gtaataaaag 420 ctt 423 <210> 34 <211 > 1281 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAD-lgG-CH3-Knob02 <400> 34 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctctgg ttccgcgtgg ttctgatgtt 60 ctgatgaccc agacaccgct gtctctgccg gttagcctgg gtgatcaggc aagcattagc 120 tgtcgtagca gccagagcat tgttcatagc aatggcaata cctatctgga atggtatctg 180 cagaaaccgg gtcagagccc gaaactgctg atttataaag tgagcaatcg ctttagcggt 240 gttccggatc gttttagcgg ttcaggttct ggcaccgatt ttaccctgaa aattagccgt 300 gttgaagcag aagatctggg cgtttattat tgttttcagg gtagccatgt tccgtatacc 360 tttggtggtg gcaccaaact ggaaattaaa cgtaccggta gcggtagtgg aggtggtgga 420 agcggtggtg gcggttctgg cggtggaggt tcttctggtg gcggtggatc aggtggaggt 480 ggctcaggcg gtggcggtag cggcagcggt gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa 540 ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatt agctgtaaag ccagcggcta tacctttacc 600 gattattata tgcattgggt tcgtcagcgt ccgggtcagg gtctggaatg gattggtgaa 660 atttatccgg gtagcggtaa taccagctat aatgaaaaat ttcgtggcaa agcaaccctg 720 accgcagata aaagcagcag caccgcatat atgcagctgt ctagcctgac cagcgaagat 780 agcgcagttt acttttgtgc acgtggcacc ctggattata ccatggatta ttggggacag 840 ggcaccagcg ttaccgttag cagcggatcc ggtagcggtg gtggtggtag tggtggcggt 900 ggttcaggtg gtggtggcag cagtggtggt ggcggttctg gcggtggcgg ttcaggtggc 960 ggaggtagcg gtagcggtga accgcaggtt tataccctgc ctccgagccg tgaagaaatg 1020 accaaaaatc aggttagcct gtattgcctg gtgaaaggtt tttatccgag cgatattgca 1080 gttgaatggg aaagcaatgg tcagccggaa aataactata aaacctatcc gcctgtgctg 1140 gatagtgatg gtagctttta tctgtatagc aaactgaccg tggataaaag ccgttggcag 1200 cagggtaatg tttttagctg tagcgttatg catgaagccc tgcataatca ctacacccag 1260 aaaagcctga gcctgtaata a 1281

Claims (14)

1. Monovalent fusionspolypeptid, der foreligger som monomer, omfattende (i) et første domæne, der omfatter den variable tungkæderegion af et antistof (VH) eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, (ii) et andet domæne, der omfatter den variable letkæderegion af et antistof (VL) eller i det mindste et afsnit heraf, der formidler antigenbindingen, og (iii) et tredje domæne, der omfatter et afsnit af en konstant tungkæderegion af et antistof (CHX), hvor domænet (iii) har en længde på 80-130 aminosyrerester, og aminosyrepositioner, hvis sidekæder har interaktioner i henhold til konceptet for „knobs-into-holes"-anordningen, er modificeret, hvor domænerne (i), (ii) og (iii) er forbundet med hinanden via peptidlinkere (L), hvor peptidlinkerne (L) uafhængigt af hinanden har en længde på 25-45 aminosyrerester og udelukkende består af glycin- og/eller serinrester, og hvor fusionspolypeptidet ikke danner intermolekylære disulfidbroer og ikke indeholder hinge-regioner af antistoffer.
2. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, omfattende strukturen VH - L- VL - L- CHX eller VL-L-VH-L-CHX,
3. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 2, ved hvilket domænerne (i), (ii) og (iii) hver især har en længde på 80-130 aminosyrerester. 4. 4. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 3, ved hvilket domænet (iii) er udvalgt fra afsnittene CH1, CH2, CH3 og CH4 af antistoffer, fortrinsvis af humane antistoffer fra klasserne IgG, IgM, IgE og IgA eller kombinationer af disse afsnit.
5. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 bis 4, ved hvilket peptidlinkerne uafhængigt af hinanden har en længde på 30-40 aminosyrerester.
6. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 5, der indeholder i det mindste et yderligere domæne, f.eks. en signalpeptid og/eller en peptid-tag.
7. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 6, der indeholder et eller flere domæner VH, VL og/eller CHX, der har en identitet på aminosyreniveau på mindst 90 %, fortrinsvis på mindst 95 % i forhold til de tilsvarende domæner i henhold til SEQ ID NO: 1 (VL), SEQ ID NO: 2 (VH), SEQ ID NO: 4 (VH, VL), SEQ ID NO: 8 (igG-CH1), SEQ ID NO: 10 (lgG-CH2), SEQ ID NO: 12 (lgG-CH3), SEQ ID NO: 14(lgA~CH2), SEQ ID NO: 16 (lgA-CH3), SEQ ID NO: 18(lgM-CH2), SEQ ID NO: 20 (lgM-CH3) eller SEQ ID NO: 22 (lgM-GH4).
8. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 7, ved hvilket i det mindste en asparaginrest fra en glykosileringsposition er erstattet af en anden aminosyrerest, fortrinsvis serin, alanin eller glycin, og/eller ved hvilket i det mindste en cysteinrest er erstattet af en anden aminosyrerest, fortrinsvis serin, alanin eller glycin.
9. Nukleinsyre, kodende for et fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 8, eventuelt i en operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens.
10. Nukleinsyre ifølge krav 9, der er codonoptimeret i forhold til en ekspression i en udvalgt værtscelle, f.eks. en bakterie som eksempelvis E, coli.
11. Værtscelle, der indeholder en nukleinsyre ifølge et af kravene 9 til 10.
12. Fremgangsmåde til fremstilling af et fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 8, omfattende kultivering af en værtscelle ifølge krav 11 og udvinding af fusionspolypeptidet fra cellen eller kultursupernataten.
13. Anvendelse af et fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 8 som reagens i en diagnostisk eller biokemisk test, fortrinsvis (i) som kontrol- eller kaiibratorreagens eller (ii) som testreagens til bestemmelse af en analyt.
14. Fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 8, nukleinsyre ifølge krav 9 eller 10 eller værtscelle ifølge krav 11 til anvendelse inden for medicin, f.eks. inden for human- eller veterinærmedicin.
15. Farmaceutisk sammensætning, der indeholder et fusionspolypeptid ifølge et af kravene 1 til 8, en nukleinsyre ifølge krav 9 eller 10 eller en værtscelle ifølge krav 11 sammen med farmaceutisk egnede bærestoffer.
DK10798744.8T 2009-11-27 2010-11-24 Monospecifikke polypeptidreagenser DK2504359T3 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009047243A DE102009047243A1 (de) 2009-11-27 2009-11-27 Monospezifische Polypeptidreagenzien
PCT/EP2010/068134 WO2011064257A2 (de) 2009-11-27 2010-11-24 Monospezifische polypeptidreagenzien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DK2504359T3 true DK2504359T3 (da) 2016-07-25

Family

ID=43589669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK10798744.8T DK2504359T3 (da) 2009-11-27 2010-11-24 Monospecifikke polypeptidreagenser

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9163079B2 (da)
EP (1) EP2504359B1 (da)
JP (1) JP2013511966A (da)
AU (1) AU2010323144B2 (da)
CA (1) CA2782016C (da)
DE (1) DE102009047243A1 (da)
DK (1) DK2504359T3 (da)
WO (1) WO2011064257A2 (da)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007145840A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
CA2676008A1 (en) 2007-01-24 2008-07-31 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
MX2011000233A (es) 2008-07-08 2011-05-19 Oncomed Pharm Inc Agentes de union del receptor notch1 y metodos para su uso.
DE102009047243A1 (de) * 2009-11-27 2011-06-01 Orgentec Diagnostika Gmbh Monospezifische Polypeptidreagenzien
WO2013156054A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Universität Stuttgart The igm and ige heavy chain domain 2 as covalently linked homodimerization modules for the generation of fusion proteins with dual specificity
US20170023576A1 (en) * 2014-04-04 2017-01-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch3 antibodies and uses thereof
JP7366742B2 (ja) * 2016-08-26 2023-10-23 サノフイ 選択的な軽鎖対形成を容易にする多重特異性抗体
EP3532034A4 (en) * 2016-10-28 2020-12-02 Washington University ANTI-APOE ANTIBODIES

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
WO1998002462A1 (en) 1996-07-16 1998-01-22 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US6151296A (en) 1997-06-19 2000-11-21 Qualcomm Incorporated Bit interleaving for orthogonal frequency division multiplexing in the transmission of digital signals
CA2376192A1 (en) 1999-06-07 2000-12-14 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
DE10001372A1 (de) 2000-01-14 2001-08-02 Deutsches Krebsforsch Anti-CD3-Einzelketten-Antikörper mit humanem Cmu3- und Cmu4- Domänen
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2003080672A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
EP1885396A2 (en) * 2005-05-04 2008-02-13 Quark Pharmaceuticals, Inc. Recombinant antibodies against cd55 and cd59 and uses thereof
SI2314623T1 (sl) * 2005-06-21 2012-11-30 Xoma Technology Ltd IL beta vezavna protitelesa in njihovi fragmenti
EP1757622B1 (en) * 2005-08-26 2009-12-23 PLS Design GmbH Bivalent IgY antibody constructs for diagnostic and therapeutic applications
WO2007062466A1 (en) * 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
US8273030B2 (en) 2005-12-01 2012-09-25 Atcor Medical Pty Ltd Method of estimating pulse wave velocity
US8940871B2 (en) * 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US20080260738A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
WO2008131252A1 (en) 2007-04-20 2008-10-30 Invista Technologies S.A.R.L. Compact continuous over end take-off (oeto) creel with tension control
WO2008145137A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
EP2116555A1 (en) * 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma
DE102009047243A1 (de) * 2009-11-27 2011-06-01 Orgentec Diagnostika Gmbh Monospezifische Polypeptidreagenzien

Also Published As

Publication number Publication date
EP2504359B1 (de) 2016-03-23
US9815891B2 (en) 2017-11-14
US20160046703A1 (en) 2016-02-18
WO2011064257A2 (de) 2011-06-03
CA2782016C (en) 2020-01-07
JP2013511966A (ja) 2013-04-11
WO2011064257A3 (de) 2011-08-11
EP2504359A2 (de) 2012-10-03
AU2010323144A1 (en) 2012-07-12
US20120276099A1 (en) 2012-11-01
US9163079B2 (en) 2015-10-20
AU2010323144B2 (en) 2013-11-07
CA2782016A1 (en) 2011-06-03
DE102009047243A1 (de) 2011-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2504359T3 (da) Monospecifikke polypeptidreagenser
AU2015295936B2 (en) Anti-CTLA4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use
JP6165713B2 (ja) インスリン様増殖因子１に特異的に結合する抗体
CN107266574A (zh) 蛋白酶调节的抗体
CN111748033B (zh) 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒
JP2023509212A (ja) 新型ポリペプチド複合物
CN109336973B (zh) 抗转铁蛋白抗体及其用途
TWI789399B (zh) 不對稱異二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途
CN116457374A (zh) 经修饰的可溶性t细胞受体
US11505614B2 (en) Antibodies binding to soluble BCMA
JP2023518225A (ja) ムチン１７に対する抗体及びその使用
CN113999306B (zh) 一种获得识别空间构象表位抗体的方法
US20230296605A1 (en) Antibody for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof
WO2023134716A1 (zh) 一种结合b7h3和nkp30的双特异性抗体及其应用
WO2024061021A1 (zh) 检测抗CD19 Car表达水平的单克隆抗体及其在激活CD19 CAR-T细胞中的应用
Sinha et al. A pipeline for facile cloning of antibody Fv domains and their expression, purification, and characterization as recombinant His-tagged IgGs
WO2022115963A1 (en) Heterodimeric iga fc constructs and methods of use thereof
CN115925908A (zh) 抗狂犬病毒的抗体及其应用
CN115397833A (zh) 多聚体IgA抗体的制造方法与多特异性多聚体IgA抗体
CN115279795A (zh) 靶向抗cd19嵌合抗原受体的抗独特型抗体
Rönnmark Affibody ligands in immunotechnology applications